CN1425694A - 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途 Download PDF

Info

Publication number
CN1425694A
CN1425694A CN 03118416 CN03118416A CN1425694A CN 1425694 A CN1425694 A CN 1425694A CN 03118416 CN03118416 CN 03118416 CN 03118416 A CN03118416 A CN 03118416A CN 1425694 A CN1425694 A CN 1425694A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polysaccharide
mycelium
centrifugal
water
poria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 03118416
Other languages
English (en)
Other versions
CN1205231C (zh
Inventor
张俐娜
陈莉
金勇�
林雨露
张玫
张志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan University WHU
Original Assignee
Wuhan University WHU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan University WHU filed Critical Wuhan University WHU
Priority to CN 03118416 priority Critical patent/CN1205231C/zh
Publication of CN1425694A publication Critical patent/CN1425694A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1205231C publication Critical patent/CN1205231C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤活性的人工培养菌种的茯苓菌丝体水溶性杂多糖及其制备方法和用途。用玉米浆为主要成分配制成培养基，由野生茯苓菌种深层发酵培养出茯苓菌丝体。分别用生理盐水和热水从菌丝体中提取水溶性杂多糖。所得该杂多糖主要由α－D－葡萄糖、甘露糖、半乳糖和蛋白质组成。体内活性实验表明，该水溶性杂多糖对植入小鼠体内的Sarcoma180肿瘤的生长具有明显的抑制作用，而且无毒副作用。体外活性实验表明，该类多糖对人体急性白血病毒细胞(HL－60)的增殖有显著的抑制效果，而且不会破坏正常猴肾细胞的增殖。上述水溶性杂多糖可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。

