ES2237429T3 - Polipeptidos quimericos modificados con propiedades farmacocineticas mejoradas. - Google Patents

Polipeptidos quimericos modificados con propiedades farmacocineticas mejoradas.

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ES2237429T3 ES00932721T ES00932721T ES2237429T3 ES 2237429 T3 ES2237429 T3 ES 2237429T3 ES 00932721 T ES00932721 T ES 00932721T ES 00932721 T ES00932721 T ES 00932721T ES 2237429 T3 ES2237429 T3 ES 2237429T3
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende: a) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente del receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV) que consiste, esencialmente, en un dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un primer receptor de FCEV y de un dominio 3 Ig de un segundo receptor de FCEV; y b) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de multimerización, en la que el primer receptor de FCEV es Flt1 y el segundo receptor de FCEV es Flk1 o Flt4 y el componente del receptor de FCEV es el único componente del receptor de FCEV del polipéptido de fusión.

Description

Polipéptidos quiméricos modificados con propiedades farmacocinéticas mejoradas.
La solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de los EE.UU. nº 60/138,133, cumplimentada el 8 de junio de 1999.
Introducción
El campo de esta invención es polipéptidos modificados con farmacocinética mejorada. Específicamente, el campo de esta invención se refiere a los polipéptidos receptores Flt1 que se han modificado de tal manera que se ha mejorado su perfil farmacocinético. El campo de esta invención también se refiere a los métodos para fabricar y usar los polipéptidos modificados que incluyen, pero no se limitan a, el uso de los polipéptidos modificados para disminuir o inhibir la pérdida de plasma y/o la permeabilidad vascular en un mamífero.
Antecedentes
La capacidad de los ligandos polipeptídicos para unirse a las células y con eso desencadenar una respuesta fenotípica como la proliferación celular, supervivencia, secreción de productos celulares o diferenciación a menudo se realiza a través de unos receptores transmembranarios en las células. El dominio extracelular de tales receptores (a saber, la parte del receptor que se expone sobre la superficie de la célula) es generalmente la parte más distintiva de la molécula al aportar las características de unión al ligando de la proteína. La unión de un ligando al dominio extracelular normalmente da lugar a una transducción de señal que transmite la señal biológica a las dianas intracelulares. A menudo, esta transducción de señal actúa a través del dominio catalítico intracelular. El ordenamiento particular de los motivos de secuencia de este dominio catalítico intracelular determina su acceso a las cinasas, que serán sustratos potenciales (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11: 5068-5078; Fantl, et al., 1992, Cell 69: 413-413). Ejemplos de receptores que transducen señales a través de los dominios intracelulares incluyen los receptores tirosina cinasa (RTK), tales como la familia de receptores Trk que generalmente se limitan a las células del sistema nervioso, la familia de los receptores de las citocinas que incluyen el complejo receptor tripartito del CNTF (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466) que, generalmente, también se limita a las células del sistema nervioso, los receptores acoplados a proteínas G, tales como el receptor \beta2-adrenérgico que se encuentra, por ejemplo, en las células del músculo cardíaco, y el receptor Fc\varepsilonRI de gran afinidad por la IgE multimérica que se localiza, en su mayor parte, en los mastocitos y los basófilos (Sutton & Gould, 1993, Nature 366: 421-428).
421-428).
Todos los receptores identificados hasta ahora parece que dimerizan, multimerizan o sufren algún otro cambio conformacional tras la unión del ligando (Schlessinger, J., 1988, Trends Biochem. Sci. 13: 443-447; Ullrich &
Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9: 383-391) y las interacciones moleculares entre los dominios intracelulares que dimerizan conducen a activar la función catalítica. En algunos casos, como el del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), el ligando es un dímero que se une a dos moléculas receptoras (Hart, et al., 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912) mientras que, por ejemplo, en el caso del factor de crecimiento epidérmico (EGF), el ligando es un monómero (Weber, et al., 1984, Biol. Chem. 259: 14631-14636). En el caso del receptor Fc\varepsilonRI, el ligando, IgE, existe unido al Fc\varepsilonRI en forma monomérica y sólo se activa cuando el antígeno se une al complejo IgE/Fc\varepsilonRI e interconecta moléculas adyacentes de IgE (Sutton & Gould, 1993, Nature 366: 421-428).
A menudo, esta distribución de tejidos de un receptor concreto dentro de los organismos superiores ayuda a profundizar en la función biológica del receptor. Los RTK de algunos factores de crecimiento y diferenciación, como el factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), se expresan ampliamente y, por lo tanto, parecen jugar un papel general en el crecimiento y el mantenimiento de los tejidos. Miembros de receptores Trk de la familia de los RTK (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262-268) se limitan más generalmente a las células del sistema nervioso, y la familia de factores de crecimiento de los nervios consisten en el factor de crecimiento del nervio (NGF), el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) y neurotrofina-4/5 (NT-4/5), que se unen a los receptores Trk de la familia RTK, promueven la diferenciación de diversos grupos de neuronas en el cerebro y la periferia (Lindsay, R. M, 1993, in Neurotrophic Factors, S. E. Loughlin & J. H. Fallon, eds., pp. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). Fc\varepsilonRI se localiza en un número muy limitado de tipos celulares como los mastocitos y los basófilos. Los mastocitos derivan de la estirpe de hemocitoblastos hematopoyéticos pluripotentes de la medula ósea, pero completan su maduración en el tejido tras abandonar el torrente circulatorio (See Janeway & Travers, 1996, in Immunobiology, 2d. Edition, M. Robertson & E. Lawrence, eds., pp. 1:3-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) y están implicados en la respuesta alérgica.
Muchos estudios han demostrado que el dominio extracelular de un receptor proporciona la característica de unión al ligando específico. Además, el entorno celular en el que se expresa un receptor puede influir en la respuesta biológica que se muestra en la unión de un ligando al receptor. Por ejemplo, cuando una célula neuronal que expresa un receptor Trk se expone a una neurotrofina que se une al receptor, da lugar a la supervivencia neuronal y a la diferenciación. Cuando el mismo receptor se expresa en un fibroblasto, la exposición a la neurofina da lugar a la proliferación del fibroblasto (Glass, et al., 1991, Cell 66: 405-413).
Se ha identificado una clase de mitógenos diméricos derivados de células con selectividad por las células endoteliales vasculares al que se ha denominado factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV). El FCEV se ha purificado de un medio de crecimiento acondicionado de células del glioma de rata [Conn et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 87. pp 2628-2632], medio de crecimiento acondicionado de células estrelladas del folículo hipofisiario bovino [Ferrara y Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, pp. 851-858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 86, pp. 7311-7315] y medio de crecimiento acondicionado de células humanas U937
[Connolly, D. T. et al. (1989), Science, 246, pp. 1309-1312]. El FCEV es un dímero con una masa molecular aparente de aproximadamente 46 kDa, en el que cada subunidad tiene una masa molecular aparente de aproximadamente 23 kDa. El FCEV tiene algunas similitudes estructurales con el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), que es un mitógeno de las células del tejido conjuntivo, pero no es mitogénico para las células del endotelio vascular de los vasos de gran tamaño.
Se demostró que el receptor tirosina cinasa unido a la membrana, conocido como Flt, era un receptor del FCEV [DeVries, C. et al., (1992), Science, 255, pp. 989 991]. El receptor Flt se une específicamente al FCEV, lo que induce la mitogenia. Se sabe que otra forma del receptor del FCEV, designado como KDR, se une al FCEV e induce la mitogenia. También se conoce la secuencia parcial del ADNc y casi toda la secuencia de la proteína del KDR [Terman, B. I. et al., (1991) Oncogene 6, pp. 1677-1683; Terman, B. I. et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, pp.
1579-1586].
La angiogénesis persistente puede causar o exacerbar algunas enfermedades tales como la soriasis, la artritis reumatoide, los hemangiomas, los angiofibromas, la retinopatía diabética y el glaucoma neovascular. Un inhibidor de la actividad del FCEV sería útil para tratar tales enfermedades y de otras alteraciones de la permeabilidad vascular y de la angiogénesis anatomopatológica inducida por el FCEV, como la vascularización del tumor. La presente invención se refiere a un inhibidor del FCEV que se basa en el receptor Flt1 del FCEV.
La pérdida de plasma, un componente clave de la inflamación, se produce en un subconjunto diferente de microvasos. En particular, en la mayoría de los órganos, la pérdida de plasma se produce específicamente en las vénulas. Al contrario que las arteriolas y los capilares, las vénulas se hacen rezumantes en respuesta a numerosos mediadores inflamatorios, que incluyen la histamina, la bradicinina y la serotonina. Una característica de la inflamación es la pérdida de plasma, que es el resultado de aberturas intercelulares que se forman en el endotelio de las vénulas. La mayoría de los modelos experimentales de la inflamación indican que estas aberturas intercelulares se producen entre las células endoteliales de las vénulas poscapilares y de recogida (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998 152: 1463-76). Se ha demostrado que se pueden usar algunas lectinas para poner de manifiesto las características de los puntos por donde se pierde el plasma, de las aberturas endoteliales y de los procedimientos dactiloides en los bordes de las células endoteliales de las vénulas inflamadas (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol, 1996,271: H2547-62). En particular, se han usado lectinas vegetales para visualizar los cambios morfológicos en los bordes de las células endoteliales en las vénulas inflamadas de, por ejemplo, la tráquea de la rata. Las lectinas, tales como la concanavalina A y la ricina, que se unen focalmente a las vénulas inflamadas, ponen de manifiesto las regiones de la pared subendotelial del vaso que se exponen a causa de las aberturas que corresponden a los sitios de pérdida de plasma (Thurston, G., et al., Am J Physiol, 1996,271: H2547-62).
Las propiedades de los microvasos son dinámicas. Las enfermedades inflamatorias crónicas, por ejemplo, se asocian con la reorganización microvascular, que incluye la angiogénesis y el agrandamiento de los microvasos. También se pueden reorganizar los microvasos al adquirir propiedades fenotípicas anormales. En un modelo murino de inflamación crónica de las vías respiratorias, los capilares de las vías respiratorias adquieren las propiedades de las vénulas, que incluyen un ensanchamiento del diámetro del vaso, un aumento de la inmunorreactividad para el factor von
Willebrand y un aumento de la inmunorreactividad para la P-selectina. Además, estos vasos reorganizados rezuman en respuesta a los mediadores inflamatorios, mientras que no lo hacen de los vasos en la misma posición en las vías respiratorias de los ratones normales.
Se ha demostrado que ciertas sustancias reducen o inhiben la permeabilidad vascular y/o la pérdida de plasma. Por ejemplo, las mistixinas son unos polipéptidos sintéticos que se ha descrito que inhiben la pérdida de plasma sin bloquear la formación de aberturas en el endotelio (Baluk, P., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998,284: 693-9). También, el formoterol, agonista del receptor \beta2-adrenérgico, reduce la pérdida microvascular mediante la inhibición de la formación de aberturas en el endotelio (Baluk, P. y McDonald, D. M., Am. J. Physiol., 1994,266:
L461-8).
Las angiopoyetinas y los miembros de la familia del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV) son los únicos factores de crecimiento que se cree que son muy específicos de las células del endotelio vascular. Los estudios de la inactivación de un gen concreto en los ratones han demostrado que el FCEV es necesario en las etapas tempranas del desarrollo vascular y que el Ang-1 se necesita en las etapas tardías de la reorganización vascular.
En la patente de los EEUU n.º 6011003, publicada el 4 de enero de 2000 a nombre de Metris Therapeutics Limited, se describe una forma soluble alterada del polipéptido FLT que se puede unir al FCEV y, por lo tanto, ejercer un efecto inhibidor sobre él; el polipéptido comprende cinco o menos dominios completos de inmunoglobulina.
En la patente de los EEUU n.º 5712380, publicada el 27 de enero de 1998 a nombre de Merck & Co., se describen los inhibidores del factor de crecimiento de las células del endotelio vascular (FCEV) que producen, naturalmente o por manipulación biotecnológica, unas formas solubles con o sin una región transmembranaria C-terminal del receptor del FCEV.
También a nombre de Merck & Co. está la publicación de PCT n.º WO 98/13071, publicada el 2 de abril de 1998, en la cual se describe una metodología de terapia génica para inhibir la metástasis y de crecimiento del tumor primario mediante transferencia génica con una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína receptora soluble que se une al FCEV.
En la publicación de PCT n.º WO 97/44453, publicada el 27 de noviembre de 1997, a nombre de Genentech, Inc., se describen nuevas proteínas quiméricas del receptor del FCEV que comprenden secuencias de aminoácidos que derivan de los receptores Flt1 y KDR del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV), que incluyen el receptor FLK1, el homólogo murino del KDR humano, en la que dichas proteínas quiméricas del receptor del FCEV se unen al FCEV y antagonizan la actividad proliferativa de las células del endotelio y la actividad angiogénica del mismo (véase también Davis-Smyth et al, EMBO J. 1996, vol 15, pp. 4919-4927).
En la publicación de PCT n.º WO 97/13787, publicada el 17 de abril de 1997 a nombre de Toa Gosei Co., LTD., se describe un inhibidor del FCEV de baja masa molecular utilizable en el tratamiento de enfermedades acompañadas de neovascularización, tales como los tumores sólidos. Un polipéptido que contiene el primer dominio inmunoglobulinoide y el segundo dominio inmunoglobulinoide en la región extracelular de un receptor FLT del FCEV, pero que no contiene el sexto dominio inmunoglobulinoide y el séptimo dominio inmunoglobulinoide del mismo, muestra una actividad inhibidora del FCEV.
En Sharifi, J. et al. (1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42: 242-249) se describe que ya que los anticuerpos monoclonales (AcM) son proteínas básicas cargadas positivamente y las células de los mamíferos están cargadas negativamente, las interacciones electrostáticas entre las dos pueden generar una gran cantidad de uniones inespecíficas que dan lugar a proporciones bajas entre órganos tumorados y normales. Para superar este efecto, los investigadores intentaron mejorar la eliminación de los AcM utilizando diferentes métodos, tales como los fármacos secundarios, así como modificaciones químicas y de carga del propio AcM.
En Jensen-Pippo, et al. (1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107) se describe que la pegilación de una proteína terapéutica, el factor recombinante estimulador de colonias de granulocitos humanos (PEG-G-CSF) da lugar a un aumento de la estabilidad y de la retención de la bioactividad in vivo cuando se administra por la vía intraduodenal.
En Tsutsumi, et al. (1997, Thromb Haemost. 77: 168-73) se describen experimentos en los que la actividad trombopoyética in vivo de la interleucina 6 modificada con polietilenglicol (MPEG-IL-6), en la que el 54% de los 14 grupos amino de las lisinas de la IL-6 se acoplaron al PEG, se comparó con la de la IL-6 nativa.
En Yang, et al. (1995, Cancer 76: 687-94) se describe que la conjugación del polietilenglicol con la interleucina 2 (IL-2) humana recombinante da lugar a un compuesto, la IL-2 modificada con polietilenglicol (PEG-IL-2), que conserva la actividad de la IL-2 in vitro e in vivo, pero que muestra una semi-vida en circulación notablemente prolongada.
En R. Duncan y F. Spreafico [Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306,296 (1994)] se recopilan los esfuerzos para mejorar la semi-vida en el plasma de la asparraginasa al conjugarla con polietilenglicol.
En la publicación internacional de PCT n.º WO 99/03996, publicada el 28 de enero de 1999, a nombre de
Regeneron Pharmaceuticals, Inc. y de The Regents of The University of California, se describen polipéptidos de la nogina humana modificada que tienen deleciones de las regiones de aminoácidos básicos. Se describe que los polipéptidos de la nogina humana modificada conservan la actividad biológica al mismo tiempo que se reduce su afinidad por la heparina y se mejora la farmacocinética en sueros animales, cuando se comparan con la nogina humana sin modificar.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende
a) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente del receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV) que consta, esencialmente, del dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un primer receptor del FCEV y del dominio 3 Ig de un segundo receptor del FCEV; y
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de multimerización;
en la que el primer receptor del FCEV es Flt1 y el segundo receptor del FCEV es Flk1 o Flt4 y el componente del receptor del FCEV es el único componente del receptor de FCEV del polipéptido de fusión.
En una realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor del FCEV está hacia 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor del FCEV.
En otra realización preferida, la secuencia nucleotídica que codifica el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor del FCEV está hacia 3' de la secuencia nucleoítidica que codifica el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor del FCEV.
En una realización preferida de la invención, el componente de multimerización comprende un dominio de la inmunoglobulina.
En otra realización, el dominio inmunoglobulínico se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de la IgG y la cadena pesada de la IgG.
Realizaciones preferidas incluyen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido de fusión del receptor Flt1 modificado, en la que la región codificante de la molécula de ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en
a) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 21A-21C;
b) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 22A-22C;
c) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 24-24C; y
d) una secuencia de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, difiere de la secuencia de nucleótidos de a) b) o c) y que codifica una molécula de polipéptido de fusión que tiene la actividad biológica del polipéptido de fusión del receptor Flt1 modificado.
En una realización adicional de la invención, con las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas anteriormente se codifica un polipéptido de fusión.
Otra realización es un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas más arriba, que incluye un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una secuencia de control de la expresión.
Otras realizaciones incluidas son un sistema de vector y hospedador para producir un polipéptido de fusión que comprende el vector de expresión, en una célula hospedadora adecuada; el sistema de vector y hospedador en el que la célula hospedadora adecuada es una célula bacteriana, una célula de levaduras, una célula de insectos o una célula de mamíferos; el sistema de vector y hospedador en el que la célula hospedadora adecuada es E. coli: el sistema de vector y hospedador, en el que la célula hospedadora adecuada es una célula COS; el sistema de vector y hospedador en el que la célula hospedadora adecuada es una célula CHO.
Otra realización de la invención es un método para producir un polipéptido de fusión que comprende unas células en proliferación del sistema de vector y hospedador en las condiciones que permiten producir el polipéptido de fusión y recuperar el polipéptido de fusión así producido.
Realizaciones adicionales incluyen un antagonista dimérico del factor de crecimiento del endotelio vascular
(FCEV), que comprende dos polipéptidos de fusión; cada polipéptido de fusión comprende:
a) un componente del receptor del FCEV que consiste esencialmente en un dominio inmunoglobulinoide (Ig) de un receptor Flt1 del FCEV y de un dominio 3 Ig de un receptor Flk-1 o Flt-4 del FCEV; y
b) un componente de multimerización, en el que el componente del receptor del FCEV es el único componente del receptor del FCEV de cada proteína de fusión.
