CN105237649B - 一种茯苓多糖、其制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药学和免疫学领域，涉及一种茯苓多糖、其制备方法及用途。具体地，组成该茯苓多糖的单糖包括岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。本发明还涉及一种药物组合物以及所述茯苓多糖用于制备疫苗佐剂、疫苗组合物或抗体的用途。本发明制备的茯苓多糖具有良好的疫苗佐剂作用。

Description

一种茯苓多糖、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于中药学和免疫学领域，涉及一种茯苓多糖、其制备方法及用途。具体地，本发明还涉及一种药物组合物以及所述茯苓多糖用于制备疫苗佐剂、疫苗组合物或抗体的用途。

背景技术

茯苓(Poria)为非褶菌目(Aphyllophorales)、多孔菌科(Polyporaceae)、茯苓属(Poria)、真菌茯苓(Poria cocos)(Schw.)Wolf.的干燥菌核，具有利水渗湿、健脾、宁心之功效(中国药典，2010版，p224)。近年来与本发明领域相关的研究和报道归纳如下：

余建国等(余建国，等.中国兽医科技，2004，34(11)：70-74)给1日龄的雏鸡腹腔注射马立克氏病病毒(MDV)强毒株(0.2mL/只)，并从当日开始给试验组雏鸡以1、2和3mg/只的剂量连续肌肉注射茯苓多糖1周。结果表明3个剂量茯苓多糖均可显著提高雏鸡的淋巴细胞转化率、NK细胞活性及MΦ活性。

张志军等(张志军，等.中国免疫学杂志,2013,29:1213-1216)将含60％茯苓多糖混合物(还含有三萜类化合物、乙酰茯苓酸、茯苓酸、胆碱，3β-羟基羊毛甾三烯酸，葡萄糖、腺嘌呤、组氨酸等，未提及制备方法)按0.4、0.8和1.6mg/鼠的剂量灌胃给予小鼠一周。发现小鼠血清中IgA、IgG和IgM水平高于生理盐水对照组，且存在剂量-效应关系。

谢国秀等(谢国秀，等.生命科学研究，2009,13(3)：246-248)将不同剂量(200μg或1000μg)的茯苓多糖分别与低剂量(0.015μg)或高剂量(1.5μg)流感病毒(A/PR/8)灭活疫苗共同免疫小鼠。一次免疫后3周收集血清，检测血清中IgG、IgG1和IgG2a的抗体水平，并用致死量(40×LD50)流感病毒(A/PR/8)攻击小鼠。结果表明茯苓多糖能增加血清抗体水平，提高小鼠抗致死量流感病毒攻击的能力，其免疫增强效果与氢氧化铝相当。

王青等(王青，等.中国实验方剂学杂志，2011,17(13)：127-130)观察茯苓多糖对卵清白蛋白(OVA)诱导的小鼠肠道黏膜免疫应答的影响。茯苓多糖每天按200mg/kg剂量灌胃给药小鼠，1周后1次性灌胃抗原OVA5mg，对小鼠进行免疫，分别于免疫后1，2，3周，收集小鼠粪便样本，ELISA检测小鼠粪便OVA特异性分泌型免疫球蛋白A(sIgA)。结果表明茯苓多糖对肠道sIgA分泌具有促进作用，这与其活化淋巴结B淋巴细胞有关。

Lee等(Lee等.和汉医药学杂志，1999，16(526)：175-182)在肺炎球菌gV型多糖类蛋白质结合抗原接种小鼠前，预先注射当归多糖和茯苓多糖0.2-1.0mg。结果表明较未用多糖组gvPSIgG与lgM生成明显增加。中药多糖组小鼠用有毒力的19F型肺炎球菌攻击后，血中的细菌迅速清除。用gV型肺炎球菌多糖类蛋白质结合抗原免疫小鼠的脾细胞与中药多糖共育后，TNF-a的生成较对照组高4.0-5.5倍，IL-2高15-39倍，IL-4高4.6－64倍。茯苓多糖还诱导IFN-γ生成增加。

