ES2296986T3 - Anticuerpos recombinantes asociados a gancliosidos y el uso de los mismos en la diagnosis y el tratamiento de tumores. - Google Patents
Anticuerpos recombinantes asociados a gancliosidos y el uso de los mismos en la diagnosis y el tratamiento de tumores. Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se relaciona con la obtención de anticuerpos modificados por ingeniería genética a partir del anticuerpo monoclonal murino P3 (AcM P3), producido por el hibridoma depositado según el tratado de Budapest bajo el número ECACC 94113026 y de su anti-idiotipo 1E10 (AcMai 1E10) producido por el hibridoma ECACC 97112901, con el objetivo de lograr anticuerpos con las mismas propiedades de reconocimiento de los originales pero que sean menos inmunogénicos que éstos. Los anticuerpos quiméricos, contienen los dominios variables de la inmunoglobulina murina y las regiones constantes de la inmunoglobulina humana; y los humanizados, además de contener las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, son modificados en la región de los marcos (FRs) murinos y en particular en aquellas zonas que pudieran resultar en un sitio antigénico para las células T, por lo que algunas posiciones de los FRS son humanas. Estos anticuerpos pueden ser utilizados en el diagnóstico y la terapia dediferentes tipos de tumores.
Description
Anticuerpos recombinantes asociados a
gangliósidos y el uso de los mismos en la diagnosis y el tratamiento
de tumores.
La presente invención se refiere al campo de la
biotecnología, en particular a nuevos anticuerpos recombinantes
obtenidos por ingeniería genética, específicamente con anticuerpos
quiméricos y humanizados obtenidos a partir del anticuerpo
monoclonal murino P3 (MAb P3).
Más específicamente, la invención está
relacionada con anticuerpos que se unen a gangliósidos que contienen
ácido siálico N-glicolilado, pero no con las formas
acetiladas de los gangliósidos ni con glicolípidos neutros. Los
gangliósidos que contienen ácido siálico
N-glicolilado son antígenos ampliamente expresados
en el cáncer de mama y en melanomas. Por otra parte, el efecto
antitumoral del MAbai 1E10 ha sido también demostrado en modelos
experimentales.
La presente invención está también relacionada
con las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos
recombinantes previamente descritos útiles en el diagnóstico y la
terapia del cáncer, en particular cáncer de mama y melanomas.
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que
contienen ácido siálico y están presentes en la membrana plasmática
de células de vertebrados (Stults et al. (1989):
Glycosphingolipids: structure, biological source and properties,
Methods Enzymology, 179:167-214). Algunas de estas
moléculas han sido publicadas en la bibliografía como antígenos
asociados a tumores o marcadores tumorales (Hakomori et al.
(1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate
antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653), por
esta razón el uso de anticuerpos anti-gangliósidos
ha sido descrito como útil en el diagnóstico y la terapia del cáncer
(Hougton et al. (1985): Mouse monoclonal antibody IgG3
antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients
with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246;
Zhang et al. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens
as targets for immune attack using immunohistochemistry. 1. Focus
on gangliosides, Int. J. Cancer, 73: 42-49).
Los ácidos siálicos más frecuentemente
expresados en animales son N-acetil (NeuAc) y
N-glicolil (NeuGc) (Corfield et al. (1982):
Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10:
5-50). NeuGc no se expresa en tejidos humanos y de
pollo normales en general, pero está ampliamente distribuido en
otros vertebrados (Leeden y Yu, (1976): Chemistry and analysis of
sialic acid, en: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A y
Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48;
Kawai et al. (1991): Quantitative determination of
N-glycolylneuraminic acid expression in human
cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor
associated sialic acid by gas chromatography-mass
spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). Sin
embargo hay publicaciones que demuestran que los anticuerpos
anti-NeuGc reconocen algunos tumores y líneas de
células tumorales humanas (Higashi et al. (1988): Detection
of gangliosides as N-glycotylneuraminic acid
specific tumor-associated
Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma
cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui et
al. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated
Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer
cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160:
1149-1154). Se han encontrado niveles más altos de
gangliósidos GM3 (NeuGC) en el cáncer de mama humano (Marquina
et al. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer,
Cancer Research, 1996; 56: 5165-5171), y este
resultado hace atractivo el uso de esta molécula como diana para la
terapia del cáncer.
El anticuerpo monoclonal (Mab) P3 producido por
la línea de células depositada con el número de ingreso ECACC
94113026 (Patente Europea EP 0 657 471 B1), es un anticuerpo
monoclonal murino con isotipo IgM, que se obtuvo fusionando
esplenocitos murinos de un ratón BALB/c inmunizado con liposomas que
contienen GM3(NeuGc) y toxoide de tétanos, con la línea
celular P3-X63-Ag8.653; que es un
mieloma murino. Este Mab P3 reacciona fuertemente con gangliósidos
que contienen ácido siálico N-glicolilado pero no
con las formas acetiladas de los gangliósidos ni con los
glicolípidos neutros. Se demostró mediante estudios
inmunocitoquímicos e inmunohistoquímicos llevados a cabo con líneas
de células y tejidos de tumores benignos y neoplásicos, que el Mab
P3 reconoce el cáncer de mama (Vázquez et al. (1995):
Generation of a murine monoclonal antibody specific for
N-glycolylneuraminic
acid-containing gangliosides that also recognizes
sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556) y el
melanoma.