Tal antagonista se puede modificar por acetilación o pegilación.
La proteína de fusión de la invención se puede usar para reducir o inhibir la pérdida de plasma en un mamífero, administrando al mamífero el polipéptido de fusión descrito arriba, que incluye realizaciones en las que el mamífero es un humano, se acetila el polipéptido de fusión o se pegila el polipéptido de fusión. También se puede usar el polipéptido de fusión para bloquear el crecimiento de los vasos sanguíneos en un humano.
Adicionales usos de la invención incluyen la atenuación del crecimiento del tumor o la prevención de la formación de un tumor en un humano; la atenuación o la prevención de edema en un humano, sobre todo en el caso en el que el edema es un edema en el cerebro; la atenuación o la prevención de formación de ascitis en un humano, sobre todo en el caso en el que la ascitis es una ascitis asociada al cáncer de ovarios.
Además, la invención proporciona un polipéptido de fusión que comprende
a) un componente del receptor del FCEV que consiste esencialmente en un dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un receptor Flt-1 del FCEV y de un dominio 3 Ig de un receptor Flt-1 o Flk-4 del FCEV.
b) un componente de multimerización, en el que el componente del receptor del FCEV es el único componente del receptor del FCEV del polipéptido de fusión.
Las realizaciones preferidas incluyen un polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor del FCEV está hacia el extremo amino de la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor del FCEV y un polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor del FCEV está hacia el extremo carboxilo de la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor del FCEV.
Aún en otra realización, el componente de multimerización del polipéptido de fusión comprende un dominio de inmunoglobulina que incluye una realización en la que el dominio de la inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de la IgG y la cadena pesada de la IgG.
Las realizaciones preferidas incluyen un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor de Flt1 modificado, en el que la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en
a) la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 21A-21C;
b) la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 22A-22C; y
c) la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 24A-24C;
Otra realización preferida es el uso de un polipéptido de fusión de un agonista dimérico de la invención para fabricar un medicamento que se usa para atenuar el crecimiento del tumor o prevenir la formación de un tumor, para atenuar o prevenir el edema, para atenuar o prevenir la formación de ascitis, para reducir o inhibir la pérdida de plasma, o para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos en un humano.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Análisis en gel de IEF de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y acetiladas. La proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar no puede entrar en el gel debido a su pI > 9,3, mientras que la Flt1(1-3)-Fc acetilada puede entrar en el gel y equilibrarse a pI 5,2.
Figura 2. Unión de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y Flt1(1-3)-Fc acetiladas a las placas recubiertas de Matrigel®. Las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar se unen extensivamente a los componentes de la matriz extracelular en Matrigel®, mientras que la Flt1(1-3)-Fc acetilada no se une.
Figura 3. Unión de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, la Flt1(1-3)-Fc acetilada y la Flt1(1-3)-Fc pegilada en un ensayo basado en Biacore. Las Flt1(1-3)-Fc acetiladas (columnas 13 a 16), pegiladas (columnas 17 a 20) y tratadas con heparina (columnas 21 a 24) son capaces de competir completamente con la Flt1(1-3)-Fc unida al chip de Biacore por la unión al FCEV cuando se comparan con la proteína de control (columnas 1 a 4) y una proteína irrelevante (columnas 5 a 8). La Flt1(1-3)-Fc sin modificar (columnas 5 a 6) parece competir sólo parcialmente con la Flt1(1-3)-Fc unida al chip de Biacore por la unión al FCEV.
Sin embargo, el lavado de las muestras de unión con NaCl a 0,5 M (columnas 7 a 8) da lugar a un perfil de unión similar a las formas modificadas de Flt1(1-3)-Fc, lo que indica que la proteína sin modificar muestra una unión no específica al chip que se puede eliminar por un lavado con la sal.
Figura 4. Unión de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada y pegilada al FCEV en un ensayo basado en ELISA. Tanto la proteína Flt1(1-3)-Fc pegilada como la acetilada se unen al FCEV con unas afinidades que se acercan a las de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar.
Figura 5. Perfiles farmacocinéticos de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, de la Flt1(1-3)-Fc acetilada y de la Flt1(1-3)-Fc pegilada. A los ratones Balb/c (23-28 g) se les inyectaron por vía subcutánea 4 mg/kg de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada o pegilada. Los ratones se sangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días de la inyección de la proteína y se analizaron los sueros en un análisis estándar basado en ELISA para detectar la proteína Flt1(1-3)-Fc. El T_{max} de todas las proteínas Flt1(1-3)-Fc estuvo entre los puntos de 6 horas y 24 horas. La C_{max} de las diferentes proteínas fue la siguiente: sin modificar: 0,06 \mug/ml a 0.15 \mug/ml; acetilada: 1,5 \mug/ml a 4,0 \mug/ml; y pegilada: aproximadamente 5 \mug/ml.
Figura 6A-6B. Análisis en gel de IEF de la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar y acetilada progresivamente. La proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar es incapaz de entrar en el gel debido a su pI > 9,3, mientras que la mayoría de las muestras de Flt1(1-3)-Fc acetiladas progresivamente (muestras con un exceso de 30 a 100 veces) podían migrar en el gel y equilibrarse a un pI que se encuentra entre 4,55 y 8,43, según el grado de la acetilación.
Figura 7. Unión de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente a las placas recubiertas de Matrigel®. Como con la proteína irrelevante de control, rTie2-Fc, la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente (muestras con un exceso de 20 y 30 veces) no muestra ninguna unión a la placa recubierta de Matrigel®, mientras que la proteína Flt1(1-3)-Fc sin acetilar muestra una unión significativa. La muestra con un exceso de 10 veces muestra una unión reducida, pero el grado de la acetilación no es suficiente para bloquear completamente la unión a los componentes de la matriz extracelular.
Figura 8. Unión de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar y la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente en un análisis basado en Biacore. En una proporción subestequiométrica (0,5 \mug/ml bien de Flt1(1-3) sin modificar o de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente frente al FCEV a 0,2 \mug/ml), no hay suficiente Flt1(1-3)-Fc (tanto sin modificar como acetilada progresivamente) en la disolución para unir completamente el FCEV. En 1,0 \mug/ml, que se aproxima a una proporción estequiométrica de 1:1, tanto la Flt1(1-3)-Fc sin modificar como la acetilada progresivamente pueden competir mejor por unirse al FCEV, pero todavía no hay suficiente proteína Flt1(1-3)-Fc (tanto sin modificar como acetilada progresivamente) para saturar completamente el FCEV disponible. Sin embargo, en 5,0 \mug/ml, que es varias veces mayor que una proporción estequiométrica de 1:1, tanto la proteína Flt1(1-3)-Fc como la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente pueden saturar el FCEV, independientemente del grado de acetilación.
Figura 9. Perfiles farmacocinéticos de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar y de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente. A los ratones Balb/c (23-28 g) se les inyectó por vía subcutánea 4 mg/kg de Flt1(1-3)-Fc sin modificar o muestras con un exceso de 10, 20, 40, 60 y 100 veces de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente (3 ratones para las muestras sin modificar y con un exceso de 10, 20 y 40 veces, y 2 ratones para las muestras con un exceso de 60 y 100 veces). Los ratones se sangraron por la cola tras 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días de la inyección. Se analizaron los sueros con un análisis basado en ELISA para detectar la Flt1(1-3)-Fc. El T_{max} de todas las proteínas Flt1(1-3)-Fc probadas estuvo en el punto de 6 horas pero la C_{max} fue como sigue: Flt1(1-3)-Fc sin modificar: 0,06 \mug/ml; muestra con un exceso de 10 veces: 0,7 \mug/ml, muestra con un exceso de 20 veces: 2 \mug/ml, muestra con un exceso de 40 veces: 4 \mug/ml, muestra con un exceso de 60 veces: 2 \mug/ml, muestra con un exceso de 100 veces: 1 \mug/ml.
Figura 10A-10D. Ácido nucleico y secuencia de aminoácidos deducidos de Flt1(1-3)-Fc.
Figura 11. Diagrama esquemático de la estructura de Flt1.
Figura 12A y 12B. Análisis de hidrofilidad de las secuencias de aminoácidos del dominio 2 Ig y del dominio 3 Ig de Flt1.
Figura 13A-13D. Ácido nucleico y secuencia de aminoácidos deducida de Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1.
Figura 14A-14C. Ácido nucleico y secuencia de aminoácidos deducida de Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2.
Figura 15A-15C. Ácido nucleico y secuencia de aminoácidos deducida de Flt1(2-3)-Fc:Mut3.
Figura 16A-16D. Ácido nucleico y secuencia de aminoácidos deducida de Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4.
Figura 17. Unión de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, Flt1(1-3)-Fc mutante de deleción de la región básica y Flt1(1-3)_{R->N} mutante en un ensayo basado en Biacore. A la proporción subestequiométrica (0,25 \mug/ml de Flt1(1-3)-Fc de muestras sin modificar, acetiladas o genéticamente modificadas frente a 1,0 \mug/ml de FCEV), no hay suficiente proteína Flt1(1-3)-Fc para bloquear la unión del FCEV a la Flt1(1-3)-Fc inmovilizada en el chip de Biacore. A 0,5 \mug/ml de proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetiladas o genéticamente modificadas, la proporción estequiométrica se aproxima a 1:1 y hay un aumento de la capacidad de bloquear la unión del FCEV al chip de Biacore. A 1,0 \mug/ml de proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetiladas o genéticamente modificadas, que es aproximadamente una proporción estequiométrica de 10:1, las proteínas Flt1(1-3)-Fc pueden bloquear la unión del FCEV al chip de Biacore, pero no son equivalentes. Las Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc sin modificar, acetiladas y :Mut1 son esencialmente iguales en su capacidad de bloquear la unión del FCEV, mientras que la Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 es algo menos eficaz a la hora de bloquear la unión.
Figura 18. Unión de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y las mutantes Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1, Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 y Flt1(2-3) a las placas recubiertas de Matrigel®. La proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar se une ávidamente a estos pocillos, la proteína Flt1(2-3)-Fc:Mut3 se une de manera algo más débil, la proteína Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 se une de manera aún más débil y la proteína Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 muestra el mejor perfil, uniéndose más débilmente que cualquiera de las otras proteínas mutantes. La proteína Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 mutante de glucosilación muestra sólo un beneficio marginal en el análisis de Matrigel®.
Figura 19. Unión de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y las mutantes Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1, Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 y Flt1(2-3)-Fc mediante un ensayo basado en ELISA. A las concentraciones probadas, la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, las mutantes Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1, la Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 y Flt1(2-3)-Fc se unen de manera similar al FCEV.
Figura 20. Perfiles farmacocinéticos de las proteínas mutantes Flt1(1-3)-Fc sin modificar, Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1, Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 y Flt1(2-3)-Fc. La C_{max} de estos reactivos fue como sigue: Flt1 (1-3)-Fc sin modificar: 0,15 \mug/ml; Flt1(1-3)-Fc acetilada a un exceso molar de 40 veces: 1,4 \mug/ml; y Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 0,7 \mug/ml.
Figura 21A-21C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Flt1 modificado denominado Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a).
Figura 22A-22C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Flt1 modificado denominado Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a).
Figura 23. Análisis de matriz extracelular (MEC). Los resultados de este análisis demuestran que las proteínas Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) se adhieren mucho menos a la MEC en comparación con la proteína Flt1(1-3)-Fc.
Figura 24A-24C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Flt1 modificado denominado RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a).
Figura 25A-25C. Análisis de fosforilación. A un exceso molar de 1,5 de bien Flt1(1-3)-Fc, bien Flt1(1-3)-Fc (A40) o bien Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria hay un bloqueo completo de la estimulación del receptor mediante estos tres receptores Flt1 modificados en comparación con la prueba de provocación de los medios de control. En cambio, la Flt1D2RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria no muestra un bloqueo significativo a este exceso molar, en comparación con la prueba de provocación de control positivo del FCEV. Se observan resultados similares en la figura 25B, en la que los receptores Flt modificados se encuentran en un exceso molar de 3 veces en relación al ligando FCEV165. En la figura 25C, en la que los receptores Flt1 modificados se encuentran en un exceso molar de 6 veces en relación al ligando FCEV165, se puede observar ahora que la Flt1D2RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria está bloqueando parcialmente la estimulación inducida por el FCEV165 de los receptores de la superficie celular.
Figura 26A-26B. Análisis de fosforilación. La detección por inmunotransferencia del RFCEV2 fosforilado en una tirosina (Flk1) mediante la estimulación del ligando FCEV165 muestra que los receptores de la superficie celular no se fosforilan mediante las muestras de provocación que tienen el FCEV165 preincubado con un exceso molar de 1 y 2 veces (figura 26A) o un exceso molar de 3 y 4 veces (figura 26B) de bien Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria, Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) estable o RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) transitoria. A todas las concentraciones probadas del receptor Flt1 modificado, hay una unión completa de ligando FCEV165 durante la preincubación, lo que da lugar a una estimulación indetectable de los receptores de la superficie celular mediante el FCEV165 no unido, en comparación con la prueba de provocación de los medios de control.
Figura 27. Análisis de la proliferación celular de MG/R2. Se graduaron de 40 nM a 20 pM los siguientes receptores del Flt modificado Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a), más un receptor irrelevante denominado Tie2-Fc como control negativo, y se incubaron con las células durante 1 hora a 37ºC. El FCEV165 recombinante humano en los medios definidos se añadió luego a todos los pocillos a una concentración de 1,56 nM. El receptor de control negativo Tie2-Fc no bloquea la proliferación celular inducida por el FCEV165 a cualquier concentración, mientras que la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) bloquea el FCEV165 a 1,56 nM con una semidosis máxima de 0,8 nM. Flt1(1-3)-Fc y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) bloquean con menos eficacia el FCEV165 en este análisis con una semidosis máxima de 2 nM. El FCEV165 sólo proporciona una lectura de 1,2 unidades de absorbencia y la absorbencia de fondo es de 0,38.
Figura 28. Análisis con Biacore de la estequiometría de la unión. Se calculó la estequiometría de la unión como una proporción molar entre el FCEV165 unido y las Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) inmovilizadas, usando el factor de conversión con el que 1000 RU equivalen a 1 ng/ml. Los resultados indicaron que la estequiometría de la unión era de una molécula dimérica del FCEV165 por una molécula de Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o de RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a).
Figura 29 y Figura 30. Estoquiometría por cromatografía de exclusión por tamaños. La Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
o la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) a una concentración de 1 nM [que se estimó que sería 1000 veces mayor que la KD de la interacción de Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) con FCEV165] se mezcló con diversas concentraciones del FCEV165. Tras la incubación, se midieron las concentraciones de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) libre en disolución. Los datos muestran que la adición del FCEV165 a 1 nM en la disolución de Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) bloquea completamente la unión de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) a la superficie del FCEV165. Este resultado sugirió que la estequiometría de unión era de una molécula del FCEV165 por una molécula del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a).
Figura 31. Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) en condiciones nativas. El pico n.º 1 representa el complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 y el pico n.º 2 representa el FCEV165 sin unir. Las fracciones eludidas entre 1,1 y 1,2 ml se reunieron y se les añadió hidrocloruro de guanidinio (GuHCI) a una concentración final de 4,5 M para disociar el complejo.
Figura 32. Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) en condiciones disociativas. Para separar los componentes del complejo receptor-ligando y para determinar su proporción molar, se cargaron 50 \mul del complejo disociado en un Superose 12 PC 3.2/30 equilibrada en GuHCI 6 M y se eluyó. El pico n.º 1 representa la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
y el pico n.º 2 representa el FCEV165.
Figura 33, figura 34 y figura 35. Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) con dispersión de luz en línea. La columna de cromatografía de exclusión por tamaños con un detector de dispersión de luz (DL) en línea MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Bárbara, California) y los detectores del índice de refracción (IR) (Shimadzu, Kioto, Japón) se usaron para determinar la masa molecular (MM) del complejo receptor-ligando. Tal como se muestra en la figura 33, el perfil de la elución muestra dos picos. El pico n.º 1 representa el complejo receptor-ligando y el pico n.º 2 representa el FCEV165 no unido. Se calculó la MM de las señales de DL e IR. Se utilizó el mismo procedimiento para determinar la MM de los componentes individuales del complejo receptor-ligando. Los resultados de estas determinaciones son como siguen: la MM del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 en la posición del pico es 157300 (figura 33), la MM del FCEV165 en la posición del pico es de 44390 (figura 34) y la MM de R1R2 en el pico es de 113300 (figura 35).
Figura 36. Cartografía de péptidos y análisis de la glucosilación. Las estructuras de los disulfuros y los sitios de la glucosilación en Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se determinaron mediante el método de cartografía de péptidos. Hay un total de cien cisteínas en Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a); seis de ellas pertenecen a la región de Fc. Cys27 está unida por un disulfuro a la Cys76. Cys121 está unida por un disulfuro a la Cys182. Las primeras dos cisteínas en la región Fc (Cys211 y Cys214) forman un enlace disulfuro intermolecular con las mismas dos cisteínas en otra cadena Fc. Sin embargo, no se puede determinar si el enlace disulfuro se produce entre las mismas cisteínas (Cys211 a Cys211, por ejemplo) o entre Cys211 y Cys214. Cys216 está unida por un disulfuro a la Cys306. Cys352 está unida por un disulfuro a la Cys410.
Hay cinco posibles sitios de N-glucosilación en Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y se ha encontrado que presentan diversos grados de glucosilación. La glucosilación completa se observa en Asn33, Asn193 y Asn282. Se observa una glucosilación parcial en Asn65 y en Asn120. Los sitios de la glucosilación se destacan con subrayado en la figura.
Figura 37. Farmacocinética de Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a). A los ratones Balb/c se les inyectó, por vía subcutánea, 4 mg/kg de Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en CHO, Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada establemente en CHO y RFEV1R2Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en CHO. Los ratones se sangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 6 días de la inyección. Se ensayaron los sueros en un ELISA diseñado para detectar Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a). El T_{max} de la Flt1(1-3)-Fc (A40) fue de 6 horas mientras que el T_{max} de la Flt1D2.Flk1D3.Fc
\DeltaC1(a) transitoria y estable y de la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) transitoria fue de 24 horas. La C_{max} de la Flt1(1-3)-Fc (A40) fue de 8 \mug/ml, para las dos transitorias [la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)] la C_{max} fue de 18 \mug/ml y la C_{max} de la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) estable fue de 30 \mug/ml.
Figura 38. Farmacocinética de Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y de Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a). A los ratones Balb/c se les inyectó, por vía subcutánea, 4 mg/kg de Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en CHO y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en CHO. Los ratones sangraron por la cola a los 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 y 20 días de la inyección. Se analizaron los sueros en un ELISA diseñado para detectar Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a). La Flt1(1-3)-Fc (A40) ya no se podía detectar en el suero después 5 días, mientras que la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la Flt1D2.VEGFR3D3.Fc
\DeltaC1(a) se detectaron durante 15 días o más.
Figura 39. La capacidad de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) para inhibir el crecimiento del tumor del fibrosarcoma HT-1080 in vivo. El tratamiento de los ratones SCID en días alternos o 2 veces a la semana con 25 mg/kg de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) reduce significativamente el crecimiento de los tumores subcutáneos del fibrosarcoma HT-1080.
Figura 40. La capacidad de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) para inhibir el crecimiento del tumor del glioma C6 in vivo. El tratamiento de los ratones SCID en días alternos o 2 veces a la semana con unas dosis de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) de simplemente 2,5 mg/kg reduce significativamente el crecimiento de los tumores subcutáneos del glioma C6.
Figura 41. Hiperpermeabilidad uterina inducida por el FCEV. La inyección de PMSG (5 IU) por vía subcutánea para inducir la ovulación en las ratas hembras prepuberales da lugar a un aumento rápido de estradiol tras 2 días, que a su vez causa una inducción del FCEV en el útero. Esta inducción da lugar a la hiperpermeabilidad del útero y a un aumento en la humedad del útero. La inyección subcutánea de la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) a 25 mg/kg una hora después de la inyección de PMSG da lugar a una inhibición de casi el 50% del aumento en peso húmedo del útero.
Figura 42A-42B. Evaluación de la angiogénesis del cuerpo lúteo con el uso de progesterona como sistema de lectura. Se inyectó PMSG por vía subcutánea (5 IU) para inducir la ovulación en ratas hembras prepuberales, lo que dio lugar a un cuerpo lúteo completamente funcional y que contenía una red densa de vasos sanguíneos que segrega progesterona en el torrente circulatorio para preparar el útero para la implantación. La inducción de la angiogénesis en el cuerpo lúteo requiere el FCEV. Los niveles en reposo de la progesterona son aproximadamente del 5 ng/ml y se pueden inducir hasta 25-40 ng/ml tras PMSG. La inyección subcutánea de la Flt1(1-3)-Fc (A40) o de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
a 25 mg/kg o a 5 mg/kg 1 hora después de la inyección de PMSG dio lugar a la inhibición completa de la inducción de la progesterona en el día 4.
Descripción detallada de la invención
Ha sido un problema de gran importancia en la técnica producir un antagonista del FCEV basado en su receptor que tenga un perfil farmacocinético que sea adecuado para considerar al antagonista como un candidato terapéutico. Los solicitantes describen en la presente invención, por primera vez, una molécula polipeptídica quimérica, capaz de antagonizar la actividad del FCEV, que muestra una mejora de las propiedades farmacocinéticas en comparación con otros conocidos antagonistas del FCEV basados en su receptor. Las moléculas del polipéptido quimérico descritas en la presente invención proporcionan, así, por primera vez moléculas adecuadas para usarlas en tratamientos en los que se desea un resultado antagonista del FCEV.
La presente invención proporciona nuevas moléculas polipeptídicas quiméricas formadas por la fusión de un dominio extracelular modificado de unión al ligando del receptor Flt1 con la región Fc de la IgG.
El dominio extracelular de unión al ligando se define como la porción de un receptor que, en su conformación nativa en la membrana celular, se orienta extracelularmente, donde puede contactar con su ligando cognado. El dominio extracelular de unión al ligando no incluye los aminoácidos hidrófobos asociados al dominio transmembranario del receptor o a cualquiera de los aminoácidos asociados al dominio intracelular del receptor. Por lo general, el dominio intracelular o citoplásmico de un receptor se compone normalmente de aminoácidos cargados positivamente o polares (a saber, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico). Los 15 a 30 aminoácidos precedentes, aminoácidos predominantemente hidrófobos o aminoácidos apolares (a saber, leucina, valina, isoleucina y fenilalanina) comprenden el dominio transmembranario. El dominio extracelular comprende los aminoácidos que preceden el tramo transmembranario hidrófobo de aminoácidos. Normalmente, el dominio transmembranario está flanqueado de unos aminoácidos cargados positivamente o aminoácidos polares tales como la lisina o la arginina. von Heijne ha publicado unas normas detalladas que citan corrientemente los expertos en la técnica cuando determinan qué aminoácidos de un receptor determinado pertenecen a los dominios extracelular, transmembranario o intracelular (véase von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25-30). Alternativamente, las páginas en Internet, tales como http://uirec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html están disponibles para proporcionar a los químicos de proteínas información sobre cómo hacer predicciones acerca de los dominios de las proteínas.
La presente invención proporciona la construcción de unas moléculas de ácido nucleico que codifican moléculas polipeptídicas quiméricas que se introducen en un vector que puede expresar las moléculas del polipéptido quimérico cuando se introducen en una célula hospedadora apropiada. Las células hospedadoras apropiadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas, células de levadura, células de insectos y células de mamíferos. Cualquiera de los métodos conocidos por el experto en la técnica para introducir los fragmentos de ADN en un vector se pueden utilizar para construir los vectores de expresión que codifican las moléculas del polipéptido quimérico bajo el control de señales de control transcripcional/traduccional. Estos métodos pueden incluir técnicas in vitro de ADN recombinante y sintético y recombinaciones in vivo (recombinación genética) (véase Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY).
La expresión de las moléculas de ácido nucleico que codifican las moléculas del polipéptido quimérico se pueden regular por una segunda secuencia de ácido nucleico, por lo que la molécula del polipéptido quimérico se expresa en un huésped transformado con la molécula del ADN recombinante. Por ejemplo, la expresión de las moléculas de polipéptido quimérico descritas en la presente invención se puede controlar mediante cualquier elemento promotor/potenciador conocido en la técnica. Los promotores que se pueden usar para controlar la expresión de las moléculas de polipéptido quimérico incluyen, pero no se limitan a, la repetición terminal larga como se describe en Squinto et al., (1991, Cell 65: 1-20); la región del promotor temprano de SV40 (Bernoist y Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), el promotor CMV, la repetición terminal 5' del M-MuLV, el promotor contenido en la repetición terminal 3' larga del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-797), el promotor de la timidina cinasa del herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 78: 144-1445), las secuencias reguladoras del gen de la metalotionina (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42); los vectores de expresión en procariotas tales como el promotor de la \beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75: 3727-3731), o el promotor tac (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 80: 21-25, véase, también, "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980,242: 74-94); elementos de los promotores de levaduras o de otros hongos, tales como el promotor de Gal4, el promotor de la alcohol deshidrogenasa (ADH), el promotor de la fosfoglicerol cinasa (PGK), el promotor de la fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional de animales, que muestran una especificidad de tejido y que se han utilizado en los animales transgénicos: la región de control del gen de la elastasa I que es activa en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); la región de control del gen de la insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315: 115-122), la región de control del gen de la inmunoglobulina que es activa en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), la región de control del virus del tumor mamario de ratones que es activa en las células de los testículos, de la mama, linfoides y en los mastocitos (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), la región de control del gen de la albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), la región del control del gen de la alfa-fetoproteína que es activa en el hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); la región de control del gen de la á1-antitripsina que es activa en el hígado (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), la región de control del gen de la \beta-globina que es activa en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); la región de control del gen de la proteína básica de la mielina que es activa en los oligodendrocitos del cerebro (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); la región de control del gen de la cadena ligera 2 de la miosina que es activa en el músculo estriado (Shani, 1985, Nature 314: 283-286), y la región de control del gen de la gonadoliberina que es activa en el hipotálamo (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
Así, según la invención, los vectores de expresión capaces de replicarse en un hospedador bacteriano o eucariótico que comprende una molécula polipeptídica que codifica un ácido nucleico tal y como se describe en la presente invención se usan para transfectar el hospedador y, por lo tanto, para dirigir la expresión de tales ácidos nucleicos para producir las moléculas polipeptídicas quiméricas, que luego se pueden recuperar en una forma biológicamente activa. Tal como se usa en la presente invención, una forma biológicamente activa incluye una forma capaz de unirse al FCEV.
Los vectores de expresión que contienen las moléculas quiméricas de ácido nucleico descritas en la presente invención se pueden identificar mediante tres enfoques generales: a) hibridación ADN-ADN, b) presencia o ausencia de las funciones de los genes "marcadores" y c) expresión de las secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión se puede detectar mediante la hibridación ADN-ADN que utiliza sondas que comprenden secuencias que son homólogas a las secuencias de la molécula polipeptídica quimérica insertada. En el segundo enfoque, el sistema vector recombinante/hospedador se puede identificar y seleccionar en base a la presencia o la ausencia de determinadas funciones de los genes "marcadores" (p. ej; actividad de la timidina cinasa, resistencia a los antibióticos, fenotipo transformante, formación de cuerpos de oclusión en baculovirus, etc.) causadas por la introducción de genes foráneos en el vector. Por ejemplo, si la secuencia del ADN de la molécula polipeptídica quimérica se introduce dentro de la secuencia del gen del marcador del vector, se pueden identificar los recombinantes que contienen el inserto por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer enfoque, los vectores de expresión recombinantes se pueden identificar mediante el análisis del producto del gen foráneo expresado por el recombinante. Tales ensayos se pueden basar, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de las moléculas polipeptídicas quiméricas.
Las células de la presente invención pueden expresar transitoriamente o, preferiblemente, constitutiva y permanentemente las moléculas del polipéptido quimérico.
Las moléculas polipeptídicas quiméricas se pueden purificar mediante cualquier técnica que permita la formación subsiguiente de una molécula polipeptídica quimérica estable y biológicamente activa. Por ejemplo, y no por limitación, los factores se pueden recuperar de células como proteínas solubles o como cuerpos de inclusión, de los que se pueden extraer cuantitativamente con hidrocloruro de guanidinio a 8 M y diálisis (véase, por ejemplo, Builder, et al., patente de los EEUU n.º 5663304). Para purificar más estos factores se pueden usar la cromatografía de intercambio iónico convencional, la cromatografía de interacciones hidrófobas, la cromatografía en fase inversa o la filtración en gel.
En una realización de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica el primer componente se encuentra hacia 5' de la secuencia nucleotídica que codifica el segundo componente. En otra realización de la invención, la secuencia nucleotídica que codifica el primer componente se encuentra hacia 3' de la secuencia nucleotídica que codifica el segundo componente. Se pueden preparar realizaciones adicionales de la invención en las que se reorganiza el orden del primer, segundo y tercer componentes del polipéptido de fusión. Por ejemplo, si la secuencia nucleotídica que codifica el primer componente se designa como 1, la secuencia nucleotídica que codifica el segundo componente se designa como 2 y la secuencia nucleotídica del tercer componente se designa como 3, entonces, el orden de los componentes en el ácido nucleico aislado de la invención, leído de 5' a 3', puede ser cualquiera de las seis combinaciones siguientes: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ó 3,2,1.
La presente invención también tiene utilidades diagnósticas y terapéuticas. Los métodos para detectar las aberraciones en la función o en la expresión de las moléculas polipeptídicas quiméricas descritas en la presente invención se pueden usar en el diagnóstico de enfermedades. La manipulación de las moléculas polipeptídicas quiméricas o los agonistas o los antagonistas que se unen a las moléculas polipeptídicas quiméricas se pueden usar para tratar enfermedades. En realizaciones adicionales, se utiliza la molécula polipeptídica quimérica como un fármaco para bloquear la unión de un ligando de unión a su diana.
Como ejemplo, pero no de manera limitante, la invención puede ser útil para tratar las dolencias clínicas que se caracterizan por permeabilidad vascular, edema o inflamación tales como el edema cerebral asociado con una lesión, un accidente cerebrovascular o un tumor; el edema asociado con enfermedades inflamatorias tales como la soriasis o la artritis, que incluye la artritis reumatoide; el asma; el edema generalizado asociado con escozor; la ascitis y el derrame pleural asociados con los tumores, la inflamación o los traumatismos; la inflamación crónica de las vías respiratorias; el síndrome de pérdida por los capilares; la septicemia; la nefropatía asociada con el aumento de pérdidas de proteína; y cualquier enfermedad ocular tales como la degeneración macular relacionada con la edad y la retinopatía diabética.
Un análisis de la secuencia de aminoácidos de Flt1(1-3)-Fc reveló la presencia de un número inusualmente elevado (46) del resto aminoacídico básico lisina. Un análisis por IEF de la Flt1(1-3)-Fc mostró que esta proteína tiene un pI mayor de 9,3, lo que confirma la predicción de que la proteína es muy básica. Se planteó la hipótesis de que la naturaleza básica de la proteína Flt1(1-3)-Fc estaba haciendo que se uniera a los componentes de la matriz extracelular y que esta interacción podría ser la causa de la extremadamente corta semi-vida detectable en el suero en circulación presentada por Flt1(1-3)-Fc cuando se inyectaba en ratones. Para probar esta hipótesis, se acetiló la proteína Flt1(1-3)-Fc en los restos de lisina para reducir la carga básica. Luego se probó la Flt1(1-3)-Fc acetilada en los análisis descritos más abajo.
Los ejemplos siguientes se ofrecen de manera ilustrativa y no de manera limitante.
Ejemplos Ejemplo 1 Expresión de la proteína Flt1(1-3)-Fc en las células CHO K1
Con el uso de las técnicas estándares de biología molecular [véase, p. ej; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel,
et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)], se introdujo el gen que codifica la Flt1(1-3)-Fc en el vector de expresión pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) en un sitio de clonación múltiple hacia 3' del promotor CMV. Las células CHO K1 se transfectaron con la construcción de ADN pEE14.1/Flt1(1-3)-Fc usando la lipofectamina (Gaithersburg, MD). Se cultivaron las células CHO K1 en DMEM sin glutamina (JRH, Kansas City, MO) que contenía sulfoximina de metionina (MSX).a 25 \muM de Sigma Inc, St. Louis, MO, y se obtuvieron unas expresiones elevadas de la proteína recombinante mediante la detección sistemática de los sobrenadantes de las células CHO K1 de aproximadamente 100 aislados de colonias picadas manualmente, usando un inmunoanálisis estándar con el que se captura y se detecta la Fc humana. El clon seleccionado picado manualmente se amplificó en presencia de MSX a 100 \muM a lo que siguió una segunda serie de detecciones sistemáticas de los clones amplificados. El clon que más produjo tuvo una productividad específica de proteína recombinante Flt1(1-3)-Fc de 55 pg/(célula\cdotdía).
El clon seleccionado se amplió en matraces T de 225 cm^{2} (Corning, Acton, MA) y, luego, en frascos cilíndricos de 8,5 l (Corning, Acton, MA) usando los medios de cultivo celular descritos más arriba. Se extrajeron las células de los frascos cilíndricos mediante la tripsinización estándar y se introdujeron en 3,5 l del medio en suspensión. El medio de suspensión comprende un medio de ISCHO sin glutamina (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contiene un 5% de suero bovino fetal (FBS de Hyclone Labs, Logan, UT), MSX a 100 \muM y un suplemento de GS (JRH Scientific, Kansas City, MO) en un biorreactor Celligen (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) de 5 l a una densidad de 0,3 x 10^{6} células/ml. Una vez que las células alcanzaron una densidad de 3,6 x 10^{6} células/ml y se adaptaron a la suspensión, se transfirieron a un biorreactor de 60 l (ABEC, Allentonwn, PA) a una densidad de 0,5 x 10^{6} células/ml en 20 l de medio ISCHO con suero bovino fetal al 5%. Tras dos días, se añadieron al biorreactor 20 l adicionales de ISCHO con suero bovino fetal al 5%. Se dejaron crecer las células durante dos días más, con lo que se alcanzó una densidad final de 3,1 x 10^{6} células/ml y la concentración final de Flt1(1-3)-Fc cuando se recogió fue de 95 mg/l. En la recogida, se retiraron las células mediante la filtración con flujo tangencial usando unos filtros Prostak de 0,45 \mum (Millipore, Inc., Bedford, MA).
Ejemplo 2 Purificación de la proteína Flt1(1-3)-Fc obtenida de las células CHO K1
La proteína Flt1(1-3)-Fc se purificó inicialmente mediante cromatografía de afinidad. Se utilizó una columna de proteína A para unir, con una especificidad elevada, la porción Fc de la molécula. Luego, esta proteína purificada por afinidad se concentró y se pasó por una columna de CET. Luego, se eluyó la proteína en el tampón de formulación. A continuación, se describen estos procedimientos en detalle.
Materiales y métodos
Todas las sustancias químicas se obtuvieron de J. T. Baker, Phillipsburg, NJ con la excepción del PBS, que se obtuvo como un concentrado 10X de Life Technologies, Gaithersburg, MD. Las resinas de grado de preparación Superdex 200 y de flujo rápido con la proteína A se obtuvieron de Pharmacia, Piscataway, NJ. El equipo y las membranas para la concentración de la proteína se obtuvieron de Millipore, Bedford, MA.
Aproximadamente 40 l del medio acondicionado de CHO filtrado de 0,45 \mum que contenía la proteína Flt1(1-3)-Fc se aplicaron a una columna de flujo rápido con proteína A de 290 ml (diámetro de 10 cm) que se había equilibrado con PBS. Se lavó la columna con PBS que contenía NaCl a 350 mM y CHAPS al 0,02%, y la proteína obtenida se eluyó con ácido cítrico a 20 mM que contenía Na_{2}HPO_{4} a 10 mM. El único pico de la elución se recogió y su pH llevó a la neutralidad con NaOH a 1 M. Las fracciones eludidas se concentraron hasta aproximadamente 9 mg/ml utilizando membranas de celulosa regeneradas 10K mediante la filtración con flujo tangencial y mediante la concentración de células en agitación. Para retirar los agregados y otros contaminantes, la proteína concentrada se aplicó en una columna empaquetada con una resina de grado de preparación Superdex 200 (10 cm x 55 cm) y se hizo funcionar en PBS que contenía glicerol al 5%. Se reunieron las fracciones del pico principal, se filtraron en esterilidad, se distribuyeron en alícuotas y se almacenaron a -80ºC.
