CN105884885A - 一种多肽疫苗的水合盐及其制备方法和含有该盐的药物制品 - Google Patents
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Abstract
本发明属于制药技术领域,涉及一种多肽化合物及其制备方法,特别是涉及KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐及其制备方法和含有该盐的药物制品。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域,涉及一种多肽化合物及其制备方法,特别是涉及KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐及其制备方法和含有该盐的药物制品。
背景技术
乳腺癌(BCa)是女性最常见的癌症诊断并且是女性中与癌症相关死亡的第二主导因素(RiesLAG等人,SEER Cancer Statistics Review,1975-2003,NationalCancer Institute,Bethesda,MD)。过去20年间在乳腺癌治疗中的主要进展使得无疾病生存(DFS)率显著提高。例如,已经将利用对肿瘤相关抗原有反应性的抗体疗法用于阻断特定的细胞过程以减缓疾病进展或者预防疾病复发。尽管近来在乳腺癌治疗上有所进展,但是相当数量的患者最终将死于复发疾病。因此,需要预防或者减缓或者抑制复发疾病的发生的治疗。
疫苗由于易于给药,以及因为他们在感染性疾病中观察到的高成功率而是对此种治疗和预防引人注意的模型。构建癌症疫苗的基本原理在理论上是直接的。然而实践中,有效的实体瘤癌症疫苗的开发仅存有限的成功。
KIFGSLAFL(氨基酸序列组成为Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu的九肽,也称之为HER2/neu 369-377)是HER2/neu原癌基因家族的肽序列,具有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答作用,预用于预防和/或治疗癌症的疫苗,目前正在相关的用于临床实验研究(Zaks T等人,Immunization with a peptide epitope(369-377)from HER-2/neu leads to peptide specific cytotoxic T lymphocytes that fail torecognize HER-2/neu+tumors,Cancer Research,1998,58(21):4902-8;Knutson KL等人,Immunization of cancer patients with HER-2/neu,HLA-A2peptide,p369-377,fesults in short-lived peptide-specific immunity,Clin Cancer Res 2002,8(5):1014-1018。
然而,现有技术公开的临床试验使用的KIFGSLAFL样品是DMSO溶液状态,在室温下稳定性差,需要在-20℃低温保存,使用前再解冻。至今未见该多肽室温稳定的化合物或混合物报道。
发明内容
本发明的目的之一在于提供KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,大幅改善原料纯度、吸潮性、水溶性和稳定性。
其中,所述KIFGSLAFL是指氨基酸序列为以下组成的九肽:
Lys-Ile-Phe-Gly-Ser-Leu-Ala-Phe-Leu
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也称之为HER2/neu 369-377。
所述KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐分子式为C50H78N10O11·nTFA·xH2O,其中n=1-2,x=1-4,TFA代表三氟乙酸。(其中,优选n=1,1.5或2;优选x=1-2,特别是x=1,1.5或2)。所述的三氟乙酸是指分子式为F3CCOOH的酸。
上述KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐通过本发明的优选方法制备得到,具有非常高的药用纯度,纯度≥95%,还可进一步优选达到≥98%,特别优选纯度≥99%。对于保证药物的有效性和安全性具有重要意义,具有良好的商业开发价值。
