CZ303656B6 - Lécivo pro lécení ocního onemocnení - Google Patents

Lécivo pro lécení ocního onemocnení Download PDF

Info

Publication number
CZ303656B6
CZ303656B6 CZ20100386A CZ2010386A CZ303656B6 CZ 303656 B6 CZ303656 B6 CZ 303656B6 CZ 20100386 A CZ20100386 A CZ 20100386A CZ 2010386 A CZ2010386 A CZ 2010386A CZ 303656 B6 CZ303656 B6 CZ 303656B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
flt1
vegf
fit
domain
protein
Prior art date
Application number
CZ20100386A
Other languages
English (en)
Inventor
J. Papadopoulos@Nicholas
Davis@Samuel
D. Yancopoulos@George
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22480568&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ303656(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of CZ303656B6 publication Critical patent/CZ303656B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Resení popisuje modifikované polypeptidy se zlepsenou farmakokinetikou. Konkrétne se popisuje pouzití fúzního polypeptidu schopného vázání cévního endotelového rustového faktoru (VEGF) pro výrobu léciva pro lécení ocního onemocnení charakterizovaného cévní permeabilitou, kde fúzní polypeptid sestává z: (a) imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 prvního VEGF receptoru a Ig domény 3 druhého VEGF receptoru; a (b) multimerizacní slozky, pricemz prvním VEGF receptorem je Flt1, druhým VEGF receptorem je Flk1 nebo Flt4, a první a druhou VEGF receptorovou slozkou jsou pouze VEGF receptorové slozky fúzního polypeptidu.

Description

Léčivo pro léčení očního onemocnění
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká modifikovaných polypeptidů se zlepšenou farmakokinetikou. Přesněji se předkládaný vynález týká použití fúzního polypeptidu schopného vázání cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) pro výrobu léčiva pro léčení očního onemocnění.
Dosavadní stav techniky
Schopnost peptidových ligandů vázat se na buňky a tak vyvolávat fenotypové reakce, jako je růst buněk, jejich přežívání, sekrece produktů buňkami nebo diferenciace, je často zprostředkována transmembránovými receptory na těchto buňkách. Extracelulámí doména takových receptorů (t.j. část receptorů vystavená na povrchu buňky) je obvykle nejvíce specifickou částí molekuly a dodává proteinu charakteristické vazebné charakteristiky. Vazba ligandů na extracelulámí doménu obvykle vede k přenosu signálu, kterým se přenáší biologické signály k intracelulámím cílům. Často je přenos signálu veden pres katalytickou intracelulámí doménu. Uspořádání motivů v této katalytické doméně určuje její účinky na potenciální kinázové substráty (Mohammadi et al., 1990, Mol, Cell Biol. 11: 5068-5078; Fantletak, 1992, Cell, 69: 413^113). Příklady receptorů, které přenášejí signály cestou katalytických intracelulámích domén, zahrnují receptorové tyrosin kinázy (RTK), jako je Trk rodina receptorů, kteréjsou obvykle omezeny na buňky nervového systému, cytokinová rodina receptorů, včetně trojdílného CNTF receptorového komplexu (Stáhl and Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466), která je také obvykle omezena na buňky nervového systému, receptory spřažené s G-proteinem, jako jsou například 2-adrenergní receptory, které se vyskytují, například, v buňkách srdečního svalu, a multimemí IgE vysoceafinitní receptor FcepsilonRI, který je lokalizován, například na žímých buňkách a na bazofilech (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421 428).
Zdá se, že všechny doposud identifikované receptory podléhají po vazbě ligandů dimerizaci, multimerizaci, nebo některým konformačním změnám (Schlessinger, J., 1988, Trens Biachem Sci., 3: 443-447; UUrich and Schlessinger, 1990, Cell 61: 203-212 Schlessinger und Ulrich,
1992, Neuron 9: 383-391) a molekulová interakce mezi dimenzujícími intracelulámími doménami vede k aktivaci katalytické funkce, V některých případech, jako například u destičkového růstového faktoru (PDGF), je ligandem dimer, který se váže na dvě receptorové molekuly (Hart et aL, 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264; 8905-8912), zatímco například u epidermálního růstového faktoru (EGF) je ligandem monomer (Weber et al., 1984,
J. Biol. Chem. 259: 14631-14636). V případě Fc RI receptorů existuje ligand, IgE, navázaný na Fc Rl ve formě monomeru a je aktivován pouze tehdy, když se na komplex IgE/Fc RI naváže antigen a dojde k zesítění sousedních molekul IgE (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421 — 428).
Často ukazuje tkáňová distribuce určitého receptorů ve vyšších organismech na biologickou funkci receptorů. RTK pro některé růstové a diferenciační faktory, jako je fibroblastový růstový faktor (FGF), jsou exprimovány v mnoha tkáních a proto se zdá, že mají nějakou úlohu při růstu tkání ajejich udržování. Členové Trk RTK rodiny (Glass and Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262-268) jsou obvykle omezeny na buňky nervového systému a rodina nervového růstového faktoru skládající se z nervového růstového faktoru (NGE), mozkového neurotrofního faktoru (BDNF), neurotrofinu 3 (NT-3) a neurotrofinu-4/5 (NT-4/5), které se váží na Trk rodinu RTk, podporuje diferenciaci různých skupin neuronů v mozku a na periferii (Lindsay, R.M.,
1993, vNeurotrofíc Factors, S.E., Loughlin and J.H. Fallon, ed., str. 257-284, San Diego, Ca, Academie Press). Fc RI se vyskytuje na velmi omezeném poctu typů buněk, jako jsou žírné buňky a bazofily. Žírné buňky vznikají z pluripotentních hematopoetických kmenovýh buněk kostní dřeně, ale dozrávají ve tkáních po migraci z krevního řečiště (viz Janeway and Travers,
- 1 CZ 303656 B6
1996. v Imunology, 2. vydání, M. Robertson and E. Lawrence, ed., str. 1:3-1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher), a podílejí se na alergické reakci.
Mnoho studií prokázalo, že extracelulámí doména receptoru dodává specifické charakteristiky vazby ligandu. Dále, buněčné prostředí, ve kterém je receptor exprimován, může ovlivňovat biologickou reakci vznikající po vazbě ligandu na receptor. Například, když je neuronální buňka exprimující Trk receptor vystavena působení neurotrofinu, který se váže na tento receptor, tak dojde k přežívání buňky a diferenciaci. Když je stejný receptor exprimován figroblasty, tak vede vystavení působení neutrofinu k proliferaci fibroblastů (Glass et al., 1991, Cell, 66: 405—413).
Byla identifikována třída buněčných dimemích mitogenů se selektivitou pro cévní endotelové buňky a tato třída byla označena jako cévní endote lový růstový faktor (VEGF). VEGF byl přečištěn z kondicionovaného růstového média krysích gliomových buněk (Conn et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, str. 2628-2632); a z kondicionovaného růstového média folikulárních hvězdicovitých buněk hovězí hypoíyzy (Ferrara and Henzel, 1989, Biachem. Biophys. Res. Comm. 161, str. 851-858 Gozopadorowicz et al, 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86, 7311— 7315); a z kondicionovaného média z lidských U937 buněk (Connelly, D.T., et al., 1989, Science, 246: 1309-1312). VEGF je dimer se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 46 kDa, kde každá podjednotka má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 23 kDa. VEGF má určitou strukturální podobnost s destičkovým růstovým faktorem (PDGF), který je mitogenem pro buňky pojivové tkáně, ale který není mitogenní pro cévní endotelové buňky z velkých cév.
Bylo zjištěno, že membránový tyrosin-kinázový receptor, známýjako Fit, je VEGF receptářem (De Vries, C. et al., 1992, Science 255, str. 989-991). Fit receptor specificky váže VEGF, který indukuje mitogenesi. O jiné formě VEGF receptoru, označené KDR, je také známí, že váže VEGF a indukuje mitogenesi. Také je známá částečná cDNA sekvence a téměř kompletní proteinová sekvence KDR (Terman, B.I., et al., 1991, Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B.I. et al., 1992, Biachem Biophys. Res. Comm. 187, str. 1579-1586),
Perzistující angiogenese může způsobovat nebo exacerbovat některá onemocnění, jako je psoriáza, revmatoidní artritida, hemangiomy, angiofibromy, diabetická retinopatie a neovaskulámí glaukom. Inhibitor aktivity VEGF by byl účinný v léčbě takových onemocnění a také jiné patologické angiogenese cévní permeability indukované VEGF, jako je vaskularizace nádorů. Předkládaný vynález se týká VEGF inhibitoru, kteiýje založen na VEGF receptoru Fltl.
Unik plazmy, klíčová složka zánětu, se vyskytuje v různých podskupinách mikrocév. Konkrétně, ve většině orgánů dochází k úniku plazmy specificky na venuiách. Na rozdíl od arteriol a kapilár se venuly stávají propustnými v reakci na různé zánětlivé mediátory, jako je histamin, bradykinín a serotonin. Jednou charakteristikou zánětu je únik plazmy, ke kterému dochází v důsledku mezibuněčných mezer v endote lu venul. Většina experimentálních modelů zánětu naznačuje, že tyto mezibuněčné mezery se vyskytují mezi endotelovými buňkami postkapilámě ve sběrných venulách (Baluk, P. et. al., Am, J. Pathol. 1998, 152: 1463-76). Bylo prokázáno, že některé lektiny mohou být použity pro odhalení lokálních míst úniku plazmy, mezer v endotelu a finger-like procesů na hranicích endotelových buněk ve venuiách v zánětlivém ložisku (Thurston, G. et al., Am. J. Physiol., 1996, 271: H72547-62). Konkrétně, rostlinné lektiny byly použity pro vizualizaci morfologických změn v endotelových buňkách v zánětlivých venuiách krysí průdušnice. Lektiny, jako je konkavalin A a ricin, které se váží lokálně na závětlivé venuly, ukázaly regiony stěny cévy pod mezerami v endotelu, které odpovídají regionům uniku plazmy (Thurston G., et aol. , Am. J. Physiol., 1996, 271: H2547-62).
Vlastnostmi mikrocév jsou dynamické. Chronická zánětlivá onemocnění jsou asociovaná s představou mikrovaskulatury, včetně angiongenese a zvětšování mikrocév. Mikrocévy mohou být také přestaveny tak, že mají abnormální vlastnosti. V myším modelu chronického zánětu dýchacích cest získávají kapiláry dýchacích cest vlastnosti venul, včetně zvětšení průměr cév, zvýšení reaktivity pro von Wilebrandův faktor a zvýšení reaktivity pro P-selektin. Dále, tyto remodelova7 e/. 303656 Βϋ né cévy se stávají propustnými v reakci na zánětlivé mediátory, zatímco cévy ve stejné lokalizaci v dýchacích cestách normálních myší nikoliv.
Bylo prokázáno, že některé substrakce snižují nebo inhibují cévní permeabilitu a/nebo unikání plazmy. Například mystíxiny jsou syntetické poíypeptidy, které inhibují unikání plazmy bez blokování tvorby endotelových mezer (Baluk, P., et al.. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284: 693 9). Také agonísta beta-2-adrenergních receptorů formoterol redukuje propustnost mikrocév tím, že ínhibuje tvorbu endotelových mezer (Baluk, P. and McDonald, D.M.. Am. J. Physiol., 1994, 266-L461-8).
to
Angiopoetiny a členy rodiny cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) jsou jedinými růstovými faktory, o kterých se soudí, že jsou specifické pro cévní endotelové buňky. Pokusy s cílenou inaktivací cév, a že pro pozdější stadia remodelování cév je nutný Ang-1.
US patent 6011003, udělený 4.1.2000 (Metris Therapeutics Limited), popisuje alterovanou, solubilní formu FLT polypeptidů, který je schopen vazby na VEGF a proto má inhibiční efekt na VEGF kde uvedený polypeptid se skládá z pěti nebo méně kompletních imunoglobulinových domén.
LJS Patem 5712380, udělený 27.1.1998 (Merck and Co.) popisuje inhibitory cévního endotelového růstového faktoru (VEGF), kteréjsou buď přirozené, nebo rekombinantně upravené solubilní formy s nebo bez C-koncového transmembránového regionu receptoru pro VEGF.
PCT přihláška WO 98/13071, publikovaná 2.4.1998 (Merck and Co.) popisuje techniku genové terapie pro inhibici růstu primárního nádoru a metastáz pomocí genového přenosu nukleotidové sekvence kódující solubilní receptorový protein, který se váže na VEGF.
PCT přihláška WO 97/44453, publikovaná 27.11.1997 (Genetech, Inc.) popisuje nové chimérické VEGF receptorové proteiny obsahující aminokyselinové sekvence odvozené od receptorů pro cévní endotelový růstový faktor (VEGF) Fltl a K.DR, včetně myšího homo logu pro lidský KDR receptor FLKl, kde uvedené chimérické VEGF receptorové proteiny se báží na VEGF a antagonizují proliferační a angiogenní aktivity endotelových buněk.
PCT přihláška WO 97/13787, publikovaná 17.4.1997 (Toa Gosei Co., Ltd.), popisuje inhibitor
VEGF s nízkou molekulovou hmotností použitelný v léčbě onemocnění spojených s neovaskularizací, jako jsou solidní nádory. Polypeptid obsahující první imunoglobulinu podobnou doménu a druhou imunoglobulinu podobnou doménu v extracelulárním regionu VEGF receptoru Fit, ale neobsahující šestou imunoglobulinu podobnou doménu a sedmou imunoglobulinu podobnou doménu vykazuje inhibiční aktivitu vzhledem k VEGF.
Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42: 242-249, popisují, že v důsledku toho, že monoklonální protilátky (MAb) jsou bazické proteiny s pozitivním nábojem a savčí buňky mají negativní náboj, mohu elektrostatické interakce mezi nimi vysoké základní interakce vedoucí k nízkému poměru nádoru vs. normální orgány. Pro vyřešení tohoto důsledku se výzkumníci pokusily zlepšit klírcns mAb pomocí různých metod, jako jsou sekundami činidla, nebo chemické nebo elektrické modifikace mAB samotných.
Jensen-Pippo et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107, popisují, že pegylace terapeutického proteinu, rekombinantního lidského faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (PEG-G-CSF), vede k zvýšení jeho stability a k retenci biologické aktivity in vivo, když je tento protein podán intraduodenálně.
Tsutsumi et aL, 1997, Thromb Haemost 77: 168-73, popisují pokusy, při kterých byla in vivo trombopoetická aktivita interleukinu 6 modifikovaného polyethylenglykolem (MPEG-1L-6). ve
-3CZ 303656 Β6 kterém bylo 54% ze 14 lysinových amino skupin IL-6 vázáno na /EG, srovnávána s aktivitou přirozeného IL-6.
Yang et ak, 1995, Cancer 76: 687-94, popisují, že konjugace polyethylenglykolu na lidský interleukin (IL-2) vede k zisku sloučeniny (polyethylen-glykolem modifikovaného IL-2 (PEG-1L2)), která si zachovává in vitro a in vivo aktivitu IL-2, ale která má významně prodloužený cirkulační poločas.
R. Duncan a F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) uvádějí přehled snad o zlepšení plazmatického poločasu asparaginázy pomocí konjugace s polyethylenglykolem.
PCT mezinárodní přihláška WO 99/03996, publikovaná 28.1. 1999 (Regeneron Pharmaceuticals, lne. a The Reagents of the University of Califomia) popisuje modifikované lidské podpůrné polypeptidy obsahující delece regionů s bazickými aminokyselinami. Je popsáno, že modifikované lidské podpůrné polypeptidy si zachovávají biologickou aktivitu a zároveň mají redukovanou afinitu pro heparin a lepší farmako kinetiku ve zvířecím séru ve srovnání s nemodifikovaným lidským podpůrným polypeptidem.
Podstata vynálezu
Předmětem tohoto vynálezu je použití fúzního polypeptidů schopného vázání cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) pro výrobu léčiva pro léčení očního onemocnění charakterizovaného cévní permeabiiitou, jehož podstata spočívá v tom, že fúzní polypeptid sestává z:
(a) imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 prvního VEGF receptoru a Ig domény 3 druhého VEGF receptoru; a (b) multimerizaění složky, kde první VEGF receptorem je Fitl, druhým VEGF receptorem je Fikl nebo Flt4 a první a druhou VEGF receptorovou složkou jsou pouze VEGF receptorové složky fúzního polypeptidů.
Výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v použití, kde fúzní polypeptid je uspořádán jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1, kde 1 je první VEGF receptorová složka, 2 je druhý VEGF receptorová složka a 3 je multimerizaění složka.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v uvedených použitích, kde multimerizaění složka zahrnuje imunoglobulinovou doménu, kterou je Fc doména IgG nebo těžký řetězec IgG.
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v uvedených použitích, kde fúzní polypeptid je kódován neukleotidovou sekvencí uvedenou na (a) obr. 21A až 21C, (b) obr. 22A a 22C, (c) obr, 24A až 24C nebo nukleotidovou sekvencí, která se v důsledku degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c).
Jiné výhodné provedení tohoto vynálezu spočívá v uvedených použitích, tohoto vynálezu spočívá v uvedených použitích, kde fúzní polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až 21C, obr. 22A až 22C nebo aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 24A až 24C. Přitom zvláště výhodné je použití, kde očním onemocněním je makulární degenerace asociovaná s věkem nebo diabetická retinopatie.
Dále se pro úplnost popisuje celá šíře nalezeného vynálezu.
Předkládaný vynález je zaměřen na antagonisty VEGF se zlepšenými farmakokinetickými vlastnostmi. Výhodným provedením je izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující fúzní polypep-4 C7, 303656 B6 tid schopný vazby na VEGF polypeptid obsahující: (a) nukleotidovou sekvenci kódující složku VEGF receptorů operativně navázanou na (b) nukleotidovou sekvenci kódující multimerizaení složku, kde VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu a kde se nukleotidová sekvence (a) skládá v podstatě z nukleotidové sekvence kódující aminos kyselinovou sekvenci Ig domény 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptorů a nukleotidové sekvence kódující aminokyselinovou sekvenci Ig domény 3 extracelulámí domény druhého
VEGF receptorů.
V prvním provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou prvního VEGF receptorů Fit l.
V dalším provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptorů Fikl,
V ještě dalším provedení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptorů F1t4.
is V dalším výhodném provedení je nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptorů před nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptorů.
V dalším výhodném provedení je nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulámí zo domény prvního VEGF receptorů za nukleotidovou sekvenci kódující Ig doménu 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptorů.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje multimerizační složka imunoglobulinovou doménu.
V jiném provedení je imunoglobulinová doména vybraná ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec IgG.