Ejemplo 3 Acetilación de la proteína Flt1(1-3)-Fc
Se acetilaron 2 mg de la proteína Flt1(1-3)-Fc tal como se describe en el manual de instrucciones proporcionado con el kit de modificación con sulfo-NHS-acetato (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. n.º 26777).
Ejemplo 4 Caracterización de la proteína Flt1(1-3)-Fc acetilada a) Análisis de IEF
Se analizaron la Flt1(1-3)-Fc y la Flt1(1-3)-Fc acetilada mediante un análisis por IEF estándar. Tal como se muestra en la figura 1, la proteína Flt1(1-3)-Fc no puede migrar en el gel y, por lo tanto, debe tener un pI mayor que 9,3, el mayor pI en el estándar. No obstante, la Flt1(1-3)-Fc acetilada puede migrar en el gel y equilibrarse a un pI de aproximadamente 5,2. Este resultado demuestra que la acetilación reduce la carga positiva neta de la proteína y, por lo tanto, su pI considerablemente.
b) Unión a los componentes de la matriz extracelular
Para probar la unión a los componentes de la matriz extracelular, se probaron la Flt1(1-3)-Fc y la Flt1(1-3)-Fc acetilada en un análisis diseñado para imitar la interacción con los componentes de la matriz extracelular. En este análisis, las placas de cultivo de tejido de 96 pocillos están recubiertas con Matrigel® (placa de 96 pocillos con una capa delgada de matriz de Biocoat MATRIGEL®, n.º de catálogo 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Se incuban las placas con las distintas concentraciones de Flt1(1-3)-Fc, la Flt1(1-3)-Fc acetilada o la proteína rTie2-Fc (un control irrelevante) que se añaden a los pocillos. Las placas se incuban de 1 a 2 horas a temperatura ambiente o a 37ºC y luego se lleva a cabo la detección de las proteínas unidas añadiendo a los pocillos un anticuerpo secundario anti-Fc humana conjugado a la fosfatasa alcalina. Finalmente, el sustrato de la fosfatasa alcalina se añade a los pocillos y se mide la densidad óptica. La figura 2 muestra los resultados de este ensayo. Al igual que la proteína de control irrelevante rTie2-Fc, la Flt1(1-3)-Fc acetilada no muestra ninguna unión a la placa recubierta de Matrigel®, mientras que la proteína Flt1(1-3)-Fc sin acetilar muestra una unión significativa. Este resultado indica que la acetilación de los restos de aminoácidos básicos es un modo eficaz de interferir con las interacciones entre cargas que existen entre las proteínas cargadas positivamente y los componentes de la matriz extracelular cargados negativamente que se exponen in vivo.
Ejemplo 5 Pegilación de la proteína Flt1(1-3)-Fc
Aunque se ha demostrado que la pegilación (polietilenglicol: PEG) de las proteínas aumenta su potencia in vivo al aumentar la estabilidad y la biodisponibilidad al mismo tiempo que se minimiza su inmunogenia (véanse las referencias citadas más arriba), es opuesto a la intuición de que las moléculas pegiladoras que son demasiado grandes para ser filtradas por los glomérulos renales mejorarían sus propiedades farmacocinéticas. Sin estar unidos en teoría, los solicitantes postularon que la pegilación de las moléculas de Flt1(1-3)-Fc podrían mejorar las propiedades farmacocinéticas, posiblemente no alterando la carga positiva o reduciendo el pI de la Flt1(1-3)-Fc, sino más bien protegiendo físicamente las cargas positivas de la interacción con la matriz extracelular. Los solicitantes decidieron intentar mejorar las propiedades farmacocinéticas de las moléculas de Flt1(1-3)-Fc agregando cadenas de PEG de 20K tal como se describe más abajo.
Materiales y métodos
La Flt1(1-3)-Fc purificada obtenida de las células CHO (véase más arriba) se usó en los siguientes experimentos de pegilación. Los PEG funcionalizados se obtuvieron de Shearwater Polymers, Huntsville, AL; la bicina de Sigma, St Louis, MO; la columna de Superose 6 de Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS como un concentrado 10X de Life Technologies, Gaithersburg, MD; el glicerol de J. T. Baker, Phillipsburg, NJ; y los geles prefundidos en Bis-Tris de Novex, CA.
Las cadenas de PEG 20K funcionalizadas con restos terminales específicos de aminos se utilizaron en estudios de reacciones a pequeña escala que se pusieron a punto para evaluar las diferentes condiciones de reacción en las que varió la estequiometría del PEG:proteína. Sobre la base de estas reacciones y de los análisis de las muestras en un SDS-PAGE estándar, se hizo reaccionar Flt1(1-3)-Fc en una concentración de 1,5 mg/ml a un pH de 8,1 con moléculas de SPA-PEG 20K (succinimidil-propionato de PEG) en una proporción molar PEG:monómero de Flt1(1-3)-Fc de 1:6. Se permitió continuar la reacción a 8ºC durante la noche. Para la purificación inicial, los productos de la reacción se aplicaron en una columna Superose 6 de 10 mm x 30 cm equilibrada con PBS que contiene glicerol al 5%. La columna pareció separar las moléculas de Flt1(1-3)-Fc pegilada en base al grado la pegilación. Se agruparon las fracciones que correspondían a lo que parecía ser primeramente una Flt1(1-3)-Fc dimérica monopegilada y dipegilada, a juzgar por el patrón de bandas en los geles reductores y no reductores de la SDS-PAGE. Se determinó la concentración de la proteína midiendo la absorbencia a 280 nm. La proteína Flt1(1-3)-Fc pegilada se filtró en esterilidad, se distribuyó en alícuotas y se almacenó a -40ºC.
Ejemplo 6 Unión de Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada y pegilada en un análisis basado en Biacore
Se probaron las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada y pegilada en un ensayo basado en Biacore para evaluar su capacidad para unirse al ligando de Flt1, el FCEV. En este análisis, la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar se inmovilizó en la superficie de un chip Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para los procedimientos estándares) y una muestra que contenía 0,2 \mug/ml del FCEV y bien la Flt1-(1-3)-Fc sin modificar, la Flt1 (1-3)-Fc acetilada o la Flt1 (1-3)-Fc pegilada (cada una a 25 \mug/ml) se pasó sobre el chip recubierto con la Flt1(1-3)-Fc. Para minimizar los efectos de la unión inespecífica, las muestras unidas se lavaron con una solución de NaCl 0,5 M. En una muestra, se mezcló la Flt1(1-3)-Fc sin modificar con heparina. La heparina es una molécula cargada negativamente y la proteína Flt1(1-3)-Fc es una molécula cargada positivamente, por lo que cuando se ponen juntas las dos moléculas, deben interaccionar por medio de sus respectivas cargas. Esto neutraliza esencialmente la carga inherente de la Flt1(1-3)-Fc, lo que hace que la molécula se comporte como si se hubiera modificado química o genéticamente de manera que se redujera su carga y su tendencia a unirse a través de las interacciones de las cargas. Tal como se muestra en la figura 3, las Flt1(1-3)-Fc acetiladas (columnas 13 a 16), pegiladas (columnas 17 a 20) y tratadas con heparina (columnas 21 a 24) son capaces cada una de competir completamente con la Flt1(1-3)-Fc unida al chip Biacore por unirse al FCEV, cuando se comparan con la proteína de control (columnas 1 a 4) y una proteína irrelevante (columnas 5 a 8). La Flt1(1-3)-Fc sin modificar (columnas 5 a 6) parece competir sólo parcialmente con la Flt1(1-3)-Fc unida al chip Biacore por unirse al FCEV. Sin embargo, lavar las muestras de unión con NaCl a 0,5 M (columnas 7 a 8) dio lugar a un perfil de unión similar al de las formas modificadas de Flt1(1-3)-Fc, lo que indica que la proteína sin modificar mostraba una unión inespecífica al chip que se podía eliminar por un lavado con sales.
Ejemplo 7 Unión de Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada y pegilada en un análisis basado en ELISA
Se probaron las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada y pegilada en un análisis estándar basado en ELISA para evaluar su capacidad para unirse al FCEV, el ligando del receptor Flt1. Tal como se muestra en la figura 4, tanto la proteína Flt1(1-3)-Fc pegilada como la acetilada son capaces de unirse al FCEV, lo que demuestra que modificar la proteína bien mediante pegilación o bien por acetilación no destruye su capacidad para unirse a su ligando.
Ejemplo 8 Análisis farmacocinético de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, de la Flt1(1-3)-Fc acetilada y de la Flt1(1-3)-Fc pegilada
Se diseñaron experimentos in vivo para evaluar los perfiles farmacocinéticos de la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar, la proteína Flt1(1-3)-Fc acetilada y la proteína Flt1(1-3)-Fc pegilada. A los ratones Balb/c (23-28 g; 3 ratones/grupo) se les inyectaron por vía subcutánea 4 mg/kg de Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada o pegilada. Los ratones se sangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días de la inyección de la proteína. Se analizaron los sueros con un análisis estándar basado en ELISA diseñado para detectar la proteína Flt1(1-3)-Fc. Brevemente, el análisis implica recubrir una placa del ELISA con FCEV, unir los sueros que contienen la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada o pegilada y delatarlas con un anticuerpo anti-Fc unido a la fosfatasa alcalina. Tal como se muestra en la figura 5, el T_{max} de todas las proteínas Flt1(1-3)-Fc estuvo entre los puntos de 6 horas y 24 horas. La C_{max} de las diferentes proteínas fue la siguiente: sin modificar: 0,06 \mug/ml a 0,15 \mug/ml; acetilada: 1,5 \mug/ml a 4,0 \mug/ml; y pegilada: aproximadamente 5 \mug/ml.
Ejemplo 9 Acetilación progresiva de la Flt1(1-3)-Fc
Para determinar qué cantidad mínima de acetilación se necesita para eliminar la unión a los componentes de la matriz extracelular, se diseñó un experimento que acetiló la proteína Flt1(1-3)-Fc de un modo escalonado con el uso de cantidades en aumento del exceso molar del reactivo de acetilación en la mezcla de reacción de acetilación. El margen del exceso molar fue el siguiente: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, y 100 moles del reactivo de acetilación por 1 mol del monómero de Flt1(1-3)-Fc. Las reacciones se llevaron a cabo tal como se detalla en el manual de instrucciones proporcionado con el kit de modificación sulfo-NHS-acetato (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. n.º 26777).
Ejemplo 10 Caracterización de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente a) Análisis por IEF
La Flt1(1-3)-Fc sin modificar y la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente se analizaron mediante un análisis estándar por IEF. Tal como se muestra en la figura 6A-6B, la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar no pudo migrar en el gel debido a su pI extremadamente elevado (mayor de 9,3). No obstante, la mayoría de las muestras de Flt1(1-3)-Fc acetiladas progresivamente (muestras con un exceso moral de 30 a 100 veces) pudieron migrar en el gel y equilibrarse a pI en un intervalo entre 4,55 y 8,43, según el grado de acetilación de la proteína. Este resultado demuestra que la acetilación puede cambiar la carga positiva de la proteína de una forma dependiente de la dosis y que la reducción del pl se puede controlar mediante el control del grado de acetilación.
b) Unión de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente a los componentes de la matriz extracelular
Para probar la unión a los componentes de la matriz extracelular, la Flt1(1-3)-Fc y la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente se probaron en el análisis descrito más arriba para imitar la interacción con los componentes de la matriz extracelular. Se añadieron diferentes concentraciones tanto de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar, como de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente (muestras a un exceso molar de 10, 20 y 30 veces) o bien de la proteína rTie2-Fc (un control irrelevante) a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 ó 2 horas a temperatura ambiente o a 37ºC y luego se llevó a cabo la detección de las proteínas unidas añadiendo a los pocillos un anticuerpo secundario anti-Fc humano conjugado con la fosfatasa alcalina. Posteriormente, se añadió el sustrato de la fosfatasa alcalina a los pocillos y se midió la densidad óptica. La figura 7 muestra los resultados de este análisis. Al igual que la proteína de control irrelevante rTie2-Fc, la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente (muestras a un exceso molar de 20 y 30 veces) no mostró unión significativa alguna a la placa recubierta de Matrigel®, mientras que la proteína Flt1(1-3)-Fc sin acetilar mostró una unión significativa. La unión es saturable, lo que indica que la proteína Flt1(1-3)-Fc puede unirse a los sitios específicos, y no a una interacción más general mediada por la carga que podría no ser saturable. La muestra a un exceso molar de 10 veces mostró una unión reducida, pero el grado de la acetilación no fue suficiente para bloquear completamente la unión a los componentes de la matriz extracelular. Las muestras a un exceso molar de 20 veces o más no mostraron ninguna unión detectable, a pesar del hecho de que, mediante el análisis por IEF (figuras 6A y 6B) las muestras con el menor exceso molar todavía tenían una carga positiva neta elevada. Este resultado demuestra que no es necesario acetilar completamente todos los aminoácidos básicos disponibles para eliminar la unión a los componentes de la matriz extracelular.
c) Unión de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente en un análisis basado en Biacore
Las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y acetilada progresivamente se probaron en un análisis basado en Biacore para evaluar su capacidad para unirse al ligando de Flt1, el FCEV. En este análisis, la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar (0,5, 1,0 ó 5,0 \mug/ml) se inmovilizó en la superficie de un chip Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para los procedimientos estándares) y se le pasó una disolución que contenía FCEV a 0,2 \mug/ml y bien la Flt1(1-3)-Fc sin modificar (a 0,5, 1,0 ó 5,0 \mug/ml) o 10 muestras diferentes de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente (a 0.5,1.0 ó 5,0 \mug/ml cada una) sobre el chip recubierto con la Flt1(1-3)-Fc. Tal como se muestra en la figura 8, en una proporción subestequiométrica (0,5 \mug/ml de bien de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar o de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente frente a FCEV a 0,2 \mug/ml), no hay suficiente Flt1(1-3)-Fc (tanto sin modificar como acetilada progresivamente) en la disolución para unir todo el FCEV. A 1,0 \mug/ml, que se aproxima a la proporción estequiométrica de 1:1, ambas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y acetilada progresivamente son capaces de competir por la unión del FCEV, pero todavía no hay suficiente proteína Flt1(1-3)-Fc (tanto sin modificar como acetilada progresivamente) como para saturar completamente el FCEV disponible. Sin embargo, a 5,0 \mug/ml, que es varias veces mayor que una proporción estequiométrica de 1:1, tanto la proteína Flt1(1-3)-Fc como la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente son capaces de unir el FCEV, independientemente del grado de acetilación. Esto demuestra, claramente que la acetilación no altera la capacidad de la Flt1(1-3)-Fc para unirse al FCEV.
d) Análisis farmacocinético de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente
Se diseñaron experimentos in vivo para evaluar los perfiles farmacocinéticos de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar y de la proteína Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente. A los ratones Balb/c (23-28 g) se les inyectó por vía subcutánea 4 mg/kg de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar o muestras de la Flt1(1-3)-Fc acetilada progresivamente en un exceso de 10, 20, 40, 60 y 100 veces (3 ratones para las muestras sin modificar y a un exceso molar de 10, 20 y 40 veces, y 2 ratones para las muestras a un exceso molar de 60 y 100 veces). Los ratones se sangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días de la inyección. Se analizaron los sueros en un análisis basado en ELISA diseñado para detectar la Flt1(1-3)-Fc (descrito más arriba). La figura 9 detalla los resultados de este estudio. El T_{max} de todas las proteínas Flt1(1-3)-Fc probadas estuvo en el punto de 6 horas pero la C_{max} fue como sigue: Flt1(1-3)-Fc sin modificar: 0,06 \mug/ml; muestra a un exceso molar de 10 veces: 0,7 \mug/ml, muestra a un exceso molar de 20 veces: 2 \mug/ml, muestra a un exceso molar de 40 veces: 4 \mug/ml, muestra a un exceso molar de 60 veces: 2 \mug/ml, muestra a un exceso molar de 100 veces: 1 \mug/ml. Este resultado demuestra que la acetilación o la pegilación de la Flt1(1-3)-Fc mejora significativamente su perfil farmacocinético.
Ejemplo 11 Construcción del mutante de deleción de la región básica de la Flt1(1-3)-Fc denominado como Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1
Sobre la base de la observación de que la Flt1(1-3)-Fc, que tiene un pI por debajo de 6, tiene una mejor farmacocinética que la Flt(1-3)-Fc sin modificar muy positiva (pI > 9,3), se cuestionó si la diferencia en la farmacocinética se podía atribuir a la carga neta de la proteína, lo que hacía que se adhiriera a los componentes de la matriz extracelular cargados negativamente, o si, quizás, había unas ubicaciones específicas en la superficie de la proteína Flt1(1-3)-Fc que constituían unos sitios específicos de unión para los componentes de la matriz extracelular. Por ejemplo, se sabe que muchas proteínas tienen unos sitios de unión para la heparina que, a menudo, consisten en un agrupamiento de restos básicos. Algunas veces, estos residuos se encuentran en un agrupamiento en la secuencia primaria de la proteína; alguna de la literatura ha identificado las "secuencias de consenso" de tales sitios de unión para la heparina (véase, por ejemplo, Hileman, et al., 1998, Bioessays 20 (2): 156-67). En otros casos, la estructura cristalizada conocida de una proteína revela un agrupamiento de restos cargados positivamente en la superficie de una proteína, pero los restos provienen de diferentes regiones de la secuencia primaria y sólo se unen cuando la proteína se pliega en su estructura terciaria. Así, es difícil deducir si un resto de aminoácido determinado forma parte de un agrupamiento de restos básicos en la superficie de la proteína. No obstante, si hay un agrupamiento de restos de aminoácidos cargados positivamente en la secuencia primaria, no es ilógico suponer que los restos están cercanos espacialmente uno a otro y, por lo tanto, podrían formar parte de un sitio de unión para los componentes de la matriz extracelular. Se ha estudiado extensamente el receptor Flt1 y se han descrito varios dominios (véase, por ejemplo, Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res 88: 867-876). En cuanto al ácido nucleico y a la secuencia de aminoácidos presentados en las figuras 10A a 10D de esta solicitud, se puede identificar la secuencia señal para la secreción, que se ubica al principio de la secuencia y que se extiende hasta la glicina codificada por los nucleótidos 76 a 78. La proteína madura comienza con Ser-Lys-Leu-Lys, que empieza en el nucleótido 79 de la secuencia del ácido nucleico. El dominio 1 Ig de Flt1 se extiende desde el nucleótido 79 hasta el 393, que termina con los aminoácidos Ser-Asp-Thr. El dominio 2 Ig de Flt1 se extiende desde el nucleótido 394 hasta el 687 (que codifica de Gly-Arg-Pro hasta Asn-Thr-Ile) y el dominio 3 Ig de la Flt1 se extiende desde el nucleótido 688 hasta el 996 (que codifica Ile-Asp-Val hasta Asp-Lys-Ala). Hay una secuencia de aminoácidos comunicante, Gly-Pro-Gly, codificada por los nucleótidos 997 a 1005, seguida de la secuencia de nucleótidos que codifica el Fc humano (nucleótidos 1006 a 1701 o los aminoácidos Glu-Pro-Lys a
Pro-Gly-Lys-fin).