Lee等(Lee,et al.International Immunopharmacology,2004,4:1029-1038)采用1％碳酸钠提取茯苓，获得水提物。水提物经过乙醇沉淀、DEAE-纤维素和Sephadex G-50柱层析，获得一个分子量为8000Da的糖肽(PCSC)，PCSC中糖与肽的百分比为78：22。糖部分含有甘露糖(92％)、半乳糖为6.2％，阿拉伯糖为1.3％。肽部分主要含有天冬氨酸、丝氨酸和缬氨酸。PCSC能显著活化RAW264.7巨噬细胞，活化NF-κB/Rel和NO的分泌。

Chen等(Chen,et al.Food and Chemical Toxicology,2004,42:759-769)从茯苓中分离得到1个中性多糖组分(PC-PS)，分子量为160000Da。PC-PS能抑制人白血病U937细胞和HL-60的增殖和分化，能提高TFN-α和IFN-γ的分泌。

归纳以上研究结果，可以看出茯苓多糖能提高受药动物的体液免疫和细胞免疫能力，但未明确阐明使用的茯苓多糖的具体制备方法和理化性质。

不同的制备方法所获得的茯苓多糖具有本质差别，理化性质往往存在截然不同的区别，生物学活性亦不相同。

目前，尚需要制备新的茯苓多糖。

发明内容

本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一种茯苓多糖。本发明人惊奇地发现，所述茯苓多糖具有良好的疫苗佐剂作用。由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及一种茯苓多糖，其中，组成该茯苓多糖的单糖包括岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

在本发明的一个实施方案中，组成该茯苓多糖的单糖为岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其中，岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次为1：(1－2)：(0.3－4)：(2－3.5)；具体地，为1：(1－1.5)：(0.5－3.5)：(2－3.5)；更具体地，为1：(1.3－1.5)：(0.5－1.8)：(2.6－3)。

在本发明的具体的实施方式中，藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次分别如表2中的摩尔比所示。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为20％－80％、20％－60％、20％－40％、40％－80％、40％－60％、20％、40％、60％或80％。

在本发明的具体的实施方式中，按照葡萄糖计算，茯苓多糖的含糖量分别如表1所示。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其分子量在1×10⁴Da－8×10⁵Da之间。具体地，该分子量范围是不连续的。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其包含如下两个多糖组分：

组分1(PCP-1)：分子量范围为1×10⁴Da－8×10⁴Da；

组分2(PCP-2)：分子量范围2×10⁵Da－8×10⁵Da；

具体地，组分1的峰高分子量为2.71×10⁴Da；组分2的峰高分子量为6.47×10⁵Da。具体数据见附图1和附图2。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其大分子成分仅由组分1和组分2组成。具体地，所述大分子成分为分子量≧1×10⁴Da的成分。

