KR101586468B1

KR101586468B1 - 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물

Info

Publication number: KR101586468B1
Application number: KR1020140193994A
Authority: KR
Inventors: 임용택; 노현종
Original assignee: 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2014-12-30
Publication date: 2016-01-18

Abstract

음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물 {ADJUVANT COMPOSITION, PRODUCING METHOD OF THE SAME, AND VACCINE COMPOSITION INCLUDING THE SAME}

본원은 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는 아주번트 조성물, 상기 아주번트 조성물의 제조 방법, 및 상기 아주번트 조성물을 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다.

백신 아주번트는 면역증강 보조제로서, 면역세포를 활성화시켜 감염성 질환의 예방/치료 백신 및 항암치료에서 중요한 역할을 한다. 종래의 백신에서 아주번트로 사용되는 면역보조제인 알루미늄염(aluminum salt, alum)은 항체 반응에 기여하는 체액성 면역반응의 향상을 유도하는데 효과적이지만, 바이러스에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는데는 한계가 있다는 치명적인 단점이 있다. 세포성 면역반응을 유도하는 면역보조제로 알려진 MPLA(Monophosphoryl Lipid A)를 백신 아주번트로 사용하고자 하는 시도가 있었으나(미국 등록번호 제7611721호), 물에 분산되지 않는 친유성 특성 때문에, 나노에멀젼(MF59 등)이나 리포좀 형태로 제형을 제조해야 하는 어려움이 있었다.

또한, 리포좀이나 나노에멀젼과 같은 백신 아주번트 제형은 액상의 형태를 가지고 있어, 냉장보관을 해야 하기 때문에, 콜드체인(cold-chain) 환경이 잘 갖추어져 있지 못한 개발도상국이나 후진국에서 보관에 어려움이 있어, 안정성에 큰 문제가 있는 현실이다.

본원은, 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는 아주번트 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 포함하는 백신 조성물을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본원의 제 1 측면은, 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는, 아주번트 조성물을 제공한다.

본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는, 백신 조성물을 제공한다.

본원의 제 3 측면은, 음이온성 고분자를 증류수에 용해시켜 제 1 용액을 제조하고, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist) 및 사포닌을 용매에 용해시켜 제 2 용액을 제조하고, 및 상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 혼합하여 교반한 후 동결건조하는 것을 포함하는, 아주번트 조성물의 제조 방법을 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는 것으로서, 감염성 질환의 예방/치료 백신 및 항암치료에서 중요한 역할을 하는 면역세포의 활성화에 사용되는 분말 형태의 백신 아주번트(면역증강 보조제)로서 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 난용성인 면역활성화 물질인 엠피엘에이(MPLA)와 큐에스21(QS21)을 계면활성제(surfactant) 사용없이, 생체고분자 물질인 음이온성 고분자를 사용하여, 용이하면서 재현성있게 수용액에 분산시킬 수 있는, 분말 형태의 백신 아주번트를 제조할 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 생체친화성 고분자인 음이온성 고분자를 사용함으로써, 수용액에서 난용성인 MPLA와 QS21을 수용액 내에 안정하게 분산시키고, 최종적으로 분말 형태로 저장할 수 있게 함으로써, 상온에서의 백신의 보관 안정성을 증가시킬 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 분말 형태의 백신 아주번트가 인플루엔자 항원과 결합되었을 때, 체액성 면역, 세포성 면역, 및 점막성 면역을 탁월하게 향상시키는 효과가 있으며, 최종적으로는 인플루엔자 바이러스를 접종한 마우스를 이용하여 생존률 및 몸무게 변화를 측정하였을 때, 우수한 바이러스 방어능 효과를 나타냈다.

도 1은, 본원의 일 구현예에 따른 PMQ 복합체/항원으로 구성된 백신시스템을 나타낸 개략도이다.
도 2a 내지 도 2e는, 본원의 일 실시예에 따른 PMQ 아주번트/항원 백신 조성물의 물리화학적 특성을 나타낸 것이다.
도 3은, 본원의 일 실시예에 따른 PMQ 아주번트 소재의 동결건조 안정제(cryoprotectant) 특성을 나타낸 것이다.
도 4a 내지 도 4e는, 본원의 일 실시예에 따른 PMQ 아주번트의 OVA 항원에 대한 면역반응을 나타낸 것이다.
도 5는, 본원의 일 실시예에 따른 PMQ 아주번트와 인플루엔자 A 바이러스 항원(재조합 단백질 HA)이 주입된 마우스에서의 항체가, 중화항체 유도능, 및 생존율을 나타낸 것이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.