Un análisis más detallado de la secuencia de aminoácidos de Flt1 revela que hay un agrupamiento, a saber, los residuos de aminoácidos 272 a 281 (KNKRASVRR) de la figura 10 A a 10D, en el que 6 de los 10 residuos de aminoácidos son básicos. Esta secuencia se ubica en el dominio 3 Ig del receptor Flt1 (véase la figura 11), que en sí misma no es esencial para la unión del ligando FCEV, pero que confiere una unión al ligando de mayor afinidad. Un alineamiento de la secuencia del dominio 3 Ig con la del dominio 2 Ig revela que en esta región se alinean muy mal los dos dominios Ig y que hay aproximadamente 10 aminoácidos de más en el dominio 3 Ig. Un análisis de los perfiles de hidrofilidad (software informático MacVector) de estos dos dominios indica claramente la presencia de una región hidrófila en la proteína (figura 12A-12B). Estas observaciones sacan a flote la posibilidad de que la conformación tridimensional real del dominio 3 Ig del Flt1 permitió algún tipo de protuberancia que no está en el dominio 2 Ig del Flt1. Para probar esta hipótesis, se eliminaron los 10 aminoácidos de más y se probó si la deleción en la proteína resultante afectaría la farmacocinética de manera favorable sin comprometer gravemente la afinidad del receptor por el FCEV. Esta construcción de ADN, que se elaboró utilizando las técnicas de biología molecular estándares (véase, p.ej; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)] en el vector de expresión de mamíferos pMT21 (Genetics Institute, Inc.,Cambridge, MA), se denomina Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1. La construcción Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 se derivó de la Flt1(1-3)-Fc mediante la deleción de los nucleótidos 814 a 843 (presentado en la figura 10A-10D),que elimina la secuencia muy básica de 10 aminoácidos Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg
del dominio 3 Ig del Flt1.
La secuencia de la construcción de ADN final se verificó secuenciándola con un secuenciador de ADN ABI 373A y el kit de secuenciación Taq Dideoxy Terminator Cycle (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La secuencia de Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 se presenta en la figura 13A-13D.
Ejemplo 12 Construcción del mutante de deleción de la región básica de Flt1(1-3)-Fc designado como Flt1 (2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2
Una segunda construcción mutante de deleción, designado como Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 se derivó de la construcción Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 por la deleción del dominio 1 Ig del Flt1 codificado por los nucleótidos 79 a 393 (véase la figura 10A-10 D); por conveniencia, los nucleótidos 73 a 78 (TCA GGT) se cambiaron por TCC GGA. Esto introdujo un sitio de restricción (BspE1) sin alterar la secuencia de aminoácidos asociada: Ser-Gly. A esta construcción de ADN, que se elaboró mediante las técnicas estándares de biología molecular (véase, p.ej; Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) en el vector de expresión en mamíferos pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), también se le verificó su secuencia usando un secuenciador de ADN ABI 373A y un kit de secuenciación Taq Dideoxy Terminator Cicle (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). La secuencia de Flt1
(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 se presenta en la figura 14A-14C.
Ejemplo 13 Construcción del mutante de deleción de Flt1(1-3)-Fc designado como Flt1(2-3)-Fc:Mut3
Una tercera construcción mutante de deleción, designada como Flt1(2-3)-Fc:Mut3, se construyó del mismo modo que la construcción Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2, excepto en que el dominio 3 Ig del Flt1 se dejó intacto (no se eliminaron los aminoácidos de la región básica). La construcción se elaboró mediante las técnicas de biología molecular estándares y la secuencia de la construcción final se verificó tal como se describió más arriba. La secuencia de Flt1(2-3)-Fc:Mut3 se presenta en la figura 15A-15C.
Ejemplo 14 Construcción del mutante de N-glucosilación de la región básica de la Flt1(1-3)-Fc designado como Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4
Se fabricó una construcción final en el que se introdujo un sitio de N-glucosilación en medio de la región básica del dominio 3 Ig del Flt1. Esta construcción se designó como Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 y se fabricó cambiando los nucleótidos 824 y 825 de GA a AC con lo que, consecuentemente, se cambió el resto de Arg (AGA) codificado en un resto de Asn (AAC) (véase la figura 10A-10D). Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos resultante se cambia de Arg-Ala-Ser a Asn-Ala-Ser, que corresponde a la señal canónica (Asn-Xxx-Ser/Thr) para la adición de un sitio de N-glucosilación en el residuo Asn. La secuencia de Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 se presenta en la figura 16A-16D.
Ejemplo 15 Caracterización de la Flt1(1-3)-Fc acetilada. Mutantes Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 y Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 a) Unión a los componentes de la matriz extracelular
Para determinar si era más o menos probable mejorar las propiedades farmacocinéticas de las tres proteínas modificadas, las placas de 96 pocillos recubiertas con Matrigel (como se describió más arriba) se incubaron con diferentes concentraciones de las proteínas mutantes y se detectaron con anticuerpos anti-Fc -humano conjugados con fosfatasa alcalina. Tal como se muestra en la figura 18, este experimento demostró que mientras la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar se podía unir ávidamente a estos pocillos, la proteína Flt1(2-3)-Fc:Mut3 se unía de manera algo más débil, la proteína Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 se unía de manera aún más débil y la proteína Flt1(2-3_{\Delta B})-Fc:Mut2 mostró el mejor perfil al unirse de manera más débil que cualquiera de las otras proteínas mutantes. La proteína mutante de glucosilación Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 mostró sólo un beneficio marginal en el análisis con Matrigel. Estos resultados confirman la hipótesis de que una secuencia lineal de aminoácidos positivos se puede eliminar de la secuencia primaria para dar lugar a una disminución en la interacción a través de las cargas con los componentes de la matriz extracelular.
b) Unión de Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 y de Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 en un análisis basado en Biacore
Las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar y acetiladas y las proteínas genéticamente modificadas Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 y Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 se probaron en un análisis basado en Biacore para evaluar su capacidad de unirse al ligando de Flt1: el FCEV. En este análisis, la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar (0,25, 0,5, ó 1,0 \mug/ml) se inmovilizó en la superficie de un chip de Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para los procedimientos estándares) y una solución que contiene FCEV a 0,1 \mug/ml y bien Flt1(1-3)-Fc sin modificar purificada o en un sobrenadante de células COS (a aproximadamente 0,25, 0,5 ó 1,0 \mug/ml), bien Flt1(1-3)-Fc acetilada purificada (a 0,25, 0,5 ó 1,0 \mug/ml), bien sobrenadante de células COS que contiene Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 (a aproximadamente 0,25, 0,5 ó 1,0 \mug/ml), o bien sobrenadante de células COS que contiene Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 (a aproximadamente 0,25, 0,5 ó 1,0 \mug/ml), se pasaron sobre el chip recubierto con la Flt1(1-3)-Fc. Tal como se muestra en la figura 17, a la proporción subestequiométrica [Flt1(1-3)-Fc de muestras sin modificar, acetiladas o genéticamente modificadas a 0,25 \mug/ml frente a FCEV a 1.0 \mug/ml] no hay suficiente proteína Flt1(1-3)-Fc para bloquear la unión del FCEV a la Flt1(1-3)-Fc inmovilizada en el chip de Biacore. A 0,5 \mug/ml de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada o genéticamente modificada, la proporción estequiométrica se aproxima a 1:1 y hay un aumento de la capacidad para bloquear la unión del FCEV al chip de Biacore. A 1,0 \mug/ml de las proteínas Flt1(1-3)-Fc sin modificar, acetilada o genéticamente modificada, que es aproximadamente una proporción estequiométrica de 10:1, las proteínas Flt1(1-3)-Fc son capaces de bloquear la unión del FCEV al chip de Biacore, pero no son equivalentes. La proteína Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc sin modificar, acetilada y :Mut1 son esencialmente iguales en su capacidad para bloquear la unión del FCEV, mientras que la Flt1(1-3_{R->N})-Fc:Mut4 es algo menos eficaz a la hora de bloquear la unión. Estos resultados confirman la hipótesis de que es posible reducir la unión no específica de una molécula cargada positivamente mediante la eliminación genética de una secuencia lineal de aminoácidos cargados predominantemente con carga negativa.
c) Unión de Flt1(1-3_{\Delta}B)-Fc:Mut1, Flt1(2-3_{\Delta}B)-Fc:Mut2 y Flt1(2-3)-Fc:Mut3 en un análisis basado en ELISA
Para determinar si las tres proteínas mutantes se podían unir al ligando del Flt1, el FCEV, se llevaron a cabo experimentos de unión en los que las placas de 96 pocillos recubiertas con el FCEV se incubaron con diferentes concentraciones de la proteína mutante respectiva y, tras el lavado, se detectó la cantidad de unión mediante la incubación con un anticuerpo anti-Fc humano conjugado a la fosfatasa alcalina y se cuantificó colorimétricalmente mediante la adición de un sustrato adecuado para la fosfatasa alcalina. Tal como se muestra en la figura 19, este experimento demostró que todas las proteínas mutantes se podían unir al FCEV de manera semejante, a las concentraciones probadas.
Ejemplo 16 Análisis farmacocinético de la Flt1(1-3)-Fc acetilada, de la Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 y de la Flt1(1-3)-Fc sin modificar
Se diseñaron experimentos in vivo para evaluar los perfiles farmacocinéticos de la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar, de Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 y de la proteína Flt1(1-3)-Fc acetilada a un exceso molar de 40 veces. A los ratones Balb/c (25-30 g) se les inyectó por vía subcutánea 4 mg/kg de la proteína Flt1(1-3)-Fc sin modificar, de la proteína Flt1(1-3)-Fc acetilada a un exceso molar de 40 veces y de la proteína Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc:Mut1 (4 ratones cada una). Estos ratones se sangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 5 días de la inyección. Los sueros se analizaron en un ELISA diseñado para detectar la proteína Flt1(1-3)-Fc, que implica recubrir una placa de ELISA con el FCEV, unir la Flt1(1-3)-Fc y delatar con un anticuerpo anti-Fc unido a la fosfatasa alcalina. Tal como se muestra en la figura 20, la C_{max} de estos reactivos fue la siguiente: Flt1(1-3)-Fc sin modificar: 0,15 \mug/ml ; Flt1(1-3)-Fc acetilada a un exceso molar de 40 veces: 1,5 \mug/ml; y Flt1(1-3_{\Delta B})-Fc: 0,7 \mug/ml.
Ejemplo 17 Construcción del vector del receptor Flt1 modificado
El fundamento teórico para construir las versiones modificadas del receptor Flt1 (también conocido como
RFCEV1) se basó en la observación de que la secuencia de la proteína del Flt1 era muy básica y, por lo tanto, tenía probabilidades de adherirse a la matriz extracelular (MEC). La naturaleza muy básica del Flt1 explica, probablemente, por qué la Flt1(1-3)-Fc sin modificar (descrita más arriba) tiene una peor farmacocinética que la hace difícil de usar como un fármaco terapéutico. Tal como se describió más arriba, la forma químicamente modificada de la Flt1(1-3)-Fc acetilada a un exceso molar de 40 veces, de aquí en adelante denominada A40, mostró un perfil farmacocinético (FC) muy mejorado frente a la Flt1(1-3)-Fc sin acetilar. Por lo tanto, se hicieron esfuerzos para construir unas moléculas de ADN que se pudieran usar para expresar por tecnología recombinante, unas formas modificadas de la molécula del receptor Flt1, que poseyeran el perfil FC mejorado mostrado por la A40 y que conservaran todavía la capacidad de unirse con firmeza al FCEV.
En la literatura, se sabe que el primer dominio Ig del Flt1 (que tiene una carga neta de +5 con pH neutro) no es esencial para la unión estrecha al FCEV, por lo que se eliminó este dominio. El tercer dominio Ig (que tiene una carga neta de +11) no es esencial para la unión, pero confiere una mayor afinidad por el FCEV que el segundo dominio Ig, por lo que en lugar de eliminarlo completamente, se reemplazó con los dominios equivalentes de los receptores de la familia de Flt1 Flk1 (también conocido como RFCEV2) y Flt4 (también conocido como RFCEV3). Estas moléculas quiméricas {denominadas R1R2 [Flt1.D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y RFCEVR2-Fc\DeltaC1(a)] y R1R3 [Flt1D2.RFCEV3D3-Fc\DeltaC1(a) y RFCEV1R3-Fc\DeltaC1(a)], respectivamente, en las que R1 y Flt1D2 se refieren al dominio 2 Ig del Flt1 (RFCEV1); R2 y Flk1D3 se refieren al dominio 3 Ig del Flk1 (RFCEV2); y R3 y RFCEV3D3 se refieren al dominio 3 Ig del Flt4 (RFCEV3)} se adhirieron mucho menos a la MEC, tal como se midió con un análisis de unión a la MEC in vitro tal como se describe más abajo, y tuvieron una FC muy mejorada tal como se describe más abajo. Además, estas moléculas pudieron unirse al FCEV con firmeza, tal como se describe más abajo, y bloquear la fosforilación del receptor Flk1 nativo expresado en las células endoteliales, tal como se describe más abajo.
a) Construcción del plásmido de expresión pFlt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
Los plásmidos de expresión pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519 pb) y pMT21.Flk-1(1-3).Fc (5230 pb) son plásmidos que codifican la resistencia a la ampicilina y versiones etiquetadas con Fc de los dominios 1 a 3 Ig del Flt1 humano y del Flk1 humano, respectivamente. Estos plásmidos se usaron para construir un fragmento de ADN que consiste en una fusión del dominio 2 Ig del Flt1 con el dominio 3 Ig del Flk1 mediante amplificación por PCR de los respectivos dominios Ig seguida de rondas adicionales de PCR para lograr la fusión de los dos dominios en un único fragmento. Para el dominio 2 Ig del Flt1, los cebadores para la amplificación desde 5' y desde 3' fueron los siguientes:
1
El cebador de la amplificación desde 5' codifica un sitio de restricción de la enzima BspEI hacia 5' del dominio 2 Ig del Flt1, definido por la secuencia de aminoácidos GRPFVEM (que corresponde a los aminoácidos 27 a 33 de la figura 21A-21C). El cebador 3' codifica la inversa complementaria del extremo 3' del dominio 2 Ig del Flt1 fusionado directamente al comienzo 5' del dominio 3 Ig de Flk1, con el punto de fusión definido como TIID del Flt1 (que corresponde a los aminoácidos 123 a 126 de la figura 21A-21C) y que continúa en el VVLS (que corresponde a los aminoácidos 127 a 130 de la figura 21A-21C) del Flk1.
Para el dominio 3 Ig del Flk1, los cebadores de la amplificación desde 5' y desde 3' fueron los siguientes:
2
El cebador de la amplificación desde 5' codifica el extremo del dominio 2 Ig del Flt1 fusionado directamente con el comienzo del dominio 3 Ig del Flk1, tal como se describió más arriba. El cebador de la amplificación desde 3' codifica el extremo del dominio 3 Ig del Flk1, definido por los aminoácidos VRVHEK (que corresponde a los aminoácidos 223 a 228 de la figura 21A-21C), seguido por una secuencia comunicante que incluye una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Srf1, y codifica los aminoácidos GPG. La secuencia comunicante corresponde a los aminoácidos 229 a 231 de la figura 21A-21C.
Tras una ronda de amplificación por PCR para producir los dominios individuales, se reunieron los productos en un tubo y se sometieron a una ronda adicional de PCR con los cebadores bsp/flt1D2 y Flk1D3/apa/srf.as (descritos más arriba) para generar el producto de fusión. Posteriormente, este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción BspEI y SmaI y el fragmento resultante de 614 pb se subclonó en los sitios de restricción BspEI a SrfI del vector pMT21/\DeltaB2.Fc para crear el plásmido pMT21/Flt1D2.Flk1D3.Fc. La secuencia de nucleótidos de la fusión génica Flt1D2-Flk1D3 insertada se verificó mediante un análisis de secuencias estándar. Luego, se digirió este plásmido con las enzimas de restricción EcoRI y SrfI y se transfirió el fragmento resultante de 702 pb a los sitios de restricción EcoRI a SrfI del plásmido pFlt1(1-3)B2-Fc\DeltaC1(a) para producir el plásmido pFlt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a). El ADN completo y las secuencias de aminoácidos deducidas de la molécula quimérica Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se presentan en la figura 21A-21C.
b) Construcción del plásmido de expresión pFlt1D2RFCEV3D3Fc\DeltaC1(a)
El plásmido de expresión pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519 pb) codifica la resistencia a la ampicilina y una versión de los dominios 1 a 3 Ig del receptor humano Flt1 etiquetados con Fc. Se usó este plásmido para producir por PCR un fragmento de ADN que contuviera el dominio 2 Ig del Flt1. Se usó el ARN de la estirpe celular HEL921.7 para producir el dominio 3 Ig de Flk1 mediante la metodología estándar de la RT-PCR. Se usó una ronda adicional de amplificación por PCR para lograr la fusión de los dos dominios Ig en un único fragmento fusionado. En el dominio 2 Ig del Flt1, los cebadores de la amplificación desde 5' y desde 3' fueron los siguientes:
3
El cebador de la amplificación desde 5' codifica un sitio de restricción para BspEI hacia 5' del dominio 2 Ig del Flt1, definido por la secuencia de aminoácidos GRPFVEM (que corresponde a los aminoácidos 27 a 33 de la figura 22A-22C). El cebador de la amplificación desde 3' codifica la complementaria inversa del extremo del dominio 2 Ig del Flt1 fusionado directamente al comienzo del domino 3 Ig del RFCEV3, con el punto de fusión definido como TIID del Flt1 (que corresponde a los aminoácidos 123 a 126 de la figura 22A-22C) y que continúa en el IQLL del RFCEV3 (que corresponde a los aminoácidos 127 a 130 de la figura 22A-22C).