根据本发明任一项所述的茯苓多糖，其仅由组分1和组分2组成。

上述任一项所述的茯苓多糖，其亦可称为茯苓总多糖或者茯苓提取物；其可由下面任一项所述的制备方法制得。

本发明的另一方面涉及一种制备茯苓多糖的方法，包括下述步骤：

1)将茯苓药材用水进行浸提，得到水提液；

在本发明的一个实施方案中，提取温度为50－60℃，浸提时间为5小时，提取2次。

2)将步骤1)中得到的水提液在50℃－60℃下减压浓缩，浓缩液加入乙醇进行沉淀，得到沉淀物；

在本发明的一个实施方案中，茯苓水提浓缩液加入3倍体积的乙醇，醇沉时间为72小时。

3)将步骤2)中得到的沉淀物加水溶解，溶解液进行透析或超滤；

4)将步骤3)中透析所得的袋内透析液或者超滤截留液在50℃－60℃下减压浓缩，得到浓缩液；

5)将步骤4)中得到的浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到茯苓多糖。

根据本发明任一项所述的制备方法，其特征在于如下的(1)－(14)项中的任意一项或者多项：

(1)步骤1)中，所述的茯苓药材为茯苓块、茯苓片或茯苓粉；

不拘于理论的限制，茯苓块或者茯苓片通常是粉末压制成的，可以在加入水浸泡之前粉碎，再进行浸提。

(2)步骤1)中，所用水为蒸馏水或去离子水；

(3)步骤1)中，水浸提的温度为0℃－100℃，优选为20℃－70℃，更优选为50℃－70℃，进一步优选为50℃－60℃；

本发明人通过研究发现，在上述温度范围内，不会破坏糖的性质，且随温度升高，糖的得率增加。

(4)步骤1)中，将浸提后得到的茯苓按照相同条件进行一次或多次浸提(例如2或3次)，合并水提液；

(5)步骤1)中，水的用量为能够浸没茯苓的用量，优选为茯苓的5－20倍量(L/kg)；

(6)步骤1)中，浸提期间进行搅拌；

(7)步骤1)中，浸提的时间为1－48小时；

(8)步骤2)中，加入的乙醇的体积为浓缩液的1－4倍；

(9)步骤2)中，乙醇沉淀的时间为大于12小时，例如为48－72小时；

(10)步骤2)中，醇沉后上清液中乙醇的终浓度为50％－80％(质量百分比浓度)，优选为60％－70％；

(11)步骤3)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀物加水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液，得到溶解液；

(12)步骤3)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；

(13)步骤3)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；透析进行一次或多次；

(14)步骤5)中，喷雾干燥的温度低于80℃。

具体地，上面述任一项所述的制备方法为本发明任一项所述的茯苓多糖的制备方法。

本发明的再一方面涉及一种茯苓多糖，其由本发明任一项所述的制备方法制得。

本发明的再一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明中任一项所述的茯苓多糖；具体地，所述药物组合物为疫苗；具体地，所述疫苗为动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；更具体地，为H1N1疫苗或者乙肝疫苗。可选地，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。

本发明的再一方面涉及一种疫苗佐剂，其包含本发明中任一项所述的茯苓多糖；具体地，所述疫苗佐剂为选自如下疫苗的佐剂：动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗；更具体地，为为H1N1疫苗佐剂或者乙肝疫苗佐剂。

本发明的再一方面涉及本发明中任一项所述的茯苓多糖在制备疫苗、疫苗佐剂或者抗体中的用途；

具体地，所述药物组合物为疫苗；具体地，所述疫苗为动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗；更具体地，为H1N1疫苗或者乙肝疫苗；

具体地，所述疫苗佐剂为选自如下疫苗的佐剂：动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗；更具体地，为为H1N1疫苗佐剂或者乙肝疫苗佐剂。

在本发明中，所述疫苗选自动物和人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗预计多肽疫苗。

本发明中，所用乙醇的浓度，如果没有特别说明，均为质量百分比浓度。

发明的有益效果

本发明制备的茯苓多糖，具有良好的疫苗佐剂作用。

附图说明

图1：55℃提取茯苓多糖的分子量(PCP-55)分布图谱(HPGPC)。色谱柱：TSK-4000PSWL；洗脱液：0.1mol/L Na₂SO₄；检测器：示差检测器。注：右侧的峰为溶剂峰。

图2：不同温度下制备的茯苓多糖的分子量分布图谱(HPGPC)。色谱柱：TSK-4000PSWL；洗脱液：0.1mol/L Na₂SO₄；检测器：示差检测器。

图3：茯苓多糖对OVA抗原三次免疫小鼠血清特异性抗体滴度的影响。Saline-生理盐水；OVA-卵清蛋白；Alum-铝佐剂；PCP-茯苓多糖。图3A，初次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定；图3B，二次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定；图3C，三次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定。

与盐水组相比，^**p<0.01；与OVA抗原组相比，^#p<0.05,^##p<0.01；与OVA+铝佐剂组相比，^$p<0.05，^$$p<0.01，n＝5。

图4：苓多糖对H1N1流感抗原免疫小鼠的佐剂作用。图4A，H1N1流感抗原初次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定；图4B，H1N1流感抗原二次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定。

与盐水组相比，^**p<0.01；与OVA抗原组相比，^#p<0.05,^##p<0.01；与OVA+铝佐剂组相比，^$p<0.05，^$$p<0.01，n＝5。

图5：茯苓多糖对乙肝抗原的佐剂作用。HBsAg-乙肝抗原；PCP-实施例1制备的茯苓多糖；AL-铝佐剂；group-组别(分组)；control-生理盐水组。图5A，乙肝抗原初次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定；图5B，乙肝抗原二次免疫后14天小鼠血清抗体滴度测定。