본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.

본원 명세서 전체에서, "A 및/또는 B"의 기재는, "A 또는 B, 또는 A 및 B"를 의미한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 고분자는 카르복실기 및/또는 히드록시기를 함유하는 생체친화성 고분자로서, 폴리감마글루탐산, 히알루론산, 셀룰로오스, 폴리아크릴산, 다당류, 이들의 유도체, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음이온성 고분자는, 난용성 면역활성화 물질이 계면활성제 없이 수용액에 용이하면서 재현성있게 분산될 수 있도록 한다. 상기 음이온성 고분자는 동결건조 안정제 역할을 함으로써, 상기 아주번트 조성물이 안정하게 분말 형태로 제조될 수 있도록 하나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 음이온성 고분자는 백신의 항원과 정전기적 인력 또는 친유성 결합을 통해 상호작용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A), 이미퀴모드, 레시퀴모드, 플라겔렌(flagellin), 시피지(CpG), 폴리아이시[poly(I:C)], 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 분말 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 음이온성 고분자, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 상기 사포닌은 약 0.5 내지 약 1 : 약 0.01 내지 약 1 : 약 0.01 내지 약 1의 중량비, 예를 들어, 약 1 : 약 0.01 : 약 0.01 또는 약 1 : 약 1 : 약 1의 중량비로서 포함되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 아주번트 조성물은 수용액에 용해시켜 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 제 2 측면은, 상기 본원의 제 1 측면에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 항원은 단백질, 세포, 바이러스, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 단백질은, 예를 들어, 오버알부민, 재조합 단백질, 서브유닛(subunit), 스플릿(split) 단백질 항원을 포함할 수 있으며, 상기 세포는, 예를 들어, 수지상세포를 포함할 수 있고, 상기 바이러스는, 예를 들어, 인플루엔자, 고병원성인플루엔자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

도 1은, 음이온성 고분자로서 폴리감마글루탐산을 이용하여, MPLA/QS21/항원을 조합하여 백신 조성물을 구성하는 방법을 도식화한 것이다. 폴리감마글루탐산과 항원, MPL 및 QS21 사이의 수소결합 및 소수성 상호작용이 음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트 및 사포닌의 복합체와 항원의 조합을 용이하게 한다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, β-에스킨, 디지토닌 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

본원의 일 구현예에 있어서, 상기 용매는 디메틸 술폭사이드(DMSO),에탄올(ethanol),아세톤(aceton),디메틸포름아마이드(DMF), 클로로포름(chloroform), 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다.

이하, 본원의 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명하며, 본 실시예에 의하여 본원의 범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: 폴리감마글루탐산 / MPLA / QS21 ( PMQ )/항원 복합체의 제조

폴리감마글루탐산을 133 ㎍/mL로 증류수(distilled water)에 용해시키고, MPLA(monophosphoryl Lipid A) 및 QS21을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 4 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 상기 두 용액을 혼합한 후 강하게 교반하고 동결건조시켰다. 수득된 분말을 5 mL 증류수에 용해시키고 3 일 동안 투석한 후, 동결건조시켰다. 동결건조된 폴리감마글루탐산/MPLA/QS21(PMQ)에 PBS(Phosphate Buffered Saline)를 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하여 용해시켰다. 여기에 다양한 농도 (0.01 μg 내지 200 μg)의 오버알부민, 재조합 단백질, 및 인플루엔자 항원을 첨가하여 PMQ/항원 시스템을 제조하였다. 제조된 PMQ/항원 시스템은 바로 사용하거나, 동결건조하여 보관하였다.