El Mab P3 indujo una respuesta inmunitaria
antiidiotípica (Ab2) en ratones BALB/c (modelo singénico), incluso
sin coadyuvante ni proteína portadora (Vázquez et al. (1998):
Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to
an anti-NeuGc-containing ganglioside
monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). El
papel de los grupos electronegativos, ácido siálico (para los
gangliósidos) y SO_{3}- (para los sulfátidos), en las propiedades
de reconocimiento de este anticuerpo fue sugerido mediante análisis
inmunoquímico (Moreno et al. (1998): Delineation of epitope
recognized by an antibody specific for
N-glycolylneuraminic acid-containing
gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705).
El Mab 1E10 anti-idiotípico
(Mabai 1E10) de subtipo IgG1 fue obtenido a partir de un ratón
BALB/c inmunizado con el Mab P3 acoplado con KLH (Patente de EE.UU.
6.063.379, línea de células depositada bajo el número de ingreso
ECACC 97112901). El Mabai 1E10 reconoció específicamente el Mab P3 y
no se unió a otros anticuerpos anti-gangliósidos
IgM. Además, el Mabai 1E10 inhibió la unión específica de Mab P3 con
el GM3(NeuGc) y a una línea de células
MDA-MB-435 derivada del carcinoma de
mama canalicular (positiva para la unión de Mab P3). El MAbai 1E10
indujo una intensa respuesta inmunitaria de anticuerpos Ab3 cuando
se inmunizaron ratones de modelos singénicos o alogénicos, estos
anticuerpos Ab3 no mostraron la misma especificidad que el Mab P3
incluso cuando llevan idiotipos similares a los que lleva el
anticuerpo Ab1 (Vázquez et al. (1998): Syngeneic
anti-idiotypic monoclonal antibodies to an
anti-NeuGc-containing ganglioside
monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). El
MAbai 1E10 indujo un intenso efecto antitumoral en ratones
singénicos, así como en alogénicos. El crecimiento de la línea de
células de carcinoma mamario F3II se redujo significativamente
mediante la dosis repetida de MAbai 1E10 acoplado con KLH en
coadyuvante de Freund, cuando se vacunaron ratones BALB/c. También
se redujo el número de metástasis pulmonares espontáneas después de
la vacunación. La administración intravenosa del Mabai 1E10 a
ratones C57BL/6 inoculados, de 10 a 14 días después de la
inoculación intravenosa de células de melanoma B16, produjo una
drástica reducción del número de metástasis de pulmón en comparación
con ratones tratados con una IgG irrelevante. Estos resultados
sugieren que se desencadena más de un mecanismo de efecto
antitumoral (Vázquez et al. (2000): Antitumor properties of
an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation
to N-glycolyl-containing
gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000).
Aun cuando la tecnología de hibridomas ha sido
desarrollada durante 15 años (Koehler y Milstein (1975): Continuous
cultures of fused cells secreting antibody of predefined
specificity, Nature, 256: 495-497) y los anticuerpos
monoclonales son aún muy útiles en diagnóstico así como en
investigación, no han demostrado su eficacia terapéutica en seres
humanos. Principalmente se ha debido a su corta
vida-mitad en la sangre y a que las funciones del
efector murino fallan para el sistema inmunitario humano y también
para la respuesta inmunitaria de anticuerpo
anti-ratón humano (respuesta HAMA: Human
Anti-Mouse Antibody).
Por lo demás, la tecnología de la ingeniería
genética ha revolucionado el potencial de la utilidad de los MAb,
ya que manipulando genes de inmunoglobulina es posible obtener
anticuerpos modificados con una antigenicidad reducida, así como
mejorar sus funciones efectoras para el tratamiento o el diagnóstico
de ciertas patologías. Los métodos para reducir la inmunogenicidad
de la inmunoglobulina tienen como objetivo esencial disminuir las
diferencias entre un anticuerpo murino y una inmunoglobulina humana,
sin alterar la especificidad del reconocimiento antigénico
(Morrison y Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules,
Adv Immunol., 44: 65-92).
Recientemente se han desarrollado varios métodos
para humanizar anticuerpos murinos o de rata y, de esta forma,
reducir la respuesta inmunitaria xenogénica contra proteínas
extrañas cuando son inyectadas en seres humanos. Uno de los
primeros métodos para reducir la antigenicidad fueron los
anticuerpos quiméricos, en los que los dominios variables de la
proteína murina se insertan en dominios constantes de moléculas
humanas, que manifiestan la misma especificidad pero una
inmunogenicidad reducida en comparación con sus contrapartidas
murinas, las funciones efectoras humanas son preservadas por los
anticuerpos quiméricos (Morrison et al. (1984): Chimeric
human antibody molecules: Mouse antigen-binding
domains with human constant region domains, PNAS USA, 81:
6851-6855). Aun cuando los anticuerpos quiméricos
tienen la misma especificidad que la contrapartida murina,
frecuentemente se observa una respuesta inmunitaria a las regiones
variables de roedor.
En un intento de reducir más la inmunogenicidad
de anticuerpos quiméricos, han sido injertadas solamente las CDRs
del anticuerpo monoclonal de roedor en regiones de entramado
(framework) humanas, y esta región variable híbrida ha sido
expresada con regiones constantes humanas (Jones et al.
