ES2344179T3 - Genes expresados diferencialmente en cancer pancreatico y displasia. - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido subgenómico aislado que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 14.

Description

Genes expresados diferencialmente en cáncer pancreático y displasia.

Área técnica de la invención

La invención se refiere al área del diagnóstico y tratamiento del cáncer y la displasia pancreática. Más específicamente, se refiere a polinucleótidos que se regulan de manera diferencial en el cáncer y la displasia pancreática.

Antecedentes de la invención

El cáncer pancreático es la quinta causa principal de muerte por cáncer en los Estados Unidos. Según la Sociedad Americana del Cáncer, aproximadamente 28.000 personas morirán de cáncer pancreático en los Estados Unidos en 1998. En ciertas familias se puede transmitir un riesgo elevado de desarrollo de cáncer pancreático, sin el incremento correspondiente de riesgo de desarrollo de otros cánceres. El cáncer pancreático está provocado muy probablemente por una acumulación de mutaciones en genes específicos que provocan el cáncer. El cáncer pancreático es muy agresivo, y los agentes quimioterápicos que pueden ser activos contra otras neoplasias malignas no actúan de manera eficaz cuando se usan para el cáncer pancreático.

La mayoría de las células del páncreas están en las glándulas exocrinas, que producen las enzimas pancreáticas, y en los conductos que transportan las enzimas pancreáticas a las vías biliares y al intestino delgado. Los cánceres de las células exocrinas del páncreas son normalmente adenocarcinomas. Los adenocarcinomas pancreáticos comienzan normalmente en los conductos del páncreas, pero a veces se pueden desarrollar a partir de las células acinares. Alrededor del 95% de los cánceres de páncreas son adenocarcinomas. Los cánceres menos comunes del páncreas exocrino incluyen los carcinomas adenoescamosos, carcinomas de células escamosas, y carcinomas de células gigantes.

El documento WO 86/02081 se refiere a proteínas reguladoras de manera diferencial en el cáncer, y a su uso para el diagnóstico del cáncer.

Debido a que el cáncer pancreático es un cáncer agresivo con una mortalidad muy elevada, existe la necesidad en la técnica de genes que se estimulen o se inhiban en la progresión de los tumores. Tales genes son útiles para fines terapéuticos y para el diagnóstico del cáncer pancreático, así como de otros cánceres.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a polinucleótidos subgenómicos aislados que comprenden al menos 25 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 14.

La presente invención se refiere además a polinucleótidos subgenómicos aislados que comprenden al menos 25 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2 y 5.

En un aspecto adicional, la presente invención se refiere a polipéptidos aislados, en los que dichos polipéptidos comprenden al menos 12 aminoácidos contiguos de un polipéptido natural codificado por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 13-15.

Según otro aspecto adicional, la invención se refiere a polipéptidos aislados, en los que dichos polipéptidos comprenden al menos 12 aminoácidos contiguos de un polipéptido natural codificado por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15.

La presente invención proporciona además preparaciones de anticuerpos que se unen de manera específica a estos polipéptidos.

Según una realización adicional, se proporciona una sonda nucleotídica aislada que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 13-15.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático, que comprenden las etapas de: determinar la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 en una muestra de tejido de un ser humano que se sospecha que es cancerosa, y en un tejido humano que es normal; y comparar las cantidades determinadas; en los que un tejido humano del probando que contiene más polipéptido que el tejido normal se identifica como canceroso.

Otros métodos in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático según la presente invención comprenden las etapas de: determinar la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 y la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 en una muestra de tejido humano que se sospecha que contiene cáncer, y en un tejido humano que es normal; y comparar las cantidades determinadas; en los que una muestra de tejido humano que contiene más polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 en comparación con el tejido normal y que contiene sustancialmente la misma cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14, en comparación con el tejido normal, se identifica como cancerosa.

Otros métodos in vitro adicionales de diagnóstico del cáncer pancreático según la invención comprenden las etapas de: determinar la cantidad de moléculas de mARN en una muestra de tejido de un ser humano que se sospecha que es cancerosa, y en un tejido humano que es normal, en los que dichas moléculas de mARN son complementarias a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 o su complemento; y comparar las cantidades determinadas de las moléculas de mARN; en los que una muestra de tejido humano que contiene más moléculas de mARN que el tejido normal se identifica como cancerosa.

De manera alternativa, la invención proporciona métodos in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático que comprenden las etapas de: determinar la cantidad de un primer grupo de moléculas de mARN en una muestra de tejido humano que se sospecha que es cancerosa, y en un tejido humano que es normal, en los que dichas moléculas de mARN son complementarias a la cadena no codificante de una secuencia polinucleotídica bicatenaria, en los que dicha secuencia polinucleotídica bicatenaria se selecciona del grupo de polinucleótidos mostrados en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14; y determinar la cantidad de un segundo grupo de moléculas de mARN en una muestra de tejido humano que se sospecha que es cancerosa y en un tejido humano que es normal, en los que dichas moléculas de mARN son complementarias a la cadena no codificante de una secuencia bicatenaria, en los que dicha secuencia polinucleotídica bicatenaria se selecciona del grupo de polinucleótidos mostrados en SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15; y comparar las cantidades determinadas; en los que un tejido humano del probando que contiene más del segundo grupo de moléculas de mARN que el tejido normal, y que contiene sustancialmente la misma cantidad del primer grupo de moléculas de mARN; en comparación con el tejido normal, se identifica como canceroso.

En otro aspecto, la invención proporciona composiciones terapéuticas útiles para disminuir la cantidad de traducción de una molécula de mARN en una célula, que comprenden un polinucleótido inverso complementario a la cadena codificante de un polinucleótido bicatenario, en las que dicho polinucleótido bicatenario se selecciona del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15, en las que dicho polinucleótido inverso se une a una molécula de mARN; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Las composiciones terapéuticas útiles para reducir la expresión de un polipéptido según la invención pueden comprender además un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido natural expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Finalmente, la invención proporciona composiciones terapéuticas útiles para reducir la traducción de una molécula de mARN, cuyas composiciones comprenden una ribozima que se une a una molécula de mARN, en las que una porción de dicha ribozima es complementaria a la cadena codificante de un polinucleótido bicatenario; en las que dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Se describen los polinucleótidos que están regulados erróneamente en el cáncer y la displasia. Las secuencias polinucleotídicas reguladas erróneamente se muestran en SEQ ID Nºs: 1-15. Los polinucleótidos están regulados erróneamente como sigue:

SEQ ID Nº: 12 está inhibida en el cáncer;

SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15 están estimuladas en el cáncer y la displasia; y

SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 están estimuladas solamente en la displasia.

Los polinucleótidos que están regulados de manera diferencial en el cáncer o la displasia, o en ambos, pueden ser útiles en el diagnóstico y el tratamiento de estas enfermedades. La displasia es una proliferación atípica de las células epiteliales o mesenquimatosas que puede representar una etapa temprana del cáncer; no obstante, la displasia no progresa necesariamente hasta el cáncer. La displasia epitelial da como resultado la pérdida de la orientación normal de una célula epitelial respecto de otra, acompañada por alteraciones del tamaño y la forma celular y nuclear. El cáncer es una proliferación de células malignas que ya no están bajo un control fisiológico normal.