上述KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的吸湿性能与x值大小有关。当x小于1,如x=0或者0.5时,样品能迅速从干燥空气(例如RH35%)中吸收水分,使x含量明显增加,这样为样品的转移和准确称量带来不便。当x=1-4之间时,样品的吸湿速度明显慢得多,暴露在常规的干燥环境中(如RH50%)短时间内进行转移和称量无须额外的湿度控制措施。而且,为了制备x小于0.5的样品,往往需要更高的干燥温度和更长的干燥时间,导致样品的杂质偏高。当x大于4,例如x=5时,样品在长期常温保存时,杂质增加较x=1-4的样品明显要大一些。
因合成KIFGSLAFL过程中产生数量众多的杂质,使制备高纯度的KIFGSLAFL盐存在明显的技术难度,难以得到高纯度的单盐纯品。
本发明通过大量实验优选得到的制备KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的方法,包括以下步骤:
(1)、KIFGSLAFL粗品的制备
采用Fmoc固相合成方法,按照氨基酸序列(9→1)的顺序,合成制备KIFGSLAFL肽树脂,然后经三氟乙酸裂解,得到KIFGSLAFL粗品,具体包括以下步骤:
(1.1)、以连接有Fmoc-Leu-OH的酸性敏感树脂(如Wang树脂或者2-氯-三苯甲基-树脂)为原料,与哌啶溶液反应,脱去Fmoc保护基,溶剂洗涤后得到Leu-树脂。
(1.2)、按照固相多肽合成的方法,Leu-树脂依次与Fmoc保护的氨基酸反应,获得九肽KIFGSLAFL-树脂。期间依次使用常用的缩合剂进行接肽反应,经溶剂洗涤后用哌啶溶液脱去Fmoc保护基,经溶剂洗涤后再进行下一个Fmoc保护的氨基酸的缩合。
与Leu-树脂进一步缩合反应的Fmoc保护的氨基酸依次为:Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH。
缩合剂优选包括HATU、HBTU、BOP、PyBOP、DIC/HOBt、DIC/HOAt等。
(1.3)、用三氟乙酸裂解溶液处理KIFGSLAFL-树脂,得到KIFGSLAFL的三氟乙酸溶液。加入乙醚析出沉淀,经离心和乙醚洗涤后得到KIFGSLAFL粗品。
三氟乙酸裂解溶液是指含有50-95%(v/v)的三氟乙酸,其余为二氯甲烷,或可进一步加入1-10%(v/v)的水、苯酚、对甲基酚、苯甲醚、苯甲硫醚、1,2-乙二硫醇、三异丙基硅烷(TIS)等碳正离子俘获试剂。
(2)、KIFGSLAFL的纯化
将步骤(1)制备得到的KIFGSLAFL粗品溶解乙腈和水的混合溶液中,过滤,滤液用反相高效液相色谱纯化,得纯品的乙腈/水溶液。
反相高效液相色谱的纯化条件优选C4、C8、C18烷基键合硅胶为固定相,进一步优选C18烷基键合硅胶;柱温优选20-35℃,进一步优选25-30℃;流动相为含有三氟乙酸的乙腈/水溶液,其中三氟乙酸浓度为0.02%-0.5%(v/v),优选0.05%-0.2%(v/v)。流动相中乙腈的体积百分比优选10%至80%,由低浓度向高浓度梯度洗脱,进一步优选从20%至50%。
(3)、脱酸(成一三氟乙酸水合盐)
将上述步骤(2)制得的KIFGSLAFL纯品溶液用乙腈/水溶液为流动相的反相高效液相色谱处理,得到KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐溶液。
脱酸条件采用的反相高效液相色谱优选C4、C8、C18烷基键合硅胶为固定相,进一步优选C18烷基键合硅胶;柱温优选20-35℃,进一步优选25-30℃;流动相为乙腈/水溶液,流动相中乙腈的体积百分比优选2%至80%,由低浓度向高浓度梯度洗脱,进一步优选先用2%至4%等度或梯度洗脱至少一个柱体积,再用20%至50%由低到高梯度洗脱。
(4)、去除溶剂得到KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐固体。
将上述步骤(2)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐溶液减压浓缩和干燥,得到KIFGSLAFL·2TFA固体。
将上述步骤(3)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐溶液减压浓缩和干燥,得到KIFGSLAFL·TFA固体。
将上述步骤(2)和(3)制得的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐溶液按照不同比例混合,然后减压浓缩和干燥,得到KIFGSLAFL·nTFA(1≤n≤2)固体。
通过控制后期干燥温度和时间,得到不同x值的产品。其中后期干燥温度为30-60℃,优选40-50℃。干燥时间通过检测样品的含水量来确定。可以使用卡尔-费休等水分测定法确定含水量。
其中,n=2的水合盐,可通过上述方法去除步骤(3)而直接进行步骤(4)制备得到。
本发明的另一目的之一在于所提供KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐为无定形固体,其X-射线衍射谱图无晶体特征的吸收峰。
例如当n=2,x=1时的水合盐的X-射线衍射谱图如图1所示,无晶体特征的吸收峰。
与游离肽相比,无定形固体的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐可明显提高水溶性和稳定性,更易于药物的制剂,特别是注射给药制剂的使用。
其中,X-射线衍射谱图通过采用如下方法检测得到,仪器型号:锐影(Empyrean)X-射线衍射仪;测试条件:Cu靶Kα1射线,电压40kv,电流40mA,2θ范围3°-50°,发散狭缝1/32°,防散射狭缝1/16°,防散射狭缝7.5mm,步长0.02°,每步停留时间40S。
当n=1,x=1时,即KIFGSLAFL一三氟乙酸一水合盐无定形固体,其采用KBr压片法IR光谱检测条件检测,其红外吸收如图2所示,在3281cm-1、3089cm-1、2960cm-1、2928cm-1、、1630cm-1、1531cm-1、1402cm-1、1204cm-1、1140cm-1、722cm-1和700cm-1处有峰(误差允许±2cm-1)。当x从1增加至4时,上述特征吸收基本不变,只观察到3400-3500cm-1左右的宽大的“形似面包峰”变大。
当n=2,x=1时,即KIFGSLAFL二三氟乙酸一水合盐无定形固体,其采用KBr压片法IR光谱检测条件检测,其红外吸收如图3所示,在3292cm-1、3087cm-1、2962cm-1、1641cm-1、1531cm-1、1203cm-1、1139cm-1、722cm-1和700cm-1处有峰(误差允许±2cm-1)。当x从1增加至4时,上述特征吸收基本不变,只观察到3400-3500cm-1左右的宽大的“形似面包峰”变大。
对于本领域普通技术人员来说,前述红外吸收的误差允许指的是采用相应方法得到的同晶型样品采用相同的仪器和检测方法进行检测时,吸收峰误差通常在所述范围以内,并且,当大部分吸收峰,如超过80%以上的吸收峰误差在此范围内,而偶然有个别少数的吸收峰的误差超出该范围,均应认为属于相同的红外吸收峰谱图,红外光谱所对对应的物质相同。
所述的KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐和KIFGSLAFL二三氟乙酸水合盐无定形固体采用ESI质谱检测,结果如图4和图5所示,其分子离子峰为995.6,符合KIFGSLAFL的分子量计算值。
将KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐无定形固体用乙腈和水(体积比=5:95)混合溶液溶解,采用以下高效液相色谱检测条件分析:C18键合硅胶(250×4.6mm,5μm)为固定相,流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH至3.0)水溶液,梯度洗脱(流动相A从5%到45%,洗脱时间20min;然后改流动相A45%等度洗脱),流速1mL/min。检测波长195nm(0-8min)和220nm(8-25min)。三氟乙酸和目标肽KIFGSLAFL的出峰时间分别约为4.8min和20min。
本发明的再一目的在于提供一种多肽疫苗的药物制品,包含前述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,它适宜用药学上可接受的溶媒重新配制为一种可注射的药用产品,通过注射途径给予患者。所述药学上可接受的溶媒包括注射用水、无菌水、无菌生理盐水和无菌葡萄糖的水溶液等。
因本发明的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,特别是其无定形固体具有良好的纯度和稳定性,以及优越的水溶性,极大的提高了该药物制品的用药有效性和安全性。
所述药物制品可以含有或者不含有一种以上的可药用的赋形剂。本发明的药物制品可以是非胃肠道给药的任何粉末形式,例如冻干粉末、混悬型、乳制品注射剂等。
所述药物制品可优选用于预防和治疗乳腺癌及乳腺癌复发。
本发明中的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,除有特别指定外,均是指分子式为C50H78N10O11·nTFA·xH2O(n=1-2,x=1-4)的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐。
本发明各试剂的缩写为如下定义:
Fmoc | 9-芴甲氧羰基 |
DMF | N,N-二甲基甲酰胺 |
HATU | 2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯 |
HBTU | 苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐 |
BOP | 苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲基氨基)磷鎓六氟磷酸盐 |
PyBOP | 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷 |
HOBt | 1-羟基苯并三唑 |
HOAt | N-羟基-7-氮杂苯并三氮唑 |
DIC | N,N-二异丙基碳二亚胺 |
tBu | 叔丁基 |
TFA | 三氟乙酸 |
TIS | 三异丙基硅烷 |
v/v | 相同度量单位的体积百分比,如mL/mL×100% |
w/w | 相同度量单位的重量百分比,如mg/mg×100% |
本发明与现有技术相比具有如下突出的优点及有益效果:
1、本发明提供的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,相对于KIFGSLAFL碱、KIFGSLAFL硫酸盐极大地提高药物纯度、水溶性和优良的抗吸潮性,充分保证药用安全和有效性。其中水分子相对于肽的摩尔比例为1-4时,进一步表现出更好的抗吸潮性和化学稳定性。
2、本发明提供的无定形固体的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,具有良好水溶性和稳定性,易于注射给药等途径使用时的药物快速复溶,充分保证药物制剂的方便使用,用药安全和有效。相比之下,溶液状态的KIFGSLAFL三氟乙酸盐在常温时的化学稳定性较差,且容易染菌;而在低温保存时由于结冰导致局部浓度不同,使用时需要充分融化和混匀,才能获得均一的溶液。
3、本发明提供了一种高纯度KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的制备方法,克服现有技术制盐和提高纯度的技术困难,该方法条件温和,易于重现,大幅降低产业化成本。
附图说明
图1,KIFGSLAFL二三氟乙酸水合盐无定形固体的X-ray衍射光谱图。
图2,KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐无定形固体的IR光谱图。
图3,KIFGSLAFL二三氟乙酸水合盐无定形固体的IR光谱图。
图4,KIFGSLAFL二三氟乙酸水合盐无定形固体的ESI质谱图。
图5,KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐无定形固体的ESI质谱图。
实施方式
以下实施例和附图用于解释本发明,但绝不限制本发明。
实施例1KIFGSLAFL粗品的制备
(1)、称取Fmoc-Leu-Wang树脂(取代度为0.8mmol/g)40g,加入DMF300mL溶胀树脂30min。抽滤去DMF,加入20%哌啶/DMF溶液300mL反应30min。抽滤,用DMF 6×150mL洗涤树脂。
(2)、加入Fmoc-Phe-OH 24.8g,HOBt 8.6g和DMF 150mL,搅拌均匀,再加入DIC 9.5mL,于28-30℃水浴中搅拌4~5h。经Kaiser法检测,树脂呈无色后,抽滤,用DMF 2×200mL洗涤树脂。加入20%哌啶/DMF溶液300mL反应30min,抽滤,用DMF 6×200mL洗涤树脂。
(3、参考步骤2,依次偶联下一个氨基酸。后续氨基酸顺序及用量为:Fmoc-Ala-OH 19.9g,Fmoc-Leu-OH 22.6g,Fmoc-Ser(tBu)-OH 24.5g,Fmoc-Gly-OH19.0g,Fmoc-Phe-OH 24.8g,Fmoc-Ile-OH 22.6g和Fmoc-Lys(Boc)-OH 30.0g。
(4)、依次用二氯甲烷和甲醇洗涤树脂,真空干燥,得KIFGSLAFL肽树脂。
(5)、称取10g肽树脂,加入100mL裂解溶液(TFA/TIS/H2O=95/2.5/2.5,v/v/v),室温搅拌2h。过滤树脂,适量裂解溶液洗涤树脂。洗涤液与滤液合并,搅拌下加入乙醚1L,析出沉淀。经离心和乙醚洗涤几遍后,真空干燥得到KIFGSLAFL粗品。
实施例2KIFGSLAFL粗品的纯化
将实施例1得到的KIFGSLAFL粗品5g溶解在100mL含有40%体积比乙腈的水中,过滤。滤液用C18柱纯化,填料高度250mm,直径150mm,流动相A为含有0.1%体积比三氟乙酸的水,流动相B为含有0.1%体积比三氟乙酸的乙腈,梯度洗脱(B 20-50%,洗脱时间60min),流速600mL/min,检测波长230nm。收集主峰成分。用分析型高效液相色谱检测收集液的纯度。合并纯度大于98%的部分,得KIFGSLAFL·2TFA纯品溶液,旋蒸浓缩,冻干即得固体。最后在50℃下真空干燥至水分含量1.5%左右(w/w,卡尔-费休水分测定法)。用分析型高效液相色谱检测收集液的纯度,纯度98.6%,收率45%。样品中三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为18.8%(计算得x=1,n=2)。
X-ray衍射光谱检测条件:仪器型号:锐影(Empyrean)X-射线衍射仪;测试条件:Cu靶Kα1射线,电压40kv,电流40mA,2θ范围3°-50°,发散狭缝1/32°,防散射狭缝1/16°,防散射狭缝7.5mm,步长0.02°,每步停留时间40S。X-ray衍射光谱如附图1所示。
KBr压片法得到的IR光谱如附图3所示。
ESI质谱检测结果如图4所示,其中995.6m/z峰为M+H+,与KIFGSLAFL的分子量计算值一致。
分析高效液相色谱检测三氟乙酸和目标肽含量的条件是:创新通恒LC300高效液相色谱仪,C18键合硅胶(250×4.6mm,5μm)为固定相,流动相A为乙腈,流动相B为0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH至3.0)水溶液。梯度洗脱(流动相A从5%到45%,洗脱时间20min;然后改流动相A45%等度洗脱),流速1mL/min。检测波长195nm(0-8min)和220nm(8-25min)。三氟乙酸和目标肽的出峰时间分别约为4.9min和20min。
分析高效液相色谱检测目标肽纯度的条件是:创新通恒LC300高效液相色谱仪,C18键合硅胶(250×4.6mm,5μm)为固定相,流动相为0.1mol/L磷酸二氢钠(磷酸调pH至3.0)水溶液和乙腈的混合液(体积比7:3)。流速1mL/min。检测波长230nm。目标肽的出峰时间约为10min。
实施例3游离肽KIFGSLAFL固体的制备
实施例2得到的KIFGSLAFL·2TFA溶液冷却至0-5℃,搅拌下滴加5%NaOH水溶液调节pH至7~8。减压浓缩至析出大量胶状沉淀。离心,用少量冰水洗涤。沉淀经冻干得白色固体,水分含量1.8%左右(w/w),纯度98.1%,三氟乙酸的重量百分数约为0.2%。
实施例4KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐的制备(n=1,x=1)
将实施例2得到的KIFGSLAFL·2TFA溶液用C18柱纯化,填料高度250mm,直径150mm。先用3%体积比乙腈的水溶液洗脱10min,流速800mL/min。然后用流动相A为水,流动相B为乙腈,梯度洗脱(B:20%-40%,洗脱时间50min),检测波长230nm。收集主峰成分,得KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐溶液,浓缩后冻干即得白色固体,最后在40℃下真空干燥至水分含量1.6%左右(w/w,卡尔-费休水分测定法),收率91%。
按实施例2的分析高效液相色谱检测,样品中三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为10%(计算得x=1,n=1)。KIFGSLAFL的纯度99.5%。
KBr压片法得到的IR光谱如附图2所示。
ESI质谱检测结果如图5所示,其中995.6m/z峰为M+H+,与KIFGSLAFL的分子量计算值一致。
实施例5.KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合盐的制备(n=1.5,x=4)
将实施例2得到的KIFGSLAFL·2TFA溶液平分成2份。一份用C18柱纯化,填料高度250mm,直径150mm。先用3%体积比乙腈的水溶液洗脱10min,流速800mL/min。然后用流动相A为水,流动相B为乙腈,梯度洗脱(B:20%-40%,洗脱时间50min),检测波长230nm。收集主峰成分,得KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐溶液。两份溶液合并后浓缩,冻干,后期在30℃下真空干燥至水分含量约5.8%(w/w),得白色KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合盐固体,收率95%。
按实施例2的分析高效液相色谱检测,样品中三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为15%。KIFGSLAFL的纯度99.1%。
实施例6KIFGSLAFL二三氟乙酸水合盐的制备
参照实施例2的操作,在后期真空干燥阶段,缩短干燥时间,并用卡尔-费休水分测定法监测产品的水分,当水分含量降至2.9%(w/w)左右时停止干燥。所得的三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为18.8%。计算得n=2,x=2。
实施例7KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合盐的制备
参照实施例5的操作,在后期真空干燥阶段,缩短干燥时间,并用卡尔-费休水分测定法监测产品的水分含量至7.2%(w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为15%。计算得n=1.5,x=5。
实施例8KIFGSLAFL倍半三氟乙酸水合盐的制备
参照实施例5的操作,在后期真空干燥阶段,干燥温度60℃,并用卡尔-费休水分测定法监测产品的水分含量至0.7%(w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为15%。计算得n=1.5,x=0.5。
实施例9KIFGSLAFL一三氟乙酸倍半水合盐的制备
参照实施例4的操作,在后期40℃真空干燥阶段用卡尔-费休水分测定法监测产品的水分含量至2.5%(w/w)左右。所得的三氟乙酸的重量百分数按无水物计算约为10%。计算得n=1,x=1.5。
实施例10KIFGSLAFL硫酸盐的制备
将实施例3所得固体,用适量40%浓度的乙腈溶解,加入等摩尔硫酸,搅拌0.5h。减压浓缩,冻干,后期50℃真空干燥,得到白色KIFGSLAFL硫酸盐固体,水分含量1.7%。
实施例11KIFGSLAFL二盐酸盐的制备
将实施例3所得固体,用适量40%浓度的乙腈溶解,加入2倍摩尔盐酸,搅拌0.5h。减压浓缩,冻干,后期50℃真空干燥,得到白色KIFGSLAFL二盐酸盐固体,水分含量1.8%。
实施例12、吸潮性对比试验
各实施例得到的化合物分别称取20mg,在无菌环境25℃和RH 50%下,测量不同时间后样品的质量。:
试验结果如下:
从上表试验可知,实施例4的一三氟乙酸水合盐,实施例2、6的二三氟乙酸水合盐,和实施例5的倍半三氟乙酸水合盐的增重相对最小,而实施例10的硫酸盐和实施例11的二盐酸盐的增重明显高于上述样品。说明本发明的一三氟乙酸水合盐、倍半三氟乙酸水合盐和二三氟乙酸水合盐具有更好的抗吸湿性能。
实施例13、热稳定性测定
把样品置于50℃密闭容器中,经过不同时间后测试其纯度。HPLC测试条件同实施例2。
上述实施例6的溶液为实施例6的样品0.1g溶解在50ml无菌水中。
从上表试验可看出,10天后上述KIFGSLAFL的各种固体三氟乙酸水合盐的纯度下降在3%以内,而水溶液、游离肽、硫酸盐和二盐酸盐的纯度下降均大于4%。KIFGSLAFL的各种三氟乙酸水合盐的热稳定性明显高于游离肽、硫酸盐和二盐酸盐。上述各种固体三氟乙酸水合盐中,实施例6、5、7样品的纯度下降幅度依次增大,提示含水量x=5较高不利于样品的稳定性。
实施例14、溶解速度实验
分别把固体样品20mg(按无水物计算)加到10ml 25℃的注射用水中,置于恒温摇床中振荡,记录固体溶清的时间。结果如下:
样品 | 实施例4 | 实施例5 | 实施例6 | 实施例8 |
溶清时间 | <1分钟 | <1分钟 | <1分钟 | >5分钟 |
上述结果显示,当实施例8的样品(x=0.5)的含水量较低时,溶解时间明显比x=1-4的样品要延长。
通过实施例12、13和14总体上可以得出:本发明的水合盐(C50H78N10O11·nTFA·xH2O,其中n=1-2,x=1-4)相对于游离肽、硫酸盐、盐酸盐和x<1或者x>4的三氟乙酸水合物盐,表现出更好的抗吸潮性,化学稳定性,以及优越的水溶解性,更有利于该药物的应用。
实施例15、多肽疫苗制品的制备
于无菌环境中按照实施例4的操作制备得到的KIFGSLAFL一三氟乙酸水合盐。精密称量(以KIFGSLAFL碱计1mg/份),分装于无菌玻璃瓶中,密闭包装,得多肽疫苗制品。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,其分子式为C50H78N10O11·nTFA·xH2O,其中n=1-2(优选n=1,1.5或2),x=1-4(优选x=1-2,特别是x=1,1.5或2),TFA代表三氟乙酸。
2.根据权利要求1的三氟乙酸水合盐,其特征在于,所述KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的纯度≥95%,优选≥98%,更优选≥99%。
3.根据权利要求1至2任一权利要求所述的三氟乙酸水合盐,其特征在于,所述三氟乙酸水合盐为无定形固体,其X-射线衍射谱图无晶体特征的吸收峰。
4.根据权利要求3所述的三氟乙酸水合盐,其特征在于,n=1,红外吸收在3281cm-1、3089cm-1、2960cm-1、2928cm-1、1630cm-1、1531cm-1、1402cm-1、1204cm-1、1140cm-1、722cm-1和700cm-1处有峰,误差±2cm-1。
5.根据权利要求3所述的三氟乙酸水合盐,其特征在于,n=2,红外吸收在3292cm-1、3087cm-1、2962cm-1、1641cm-1、1531cm-1、1203cm-1、1139cm- 1、722cm-1和700cm-1处有峰,误差±2cm-1。
6.一种多肽疫苗的药物制品,其特征在于,包含权利要求1至5任一权利要求所述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐,它适宜用药学上可接受的溶媒重新配制为一种可注射的药用产品,通过注射途径给予患者。
7.根据权利要求6的制品,其特征在于,所述溶媒包括注射用水、无菌水、无菌生理盐水和无菌葡萄糖的水溶液。
8.一种制备权利要求1至5任一权利要求所述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)采用Fmoc固相合成方法,按照氨基酸序列(9→1)的顺序,合成KIFGSLAFL肽树脂,然后经三氟乙酸裂解,得到KIFGSLAFL粗品;
(2)将KIFGSLAFL粗品溶解,过滤,以含三氟乙酸的乙腈/水溶液为流动相进行反相高效液相色谱纯化,收集主峰成分;
(3)将步骤(2)所得的主峰成分以乙腈/水溶液为流动相进行反相高效液相色谱脱酸,收集主峰成分;
(4)、减压浓缩,经干燥得到。
9.一种制备权利要求1、2、3和5任一权利要求所述的KIFGSLAFL三氟乙酸水合盐的方法,其特征在于,所得水合盐n=2,包括如下步骤:
(1)采用Fmoc固相合成方法,按照氨基酸序列(9→1)的顺序,合成KIFGSLAFL肽树脂,然后经三氟乙酸裂解,得到KIFGSLAFL粗品;
(2)将KIFGSLAFL粗品溶解,过滤,以含三氟乙酸的乙腈/水溶液为流动相进行反相高效液相色谱纯化,收集主峰成分;
(3)减压浓缩,经干燥得到。
10.根据权利要求8或9的制备方法,其特征在于,步骤(2)纯化和步骤(3)脱酸条件分别以C4、C8或C18烷基键合硅胶为固定相;柱温20-35℃;步骤(2)纯化使用流动相中三氟乙酸浓度为0.02%-0.5%(v/v)。
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