CN103305567A - 卡介菌复合多糖及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种卡介菌复合多糖及其制备方法和用途，本发明用生物化学方法从卡介菌细胞壁中提取卡介菌复合多糖，首先将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜；然后进行复合多糖粗提和复合多糖精制。制备的卡介菌复合多糖，包括阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，分子量范围为2000～36000道尔顿。它可刺激人的免疫系统，通过使多种免疫细胞的活化及细胞因子的产生，发挥免疫调节效应。该制剂对人体应用无任何毒副作用，可用于防治感冒、哮喘、过敏性疾病、胞内感染性疾病、辅助抗肿瘤治疗。

Description

卡介菌复合多糖及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种从卡介菌细胞壁中提取的卡介菌复合多糖的方法和提取的卡介菌复合多糖的用途。

背景技术

卡介菌多糖核酸是原湖南医科大学自20世纪70—90年代研发的新型生物反应调节剂。大量的研究显示，本品具有抗过敏、抗胞内感染、抗肿瘤等较强的免疫调节药理作用，临床用于防治感冒、哮喘等疗效好。其主要作用机制是：（1）诱导Th₀细胞分化成Th₁型细胞亚群，促进其分泌γ－干扰素（IFN－γ）、白介素－2（IL－2），刺激B细胞合成IgG2a，抑制合成IgG1，具有免疫调节和抗过敏作用；（2）增强单核－巨噬细胞功能，小鼠经腹腔注射本品，其腹腔巨噬细胞（MФ）数量增加，分泌酸性磷酸酶、溶菌酶增多，对胞内感染菌，如人型结核菌、白色念珠菌、仙台病毒等有杀灭作用；（3）增强自然杀伤细胞（NK）活性，促使外周血中的γ/δT细胞扩增10～20倍，具有填补早期NK细胞及共性吞噬细胞介导的非特异性抵抗力和晚期αβT细胞介导的特异性免疫应答间的“空隙”（gap）作用，调节趋化、活化病变中的αβT细胞，具有抗肿瘤、抗胞内感染作用；（4）促进细胞毒T淋巴细胞（CTL）的细胞毒作用，从另一个角度发挥抗肿瘤、抗胞内感染的作用。本发明的负责人之一（高洁生）曾主持卡介菌多糖核酸防治儿童哮喘的研究，获得良好的临床疗效。其论文评为国际优秀论文；其治疗方法纳入全国儿童哮喘诊断治疗方案[中华儿科杂志，1998，36（12）：747]；其研究成果于1997年获得湖南省科委科技进步二等奖[湘科奖学（97）第002号，项目编号：9713204]。目前，市面上已有湖南九芝堂斯奇康生物制药有限公司生产的“斯奇康”（卡介菌多糖核酸注射液），0.5mg/支，经肌肉注射给药，被批准用于治疗慢性支气管炎、感冒、哮喘。但是，该产品推荐的使用剂量和给药时间为每次0.5mg,隔日1次，与我们研发使用的1.0mg，每3日1次不同。另一方面，众多的研究表明，某些细菌、植物中药来源的多糖具有明显的免疫调节作用，如丸山疫苗，它是人型结核杆菌青山株的提取物，其主要成分为阿拉伯甘露聚糖， 1992年日本厚生省批准该药作为治疗后肿瘤患者的白血病减少的药物（药品名 Ancer-20）；还有黄芪多糖、香菇多糖等。由于当时的条件和时间限制，没有进一步对卡介菌多糖核酸各个组分做进一步研究。因此需要挖掘卡介菌细胞壁中的复合多糖对免疫调节的更大作用。

发明内容

本发明所解决的技术问题在于提供一种卡介菌复合多糖及其制备方法和用，以解决上述背景技术中的问题。

本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

一种卡介菌复合多糖的制备方法，包括以下步骤：

   （1）将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜；

   （2）复合多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，用极性有机溶剂在2-6℃沉淀复合多糖，获得粗制复合多糖；

   （3）复合多糖精制：将上述粗制复合多糖经阴离子交换柱及超滤处理后，冷冻干燥获得精制复合多糖，即卡介菌复合多糖。

作为进一步的方案：步骤（1）具体包括以下步骤：

1）制备苏通液体培养基：将天门冬素 4.0g、MgSO₄.7H₂O  0.5g、枸橼酸 2.0g、枸橼酸铁胺 0.05g 、K₂HPO₄ 0.5g、丙三醇 6ml溶于800 ml蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，以氨水调PH至7.2，再过滤后分装100 ml锥形瓶，102.9KPa高压灭菌20分钟，待冷后作无菌试验，置4℃冰箱保存；

2）菌种的扩大保存：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密至生长成乳白色至暗橙色菌膜，置4℃备用；