Los polinucleótidos subgenómicos de la invención contienen menos de un cromosoma completo, y preferiblemente están exentos de intrones. Los polinucleótidos subgenómicos de la invención se pueden aislar y purificar sin otras secuencias nucleotídicas mediante técnicas habituales de purificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante el uso de PCR, clonación, y/o enzimas de restricción y sondas para aislar los fragmentos que comprenden las secuencias codificantes. Los polinucleótidos subgenómicos de la invención pueden incluir toda o una porción contigua de una región codificante de un gen. En una realización, un polinucleótido subgenómico aislado y purificado de la invención comprende al menos 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 74, 80, 90, 100, 125, 150, 154, 175, 200, 250, 300 ó 350 nucleótidos contiguos seleccionados de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 14. En una realización preferida, las moléculas polinucleotídicas comprenden una secuencia contigua de al menos doce nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los polinucleótidos mostrados en SEQ ID Nºs: 1-11 y 14.

Un marco de lectura abierto es una región del ADN que consiste exclusivamente en tripletes que representan aminoácidos. El marco de lectura abierto de las secuencias polinucleotídicas de la invención se puede determinar examinando los tres marcos de lectura posibles en ambas direcciones. Si un marco de lectura contiene codones de terminación no se puede traducir a una proteína, y no se considera un marco de lectura abierto. Normalmente, no más de uno de los seis marcos posibles está abierto en cualquier tramo simple del ADN. Es poco probable que exista un marco de lectura abierto extenso por casualidad debido a la carencia de presión selectiva para evitar la acumulación de codones sin sentido. Por lo tanto, la identificación de un marco de lectura abierto largo se considera una prueba suficiente de que la secuencia se traduce a una proteína en ese marco. Lewin, ed,. 1990, Genes IV, Cell Press, Cambridge, Mass.

Los polinucleótidos subgenómicos de la invención se pueden usar, entre otros, para producir proteínas o polipéptidos, como sondas para la detección del mARN de la invención en muestras o extractos de células humanas, para generar copias adicionales de los polinucleótidos, y para generar ribozimas u oligonucleótidos inversos. Los polinucleótidos subgenómicos se pueden usar también como sondas de ADN monocatenarias o como oligonucleótidos que forman cadenas triples. Las sondas se pueden usar para determinar la presencia o ausencia de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-15 o las variantes de las mismas en una muestra.

La secuencia de un ácido nucleico que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de al menos cualquiera de SEQ ID Nº: 1-15, preferiblemente la secuencia completa de al menos cualquiera de SEQ ID Nº: 1-15, no está limitada, y puede ser cualquier secuencia de A, T, G, y/o C (para el ADN) y A, U, G, y/o C (para el ARN) o bases modificadas de las mismas, que incluyen inosina y pseudouridina. La elección de la secuencia dependerá de la función deseada, y estará dictada por las regiones codificantes deseadas, las regiones similares a intrones deseadas, y las regiones reguladoras deseadas.

Cuando la secuencia completa de cualquiera de SEQ ID Nº: 1-15 está dentro del ácido nucleico, el ácido nucleico obtenido se denomina en la presente memoria un polinucleótido que comprende la secuencia de cualquiera de SEQ ID Nº: 1-15.

Son de interés tanto los polipéptidos secretados como los asociados a membranas de la presente invención. Por ejemplo, se pueden analizar de manera conveniente los niveles de polipéptidos secretados en los fluidos corporales, tales como sangre y orina. Los polipéptidos asociados a membranas son útiles para construir antígenos de vacunas o para inducir una respuesta inmunitaria. Tales antígenos comprenderían toda o parte de la región extracelular de los polipéptidos asociados a membranas.

Debido a que tanto los polipéptidos secretados como los asociados a membranas comprenden un fragmento de aminoácidos hidrófobos contiguos, se pueden usar algoritmos que predicen la hidrofobicidad para identificar tales polipéptidos.

Normalmente, los genes de los polipéptidos tanto secretados como asociados a membranas codifican una secuencia de señalización para dirigir al polipéptido hacia la superficie de la célula. La secuencia de señalización comprende normalmente un tramo de residuos hidrófobos. Tales secuencias de señalización se pueden plegar en estructuras helicoidales.

Los polipéptidos asociados a membranas comprenden en general al menos una región transmembrana que posee un tramo de aminoácidos hidrófobos que puede atravesar la membrana. Algunas regiones transmembrana exhiben además una estructura helicoidal.

Los fragmentos hidrófobos en un polipéptido se pueden identificar mediante el uso de algoritmos informáticos. Tales algoritmos incluyen Hopps & Woods, Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:3824-3828 (1981); Kyte & Doolittle, J. Mol. Biol. 157:105-132 (1982); y el algoritmo RAOAR, Degli Esposti et al., Eur. J. Biochem. 190:207-219 (1990).

Otro método de identificación de los polipéptidos secretados y asociados a membranas es traducir los presentes polinucleótidos, SEQ ID Nº: 1-15, en los seis marcos y determinar si hay presentes al menos 8 aminoácidos hidrófobos contiguos. Los polipéptidos traducidos con al menos 8; más en general, 10; aún más en general, 12 aminoácidos hidrófobos contiguos se consideran un supuesto polipéptido secretado o asociado a membranas. Los aminoácidos hidrófobos incluyen alanina, glicocola, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, treonina, triptófano, tirosina y valina.

Los polipéptidos de la invención se definen en el sumario de la invención, anteriormente. Estos polipéptidos pueden estar codificados también por ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en su secuencia a los polinucleótidos descritos. Así, la invención incluye en su alcance ácidos nucleicos que comprenden polinucleótidos que codifican una proteína o polipéptido expresado por un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de SEQ ID Nº: 1-15. También están dentro del alcance de la invención las variantes; las variantes de los polipéptidos incluyen los mutantes, fragmentos, y fusiones. Los mutantes pueden incluir sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones de aminoácidos conservativas o sustituciones para eliminar aminoácidos no esenciales, para alterar un sitio de glicosilación, un sitio de fosforilación o un sitio de acetilación, o para minimizar el plegamiento erróneo mediante la sustitución o la deleción de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas que conservan la carga general, la hidrofobia/hidrofilia, y/o el volumen estérico del aminoácido sustituido. Por ejemplo, las sustituciones entre los siguientes grupos son conservativas: Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Ser/Cys, Thr, y Phe/Trp/Tyr.

Las muteínas sin cisteínas son variantes dentro del alcance de la invención. Estas variantes se pueden construir según los métodos descritos en la patente de EE.UU. nº 4.959.314, "Cysteine-Depleted Muteins of Biologically Active Proteins". La patente describe cómo sustituir otros aminoácidos por cisteínas, y cómo determinar la actividad biológica y el efecto de la sustitución. Tales métodos son adecuados para las proteínas según esta invención, que tienen residuos de cisteína adecuados para tales sustituciones, por ejemplo para eliminar la formación de enlaces disulfuro.

Las variantes proteicas descritas en la presente memoria están codificadas por polinucleótidos que están dentro del alcance de la invención. Se puede usar el código genético para seleccionar los codones apropiados para construir las variantes correspondientes.

La invención abarca las secuencias polinucleotídicas que tienen al menos un 65% de identidad de secuencias respecto de cualquiera de SEQ ID Nºs: 1-15, tal como se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman, tal como está implementado en el programa MSPRCH (Oxford Molecular) mediante el uso de una búsqueda de huecos afines con los siguientes parámetros de búsqueda: penalización por apertura de hueco de 12, y penalización por extensión de hueco de 1.

Las sondas polinucleotídicas que comprenden al menos 12 nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia nucleotídica de un polinucleótido de SEQ ID Nº: 1-15 se usan para una diversidad de fines, que incluyen la identificación de cromosomas humanos y la determinación de los niveles de transcripción.

