CN104288758A - 聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗，所述疫苗能够预防或治疗肿瘤，所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗自组装形成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇(亲水嵌段)通过共价键和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮碱基结合形成的化合物。胶束疫苗的粒径为10～100nm，所述的胶束多肽疫苗中装载的多肽抗原为长度为5～100个氨基酸的多肽疫苗，根据需要，该胶束多肽疫苗还包含调节机体免疫功能的免疫佐剂。

Description

聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗
技术领域
本发明属于医药生物领域，具体而言，涉及一种以聚乙二醇化磷脂为载体的胶束多肽疫苗，及其制备方法和应用。 
背景技术
以纳米尺度材料作为载体设计的肿瘤治疗性疫苗是治疗肿瘤的新思路。已有的研究表明，利用纳米尺度材料载体携带蛋白抗原，能够提高抗原的免疫原性，这种现象可能与纳米尺度材料相对巨大的比表面积和复杂的结构有关；同时纳米尺度材料载体对蛋白抗原能够起到一定程度的保护，防止蛋白抗原很快地被血液中的蛋白酶和内网系统降解，有利于蛋白抗原发挥作用；另外，携带有蛋白抗原的纳米尺度材料载体易被抗原呈递细胞(antigen present cells,APCs)，特别是树突状细胞(Dendritic Cells,DCs)，摄取和加工，从而使DCs处理和呈递大量蛋白抗原，引发更为有效的免疫反应。使用特定的纳米尺度材料包载肿瘤特异性抗原和免疫佐剂组成肿瘤治疗性疫苗，接种肿瘤患者能够刺激患者的免疫系统，产生杀伤肿瘤细胞的免疫反应，减小甚至清除手术或放、化疗后体内残存的肿瘤病灶。 
目前虽然已经出现多种以纳米尺度材料为载体的肿瘤疫苗设计方案，但都存在一些关键性的技术障碍。以病毒(viruses)、病毒样颗粒(virus-like particles)或病毒颗粒(virosomes)作为载体的肿瘤疫苗(1.Arlen PM,et al.A randomized phase II study ofdocetaxel alone or in combination with PANVAC-V(vaccinia)and PANVAC-F(fowlpox)in patients with metastatic breast cancer(NCI 05-C-0229).Clin Breast Cancer.2006；7:176–179.；2.Gulley JL,et al.Immunologic and prognostic factors associated with overall survival employing a poxviral-based PSA vaccine in metastatic castrate-resistant prostate cancer.Cancer Immunol Immunother.2009)，虽然能够在使用初期刺激机体产生免疫反应，但由于病毒的蛋白成分本身就是有效的抗原同时组成占优，因此引发的免疫反应主要是针对病毒载体本身的抗原而非病毒载体携带的肿瘤特异性抗原，降低了免疫反应的效率，特别是在肿瘤特异性抗原的抗原性比较弱的情况下，这种效应更为明显；而为了提高治疗性疫苗的免疫治疗效果，通常要进行多次免疫，这种情况下前次免疫引发的针对病毒载体本身的免疫反应(主要是抗体反应)，会大大降低后续免疫治疗的效果；此外以常见病毒，例如腺病毒，痘病毒等为载体设计的疫苗，往往因为患者可能的早期病毒感染产生的免疫保护而显著降低疫苗的免疫治疗效果(Huang X,Yang Y.Innate immune recognition of viruses and viral vectors.Hum Gene Ther.2009；20:293–301.)。 
以脂质体为载体的纳米疫苗，载体本身不具有免疫原性，能够有效提高肿瘤特异性抗原的免疫效率，但是，脂质体载体由于尺度和成分的原因，经过皮下接种后其颗粒并不能有效地扩散入引流淋巴结，一部分疫苗成分长时间驻留在接种部位，随之而来的，免疫产生的肿瘤特异性抗原细胞毒性淋巴细胞 (Cytotoxic lymphocytes,CTLs)会有很大一部分迁移至疫苗接种部位而非肿瘤生长部位，大大降低了针对肿瘤的特异性免疫反应(Hailemichael Y,et al.Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8+T cell sequestration,dysfunction and deletion.Nat Med.2013；19(4):465-72.)。另外，由于脂质体制备的特点，得到的产物往往均一性较差，颗粒尺度跨度很大，而且批次之间的重复性也一般，在质量控制上存在一定的难度。 