Para el dominio 3 del RFCEV3, los cebadores de la amplificación desde 5' y desde 3' usados en la RT-PCR fueron los siguientes:
4
Los cebadores de la amplificación desde 5' y desde 3' se hibridan con la secuencia del RFCEV3. El producto de amplificación de 296 pb de esta reacción de RT-PCR se aisló mediante las técnicas estándares y se sometió a una segunda ronda de PCR para añadir las secuencias adecuadas que permiten fusionar el Flt1D2 con los dominios del Flk1D3 y fusionar el Flk1D3 y el dominio de Fc a través de un puente de GPG (véase más adelante). Se usaron los cebadores de amplificación siguientes:
5
El cebador de amplificación desde 5' codifica el extremo de 3' del dominio 2 Ig del Flt1 fusionado directamente al comienzo (extremo 5') del dominio 3 Ig del RFCEV3, tal como se describió más arriba. El cebador de la amplificación desde 3' codifica el extremo de 3' del dominio 3 Ig del RFCEV3, definido por los aminoácidos VIVHEN (que corresponden a los aminoácidos 221 a 226 de la figura 22A-21C), seguido de una secuencia comunicante que incluye una secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción de SrfI y que codifica los aminoácidos GPG. La secuencia comunicante corresponde a los aminoácidos 227 a 229 de la figura 22A-22C.
Tras una ronda (para el dominio 2 Ig del Flt1) o dos rondas (para el dominio 3 Ig del Flt4) de PCR para producir los dominios Ig individuales, los productos de la PCR se reunieron en un tubo y se sometieron a una ronda adicional de amplificación por PCR con los cebadores de amplificación bsp/fltlD2 y RFCEV3D3/srf.as, tal como se describió más arriba, para producir el producto de fusión. Posteriormente, este producto de PCR se digirió con las enzimas de restricción BspEI y SmaI y el fragmento resultante de 625 pb se subclonó en los sitios de restricción de BspEI a SrfI del vector pMT21/Flt1\DeltaB2.Fc (descrito más arriba) para crear el plásmido pMT21/Flt1D2.RFCEV3D3.Fc. La secuencia del inserto de la fusión génica Flt1D2-RFCEV3D se verificó mediante un análisis de secuencias estándar. Luego, este plásmido se digirió con las enzimas de restricción EcoRI y SrfI y el fragmento resultante de 693 pb se subclonó en los sitios de restricción de EcoRI a SrfI del plásmido pFlt1(1-3)\DeltaB2-Fc\DeltaC1(a) para producir el plásmido designado como pFlt1D2.RFCEVD3.Fc\DeltaC1(a). La secuencia de aminoácidos completa deducida del ADN de la molécula quimérica Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) se presenta en la figura 22A-22C.
Ejemplo 18 Análisis de unión de la unión a la matriz extracelular (MEC)
Las placas recubiertas de MEC (n.º de catálogo 35-4607 de Becton Dickinson) se rehidrataron con DME templado complementado con glutamina a 2 mM, 100 U de penicilina, 100 U de estreptomicina y BCS al 10% durante, al menos, 1 hora antes de añadir las muestras. Luego, se incubaron las placas durante 1 hora a temperatura ambiente con diferentes concentraciones de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y de Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) que parten de 10 nM seguidas de diluciones posteriores a la mitad en PBS más BCS al 10%. Luego, se lavaron las placas 3 veces con una PBS más Triton-X al 0,1% y se incubaron con anticuerpos anti-Fc humano conjugados a la fosfatasa alcalina (Promega, 1:4000 en PBS más BCS al 10%) durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, se lavaron las placas 4 veces con una PBS y Triton-X al 0,1% y se añadió una solución con pNPP y tampón de fosfatasa alcalina (Sigma) para revelar el color. Las placas se leyeron a \lambda = 405 a 570 nm. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 23 y demuestran que las proteínas Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) se adhieren mucho menos a la MEC en comparación con la proteína Flt1(1-3)-Fc.
Ejemplo 19 Expresión transitoria del pFlt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) en las células CHO-K1 (E1A)
Un cultivo a gran escala (2 l) de células de DH10B de E. coli que llevaban el plásmido pFlt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) descrito arriba en el ejemplo 17a) se hizo crecer durante la noche en caldo "estupendo" (TB) más ampicilina a 100 \mug/ml. Al día siguiente, se extrajo el ADN plasmídico mediante el kit Endofree Megaprep de QIAgen siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración del ADN plasmídico purificado se determinó mediante las técnicas estándares con el uso del espectrofotómetro UV y del fluorímetro. El ADN plasmídico se verificó mediante la digestión estándar de alícuotas con las enzimas de restricción EcoRI más NotI y AseI. Todos los fragmentos digeridos con las enzimas de restricción se correspondieron a los tamaños predichos cuando se analizaron en un gel de agarosa al 1%.
Se sembraron 40 placas de Petri de 15 cm con células CHO-K1/E1A con una densidad de 4 x 10^{6} células por placa. El medio de plaqueo fue F-12 de Ham de Gibco complementado con suero bovino fetal (SBF) Hyclone al 10%, 100 U de penicilina/100 U de estreptomicina y glutamina a 2 mM. Al día siguiente, cada placa de células se transfectó con 6 \mug de ADN del plásmido pFlt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) con Optimem de Gibco y Lipofectamine de Gibco en un volumen de 12 ml, siguiendo el protocolo del fabricante. A las cuatro horas de añadir la mezcla de transfección a las células, se añadieron 12 ml de Optimem complementado con SBF al 10% a cada placa. Las placas se incubaron a 37ºC en un incubador de CO_{2} al 5% durante la noche. Al día siguiente, se retiró el medio de cada placa y se añadieron 25 ml del medio de expresión (CHO-S-SFM II de Gibco complementado con glutamina a 2 mM y butirato de sodio a 1 mM). Las placas se incubaron a 37ºC durante 3 días. Tras 3 días de incubación, se aspiró el medio de cada placa y se centrifugó a 400 rpm en un rotor de ángulo flotante para sedimentar las células. Se decantó el sobrenadante en frascos de 1 l estériles y se llevó a cabo la purificación de la proteína expresada tal y como se describe más adelante.
Ejemplo 20 Construcción del vector de expresión pRFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)
Se construyó el plásmido de expresión pRFCEV1R2.Fc\DeltaC1(a) mediante la inserción del ADN que codifica los aminoácidos SDT (que corresponde a los aminoácidos 27 a 29 de la figura 24A-24C) entre los aminoácidos 26 y 27 de Flt1D2-Flk1D3-Fc\DeltaC1(a) de la figura 21A-21C (GG) y la eliminación del ADN que codifica los aminoácidos CPG que corresponden a los aminoácidos 229 a 231 de la figura. La secuencia de aminoácidos SDT es natural para el receptor Flt1 y se añadió para reducir la probabilidad de un procesamiento heterogéneo del extremo amino. Se retiró la CPG (secuencia de unión) para que los dominios Ig del Flt1 y del Flk1 se fusionaran directamente uno a otro. El ADN completo y las secuencias de aminoácidos deducidas de la molécula quimérica Flt1D2.pRFCEV1R2.Fc\DeltaC1(a) se presentan en la figura 24A-24C.
Ejemplo 21 Procedimiento de cultivo celular usado para producir receptores Flt1 modificados a) Procedimiento de cultivo celular usado para producir Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
El procedimiento para producir la proteína Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) mediante el plásmido de expresión pFlt1D
2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) descrito más arriba en el ejemplo 1 implica un cultivo en suspensión de células de ovarios recombinantes del hámster chino (CHO K1/E1A) que expresan constitutivamente el producto proteico. Las células se hacen crecer en biorreactores y el producto proteico se aísla y se purifica mediante cromatografías de exclusión por tamaños y de afinidad. El procedimiento se proporciona con mayor detalle más adelante.
Expansión celular
Dos matraces T-225 cm^{2} en confluencia que contenían la estirpe celular que expresa la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se expandieron haciendo pases de células en ocho frascos T-225 cm^{2} en el medio GMEM más suero al 10% (GIBCO) y se incubaron a 37ºC y en CO_{2} al 5%. Cuando los frascos se acercaron a la confluencia (aproximadamente a los 3 ó 4 días), las células se despegaron con tripsina. Se añadió medio nuevo para proteger las células de una exposición posterior a la tripsina. Se centrifugaron las células y se resuspendieron en el medio nuevo, luego se transfirieron a ocho frascos cilíndricos de 850 cm^{2} y se incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5% hasta la confluencia.
Cultivo en suspensión en biorreactores
Las células cultivadas en frascos cilíndricos se digirieron con tripsina para despegarlas de la superficie y se lavaron con el medio de cultivo de la suspensión. Las células se transfirieron en asepsia a un biorreactor de 5 l (New Brunswick Celligen Plus), donde las células se hicieron crecer en un cultivo en suspensión de 3,5 l. El medio de cultivo de suspensión fue una modificación del IS-CHO (Irvine Scientific) bajo en glucosa y sin glutamina, al que se añadió suero bovino fetal al 5% (Hyclone), un complemento de GS (Life Technologies) y sulfoximina de metionina (Sigma) a 25 \muM. El pH se mantuvo a 7,2 añadiendo dióxido de carbono por la toma de gas o añadiendo una disolución líquida de carbonato de sodio al biorreactor. La cantidad de oxígeno disuelto se mantuvo al 30% de saturación añadiendo oxígeno o nitrógeno por la toma de gas y la temperatura se controló a 37ºC. Cuando se alcanzó una densidad de 4 x 10^{6} células/ml, las células se transfirieron a un biorreactor de 40 l que contenía el mismo medio y los mismos valores de referencia para controlar el biorreactor. Se redujo el valor de referencia de la temperatura a 34ºC para retardar el crecimiento celular y aumentar la tasa relativa de la expresión de la proteína.
b) Procedimiento de cultivo celular usado para producir Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a)
Las mismas metodologías descritas más arriba para Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se usaron para producir Flt1D2.RFC
EV3D3.Fc\DeltaC1(a).
Ejemplo 22 Recogida y purificación de los receptores del Flt1 modificados a) Recogida y purificación de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
La proteína producida se recogió en asepsia del biorreactor al mismo tiempo que se retuvieron las células usando los módulos de filtración de flujo tangencial Prostak de Millipore y una bomba mecánica poco cizalladora (Fristam). Se añadió el medio puro al biorreactor para reemplazar lo retirado durante la filtración de recogida. Luego, se cargaron aproximadamente 40 l del filtrado recogido en una columna de 400 ml que contenía la resina Sepharose con proteína A (Amersham Pharmacia). Tras la carga, se lavó la resina con un tampón que contenía fosfato sódico a 10 mM, cloruro sódico a 500 mM y pH de 7,2 para retirar cualquier proteína contaminante sin unir. Se eluyó la proteína Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) con un tampón de citrato a pH 3,0. La proteína eluida se neutralizó añadiendo Tris puro y se congeló a -20ºC.
Se descongelaron varios lotes congelados de la proteína Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) de la etapa de proteína A anterior, se agruparon y se concentraron mediante una membrana de filtración de flujo tangencial con valor discriminatorio nominal para masa molecular (NMWCO) de 30 kDa de Millipore. Se transfirió la proteína a un concentrador de células en agitación (Millipore) y, además, se concentró a 30 mg/ml mediante una membrana NMWCO de 30 kDa. Se cargó la proteína concentrada en una columna de exclusión por tamaños empaquetada con la resina Superdex 200 (Amersham Pharmacia) que se equilibró con una solución salina tamponada con fosfato más glicerol al 5%. Se usó el mismo tampón para hacer funcionar la columna. Las fracciones correspondientes al dímero de Flt1D2.Flk1D3.Fc
\DeltaC1(a) se agruparon, se filtraron en esterilidad a través de un filtro de 0,22 micras, se distribuyeron en alícuotas y se
congelaron.
b) Recogida y purificación de la Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a)
Las mismas metodologías que se describen más arriba para la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se usaron para recoger y purificar Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a).
Ejemplo 23 Análisis de fosforilación del RFCEV2 expresado transitoriamente
Las células endoteliales de la vena umbilical humana (las CEVUH) primarias, pases 4 a 6, se mantuvieron en ayuno durante 2 horas en un medio DME con abundante glucosa y sin suero. Las muestras que contenían 40 ng/ml (1 nM) del FCEV165 humano, que es un ligando para los receptores del FCEV Flt1, Flk1 y Flt4 (RFCEV3) se prepararon y se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con diferentes cantidades de los receptores Flt1 modificados Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) en un medio DME con abundante glucosa y sin suero que contenía BSA al 0,1%. Las células se sometieron a una prueba de provocación durante 5 minutos con las muestras preparadas arriba con y sin el FCEV165 y a continuación se lisaron todas las células usando un tampón de lisis completa. Los lisados celulares se inmunoprecipitaron con un anticuerpo dirigido contra el extremo carboxilo del receptor RFCEV2. Los lisados inmunoprecipitados se cargaron en un gel SDS-PAGE Novex del 4 al 12% y, luego, se transfirieron a una membrana de PVDF mediante las metodologías de transferencia estándares. La detección del RFCEV2 fosforilado se llevó a cabo mediante inmunotransferencia con el AcM anti-fosfotirosina denominado 4G10 (UBI) y se reveló usando los reactivos ECL (Amersham). Las figuras 25A-25C y 26A-26B muestran los resultados de este experimento. La figura 25A-25C revela que la detección mediante un análisis de inmunotransferencia del RFCEV2 (Flk1) fosforilado en la tirosina mediante la estimulación con el ligando FCEV165 muestra que los receptores de la superficie celular se fosforilan a diferentes niveles, según qué receptor Flt1 modificado se use durante las preincubaciones con el FCEV. Tal como se observa en la figura 25A, a un exceso molar de 1,5 de la Flt1(1-3)-Fc, de la Flt1(1-3)-Fc (A40) o de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria se produce un bloqueo total de la estimulación del receptor por parte de estos tres receptores Flt1 modificados en comparación con la prueba de provocación del medio de control. En cambio, la Flt1D2RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria no muestra un bloqueo significativo a este exceso molar en comparación con la prueba de provocación del control positivo con FCEV. Se observan resultados similares en la figura 25B, en la que los receptores Flt modificados se encuentran en un exceso molar de 3 veces en relación al ligando FCEV165. En la figura 25C, en la que los receptores Flt1 modificados se encuentran en un exceso molar de 6 veces en relación al ligando FCEV165, se puede observar ahora que la Flt1D2RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria está bloqueando parcialmente la estimulación inducida por el FCEV165 de los receptores de la superficie
celular.
En la figura 26A-26B, la detección por inmunotransferencia del RFCEV2 (Flk1) fosforilado en una tirosina mediante la estimulación con el ligando FCEV165 muestra que los receptores de la superficie celular no se fosforilan mediante las muestras de prueba de provocación que tienen el FCEV165 preincubado con un exceso molar de 1 y 2 veces (figura 26A) o un exceso molar de 3 y 4 veces (figura 26B) de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria, la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) estable o la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) transitoria. En todas las concentraciones probadas del receptor Flt1 modificado hay una unión completa del ligando FCEV165 durante la preincubación, lo que da lugar a una estimulación indetectable de los receptores de la superficie celular mediante el FCEV165 sin unir, en comparación con la prueba de provocación de los medios de control.
Ejemplo 24 Bioanálisis de la proliferación celular
Las células Mg87 son la población de células de prueba que se transfectaron establemente con un plásmido de expresión que contiene un inserto de ADN que codifica el dominio extracelular del RFCEV2 (Flk1) fusionado al dominio cinasa intracelular de TrkB, lo que produjo una molécula híbrida. La razón por la que se usó el dominio cinasa intracelular del TrkB y no el dominio cinasa intracelular del RFCEV2 (Flk1) natural es que el dominio cinasa intracelular del RFCEV2 (Flk1) no causa una respuesta proliferativa fuerte cuando se estimula mediante el FCEV165 en estas células. Se sabe que las células MG87 que contienen un receptor TrkB completo proporcionan una respuesta proliferativa fuerte cuando se estimulan con BDNF, por lo que el dominio cinasa intracelular del TrkB se modificó genéticamente para reemplazar el dominio cinasa intracelular del RFCEV2 (Flk1) para aprovecharse de esta capacidad de respuesta proliferativa.
Se sembraron 5 x 10^{3} células por pocillo en una placa de 96 pocillos y se las dejó establecerse durante 2 horas a 37ºC. Se titularon de 40 nM a 20 pM los siguientes receptores Flt modificados Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a), más un receptor irrelevante denominado Tie2-Fc a modo de control negativo, y se incubaron con las células durante 1 hora a 37ºC. Luego, el FCEV165 recombinante humano en los medios definidos se añadió a todos los pocillos a una concentración de 1,56 nM. Se incubaron las placas durante 72 horas a 37ºC y, luego, se les añadió MTS (reactivo de Owen, Promega) y se incubaron las placas durante 4 horas más. Finalmente, se leyeron las placas en un espectrofotómetro a 450/570 nm. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 27. El receptor de control Tie2-Fc no bloquea la proliferación celular inducida por el FCEV165 a ninguna concentración, mientras que la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) bloquea el FCEV165 a 1,56 nM con una semidosis máxima de 0,8 nM. La Flt1(1-3)-Fc y la Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) son menos eficaces a la hora de bloquear el FCEV165 en este análisis con una semidosis máxima de \sim2 nM. El FCEV165 solo da una lectura de 1,2 unidades de absorbencia y el fondo es de 0,38 unidades de aborbencia.
Ejemplo 25 Estequiometría de unión de los receptores Flt modificados al FCEV165 a) Análisis de BIAcore
Se determinó la estequiometría de la interacción del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y del RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) con el FCEV165 midiendo el nivel de la unión de saturación del FCEV a las superficies del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o del RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) o midiendo la concentración del FCEV165 necesaria para prevenir completamente la unión del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o del RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) a la superficie del chip de BIAcore de FCEV.