Description

一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途。属于天然高分子领域，也属于分子生物学领域。
背景技术
七十年代，由于细胞膜的化学功能、免疫物质和新药等研究方面取得的进展，以及多种糖蛋白、糖脂等复合多糖的发现，已确信多糖具有许多方面的生物活性。Chihara(J.Immunol.Immunopharmacol.，IV，85，1983)的研究认为多糖类化合物的活性不是象在化疗中那样直接杀死细胞，而是存在一种间接的抗肿瘤活性，即由免疫系统传递的活性，主要是对免疫系统的特定非特异性或特异性功能的激发，因此毒性极小。茯苓是我国的传统中药，具有利尿、渗湿、补脾、安神等功能。近年来，茯苓的研究主要集中在其主要成分茯苓多糖上，它和它的衍生物具有抗诱变、抗肿瘤(Yakugaku Zasshi，106，206，1986)和免疫(Phytother.Res.，9，448，1995)等活性。Narui等人(Carbohydr.Res.87，161，1980)报道从茯苓菌核中提取的多糖具有明显的抗肿瘤活性。然而，由于茯苓人工栽培周期长，而且很难保存及运输，使得由菌核制得的茯苓多糖难以推广。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途，这种杂多糖以容易获得的人工培育的茯苓菌种为原料，其制法简单，易以工业化生产。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖(ac-PCM2)，由下法制得：采用人工培育的茯苓菌种(Poria cocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后逆向流水透析，最后冷冻干燥得水溶性杂多糖纯品。
上述水溶性杂多糖主要由α-D-葡萄糖、甘露糖、半乳糖和蛋白质组成。其中含蛋白质18.1％，多糖81.9％(多糖中α-D-葡萄糖占51.4％、半乳糖占29.7％、甘露糖占19.1％、岩藻糖占0.8％)，重均分子量为17.0×104。以上均为重量百分比。
本发明还提供了上述水溶性杂多糖的制备方法，采用人工培育的茯苓菌种(Poria cocos；中国科学院微生物所菌种保藏中心提供，编号5.78)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集提取液。提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得所需水溶性杂多糖(ac-PCM2)纯品。
上述培养基的基本组成为1L蒸馏水含玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g，CaCl2·2H2O 0.04～0.08g，MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg、蒸馏水1L。
上述茯苓菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4～8小时，其在生理盐水中的提取时间在8～12小时；透析时间在5～10天。
上述水溶性杂多糖可用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
用红外光谱、核磁共振、气相色谱、蛋白质分析仪、粘度计及光散射仪确定了上述水溶性杂多糖化学组成和二级结构。
该水溶性杂多糖对植入小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤抑制率的结果其抗肿瘤活性明显高于其它杂多糖，且无毒副作用，可用作保健品，作为抗肿瘤天然药物也具有应用前景。
与已有技术相比较，本发明的创新如下：所提供的茯苓菌丝体水溶性杂多糖为一种结构清楚的全新物质，它具有明显的抗肿瘤活性，且无毒副作用。这种茯苓菌丝体杂多糖可望成为有开发前景的抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。该多糖的制备方法是培养基中采用廉价的玉米浆为主要原料，利用生物工程发酵技术培养茯苓菌丝体，并从中分离出具有抗肿瘤活性的多糖。它比用麸皮为主要原料的培养基得到的菌丝体多糖具有更显著的抗肿瘤活性。不同培养基得到的菌丝体多糖其化学组成、蛋白质含量和分子量均不同，因此影响到生物活性的不同。本发明制法简单，易以工业化生产。
具体实施方式
以下结合具体的实例对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例
茯苓菌种为中国科学院微生物所菌种保藏中心提供，编号5.78(公众可随时购买)。首先在斜面培养基中培养菌种。培养用的试管以及棉塞先在121℃消毒灭菌30分钟(空消)，再装入培养基在121℃消毒灭菌30分钟，斜放冷却使其凝固成斜面，然后在无菌室接种。斜面培养在恒温28℃下进行，为期7天。液体培养基配方如下：1L蒸馏水中含玉米浆(10mL)，D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O(0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，Fe2(SO4)3(5mg)，维生素B1(0.1mg)。培养用的摇瓶(250mL)和棉塞事先在121℃消毒灭菌30分钟，装入液体培养基后再在121℃消毒灭菌30分钟，冷却后在无菌室接种。静置一天后将摇瓶置于摇床上，于25±1℃条件下震荡培养12天。所得菌丝体为浅黄色，且有一种淡香味。
将茯苓菌丝体从培养基中过滤分离后，经冷冻干燥得到的粉末依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取各8小时。然后用9g/L氯化钠水溶液提取三次：浸泡在9g/L氯化钠水溶液中过夜，离心，收集上清液(ac-PCM1)。残渣用热水于高压120℃下提取三次，每次半小时，离心，收集上清液(ac-PCM2)。提取液浓缩后，均用30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次直至紫外检测无280nm处的吸收峰，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得多糖纯品。茯苓菌丝体培养液过滤，浓缩后用30％H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质，反复进行9次直至紫外检测无280nm处的吸收峰，然后分别用清水和二次蒸馏水透析5天和3天，浓缩，最后冷冻干燥得胞外多糖(ac-PCM0)。所得多糖均为浅黄色粉状固体。
对照组液体培养基配方为：1L蒸馏水中含麸皮(200g)的提取液，D-葡萄糖(25g)，酵母膏(3.2g)，KH2PO4(1.0g)，CaCl2·2H2O(0.06g)，MnCl2·4H2O(5mg)，MgSO4·7H2O(0.5g)，ZnCl2(4mg)，Fe2(SO4)3(5mg)，维生素B1(0.1mg)。菌丝体培养方法和茯苓菌丝体水溶性杂多糖提取方法司ac-PCM0和ac-PCM1上。所得多糖为浅黄色固体粉末分别命名为：ab-PCM0和ab-PCM1。
这些多糖的组成、蛋白质含量、分子量以及产率列于附表1，多糖样品经香港中文大学生物系对植入Sarcoma 180肿瘤小鼠进行体内腹腔注射试验，得出抗肿瘤活性结果列于附表2。由此表明由含玉米浆培养基培养的菌丝体多糖ac-PCM2具有明显的抗肿瘤活性。同时对本发明的水溶性杂多糖进行人体急性白血病毒细胞(HL-60)的抗增殖实验结果表明其对增殖有显著的抑制效果，而不会破坏正常猴肾细胞的增殖。该多糖可用于制备抗肿瘤药物和提高机体免疫功能的保健品。附表1.茯苓菌丝体多糖单糖组成、蛋白质含量、产率和分子量
样品                       多糖中单糖含量(％)   蛋白质(％)     产率(％)     Mw×10-4(gmol-1)
    岩藻糖     阿拉伯糖    木糖   甘露糖   半乳糖   葡萄糖
  ac-PCM0ac-PCM1ac-PCM2     1.44.50.8     1.0--    -+-   43.015.819.1   27.423.929.7   27.253.451.4   25.542.918.1 1.71.7     10.112.517.0
  ab-PCM0ab-PCM1     --     8.33.8    10.02.5   19.410.0   11.526.3   50.649.9   11.6- 1.5     7.75.2
-：未检测到；+：痕量附表2.茯苓菌丝体多糖的抗肿瘤活性
样品    剂量(mg/kg×days) 抑制率(％) 完全抑制
实例  ac-PCM0ac-PCM1ac-PCM2    20×1020×1020×10     -12.742.3*     0/71/70/7
比较组  ab-PCM0ab-PCM1    20×1020×10     8.334.17     0/80/8
-对小鼠体内的Sarcoma 180肿瘤的生长没有明显的抑制作用*p＜0.01

Claims (5)