Mezi výhodná provedení patří izolovaná molekula nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující modifikovaný Fltl receptorový fúzní polypeptid, kde kódující region molekuly nukleové kyseliny se skládá z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující:
(a) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 13A až 13D;
(b) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 14A až 14C;
(c) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 15A až 15C;
(d) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 16A až 16D;
(e) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 21A až 21C;
(f) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 22A až 22C;
(g) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 24A až 24C; a (h) nukleotidové sekvence, které se - v důsledku degenerace genetického kódu - liší od nukleoti40 dové sekvence (a), (b), (c), (d), (e), (f) nebo (g) a které kódují molekulu fúzního polypeptidu majícího biologické aktivity Eltl receptorového fúzního polypeptidu.
V dalším provedení vynálezu je fúzní polypeptid kódovaný izolovanou molekulou nukleové kyseliny popsanou výše.
Výhodným provedením je přípravek schopný vazby VEGF molekuly za vzniku nefunkčního komplexu obsahujícího multimer fúzního polypeptidu.
Výhodný je také přípravek, ve kterém je multimerem dimer.
V ještě jiném provedení obsahuje přípravek nosič.
- 5 _
Jiným provedením je vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny popsanou výše, včetně expresního vektoru obsahujícího popsané molekuly nukleové kyseliny, ve kterých je molekula nukleové kyseliny operativně navázána na sekvenci řídicí expresi.
Dalším provedením jsou systémy vektor-hostite! pro produkci fúzního polypeptidů, které obsahují expresní vektor, ve vhodné hostitelské buňce; systémy hostitel-vektor, ve kterém je vhodnou hostitelskou buňkou bakteriální buňka, kvasinky, hmyzí buňka nebo savčí buňka; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou E. coli; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodnou hostitelskou buňkou COS buňka; systémy hostitel-vektor, ve kterých je vhodio nou hostitelskou buňkou CHO buňka.
Jiným provedením vynálezu je způsob přípravy fúzního polypeptidů, který zahrnuje kultivaci buněk systému vektor-hostitel za podmínek umožňujících produkci fúzního polypeptídu a odběr takto produkovaného fúzního polypeptidů.
Další provedení zahrnují fúzní polypeptid kódovaný sekvencí nukleové kyseliny uvedené na obr. 10A až 10D nebo na obr. 24A až 24C, který byl modifikován acetylací nebo pegylací, kde acetylace je provedena a alespoň lOOnásobným molámím nadbytkem acetylačního činidla nebo kde je acetylace provedena s molámím nadbytkem acetylačního činidla v rozmezí od alespoň
2o přibližně lOnásobku do přibližně lOOnásobku, nebo kde pegylaceje 10K nebo 20 PEG.
Výhodným provedením je způsob pro snížení nebo inhibici úniku plazmy u savců, který zahrnuje podání fúzního polypeptidů popsaného výše savci, včetně provedení, ve kterých je savcem člověk a fúzní polypeptidacetyiovaný nebo pegylovaný.
Dalším provedením je fúzní polypeptid, který se specificky váže na ligand VEGF receptorů, kterým je VEGF.
Výhodným provedením vynálezu je způsob pro blokování růstu krevních cév u člověka, který zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptid popsaného výše.
Výhodným provedením vynálezu je také způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF receptorů u člověka, který' zahrnuje podání účinného množství fúzního polypeptidů popsaného výše.
Výhodnými provedeními těchto metod jsou ta provedení, ve kterých je savcem člověk.
Další provedení způsobů podle předkládaného vynálezu zahrnují způsob pro zmírnění nebo prevenci růstu nádorů u člověka; zmírnění nebo prevenci vzniku otoků u člověka, zejména edému mozku; zmírnění nebo prevenci vzniku ascitu u člověka, zejména tehdy, když se jedná o ascites spojený s karcinomem ovaria.
Výhodnými provedeními vynálezu jsou fúzní polypeptidy schopné vazby na VEGF polypeptid obsahující (a) složku VEGF receptorů operativně navázanou na (b) multimerizačni složku, kde VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidů a skládá se v podstatě z aminokyselinové sekvence Ig domény 2 extracelulární domény prvního VEGF receptorů a aminokyselinové sekvence Ig domény 3 extracelulární domény druhého VEGF receptoru.
V dalším provedení fúzního polypeptídu je prvním VEGF reeeptorem Fhl.
V ještě dalším provedení fúzního polypeptidů je druhým VEGF reeeptorem Fikl.
V ještě dalším provedení fúzního polypeptidů je druhým VEGF reeeptorem Flt4.
-6CL 303656 Bó
Výhodnými provedeními jsou fúzní polypeptidy, ve kterých je aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulámí domény prvního VEGF reeeptoru před aminokyselinovou sekvencí Ig domény 2 extracelulámí domény druhého VEGF reeeptoru a fúzní polypeptidy, ve kterých je aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulámí domény prvního VEGF reeeptoru za aminokyselinovou sekvencí Ig domény 2 extracelulámí domény druhého VEGF reeeptoru.
V ještě jiném provedení obsahuje multimerizační složka fúzního polypeptidu imunoglobulinovou doménu a sem patří také provedení, ve kterém je imunoglobulinová doména vybrána ze skupiny zahrnující Fc doménu lgG, těžký řetězec IgG a lehký řetězec lgG.
H)
Mezi výhodná provedení patří fúzní polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci modifikovaného Fltl reeeptoru, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:
(a) aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 13A až 13D;
(b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 14A až 14C;
(c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 15A až 15C;
(d) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 16A až 16D;
(e) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až 21C;
(f) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 22A až 22C;
(g) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 24A až 24C.
Jiným výhodným provedením je způsob pro snížení nebo inhibici úniku plazmy u savce, který zahrnuje podání polypeptidu popsaného výše uvedenému savci.
Jiným výhodným provedením je způsob pro inhibici aktivity ligandu VEGF reeeptoru u savce, který zahrnuje podání polypeptidu popsaného výše uvedenému savci.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1. IEF gelová analýza nemodifikovaných a acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteinů. Nemodifikovaný Fit 1 (1-3)-Fc protein není schopen pronikat gelem v důsledku svého pH >9,3, zatímco acetylovaný Fit l (l—3)—Fc protein je schopen prostupovat gelem a dosahuje rovnováhy pří pí 5,2.
Obr. 2. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 -3) Fc a acetylovaného Fltl( 1 —3)—Fc proteinu na plotny potažené Matrigelem*. Nemodifikované Fit l( 1—3) proteiny se výrazně váží na složky extracelulámí matrice v MatrigeluR, zatímco acetylované Fit 1 (I—3)—Fc proteiny se neváží.
Obr. 3. Vazba nemodifikovaných Fit 1(1-3)-Fc proteinů, acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteinů a pegylovaných Fltl(l—3)—Fc proteinů v testu na bázi Biacore. Acetylované (sloupce 13 až 16), pegylované (sloupce 17 až 20) a heparinem zpracované Fit 1( 1 —3)—Fc (sloupce 21-24) byly každý schopen úplně kompetovat s Fit 1( 1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu na VEGF ve srovnání s kontrolními (sloupce 1 až 4) a irelevantními proteiny (sloupce 5 až 8). Nemodifikovaný Fltl (1-3 )-Fc (sloupce 5 až 6) jako jediný částečně kompletuje s Fltl(l-3)-Fc navázaným a Biacore čip o vazbu VEGF. Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (Sloupce 7 až 8) vedlo k zisku vazebného profilu podobného vazebného profilu (modifikovaných forem Fltl( l —
3)-Fc, což naznačuje, že nemodifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na čip, která může být eliminována promytím roztokem soli.
Obr. 4. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc, acetylovaného Fit 1(1-3)-Fe a pegylovaného
Fltl( 1-3)-Fc na VEGF v testu na bázi ELISA. Je pegylovaný, tak acetylovaný FitI( I—3)—Fc se váží na VEGF s afinitami blížícími se nemodifikovanému Fitl(l —3)—Fc.
-7CZ 303656 B6
Obr 5. Farmako kin etické profily nemodifikovaného Fit 1 (1 - 3)- Fc, acetylovaného Fit 1( !-3>Fc a pegylovaného F ltl(13)— Fe. Balb/c myším (23-28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc. Myším se odebírala krev z ocasu za 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci a sérum se testovalo ve standardním ELISA testu určeném pro detekci Fit 1 (1 —3)—Fc proteinu. Tmax pro všechny Fit I (1-3)-Fc proteiny bylo mezi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pro různé proteiny byla následující: nemodifikovaný 0,06 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetylovaný - 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; a pegylovaný - přibližně 5 ug/ml.
Obr. 6 A až 6B. IEG gelová analýza nemodifikovaných a postupně acety Iovaných Fltl( 1- 3)- Fc proteinů. Nemodifikovaný Fltl(l—3)—Fc protein není schopen prostupovat gelem v důsledku svého pH > 9,3, zatímco většina postupně acety Iovaných Fit 1 (1—3)—Fc (30 až lOOnásobný nadbytek vzorků) byly schopné migrovat gelem a dosahovaly rovnováhy při pí v rozmezí od 4,55 až 8,43, podle stupně acetylace.
Obr. 7. Vazba nemodifikovaného Fltl (1-3 )-Fc a postupně acety Iovaných Fltl( 1- 3)- Fc proteinů na plotny potažené Matrigelem(R). Stejně jako irelevantní kontrolní protein nevykazují postupně acetylovené Fltl(l—3)—Fc (20 až 30násobné vzorky) jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou MatrigelemtR), zatímco neacetylovaný Fit 1(1—3)—Fc protein vykazuje významnou vazbu. lOnásobné vzorky vykazují redukovanou vazbu, ale stupeň acetylace není dostatečný pro úplné blokování vazby na složky extracelulámí matrice.
Obr. 8. Vazba nemodifikovaného Fltl (1-3)-Fc a postupně acetylovaného Fit 1 (1—3)—Fc v testu na bázi Biacore. V sub-stoichiometrickém poměru (0,5 ug/ml bud’ nemodifikovaného Fltl (1-3) nebo postupně acetylovaného Fit 1 (1—3)—Fc vs. 0,2 ug/ml VEGF) není v roztoku dostatek Fltl(13)-Fc (nemodifikovaného nebo acetylovaného) pro úplnou vazbu VEGF. Při 1,0 ug/ml, což je přibližně 1 : 1 stoichiometrický poměr, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fltl (1-3 )-Fc lépe schopny kompetovat o vazbu VEGF, ale stále ještě není dostatek Fltl( 1-3)-Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) pro kompletní saturaci dostupné VEGF. Nicméně, při 5,0 ug/ml, což je několikrát více, než je stoichiometrický poměr 1 : 1, jsou jak Fit 1 (1-3)-Fc, tak postupně acetylovaný Fltl( 1-3)-Fc proteiny schopny saturovat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace.
Obr. 9. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Fit 1(1-3)-Fc a postupně Fit 1(1—3)-Fc. Balb/c myším (23-28 g) v podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo 10, 20, 40, 60 a 100-násobné vzorky postupně acetylovaného Fltl(1—3>—Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10, 20 a 40násobné vzorky a 2 myši pro 60 a lOOnásobné vzorky). Myším se odebírala krev z ocasu za 1,2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu a sérum se testovalo v ELISA testu určeném pro detekci Fltl( 1-3)-Fc proteinu. Tmax pro všechny testované Fitl( 1—3)—Fc proteiny bylo 6 hodin, ale Cmax byla následující: nemodifikovaný Fltl(l—3)—Fc - 0,06 ug/ml; lOnásobný nadbytek - 0,7 ug/ml; 20násobný nadbytek - 2,0 ug/ml; 40násobný nadbytek - 4,0 ug/ml; 60násobný nadbytek - 2,0 ug/ml; 1 OOnásobný nadbytek - 1,0 ug/ml.
Obr. 10A až 10D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Fltl(l3)-Fc.
Obr. 11. Schématický diagram struktury Fltl.
Obr. 12A a 1 2B. Analýza hydrofilnosti aminokyselinových sekvencí Ig domény 2 a Ig domény 3 Fltl.
Obr. 13A až I3D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mutl:
FLTl(l-3„)-Fc.
-8CZ 303656 Bó
Obr. 14A až 14C. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut2: Fit 1(2—3B)—Fc.
Obr. 15A a 15C. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut3: Fltl(2-3>-Fc.
Obr. 16A a 16D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc.
Obr. 17. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 -3)-Fc, mutantního Fltl(l—3)—Fc s delecí bazického regionu a mutantního proteinu Fit 1 (1-3)R >řs v testu na bázi Biacore. Při substoichiotrickém poměru (0,25 ug/ml Fit 1( 1-3)-Fc nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných vzorků vs. 0,1 ug/ml VEGF) je nedostatek Fit 1 (1-3)-Fc proteinu pro blokování vazby VEGF na Elt 1 (1 -3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Při 0,5 ug/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky nemodifikovaných Fltl( l-3)-Fc proteinů je stoichiomerický poměr přibližně 1:1 a je patrná zvýšená schopnost blokování vazby VEGF na Biacore čip. Při 1,0 ug/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných Fit 1(1-3)-Fc proteinů je stoiehiometrický poměr přibližně 10:1a Fltl(l-3)-Fc proteiny jsou schopny blokovat vazbu VEGF na Biacore čip, ale nejsou rovnocenné. Nemodifikovaný, acetylovaný a MutLFltl(1-3b)-Fc jsou v podstatě rovnocenné ve schopnosti blokovat vazbu VEGF zatímco Mut4:Fltl(1-3R_>N)-Fc je o něco méně účinný v blokování vazby.
Obr. 18. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (l-3)-Fc, Mutl:Fltl(l-3B)-Fc, Mut2:Fll(2-3B)-Fc a Fit 1(2-3) mutantních proteinů na plotny potažené MatrigelemR. Nemodifikovaný Fit 1 (1-3>-Fc protein se váže dobře na tylo jamky, Mut3:Fltl(2-3)-Fc protein se váže o něco slaběji a Mutl (23B)-Fc protein má nej lepší profil s vazbou slabší než kterýkoliv jiný mutantní protein. Mut4:Fltl(1—3r >n)~Fc glykosylovaný mutantní protein je v tomto testu pouze o něco lepší.
Obr. 19. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 - 3)- Fc, Mutl:Fll(l-3B)-Fc, Mut2:Fltl(2-3B)-Fc a Fltl(2-3) mutantních proteinů v testu na bázi ELISA. Při testovaných koncentracích se váží nemodifikovaný Fitl(1—3)—Fc, Mutl:Fltl(l-3B)-Fc, Mut2:Fltl(2-3B)-Fc a Fit 1(2-3) mutantní proteiny na VEGF podobně.
Obr. 20. Farmakokinetické proteiny pro nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc, Mutl :Flt 1(1-3 B)-Fc, Mut2:Fltl(2-3B)-Fc a Fit 1(2—3) mutantní proteiny. Cmax pro všechny tato činidla byly následující: nemodifikovaný Fítl(l-3)-Fc - 0,15 g/ml, 40-násobný molámí nadbytek acylovaného Fltl(l-3)-Fc-1,5 ug/ml; a Mutl:Fit 1(1-3b)-Fc -0,7 ug/ml.
Obr. 21A až 21C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptorů označeného Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a).
Obr. 22A až 22C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptorů označeného FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a).
Obr. 23. Test na extracelulámí matrici (ECM). Výsledky tohoto testu ukazují, že Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) proteiny jsou významně méně lepivé na ECM ve srovnání s Fit 1( 1—3)—Fc proteinem.
Obr. 24A až 24C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptorů označeného VEGFRlR2.Fc Cl (a).
Obr. 25A až 25C. Fosforylační test. Při 1,5 molárním nadbytku buď Fit 1 (1 -3)-Fc, nebo Fltl( 13)-Fc(A40) nebo dočasného Fltl D2Flkl D3.Fc Cl(a) dochází ke kompletní blokádě receptorové stimulace těchto tří modifikovaných Fltl receptorů ve srovnání s expozicí kontrolnímu médiu.
Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl (a) nevykazuje při tomto molámím nadbytku žádnou
- 9CZ 303656 B6 blokádu, ve srovnání s VEGF pozitivní kontrolou. Podobné výsledky jsou uvedeny na obr. 25B, kde jsou modifikován Fit receptory ve 3násobném molámím nadbytku vzhledem k VEGF 165 ligandu. Na obr. 25C, kde jsou modifikované Fltl receptory v 6-násobném molárním nadbytku kVEGF165 ligandu, je uvedeno, že dočasný FltlD2VEGFR.3D3.Fc Cl(a) Částečně blokuje
VEGF-165 indukovanou stimulaci buněčných povrchových receptorů.
Obr. 26A až 26B. Fosforylační test. Westernová hybridizace na tyrodinu fos fóry lo váných VEGFR2 (Fikl) VEGF165 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory nejsou fosforylované expozicí na vzorky, které obsahovaly VEGF 165 preinkubovaný v 1 a 2násobném molámím io nadbytku (obr. 261) nebo 3- nebo 4—násobném molámím nadbytku (obr. 26B) buď s dočasným
FltlD2FlklD3.Fc Cl (a), nebo stabilním Fltl D2Flkl D3.Fc Cl (a), nebo s dočasným VEGFR1R2Fc Cl (a). Při všech testovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru je patrná kompletní vazba VEGF 165 ligandu během preínkubace, což vede k nedetekovatelné stimulaci povrchových buněčných receptorů navázaných VEGF ve srovnání s kontrolním médiem.
Obr. 27. MG/R2 buněčný proliferační test. Následující modifikované Fit receptory Fit 1 (1 -3)-Fc,
Fit 1 D2Flk 1D3. Fc Cl (a) a Fltl D2VEGFR3D3.Fc Cl (a) a irelevantní receptor označený Tie2-Fc jako negativní kontrola, byly titrovány od 40 nM do 20 pM a byly inkubovány na buňkách po dobu 1 hodiny při 37 °C. Lidský rekombinantní VEGF165 v definovaném médiu se potom přidal do všech jamek v koncentraci 1,56 nM. Negativní kontrolní receptor Tie2-Fc neblokoval proliferaci buněk indukovanou VEGF 165 v žádné koncentraci, zatímco FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) blokoval 1,56 nM VEGF165 při poloviční maximální dávce 0,8 nM. Fltl(l-3)-Fc a Fltl D2VEGFR.3D3.Fc Cl (a) byla méně účinné v blokování VEGF 165 v tomto testu s poloviční maximální dávkou přibližně 2 nM. VEGF 165 sám měl při odečtu absorbanci 1,2 jednotky a pozadí je 0,38 absorbačních jednotek.