Se capturaron los receptores Flt modificados, el Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y el RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) con un anticuerpo específico anti-Fc que se inmovilizó, primero, en un chip de Biacore (BIACORE) mediante una reacción química de acoplamiento de aminas. Se usó una superficie con anticuerpo en blanco como un control negativo. Se inyectó el FCEV165 a una concentración de 1 nM, 10 nM y 50 nM sobre las superficies del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
y del RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) a 10 \mul/min durante una hora. Se registró una señal de unión en directo y se logró una unión a saturación al final de cada inyección. Se calculó la estequiometría de la unión como una proporción molar del FCEV165 unido al Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o al RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) inmovilizados, usando el factor de conversión con el que 1000 RU equivalen a 1 ng/ml. Los resultados indicaron que la estequiometría de unión era de una molécula dimérica del FCEV165 por una molécula de Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o de RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)
(figura 28).
En una disolución, el Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o el RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) a una concentración de 1 nM (que se estimó que sería 1000 veces mayor que la KD de la interacción del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o del RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) con el FCEV165) se mezclaron con diferentes concentraciones del FCEV165. Tras una hora de incubación, las concentraciones del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) libre en disolución se midieron como una señal de unión a la superficie del FCEV165 con aminas unidas. Se usó una curva de calibración para convertir la señal de unión de BIAcore del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) a su concentración molar. Los datos mostraron que la adición del FCEV165 a 1 nM en la disolución del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) bloqueó completamente la unión del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) a la superficie del FCEV165. Este resultado sugirió que la estequiometría de unión era de una molécula del FCEV165 por una molécula del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) (figura 29 y figura 30). Cuando se representó la concentración del Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) en función de la concentración de FCEB165 añadida, la pendiente de la región lineal fue de -1,06 para el Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y de -1,07 para el RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a). La magnitud de la pendiente, muy cercana a menos uno, fue indicativa de que una molécula del FCEV165 se unía a una molécula del Flt1D2Flk1D3.Fc
\DeltaC1(a) o del RFCEVR1R2-Fc\DeltaC1(a).
b) Cromatografía de exclusión por tamaños
Se mezcló el Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) con un exceso de 3 veces del FCEV165 y se purificó el complejo receptor-ligando con una columna de cromatografía de exclusión por tamaños de Superose 6 de Pharmacia. Luego, el complejo receptor-ligando se incubó en un tampón que contenía hidrocloruro de guanidinio a 6 M para disociarlo en las proteínas que lo componen.
El Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se separó del FCEV165 con una columna de cromatografía de exclusión por tamaños de Superose 6 que se hizo funcionar en cloruro de guanidinio a 6 M. Para determinar la estequiometría del complejo se realizaron varias inyecciones del Flt1D2FIk1D3.Fc\DeltaC1(a) y del FCEV165 y se representaron la altura del pico o la intensidad integrada del pico en función de la concentración de la proteína inyectada. La calibración se realizó en una situación idéntica a la usada para separar los componentes del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV. La cuantificación de la composición del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV se basó en las curvas de calibración. Los resultados de este experimento se presentan el la figura 28, que muestra que la proporción de FCEV165 a Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) en un complejo es de 1:1.
Ejemplo 26 Determinación de la estequiometría de unión del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 mediante cromatografía de exclusión por tamaños Preparación del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165
El FCEV165 (concentración = 3,61 mg/ml) se mezcló con el Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresado, transitoriamente en las células CHO (concentración = 0,9 mg/ml) en una proporción molar de 3:1 (FCEV165:Flt1D2.Flk1D3.Fc
\DeltaC1(a)) y se incubó durante la noche a 4ºC.
(a) Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) en condiciones nativas
Para separar el complejo del exceso del FCEV165 sin unir, se cargaron 50 \mul del complejo en una Superose 12 PC 3.2/30 de Pharmacia, que se equilibró en un tampón PBS. La muestra se eluyó con el mismo tampón a una velocidad de flujo de 40 \mul/min a temperatura ambiente. Los resultados de esta CET se muestran en la figura 31. El pico n.º 1 representa el complejo y el pico n.º 2 representa el FCEV165 sin unir. Las fracciones eluidas entre 1,1 y 1,2 ml se reunieron y se les añadió hidrocloruro de guanidinio (GuHCl) a una concentración final de 4,5 M para disociar el complejo.
b) Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) en condiciones disociativas
Para separar los componentes del complejo receptor-ligando y para determinar su proporción molar, se cargaron, tal como se describió más arriba, 50 \mul del complejo disociado en una Superose 12 PC 3.2/30 equilibrada con GuHCl a 6 M de y se eluyeron con la misma disolución a una velocidad de flujo de 40 \mul/min a temperatura ambiente. Los resultados de esta CET se muestran en la figura 32. El pico n.º 1 representa la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y el pico n.º 2 representa el FCEV165.
c) Cálculo de la estequiometría del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a):FCEV165
La estequiometría del complejo receptor-ligando se determinó a partir del área del pico o de la altura del pico de los componentes. Las concentraciones del FCEV165 y de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) correspondientes a la altura de pico o al área de pico, respectivamente, se obtuvieron de las curvas estándares del FCEV165 y del Flt1D2Flk1D3.Fc
\DeltaC1(a). Para obtener una curva estándar, se inyectaron cuatro concentraciones diferentes (0,04 mg/ml a 0,3 mg/ml) de cualquier componente en una columna de Superose 12 PC 3.2/30 de Pharmacia en cloruro de guanidinio a 6 M y se eluyeron con la misma disolución a una velocidad de flujo de 40 \mul/min a temperatura ambiente. La curva estándar se obtuvo representando el área del pico o la altura del pico frente a la concentración de proteína. La proporción molar de FCEV165:Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) determinada a partir del área de pico de los componentes fue de 1,16. La proporción molar de FCEV165:Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) determinada a partir de la altura de pico de los componentes fue de 1,10.
Ejemplo 27 Determinación de la estequiometría del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 mediante cromatografía de exclusión por tamaños con dispersión de luz en línea Preparación del complejo
Se mezcló el FCEV165 con la proteína Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada, transitoriamente, en las células CHO en la proporción molar de 3:1 (FCEV165:Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)) y se incubó durante la noche a 4ºC.
a) Cromatografía de exclusión por tamaños (CET) con dispersión de luz en línea
La columna de cromatografía de exclusión por tamaños con un detector de dispersión de luz (DL) en línea MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Bárbara, California) y los detectores del índice de refracción (IR) (Shimadzu, Kioto, Japón) se usaron para determinar la masa molecular (MM) del complejo receptor-ligando. Se inyectaron las muestras en una columna Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada en tampón PBS y se eluyó con el mismo tampón a la velocidad de flujo de 0,5 ml/min a temperatura ambiente. Tal como se muestra en la figura 33, el perfil de la elución muestra dos picos. El pico n.º 1 representa el complejo receptor-ligando y el pico n.º 2 representa el FCEV165 sin unir. Se calculó la MM a partir de las señales de DL e IR. Se utilizó el mismo procedimiento para determinar la MM de los componentes individuales del complejo receptor-ligando. Los resultados de estas determinaciones son los siguientes: la MM del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 en la posición de pico es 157300 (figura 33), la MM del FCEV165 en la posición de pico es de 4390 (figura 34) y la MM de R1R2 en el pico es de 113300 (figura 35).
Estos datos indicaron que la estequiometría del complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV es 1:1 pues corresponde a la suma de las masas moleculares de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y del FCEV165. Cabe destacar que este método demostró concluyentemente que el complejo Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)/FCEV165 realmente se componía de sólo una molécula de ligando FCEV165 y de sólo una molécula de la Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a).
Ejemplo 28 Cartografía de péptidos de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a)
Las estructuras de los disulfuros y los sitios de glucosilación en Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) se determinaron mediante el método de cartografía de péptidos. En este método, primero se digirió la proteína con tripsina. Los fragmentos trípticos se analizaron y se identificaron mediante HPLC acoplada a espectrometría de masas, además de la técnica de secuenciación del extremo amino. Se usó la reducción de la digestión tríptica para ayudar a identificar los fragmentos que contenían puentes disulfuro. Se trató la digestión tríptica con PNGasa F (Glyko, Novato, CA) para ayudar a identificar los fragmentos con unos sitios de N-glucosilación. Los resultados se resumen en la figura 36 acompañante.
Hay un total de diez cisteínas en la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a); seis de ellas pertenecen a la región Fc. Se ha confirmado que la Cys27 está unida mediante un puente disulfuro a la Cys76. Se ha confirmado que la Cys121 está unida mediante un puente disulfuro a la Cys182. Las primeras dos cisteínas de la región Fc (Cys211 y Cys214) forman un enlace disulfuro intermolecular con las mismas dos cisteínas de otra cadena Fc. Sin embargo, dado que estas dos cisteínas no se pueden separar enzimáticamente una de la otra, no se puede determinar si se produce un puente disulfuro entre las mismas cisteínas (por ejemplo, de Cys211 a Cys211) o entre la Cys211 y la Cys214. Se ha confirmado que la Cys216 está unida mediante un puente disulfuro a la Cys306. Se ha confirmado que la Cys352 está unida mediante un puente disulfuro a la Cys410.
Hay cinco posibles sitios de N-glucosilación en la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a). Se ha encontrado que los cinco se glucosilan en diferentes grados. Se observó una glucosilación completa en la Asn33 (secuencia de aminoácidos NIT), en la Asn193 (secuencia de aminoácidos NST) y en la Asn282 (secuencia de aminoácidos NST). Además, se observó una glucosilación parcial en la Asn65 y en la Asn120. Los sitios de la glucosilación se destacan con subrayado en la figura 36.
Ejemplo 29 Análisis farmacocinético de los receptores Flt modificados a) Análisis farmacocinético de la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)
A los ratones Balb/c (de 25 a 30 g) se les inyectó por vía subcutánea 4 mg/kg de la Flt1(1-3)-Fc (A40), de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en las células CHO, de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada de forma estable en las células CHO y de la RFEV1R2-Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en las células CHO. Los ratones se sangraron por la cola tras 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 6 días de la inyección. Se analizaron los sueros en un ELISA diseñado para detectar la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a). El ELISA implica recubrir una placa de ELISA con el FCEV165, unir la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) y delatar con un anticuerpo anti-Fc unido a la peroxidasa de rábano picante. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 37. El T_{max} de la Flt1(1-3)-Fc (A40) fue de 6 horas mientras que el T_{max} transitoria fue de 24 horas para la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) transitoria y estable, y la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) transitoria. La C_{max} de la Flt1(1-3)-Fc (A40) fue de 8 \mug/ml. La C_{max} de las dos proteínas transitorias (la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)) fue de 18 \mug/ml y la C_{max} de la RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) estable fue de 30 \mug/ml.
a) Análisis farmacocinético de la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y de la Flt1D2.RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a)
A los ratones Balb/c (de 25 a 30 g) se les inyectó por vía subcutánea 4 mg/kg de la Flt1(1-3)-Fc (A40), de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en las células CHO y de la Flt1D2.RFCEV1R2.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente en las células CHO. Los ratones se sangraron por la cola tras 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 y 20 días de la inyección. Se analizaron los sueros en un ELISA diseñado para detectar la Flt1(1-3)-Fc, la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la FltD2.RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a). El ELISA implica recubrir una placa de ELISA con el FCEV165, unir la Flt1(1-3)-Fc, la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o la Flt1D2.RFCEV1R2-Fc\DeltaC1(a) y delatar con un anticuerpo anti-Fc unido a la peroxidasa de rábano picante. La Flt1(1-3)-Fc (A40) no se pudo detectar más en el suero después de 5 días, mientras que la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) se detectaron durante 15 días o más. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 38.
Ejemplo 30 Evaluación de la capacidad de Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) para inhibir el crecimiento del tumor in vivo
Para evaluar la capacidad de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) para inhibir el crecimiento del tumor in vivo, se usó un modelo en el que se implantan subcutáneamente suspensiones de células tumorales en el lado derecho de ratones macho con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Dos estirpes celulares, la estirpe celular del fibrosarcoma humano HT-1080 (n.º de acceso CCL-121 de la ATCC) y la estirpe celular de glioma de rata C6 (n.º de acceso CCL-107 de la ATCC), cada una de las cuales muestra una morfología y unas características de crecimiento claramente diferentes, se usaron en este análisis. La primera dosis de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) (25 mg/kg o tal como se indicó en las figuras 39 y 40) se administró el día de la implantación del tumor. Posteriormente, los animales recibieron inyecciones por vía subcutánea de Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) o excipiente bien en días alternos (EDA) o dos veces a la semana (2X/smn) durante un periodo de 2 semanas. A las 2 semanas, los animales se sometieron a una perfusión fijativa, se extrajeron los tumores y las muestras se enmascararon. Se determinó el volumen del tumor midiendo la longitud y la anchura de los tumores subcutáneos visibles. Ambas, Flt1(1-3)-Fc (A40) y Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a), redujeron significativamente el crecimiento de los tumores originados con las células HT-1080 y C6. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 39 y en la figura 40.
Ejemplo 31 El efecto del FCEV165 y de los receptores Flt modificado en el sistema reproductor femenino
Se ha caracterizado bien el patrón estereotípico de la reorganización vascular que se produce en el útero y en los ovarios durante el transcurso del ciclo reproductivo, lo que hace que el estudio de los mecanismos que regulan la angiogénesis, la reorganización vascular y la regresión vascular se realice particularmente bien en los tejidos de estos órganos. De hecho, los estudios de hibridación in situ en los tejidos gonadales proporcionaron la primera prueba clara de que el FCEV actúa como un mediador de la angiogénesis fisiológica en los roedores maduros, así como también en los humanos y en los primates no humanos (Phillips et al, 1990; Ravindranath et al, 1992; Shweiki et al, 1993; Kamat et al, 1995). Dado que la angiogenia cíclica y la reorganización vascular son características prominentes de ovarios y útero normales, no es sorprendente que se haya encontrado que el crecimiento anormal de los vasos sanguíneos y/o la disfunción vascular caracterizan muchos procesos patológicos que afectan a estos órganos. Además, se piensa que estas anomalías vasculares patogénicas están causadas o perpetuadas por la expresión desregulada de uno o más factores angiogénicos o anti-angiogénicos, entre los que el FCEV es el más sobresaliente.
Por ejemplo, la angiogénesis anormal es característica de la poliquitosis ovárica, de la endometriosis y del carcinoma endometrial y, en cada caso, el FCEV se sobreexpresa en el tejido afectado (Kamat et al, 1995; Shifren et al, 1996; Guidi et al, 1996; Donnez et al, 1998). También se cree que la sobreexpresión del FCEV desempeña una función patógena en el establecimiento de la hiperpermeabilidad vascular diseminada en el síndrome de hiperestimulación ovárica (McClure et al, 1994; Levin et al, 1998) y en la preeclampsia (Baker et al, 1995; Sharkey et al, 1996). Además, el FCEV se ha señalado como el factor de permeabilidad responsable de la producción de ascitis asociada con el carcinoma de ovarios y otros tumores (Senger et al, 1983; Boocock et al, 1995). Los fármacos que neutralizan eficazmente las acciones biológicas del FCEV se pueden anticipar razonablemente por tener un beneficio terapéutico en las enfermedades mencionadas más arriba y en las relacionadas.
La angiogénesis y la reorganización vascular también son distintivas de la implantación de blastocitos y del desarrollo de la placenta (Findlay, 1986). El FCEV se expresa mucho en la caduca maternal y en los trofoblastos embrionarios, donde se piensa que primero estimulan la expansión y la hiperpermeabilidad de la vasculatura uterina durante el periodo de preimplantación y, subsecuentemente, median la formación tanto de los componentes maternos como de los embrionarios de la vasculatura de la placenta (Shweiki et al, 1993; Cullinan-Bove y Koos, 1993; Chakraborty et al, 1995; Das et al, 1997). El FCEV también se requiere para la angiogénesis luteínica y la secreción de progesterona asociada necesaria para preparar el útero para la implantación (Ferrara et al, 1998). Así, los fármacos que inhiben las acciones biológicas del FCEV pueden resultar útiles como fármacos anticonceptivos (previniendo la implantación) o como fármaco abortivo en las etapas tempranas de la gestación. La última aplicación podría encontrar un uso particular a modo de intervención no quirúrgica para terminar los embarazos ectópicos.
Mientras que la expresión de los receptores del FCEV se confina, mayormente, en el endotelio vascular de los tejidos gonadales normales, los trofoblastos también expresan el Flt1 en la placenta tanto de humanos como de animales (Clark et al, 1996; He et al, 1999), donde se ha propuesto que desempeña una función en la invasión de los trofoblastos. Interesantemente, la estirpe celular de coriocarcinoma BeWo expresa tanto Flt1 como KDR (Flk1) (Charnock-Jones et al, 1994), y se ha demostrado que el FCEV promueve la síntesis del ADN y la fosforilación de la tirosina de la MAP cinasa en estas células. Además, los carcinomas de ovario primarios y metastásicos no sólo expresan unos niveles elevados del FCEV, sino que -además del endotelio vascular- las propias células tumorales expresan KDR y/o Flt1 (Boocock et al, 1995). Estos resultados sugieren que el FCEV no sólo puede estar implicado, críticamente, en la generación y en el mantenimiento de la vasculatura del tumor, sino que, al menos en algunos tumores de origen gonadal, el FCEV puede subordinar una función autocrina, que sustenta directamente la supervivencia y la proliferación de las células tumorales. Así, los fármacos que bloquean las acciones del FCEV pueden tener aplicaciones particularmente beneficiosas en el tratamiento de los tumores de origen gonadal.
Métodos y resultados (a) Evaluación de la hiperpermeabilidad uterina inducida por el FCEV
Se inyectaron 5 IU de gonadotropina de suero de yegua gestante (PMSG) por vía subcutánea para inducir la ovulación en ratas hembras prepuberales. Esto da lugar a un aumento rápido de estradiol a los 2 días, que a su vez causa una inducción del FCEV en el útero. Se ha descrito que esta inducción da lugar a la hiperpermeabilidad del útero y a un aumento del peso húmedo del útero 6 horas después y, por lo tanto, potencialmente se podría bloquear mediante los receptores Flt modificados Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a).