Las sondas nucleotídicas se marcan, por ejemplo, con un marcador radiactivo, fluorescente, biotinilado o quimioluminiscente, y se detectan mediante métodos muy conocidos apropiados para el marcador particular seleccionado. También se conocen bien en la técnica los protocolos para la hibridación de las sondas nucleotídicas en preparaciones de cromosomas en metafase. Una sonda nucleotídica hibridará de manera específica con las secuencias nucleotídicas en preparaciones cromosómicas que sean complementarias a la secuencia nucleotídica de la sonda. Una sonda que hibrida de manera específica con un polinucleótido debería proporcionar una señal de detección de al menos 5, 10 ó 20 veces más que la hibridación de fondo proporcionada con otras secuencias no relacionadas.

Los polinucleótidos de la presente invención se usan para identificar un cromosoma en el que reside el gen correspondiente. Mediante el uso de la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) en extensiones de metafases normales, la hibridación genómica comparativa permite el estudio en el genoma completo de cambios en el número relativo de copias de las secuencias de ADN. Véase Schwartz y Samad, Current Opinions in Biotechnology (1994) 8:70-74; Kallioniemi et al., Seminars in Cancer Biology (1993) 4:41-46; Valdes y Tagle, Methods in Molecular Biology (1997) 68:1, Boultwood, ed., Human Press, Totowa, NJ.

Las preparaciones de cromosomas humanos en metafase se preparan mediante el uso de técnicas citogenéticas habituales a partir de tejidos primarios humanos o líneas celulares. Se usan sondas nucleotídicas que comprenden al menos 12 nucleótidos contiguos seleccionados de la secuencia nucleotídica de SEQ ID Nºs: 1-15 para identificar el cromosoma correspondiente. Las sondas nucleotídicas se marcan, por ejemplo, con un marcador radiactivo, fluorescente, biotinilado o quimioluminiscente, y se detectan mediante métodos conocidos apropiados para el marcador particular seleccionado. También se conocen en la técnica los protocolos para la hibridación de las sondas nucleotídicas con preparaciones de cromosomas en metafase. Una sonda nucleotídica hibridará de manera específica con secuencias nucleotídicas en las preparaciones cromosómicas que sean complementarias a la secuencia nucleotídica de la sonda. Una sonda que hibrida de manera específica con un gen relacionado con el polinucleótido proporciona una señal de detección al menos 5, 10 ó 20 veces mayor que la hibridación de fondo proporcionada con secuencias codificantes no relacionadas con el polinucleótido.

Los polinucleótidos se cartografían en cromosomas particulares mediante el uso, por ejemplo, de híbridos radiactivos o de paneles de híbridos específicos de los cromosomas. Véase Leach et al., Advances in Genetics, (1995) 33:63-99; Walter et al., Nature Genetics (1994) 7:22-28; Walter y Goodfellow, Trends in Genetics (1992) 9:352. Tal cartografía puede ser útil en la identificación de la función del gen relacionado con el polinucleótido por su proximidad a otros genes de función conocida. La función se puede asignar también al gen relacionado cuando los síndromes o enfermedades particulares se cartografían en el mismo cromosoma.

Un polinucleótido será útil en aplicaciones de análisis forense, análisis genético, cartografía y diagnóstico si la región correspondiente de un gen es polimórfica en la población humana. Se puede usar una forma polimórfica particular del polinucleótido para identificar que una muestra procede de un sospechoso, o para descartar la posibilidad de que la muestra proceda del sospechoso. Se usa cualquier medio para detectar un polimorfismo en un gen, lo que incluye, pero sin limitación, la electroforesis de variantes polimórficas de la proteína, la sensibilidad diferencial a la escisión mediante enzimas de restricción, y la hibridación a una sonda específica de un alelo.

Cualquiera de las variantes naturales de las secuencias nucleotídicas que codifican variantes de las mismas están dentro del alcance de esta invención. Se pueden dar variantes alélicas de polinucleótidos subgenómicos de la invención, y se pueden identificar mediante hibridación de las variantes alélicas supuestas con las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria en condiciones rigurosas. Por ejemplo, usando las siguientes condiciones de lavado -SCC 2 x, 0,1% de SDS, temperatura ambiente dos veces, 30 minutos cada vez; después SCC 2 x, 0,1% de SDS, 50ºC una vez, 30 minutos; después SCC 2 x, temperatura ambiente dos veces, 10 minutos cada vez- se pueden identificar las variantes alélicas de los polinucleótidos de la invención que contienen como máximo alrededor de un 25-30% de emparejamientos incorrectos de bases. Más preferiblemente, las variantes alélicas contienen un 15-25% de emparejamientos incorrectos de bases, aún más preferiblemente un 5-15%, o un 2-5%, o un 1-2% de emparejamientos incorrectos de bases.

Se puede usar la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para obtener los polinucleótidos de la invención, mediante el uso de cADN o ADN genómico como molde. Los polinucleótidos de la invención se pueden obtener también mediante el uso de la transcriptasa inversa y de moléculas de mARN que son complementarias a la cadena complementaria de una secuencia bicatenaria, en la que dicha secuencia bicatenaria se selecciona del grupo de polinucleótidos que comprende una secuencia mostrada en SEQ ID Nºs: 1-15. Mediante el uso de las secuencias polinucleotídicas descritas en la presente memoria, las moléculas polinucleotídicas subgenómicas de la invención se pueden producir también usando las técnicas de química sintética.

Se pueden generar sondas específicas para los polinucleótidos de la invención mediante el uso de las secuencias polinucleotídicas descritas en SEQ ID Nºs: 1-15. Las sondas tienen preferiblemente una longitud de al menos 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 25 nucleótidos, y pueden tener una longitud menor de 2, 1, 0,5, 0,1, o 0,05 kb. Las sondas se pueden sintetizar químicamente, o se pueden generar a partir de polinucleótidos más largos mediante el uso de enzimas de restricción. Las sondas se pueden marcar, por ejemplo, con un marcador radiactivo, biotinilado o fluorescente.

Los polinucleótidos subgenómicos de la invención se pueden propagar en vectores y líneas celulares mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica. Los sistemas de expresión en bacterias incluyen los descritos en Chang et al., Nature (1978) 275:615; Goeddel et al., Nature (1979) 281: 544; Goeddel et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8: 4057; el documento EP 36.776; el documento U.S. 4.551.433; deBoer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1983) 80: 21-25; y Siebenlist et al., Cell (1980) 20: 269.

Los sistemas de expresión en levaduras incluyen los descritos en Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 75: 1929; Ito et al., J Bacteriol. (1983) 153: 163; Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. (1986) 6: 142; Kunze et al., J. Basic Microbiol. (1985) 25: 141; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. (1986) 132: 3459; Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. (1986) 202:302; Das et al., J. Bacteriol. (1984) 158: 1165; De Louvencourt et al., J. Bacteriol. (1983) 154: 737; Van den Berg et al., Bio/Technology (1990) 8: 135; Kunze et al., J Basic Microbiol. (1985) 25:141; Cregg et al., Mol. Cell. Biol. (1985) 5: 3376; el documento U.S. 4.837.148; el documento US 4.929.555; Beach y Nurse, Nature (1981) 300: 706; Davidow et al., Curr. Genet. (1985) 10: 380; Gaillardin et al., Curr. Genet. (1985) 10: 49; Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. (1983) 112: 284-289; Tilburn et al., Gene (1983) 26: 205-221; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81: 1470-1474; Kelly y Hynes, EMBO J. (1985) 4: 475-479; el documento EP 244.234; y el documento WO 91/00357.