胶束载体，是一种由同时包含疏水嵌段和亲水嵌段的双亲性聚合物分子自组装成的纳米颗粒，胶束纳米颗粒的组装是聚合物分子在水溶液中自发形成热力学稳定体系，这个过程是由疏水片段从水溶液中撤出并自发堆积聚合引起的自由能降低推动的。与低分子量表面活性剂相比，双亲性聚合物的临界胶团浓度(critical micelle concentration，CMC)更低，这使得聚合物胶束更能对抗溶液的稀释，同时，疏水嵌段组成的胶束核结构紧密，在生理环境中被大量体液稀释后，不容易解离，稳定性更好。双亲性聚合物分子的亲水性嵌段大都选用聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)，聚乙二醇水溶性良好，具有高度水合特性，在胶束颗粒的外壳区域能够为胶束颗粒提供足够的空间位阻。此外，它的生物相容性良好，是通过FDA认证的广泛使用的药用辅料。双亲性聚合物分子的疏水嵌段材料比较丰富，是决定胶束载体载药效率和稳定性的主要因素。根据化学结构不同，疏水嵌段中的亲脂基团可分为三类，聚酯(polyester)衍生物，聚氨基酸(poly(amino acid))衍生物和普郎尼克类(Pluronics)。聚酯类内核嵌段中，聚乳酸(poly(lactic acid),PLA)，聚己内酮(poly(caprolactone),PCL)和聚羟基乙酸(poly(glycolic acid))均为FDA认可的具有良好生物相容性的材料。聚氨基酸类内核嵌段中，聚天冬氨酸(poly(aspartic acid),PAsp)，聚谷氨酸(poly(glutamic acid),PGlu)，聚赖氨酸(poly(L-lysine),PLys)，聚组氨酸(poly(histidine),PHis)等材料已被普遍利用。Pluronics为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷组成的三嵌段共聚物，可以表示为PEOm-PPOn-PEOm。 
聚乙二醇化磷脂是一种新型的双亲性聚合物分子。其亲水嵌段为聚乙二醇，疏水嵌段为磷脂分子。聚乙二醇分子通过共价键与磷脂分子上的含氮碱基结合。目前，聚乙二醇化磷脂作为包载材料主要是用于包载小分子化疗药物，其优点包括：其优点如下：1)疏水内核磷脂可以包载难溶性药物，大大提高药物的溶解能力；2)亲水外壳聚乙二醇可以保护胶束内部的药物分子不被外界吸附或降解，能够帮助药物逃逸网状内皮系统的摄取，延长药物循环时间；3)控制药物的释放，优化药物的体内分布以达到更好的治疗效果(不会引发免疫反应)。但是，有关聚乙二醇化磷脂胶束对蛋白或多肽的包载研究极少，有关聚乙二醇化磷脂制备的胶束作为载体系统开发的肿瘤治疗性疫苗的研究国内外均未见报道。 
单磷酰脂A(Monophosphoryl Lipid A,MPLA)是一类较为常见的免疫佐剂(结构见图9)，其是通过化学修饰来源于沙门氏菌R595的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)而得到的新型的免疫佐剂。与LPS相比，MPLA基本保留了免疫刺激能力，但是内毒素毒性大大降低，因此成为了一种更加安全且有效的免疫佐剂，并已被美国FDA批准作为免疫佐剂进入临床。与LPS发挥作用的分子机制相似，MPLA也是通过与 Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)4相作用，激活其下游与天然免疫相关的信号通路，激活天然免疫反应，促进干扰素γ和肿瘤坏死因子α的表达；与此同时活化树突状细胞，进而进一步激活获得性免疫反应。 
发明内容
本发明涉及一种能够预防和治疗肿瘤的胶束多肽疫苗。 
本发明所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗自组装形成，所述的聚乙二醇化磷脂为聚乙二醇(亲水嵌段)通过共价键和磷脂分子(疏水嵌段)上的含氮碱基结合形成的化合物。 
本发明所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段为分子量500～10000的PEG分子，优选为PEG1500～3000，最优选为PEG2000。 
本发明所述的胶束疫苗的粒径为10～100nm，优选为10～50nm，最优选为20nm。 
本发明所述的多肽疫苗为长度为5～100个氨基酸的多肽疫苗，优选为10～50个氨基酸的多肽疫苗，更优选为20～30个氨基酸的多肽疫苗，最优选为E7多肽或OT-1多肽。 
本发明所述的E7抗原多肽为来源于人16型乳头瘤病毒(HPV16)肿瘤的相关抗原，在N端连接一个棕榈酸分子，即E743-62序列：棕榈酸-GQAEPDRAHYNIVTFCCKCD； 
本发明所述的OT-1多肽为来源于卵清蛋白(OVA)的17个氨基酸的多肽，包含OVA蛋白在H-2Kb分型小鼠特异性CTL表位OVA257-264，氨基酸序列结构为棕榈酸-EQLESIINFEKLTEWKD。 
本发明所述的胶束多肽疫苗还可以包含调节机体免疫功能的免疫佐剂，所述的免疫佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、单磷酰脂A佐剂，优选为单磷酰脂A(MPLA)佐剂。 
本发明所述的胶束多肽疫苗中，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多肽抗原、免疫佐剂的用量摩尔比例范围720：4～160：3～80，最优选摩尔比180：4：3。 
