CN104628880B - 红毛五加多糖、提取及提纯方法、组成分析方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种红毛五加多糖的提取方法、提纯方法、组成分析方法以及该提纯后的红毛五加多糖及其用途，所述提取方法包括A、原料预处理；B、分步酶解；C、液液萃取；D、醇沉，得红毛五加粗多糖，该方法通过独特的原料预处理、分步酶解等技术特征的组合/协同作用，从而以良好的产率和纯度而得到了红毛五加粗多糖；在得到粗多糖的基础上，通过离子柱层析和：凝胶柱层析而得到了纯度很高的提纯后多糖，进而通过独特的组成分析方法对该多糖进行了组成分析，明确了其组分构成，并发现该提纯后多糖可用于调节T细胞亚群和/或提高IgM表达水平，从而可用于医药领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种天然植物活性成分、提取及提纯方法、组成分析方法和用途，更特别地涉及一种红毛五加多糖、提取及提纯方法、组成分析方法及其用途，属于植物活性成分及其提取、分析和应用领域。
背景技术
中药红毛五加皮是五加科五加属红毛五加(Acanthopanax giraldiiHams)的茎皮，是我国传统的著名药材，在中药领域有着广泛的应用。
红毛五加皮性温、味辛，入肝、肾经，具有多种药用功能，如祛风湿、通关节、强筋骨等功效，在临床上主治痿痹、拘挛疼痛、风寒湿痹、足膝无力、皮肤风湿及阴痿囊湿等多种疾病。
虽然对红毛五加的研究的日益深入，人们已经从红毛五加中分离的了多种多糖成分，该成分具有显著的药物活性。大量实验研究发现，红毛五加中多糖成分具有显著的抗病毒、抗肿瘤、抗炎、保肝等作用。
也正是由于红毛五加多糖的如此显著作用，人们对其提取和纯化方法等进行了大量的深入研究，取得了一定的成果，例如：
施亚琴等人(“红毛五加多糖的提取及含量测定”，《华西药学杂志》，1994年，第9卷第2期，73-74页)公开了一种红毛五加多糖的提取方法，是将红毛五加皮粉碎，置于索氏抽提器中，依次用石油醚、乙醚、乙醇进行回流；残渣用水回流提取，合并提取液，滴加NaOH溶液，减压浓缩，再加入乙醇，静置、过滤，沉淀用乙醇、丙酮反复洗涤，得到疏松的红毛五加多糖纯品。
郭辉等人(“红毛五加粗多糖脱蛋白工艺比较”，《现代中药研究与实践》，2004年，第18卷第6期，53-55页)公开了一种红毛五加粗多糖的脱蛋白研究，首先将红毛五加茎皮经水提醇沉法得到红毛五加粗多糖，然后分别考察了Sevag法脱蛋白和三氯乙酸脱蛋白，结果发现前者效果要优于后者。
郭辉等人(“用高效凝胶色谱法测定红毛五加多糖组分的分子量”，《中国药师》，2005年，第8卷第7期，551-552页)公开了将红毛五加茎皮水提、醇沉、Sevag脱蛋白，透析除去小分子物质，然后上DEAE-纤维素DE 23阴离子交换层析柱纯化，得到红毛五加精制多糖，再上Sephadex G-100层析柱分离，氯化钠洗脱，得到多个均一组分。
CN1073599A公开了一种红毛五加多糖及其制剂的制备方法，所述方法为：将红毛五加茎皮经分选除杂，用粗粉碎机轧碎，在煮提锅中煎煮三次，将三次煮提滤液混合、过滤，其滤液减压浓缩至呈现稀流浸膏状，放凉，置于离心机中离心分离，取出上清液，弃去沉淀物。将上清液加入85％以上的乙醇充分搅动，静置，上清液去回收乙醇，粗多糖沉淀物离心甩干，用乙醇洗涤，然后冷冻干燥，粉碎，包装。该方法得到的红毛五加多糖收率高，步骤简便，成本低廉，制备的多种剂型，通过药效学实验证明具有调节人体免疫功能，防治艾滋病，抗肿瘤的作用。
CN1834108A公开了一种从红毛五加茎皮中提取、分离、纯化得到的红毛五加多糖，所述多糖的重均分子量在20000-40000道尔顿之间，主要由阿拉伯半乳聚糖蛋白、鼠李糖半乳糖醛酸聚糖、半乳糖醛酸聚糖和阿拉伯半乳聚糖组成。使用适量的该红毛五加复合多糖，加入一种或多种药学上可以接受的辅剂，可制成注射剂，该注射剂可用于治疗中性粒细胞减少症、贫血、血小板减少症，病毒感染性疾病和作为抗癌的辅助剂，可单独用药，也可与其它多糖或G-CSF等联合用药。
CN103724444A公开了一种红毛五加多糖的超声波提取方法，所述方法包括：将红毛五加于70-80℃烘干，粉碎机粉碎；按照红毛五加与水重量比为1:20-22加水浸泡，并以超声波辅助提取红毛五加多糖，过滤后得提取液；将提取液减压浓缩至原体积1/10-1/12，加入三氯醋酸充分溶解后静置10-12小时，过滤收集滤液；滤液中加入乙醇充分搅拌、静置，收集沉淀；用水复溶后冷冻干燥，既得红毛五加多糖。所述方法可显著提高多糖提取率，缩短提取时间、能耗低，所得红毛五加多糖对化疗药物导致的免疫力低下，有明显的改善作用。
如上所述，现有技术中已经公开了多种红毛五加多糖的提取方法、组成分析以及用途研究等，但这些方法均存在一定的缺陷，例如提取得率低、提取方法单一等，且得到的红毛五加多糖分子量在某个范围内，无法得到其它分子量范围内的红毛五加多糖，以及组成分析方法仍有待扩展和改善等等。因此，如何以更高的得率得到红毛五加多糖，并对其进行特定的组成分析方法等，这些仍然是广大科研工作者的目标，这也正是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。
发明内容
为了研究红毛五加多糖的新颖提取方法、组成分析方法及开发新的用途，本发明人对此进行了大量深入的研究，在付出了充分的创造性劳动和经过深入的科学探究后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明主要涉及一种红毛五加多糖、提取方法、组成分析方法及其用途。
第一个方面，本发明涉及一种红毛五加粗多糖的提取方法，所述方法包括如下步骤：
A、原料预处理；
B、分步酶解；
C、液液萃取；
D、醇沉，得红毛五加粗多糖。
在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤A具体如下：
将干燥的红毛五加茎皮粉碎，过100目筛，得到红毛五加粉末；将该粉末用丙酮浸泡，使其充分膨胀，然后过滤，得到膨胀后粉末；将该膨胀后粉末加入到索氏抽提器中，用乙酸乙酯与氯仿的混合溶剂回流提取1-2小时，趁热过滤，得到料渣；将料渣充分干燥完全，得到干燥残渣。
其中，在步骤A中，所述红毛五加粉末与丙酮的质量体积比为1:4-8g/ml，即每1g红毛五加粉末用4-8ml丙酮浸泡，例如可为1:4g/ml、1:6g/ml或1:8g/ml。
其中，在步骤A中，进行索氏抽提时，乙酸乙酯与氯仿的体积比为1:2-3，例如可为1:2、1:2.5或1:3。
其中，在步骤A中，所述膨胀后粉末与混合溶剂(即乙酸乙酯与氯仿的混合溶剂)的质量体积比为1:5-8g/ml，即每1g膨胀后粉末使用5-8ml混合溶剂，例如可为1:5g/ml、1:6g/ml、1:7g/ml或1:8g/ml。
在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤B具体如下(也即步骤B包括如下步骤)：
B1：室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中，再加入混合酶，搅拌完全，得到残渣酶溶液；调节该溶液的pH为6.5-7.5，在温度T1下保温酶解50-120分钟，得到初次酶解液；
B2：将初次酶解液进行梯度升温，当温度达到T2时，加入木瓜蛋白酶，并在该温度下保温酶解40-70分钟，然后以10-15℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持10-15分钟，使酶灭活，得到二次酶解液。
其中，在步骤B1中，干燥残渣与去离子水的质量比为1:5-8，例如可为1:5、1:6、1:7或1:8。
其中，在步骤B1中，所述干燥残渣与混合酶的质量比为1:0.004-0.01，例如可为1:0.004、1:0.006、1:0.008或1:0.01。
其中，在步骤B1中，所述混合酶为纤维素酶与木聚糖酶的混合物，两者的质量比为1:0.2-0.6，例如可为1:0.2、1:0.4或1:0.6。
其中，在步骤B1中，得到残渣酶溶液后，调节该溶液的pH为6.5-7.5，例如可为6.5、7或7.5，调节的手段例如可通过加入1mol/L的盐酸水溶液或1mol/L的NaOH水溶液来实现。
其中，在步骤B1中，所述温度T1为35-45℃，例如可为35℃、40℃或45℃；在该温度下酶解50-120分钟，例如50分钟、70分钟、90分钟、110分钟或120分钟。
其中，在步骤B2中，所述温度T2为60-75℃，例如可为60℃、65℃或70℃。
其中，在步骤B2中，所述梯度升温(即“将初次酶解液进行梯度升温”中的“梯度升温”)为4-6℃/分钟，优选为5℃/分钟。
其中，在步骤B2中，所述木瓜蛋白酶与步骤B1中干燥残渣的质量比为1:0.008-0.012，例如可为1:0.008、1:0.01或1:0.12。
其中，步骤B2中的温度T2与步骤B1中的温度T1的差值应为21-29℃，即21℃≤T2-T1≤29℃，优选T2-T1＝25℃。
在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤C具体如下(也即步骤C包括如下步骤)：
C1：将步骤B2得到的二次酶解液过滤，将所得滤液浓缩至其体积的1/10-1/20，得到浓缩液，然后离心，分离出上清液1；将上清液1再次离心，分离出上清液2；
C2：将乙酸乙酯加入到上清液2中，充分振荡、混合，静置分层，分出水相。
其中，在步骤C1中，将滤液浓缩至其体积的1/10-1/20，例如1/10、1/15或1/20。
其中，在步骤C1中，“上清液1”和“上清液2”中的数字“1”和“2”只是对所得到的不同上清液的指代，并无特定的具体含义。
其中，在步骤C2中，乙酸乙酯与上清液2的体积比为1.5-3:1，例如可为1.5:1、2:1、2.5:1或3:1。
在本发明的红毛五加粗多糖的提取方法中，所述步骤D具体如下(也即步骤D包括如下步骤)：
D1：向步骤C2得到的水相中加入无水乙醇，搅拌，静置，过滤，得沉淀；
D2：将沉淀充分干燥，用水复溶后，冷冻干燥，得到冻干粉，即红毛五加粗多糖。
其中，在步骤D1中，所述水相与无水乙醇的体积比为1:3-4，例如可为1:3、1:3.5或1:4。
其中，在步骤D2中，冷冻干燥的温度为-30～-20℃，例如可为-30℃、-25℃或-20℃。
本发明人发现，使用上述方法得到的红毛五加粗多糖，具有良好的收率和纯度：其收率要显著高于现有技术中的收率，而且纯度良好，从而为红毛五加多糖的提取提供了一种全新的方法，具有良好的研究价值和应用潜力。
第二个方面，本发明涉及一种红毛五加多糖的提纯方法，所述方法包括如下步骤：
S1：按照上述红毛五加粗多糖的提取方法，即按照上述步骤A-D的提取方法，得到红毛五加粗多糖；
S2：离子柱层析，得到离子柱层析液；
S3：凝胶柱层析，后处理，得到提纯后红毛五加多糖。
在本发明的红毛五加多糖的提纯方法中，所述步骤S2具体如下(也即步骤S2包括如下步骤)：
S2-1：将所述红毛五加粗多糖(即步骤D2中得到的冻干粉)溶于Tris-HCl缓冲溶液1中，得到上样溶液；
S2-2：将上样溶液用规格为2.6cm×60cm(即直径2.6cm，高度60cm)的DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱进行层析分离，先用Tris-HCl缓冲溶液2洗脱，流速为1ml/分钟，洗脱200-220分钟，完成后再用含梯度浓度NaCl的Tris-HCl缓冲溶液3进行洗脱，流速为2ml/分钟，继续洗脱260-300分钟(即重新计时，不在Tris-HCl缓冲溶液2洗脱的200-220分钟内)，并收集第80-180分钟内(即为该次洗脱所用时间260-300分钟的第80-180分钟内)的洗脱液；将该洗脱液减压浓缩至原体积的1/10-1/15，得到离子柱层析液。
其中，在步骤S2-1中，所述红毛五加多糖冻干粉与Tris-HCl缓冲溶液1的质量体积比为1:80-120g/ml，即每1g红毛五加多糖冻干粉溶于80-120ml所述Tris-HCl缓冲溶液1中，例如可为1:80g/ml、1:100g/ml或1:120g/ml。
其中，在步骤S2-1和步骤S2-S2中，所述Tris-HCl缓冲溶液1、Tris-HCl缓冲溶液2和Tris-HCl缓冲溶液3的浓度均为0.05mol/L，pH值均为7.3。
其中，步骤S2-1中的所述红毛五加多糖冻干粉与步骤S2-2中的Tris-HCl缓冲溶液2(即用来洗脱的Tris-HCl缓冲溶液)的质量体积比为1:180-250g/ml，即相对于每1g红毛五加多糖冻干粉使用180-250ml所述Tris-HCl缓冲溶液2进行洗脱，例如可为1:180g/ml、1:200g/ml、1:220g/ml、1:240g/ml或1:250g/ml。
其中，在步骤S2-2中，所述“含NaCl的Tris-HCl缓冲溶液3”中的NaCl的梯度浓度为从0线性增大至0.8mol/L(具体可见附图1，即图1中的对应右纵坐标的斜直线)。
其中，在步骤S2-1和S2-2中的“Tris-HCl缓冲溶液1”、“Tris-HCl缓冲溶液2”和“Tris-HCl缓冲溶液3”中的数字“1”、“2”和“3”只是对不同Tris-HCl缓冲溶液的指代，并无特定的具体含义。
在本发明的红毛五加多糖的提纯方法中，所述步骤S3具体如下(也即步骤S3包括如下步骤)：
S3-1：将2ml步骤S2所得的离子柱层析液用规格为1.6×60cm的Superdex 200pg凝胶柱进行进一步纯化，以0.15mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，流速为0.3-0.7ml/分钟，收集第110-140分钟内的洗脱液；
S3-2：向步骤S3-1得到的洗脱液浓缩至原体积的1/10-1/15，加入为其3-5倍体积的无水乙醇，搅拌，静置，过滤，得沉淀物，将沉淀物依次用氯仿和无水乙醇进行洗涤，真空干燥完全，得到提纯后红毛五加多糖。
其中，在步骤S3-2中，浓缩后洗脱液与无水乙醇的体积比为1:3-5，例如可为1:3、1:4或1:5。
本发明人发现，使用上述提纯方法得到的红毛五加多糖为单一组分，不含蛋白、核酸成分，经过测定发现其相对分子质量为80.2kd，即为80200道尔顿。
其中，纯度鉴定方法如下：
使用Silent 1100高效液相色谱，将所得的提纯后红毛五加多糖用0.2mol/L的NaCl水溶液配制成2mg/ml的溶液，流动相为0.2mol/L的NaCl水溶液；工作条件：流速0.8ml/分钟，柱温箱温度40℃，示差检测器检测温度30℃，进样量20μl，检测时间35分钟。
其中，相对分子量测定使用HPLC法，该方法为常规公知技术(例如可见魏远安等人，“高效凝胶渗透色谱法测定多糖纯度及分子量”，《药学学报》，1989，24(7)，523-524)，在此不再一一赘述。
第三个方面，本发明涉及上述提纯方法所得到的红毛五加多糖。
第四个方面，本发明涉及一种红毛五加多糖的组成分析方法，所述方法包括如下步骤：
(1)按照上述方法得到提纯后的红毛五加多糖，也即进行上述步骤S1-S3而得到提纯后红毛五加多糖；
(2)将步骤(1)的提纯后红毛五加多糖加入到三氟乙酸水溶液中进行水解、蒸干，再加入甲醇、蒸干，得到残留物；
(3)向残留物中加入双蒸水和硼氢化钠进行还原，然后加入冰醋酸进行中和，再加入甲醇，旋转蒸发得到粉末；
(4)将粉末真空干燥，然后加入乙酸酐，在90-110℃下反应0.5-1.5小时，冷却，加入甲苯，减压浓缩至干，重复加入甲苯并减压浓缩至干的操作3-5次，以完全除去乙酸酐，从而得到乙酰化产物；
(5)将乙酰化产物用氯仿溶解，然后加入蒸馏水，充分振荡，除去水层，将氯仿层用无水硫酸钠干燥，得到进样样品，按照如下的操作进行GC分析：
使用Hp-5色谱柱，其参数为30m×0.25mm×320μm；进样量为1μl；程序升温条件为：起始温度140℃，以1.5℃/分钟升温至200℃，再以10℃/分钟升温至250℃，在该温度下保持5分钟；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，氢气流量30ml/分钟，空气流量400ml/分钟；载气为氮气，流速为1ml/分钟，从而分析出该提纯的红毛五加多糖的组成成分。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(2)中，所述三氟乙酸水溶液的摩尔浓度为1.5-2.5mol/L，例如可为1.5mol/L、2mol/L或2.5mol/L。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(2)中，所述提纯后红毛五加多糖与三氟乙酸水溶液的质量体积比为1:0.3-0.7mg/ml，即每1mg提纯后红毛五加多糖加入到0.3-0.7ml三氟乙酸水溶液中，例如可为1:0.3mg/ml、1:0.5mg/ml或1:0.7mg/ml。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(2)中，水解时间为80-100分钟，例如可为80分钟、90分钟或100分钟。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(2)中，所述三氟乙酸水溶液与甲醇的体积比为1:0.5-1.5，例如可为1:0.5、1:1或1:1.5。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(3)中，所述双蒸水与步骤(2)中三氟乙酸水溶液的体积比为2:1；硼氢化钠与步骤(2)中提纯后红毛五加多糖的质量比为25-35:1，例如可为25:1、30:1或35:1。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(3)中，还原时间为6-10小时，例如可为6小时、8小时或10小时。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(3)中，加入冰醋酸的量并没有特别的限制，只要中和后体系的pH值为6.5-7.5即可。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(3)中，所述甲醇与双蒸水的体积比为1-2:1，例如可为1:1、1.5:1或2:1。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(4)中，所述乙酸酐与步骤(1)中三氟乙酸水溶液的体积比为1:1，所述甲苯与乙酸酐的体积比为2-4:1，例如可为2:1、3:1或4:1。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(5)中，所述氯仿与步骤(4)中乙酸酐的体积比为2-4:1，例如可为2:1、3:1或4:1。
在本发明的红毛五加多糖的组成分析方法中，在步骤(5)中，蒸馏水的加入量并没有特别的限定，只要便于后处理即可，本领域技术人员可进行合适的选择。
经本发明的组成分析方法进行分析可知，所述提纯后的红毛五加多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为0.11:0.26:0.06:0.10:0.48。
发明人发现，通过使用本发明的所述组成分析方法，可以得到良好的分离效果，从而鉴定出本发明提纯后红毛五加多糖的具体组成，为该类多糖的成分组成分析提供了全新的方法，具有良好的科研价值和研究意义。
第五个方面，本发明涉及通过上述提纯方法后得到的提纯后红毛五加多糖的用途。
发明人经过研究发现，本发明的所述提纯后红毛五加多糖具有优异的调节T细胞亚群和提高IgM表达水平的能力，也即本发明还涉及了通过上述提纯方法后得到的提纯后红毛五加多糖在制备用于调节T细胞亚群和/或提高IgM表达水平的药物中的用途。
如上所述，本发明提供了一种红毛五加多糖的提取方法、提纯方法、通过该提纯方法得到的红毛五加多糖、组成分析方法及其制药用途。与现有技术相比，本发明通过独特的提取方法而以高收率得到了红毛五加粗多糖，然后通过优异的提纯方法而得到了高纯度的红毛五加多糖，并提供了该提纯后红毛五加多糖的组成分析方法，发现如此得到的红毛五加多糖具有优异的调节或提高某些特定细胞活性的医药用途，从而可用于相应的药物开发中。
附图说明
附图1是本发明实施例19的离子柱层析洗脱曲线图；
附图2为本发明实施例19所得到的提纯后多糖进行纯度鉴定方法时的HPLC洗脱图；
附图3是本发明实施例19所得到的提纯后多糖的紫外扫描图；
附图4是本发明实施例21进行组成分析时的GC图谱；
附图5是本发明实施例19得到的提纯后多糖以及其它组对于提高小鼠血清中IgM表达水平的影响。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
红毛五加粗多糖的提取方法
实施例1
A、原料预处理
将干燥的红毛五加茎皮粉碎，过100目筛，得到红毛五加粉末；将该粉末用丙酮浸泡(两者的质量体积比为1:6g/ml)，使其充分膨胀，然后过滤，得到膨胀后粉末；将该膨胀后粉末加入到索氏抽提器中，用乙酸乙酯与氯仿的混合溶剂(乙酸乙酯与氯仿的体积比为1:2.5，膨胀后粉末与混合溶剂的质量体积比为1:6.5g/ml)回流提取90分钟，趁热过滤，得到料渣；将料渣充分干燥完全，得到干燥残渣。
B、分步酶解
B1：室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中(干燥残渣与去离子水的质量比为1:7)，再加入纤维素酶与木聚糖酶的混合酶(纤维素酶与木聚糖酶的质量比为1:0.4，所述干燥残渣与混合酶的质量比为1:0.007)，搅拌完全，得到残渣酶溶液；调节该溶液的pH为7，在温度T1为40℃下保温酶解80分钟，得到初次酶解液；
B2：将初次酶解液进行5℃/分钟的梯度升温，当温度达到T2为65℃时，加入木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶与步骤B1中干燥残渣的质量比为1:0.01)，并在65℃的温度下保温酶解55分钟，然后以12℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持15分钟，使酶灭活，得到二次酶解液。
C、液液萃取
C1：将步骤B2得到的二次酶解液过滤，将所得滤液浓缩至其体积的1/15，得到浓缩液，然后离心，分离出上清液1；将上清液1再次离心，分离出上清液2；
C2：将乙酸乙酯加入到上清液2中(乙酸乙酯与上清液2的体积比为2.5:1)，充分振荡、混合，静置分层，分出水相。
C2：将乙酸乙酯加入到上清液2中，充分振荡、混合，静置分层，分出水相。
D、醇沉，得红毛五加粗多糖
D1：向步骤C2得到的水相中加入无水乙醇(水相与无水乙醇的体积比为1:3.5)，搅拌，静置，过滤，得沉淀；
D2：将沉淀充分干燥，用水复溶后，在-25℃下冷冻干燥，得到冻干粉，即红毛五加粗多糖，将其命名为CDT。
经换算，以100g干燥的红毛五加茎皮，得到4.67g红毛五加粗多糖，该粗多糖中的多糖含量为45.6％，其中多糖含量的测定方法属于公知技术，在此不再一一赘述。
实施例2-12：不同酶解温度的考察
除仅仅步骤B1中的温度T1和步骤B2中的温度T2不同外(其它均相同)，以与实施例1的相同方法得到了实施例2-12，以100g干燥的红毛五加茎皮计，所得粗多糖的量及多糖含量见下表1所示，为了方便比较，将实施例1的结果一同列出。
表1：两次酶解温度的影响
由上表1可见，两次酶解中的温度对最终的提取结果有着显著的影响，只有当T1为35-45℃以及T2为60-75℃，且T2与T1的差值为21-29℃时具有更好的效果，而当T2-T1＝25℃时具有最好的提取效果。
实施例13-16：酶解步骤的考察
实施例13：除省略掉步骤B2外，其它均相同，从而以与实施例1的相同方式实施了实施例13，即只进行了第一次酶解。
实施例14：除将步骤B修改为“室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中(干燥残渣与去离子水的质量比为1:7)，搅拌完全，然后调节该溶液的pH为7，将所得溶液进行5℃/分钟的梯度升温，当温度达到65℃时，加入木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶与干燥残渣的质量比为1:0.01)，并在65℃的温度下保温酶解55分钟，然后以12℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持15分钟，使酶灭活，得到酶解液”外，其它均相同，而与实施例1的相同方式实施了实施例14。即只进行了第二次酶解。
实施例15：除将步骤B修改为“室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中(干燥残渣与去离子水的质量比为1:7)，再加入纤维素酶与木聚糖酶的混合酶(纤维素酶与木聚糖酶的质量比为1:0.4，所述干燥残渣与混合酶的质量比为1:0.007)，再加入木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶与步骤B1中干燥残渣的质量比为1:0.01)，搅拌完全，得到残渣酶溶液；调节该溶液的pH为7，在温度为40℃下保温酶解80分钟，得到初次酶解液；然后以12℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持15分钟，使酶灭活，得到二次酶解液”外，其它均相同，而与实施例1的相同方式实施了实施例15。即同时加入所有的酶，并按照第一次酶解的条件进行酶解。
实施例16：除将步骤B修改为“室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中(干燥残渣与去离子水的质量比为1:7)，再加入纤维素酶与木聚糖酶的混合酶(纤维素酶与木聚糖酶的质量比为1:0.4，所述干燥残渣与混合酶的质量比为1:0.007)，再加入木瓜蛋白酶(木瓜蛋白酶与步骤B1中干燥残渣的质量比为1:0.01)，搅拌完全，得到残渣酶溶液；调节该溶液的pH为7，然后进行5℃/分钟的梯度升温，当温度达到65℃时，在该温度下保温酶解55分钟，然后以12℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持15分钟，使酶灭活，得到酶解液”外，其它均相同，而与实施例1的相同方式实施了实施例16。即同时加入所有的酶，并按照第二次酶解的条件进行酶解。
以100g干燥的红毛五加茎皮计，实施例13-16的所得粗多糖的量及多糖含量见下表2所示。
表2：酶解步骤的影响
由上表2可见，当对酶解步骤进行改变时，均导致了粗多糖量和多糖含量的显著降低，这证明了只有采用本发明的分步酶解(并同时限定其中的温度范围等)，才能取得最好的提取效果。
实施例17-18：步骤A的考察
实施例17：除步骤A中的红毛五加粉末未使用丙酮进行浸泡膨胀外，其它均相同，从而以与实施例1的相同方式实施了实施例17。
实施例18：除未进行步骤A中的丙酮浸泡膨胀、索氏抽提外，其它均相同，从而以与实施例1的相同方式实施了实施例18，即直接将粉碎得到的红毛五加粉末进行步骤B。
以100g干燥的红毛五加茎皮计，所得粗多糖的量及多糖含量见下表3所示，为了方便比较，将实施例1-3的结果一同列出。
表3：步骤A不同操作的影响
由上表3可见，当省略掉步骤A中的丙酮浸泡膨胀的操作后，虽然粗多糖含量降低不明显，但多糖含量降低显著，证明了其中杂质含量有急剧增大；而当省略掉步骤A时，同样的，粗多糖含量降低并不明显，但其中的多糖含量有着大幅度降低(甚至远低于实施例17)，这证明了进行步骤A操作的必要性。
红毛五加多糖的提纯方法及纯度与分子量测定
实施例19
S1：按照上述实施例1的红毛五加粗多糖的提取方法，得到红毛五加粗多糖(即实施例1中的CDT)；
S2：离子柱层析，得到离子柱层析样品
S2-1：将CDT溶于0.05mol/L、pH值为7.3的Tris-HCl缓冲溶液1中(所述CDT与Tris-HCl缓冲溶液1的质量体积比为1:100g/ml)，得到上样溶液；
S2-2：将上样溶液用用规格为2.6×60cm的DEAE-Sepharose FastFlow离子柱进行层析分离，先用浓度为0.05mol/L、pH值为7.3的Tris-HCl缓冲溶液2洗脱(步骤S2-1中的CDT与Tris-HCl缓冲溶液2的质量体积比为1:210g/ml)，流速为1ml/分钟，洗脱210分钟，完成后再用含梯度浓度NaCl的Tris-HCl缓冲溶液3进行直线梯度洗脱(该Tris-HCl缓冲溶液3的浓度为0.05mol/L、pH值为7.3，其中的NaCl的浓度为从0线性增大至0.8mol/L)，流速为2ml/分钟，继续洗脱280分钟，并收集第80-180分钟(针对该次洗脱的280分钟而言)内的洗脱液；将该洗脱液减压浓缩至原体积的1/12，得到离子柱层析液。
S3：凝胶柱层析，后处理，得到提纯后红毛五加多糖
S3-1：将2ml步骤S2所得的离子柱层析液用规格为1.6×60cm的Superdex 200pg凝胶柱进行进一步纯化，以0.15mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，流速为0.5ml/分钟，收集第110-140分钟内的洗脱液；
S3-2：向步骤S3-1得到的洗脱液浓缩至原体积的1/12，然后加入为其4倍体积的无水乙醇，搅拌，静置，过滤，得沉淀物；将沉淀物依次用氯仿和无水乙醇进行洗涤，真空干燥完全，得到提纯后的红毛五加多糖，命名为DT，以最开始的100g干燥的红毛五加茎皮计，所得提纯后红毛五加多糖的量为2.15g，多糖含量为98.9％，相对分子量为80.2kd，即80200道尔顿。
其中，纯度鉴定方法和分子量测定方法见如上所述。
其中，附图1是本实施例的离子柱层析洗脱曲线图；
附图2为本实施例所得提纯后红毛五加多糖按照上述纯度鉴定方法而得到的HPLC洗脱图，从该图中可见，所得洗脱曲线为单一对称峰，证明该多糖为单一组分。
将本实施例所得提纯后红毛五加多糖配制成质量浓度为1mg/ml的水溶液，在190-400nm内进行紫外光扫描，260nm、280nm处未见紫外吸收峰，说明样品中无蛋白、核酸成分，该紫外扫描图见附图3。
实施例20
除将步骤S2-2中的“浓度为0.05mol/L、pH值为7.3的Tris-HCl缓冲溶液2”替换为“浓度为0.01mol/L、pH值为6.0的磷酸缓冲液”外，其它操作均不变，而进行了实施例20，得到提纯后红毛五加多糖。以最开始的100g干燥的红毛五加茎皮计，所得提纯后红毛五加多糖的量为1.68g，多糖含量为85.6％。
由此可见，在离子交换层析中，洗脱液的种类对最终结果有着显著影响，当改变洗脱液时，不但提纯后红毛五加多糖的量有了显著降低，而且纯度也大幅度降低。
提纯后红毛五加多糖的组成分析方法
实施例21
(1)按照上述实施例19的红毛五加粗多糖的提纯方法，得到提纯后红毛五加多糖(即实施例19中的DT)；
(2)将步骤(1)的DT加入到2mol/L的三氟乙酸水溶液中(DT与三氟乙酸水溶液的质量体积比为1:0.5mg/ml)进行水解90分钟、蒸干，再加入甲醇(所述三氟乙酸水溶液与该甲醇的体积比为1:1)、蒸干，得到残留物；
(3)向残留物中加入双蒸水(所述双蒸水与步骤(2)中三氟乙酸水溶液的体积比为2:1)和硼氢化钠(硼氢化钠与步骤(2)中DT的质量比为30:1)进行还原8小时，然后加入适量冰醋酸进行中和，使得中和后体系的pH值为7，再加入甲醇(所述甲醇与双蒸水的体积比为1.5:1)，旋转蒸发得到粉末；
(4)将粉末真空干燥，然后加入乙酸酐(所述乙酸酐与步骤(1)中三氟乙酸水溶液的体积比为1:1)，在100℃下反应1小时，冷却，加入甲苯(所述甲苯与乙酸酐的体积比为3:1)，减压浓缩至干，重复加入甲苯并减压浓缩至干的操作4次，以完全除去乙酸酐，从而得到乙酰化产物；
(5)将乙酰化产物用氯仿(所述氯仿与步骤(4)中乙酸酐的体积比为3:1)溶解，然后加入蒸馏水，充分振荡，除去水层，将氯仿层用无水硫酸钠干燥，得到进样样品，按照如下的操作进行GC分析：
使用Hp-5色谱柱，其参数为30m×0.25mm×320μm；进样量为1μl；程序升温条件为：起始温度140℃，以1.5℃/分钟升温至200℃，再以10℃/分钟升温至250℃，在该温度下保持5分钟；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，氢气流量30ml/分钟，空气流量400ml/分钟；载气为氮气，流速为1ml/分钟，从而分析出该提纯的红毛五加多糖的组成成分，经对GC图谱(见附图4)的分析可知，该提纯后红毛五加多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成，其摩尔比为0.11:0.26:0.06:0.10:0.48，与混合的标准单糖GC图谱完全一致。
提纯后红毛五加多糖的生物活性测试
实验动物分组和处理
取SPF级BALB/c小鼠，雄性、体重为20±2g，常规饲养。
将60只小鼠随机分为6组，分为A、B、C、D、E、F组，每组10只，具体分组及给药方法见下表4。除A组外，其余各组在给药1、2、3天腹腔注射Cy(环磷酰胺)、剂量为80mg/kg的方法建立各个模型组，模型制备成功后，各组采取灌胃的方式给药，连续给药10天，其中的本发明多糖即为实施例19得到的DT，香菇多糖为市场上销售的香菇多糖注射液(例如康缘药业的注射用香菇多糖，国药准字H20067183)。
表4：各模型组的分类及给药方式
I、对调节小鼠T细胞亚群的影响
将上述6组小鼠末次给药前12小时禁食不禁水，然后停药24小时，称量体质量，各组动物摘眼球取血、脱颈处死后，无菌取脾脏，滤网研磨制脾细胞悬液。裂解红细胞后，调整细胞浓度为1×107个/ml，加入三种不同颜色的Anti-mouse CD3e-PE-Cy5、Anti-mouseCD4-PE、Anti-mouse CD8a-FITC单克隆抗体，用流式细胞仪检测T细胞亚群变化。
在T淋巴细胞中主要有辅助性T细胞CD4和调节性T细胞CD8两个主要亚群，这两类细胞相互变化、调整可以维持机体平衡。
经过测量，数据见下表5。
表5：T细胞亚群CD4 +和CD8 +及比值CD4 +/CD8 +
注：与空白对照组相比1)P<0.05，2)P<0.01；
与模型组相比3)P<0.05，4)P<0.01。
由上表5可见，与空白对照组A相比，注射环磷酰胺的B组小鼠的CD4 +细胞由正常值(25.99±1.14)％升高至(35.08±0.87)％，而给予不同剂量本发明多糖DT后CD4 +值逐渐恢复至正常。另一方面，在环磷酰胺处理后，调节性T淋巴细胞CD8 +细胞由正常值(6.21±2.94)％升高至(11.39±0.38)％，而在给予本发明多糖DT后使升高的CD8 +恢复至正常水平。由于CD8 +的升高幅度大于CD4 +，导致注射环磷酰胺的B组CD4 +/CD8 +的比值由正常值(4.19±0.42)％降至(3.07±0.18)％，此差异有显著性(P<0.01)。在给予本发明多糖DT以50、100、200mg/kg后，CD4 +/CD8 +的比值相对B组分别增至(3.43±0.42)％、(4.70±0.16)％和(3.78±0.164)％。尤其是本发明多糖DT中剂量组(即E组)恢复超过正常值水平(P<0.01)。由这些数据可见，本发明多糖DT可以调节CD4 +/CD8 +的比值至正常水平左右。
II、对提高小鼠血清中IgM表达水平的影响
将上述6组小鼠末次给药前12小时禁食不禁水，停药24小时，称量体重，各组动物摘眼球取血。血液在EP管中静置30分钟，1000rpm离心30分钟，取上层血清，用ELISA法检测血清中IgM含量。
各个组别对于提高小鼠血清中IgM表达水平的影响见附图5。
由图5可见，本发明多糖DT对提高小鼠血清中的IgM表达水平有着显著的影响：小鼠在给予不同剂量的本发明多糖DT后，低剂量组和中剂量组均显著地提高了小鼠血清中的IgM的表达水平(P<0.01)，从而具有显著的特异性体液增强作用。
由上述I-II可见，本发明的提纯后红毛五加多糖具有优异的调节T细胞亚群和提高IgM表达水平的能力，从而可用来制备用于调节T细胞亚群和/或提高IgM表达水平的药物，在医药领域具有很大的应用潜力和科研价值。
如上所述，本发明提供了一种从红毛五加皮中提取红毛五加多糖的方法，该方法通过独特的原料预处理、分步酶解等技术特征的组合/协同作用，从而以良好的产率和纯度而得到了红毛五加粗多糖，该粗多糖的收率和纯度均要显著优于现有技术；在得到粗多糖的基础上，通过独特的提纯方法而得到了纯度很高的提纯后多糖，进而通过独特的组成分析方法对该多糖进行了组成分析，明确了其组分构成，并发现该提纯后多糖具有显著的生理活性，可用于医药领域。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种红毛五加粗多糖的提取方法，所述方法包括如下步骤：
A、原料预处理；
B、分步酶解；
C、液液萃取；
D、醇沉，得红毛五加粗多糖；
所述步骤A具体如下：
将干燥的红毛五加茎皮粉碎，过100目筛，得到红毛五加粉末；将该粉末用丙酮浸泡，使其充分膨胀，然后过滤，得到膨胀后粉末；将该膨胀后粉末加入到索氏抽提器中，用乙酸乙酯与氯仿的混合溶剂回流提取1-2小时，趁热过滤，得到料渣；将料渣充分干燥完全，得到干燥残渣；
所述步骤B具体如下：
B1：室温下，将步骤A的干燥残渣加入去离子水中，再加入混合酶，搅拌完全，得到残渣酶溶液；调节该溶液的pH为6.5-7.5，在温度T1下保温酶解50-120分钟，得到初次酶解液；
B2：将初次酶解液进行梯度升温，当温度达到T2时，加入木瓜蛋白酶，并在该温度下保温酶解40-70分钟，然后以10-15℃/分钟的升温速率将温度升高至沸腾，保持10-15分钟，使酶灭活，得到二次酶解液
所述步骤C具体如下：
C1：将步骤B2得到的二次酶解液过滤，将所得滤液浓缩至其体积的1/10-1/20，得到浓缩液，然后离心，分离出上清液1；将上清液1再次离心，分离出上清液2；
C2：将乙酸乙酯加入到上清液2中，充分振荡、混合，静置分层，分出水相。
2.一种红毛五加多糖的提纯方法，所述方法包括如下步骤：
S1：按照权利要求1的提取方法，得到红毛五加粗多糖；
S2：离子柱层析，得到离子柱层析液；
S3：凝胶柱层析，后处理，得到提纯后红毛五加多糖；
所述步骤S2具体如下：
S2-1：将所述红毛五加粗多糖溶于Tris-HCl缓冲溶液1中，得到上样溶液；
S2-2：将上样溶液用规格为2.6cm×60cm的DEAE-Sepharose FastFlow离子柱进行层析分离，先用Tris-HCl缓冲溶液2洗脱，流速为1ml/分钟，洗脱200-220分钟，完成后再用含梯度浓度NaCl的Tris-HCl缓冲溶液3进行洗脱，流速为2ml/分钟，继续洗脱260-300分钟，并收集第80-180分钟内的洗脱液；将该洗脱液减压浓缩至原体积的1/10-1/15，得到离子柱层析液；
所述步骤S3具体如下：
S3-1：将2ml步骤S2所得的离子柱层析液用规格为1.6×60cm的Superdex 200pg凝胶柱进行进一步纯化，以0.15mol/L的NaCl水溶液进行洗脱，流速为0.3-0.7ml/分钟，收集第110-140分钟内的洗脱液；
S3-2：向步骤S3-1得到的洗脱液浓缩至原体积的1/10-1/15，加入为其3-5倍体积的无水乙醇，搅拌，静置，过滤，得沉淀物，将沉淀物依次用氯仿和无水乙醇进行洗涤，真空干燥完全，得到提纯后红毛五加多糖。
3.一种红毛五加多糖的组成分析方法，所述方法包括如下步骤：
(1)按照权利要求2的提纯方法得到提纯后红毛五加多糖；
(2)将步骤(1)的提纯后红毛五加多糖加入到三氟乙酸水溶液中进行水解、蒸干，再加入甲醇、蒸干，得到残留物；
(3)向残留物中加入双蒸水和硼氢化钠进行还原，然后加入冰醋酸进行中和，再加入甲醇，旋转蒸发得到粉末；
(4)将粉末真空干燥，然后加入乙酸酐，在90-110℃下反应0.5-1.5小时，冷却，加入甲苯，减压浓缩至干，重复加入甲苯并减压浓缩至干的操作3-5次，以完全除去乙酸酐，从而得到乙酰化产物；
(5)将乙酰化产物用氯仿溶解，然后加入蒸馏水，充分振荡，除去水层，将氯仿层用无水硫酸钠干燥，得到进样样品，按照如下的操作进行GC分析：
使用Hp-5色谱柱，其参数为30m×0.25mm×320μm；进样量为1μl；程序升温条件为：起始温度140℃，以1.5℃/分钟升温至200℃，再以10℃/分钟升温至250℃，在该温度下保持5分钟；进样口温度为250℃，检测器温度为250℃，氢气流量30ml/分钟，空气流量400ml/分钟；载气为氮气，流速为1ml/分钟。
4.提纯后红毛五加多糖在制备用于调节T细胞亚群和/或提高IgM表达水平的药物中的用途，其特征在于：所述提纯后红毛五加多糖是根据权利要求2的提纯方法得到的。
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