3）液体培养：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密后，离心去沉淀。

作为进一步的方案：卡介菌标准菌株的保存与鉴定：卡介菌丹麦株接种用罗氏鸡蛋斜面培养基上培养保存；增菌接种前，先经苏通培养基传代培养；传代培养后，对细菌生长情况进行检定，并经耐酸染色和革兰染色进行形态学鉴定；将鉴定合格的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养4周；由于本菌为表面生长，在苏通液体培养基表面生长成乳白至暗橙色菌膜。

作为进一步的方案：步骤（2）具体步骤为：将卡介菌苏通液体培养基增菌培养物加入25～35倍重量的去离子水，煮沸回流2小时，离心并收集提取液；向培养物中再加水煮沸回流1小时，离心，收集提取液；合并两次提取液，继续煮沸蒸发浓缩至溶液总糖含量达2%，加入2倍体积95%乙醇，离心，收集沉淀，再用95%乙醇清洗沉淀，离心，4℃收集沉淀，晾干，获得粗制复合多糖。

所述的卡介菌复合多糖的制备方法制备的卡介菌复合多糖，包括阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，卡介菌复合多糖的分子量范围为2 000～36 000道尔顿。

所述的卡介菌复合多糖的用途，将卡介菌复合多糖制成脂肪注射液、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、微乳剂和脂肪乳剂中任意一种形式的药物组合物；所述药物组合物含有赋型剂、载体或稀释剂；药物组合物的给药途径为口服、含服、腔道灌注、经皮、静脉和肌肉注射中任意一种。

作为进一步的方案：所述卡介菌复合多糖的药物组合物单独使用，或者结合抗肿瘤药物使用；所述的抗肿瘤药物包括环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔和紫杉醇。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：本发明用生物化学方法从卡介菌细胞壁中提取复合多糖成分，单糖构成有阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。他可刺激人的免疫系统，通过使多种免疫细胞的活化及细胞因子的产生，发挥免疫调节效应。该制剂对人体应用无任何毒副作用，可用于防治感冒、哮喘、过敏性疾病、胞内感染性疾病、辅助抗肿瘤治疗。具有更好的临床疗效，更广泛的适应证，更方便的给药方法，给药途径可以口服、含服、腔道灌注、经皮、静脉和肌肉注射中任意一种。

具体实施方式

为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解，下面进一步阐述本发明。

一种卡介菌复合多糖的制备方法，包括以下步骤：

   （1）将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜；

   （2）复合多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，用极性有机溶剂在2-6℃沉淀复合多糖，获得粗制复合多糖；

   （3）复合多糖精制：将上述粗制复合多糖经阴离子交换柱及超滤处理后，冷冻干燥获得精制复合多糖，即卡介菌复合多糖。

作为进一步的方案：步骤（1）具体包括以下步骤：

1）制备苏通液体培养基：将天门冬素 4.0g、MgSO₄.7H₂O  0.5g、枸橼酸 2.0g、枸橼酸铁胺 0.05g 、K₂HPO₄ 0.5g、丙三醇 6ml溶于800 ml蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，以氨水调PH至7.2，再过滤后分装100 ml锥形瓶，102.9KPa高压灭菌20分钟，待冷后作无菌试验，置4℃冰箱保存；

2）菌种的扩大保存：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密至生长成乳白色至暗橙色菌膜，置4℃备用；

3）液体培养：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密后，离心去沉淀。

作为进一步的方案：卡介菌标准菌株的保存与鉴定：卡介菌丹麦株接种用罗氏鸡蛋斜面培养基上培养保存；增菌接种前，先经苏通培养基传代培养；传代培养后，对细菌生长情况进行检定，并经耐酸染色和革兰染色进行形态学鉴定；将鉴定合格的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养4周；由于本菌为表面生长，在苏通液体培养基表面生长成乳白至暗橙色菌膜。

作为进一步的方案：步骤（2）具体步骤为：将卡介菌苏通液体培养基增菌培养物加入25～35倍重量的去离子水，煮沸回流2小时，离心并收集提取液；向培养物中再加水煮沸回流1小时，离心，收集提取液；合并两次提取液，继续煮沸蒸发浓缩至溶液总糖含量达2%，加入2倍体积95%乙醇，离心，收集沉淀，再用95%乙醇清洗沉淀，离心，4℃收集沉淀，晾干，获得粗制复合多糖。

所述的卡介菌复合多糖的制备方法制备的卡介菌复合多糖，包括阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，卡介菌复合多糖的分子量范围为2 000～36 000道尔顿。

所述的卡介菌复合多糖的用途，将卡介菌复合多糖制成脂肪注射液、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、微乳剂和脂肪乳剂中任意一种形式的药物组合物；所述药物组合物含有赋型剂、载体或稀释剂；药物组合物的给药途径为口服、含服、腔道灌注、经皮、静脉和肌肉注射中任意一种。