本发明所述的胶束多肽疫苗制剂为溶液形式或冻干形式。 
本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法为： 
(1)以易挥发有机溶剂溶解PEG-PE载体分子、疫苗分子、佐剂分子，制备载体分子溶液、疫苗溶液、佐剂溶液； 
(2)按照特定比例将步骤(1)所获得的载体分子溶液、疫苗溶液、佐剂溶液混匀； 
(3)除去步骤(2)所获得的混合溶液中的全部有机溶剂，使载体分子、疫苗分子和佐剂分子形成分布均匀的混合脂膜； 
(4)以一定量的生理盐水溶解步骤(3)所获得的混合脂膜，温育条件下使脂膜水化均匀，随后室温静置一定时间，获得胶束疫苗溶液； 
(5)将步骤(4)所获得的胶束疫苗溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌； 
(6)根据需要，向步骤(5)所获得胶束疫苗溶液中添加一定量的冻干保护剂后对胶束疫苗溶液进行 冻干，制备胶束疫苗冻干粉。 
本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤(1)中所述的易挥发有机溶剂为，甲醇、氯仿、乙醇或其混合物。 
本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤(3)中所述的除去有机溶剂的方法优选为减压水浴加热旋转蒸发。 
本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤(4)中所述的温育条件优选为55℃水浴孵育30分钟。 
本发明所述的胶束多肽疫苗的制备方法步骤(6)中所述的冻干保护剂优选为浓度为0.05g/ml的甘露醇。 
本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗制剂在治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤包括非实体瘤与实体瘤，所述应用具体为，通过皮下注射或静脉注射的方式，给予患者一定剂量的所述胶束多肽疫苗制剂。 
本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗制剂在预防肿瘤中的应用，所述肿瘤包括非实体瘤与实体瘤，所述应用具体为，通过皮下注射或静脉注射的方式，给予患者一定剂量的所述胶束多肽疫苗制剂。 
本发明还涉及一种抗肿瘤疫苗产品，所述的疫苗产品由所述的胶束多肽疫苗和药学上可接受的辅料组成。 
本发明还涉及所述的胶束多肽疫苗在治疗肿瘤或预防肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤包括非实体瘤与实体瘤。 
附图说明
图1，胶束E7疫苗的透射电镜照片 
图2，胶束E7疫苗的动态光散射粒径分析 
图3，与脂质体装载的E7疫苗相比，胶束E7疫苗能够高效快速的在皮下扩散 
图4，胶束疫苗能够被淋巴结中的树突状细胞和巨噬细胞高效吞噬 
图5A、5B，与脂质体纳米颗粒相比，肿瘤胶束疫苗能够高效的刺激巨噬细胞分泌炎性细胞因子 
图6，与脂质体纳米颗粒相比，胶束疫苗能够高效刺激树突状细胞的成熟、活化 
图7，胶束E7疫苗能够有效产生针对肿瘤特异性抗原的CTL反应 
图8，胶束E7疫苗能够有效降低肿瘤生长速度，延长荷瘤小鼠生存期 
图9，胶束E7疫苗能够完全预防肿瘤切除手术后的肿瘤复发 
图10，MPLA分子结构 
具体实施方式
实施例1，胶束E7疫苗的制备 
E7抗原多肽为来源于人16型乳头瘤病毒(HPV16)肿瘤相关抗原，在N端连接一个棕榈酸分子，即E7-20多肽；E743-62序列：棕榈酸-GQAEPDRAHYNIVTFCCKCD 
储液配制： 
(1)向分装完成的每管1mg的E7-20加入1mL无水甲醇配制成浓度为1mg/mL的E7-20储液； 
(2)将MPLA粉末溶解于甲醇与氯仿1:2混合溶液中配制成浓度为1mg/mL的MPLA储液； 
(3)称取30mg PEG-PE粉末加入3mL氯仿溶解配制成10mg/mL的PEG-PE储液。 
1.胶束疫苗溶液制备，按照表1的处方制备10mL胶束疫苗： 
步骤(1)取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取400μL MPLA储液和1mL E7-20储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀； 
步骤(2)于水浴加温条件下真空旋转蒸发仪除去有机溶剂(转速90转/分钟，水浴40℃)，除去有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水； 
步骤(3)加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的胶束E7疫苗溶液； 
步骤(4)室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用(可保存两周)。 
表1：胶束E7疫苗处方 
脂类/肽(mol/mol) 脂类/MPLA(mass/mass) PEG-PE溶液浓度 MPLA溶液浓度 E7-20溶液浓度
44:1 79:1 5mg/mL 40μg/mL 100μg/mL
2.胶束疫苗冻干粉制备，处方及步骤(1)～(3)同上； 
步骤(4)室温放置2小时后，准确称取0.5g甘露醇加入10mL待冻干样品中，完全溶解后经0.22μm滤膜过滤，按照每瓶1mL分装于无菌小瓶中，置于-80℃预冻过夜； 
步骤(5)将样品真空冷冻干燥36小时(真空度0.1mbar)，得到冻干制剂。 
实施例2，脂肪酸化E7/OT-1抗原胶束的包封率测定 
合成带有罗丹明荧光修饰的脂肪酸化E7抗原多肽和OT-1抗原多肽(棕榈酸-EQLESIINFEKLTEWKD)，脂肪酸化的抗原多肽无法溶于水中因而形成悬浊液，而脂肪酸化抗原多肽被PEG-PE胶束装载后则形成稳定的溶液，由此可以将游离的抗原多肽和装载了抗原多肽的胶束分离开来，继而根据溶液中游离抗原多肽的含量的变化计算得到有效的抗原多肽包封率，包封率＝(总抗原量-游离抗原量)/总抗原量x100％。 
按照表2和表3的配比，制备含不同比例多肽的胶束，制备工艺方法同实施例1所述的胶束疫苗溶液制备步骤方法。将制备得到的不同比例胶束疫苗溶液，经过14000g高速离心30分钟，分离非溶解状态的游离的抗原多肽和溶液中的胶束包载的抗原。根据多肽标记的罗丹明荧光的最大激发波长为535nm，最大发射波长590nm，通过荧光法分光光度法检测溶液中的抗原含量，继而根据公式计算得到有效的抗原多肽包封率(结果见表2、表3第三行)。可见，当PEG-PE与脂肪酸修饰多肽的质量比例大于或等于10:1的条件下包封率约为100％。 
表2：不同的PEG-PE与E7抗原多肽质量比条件下的胶束包封率 
脂：肽(w/w) 50:1 20:1 10:1 5:1 2:1 1:1
 
脂：MPLA(w/w) 100:1 100:1 100:1 100:1 100:1 100:1
包封率(％) 100.00 100.00 100.00 97.99 67.76 25.48
表3：不同的PEG-PE与OT-1抗原多肽质量比条件下的胶束包封率 
脂：肽(w/w) 50:1 20:1 10:1 5:1 2:1 1:1
脂：MPLA(w/w) 100:1 100:1 100:1 100:1 100:1 100:1
包封率(％) 100.00 100.00 100.00 91.76 40.10 27.91
实施例3，胶束多肽疫苗的物理性状表征 
1、透射电子显微镜对胶束E7疫苗的形态观察 
将实施例1中制备的胶束E7疫苗溶液用去离子水稀释，使PEG-PE浓度稀释至0.1mg/mL，取10μL的样品溶液，滴加到经过辉光放电亲水化处理的镀碳膜铜网上，吸附30秒后用滤纸吸掉样品溶液，滴加10μL的醋酸双氧铀(浓度为2％(w/v))染色30秒，滤纸吸干染色液，用透射电子显微镜(Tectai20)观察负染后的胶束形态。结果如图1所示，透射电镜观察胶束疫苗是呈均一、球形的纳米颗粒。 
2、动态光散射法对胶束E7疫苗粒径分析 
将实施例1中制备的胶束E7疫苗溶液用去离子水稀释，使PEG-PE浓度稀释至1mg/mL。将样品混匀后静置2小时。取20μL样品加入经去离子水清洗大于3次的石英比色杯中，避免产生气泡。用擦镜纸将比色杯透光部分擦拭干净，放入动态光散射仪(271-DPN)的样品池，预热至设定温度25℃，设定方法检测时间为每次10秒，每组检测10次。结果如图2所示，动态光散射分析显示胶束的粒径分布在10-20nm之间。 
实施例4，接种后的皮下扩散行为分析 
1、样品制备： 
(1)罗丹明E7溶液制备 
取20μL的10mg/mL罗丹明标记的脂肪酸化E7多肽(序列：棕榈酸-GQAEPDRAHYNIVTFCCKCD，罗丹明标记在氨基酸K，合成于吉尔生化有限公司)的DMSO储液，加入0.980mL无菌水中，得到浓度为0.2mg/mL的荧光多肽溶液。 
(2)胶束罗丹明E7制备 
称取10mgPEG-PE粉末溶于1mL氯仿于试管中，取0.2mL罗丹明标记的脂肪酸化E7多肽的甲醇溶液(1mg/mL)，使胶束中，按照实施例1的方法轻轻振摇其混合均匀，氮气吹干使其形成均匀薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分。加入1mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得浅紫色均一透明的溶液，其中荧光多肽浓度为0.2mg/mL。室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
(3)脂质体罗丹明E7制备 
分别取7mg DPPC、3mg胆固醇分别溶于氯仿中后混合于试管，取0.2mL的罗丹明标记的脂肪酸化E7多肽的甲醇溶液(1mg/mL)，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入1mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理1分钟。之后用Mini-Extruder(Avanti)挤出仪经过孔径为0.4μm的聚碳酸脂滤膜挤压，至少11次过滤挤压，最终得到粒径400nm左右的脂质体,，其中荧光多肽浓度为0.2mg/mL。 
2、实验分组与结果 
裸鼠9只，分为3组，每组3只。分别用上述几种制剂在裸鼠肩部相同位置皮下注射100μL样品。在注射后的0，1，3，6，24小时，4天，6天，7天，以活体成像观察荧光制剂在小鼠体内的扩散情况。 
结果如图3所示，可见： 
(1)脂肪酸化E7抗原在水溶液中溶解度较差，因此在注射位点皮下局部潴留现象明显； 
(2)胶束抗原多肽疫苗，在皮下扩散速度较快，扩散范围较大； 
(3)脂质体抗原多肽疫苗，与胶束抗原多肽疫苗相比，脂质体的皮下局部的潴留时间长，较难扩散。 
综上，说明胶束是更为适合皮下给药的制剂形式。 
实施例5，引流淋巴结分布 
1、样品制备： 
(1)FITC标记的PEG-PE胶束制备： 
称取10mgPEG-PE粉末溶于1mL氯仿于试管中，取0.6mL FITC-PEG-PE(FITC标记的PEG-PE)氯仿储液(1mg/mL)，使胶束中FITC-PEG-PE分子相对于全部的PEG-PE分子的摩尔比为5％，按照实施例1的方法轻轻振摇其混合均匀，氮气吹干使其形成均匀薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分。加入1mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得亮黄色均一透明的溶液。室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
(2)罗丹明标记的脂质体制备： 
分别取7mg DPPC、3mg胆固醇分别溶于氯仿中后混合于试管，取50μL Rhodamine-PE(罗丹明标记的PE分子)氯仿储液(2mg/mL)，使Rho-PE相对于全部的脂质分子的质量比为1％，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入1mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理1分钟。之后用Mini-Extruder(Avanti)挤出仪分别经过孔径为0.4μm，0.1μm的聚碳酸脂滤膜挤压，至少11次过滤挤压，最终得到粒径100nm左右的单室脂质体。 
2.试验方法 
将27只雌性C57BL/6小鼠，分成3组，每组9只，分别在肩部两侧各皮下注射50μL的FITC胶束疫苗、罗丹明脂质体疫苗，以注射生理盐水作为空白对照。在注射后1，2，3天分别从各组取3只小鼠，分离两侧的腋下淋巴结于1.5mL的EP管中，用眼科直剪将淋巴结轻轻剪碎后，每管加200μL消化液(7.5ml  RMPI1640培养基，2％胎牛血清，0.5mg/ml胶原酶IV，40U/ml脱氧核糖核酸酶I，10mM HEPES)，经37℃消化30分钟后，每管加4mL完全培养基中和，经过70μm筛网，500g离心5分钟，收集细胞用FACS buffer重悬，至5×105细胞/mL。细胞悬液按照说明书中比例加入CD11c-APC抗体4℃孵育30分钟，用FACS buffer洗一次，流式细胞分选技术分析荧光阳性的淋巴结DC细胞比例。 
结果与结论：与脂质体相比，胶束能够更多的被淋巴结树突细胞吞噬。且在接种2天后淋巴结内吞噬胶束的树突细胞比例达到最多。说明胶束比脂质体更加靶向淋巴结树突细胞(图4)。 
实施例6，MPLA胶束体外刺激巨噬细胞实验 
样品制备： 
(1)、按照实施例1所述方法制备胶束E7疫苗溶液：取1mL PEG-PE储液于试管内，准确量取100μL MPLA储液和200μL E7-20储液加入试管，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀；氮气吹干除去有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水；加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的溶液。其中MPLA浓度为100μg/mL。 
(2)、按照与(1)相同的方法制备胶束MPLA溶液：取10mg PEG-PE粉末分别溶于氯仿中后混合于试管，另取100μL MPLA储液加于该试管中，混合均匀后，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入4mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟。 
(3)、与(1)相同浓度的MPLA对照：取100μL的MPLA储液于试管中，以氮气吹干有机溶剂，在真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分。加入1mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理5-10分钟，制备成为100μg/mL的MPLA混悬液。 
(4)、以薄膜水化法联合挤出法制备MPLA脂质体，制备方法：分别取7mg DPPC、3mg胆固醇分别溶于氯仿中后混合于试管，另取100μL MPLA储液加于该试管中，混合均匀后，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入1mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理1分钟使脂膜脱离。之后利用Mini-Extruder(Avanti)挤出法分别经过孔径为0.4μm，0.1μm的聚碳酸脂滤膜，至少11次过滤，最终得到100nm左右的单室脂质体。 
(5)、与(4)相同脂含量的空载脂质体，制备方法：分别取7mg DPPC、3mg胆固醇分别溶于氯仿中后混合于试管，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入1mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理1分钟使脂膜脱离。之后利用Mini-Extruder(Avanti)挤出仪分别经过孔径为0.4μm，0.1μm的聚碳酸脂滤膜，至少11次过滤，最终得到100nm左右的单室脂质体。 
小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7(购自中国科学院细胞库)用含10％优质胎牛血清的DMEM培养基培养，培养条件5％二氧化碳，温度37℃。将细胞接种于12孔板，细胞计数3×106/mL，每孔1mL培养基，待贴 壁过夜后进行处理， 
处理方式(1)：生理盐水作为空白对照，MPLA，胶束疫苗，MPLA胶束为实验组，各实验组中MPLA的作用终浓度为100ng/mL。各对照组中载体量或溶剂量与对应的实验组一致，细胞经过处理2小时后收集培养基上清，ELISA检测培养基上清中细胞外分泌的细胞TNF-α以及其他细胞因子的浓度，结果见图5A。 
处理方式(2)：生理盐水作为空白对照，载体对照组为空载胶束和空载脂质体，MPLA，MPLA胶束，MPLA脂质体为实验组。各实验组中MPLA的作用终浓度为100ng/mL。各对照组中载体量或溶剂量与对应的实验组一致，细胞经过处理3小时后收集培养基上清，ELISA检测培养基上清中细胞外分泌的细胞TNF-α以及其他细胞因子的浓度，结果见图5B。 
结果与结论：MPLA为TLR4受体的配体，促炎性细胞因子TNF-α的分泌量反映了巨噬细胞被MPLA的激活程度。MPLA胶束与胶束疫苗具有相当的活化细胞能力(图5A)，与MPLA相比能够更大程度的激活巨噬细胞，而脂质体不能提高MPLA的刺激作用，胶束MPLA增强了MPLA的佐剂活化巨噬细胞的效率(图5B)。 
实施例7，胶束多肽疫苗的体外刺激树突状细胞实验 
骨髓诱导的树突细胞(BMDC)的获取方法如下：6-8周龄雌性C57BL/6小鼠一只，取股骨、胫骨骨髓于无菌PBS中，将吹散的细胞悬液经过70μm筛网过滤，裂解红细胞并用PBS洗1-2遍，将细胞种于100mm(或90mm)培养皿中，细胞数2×106/10mL/皿。培养基成分：RPMI-1640，10％FBS，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，2mM L-谷氨酰胺，50μMβ-巯基乙醇，rmGM-CSF(重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)200U/mL，rmIL-4(重组小鼠白细胞介素4)200U/ml。培养条件：5％二氧化碳，温度37℃。培养基第3天补液10mL，第6天换液10mL。经过8天的诱导，收集所有的悬浮细胞，经流式细胞分选技术分析鉴定，以CD11c(树突细胞表面标记物分子)作为DC细胞标志物，DC细胞纯度为90％以上。 
按照实施例6中样品制备方法制备PEG-PE空载胶束，MPLA混悬液、MPLA胶束，胶束疫苗溶液，其中MPLA浓度均为100μg/mL。将培养8天的骨髓诱导的树突细胞收集并接种于24孔板中，细胞计数5×105/mL，每孔培养基总量1mL。接种后直接用制备好的样品处理，以溶剂生理盐水作为空白对照组，空载胶束作为载体对照组，MPLA、MPLA胶束和胶束疫苗为实验组，各实验组中MPLA的作用终浓度为100ng/mL。各对照组中载体量或溶剂量与对应的实验组一致。经过24处理后，收集细胞培养基上清和细胞。ELISA检测培养基上清中细胞外分泌的细胞TNF-α，IL-6的浓度，流式细胞分选技术分析成熟DC的表面标志物的表达程度。 
结果：树突细胞为疫苗在体内的主要效应细胞，树突细胞表面CD80(树突细胞活化标志分子)分子的表达以及TNF-α，IL-6等细胞因子的分泌反映了树突细胞的活化程度。实验证明胶束MPLA与MPLA相比能够更有效的激活树突细胞(图6)。 
实施例8，胶束E7疫苗免疫活化杀伤性T细胞(CTL)实验 
样品制备： 
(1)、按照实施例1方法制备胶束E7疫苗溶液。所得胶束疫苗中成分PEG-PE浓度2.5mg/mL，MPLA浓度为25μg/mL，E7-20浓度为50μg/mL。 
(2)、制备无载体装载的MPLA与E7-20混合对照组。取100μL的MPLA储液，200μL的E7-20储液均匀混合于试管中，以氮气吹干有机溶剂，在真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分。加入4mL生理盐水，55℃温水浴30分钟水化脂膜，其间间歇性超声处理5-10分钟，制备成为MPLA浓度为25μg/mL，E7-20浓度为50μg/mL的混悬液。 
(3)、以薄膜水化法联合挤出法制备脂质体疫苗。制备方法：分别称取取7mg DPPC、3mg胆固醇分别溶于氯仿中后混合于试管，另取100μL MPLA储液、200μL的E7-20储液加于该试管中，混合均匀后，氮气吹干使其形成均匀薄膜，真空干燥器中过夜彻底去除有机溶剂和水分，加入4mL生理盐水水化，55℃温水浴30分钟，其间超声处理3分钟使脂膜脱离。之后利用Mini-Extruder(Avanti)挤出法分别经过孔径为0.4μm，0.1μm的聚碳酸脂滤膜，至少11次过滤，最终得到100nm左右的单室脂质体。 
作为对照的为(2)所述无载体MPLA+E7-20，(3)所述脂质体疫苗。 
将雌性C57BL/6小鼠分3组，每组3只，疫苗接种方式采用皮下多点注射每只鼠100μL，以生理盐水溶液作为空白对照组，其他实验各组MPLA的给药剂量为125μg/kg，E7的给药剂量为250μg/kg，胶束和脂质体两种制剂所含脂的给药剂量为12.5mg/kg。6天后分离小鼠淋巴结，过70μm筛网，将淋巴结细计数调整为1×107/mL，每孔100μL于圆底96孔板。加3μg/mL brefeldin A(BFA)和5μg/mL E749-57(氨基酸序列为RAHYNIVTF)共孵育6h后收集细胞。调整细胞浓度为1×106，先加CD8抗体20分钟。染色后的细胞经过4％多聚甲醛固定15分钟，0.1％tritonX100通透10分钟后，进行胞内染色，加IFNγ抗体孵育20分钟。流式细胞分选技术分析淋巴结CD8+T细胞中特异性激活的IFNγ+CD8+T细胞所占的百分比。 
结果：胶束多肽疫苗比脂质体疫苗引起更强的特异性CTL反应(图7)。 
实施例9，胶束多肽疫苗的免疫治疗效果评价实验 
样品制备： 
(1)按照实施例1的方法制备10mL胶束E7疫苗溶液，其中各成分浓度分别为PEG-PE：5mg/mL，MPLA：40μg/mL，E7-20：100μg/mL。 
(2)制备10mL与(1)同浓度的MPLA/PEG-PE胶束。取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取400μL MPLA储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀，于真空旋转蒸发仪出去有机溶剂(氯仿和甲醇)，转速90r/min，水浴40℃，抽干有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分。加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的溶液。室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
(3)制备10mL与(1)同浓度的E7/PEG-PE胶束。取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取1mL E7-20储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀，于真空旋转蒸发仪出去有机溶剂(氯仿和甲醇)， 转速90r/min，水浴40℃，抽干有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分。加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的溶液。室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
取30只雌性C57BL/6小鼠肩部皮下接TC-1细胞，每只接5×104细胞。接瘤后第8天，按照肿瘤大小平均将其分为4组，每组5或6只。第8天在小鼠生长肿瘤同侧相邻部位皮下接种各组疫苗，以生理盐水作为空白对照，实验组为胶束疫苗，以及两个对照组MPLA/PEG-PE胶束和E7/PEG-PE胶束。皮下免疫接种注射剂量100μL/只，给药剂量分别为PEG-PE：25mg/kg，MPLA：200μg/kg，E7-20：500μg/kg。以相同的方式在第11，15，18天各接种一次。自第8天起至第40天监测肿瘤体积，并记录小鼠的生存期。 
结果：与空白对照组相比，三个治疗组对肿瘤的生长都有一定的抑制作用，以胶束E7疫苗组的效果最为显著，其中有两只出现肿瘤消退的现象。小鼠的生存期记录显示，MPLA/PEG-PE胶束组和E7/PEG-PE胶束组两个对照组与空白对照组生存期无显著差异，但胶束E7疫苗组能够显著延长小鼠生存期，有效地控制肿瘤的生长(图8)。 
实验例10，胶束疫苗预防手术后肿瘤复发评价实验 
样品制备： 
(1)、按照实施例1的方法制备10mL胶束E7疫苗溶液，其中各成分浓度分别为PEG-PE：5mg/mL，MPLA：40μg/mL，E7-20：100μg/mL。 
(2)、制备10mL与(1)同浓度的胶束MPLA： 
取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取400μL MPLA储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀； 
于真空旋转蒸发仪出去有机溶剂(氯仿和甲醇)，转速90r/min，水浴40℃，抽干有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分； 
加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的溶液。室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
(3)、制备10mL与(1)同浓度的不含MPLA的胶束E7： 
取5mL PEG-PE储液于旋蒸瓶内，准确量取1mL E7-20储液加入旋蒸瓶，轻轻振摇使之与PEG-PE溶液混合均匀； 
于真空旋转蒸发仪出去有机溶剂(氯仿和甲醇)，转速90r/min，水浴40℃，抽干有机溶剂后PEG-PE与MPLA、E7-20形成分布均匀的薄膜，于真空干燥器内过夜彻底除去残留的有机溶剂和水分； 
加入10mL生理盐水，于55℃水浴孵育30分钟水化脂膜，得外观均一无色透明的溶液，室温静置2小时后，经0.22μm滤膜过滤除菌后4℃储存备用。 
预防手术后肿瘤复发评价动物实验： 
(1)取20只雌性C57BL/6小鼠分成两组，肩部皮下接种50000TC-1肿瘤细胞。 
(2)接种后21天，肿瘤大小在500mm3时进行外科手术切除肿瘤，缝合伤口，用碘伏进行局部皮肤消毒处理。 
(3)免疫预防组在肿瘤切除后，皮下接种100μL胶束疫苗，给药剂量分别为PEG-PE：25mg/kg，MPLA：200μg/kg，E7-20：500μg/kg；另外一组以生理盐水作为空白对照组。 
(4)以相同的方式分别在第7天和第14天各加强接种一次，记录小鼠肿瘤出现情况。 
(5)第42天时，给两组没有出现肿瘤复发的小鼠皮下再接种2×105TC-1肿瘤细胞。记录小鼠肿瘤出现情况。 
结果与结论：与空白对照组相比，胶束疫苗的接种对肿瘤手术切除后的肿瘤复发具有完全的抑制作用。结果如图9所示，胶束疫苗能够完全抑制手术切除后肿瘤的复发，在术后42天额外再继续接种肿瘤细胞的情况下，给药组依然能够在术后70天完全抑制肿瘤的生长。 
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，并不解释为对本发明保护范围的限制。 

Claims (10)

1.一种胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的胶束多肽疫苗由聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗自组装形成。
2.根据权利要求1所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，
所述的聚乙二醇化磷脂分子中的聚乙二醇亲水嵌段为分子量500～10000的PEG分子，优选为PEG1500～3000，最优选为PEG2000；
所述的多肽疫苗为长度为5～100个氨基酸的多肽疫苗，优选为10～50个氨基酸的多肽疫苗，最优选为20～30个氨基酸的多肽疫苗。
3.根据权利要求1或2任一所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的聚乙二醇化磷脂(PEG-PE)和多肽疫苗的摩尔比为720：4～160，优选摩尔比180：4。
4.根据权利要求1或2任一所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，所述的胶束多肽疫苗进一步包含免疫佐剂，所述的免疫佐剂包括弗氏佐剂、氢氧化铝佐剂、单磷酰脂A(MPLA)佐剂，优选为单磷酰脂A佐剂。
5.根据权利要求4所述的胶束多肽疫苗，其特征在于，聚乙二醇化磷脂聚合物分子、多肽疫苗、免疫佐剂的摩尔比例范围720：4～160：3～80，优选摩尔比180：4：3。
6.权利要求1-5任一所述的胶束多肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)，以易挥发有机溶剂溶解PEG-PE载体分子、疫苗分子、佐剂分子制备载体分子溶液、疫苗溶液、佐剂溶液；
步骤(2)，按目标胶束多肽疫苗中各成分的比例将步骤(1)所获得的载体分子溶液、疫苗溶液、佐剂溶液混匀；
步骤(3)，除去步骤(2)所获得的混合溶液中的全部有机溶剂，使载体分子、疫苗分子和佐剂分子形成分布均匀的混合脂膜；
步骤(4)，以生理盐水溶解步骤(3)所获得的混合脂膜，温育条件下使脂膜水化均匀，随后室温静置一定时间，获得胶束疫苗溶液；
步骤(5)，将步骤(4)的胶束疫苗溶液用0.22μm的滤膜过滤除菌。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，该方法还包括：
步骤(6)，向所获得胶束疫苗溶液中添加一定量的冻干保护剂后对胶束疫苗溶液进行冻干，获得胶束疫苗冻干粉剂。
8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，
步骤(1)所述的易挥发有机溶剂为，甲醇、氯仿、乙醇或其混合物；
步骤(3)所述的除去有机溶剂的方法为减压水浴加热旋转蒸发；
步骤(4)所述的温育条件为55℃水浴孵育30分钟；
步骤(6)所述的冻干保护剂为0.05g/ml的甘露醇。
9.一种用于治疗或预防肿瘤的疫苗，所述的疫苗由权利要求1-5任一所述的胶束多肽疫苗和药学上可接受的辅料组成。
10.权利要求1-5任一所述的胶束多肽疫苗或权利要求9所述疫苗在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
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