Obr. 28. Biacore analýza vazebné stoichiometríe. Vazebná stoichiometrie byla vypočtena jako molámí poměr navázaného VEGF165 k imobilizovanému FltlD2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFRlR2Fc Cl(a), za použití konverzního faktoru 1000 RU ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují vazebnou stoichiometrii jedné VEGF 165 dimemí molekuly na jednu molekulu FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFRlR2Fc Cl (a).
Obr. 29 a Obr. 30. Stoichiometrie chromatografie s vylučováním podle velikosti. Fltl D2FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFRlR2Fc Cl(a) v koncentraci 1 nM (což by mělo být
1 OOOkrát více než KD interakce FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFRlR2Fc C l(a)/VEGF 165) se smísily s různými koncentracemi VEGF 165. Po inkubací se měřily koncentrace volného Fltl D2FIklD3.Fc Cl (a) a roztoku. Data ukazují, že adice VEGF 165 do roztoku FItlD2FIkl D3.Fc Cl(a) zcela blokuje vazbu Fit 1 D2Flk 1 D3.Fc Cl (a) na povrch VEGF165. Tento výsledek ukazuje na vazebnou stoichiometrii jedné molekuly VEGF 165 na jednu molekulu
FltlD2FlklD3.Fc Cl(a).
Obr. 31. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za nativních podmínek. Pík 1 představuje komplex FltlD2Flkl D3.Fc Cl (a)/VEGF165 a pík 2 představuje nenavázaný VEGF 165. Frakce eluované mezi 1,1 a 1,2 ml se kombinovaly a přidal se guanidinium hydro45 chlorid (GuHCl) v konečné koncentraci 4,5 M pro disociací komplexu.
Obr. 32. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za disociačních podmínek. Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molárního poměru se 50 ml disociovaného komplexu vneslo do Superose 12 Pc 3.2/30 uvedené do rovnováhy v 6M GuHCl ?() a provedla se eluce. Pík 1 představuje Fltl D2Flkl D3.Fc Cl (a) a pík 2 představuje VEGF 165.
Obr. 33. 34 a 35. Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s detektorem rozptylu světla. Kolona pro chromatograťii s vylučováním podle velikosti částic s MiniDawn Online detektorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) a detektory refrakterního indexu (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) se použily pro určení molekulové hmotnosti
- 10CZ 303656 tsó (mol. hmot.) komplexu ligand-receptor. Jak je uvedeno na obr. 33, ukazuje eluční profil dva píky. Pík 1 představuje komplex ligand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Mol. hmotnost byla vypočtena z LS a RI signálů. Stejný postup byl použit při určení molekulové hmotnosti jednotlivých složek komplexu ligand-receptor. Výsledky těchto pokusů jsou následus jící: molekulová hmotnost komplexu Fit 1 D2Flk 1D3.Fc Cl(a)/VEGF165 v píkové pozici je
157300 (obr. 33), molekulová hmotnost VEGF165 v píkové pozici je 44390 (obr. 34) a molekulová hmotnost Rl R2 v píku je 113300 (obr. 35).
Obr. 36. Mapování peptidů a analýza glykosylace. Disulfidové struktury a glykosylační místa ío Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) byly určeny metodou peptidového mapování. Ve Fltl D2.Flk 1 D3.Fc Cl (a) existuje celkem 10 cysteinů; šest z nich náleží k Fc regionu. Cys27 je disulfidové vázán na
Cys76. Cysl21 je disulfidové vázán na Cysl82. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys21l aCys214) tvoří intermolekulovou disulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny vjíném Fc řetězci. Nicméně, nemůže být stanoveno, zda se disulfidová vazby vyskytuje mezi stejnými cysteiny (Cys211 a Cys211, například), nebo mezí Cys211 a Cys214. Cys216 je disulfidové vázán na Cys306. Cys352 je disulfidové vázán na Cys410.
Ve Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) existuje 5 možných N-vázaných glykosylačních míst a tato místa jsou glykosylována v různém stupni. Kompletní glykosylace je pozorována na Asn33, Asnl93 aAsn282. Částečná glykosylace je pozorována na Asn65 a Snl20. Místa glykosylace na obr. podtržena.
Obr. 37. Farmakokin etiky F1tl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a). Balb/c myším byly injekčně podkožně podány 4 mg/kg Fit 1( 1—3)—Fc (A40), CHO dočasně 25 exprimující Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a), CHO stabilně exprimující Fltl D2. Fikl D3.Fc Cl (a)
A CHO dočasně exprimující VEGFR1R2-Fc Cl(a) Myším byla z ocasu odebírána krev za 1,2,
4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 dnů po injekci. Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekci Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a). Tmax a stabilní FltlD2.FlklD3.Fc C1 (a) a přechodný VEGFR1R2-Fc Cl (a) byl 24 hodin. Cmax) pro
Fltl(l-3)Fc (A40) byla 8 ug/ml, pro oba dočasné (FltlD2,FIklD3.Fc Cl(a) a VEGFR1R2-Fc
Cl (a)) byla 18 ug/ml a Cmax pro stabilní VEGFRlR2-FcCl(a) byla 30 ug/ml.
Obr. 38. Farmakokinetiky Fit 1( 1-3)-Fc (A40), FltiD2.FlklD3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR3R3Fc Cl (a). Balb/c myším byly injekčně podkožně podány 4 mg/k Fit 1( 1-3)-Fc (A40). CHO do35 ěasne exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a CHO dočasně exprimující FltlD2VEGFR3R3-Fc
Cl (a). Myším byla z ocasu odebírána krev za 1,2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci. Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekci Fltl(1—3)—Fc (A40), Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) nebo FltlD2.VEGFR3R3-Fc Cl (a). Fltl(l-3)-Fc (a40) nebyl detekován v séru po 5 dnech, zatímco FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a FItlD2.VEGFR3R3-Fc Cl (a) byly detekovatelně i po 15 dnech.
Obr. 39. Schopnost FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) inhibovat růst tibrosarkomu HT-1080 in vivo.
Léčba SCID myší každý druhý den nebo 2krát týdně 25 mg/kg Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (A) signifikantně snižuje růst podkožních fibrosarkomů HT-1080.
Obr. 40. Schopnost Fltl D2.FiklD3.Fc C1 (a) inhibovat růst gliomu C6 in vivo. Léčba SCID myší každý den nebo 2krát týdně 2,5 mg/kg Fit 1D2.Flk 1 D3.Fc Cl(a) signifikantně snižuje růst podkožních gliomů C6.
Obr. 41. Děložní hyperpermeabilita indukovaná VEGF. PMSG injikovaný podkožně (5 IU) pro indukci ovulace preburetálním myším samicím způsobil surge of estradiolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukci VEGF v děloze. Tato indukce způsobila hyperpermeabilitu dělohy azvýšila obsah kapaliny v děloze. Podkožní injekce fltl(l-3)-Fc (A40), Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) v dávkách 25 mg/kg l hodinu po injekci PMSG vedla k přibližně 50% inhibici zvýšení vlhké hmotnosti dělohy.
Obr. 42A až 42B. Hodnocení angiogenese v corpus luteum za použití progesteronu jako sledované hodnoty PMSG byl injikován podkožně (5 IU) pro indukci ovulace u prepubertálních myších samic, což vedlo ke vzniku plně funkčního corpus luteum obsahujícího hustou síť krev5 nich cév, kde toto corpus luteum secemovalo do krve progesteron za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogenese v corpus luteum vyžaduje VEGF. Klidové koncentrace progesteronu jsou přibližně 5 ng/ml a PMSG může indukovat hodnoty až 25 až 40 ng/nl. Podkožní injekce Fltl(l-3)-Fc (A40) nebo FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) vdávce 25 mg/kg nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4.
io
Podrobný popis vynálezu
V oboru dlouho přetrvávaly problémy při indukci receptorového antagonisty VEGF s farmakokinetickým profilem, který by byl vhodný pro použití antagonisty jako možného terapeutika. i5 Předkladatelé vynálezu zde poprvé popisují chimérický polypeptid schopný antagonizování
VEGF, který má lepší farmako kinetické vlastnosti ve srovnání s jinými antagonisty VEGF na bázi receptoru. Chimérické polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou tedy prvními molekulami vhodnými pro léčbu, při které je žádoucí dosažení antagonizování VEGF.
Předkládaný vynález poskytuje nové chimérické polypeptidy vytvořené fúzováním modifikované extracelulámí vazebné domény pro ligand Fltl receptoru a Fc regionu IgG.
Extracelulámí vazebná doména pro ligand je definována jako Část receptoru, která - ve své přirozené konformací v buněčné membráně — je orientována extracelulámě, takže může kontakto25 vat svůj ligand. Extracelulámí vazebná doména pro ligand neobsahuje hydrofobní aminokyseliny asociované s transmembránovou doménou receptoru ani žádné aminokyseliny asociované s intracelulámí doménou receptoru. Obecně je intracelulámí nebo cytoplazmatická doména receptoru složena obvykle z pozitivně nabitých nebo polárních aminokyselin (t.j. lysinu, argininu, histidinu, kyseliny glutamové, kyseliny asparagové). Předchozích 15 až 30, především hydrofob30 nich nebo apolámích aminokyselin (jako je leucin, valin, isoleucin a fenylalanin), tvoří transmembránovou doménu. Extracelulámí doména obsahuje aminokyseliny, které předcházejí hydrofobnímu transmembránovému řetězci aminokyselin. Obvykle je transmembránová doména obklopena pozitivně nabitými nebo polárními aminokyselinami, jako je lysin nebo arginin. Von Heijne publikoval podrobná pravidla, která jsou používána odborníky v oboru pro stanovování toho, zda daný receptor náleží k extracelulámí, transmembránové nebo intracelulámí doméně (viz von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25-30). Alternativně, na Internetu jsou dostupné stránky, jako například http://ulrec3.unil.ch/software/TM PRED_form.html, které umožní odborníkům v proteinové chemii predikci týkající se proteinových domén.
Předkládaný vynález umožňuje konstrukci molekul nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy, kteréjsou vloženy do vektoru, který exprimuje molekuly chimérických polypeptidů po vložení do vhodné hostitelské buňky. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou, například, bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky a savčí buňky. Jakákoliv metoda známá odborníkům v oboru pro inserci DNA fragmentů do vektoru může být použita pro konstrukci expresních vektorů kódujících chimérické polypeptidové molekuly pod kontrolou transkripčních/translačních kontrolních signálů. Mezi tyto metody patří rekombinantní DNA a syntetické techniky in vitro, a in vivo rekombinace (genetické rekombinace) (viz Sambrook ct al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, cd. Ausubel et al., Greene PubL Assoc., Wiley-Interscience, NY).
Exprese molekul nukleové kyseliny kódujících chimérické polypeptidové molekuly muže být regulována druhou sekvencí nukleové kyseliny tak, že chimérická polypeptidová molekula je exprimována v hostiteli transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Například, exprese chimérických polypeptidových molekul, jak je zde popsána, může být řízena jakýmkoliv promo55 torem/zesilovačem transkripce známým v oboru. Promotory, které mohou být použity pro řízení
- 12CZ 303656 B6 exprese chimérických polypeptidových molekul, jsou například: dlouhá koncová repetice, jak je popsána v Squinto et al., (1991, Cell, 65: 1-20); časný promotorový region SV40 (Bemoist and Chambon, 1981, Nátuře 290: 304-310), CMV promotor, M-MuLV 5' koncový repetitivní promotor obsažený v 3' dlouhé koncové repetitivní sekvenci viru Rousova sarkomu (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22: 787-797), promotor herpetické thymidin kinázy) wagner et al, 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78. 144-1445), regulační sekvence metailothioninového genu (Brinsten et al., 1982, Nátuře 296: 39 42); prokaryotické expresní vektory, jako je beta-laktamový promotor (Villa-Kamaroff et al., 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731), nebo tac promotor (DeBoer et al.. 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25, viz též „Useful proteins from recombinant bacteria“, v Scientific American, 1980, 242: 74-94); promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, jako je Gal4 promotor, ADH (alkohol dehydrogenasový) promotor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promotor, promotor alkalické fosfatázy a následující zvířecí transkripční kontrolní regiony, které vykazují tkáňovou speciflcitu a které byly použity u transgenních zvířat: kontrolní region genu pro elastasu I, který je aktivní v acinámích buňkách slinivky břišní (Swift et al., 1984, Cell, 38: 639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); kontrolní region insulinového genu, který je aktivní v beta-buňkách slinivky břišní (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 115-122), kontrolní region imunoglobulinového genu, který je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl et al., 1984, cell 38. 647-658; Adames et al., 1985, Nátuře 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436-1444), kontrolní region viru myších nádorů mléčné žlázy, který je aktivní v testikulámích, prsních, lymfoidních a žímých buňkách (Leder et al., 1986, Cell 45: 485 495), kontrolní region albuminového genu, který je aktivní v játrech (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), kontrolní region alfa-fetoproteinového genu, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 5358); kontrolní region genu pro alfa-l-antitrypsin, který je aktivní v játrech (Kelsey et al., 1987, Genes and devel. 1: 161-171), kontrolní region genu por beta-globin, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); kontrolní region genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytech v mozku (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-712); kontrolní region genu pro lehký řetězec 2 myosinu, který je aktivní v kosterním svalu (Shani, 1985, Nátuře 314: 283-286), a kontrolní region genu pro hormon uvolňující gonadotropin, který je aktivní v hypothalamu (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
Podle předkládaného vynálezu jsou tedy expresní vektory replikovatelné v bakteriálních nebo eukaryotíckých hostitelích obsahující nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy podle předkládaného vynálezu použity pro transfekci hostitele a tak pro řízení exprese takových nukleových kyselin tak, že produkují chimérické polypeptidy, které mohou být potom získány v biologicky aktivní formě. Termín biologicky aktivní formy označuje formy schopné vazby na VEGF.
Expresní vektory obsahující chimérické molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být identifikovány třemi obecnými postupy: (a) DNA-DNA hybridizací; (b) podle přítomnosti nebo nepřítomnosti funkce „markerového“ genu; a (c) podle exprese inserto váných sekvencí. V prvním způsobu může být přítomnost cizorodého genu insertovaného v expresním vektoru detekována DNA-DNA hybridizací za použití sond obsahujících sekvence, které jsou homologní se sekvencemi insertované chimérické polypeptidové molekuly. Ve druhém způsobu může být systém rekombinantní vektor/hostitel identifikován a selektován podle přítomností nebo nepřítomnosti některých funkcí „markerového“ genu (například podle aktivity thymidin-kinázy, podle resistence na antibiotika, podle transformačního fenotypu, podle tvorby oklusníeh tělísek v bakuloviru atd.), kteréjsou způsobeny insercí cizorodých genů do vektoru. Například, kdyžjc DNA sekvence pro chimérický polypeptid vložena do vektoru do sekvence markerového genu, tak mohou být rekombinanty obsahující insert identifikovány podle absence funkce markerového genu. Ve třetím způsobu mohou být rekombinantní expresní vektory identifikovány testováním produktu cizorodého genu exprimovaného rekombinantem. Takové testy mohou být založeny, například, na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech chimérických polypeptidů.
- 13CZ 303656 B6
Buňky podle předkládaného vynálezu mohou dočasně, nebo lépe konstitutivně a permanentně, exprimovat chimérické polypeptidy.
Chimérické polypeptidy mohou být přečištěny jakoukoliv technikou, která umožňuje následnou tvorbu stabilních, biologicky aktivních chimérických polypeptidu. Například mohou být faktory získány z buněk ve formě sol ubil nich proteinů nebo ve formě inkl usních tělísek, ze kterých mohou být extrahovány kvantitativně 8M guinidinium hydrochloridem a dialýzou (viz například Builder et al., US patent 5663304). Pro další přečištění faktorů může být použito běžné iontoměničové chromatografie, chromatografie s reverzní fází nebo gelové filtrace.
V jednom provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku před nukleotidovou sekvencí kódující druhou složku, V jiném provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku za nukleotidovou sekvencí kódující druhou složku. Mohou být připravena další provedení vynálezu, ve kterých je pořadí první, druhé a třetí složky jiné. Například, pokud je nukleotidová sekvence kódující první složku označena č. 2 a nukleotidová sekvence kódující třetí složku označena č. 2, tak může být pořadí složek izolované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve směru 5' až 3' jedno z následujících pořadí, 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1.
Předkládaný vynález má také diagnostické a terapeutické použití. V konkrétních provedeních vynálezu mohou být způsoby pro detekci aberancí ve funkci nebo expresi chimérických polypeptidů podle předkládaného vynálezu použity pro diagnostiku onemocnění. V jiných provedeních může být úprava chimérických polypeptidu nebo agonisté nebo antagonisté, kteří se váží na chimérické polypeptidy, použita pro léčbu onemocnění. V dalších provedeních jsou chimérické polypeptidy použity jako činidla pro blokování vazby vazebného Činidla na cíl.
Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit například pro léčbu onemocnění, která jsou charakterizována cévní permeabilitou, edémem nebo zánětem, jako je edém mozku, asociovaný s poraněním, mrtvicí nebo nádorem; edémem asociovaným se záněty jako je psoriáza nebo artritida, včetně revmatoidní artritidy; atsha; generálizovaný edém spojený s popáleninami; ascites a pleurální výpotky asociované s nádory, záněty nebo úrazy; chronické záněty dýchacích cest, syndrom zvýšené propustnosti kapilár; sepse; onemocnění ledvin asociované s vyššími ztrátami proteinů; a oční onemocnění, jako je makulámí degenerace asociovaná s věkem a diabetická retinopatie.
Analýza aminokyselinové sekvence Fltl( 1-3)-Fc ukázala přítomnost neobvykle vysokého počtu (46) bazické aminokyseliny lysinu. IEF analýza Fltl(l-3)-Fc ukázala, že tento protein má pl vyšší než 9,3, což potvrzuje předpoklad, že tento protein je velmi bazický. Předpokládá se, že bazický charakter Fltl (1-3 )-Fc způsobuje jeho vazbu na složky mezibuněčné hmoty a tato interakce může způsobit extrémně krátký cirkulační sérový poločas Fit 1 (l —3)—Fc, když je injekčně podán myším. Pro testování této hypotézy byl Fit 1(1— 3)-Fc protein acetylován na lysinu za účelem redukce této bazicity. Acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc byl potom testován v testu popsaném dále.
Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak jek neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1: Exprese Fit 1 (1 —3>—Fc proteinu v CHO K.1
Za použití standardních technik molekulární biologie (viz např. Molecular Cloning, A Laboratory
Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Bio- 14 CZ 303656 B6 logy (ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) se gen kódující Fit 1(13)-Fc insertoval do expresního vektoru pEE14.1 (Lonza Biologics, pil) v mnohotném klonovacím místě za CMV promotorem. CHO K1 buňky se transfektovaly pEEl4.1/Flt 1 (1 -3)-Fc DNA konstruktem za použití lipofektaminu (Gaithersburg, MD). Transfektovaně CHO K1 buňky se kultivovaly v bezglutaminovém DMEM (JRH, Kansas City, MO) obsahujícím 25 um methionin sulfoximu (msx) od Sigma lne., St. Louis, MO, a buňky exprimující vysoké kvality rekombinantního proteinu se získaly testováním supematantů CHO K1 buněk zvíce než 100 ručně odebraných kolonií izolátů za použití standardního imunotestu, který zachycuje a detekuje lidský Fc. Selektované ručně odebrané kolonie se amplifikovaly za přítomnosti 100 μΜ MSX a potom se provedlo druhé kolo skríningu amplifíkovaných kolonií. Klon s vyšší produkcí měl specifickou produktivitu rekombinantního Fit 1 (1-3)-Fc proteinu 55 pg/buňky/den.
Selektovaný klon byl expandován v T-baňce o objemu 225 cm2 (Corning, Acton, MA) a potom se přenesl do 8,5 1 válcových zkumavek (Corning, Acton, MA) za použití buněčného kultivačního média popsaného výše. Buňky se odstranily z válcových zkumavek pomocí standardní trypsinizace a vnesly se do 3,5 litru suspenzního média. Suspenzní médium se skládalo z bezglutaminového ISCHO média (Irvine Scientifie, Santa Ana, CA) obsahujícího 5% fetální hovězí sérum (FBS od Hyclone Labs, Logan, LT), 100 μΜ MSX a GS doplněk (JRH Scientifie, Kansas City, MO) v 5 1 Cellingen bioreaktoru (New Brunswick Scientifie, New Brunswick, NJ) v hustotě
3,5 x 106 buněk/ml. Poté, co buňky dosáhly density 3,6 x 106/ml a adaptovaly se na suspenzi, byly přeneseny do 60 1 bioreaktoru (ABEC, Allentown, PA) v hustotě 0,5 x 106 buněk/ml ve 20 1 ISCHO média s 5% fetálním hovězím sérem. Po 2 dnech se do bioreaktoru přidalo dalších 20 I ISCHO + 5% fetální hovězí sérum. Buňky se nechaly růst po dobu dalších dvou dnů do dosažení konečné hustoty 3,1 x 106 buněk/ml a konečná koncentrace Fit 1(1-3)-Fc při sběru byla 95 mg/ml. Při odběru byly buňky odstraněny filtrací s tangenciálním tokem za použití 0,45 μηι Prostak filtrů (Millipore, lne., Bedford, MA).
Příklad 2: Přečištění Fit 1 (1-3)-Fc proteinu získaného z CHO K1 buněk.
Fltl(l-3)-Fc protein byl nejprve přečištěn afinitní chromatografii. Kolona s proteinem A byla použita pro navázání, s vysokou specificitou, Fc části molekuly. Tento afinitně přečištěný protein byl potom zahuštěn a nechal se projít SEC-kolonou. Protein byl potom eluován do formulačního pufru. Dále je tento postup popsán podrobně.
Materiály a metody
Všechny chemikálie byly získány od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, s výjimkou PBS, který byl získán jako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Protein A Fast Flow a Superdex 200 přípravky pryskyřic byly získány od Pharmacia, Piscataway, NJ. Vybavení a membrány pro zahuštění proteinu byly získány od Millipore, Bedford, MA.
Přibližně 40 1 0,45 um-filtro váného CHO kondicionovaného média obsahujícího Fit 1 (1- 3)- Fc protein se aplikovalo do 290 ml Protein A Fast Flow kolony (průměr 10 cm), která se uvedla do rovnováhy v PBS. Kolona se promyla PBS obsahujícím 350 mM NaCl a 0,02% CHAPS a navázaný protein se eluoval 20 mM kyseliny citrónové obsahujícími 10 mM Na2HPO4. Jediný pík v eluátu se odebral ajeho pH se zvýšilo na neutrální hodnotu pomocí 1M NaOH. Frakce eluátu se zahustily na neutrální hodnotu pomocí ÍM NaOH. Frakce eluátu se zahustily na přibližně 9 mg/ml za použití 10K regenerovaných celulózových membrán za použití jak filtrace s tangenciálním tokem, tak zahuštění buněk míšením. Pro odstranění agregátů a jiných kontaminujících složek se zahuštěný protein aplikoval do kolony naplněné Superdex 200 pryskyřicí (10 cm x 55 cm) a provedla se eluce PBS obsahujícím 5% glycerol. Hlavní píky se odebraly, sterilně se přefiltrovaly, rozdělily se do podílů a uskladnily se při teplotě -80 °C.
- 15 CZ 303656 B6
Příklad 3: Acetylace Fit 1 (1—3)—Fc proteinu mg Fit 1 (l—3)—Fc proteinu se acetylovaly způsobem popsaným v návodu k použití sulfo—NHS— acetátového modifikačního kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Kat. č. 26777).
Příklad 4: Charakterizace acetylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc proteinu (a) IEF analýza: Fltl (1-3)-Fc a acetylovaný Fltl (1—3)—Fc se analyzovaly standardní IEF analýzou. Jak je uvedeno na obr. 1, Fit 1(1—3)—Fc protein není schopen migrovat do gelu a proto musí mít pí vyšší než 9,3, což je nejvyšší pl ve standardu. Nicméně, acetylovaný Fit 1( 1—3>—Fc je schopen migrovat do gelu a dosahuje rovnováhy při pí přibližně 5,2. Tento výsledek demonstruje, že acetylace významně redukuje pozitivní náboj proteinu a tak jeho pl.
(b) Vazba na složky mezibuněčné hmoty
Pro testování vazby na složky mezibuněčné hmoty se Fltl(l—3)—Fc acetylovaný Fltl(1—3)—Fc testovaly v testu napodobujícím interakce se složkami mezibuněčné hmoty. V tomto testu jsou 96-jamkové tkáňové kultivační plotny potažené Matrigelem (Biocoat MATRIGELR 96—jamková plotna s tenkou vrstvou matrice, katalog, č. 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Plotny se inkubovaly se různými koncentracemi Fit 1 (1—3)—Fc, acetylovaného Fltl(1—3)—Fc nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu, které se přidaly do jamek. Plotny se inkubovaly po dobu 1 až 2 hodin buď při teplotě místnosti, nebo při 37 °C, a potom se detekce navázaných proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamek. Nakonec se do jamek přidal substrát pro alkalickou fosfatázu a měřila se optická densíta. Obr. 2 ukazuje výsledky tohoto testu. Podobně jako irelevantní kontrolní protein rTie2-Fc, nevykazoval acetylovaný Fit 1( 1-3)-Fc jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný Fltl( 1—3)—Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tento výsledek naznačuje, že acetylace bazických aminokyselinových zbytků je účinnou cestou pro interferenci s elektrickými interakcemi, které existují mezi proteiny s pozitivním nábojem a negativně nabitými složkami extracelulámí hmoty, které se odehrávají in vivo.
Příklad 5: Pegylace Fltl(l—3>—Fc proteinu
Ačkoliv bylo prokázáno, že pegylace (polyethylenglykol = PEG) proteinu zvyšuje jeho účinnost in vivo tím, že zvyšuje jeho stabilitu a biologickou dostupnost za minimalizace imunogenicity (viz odkazy citované výše), je intuitivně nevhodné pegylovat molekuly, kteréjsou příliš velké pro g lome rulami filtraci s cílem zlepšení jejich farmako kinetických vlastností. Bez vazby na konkrétní teorii předkladatelné vynálezu postupovaly teorii, že pegylace Fit 1(1-3)-Fc molekul může zlepšit jejich farmako kinetické vlastnosti, pravděpodobně ne změnou pozitivního náboje nebo snížením pl Fit 1 (1—3)—Fc, ale spíše fyzikálním odstraněním pozitivního náboje z interakce s extracelulámí hmotou. Předkladatelé vynálezu se rozhodli o pokus o zlepšení farmakokinetických vlastností Fit 1 (1—3)—Fe molekul tak, že naváží řetězec 20K PEG, jak je popsáno dále. Materiály a metody
Přečištění Fltl( 1-3)-Fc získaný z CHO buněk (viz výše) byl použit v následujících pegylačních pokusech. Funkcionalizované EPG byly získány od Shearwater Polyrners, Huntsville, AL; Bicin od Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 kolona do Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS jako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; a Bis-Tris přede odlité gely od Novex, CA.
20K řetězce funkcionalizované amin-specifíckými koncovými skupinami byly použity v reakčních pokusech v malém rozsahu, které byly provedeny pro hodnocení různých reakčních
- 16 CZ 303656 B6 podmínek, ve kterých se lišila stoichiometrie PEG : protein. Na základě těchto reakcí a analýzy vzorků na standardní SDS-PAGE reagoval Fit 1(1-3)-Fc v koncentraci 1,5 ng/ml při pH 8,1 s20K SPA-PEG (PEG-sukcinimidylpropionat) molekulami při molámím poměru PEG:FIt 1 (1 3)-Ec monomer 1 : 6. Reakce se nechala probíhat při 8 °C přes noc. Pro počáteční přečištění se s reakční produkty aplikovaly do 10 mm x 30 cm Superose 6 kolony uvedené do rovnováhy PBS obsahujícím 5% glycerol. Zdá se, že kolona separovala pegylované Fltl(1 —3)—Fc molekuly podle rozsahu pegy láce. Byly odebrány frakce odpovídající primárně monopegylovaným a dipegylovaným dimerickým Fit 1 (1 -3)-Fc, jak byl potvrzeny charakterem proužků na redukujících a neredukujících SDS-PAGE gelech. Koncentrace proteinu byla určena měřením absorbance při io 280 nm. Pegylovaný Fltl(1 -3>-Fc protein byl sterilně přefiltrován, rozdělen do podílů a uskladněn při 40 °C.
Příklad 6: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(1 —3)—Fc v testu na bázi Biacore
Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fltl(1—3)—Fc proteiny byly testovány v testu na bázi Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(l-3>-Fc protein imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction
Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a vzorek obsahující 0,2 ug/ml VEGF a buď nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc, acetylovaný Fit 1 (1-3)-Fc nebo pegylovaný Fitl(I-3)-Fc (vždy při 25 ug/ml) se přelil přes čip potažený Fit 1 (1 —3)—Fc. Pro minimalizaci vlivu nespecifické vazby se navázané vzorky promyly 0,5 M NaCl. V jednom vzorku se nemodifikovaný Fltl(l— 3)-Fc smísil s heparinem. Heparin je molekula s pozitivním nábojem, takže když jsou tyto dvě molekuly smíseny dohromady, měly by interagovat v důsledku svých příslušných nábojů. Toto v podstatě neutralizuje vlastní pozitivní náboj Fit 1( 1—3)—Fc což způsobí, že se molekula chová jako chemicky či geneticky modifikovaná tak, zeje redukován její náboj a její tendence k vazbě prostřednictvím elektrických interakcí. Jak je uvedeno na obr. 3, acetylované (sloupce 13 až 16), pegy lované (sloupce 17 až 20) a heparinem zpracované Fit l (1—3)—Fc (sloup30 ce 21 až 24) jsou každý schopen zcela inhibovat s Fltl(l— 3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF ve srovnání s kontrolním (sloupcem l až 4) a irelevantním (sloupce 5 až 6) pouze částečně soutěžil s Fltl(l-3)-Fc navázaným na Biacore Čip o vazbu VEGF. Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (sloupce 7 až 8 vedlo k dosažení vazebného profilu podobného profilu modifikovaných forem Fit 1 (1 —3)—Fc, což naznačuje, že modifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na čip, která může být eliminována promytím solným roztokem.
Příklad 7: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(1-3)-Fc v testu na bázi ELISA.
Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc proteiny byly testovány v testu na bází ELISA pro hodnocení jejich schopnosti vazby na ligand Fltl receptoru VEGF. Jak je uvedeno na obr, 4, jak pegylovaný, tak acetylovaný Fltl(l—3)—Fc proteiny se mohou vázat na VEGF. což dokazuje, že modifikace proteinu buď pegylací, nebo acetylací, neničí jejich schopnost vázat se na ligand.
Příklad 8: Farmakokinetické analýzy nemodifikovaného Fltl( l—3>—Fc. acetylovaného Fit 1(13)-Fc a pegylovaného Fit 1 (1—3)—Fc
Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného
FitI(1 -3)-Fc, acetylovaného Fltl( 1—3)—Fc a pegylovaného Fit 1( 1-3)-Fc proteinu. Balb/c myším (23 až 28 g; 3 myši na skupinu) se podkožní injekcí podaly 4 mg/k nemodifikovaného, acetylovaného nebo pegylovaného Fit 1 (1 —3)—Fc. Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin,
2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro
- 17CZ 303656 Β6 detekcí Fit 1( 1-3)-Fc proteinu. Stručně, test zahrnoval potažení ELISA plotny VEGF, vazbu séra obsahujícího nemodifikovaný, acetyiovaný nebo pegylovaný Fit 1 (1-3)--Fc, a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu. Jak jc uvedeno na obr. 5, Tmax pro všechny Fit 1( 1—3)—Fc proteiny bylo mezi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pro různé proteiny byly následující: nemodifikovaný: 0,06 ug/ml - 0,15 ug/ml; acetyiovaný: 1,5 ug/ml - 4,0 ug/ml; a pegylovaný: přibližně 5 ug/ml.
Příklad 9: Postupná acetylace Fit 1( 1—3)-Fc
Pro stanovení toho, jaké minimální množství acetylace je nutné pro eliminaci vazby na složky extracelulámí matrice, byl navržen pokus, ve kterém byla provedena postupná acetylace Fit 1( 1 — 3)-Fc za použití postupně se zvyšujících molámích nadbytků acetylačního činidla v acetylační reakční směsi. Rozmezí molámích nadbytků bylo následující: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 molů acetylačního Činidla na 1 mol Fltl(1— 3)-Fc monomeru. Reakce se provedly podle návodu dodaného k sulfo-NHS—acetat modifíkačnímu kitu (Pierce Chemical Co., Rocford, IL, kat. č. 26777).
Příklad 10: Charakterizace postupně acetylovaného Fltl( 1—3)—Fc (a) IEF analýza: Nemodifikovaný Fltl( 1—3)—Fc a postupně acetyiovaný Fltl( 1—3)—Fc proteiny se analyzovaly standardní IEF analýzou. Jakje uvedeno na obr. 6A 6B. nemodifikovaný Fit 1( 13)-Fc protein není schopen migrovat do gelu v důsledku extrémně vysokého pl (vyššího než 9,3). Nicméně, většina z postupně acetylovaných Fit 1 (1—3)—Fc vzorků bylo schopno migrovat do gelu a dosahovaly rovnováhy při pl přibližně 4,55 až 8,43, podle stupně acetylace proteinu. Tento výsledek demonstruje, že acetylace může měnit pozitivní náboj proteinu v závislosti na velikosti acetylace a že redukce pl může být řízena ovlivněním stupně acetylace.
(b) Vazba postupně acetylovaného Fit 1 (1—3)—Fc na složky mezibuněčné hmoty
Pro testování vazby na složku mezibuněčné hmoty se Fit 1 (1—3)—Fc postupně acetyiovaný Fit 1(13)-Fc testovaly v testu popsaném výše napodobujícím interakce se složkami mezibuněčné hmoty. Různé koncentrace nemodifikovaného Fit 1 (1 —3)—Fc, postupně acetylovaného Fit 1(1-3)-Fc (vzorky s molámím nadbytkem 10, 20 a 30násobným) nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu se přidaly do jamek. Plotny se inkubovaly po dobu 1 až 2 hodin buď při teplotě místnosti, nebo při 37 °C, a potom se detekce navázaných proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamek. Nakonec se do jamek přidal substrát pro alkalickou fosfatázu a měřila se optická densita. Obr. 7 ukazuje výsledky tohoto testu. Podobně jako irelevantní kontrolní protein rTie2-Fc, nevykazoval postupně acetyiovaný Fit l(l —3)—Fc (20 až 30násobný molární nadbytek) jakoukoliv významnou vazbou na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný Fltl(l—3)—Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tato vazba je saturovatelná, což naznačuje, že Fit 1 (l—3)—Fc protein se může vázat na specifická místa a ne prostřednictvím obecnějších interakcí zprostředkovaných nábojem, které by nebyly saturovatelné. Vzorek s lOnásobným molámím nadbytkem vykazoval redukovanou vazbu, ale stupeň acetylace nebyl dostatečný pro úplný blok vazby na složky mezibuněčné hmoty. Vzorky s 20násobným a vyšším molámím nadbytkem nevykazovaly žádnou detekovatelnou vazbu, i přes skutečnost, že IEF analýza (obr. 6A a 6B) vzorků s nižším molárním nadbytkem stále měla velký pozitivní náboj. Tento výsledek demonstruje, že není nutné kompletně acetylovat všechny dostupné bazické aminokyseliny pro eliminaci vazby na složky extracelulámí matrice.
(c) Vazba postupně acetylovaného Fit l (1—3)—Fc v testu na bázi Biacore
Nemodifikovaný a postupně acetyiovaný Fltl(l—3)—Fc proteiny byly testovány v testu na bázi
Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifi- 18CZ 303656 Bó kovaný Fit 1 (1-3)-Fc protein (0,5, 1,0 nebo 5,0 ug/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc. Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a roztok obsahující 0,2 ug/ml VEGF a buď nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc (v koncentraci 0,5, 1,0 nebo 5,0 ug/ml) nebo 10 různě acetylovaných Fltl(l—3)—Fc (v koncentraci 0,5; 1,0 nebo ? 5,0 ug/ml) a přelil přes čip potažený Fit 1 (1-3)-Fc. Jak je uvedeno na obr. 8, v sub-stoichiometrickém poměru (0,5 ug/ml nemodifikovaného Flt( 1—3) nebo postupně acetylovaného Fit 1(1-3)Fc vs. 0,2 ug/ml VEGF) není přítomno dostatečné množství Fltl( 1-3)-Fc (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) v roztoku pro úplnou inhibici vazby VEGF. Při 1.0 ug/ml, cožje přibližně stoichiometrický poměr 1 : 1, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný io Fltl( 1-3)-Fc lépe schopni soutěžit o vazbu VEGF, ale není stále ještě přítomen dostatek Fit 1 (1 3)-Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) pro úplnou vazbu dostupného VEGF. Nicméně, při 5,0 ug/ml, cožje několikrát více než je stoichiometrický poměr 1 : 1, jsou jak Fit 1( 1-3ý-Fc, tak postupně acetylovaný Fit 1( 1-3)-Fc proteiny schopni vázat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace. Toto jasné demonstruje, že acetylace neovlivňuje schopnost Fltl( 115 3)-Fc vázat VEGF.