La expresión de los polinucleótidos subgenómicos de la invención en insectos se puede llevar a cabo como se describe en el documento U.S. 4.745.051, Friesen et al. (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES (W. Doerfler, ed.); el documento EP 127.839; el documento EP 155.476; Vlak et al., J. Gen. Virol. (1988) 69: 765-776; Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. (1988) 42: 177; Carbonell et al., Gene (1988) 73: 409; Maeda et al., Nature (1985) 315: 592-594; Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell. Biol. (1988) 8: 3129; Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: 8404; Miyajima et al., Gene (1987) 58: 273; y Martin et al., DNA (1988) 7:99. Se describen numerosas cepas y variantes baculovirales y las células hospedadoras de insecto permisivas correspondientes en Luckow et al., Bio/Technology (1988) 6: 47-55; Miller et al., en GENETIC ENGINEERING (Setlow, J.K. et al. eds.), Vol. 8 (Plenum Publishing, 1986), págs. 277-279; y Maeda et al., Nature, (1985) 315: 592-594.

La expresión mamífera de los polinucleótidos subgenómicos de la invención se puede llevar a cabo como se describe en Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 76; Gorman et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA (1982) 79: 6777; Boshart et al., Cell (1985) 41: 521; y el documento U.S. 4.399.216. Se pueden facilitar otras características de la expresión mamífera como se describe en Ham y Wallace, Meth. Enz. (1979) 58: 44; Barnes y Sato, Anal. Biochem. (1980) 102: 255; el documento U.S. 4.767.704; el documento US 4.657.866; el documento US 4.927.762; el documento US 4.560.655; el documento WO 90/103430; el documento WO 87/00195; y el documento U.S. RE 30.985.

Los polinucleótidos subgenómicos de la invención pueden ser moléculas lineales o circulares. Pueden estar en moléculas con replicación autónoma (vectores) o en moléculas sin secuencias de replicación. Pueden estar regulados por sus propias secuencias reguladoras o por otras secuencias reguladoras, tal como se conoce en la técnica. Los polinucleótidos subgenómicos de la invención se pueden introducir en células hospedadoras adecuadas mediante el uso de una diversidad de métodos que están disponibles en la técnica, tales como transferencia de ADN mediada por transferrina-policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, transferencia de ADN mediada por liposomas, transporte intracelular de esferas de látex revestidas con ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, biolística, y transfección mediada por fosfato cálcico.

La invención proporciona un método de detección de la expresión de un polinucleótido, por ejemplo, en una muestra biológica, que puede ser útil, entre otros, para el diagnóstico del cáncer o la displasia. La base de este método es el descubrimiento de que la(s) secuencia(s) polinucleotídica(s) mostradas en:

SEQ ID Nº: 12 está inhibida en el cáncer;

SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15 están estimuladas en el cáncer y la displasia; y

SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 están estimuladas solamente en la displasia.

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En los pacientes a los que se les ha diagnosticado displasia o cáncer pancreático, se puede usar la detección de los niveles de los productos de expresión de las secuencias polinucleotídicas de la invención, mARN o proteína, para diagnosticar o pronosticar un trastorno, para monitorizar el tratamiento del trastorno, o para cribar en busca de agentes que afectan al trastorno.

Los productos de expresión de las secuencias polinucleotídicas de la invención, mARN o proteínas, se pueden detectar en una muestra corporal para el diagnóstico o el pronóstico. La muestra corporal puede ser, por ejemplo, una muestra de tejido sólido o de un fluido. El paciente del cual se obtiene la muestra corporal puede estar sano, o ya se puede haber identificado que tiene una afección en la cual está implicada la expresión alterada de una proteína de la invención.

En una realización, se analiza el nivel de una proteína expresada a partir de una secuencia polinucleotídica de la invención en la muestra corporal. La proteína se podría detectar, por ejemplo, mediante anticuerpos hacia las proteínas. Los anticuerpos se pueden marcar, por ejemplo, con un marcador radiactivo, fluorescente, biotinilado o enzimático, y se pueden detectar directamente, o se pueden detectar mediante el uso de métodos inmunoquímicos indirectos, con el uso de un anticuerpo secundario marcado. La presencia de la proteína se puede analizar, por ejemplo, en cortes de tejidos mediante inmunocitoquímica, o en lisados mediante el uso de transferencia de Western, tal como se conoce en la técnica.

El nivel de la proteína en una muestra de tejido que se sospecha que es cancerosa o displásica se compara con el nivel de la proteína en un tejido normal. Un nivel mayor de los polipéptidos expresados a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células displásicas en el tejido sospechoso. Un nivel mayor de los polipéptidos expresados a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células displásicas o de células cancerosas o ambas en el tejido sospechoso. Un nivel menor del polipéptido expresado a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nº: 12 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células cancerosas en el tejido sospechoso.

Además, se puede realizar una diferenciación entre el cáncer o la displasia en el diagnóstico de un paciente. La expresión de una secuencia polinucleotídica de la invención que está estimulada solamente en las células displásicas (es decir, SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14) y la expresión de un polinucleótido que está estimulado tanto en las células displásicas como en las células cancerosas (es decir, SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15) se puede usar para cribar los tejidos de un paciente. Si el examen de los tejidos de un paciente revela que no existe una estimulación de una secuencia polinucleotídica que está estimulada solamente en las células displásicas (es decir, SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14), y que existe una estimulación de una secuencia polinucleotídica que está estimulada tanto en las células cancerosas como en las células displásicas (es decir, SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15), entonces se diagnostica cáncer al
paciente.

De manera alternativa, se puede comparar la presencia de mARN expresado a partir de las secuencias polinucleotídicas de la invención en dos tejidos. El mARN se puede detectar, por ejemplo, mediante hibridación in situ en cortes de tejidos, mediante transcriptasa inversa-PCR, o en transferencias de Northern que contienen mARN poli A+. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las diferencias en el tamaño o la cantidad de los transcritos de mARN entre dos tejidos, mediante el uso de transferencias de Northern y sondas nucleotídicas. Por ejemplo, el nivel de mARN de la invención en una muestra de tejido que se sospecha que es cancerosa o displásica se compara con la expresión del mARN en un tejido normal. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para la determinación de las cantidades de mARNs específicos.

Un nivel mayor de mARN expresado a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células displásicas en el tejido sospechoso. Un nivel mayor de mARN expresado a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células displásicas o células cancerosas o ambas en el tejido sospechoso. Un nivel menor del mARN expresado a partir de la secuencia polinucleotídica mostrada en SEQ ID Nº: 12 en el tejido sospechoso, en comparación con el tejido normal, indica la presencia de células cancerosas en el tejido sospechoso. Se puede usar cualquier combinación de estas secuencias para determinar un diagnóstico.

De manera opcional, se puede cuantificar el nivel de un producto de expresión particular de una secuencia polinucleotídica de la invención en una muestra corporal. La cuantificación se puede llevar a cabo, por ejemplo, comparando el nivel del producto de expresión detectado en la muestra corporal con las cantidades de producto presentes en una curva patrón. Se puede realizar una comparación de manera visual o mediante el uso de una técnica tal como la densitometría, con o sin asistencia computerizada. Se pueden usar métodos alternativos, por ejemplo ELISA, transferencia de Western, inmunoprecipitación, radioinmunoensayo, etc. Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para la detección y la cuantificación de una proteína particular.