(1986): Replacing the complementary-determining
regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321:
522-524; Verhoeyen et al. (1988): Reshaping
human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239,
1534-1536). Sin embargo, este método tiene varios
inconvenientes: frecuentemente el anticuerpo resultante tiene una
afinidad reducida y varios restos de entramado han de ser
retromutados a los correspondientes murinos para restablecer la
unión (Rietchmann et al. (1988): Reshaping human antibodies
for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen et
al. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin
2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest et
al. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit
human respiratory syncytial virus infection in vivo,
Biotechnology, 9: 266-272). Además, frecuentemente
se observa una inmunogenicidad persistente en los anticuerpos
injertados con CDR.
Mateo y colaboradores (Patente de EE.UU. Nº 5
712 120) han descrito un procedimiento para reducir la
inmunogenicidad de anticuerpos murinos. De acuerdo con el método,
las modificaciones están restringidas a los dominios variables y
específicamente a las FRs murinas de anticuerpos quiméricos. Además,
las sustituciones se llevan a cabo solamente en aquellas regiones
de las FRs que tienen secuencias anfipáticas y por tanto son
epítopos potenciales reconocidos por las células T. El método
comprende la sustitución juiciosa de unos pocos restos de
aminoácidos, situados en los epítopos inmunogénicos potenciales,
por los correspondientes restos procedentes de la secuencia humana
más homóloga, los aminoácidos que son principalmente responsables de
las estructuras canónicas y también los restos en las proximidades
inmediatas de las CDRs o en la zona de Vernier, han de ser
conservados.
El anticuerpo resultante conserva su
especificidad de unión con el antígeno y es menos inmunogénico que
su predecesor, bien sea murino o quimérico (Mateo et al.
(2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered
antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced
immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71), estas
propiedades incrementan su utilidad terapéutica. Usando este nuevo
procedimiento, solamente han de hacerse una pocas mutaciones y,
desde luego, menos manipulaciones genéticas.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
monoclonal quimérico derivado del anticuerpo monoclonal murino Mab
P3 que reconoce gangliósidos que contienen ácido siálico
N-glicolilado, y que es producido por la líneas de
células de hibridoma con el número de depósito ECACC 94 113026, en
el que los dominios hipervariables de las cadenas ligera y pesada
de Mab P3 comprenden las siguientes secuencias:
CADENA PESADA
- CDR1: RYSVH
- CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
- CDR3: SGVREGRAQAWFAY
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA LIGERA
- CDR1: KASQDVSTAVA
- CDR2: SASYRYT
- CDR3: QQHYSTPWT;
las regiones de entramado (FRs: Framework
Regions) de las cadenas pesada y ligera de Mab P3 comprenden las
siguientes secuencias:
CADENA PESADA
- FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
- FR2: WVRQPPGKGLEWLG
- FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
- FR4: WGQGTLV
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA LIGERA
- FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
- FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
- FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
- FR4: FGGGTKL;
en donde el anticuerpo monoclonal quimérico,
para su humanización y preservación de las propiedades de unión con
el antígeno, incluye las siguientes sustituciones en la región FR1
de la cadena ligera:
CADENA LIGERA
- Posición 8: His por Pro
- Posición 9: Lys por Ser
- Posición 10: Phe por Ser
- Posición 11: Met por Leu
- Posición 13: Thr por Ala
En una realización preferida del anticuerpo
monoclonal quimérico de la invención, éste contiene la región
constante de la cadena pesada IgG1 humana y la región constante de
la cadena ligera Ck humana. Así, se prefiere que la región
constante de la cadena pesada comprenda la secuencia de aminoácidos
de la cadena gamma-1 y la región constante de la
cadena ligera comprenda la secuencia de aminoácidos de una cadena
kappa, ambas derivadas de inmunoglobulinas humanas.
La invención se refiere también a una línea de
células que produce un anticuerpo monoclonal de la invención; a una
composición farmacéutica para el tratamiento de tumores malignos de
mama y melanomas, sus metástasis y sus recidivas, que comprende un
anticuerpo monoclonal de la invención; a una composición
farmacéutica para la localización e identificación in vivo
de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y sus
recidivas, que comprende un anticuerpo monoclonal de la invención; y
al uso de un anticuerpo monoclonal de la invención para la
preparación de un medicamento útil para el tratamiento de tumores
malignos de mama y melanomas, sus metástasis y sus recidivas. Estos
incluyen tumores de mama, pulmón, aparato digestivo, aparato
urogenital, melanomas, sarcomas y tumores neuroectodérmicos, y sus
metástasis y recidivas.
Se extrajo el RNA citoplásmico de
aproximadamente 10^{6} células de hibridoma de P3 (MAb IgM murino,
que reconoce el gangliósido N-glicolilado GM3) o de
1E10 (anticuerpo anti-P3 antiidiotipo). El RNA se
extrajo usando el reactivo TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
La reacción de síntesis de cDNA se llevó a cabo
mezclando 5 \mug del RNA, 25 pmoles de Vh (complementario de la
región constante de IgM murina para VHP3, y con la región constante
de IgG1 murina para VH 1E10) o Vk (complementario de la región
kappa murina constante para ambos anticuerpos), 2,5 mM de cada uno
de los dNTPs, Tris-HCl 50 mM pH 7,5, KCl 75 mM, DTT
10 mM, MgCl_{2} 8 mM y 15 unidades de inhibidor de RNAsa en una
mezcla de reacción de 50 \mul. Se calentó a 70ºC durante 10
minutos y se enfrió lentamente hasta 37ºC. Después se añadieron 100
unidades de enzima transcriptasa inversa del MLV (virus de la
leucemia murina) y continuó la incubación a 42ºC durante una
hora.
Los cDNAs de las regiones variables VK y VH
fueron amplificados mediante PCR. De forma resumida, se mezclaron 5
\mul de cDNA de VH o VK con 25 pmoles de cebadores específicos,
2,5 mM de cada dNTP, 5 \mul de constituyentes de 10X tampón DNA
polimerasa Taq y 1 unidad de esta enzima. Las muestras se sometieron
a 25 ciclos térmicos a 94ºC, 30 segundos; 72ºC, 1 minuto, y una
última incubación durante 5 minutos a 72ºC.
Los productos de la PCR de VH y VK (del P3 y del
1E10, respectivamente) fueron clonados en el vector TA (kit
de clonación TA, Promega, EE.UU.). Los clones resultantes fueron
secuenciados por el método didesoxi usando DNA polimerasa T7
(kit de secuenciación T7, Pharmacia, Suecia).
Los genes VH VK fueron escindidos de vectores TA
mediante digestión enzimática y se clonaron en los correspondientes
vectores de expresión (Coloma et al. (1992): Novel vectors
for the expression of antibody molecules using variable regions
generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152:
89-104).
Los genes VH fueron escindidos del vector TA
mediante digestión enzimática con EcoRV y NheI y se clonaron en un
vector de expresión (PAH 4604) que lleva incluída una región
variable de IgG1 humana y el gen de resistencia al histidinol. Las
construcciones resultantes fueron P3VH-PAH4604 y
1E10VH-PAH4604. Los genes VK fueron escindidos del
vector TA mediante digestión enzimática con EcoRV y SalI, y clonados
en un vector de expresión (PAG4622). Este vector tiene incluído el
gen de resistencia al ácido micofenólico y la región constante kappa
humana. Las construcciones resultantes fueron
P3VK-PAG4622 y 1E10VK-PAG4622.
Células NS-O fueron sometidas a
electroporación con 10 \mug de P3VK-PAG4622 o
1E10VK-PAG4622, se transfectaron clones que
expresan cadenas ligeras kappa humanas con 10 \mug de
P3VH-PAH4604 o 1E10VH-PAH4604.
Los DNAs fueron linealizados mediante digestión
con enzima PvuI, se precipitaron con etanol y se disolvieron en 50
\mul de PBS. Aproximadamente 10^{7} células fueron recolectadas
mediante centrifugación y resuspendidas en 0,5 ml de PBS junto con
el DNA digerido en una cubeta de electroporación.
Después de 10 minutos en hielo, se administró a
las células una pulsación de 200 voltios y 960 \muF y las células
se dejaron en hielo durante 10 minutos más. Las células se
distribuyeron en una placa de 96 pocillos con D'MEM F12 más 10% de
suero de ternera fetal. Dos o cuatro días más tarde, se añade medio
selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45 \mug/mL o
histidinol 10 mM, respectivamente). Los clones transfectados eran
visibles a simple vista 14 días más tarde.
La presencia de anticuerpo humano en el medio de
los pocillos que contienen clones transfectados se midió mediante
un ELISA. Los pocillos de las placas de microtítulo fueron
recubiertos con anticuerpos de cadena ligera kappa
anti-humana de cabra (para los clones que producen
cadena kappa humana) o IgG anti-humana (específico
de cadena gamma) (para los clones que producen anticuerpo completo).
Después de lavar con PBST (solución salina tamponada con fosfato,
que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió medio de cultivo diluido
de los pocillos que contienen transfectantes a cada pocillo de
mitrotítulo durante una hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron con
PBS-T y se añadieron cadena ligera kappa antihumana
de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG
antihumana de cabra, conjugada con fosfatasa alcalina (específica de
cadena gamma), y se incubaron a 37ºC durante una hora. Los pocillos
se lavaron con PBS-T y se añadió tampón sustrato que
contiene o-fenilendiamina o
p-nitrofenilfosfato, respectivamente. Después de
media hora, se midió la absorbancia a 492 o 405 nm,
respectivamente.
Las secuencias de los dominios variables de P3 y
1E10 fueron analizadas con el algoritmo AMPHI (Margalit et
al. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic
sites from the primary sequence, J. Immunol., 138:
2213-2229). Este algoritmo buscaba segmentos
anfipáticos helicoidales, con 7 ó 11 restos de aminoácidos, que han
sido asociados con la inmunogenicidad T. El programa SOHHA predijo
también segmentos hidrófilos helicoidales. (Elliot et al.
(1987). An hypothesis on the binding of an amphipatic, alpha helical
sequence in li to the desotope of class 11 antigen, J. Immunol.,
138: 2949-2952). Ambos algoritmos predijeron qué
segmentos de secuencias de la región variable de los anticuerpos P3
y 1E10 podrían ser presentadas a las células T colaboradoras en el
contexto de las moléculas de MHC clase II.
Las secuencias de aminoácidos de las regiones
variables murinas fueron comparadas con las secuencias de la
inmunoglobulina incluidas en las bases de datos GeneBank y EMBL
(disponibles en Internet). Se determinó para cada anticuerpo la
secuencia de la región variable humana más homóloga. Se usó el
software PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00
(Hitachi) para la búsqueda de homología de secuencias.
El objetivo del método es reducir la
inmunogenicidad rompiendo o humanizando epítopos T inmunogénicos
potenciales, con un mínimo de cambios. El método comprende la
sustitución juiciosa de unos pocos restos de aminoácidos, situados
en segmentos anfipáticos helicoidales. Los aminoácidos que son
principalmente responsables de las estructuras canónicas y también
los restos en la proximidades inmediatas de las CDRs o en la zona de
Vernier, han de ser conservados.
De acuerdo con el método, se compararon las
secuencias de la región variable murina con la secuencia humana más
homóloga y se identificaron diferentes restos de aminoácidos en cada
posición entre el MAb murino y la secuencia humana más homóloga,
solamente se tuvieron en cuenta los restos en FRs (Kabat (1991),
Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition,
National Institute of Health), los restos previamente definidos
fueron reemplazados por los restos presentes en la secuencia humana
más homóloga. Las sustituciones se hicieron mediante técnicas de
mutagénesis directa.
Los residuos implicados en la estructura
tridimensional del sitio de unión no se mutaron; esto podría afectar
al reconocimiento del antígeno. Puede obtenerse información
adicional acerca de la influencia de las sustituciones en la
estructura terciaria mediante modelado molecular del sitio de unión
del antígeno.
La presencia de restos de prolina en el segmento
anfipático helicoidal y el hecho de que ciertos restos murinos no
aparecen en la misma posición en la secuencia humana más homóloga,
pero son frecuentes en otras inmunoglobulinas humanas, han de ser
tenidos en cuenta. Por esta razón no hay un único conjunto de
aminoácidos murinos a reemplazar en los entramados. Es posible
obtener diferentes versiones del anticuerpo modificado con
diferentes números de sustituciones. Las mutaciones se llevaron a
cabo mediante solapamiento de PCRs.
Las construcciones genéticas correspondientes a
P3hu y 1E10hu fueron clonadas en vectores de expresión siguiendo el
método descrito para los anticuerpos quiméricos. Las construcciones
resultantes fueron P3VKhu-PAG4622 o
1E10Vkhu-PAG4622 y P3VHhu-PAH4604 y
1E10VHhu-PAH4604. Fueron transfectadas en células
NS-0 siguiendo el protocolo descrito previamente
para los anticuerpos quiméricos.
Los anticuerpos recombinantes fueron purificados
mediante cromatografía de afinidad usando proteína A (Pharmacia,
Upssala, Suecia).
La unión específica con el antígeno medida
mediante ELISA ensayó la actividad biológica de los anticuerpos
recombinantes.
\newpage
Para MAb P3 recombinante, se recubrieron placas
de microtítulo con gangliósido GM3(NeuGc) en metanol. Después
de secar durante una hora, la unión no específica fue bloqueada con
albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en tampón
Tris-HCl, y se incubó durante una hora a 37ºC. Los
pocillos se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a 37ºC
con MAb P3 recombinante purificado. Los pocillos se lavaron con
Tris-HCl y se añadió anticuerpo
anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina, y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Finalmente, los
pocillos se lavaron y se añadió el tampón sustrato que contiene
p-nitrofenilfosfato. Después de media hora se midió
la absorbancia a 405 o a 492 nm, respectivamente.
Para Mabai 1E10 recombinante, el ensayo ELISA
fue similar, excepto que los pocillos fueron recubiertos con Mab P3
y se hicieron lavados con PBS-0,05% de Tween 20.
En los siguientes Ejemplos todas las enzimas
usadas, así como los materiales y reactivos, fueron obtenidos de
fuentes comerciales, a menos que se indique lo contrario.
La síntesis de cDNA se obtuvo por una reacción
con enzima transcriptasa inversa, comenzando con RNA del hibridoma
que produce Mab P3, como se describió previamente. Se muestra la
secuencia de los cebadores específicos usados en esta reacción:
El cDNA VHP3 y el cDNA VKP3 fueron amplificados
mediante PCR usando Taq Polimerasa y cebadores específicos. Los
sitios de restricción incluidos en los cebadores eran ECORV/NHEI,
para VH y ECORV/SALI para VK. Las secuencias de los cebadores
usadas fueron las siguientes:
Los productos de la PCR fueron clonados en
vector TA (kit de clonación TA, Invitrogen). Doce clones
independientes fueron secuenciados por el método didesoxi usando T7
DNA Pol (Pharmacia). Por análisis de búsqueda de homología, se
determinó el grupo de secuencias más homólogas para VHP3 y VKP3. Las
secuencias VHP3 y VKP3 (Figuras 1 y 2) tienen una elevada homología
con los grupos IB y V respectivamente, de acuerdo con la
clasificación de Kabat.
Después de la digestión con las enzimas de
restricción ECORV y NHEI para VHP3 y con ECORV y SALI para VKP3, se
clonaron en los vectores de expresión previamente digeridos con las
mismas enzimas, PAH4604 y PAG4622 para VH y VK respectivamente.
Estos vectores de expresión fueron donados por Sherie Morrison
(UCLA, California, USA), son adecuados para la expresión de
inmunoglobulinas en células de mamíferos. El vector PAH 4604 lleva
incluida la región constante humana IgG1 y la PAG 4622 humana
(Coloma et al. (1992): Novel vectors for the expression of
antibody molecules using variable regions generated by polymerase
chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
Las construcciones resultantes fueron P3VH-PAH4604 y
P3VK-PAG4622.
Células NS-0 fueron
transfectadas con 10 \mug de P3VK-PAG4622, un clon
que expresa la cadena ligera fue transfectado con 10 \mug de
P3VH-PAH4604, en ambos casos el DNA es linealizado
con PvuI, se precipita con etanol y se disuelve en 50 \mul de PBS
antes de la transfección.
Aproximadamente se recolectaron 10^{7} células
mediante centrifugación y se resuspendieron en 0,5 mL de PBS junto
con el DNA digerido en una cubeta de electroporación. Después de 10
minutos en hielo, se administró a las células un impulso de 200
voltios y 960 \muF y se dejaron en hielo durante 10 minutos más.
Las células se distribuyeron en una placa de 96 pocillos con D'MEM
F12 más 10% de suero de ternera fetal. Dos o cuatro días más tarde,
se añade medio selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45
\mug/mL o histidinol 10 mM, respectivamente). Los clones
transfectados eran visibles a simple vista 14 días más tarde.
La presencia de anticuerpo humano en el medio de
los pocillos que contienen clones transfectados se determinó
mediante un ELISA. Los pocillos de las placas de microtítulo fueron
recubiertos con anticuerpos de cadena ligera kappa
anti-humana de cabra (para los clones que producen
cadena kappa humana) o IgG anti-humana (específico
de cadena gamma) (para los clones que producen anticuerpo completo).
Después de lavar con PBST (solución salina tamponada con fosfato,
que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió medio de cultivo diluido
de los pocillos que contienen transfectantes a cada pocillo de
mitrotítulo durante una hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron con
PBS-T y se añadieron cadena ligera kappa antihumana
de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG
antihumana de cabra (específica de cadena gamma) conjugada con
fosfatasa alcalina, y se incubaron a 37ºC durante una hora. Los
pocillos se lavaron con PBS-T y se añadió tampón
sustrato que contiene o-fenilendiamina o
p-nitrofenilfosfato, respectivamente. Después de
media hora, se midió la absorbancia a 492 o 405 nm,
respectivamente.
Se compararon secuencias de VHP3 y VKP3 murinas
(Figuras 1 y 2) con secuencias humanas. Las Figuras 3 y 4 muestran
las secuencias humanas más homólogas. Se buscaron regiones
anfipáticas helicoidales o epítopos de células T potenciales en
secuencias de la región variable P3 murina y de acuerdo con el
método se estableció una estrategia juiciosa para sustituciones de
aminoácidos con el fin de romper o humanizar los epitopos de
células T potenciales en las secuencias murinas.
Los análisis en VHP3 arrojaron (Figura 3) 2
segmentos anfipáticos, el primero de ellos abarca CDR1, FR2 y
algunos restos de la CDR2, el segundo abarca el extremo de FR3 y
CDR3. Las principales diferencias de la secuencia murina en
comparación con la secuencia humana más homóloga se encontraron en
CDRs o restos implicados en la estructura tridimensional del sitio
de unión. Por esta razón se decidió no reemplazar ningún aminoácido
en VHP3 murina.
Los análisis para VKP3 arrojaron también 2
segmentos anfipáticos (Figura 4), el primer segmento abarca FR1, el
segundo abarca CDR2 y algunos restos de la FR3. Se decidió
reemplazar los restos en las posiciones 8, 9, 10, 11 y 13 por
restos en la misma posición en la secuencia humana más homóloga. Los
aminoácidos His, Lys, Phe, Met y Thr fueron reemplazados por Pro,
Ser, Ser, Leu, y Ala, respectivamente. Las sustituciones se hicieron
mediante solapamiento de PCR (Kammann et al. (1989) Rapid
insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR),
Nucleic Acids Res., 17: 5404) usando los cebadores 1 y 2 y 3 y 4,
cuyas secuencias son las siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Las mutaciones de punto se comprobaron por
secuenciación. La construcción resultante fue P3Vkhu y se clonó en
el vector de expresión PAG 4622. La construcción resultante fue
P3VKhu-PAG4622. Para expresar el anticuerpo
humanizado P3, células NS-0 fueron transfectadas con
P3VH-PAH4604 y P3VKhu-PAG4622.
El anticuerpo P3hu fue transfectado siguiendo el
mismo procedimiento de electroporación y detección descrito
previamente para los anticuerpos quiméricos.
\vskip1.000000\baselineskip
La unión específica con el antígeno medida
mediante ELISA ensayó la actividad biológica del Mab P3
quimérico.
Para MAb P3 recombinante, se recubrieron placas
de microtítulo con gangliósido GM3(NeuGc) en metanol. Después
de secar durante una hora a 37ºC, la unión no específica fue
bloqueada con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% en tampón
Tris-HCl, y se incubó durante una hora a 37ºC. Los
pocillos se lavaron con PBS y se incubaron durante 1 hora a 37ºC
con MAb P3 recombinante purificado. Los pocillos se lavaron con
Tris-HCl y se añadió anticuerpo
anti-humano de cabra conjugado con fosfatasa
alcalina, y se incubaron a 37ºC durante 1 hora. Finalmente, los
pocillos se lavaron y se añadió el tampón sustrato que contiene
p-nitrofenilfosfato. Después de media hora se midió
la absorbancia a 405 nm.
El Mabai T1 quimérico se utilizó como control
negativo.
La Figura 5 muestra la unión específica del Mab
P3 quimérico al antígeno.
Los Ejemplos 4 a 6 que siguen no se refieren a
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La síntesis de cDNA se obtuvo por una reacción
con enzima transcriptasa inversa, comenzando con RNA del hibridoma
que produce Mab 1E10, como se describió previamente. Se muestra a
continuación la secuencia de los cebadores específicos usados en
esta reacción:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El cDNA VH1E10 y el cDNA VK1E10 fueron
amplificados mediante PCR usando Taq Pol y cebadores
específicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Los productos de la PCR fueron clonados en
vector TA (kit de clonación TA, Invitrogen). Doce clones
independientes fueron secuenciados (Figuras 7 y 8) por el método
didesoxi usando T7 DNA Pol (Pharmacia). Por análisis de búsqueda de
homología, se determinó el grupo de secuencias más homólogas para
VH1E10 y VK1E10. Las secuencias VH1E10 y VK1E10 tienen una elevada
homología con los grupos misceláneo y V respectivamente, de acuerdo
con la clasificación de Kabat. Después de la digestión con las
enzimas de restricción ECORV y NHEI para VH1E10 y con ECORV y SALI
para VK1E10, se clonaron en los vectores de expresión previamente
digeridos con las enzimas apropiadas, PAH4604 y PAG4622 para VH y
VK respectivamente. Estos vectores de expresión fueron donados por
Sherie Morrison (UCLA, California, USA), son adecuados para la
expresión de inmunoglobulinas en células de mamíferos. El vector
PAH 4604 lleva incluida la región constante humana IgG1 y la PAG
4622 humana (Coloma et al. (1992): Novel vectors for the
expression of antibody molecules using variable regions generated by
polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152:
89-104). Las construcciones resultantes fueron
1E10VH-PAH4604 y
1E10VK-PAG4622.
Células NS-O fueron
transfectadas con 10 \mug de 1E10VK-PAG4622, un
clon que expresa la cadena ligera fue transfectado con 10 \mug de
1E10VH-PAH4604, en ambos casos el DNA es linealizado
con PvuI, se precipita con etanol y se disuelve en 50 \mul de PBS
antes de la transfección.
Aproximadamente se recolectaron 10^{7} células
mediante centrifugación y se resuspendieron en 0,5 mL de PBS junto
con el DNA digerido, en una cubeta de electroporación. Después de 10
minutos en hielo, se administro a las células un impulso de 200
voltios y 960 \muF y se dejaron en hielo durante 10 minutos más.
Las células se distribuyeron en una placa de 96 pocillos con D'MEM
F12 más 10% de suero de ternera fetal. Dos o cuatro días más tarde,
se añade medio selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45
\mug/mL o histidinol 10 mM, respectivamente). Los clones
transfectados fueron visibles a simple vista 14 días más tarde.
La presencia de anticuerpo humano en el medio de
los pocillos que contienen clones transfectados se midió mediante
un ELISA. Los pocillos de las placas de microtítulo fueron
recubiertos con anticuerpos de cadena ligera kappa
anti-humana de cabra (para los clones que producen
cadena kappa humana) o IgG anti-humana (específico
de cadena gamma) (para los clones que producen anticuerpo completo).
Después de lavar con PBST (solución salina tamponada con fosfato,
que contiene 0,05% de Tween 20), se añadió medio de cultivo diluido
de los pocillos que contienen transfectantes a cada pocillo de
mitrotítulo durante una hora a 37ºC. Los pocillos se lavaron con
PBS-T y se añadieron cadena ligera kappa antihumana
de cabra conjugada con peroxidasa de rábano picante o IgG
antihumana de cabra (específica de cadena gamma) conjugada con
fosfatasa alcalina, y se incubaron a 37ºC durante una hora. Los
pocillos se lavaron con PBS-T y se añadió tampón
sustrato que contiene o-fenilendiamina o
p-nitrofenilfosfato, respectivamente. Después de
media hora, se midió la absorbancia a 492 o 405 nm,
respectivamente.
Se compararon secuencias VH1E10 y VK1E10 murinas
(Figuras 6 y 7) con secuencias humanas. Las Figuras 8 y 9 muestran
las secuencias humanas más homólogas. Se buscaron regiones
anfipáticas helicoidales o epítopos de células T potenciales en
secuencias de la región variable de 1E10 murina y de acuerdo con el
método se estableció una estrategia juiciosa para sustituciones de
aminoácidos con el fin de romper o humanizar los epítopos de
células T potenciales en las secuencias murinas.
Los análisis en VH1E10 arrojaron (Figura 8) 3
segmentos anfipáticos, el primero de ellos abarca FR1, el segundo
abarca FR2, el tercero abarca FR3. Se decidió reemplazar los restos
en las posiciones 5, 40, 42 y 87 (83 de acuerdo con la numeración
de Kabat) por restos en las mismas posiciones en la secuencia humana
más homóloga. Los aminoácidos Gln, Arg, Glu y fueron reemplazados
por Val, Ala, Gly y Arg, respectivamente.
Las sustituciones se hicieron mediante
solapamiento de PCR (Kammann et al. (1989) Rapid insertional
mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic
Acids Res., 17: 5404) usando diferentes juegos de cebadores.
Los cebadores para la mutación en la posición 5
de la cadena pesada fueron 1 y 2 y 3 y 4, cuyas secuencias son las
siguientes:
Después de comprobar mediante la secuencia la
mutación de punto en la posición 5, se introdujeron mutaciones en
la posiciones 40 y 42.