상기 수득한 PMQ/항원 시스템에 대하여, Agilent사의 　Cary 630 FTIR Spectrometer를 사용하였다. 우선 ATR의 베이스라인을 설정하고 여기에 DMSO-d6를 이용하여 베이스라인을 획득했다. 각 샘플을 DMSO-d6에 녹여 각기 300 회 내지 1,000 회 스캔하여 동등한 스캔 조건으로 샘플을 측정하였다. 얻어진 샘플 스펙트럼에서 DMSO-d6의 픽을 빼주어 샘플의 스펙트럼을 분석하였다. 얻어진 스펙트럼을 상호비교하여 제거된 픽과 새로 생성된 픽을 분석하여 분자내부의 연관성을 검증하였다. 결론적으로, FT-IR을 이용하여 폴리감마글루탐산과 MPLA/QS21이 수소결합을 통하여 결합함을 확인하고 이를 도 2a에 나타내었다. 도 2b는 폴리감마글루탐산/오브알부민(OVA)(FITC) 혼합물의 형광특성을 나타내는 것으로, 폴리감마글루탐산이 오버알부민 항원을 효과적으로 분산시킴을 형광의 증가를 통하여 확인할 수 있다. GPC-MALLS는 다각도 광산한측정기를 이용하여 입자의 입경과 크기 그리고 형태를 이용해서 절대 분자량을 측정하는 방식이다. 사용된 이동상은 NaNO₃ 0.1 M 용액을 사용했고 컬럼은 TSK-GEL GMPWXL 컬럼 7.8 mm ID × 30.0 cm L 13 μm의 규격을 사용했다. MALLS는　Wyatt Technology 사의 DAWN^® HELEOS™ II 　제품을 사용하여 분석하였다. 농도대비 분석을 위해서 굴절률 검출기(viscotek ve 3580 RI detector)를 사용했다. RI 검출기 및 MALLS는 온라인으로 연결되어 실시간으로 검출 및 연산을 실시하였다. 컬럼 오븐 셋팅값은 40℃로서 설정하였다. 샘플 주입은 수동주입기를 이용하여 1 mg/mL 내지 0.25 mg/mL 까지 다양한 농도를 사용하여 측정하였고,　가장 좋은 결과를 도출한 농도값을 취했다. 다각도 광산란측정기(MALLS)에서 데이터는 평균 분자 직경과 절대 분자량을 취득하여 각샘플들의 분자직경/분자량 값을 정리하여 분자 내부의 상호 인력(interaction)을 판별하였다. 결론적으로, GPC-MALLS를 이용하여 PMQ/항원 시스템에서의 결합 특성을 확인하였으며, 폴리감마글루탐산과 MPLA/QS21이 강하게 결합하는 것을 보여주고 있다(도 2c; 검은색: 폴리감마글루탐산, 청색:폴리감마글루탐산/MPLA, 적색: 폴리감마글루탐산/QS21).

6 개월이 지난 후에, 상기 PMQ/항원 시스템에서 면역보조 아주번트의 안정성을 대조군으로 OVA 우선 대조군으로 OVA(20 ㎍)를 C57BL/6 마우스에 비강 투여하였고, 실험군으로 실시예 1과 같이 제조한 PGA/MPLA/QS-21 복합체를 각각 상온보관(6 개월) 및 제조 즉시 만든 것을 OVA(20 ㎍)을 섞어서 비강 투여하였다. 그 후 특성을 평가했을 때, 면역보강제 특성이 그대로 유지됨을 알 수 있었다(도 2d; 1: 항원(OVA), 2: PMQ/항원 (제조 즉시), 3: PMQ (제조 후 상온보관 6 개월 후)/항원). 표지된 항원(OVA)을 BALB/C 마우스에 투여하고 동물 SPECT/CT(Siemens, Knoxville, TN, USA; 한국기초과학지원연구원 오창센터)를 이용하여 비강 내에서 항원의 체류시간을 6 시간 및 12 시간 측정함으로써, 폴리감마글루탐산은 점막층과 결함함으로써 점막층에서 항원의 체류시간을 증가시켜 줄 수 있어, 점막 아주번트 소재로도 활용될 수 있음을 확인하였다(도 2e). 폴리감마글루탐산은 동결건조 과정에서도 상업적으로 널리 사용되는 글루코스와 비슷한 정도의 동결건조 안정제로서의 특성을 보였다(도 3).

실시예 2: PMQ 복합체의 OVA 특이 항체 생성 확인

PMQ 복합체가 OVA 항원에 대하여 특이적 면역 증진효과를 나타내는지 조사하기 위하여 항체 특이적인 면역반응 중, 특이 항체 생산과 관련이 있는 B 세포에 의한 체액성 면역반응에 미치는 영향을 조사하였다. 우선 대조군으로 OVA(20 ㎍)를 C57BL/6 마우스에 비강 투여하였고, 실험군으로 PGA, PGA/QS-21, PGA/MPLA, 및 실시예 1과 같이 제조한 PGA/MPLA/QS-21 복합체에 OVA(20 ㎍)을 섞어서 비강 투여하였다.