Se pueden suministrar los reactivos específicos para los polinucleótidos y polipéptidos de la invención, tales como anticuerpos y sondas nucleotídicas, en un equipo para la detección de la presencia de un producto de expresión en una muestra biológica. El equipo puede contener además tampones o componentes de marcaje, así como instrucciones para el uso de los reactivos para detectar y cuantificar los productos de expresión en la muestra biológica.

La expresión polinucleotídica en una célula se puede incrementar o disminuir según se desee. La expresión polinucleotídica se puede alterar con fines terapéuticos, tal como se describe más adelante, o se puede usar para identificar y estudiar el papel de los agentes terapéuticos en el cáncer y otras enfermedades.

La disminución de la expresión de los genes que contienen las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 es útil, por ejemplo, como agente terapéutico para alterar las características anormales de las células displásicas. La disminución de la expresión de las secuencias polinucleotídicas seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias mostradas en SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15 es útil, por ejemplo, como agente terapéutico para disminuir la velocidad de crecimiento de las células displásicas y cancerosas.

La expresión de las secuencias polinucleotídicas de la invención se puede alterar mediante el uso de una secuencia oligonucleotídica inversa. Las composiciones terapéuticas para la disminución de la expresión génica comprenden una construcción de expresión que contiene polinucleótidos que codifican toda o una parte de una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID Nºs: 1-11, y 13-15. Dentro de la construcción de expresión, el segmento polinucleotídico se orienta en la dirección inversa, y se localiza en dirección 3' de un promotor. La transcripción del segmento polinucleotídico se inicia en el promotor.

Preferiblemente, la secuencia oligonucleotídica inversa tiene una longitud de al menos diez nucleótidos, pero también se pueden usar secuencias más largas de al menos 11, 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 74, 80, 90, 100, 125, 150, 162, 175, 200, 250, 300, o 350 nucleótidos contiguos. Las moléculas oligonucleotídicas inversas se pueden proporcionar en una construcción de ADN y se pueden introducir en células cuya división se debe disminuir, tal como se describió anteriormente. Una descripción más completa de los vectores de transferencia génica, en especial de vectores retrovirales, está contenida en el documento de EE.UU. de nº de serie 08/869.309, que se incorpora en la presente memoria como referencia.

Los oligonucleótidos inversos pueden estar compuestos de desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o mediante un sintetizador automatizado, uniendo de manera covalente el extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces internucleotídicos fosfodiéster o no fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres de fosfato, carbamatos, acetamidatos, ésteres de carboximetilo, carbonatos, y triésteres de fosfato. Véase Brown, 1994, Meth. Mol. Biol. 20:1-8; Sonveaux, 1994, Meth. Mol. Biol. 26:1-72; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-583.

Aunque la complementariedad exacta no es necesaria para la formación eficaz de moléculas bicatenarias entre una molécula inversa y la secuencia codificante complementaria de un gen, se prefieren las moléculas inversas con no más de un emparejamiento incorrecto. Un experto en la técnica puede usar fácilmente el punto de fusión calculado de un par inverso-directo para determinar el grado de emparejamientos incorrectos que serán tolerados entre un oligonucleótido inverso particular y una secuencia codificante particular del gen seleccionado.

Los oligonucleótidos inversos de la invención se pueden modificar sin afectar a su capacidad de hibridar a una secuencia polinucleotídica codificante de la presente invención. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula inversa. Por ejemplo, se pueden modificar los enlaces fosfato internucleósido añadiendo restos de colesterilo o diamina con diversos números de residuos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. También se pueden emplear en un oligonucleótido inverso modificado bases modificadas o carbohidratos o ambos, tales como arabinosa en vez de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3', 5' en el que el grupo hidroxilo de 3' o el grupo fosfato de 5' están sustituidos. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar mediante métodos conocidos en la técnica. Agrawal et al., 1992, Trends Biotechnol. 10:152-158; Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev. 90:543-584; Uhlmann et al., 1987, Tetrahedron. Lett. 215:3539-3542.

La expresión de los polinucleótidos de la invención se puede disminuir también administrando anticuerpos policlonales, monoclonales, o de cadena simple que se unen de manera específica a los polipéptidos expresados a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 13-15. Los anticuerpos específicos hacia estas proteínas se unen a la proteína y evitan que la proteína funcione en la célula. El bloqueo de la expresión o función de la proteína es útil para prevenir, reducir los efectos de, o curar, el cáncer y la displasia.

En una realización de la invención, la expresión de los polinucleótidos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11, y 13-15 se disminuye mediante el uso de una ribozima, una molécula de ARN con actividad catalítica. Véase, p.ej., Cech, 1987, Science 236: 1532-1539; Cech, 1990, Ann. Rev. Biochem. 59:543-568; Cech, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 605-609; Couture y Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-515. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la función génica mediante la escisión de una secuencia de ARN, tal como se conoce en la técnica (p.ej., Haseloff et al., documento U.S. 5.641.673).

La secuencia codificante de un polinucleótido de la invención se puede usar para generar una ribozima que se unirá de manera específica al ARN transcrito a partir de dicho polinucleótido. Los métodos para diseñar y construir ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN en trans de una manera sumamente específica en cuanto a la secuencia se han desarrollado y descrito en la técnica (véase Haseloff, J. et al. (1988), Nature 334:585-591). Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas se puede dirigir hacia ARNs específicos modificando una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La reacción de hibridación contiene una secuencia complementaria al ARN objetivo, y así se hibrida de manera específica con el objetivo (véase, por ejemplo, Gerlach, W. L. et al., documento EP 321.201). Se pueden usar secuencias complementarias más largas para incrementar la afinidad de la secuencia de hibridación hacia el objetivo. Las regiones de hibridación y escisión de la ribozima de la invención pueden estar relacionadas de manera integral; así, tras la hibridación al ARN objetivo por medio de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir el objetivo.

Las ribozimas de la invención se pueden introducir en las células como parte de una construcción de ADN, tal como se conoce en la técnica. La construcción de ADN puede incluir además elementos reguladores transcripcionales, tales como un elemento promotor, un potenciador o un elemento UAS, y una señal terminadora transcripcional, para controlar la transcripción de la ribozima en las células.

Se pueden usar métodos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación, biolística, o precipitación con fosfato cálcico, para introducir la construcción de ADN que contiene la ribozima en las células cuya división se desea disminuir, tal como se describió anteriormente. De manera alternativa, si se desea que la construcción de ADN se mantenga de manera estable en las células, se puede suministrar la construcción de ADN en un plásmido y mantenerla en forma de un elemento separado o integrado en el genoma de las células, tal como se conoce en la técnica.

Tal como se enseñó en Haseloff et al., documento U.S. 5.641.673, las ribozimas de la invención se pueden modificar de manera que su expresión se dará en respuesta a factores que inducen la expresión de los polinucleótidos de la invención. La ribozima se puede modificar también para proporcionar un nivel adicional de regulación, de manera que la destrucción del ARN se da solamente cuando tanto la ribozima como el gen correspondiente se inducen en las células.

Preferiblemente, el mecanismo usado para disminuir la expresión de los polinucleótidos de la invención, ya sea una secuencia nucleotídica inversa, anticuerpo, o ribozima, disminuye la expresión del polinucleótido un 50%, 60%, 70%, o 80%. Lo más preferiblemente, la expresión del polinucleótido se disminuye un 90%, 95%, 99%, o 100%. La eficacia del mecanismo elegido para alterar la expresión del polinucleótido se puede determinar mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, tales como la hibridación de sondas nucleotídicas al mARN del polinucleótido, RT-PCR cuantitativa, o la detección de una proteína mediante el uso de los anticuerpos específicos de la invención.