实施例如下：

（1）卡介菌复合多糖注射液制备：将卡介菌复合多糖加35℃-45℃注射用水溶解，调pH值为7.0-7.4，加注用水至全量，用超滤器除热源，PVDF膜过滤分装后，高压灭菌；

（2）卡介菌复合多糖悬浮液制备：将卡介菌复合多糖加35℃-45℃注射用水溶解，调pH值为7.0-7.4，加注用水至全量，用超滤器除热源，高压灭菌；

（3）卡介菌复合多糖片剂制备：将卡介菌复合多糖充分混合后置高速磨粉机中研磨，进行微粉化处理，并与细粉与助崩剂、粘合剂及2/3量崩解剂充分混合均匀，以3-4kg/cm²压力压片。

作为进一步的方案：所述卡介菌复合多糖的药物组合物单独使用，或者结合抗肿瘤药物使用；所述的抗肿瘤药物包括环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔和紫杉醇。

卡介菌复合多糖结合抗肿瘤药物实验如下：

采用体外细胞半数致死量IC₅₀测定。分别取对数生长期的Hel细胞和Bel-7402细胞，加入96孔培养板中，同时加入不同稀释浓度的复合多糖样品，每个浓度加入常用的抗重力药物（为环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔和紫杉醇中一种或几种），设置阴性对照，每个样品设置3个复空。37℃、5% CO₂培养箱中静置培养，每天换一次培养液（DMEM完全培养基），培养3-5天后，取悬浮细胞，台盼蓝染色，白细胞计数板计数，绘制细胞存活率——药物浓度曲线。

在本发明中卡介菌复合多糖的对比研究的使用方法是单剂量肌肉注射。将用本发明的方法获得卡介菌多糖溶于注射用0.01M，pH7.4的磷酸盐缓冲液中，供肌肉注射使用。每次500ug（1mL溶液中含有500ug）。斯奇康注射液作对照，通过小鼠巨噬细胞吞噬试验进行验证。

以下通过实施例进一步阐述本发明：

卡介菌丹麦株采用罗氏鸡蛋斜面培养基培养保持。采用苏通培养基进行扩增培养，每瓶110-120mL，在35℃-37℃室温培养4周后，培养瓶表面生长出乳白色至暗橙色菌膜。培养瓶中菌膜下的液体应澄清透明，不应该有灰绿色或灰黑色污染物生长，也不应有臭味或异味。培养物需逐瓶检查，确保其未污染、无异常方可用于多糖的提取。

将上述培养物集中于大烧杯内，置沸水中加热煮沸2个小时，冷却后4000转/分离心20分钟，是菌体沉淀碴完全沉淀，上清液为清澈透明。收集上清液，加入冰醋酸，冰醋酸量约为占总液体量的1%，同样方法离心，收集上清液。此上清液再加总液体量的1%，同样方法离心，收集上清液。此上清液再加总液体量的1%的氢氧化钠，100℃水浴中加热2小时，同样方法离心，收集上清液，3倍乙醇沉淀，沉淀物使用乙醇、丙酮洗涤，烘干即为复合多糖粗提物。

上述复合多糖粗提物用水溶解。经阴离子交换柱处理，自动部分收集器及紫外监视器收集。样品加入量为20-30mL。对收集的各部分多糖组分用苯酚-硫酸法检测，弃去无糖及含色素的部分。

将收集的多糖部分，膜超滤，放入冷冻真空干燥机中干燥，分装于小瓶密封，置干冷处保存。

用注射0.01M pH7.4磷酸盐缓冲液，按处方使用含量配置成500ug/mL、5mg/mL的含药复合多糖溶液，分装按瓶，经高压灭菌处理。经此处理的卡介菌复合多糖注射液其保质期至少为2年。

为检测经实施例1制备的卡介菌复合多糖，经大量的实验研究表明：本发明提供的卡介菌复合多糖具有免疫调节功能；人体应用无任何毒副作用。

下面为检验本发明卡介菌复合多糖增强小鼠巨噬细胞吞噬功能实验。

使用20-25g的SD小鼠进行实验。将动物随机分为3组，每组12只。于实验组小鼠腹腔内注射本发明的药物0.5mL（500ug/mL），阳性药物对照组在腹腔内注射斯奇康注射液0.5mL，阴性对照组在腹腔内注射0.5mL生理盐水，16hrs 后，用pH 7.4 的RPMI1640液（美国，洛杉矶，Sigma公司）3mL冲洗小鼠腹腔，将腹腔冲洗液置于组织培养瓶内，37℃孵育30分钟后，弃去瓶内液体，以0.5mL RPMI1640液冲洗瓶壁获得的粘附细胞即为本实验用巨噬细胞来源。计数细胞后制成5×10⁵/mL的细胞悬液。经台盼蓝排斥试验检查细胞存活率＞95%。

使用本实验室保存的临床分离金黄色葡萄球菌菌株，将细胞接种于肉汤培养基18hrs后，制备成2×10⁸/mL悬液备用。

本发明制剂对小鼠巨噬细胞受金黄色葡萄球菌刺激后活性的影响见表-1.