与盐水组相比，^**p<0.01；与OVA抗原组相比，^#p<0.05,^##p<0.01；与OVA+铝佐剂组相比，^$p<0.05，^$$p<0.01，n＝5。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：55℃温度下制备茯苓多糖

取茯苓块1kg，向其中加入蒸馏水15L，55℃温度下浸泡5小时，期间不时搅拌；浸提液过滤，滤液离心；浸提后的茯苓残渣在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(质量百分比浓度)进行醇沉48小时；醇沉物离心，将沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量>1000)，用水透析；将所截留的透析液减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥，获得所述茯苓多糖(命名为PCP-55)。

实施例2：在10℃－100℃之间制备茯苓多糖

取茯苓块8份，每份100g。分别在15℃、25℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃温度下加水浸提。每份茯苓各加入1.5L水。15℃和25℃浸提24小时，50℃、60℃、70℃、80℃、90℃温度下各浸提5小时，100℃煎煮1.5小时。每个温度下均浸提二次。浸提液过滤，滤液离心；浸提后的茯苓残渣在同样条件下进行第二次提取；合并两次提取的水提液，减压浓缩，然后加入3倍体积的乙醇，使乙醇终浓度为70％(质量百分比浓度)进行醇沉48小时；醇沉物离心，将沉淀部分加入水中搅拌溶解，离心，沉淀再同样操作二次；合并溶解的上清液，装入透析袋(截留分子量>1000)，用水透析；将所截留的透析液减压浓缩后，浓缩液装入小瓶，进行冷冻干燥，获得不同温度下获得的茯苓多糖(分别命名为PCP-15、PCP-25、PCP-50、PCP-60、PCP-70、PCP-80、PCP-90和PCP-100)。

实施例3：不同温度制备茯苓多糖的理化性质测定

1.实验样品

根据实施例1和实施例2的制备方法制备的茯苓多糖。

2.茯苓多糖得率以及茯苓多糖中糖含量的测定(苯酚-硫酸法)

(1)标准曲线制作

葡萄糖标准品置于55℃真空干燥箱中干燥，至恒重。准确称取葡萄糖标准品5mg，转移至50mL容量瓶中，加蒸馏水定容。移取葡萄糖标准溶液0.0、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、1.8mL至于具塞试管中，再分别补水至2.0ml。各试管中加入8％苯酚溶液1.0mL，摇匀，然后沿管壁缓慢加入浓硫酸5.0mL，摇匀。室温放置30分钟后于490nm波长处测定吸光度值。以葡萄糖溶液浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)样品糖含量测定

待测样品置于55℃真空干燥箱干燥至恒重。精确称量10mg样品，转移至25mL容量瓶中，加水定容。移取待测样品溶液0.5mL至于具塞试管中，补加蒸馏水至2.0mL。按标准曲线相同方法操作，测定其吸光度值，代入标准曲线方程中，计算样品中糖含量。

茯苓多糖得率＝茯苓多糖重量(g)/药材重量(g)×100％。

糖含量(以葡萄糖计)＝糖重量(mg)/茯苓多糖重量(mg)×100％。

结果见下面的表1。

表1：茯苓多糖得率和糖含量

3.茯苓多糖分子量分布(凝胶渗透色谱法，HPGPC)

(1)色谱条件：

标准品：一系列不同分子量的葡聚糖。

色谱柱：TSKgel-G4000PWXL(7.8×300mm)。

流动相：0.1mol/L的Na₂SO₄溶液。

进样：20μL。

检测器：2414示差检测器。

(2)标准曲线制作：

分别称取5mg不同分子量葡聚糖标准品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤。在流速0.5mL/min条件下分别进样20μL。采用Waters Empower2.0GPC软件处理实验数据，绘制分子量标准曲线。

(3)样品分子量测定:

分别称取5mg待测样品，加入0.5mL超纯水溶解，0.45μm膜过滤，进样20μL。根据样品的保留时间，计算多糖样品的峰高分子量(Mp)。

(4)测定结果：

按照实施例1和实施例2的方法制备的茯苓多糖，其分子量分布结果见附图1和附图2。

4.单糖组成测定

分别称取实施例2的茯苓多糖各5mg，分别置于水解管中，加入3mL2mol/L三氟乙酸溶解，密封，置于120℃烘箱中加热水解2小时。取出放置冷至室温后，转移至25mL圆底烧瓶中。45℃减压条件下反复加入少量甲醇，去除残余的三氟乙酸。反应瓶中各加入2mL水溶解，再加入80mg硼氢化钠，室温搅拌反应4小时。反应结束后滴加25％醋酸除去过量的硼氢化钠。然后45℃减压条件下多次加入甲醇，去除残留的硼酸。待测样品70℃真空干燥2小时，再各加入2mL无水吡啶和2mL无水醋酸酐，密封，90℃加热1小时进行乙酰化衍生反应。反应结束后，60℃减压条件下多次加入少量甲苯，去除反应瓶中残余的吡啶及醋酸酐。样品加入少量氯仿溶解、过滤，滤液进行气相色谱分析，根据不同单糖的峰面积计算单糖之间的摩尔比。

结果见下面的表2。

表2：茯苓多糖的单糖组成

。

实施例4：茯苓多糖对抗原蛋白OVA的佐剂活性评价

将实施例1制备的茯苓多糖(PCP-55，本实施例及附图中亦简称为PCP)作为佐剂，以卵清蛋白(OVA)为抗原，二者联用肌肉注射小鼠，测定产生的抗体滴度。

1.实验动物和实验用品

实验动物：Balb/C，6－8周，5只/组，雌性。

药物浓度：PCP-55：10mg/mL；OVA：0.6mg/mL；铝佐剂：2mg/mL。

对照溶剂：生理盐水。

给药剂量：OVA-60μg/0.1mL/鼠；铝佐剂－200μg/0.1mL/鼠。

PCP-55：1mg/0.1mL/鼠。

2.实验方法

分组：生理盐水组、单独OVA组、OVA+PCP组、OVA+铝佐剂组。

注射前等体积混合，100μL/鼠，右后肢肌肉注射。

免疫方案：动物按照免疫分组首次免疫注射后3周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。首次免疫注射后第3周检测抗体滴度，第4周加强免疫，二次免疫注射后2周，尾静脉取血，测定血清中抗体滴度，视滴度情况，测定后2周进行第3次免疫。ELISA测定血清中抗体滴度。

ELISA法所用试剂配制：

(1)抗原包被液：50mmol/L碳酸盐缓冲液pH9.6。称取无水Na₂CO₃1.696g，NaHCO₃2.856g加水溶解到1000mL，调节pH至9.6。

(2)洗涤液(10×PBST，pH7.4)：称取NaCl80g，KCl2g，Na₂HPO₄29g，KH₂PO₄2g，Tween-2010ml，双蒸水至1000mL，调节pH7.4，10倍稀释使用。

(3)封闭液：1％BSA，用50mmol/L PBS pH7.4溶解。

(4)底物液(TMB-H₂O₂)：使用时将底物液A和B等体积混合，加入30％H₂O₂，终浓度0.5％。

底物液A(TMB)：称取TMB200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL。

底物液B(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L Na₂HPO₄缓冲液)：Na₂HPO₄24.8g，柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000ml，调节pH5.0－5.4。

(5)2N H₂SO₄。

(6)OVA溶解于抗原包被液，浓度为4μg/mL，包被96孔板(Costa)100μl/孔，4℃过夜。PBST洗3遍，1％BSA-PBS37℃封闭1小时。PBST洗3遍后加入以PBST稀释的小鼠血清样品，100μL/孔，37℃孵温1小时。PBST洗3遍，加入HRP-羊抗小鼠IgG(1:1000，PBST)37℃孵温1小时，PBST洗6遍，加入100μL底物液显色后，加入50μL2N H₂SO₄终止反应测定A₄₅₀。

3.实验结果

茯苓多糖PCP、生理盐水、Al(OH)₃分别与OVA等体积混合，免疫小鼠，100μL/鼠，免疫3周尾静脉取血，取血清自1:200始至1:12800等比稀释，ELISA方法检测血清抗体滴度。

实验结果表明第一次免疫所有测试组抗体滴度均比较低，而经过第二、三次免疫后PCP注射组动物血清滴度明显升高，表明PCP具有显著促进特异性抗体产生作用(见附图3，A－C)。

实施例5：茯苓多糖对H1N1流感抗原的佐剂活性评价

100℃下提取茯苓多糖PCP-100(实施例2制备，本实施例及附图中亦简称为PCP)作为佐剂，以H1N1病毒裂解液为抗原，PCP-100按照0.2mg/鼠和1.0mg/鼠的剂量分别与甲型流感疫苗H1N1病毒裂解液(北京科兴生物制品有限公司生产，3μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。实验分为生理盐水对照组、单独H1N1抗原组、H1N1+低剂量PCP-100组(0.2mg/鼠)、H1N1+高剂量PCP-100组(1.0mg/鼠)和H1N1+铝佐剂组(0.2mg/鼠)。小鼠初次免疫后14天，ELISA方法测定H1N1流感抗原特异性抗体滴度。初次免疫后28天进行二次免疫，剂量同初次。二次免疫后14天测定H1N1流感抗原特异性抗体滴度。具体测定方法参考实施例4。实验结果见附图4，A－B。

实验结果表明：初次免疫后14天，1.0mg/鼠PCP-100能显著促进H1N1流感抗原免疫小鼠血清特异性抗体滴度的产生(p<0.05)。二次免疫后14天，单独抗原免疫组小鼠抗体滴度明显升高，但联用PCP后抗体滴度显著高于单独抗原或加入铝佐剂组，表明PCP对H1N1流感抗原有明显佐剂活性。

实施例6：对乙肝抗原的佐剂活性评价

将实施例1制备的茯苓多糖(PCP-55，本实施例及附图中亦简称为PCP)作为佐剂，以乙肝重组蛋白(HBsAg)为抗原(大连汉信生物制药有限公司生产)，PCP按照1.0mg/鼠的剂量与乙肝抗原(2μg/鼠)配伍肌肉注射免疫小鼠。实验分为生理盐水对照组、单独HBsAg抗原组、HBsAg+PCP组(1.0mg/鼠)和HBsAg+铝佐剂组(0.2mg/鼠)。小鼠初次免疫后14天，ELISA方法测定乙肝抗原特异性抗体滴度。初次免疫后28天进行二次免疫，剂量同初次。二次免疫后14天测定乙肝抗原特异性抗体滴度。ELISA法检测血清HBsAg特异性抗体滴度。

具体操作如下：

(1)HBsAg抗原包被：重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)用抗原包被液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6)稀释至终浓度3mg/L，加入96孔板中，100μL/孔，置于湿盒，于4℃包被过夜。

(2)封闭：设置好洗板仪程序，取出包被过夜的96孔酶标板用PBST洗3次，200μL/孔，吸去洗液后加入1％BSA(PBS配制)，200μL/孔，37℃封闭1小时。

(3)加血清样品：封闭后的96孔酶标板用PBST洗涤3次，小鼠初次免疫血清从1：400开始，用PBST按2倍倍比稀释6个梯度，加入96孔酶标板，100μL/孔，37℃孵育1小时；加强免疫后的血清从1：4000倍倍比稀释到1：128000测定。

(4)加山羊抗小鼠IgG-HRP抗体：弃去血清样品，PBST洗涤，200μL/孔，洗涤3次。HRP标记的羊抗鼠IgG抗体用PBST1：1000倍稀释，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1小时。

(5)酶标底物显色：弃去二抗，PBST洗涤5次，200μL/孔。加入新鲜配制的TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光显色15分钟。

(6)终止显色：加入0.2M硫酸溶液终止显色，50μL/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A₄₅₀)。

实验结果表明：茯苓多糖与乙肝抗原配伍初次免疫小鼠14天，能显著促进抗原特异性抗体滴度的产生(p<0.05)，效果优于铝佐剂。二次免疫后茯苓多糖组和铝佐剂组均显示明显的佐剂效果，茯苓多糖的作用仍优于铝佐剂(见附图5，A－B)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (30)

1.一种茯苓多糖，其中，组成该茯苓多糖的单糖包括岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖；

其中，岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次为1：(1－2)：(0.3－4)：(2－3.5)，茯苓多糖的分子量在1×10⁴Da－8×10⁵Da之间；并且，所述茯苓多糖包含两个多糖组分，其分子量范围分别为1×10⁴Da－8×10⁴Da和2×10⁵Da－8×10⁵Da。

2.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次为1：(1－1.5)：(0.5－3.5)：(2－3.5)。

3.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，岩藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖之间的摩尔比依次为1：(1.3－1.5)：(0.5－1.8)：(2.6－3)。

4.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为20％－80％。

5.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为20％－60％。

6.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为20％－40％。

7.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为40％－80％。

8.根据权利要求1所述的茯苓多糖，其中，按照葡萄糖计算，其含糖量为40％－60％。

9.一种制备权利要求1至8中任一项所述茯苓多糖的方法，包括下述步骤：

1)将茯苓药材用水进行浸提，得到水提液；

2)将步骤1)中得到的水提液在50℃－60℃下减压浓缩，浓缩液加入乙醇进行沉淀，得到沉淀物；

3)将步骤2)中得到的沉淀物加水溶解，溶解液进行透析或超滤；

4)将步骤3)中透析所得的袋内透析液或者超滤截留液在50℃－60℃下减压浓缩，得到浓缩液；

5)将步骤4)中得到的浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥，得到茯苓多糖。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于如下的(1)－(14)项中的任意一项或者多项：

(1)步骤1)中，所述的茯苓药材为茯苓块、茯苓片或茯苓粉；

(2)步骤1)中，所用水为蒸馏水或去离子水；

(3)步骤1)中，水浸提的温度为0℃－100℃；

(4)步骤1)中，将浸提后得到的茯苓按照相同条件进行一次或多次浸提，合并水提液；

(5)步骤1)中，水的用量为能够浸没茯苓的用量；

(6)步骤1)中，浸提期间进行搅拌；

(7)步骤1)中，浸提的时间为1－48小时；

(8)步骤2)中，加入的乙醇的体积为浓缩液的1－4倍；

(9)步骤2)中，乙醇沉淀的时间为大于12小时；

(10)步骤2)中，醇沉后上清液中乙醇的终浓度为50％－80％；

(11)步骤3)中，乙醇沉淀后离心，得到的沉淀物加水进行一次或多次溶解，离心，合并上清液，得到溶解液；

(12)步骤3)中，透析所用的透析袋的截留分子量大于1000；

(13)步骤3)中，用自来水和/或蒸馏水进行透析；透析进行一次或多次；

(14)步骤5)中，喷雾干燥的温度低于80℃。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤1)中，水浸提的温度为20℃－70℃。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤1)中，水浸提的温度为50℃－70℃。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤1)中，水浸提的温度为50℃－60℃。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤1)中，将浸提后得到的茯苓按照相同条件进行2或3次浸提，合并水提液。

15.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤1)中，水的用量为茯苓的5－20倍量(L/kg)。

16.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤2)中，乙醇沉淀的时间为48－72小时。

17.根据权利要求10所述的制备方法，其中，步骤2)中，醇沉后上清液中乙醇的终浓度为60％－70％。

18.一种茯苓多糖，其由权利要求9至17中任一所述的制备方法制得。

19.一种药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项或者权利要求18所述的茯苓多糖。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中，所述药物组合物为疫苗。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，所述疫苗为动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。

22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中，所述疫苗为H1N1疫苗或者乙肝疫苗。

23.一种疫苗佐剂，其包含权利要求1至8中任一项或者权利要求18所述的茯苓多糖。

24.根据权利要求23所述的疫苗佐剂，其为选自如下疫苗的佐剂：动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗。

25.根据权利要求23所述的疫苗佐剂，其为H1N1疫苗佐剂或者乙肝疫苗佐剂。

26.权利要求1至8中任一项或者权利要求18所述的茯苓多糖在制备疫苗、疫苗佐剂或者抗体中的用途。

27.根据权利要求26所述的用途，其中，所述疫苗为动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗或多肽疫苗。

28.根据权利要求26所述的用途，其中，所述疫苗为H1N1疫苗或者乙肝疫苗。

29.根据权利要求26所述的用途，其中，所述疫苗佐剂为选自如下疫苗的佐剂：动物或人用的减毒疫苗、灭活疫苗、蛋白质疫苗、DNA疫苗和多肽疫苗。

30.根据权利要求26所述的用途，其中，所述疫苗佐剂为H1N1疫苗佐剂或者乙肝疫苗佐剂。