JPH09501159A - 合成多重縦列反復ムチンおよびムチン様ペプチド、並びにそれらの利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る新規合成muc-1 ペプチドおよびmuc-1 類似体であって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる前記合成muc-1 ペプチドに関する。本発明はまた、該ペプチドの製造方法にも関する。本発明は更に、例えばワクチンや診断試験への該ペプチドの利用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 合成多重縦列反復ムチンおよびムチン様ペプチド、 並びにそれらの利用 発明の分野 本発明は、合成多重縦列反復ペプチドおよび該ペプチドの合成方法に関する。 本発明はまた、該ペプチドの利用、例えば縦列反復合成ペプチドの骨組構造を使 ったヒトの癌や感染性疾患のためのワクチンと診断試験における利用に関する。 背景情報 ムチンは、それらの分子量の50％以上がセリンとスレオニン残基に結合したＯ −結合型炭水化物に由来する、大量分泌および／または膜貫通性の糖タンパク質 である（総説についてはStrouss，G.J．およびDekker，Critical Reviews in Bi ochemistry and Molecular Biology，27 1/2: 57-92，1992を参照のこと）。１ 反復あたり10〜81アミノ酸の縦列反復配列から構成される領域中には多量のグリ コシル化が含まれる（Gum 他、J．Biol．Chem.，264: 6480-6487，1989；Gum他 、Biochem．Biophys．Res．Commun．171: 407-415，1990；Lan他、J．Biol．Che m.，265: 15294-15299，1990；Lan他、Cancer Res.，50: 2997-3001，1990およ び Porchet他、Biochem．Biophys．Res．Commun．175: 414-422，1991）。ムチ ンは上皮の腺細胞により生産され、そして最近になって、ムチンの１つ、muc-1 遺伝子によりコードされる多形性上皮ムチン（ＰＥＭ）、の上にある或る種のエ プトープの発現が腫瘍に関係していると同定された（Hilkens 他、Cancer Res. ，49: 786-793，1989およびJerome他、 Cancer Res.，51: 2908-2915，1991）。 上皮性腫瘍および対応する正常組織と反応するモノクローナル抗体を使った研 究は、正常細胞と対立するものとして悪性細胞からのムチンと関係づけられる異 なるエピトープが存在し得ることを明らかにした（Jerome他、Cancer Res.，51: 2908-2916，1991; Girling他、Int．J．Cancer，43:1072-1076，1989; Taylor-P apadimitriou，J.，Int．J．Cancer，49:1-5，1991）。これは、一部分は、細胞 表面上のムチン縦列反復タンパク質コアの露出を引き起こす、或る種の腫瘍にお ける異常なグリコシル化のためである（Hilkens 他、Cancer Res.，49: 786-793 ，1989; Girling 他、Int．J．Cancer，43: 1072-1076，1989；Sell，Progress Path.，21: 1003-1019，1990；Devine 他、Cancer Res．51: 5826-5836，1991 およびItzkowitz 他、Gastroenterol.，100: 1691-1700，1991）。悪性細胞上に 見つかる幾つかのムチンのタンパク質コアの露出は、それらの構造に反応する免 疫系の能力と組み合わせると（Jerome他、Cancer Res.，51: 2908-2916，1991お よびBarnd 他、PNAS USA，86:7159-7163，1989）、腫瘍の特異的免疫療法にムチ ン基剤のワクチンを使用する独特の機会を与える。 ヒトの癌や感染性物質に効果的なワクチンおよび免疫療法の開発は、しばしば 膜タンパク質の特定領域に対する防御免疫応答の発生に依存する。そのような例 としては次のものが挙げられる：胸部、膵臓および卵巣腫瘍抗原ヒトムチンmuc- 1 の縦列反復（ＴＲ）領域（Barnd 他、PNAS USA，86:7159-7163，1989；Jerome 他、Cancer Res.，51:2908-2916，1991）およびネコ白血病ウイルス外面構成単 位タンパク質（gp-70）の高プロリン中和領域（Nunberg 他、PNAS,81: 3675-367 9，1984；Elder 他、J．Virol.，61: 8-15，1987；Strouss 他、J．Virol.，61: 3410-3415，1987；Nick他、J．Gen． Virol.，71: 77-83，1990）。 最近、ヒトmuc-1 ＴＲ領域のタンパク質コア（Fontenot他、印刷中1993Ａ）お よびネコ白血病ウイルスのgp-70 のＰＲＮ領域（Fontenot他、印刷中1993Ｂ）が ポリプロリンβ−ターンヘリックス（Matsushima他、Function and Genetics，7 :125-155，1990）を形成することが証明された。ポリプロリンβ−ターンヘリッ クスの幾つかの共通の特徴としては、(1)約20〜60％のプロリンと、グリシン、 セリンおよびグルタミンの高含量；(2)低い推定α−ヘリックスおよびβ−シー ト二次構造含量と高い推定β−ターン含量；(3)高いターン含量と低いα−ヘリ ックスおよびβ−シート二次構造含量に一致する円二色性スペクトル；(4)伸び た棒状構造の形態と一致する固有粘度値が挙げられる（Matsushima他、1990）。 多くの場合、ヒトの癌や感染性物質のための効果的なワクチンと免疫療法の開 発に、免疫原として完全な糖タンパク質を使うことは、免疫原性が欠けているた めに無効であるか、または非防御エピトープの包含のために感染や病気の増大を もたらすかのいずれかであることがわかった（Osterhaus 他、Vaccine，7:137-1 41，1989；Gilbert 他、Virus Research，7:49-67，1987；Burke，D．Perspect ．Biol．Med.，35:511-530，1992）。 ワクチンとして合成ペプチドを使うと、組換えワクチンに伴う多数の問題を回 避することができる。特定の膜タンパク質領域に該当する合成ペプチドの使用の 利点としては次のものが挙げられる：防御エピトープのみの選択および包含；病 気促進性エピトープおよび感染性物質の排除；並びに、合成ペプチド抗原は化学 的に十分明確にされており、且つ妥当な費用で製造できること（Arnon およびHo rwitz，Curr．Opin．Immunol.，4:449-453，1992）。 欠点は、小さな合成ペプチドが免疫系への提示に向けたプロセシ ングや主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩおよびクラスIIタンパク質への結合 に必要な正確なアミノ酸配列を含まないかもしれないことである（Rothbard，Bi otechnology，20: 451-465，1992）。もう１つの欠点は、小さなペプチドの溶液 構造が生来のタンパク質に見られるものとは異なるかもしれず、従って防御免疫 を提供するのに適当な特異性と親和性の体液性免疫を誘導しない場合がある点で ある（Bernard他、Aids Res．and Hum．Retroviruses，6:243-249，1990）。 しかしながら、プロリンに富む大きなタンパク質のペプチド断片、β−ターン を含むペプチド、およびプロリンに富む直列の配列繰り返しを有するペプチドは 、溶液中で生来の構造を維持し且つ免疫原性であることが示されており（Broekh uijsen他、J．Gen．Virol.，68:3137-3145，1987；Bhandary他、Int．J．Peptid e Protein Res.，36:122-127，1990；Dyson他、J．Mol．Biol.，201:201-217，1 988；Dyson他、Biochemistry 31:1458-1463，1992；Mayo 他、Biochemistry 30: 8251-8267，1991；Richman およびReese，Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，85: 1 662-1666，1988）、ワクチン候補としての可能性があると思われる。それらの例 としては、ヒトムチンおよび腫瘍抗原（muc-1）縦列反復（ＴＲ）領域（Gendler 他、J．Biol．Chem.，26:12820-12823，1988；Lan 他、Cancer Res.，50:2997- 3001，1990；Barnd 他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA.，86:7159-7163，1989；J erome他、Cancer Res.，51:2908-2916，1991）、ネコ白血病ウイルスgp70（Dona hue 他、J．Virol.，62: 722-731，1988）、マウス白血病ウイルスgp70（Battin i 他、J．Virol.，66:1468-1475，1992）およびテナガザル白血病ウイルス（Del assus他、Virology，53:205-213，1989）のレトロウイルス高プロリン領域、並 びに淋菌（ナイセリア・ゴノレエ；Neisseria gonorrhoeae）の H.8 リポタンパク質の縦列反復配列（Baehr 他、Mol．Microbiol.，3: 49-55） が挙げられる。 ムチンは管上皮細胞の管腔側と、この細胞型に由来する腫瘍上に豊富に存在す る。正常または悪性上皮細胞による動物の免疫化によって多数のムチン特異抗体 が誘導されている。それらは最初は異なる分子を認識すると思われたが、ほとん どの場合に多様な炭水化物ムチンエピトープと反応することがわかった。炭水化 物特異的抗体により明らかにされるようなムチン分子の不均一性は広範囲である と思われた。正常ムチンと腫瘍ムチンの両者と反応する抗体が報告され、明らか な腫瘍特異性を示した抗体もあれば、器官特異性を示したものもあり、またあら ゆる器官部位からのムチンと反応したものもあった。最も識別力があるのは、ム チンポリペプチドコア上のペプチドエピトープと反応する抗体であった。それら の抗体のいくつかは全ムチンまたは上皮細胞腫による免疫化から得られ、幾つか のペプチドエピトープがこの高グリコシル化分子上および腫瘍細胞表面上に露出 されるに違いないという証拠を提供した（Kufe D，Inghirami M，Abe D，Hayes H，Justi-Wheeler HおよびSchlom J，“Differential reactivity of a novel m onoclonal antibody（DF3）with human malignant versus benign tumors”Hybr idoma 3:223，1984；Hilkens J，Buijs F，Hilgers J他、“Monoclonal anti-bo dies against human milk-fat globule membranes detecting differentiation antigens of the mammary gland and its tumors”Int．J．Cancer 34: 197，19 84；Burchell J，Gendler SおよびTaylor-Papadimitriou J，“Developmemt and characterization of breast cancer reactive monoclonal antibodies direct ed to the core protein of the human milk mucin”Cancer Res．47: 5476，19 87；Girling A，Bartkova J，Burchell J他、“A core protein epitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal a ntibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary carcinomas”In t．J．Cancer 43: 1072，1989；Xing PX，Tjandra JJ，Stacker SA他、“Monocl onal antibodies reactive with mucin expressed in breast cancer”Immunol ．Cell Biol．67: 183，1989；Gendler SJ，Burchell JM，Duhig T他、“Clonin g of a partial cDNA encoding differentiation and tumor-associated mucin glycoproteins expressed by human mammary epithelium”Proc．Natl．Acad．S ci．USA 84: 6060，1987）。 様々な器官により生産されるムチンの性質、並びに腫瘍由来のムチンと正常上 皮細胞由来のムチン間の相違は、胸部（Gendler SJ，Lancaster CA，Taylor-Pap adimitriou J他、“Molecular cloning and expression of human tumor-associ ated polymorphic epithe-lial mucin”J．Biol．Chem．265: 15286 ^*，1990；S iddiqui J，Abe M，Hayes E，Shani E，Yunis Eおよび Kufe D，“Isolation an d sequencing of a cDNA coding for the human DF3 breast carcinoma-associa ted antigen.”Rroc．Natl．Acad．Sci．USA 85: 2320，1988；Ligtenberg MJL ，Vos HL，Gennissen AMCおよびHilkens J，“Episialin，a carcinoma-associa ted mucin，is generated by a polymorphic gene encoding splice variants w ith alternative amino termini”J．Biol．Chem．265: 5573，1990）、膵臓（G um JR，Hicks JW，Swallow DM他、“Molecular cloning of cDNAs derived from a novel human intesteinal mucin gene”Biochem．Biophys．Res．Commun．17 1:407，1990）、小腸（Gum JR，Byrd JC，Hicks JW，Toribara NW，Lamport DTA およびKim TS，“Molecular cloning of human intesteinal mucin cDNAs．Seq uence analysis and evidence for genetic polymor- phism.”J．Biol．Chem．264: 6480，1989；Gum JR，Hicks JW，Swallow DM他、 “Molecular cloning of cDNAs derived from a novel human intesteinal muci n gene”Biochem．Biophys．Res．Commun．171: 407，1990）および気管支上皮 細胞ムチン（Porchet N，Van Cong N，Dufosse J他、“Molecular cloning and chromoso-mal localization of a novel human tracheo-bronchial mucin cDNA containing tandemly repeated sequences of 48 base pairs”Biochem．Biophy s．Res．Commun．175:414，1991）のcDNAクローンの単離の後、つい最近明らか になったばかりである。cDNAの比較は、該分子の全体構造の重大な類似性を示し たばかりか、異なる染色体上に置かれた少なくとも４つの異なる遺伝子がムチン 分子をコードすることと、それらの遺伝子の発現が組織特異的であることも示し た。乳腺癌からクローニングされた該遺伝子の配列はほとんど同一であり、それ らは膵腺癌からクローニングされた該遺伝子の配列とも同一であった。それらは 結腸癌にも見つかった。それらはMUC 1 と命名された。小腸cDNAライブラリーか ら単離されそして結腸癌では低レベルで発現される別の２つの遺伝子（MUC 2 と MUC 3）は互いに異なっており、また第四の気管気管支ムチン遺伝子MUC 4 とも 異なっている。 全てのムチン遺伝子およびタンパク質の最も一様な特徴は、該分子のほぼ３分 の２を占める多数の（40〜100 の）縦列反復の存在である。この反復アミノ酸配 列はＯ−グリコシル化部位であるセリンとスレオニンに富む。アミノ末端は推定 上のシグナルペプチドに続き縮重縦列反復配列を含み、そしてカルボキシル末端 は縮重縦列反復配列、ユニークな膜貫通配列および細胞質末尾配列を含む。下表 Ａは胸部および脾臓ムチンcDNA（MUC 1）の縦列反復構造を示す。それは長さ20 アミノ酸のポリペプチドをコードする60ヌクレオチド から成る。反復１回あたり５つのＯ−結合グリコシル化部位（セリン２個とスレ オニン３個）が存在する。 表Ａは４つの遺伝子によりコードされる縦列反復アミノ酸配列を比較する。 本発明は、ポリプロリンβ−ターンヘリックスを有する長鎖ペプチドを合成す る方法、および重要なＢ細胞エピトープもしくはＴ細胞エピトープを縦列に反復 させるかまたはＢ細胞およびＴ細胞エプトープを結合してより大きなサイズの抗 原を製造することによる、新規抗原のデザインのためにそれらの合成ポリプロリ ンヘリックスを修飾する方法を提供する。 本発明は、ポリプロリンβ−ターン構造モチーフを有する多重縦列反復の非常 に長鎖のペプチド、例えばヒトムチン（muc-1）ペプチドを合成する新規方法に 基づく。本発明のペプチドは、グリコシル化の欠損下で、生来のムチン中に見ら れる構造を反映する生来のコンホメーションをとる。 本発明は免疫応答を誘導することができる抗原をデザインする方法にも関する 。本発明のこの観点は、このタンパク質を発現している乳腺癌患者と脾腺癌患者 に見られるムチンに対する既に同定されたＭＨＣ無制限Ｔ細胞反応性（Jerome他 、Cancer Res.，51:2908-2916，1991；Barnd他、Proc．Natl．Acad．Sci．USA. ，86:7159-7163，1989；Jerome 他、Cancer Res.，52: 5985-5990，1992）に 加えて、新たに発見された多重反復合成ムチンペプチドの構造的特徴（Cancer R esearch に提出されたFontenot 他、“Biophysical Characterization of One- ，Two-，and Three-Tandem Repeats of the Human Mucin（MUC-1）Protein Core ”）に基づいている。 多重反復ムチンペプチドは、生来のコンホメーションとＭＨＣ無制限Ｔ細胞反 応性に重要な縦列反復配列の構造を損なうことなく、ムチンの主要エピトープか らの数個のアミノ酸の除去を可能にする。ムチンエピトープの無妨害のアミノ酸 を、無制限Ｔ細胞反応性を与える重要な抗原のエピトープからのアミノ酸により 置換して、新たにデザインされた免疫原にすることが可能である。 発明の要約 本発明は、muc-1 の20アミノ酸縦列反復を少なくとも２回含んで成る合成muc- 1 ペプチドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとるこ とができる合成muc-1 ペプチドに関する。例えば、合成muc-1 ペプチドはmuc-1 の縦列反復を２，３，４，５回またはそれ以上含んで成る。 別の態様では、本発明は、少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と１ つの外来アミノ酸配列を含んで成る合成muc-1 様ペプチドであって、グリコシル 化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる合成muc-1 様ペプチド に関する。例えば、合成muc-1 様ペプチドはmuc-1 の縦列反復配列を２，３，４ ，５つまたはそれ以上含んで成る。外来アミノ酸配列はエピトープ、、例えばウ イルス（例えばＨＩＶ）、細菌、寄生虫または癌（例えば膵臓癌、乳癌、卵巣癌 または結腸癌）に対応する抗原性エピトープであることができる。よって、該ペ プチドはmuc-1 様であり、または免疫学的に未変性の（生来の）合成抗原を形成 するように「外来」エピト ープが適当に挿入されているmuc-1 の類似体である。 本発明の合成muc-1 およびmuc-1 様ペプチドは、長さが40，60，80または好ま しくは105 アミノ酸であるか、または更に大きくてもよく、そして医薬上許容さ れるアジュバントに共有結合により結合されてもよい。 更なる態様では、本発明は、少なくとも２回の縦列反復を有するムチンペプチ ドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ るムチンペプチドの製造方法に関する。該方法は、幾つかの変更を伴った標準的 固相合成プロトコールに関する。次の変更を伴って常用の方法論が使われる。ま ず、一次配列が長さ30アミノ酸に達した時に合成を停止する。次いで樹脂に結合 した30アミノ酸ペプチドの２分の１を除去する。次いでモニター段階を使って反 応の完全性をモニタリングする。次いで所望の長さが得られるまで反応サイクル を続ける。 別の態様では、本発明は、少なくとも２回の縦列反復と１つの外来アミノ酸配 列を有するmuc-1 様ペプチドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメ ーションをとることができるmuc-1 様ペプチドの製造方法に関する。該方法は、 上述した幾つかの変更を伴った標準的固相合成プロトコールに関する。外来アミ ノ酸配列はエピトープであることができる。 本発明は、上記方法により製造されるムチンペプチドにも関する。このペプチ ドは長さ40，60，80または好ましくは105 アミノ酸であることができ、より長い サイズも可能である。 別の態様では、本発明は哺乳類（例えはヒトまたはマウス）においてエピトー プ（例えばワクチン）に対する抗体を誘導することができる免疫原性組成物であ って、合成muc-1 様ペプチドを含んで成る免疫原性組成物に関する。本発明は更 に、哺乳類（例えはヒトま たはマウス）においてエピトープ（例えばワクチン）に対する細胞障害性Ｔ細胞 （ＣＴＬ）を誘導することができる免疫原性組成物であって、合成muc-1 様ペプ チドを含んで成る免疫原性組成物に関する。合成muc-1 様ペプチドはmuc-1 の20 アミノ酸縦列反復を少なくとも２回含んで成り、且つグリコシル化の欠損下で生 来のコンホメーションをとることができる。合成muc-1 様ペプチドはエピトープ のためのアミノ酸配列を更に含んでもよい。この合成muc-1 様ペプチドは長さ40 ，60，80または好ましくは105 アミノ酸であることができ、より長いサイズも可 能である。 更なる態様では、本発明は哺乳類において免疫応答を抑制する方法であって、 上述の免疫原性組成物を免疫原的に有効な量において哺乳類に投与する段階を含 んで成り、該エピトープが該哺乳類により産生された自己抗体により認識される 方法に関する。 更に別の態様では、本発明は、生物学的試験試料中の特定の病気（例えば癌、 例えば膵臓癌、乳癌または結腸癌）に対する抗体の存在を検出する方法であって 、次の段階： ａ）エピトープを含む上述の合成muc-1様ペプチドを、合成muc-1様ペプチド− 抗体複合体が形成されるような条件下で生物学的試験試料と接触させ、ここで前 記エピトープは前記病気に対する抗体と反応性であり、そして ｂ）合成muc-1 様ペプチド−抗体複合体の形成を検出し、前記複合体が特定の 病気に対する抗体の存在を示す を含んで成る方法に関する。 別の態様では、本発明は癌細胞の増殖を抑制する方法であって、次の段階： ａ）試験哺乳類、例えばマウスまたはウサギに、エピトープを含む上述の合成 muc-1 様ペプチドを、合成muc-1 様ペプチド−抗体複 合体が形成されるような条件下で注射し、ここで前記エピトープは前記癌細胞に 対する抗体と反応性であり、そして前記哺乳類から得られた前記複合体から前記 抗体を単離し、 ｂ）段階ａ）からの単離された抗体を、抗体−薬剤複合体が形成されるような 条件下で、癌細胞の増殖を抑制することができる薬剤と接触させ、そして ｃ）段階ｂ）からの抗体−薬剤複合体を、抗体−薬剤複合体が癌細胞と反応し そして癌細胞の増殖を抑制するような条件下で、癌細胞と接触させる を含んで成る方法に関する。前記薬剤は、放射性同位体（例えばイットリウム90 およびヨウ素131 ）、化学薬品（例えばメトトレキセート）、毒素（例えばリシ ンまたはそれの部分）または酵素であることができる。 更なる態様では、本発明は膵臓癌、乳癌または結腸癌細胞の増殖を抑制する方 法であって、次の段階： ａ）上述の105 アミノ酸合成muc-1 様ペプチドを、合成muc-1 様ペプチド−抗 体複合体が形成されるような条件下で、膵臓癌、乳癌または結腸癌に対応する癌 細胞を含有する生物学的試験試料と接触させることにより、前記癌細胞に対する 抗体を得、 ｂ）段階ａ）からの抗体を、前記抗体が癌細胞と反応しそして癌細胞の増殖を 抑制するような条件下で、癌細胞と接触させる を含んで成る方法に関する。 本発明はまた、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入されたエピトープ （例えばウイルス、癌または細菌に対応する）のためのアミノ酸配列を有する少 なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復の合成muc-1 様ペプチドを含んで成 るワクチンであって、前記合成muc-1様ペプチドがグリコシル化の欠損下で生来 のコンホメー ションをとることができるワクチンに関する。好ましくは、前記合成muc-1様ペ プチドは、長さ105 アミノ酸であり、そして生来の合成抗原を形成させるように 適当に挿入されたエピトープのためのアミノ酸配列を有する少なくとも５回のmu c-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る。合成muc-1様ペプチドは、５回の連続 したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復配列と５つの追加のアミノ酸を含んでもよく、 ここで前記５つの追加のアミノ酸は５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前また は後に置かれる。 本発明は更に、病気、例えばウイルス、癌または細菌感染に対する免疫を生じ させる方法であって、前記ワクチンを免疫原的に有効な量で哺乳類に投与する段 階を含んで成る方法にも関する。 本発明は、105 アミノ酸の合成muc-1様ペプチドとアジュバントを含んで成る ワクチンであって、前記muc-1 様ペプチドが少なくとも５回の連続したmuc-1 の 20アミノ酸縦列反復と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、且つグリコシル化の 欠損下で生来のコンホメーションをとることができるワクチンに関する。５個の 追加のアミノ酸は５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる。 本発明は、膵臓癌、乳癌または結腸癌に対する免疫を生じさせる方法であって 、前記ワクチンを免疫原的に有効な量でヒトに投与する段階を含んで成る方法に も関する。 図面の簡単な説明 図1. 20，40および60アミノ酸ペプチドの粗製合成ペプチド生成物の分析HPLC クロマトグラムが上段に示される。最大HPLCピーク画分（矢印により示されたも の）の電子噴射質量スペクトルが下段に示される。各場合に、得られた質量は予 想通りの分子量であった （20マー＝1886ダルトン、40マー＝3766ダルトン、60マー＝5625ダ ルトン）。 図2. D₂O 中の重水素化 0.1Ｍリン酸緩衝液pH 7.2に溶解されたmuc-1 60アミ ノ酸ペプチドの600-MHz Cosy ¹H-NMR スペクトル。交差ピークはアミド− ¹Ｈと ¹Ｈαの間のスカラー関係を示す。それらのアミドプロトンは、ムチンペプチド の折り畳まれた構造により溶媒との交換から保護される。 図3. アスパラギン酸とヒスチジンのβ−プロトンの領域を示す、D₂O 中の重 水素化 0.1Ｍリン酸緩衝液pH 7.2に溶解されたムチンペプチドの ¹H-NMR スペク トル。構造の進展はペプチド中の縦列反復の数に依存する。 図4. Ｃ２（8.2-8.4 ppm）およびＣ４領域を示す、D₂O 中の重水素化 0.1Ｍ リン酸緩衝液pH 6.89 に溶解されたムチンペプチドの¹H-NMRスペクトル。 図5. H₂O および0.1 Ｍリン酸緩衝液pH 6.8に溶解されたムチンペプチドの ¹ H-NMR スペクトル。（Ａ）１回の縦列反復に相当する20アミノ酸ペプチド。（Ｂ ）２回の縦列反復に相当する40アミノ酸ペプチド。（Ｃ）３回の縦列反復に相当 する60アミノ酸ペプチド。 図6. 25，55，75および90℃における0.01Ｍリン酸緩衝液pH 7.2に溶解された ムチン60アミノ酸ペプチドの円二色性スペクトル。 図7. Tripos分子グラフィックプログラムSybyl を使ってポリＩ型ターンコン ホメーションに模型化したヒトムチン uc-1遺伝子の３回縦列反復の配列。 図8. (a)ムチン 105残基、(b) PRN60，60残基、(C)H2D8，72残基、(d)H2DAS7 ，70残基の粗製合成ペプチド生成物の分析用HPLCクロマトグラム、(e)ムチン105 主画分の電子噴射質量スペクトル、(f)PRN60主画分の電子噴射質量スペクトル、 (g)H2D8主画分の電子噴射質量スペクトル、(h)H2DAS7主画分の電子噴射質量スペ クトル。 図9. 25，55，75および90℃における(a)ムチン105、(b)PRN60、(C)H2D8、(d) H2DAS7の円二色性スペクトル。 図10．25℃における(1)対照ペプチド、(2)ムチン20残基、(3)ムチン60残基、( 4)ムチン105 残基、(5)PRN60、(6)H2DAS7のモル楕円率〔θ〕。 図11．この図は、乳癌患者の少なくとも10％がムチンに対する抗体を有するこ とを証明する。乳癌患者からの血清を105 アミノ酸合成ペプチドと反応させ、そ して特異的反応性をELISA アッセイにより検出した。正常血清は該ペプチドと反 応せず、これを対照として使った。脾臓癌および結腸癌患者からの血清でも同じ 結果が得られた。 図12．この図は、ムチンに対する抗体が本発明のペプチドによってのみ検出可 能であり、その場合、105 アミノ酸ペプチドが最良の結果をもたらすことを示す 。患者の血清を短鎖ムチンペプチドまたは癌患者の血清からの精製ムチン分子と 反応させることによって本発明者らが行った予備実験は、全く特異抗体を検出し なかった。 図13．この図は、本発明の105 アミノ酸ペプチドが血清抗体の特異性を正確に 決定するのに有用であることを示す。105 ペプチドとの血清反応性を阻害するの に短鎖ペプチドを使う。まず、血清を縦列反復配列の相違領域を表す短鎖ムチン ペプチドと混合する。次いでこの混合物をELISAプレート上で長鎖105 アミノ酸 ペプチドと反応させる。患者の血清中の抗体により認識されるエピトープを有す る短鎖ペプチドは、長鎖ペプチドへの抗体結合を妨害することができる。 図14．この図は、本発明の105 アミノ酸ペプチドが抗ムチン抗体の正確なイソ タイプを決定するのに有用であることを示す。長鎖ペプチドは患者の血清からの 特異抗体と結合する。ELISA プレートを洗浄することにより他の抗体を回収する 。次いで市販の第二抗体を 添加する。それらは特異的な反応性と様々な抗体イソタイプを有する。最終結果 は、105 アミノ酸ペプチドに結合した血清からの抗体がIgG，IgM，IgD，IgAもし くはIgE またはそれらの混合物のいずれであるかを決定することができる。この 図は、ムチンに対して患者により産生される抗体が全てIgM であることを示す。 発明の具体的説明 本発明は、一部は、ポリプロリンβ−ターンヘリックスの追加の特徴がFmoc固 相ペプチド合成（Fields他、“Principles and pract-ice of solid-phase pept ide synthesis”，Synthetic Peptides，G.A．Grant編，W.H．Freeman and Co. ，New York，77-183頁，1992）を使って今までに達成されなかった長さへの合成 の忠実度であるという発見に基づいている。ポリプロリンβ−ターンヘリックス の２つの追加の特徴は、(1)溶液中で規則正しい長命のコンホメーションを形成 する能力および¹H-NMR分光法により測定した時のD₂O 中に溶解される間中のプロ トンの保護（Fontenot他、印刷中、1993Ａ＆Ｂ）；および(2)水溶液中での約198 nmのところの大きな負のＣＤバンドである。220 nmと208 nmのところの２つの 別々の負のＣＤバンドの不在および192 nmのところの正のバンドの欠失は、ムチ ン、PRN60 またはH2Dmuc7 に対してα−ヘリックス性質を除外する。加えて、21 6 nmの負のバンドと195 nm〜200 nmの大きな正のバンドが無いことから、β−シ ート構造が無いことは明らかである（Woody，“Circular Dichoism of Peptides ”，The Peptides: Analysis，Synthesis，Biology，7: 16-104，1985；Johnson ，Am．Rev．Biophys．Chem.，17:145-166，1988）。 縦列反復ペプチド(PKLKL)nを使ったモデルペプチド予備実験は、198 nmのとこ ろの１本の負のＣＤバンドがランダムコイルを示すと いう結論を下した。しかしながら、Dukor & Keiderling(Biopoly-mers，31: 174 7-1761，1991)は、小さなペプチドが、全部トランス−プロリンから成るポリ− プロリンII(Dukor & Keiderling，Bio-polymers，31: 1747-1761，1991)中に見 られるのに似た一時的な左巻き３₁ −ヘリックスをとる傾向にあることを示した 。よって、「ランダムコイル」ペプチドは、ポリプロリンβ−ターンヘリックス に類似したコンホメーションとＣＤスペクトルを示すが、図10に示されるように ずっと低い強度である。明らかに、大きな負のＣＤバンドは構造の不在というよ りむしろ二次構造を指摘する。 60アミノ酸合成ペプチドを使ったD₂O 中での二次元¹H-NMR（COSY）実験（一例 は下記に記載される）は、ムチン縦列反復領域が安定な構造に折り畳まれ得るこ とを示し、そしてこの構造が24時間以上に渡り重水素による交換からプロトンを 隔離することができることを示す。その上、縦列反復領域の１，２および３回反 復に相当する合成ペプチド類似体を使ったD₂O 中での一次元¹H-NMR実験は、反復 の数が増加するにつれて該構造の形成が起こっていくことを示す。 ＤＳＳからの2.4 〜3.3 ppm の領域中のβ−プロトンに注意を集中させること により、分子全体に渡って変化が検出できるので、20アミノ酸反復領域の長さ全 体を通して構造的変化が起こっていると思われる（図３）。β−プロトンに意識 を集中することにより、本発明者らはこのタンパク質領域の特有の反復性質を利 用する。１つの20アミノ酸ペプチドは¹H-NMRスペクトルに寄与し得るプロトンを 全て含有し、そして１、２または３回の縦列反復に相当するペプチドのスペクト ル中に観察される相違は、ポリペプチド骨格に沿った二次構造の発達によって課 せられる局所的な磁気環境の変化にのみ寄与し得る。明らかに、¹H-NMRスペクト ルは、１、２および３回の反復を含むペプチドの構造が異なることを明らかにし た。しかし、 Ｃ２とＣ４共鳴が単一ピークに分解する多数のヒスチジン残基を含むペプチドは 、多重反復ペプチドの中の各ヒスチジンの環境が同等であることを示唆する。１ つの残基の正確なコンホメーションはペプチド中の反復の数に依存するというこ とを¹H-NMRの結果は示していると思われる。 muc-1 縦列反復配列の11アミノ酸断片を使ったmuc-1 コア構造に関する以前の 研究は、ジメチルスルホキシド中に溶解させた時、Ｄ２からＰ４までが逆ターン 構造を形成すること、およびＰ４がトランスコンホメーション中に存在すること を証明することができた（Tendler，1990 およびScanlon 他、1992）。もっと大 きな合成ペプチドを使って、本発明者らは該ペプチドのサイズに依存する構造の 段階的変化があることを証明した。 このデータは、モノクローナル抗体結合データにより強く支持される。モノク ローナル抗体の多くは、エピトープが存在した時であっても、ちょうど１回の反 復に相当するペプチドと反応することができなかった。しかし、反復配列の数を 増加させると抗体反応性が増加した。この現象は、最初のプロリンのＣ末端にア ミノ酸を提供すると主要な免疫優性エピトープを形成することを示す他の著者ら により観察された現象（Price他、Molecular Immunology，27:795-802，1990 お よびXing他、Immunology，72，1991）と一致する。 後述の¹H-NMR実験はムチン縦列反復領域が溶液中で規則正しい構造をとること を明らかに示し、そしてこの構造の形はムチン配列の分析、固有粘度測定と電子 顕微鏡検査から得られる分子の形状、および円二色性実験によって更に解明する ことができる。 一態様では、本発明は、muc-1 の20アミノ酸縦列反復を少なくとも２回含んで 成る合成muc-1 ペプチドに関し、該合成muc-1 ペプチドはグリコシル化の欠損下 で生来のコンホメーションをとることができる。例えば、muc-1 ペプチドはmuc- 1 の20アミノ酸縦列反復を２，３，４，５回またはそれ以上含んで成ることがで きる。本発明の合成muc-1 ペプチドは、長さ40，60，80もしくは好ましくは105 アミノ酸であるか、または更に長くてもよく、医薬上許容される担体分子または アジュバントに共有結合により結合されてもよく、そして合成muc-1 様ペプチド と常用の試薬を含んで成るキットの一部分であってもよい。 使用するペプチド反復配列は、ポリプロリンβ−ターンヘリックスであるもの である。ポリプロリンβ−ターンヘリックスを有するペプチドの幾つかの共通の 特徴として、次のものが挙げられる： 1. 約20〜60％のプロリンと、グリシン、セリンおよびグルタミンの高含量； 2. 低い推定α−ヘリックスおよびβ−シート二次構造含量と高い推定β−タ ーン含量； 3. 高いターン含量と低いα−ヘリックスおよびβ−シート二次構造含量と一 致する円二色性スペクトル； 4. 伸びた棒状構造の形態と一致する固有粘度値（Matsushima他、Proteins: Structure，Function and Genetics 7:125-155，1990）。 PaMPS により合成することができるペプチドの配列の例が表１に示される。天 然のムチン縦列反復配列は表１のNo.1に示される。ネコ白血病ウイルスの高プロ リン中和領域全体とこの領域の42アミノ酸Ｎ末端断片は、それぞれ表１のNo.2と No.3に示される。他のムチンペプチド、例えばmuc-2，muc-3またはmuc-6 は様々 な長さの縦列反復配列である。それらのムチンペプチドは全く同じmuc-1 の特徴 を有しているわけではないが、それらの配列の領域は例えばプロリンにより置換 することができる。かくして、各々の特定のムチンの縦列反復配列の生来の長さ を維持することができる。 別の態様では、本発明は、少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と１ つの外来アミノ酸配列を含んで成る合成muc-1 様ペプチドであって、グリコシル 化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる合成muc-1 様ペプチド に関する。例えば、muc-1 様ペプチドはmuc-1 の縦列反復配列を２，３，４，５ 回またはそれ以上含んで成ることができる。外来アミノ酸配列はエピトープ、例 えばウイルス（例えばＨＩＶ）、細菌、寄生虫または癌（例えは膵臓癌、乳癌、 卵巣癌または結腸癌）に対応する抗原性エピトープであることができる。 本発明の合成muc-1 様ペプチドは、長さが40，60，80または好ましくは105 ア ミノ酸であり、医薬上許容される担体分子またはアジュバントに共有結合により 結合されてもよく、そして合成muc-1 様ペプチドと常用の試薬を含んで成るキッ トの一部分であってもよい。 更なる態様では、本発明は、少なくとも２回の縦列反復を有するムチンペプチ ドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ るムチンペプチドの製造方法に関する。該方法は、幾つかの変更を伴った標準的 固相合成プロトコールに関する。 次の変更を伴って常用の方法論が使われる。まず、一次配列が長さ30アミノ酸 に達した時に合成を停止する。次いで樹脂に結合した30アミノ酸ペプチドの２分 の１を除去する。次いでモニター段階を使って反応の完全性をモニタリングする 。次いで所望の長さのペプチドが得られるまで反応サイクルを続ける。 この方法は次の段階を含んで成る： ｉ）着目のアミノ酸を活性化し； ii）活性化された着目のアミノ酸を適当な固相に導入し； iii）適当な条件下で完結まで反応させ； iv）反応の完全性についてモニタリングし； ｖ）30アミノ酸ペプチドが得られるまで次の着目のアミノ酸を使って段階ｉ） 〜iv）を繰り返し、その時点で30アミノ酸ペプチドの半分を除去し；そして vi）少なくとも２つの縦列反復配列を有し且つグリコシル化の欠損下で生来の コンホメーションをとることができる所望の長さのムチンペプチドが形成される まで、反応サイクルを続ける。 一例として、本発明の方法は、迅速多重ペプチド合成装置(Rapid Multiple Pe ptide Synthesizer；RaMPS)上で手動方法論を使って、次のプロトコールにより 達成することができる。 カップリング反応 適当なOPfpまたはOdhbt アミノ酸エステル0.25モルを１mlのDMF に溶かし、こ れを標準的RaMPS 樹脂カートリッジに添加する。DMF 中の0.5 M １−ヒドロキシ ベンゾトリアゾール（HOBT）0.2 mlを該カートリッジに添加する。２mlのDMF を 使って、残ったOPfpエステルをアミノ酸バイアルからRaMPS カートリッジ中に洗 い流す。しっかりカートリッジの蓋をした後、それを室温で２時間振盪する。 次いでRaMPS プロセッサーを切り、カートリッジの蓋をはずし、開放し、排水 する。溶媒を真空下で吸引する。 樹脂を30〜45秒間 DMFに浸漬し、排水し、吸引する。これを２回繰り返す。（ 合計３サイクル） 次に、樹脂を30〜45秒間メタノールに浸漬し、排水し、吸引する。これを繰り 返す。（合計２サイクル） 次に、KaiserまたはIsatin試験を使って反応を完全性についてモ ニタリングする。もしカップリングが不完全であったら、次の段階を行ってそし て最初の４段階を繰り返す（メタノール中への樹脂の浸漬、排水および吸引まで ）。カップリングが完全であったら、次の段階を行うことにする。 樹脂を30〜45秒間 DMFに浸漬し、排水しそして吸引する。これを３回繰り返す 。（合計４サイクル） 次いで樹脂を30〜45秒間50％ピペリジン／DMF に浸漬し、排水する。 次に、RaMPSカートリッジ弁を閉じ、３mlの50％ピペリジン／DMFを添加する。 該カートリッジの蓋をし、20分間振盪する。次いでカートリッジを排水する。 次に、RaMPS 樹脂を30〜45秒間 100％DMF に浸漬し、排水し、そして吸引する 。これを２回繰り返す。（合計３サイクル） この時点でモニタリング段階を加え、不完全な脱保護反応を検出し、人による 誤差を防ぐ。 （この時点で、最後のアミノ酸が樹脂にカップリングされていたら、完成した ペプチドの開裂を次に行うことにする。） 次いでRaMPS 樹脂を30〜45秒間 100％メタノールに浸漬し、排水し、そして吸 引する。これを繰り返す。（合計２サイクル） RaMPS 樹脂を30〜45秒間 100％DMFに浸漬し、排水し、そして吸引する。これ を３回繰り返す。（合計４サイクル） 次いで上記に概説した手順を使って次のアミノ酸を添加し、最初の段階を始め ることができる。 30アミノ酸の長さに達した後、樹脂の半分を取り出し、別のカートリッジに入 れる。アミノ酸の濃度を同一に維持し、ただし〔ＡＡ／樹脂上のペプチド鎖〕の 比を二倍にする。 完成したペプチドの開裂 RaMPS ^TM樹脂を30〜45秒間 100％メタノールに浸漬し、排水し、そして吸引す る。これを２回繰り返す。（合計３サイクル） 樹脂が乾燥するように10分間吸引する。 RaMPS カートリッジの弁を閉じた後、次のものを添加する：2.85mlのトリフル オロ酢酸（ＴＦＡ）；適当なら、135 μｌのフェノール（H₂O で液化したもの） またはチオアニソール；15μｌのエタンジチオール。 RaMPS カートリッジの蓋をし、そして指摘したように室温で振盪する： RapidAmide^TM樹脂 16時間 Wang樹脂 ３時間 次に、RaMPS カートリッジをRaMPS プロセッサーから取り外し、50mlのポリプ ロピレン試験管上で懸濁する。 弁を開き、蓋を開け、試験管中に溶媒を排水する。 次いで樹脂を5.0 mlのTFA ですすぎ、試験管中に排水する。これを繰り返す。 次いでRaMPS カートリッジを捨ててもよい。 不活性ガスの穏やかな流れによりTFA の量を１〜２mlに減らしてもよい。 次に、該試験管に25mlのジエチルエーテルを加え、混合する。次いで試験管を ドライアイス／アセトン上に５分間またはペプチドが沈澱するまで置く。 上部のエーテル層を除去し、捨ててもよい。 前の２段階を３回繰り返す。（合計４サイクル） 次に、試験管に25mlの酢酸エチル／ジエチルエーテル(1.5:1)を加え、混合す る。該試験管をドライアイス／アセトン上に５分間またはペプチドが沈澱するま で置く。 上部のエーテル層を除去し、捨ててもよい。 前の２段階を繰り返す。（合計２サイクル） 次に、1.0 mlのH₂O と25mlのジエチルエーテルを試験管に加える。次いで該試 験管を氷上に５分間または層が分離するまで置く。上部のエーテル層を捨てる。 不活性ガスの穏やかな流れにより、残ったエーテルを蒸発させる。 次いでペプチドをH₂O から凍結乾燥するかまたはSpeed-Vac 中に置くことがで きる。 本発明の方法は、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションが維持され る限り、長さ60〜105 アミノ酸およびそれより大きい合成ペプチドのルーチン合 成の大きな進歩を意味する。典型的には、20を過ぎるとペプチド合成の効率が各 アミノ酸カップリングにつき５％減少する。（Grant，G.A.，Evaluation of the Finished Product，“Synthetic Peptides，A User's Guide”(1992)中，G.A． Grant 編，W.H．Freeman and Company，New York，185-258頁。）従って、カッ プリングあたり５％の誤差では、40アミノ酸を有するペプチドを合成する試みは 所望の生成物を全くもたらさないことになる。 目下、より長鎖のペプチド（例えば、長さ40〜60アミノ酸のペプチド）の製造 効率を高める最も一般的な方法は、２つの同一アミノ酸のカップリングを連続的 に実施することである。不運にも、この方法は、難しいアミノ酸カップリングで は一定の段階での誤差と或る種の副反応の頻度を増加させることになった。従っ て、本発明者らは105 アミノ酸までのムチンを製造することができた効率に非常 に驚いた。Fmoc合成によって以前に製造された最長のペプチドは86アミノ酸であ った。（Field 他、Principles and Practice of Solid-Phase Peptide Synthes is，“Synthetic Peptides，A User's Guide”（1992）中，G.A．Grant編，W.H．Freeman and Company，New YorK，77- 183頁。）これを達成するためには、合成の各段階の忠実度が100 ％に近くなけ ればならなかった。これは、プロリン含量が比較的高い限り（例えば15％以上） 、操作された配列を使って達成することができる。 別の態様では、本発明は、少なくとも２つの縦列反復配列と１つの外来アミノ 酸配列を有するmuc-1 様ペプチドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコン ホメーションをとることができるmuc-1 様ペプチドの製造方法に関する。該方法 は、上述した幾つかの変更を伴った標準的固相合成プロトコールに関する。 次の変更を伴って常用の方法論が使われる。まず、一次配列が長さ30アミノ酸 に達した時に合成を停止する。次いで樹脂に結合した30アミノ酸ペプチドの２分 の１を除去する。次いでモニター段階を使って反応の完全性をモニタリングする 。次いで所望の長さのペプチドが得られるまで反応サイクルを続ける。 この方法は次の段階を含んで成る： ｉ）着目のアミノ酸を活性化し； ii）活性化された着目のアミノ酸を適当な固相に導入し； iii）適当な条件下で完結まで反応させ； iv）反応の完全性についてモニタリングし； ｖ）30アミノ酸ペプチドが得られるまで次の着目のアミノ酸を使って段階ｉ） 〜iv）を繰り返し、その時点で30アミノ酸ペプチドの半分を除去し；そして vi）少なくとも２回の縦列反復配列と１つの外来アミノ酸配列を有し且つグリ コシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる所望の長さのム チンペプチドが形成されるまで、反応サイクルを続ける。 一例として、上述のプロトコールを使って本発明を達成することができる。 外来アミノ酸配列はエピトープ、例えばウイルス（例えばHIV）、細菌、寄生 虫または癌（例えば膵臓癌、乳癌、卵巣癌または結腸癌）に対応する抗原性エピ トープであることができる〔Baehr 他（1989）Mol．Microbiol．3: 49-55）。多 重縦列反復合成ペプチド中に組み込むことができるエピトープは表２に示される 。 例えば、Ｔ細胞エピトープは非常に短く、長さがわずか３〜４アミノ酸であろ う。他方、Ｂ細胞エピトープは典型的にはより長いが、３〜５アミノ酸ほどの短 い場合もあり得る。 本発明は、上述の方法により製造されるムチンペプチドにも関し、該ペプチド は長さ40，60，80または好ましくは105 アミノ酸であることができるが、二次構 造が破壊されない限り、より長いサイズも可能である。 加えて、本発明は、ヒトの癌および感染性疾患のためのワクチンおよび診断の 開発にとって重要な抗原（Finn，Biotherapy 4:239-249，1992）を含有する１ク ラスの合成ペプチドを製造する実用的方法論を提供する。ポリプロリンヘリック スは、重要なＢ細胞もしくはＴ細胞エピトープを縦列に反復させるかまたはＢ細 胞エピトープとＴ細胞エピトープをカップリングしてより大きなサイズの抗原を 製造することにより新規抗原をデザインするための、有効な骨組構造を提供する 。 別の態様では、本発明は哺乳類においてエピトープ（例えばワクチン）に対し て抗体を誘導することができる免疫原性組成物または分子であって、合成muc-1 様ペプチドを含んで成る免疫原性組成物または分子に関する。合成muc-1 様ペプ チドは少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復とエピトープのためのアミ ノ酸配列を 含んで成り、そして合成muc-1 様ペプチドはグリコシル化の欠損下で生来のコン ホメーションをとることができる。合成muc-1 様ペプチドはmuc-1 の縦列反復配 列を２，３，４，５回またはそれ以上含んで成ることができ、そして長さ40，60 ，80または好ましくは105 アミノ酸であることができ、より長いサイズも可能で ある。免疫原性分子はアジュバントと共に投与することもできる。 ムチン縦列反復ポリペプチドコア領域は免疫原性であり且つＨＬＡ無制限であ る。何故なら、それはプロリンに富む二次構造を有しこの構造は安定であり、生 来の立体配置を取り、配列の反復だけでなく構造的であり、そしてこの全てのた めに、Ｔ細胞とＢ細胞の抗原レセプターの直接結合および架橋結合を行うことが できるからである。例えば、本発明の方法により、各々が長さ20アミノ酸の５回 の縦列反復と５個のアミノ酸（例えば、GVTSA 、これは該ペプチドの末端または 好ましくは先端に置くことができる）を含有する、長さ105 アミノ酸の合成ペプ チドを製造することができる。今までに報告された最長のムチン合成ペプチドは ２回の反復を有する。該ペプチドが生来の構造を取り、かくして抗体と適切に反 応して適当な抗体を誘導し、そして細胞性免疫を刺激するのには、２回より多い 縦列反復が重要である。 この合成方法は、特徴的に配置されたプロリンを有するペプチドに特に有効で ある。更に、本発明は、別の非常に長鎖のペプチドの合成に利用することができ る。この場合、長鎖ムチン様骨格上に特定の短鎖配列を合成することができ、よ り一層生来の立体配置および抗体または免疫系細胞との所望の反応性を該ペプチ ドに与えることができる。ポリプロリンβ−ターンヘリックス構造モチーフを使 った複雑なペプチドの合成は、極めて大きなペプチド（例えば、40アミノ酸より 長いペプチド）の合成において著しく高い水準の効率 と精度をもたらすことができる新規合成方法を確立する。 長さ105 アミノ酸の合成ムチンペプチドは、膵臓癌、乳癌、卵巣癌および結腸 癌患者のための腫瘍特異的ワクチンとして利用することができる。事前研究は、 ムチンポリペプチドコア上のエピトープが腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞の標的で あること、およびそれらの免疫原性が縦列に反復されているそれらのうちの数個 に依存することを示している。それらのエピトープは105 アミノ酸合成ペプチド 上に存在し、そして５回反復される。溶液形態で且つ不完全フロイントアジュバ ントと一緒にこのペプチドを使ったマウスの免疫化は、所望の細胞性免疫を誘導 した。これは以前に短い合成ペプチドを使った時には達成されなかった。生来の 構造が形成するのを考慮に入れたペプチドの長さ、および縦列に反復したエピト ープはこの分子の新しい特徴であり、それの免疫原性の原因であるかもしれない 。 ムチン遺伝子のcDNA配列は利用可能であるが、免疫応答のＭＨＣ無制限刺激へ の縦列反復エピトープの利用は予測できなかった。いずれかの抗原（細菌、ウイ ルス、腫瘍、自己抗原）に由来する重要な免疫原性アミノ酸残基を含有する構造 的に安定な縦列反復分子が、それらのＨＬＡ（ＭＨＣ）分子と無関係に、あらゆ る個体において免疫応答を惹起させることができることは、新たな発見である。 更に、それらの長鎖縦列反復ペプチドを好結果に合成するための技術もまた新規 である。 ムチン構造はそのような構造の原型として用いることができる。一例を下記に 示す。 たとえプロリンの正確な位置が維持される必要が無いとしても、強固な構造を 維持するには多数のプロリンが必要である。各反復配列中の最初の２つのプロリ ンの間に置かれたムチンの配列ＤＴＲは抗ムチン免疫応答の標的である。該配列 の残りの部分は免疫応答の目的上不活性であり、三次元構造を更に維持する足場 として役立てるために未変更のまま残すことができる。ＤＴＲ配列はウイルス、 腫瘍抗原または自己抗原からの配列により置換することができる。 一般に、置換配列は短鎖ペプチド（例えば長さが約３アミノ酸）であり、その 中の２または３アミノ酸だけが免疫系による認識のためにＴ細胞レセプターと接 触することができる。短鎖ペプチドは、例えば、ＨＬＡに結合した長鎖ペプチド から誘導してもよい。 それらの短いアミノ酸配列のほとんどは安定な構造を持たないので、それらは 免疫系に提示するためにＨＬＡ分子に結合しなければならない。この結合は非常 に特異的であり、ＨＬＡ分子の特定の型（アレレ）に依存する。よって免疫原性 配列を或る個体において免疫応答を刺激するそれの能力により同定すると、それ らの免疫系がその配列により刺激されないような異なるＨＬＡ型を有する別の個 体が存在するだろう。このＨＬＡに対する依存はＨＬＡ制限として知られており 、ペプチドを基剤としたワクチンをデザインする上で回避しなければならない問 題である。ムチン様構造は、必要な強固で、安定で、且つＴ細胞レセプター、Ｂ 細胞レセプターおよび免疫系を活性化することのできる縦列に反復した構造を提 供することにより、ＨＬＡ制限とペプチド提示への要求を回避する。 多重縦列反復ムチンエピトープは、患者のＨＬＡ分子による提示とは無関係に 、直接的にＴ細胞を刺激する。Ｔ細胞を直接刺激するように５回以上の縦列反復 を含む長鎖合成ムチンペプチドをデザインする。ペプチドワクチンは患者のＨＬ Ａ型とワクチンペプチドを 提示するそれの能力または無能力により使用が制限されるため、これは非常に意 義深い。長鎖合成ムチンペプチドは全ての患者においてワクチンとして使用する ことができる。更に、ムチン様構造の上に重ねた免疫原性配列は、ＨＬＡ型にか かわらず全ての患者において免疫応答を刺激することができるであろう。 患者のＨＬＡ型と無関係に免疫応答を刺激する縦列反復エピトープの能力につ いて長鎖合成ムチンペプチドによって確立された理論は、腫瘍抗原、ウイルス抗 原、および自己抗原中に見つかる他のエピトープにも応用することができる。そ れらのエピトープは、それらを提示することのできる特定のＨＬＡ型を有する人 の亜集団においてのみ免疫原性である。ムチン構造に従ってそれらのエピトープ を合成することは、それらをＨＬＡ分子による提示と無関係にしそして全ての個 体に免疫原性にする。従って、本発明のペプチドを使う１つの利点は、それらの ＨＬＡ型に関係なく哺乳類においてＭＨＣ無制限の免疫応答を誘導できることで ある。 例えば、生来の分子の代わりに、５回の縦列反復配列と５アミノ酸（例えばＧ ＶＴＳＡ、これはペプチドの末端または好ましくは先端に置くことができる）か ら成る長さ105 アミノ酸の合成ムチンペプチドを免疫原として代用することがで きる。合成ムチン105 ペプチドは安定な縦列反復構造の原型を表し、その上に別 の免疫原性エピトープを合成することができ、そしてそれらに対する免疫応答を ＨＬＡ無制限にすることができる。 この免疫原性接合体は、免疫原的に有効な量で例えば皮内経路により哺乳類に 投与した時、多重縦列反復合成ペプチド中に抗原性エピトープがデザインされて いる病気に対する免疫化に安定であろう。 多重縦列反復合成ペプチド中に組み込むことができるエピトープとしては、例 えば、ウイルス（例えばＨＩＶ）、細菌、または癌 （例えば膵臓癌、乳癌、卵巣癌または結腸癌）に対応する抗原性エピトープが挙 げられる。（表２を参照のこと。） 更なる態様では、本発明は哺乳類において免疫応答を抑制する方法であって、 上述のムチン様ペプチド組成物を免疫原的に有効な量において哺乳類に投与する 段階を含んで成り、該エピトープが該哺乳類により産生された自己抗体により認 識される方法に関する。ムチン様ペプチドが前記抗体により認識され、生来の標 的への抗体の結合を防ぐであろう。 哺乳類に投与すると反復配列上に存在するエピトープに対する防御免疫応答を 誘導する本発明のワクチンは、病気特異的エピトープを有するペプチドを含んで 成る１または複数の免疫原性ムチン様ペプチドを含んで成り、ここで各病気特異 的エピトープは該エピトープの異なる部分に相当する。 加えて、２つの異なる病気のエピトープからの合成エピトープを含んで成る上 述の免疫原性ペプチドを混合し、哺乳類において両方の病気に対する防御抗体が 同時に惹起されるように単一の接種材料を作製することにより、二価ワクチンを 製造することができる。 上述したように、本発明の合成方法は、該方法が長鎖ペプチドの効率的で且つ 確実な合成を成し遂げるという点で新規である。現在合成されている短鎖ペプチ ドを上回る、長鎖ペプチドに関連する利点が多数ある。それらの利点としては、 例えば次のものが挙げられる： （1）生来の構造の形成、 （2）同一分子内により多くの配列情報および構造情報を含めることができる 、 （3）大きなペプチドの方がより優れた抗原になるという事実、 （4）免疫系細胞の表面上のＢおよびＴ抗原レセプターの両方の抗 原レセプターと架橋結合し、そして抗原産生またはＴ細胞活性化のいずれかを直 接的に誘導することができる、および （5）与えられたペプチド基質と多価抗体の間の高結合力型相互作用の発生（ 診断目的）。 生来の構造の形成については、このペプチドモチーフのポリ逆ターン構造がワ クチンの開発への該ペプチドの利用を可能にするであろう。折り畳まれた生来の タンパク質では、アミノ酸の直鎖状配列から成る骨組の鎖が、タンパク質の疎水 性内部を横切り、そして逆ターン（またはβ−ターン）を使って表面のところで 向きを変えてタンパク質鎖の方向を逆転させる。細菌やウイルスの重要な抗原は タンパク質であり、同じように折り畳まれるので、抗原の表面の大部分はこれら のターンから構成されている。 従って、感染の間、Ｂ細胞の表面上にある抗体分子が生来の折り畳まれた状態 の逆ターンから成る表面ウイルス抗原と最初に接触する。ターン構造は、タンパ ク質の構造を実際に解明せずに、配列だけに基づいて推定または検出する最も簡 単な二次構造の形である。それらの構造はプロリンとグリシンの存在により象徴 される。多数のウイルスおよび細菌抗原の既知の中和（防御）抗体結合部位の多 くは、それらのターン構造であると知られているかまたはそう思われる。 例えば、エイズ（AIDS）を引き起こすウイルスであるHIV-1 の主要な中和決定 基（Ｖ３ループ）は、必須配列ＧＰＧＲＡＦを含有する。タンパク質二次構造推 定の全ての基準によりおよび実験的決定により、この配列は生来のタンパク質中 で逆ターンを形成する。この構造に対する抗体はHIV-1 を中和し、よって該ウイ ルスからの病原性作用から保護することが知られている。この配列を次のように ムチン配列中に置換することができる： ムチン P D T R P A P S T A P P A H G V T S A HIV −ムチン G P G R A F P A P S T A P P A H G V T S A または P D T R P A P S T A P P A G P G R A F 反復方式でのそれらの配列の合成は、生来のターン構造であるかもしれないも のの中にＶ３ループの多重コピーを有するムチン様分子をもたらすだろう。この ペプチド分子は例えば次のような応用において有利に用いることができる。 ムチン様分子はIgM 抗体を誘導することが示されている。IgM 抗体は五価であ り（円筒状に一緒に連結された５コピー）従って非常に大きい。よって、それら の抗体は優れた中和抗体になるかもしれない。この巨大なサイズは細胞へのウイ ルスの進入を阻止する上で非常に有効であろう。現在、多価抗原のみがIgM を誘 導するので、HIV-1 に対する既知の中和抗体はいずれもIgM でない。 更に、IgM はＨＬＡ無制限方式でＴ細胞と無関係に誘導することができる。こ れは、Ｔ細胞涸渇および／またはＴ細胞抑制であり従って効果的なＨＬＡ制限免 疫応答を開始することができないエイズ患者にとって有利であろう。大きな多価 Ｖ３ループ抗原はＨＩＶ陽性の人々に非常に有効な免疫治療薬であり、ウイルス に対する免疫を著しく高め、それらの絶望的な人々においてエイズの発病を遅ら せるかまたは防ぐことができる。 同一分子中により多くの配列情報と構造情報が含まれるという点からも、長鎖 のペプチドは有利である。例えば、Ｔ細胞エピトープをコードする追加の配列を 高プロリン骨格中に挿入し、縦列に反復させることによってムチン様分子を製造 し、Ｔ細胞依存性方式またはＨＬＡ制限方式で抗体を誘導することができる。 加えて、長鎖ペプチドは短鎖ペプチドよりもよい抗原となる。更に、長鎖ペプ チドは免疫系の表面上のＢおよびＴ抗原レセプターの 両抗原レセプターと架橋結合し、そして抗体産生かＴ細胞活性化のいずれかを直 接誘導する能力を示す。また、長鎖ペプチドは、例えば診断試験において有用で ある、与えられたペプチド基質と多価抗体との間での結合活性型相互作用の発生 を可能にするだろう。 ワクチンとしてまたはワクチンの成分としてのそれらのペプチドの利用に加え て、本発明のペプチドは診断目的にも利用することができる。測定しようとする 病気の免疫原性物質の特異エピトープを使ってデザインされた合成ペプチドを用 いて、生物学的試料中の特定の病気に対する抗体の存在および力価を検出するこ とができる。 よって、更に別の態様では、本発明は、生物学的試験試料中の特定の病気（例 えば癌、例えば膵臓癌、乳癌または結腸癌）に対する抗体の存在を検出する方法 であって、次の段階： ａ）エピトープを含む上述の合成muc-1 またはmuc-1 様ペプチドを、合成muc- 1 またはmuc-1 様ペプチド−抗体複合体が形成されるような条件下で生物学的試 験試料（例えば血清または血漿）と接触させ、ここで前記エピトープは前記病気 に対する抗体と反応性であり、そして ｂ）合成muc-1 またはmuc-1 様ペプチド−抗体複合体の形成を検出し、前記複 合体が特定の病気に対する抗体の存在を示すを含んで成る方法に関する。それら のペプチドを、例えば、標準的なエンザイム−リンクドイムノソルベントアッセ イ（ELISA）またはラジオイムノアッセイ（RIA）において使って、生物学的試料 中の抗体の存在を検出することができる。 その上、本発明のペプチドは、免疫化前および免疫化後の腫瘍に対する患者の 免疫応答を評価するための診断薬として利用することができる。例えば、長鎖合 成ムチンペプチドは、脾臓癌、乳癌、卵巣癌および結腸癌を有する患者における 進行中の免疫応答の有用な 指示薬になり得る。免疫化前後の抗ムチン抗体の存在は、短鎖ペプチドでは検出 できないが、例えば105アミノ酸ペプチドをELISAにおいて使うと容易に検出可能 である。このペプチドは、低レベルであるか存在している腫瘍への免疫応答を測 定するために、免疫化されていない患者においてさえも有用となり得る。よって 、該ペプチドは、それらの腫瘍に既に応答している患者と、応答していない人と を識別するために用いてもよい。この識別は、患者の病気の治療および予後の過 程に関する何らかの決断にかなり影響を及ぼし得る。 上記のことおよび技術の現状を考慮して、ELISA、RIA、間接免疫蛍光標識法お よびウエスタンブロット分析などといった検出技術を使って、生物学的試料中の 所望の病気に対する抗体を検出するための病気特異的試験キットを作製できるこ とは当業者に明白であろう。 別の態様では、本発明は癌細胞の増殖を抑制する方法に関する。 この方法は、次の段階： ａ）従来の技術を使って、試験哺乳類（例えばマウスまたはウサギ）に、合成 muc-1 様ペプチド−抗体複合体が形成されるような条件下で、エピトープを含む 上述の合成muc-1 様ペプチドを注射することにより腫瘍細胞に対する抗体を得、 ここで前記エピトープは前記癌細胞に対する抗体と反応性であり、そして前記哺 乳類から得られた前記複合体から前記抗体を単離し、 ｂ）段階ａ）からの単離された抗体を、抗体−薬剤複合体が形成されるような 条件下で、癌細胞の増殖を抑制することかできる薬剤と接触させ、そして ｃ）段階ｂ）からの抗体−薬剤複合体を、抗体−薬剤複合体が癌細胞と反応し そして癌細胞の増殖を抑制するような条件下で、癌細胞と接触させる を含んで成る。 前記薬剤は、放射性同位体（例えばイットリウム90およびヨウ素131）、化学 薬品（例えばメトトレキセート）、毒素（例えばリシンまたはそれの部分）また は酵素であることができる。 本発明は、哺乳類において免疫応答を抑制または阻止する方法にも関する。１ および２回の縦列反復（即ち20または40アミノ酸）は安定な二次構造を維持し、 且つ特異的なモノクローナル抗体と十分反応する。一般に、抗体の産生を刺激す るためには、抗原レセプターと架橋結合することができる数回の縦列反復を有す るペプチドが要求される。しかしながら、短い形は安定な構造を維持するがレセ プターと架橋結合しそして免疫系を活性化することができないため、それは免疫 応答を阻止するために用いることができる。これは自己免疫や移植において非常 に重要であるかもしれない。 従って、別の態様では、本発明は哺乳類において免疫応答を抑制する方法であ って、上述の免疫原性組成物を免疫原的に有効な量において哺乳類に投与する段 階を含んで成り、エピトープが該哺乳類により産生された自己抗体により認識さ れる方法に関する。 20または40アミノ酸だけの合成ムチン縦列反復ペプチドはレセプターと架橋結 合できないため、それらは免疫応答を刺激しない。しかしながら、免疫応答を抑 制または阻止する目的で、望ましくない免疫応答の様々な抗原または標的をムチ ン構造上に合成し、そしてそれの天然の標的との免疫応答の相互作用を阻止する のに使うことができる。 自己免疫における標的抗原はまだ未知である。しかし、自己免疫応答に関与す る特定のペプチドを同定し始めるための技術がたった今出現した。それらのペプ チドが同定されたら、自己免疫Ｔ細胞により特異的に認識される２または３アミ ノ酸残基も同定されるだろ う。それらの残基を使って、ムチン短鎖縦列反復ペプチド中のＤＴＲまたは別の 数個のアミノ酸を置換することができる。このペプチドはムチン様であり従って 構造的に安定であるため、Ｔ細胞およびＢ細胞レセプター並びに抗体に直接結合 し、そしてそれらと標的抗原との相互作用を阻止すると期待される。 この阻止方法を適用することができる自己免疫疾患の例は関節リウマチである 。標的抗原が未知であっても、関節リウマチと長さ３アミノ酸のアミノ酸配列の 全てを共有するＨＬＡクラスII分子の存在とには非常に強い関連がある。それら の配列はＴ細胞に抗原を提示することに関係すると思われる。ムチンＤＴＲ配列 を短鎖合成縦列反復ペプチド（20または40アミノ酸）上のそれらのアミノ酸配列 の１つにより置換することにより、自己免疫Ｔ細胞を阻止することが可能かもし れない。 自己免疫疾患はいずれも自己抗体の存在により特徴づけられる。多くの場合、 それらの抗体の正確な標的が既知である。よって、該抗体により認識される特異 エピトープを有する短鎖ムチンペプチドを使って、標的への結合を防止すること ができる。 本発明では、長鎖縦列反復ペプチド（例えば長さ105 アミノ酸）はレセプター と結合するだけでなく架橋結合するので、免疫刺激性である。短鎖のもの（例え ば長さ20または40アミノ酸）は結合するが架橋結合しないので、免疫応答を阻止 または抑制すると予想される。その意味で、それらは真の標的への結合を阻害す ることができるだけである。 移植片拒絶における標的抗原はＨＬＡ分子それ自体である。臓器提供者と臓器 受容者のＨＬＡ間で異なる配列を使い、ムチン構造上でそれらを合成し、そして 移植された臓器を拒絶する細胞または抗体を阻止するのに使うことが可能である 。 縦列反復構造を有する長鎖合成ペプチドを合成できることにより、本発明者ら は、ピッツバーグ大学で行った臨床試験において癌患者に最初の合成ペプチドワ クチンを試験した。このワクチンは、５回の縦列反復を含む長さ105 アミノ酸の ムチン合成ペプチド100 gをＢＣＧアジュバントと混合したものから成った。こ のワクチンを３週間おきの３回の皮下注射として投与した。このペプチドは上述 の手順で合成した。考案した臨床プロトコールはピッツバーグ大学協会検査局（ University of Pittsburgh Institutional Review Board）により認可された。 次いでこのプロトコールを食品医薬品局（the Food and Drug Administration） に提出し、特異性、同一性、毒性および安全性を試験した後、それは発明上新規 な薬剤であると認可された（BB-IND 5114）。あらゆる事前療法に失敗した進行 した膵臓癌、結腸癌および乳癌を有する60人の癌患者に対して第Ｉ相／第II相試 験を開始する認可が与えられた。この試験は、潜在的な毒性、および生体内で免 疫応答を調節する該ペブチドの可能性を試験するために設計された。ワクチン接 種した60人の患者においてペプチド関連の毒性は今までのところ全く観察されな かった。 本発明者らが達成しそして測定しようと試みている最も重要なパラメーターは 、ムチンを発現している腫瘍細胞を殺すことができるＴ細胞の数の増加であった 。ワクチン接種プロトコールを完了した最初の４人の患者では、細胞障害性Ｔ細 胞の数が倍増したようだ（表６）。 上述したように、長鎖合成ペプチドは、特異的な免疫応答を検出するための診 断用具として利用することができる。臨床試験において、本発明者らは長鎖縦列 反復ムチンペプチドのこの特徴を使って抗ムチンを検出し、従って潜在的に癌患 者の血清中の抗腫瘍抗体応答を検出した。ムチンペプチドのこの同じ特徴を使っ て、ワクチン 接種した患者のワクチン接種前と後の抗体レベルを測定した。予想通り、患者の 約10％が検出可能な抗体を示し、またワクチンのデザインから予想される通り、 抗体応答はワクチン接種後も増加しなかった（表７）。このワクチンはＴ細胞免 疫のみを増大するようにデザインされた。 この初期試験での重要な所見は、長鎖ムチン合成ペプチドを使って癌患者に先 在する免疫の状態を測定できることであった。本発明者らは100 gの105 マーペ プチドを単独で注入することによる皮膚試験を実施した。これは以前に患者によ り同分子が認識されたことがある場合にのみ反応を引き起こすだろう。表８は、 ほとんど全ての患者が該ペプチドに応答したことを示す。注射の部位を生検しそ して浸潤しているＴ細胞を試験管内で増殖させることにより、この応答を測定し た。これは、患者の腫瘍において以前に検出された同一エピトープが、合成ペプ チドによって適切に模倣されて読出（recall）応答を誘導したことを示した。主 要な免疫原性エピトープを含む９アミノ酸短鎖ムチンペプチド、９マー（+PDTRP ）、の等モル混合物に対してはより少ない応答しか観察されず、そのエピトープ を除外した短鎖ペプチド、９マー（-PDTRP）に対しても少ない応答しか観察され なかった。この少ない応答は短鎖ペプチドの認識かＨＬＡ依存性であるからであ り、そのため患者の全てがそれらを認識できるわけではなく、正しいＨＬＡ分子 を有する患者だけがそれらを認識できるのである。表８に含まれる55人の患者の うち、11人が無応答の者であり、これはそれらの病気のせいで全般的に抑制され た免疫状態を説明している。表９，10および11は、１または複数のペプチドに応 答した各患者についてのより詳細な応答の評価を与える。 これらの結果から幾つかの重要な点を導き出すことができる。 １．皮膚試験の結果から、長鎖合成ペプチドが癌細胞上に発現される生来のム チン分子を実際に模倣することは明らかである。以前に腫瘍上でこの分子と出会 ったことのある患者の免疫系は、合成ペプチド上の対応する免疫原性エピトープ を認識する。 ２．本発明者らは、有力なアジュバントであるＢＣＧとの混合物において105 マーペプチドを使って免疫の発生をまず試験することを選んだ。皮膚試験結果が 免疫系により認識され得る105 マーの能力を確証したので、長鎖ペプチドに基づ いて幾つかの異なるワクチン形態をデザインすることができる。他のアジュバン トを使ってもよく、ペプチド濃度を高めてもよく、ペプチドを様々なサイトカイ ンなどと組み合わせて投与してもよい。 ３．本発明者らは、該ペプチドが抗ムチン、従って細胞性（皮膚試験）と体液 性（ELISA アッセイにおける抗体）の両方の抗腫瘍免疫を検出するための診断用 具として利用できることを示した。 本発明者らは、次の乳癌、結腸癌または膵臓癌を有する患者において、９マー の長鎖ムチンペプチドの様々なプールに対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を使 って、乳癌、結腸癌および膵臓癌に発現されるムチンに対する免疫応答を評価す ることを提案した：１）未治療の患者、２）治療を終えた患者（治療後）および 明らかな病気を持たない患者、３）進行した転移性疾患を有する患者。このプロ トコールは、脾臓／胸部／結腸ムチンペプチドに対する免疫応答が生体内に存在 するかどうかの試験としてデザインした。膵臓、結腸または胸部の悪性を有する 患者では、ＤＴＨについて試験した患者において抗腫瘍作用と毒性副作用が両方 観察され得るが、これは非常に見込みかないと思われる。それらはこのプロトコ ールの二次的目標であろう。治療不可能なまたは転移性の病気をもつ20人の患者 を、三週間間隔で３回免疫処置し、そして生体内および試験管内免 疫反応性について評価することにする。 脾臓、結腸および乳腺癌は、正常な管上皮細胞の悪性形質転換から生じる。正 常な管上皮細胞も形質転換した管上皮細胞も両方ともそれらの表面上に大きな糖 タンパク質ムチンを発現しているが、正常細胞では管に面した先端の表面に限ら れている。一定数のムチン分子は細胞表面から開裂されて管の分泌物中に見つけ ることができる。腫瘍ではこの分子の指令的発現が失われ、そのため正常な管の 構造的圧縮が起こり、腫瘍細胞表面全体上へのムチンの異常発現、並びに末梢の 血液循環中のムチンの異常な存在を引き起こす。かくして、それは認識のための 免疫系の影響を受けやすくなる。 膵臓および乳癌患者からのＴ細胞系の細胞障害性特異性を特徴づけることによ り、本発明者らは患者のＴ細胞免疫を刺激することのできる腫瘍抗原としてムチ ン分子を同定した。本発明者らは更に、胸部腫瘍特異的モノクローナル抗体を使 って以前に限定された、この分子上のペプチドエピトープＰＤＴＲＰを同定した 。このエピトープは腫瘍特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の標的として働く。 正常なムチン産生細胞はこのエピトープを発現しない。このエピトープの存在ま たは不在は腫瘍特異的ＣＴＬによりムチン産生細胞を致死させることができるこ とと関係がある。これがムチンのポリペプチドコア上に存在する直鎖状エピトー プであること、それが正常ムチン上に隠れていること、グリコシル化により隠蔽 されること、そして悪性ムチン上では不完全なグリコシル化のために露出されて いることが今わかった。不完全なグリコシル化のために腫瘍ムチン上に優先的に 発現される、抗体により検出される他の幾つかのペブチドエピトープが存在する 。 臨床試験の目標は、縦列に反復したムチンエピトープを有する合成ムチンペプ チドと短いペプチドを使って、乳癌および膵臓癌患者 においてムチン特異的免疫応答の程度と頻度、並びに合成ムチンペプチドの注入 によりそれらの応答を誘導または増強できる可能性を評価することであった。こ の試験は、腫瘍の増殖の抑制と延長された生存をもたらし得る、より有効な抗ム チン免疫応答を証明した。 もっと複雑な免疫刺激剤、例えば組換えワクチン、サイトカイン含有製剤、ま たは細菌アジュバントと組み合わせた製剤を開発する前に、この分子に対する検 出可能な遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応の存在（または不在）を評価することが重 要であった。合成ムチンペプチドがワクチンとして機能する能力を、他の方法で は治療不可能な結腸癌または膵臓癌を有する患者におけるワクチンとして試験す ることにした。Ｔ細胞によるムチンのＭＨＣ制限および無制限認識 乳癌患者または膵臓癌患者のいずれかから誘導されたムチン特異的Ｔ細胞は、 全ての腫瘍の特異的溶解を行うことができたが、他のムチン産生腫瘍または正常 なムチン産生細胞は特異的溶解を行うことができなかった。胸部と膵臓の腫瘍ム チンのポリペプチドコア配列の同一性は、それら２つの腫瘍に対する独特の特異 性を説明した。幾つかの腫瘍特異的抗体と正常および腫瘍ムチンとの差異的な反 応性は、ＣＴＬ溶解に対する感受性と関係があるエピトープ発現の相違を指摘し た。 完全に保存された縦列反復構造は、明らかにこの分子のＭＨＣ無制限認識のわ けを説明した。ＭＨＣ無制限の抗原特異的Ｔ細胞活性化は、まれであるけれども 、ムチンに特有ではなく、むしろ一定の限定された特徴を有する分子およびエピ トープの性質であるかもしれない。Ｔ細胞は、それの抗原レセプターを通して抗 原または抗レセプター抗体のいずれかにより活性化される。抗レセプター抗体に よる活性化は、Ｔ細胞を活性化するのにレセプターの架橋結合が十 分であることを示す。ほとんどの抗原にとってＴＣＲの架橋結合や多重結合は非 常にありそうにない現象である。よって、たとえ３分子ＴＣＲ／抗原／ＭＨＣが 複合体を形成しても、ＣＤ４およびＣＤ８分子とそれらのＭＨＣリガンドとの補 助的な相互作用によりこの複合体がより安定になった時にだけ、単独のレセプタ ーからの有効なシグナルが伝えられる。ほとんどの抗原は単独では、正常な環境 下で、Ｔ細胞を活性化するのに十分な親和力でＴＣＲを結合しない。これが期待 でき且つ起こることがわかった次の場合がある：１）提示細胞上の抗原の密度が 非常に高く、そのため多数のＴ細胞レセプターが同時に結合し得る時；および２ ）抗原が十分に大きく、多数のレセプターが同時に結合し得るような多数の同一 の抗原性エピトープを有する時。ムチン分子はこれらの必要条件の両方を満たし ている。ムチン分子上の腫瘍特異的エピトープ ムチンが有効な腫瘍特異的抗原として働くためには、腫瘍細胞により作られる ムチンが正常細胞により作られるムチンとは或る程度異なることを想定しなけれ ばならない。腫瘍細胞に対してはあるが正常のムチン産生細胞に対してはない、 ユニークな胸部腫瘍特異的ＣＴＬの反応性はこの可能性を支持する。腫瘍により 産生されたムチンの炭水化物側鎖は、正常細胞により産生されたムチンの側鎖よ りも短いことが示されている。腫瘍ムチンでは潜在的グリコシル化部位の全てが 使われるわけではないという指摘もある。これは、正常では隠れている腫瘍ムチ ン上のタンパク質コアエピトープの露出(unmasking)をもたらし、それが腫瘍特 異的抗原として働く。正常ムチンでは同エピトープは完全なグリコシル化により 隠蔽されている（Girling A，Bartkova J，Burchell J 他、“A core protein e pitope of the polymorphic epithelial mucin detected by the monoclonal antibody SM-3 is selectively exposed in a range of primary ca rcinomas”Int．J．Cancer 43:1072，1989; HanischF-G，Uhlenbruck G，Peter- Katlinic J，Egge H，Dabrowski JおよびDabrowski U，“Structures of neutra l O-linked polylactosa-minoglycans on human skim milk mucins”J．Biol．C hem．264:872，1989；Yan P-S，Ho SB，Itzkowitz SH，Byrd JC，Siddlqui B お よびKim YS，“Expression of native and deglycosylated colon cancer mucin antigens in nomal and malignant epithelialtissues”Laboratory Investiga tion 62:698，1990）。 本発明者らは、腫瘍特異的エピトープの発現を不完全なムチンのグリコシル化 の結果として更に探究し、そして制御された実験設定においてこの現象を確認し た。この現象は今や再現できるように引き起こすことができる。それを念頭にお いて、免疫原性エピトープの合成的な最大露出を考慮に入れて、ＤＴＨ読みを試 験しそして免疫化するのに非グリコシル化合成ペプチドを使った。 今までに試験管内で行った実験は、ムチン産生腺癌を有する患者が該腫瘍と反 応することのできるＴ細胞を有するという証拠を提供し、そして今やレトロウイ ルスワクチンのデザインの基本として使うことができる腫瘍特異的エピトープの 性質に関する情報を提供する。それらの所見の詳細は次のように要約することが できる： １．癌患者の局所リンパ節から胸部または膵臓の腫瘍特異的Ｔ細胞（ＣＤ４＋ およびＣＤ８＋）を単離することができ、そして試験管内で多数に増殖させるこ とができる。 ２．この２つのＴ細胞集団は共にムチン分子上のエピトープと反応する。 ３．ＣＴＬ機能を阻止し且つムチン20アミノ酸ペプチドコア縦列反復配列 PDT RPAPGSTAPPAGHVTSA に特異的である抗体SM3 を使って、 ＣＴＬ活性の標的である１つのそのようなエピトープが同定された。 ４．Ｔ細胞とSM3 抗体が正常のムチン産生細胞を認識しないので、このエピト ープは腫瘍特異的と思われる。 ５．ポリペプチドコア上に置かれた幾つかの他のエピトープは腫瘍ムチン上に 選択的に発現され、正常ムチン上には発現されない。 ６．それらのエピトープの選択的発現の理由は、形質転換された細胞における ムチンの異常なグリコシル化である。 ７．ムチンcDNA発現ベクターは、ＥＢＶにより不死化されたＢ細胞中でムチン の高レベル発現を指令するが、このムチンはより多くグリコシル化され、或るエ ピトープ（例えば SM3）の発現を欠き、そして低レベルの別の腫瘍特異的エピト ープを発現している。 ８．トランスフェクトされた細胞におけるＯ−結合グリコシル化の阻害は、SM 3 の発現と別の腫瘍特異的エピトープの増加発現をもたらし、そしてＣＴＬの特 異的増殖を続けることができるそれらの細胞の能力とＣＴＬ溶解に対して感受性 である能力をもたらす（Kufe D，Inghirami M，Abe D，Hayes H，Justi-Wheeler HおよびSchlom J，“Differential reactivity ofａnovel monoclonal antibod y（DF3）with human malignant versus benign tumors”，Hybridoma 3:223，19 84；Hilkens J，Buijs F，Hilgers J 他、“Monoclonal antibodies against hu man milk-fat globule membranes detecting differentiation antigens of the mammary gland and its tumors”，Int．J．Cancer 34:197，1984; Burchell J ，Gendler SおよびTaylor-Papadimitriou J，“Development and characterizat ion of breast cancer reactive monoclonal antibodies directed to the core protein of the human milk mucin”Cancer Res．47: 5476，1987）。 別の病的部位上のＴ細胞により認識される明確な免疫原性エピト ープを細かく分析できることは、ごく最近になって可能になった（Hart MK，Wei nhold KJ，Scearce RM他、“Primimg of anti-human immunodeficiency virus（ HIV）CD8+ cytotoxic T cells in vivo by carrier-free HIV synthetic peptid es”Proc．Natl．Acad．Sci．88: 9448-9452，1991；Kast WM，Roux L，Curren J他、“Protection against lethal Sendai virus infection by in vivo primi ng of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with a free synthetic pepti de”Proc．Natl．Acad．Sci．88:2283-2287，1991；Battegay M，Oehen S，Schu lz M，Hengartner HおよびZinkernagel RM“Vaccination with a synthetic pep tide modulates lymphocytic choriomeningitis virus-mediated immunopatholo gy”J．Virol 66: 119-1201，1992）。しかしながら、この情報は、ワクチンと して短鎖ペプチドを使ってセンダイウイルスやリンパ球脈絡髄膜炎ウイルス感染 のような様々なウイルス疾患において感作と保護を可能にするために、1991〜19 92年の時間枠でマウスモデルに緊急に適用したものである。着手した下記に記載 の研究は、そのようなアプローチをヒトにおいておよび癌において試験する最初 の実例であった。長鎖合成ムチンペプチドの免疫原性 本発明者らは、５回の完全な20アミノ酸縦列反復と６回目の反復の５アミノ酸 から成るムチンペプチドを合成した。合計するとこのペプチドは６つの縦列に反 復したＴ細胞刺激性エピトープを含有する。ＮＭＲ分析と別の生物物理学的測定 を使って、このペプチドが、短鎖ペプチドよりもずっと高い結合力で抗ムチン抗 体と反応することができ且つ試験管内でＴ細胞増殖を刺激することができる生来 のムチン構造をとることを決定づけた。 この長鎖ペプチドを使ってBalb/Cマウスを免疫化した。100 g の 可溶性ペプチドを不完全フロイントアジュバントと混合して腹腔内投与した。三 週間間隔で２回、マウスに予防接種した。最後の予防接種後７日目に20 gの可溶 性ペプチドの肉趾注射によりＤＴＨについてマウスを試験した。ムチンに無関係 の長鎖合成ペプチドを対照として対側性の肉趾に注射した。追加の対照は免疫化 しないマウスであった。24，48，72時間目に肉趾の腫張を測定した。マウスを出 血させ、血清中の抗ムチン抗体を測定した。105 アミノ酸ペプチドにより事前に 免疫化した全てのマウスにおいてＤＴＨが観察された。比較的低レベルの抗体が 検出され、そのほとんどがIgＭイソタイプのものであった。 １回だけの反復と１つだけのエピトープを含有する長さ20アミノ酸の短鎖ペプ チドにより免疫化したマウスは、全く免疫を発現せず、そして105 アミノ酸ペプ チドを使って試験した時でも全くＤＴＨが観察されなかった。 この長鎖合成ペプチドが可溶性の未接合形態で免疫応答を惹起できることは、 非常に印象的である。より印象的なのは、それが体液性免疫よりも細胞性免疫を 優先的に誘導できることである。非常に免疫原性の複雑な担体タンパク質に接合 されたペプチドは通常非常に高い抗体レベルを生じる。抗体とＣＴＬの両方が同 一エピトープを認識できることは、特に特異的Ｔ細胞よりも優先的に且つ大量に 抗体が産生されれは、抗体が腫瘍に対するＴ細胞反応性を阻止することができる 可能性を示唆する。 次の非限定例は本発明をより詳細に説明する。 実施例 以下の実験において次の材料、方法およびプロトコールを使った。ペプチド合成 ペプチドは、Dupont（Boston MA）から購入した迅速多重ペプチド合成装置（R apid Multiple Peptide Synthesizer；RaPMS）上で手動法により合成した。合成 は、Dupont(Boston MA)から購入した0.１mM Rapid Amide（２，３−ジメトキシ ベンズヒドリルアミン）樹脂カートリッジを使って行った。溶媒としてのＮ，Ｎ −ジメチルホルムアミド(DMF)（タンパク質配列分析用）、塩化メチレン(DCM)（ 検定済A.C.S.用）およびメタノール（Karl Fischer用）はFischer Scientific(F air Lawn，NJ)から購入した。無水ピペリジンとトリフルオロ酢酸（タンパク質 配列分析用）はSigma（St．Louis，MO）から購入した。スカベンジャーとしての １，２−エタンジチオール、チオアニソールおよびアニソールはDupont（Boston MA）から購入 した。 Fmocアミノ酸の側鎖保護基は、アスパラギン酸とグルタミン酸がtert−ブチル エステル（OtBu）；セリン、スレオニンおよびチロシンがtert−ブチルエーテル ；アルギニンが２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ Pmc）；リジンがtert−ブチルオキシカルボニル（Boc）；ヒスチジンがトリフェ ニルメチル（trt）であり、全てのFmocアミノ酸はAdvanced Chem Tech(Louis-vi lle，KY)から購入した。アミノ酸は、アラニン、アルギニンおよびヒスチジンの 場合は対称無水物として；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グル タミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルア ラニン、プロリン、トリプトファン、チロシンおよびバリンの場合はペンタフル オロフェノール（OPfp）の活性エステルとして；セリンおよびスレオニンの場合 は３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ−４−オキソベンゾトリアジン（ODhbt） の活性エステルとして；ヒスチジンの場合は１−ヒドロキシベンゾトリアゾール （HOBt）の活性エステルとしてカップリングした。カップリング時間は、３mlの DMF 中で0.25ミリモルのOPfpまたはODhbt 活性アミノ酸と0.1 ミリモルのHOBtを 使って室温で標準１時間であった。0.25ミリモルのH0Btまたは対称無水物活性ア ミノ酸を使ったカップリング反応は、２mlのDMF と１mlのDCM 中で室温で１時間 行った。30アミノ酸の鎖長に達した後、ペプチド樹脂を半分に分けた。ただし新 たに分けられた樹脂部分の投入アミノ酸の濃度を溶媒３mlあたり0.25ミリモルに 維持した。各カップリング反応の終了時に、Dupont(Boston MA)から購入したニ ンヒドリン試験キット試薬を使ってニンヒドリン反応を行った。 Fmoc−Ｎα保護基は、合成サイクルの終了時に、３mlのピペリジン：DMF（50: 50）中で20分間振盪し、次いでDMF とメタノールで徹 底的に洗浄することにより除去した。側鎖保護基と樹脂からのペプチドの開裂は 、Isolab（AcKron，OH）からの５mlのポリプロピレンQuik-Sepディスポーザブル クロマトグラフィーカラム中で、３mlのTFA：チオアニソール：１，２−エタン ジチオール：アニソール（90:5:3:2）中で室温で４時間振盪することによって行 った。該カラムから冷エチルエーテル中にTFA とペプチド混合物を流出させ、次 いでエチルエーテルで３回続けて抽出した後、エチルエーテル：酢酸エチル（60 ：40）で３回抽出した。最後に、ペプチドを３mlの水に抽出し、凍結乾燥した。ペプチド精製 粗ペプチド混合物は、Waters 486吸光度検出器（Milford，MA）とCole Palmer 社(Chicago，IL)のリニア1200シリーズ記録計を取りつけたWaters 600Eクロマ トグラフ上での分析用逆相高圧液体クロマトグラフィーにより精製した。分析用 分離はWaters（Milford，MA）からのDelta Pak C18，300Å(3.9×300)mm RP-HPL Cカラムを使い、半調製用分離はuBondaPak C18，(7.8 ×300)mmカラムを使った 。クロマトグラフィー溶媒は、Fisher Scientific（Fair Lawn，NJ）からのHPLC 用アセトニトリルと水（両者とも0.1% TFAを含有する）であった。クロマトグラ フィー分離は、水（0.1% TFA）とアセトニトリル（0.1% TFA）の毎分１％の直線 勾配を使って行った。初期条件は水：アセトニトリル（95:5）であり、最終条件 は水：アセトニトリル（40:60）であった。質量分析 Vestec電子噴射源と2000 m/z領域に備えた201 型単一型四重極質量分析器（Ve stec Corp.，Houston，TX）を使って、電子噴射イオン化質量スペクトルを得た 。試料を４％酢酸：50％アセトニトリル中において５μl／分の速度で10μl注入 ループを通して噴射源に 供給した。円二色性 円二色性スペクトルは、Japan Spectroscopic Company（Jasco）J-710 型円二 色性分光偏光計（八王子市、日本）において記録した。Jasco PTC-343 ペルチエ 型恒温セルホルダーと温度制御プログラムを使って温度を制御した。25，55，75 および90℃において0.1 nm毎の読みを使って195〜260 nmに渡りスペクトルを記 録した。ペチド濃度は、ペプチドH2D8を除き、pH 7.2の0.01Ｍリン酸緩衝液中0. 1 mg／mｌのHPLC精製ペプチドであった。ペプチドH2D8はアセトニトリル：リン 酸緩衝液(0.01 M，pH 7.2)20：80中、1.0mg／mlで使用した。スペクトルを記録 するのに行路長さ0.1 cmの無張カクオーツキュベットを使った。試料のスペクト ルから溶媒スペクトルを差し引き、そして得られたスペクトルにノイズ低下サブ ルーチンをかけた。合計10回のスキャンを各試料について蓄積した。温度を高め ても溶媒スペクトルの変化は全く観察されなかった。ＴＲペプチドの¹H-NMR分光法 ¹H-NMR分析は、HPLC精製し凍結乾燥したペプチドを使って行った。使用濃度は 、H₂O/D₂O（90%/10%）またはD₂O（99.9%）のいずれかを使った0.1 リン酸緩衝液 ，pH 5.9中、6 〜7.5 mMであった。我々は、分子間の静電的相互作用を減らすた めに高イオン強度の緩衝液を使うことを選んだ。D₂O 実験には、ヒスチジンの部 分的プロトン化から起こるスペクトルの摂動を避けるために、ヒスチジンのpKa 値とはかなり異なるが5.9のpHを選択した。H₂O での一次元¹H-NMR 実験はpH 8.6 で実施した。 Aspect 3000コンピューターと5 mmの ¹Ｈ探査針を取りつけたBruker AM-500 N MR 分光計を使って、ムチンmuc-1 ペプチドのスペクトルを記録した。スペクト ルを25℃で記録し、探査針の温度を BVT-1000装置を使って制御し、そしてメタノール試料を使って較正した。該ペプ チドのD₂O スペクトルは溶解から5 〜10分後に記録した。H₂O/D₂O 中のペプチド 試料の場合には、1.5 秒の反復遅れの間に水シグナルの抑制を行った。１本の90 °パルスの後から一次元スペクトルを記録した。水の事前飽和を行わずにH₂O 試 料の対照スペクトルをとり、与えられた電力レベルで水シグナルの事前飽和によ りアミドプロトンが１つも影響を受けないことを保証した。二次元相関スペクト ル（COSY）は位相感受性モードで記録した。Ｆ１とＦ２の両方の時間領域データ に正弦ベルフィルターをかけた。得られたデータサイズは2048×1024点であった 。ゼロファイリングを使って4096×4096点の最終データ行列を得た。全ての化学 シフトは、0.0 ppmの基準化合物２，２−ジメチル−２−シラペンタン−５−ス ルホン酸（DSS）に対する相対値であった。固有粘度 全ての粘度測定は、pH 7.0および30℃の0.1 M リン酸緩衝液中のHPLC精製ペプ チドを使って、Cannon-Fenske-Ostwald 型細管粘度計を使って実施した。手順は 以前に記載された通りであった（Tanforrd他、J．Am．Chem.，89:729-736，1967 およびBuzzell 他、J．Phys．Chem.，60:1204-1207，1956）。細管定数はTanfor d およびBuzzell，1956により報告されたように計算されたものであった（Tanfo rd 他、J．Phys．Chem．60:225-231，1956）。動粘度測定を少なくとも10回繰り 返し、平均値を使って固有粘度を計算した。固有粘度は動粘度から計算し、そし て推奨されるように（Tanford，1955）適当な密度補正（0.0029ml／ｇ）を行っ た。Simha 形状係数とペプチドの軸比はTanford，1961およびCantor他，1980に 従って算出した。60アミノ酸ペプチドの分子模型化 ヒトムチンmuc-1（Gendler 他、PNAS USA，84:6060-6054，1987）遺伝子の縦 列反復（ＴＲ）領域の配列を、Tripos分子グラフィックプログラムSybyl（St．L ouis）を使って、シリコングラフィックモデルINDIGO(Mountain View，CA)端末 上でポリＩ型ターンコンホメーションに模型化した。この模型を使って、縦軸と 横断面軸を測定し、60アミノ酸ペプチドの軸比（縦／横断面）を見積もった（表 ３）。 ヒトムチンmuc-1，2，3，4のＴＲ領域も、二次構造の推定のためにChouおよび Fasman，1978（Chou他、Ann．Rev．Biochem.，47:251-276，1978）のルールに従 って模型化した。記載されたような（Parker他、Biochemistry，25:5425-5431， 1986）「面プロット」演算法を使って面ポテンシャルを推定した。Margalit他の “Amphi”演算法（Margalit他、J．Immunol.，138:2213-2229，1987）を使って 、潜在的な両親媒性α−ヘリックス領域を推定した。それらの分析の結果を使っ てコンホメーション模型を作製した（結果は示してない）。反復あたりの推定タ ーン数を表Ｉに要約する。 実施例１ペプチド合成 PaMPSにより合成したペプチドの配列を表４に示す。天然のムチン縦列反復配 列は表４のNo.１に示される。ネコ白血病ウイルスの完全な高プロリン中和領域 とこの領域の42アミノ酸Ｎ末端断片はそれぞれ表４のNo.2とNo.3に示される。改 変型縦列反復タンパク質を作製するのに使ったＴ細胞エピトープはそれぞれ表４ のNo.4とNo.5に示される。 表４に指摘したようなヒトムチンmuc-1 縦列反復配列を使って、本発明者らは 上述した手動固相ペプチド合成により、１，２， ３， ４および5.25回の完全な縦列反復から成る一連のペプチドを合成した。図８ａは 、105 アミノ酸ムチンペプチドの合成からの粗製ペプチド生成物のHPLCプロフィ ールを示す。9770ダルトンの正規分子量を示す主画分の電子噴射質量スペクトル （ＥＭＳ）が下に与えられている（図８ｅ）。105 アミノ酸ムチンペプチドから 得られたHPLCプロフィールとＥＭＳは、ヒトムチンmuc-1 タンパク質コアの１， ２，３および４回の縦列反復に相当する20，40，60および80アミノ酸ペプチドの 合成からのプロフィールを象徴する。それらは全て驚くほどの合成効率と忠実度 を示した。表５に示されるようにムチンペプチド合成の各々について期待通りの 分子量が得られた。ムチンペプチドの半調製的精製時に、典型的には85〜92％の 回収率の最終生成物が得られた。 ネコ白血病ウイルス外面構成単位gp-70Eの全60アミノ酸高プロリン領域（FeLV -PRN60）の合成もRaMPS により試みた。図８ｂは、この手動合成からの粗合成産 物の分析用HPLCプロフィールを示す。主画分のＥＭＳ（図８ｆ）と表５は正しい 分子量が得られたことを示す。PRN60 のＮ末端42アミノ酸に相当する関連ペプチ ド(PRN42)も、主画分の分子量により指摘されるように（表５）正しく合成され た。PRN60 の小型類似体に相当する他のペプチドも全て、同等な効率と忠実度で 合成された。 次に、表４に示されるシトメガロウイルスpp89配列の初期調節タンパク質（H2 D8）からの縦列に反復した９アミノ酸Ｔ細胞エピトープに相当するペプチドを合 成した。このペプチドは以前にH-2D^d マウスにおいて最適免疫原性ＣＴＬエピト ープとして同定された（Reddehase 他、Nature，337: 651-653，1992；Boyd 他 、PNAS USA，89:2242-2246，1992）。これはムチン縦列反復配列の主要な免疫優 性ＢおよびＴ細胞エピトープ（ＰＤＴＲＰ）中に見つかるよ うな３アミノ酸により隔てられた２つのプロリンを含むため、このペプチドを選 択した（Barnd 他、PNAS USA，86:7159-7163，1989；Jerome他、Cancer Res.，5 1: 2908-2916，1991）。このペプチドは９アミノ酸あたり２個のプロリン残基を 含み、従って22％がプロリンである。８回の縦列反復を含む粗製の合成72アミノ 酸（H2D8）ペプチドのHPLCプロフィールを図８ｃに示す。H2D8ペプチドは疎水性 がムチンおよびFeLVペプチドと大きく異なっている。主要HPLC画分のＥＭＳ結果 は、正しいペプチドが得られたことを証明する（図８ｇ）。５回の縦列反復に相 当するペプチドも同様な結果を示した（表５）。 H2D8の疎水性を減らすために、配列中の10位にセリンを付加し、そして４位の フェニルアラニンをアラニンに置換してH2Dmuc7 を作製した。このペプチドは７ つの縦列反復配列から合成した（表４）。H2Dmuc7 中のこれらの変更は、70アミ ノ酸のHPLCプロフィールにより証明されるように疎水性が著しく減少したペプチ ドをもたらした（図８ｄ）。主画分のＥＭＳスペクトルは正しいペプチドが得ら れたことを示す（図８ｈ）。 生成したペプチドのコンホメーションが合成の容易さと関係づけられる可能性 を調べるために、HPLC精製ペプチドについて円二色性分光法を実施した。ムチン 105 アミノ酸ペプチドのＣＤスペクトルを図９ａに示す。198 nmのところの大き な負のピークは、ウシエラスチン（Urry，J．Prot．Chem.，7:1-34，1987）、Ｃ ホルデイン（Tatham他、Biochem．J.，226:557-562，1985）、並びにコラーゲン およびポリプロリンII（Madison およびSchellman，Biopolymers，9:511-567，1 970b）を包含する、伸びた構造を形成することが知られている高プロリンタンパ ク質に特徴的である。ネコ白血病ウイルスPRN60 を使って得られたスペクトル（ 図９ｂ）はムチンで得られ たものと同じであった。疎水性（H2D8）のため、pH 7.2の0.01Ｍリン酸緩衝液中 に不溶であるので、縦列反復Ｔ細胞エピトープペプチドのスペクトルはアセトニ トリル：リン酸緩衝液（20：80）中で得た。そのスペクトルは、222 nmのところ の大きな負のピークと238 nmのところの小さな負のバンドから成った。変更H2D8 ペプチド（H2Dmuc7）の場合はリン酸緩衝液中で測定し、それを図９ｄに示す。 このスペクトルはムチンやPRN60について得られたものと類似しており、198 nm のところに大きな負のＣＤバンドを有する。 198 nmのところの大きな負のＣＤバンドは、モデルプロリン化合物Ｎ−アセチ ル−Ｌ−プロリン−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミド（AcPro-DMA）（MadisonおよびSche llman，Biopolymers，9:511-588，1970b & c）について得られたものと同じであ った。水溶液中のAcProDMAの198 nmのところの大きな負のＣＤバンドは、３つの π−π^* 遷移と１つの大きなｎ−π^* 遷移のためであることが示され、そしてト ランス配置にあるプロリンに特徴的であることが示されている（MadisonおよびS chellman，Biopolymers，9:511-588，1970b & c）。シス配置にあるAcProDMAの ＣＤスペクトルは疎水性環境で好まれ、198 nmのところに正のバンドを生じる。 シス異性体とトランス異性体の混合物のスペクトルは、２つのスペクトルの線形 結合により表すことができた（Madison およびSchellman，Biopolymers，9:511- 588，1970b & c）。 198 nmの負のＣＤバンドがシスとトランスプロリン異性体のためであるのかま たはコンホメーション効果のためであるのかを見るために、本発明者らは、温度 を高めると198 nmのＣＤ強度が減少する可能性を試験した。ＣＤスペクトルを25 ，55，75および90℃で記録した。図８ａ，ｂおよびｄは、0.01 Mリン酸緩衝液 p H 7.2 中での198 nmのＣＤ強度が、25℃と比べて90℃ではムチン105の場合33％ 、 PRN60 の場合29％、そしてH2Dmuc7 の場合22％減少したことを示す。対照的に、 215 nm〜約240 nmのショルダー領域のＣＤ強度は、温度を増加させると全てのペ プチドの場合に増加する。ムチン、PRN60 およびH2Dmuc7についての温度曲線の セットは、208，209および207 nmで等円二色性点を示す（図９ａ，ｂおよびｄ） 。このことは、１つは高温もう１つは低温において２つの目立たない分布が存在 することを示唆する（Tatham他、Biochem．J.，226:557-562，1984）。H2D8のＣ Ｄスペクトル（図９ｃ）を10倍の濃度で記録したら、198 nmの大きな負のピーク が欠けていた。これは、20％アセトニトリル中ではシス配置のプロリンを含むこ とを示唆している。H2D8のスペクトルの残部は、温度を増加させるとムチン、PR N60およびH2Dmuc7のショルダー領域と同様にふるまった。 図10は、ムチン20，60および105 アミノ酸ペプチド、PRN60 、H2Dmuc7、並び にプロリンを含まない10アミノ酸対照ペプチド（TAENAEYLRV）についての25℃で のモル楕円率〔θ〕のプロットを示す。明らかに、高プロリンペプチドは、二次 構造の形成を表す非常に大きい〔θ〕を示す（図10）。25℃における高プロリン ペプチドの〔θ〕：対照ペプチドの〔θ〕の比は、ムチン20アミノ酸ペプチドの 3.2 からムチン105 アミノ酸ペプチドの21.1までの範囲に及ぶ。ムチン縦列反復 配列の数の増加に伴うそれらの〔θ〕の増加は、¹H-NMR分光法およびモノクロー ナル抗体結合データにより検出されるような生来の二次構造の形成と相関関係が ある（Fontenot他、印刷中、1993Ａ）。 実施例２生来のmuc-1 に対するモノクローナル抗体が合成ペプチドを認識した モノクローナル抗体は当業界で公知の方法により得ることができる。例えは、 ムチンを発現するヒト腫瘍細胞、または糖部分を取り外したもしくは取り外さな い精製ヒトムチンを使ってマウスを免疫化することにより、抗体を得ることがで きる。モノクローナル抗体は標準的なKohler Milstein のハイブリドーマ技術に より製造した。 muc-1 タンパク質コアの１回、２回および３回の縦列反復に相 当する合成ペプチドが生来の構造に折り畳まれることを確かめるために、それら のペプチドをmuc-1 特異的モノクローナル抗体のパネルと反応させた（表２）。 それらの抗体はmuc-1 の癌関連形態に特異的なエピトープと反応することが既に 示されている（Taylor-Papadimitriou，Int．J．Cancer，49:1-5，1991およびJe rome他、Cancer Res.，52: 5985-5990）。固相ELISA においてこの抗体を等量の 合成ペプチドと反応させた。反応性は時間に伴う色の変化の傾きとして定義され る。 大部分の抗体は１回の反復に相当しそしてプロリン１で始まる20アミノ酸ペプ チドと反応することができなかった（表２）。しかしながら、それらの抗体はタ ンパク質コアの２回および３回の縦列反復に相当するペプチドと反応した。これ は、おそらく、それらの抗体により認識される優性エピトープ（ＰＤＴＲＰ）の 生来の提示が少なくとも前の反復配列のアラニンを必要とすることで説明がつく だろう。この結果は、アラニンを別のアミノ酸により置換できること、および担 体またはピンに連結されたペプチドがアラニン無しでも反応するだろうことを示 した他の者により得られた結果（Price 他、Molecular Immunology，27:795-802 ，1990およびXing他、Immunology，72，1991）を説明することができる。40およ び60アミノ酸ペプチドとモノクローナル抗体の反応性の増加よ、それらのエピト ープがグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとり、 生来のムチンに見られる構造を反映することを表す。 実施例３ムチンタンパク質コアが折り畳まれた安定な二次構造を形成した D₂O 中のムチン60アミノ酸ペプチドの二次元相関分光法（COSY）のフィンガー プリント（指紋）領域は、幾つかの交換不能なアミドプロトンの交差ピークを明 白に示す。スペクトルのこの特定領域は、アミド−¹Ｈと¹Ｈ−αプロトンとのス カラー関係を示す。それらの交差ピークは、27℃で12時間以上の期間の間に交換 しなかった。よって、それらのアミドプロトンは折り畳まれたムチンの三次元構 造の内側で非常に良く保護されると思われる。この実験は、以前に報告されたラ ンダムコイル構造（Jentoft，Trends Biochem．Sci.，15:291-294，1990）とは 全く異なり、ムチン60アミノ酸ペプチドが溶液中で安定な規則正しい構造を保持 していることを明らかに示す。 実施例４ 構造の発展は多重縦列反復を必要とする 図３は、アミノ酸側鎖のβ−プロトンに特徴的である¹H-NMRスペクトルの領域 を示す。muc-1 縦列反復配列はＴＲあたりただ１つのアスパラギン酸（Ｄ）残基 と１つのヒスチジン（Ｈ）残基を含み、それらのアミノ酸の側鎖のβ−プロトン はスペクトルの２つの別々の領域に分解される（Wuthrich，NMR of proteins an d nucleic aclds，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1986）。図３は、１回 の縦列反復、２回の縦列反復および３回の縦列反復に相当する合成ペプチドのス ペクトルと遊離アミノ酸のスペクトルとの比較を示す。矢印は、ペプチド中の縦 列反復の数の増加に関係するスペクトル中の差異を表す。それらのスペクトルは 、規則正しい構造の発展 がペプチド中の縦列反復の数（サイズ）に依存することを表す。それらのペプチ ドの二次構造がランダム構造であったとしたら、この領域のスペクトルは存在す る反復の数に無関係であり、且つ遊離アミノ酸のものにぴったり一致すると予想 される（Wuthrich，NMR of proteins and nucleic acids，John Wiley & Sons， New York，N.Y.，1986）。図３のデータは、該スペクトルが反復の数に依存し且 つ遊離アミノ酸に観察されるスペクトルとは有意に異なることを明らかに示して いる。 遊離アミノ酸、またはmuc-1 コアの20アミノ酸反復配列を１、２もしくは３回 含むペプチドは、ＤＳＳからの1.6 〜3.3 ppm のスペクトル領域中の¹H-NMR反応 性プロトンを考察すると、いずれも同じ情報を含む（Wuthrich，NMR of protein s and nucleic acids，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1986）。異なる化 学シフトやピークの数は、ペプチド骨格の構造的変化（折り畳み）から起こる局 所的な磁場の変化の結果である。図３で特に着目されるのは、遊離アミノ酸から １、２および３縦列反復へと移るにつれて、アスパラギン酸のβ−プロトン共鳴 （2.4 〜2.7 ppm ）に起こる明確なスペクトル変化である。同様に、構造的変化 は、タンパク質の縦列反復の数が増加すると起こるヒスチジンβ−プロトン共鳴 （2.9 〜3.3 ppm）の変化からも明らかである。これらの結果は、わずか１回の2 0アミノ酸反復を有するペプチドでは規則正しい構造が完全には形成されず、２ および３回の縦列反復を含むより大きなペプチドが協同的形成構造をもたらすの に十分な折り畳み情報を含んでいることを示すと解釈することができる。 実施例５ 固有粘度測定は折り畳まれた棒状構造を支持する 固有粘度〔η〕ml/gは折り畳みの状態およびタンパク質の分子形状（球状対棒 状）に敏感な尺度である（Tanford，Physical Chemi-stry of Macromolecules， John Wiley and Sons，New York，N.Y.，798-799頁，1961およびTanford 他，19 67）。Tanford は、ランダムコイル状態にあるタンパク質について、固有粘度〔 η〕ml/gが最大でありそして式〔η〕ml/g＝0.684 ｎ^0.67（ここでｎはタンパク 質中のアミノ酸の数である）により与えられることを示した。タンパク質のラン ダムコイル固有粘度は残基の数にだけ依存する。60アミノ酸ペプチドについての 固有粘度値は10.7ml/gであると推定される。３反復を有するmuc-1 合成ペプチド についての測定値は7.71ml/gである（表３）。7.71ml/gのこの値は、ランダムコ イルの36アミノ酸ペプチドの予測固有粘度に相当するだろう。３反復を有するmu c-1 ペプチドの固有粘度の測定値は、muc-1 ペプチドがランダムコイルであると した場合の予測値よりも有意に小さい。従って、固有粘度に基づくと、このペプ チドは溶液中で規則正しいコンホメーションをとり、これは前のＮＭＲ実験によ り提唱された構造と一致する。 固有粘度は分子形状についての情報も与えることができる。あらゆる球状タン パク質の固有粘度は3.3 〜3.9 ml/gであり、そして分子量に無関係である（Tanf ord，Physical Chemistry of Macromol-ecules，John Wiley and Sons，New Yor k，N.Y.，798-799頁，1961）。３反復を有するmuc-1 ペプチドの7.71ml/gという 値は球状形を排除し、9.2 の軸比（長軸／幅）を有する棒状形と一致する（Cant or他、Biophysical Chemistry Part２：Technique for the Study of Biologica l Structure and Functions，W.H．Freeman and Co.，New York，N.Y.，1980） 。この軸比測定値(9.2)は、ペプチド配列をＩ型逆ターンの連続として模型化し て分子グラフィックプログラ ムSybyl から決定した 9.7の値（表３）とよく一致する。 固有粘度値から、３反復を有するペプチドが、33〜34Å／反復の縦スパンを有 する棒状形である、溶液中で規則正しいコンホメーシヨンを形成すると結論づけ ることができる。この結果は、非グリコシル化タンパク質コアが電子顕微鏡写真 に見られる伸びた構造（Lan 他、J．Biol．Chem.，262: 12863-12870，1987）を 決定できたことを示唆する。それらの結果はまた、muc-1 タンパク質コアがポリ プロリンβ−ターンヘリックスとして存在するという仮定も支持する。 実施例６muc-1 ＴＲ領域についてのポリプロリンβ−ターンヘリックスの模型 。 図７は、ムチン配列がポリＩ型ターンコンホメーションで存在すると仮定する ことにより作った、ポリプロリンβ−ターンヘリックスコンホメーションの60ア ミノ酸ペプチドのコンピューター模型を示す。この模型は、アミノ酸側鎖が横に 伸びた棒状骨格から外側に放射状にのび、溶媒に完全に暴露されることを明らか にする（図７）。この側鎖の配向は、潜在的なグリコシル化部位がグリコシル化 機構に接近しやすくする。この二次構造はグリコシル化に必ずしも依存しないし 、炭水化物の付加により破壊される必要もない。この模型は、ペプチドを加熱し た時にＮＭＲスペクトルに影響がないことを説明する。嵩張った疎水性コアから 水性外部へと動く側鎖を有する球状感覚では全く折り畳みは起こることができな いので、加熱した時の側鎖プロトンの大きな化学シフトは全くない（Price 他、 Molecular Immunology，27:795-802，1990）。この模型は、ＡＰＤＴＲＰの基本 エピトープ中でＡおよびＤＴ残基がなぜ置換可能であ るかも説明する。ターンが形成されると、ＰとＲアミノ酸側鎖は同じ場所にあり 、そして抗体への結合に利用可能である。このターンの形成が可能である置換は 許容されるだろう。 実施例７ 臨床試験 倫理的考察： 転移性疾患を持たない患者には「ワクチン接種」は実施せず、無担体で無アジ ュバントのムチンペプチドに対するＤＴＨの単純な検出を行う予定だったので、 全くまたはほとんど毒性を招かないだろうと予想された。それらの患者において 全く患者の直接の恩恵は生じないであろうが、この患者またはその後の患者のた めになる免疫療法の基礎として役立つ。治療不可能な膵臓、結腸または乳癌を有 する30人の患者（グループ３）にはそれらのペプチドとアジュバントを使ったワ クチンを投与する。スキーム： 患者を次のグループにより成層化した〔膵臓癌（Ｐ）、乳癌（Ｂ）、結腸癌（ Ｃ）〕： グループ１．未治療の患者（10Ｐ，10Ｂ，10C） グループ２．治療後のグループ（10P，10Ｂ，10C） グループ３．進行した転移性のグループ（60pts ：治療のために差し出さ れた適任の患者として成層化した） ・ムチンに対するＴ細胞反応性の試験のためのＰＢＬの収得；およびＨＬＡ型 決定。 ・抗体により限定される免疫反応性ムチンの存在についての原発性腫瘍の免疫 組織化学。 ・血中のムチンまたはそれに対する抗体の存在について血清を試 験した（ELISA）。 ・３つの別々の製剤を使って免疫反応性を試験した。第一は、アミノ酸1-9，2 -10，3-11，15-23，16-24，18-26，20-28から成る８つの別個のノナマー配列を 包含し、そして事前の血清反応性および細胞反応性に基づくとおそらく免疫原性 エピトープであると思われる５アミノ酸のうち少なくとも３つを含有するペプチ ドを構成した。第二の製剤は、その他の７つのノナマー配列を包含した。第三の 製剤は、ムチン分子中に見られる６つの保存された縦列反復配列に及ぶ合成105 アミノ酸ポリペプチドから成った。 ・個々の９アミノ酸ペプチドプール〔製剤１：PDTRP 優性、製剤２：他のペプ チド（6-14，7-15，8-16，9-17，10-18，11-19，12-20，14-22）および製剤３： 105 アミノ酸ペプチド(1-105)〕に対する段階的（1，10，100μg ）皮膚試験。 ・一般の読出抗原に対する反応性についての同時マルチ試験（Merieux）。 ・24時間および48時間目に紅斑と硬化について皮膚試験を評価する。 ・最大抗原投与部位の皮膚パンチ生検：１）免疫病理学、２）その場のサイト カイン遺伝子発現、３）Ｔ細胞培養、４）サイトカイン並びにＶａおよびＶＳ用 法のためのＰＣＲ。 ・３〜８週間目に最大の試験管内反応性を有する２つのペプチドと試験管内反 応性を全く持たない１つのペプチドを使ってＤＴＨ試験を繰り返し、反応性患者 での105 aaペプチドに対する応答により制御する。試験管内試験が全くペプチド 優性反応性を示唆しない場合、個別に試験したグループ中に８つのペプチドの各 々を有する患者がいるかもしれない。 ・ＤＴＨ試験の間毎日（０，２４および４８時間目）と試験後１〜４ 週間目に、ウイルス徴候、アミラーゼ、リパーゼ、ＢＵＮ／クレアチン検査。 ・３，６および９週間目に100μg の長鎖ペプチドとＢＣＧ（５×107 TICE BC G；Organon Teknika Corp.，Chicago，IL．）によるグルーブ３の患者のワクチ ン接種；12週間目に３つの異なるペプチド製剤に対するＤＴＨ試験を繰り返しそ して病気の程度を評価する。患者の選択： この評価のために、ピッツバーグ大学医療センターの診療所と病院の中、主と してピッツバーグ癌研究所の施設の中で患者を選択した。主任研究者との相談後 に診察医および関係医により患者をカウンセリングしたか、あるいはまた患者を プロトコールナースによる最初の「集団検診（screening）」に差し向けること によりカウンセリングした。適任判定基準： ＤＴＨ試験のためには、患者は組織学的に証明された膵臓癌、乳癌または結腸 癌を有していなければならなかった。免疫化のためには、（グループＣ）患者は 、他の通常の治療形態が全く有意な治癒の望みや緩和を与えないような転移性の 切除不可能のまたは局所的に再発性の病気を有していなければならなかった。 生検は脾臓、結腸または乳癌を証明した。 患者はＤＴＨ試験前に化学療法を受けていてもよい。化学療法から少なくとも ４週間が経過していなければならない。 患者は放射線療法を事前に受けていてもよいが、ただし少なくとも４週間が経 過していなければならない。 少なくとも３か月の平均余命を有する０〜２の動作状態（Zubrod）であること 。 患者の年齢は少なくとも18才であった。 患者は治療の開始時に次の状態であった：3500mm³ より高いＷＢＣ、100,000 mm³ より高い血小板数、1.5 mg／dl未満の血清クレアチンまたは60cc／分より大 きいクレアチンクリアレンス、１.5mg／dl未満の血清ビリルビン。 患者は主な手術の影響から回復していなければならず、且つ感染を免れていな ればならない。 書面によるインホームドコンセプトが得られていなくてはならない。不適任判定基準： 糖質コルチコイド療法またはNSAIDsを含む抗炎症剤で最近治療した患者は不適 任であった。 ムチンの抗体染色に利用可能な凍結組織またはパラフィン固定組織のない患者 は不適任であった。臨床の場所： 全ての患者はピッツバーグ癌研究所の外来患者用室でまたは臨床検査センター 外来患者用室において治療した。試験によっては、診断精密検査の一部として患 者をMontefioreまたはPresbyterian大学病院に入院させて投与したものもある。実験期間： 12カ月。評価計画： ＤＴＨ試験 免疫反応性を試験するのに３つの異なる製剤を使った。第一は、アミノ酸1-9 ，2-10，3-11，15-23，16-24，18-26，20-28から成る８つの別個のノナマー配列 を包含し、そして事前の血清反応性および細胞反応性に基づくとおそらく免疫原 性エピトープであると思われる５アミノ酸のうち少なくとも３つを含有するペプ チドを構成し た。第二の製剤は、その他の７つのノナマー配列を包含した。第三の製剤は、ム チン分子中に見られる５回の保存された縦列反復に及ぶ合成105 アミノ酸ポリペ プチドから成った。 用量 各ＤＴＨは、皮内注射される各製剤１mcg，10 mcg，100 mcgから成る0.05ml／ 部位の３つまでの別個の注射から成った。等モル濃度の各構成成分のノナマー配 列を、統計学者により決められた通りにランダムに調合し、１〜９までの番号を 付けたシリンジ中に入れた。全ての試験は、正中線から２，４および６cmのとこ ろの後神経幹上において実施し、３つの試験の各セット（合計９）を垂直軸に少 なくとも２cm離して実施した。後神経幹の対側性部位において、細胞性過敏症の 抗原（Merieux）を使ったマルチテストＣＭＩ皮膚試験を行った。各試験は、次 の７つの遅延型過敏症皮膚試験抗原および負の対照としてのグリセリンが予め充 填されたディスポーザブルプラスチックアプリケーターを使用した：破傷風毒素 抗原、ジフテリア毒素抗原、連鎖球菌抗原、旧ツベルクリン抗原、カンジダ抗原 、白癬菌抗原およびプロテウス抗原（NDC 50361-780-80）。 スケジュール 標準的な読出抗原とムチン由来ペプチドの両者についてのＤＴＨを第０日に実 施し、そして24，48および72時間目に測定した。皮膚試験を判断し、各皮膚試験 について紅斑と硬化の垂直直径を記録した。 血中ムチンのアッセイおよびムチンに対する抗体の検出に用いる血清 ＤＴＨ試験の前に二本の赤印付チューブに全血を採血した。 ＤＴＨ試験の直前に、個々のムチンペプチドに対する試験管内Ｔ細胞反応性用 に60mｌのヘパリン化血液（６本の緑印付チューブ）を 得た。 ムチンペプチドに対する陽性皮膚試験と対照として正の読出抗原のいずれかに 対する陽性皮膚試験のために、局所麻酔下で６mmのパンチ生検を得た。反応性が 全く観察されなかったら、適用した最大濃度(100μg)の各々の生検材料を生検し た。パンチ生検の半分をその場でのサイトカインアッセイと免疫組織化学検査の ためにＯＣＴ中に埋め込んだ。もう半分は、Ｔ細胞の増殖のためにFinn博士の研 究室に運んだ。 追跡調査 潜在的な病気についての患者の定期的な追跡調査の一部として、患者を一週間 目と三週間目に観察した。ワクチンプロトコール： グループ３の患者に、皮膚試験の結果に関係なく、0.15mlの注射用生理的食塩 水（ＵＳＰ）中の100 g のp105ペプチドと5 ×107 凍結乾燥TICE BCGコロニー形 成単位（Organon Teknika Corp.，Chicago，IL）を使って別々の部位にワクチン 接種を行った。 スケジュール 最初のＤＴＨ試験の後３週目、６週目および９週目に患者にワクチンを投与し 、そして８週目にはＤＴＨについて記載した通りペプチドにより再試験した。８ 週目に通常のＸ線写真判断基準を使って抗腫瘍応答の証拠についても再評価した 。 ３週目、６週目および12週目に、アミラーゼ、リパーゼおよびクレアチンにつ いての血清検査を行った。毒性の評価および管理： 全ての毒性は一般の毒性評価基準を使って等級をつけることにした。今までに 未知のまたは非常に深刻な毒性は薬害反応としてＮＣＩに事前報告しなければな らなかった。 第Ｉ相ＡＤＲ報告のＮＣＩ要件は次の通りであった。主任研究員の責任は、次 の事のいずれか起こった場合に24時間以内にＩＤＢへの電話連絡（301-496-7957 ，24時間受付）により報告することであった：薬剤投与によると思われる全ての 生命にかかわる事（等級４）；致命的でき事；および等級に関係なく今までに定 義されていない毒性の最初の発生。10日以内に、Investeigational Drug Branch ，P.O．Box 30012，Bethesda，MD 20814に、あとから書面による報告を行わなけ ればならなかった。 用量変更 このプロトコールでは用量変更は行わなかった。診断実験および治療計画： 適当なインホームドコンセプトの後でこの皮膚試験プロトコールに適任である 全ての実験患者は、上述したようなＤＴＨ試験を受けた。その後の治療は皮膚試 験評価の終了後24時間位の早いうちに施したかもしれない。治療の変更： 病理学的変化／腫瘍宿主素因 アレルギー反応またはアトピー反応を含む不利な応答の証拠を有する患者は、 症候的に適宜治療すべきであった。アナフィラキシーなどの激しい全身反応を有 する患者は、これ以上の皮膚試験を行ったりワクチン接種を受けたりしてはなら なかった。測定すべき検査パラメーター（即ち、定期観察）： 事前試験 分画ＣＢＣ、ＬＦＴｓ、クレアチン、ＢＵＮ、アミラーゼおよびリパーゼ。 仮試験および評価の頻度 皮膚試験反応性の72時間の観察の終わりに、この試験を受ける患 者に上述したようなアミラーゼ、リパーゼおよびクレアチン並びに身体検査を実 施した。 グループ１とグループ２ではＤＴＨ反応性の評価から一週間後、死亡または病 気の進行までの時間に関する追跡調査を除いて、患者を試験終了と見なした。評価基準： この試験の主な終点（endpoint）は、ムチンペプチドに対する免疫の生体内お よび試験管内アッセイであった。本発明者らは、自己の乳癌、結腸癌または膵臓 癌に対する免疫に対するワクチン治療の効果、並びに病気応答および／または病 気進行に対する各カテコリーでの免疫応答の関係も評価した。 優先順位における免疫学的終点は次の通りであった：ペプチド皮膚試験に対す るＤＴＨ；生検部位または末梢血からの個々のペプチドに対する細胞毒性および 細胞増殖；および組換えムチンに対する体液性応答または血中ムチンの証拠。 追跡した臨床パラメーターとしては、腫瘍後退の客観的証拠；各生存者の経過 ；総生存者（異なるグループ１，２および３の各々において比較する）。（後述 するような病気進行の評価のために臨床試験におけるこれらのパラメーターの定 義を定めた。） 完全な応答：全く新たな病変の出現を伴わず且つ４週間より長く維持される、 全ての測定可能な病変の完全なる消失。完全な応答は全ての病変の消失時から日 付を付けた。 部分的応答：最大の長さと最大幅の積により測定される全ての測定可能な腫瘍 領域の大きさの少なくとも50％の減少。 変化なし：全ての測定可能な病変の垂直直径の積の和の、50％未満の減少また は25％未満の増加。 進行：測定可能な病変の垂直直径の積の和の元の測定値の25％よ り大きな増加および／または新たな病変の発生。可能であれば、新たな病変を生 検して進行を確かめるべきである。 登録： インホームドコンセプトを得る試験形式の完了および最初の皮膚試験の施行ま でに、プロトコールナースおよび／または主任研究員による試験の時に患者を登 録した。統計学的考察： 試験の第一終点は個々のペプチドに対するＤＴＨ反応性の測定であった。統計 学的分析は、グループ３におけるＤＴＨの程度の評価および／またはワクチンに 対する応答の証拠を含んだ。 分析の目的 統計学的分析の主要な目的は次のことであった： (1)乳癌、結腸癌または脾臓癌患者に３濃度の各々で投与された３つの異なる ムチンペプチド製剤に対する遅延型過敏症（ＤＴＨ）反応を定量しそして要約す ること； (2)それらの製剤が惹起する反応の強度の点で異なるかどうかを決定すること ； (3)試験した濃度範囲に渡り増加する用量応答が見られるかどうかを決定する こと； (4)病気グループ間で生じうる応答パターンの差を調べること； (5)未治療の患者、明確な病気を持たない治療を完了した患者、および転移性 または治療不可能な癌を有する患者の間で応答が異なるかどうかを決定すること ； (6)注射部位の近くに見られるＴ細胞亜集団の浸潤の程度と、血中ムチンレベ ルに対して、ＤＴＨ反応性を相関づけること； (7)ムチンペプチドに対するＤＴＨ反応性と、標準的な読出抗原の同時投与パ ネルにより測定した時の患者の全身アレルギー／非アレルギー状態との関係を調 べること。 分析の第二段階は、ＤＴＨ試験後に３週間おきの３回の免疫化を受けることに なっている、転移性または治療不可能な病気を有する患者を考察した。ここで、 着目の主な論点は次のことである： (1)免疫化後のＤＴＨ試験は免疫化前のベースラインに対して増加したレベル の反応性を示すか？ (2)注射部位におけるＴ細胞浸潤のパターンまたは血中ムチンレベルに事前／ 事後変化があるか？ (3)臨床応答とベースラインＤＴＨ反応性との関係を示す指標があるか？試験計画 試験に参加する患者を、下の図Ｂ．２に示される６つのグループから引き出し た。 第一の２つの治療グループの各々に入る30人の患者と、第三グループに入る60 人の患者の、計120人の患者がこのプロトコールに含まれた。次いで各患者を３ つのムチンペプチド製剤（Ａ，Ｂ，Ｃ）と濃度（1 mcg，10 mcg，100 mcg）の計 ９つの組合せに対してＤＴＨ試験した。 ペプチド製剤の詳細な記載は上記に報告されている。そうしなければ多分起こ ったであろう相互的な偏りを避けるために、各患者に対して無作為化した注射の 順序と相対位置により、９つの試験品の各々を0.05mlの皮下注射により投与した 。注射に使うシリンジは、患者も、注射を行う人も、浸潤の測定を担う人も、だ れも試験の場所を知らないように、予備充填されそして盲検された。 従って、試験計画の構成は、２つの患者間要因（病気と治療状態）と２つの患 者内要因（ペプチド製剤と濃度）に分けられた。ＤＴＨ反応は注射後24時間目と 48時間目に評価した（このため時間は三番目の患者内要因と考えられ得る）。反 応の強度は、各時点における硬化の最大直径とそれの垂線（硬化面積に比例する ）の積を測定することにより量化した。分析の目的上、72時間の観察期間に渡る 硬化の最大面積は着目の第一終点として働いた。 分析方法 ＤＴＨ反応の分析：分析に最も適当である統計学的方法は、試験の間中観察さ れるＤＴＨ反応の性質に強く依存した。患者の大部分がペプチド製剤の各々に測 定可能なくらい応答すれば、間隔目盛りのある変数としての硬化面積の処理が指 示される。この場合、上述した分析の目標は、次の参考文献に記載されている種 々の反復測度分析方法の使用により処理することができる：Winer，BJ，Statis- tical Principles in Experimental Design，1971，McGraw-Hill，New York，NY ；Crowder，MJおよびHand，DJ，Analysis of Repeated Measures，1990，Chapma n and Hall，London；Milliken，Gzeorge A.,およびJohnson，Dallas E.，Analy sis of Messy Data，Vol.１: Designed Experiments，1984，Wadsworth，Belmon t，CA。 他方で、患者の一部分のみにおいて陽性のＤＴＨ反応が観察され、有意な比率 が無応答の者であったら、通常の反復測度分析方法は適切でないだろう。代わり に、採用されるアプローチは、順序づけられたカテゴリーへの応答の分類を含む だろう。手にあるデータの性質に応じて、カテゴリー化の最良方法は、単純な「 応答なし」／「応答」の二分化から、より複雑な順序づけられたカテゴリーのセ ット、例えば「応答なし」、「I00 mcg でのみ応答」、「≧10 mcgでのみ応答」 、「≧1 mcgで応答」、にまで異なり得る。カテゴリー的応答に適当な反復測度 分析の方法は、Prowder，MJおよびHand，DJ，Analysis of Repeated Measures， 1990，Chapman and Hall，London中、およびAgresti，Alan，Categorical Data Analysis，1990，John Wiley & Sons，New York，NY 中に記載されている。例え ば、患者により階層化されたペプチド×応答の偶然表に適用されたCMH AN0VA 統 計法の使用により、３つのペプチドにまたがる応答プロフィールの証拠の正式試 験を実施することができる。 アミノ酸 1-9，2-10，3-11，15-23，16-24，18-26および20-28から成るペプチ ド製剤は、典型的には間隔目盛りでの分析に適当な測定可能な応答をもたらす見 込みがないことはないが、一方で残りの製剤はほとんど応答を引き起こさないだ ろう。そのような場合、３つの製剤を正式に比較する普通の性質の初期分析に続 いて、典型的な反復測度法により第一製剤のその後のより詳しい分析を実施する 。 ワクチン接種効果の分析：研究のこの段階で、10人の転移性乳癌患者と10人の 転移性膵臓癌患者において、ワクチン接種がＤＴＨ反応性を増強する上で有効で あるかどうかを決定するために、ワクチン接種後のＤＴＨ反応をベースライン反 応と比較しなければならなかった。効果の正式な統計学的試験は、適宜、典型的 なまたはカテゴリー的な反復測度分析により実施する予定であった。Ｔ細胞浸潤 レベルと血中ムチンレベルに対するワクチン接種後の変化の発生についての試験 も同様に実施した。 臨床的反応とワクチン接種前パラメーター、特にベースラインＤＴＨ反応との 可能な関係を評価することも重要であった。これは、ロジスティック回帰モデル により行った。研究のこの段階（相）に係わる試料サイズが限定されているため 、そして臨床的反応の度数か大きいと予想できないため、完全置換試験（exact permutation test）によってｐ値を引き出した。それらの幾つかの理由から、臨 床的反応と前のＤＴＨ反応との間の真の相関関係が大きいとしても、統計的に有 意な関係が検出される見込みはなかった。 時間枠 計120 人の患者がこの試験に携わった。これは１年の期間に渡り毎週１〜２人 の患者が試験を受けることを要求した。脾臓癌患者を有する２〜４人の患者およ び10〜20人をかなり越す乳癌を有する患 者を毎週検査した。このプロトコールを６カ月以内に終了してもよくそして他の 問題を扱う必要があるかもしれないと予想された。 上記に引用した全ての参考文献の全内容は本明細書中に参考として組み込まれ る。 今まで本発明を明確化と理解の目的で或る程度詳細に記載してきたが、本発明 の正当な範囲から逸脱することなく、この開示を読むことにより形式および細部 に様々な変更を行い得ることは当業者にとって明白であろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 フィン，オリベラ ジェイ アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15206, ピッツバーグ，ノース ウッドランド ロ ード 152 (72)発明者 フォンテノット，ジェイ．ダーレル アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15206, ピッツバーグ，ゲッティーズバーグ ドラ イブ 600 (72)発明者 モンテラーロ，ロナルド シー. アメリカ合衆国，ペンシルバニア 15090, ウェックスフォード，バーンウッド ドラ イブ 2563

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．少なくとも４回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る合成muc-1 ペ プチドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることが できる前記合成muc-1 ペプチド。 ２．長さが105 アミノ酸でありそして少なくとも５回のmuc-1 の20アミノ酸縦 列反復を含んで成る、請求項１の合成muc-1 ペプチド。 ３．少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のア ミノ酸を含んで成り、ここで前記５個の追加のアミノ酸が前記５回の連続した20 アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる、請求項２の合成muc-1 ペプチド。 ４．医薬上許容される担体分子に共有結合により結合された請求項１，２また は３のいずれか一項に記載の少なくとも１つの合成muc-1 ペプチドを含んで成る 組成物。 ５．生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有 する少なくとも４回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る合成muc-1 ペプ チドであって、グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることがで きる前記合成muc-1 ペプチド。 ６．長さが105 アミノ酸であり、そして生来の合成抗原を形成するように適当 に挿入された外来アミノ酸配列を有する少なくとも５回のmuc-1 の20アミノ酸縦 列反復を含んで成る、請求項５の合成muc-1 ペプチド。 ７．少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のア ミノ酸を含んで成り、ここで前記５個の追加のアミノ酸が前記５回の連続した20 アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる、請求項６の合成muc-1 ペプチド。 ８．医薬上許容される担体分子に共有結合により結合された請求項５，６また は７のいずれか一項に記載の少なくとも１つの合成muc-1 ペプチドを含んで成る 組成物。 ９．前記外来アミノ酸配列がウイルス、癌または細菌に対応するエピトープで ある、請求項５，６または７のいずれか一項に記載の合成muc-1 ペプチド。 10．少なくとも４回の20アミノ酸縦列反復を有するムチンペプチドの製造方法 であって、前記ムチンペプチドはグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーショ ンをとることができ、次の段階： ｉ）着目のアミノ酸を活性化し； ii）前記活性化された着目のアミノ酸を適当な固相に導入し； iii）適当な条件下で完結まで反応させ； iv）反応の完全性についてモニタリングし； ｖ）30アミノ酸ペプチドが得られるまで次の着目のアミノ酸を使って段階ｉ） 〜iv）を繰り返し、その時点で30アミノ酸ペプチドの半分を除去し；そして vi）少なくとも４回の縦列反復を有し且つグリコシル化の欠損下で生来のコン ホメーションをとることができる所望の長さのムチンペプチドが形成されるまで 、反応サイクルを続けるを含んで成る方法。 11．少なくとも５回の縦列反復を有し且つグリコシル化の欠損下で生来のコン ホメーションをとることができる105 アミノ酸のムチンペプチドの製造方法であ って、次の段階： ｉ）着目のアミノ酸を活性化し； ii）前記活性化された着目のアミノ酸を適当な固相に導入し； iii）適当な条件下で完結まで反応させ； iv）反応の完全性についてモニタリングし； ｖ）30アミノ酸ペプチドが得られるまで次の着目のアミノ酸を使って段階ｉ） 〜iv）を繰り返し、その時点で30アミノ酸ペプチドの半分を除去し；そして vi）少なくとも５回の縦列反復を有し且つグリコシル化の欠損下で生来のコン ホメーションをとることができる105 アミノ酸のムチンペプチドが形成されるま で、反応サイクルを続ける を含んで成る方法。 12．生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有 する少なくとも５回の連続した縦列反復を有する105 アミノ酸のムチン様ペプチ ドの製造方法であって、ここで前記ムチン様ペプチドはグリコシル化の欠損下で 生来のコンホメーションをとることができ、次の段階： ｉ）着目のアミノ酸を活性化し； ii）前記活性化された着目のアミノ酸を適当な固相に導入し； iii）適当な条件下で完結まで反応させ； iv）反応の完全性についてモニタリングし； ｖ）30アミノ酸ペプチドが得られるまで次の着目のアミノ酸を使って段階ｉ） 〜iv）を繰り返し、その時点で30アミノ酸ペプチドの半分を除去し；そして vi）生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有 する少なくとも５回の連続した縦列反復を有し且つグリコシル化の欠損下で生来 のコンホメーションをとることができる105 アミノ酸のムチン様ペプチドが形成 されるまで、反応サイクルを続ける を含んで成る方法。 13．前記外来アミノ酸配列がウイルス、癌または細菌に対応するエピトープで ある、請求項12に記載の方法。 14．哺乳類においてエピトープに対する抗体を誘導することができる免疫原性 組成物であって、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された前記エピト ープのためのアミノ酸配列を含有する少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列 反復の合成muc-1 様ペプチドを含んで成り、ここで前記合成muc-1 様ペプチドは グリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる、前記免疫 原性組成物。 15．哺乳類においてエピトープに対する細胞障害性Ｔ細胞を誘導することがで きる免疫原性組成物であって、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入され た前記エピトープためののアミノ酸配列を含有する少なくとも２回のmuc-1 の20 アミノ酸縦列反復の合成muc-1 様ペプチドを含んで成り、ここで前記合成muc-1 様ペプチドはグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ る、前記免疫原性組成物。 16．前記免疫原性組成物が105 アミノ酸の合成muc-1 様ペプチドを含んで成り 、前記合成muc-1 様ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入さ れた前記エピトープのためのアミノ酸配列を含有する少なくとも５回のmuc-1 の 20アミノ酸縦列反復を含んで成る、請求項14または請求項15の免疫原性組成物。 17．前記合成muc-1 様ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿 入された前記エピトープのためのアミノ酸配列を含有する少なくとも５回の連続 したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、前記５ 個の追加のアミノ酸が前記５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置 かれる、請求項16の免疫原性組成物。 18．前記エピトープがウイルス、癌または細菌に対応するエピトープである、 請求項14，15または16のいずれか一項に記載の免疫原 性組成物。 19．ヒトにおいて膵臓癌、乳癌または結腸癌に対応するエピトープに対する抗 体を誘導することができる免疫原性組成物であって、前記免疫原性組成物が105 アミノ酸の合成muc-1 様ペプチドを含んで成り、前記合成muc-1 様ペプチドが、 少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のアミノ酸 を含んで成り、且つグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとること ができる、前記免疫原性組成物。 20．ヒトにおいて膵臓癌、乳癌または結腸癌に対応するエピトープに対する細 胞障害性Ｔ細胞を誘導することができる免疫原性組成物であって、前記免疫原性 組成物が105 アミノ酸の合成muc-1 様ペプチドを含んで成り、前記合成muc-1 様 ペプチドが、少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追 加のアミノ酸を含んで成り、且つグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーショ ンをとることができる、前記免疫原性組成物。 21．病気に対する免疫を生じさせる方法であって、前記病気がウイルス、癌ま たは細菌感染であり、請求項14，15または16のいずれか一項に記載の免疫原性組 成物を免疫原的に有効な量で哺乳類に投与する段階を含んで成る方法。 22．膵臓癌、乳癌または結腸癌に対する免疫を生じさせる方法であって、請求 項19または請求項20に記載の免疫原性組成物を免疫原的に有効な量でヒトに投与 する段階を含んで成る方法。 23．哺乳類において免疫応答を抑制する方法であって、 ａ）請求項14，15または16のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を免疫原的 に有効な量で哺乳類に投与し、それにより前記エピトープが前記哺乳類により産 生された自己抗体により認識される段階を含んで成る方法。 24．生物学的試験試料中の特定の病気に対する抗体の存在を検出する方法であ って、次の段階： ａ）生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を含 有する少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る合成muc-1 ペ プチドを、合成muc-1 ペプチド−抗体複合体が形成されるような条件下で、前記 特定の病気に対する抗体を含む疑いのある生物学的試料と接触させ、ここで前記 合成muc-1 ペプチドはグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとるこ とができ、前記外来アミノ酸配列は前記特定の病気に対する抗体と反応性であり 、そして ｂ）前記合成muc-1 ペプチド−抗体複合体の形成を検出し、前記複合体が前記 生物学的試料中の前記特定の病気に対する抗体の存在を示す を含んで成る方法。 25．前記合成muc-1 ペプチドが、長さ105 アミノ酸であり、そして生来の合成 抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有する少なくとも５ 回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る、請求項24の方法。 26．前記合成muc-1 ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入 された外来アミノ酸配列を有する少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸 縦列反復配列と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、前記５個の追加のアミノ酸 が前記５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる、請求項25の 方法。 27．生物学的試験試料中の膵臓癌、乳癌または結腸癌に対応するエピトープに 対する抗体の存在を検出する方法であって、次の段階： ａ）少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のア ミノ酸を含んで成る105 アミノ酸の合成muc-1 ペプチ ドを、合成muc-1 ペプチド−抗体複合体が形成されるような条件下で、前記抗体 を含む疑いのある生物学的試料と接触させ、ここで前記合成muc-1 ペプチドはグ リコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ、そして ｂ）前記合成muc-1 ペプチド−抗体複合体の形成を検出し、前記複合体が膵臓 癌、乳癌または結腸癌に対応する前記エピトープに対する抗体の存在を示す を含んで成る方法。 28．癌細胞の増殖を抑制する方法であって、次の段階： ａ）生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有 する少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る合成muc-1 ペプ チドを、合成muc-1 ペプチド−抗体複合体が形成されるような条件下で、癌細胞 を含む生物学的試験試料と接触させ、ここで前記合成muc-1 ペプチドはグリコシ ル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ、前記外来アミノ酸配 列は前記癌細胞に対する抗体と反応性であり、そして前記複合体から前記抗体を 単離することにより前記癌細胞に対する抗体を得、 ｂ）段階ａ）からの前記抗体を、抗体−薬剤複合体が形成されるような条件下 で、癌細胞の増殖を抑制することができる薬剤と接触させ、そして ｃ）段階ｂ）からの抗体−薬剤複合体を、前記抗体−薬剤複合体が癌細胞と反 応しそして前記癌細胞の増殖を抑制するような条件下で、癌細胞と接触させる を含んで成る方法。 29．前記合成muc-1 ペプチドが、長さが105 アミノ酸であり、そして生来の合 成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有する少なくとも ５回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含 んで成る、請求項28の方法。 30．前記合成muc-1 ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入 された外来アミノ酸配列を有する少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸 縦列反復配列と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、ここで前記５個の追加のア ミノ酸は前記連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる、請求項29の 方法。 31．膵臓癌、乳癌または結腸癌に対応する癌細胞の増殖を抑制する方法であっ て、次の段階： ａ）少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のア ミノ酸とを含んで成る105 アミノ酸の合成muc-1 ペプチドを、合成muc-1 ペプチ ド−抗体複合体が形成されるような条件下で、脾臓癌、乳癌または結腸癌に対応 する癌細胞を含む生物学的試験試料と接触させ、ここで前記合成muc-1 ペプチド はグリコシル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができ、 ｂ）段階ａ）からの前記抗体を、前記抗体が脾臓癌、乳癌または結腸癌に対応 する癌細胞と反応しそして前記癌細胞の増殖を抑制するような条件下で、癌細胞 と接触させる を含んで成る方法。 32．請求項１，２または３のいずれか一項に記載の合成muc-1 ペプチドを含ん で成るキット。 33．合成muc-1 ペプチドを含んで成るキットであって、前記合成muc-1 ペプチ ドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配列を有 する少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成り、且つグリコシ ル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる、前記キット。 34．前記合成muc-1 ペプチドが、長さ105 アミノ酸であり、且つ生来の合成抗 原を形成するように適当に挿入された外来アミノ酸配 列を有する少なくとも５回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る、請求項 33のキット。 35．前記合成muc-1 ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿入 された外来アミノ酸配列を有する少なくとも５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸 縦列反復と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、ここで前記５個の追加のアミノ 酸は前記５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置かれる、請求項34 のキット。 36．生来の合成抗原を形成するように適当に挿入されたエピトープのためのア ミノ酸配列を有する少なくとも２回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復の合成muc-1 様ペプチドを含んで成るワクチンであって、前記合成muc-1 様ペプチドがグリコ シル化の欠損下で生来のコンホメーションをとることができる、前記ワクチン。 37．前記合成muc-1 様ペプチドが、長さ105 アミノ酸であり、且つ生来の合成 抗原を形成するように適当に挿入されたエピトープのためのアミノ酸配列を有す る少なくとも５回のmuc-1 の20アミノ酸縦列反復を含んで成る、請求項36のワク チン。 38．前記合成muc-1 様ペプチドが、生来の合成抗原を形成するように適当に挿 入されたエピトープのためのアミノ酸配列を有する少なくとも５回の連続したmu c-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のアミノ酸を含んで成り、ここで前記５ 個の追加のアミノ酸は前記５回の連続した20アミノ酸縦列反復の前または後に置 かれる、請求項37のワクチン。 39．前記エピトープがウイルス、癌または細菌に対応するエピトープである、 請求項36，37または38のいずれか一項に記載のワクチン。 40．105 アミノ酸の合成muc-1 様ペプチドとアジュバントを含んで成るワクチ ンであって、前記合成muc-1 様ペプチドが少なくとも ５回の連続したmuc-1 の20アミノ酸縦列反復と５個の追加のアミノ酸を含んで成 り、ここで前記５個の追加のアミノ酸は前記５回の連続した20アミノ酸縦列反復 の前または後に置かれ、前記合成muc-1 様ペプチドがグリコシル化の欠損下で生 来のコンホメーションをとることができる、前記ワクチン。 41．ウイルス、癌または細菌感染に対する免疫を生じさせる方法であって、請 求項36，37または38のいずれか一項に記載のワクチンを免疫原的に有効な量で哺 乳類に投与する段階を含んで成る方法。 42．膵臓癌、乳癌または結腸癌に対する免疫を生じさせる方法であって、請求 項40に記載のワクチンを免疫原的に有効な量でヒトに投与する段階を含んで成る 方法。