(d) Farmakokinetické analýzy postupně acetylovaného Fit 1 (1 —3)—Fc
Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokínetíckých profilů nemodifikovaného
Fltl(l-3)-Fc a postupně acetylovaného Fltl(l— 3)-Fc proteinu. Balb/c myším (23 až 28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo vzorků s 10, 20, 40, 60 a 1 OOnásobným molámím nadbytkem postupně acetylovaného Fit 1( 1—3)—Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10, 20 a 40násobný molámí nadbytek a 2 myši pro 60 a lOOnásobný molámí nadbytek). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fit 1 (1—3)—Fc proteinu, jak byl popsán výše. Obr. 9 shrnuje výsledky tohoto pokusu. Tmax pro všechny Fit l (l —3)—Fc proteiny byl 6 hodin, ale Cmax pro různé proteiny byly následující; nemodifikovaný; 0,06 ug/ml; lOnásobný molámí nadbytek — 0,7 ug/ml, 20násobný molámí nadbytek - 2 ug/ml, 40násobný molámí nadbytek 4 ug/ml, 60násobný molámí nadbytek - 2 ug/ml, lOOnásobný molámí nadbytek - 1 ug/ml. Tyto výsledky ukazují, že acetylace nebo pegylace Fit 1(1-3)-Fc významně zlepšuje jeho farmakokinetický profil.
Příklad 11: Konstrukce mutantního Fltl(l-3)-Fc s delecí bazického regionu označeného jako
Mutl:Fltl(l-3B)-Fc
Na základě zjištění, že acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc, který má pl nižší než 6, má mnohem lepší farmakokinetiku než vysoce pozitivní nemodifikovaný Fltl(1—3)—Fc (pí > 9,3), se zjišťovalo, zda rozdíly ve farmakokinetice mohou být přisouzeny náboji proteinu, který se váže na negativně nabité složky extracelulámí matrice, nebo zda existují specifické regiony na povrchu Fit 1(1—3)— Fc proteinu, které tvoří specifická vazebná místa pro složky extracelulámí matrice. Například, o mnoha proteinech je známo, že mají vazebná místa pro heparin, která se často skládají ze seskupení bazických zbytků. Někdy se tyto zbytky vyskytují v seskupení na primární sekvenci proteinu; v literatuře byly identifikovány „konsensuální sekvence“ pro taková vazebná místa pro heparin (viz např. Hileman et al., 1998, Bioessays 20(2): 156-67). V jiných případech ukazuje známá krystalická struktura proteinu seskupení pozitivně nabitých zbytků na povrchu proteinu, ale zbytky pocházejí z různých regionů primární sekvence a dostávají se do kontaktu pouze po složení proteinu do terciární struktury. Tak je obtížné zjistit, zdaje izolovaný aminokyselinový zbytek součástí seskupení bazických zbytků na povrchu proteinu. Nicméně, pokud existuje ses50 kupení pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků v primární sekvenci, není neopodstatněné předpokládat, že tyto zbytky jsou si prostorově blízké a mohou být proto součástí vazebného místa pro mezibunččnou hmotu. Fltl receptor byl důkladně zkoumán a byly popsány různé jeho domény (viz například Tanaka et al., 1997, Jpn, J. Cancer R.es. 88: 867-876). Podle sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí uvedených na obr. 10A až 10D tohoto vynálezu lze identifikovat signální sekvence pro sekreci, které jsou lokalizované na začátku
- 19CZ 303656 B6 sekvence a končí glycínem kódovaným nukleotidy 76 až 78. Zralý protein začíná sekvencí Ser— Lys-Leu-Lys, začínající nukleotidem 79 sekvence nukleové kyseliny. Fltl Ig doména 1 je kódovaná nukleotidy 79-393 a končí aminokyselinami Ser-Asp-Thr. Fltl Ig doména 2 je kódovaná nukleotidy 394 až 687 (kódujícími Gly—Arg—Pro až Asn—Thr-Ile) a Fltl Ig doména 3 je kódovaná nukleotidy 688 až 996 (kódujícími Ile-Asp-Val až Asp-Lys-Ala). Je zde přítomna přemosťující aminokyselinová sekvence Gly-Pro-Gly, kódovaná nukleotidy 997-1005, po které následuje nukleotidová sekvence kódující lidský Fc (nukleotidy 1006-1701 nebo aminokyseliny Glu-Pro— Lys až Pro-Gly-Lys-stop).
Podrobnější analýzy Fltl aminokyselinové sekvence ukázala, že zde existuje seskupení, konkrétně aminokyselinové zbytky 272-281 (KNKRASVRR) obr. 10A až 10D, ve kterém je 6 z 10 aminokyselin bazických. Tato sekvence je lokalizována ve Fltl Ig doméně 3 receptorů (viz obr. 11), ale není sama o sobě esenciální pro vazbu VEGF ligandů, ale způsobuje vysokou afinitu vazby pro ligand. Srovnání sekvence Ig domény 3 se sekvencí Ig domény 2 ukazuje, že v tomto regionu je velmi slabá shoda mezi dvěma Ig doménami, a že v doméně 3 existuje přibližně 10 dalších aminokyselin. Analýza profilů hydrofilnosti (MacVector počítačový software) těchto dvou domén jasně ukazuje přítomnost hydrofilního regionu v proteinu (obr. 12A až 12B). Tato zjištění ukazují na možnost, že skutečná trojrozměrná konformace Fltl Ig domény 3 umožňuje určitou protrusi, která není přítomná ve Fltl Ig doméně 2. Pro testování této hypotézy se de letovalo 10 dalších aminokyselin a vzniklý protein se testoval za účelem zjištění toho, zda delece bude příznivě ovlivňovat farmakokinetiku bez narušení afinity receptorů pro VEGF. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Ausubel et al., Greene Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v savčím expresním vektoru pMT21 (Genetics Institute, Inc. Cambridge, MA), je označován jako Multl: Fit l(l-3B)-Fc. Multl :Fltl(l-3B)-Fc konstrukt byl získán z Fltl(1-3)-Fc delecí nukleotidů 814-843 (podle obr. 10A až 10D), což znamená deleci vysoce bazických 10 aminokyselinových zbytků sekvence Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-SerVal-Arg-Arg-Arg z Fltl Ig domény 3.
Sekvence konečného DNA konstruktu byla verifikována za použití ABI 373A DNA sekvenátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvence Multl :Fltl(l-3B)-Fc je uvedena na Obr. 13A až 13D.
Příklad 12: Konstrukce mutantního Fltl(l— 3}-Fc s delecí bazického regionu označovaného jako Mut2:Fltl(2-3B)-Fc.
Druhý deleční mutantní konstrukt, označený Mut2:Fltl(2-3B)-Fc, byl získán z Multl :Fltl(l-3B)Fc konstruktu delecí Fltl Ig domény 1 kódované nukleotidy 79-393 (viz obr. 10A až 10D); přesněji, nukleotidy 73 - 78 (TCA GGT) byly změněny na TCC GGA. Tímto se vložilo restrikční místo (BspEl) bez alterace asociované aminokyselinové sekvence, Ser Gly. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v savčím expresním vektoru pMT21 (Genetics Institute, Inc. Cambridge, MA), byl také verifikován z hlediska sekvence za použití ABI 373A DNA sekvenátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvence Mut2:Fltl(2-3B)-Fc je uvedena na Obr. 14Aaž 14C.
- 20C7. 303656 B6
Příklad 13: Konstrukce mutantního Fltl(l-3)-Fc s delecí označeného jako Mut3:Fit 1(2-3B>Fe
Třetí deleční mutantní konstrukt, označený Mut3:Fltl(2-3B)-Fc, byl získán stejně jako Mut2:Fltl(2-3B)-Fc konstrukt, stou výjimkou, že Fltl Ig doména 3 byla ponechána intaktní (bazický aminokyselinový region nebyl deletován). Konstrukt byl připraven technikou molekulární biologie a sekvence konečného konstruktu byla verifikována způsobem popsaným výše. Sekvence mut3, fltl (2-3)-Fc je uvedena na obr. 15Aaž 15C.
io
Příklad 14: Konstrukce mutantního Fltl(l-3)-Fc s N-glykosylací bazického regionu označeného mut4:Fltl(l-3R_>N}-Fc
Byt připraven konstrukt, ve kterém bylo N-glykosylaČní místo vloženo do středu bazického regionu Fltl Ig domény 3. Tento konstrukt byl označen jako mut4:Fltl(l-3R >N)-Fc a byl připraven změnou nukleotidů 824-825 z GA na AC, což změnilo kódovaný Arg zbytek (AGA) na Asn zbytek (AAC) (viz obr. 10A až 10D). Vzniklá aminokyselinová sekvence je tedy změněna z Arg-Ala—Ser na Asn-Ala-Ser, což odpovídá kanonickému signálu (Asn-Xxx-Ser/Thr) pro adici N-glykosylaČního místa v Asn zbytku. Sekvence mut4:Fltl(l-3R >N)-Fc je uvedena na obr. 16A až 16D.
Příklad 15: Charakterizace acetylovaného Fitl(1 —3>—Fc, Mutl:Fltl(l-3B)-Fc a mut4:Fltl(l25 3r_>n)-Fc mutantů (a) Vazba na složky mezibuněčné hmoty
Pro stanovení toho, zda tři modifikované proteiny mají více či méně zlepšené farmakokinetické vlastnosti se 9ójamkové plotny potažené Matrigelem (jak jsou popsané výše) inkubovaly s různými koncentracemi mutantních proteinů a detekovaly se protilátkami proti lidskému Fc konjugovanými s alkalickou fosfatázou. Jak je uvedeno na obr. 18, tento pokus ukázal, že zatímco nemodifikovaný Fltl (1-3 )-Fc protein se dobře váže na tyto jamky, M ut3. Fltl (2-3 )-Fc protein se váže o něco slaběji, Mutl :Fltl(l-3B)-Fc se váže ještě slaběji a mut2:Fltl (2-3B)-Fc protein má nejlepší profil a váže se slaběji než jakýkoliv jiný mutantní protein. Mut4:Fltl-(l-3R_>N)-Fc gly kosy lační mutantní protein vykazoval pouze marginální benefit f Matrigel testu. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že lineární sekvence pozitivních aminokyselin může být deletována z primární sekvence, což vede ke snížení elektrických interakcí se složkami extracelulámí hmoty.
(b) Vazba Mutl 1 :Fltl(l-3B)-Fc a mut4:Fltl(l-3R >N)-Fc v testu na bázi Biacore
Nemodifikovaný a acetylovaný Fltl( 1-3>-Fc protein a geneticky modifikovaný Mutl:Flt(l-3B)Fc a mutl4:Fltl(l-3R >N)-Fc proteiny byly testovány v testu na Bázi Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(1-3}-Fc protein (0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/m) imobiiizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual,
Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a roztok obsahující 0,1 ug/ml VEGF a buď přečištěný, nebo supematant COS buněk obsahující nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), přečištěný acetylovaný Fltl(l—3)—Fc (v koncentraci 0.25, 0,5, nebo 1,0 ug/ml), supematant COS buněk obsahující Mutl :Flt( 1-3B)-Fc (v koncentraci
0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), nebo supematant COS buněk obsahující mut4:Fltl(l-3R_?N)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 ug/ml), se přelil přes čip potažený Fit 1 (1 -3)-Fc. Jak je uvedeno na obr. 17, v sub-stoichiometrickém poměru (0,25 ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného vzorku vs. 0,1 ug/ml VEGF) není přítomno dostatečné množství
Fit 1(1-3)—Fc proteinu v roztoku pro blokování vazby VEGF na Fit 1 (1 -3)-Fc imobiiizovaný na
-21 CZ 303656 B6
Biacore čipu. Při 0,5 ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného Fit 1 (1 -3)-Fc proteinu, což je přibližně stoichiometrický poměr 1:1, je patrna zlepšená schopnost blokovat vazbu VEGF na Biacore Čip. Při koncentraci 1,0 ug/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného Fltl(l—3)—Fc proteinu, což je přibližně stoichiometrický poměr 10:1, jsou Fltl(l—3)—Fc proteiny schopny blokovat vazbu VEGF na Biacore čip, ale nejsou ekvivalentní. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mutl :FIí(1-3b)-Fc jsou v podstatě rovnocenné ve své schopnosti blokovat vazbu VEGF, zatímco mut4:Fltl( 1-3R_>N)-Fc je o něco méně účinný v blokování vazby. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že je možné redukovat nespecifickou vazbu molekuly genetickým odstraněním lineární sekvence predominantne negativně nabitých aminokyselin.
(c) Vazba Multl :Fltl(l-3B)-Fc, Mut2:Fltl(2-3B>_Fc= Mut3:Fltl(l-3B)-Fc v testu na bázi ELISA
Pro stanovení toho, zda se mohou tri mutantní proteiny vázat na Fltl ligand VEGF se provedly vazebné experimenty, ve kterých se 96jamkové plotny potažené VEGF inkubovaly s různými koncentracemi příslušného mutantního proteinu a po promytí se úroveň vazby detekovala inkubací s protilátkou proti lidskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou a kvantifikovala se kolorimetricky přidáním vhodného substrátu pro alkalickou fosfatázu. Jak je uvedeno na obr. 19, pokus ukázal, že v testovaných koncentracích se mohou všechny mutantní proteiny podobně vázat na VEGF.
Příklad 16: Farmakokinetická analýza acetylovaného Fltl(13> Fc, Mutl :F1tl( 1-3 B)-Fc a nemodifikovaného Fltl (1-3 )-Fc
Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fltl (1-3 )-Fc, Mutl:Fltl( 1-3b)-Fc a při 40násobného molámího nadbytku acetylovaného Fltl(1 — 3)-Fc proteinu. Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného Fit 1 (1- 3)- Fc, při 40násobném molámím nadbytku acetylovaného Fit 1(1—3)-Fc a Mutl:Fltl(1-3b)-Fc proteinu (vždy 4 myši). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 5 dnů po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fltl(1-3)-Fc proteinu, který zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF, vazbu Fltl(l—3)—Fc a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu. Jak je uvedeno na obr. 20, byly Cmax pro tato činidla následující: nemodifikovaný Fit 1( 1-3)-Fc 0,15 pg/ml; při 40násobném molámím nadbytku acetylovaný Fit 1(1-3)-Fc - 1,5 pg/ml; a Mut 1:Fit 1 (1 -3B)— Fc - 0,7 pg/ml.
Příklad 17: Konstrukce vektoru pro modifikovaný Fltl receptor
Konstrukce modifikované verze Fltl reeeptoru (též známého jako VEGFR.1) byla provedena na základě pozorování, že proteinová sekvence Fltl je značně bazická a proto je pravděpodobné, že se bude vázat na extracelulámí hmotu (ECM). Vysoce bazický charakter Fltl pravděpodobně vysvětluje to, proč má nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc (popsaný výše) špatné farmakokinetické vlastnosti, které činí obtížným jeho použití jako terapeutického činidla. Jak bylo popsáno výše, chemicky modifikovaná forma při 40násobném molámím nadbytku acetylovaného Fit l (1 —3)—Fc, která je zde označována jako A40, vykazuje značně vylepšenou íarmakokinetiku vzhledem k neacetylovanému Fit 1 (1 —3)—Fc. Proto byly provedeny pokusy o přípravu upravených DNA molekul, které mohou být použity pro rekombinantní expresi modifikovaných forem Fltl reeeptoru, které by měly lepší farmakokinetický profil A40 a zároveň by si zachovávaly schopnost vazby VEGF.
Z literatury je známo, že první Ug doména Fltl (která má náboj ±5 při neutrálním pH) není zásadní pro těsnou vazbu na VEGF, proto je tato doména deletována. Třetí Ig doména (mající náboj +11) není zásadní pro vazbu, ale dodává vyšší afinitu pro VEGF než druhá lg doména, takže místo úplného deletování byla nahrazena ekvivalentními doménami receptoru příbuzného Fltl, kterým byl Fikl (též známý jako VEGFR2) a Flt4 (též známý jako VEGFR3). Tyto chimérické molekuly (označené R1R2 (Fltl .D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc- Cl (a) s a VEGFR 1 R3-Fc- Cl (a), v příslušném pořadí, kde Rl a Fltl D2 = lg doména 2 Fltl (VEGFR 1);
R2 a Fikl D3 = lg doména 3 Fikl (VEGFR2); a R3 a VEGFR3D3 - lg doména 3 Flt4 (VEGFR3)) mají mnohem menší vazbu na ECM, jak bylo potvrzeno in vitro testem vazby na
ECM, jakje popsán dále, měly značně zlepšenou farmakokinetiku, jak je popsáno dále. Dále, tyto molekuly byly schopny pevně se vázat na VEGF, jak je popsáno dále, a blokovat fosforylací io přirozeného Fikl receptoru exprimovaného v endotelových buňkách, jak je popsáno dále.
(a) Konstrukce expresního plazmidu pFltl .D2.Fikl D3.Fc Cl (a)
Expresní plazmidy pMT21.Fltl(l-3)-Fc (6519 bp) a pM21 .Fit 1 (1 -3)-Fc (5230 bp) jsou 15 plazmidy, které kódují resistenci na ampícilin a lg domény 1-3 lidského Fltl a lidského Fltl s navázaným Fc, v příslušném pořadí. Tyto plazmidy byly použity pro konstrukci DNA fragmentu skládajícího se z fúze lg domény 2 Fltl s lg doménou 3 Fikl, za použití PCR amplifikace příslušných lg domén, po které následovalo další kolo PCR pro provedení fúze dvou domén do jediného fragmentu. Pro lg doménu 2 Fltl byly 5' a 3' amplifikační primery následující:
’ : bsp/ f ltlD2 (5 » -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG- 3 ’ ) 1 :Fltld2-Flkld3 .as (5 ’ -CGGACTCAGAACCACATCTAIGATTGTATTGGT-3 ’ )
5' amplifikační primery kódují restrikční místo pro BspEl enzym před lg doménou 2 Fltl, které je definované aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající aminokyselinám 27-33 obr. 21A až 21C). 3' primer kóduje reverzní komplement 3' konce Fltl lg domény 2 fúzovaný přímo na 5' začátek Fikl lg domény 3, s fúzí v místě definovaném jako Fltl (odpovídajícím aminokyselinám 123-126 obr. 21A až 21C) a pokračujícím do VVLS (odpovídajícím aminokyselinám 127-130 obr. 21A až 21C) Fikl.
Pro lg doménu 3 Fikl byly 5' a 3' amplifikační primery následující:
’ : FltlD2-FlklD3 . S (5 ’ -ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3 ’ )
3’:FlklD3/apa/srf.as (5 ' -GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3 ')
5' amplifikační primer kóduje konec Fltl lg domény 2 fúzovaný přímo na začátek Fikl lg domé35 ny 3, jak bylo popsáno výše. 3' amplifikační primer kóduje konec Fikl lg domény 3, definovaný aminokyselinami VRVHEK (odpovídajícími aminokyselinám 223-228 obr. 21Λ až 21C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srf 1, a která kóduje aminokyseliny GPG. Přemosťující sekvence odpovídá aminokyselinám 229 až 231 obr. 21A až 21C.
Po kole PCR amplifikace pro produkci jednotlivých domén se produkty smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCr s primery bsp/flt 1D2 a Fikl D3/apa/srf.as (popsanými výše) za zisku fúzního produktu. Tento PCR produkt byl potom tráven restrikčními enzymy BspEl a Smál a získaný 614 bp fragment byl subklonován do BspEl až Srfi restrikčních míst vektoru pMT21/B2Fc, za zisku plazmidu pMT21/Fltl D2.FlkD3.Fc. Nukleotidová sekvence FltlD2FlklD3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plaz-23 CZ 303656 B6 mid byl potom tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získaný 702 bp fragment byl přenesen do EcoRI až Srfl restrikčních míst plazmídu pFlt 1 (1 - 3)B2-Fc Cl (a) za zisku plazmídu pFltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a). Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) jsou uvedeny na obr 21A až 21C.
(b) Konstrukce expresního plazmídu pFltl D2VEGFRD3Fc Cl(a)
Expresní plazmid pMT21 .Fltl(1-3)-Fc (6519 bp) je plazmid, který kóduje resístenci na ampicilin a Ig domény 1-3 lidského Fltl receptorů s navázaným Fc. Tento plazmid byl použit pro konio strukci DNA fragmentu obsahujícího Ig doménu 2 Fltl za použití PCR. RNA z buněčné linie
HEL921.7 byla použita pro produkci Ig domény 3 Fikl, za použití standardní PCR. Další kolo
PCR amplifikace bylo použito pro provedení fúze dvou Ig domén do jediného fragmentu. Pro Ig doménu 2 Fltl byly 5' a 3' amplifikační primery následující:
· :bsp/f ltlD2 (51 -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTITCGTAGAGATG-3 1)
3’:FltlD2.VEGFR3D3.as ] (5 ’ - TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
5' amplifikační primer kóduje restrikční místo pro BspEl enzym před Ig doménou 2 Fltl, které je definované aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající aminokyselinám 27—33 obr. 21A až 21C). 3' primer kóduje reverzní komplement konce Fltl Ig domény 2 fúzovaný pří20 mo na 5' začátek VEGFR3 Ig domény 3, s fúzí v místě definovaném jako TI ID Fltl (odpovídajícím aminokyselinám 123-126 obr. 22A až 22C) a pokračujícím do IQLL VEGFR3 (odpovídajícím aminokyselinám 127-130 obr. 22A až 22C).
Pro Ig doménu 3 VEGFR3 byly 5' a 3' amplifikační primery následující:
51 : R3D3 . s (51 -ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTO3CTGGAGCTGCTGGTA) ’ :R3D3 .as {5 ’ -ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
5' a 3' amplifikační primery odpovídají sekvenci VEGFR3. 296 bp produkt amplifikace této RTPCR reakce byl izolován standardními technikami a byl zpracován druhým kolem PCR pro .to přidání vhodných sekvencí pro umožnění fúze FltlD2 s FlklD3 doménami a fúze FlklD3 a Fc domén prostřednictvím GPC můstku (viz dále). Amplifikační primery byly následující:
5': FltlD2.VEGFR3D3.as (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
5' amplifikační primer kóduje 3' konec Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na začátek (5' konec)
VEGFR3 Ig domény 3, jak bylo popsáno výše. 3' amplifikační primer kóduje 3' konec VEGFR3
Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VIVHEN (odpovídajícími aminokyselinám 221-226 obr. 22A až 221C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srfl, a která kóduje aminokyseliny GPG. Přemosťující sekvence
4o odpovídá aminokyselinám 227-229 obr. 22A až 22C.
-24 CZ 303656 B6
Po jednom kole (pro Fltl Ig doménu 2) nebo dvou kolech (pro Flt4 Ig doménu 3) PCR amplifikace pro produkci jednotlivých Ig domén se produkty PCR smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCR amplifikace s amplifikačními primery bsp/ťlt 1D2 a VEGFR3D3/srf.as (popsanými výše) za zisku fúzního produktu. Tento PCR produkt byt potom tráven restrikČním i enzymy BspEI a Smál a získaný 625 bp fragment byl subklonován do BspEI až Srfl restrikčních míst vektoru pMT21/Fltl B2.Fc (popsaného výše), za zisku plazmidů pMT21/Flt 1 D2.VEGFR3D3.Fc. Nukleotidová sekvence Fltl D2-VEFR3D3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plazmid byl potom tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získaný 693 bp fragment byl subklonován do EcoRI až Srfl restrikčních míst plazmidů přít 1 (1-3) B2Fc Cl(a) za zisku plazmidů pFltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a). Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) jsou uvedeny na obr. 22A až 22C.
Příklad 18: Test vazby na mezibuněčnou hmotu (ECM)
Plotny potažené ECM (Becton Dickinson katalogové č. 35-4607) byly rehydratovány teplým DME doplněným glutaminem (2 mM), 100 U penicilinu, 100 U streptomycinu a 10% BCS po dobu alespoň 1 hodiny před přidáním vzorků. Plotny se potom inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s různými koncentracemi Fltl D2.FlklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) s první hodnotou 10 nM a potom s 2násobným ředěním v PBs plus 10% BCS. Plotny se potom promyly 3krát PBS plus 0,1% Triton-X s alkalickou fosfatázou (Promega, 1: 4000 v PBS plus 10% BCS) po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Plotny se potom promyty 4krát PBS s 0,1% Triton-X a přidal se pufr pro alkalickou fosfatázu/pNPP roztok (Sigma) pro vývoj zbarvení. Plotny se odečítaly při I - 405 až 507 nm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 23 a demonstrují, že Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) proteiny se významně méně váží na ECM ve srovnání s Fltl(1-3)-Fc proteinem.
Příklad 19: Dočasná exprese Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl(a) v CHO-K1 (ElA)buňkách
Velkoobjemová (2 1) kultura E.coli DH10B nesoucích pFltlD3.FlklD3.Fc Cl (a) plazmid popsaný výše v příkladu 17(a) se kultivovala přes noc v Terrific Broth (TB) plus 100 pg/ml ampicilinu. Další den se piazmidová DNA extrahovala za použití QlAgen Endofree Megaprep kitu podle návodu výrobce. Koncentrace přečištěné plazmidové DNA se určila standardními technikami za použití UV spektrofotometru a fluorometru. Piazmidová DNA se verifikovala standardním trávením podílů restrikčními enzymy za použití restrikčních enzymů EcoRI plus Notl a Asel. Všechny fragmenty získané trávením restrikčními enzymy měly předpokládanou velikost při analýze na 1% agarosovém gelu.
Ve 14 15cm Petriho miskách se kultivovaly CHO-K1/E1A buňky v hustotě 4 x 106 buněk/plotnu. Kultivačním médiem bylo Gibco Ham's F—12 doplněné 10% Hyclone fetálním hovězím sérem (FBS), 100 U penicilinu/lOOU streptomycinu a glutaminem (2 nM). Následující den byla každá plotna buněk transfekována 6 ug pFltl D2.FlklD3.Fc Cl(a) plazmidové DNA za použití Gibco Optimem a Gibco Lipofectamine v objemu 12 ml, podle návodu výrobce. 4 hodiny po přidání transfekční směsi k buňkám se přidalo 12 ml/plotnu Optimem doplněného 10% FBS. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5% CO2 přes noc. Následující den se z každé plotny odstranilo médium a přidalo se 25 μΐ expresního média (Gibco CHO-S-SFM-1I doplněné glutaminem (2 mM) a I mM natřium-butyrátem). Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 3 dnů. Po 3 dnech inkubace se z každé plotny aspirovalo médium, které se odstředilo při 400 rpm v odstředivce s houpající se komorou za účelem peletování buněk. Supematant se dekantoval do sterilních 1 litrových baněk a přečištění exprimovaného proteinu se provedlo způsobem popsaným dále.
-25CZ 303656 B6
Příklad 20: Konstrukce pVEGFRl R2-Fc Cl (a) expresního vektoru
Expresní plazmid pVEGFRl R2Fc Cl (a) byl konstruován inserci DNA kódující aminokyseliny SDT (odpovídající aminokyselinám 27-29 na obr. 24A až 24C) mezi Fit 1 d2- Flk 1 d3-Fc Cl (a) aminokyseliny 26 a 27 podle obr. 21A až 21C (GG) a odstraněním DNA kódující aminokyseliny GPG odpovídající aminokyselinám 229 až 231 obr. SDT aminokyselinová sekvence je přirozená pro Fltl receptor a byla vrácena pro snížení pravděpodobnosti heterogenního N—koncového zpracování. GPG (přemosťující sekvence) byla odstraněna, takže Fltl a Fikl Ig domény byly fúzovány přímo jedna na druhou. Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence pVEGFRlR2-Fc Cl (a) chimérické molekuly jsou uvedeny na obr. 24A až 24C.
Příklad 21: Kultivace buněk použitá pro produkci modifikovaných Fltl receptorů (a) Kultivace buněk použitá pro produkci Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a)
Proces pro produkci Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) proteinu za použití expresního plazmidu pFltlD2.Flkl D3.Fc Cl(a) popsaného výše v příkladu 1 zahrnoval suspenzní kultivaci rekombinantních ovariálních buněk čínského křečka (CHO-K1/E1 A), které konstitutivně exprimují proteinový produkt. Buňky se kultivovaly v bioreaktorech a proteinový produkt se izoloval a přečistil afinitní chromatografií a chromatografií s vylučováním podle velikosti. Proces je podrobně popsán dále.
Expanze buněk
Dvě konfluentní T-225 cm2 zkumavky obsahující buněčnou linii exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) se expandovaly pasážováním buněk do 8 T—225 cnT zkumavek v médiu (GMEM + 10% sérum, GIBCO) a inkubováním při 37 °C a 5% CO2. Když bylo dosaženo požadované konfluence (přibližně za 3 až 4 dny), tak se buňky rozvolnily za použití trypsinu. Čerstvé médium se přidalo pro chránění buněk před dalším působením trypsinu. Buňky se odstředily a resuspendovaly se v čerstvém médiu a potom se přenesly do 8 850 cm2 válcových zkumavek a ínkubovaly se při 37 °C a 5% CO2 do dosažení konfluence.
Suspenzní kultura v bioreaktorech
Buňky kultivované ve válcovitých zkumavkách se trypsinizovaly pro uvolnění od povrchu a promyly se suspenzí kultivačního média. Buňky se asepticky přenesly do 5 1 bioreaktoru (New Brunswick Cellígen Plus), kde se kultivovaly ve 3,5 litrové suspenzní kultuře. Suspenzním kultivačním médiem bylo bezglutaminové IS—CHo s nízkým obsahem glukózy (Irvine Scientific), do kterého se přidalo 5% fetální hovězí sérum (Hyclone), GS doplněk (Life Technologies) a 25 μΜ methionin sulfoximinu (Sigma). pH se udržovalo na 7,2 pomocí přidávání oxidu uhličitého do dodávaného plynu nebo přidáním kapalného roztoku uhličitanu sodného do bioreaktoru. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se udržovala na 30% saturace pomocí přidávání kyslíku nebo dusíku do dodávaného plynu a teplota se udržovala na 37 °C. Když bylo dosaženo hustoty buněk 4 x 106 buněk/ml, tak se buňky přenesly do 40 l bioreaktoru obsahujícího stejné médium a stejné nastavení hodnot. Teplota byla snížena na 34 °C pro zpomalení růstu a zvýšení relativní rychlosti exprese proteinu.
(b) Kultivace buněk použitá pro produkci FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a)
Stejný postup jako je postup popsaný výše pro Fltl D2. Fikl D3.Fc Cl (a) se použil pro produkci
FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a).
- 26C7 303656 B6
Příklad 22: Odběr a přečištění modifikovaných Fltl receptorů (a) Odběr a přečištění Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a)
Proteinový produkt byl asepticky odebírán z bioreaktoru za zachycování buněk za použití Millipore Prostec filtračních modulů s tangenciálním tokem a mechanické pumpy s nízkým střihem (Fristam). Čerstvé médium se přidalo do bioreaktoru pro nahrazení média odstraněného při filtraci. Přibližně 40 1 získaného filtrátu se potom vneslo do 400 ml kolony obsahující Protein A Sepharose pryskyřici (Amersham Pharmacia). Po vložení se pryskyřice promyla pufrem obsahuio jícím 10 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 7,2, pro odstranění jakýchkoliv nenavázaných kontaminujících proteinů. FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) protein se eluoval citrátovým pufrem s pH 3,0. Eluovaný protein se neutralizoval přidáním Tris báze a zmrazil se při -20 °C.
Několik zmrazených šarží FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) proteinu z kroku s Proteinem A se rozmrazili lo, smísilo a zahustilo za použití Millipore filtrační membrány s tangenciálním tokem s limitem molekulové hmotnosti (NMWCO) 30 kD. Protein se přenesl do zařízení pro zahuštění buněk (Millipore) a dále se zahustil na 30 mg/ml za použití 30 kD NMWCO membrány. Zahuštěný protein se vnesl do kolony s vylučováním podle velikosti částic naplněné Supcrdcx 200 pry skyřicí (Amersham Pharmacia), která byla uvedena do rovnováhy fosfátem pufrovaným salinickým roz20 tokem plus 5% glycerolem. Stejný pufr byl použit pro eluci kolony. Frakce odpovídající FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) dimeru se smísily, sterilně se přefiltrovaly pres 0,22 mikronový filtr, rozdělily se do podílů a zmrazily se.
(b) Odběr a přečištění FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a)
Stejný postup jako je postup popsaný výše pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) se použil pro odběr a přečištění FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a).
Příklad 23: Fosforylační test pro dočasně exprimovaný VEGFR2
Primární lidské endotelové buňky pupečníkové žíly (HUVEC), pasáž 4 až 6, se nechaly po dobu 2 hodin v bezsérovém DME médiu s vysokou koncentrací glukózy. Připravily se vzorky obsahující 40 ng/ml (1 nM) lidského VEGF165, což je ligand pro VEGF receptory Fltl, Fikl a Flt4(VEGFR3), a tyto vzorky se preinkubovaly po dobu l hodiny při teplotě místnosti s různými množstvími Fltl receptorů Fit 1 (1—3)—Fc, Fltl (1-3 )-Fc (A40), Fltl D2Flkl D3.Fc Cl (a) a FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl (a) v bezsérovém DME s vysokou koncentrací glukózy obsahujícím 0,1% BSA. Buňky se na dobu 5 minut vystavily působení vzorků připravených výše +/VEGF 165 a potom se provedla kompletní lýza buněk za použití pufru pro kompletní lýzu bunék.
Buněčné lyzáty se ímunoprecipitovaly protilátkou namířenou proti C-konci VEGFR2 receptoru. Imunoprecípitované lyzáty se vnesly na 4-12% SDS-PAGE Novex gel a potom se přenesly na PVDF membránu za použití standardní techniky. Detekce fosforylovaného VEGFR.2 byla provedena imunopřenosem s anti-fosfo-tyrosin mAb označenou 4G10 (UB1) a vývoj se provedl za použití ECL-činid!a (Amersham). Obr. 25A až 25C a 26A až 26B ukazují výsledky tohoto poku45 su. Obr. 25A až 25C ukazují, že detekce westernovým přenosem VEGFR2(Flkl) s fosforylovaným tyrosinem pomocí stimulace VEGF 16 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory jsou fosforylované v různé míře podle toho, který modifikovaný Fltl receptor je použit během preínkubace s VEGF. Jak je vidět na obr. 25 A, při 1,5 násobném molámím nadbytku buď Fit 1( 13)-Fc, nebo EltI(l-3)-Ec (A40) nebo dočasného FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) je přítomna kompletní blokáda stimulace receptoru těmito třemi modifikovanými Fltl receptory ve srovnáni s působením kontrolního média. Naopak, dočasný Fltl D2VEGFR3D3.Fc C1(A) nevykazuje při tomto molámím nadbytku žádnou významnou blokádu, ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou je VEGF. Podobné výsledky jsou vidět na obr. 25B, kde jsou modifikované Fit receptory ve 3násobném molámím nadbytku vzhledem k VEGF165 ligandu. Na ob. 25C, kde jsou modifiko55 váné Fltl receptory v ónásobném molámím nadbytku vzhledem kVEGF165 ligandu. blokuje
-27CZ 303656 B6
Fltl D2VEGFR3D3.Fc Cl(a) částečně stimulaci buněčných povrchových receptorů indukovanou VEGF 165.
Na obr. 26A až 26B ukazuje detekce westernovým přenosem VEGFR2(Flkl) fosforyiovaného na tyrosinu v důsledku stimulace VEGF165 ligandem, že buněčné povrchové receptory nejsou stimulované vzorky, které mají VEGF 165 preinkubovaný s 1 a 2násobným molámím nadbytkem (obr. 26A) nebo 3 a 4násobným molárním nadbytkem (obr. 26B) dočasného FitlD2FlklD3.Fc Cl (a), stabilního Fltl D2Flkl D3.Fc Cl (a) nebo dočasného VEGFR1R2-Fc Cl (a). Pri všech testovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru byla pozorována kompletní vazba VEGF165 Iigandu během preinkubace, což vedlo k nedetekovatelné stimulaci buněčných povrchových receptorů pomocí nenavázaného VEGF 165 ve srovnání s působením kontrolního média.