表-1 本发明制剂对小鼠巨噬细胞受金黄色葡萄球菌刺激后活性的影响

组别	小鼠数（只）	积分值（cpm）X±S
			实验组	12	43.16±30.97①②
阳性药物对照组	12	29.11±19.72②
			阴性对照组	12	4.16±3.56

①与阳性药物对照组比较，p＜0.05

②与阴性对照组比较，p＜0.01

结果表明，卡介菌复合多糖制剂诱导的小鼠巨噬细胞在与金黄色葡萄球菌作用过程中，其发光强度（积分值）比阳性对照组明显增强（p＜0.05），比阴性对照组比较，显著增强（p＜0.01）。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定 。

Claims (9)

1.一种卡介菌复合多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

   （1）将含有卡介菌标准菌株的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩展培养至生长成乳白色至暗橙色菌膜；

   （2）复合多糖粗提：将上述培养物经煮沸提取，离心去沉淀，用极性有机溶剂在2-6℃沉淀复合多糖，获得粗制复合多糖；

   （3）复合多糖精制：将上述粗制复合多糖经阴离子交换柱及超滤处理后，冷冻干燥获得精制复合多糖，即卡介菌复合多糖。

2.根据权利要求1所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，步骤（1）具体包括以下步骤：

 1）制备苏通液体培养基：将天门冬素 4.0g、MgSO₄.7H₂O  0.5g、枸橼酸 2.0g、枸橼酸铁胺 0.05g 、K₂HPO₄ 0.5g、丙三醇 6ml溶于800 ml蒸馏水中，待溶解后加蒸馏水至1000ml，以氨水调PH至7.2，再过滤后分装100 ml锥形瓶，102.9KPa高压灭菌20分钟，待冷后作无菌试验，置4℃冰箱保存；

2）菌种的扩大保存：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密至生长成乳白色至暗橙色菌膜，置4℃备用；

3）液体培养：接种卡介菌标准菌株至制备好的苏通液体培养基，37℃恒温培养箱中静态培养14-28天，待菌生长浓密后，离心去沉淀。

3.根据权利要求1所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，卡介菌标准菌株的保存与鉴定：卡介菌丹麦株接种用罗氏鸡蛋斜面培养基上培养保存；增菌接种前，先经苏通培养基传代培养；传代培养后，对细菌生长情况进行检定，并经耐酸染色和革兰染色进行形态学鉴定；将鉴定合格的传代培养物继续接种于苏通培养基进行扩增培养4周；由于本菌为表面生长，在苏通液体培养基表面生长成乳白至暗橙色菌膜。

4.根据权利要求1所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，步骤（2）具体步骤为：将卡介菌苏通液体培养基增菌培养物加入25～35倍重量的去离子水，煮沸回流2小时，离心并收集提取液；向培养物中再加水煮沸回流1小时，离心，收集提取液；合并两次提取液，继续煮沸蒸发浓缩至溶液总糖含量达2%，加入2倍体积95%乙醇，离心，收集沉淀，再用95%乙醇清洗沉淀，离心，4℃收集沉淀，晾干，获得粗制复合多糖。

5.一种如权利要求1-4任一所述的卡介菌复合多糖的制备方法制备的卡介菌复合多糖，其特征在于，包括阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，卡介菌复合多糖的分子量范围为2 000～36 000道尔顿。

6.一种如权利要求5所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，将卡介菌复合多糖制成脂肪注射液、片剂、丸剂、胶囊剂、溶液、悬浮剂、微乳剂和脂肪乳剂中任意一种形式的药物组合物；所述药物组合物含有赋型剂、载体或稀释剂。

7.根据权利要求6所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，所述药物组合物的给药途径为口服、含服、腔道灌注、经皮、静脉和肌肉注射中任意一种。

8.根据权利要求6所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，所述卡介菌复合多糖的药物组合物单独使用；或者结合抗肿瘤药物使用。

9.根据权利要求8所述的卡介菌复合多糖的用途，其特征在于，所述的抗肿瘤药物包括环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、氟铁龙、安曲希、丝裂霉素、阿霉素、表阿霉素、正定霉素、长春新碱、喜树碱、顺铂、乐沙定、辛乐尔和紫杉醇。