La expresión incrementada de un polinucleótido es útil para disminuir la velocidad de crecimiento de las células cancerosas en las que el polinucleótido particular está inhibido en las células cancerosas, tal como la secuencia polinucleotídica mostrada en SEQ ID Nº: 12. Las composiciones terapéuticas para incrementar la expresión del polinucleótido comprenden una construcción de expresión que contiene toda o parte de la secuencia polinucleotídica mostrada en SEQ ID Nº: 12. En una construcción de expresión, el segmento polinucleotídico está orientado en la dirección codificante, y está localizado en dirección 3' respecto del promotor. La transcripción del segmento polinucleotídico se inicia en el promotor. La construcción de expresión se puede introducir en las células junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable para disminuir la velocidad de crecimiento de las células cancerosas o para mejorar otras características anormales. La expresión de la secuencia polinucleotídica se puede monitorizar detectando la producción de mARN que hibrida con el polinucleótido administrado o detectando la proteína codificada por el polinucleótido administrado.

Las proteínas que se expresan a partir de las secuencias polinucleotídicas de la invención se pueden producir de manera recombinante en células hospedadoras procarióticas o eucarióticas, tales como células de bacterias, levaduras, insectos, o mamíferos, mediante el uso de vectores de expresión conocidos en la técnica. Se pueden usar enzimas para generar polipéptidos menores que los polipéptidos de longitud completa mediante la proteolisis enzimática de proteínas de longitud completa de la invención. De manera alternativa, se pueden usar métodos de química sintética, tales como la síntesis peptídica en fase sólida, para sintetizar las proteínas y los polipéptidos.

Las especies homólogas de los polinucleótidos subgenómicos humanos o de los polipéptidos codificados se pueden identificar produciendo sondas o cebadores adecuados y cribando bibliotecas de expresión de cADN de otras especies, tales como ratones, monos, levaduras, o bacterias. No obstante, se prefieren los homólogos de mamíferos.

Las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nº: 1-15 se pueden aislar y purificar a partir de células humanas que expresan las proteínas. Las proteínas se pueden obtener sustancialmente exentas de otras proteínas humanas mediante métodos habituales de purificación de proteínas, tales como cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de intercambio iónico, fraccionamiento con sulfato amónico, cromatografía de afinidad, o electroforesis preparativa en gel.

Las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención se pueden usar también en una proteína de fusión, por ejemplo, como un inmunógeno. La proteína de fusión comprende dos segmentos de proteína. El primer segmento de proteína consiste en al menos seis, ocho, diez, doce, quince, veinte o treinta aminoácidos contiguos de una secuencia polipeptídica expresada a partir de una secuencia polinucleotídica mostrada en SEQ ID Nºs: 1-15. El primer segmento de proteína está fusionado a un segundo segmento de proteína por medio de un enlace peptídico. El segundo segmento de proteína puede ser una proteína de longitud completa o un fragmento de una proteína. Las técnicas para producir proteínas de fusión, de manera recombinante o uniendo de manera covalente dos segmentos de proteínas, se conocen bien en la técnica.

La segunda proteína o fragmento de proteína de una proteína de fusión puede proceder de otro tipo de proteína o de una proteína similar. La segunda proteína o fragmento de proteína se puede marcar con un marcador detectable, tal como un marcador radiactivo o fluorescente, o puede ser una enzima que generará un producto detectable. Las enzimas adecuadas para este fin, tales como la \beta-galactosidasa, se conocen bien en la técnica. Se puede usar una proteína de fusión, por ejemplo, para dirigir las proteínas o los polipéptidos de la invención a una localización particular en una célula o tejido, en diversos ensayos, tales como la técnica de doble híbrido en levaduras, o como un
inmunógeno.

Las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención se pueden usar para generar anticuerpos. Los anticuerpos se pueden usar, entre otros, para detectar y cuantificar la expresión de la proteína relacionada. Las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención que comprenden al menos seis, ocho, diez, doce, quince, veinte o treinta aminoácidos consecutivos se pueden usar como inmunógenos. Las proteínas o los polipéptidos se pueden usar para obtener una preparación de anticuerpos que se unen de manera específica a una proteína o polipéptido de la invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. Los métodos para generar anticuerpos policlonales y monoclonales se conocen bien en la técnica.

También se pueden construir anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos de cadena simple que se unen de manera específica a una proteína o polipéptido expresado a partir de los polinucleótidos de la invención se pueden aislar, por ejemplo, a partir de bibliotecas de expresión de inmunoglobulinas de cadena simple, tal como se conoce en la técnica. La biblioteca se "criba" con una proteína o polipéptido, y se pueden aislar varios anticuerpos de cadena simple que se unen a diferentes epítopos del polipéptido con una afinidad elevada. Hayashi et al., 1995, Gene 160:129-30. Tales bibliotecas se conocen, y están disponibles para los expertos en la técnica. Los anticuerpos se pueden construir también mediante el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), con el uso de cADN de hibridoma como molde. Thirion et al., 1996, Eur. J Cancer Prev. 5:507-11.

El anticuerpo de cadena simple puede ser mono- o bi-específico, y puede ser bivalente o tetravalente. La construcción de anticuerpos de cadena simple biespecíficos tetravalentes se enseña en Coloma y Morrison, 1997, Nat. Biotechnol. 15:159-63. La construcción de anticuerpos de cadena simple biespecíficos bivalentes se enseña en Mallender y Voss, 1994, J. Biol. Chem. 269:199-206.

Se puede construir una secuencia nucleotídica que codifica el anticuerpo de cadena simple mediante el uso de la síntesis nucleotídica manual o automatizada, clonarla en vectores de expresión de ADN mediante el uso de metodologías habituales de ADN recombinante, e introducirla en las células que expresan el gen seleccionado, tal como se describe más adelante. De manera alternativa, los anticuerpos se pueden producir directamente mediante el uso de la técnica de fagos filamentosos. Verhaar et al., 1995, Int. J Cancer 61:497-501; Nicholls et al., 1993, J. Immunol. Meth. 165:81-91.

Los anticuerpos se unen de manera específica a los epítopos de las proteínas o los péptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención. En una realización preferida, los epítopos no están presentes en otras proteínas humanas. En general, el número mínimo de aminoácidos contiguos para codificar un epítopo es 6, 8, o 10. Sin embargo, se pueden usar más, por ejemplo, al menos 15, 25, o 50, en especial para formar epítopos que implican residuos que no son contiguos o conformaciones particulares.

Los anticuerpos que se unen de manera específica a las proteínas o los polipéptidos incluyen aquellos que se unen a las proteínas o los polipéptidos de longitud completa. Los anticuerpos que se unen de manera específica no detectan otras proteínas en transferencias de Western de células humanas, o proporcionan una señal que es al menos 10 veces menor que la señal proporcionada por la proteína objetivo de la invención. Se pueden obtener anticuerpos que tienen tal especificidad mediante cribado rutinario. En una realización preferida de la invención, los anticuerpos inmunoprecipitan las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención de los extractos celulares o de las disoluciones. Además, los anticuerpos pueden reaccionar con las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención en cortes de tejidos o en transferencias de Western de geles de poliacrilamida. Preferiblemente, los anticuerpos no exhiben una reactividad cruzada inespecífica hacia otras proteínas humanas en transferencias de Western o en ensayos inmunocitoquímicos.