Příklad 24: Test buněčné proliferace
Pro testování buněčné populace byly MG87 buňky stabilně transfekovány expresním plazmidem obsahujícím DNA insert kódující extracelulámí doménu VEGFR2(Flkl) fúzovanou na TrkB intraceiulámí kinázovou doménu, za zisku chimérické molekuly. Důvodem použití TrkB intracelulámí kinázové domény místo přirozené VEGFR2(Flkl) intraceiulámí kinázové domény bylo to, že intraceiulámí kinázová doména VEGFR2(FIkl) nezpůsobuje silnou proliferační odpověď těchto buněk po stimulaci VEGF 165. Je známo, že MG87 buňky obsahující kompletní TrkB receptor mají silnou proliferativní odpověď po stimulaci BDNF, a proto byla Trkb intraceiulámí kinázová doména použita pro nahrazení intraceiulámí kinázové domény VEGFR2(Flkl) za účelem získání výhody této proliferační reakce.
x 103 buněk se umístilo do 96jamkové plotny a buňky se nechaly usadit během 2 hodin pri 37 °C. Následující modifikované Fit receptory, Fit 1 (1 —3)—Fc, FltlD2.FiklD3.Fc Cl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a), a irelevantní receptor Tie2-Fc jako negativní kontrola, se titrovaly od 40 nM do 20 pM a inkubovaly se s buňkami po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Lidský rekombinantní VEGF 165 v definovaném médiu se potom přidal do všech jamek v koncentraci 1,56 nM. Plotny se inkubovaly po dobu 72 hodin při teplotě 37 °C a potom se přidalo MTS (Owenovo činidlo, Promega) a plotny se inkubovaly po dobu dalších 4 hodin. Nakonec se plotny odečítaly na spektrofotometru pri 450/570 nm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 27. Kontrolní receptor Tie2-Fc neblokuje proliferaci buněk indukovanou VEGF 165 v žádné koncentraci, zatímco FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) blokuje proliferaci pri 1,56 nM VEGF 165 s polovinou maximální dávky rovnou 0,8 nM. Fltl (1-3)- Fc a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) jsou méně účinné v blokování VEGF 165 v tomto testu, s polovinou maximální dávky rovnou přibližně 2 nM. VEGF165 sám o sobě vede k dosažení absorbance 1,2 jednotek a pozadí je 0,38 absorbančních jednotek.
Příklad 25: Vazebná stoichíometríe modifikovaných Fit receptorů pro VEGF165 (a) Bíacore analýza
Stoichiometrie Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (A) a VEGFR1R2-Fc Cl (a) interakcí s lidským VEGFI65 se určila měřením buď úrovně saturační vazby VEGF na FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VLGFR1R2—Fc Cl (a) povrchy nebo měření koncentrace VEGF 165 nutné pro kompletní blokování vazby Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (A) na povrch VEFG BIAcore čipu.
Modifikované Fit receptory Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a) byly zachyceny pomocí protilátky specifické pro Fc, která byla nejprve imobilizována na Biacore čipu (BIACORE) za použití aminových kopulačních Činidel. Povrch bez protilátky byl použit jako negativní kontrola. VEGF 165 byl injikován v koncentraci 1 nM, 10 nM a 50 nM na
-28CZ 303656 R6
FltlD2.Flkl D3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a) povrchy v dávce 10 μΙ/min po dobu jedné hodiny. Vazebný signál v reálném čase byl měřen a na konci každé injekce byla dosažena saturacní vazba. Vazebná stoichiometrie byla vypočtena jako molámí poměr navázaného VEGF 165 k imobilizovanému FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl(a), za použití konverzního faktoru 1000 RC ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují na vazebnou stoichiometrii jedné VEGF 165 dimemí molekuly na jednu molekulu FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a) (obr. 28).
V roztoku se Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a) v koncentraci 1 nM (což je koncentrace předpokládané lOOOkrát vyšší než KD Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl(a) nebo VEGFR1R2Fc Cl(a)/VEGF165 interakce) smísily s různými koncentracemi VEGF165. Po jedné hodině inkubace se volný FltlD2.Fikl D3.Fc C l(a) v roztoku stanovil jako vazebný signál na VEGF 165 aminovém povrchu. Kalibrační křivka se použila pro konverzi Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) BIAcore vazebného signálu na jeho molámí koncentraci. Data ukazují, že přidání 1 nM VEGF 165 do roztoku FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) zcela blokují vazbu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) na VEGF165 povrch, fento výsledek ukazuje na vazebnou stoichiometrii jedné VEGF165 molekuly na jednu molekulu FltlD2.Flkl D3.Fc Cl (a) (obr. 29 a obr. 30). Když se koncentrace FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) vnesla do grafu jako funkce přidané koncentrace VEGF 165, tak byl sklon lineární části -1,06 pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a-1,07 pro VEGFR1R2-Fc Cl(a). Velikost sklonu, velmi blízká minus jedné, ukazovala na vazbu jedné molekuly VEGF165 na jednu molekulu buď FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a), nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a).
(b) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic
FltlD2.Flk 1 D3.Fc Cl(a) se smísil s 3násobným nadbytkem VEGfl65 a komplex íigand-receptor se přečistil za použití Pharmacia Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic. Komplex ligand-receptor se potom inkuboval v pufru obsahujícím 6M guanidinium hydrochlorid pro disociaci do jednotlivých proteinových složek. FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) se separoval od VEGF165 za použití Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic eluované 6M guanidinium chloridem. Pro určení stoichiometrie komplexu se provedlo několik injekcí FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGF 165 a výška píku nebo integrovaná intenzita píku se vnesla do grafu jako funkce koncentrace injikovaného proteinu. Kalibrace se provedla za podmínek identických podmínkám použitým pro separování složek komplexu Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl(a)/VEGF. Kvantifikace složení komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF se provedla podle kalibračních křivek. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 28, který ukazuje, že poměr VEGF165 k FltlD2.F1klD3.Fc Cl(a) v komplexu je 1 : 1.
Příklad 26: Určení vazebné stoichiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) /VEGF165 pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti částic Příprava komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165
VEGF165 (koncentrace = 3,61 mg/ml) se smísil sCFIO buňkami dočasně exprimujícími FltlD2.FiklD3.Fc Cl(a) (koncentrace = 0,9 mg/ml) v molámím poměru 3:1 (VEGF 165:FIt 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a)) a provedla se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.
(a) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za nativních podmínek
Pro separování komplexu od nadbytku nenavázaného VEGF 165 se 50 μΐ komplexu vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy v PBS pufru. Vzorek se eluoval stejným pufrem při průtoku 40 μΙ/min, při teplotě místnosti. Výsledky této SEC jsou uvedeny na obr. 31. Pík 1 představuje komplex a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Frakce eluované mezi 1,1 a 1,2 ml se smísily a guanidinium chlorid (GuHCl) se přidal v konečné koncentraci 4,5 M pro dtsociování komplexu.
-29CZ 303656 B6 (b) Chromatografíe s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za disociačních podmínek
Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molámího poměru se 50 μΙ disociovaného komplexu popsaného výše vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 μΙ/min. při teplotě místnosti. Výsledky této SEC jsou uvedeny na obr. 32. Pík 1 představuje Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a pík 2 představuje VEGF 165.
(c) Výpočet stoichiometrie komplexu FltlD2.Fikl D3.Fc Cl(a)/VEGF165
Stoichiometrie komplexu receptor-ligand se určila z plochy píku nebo výšky píku složek. Koncentrace VEGF 165 nebo FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) odpovídající výšce píku nebo ploše píku, v příslušném pořadí, se získaly ze standardních křivek pro VEGF165 a FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a). Pro získání standardní křivky se 4 různé koncentrace (0,04 mg/ml až 0,3 mg/ml) jedné ze složek injikovaly do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 μΙ/min. při teplotě místnosti. Standardní křivka se získala sestrojením grafu plocha píku nebo výška píku vs koncentrace proteinu. Molámí poměr VEGF 165: Fit lD2.FlklD3.Fc Cl (a) určený z výšky píku složek byl 1,10.
Příklad 27: Určení vazebné stoichiometrie komplexu
FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 pomocí chromatografíe s vylučováním podle velikosti částic s on-line detektorem rozptylu světla Příprava komplexu
VEGF 165 se smísil s CHO buňkami dočasně exprimujícími FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) v molámím poměru 3 : 1 (VEGF 165: Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a)) a provedla se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.
(a) Chromatografíe s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s on-line detektorem rozptylu světla
Chromatografická kolona s vylučováním podle velikosti částic s Mini-Dawn on-line detektorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) a detektory indexu lomu (RI) (Shímadzu, Kyoto, Japan) se použila pro stanovení molekulové hmotnosti (MW) komplexu receptorligand. Vzorky se injikovaly do Superose 12 HR 10/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy v PBS pufru, a eluovaly se stejným pufrem pri průtoku 0,5 ml/min. při teplotě místnosti. Jakje uvedeno na obr. 33, vykazoval eluční profil dva píky. Pík 1 představuje komplex ligand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF 165. Mol. hmot. byla vypočtena z LS a RI signálů. Stejný postup se použil pro stanovení mol. hmot. jednotlivých složek komplexu ligand-receptor. Výsledky těchto měření jsou následující: mol. hmot. komplexu Fltl D2.Fikl D3.Fc C I(a)/VEGF165 v píkové pozici je 157300 (obr. 33), mol hmot. VEGF165 v píkové pozici je 44390 (obr. 34) a mol. hmot. R1R2 v píku je I 13300 (obr. 35).
Tato data ukazují, že stoichiometrie komplexu Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl(a)/VEGF je 1:1, protože to odpovídá součtu molekulových hmotností pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGF 165. Důležité je to. že tato metoda ověřila, že komplex Fltl D2.FiklD3.Fc Cl(a)/VEGF165 se skládá z pouze jedné molekuly VEGF 165 ligandů a pouze jedné molekuly Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a).
- 30 CZ 3(13656 Β6
Příklad 28: Peptidové mapování Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a)
Disulfidové struktury a glykosylační mísa v FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) se určily metodou peptidového mapování. V této metodě se protein nejprve štěpil trypsinem. Získané fragmenty se analyzovaly a identifikovaly HPLC společně s hmotnostní spektrometrií, a dále také technikou Nterminálního sekvenování. Redukce trávení trypsinem se použila pro identifikaci fragmentů obsahujících disulfidové vazby. Zpracování produktů trávení trypsinem PNGasou (Glyko, Novato, CA) se použilo pro identifikaci fragmentů s N-vázanými glykosylačními místy. Výsledky jsou shrnuty na obr. 36.
V FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) existuje celkem 10 cysteinů; 6 z nich je přítomno v Fc regionu. Bylo potvrzeno, že Cys27 je disulfidové vázán na Cys76. Bylo potvrzeno, že Cysl21 je disulfidové vázán na Cysl82. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys211 a Cys214) tvoří intermolekulovou disulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny v jiném Fc řetězci. Nicméně, protože tyto dva cysteiny nemohou být od sebe enzymově separovány, nemůže být určeno, zda existuje disulfidová vazba mezi stejnými cysteiny (například Cys211-Cys211), nebo mezi Cys211 a Cys214. Bylo potvrzeno, že Cys216 je disulfidové vázán na Cys306. Bylo potvrzeno, že Cys352 je disulfidové vázán na Cys410.
V Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) existuje 5 potenciálních N-glykosylačních míst. Všech 5 míst je v různém rozsahu glykosylováno. Kompletní glykosylace byla zjištěna na Asn33 (aminokyselinová sekvence NIT), Asnl93 (aminokyselinová sekvence NST), a Asn282 (aminokyselinová sekvence NST). Dále byla zjištěna částečná glykosylace na Asn65 a Asn 120. Místa glykosylace jsou podtržená na obr. 36.
Příklad 29: Farmakokinetická analýza modifikovaných Fit receptoru (a) Farmakokinetická analýza Fit 1( l—3)—Fc (A40), Fltl D2.Flk lD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a)
Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg Fit 1 (1-3)-Fc(A40), CHO dočasně exprimujících FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a), CHO stabilně exprimujících FltlD2.FlklD3.Fc Cl(a) a CHO dočasně exprimujících VEGFR1R2-Fc Cl(a). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 dnů po injekci. Sérum se testovalo v ELISA navrženém pro detekci Fltl(l-3)-Fc (A40), Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF 165, vazbu Fltl (1-3)- Fc (A40), Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl(a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxidasu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 37 Tmax pro Fltl(l-3)-Fc (A40) byl 6 hodin, zatímco Tmax pro dočasně a stabilně exprimovaný Fltl D2.Flk lD3.Fc Cl (a) a dočasně exprimovaný FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) byly 24 hodin. Cmax pro Fltl(l-3)-Fc (A40) byla 8 pg/ml. Pro dočasně exprimované peptidy (FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a)) byly Cmax 18 pg/ml a pro stabilně exprimovaný VEGFR1R2-Fc Cl (a) byla Cmax 30 pg/ml.
(b) Farmakokinetická analýza FItl(l—3)—Fc (A40), Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a)
Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 MG/KG Fit 1 (l-3)-Fc(A40), CHO dočasně exprimujících Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a CHO dočasně exprimujících FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci. Sérum se testovalo v ELISA navrženém pro detekci Fit 1 (1 -3)-Fc, FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) nebo Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF165, vazbu Fltl( l-3)-Fc. Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl(a) nebo FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxidasu. Fltl(l-3)-Fc (A4) nemohl
-31 CZ 303656 B6 být detekován v séru po dnu 5, zatímco Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR.3D3.Fc Cl (a) byly detekovatelné po 15 dnech a déle. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 38.
Příklad 30: Hodnocení schopnosti Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) inhibovat růst nádorů in vivo
Pro hodnocení schopnosti Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl(a) inhibovat růst nádorů in vivo se použil model, ve kterém je suspenze nádorových buněk implantována podkožně do pravé tlapky samců myší s těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCID). V tomto testu se použily dvě buněčné linie, lidská HT-1080 fibrosarkomová buněčná linie (ATCC přírůstkové č. CCL-121) a krysí C6 gliomová buněčná linie (ATTC přírůstkové č. CCL—107), které mají značně odlišné morfologické a růstové charakteristiky. První dávka Fltl D2.FiklD3.Fc Cl(a) (25 mg/kg nebo v dávce uvedené na obr. 39 a 40) se podala v den implantace nádoru. Zvířatům se potom podávaly podkožní injekce Fltl (1—3)—Fc (A40), Fltl D2.Fík lD3.Fc Cl (a) nebo vehikula bud1 každý druhý den (EOD), nebo dvakrát týdně (2x/týdně) po dobu 2 týdnů. Po 2 týdnech se zvířata fixovala, odebraly se nádory a vzorky se zaslepily. Objem nádorů se měřil pomocí měření délky a šířky viditelných podkožních nádorů. Jak Fltl (1-3 )_Fc (A40), tak Fltl D2.Fík lD3.Fc Cl (a) významně redukovaly růst nádorů tvořených HT-1080 a C6 buňkami. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny na obr. 39 a 40.
Příklad 31: Efekt VEGF 165 a modifikovaných Fit receptoru na samičí reprodukční systém
Stereotypní charakter cévní přestavby, ke které dochází v děloze a ovariu během reprodukčního cyklu, byl dobře charakterizován, což Činí tuto tkáň velmi vhodnou pro testování mechanismů, které regulují angiogenesi, cévní přestavbu a regresi cév. Dále, pokusy s hybridizaci reprodukčních tkání in šitu poskytly jasné důkazy, že VEGF působí jako mediátor fyziologické angiogenese u zdravých hlodavců, stejně jako u člověka a ostatních primátů (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al., 1995). Protože jsou cyklická angiogenese a cévní přestavba význačnými rysy normálních vaječníků a dělohy, není překvapivé, že abnormální růst cév a/nebo dysfunkce cév charakterizují mnohé patologické stavy, které postihují tyto orgány. Dále, předpokládá se, že tyto patogenní cévní abnormality jsou způsobeny nebo podporovány dysregulovanou expresí, jednoho nebo více angiogenních nebo anti—angiogenních faktorů, hlavně VEGF.
Například je abnormální angiogenese charakteristická pro polycystaická ovaria, endometrisou a karcinom endometria, a u každého z těchto onemocnění je VEGF nadměrně exprimován v postižené tkáni (Kamat et al., 1995; Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Předpokládá se, že nadměrná exprese VEGF hraje patogenní úlohu při vzniku cévní hyperpermeability při ovariálním hyperstimulačním syndromu (McClure et al., 1994; Levin et al., 1998) a preeklampsii (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Dále, VEGF se považuje za faktor permeability odpovědný za produkci ascitu asociovaného s karcinomem ovaria a jinými nádory (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Činidla, která účinně neutralizují biologické účinky VEGF, mohou mít terapeutický přínos u výše uvedených a podobných stavů.
Angiogenese a cévní přestavba jsou také charakteristikami implantace blastocysty a vývoje placenty (Findlay, 1986). VEGF je silně exprimován jak v matemální lamina decidua, tak v embryonálním trofoblastu, kde se předpokládá, že nejprve stimuluje expanzi a hyperpermeabilitu cévní vaskulatury během periimplantačního období, a potom zprostředkuje tvorbu mateřských a embryonálních složek placentámí vaskulatury (Schweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995; Das et al., 1997). VEGF je také nutný pro luteální nagiogenesi a s ní spojenou sekrecí progesteronu nutnou pro přípravu dělohy pro implantaci (Ferrara et al„ 1998). Proto mohou být činidla inhibující biologické účinky VEGF použitelná jako antikoncepční Činidla (tím, že brání implantaci), nebo jako činidla způsobující potraty v časných stadiích
-32CZ 303656 Rň gcstace. Druhé uvedené použití může být zejména významné při nechirurgickém ukončení ektopiekých těhotenství.
Ačkoliv je exprese VEGF receptorů omezena zejména na cévní endotel v normální reprodukční tkáni, je Fltl exprimován také trofoblasty v placentě jak lidí. tak jiných zvířat (Clark et al., 1996: He et al., 1999), kde se předpokládá, že se podílí na invazi trofoblastu. Zajímavé je, že jak Fltl, tak KDR (Fikl) jsou exprimovány choriokarcinomovou buněčnou linií BeWo (Charnock-Jones et al., 1994), a bylo prokázáno, že VEGF podporuje syntézu DNA a fosforylaci tyrosinu MAP kinázy v těchto buňkách. Dále, metastazující ovariální karcinomy nejen exprimuji vysoké ko πιο centrace VEGF, ale - kromě cévního endotelu - nádorové buňky sami exprimuji KDR a/nebo Fltl (Boocock et al., 1995). Tato zjištění naznačují, že VEGF se může nejen zásadně podílet na tvorbě a udržování cévní vaskulatury, ale že alespoň u některých nádorů může mít VEGF samotný autokrinní úlohu a může přímo podporovat přežívání a proliferaci nádorových buněk. Proto mohou mít činidla blokující účinky VEGF zejména výhodné účinky při léčbě nádorů reprodukč15 nich orgánů.
Metody a výsledky (a) Hodnocení děložní hyperpermeability indukované VEGF
Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG) se podkožní injekcí (5 IC) aplikoval za účelem indukce ovulace u prepubertálních krysích samic. Toto vedlo k vzestupu estradiolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukci VEGF v děloze. Je popsáno, že tato indukce vede k hyperpermeabílitě dělohy a zvyšuje hmotnost dělohy o 6 hodin později a tento účinek může být potenciálně blokován modifikovanými Fit receptory Fltl (1-3 )-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). V tomto modelu in vivo je normální hmotnost krysí dělohy přibližně 50 mg a PMSG může indukovat zvýšení hmotnosti na 350 mg. Sušením tkáně se ukáže, že toto navýšení hmotnosti je způsobeno zcela vodou. Podkožní injekce Fltl (1-3 )-Fc (A40), Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl(a) v dávce 25 mg/kg za 1 hodinu po injek30 ci PMSG vede k přibližně 50% inhibici zvýšení hmotnosti dělohy. Zvýšení dávky modifikovaných Fit receptorů dále neredukuje zvýšení dělohy, což naznačuje, že v tomto modelu existuje složka nezávislá na VEGF. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 41.
(b) Hodnocení angiongenese v corpus luteum za použití progesteronu jako sledované hodnoty
Sérový gonadotropin březích klisen (PSMG) se podkožní injekcí (5 IU) aplikoval za účelem indukce ovulace u prepubertálních krysích samic. Toto vedlo po 4 dnech k vzniku plně funkčního corpus luteum, obsahujícího hustou síť cév, která umožňovala sekreci progesteronu do krevního řečiště za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogenese v corpus luteum vyžaduje
VEGF; blokování VEGF tedy povede k chybění nových krevních cév a tak k nedostatku progesteronu secemovaného do krevního řečiště. V tomto modelu ín vivo jsou klidové hladiny progesteronu přibližně 5 ng/ml a pomocí PMSG mohou být indukovány hodnoty 25 až 40 ng/ml. Podkožní injekce Fltl(l—3)—Fc (A40) nebo Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl(a) v dávce 25 mg/kg nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 42A až 42B.
Příklad 33: Farmakokinetické analýzy Fltl (1-3 )-Fc (A40) a pegylovaného Fltl(1—3>—Fc
Fit 1(1-3)—Fc byl PEGylován bud’ pomocí 10 kD PEG, nebo 20 kD PEG, a byl testován na Balb/c myších pro zjištění jeho farmakokinetického profilu. Bylo zjištěno, že obě pegylované formy Fltlfl—3)—Fc mají mnohem lepší farmakokinetické profily než Fltl(l—3)—Fc (A40), s Tmat ve 24 hodinách pro pegylované molekuly oproti 6 hodinám pro Fit I (I-3)-Fc (A40).
- JJ CZ 303656 B6
Příklad 34: VEGF 165 ELISA pro testování afinity modifikovaných variant Fltl receptorů pM VEGF165 se inkubovalo přes noc pří teplotě místnosti s modifikovanými variantami Fltl receptorů v koncentracích od 160 pM do 0,1 pM. Modifikovanými variantami Fltl receptorů použitými v tomto pokusu byly Fit 1 (1 -3)-Fc, EIt 1 (1 -3)-Fc (A40), dočasně exprimovaný Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a), dočasně exprimovaný Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a), Fltl(l-3NAs)~Fc, l ltl(l -3K ,c)-Fc a Tie2-Fc. Fltl(l-3NAS)-Fc je modifikovanou verzí Fit 1 (1 -3)-Fc, ve které je vysoce bazická aminokyselinová sekvence KNKRASVRRR nahrazena sekvencí NASVNGSR, což vede k inkorporací dvou nových glykosylačních míst a k redukci pěti pozitivních nábojů, oboje s cílem snížení nežádoucích vlivů této sekvence na farmakokinetiku. Fltl(l-3)R_>C)-Fc je modifikací, ve které je jeden argininový (R) zbytek ve stejné bazické aminokyselinové sekvenci změněn na cystein (C) (KNKRASVRRR -> KNKCASVRRR) pro umožnění pegylace na tomto zbytku, která může potom odstínit bazický region tak, že nemůže vykazovat nežádoucí účinky na farmakokinetiku. Po inkubaci se roztok přenese na plotnu obsahující zachycovací protilátku pro VEGF 165 (RandD). Množství volného VEGF 165 se potom určí za použití protilátky pro zobrazení volného VEGF165. Toto ukazuje, že modifikovanou variantou Fltl receptorů s nejvyšší afinitou pro VEGF 165 (podle nejnižšího množství volného VEGF 165) byla FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a), potom Fltl(l-3)-Fc a Fltl (1-3 )-Fc (A40) a potom Fit 1( 1- 3R >c)-Fc, Fltl(l-3NAs)-Fc a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). Tie2-Fc neměl žádnou afinitu pro VEGF 165.

Claims (7)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Použití fúzního polypeptidu schopného vázání cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) pro výrobu léčiva pro léčení očního onemocnění charakterizovaného cévní permeabilitou, vyznačující se tím, že fúzní polypeptid sestává z:
    (a) imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 prvního VEGF receptorů a Ig domény 3 druhého VEGF receptorů; a (b) multimerizační složky, kde prvním VEGF receptorem je Fltl, druhým VEGF receptorem je Fikl nebo Flt4 a první a druhou VEGF receptorovou složkou jsou pouze VEGF receptorové složky fúzního polypeptidu.
  2. 2. Použití podle nároku 1, kde fúzní polypeptid je uspořádán jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1, kde 1 je první VEGF receptorová složka, 2 je druhá VEGF receptorová složka a 3 je multimerizační složka.
  3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, kde multimerizační složka zahrnuje imunoglobulinovou doménu, kterou je Fc doména IgG nebo těžký řetězec IgG.
  4. 4. Použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde fúzní polypeptid je kódován neukleotidovou sekvencí uvedenou na (a) obr. 21A až 21C, (b) obr. 22A až 22C, (c) obr. 24A až 24C nebo nukleotidovou sekvencí, která se v důsledku degenerace genetického kódu lisí od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c).
  5. 5. Použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde fúzní polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až 21C, obr. 22A až 22C nebo obr. 24A až 24C.
  6. 6. Použití podle nároku 5, kde fúzní polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 24A až 24C.
    -34CL 303656 bó
  7. 7. Použití podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde očním onemocněním je makularní degenerace asociovaná s věkem nebo diabetická retinopatie.
CZ20100386A 1999-06-08 2000-05-23 Lécivo pro lécení ocního onemocnení CZ303656B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13813399P 1999-06-08 1999-06-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ303656B6 true CZ303656B6 (cs) 2013-01-30

Family

ID=22480568

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20100386A CZ303656B6 (cs) 1999-06-08 2000-05-23 Lécivo pro lécení ocního onemocnení
CZ20014387A CZ302689B6 (cs) 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleové kyseliny, fúzní polypeptid jí kódovaný, vektor s jejím obsahem, systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu a zpusob jeho prípravy, antagonista dimerního VEGF a použití

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20014387A CZ302689B6 (cs) 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleové kyseliny, fúzní polypeptid jí kódovaný, vektor s jejím obsahem, systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu a zpusob jeho prípravy, antagonista dimerního VEGF a použití

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1544299B1 (cs)
JP (2) JP4723140B2 (cs)
KR (1) KR100659477B1 (cs)
CN (3) CN101433715B (cs)
AT (2) ATE417928T1 (cs)
AU (2) AU779303B2 (cs)
BE (1) BE2013C029I2 (cs)
BR (2) BRPI0011407B8 (cs)
CA (1) CA2376379C (cs)
CY (2) CY1108883T1 (cs)
CZ (2) CZ303656B6 (cs)
DE (2) DE60019415T2 (cs)
DK (2) DK1544299T3 (cs)
ES (2) ES2319305T3 (cs)
FR (1) FR13C0028I2 (cs)
HK (3) HK1043388A1 (cs)
HR (1) HRP20010908B1 (cs)
HU (3) HU230159B1 (cs)
IL (3) IL146890A0 (cs)
LT (1) LTC1183353I2 (cs)
LU (1) LU92195I2 (cs)
ME (2) ME00024B (cs)
MX (1) MXPA01012630A (cs)
NO (3) NO330775B1 (cs)
NZ (1) NZ515913A (cs)
PL (1) PL208247B1 (cs)
PT (2) PT1183353E (cs)
RS (1) RS50073B (cs)
RU (1) RU2265661C2 (cs)
SK (1) SK287332B6 (cs)
UA (1) UA74146C2 (cs)
WO (1) WO2000075319A1 (cs)
ZA (1) ZA200110068B (cs)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US6833349B2 (en) * 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
US7087411B2 (en) * 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US6734017B2 (en) 2001-09-28 2004-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression
WO2004108069A2 (en) 2002-05-04 2004-12-16 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth
PL1608685T3 (pl) 2003-03-28 2007-07-31 Regeneron Pharma Antagoniści VEGF do leczenia cukrzycy
ES2616749T3 (es) 2003-05-16 2017-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
ES2831031T3 (es) * 2003-05-16 2021-06-07 Acorda Therapeutics Inc Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS
WO2004106378A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
WO2004110490A2 (en) * 2003-06-06 2004-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
AR046510A1 (es) * 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
WO2005016369A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
CA2566731C (en) 2004-05-18 2012-07-24 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of purifying chondroitinase and stable formulations thereof
CA2569108C (en) 2004-06-08 2012-08-21 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use
AU2005254058A1 (en) 2004-06-10 2005-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for the treatment of human cancer
AU2005265071A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center VEGF inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion
MX2007001241A (es) 2004-07-30 2007-07-11 Regeneron Pharma Metodos para tratar diabetes tipo i mediante el bloqueo de la actividad mediada de vegf.
PL2229956T3 (pl) 2004-09-13 2013-09-30 Genzyme Corp Konstrukty multimeryczne
FR2878749B1 (fr) * 2004-12-03 2007-12-21 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives
US7303748B2 (en) 2005-02-02 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor
WO2006104852A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
JP5189985B2 (ja) 2005-09-26 2013-04-24 アコーダ セラピューティクス、インク． コンドロイチナーゼａｂｃｉ変異体を用いた組成物およびその使用方法
PT1962895E (pt) † 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
FR2895258B1 (fr) 2005-12-22 2008-03-21 Aventis Pharma Sa Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux
CN100502945C (zh) * 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
MX2008016124A (es) 2006-06-16 2009-01-20 Regeneron Pharma Formulaciones antagonistas de vegf adecuadas para la administracion intravitreal.
MX2009003229A (es) 2006-09-29 2009-06-18 Oncomed Pharm Inc Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer.
EP2450442B1 (en) 2006-10-10 2017-07-19 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
FR2918279B1 (fr) * 2007-07-05 2010-10-22 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan
CN101575379B (zh) * 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
ES2836948T3 (es) 2008-11-03 2021-06-28 Molecular Partners Ag Proteínas de unión que inhiben la interacción del receptor de VEGF-A
CN101838329A (zh) * 2009-03-18 2010-09-22 嘉和生物药业有限公司 抗血管新生融合蛋白
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AR081361A1 (es) * 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
EP3327032A1 (en) 2010-08-06 2018-05-30 Genzyme Corporation Vegf antagonist compositions and uses thereof
JP6043629B2 (ja) * 2011-01-07 2016-12-14 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
KR20190049934A (ko) 2011-01-13 2019-05-09 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
KR101397088B1 (ko) 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
ES2651521T3 (es) * 2011-12-01 2018-01-26 Innovent Biologics, Inc. Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y métodos de uso de los mismos
CN103304668B (zh) * 2012-03-12 2015-10-28 江苏健德生物药业有限公司 Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
DK2846836T3 (da) 2012-05-07 2019-11-11 Allergan Inc Fremgangsmåde til behandling af amd hos patienter, der er refraktære overfor anti-vegf-terapi
WO2014006113A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sanofi Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CN104193828B (zh) * 2013-09-12 2017-04-05 北京韩美药品有限公司 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
EP3065761B1 (en) 2013-11-05 2020-01-08 Allergan, Inc. Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin
EP3143044A1 (en) 2014-05-12 2017-03-22 Formycon AG Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
ES2732925T3 (es) 2014-07-18 2019-11-26 Sanofi Sa Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
SI3230316T1 (sl) 2014-12-11 2022-05-31 Bayer Healthcare Llc Zdravljenje starostne degeneracije makule z majhno aktivno horoidalno neovaskularizacijsko lezijo
GB201503453D0 (en) 2015-03-01 2015-04-15 Jain Arjun Endothelin-1"sponge"
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
WO2017065559A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 (주)알테오젠 Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
US20180326126A1 (en) 2015-11-18 2018-11-15 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
KR102354198B1 (ko) 2015-11-18 2022-01-20 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 인크. Vegf-길항제의 액체 제제를 포함하는 사전-충전된 제약 패키지
US11654046B2 (en) 2015-11-18 2023-05-23 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
CA3005391A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. Methods and compositions for binding vegf
LT3384049T (lt) 2015-12-03 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetinių variacijų susiejimo su klinikiniais rezultatais būdai pacientams, sergantiems amžine geltonosios dėmės degeneracija, gydytiems anti-vegf
JP6953433B2 (ja) 2016-01-26 2021-10-27 フォーマイコン アーゲーＦｏｒｍｙｃｏｎ Ａｇ Ｖｅｇｆアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ
JPWO2018070390A1 (ja) 2016-10-12 2019-08-22 第一三共株式会社 抗ｒｏｂｏ４抗体と他剤を含む組成物
WO2018094316A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Just Biotherapeutics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
EP3630062A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 SiO2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
EP3630043A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Formycon AG Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
CA3067735A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Just Biotherapeutics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
JP7183268B2 (ja) 2017-11-20 2022-12-05 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用
DK3717636T3 (da) 2017-11-27 2023-05-30 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associeret-virus-variantcapsider og anvendelse til inhibering af angiogenese
JP7339248B2 (ja) 2017-11-30 2023-09-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 血管形成眼障害を処置するためのｖｅｇｆアンタゴニストの使用
CN117405806A (zh) * 2017-12-13 2024-01-16 里珍纳龙药品有限公司 管理层析柱床支架的装置和系统及相关方法
CN116059318A (zh) 2018-01-26 2023-05-05 加利福尼亚大学董事会 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物
AU2019265005A1 (en) 2018-05-10 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
CN111378044B (zh) 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
US20220204920A1 (en) 2019-05-16 2022-06-30 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
CA3150481A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Amgen Inc. Injection device for drug delivery and packaging for the injection device
US20210077645A1 (en) 2019-09-16 2021-03-18 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021108255A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Long-acting vegf inhibitors for intraocular neovascularization
NZ781143A (en) * 2019-12-06 2023-05-26 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
JP2023505216A (ja) 2019-12-06 2023-02-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆミニトラップおよびそれらの使用方法
JP2023514325A (ja) 2020-02-24 2023-04-05 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの外部滅菌中に使用するための容器及びシステム
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2024029876A1 (ko) * 2022-08-02 2024-02-08 주식회사 파노로스바이오사이언스 변형된 융합 단백질 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997044453A1 (en) * 1996-05-07 1997-11-27 Genentech, Inc. Novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity, their uses and processes for their production

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997044453A1 (en) * 1996-05-07 1997-11-27 Genentech, Inc. Novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity, their uses and processes for their production

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Davis-Smyth T. et al.: "The second immunoglobulin-like domain of the VEGF tyrosine kinase receptor Flt-1 determines ligand binding and may initiate a signal transduction cascade", EMBO Journal, Vol. 15(18), 4919-4927, 1996 *

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0201515A3 (en) 2004-12-28
EP1183353B1 (en) 2005-04-13
EP1544299A1 (en) 2005-06-22
HUP0201515A2 (en) 2002-08-28
CN103349781B (zh) 2015-04-01
HK1185798A1 (en) 2014-02-28
CA2376379C (en) 2007-08-07
NO2013010I1 (no) 2013-06-17
IL190234A0 (en) 2008-11-03
DK1544299T3 (da) 2009-03-23
CN101433715A (zh) 2009-05-20
NO330775B1 (no) 2011-07-11
DE60019415D1 (de) 2005-05-19
BRPI0011407B1 (pt) 2018-09-25
BR0011407A (pt) 2002-04-02
RS50073B (sr) 2009-01-22
JP2003501089A (ja) 2003-01-14
HU230159B1 (hu) 2015-09-28
FR13C0028I1 (fr) 2013-06-14
HRP20010908B1 (en) 2006-05-31
RU2265661C2 (ru) 2005-12-10
HRP20010908A2 (en) 2005-04-30
HK1132653A1 (en) 2010-03-05
AU2005201365B2 (en) 2007-08-09
AU779303B2 (en) 2005-01-13
KR20020019070A (ko) 2002-03-09
CZ20014387A3 (cs) 2002-10-16
CY1108883T1 (el) 2014-07-02
NO20100656L (no) 2002-02-08
NO332559B1 (no) 2012-10-29
IL146890A (en) 2008-07-08
NO20016036L (no) 2002-02-08
EP1183353A1 (en) 2002-03-06
JP4723140B2 (ja) 2011-07-13
DE60041159D1 (de) 2009-01-29
NO2013010I2 (no) 2013-05-15
ATE417928T1 (de) 2009-01-15
AU5040400A (en) 2000-12-28
DK1183353T3 (da) 2005-08-08
JP2011024595A (ja) 2011-02-10
CY2013019I1 (el) 2015-11-04
CN101433715B (zh) 2013-04-17
ZA200110068B (en) 2002-12-06
LTPA2013009I1 (lt) 2013-06-25
LTC1183353I2 (lt) 2023-02-27
PL352246A1 (en) 2003-08-11
PT1183353E (pt) 2005-06-30
WO2000075319A1 (en) 2000-12-14
ES2319305T3 (es) 2009-05-06
MEP3208A (xx) 2010-02-10
DE60019415T2 (de) 2006-03-09
CZ302689B6 (cs) 2011-09-07
CY2013019I2 (el) 2015-11-04
UA74146C2 (uk) 2005-11-15
IL146890A0 (en) 2002-08-14
AU2005201365A1 (en) 2005-04-28
CN1369009A (zh) 2002-09-11
HK1043388A1 (en) 2002-09-13
SK17522001A3 (sk) 2003-04-01
PT1544299E (pt) 2009-03-18
MXPA01012630A (es) 2002-07-22
ATE293164T1 (de) 2005-04-15
PL208247B1 (pl) 2011-04-29
EP1544299B1 (en) 2008-12-17
CN100523187C (zh) 2009-08-05
SK287332B6 (sk) 2010-07-07
NO20016036D0 (no) 2001-12-10
NZ515913A (en) 2004-01-30
CN103349781A (zh) 2013-10-16
ME00024B (me) 2010-02-10
JP5273746B2 (ja) 2013-08-28
FR13C0028I2 (fr) 2014-05-16
HUS1300052I1 (hu) 2016-08-29
BE2013C029I2 (cs) 2019-03-06
LU92195I2 (fr) 2013-07-15
HU229156B1 (en) 2013-09-30
YU86901A (sh) 2004-05-12
BRPI0011407B8 (pt) 2021-05-25
KR100659477B1 (ko) 2006-12-20
ES2237429T3 (es) 2005-08-01
CA2376379A1 (en) 2000-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10392430B2 (en) Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
CZ303656B6 (cs) Lécivo pro lécení ocního onemocnení
CA2588221C (en) Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20200523