1 주에 한 번씩 3 회 비강 투여 후 4 주째에 마우스 혈청과 비강물을 채취하여 혈청과 비강물 중 각각의 OVA에 대한 항체 역가(titer)를 ELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)법으로 측정하였다. 상기 ELISA법은 OVA(1 ㎍/mL)가 코팅된 플레이트를 PBS/3% BSA를 블록킹한 후, 대조군과 실험군 혈청을 다양한 일련의 희석율로 37℃에서 배양하였다. 그 후 호스 래디쉬 퍼옥사이드(Horse raddish peroxidase)가 부착된 마우스 IgG 및 IgA(점막면역관련) 항체를 1 시간 동안 첨가하고 혈청을 2 시간 동안 보관하였다. 언급된 각각의 단계 후에는 PBS/0.05% 트윈(Tween) 20을 사용하여 3 회 세척하였다. 기질로는 TMB(tetramethylbenzidine, BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후 450 nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다(도 4a 내지 도 4c). 구체적으로, 도 4a 내지 도 4e는 PMQ 아주번트의 OVA 항원에 대한 면역반응을 나타낸 것으로, 도 4a는 IgG에 대한 면역반응을 나타낸 것이고, 도 4b는 IgA에 대한 면역반응을 나타낸 것이며, 도 4c는 IgG1 및 IgG2a에 대한 면역반응 결과이고 도 4d 및 도 4e는 ELISPOT을 이용한 Th-유도 사이토카인을 나타낸 것이다[1: OVA only (20 ㎍), 2: OVA plus γ-PGA, 3: OVA plus γ-PGA/QS21 (PQ), 4: OVA plus γ-PGA/MPL (PM), 5: OVA plus γ-PGA/MPL/QS21 (PMQ), 6: OVA plus CT (1 ㎍)]. PMQ를 OVA와 함께 주사한 마우스에서의 OVA에 대한 항체 역가는 OVA와 CT를 섞어서 주사한 마우스에서의 OVA 각 항원에 대한 항체 역가보다 높게 나타났다.

실시예 3: PMQ 세포매개 특정 T 세포 반응 확인

PMQ에 의한 마우스 비장 내 T 세포의 PMQ에 대한 세포성 면역반응을 조사하였다. 실시예 1에서 접종된 마우스 중에서 OVA 및 OVA-PMQ 그룹 중 3 마리의 마우스를 선택하여 2 주 후에 각각의 마우스에서 비장을 적출한 후, 멸균된 페트리디쉬에 상기 비장 조직을 옮기고, 셀 스트레이너(cell strainer)를 이용하여 상기 비장을 갈아 조직 피막으로부터 세포를 분리하였다. 상기 페트리디쉬 내의 모든 내용물을 50 mL 튜브에 옮기고 RPMI 배지로 가득 채운 후, 1,500 rpm에서 5 분간 원심분리한 후, 상층액을 제거한 펠렛에 적혈구 용출 버퍼(sigma Aldrich, Germany)를 5 mL 넣고 30℃ 수조에서 5 분 내지 10 분간 방치하여, 적혈구를 용혈시켰다. 튜브에 포함된 세포를 PBS로 세척한 후, RPMI 배지에 부유시켜 비장세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 비장세포를 IFN-r와 IL-4로 코팅된 플레이트에 5×10⁵ cell/100 μL로 96-웰에 깔고 MHC 클래스 I-제한 OVA 펩티드를 5 ㎍/mL의 농도로 48 시간 동안 처리하였다. 그 후에 호스 레디쉬 퍼옥사이드가 부착된 IFN-r와 IL-4를 첨가하였다. 기질로는 ACE(3-amino-9-ethyl-carbazole, BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후, ELSPOT(enzyme-linked immunospot)법으로 측정하였다. 그 결과 대조군에 IFN-γ와 IL-4가 현저하게 높은 반응을 나타내는 것을 확인하였다(도 4d 및 도 4e). 도 4d는 인터류킨-4(IL-4) 측정량을 나타낸 것이고, 도 4e는 인터페론-감마(IFN-γ) 측정량을 나타낸 것이다.

실시예 4: PMQ-rHA에 대한 항체 생성 확인

PMQ가 조류인플루엔자 바이러스 특이 항원 단백질인 HA 단백질에 대하여 특이적 면역 증진효과를 나타내는지 조사하기 위하여, 항체 특이적인 면역반응 중, 특히 항체 생산과 관련이 있는 B 세포에 의한 체액성 면역반응에 미치는 영향을 조사하였다. 대조군으로는 HA(0.5 ㎍) 단백질 단독으로 비강 투여하였으며 PMQ에 HA(0.5 ㎍)을 섞어 비강 투여하였다. 첫 번째 비강주사 후에 각 1 주마다 마우스 혈청을 채취하여 혈청 중의 HA 단백질에 대한 항체 역가(titer)를 ELISA(Enzyme linked Immunosorbent assay)법으로 측정하였다. 상기 ELISA법은 HA 단백질이 코팅된 플레이트를 PBS/3% BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하여 블록킹한 후 대조 실험군 혈청을 다양한 일련의 희석율에서 인큐베이션하였다. 그 후, 호스 래디쉬 퍼옥사이드가 부착된 마우스 IgG 및 IgA를 첨가하였다. 상기 모든 인큐베이션은 37℃에서 1 시간 동안 수행하였으며, 언급된 각각의 단계 후에는 PBS/0.05 % 트윈(Tween) 20을 사용하여 3 회 세척하였다. 기질로는 TMB(tetramethylbenzidine, BD biosciences, USA) 100 μL를 첨가하여 반응을 전개시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 ELISA 판독기로 측정하였다. 도 5는 PMQ 아주번트 복합체와 인플루엔자 A 바이러스 항원(재조합 단백질 HA)이 주입된 마우스에서의 항체가, 중화항체 유도능 및 생존율을 나타낸 것으로, HA에 의한 IgG(도 5의 A), IgA(도 5의 B), PMQ와 HA 단백질(도 5의 C)을 비강투여한 실험군에서 바이러스에 대한 항체 역가를 나타낸 것이며, 도 5의 D는 이의 생존율을 나타낸 것이다. PMQ를 HA단백질과 함께 비강 투여한 마우스에서의 HA 단백질에 대한 항체 역가는 HA 단백질만을 비강투여한 마우스에서의 항체 역가가 보다 높게 나타났다(도 5의 A 및 B).

실시예 5: PMQ의 중화항체 유도능 확인

각 그룹별 마우스 혈청에서의 항체 역가 측정은 하기의 HI(Haemagglutination Inhibition) 테스트법으로 측정하였다. 모든 혈청은 비브리오 콜레라(vibreo cholera)에서 추출한 RDE(receptor-destroying enzyme)을 혈청 샘플 부피 대비 1:3으로 처리한 뒤 37℃의 배양기에서 20 시간 동안 배양하였다. 혈청 내 비특이적인 수용체들의 활성을 제거한 샘플을 96-웰 둥근 바닥 플레이트에서 25 μL씩 순차적으로 2 배 희석하였다. 두 번째로 혈청 샘플에 동일 부피의 4HAU 바이러스를 넣고 37℃의 배양기에서 30 분간 반응시키고, 마지막으로 0.5% 닭 적혈구가 포함된 PBS를 50 μL씩 넣어준 뒤 실온에서 40 분간 반응시켰다. 역가는 희석된 50 μL 안에서 계산된 값으로 log10N=10N 에서 N 값으로 표기하였다. 그 결과 PMQ와 HA 단백질을 비강투여한 실험군에서 바이러스에 대한 항체 역가가 증가하였다(도 5의 C).

실시예 6: PMQ의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염에 대한 저항성

PMQ의 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 면역증강 효과를 조사하기 위하여, 인플루엔자 바이러스를 감염시킨 실험동물의 폐사를 확인하였다. 병원체로 사용된 인플루엔자 바이러스는 충북대학교 의과대학 미생물학 실험실 최영기 교수로부터 분양받은 A/California/04/09를 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포에서 증폭한 뒤 실험에 사용하였으며, 실험동물로는 6 주령의 암컷 BalB/C 마우스를 사용하였다. 바이러스 분리는 (1) 분리된 바이러스를 항생제가 들어있는 PBS에 희석해서 10 일된 백색 산란계의 유정란에 접종한 뒤 37℃에서 48 시간 정치 배양한 뒤 유정란의 요수를 취하여 증폭된 바이러스를 사용하였다; (2) 6-웰 세포배양 플레이트에서 페니실린과 스트렙토마이신과 5% 우태아혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)이 포함된 alpha-MEM(minimum essential medium, Gibco, USA) 배지에서 자란 MDCK 셀을 PBS로 3 번 세척한 후, FBS가 들어 있지 않은 0.1% TPCK(N-alpha-tosyl-L-phenylalanyl chloromethyl ketone) 처리된-트립신(trypsin) EDTA(ethylenedizminetetraacetic acid)와 P/S(penicillin streptomycin)가 포함된 알파(alpha)-MEM 배지를 각 웰에 넣어주고 세포 배양기에서 배양하였다. 배양 24 시간 후 세포배양된 플레이트를 PBS로 세척해주고 배지를 포함하고 있는 0.1% 한천배지(noble agar)를 사용하여 고정하였다. 배양된 플라크를 미리 준비된 MDCK 세포가 배양된 24 웰 플레이트에 각 웰 당 1 개의 플라크를 접종하고 FBS가 들어 있지 않은 0.1% TPCK 처리된-트립신 EDTA와 P/S가 포함된 알파-MEM 배지를 각 웰에 넣어주고 세포배양기에서 배양하였다. 48 시간 뒤 각 웰의 배지를 취하여 원심분리해서 상층액을 상기와 동일한 방법으로 준비된 MDCK 세포 플라스크에 감염시킨 후 48 시간 배양해서 얻어진 배양액을 원심분리하여 상층액을 마이크로 튜브에 옮긴 후 -80℃의 냉동고에 보관하였다. 대조군으로는 인플루엔자 바이러스를 단독으로 비강투여한 마우스를 사용하였고 실험군은 PMQ와 HA 단백질을 혼합하여 1 주당 1 회 3 주 동안 비강투여한 후 2 주 후 인플루엔자 바이러스를 투여하였다. 바이러스 감염은 실험동물을 마취한 후 바이러스 30 μL를 각 마우스 비강에 10x LD50 투여하였다. 그 결과, 대조군은 바이러스 투여 후 7 일째 전량이 폐사하였으나 PMQ와 HA 단백질 혼합 투여군의 경우 14 일 경과 후까지 모두 생존하였다(도 5의 D).

전술한 본원의 설명은 예시를 위한 것이며, 본원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본원의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

음이온성 고분자, 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 사포닌의 복합체를 포함하는, 아주번트 조성물로서,
상기 음이온성 고분자는 폴리감마글루탐산을 포함하는 것이고,
상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A)를 포함하는 것이고,
상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이며,
상기 음이온성 고분자는 상기 톨-유사 수용체 아고니스트 및 상기 사포닌을 계면활성제 사용 없이 수용액에 분산시키며, 백신의 항원과 정전기적 인력 또는 친유성 결합을 통해 상호작용하는 것이고,
상기 음이온성 고분자는 동결건조 안정제 역할을 함으로써 상기 아주번트 조성물을 최종적으로 분말 형태로 저장할 수 있게 하여, 상기 아주번트 조성물의 상온에서의 보관 안정성을 증가시키는 것인,
아주번트 조성물.
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제 1 항에 있어서,
상기 음이온성 고분자, 상기 톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist), 및 상기 사포닌은 0.5 내지 1 : 0.01 내지 1 : 0.01 내지 1의 중량비 범위로서 포함되는 것인, 아주번트 조성물.
제 1 항 또는 제 8 항에 따른 아주번트 조성물; 및 항원을 포함하는, 백신 조성물.
제 9 항에 있어서,
상기 항원은 단백질, 세포, 바이러스, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 백신 조성물.
음이온성 고분자를 증류수에 용해시켜 제 1 용액을 제조하고,
톨-유사 수용체 아고니스트(toll-like receptor agonist) 및 사포닌을 용매에 용해시켜 제 2 용액을 제조하고, 및
상기 제 1 용액 및 상기 제 2 용액을 혼합하여 교반한 후 동결건조하는 것
을 포함하는, 아주번트 조성물의 제조 방법으로서,
상기 음이온성 고분자는 폴리감마글루탐산을 포함하는 것이고,
상기 톨-유사 수용체 아고니스트는 MPLA(Monophosphoryl lipid A)를 포함하는 것이고,
상기 사포닌은 QS21, Quil A, QS7, QS17, 및 이들의 조합들로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것이며,
상기 음이온성 고분자는 상기 톨-유사 수용체 아고니스트 및 상기 사포닌을 계면활성제 사용 없이 수용액에 분산시키며, 백신의 항원과 정전기적 인력 또는 친유성 결합을 통해 상호작용하는 것이고,
상기 음이온성 고분자는 동결건조 안정제 역할을 함으로써 상기 아주번트 조성물을 최종적으로 분말 형태로 저장할 수 있게 하여, 상기 아주번트 조성물의 상온에서의 보관 안정성을 증가시키는 것인,
아주번트 조성물의 제조 방법.
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