Los métodos para purificar los anticuerpos hacia las proteínas o los polipéptidos expresados a partir de los polinucleótidos de la invención están disponibles en la técnica. En una realización preferida, los anticuerpos se hacen pasar a través de una columna a la que está unida una proteína o polipéptido particular expresado a partir de los polinucleótidos de la invención. Los anticuerpos unidos se eluyen después, por ejemplo, con un tampón que tiene una concentración salina elevada.

Las composiciones terapéuticas de la invención también comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los expertos en la técnica conocen muy bien los vehículos farmacéuticamente aceptables. Tales vehículos incluyen, pero sin limitación, macromoléculas grandes, metabolizadas lentamente, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos, y partículas virales inactivas. También se pueden usar sales farmacéuticamente aceptables en la composición, por ejemplo, sales minerales tales como hidrocloruros, hidrobromuros, fosfatos, o sulfatos, así como las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, o benzoatos.

Las composiciones terapéuticas también pueden contener líquidos, tales como agua, solución salina, glicerol, y etanol, así como sustancias tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. También se pueden usar liposomas, tales como los descritos en los documentos U.S. 5.422.120, WO 95/13796, WO 91/14445, o EP 524.968 B1, como vehículos para la composición terapéutica.

En general, una composición terapéutica se prepara como una preparación inyectable, en forma de una disolución líquida o suspensión; sin embargo, también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para disolución, o para suspensión, en vehículos líquidos antes de la inyección. También se puede formular una composición en un comprimido con revestimiento entérico o una cápsula de gel según métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en los documentos U.S. 4.853.230, EP 225.189, AU 9.224.296, y AU 9.230.801.

La administración de los agentes terapéuticos de la invención puede incluir la administración local o sistémica, lo que incluye la inyección, administración oral, biolística, o administración mediante catéter, y la administración tópica. Se pueden usar diversos métodos para administrar una composición terapéutica directamente en un sitio específico del organismo.

Para el tratamiento de tumores, por ejemplo, se puede localizar un tumor pequeño o una lesión metastásica y se puede inyectar una composición terapéutica varias veces en varios lugares diferentes en el cuerpo del tumor. De manera alternativa, se pueden identificar las arterias que sirven al tumor, y se puede inyectar una composición terapéutica en tales arterias, para administrar la composición directamente al tumor.

Se puede aspirar un tumor que tiene un centro necrótico e inyectar directamente la composición en el centro ya vacío del tumor. Se puede administrar una composición terapéutica directamente a la superficie de un tumor, por ejemplo, mediante la administración tópica de la composición. Se puede usar la formación de imágenes mediante rayos X para ayudar en algunos de los métodos anteriores. La combinación de agentes terapéuticos, que incluyen una proteína o polipéptido o un polinucleótido subgenómico y otros agentes terapéuticos, se puede administrar de manera simultánea o secuencial.

Se puede usar la administración dirigida mediada por receptores para administrar composiciones terapéuticas que contienen polinucleótidos subgenómicos, proteínas, o reactivos tales como anticuerpos, ribozimas, u oligonucleótidos inversos de la invención en tejidos específicos. Las técnicas de administración mediada por receptores se describen, por ejemplo, en Findeis et al. (1993), Trends in Biotechnol. 11, 202-05; Chiou et al. (1994), GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANSFER (J.A. Wolff, ed.); Wu & Wu (1988), J. Biol. Chem. 263, 621-24; Wu et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 542-46; Zenke et al. (1990), Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 87, 3655-59; Wu et al. (1991), J Biol. Chem. 266, 338-42.

De manera alternativa, se pueden introducir las composiciones terapéuticas en las células humanas ex vivo, y las células se vuelven a colocar después en el ser humano. Las células se pueden extraer de una diversidad de lugares que incluyen, por ejemplo, un tumor seleccionado o un órgano afectado. Además, se puede insertar una composición terapéutica, por ejemplo, en fibroblastos dérmicos o leucocitos de sangre periférica que no están afectados. Si se desea, también se pueden extraer específicamente de la sangre fracciones particulares de células tales como un subgrupo de células T o células pluripotenciales (véase, por ejemplo, el documento PCT WO 91/16116). Las células extraídas se pueden poner en contacto después con una composición terapéutica mediante la utilización de cualquiera de las técnicas anteriormente descritas, seguido por la devolución de las células al ser humano, preferiblemente al tumor o cerca del tumor o en otro sitio a tratar. Los métodos descritos anteriormente pueden comprender además las etapas de eliminar los fibroblastos u otras células que no son tumorales tras extraer las células tumorales de un ser humano, y/o la etapa de inactivar las células, por ejemplo, mediante irradiación.

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Tanto la dosis de una composición como el medio de administración se pueden determinar basándose en las cualidades específicas de la composición terapéutica, la afección, la edad y el peso del paciente, la progresión de la enfermedad, y otros factores relevantes. Preferiblemente, una composición terapéutica de la invención incrementa o disminuye la expresión de un polinucleótido en un 50%, 60%, 70%, o 80%. Lo más preferiblemente, se incrementa o se disminuye la expresión del polinucleótido en un 90%, 95%, 99%, o 100%. La eficacia del mecanismo elegido para alterar la expresión del polinucleótido se puede estudiar mediante el uso de métodos bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de sondas nucleotídicas al mARN del polinucleótido, RT-PCR cuantitativa, o detección de una proteína o polipéptido mediante el uso de anticuerpos específicos.

Si la composición contiene proteína, polipéptido, o anticuerpo, las dosis eficaces de la composición están en el intervalo de alrededor de 5 \mug a alrededor de 50 \mug/kg de peso corporal del paciente, alrededor de 50 \mug a alrededor de 5 mg/kg, alrededor de 100 \mug a alrededor de 500 \mug/kg de peso corporal del paciente, y alrededor de 200 a alrededor de 250 \mug/kg.

Las composiciones terapéuticas que contienen polinucleótidos subgenómicos se pueden administrar en un intervalo de alrededor de 100 ng a alrededor de 200 mg de ADN para la administración local en un protocolo de terapia génica. También se pueden usar intervalos de concentración de alrededor de 500 ng a alrededor de 50 mg, alrededor de 1 \mug a alrededor de 2 mg, alrededor de 5 \mug a alrededor de 500 \mug, y alrededor de 20 \mug a alrededor de 100 \mug de ADN durante un protocolo de terapia génica. Los factores tales como el método de acción y la eficacia de la transformación y de la expresión son consideraciones que afectarán a la dosis necesaria para la eficacia final de los polinucleótidos subgenómicos. Cuando se desea una expresión mayor en un área mayor de tejido, pueden ser necesarias cantidades mayores de polinucleótidos subgenómicos o las mismas cantidades re-administradas en un protocolo sucesivo de administraciones, o varias administraciones en diferentes porciones de tejido adyacentes o cercanas, por ejemplo, de un sitio de un tumor, para llevar a cabo un resultado terapéutico positivo. En todos los casos, la experimentación rutinaria en ensayos clínicos determinará los intervalos específicos para el efecto terapéutico
óptimo.