1.一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖，由下法制得：采用人工培育的茯苓菌种(Poriacocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透析、冷冻干燥得水溶性杂多糖纯品。
2.权利要求1所述水溶性杂多糖的制备方法，其特征在于：采用人工培育的茯苓菌种(Poriacocos)在含玉米浆的液体培养基中深层发酵培养出茯苓菌丝体，将茯苓菌丝体依次用乙酸乙酯、丙酮进行索氏提取去除脂肪；然后浸泡在生理盐水中，离心，离心后所得沉淀用105～120℃的热水在0.12～0.20MPa下浸泡提取，离心，收集提取液；提取液浓缩后，用20％～30％(重量百分比)H2O2脱色，用Sevag法除去游离的蛋白质直至紫外检测无280nm的蛋白质吸收峰，然后透、冷冻干燥得多糖纯品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述培养基的基本组成为1L蒸馏水含玉米浆5～15mL、D-葡萄糖20～30g、酵母膏3～3.5g、KH2PO4 0.8～1.2g、CaCl2·2H2O 0.04～0.08g、MnCl2·4H2O 3～7mg、MgSO4·7H2O 0.3～0.7g、ZnCl2 2～6mg、Fe2(SO4)3 3～7mg、维生素B1 0.08～0.12mg。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：上述茯苓菌丝体索氏提取去除脂肪时间在4～8小时，其在生理盐水中的提取时间在8～12小时；透析时间在5～10天。
5.权利要求1所述的水溶性杂多糖用作抗肿瘤药物或提高机体免疫功能的保健品。
CN 03118416 2003-01-06 2003-01-06 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途 Expired - Fee Related CN1205231C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03118416 CN1205231C (zh) 2003-01-06 2003-01-06 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03118416 CN1205231C (zh) 2003-01-06 2003-01-06 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1425694A true CN1425694A (zh) 2003-06-25
CN1205231C CN1205231C (zh) 2005-06-08

Family

ID=4790759

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 03118416 Expired - Fee Related CN1205231C (zh) 2003-01-06 2003-01-06 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1205231C (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308350C (zh) * 2004-07-28 2007-04-04 武汉大学 一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法
CN105061627A (zh) * 2015-08-31 2015-11-18 桂林茗兴生物科技有限公司 茯苓多糖的提取方法
CN105237649A (zh) * 2014-07-11 2016-01-13 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种茯苓多糖、其制备方法及用途
WO2016062020A1 (zh) * 2014-10-22 2016-04-28 北京中安佐际生物科技有限公司 茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用途

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1308350C (zh) * 2004-07-28 2007-04-04 武汉大学 一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法
CN105237649A (zh) * 2014-07-11 2016-01-13 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种茯苓多糖、其制备方法及用途
CN105237649B (zh) * 2014-07-11 2018-01-16 中国人民解放军军事医学科学院毒物药物研究所 一种茯苓多糖、其制备方法及用途
WO2016062020A1 (zh) * 2014-10-22 2016-04-28 北京中安佐际生物科技有限公司 茯苓多糖活性组分和成分、其制备方法及用途
CN105061627A (zh) * 2015-08-31 2015-11-18 桂林茗兴生物科技有限公司 茯苓多糖的提取方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN1205231C (zh) 2005-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101467903B1 (ko) 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 면역증강제
CN108823261A (zh) 一种超低分子量铁皮石斛多糖及其制备与应用
CN109207544A (zh) 一种小球藻抗氧化多肽的制备方法
CN108641007A (zh) 一种具有免疫活性的野葛根多糖制备方法
KR20060116463A (ko) 인삼박을 배지로 한 버섯 균사체 및 그 생산방법
Zhu et al. Effects of cultural medium on the formation and antitumor activity of polysaccharides by Cordyceps gunnii
US20040106187A1 (en) Composition for the culturing of Phellinus linteus mycelium
CN1425694A (zh) 一种具有抗肿瘤活性的水溶性杂多糖及其制备方法和用途
KR100405990B1 (ko) 유기게르마늄 함유 동충하초의 제조방법
CN105796587B (zh) 竹茹多糖在免疫调节、抗肿瘤中的应用
CN103014095B (zh) 戴氏绿僵菌gyya0601菌株用于产透明质酸的用途
CN1205230C (zh) 一种水溶性杂多糖及其制备方法和用途
CN103305567A (zh) 卡介菌复合多糖及其制备方法和用途
CN114807270B (zh) 一种利用黑根霉发酵制备的牛蒡根多糖及其生产工艺和应用
Pérez-Fernández et al. Effect of exopolysaccharide V2-7, isolated from Halomonas eurihalina, on the proliferation in vitro of human peripheral blood lymphocytes
KR20120053564A (ko) 영지발효삼 음료 제조방법과 그 음료
CN1228449C (zh) 灵芝菌丝体抗肿瘤水溶性杂多糖及其制备方法和用途
CN105586267B (zh) 生产灵芝菌丝体的灵芝诱变菌株
CN114854604A (zh) 一种肉灵芝、包含肉灵芝的高浓度口服液及其制备方法
CN101280333B (zh) 一种利用灰玫瑰青霉制备青霉源性抗菌肽的方法
KR100398677B1 (ko) 감귤농축액을 이용한 버섯균사체의 배양방법 및 그버섯균사체
KR100706132B1 (ko) 펠리누스 린테우스 균사체 배양용 배지 조성물
CN103880678B (zh) 苯甲酸衍生物及其制备与降糖应用
CN103283687A (zh) 用白僵菌制备蛴螬僵虫的方法
CN1308350C (zh) 一种具有抗肿瘤活性的茯苓菌丝体胞外多糖的制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C19 Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee