ES2350828T3 - Nuevas secuencias de polinucleótidos y polipéptidos y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
Description
La presente invención se refiere a polinucleótidos y polipéptidos que se expresan en forma diferencial en una célula enferma y los procedimientos de diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades relacionadas con estos.
El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos, sólo superada por la enfermedad cardíaca. En 2002, la American Cancer Society estimó que se diagnosticarán 1.284.900 nuevos casos y se espera que 550.000 de los 1,6 millones que viven con cáncer mueran. El cáncer es causado por la alteración genética o mal funcionamiento de los genes en la célula que origina la proliferación descontrolada de las células anormales para formar una masa o neoplasia tumoral. Uno de los principales contribuyentes a la proliferación descontrolada de las células es la sobreexpresión de los protooncogenes y/o subexpresión de los genes supresores del tumor. Ambos genes cumplen un papel crítico en la patogénesis del cáncer y el desbalance de la expresión del polinucleótido de estas dos familias de polinucleótidos perpetúa la inmortalización del cáncer. Las clases de oncogenes y genes y polipéptidos supresores del tumor incluyen los factores de crecimiento, tales como factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento transformante α (TNF-α) y sus correspondientes receptores, polipéptidos de señalización intracelular (tirosina quinasas), factores de transcripción de polinucleótidos, polipéptidos de control del ciclo celular, y polipéptidos de interacción célula-célula o célula-matriz.
El crecimiento celular descontrolado lleva a la formación de una masa celular tumoral localizada, cuya viabilidad se mantiene por la formación de neovasculatura tal como capilares sanguíneos que son esenciales para transportar los nutrientes a las células. La angiogénesis es en consecuencia un elemento clave en la supervivencia, crecimiento y metástasis de los tumores. Los polipéptidos conocidos por cumplir un papel vital en la angiogénesis son los factores de crecimiento y sus correspondientes receptores, que incluyen EGF y TGF-α, así como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF).
La masa tumoral localizada, con su proliferación celular rápida y continua, finalmente produce la invasión de los tejidos adyacentes ya que las células tumorales se escapan de la masa tumoral original y migran a los ganglios linfáticos regionales y estructuras vitales distales en el cuerpo por medio de los sistemas sanguíneos o linfáticos. La invasión de las células tumorales requiere la adhesión de las células a la matriz extracelular, seguida por su ruptura y finalmente la migración de la célula tumoral. Se ha mostrado la diseminación de ciertos cánceres en los sitios preferidos por la presencia de ciertos polipéptidos en la superficie celular que son capaces de concentrar marcadores de superficie celular seleccionados en las células diana.
En consecuencia, la inhibición de la proliferación celular descontrolada, angiogénesis, y difusión celular son algunos de las dianas clave en el desarrollo de agentes terapéuticos para tratar la progresión y recurrencia tumoral. Si bien se ha realizado mucho avance en el campo del cáncer y terapia del cáncer, muchas de las terapias en desarrollo actuales han sido poco satisfactorias, y existe la necesidad de una terapia adyuvante alternativa para muchos de estos tipos de tumores específicos. La presente solicitud involucra el descubrimiento de un nuevo polinucleótido que codifica un polipéptido o polipéptido que se expresa en forma diferencial en ciertas células tumorales y puede ser útil en el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención del cáncer.
La presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido está constituido de 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
Se proporcionan polinucleótidos de S30-21616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA o mS30-21616/DEGA respectivamente), en particular SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, o un fragmento de estos. Se describen los polipéptidos de S3021616/DEGA humanos y murinos aislados y/o purificados (hS30-21616/DEGA y mS3021616/DEGA), en particular SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4, o un fragmentos de estos. Además, se proporcionan procedimientos y composiciones para el diagnóstico, evaluación, tratamiento y prevención de enfermedades usando tales polinucleótidos.
La Figura 1 ilustra la secuencia de nucleótidos y aminoácidos deducidos de S3021616/DEGA (ADNc = 3769 pb; ORF = 1569 pb, que codifica un polipéptido de 522 aminoácidos) con las siguientes características: secuencia del péptido señal (negrita); dominio de transmembrana (negrita subrayada); sitios de glicosilación positivos (aminoácidos rodeados) y serinas y treoninas fosforiladas putativas (aminoácidos recuadrados)
Las Figuras 2 A y B muestran el análisis de transferencia de punto de los niveles de expresión de ADNc de S30-21616/ DEGA en muestras de tejido tumoral y normal de los pacientes individuales usando Matrices de Perfil del Cáncer BD Biosciences I (A) y II (B).
La Figura 3 muestra el análisis de transferencia Northern de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares de adenocarcinoma gástrico, AGS (calle A), NCI-N87 (calle B), RF-1 (calle C), KatoIII (calle D), KKVR (calle E), NCI-SNU-16 (calle F), y NCI-SNU-1 (calle G). El panel inferior muestra el nivel de ARNm de β-actina en las líneas celulares respectivas.
La Figura 4 muestra el análisis de transferencia de punto de la expresión de S3021616/DEGA en líneas celulares generales no de adenocarcinoma gástrico.
La Figura 5A muestra la representación esquemática de la proteína de S3021616/DEGA. Los dominios presentes en la proteína de S30-21616/DEGA se muestran con sus límites de aminoácidos siguientes: SP=Péptido señal; LRR=Repetición rica en leucina; LRR-NT=LRR Dominio rico en cisteína flanquante N-terminal; LRR-CT=LRR Dominio rico en cisteína flanqueante C-terminal; IgG=dominio de inmunoglobulina; TM=dominio de transmembrana; y S/T-Rico=Dominio rico en serina/treonina-rico. Los rombos negros representan sitios de glicosilación N-ligados putativos. La Figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos del polinucleótido de S30-21616/DEGA con la LRR en negrita, el dominio tipo inmunoglobulina subrayado, el dominio de transmembrana recuadrado, y los sitios de fosforilación de caseína quinasa y de fosforilación de polipéptido quinasa C indicados por [] y (), respectivamente.
La Figura 6 ilustra la localización subcelular de la proteína de fusión S30-21616/DEGAEGFP (Proteína Fluorescente Verde Potenciada) que se expresó en forma estable en células 293 y se evalúa usando microscopia de fluorescencia (aumento 200X).
La Figura 7 muestra la expresión de S30-21616/DEGA por análisis de transferencia Northern en células progenitoras AGS o tipo salvajes (calle 1), AGS transfectadas con el vector vacío, AGS/clon del vector vacío #15 (calle 2), AGS transfectadas con S30-21616/DEGA antisentido, clon AGS/DEGA antisentido #6 (calle 3) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (calle 4). El panel inferior muestra la expresión endógena de ARNm de β-actina en los tipos celulares respectivos (control interno).
La Figura 8 (panel izquierdo) muestra los histogramas de citometría de flujo de los perfiles de contenidos de ADN/ ciclo celular del clon del vector vacío AGS #15 (panel izquierdo superior), clon antisentido AGS/DEGA #6 (panel izquierdo medio) y clon antisentido AGS/DEGA #11 (panel izquierdo inferior). La Figura 8 (panel derecho) muestra la microscopía óptica que compara el tamaño celular del clon antisentido AGS #6 (panel derecho medio) y clon #11 (panel derecho inferior) al AGS/clon del vector vacío #15 (panel derecho superior).
La Figura 9 ilustra las curvas de crecimiento tumorigénico de los clones de AGS transfectados en forma estable con constructo de DEGA antisentido o vector vacío determinado por la cantidad de ratones portadores del tumor versus la cantidad total de ratones inyectados, de la siguiente manera: AGS WT (12/12); AGS/clon del vector vacío #15 (19/19); clon antisentido AGS/DEGA #6 (6/12); y clon antisentido AGS/DEGA #11 (6/19).
La presente invención se refiere a secuencias de polinucleótidos de una línea celular de carcinoma pulmonar, A549 ADNc (BD Biosciences/Clonentech, Palo Alto, CA), que tiene un marco de lectura abierto de 1569 nucleótidos. Esta secuencia de nucleótidos humana se denomina como hS30-21616 o hS30-21616/DEGA debido a su Perfil de Expresión Diferencial en Adenocarcinoma Gástrico. También se ha aislado la contraparte de ratón de esta secuencia de polinucleótidos, mS30-2161/DEGA, que se expresa en forma diferencial en una biblioteca de ADNc sustractiva de células madre hematopoyéticas y en una línea celular de cáncer renal de ratón. Por consiguiente la presente invención proporciona un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3, en el que el oligonucleótido constituye de 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o el complemento de esta.
Los polinucleótidos de la presente invención pueden ser ADN, ARN, duplex ADN/ARN, polipéptido-ácido nucleico (PNA), o sus derivados. La secuencia de polinucleótidos incluye fragmentos o segmentos que son suficientemente largos para usar en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o varias técnicas de hibridación bien conocidas en la técnica para la identificación, clonación y amplificación del total o parte de las moléculas de ARNm o ADN.
Por ejemplo, la hibridación en condiciones de rigurosidad alta significa las siguientes condiciones de hibridación y lavado del ácido nucleico: hibridación a 42°C en presencia de 50% de formamida; un primer lavado a 65°C con 2 X SSC que contiene 1% de SDS; seguido por un segundo lavado a 65°C con 0,1 X SSC. Además, los polinucleótidos de la presente invención incluyen los complementos de cualquiera de los nucleótidos o péptidos mencionados anteriormente, por ejemplo, ADNc y ARNm.
Como se usa en la presente, "aislado" o "purificado" significa que una molécula, por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido, está separado del material celular u otros componentes que lo acompañan naturalmente. Normalmente, el polinucleótido o polipéptido está sustancialmente puro cuando está al menos 60% (en peso) libre de las proteínas y otras moléculas orgánicas naturales con las que está asociado naturalmente. Preferentemente, la pureza de la preparación es al menos 75%, más preferentemente al menos 90%, y de máxima preferencia al menos 99% (en peso) libre. Un polinucleótido o polipéptido sustancialmente puro se puede obtener, por ejemplo, por extracción de una fuente natural, expresión de un ácido nucleico recombinante que codifica el polipéptido, o síntesis química. La pureza se puede medir por cualquier procedimiento apropiado, por ejemplo, cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC. Se debe apreciar que el término aislado o purificado no se refiere a una preparación tipo genoteca que contiene una miríada de otros fragmentos de secuencia. Un polinucleótido o polipéptido sintetizado químicamente o un polinucleótido o polipéptido recombinante producido en un tipo celular diferente del tipo celular en que está naturalmente, por definición, está sustancialmente libre de los componentes que naturalmente lo acompañan. Por consiguiente, los polinucleótidos o polipéptidos sustancialmente puros incluyen los que tienen secuencias derivadas de organismos eucarióticos pero producidos en E. coli u otros procariotas.
En una realización de la presente invención, se proporcionan los constructos recombinantes. Estos constructos comprenden un polinucleótido de S30-21616/DEGA, en particular, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:3, o un fragmento de este, y un vector adecuado, que incluye, pero sin limitación, un vector de plásmido o viral, fagémido, cósmido, vector fago o derivado útil para los fines de expresión, replicación, generación de sonda y secuenciación. Tales constructos se pueden usar para modular la función de S30-21616/DEGA.
La función de S30-21616/DEGA puede ser regulada por aumento o disminución por la modulación del control de transcripción o traducción del ácido nucleico en la célula, lo que produce la inhibición de la expresión del polinucleótido de S30-21616/DEGA o alteración de la cantidad de polipéptido de S30-21616/DEGA. Por la regulación por aumento, se entiende que la actividad asociada con S30-21616/DEGA está aumentada, mientras que la regulación por disminución significa reducción o inhibición de la actividad. El control de la expresión del polinucleótido de S30-21616/DEGA puede ser en el nivel de ADN o ARN. En el nivel del ADN, las funciones que se pueden inhibir incluyen la replicación o transcripción. Las funciones del ARN interferidas incluyen la translocación del ARN en el sitio de la traducción del polipéptido, la traducción del polipéptido del ARN, empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y actividad catalítica que puede estar involucrada en o facilitada por el ARN.
Un agente o constructo que puede inhibir la expresión del polinucleótido S3021616/DEGA es un oligonucleótido antisentido, que puede estar en la forma de ADN o ARN, o un híbrido de este. Los oligonucleótidos antisentido pueden ser ADNc, ADN genómico o ARN o ADN sintético. El ADN puede ser bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la cadena codificadora o no codificadora. Por antisentido, se denomina a la hibridación específica del oligómero con su ácido nucleico diana, lo que produce interferencia en la función normal del ácido nucleico. Todas las funciones del ADN se pueden interferir por antisentido, lo que incluye replicación y transcripción. Además, todas las funciones del ARN se pueden interferir por antisentido, lo que incluye la translocación del ARN al sitio de traducción de la proteína, la traducción de la proteína a partir del ARNm, empalme del ARN para producir una o más especies de ARNm, y la actividad catalítica que puede estar involucrada o facilitada por ARN. El efecto global de tal oligonucleótido antisentido es la inhibición de la expresión de S3021616/DEGA en una célula, que puede producir reducción de la transcripción de ADN,
Preferentemente, el oligonucleótido antisentido tiene una porción de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, o el complemento de esta. También preferentemente, el oligonucleótido antisentido es complementario con una porción de una secuencia de nucleótidos que codifica el total o una porción de un polipéptido S3021616/DEGA de la SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4. Preferentemente, el oligonucleótido antisentido comprende secuencias específicas del gen cortas del ácido nucleico S3021616/DEGA de 20-30 nucleótidos de longitud y más preferentemente entre 12-25 nucleótidos de longitud.
Los oligonucleótidos antisentido de la presente invención se pueden administrar en una célula por cualquier procedimiento adecuado, que incluye endocitosis mediada por receptor, microinyección y por medio de complejos de proteína y ADN o encapsulado liposómico catiónico. Otro procedimiento para mejorar la administración es por la unión de ligandos del receptor o anticuerpos específicos de la célula a las secuencias de oligonucleótidos antisentido para asistir en la dirección y conducción de estos a las células y/o regiones del tejido diana particulares.
Uno de los mayores problemas al usar el oligonucleótido antisentido como molécula terapéutica es la degradación enzimática rápida de los oligonucleótidos en sangre y en las células. Una solución es invertir en forma terminal la polaridad del oligonucleótido. Este concepto se basa en la suposición de que la degradación intracelular se debe principalmente a una exonucleasa y. en consecuencia, las modificaciones en los extremos de los oligonucleótidos podrían estabilizar la secuencia.
Otra solución propuesta es por medio de la modificación de las uniones fosfodiéster entre las bases nucleotídicas para formar, por ejemplo, enlaces fosforotioato al sustituir uno o más oxígenos no ligados en el esqueleto de fosfato con átomos azufre para formar, por ejemplo, monotiofosfato y ditiofosfatos. Se ha mostrado que estos oligonucleótidos modificados tienen vida media aumentada. Además de la modificación del azufre, otros tipos de modificaciones en el esqueleto de azúcar-fosfato del oligonucleótido antisentido incluyen, pero sin limitación, un grupo 3’amino sustituido con un grupo 3’hidroxilo en el anillo de 2’desoxirribosa del ADN (modificación con fosforamidato), 2’O-metil oligorribonucleósido fosfodiésteres, metilfosfonatos (adición de un grupo metilo al oxígeno no ligado en el esqueleto fosfodiéster), y fosfotriéster.
Una segunda generación de oligonucleótidos antisentido incluye oligonucleótidos de esqueleto mixto que pueden contener la modificación de monotiofosfato en ambos extremos 3’ y 5’ del oligonucleótido. Otros ejemplos de modificaciones incluyen por ejemplo, 3’-desoxi-3’-(2N,N-difeniliminidazolidino)-timidina-5’-N,N,-diisopropil-O-metilfosforamidita, 3’-desoxi-3’-(2-N,Ndifeniliminidazolidino)-timidina-5’-O-metilfosfita. Los ejemplos de modificadores potenciales incluyen, por ejemplo, pero sin limitación, hidraxina, succinato, etilendiamina y muchos otros. En forma alternativa, la posición 3’ del enlace fofosdiéster no modificada se puede sustituir con un carbono en la unión P-O para formar una unión 3’metileno o 3'-hidroximetileno.
Uno de los efectos secundarios de usar oligonucleótidos antisentido trata del reconocimiento por el sistema inmune de que el oligonucleótido antisentido es una molécula extraña, en particular, los oligonucleótidos que contienen la secuencia de dos bases, CpG (Citosina-fosfato-Guanina) no metilada, que se hallan comúnmente en el ADN bacteriano y no en el ADN de mamífero. Una solución potencial es metilar tal oligonucleótido. Otros procedimientos para minimizar los efectos secundarios del tratamiento con oligonucleótidos involucran la administración lenta de los oligonucleótidos en dosis bajas por inyección intravenosa continua (en vez de administrar dosis altas durante un período corto de tiempo) y el desarrollo de vehículos de administración tópica que permiten la administración suficiente del oligonucleótido a través de la epidermis.
También es posible inhibir la expresión de S30-21616/DEGA por la inactivación de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de S30-21616/DEGA y en consecuencia disminuir o inhibir la expresión del polipéptido. Tal inactivación puede ocurrir por la supresión de la secuencia de nucleótidos en la célula o por la introducción una supresión o mutación en la secuencia de nucleótidos, de este modo se inactiva la secuencia de nucleótidos. La secuencia de nucleótidos también se puede inactivar por la inserción en el polinucleótido de otro fragmento de ADN de modo que no se produzca la expresión del S30-21616/DEGA. Los procedimientos para introducir mutaciones, tales como supresiones e inserciones, en genes en células eucarióticas son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, Patente U.S. Nº 5.464.764. Los oligonucleótidos y los vectores de expresión útiles para la mutación de los genes en las células se pueden obtener de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica y las pautas provistas en la presente memoria; por ejemplo, se pueden usar procedimientos útiles para obtener y expresar oligonucleótidos antisentido y vectores de expresión útiles para mutar genes en las células.
En otra realización de la presente invención, la función o expresión de S3021616/DEGA se puede regular por aumento o inducir en una célula. Los ejemplos de regulación por aumento incluyen pero sin limitación la administración a la célula de ácidos nucleicos desnudos (vectores de ADN desnudos tales como oligonucleótidos o plásmidos), o polipéptidos, que incluyen polipéptidos producidos en forma recombinante. Polipéptidos producidos en forma recombinante significa que las secuencias de ADN que codifican S3021616/DEGA se colocan en un vector de expresión adecuado, que se describe en detalle a continuación.
Se halló que el S30-21616/DEGA está regulado por aumento en ciertos tipos de células tumorales, tales como cánceres de estómago y tiroides, pero generalmente está regulado por disminución en cáncer de mama, pulmón y ovario. La expresión es generalmente baja en muestras de tejido normal o no neoplásico y en consecuencia puede ser útil como un marcador molecular para el diagnóstico de varios cánceres. En consecuencia es un objeto de esta invención que la expresión o la carencia de expresión de este polinucleótido se puede usar para determinar la predisposición de un animal, preferentemente un individuo humano, a un cáncer específico tal como, pero sin limitación, por ejemplo, cáncer de estómago. Se contempla específicamente un kit, útil en el diagnóstico o pronóstico de cáncer, que tiene una sonda de ADN o ADN antisentido o ARN derivada de las secuencias del polinucleótido de S3021616/DEGA y sus variantes, en una mezcla de reactivos conocidos en la técnica.
En otra realización de esta invención, el polinucleótido de S30-21616/DEGA y/o polipéptido de S30-21616/DEGA se pueden regular por aumento y/o por disminución. Por ejemplo, la regulación por aumento o disminución de S30-21616/DEGA en la superficie de la célula o secretada en el suero del paciente con cáncer se puede usar en forma diagnóstica para confirmar o descartar un cáncer sospechado. Como biomarcador sérico o de superficie celular, el nivel de expresión del polipéptido en el momento del diagnóstico también puede proporcionar un pronóstico más preciso que por la estadificación sola. Se ideó un kit de inmunoensayo que tiene, por ejemplo, un anticuerpo dirigido al polipéptido o un péptido derivado de la unión del ligando al polipéptido para la presente invención. Las lecturas de los ensayos son a partir de inmunoensayos estándares bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de tales ensayos incluyen, pero sin limitación, ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), ensayo radioinmunomarcado (RIA), inmunotransferencias y separación celular activada por fluoresceína (FACS).
La invención también desvela un procedimiento para purificar y producir las variantes extracelulares o intracelulares de longitud completa del polipéptido. Por ejemplo, una realización de la invención proporciona constructos recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3 que tiene la secuencia de polinucleótidos o un fragmento de esta, y un vector de expresión adecuado operativamente unido a un promotor y una secuencia líder para la expresión en una célula huésped procariótica o eucariótica. Los huéspedes procarióticos adecuados incluyen, por ejemplo, E. coli, tal como E. coli HB 101, E. coli W3110, E. coli DH1 ol; Pseudomonas, Bacillus, tal como Bacillus subtilis y Streptomyces. Las células eucarióticas adecuadas incluyen levaduras y otros hongos, insectos, y células animales tales como células CHO, células COS y células humanas y células vegetales en cultivo de tejidos. Por consiguiente, la presente invención proporciona una célula transfectada con un constructo de expresión que tiene un polinucleótido de S30-21616/DEGA, por ejemplo, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3, operativamente unido a secuencias de control de expresión. Preferentemente, tal célula transfectada expresa un polipéptido de S30-21616/DEGA, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO 4.
Se puede tratar cualquier enfermedad neoplásica adecuada, es decir, cáncer, usando los presentes procedimientos de la invención, que incluye, por ejemplo, cánceres de estómago, tiroides, mama, ovario, riñón o pulmón.
Los polinucleótidos de la presente invención se pueden usar en el tratamiento de cáncer metastático. Los tratamientos incluyen ablación del polinucleótido, reemplazo del polinucleótido, expresión del polinucleótido y supresión del polinucleótido antisentido. En una realización preferida de la invención, el procedimiento de tratamiento de un cáncer metastásico, involucra la administración de una composición farmacéutica que contiene una cantidad efectiva de un polinucleótido de S30-21616/DEGA, o fragmento de este, con secuencias adicionales tales como promotores para la expresión del mensaje de sentido y antisentido, secuencias recombinantes para la localización del gen, marcadores seleccionables para la transfección y selección o replicación u orígenes para el pasaje en células procarióticas, eucarióticas, bacterianas, de insecto o levadura. Los ácido nucleicos usados pueden ser ADN, ARN o PNA monocatenarios o bicatenarios. Las variantes de los ácidos nucleicos pueden incluir alteraciones tales como supresión, sustitución, adición o alteraciones no conservadoras naturales o manipuladas genéticamente.
Se considera que los polinucleótidos y fragmentos de la invención, que incluyen el antagonista, cuando se usan en el cuerpo humano para el fin de diagnóstico o tratamiento, se administrarán en la forma de una composición que tiene adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Tales portadores son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los modos de administración incluyen, pero sin limitación, las vías subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica o mucosa.
Los polinucleótidos y polipéptidos de S30-21616/DEGA humano de esta invención se expresan en forma diferencial en células madre hematopoyéticas (ver Ejemplo 2) y pueden ser útiles en la regulación de la hematopoyesis. En consecuencia, los polinucleótidos y polipéptidos de S30-21616/DEGAs de esta invención, o los agentes dirigidos contra tales polinucleótidos y polipéptidos, pueden ser útiles para el tratamiento de enfermedades asociadas con células madre, y en particular una enfermedad hematopoyética tal como deficiencias de las células mieloides y linfoides, por ejemplo, leucemia o para mantener el crecimiento y la proliferación de células madre progenitoras eritroides. El agonista y el antagonista del polipéptido de esta invención también se prevén en el tratamiento de enfermedades asociadas con células madre.
Los polinucleótidos de S30-21616/DEGA de la presente invención se pueden administrar solos o en combinación con otras citoquinas en una composición farmacéuticamente aceptable para el tratamiento de, pero sin limitación, varias anemias o para el uso en conjunto con la irradiación o quimioterapia para estimular la producción de precursores o células eritroides; para mantener el crecimiento y la proliferación de células mieloides tales como monocitos, macrófagos y megacariocitos; y para mantener el crecimiento y la proliferación de células madre hematopoyéticas. En otra realización de la invención, las moléculas inhibidoras se pueden usar para alterar las células madre hematopoyéticas que interactúan con células estromáticas de sostén.
Por consiguiente, la presente invención se puede usar in vivo e in vitro para procedimientos investigativos, diagnósticos, profilácticos o de tratamiento, que son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos siguientes ilustran adicionalmente la invención, pero no deben interpretarse como limitación del alcance de la invención de ningún modo. Otras realizaciones y usos de la invención serán obvias para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la memoria descriptiva y la práctica de la invención desvelada en la presente memoria. Las descripciones detalladas de los procedimientos convencionales, tal como los empleados en la construcción de vectores y plásmidos, la inserción de los genes que codifican polipéptidos en tales vectores y plásmidos, la introducción de plásmidos en las células huésped y la expresión y determinación de sus productos de genes y polinucleótidos, se pueden obtener en numerosas publicaciones, que incluyen Sambrook, J. et al., (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Cultivos celulares
Las líneas celulares usadas se obtuvieron de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y los medios usados para su propagación se adquirieron en Gibco, Grand Island, NY. Las líneas celulares y sus respectivos medios de crecimiento (se muestran entre paréntesis) fueron los siguientes: AGS, una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano, (F-12); 293, una línea celular epitelial de riñón humano transformada con el adenovirus 5 ADN, (medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)) ; KKVR (DMEM de Iscove); RF-1, una línea celular de adenocarcinoma gástrico humano, (L-15 de Leibovitz); NCI-SNU-1, NCI-SNU-16, NCI-N87, una línea celular de carcinoma gástrico hepático humano y KatoIII, un carcinoma gástrico humano, (RPMI). Todos los medios se suplementaron con 2 mM de L-Glutamina (Gibco, Grand Island, NY) y 10% de suero fetal bovino (FBS; Hyclone, Logan, UT).
KatoIII y KKVR, sin embargo, se cultivaron en 20% de FBS y los medios de cultivo NCIN87 y KKVR se suplementaron adicionalmente con 1,5 g/L de bicarbonato de sodio.
Ejemplo 1
El presente ejemplo demuestra la identificación de nuevos genes de cáncer expresados en forma diferencial. En breves palabras, se utilizó una genoteca de ADNc sustractiva de células madre hematopoyéticas murinas. Phillips et al. (2000) Science 288: 1635-1640. Aproximadamente 7.500 EST de esta genoteca se colocaron en micromatrices de ADN y se hibridaron con ADNc preparado de una variedad de líneas celulares de cáncer murino y el tejido normal correspondiente.
Uno de los EST murinos, S30-21616/DEGA, se identificó como que se expresó en forma diferencial 7,6 veces en la línea celular renal murina, RAG versus tejido renal normal, Este EST se secuenció y sus 522 bp se usaron para la búsqueda blast en las bases de datos de secuencias no redundante NCBI. Hasta este momento, S30-21616/DEGA no mostró homología con ninguna secuencia murina conocida. Sin embargo, mostró aproximadamente 85% de semejanza con el clon 12BAC del cromosoma humano y con una porción del clon de ADNc parcial del cáncer de endometrio humano (IMAGE: 3625286). La secuencia de ADN IMAGE:3625286 se usó para generar el ORF de 5’RACE, y los productos de PCR de 3’UTR para dar un ADNc final (hS30-21616/DEGA) de 3769 pb (Figura 1). La transcripción del ADNc produjo transcriptos de varios tamaños de 2,2 y 3,5 KB, lo que implica un empalme alternativo.
Ejemplo 2
El presente ejemplo demuestra la expresión de hS30-21616/DEGA en células normales y cancerosas. En breves palabras, se realizaron análisis de transferencia Northern usando Northern (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA) para múltiples tejidos para evaluar la expresión de hS30-21616/DEGA en células normales y cancerosas. Los tejidos normales analizados incluyen cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón, leucocitos de sangre periférica, glándula adrenal, vejiga, médula ósea, ganglios linfáticos, próstata, columna vertebral, estómago, tiroides, tráquea, útero y lengua. En la mayor parte de estos tejidos, la expresión de hS30-21616/DEGA fue muy baja.
Con respecto a la expresión de la línea celular de cáncer, evaluamos la expresión de hS30-21616/DEGA por análisis de transferencia Northern en células HL-60 (Leucemia Promielocítica), Hela (Carcinoma Cervical), K562 (Leucemia Mieloide Crónica), Molt-(Leucemia Linfoblástica Aguda), Raji y Daudi (Linfoma de Burkitt), SW480 (Adenocarcinoma Colorrectal), G3 (Melanoma), A549 (Carcinoma de Pulmón), AGS (Adenocarcinoma Gástrico Humano), NCISNU-1, NCI-SNU 16 y NCI-N87 (Carcinoma Gástrico Hepático Humano).
El S30-21616/DEGA humano se expresó como transcriptos de múltiple tamaño de 2-3,5
KB en A549 (datos no mostrados) así como en células de AGS y NCI-SNU-16 (ver, Figura 3). También se observan transcriptos de este tamaño en ADNc de GenBank® expresado en testículos, estómago, pulmón y útero. Debido a su perfil de expresión diferencial en adenocarcinoma gástrico, el ADNc de S30-21616 de aquí en adelante se denomina S3021616/DEGA.
Ejemplo 3
El presente ejemplo demuestra el análisis de Micromatriz del Perfil del Cáncer (CPA) de la expresión de S30-21616/DEGA en muestras de pacientes usando transferencia de punto de ADNc. En breves palabras, una variedad de tejidos tumorales y normales (CPA) I y II (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) se investigaron con una sonda del fragmento de ADNc que abarca el ORF de los nucleótidos 1540-2045 (numeración basada en la Figura 1) según las recomendaciones del fabricante. La sonda se marcó usando un [α-32P]-dCTP (PerkinElmer Life Sciences, Inc, Boston, MA) y se aisló usando el kit Prime-It® II (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). CPA I y II son matrices de nylon que contienen ADNc normalizado de 241 y 160 tejidos tumorales y normales correspondientes obtenidos de pacientes cancerosos individuales, respectivamente. Los tejidos representados por CPA I incluyen: mamas, útero, colon, estómago, ovario, pulmón, riñón, recto, tiroides, cuello uterino, intestino delgado, páncreas y próstata. Además de estos tejidos, CPA II aparece en tejido de vejiga, testículos y piel. Estas matrices también contienen controles positivos y negativos así como ADNc aislado de nueve líneas celulares de cáncer: HeLa, Daudi, K-562, HL-60, G-361, A549, Molt-4, SW480 y Raji.
Los resultados de este perfil de matriz de las Figuras 2A (CPA 1) y 2B (CPA II) nuevamente mostraron que DEGA se expresó en algunas muestras de pulmón, colon y recto normales pero la expresión fue generalmente menor que en los tejidos reproductores femeninos. Casi todos los pacientes mostraron fuerte expresión de DEGA en tejidos de mamas normales. En contraste, la expresión de DEGA en las muestras tumorales se expresó en forma diferencial en 56% de los cánceres de tiroides (9/16; 5/6 en CPA I, y 4/10 en CPA II) y 45% de los de estómago (17/38; 14/28 en CPA I y 3/10 en CPA II). De las líneas celulares de cáncer examinadas en CPA I (Figura 2A) y CPA II (Figura 2B), A549 expresó altos niveles de ADNc de DEGA y K562 esto es aproximadamente 10 veces menos ADNc de DEGA que las células A549. Hubo expresión mínima en las células Molt-4, G361 y HeLa.
La Tabla 1 además proporciona una síntesis de la expresión diferencial regulada de DEGA de varios tejidos usando las matrices. Los niveles de expresión se normalizaron contra el ADNc de 241 tejidos tumorales y normales correspondientes de pacientes individuales.
TABLA 1
- Tipo de cáncer
- Número de muestras Regulado por aumento Regulado por disminución Sin diferencia
- Estómago
- 28 45% 34% 21%
- Tiroides
- 6 83% 0% 17%
- Mamas
- 50 6% 70% 24%
- Ovario
- 14 0% 43% 57%
- Pulmón
- 21 19% 57% 24%
- Útero
- 42 19% 26% 55%
- Colon
- 34 26% 26% 48%
- Cuello uterino
- 1 0% 0% 100%
- Riñón
- 20 10% 10% 80%
- Recto
- 18 11% 11% 78%
- Próstata
- 4 0% 50% 50%
- Páncreas
- 1 0% 0% 100%
- Intestino delgado
- 2 0% 0% 100%
En veintiocho cánceres de estómago y seis de tiroides perfilados, hS30-21616/DEGA estaba regulado por aumento en 45% y 83% de los tumores respectivamente versus las muestras normales. Sin embargo, en cincuenta cánceres de mamas, catorce de ovarios, y
5 veintiún de pulmón tipificados, hS30-21616/DEGA estaba regulado por disminución en 70%, 43% y 57% de los tumores respectivamente versus las muestras normales. Los resultados mostraron que hS30-21616/DEGA se expresa en forma diferencial en diferentes tipos de tumores y puede cumplir un papel en la modulación del crecimiento tumoral.
Ejemplo 4
10 El presente ejemplo demuestra el análisis de Northern Blot de la expresión de DEGA en células de adenocarcinoma gástrico. La observación de que 45% de las muestras de pacientes con cáncer de estómago mostraron expresión diferencial de DEGA en sus tumores pero expresión insignificante en el tejido de estómago normal adyacente sugiere que el DEGA puede cumplir un papel crítico en el desarrollo o progresión de al menos una subfracción del
15 adenocarcinoma gástrico. El análisis de transferencia Northern se llevó a cabo para determinar si DEGA se expresó en las líneas celulares de adenocarcinoma, AGS, NCI-SNU-1, NCI-SNU16, NCI-N87, KATOIII, KKVR y RF-1. La autorradiografía de la Figura 3 muestra esa expresión en células AGS (calle A) y NCI-SNU-16 (calle F), con AGS que tienen una expresión ocho veces superior respecto de
Ejemplo 5
El presente ejemplo demuestra el análisis de Matriz del Perfil del Cáncer (CPA) de la expresión de S30-21616/DEGA en otras líneas celulares de cáncer no adenocarcinoma gástrico. Usando transferencias de punto de ADNc, también se usaron la sonda de S3021616/DEGA y las condiciones usadas para CPA I y II para hibridar la Matriz de Perfil de Línea de Cáncer BD Bioscience, que contiene ADNc de líneas celulares que representan cáncer de pulmón (A549, NCI-H-460, NCI-H1299), colon (HCT-116, HCT-15, HT-29), mamas (MDAMB4355, MDA-MB231, MCF7), ovario (SK-OV-3), cuello uterino (HeLa), próstata (DU-145, PC3), piel (SK-MEL-28, SK-MEL-5, SK-NSH, IMR-32, U-87MG), cerebro (IMR-32, U-87MG), riñón (786-O, ACHN), hígado (Hep-G2), colon (Colo589), osteosarcoma (U2-OS) y epidermis (A431).
Los resultados mostraron que la expresión más alta se observó en las células pulmonares NCI-H1299 y A549 (Figura 4, panel izquierdo), células de riñón ACHN y células de osteosarcoma U2-OS (Figura 4, panel derecho). Se observó menor expresión pero significativa en la línea renal, 786-O (Figura 4, panel derecho), células mamarias MDA-MB-231 y línea celular de cáncer de ovario, SKOV-3 (Figura 4, panel izquierdo).
Ejemplo 6
El presente ejemplo demuestra la clonación del ADNc de S30-21616/DEGA. En breves palabras, se amplificó ADNc de S30-21616/DEGA humano como un producto RT-PCR derivado de Marathon-Ready™ A549, preparaciones de ADNc de línea celular de carcinoma de pulmón y bazo (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA). Los cebadores de PCR usados para amplificar el polinucleótido de interés son el cebador de PCR delantero No. 1 con la secuencia 5’ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG 3’ (SEQ ID NO14) y el cebador de PCR inverso No. 2,5’ TTA AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT G 3’ (SEQ ID NO: 15) (Bio-Synthesis Incorporated, Lewisville, TX; los codones de comienzo y detención están subrayados). Se realizó la reacción de PCR usando protocolos de RT-PCR estándares bien conocidos en la técnica, con la excepción de la polimerasa usada, que es Titanium Taq polimerasa (BD Biosciences/Clonetech, Palo Alto, CA), se utilizó específicamente la condición de RT-PCR descripta en el manual de ADNc de Marathon-Ready™: 94°C, 30 segundos; 68°C, 2 minutos.
El producto de PCR del ORF de S30-21616/DEGA (1569 pb) se clonó en pCR2.1 (InVitrogen Corporation, TOPO TA® Cloning Kit, Carlsbad, CA) y se verificó la secuencia (Molecular Genetics Instrumentation Facility, University of Georgia, Athens, GA; GENEWIZ Inc, North Brunswick, NJ). Para obtener la secuencia de ADN corriente arriba del codón de comienzo de S30-21616/DEGA; se realizó 5’RACE usando ADNc A549 Marathon-Ready como se explicó antes con pocas modificaciones. Asp1, un cebador delantero (incluido con ADNc Marathon-Ready™) y un cebador inverso específico del gen de S30-21616/DEGA (5’AAC TCA GGT CCA GTC TCT TAA TCA G 3’; SEQ ID NO : 16) generaron un producto de PCR después de 35 rondas de amplificación (94°C, 30 seg; 57°C, 30 seg; 68°C, 2 min) que se subclonó en pCR2.1 y se verificó la secuencia. La secuencia que representa la 3’UTR de S30-21616/DEGA se obtuvo inicialmente por computación del clon BAC del cromosoma 12 humano, GS1-99H8 (GenBank® N° de acceso AC004010). Posteriormente se diseño una serie de cebadores de PCR para determinar la secuencia de 3’UTR más larga presente en la preparación de ADNc de A549. El siguiente conjunto de cebadores se usó para identificar el segmento de 3’UTR más largo: cebador delantero 5’ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG 3’ (SEQ ID NO: 17); codón de comienzo subrayado y cebador inverso 5’CAA AAT GAA AAG ACA GGC AAA CAA ATG 3’ (SEQ ID NO: 18), que se inicia en los X nucleótidos 3’del ORF de S30-2161 6/DEGA.
La Figura 5A muestra esquemáticamente los rasgos estructurales del producto génico de S30-21616/DEGA. La proteína posee una secuencia señal y un dominio de transmembrana lo que sugiere que se puede localizar en la superficie celular. Su porción extracelular putativa contiene un dominio de Ig y 5 repeticiones ricas en leucina (LRR) flanqueadas por residuos de cisteína presentes en los dominios de LRR-N-terminal (LRR-NT) y LRR-C-terminal (LRR-CT). En consecuencia, S30-21616/DEGA parece pertenecer a la superfamilia LRR. La porción citosólica putativa de S30-21616/DEGA contiene 102 aminoácidos y carece de la presencia de algunos dominios de proteína conocidos. Aproximadamente 1/5 o 20 de los residuos citosólicos son una serina o una treonina, lo que sugiere que S30-21616/DEGA puede actuar como una molécula de señalización en la célula. Tomado en conjunto, el análisis de la secuencia de proteínas sugiere que el producto génico de S30-21616/DEGA puede actuar como una molécula de adhesión celular de señalización. La correspondiente secuencia de aminoácidos de la proteína se ilustra en la Figura 5B.
Ejemplo 7
El presente ejemplo demuestra la expresión estable de un constructo de fusión de S3021616/DEGA-EGFP en células 293 y localización subcelular de la proteína. En breves palabras, una proteína de fusión se manipuló genéticamente por la cual una proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) se fusionó a su extremo C terminal. El ORF de S3021616/DEGA se amplificó por PCR y se clonó en sitios XhoI/AgeI de pEGFP-N1 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Se realizó la reacción de PCR como se describió en la sección de clonación del ADNc de S30-21616/DEGA con la excepción de que se usó el cebador delantero (5’ATC CTC GAG GCG ACC ATA ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT 3’; SEQ ID NO: 19), que contenía la secuencia nativa Kozak y un sitio Xho I (subrayado) 5’ al codón de comienzo mostrado en negrita. El cebador inverso usado (5’GAT CAC CGG TGC AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT GTC 31; SEQ ID NO: 20) contenía un sitio Age I (subrayado) 3’ del codón de detención que se muestra en negrita.
El constructo S30-21616/DEGA-EGFP se transfectó en forma estable en células 293 usando el reactivo de transfección FuGENE6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) descripto por el fabricante. Se usó una relación de FuGENE6 : ADN de 2: 1. Las células transfectadas se dejaron 2 días a 37 °C, después de tal tiempo se sembraron en dilución limitante y se sometieron a selección con 800 µg/ml de geneticina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Los clones individuales se aislaron por tripsinización usando anillos de clonación y se dejaron expandir.
Para determinar la localización subcelular de la proteína de fusión de S30-21616/DEGAEGFP, se evaluaron los clones usando un microscopio fluorescente Zeiss Axioskop (200x de aumento). La micrografía fluorescente que se muestra en la Figura 7 confirmó la localización en la superficie celular de la proteína S30-21616/DEGA.
Ejemplo 8
El presente ejemplo demuestra la expresión estable de los constructos antisentido S3021616/DEGA en las células AGS. El perfil de expresión de S30-21616/DEGA sugiere que puede cumplir un papel funcional en el desarrollo o la progresión de un subconjunto de adenocarcinoma gástrico humano. Para tratar el papel funcional de S30-21616/DEGA, la línea celular AGS humana que ha mostrado que expresa niveles significativos de ARNm de S3021616/DEGA se transfectó para expresar en forma estable el constructo de S30-21616/DEGA antisentido o un vector vacío. Las líneas celulares establecidas se usaron en estudios de comparación de clones en ensayos de ciclo celular, proliferación y tumorigenicidad.
Para generar clones antisentido S30-21616/DEGA, se clonaron un fragmento de nucleótidos que abarca el ORF entero de 30-21616/DEGA así como un que comprendía los 608 nucleótidos más cercanos a 5’ de su ORF (generados de un digesto parcial de EcoRI de pCR2.1-S30-21616/DEGA) en pIRES PURO2 (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA) en orientación inversa y se transfectaron en forma estable en células AGS. En forma concurrente, pIRES PURO2 también se transfectó en forma estable en estas células para actuar como un control del vector vacío. La transfección y el aislamiento del clon se realizaron exactamente como se describió para la fusión de S30-21616/DEGA-EGFP con la excepción de que las células se seleccionaron con 400 µg/ml de puromicina (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO).
Ejemplo 9
El presente ejemplo demuestra la expresión comparativa de los clones AGS/DEGA antisentido y del vector vacío por análisis de transferencia Northern. Para determinar el efecto de la expresión de S30-21616/DEGA en la línea celular de adenocarcinoma gástrico, se llevaron a cabo procedimientos de transferencia Northern de AGS transfectado en forma estable con S30-21616/DEGA antisentido y el vector vacío. Se aisló ARN total usando el sistema Micro-to-Midi Total RNA (InVitrogen Corporation, Carlsbad, CA) exactamente como recomienda el fabricante y 5 µg se resolvieron en 1,2% de gel de formaldehído desnaturalizante y se transfirieron a membranas de Nytran® SuPerCharge (Schleicher & Schuell, Inc., Keene, NH). Las transferencias se hibridaron con sonda C-terminal de S3021616/DEGA marcada aleatoriamente con 32P usada como sonda de las transferencias de ADNc CPA I y II. Se realizaron hibridaciones durante una hora a 68°C usando solución de ExpressHyb™ (BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA). Posteriormente se realizaron tres lavados a temperatura ambiente de 10 minutos (2 X SSC, 0,05% de SDS) y dos lavados de 20 minutos a 50°C (0,1 X SSC, 0,1% de SDS). Las membranas se lavaron en 2 X SSC y se expusieron toda una noche a -70°C a una película Kodak BioMax MR. (Eastman Kodak Company, Rochester, NY).
El análisis de transferencia Northern de los clones antisentido AGS/DEGA mostró la regulación por disminución significativa y estable de la expresión de S30-21616/DE. La Figura 8 muestra una reducción del nivel de expresión de ARNm para el clon antisentido AGS/DEGA #6 (calle 3) y el clon #11 (calle 4) en comparación con las células progenitoras AGS no transfectadas o de tipo salvaje (WT) (calle 1) y el clon del vector vacío AGS #15 (calle 2). El panel inferior muestra la expresión de ARNm de β-actina en las células analizadas como controles.
Ejemplo 10
El presente ejemplo demuestra los perfiles de contenido de ADN/ ciclo celular de los clones antisentido AGS/DEGA y los clones del vector vacío por análisis de citometría de flujo. Para medir el contenido de ADN y en consecuencia del perfil del ciclo celular, se utilizó la citometría de flujo.
El vector vacío de AGS y los clones antisentido S30-21616/DEGA se cultivaron asincrónicamente en medio de cultivo que contiene suero, se tripsinizaron, se lavaron una vez en PBS y se tiñeron durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad con solución de yoduro de propidio provista en el kit ADN QC Particles (Catálogo # 349523; Becton Dickinson). Las células se analizaron posteriormente en un citómetro de flujo Becton Dickinson FACSVantage™ M usando los parámetros descriptos en el kit ADN QC particle. Se evaluó el tamaño celular por microscopía óptica.
El análisis de citometría de flujo de las células teñidas con yoduro de propidio mostró que las células AGS/vector vacío demostraron un perfil del contenido de ADN/fase de ciclo celular típico para células proliferantes, con una mayoría de células en G0/G1, seguido en cantidad por células en fase G2/M y S (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma superior). En contraste los clones antisentido S30-21616/DEGA #6 (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma medio) y #11 (ver, Figura 9, panel izquierdo, histograma inferior) exhibieron una alteración drástica del perfil del ciclo celular. Casi todas las células exhibieron un desplazamiento hacia la fase G2/M del ciclo celular. El clon #11 mostró un desplazamiento ligeramente superior hacia la fase G2/M que el clon #6. El desplazamiento a G2/M también se correlacionó con el incremento en el tamaño celular observado para el clon antisentido AGS/DEGA #6 y #11 (ver, Figura 9, panel derecho dos inferior) en contraste con el tamaño celular observado en las células del AGS/vector vacío (ver, Figura 9, panel derecho superior).
Ejemplo 11
El presente ejemplo demuestra los estudios de tumorigenicidad in-vivo de las células que expresan DEGA. Dadas las diferencias del perfil del ciclo celular observadas entre AGS/vector vacío y los clones antisentido AGS/DEGA, también se espera una diferencia de la proliferación celular in vivo. Debido a que las células AGS son tumorigénicas en ratones desnudos, se estudió el efecto de S30-216161DEGA antisentido en la supresión de la expresión de S30-21616/DEGA y en consecuencia la influencia negativa sobre el potencial tumorigénico de las células AGS de la siguiente manera. Los clones de AGS se suspendieron en medio de cultivo, se colocaron en hielo y se mezclaron por completo con MATRIGEL™ (Collaborative Research Biochemicals, Bedford, MA) en una relación de 1: 1 (v/v). MATRIGEL™ deriva del sarcoma de ratón Engelbroth-Holm-Swarm, que se halló que es una fuente rica en proteínas de ECM: laminina, colágeno IV, nidogeno/enactina y proteoglicano (12). Cuando se mezcla con las líneas celulares, MATRIGEL™ aumenta la tumorigénesis (27). En cada ratón atímico (nu/nu)(Charles River Laboratories, Wilmington, MA), se inyectaron diez millones de células por vía subcutánea y se midieron los volúmenes del tumor (mm3) en forma semanal usando calibres durante 11 semanas.
La Figura 10 ilustra los resultados del estudio de crecimiento del tumor en ratones. Después de 75 días, 12/12 ratones inyectados con células AGS y 19/19 ratones inyectados con AGS/vector vacío clon #15 desarrollaron un tumor con un volumen medio de aproximadamente 800 mm3. En marcado contraste, solo 6/12 ratones inyectados con clon antisentido AGS/DEGA #6 y 6/19 ratones inyectados con clon antisentido AGS/DEGA #11 desarrollaron tumores con un volumen de tumor medio de aproximadamente 20 mm3. SEQ IDNO: 1 Secuencia de ADNc hS30-21616/DEGA: El marco de lectura abierto se muestra en mayúsculas. Letras en negrita = codones de
comienzo y detención. Para más información de la secuencia, ver la Figura 1 del manuscrito.
SEQ IDNO: 2
Secuencia de aminoácidos de hS30-21616/DEGA:
SEQ IDNO: 3
Secuencia de polinucleótidos de S30-21616 de ratón, mS30-21616/DEGA.
SEQ IDNO: 4
Secuencia de aminoácidos del polipéptido de S30-21616 de ratón, mS30-21616/DEGA.
SEQ IDNO: 5 Secuencia de aminoácidos del polipéptido de S30-21616/DEGA humano que carece del dominio de transmembrana (TM), -TM hS30-21616/DEGA.
LYLSGNFLTQFPMDLYVGRFKL
SEQ ID NO: 7 Repetición Rica en Leucina 1
10 VCPTACICATDIVSCTNKNLSKVPGNLFRLIKR
SEQ ID NO: 8 Repetición Rica en Leucina 2
SFAKLNTLILRHNNI
SEQ ID NO: 9 Repetición Rica en Leucina 3
TSISTGSFSTTPNLKCLDLSSNKLKTVKNAVFQELKVLEVLLLYN
15 SEQ ID NO: 10 Repetición Rica en Leucina 4
LKVLEVLLLYNNHISYLDPSAFGG
SEQ ID NO: 11 Repetición Rica en Leucina 5
LSQLQKLYLSGNFLTQFPMDLYVG
SEQ ID NO: 12 Repetición Rica en Leucina 6
20 LAELMFLDVSYNRIPSMPMHHINLV
5’-ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG -3’
5 SEQ ID NO: 15 Cebador de PCR 2
5’-TTA AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT-3’
SEQ ID NO:16 Cebador inverso específico del gen S30-21616/DEGA
5’-AAC TCA GGT CCA GTC TCT TAA TCA G-3’
SEQ ID NO:17 Cebador delantero
10 5’-ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT CTG-3’
SEQ ID NO:18 Cebador inverso
5’-CAA AAT GAA AAG ACA GGC AAA CAA ATG-3’
SEQ ID NO:19 Cebador delantero para el constructo de fusión S30-21616/DEGA-EGFP
5’ATC CTC GAG GCG ACC ATA ATG TCG TTA CGT GTA CAC ACT 3’
15 SEQ ID NO:20 Cebador inverso para el constructo de fusión S30-21616/DEGA-EGFP
5’ GAT CAC CGG TGC AGT GGA CGC CAC AAA AGG TGT GTC 3’
Claims (14)
- Reivindicaciones
- 1.
- Un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, en el que el oligonucleótido consiste en 20-30 o 12-25 nucleótidos de la región codificadora de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3 o el complemento de esta.
-
- 2.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1, en el que el oligonucleótido está en forma de ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
-
- 3.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora o una cadena no codificadora.
-
- 4.
- Un oligonucleótido antisentido aislado de cualquier reivindicación precedente, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
-
- 5.
- Un procedimiento in vitro de inhibición de la expresión del polipéptido de la SEQ ID NO:2 o SEQ ID NO:4 que comprende introducir el oligonucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en una célula, en el que el oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el oligonucleótido se administra en una célula por un procedimiento seleccionado del grupo constituido por: endocitosis mediada por receptor; microinyección; por medio de complejos ADN-proteína; y encapsulación liposómica catiónica.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 5, en el que un ligando del receptor o anticuerpos específicos de la célula asisten en la conducción del oligonucleótido a la célula.
-
- 8.
- Uso de un oligonucleótido antisentido aislado, en el que dicho oligonucleótido inhibe la expresión del polinucleótido de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, para la fabricación de un medicamento para tratar adenocarcinoma gástrico.
-
- 9.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el oligonucleótido está en forma de un ADN bicatenario, ADN monocatenario, ARN o una combinación de estos.
-
- 10.
- Uso de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que el ADN monocatenario es una cadena codificadora, una cadena no codificadora o una combinación de estas.
-
- 11.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el oligonucleótido comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3, un complemento de esta, un fragmento de esta o un ORF de esta.
-
- 12.
- Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en el que el oligonucleótido comprende 20-30 o 12-25 nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:3.
- 13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que las uniones fosfodiéster del oligonucleótido están modificadas.
- 14. Un oligonucleótido antisentido aislado como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, para tratar el adenocarcinoma gástrico.
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-
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