Las composiciones terapéuticas son útiles para tratar el cáncer pancreático y la displasia pancreática, así como otros tipos de cánceres tales como: cáncer óseo; tumores cerebrales; cáncer de mama; cánceres del sistema endocrino, tales como cánceres de las glándulas tiroidea, hipofisaria y suprarrenal y de los islotes pancreáticos; cánceres gastrointestinales, tales como cáncer de ano, colon, esófago, vesícula biliar, estómago, hígado, y recto; cánceres genitourinarios tales como cáncer de pene, próstata y testículo; cánceres ginecológicos, tales como cáncer de ovario, cuello uterino, endometrio, útero, trompas de Falopio, vagina, y vulva; cánceres de cabeza y cuello, tales como cánceres hipofaríngeos, laríngeos, orofaríngeos, cánceres de labio, boca y orales, cáncer de la glándula salival, cáncer del tracto aerodigestivo y cáncer sinusal; leucemia; linfomas, que incluyen el linfoma de Hodgkin y no Hodgkin; cáncer metastásico; mielomas; sarcomas; cáncer de piel; cánceres del tracto urinario que incluyen los cánceres de vejiga, riñón y uretra; y cánceres pediátricos, tales como tumores cerebrales pediátricos, leucemia, linfomas, sarcomas, cáncer hepático y neuroblastoma y retinoblastoma.

El siguiente ejemplo proporciona datos y procedimientos experimentales.

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Ejemplo 1

Se identificó una familia que tenía varios miembros a los que se había diagnosticado cáncer pancreático. Las características patológicas de la enfermedad en la familia incluían la progresión desde un estado normal a metaplasia, a displasia, y a cáncer. Se obtuvieron tejidos de un miembro de la familia con diagnóstico de cáncer pancreático, de un miembro de la familia con diagnóstico de displasia de las células pancreáticas, de una persona no relacionada con la familia con diagnóstico de pancreatitis, y de una persona no relacionada con la familia con un páncreas
normal.

Se cultivaron las células ductales de los tejidos de cada uno de estos sujetos y se aisló el mARN de los cultivos. El mARN se sometió a reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa mediante el uso de 200 pares de cebadores (10 anclados y 10 cebadores arbitrarios). El cADN resultante se sometió a una expresión diferencial en la que el cADN de cada una de las 4 muestras se comparó en un gel. Las bandas de cADN que parecieron estar estimuladas o inhibidas en las muestras displásicas o de cáncer de páncreas, en comparación con las muestras normales y de pancreatitis, se cortaron del gel, se amplificaron, se clonaron y se secuenciaron.

Se identificó que las siguientes secuencias polinucleotídicas, tal como se muestra en SEQ ID Nºs: 1-15, estaban reguladas erróneamente en la displasia o el cáncer pancreático, o en ambos:

TABLA 1 Polinucleótidos Estimulados e Inhibidos en la Displasia y el Cáncer Pancreático

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1

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: KENNEDY, GIULIA

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENES DEL CÁNCER PANCREÁTICO

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 15

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(iv)

DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Seed and Berry LLP

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(B)

CALLE: 701 Fifth Avenue

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(C)

CIUDAD: Seattle

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(D)

ESTADO: WA

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(E)

PAÍS: USA

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 98104

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(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDEANDOR: Compatible con IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: DOS

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(D)

PROGRAMA: FastSEQ para Windows Versión 2.0

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: 60/118570

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 3 de Junio de 1999

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Potter, Jane E.R.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 33.332

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 200130.454

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

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(A)

TELÉFONO: 206-622-4900

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 206-681-6031

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX:

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 492 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 545 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 978 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 978 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 539 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 491 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 491 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 492 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 492 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 492 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 492 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 826 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

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14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 819 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1386 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 547 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

17

Claims (14)

1. Un polinucleótido subgenómico aislado que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 14.

2. Un polinucleótido subgenómico aislado que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos seleccionados del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2 y 5.

3. Un polipéptido aislado, en el que dicho polipéptido comprende al menos 12 aminoácidos contiguos de un polipéptido natural codificado por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 13-15.

4. Un polipéptido aislado, en el que dicho polipéptido comprende al menos 12 aminoácidos contiguos de un polipéptido natural codificado por un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15.

5. Una preparación de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 3.

6. Una preparación de anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 4.

7. Una sonda nucleotídica aislada que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1-11 y 13-15.

8. Un método in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático que comprende las etapas de: determinar la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 en una muestra de tejido de un ser humano que se sospecha que es cancerosa, y en un tejido humano que es normal; y

comparar las cantidades determinadas; en el que un tejido humano del probando que contiene más polipéptido que el tejido normal se identifica como canceroso.

9. Un método in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático que comprende las etapas de: determinar la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 y la cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14 en una muestra de tejido humano que se sospecha que contiene cáncer, y en un tejido humano que es normal; y

comparar las cantidades determinadas; en el que una muestra de tejido humano que contiene más polipéptido expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 en comparación con el tejido normal y que contiene sustancialmente la misma cantidad de un polipéptido expresado a partir de un polinucleótido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas mostradas en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14, en comparación con el tejido normal, se identifica como canceroso.

10. Un método in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático que comprende las etapas de: determinar la cantidad de moléculas de mARN en una muestra de tejido de un ser humano que se sospecha que es cancerosa y en un tejido humano que es normal, en el que dichas moléculas de mARN son complementarias a un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15 o su complemento; y

comparar las cantidades determinadas de las moléculas de mARN; en el que una muestra de tejido humano que contiene más moléculas de mARN que el tejido normal se identifica como canceroso.

11. Un método in vitro de diagnóstico del cáncer pancreático que comprende las etapas de: determinar la cantidad de un primer grupo de moléculas de mARN en una muestra de tejido humano que se sospecha que es cancerosa y en un tejido humano que es normal, en el que dichas moléculas de mARN son complementarias a la cadena no codificante de una secuencia polinucleotídica bicatenaria, en el que dicha secuencia polinucleotídica bicatenaria se selecciona del grupo de polinucleótidos mostrados en SEQ ID Nºs: 1, 3-4, 6-11, y 13-14; y

determinar la cantidad de un segundo grupo de moléculas de mARN en una muestra de tejido humano que se sospecha que es cancerosa y en un tejido humano que es normal, en el que dichas moléculas de mARN son complementarias a la cadena no codificante de una secuencia bicatenaria, en el que dicha secuencia polinucleotídica bicatenaria se selecciona del grupo de polinucleótidos mostrados en SEQ ID Nºs: 2, 5, y 15; y

comparar las cantidades determinadas; en el que un tejido humano del probando que contiene más del segundo grupo de moléculas de mARN que el tejido normal, y que contiene sustancialmente la misma cantidad del primer grupo de moléculas de mARN; en comparación con el tejido normal, se identifica como canceroso.

12. Una composición terapéutica útil para disminuir la cantidad de traducción de una molécula de mARN en una célula, que comprende:

un polinucleótido inverso complementario a la cadena codificante de un polinucleótido bicatenario, en el que dicho polinucleótido bicatenario se selecciona del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15, en el que dicho polinucleótido inverso se une a una molécula de mARN; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

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13. Una composición terapéutica útil para reducir la expresión de un polipéptido que comprende:

un anticuerpo que se une de manera específica a un polipéptido natural expresado a partir de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15; y

un vehículo farmacéuticamente aceptable.

\vskip1.000000\baselineskip

14. Una composición terapéutica útil para reducir la traducción de una molécula de mARN que comprende:

una ribozima que se une a una molécula de mARN, en el que una porción de dicha ribozima es complementaria a la cadena codificante de un polinucleótido bicatenario;

en el que dicho polinucleótido se selecciona del grupo que consiste en las secuencias polinucleotídicas de SEQ ID Nºs: 2, 5 y 15;

y un vehículo farmacéuticamente aceptable.