En este modelo in vivo, el peso normal del útero de las ratas es aproximadamente de 50 mg y se puede inducir hasta 300 ó 350 mg con PMSG. La desecación del órgano revela que no es más que peso del agua. La inyección por vía subcutánea de la Flt1(1-3)-Fc (A40), la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) y la Flt1D2.RFCEV3D3.Fc\DeltaC1(a) a 25 mg/kg a una hora tras la inyección de PMSG da lugar a una inhibición aproximada del 50% del aumento del peso húmedo del útero. Aumentar la dosis del receptor Flt modificado no reduce más el aumento del peso húmedo, lo que sugiere que existe un componente independiente del FCEV en este modelo. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 41.
(a) Evaluación de la angiogénesis del cuerpo lúteo en base a los valores de progesterona
Se inyectaron 5 IU de gonadotropina de suero de yegua gestante (PMSG) por vía subcutánea para inducir la ovulación en ratas hembras prepuberales. Esto da lugar a un cuerpo lúteo completamente funcional que contiene una red densa de vasos sanguíneos tras 4 días, lo que permite la secreción de la progesterona al torrente circulatorio para preparar el útero para la implantación. Se requiere el FCEV para inducir la angiogénesis en el cuerpo lúteo; por lo tanto, bloquear el FCEV daría lugar a una ausencia de nuevos vasos sanguíneos y, por lo tanto, a una ausencia de progesterona secretada al torrente circulatorio. En este modelo in vivo, los niveles estacionarios de progesterona están en torno a 5 ng/ml y se pueden inducir hasta una concentración de 25 a 40 ng/ml tras la PMSG. La inyección subcutánea de la Flt1(1-3)-Fc (A40) o de la Flt1D2.Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) a 25 mg/kg o a 5 mg/kg una hora después de la inyección de la PMSG da lugar a la inhibición total de la inducción de la progesterona en el día 4. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 42A-42B.
Ejemplo 33 Análisis farmacocinético de Flt1(1-3)-Fc (A40) y Flt1(1-3)-Fc
La Flt1(1-3)-Fc se pegiló con PEG de 10 kDa o con PEG de 20 kDa y se probó su perfil farmacocinético en los ratones balb/c. Se encontró que las dos formas pegiladas de la Flt1(1-3)-Fc tenían un mejor perfil FC que la Flt1(1-3)-Fc (A40), apareciendo el T_{max} a las 24 horas para las moléculas pegiladas a diferencia de las 6 horas para la Flt1(1-3)-Fc (A40).
Ejemplo 34 ELISA del FCEV165 para probar la afinidad de las variantes del receptor Flt1 modificado
Se incubó FCEV165 a 10 pM durante la noche a temperatura ambiente con las variantes del receptor Flt1 modificado en un margen de 160 pM a 0,1 pM. Las variantes del receptor Flt1 modificado que se usaron en este experimento fueron Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente, Flt1D2RFCEV3D3-Fc\DeltaC1(a) expresada transitoriamente, Flt1-(1-3_{NAS})-Fc, la Flt1(1-3_{R->C})-Fc y Tie2-Fc. La Flt1(1-3_{NAS})-Fc es una versión modificada de la Flt1(1-3)-Fc, en la que la secuencia de aminoácidos muy básica KNKRASVRRR se reemplaza por NASVNGSR, lo que da lugar a la incorporación de dos nuevos sitios de glucosilación y a una reducción neta de cinco cargas positivas, ambas con el objetivo de reducir los efectos desfavorables de esta secuencia en la FC. La Flt1(1-3_{R->C})-Fc es una modificación en la que un único resto de arginina (R) dentro de la misma secuencia de aminoácidos básica se cambia por una cisteína (C) (KNKRASVRRR- > KNKCASVRRR), para permitir la pegilación en este resto, que entonces podría evitar que la región básica ejerciera sus efectos desfavorables en la FC. Tras la incubación, la disolución se transfirió a una placa que contenía un anticuerpo de captura del FCEV165 (R&D). Luego, se determinó la cantidad de FCEV165 libre usando un anticuerpo para revelar el FCEV165 libre. Esto demostró que la variante del receptor Flt1 modificado con la mayor afinidad por FCEV165 (determinada como la menor cantidad de FCEV165 libre) era Flt1D2Flk1D3.Fc\DeltaC1(a), seguida de Flt1(1-3)-Fc y Flt1(1-3)-Fc (A40) y luego de Flt1(1-3_{R->C})-Fc, Flt1(1-3_{NAS})-Fc y la Flt1D2RFCEV3D3-Fc\DeltaC1(a). La Tie2Fc no presentó afinidad por FCEV165.

Claims (21)

1. Una molécula de ácido nucleico aislada, que comprende:
a) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente del receptor del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV) que consiste, esencialmente, en un dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un primer receptor de FCEV y de un dominio 3 Ig de un segundo receptor de FCEV; y
b) una secuencia de nucleótidos que codifica un componente de multimerización, en la que el primer receptor de FCEV es Flt1 y el segundo receptor de FCEV es Flk1 o Flt4 y el componente del receptor de FCEV es el único componente del receptor de FCEV del polipéptido de fusión.
2. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de FCEV está hacia 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de FCEV.
3. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de FCEV está hacia 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de FCEV.
4. Una molécula aislada de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el componente de multimerización comprende un dominio de inmunoglobulina.
5. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el dominio de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de la IgG y la cadena pesada de la IgG.
6. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que se selecciona del grupo que consiste en:
a) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 21A-21C;
b) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 22A-22C;
c) la secuencia de nucleótidos presentada en la figura 24A-24C; y
d) una secuencia de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, difiere de la secuencia de nucleótidos de (a), (b) o (c).
7. Una molécula aislada de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los componentes del polipéptido de fusión se ordenan como 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 ó 3,2,1, en la que 1 es el componente del primer receptor de FCEV, 2 es el componente del segundo receptor de FCEV y 3 es el componente de multimerización.
8. Un polipéptido de fusión codificado por una molécula aislada de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
9. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
10. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la molécula de ácido nucleico está operativamente unida a una secuencia de control de expresión.
11. Un sistema de vector y hospedador para producir un polipéptido de fusión que comprende el vector de expresión de la reivindicación 10, en una célula hospedadora adecuada.
12. El sistema de vector y hospedador de la reivindicación 11, en el que la célula hospedadora adecuada es una célula bacteriana, una célula de levaduras, una célula de insectos o una célula de mamíferos.
13. El sistema de vector y hospedador de la reivindicación 12, en la que la célula hospedadora adecuada es E. coli o una célula CHO.
14. Un método para producir un polipéptido de fusión que comprende hacer crecer las células del sistema de vector y hospedador de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en las condiciones que permiten producir el polipéptido de fusión y recuperar el polipéptido de fusión así producido.
15. Un antagonista dimérico del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV), que comprende dos polipéptidos de fusión, y cada polipéptido de fusión comprende:
a) un componente del receptor de FCEV que consiste esencialmente en un dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un receptor Flt1 de FCEV y de un dominio 3 Ig de un receptor Flk-1 o Flt-4 de FCEV; y
b) un componente de multimerización,
en el que el componente del receptor de FCEV es el único componente del receptor de FCEV de cada proteína de fusión.
16. Un antagonista dimérico de acuerdo con la reivindicación 15, que se modifica por acetilación o pegilación.
17. Un polipéptido de fusión, que comprende:
a) un componente del receptor de FCEV que consiste esencialmente en un dominio 2 inmunoglobulinoide (Ig) de un receptor Flt1 de FCEV y de un dominio 3 Ig de un receptor Flk-1 o Flt-4 de FCEV; y
b) un componente de multimerización,
en el que el componente del receptor de FCEV es el único componente del receptor de FCEV del polipéptido de fusión.
18. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 17, en el que el componente de multimerización comprende un dominio de inmunoglobulina.
19. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 18, en el que el dominio de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de la IgG y la cadena pesada de la IgG.
20. Un polipéptido de fusión de acuerdo con la reivindicación 19, que comprende la secuencia de aminoácidos presentada en la figura 21A-21C, en la figura 22A-22C o en la figura 24A-24C.
21. Uso de un polipéptido de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 o un antagonista dimérico según una cualquiera de las reivindicaciones 15 ó 16 en la fabricación de un medicamento que se usa para atenuar o prevenir el crecimiento tumoral, para atenuar o prevenir el edema, para atenuar o prevenir la formación de ascitis, para reducir o inhibir la pérdida de plasma, o para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos en un humano.
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Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US7087411B2 (en) * 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US6833349B2 (en) * 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US6734017B2 (en) 2001-09-28 2004-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression
DE60336341D1 (de) 2002-05-04 2011-04-21 Acorda Therapeutics Inc Zusammensetzungen und verfahren zur förderung des neuronalen wachstums
ES2278333T3 (es) * 2003-03-28 2007-08-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Antagonistas de vegf para el tratamiento de la diabetes.
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
MX351062B (es) * 2003-05-16 2017-09-29 Acorda Therapeutics Inc Proteinas de fusion para el tratamiento del snc.
ES2887949T3 (es) 2003-05-16 2021-12-29 Acorda Therapeutics Inc Mutantes degradantes de proteoglicanos para el tratamiento del SNC
WO2004106378A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
US7354578B2 (en) 2003-06-06 2008-04-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of tumor regression with VEGF inhibitors
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
AR046510A1 (es) * 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
WO2005016369A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
CA2566731C (en) 2004-05-18 2012-07-24 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of purifying chondroitinase and stable formulations thereof
PL1767546T3 (pl) * 2004-06-08 2012-07-31 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd Hamujące angiogenezę białka chimeryczne i ich zastosowanie
MXPA06014421A (es) 2004-06-10 2007-05-04 Regeneron Pharma Uso de inhibidores de vegf para el tratamiento de cancer humano.
US20050281822A1 (en) * 2004-06-18 2005-12-22 Cedarbaum Jesse M Method of administering and using VEGF inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion
JP4807802B2 (ja) * 2004-07-30 2011-11-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
WO2006031689A2 (en) 2004-09-13 2006-03-23 Genzyme Corporation Multimeric constructs
FR2878749B1 (fr) * 2004-12-03 2007-12-21 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives
WO2006088650A2 (en) * 2005-02-02 2006-08-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a vegf inhibitor
ZA200708845B (en) 2005-03-25 2010-07-28 Regeneron Pharma Vegf antogonist formulations
CA2623635C (en) 2005-09-26 2013-04-02 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
CA2630839C (en) † 2005-12-16 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists
FR2895258B1 (fr) 2005-12-22 2008-03-21 Aventis Pharma Sa Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
CN100502945C (zh) * 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
JP5216002B2 (ja) 2006-06-16 2013-06-19 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 硝子体内投与に適したｖｅｇｆアンタゴニスト製剤
BRPI0717431A2 (pt) 2006-09-29 2013-11-12 Oncomed Pharm Inc Composições e métodos de diagnóstico e tratamento do câncer
US7722864B2 (en) 2006-10-10 2010-05-25 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase ABCI mutants
FR2918279B1 (fr) * 2007-07-05 2010-10-22 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan
CN101575379B (zh) * 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
RU2550258C2 (ru) 2008-11-03 2015-05-10 Молекьюлар Партнерс Аг Связывающие белки, ингибирующие взаимодействия vegf-a рецептора
CN101838329A (zh) * 2009-03-18 2010-09-22 嘉和生物药业有限公司 抗血管新生融合蛋白
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AR081361A1 (es) 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
HUE035554T2 (en) 2010-08-06 2018-05-02 Genzyme Corp VEGF antagonist compositions and their uses
EP2662385A4 (en) * 2011-01-07 2015-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd METHOD FOR IMPROVING THE PHYSICAL PROPERTIES OF ANTIBODIES
SG10201802789VA (en) 2011-01-13 2018-05-30 Regeneron Pharma Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
KR101397088B1 (ko) 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
CN104159926B (zh) 2011-12-01 2019-02-01 圆祥生命科技有限公司 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法
CN103304668B (zh) * 2012-03-12 2015-10-28 江苏健德生物药业有限公司 Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
PT2846836T (pt) 2012-05-07 2019-10-29 Allergan Inc Método de tratamento de dmi em doentes refratários à terapia anti-vegf
WO2014006113A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sanofi Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept
TW201438736A (zh) 2012-11-14 2014-10-16 Regeneron Pharma 以ｄｌｌ４拮抗劑治療卵巢癌之方法
EP3693381A1 (en) 2013-02-18 2020-08-12 Vegenics Pty Limited Ligand binding molecules and uses thereof
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CN104193828B (zh) * 2013-09-12 2017-04-05 北京韩美药品有限公司 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
WO2015069668A1 (en) 2013-11-05 2015-05-14 Allergan, Inc. Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin
WO2015173260A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
ES2732925T3 (es) 2014-07-18 2019-11-26 Sanofi Sa Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
CN112826934A (zh) 2014-12-11 2021-05-25 拜耳医药保健有限责任公司 具有小的活动性脉络膜新生血管病变的年龄相关性黄斑变性的治疗
GB201503453D0 (en) 2015-03-01 2015-04-15 Jain Arjun Endothelin-1"sponge"
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
WO2017065559A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 (주)알테오젠 Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
CN108883057A (zh) 2015-11-18 2018-11-23 Sio2医药产品公司 用于眼科配制品的药物包装
RU2734958C2 (ru) 2015-11-18 2020-10-26 Формикон Аг Предварительно заполненная фармацевтическая упаковка, содержащая жидкий состав на основе антагониста vegf
MX2018006171A (es) 2015-11-18 2018-12-19 Formycon Ag Jeringa de plastico precargada que contiene un antagonista de vegf.
CA3005391A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. Methods and compositions for binding vegf
FI3384049T3 (fi) 2015-12-03 2023-09-25 Regeneron Pharma Menetelmiä geenimuunnosten liittämiseksi kliiniseen tulokseen potilailla, jotka kärsivät silmänpohjan ikärappeumasta ja joita on hoidettu anti-VEGF:llä
CA3011638C (en) 2016-01-26 2023-01-10 Formycon Ag Liquid formulation of a vegf antagonist
EP3527225A4 (en) 2016-10-12 2020-06-10 Daiichi Sankyo Company, Limited COMPOSITION CONTAINING ANTI-ROBO4 ANTIBODY AND OTHER AGENT
US11135266B2 (en) 2016-11-21 2021-10-05 Just-Evotec Biologics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
EP3630043A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Formycon AG Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
CA3063995A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Sio2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
CN111344410B (zh) 2017-08-17 2023-09-15 济世易为生物有限公司 从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法
EP3713591A1 (en) 2017-11-20 2020-09-30 Just-Evotec Biologics, Inc. Aflibercept formulations containing a lysine salt as tonicifying agent and uses thereof
AU2018372235B9 (en) * 2017-11-27 2022-03-10 4D Molecular Therapeutics Inc. Adeno-associated virus variant capsids and use for inhibiting angiogenesis
LT3716992T (lt) 2017-11-30 2022-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonisto panaudojimas akių angiogeninių sutrikimų gydymui
BR112020011072A2 (pt) 2017-12-13 2020-11-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. dispositivos e sistemas para gerenciamento de suporte de leito de coluna cromatográfica e métodos relacionados
CA3089481A1 (en) * 2018-01-26 2019-08-01 The Regents Of The University Of California Methods and compositions for treatment of angiogenic disorders using anti-vegf agents
WO2019217927A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
CN111378044B (zh) 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
EP3969564A1 (en) 2019-05-16 2022-03-23 Formycon AG Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
JP2022546082A (ja) 2019-09-03 2022-11-02 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達のための注入デバイス及び注入デバイスのためのパッケージ
CA3150482A1 (en) 2019-09-16 2021-03-25 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
WO2021072265A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
AU2020393842A1 (en) 2019-11-25 2022-06-16 The Regents Of The University Of California Long-acting VEGF inhibitors for intraocular neovascularization
BR112021025438A2 (pt) 2019-12-06 2022-06-21 Regeneron Pharma Composições de proteínas anti-vegf e métodos para produzir as mesmas
CA3163876A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf mini-traps and methods of use thereof
MX2022010177A (es) 2020-02-24 2022-09-12 Amgen Inc Envases y sistemas para su uso durante la esterilizacion externa de dispositivos de administracion de farmacos.
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2024029876A1 (ko) * 2022-08-02 2024-02-08 주식회사 파노로스바이오사이언스 변형된 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US6100071A (en) * 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production

Also Published As

Publication number Publication date
NO20100656L (no) 2002-02-08
DE60041159D1 (de) 2009-01-29
DK1544299T3 (da) 2009-03-23
AU779303B2 (en) 2005-01-13
NO20016036D0 (no) 2001-12-10
PT1544299E (pt) 2009-03-18
CA2376379C (en) 2007-08-07
CY2013019I1 (el) 2015-11-04
SK287332B6 (sk) 2010-07-07
MXPA01012630A (es) 2002-07-22
RS50073B (sr) 2009-01-22
MEP3208A (xx) 2010-02-10
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CZ302689B6 (cs) 2011-09-07
UA74146C2 (uk) 2005-11-15
NZ515913A (en) 2004-01-30
EP1544299A1 (en) 2005-06-22
PL352246A1 (en) 2003-08-11
ME00024B (me) 2010-02-10
DK1183353T3 (da) 2005-08-08
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HUS1300052I1 (hu) 2016-08-29
CN103349781A (zh) 2013-10-16
CN103349781B (zh) 2015-04-01
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AU2005201365A1 (en) 2005-04-28
YU86901A (sh) 2004-05-12
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JP2011024595A (ja) 2011-02-10
CY2013019I2 (el) 2015-11-04
EP1183353A1 (en) 2002-03-06
DE60019415T2 (de) 2006-03-09
HU230159B1 (hu) 2015-09-28
IL146890A0 (en) 2002-08-14
CA2376379A1 (en) 2000-12-14
CZ20014387A3 (cs) 2002-10-16
KR100659477B1 (ko) 2006-12-20
HUP0201515A2 (en) 2002-08-28
JP4723140B2 (ja) 2011-07-13
BE2013C029I2 (es) 2019-03-06
LTPA2013009I1 (lt) 2013-06-25
WO2000075319A1 (en) 2000-12-14
LU92195I2 (fr) 2013-07-15
CN101433715A (zh) 2009-05-20
DE60019415D1 (de) 2005-05-19
FR13C0028I1 (fr) 2013-06-14
RU2265661C2 (ru) 2005-12-10
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