Cebador para las mutaciones en las posiciones 40
y 42 de la cadena pesada:
Después de comprobar mediante secuenciación la
mutación de punto en las posiciones 40 y 42, se introdujeron
mutaciones en la posición 87 (83 de acuerdo con la numeración de
Kabat).
El cebador para las mutaciones en la posición 87
(83 de acuerdo con la numeración de Kabat) de la cadena pesada:
No se hicieron otras sustituciones porque los
restos estaban implicados en la estructura tridimensional del sitio
de unión.
Las mutaciones de punto se comprobaron por
secuenciación. La construcción resultante fue 1E10VHhu y fue clonada
en vector de expresión PAH4604. La construcción resultante fue
1E10VH-PAH4604.
El análisis para VK1E10 arrojó también 3
segmentos anfipáticos (Figura 9), el primer segmento abarca FR1, el
segundo abarca CDR1, y el tercero abarca FR3. Se decidió reemplazar
los restos en las posiciones 7, 8 y 15 por restos en las mismas
posiciones en la secuencia humana más homóloga. Los aminoácidos Thr,
Thr y Leu fueron reemplazados por Ser, Pro y Val, respectivamente.
Las sustituciones se hicieron mediante solapamiento de PCR (Kammann
et al. (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by
polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404)
usando los cebadores 1 y 2 y 3 y 4, cuyas secuencias son las
siguientes:
Cebadores para las mutaciones en las posiciones
7, 8 y 15 de la cadena ligera:
Las mutaciones de punto se comprobaron por
secuenciación. La construcción resultante fue 1E10Vkhu y fue clonada
en vector de expresión PAG 4622. La construcción resultante fue
1E10VKhu-PAG4622.
\newpage
Para expresar el anticuerpo humanizado 1E10,
células NS-0 fueron transfectadas con
1E10VHhu-PAH4604 y
1E10VKhu-PAG4622.
El anticuerpo 1E10hu fue transfectado siguiendo
el mismo procedimiento de electroporación y detección descrito
previamente para los anticuerpos quiméricos.
La unión específica con el antígeno medida
mediante ELISA ensayó la actividad biológica del Mab 1E10
quimérico.
Para MAb 1E10 recombinante, se recubrieron
placas de microtítulo con Mab P3. Después de lavar con PBST
(solución salina tamponada con fosfato, que contiene 0,05% de Tween
20), la unión no específica se bloqueó con albúmina de suero bovino
(BSA) al 1% en PBST, se incubó durante una hora a 37ºC. Los pocillos
se lavaron y se incubaron durante una hora a 37ºC con Mab 1E10
recombinante purificado. Los pocillos se lavaron con PBST y se
añadió un anticuerpo anti-humano de cabra conjugado
con fosfatasa alcalina y se incubó a 37ºC durante una hora.
Finalmente, los pocillos se lavaron con PBST y se añadió el tampón
sustrato que contiene p-nitrofenilfosfato. Después
de media hora se midió la absorbancia 405 nm.
El Mab C5 quimérico se utilizó como control
negativo.
La Figura 10 muestra la unión específica del Mab
1E10 quimérico a Mab P3.
Figura 1: DNA de VHP3 y secuencias de
aminoácidos deducidas. Las secuencias están alineadas de acuerdo con
la numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), Sequences of
proteins of immunological interest, Fifth Edition, National
Institute of Health), las CDRs aparecen marcadas con líneas de
puntos.
Figura 2: DNA de VKP3 y secuencias de
aminoácidos deducidas. Las secuencias están alineadas de acuerdo con
la numeración de Kabat (Kabat y colaboradores (1991), Sequences of
proteins of immunological interest, Fifth Edition, National
Institute of Health), las CDRs aparecen marcadas con líneas de
puntos.
Figura 3: VHP3 se alineó con la secuencia humana
más homóloga. Los segmentos anfipáticos están subrayados y las CDRs
están en negrita.
Figura 4: VKP3 se alineó con la secuencia humana
más homóloga. Los segmentos anfipáticos están subrayados y las CDRs
están en negrita.
Figura 5: Unión específica con GM3(NeuGc)
por Mab P3 quimérico. Diferentes concentraciones de Mab P3 y MAb T1
(control negativo) fueron ensayadas mediante ELISA. Se recubrieron
placas de microtítulo con gangliósido GM3(NeuGc) y
GM3(NeuAc) (control negativo) en metanol y se midió la unión
específica.
Figura 6: DNA de VH1E10 y secuencias de
aminoácidos deducidas. Las secuencias están alineadas de acuerdo con
la numeración de Kabat (Kabat y colaboradores (1991), Sequences of
proteins of immunological interest, Fifth Edition, National
Institute of Health), las CDRs aparecen marcadas con líneas de
puntos.
Figura 7: DNA de VK1E10 y secuencias de
aminoácidos deducidas. Las secuencias están alineadas de acuerdo con
la numeración de Kabat (Kabat et al. (1991), Sequences of
proteins of immunological interest, Fifth Edition, National
Institute of Health), las CDRs aparecen marcadas con líneas de
puntos.
Figura 8: VH 1E10 se alineó con la secuencia
humana más homóloga. Los segmentos anfipáticos están subrayados y
las CDRs están en negrita.
Figura 9: VK 1E10 se alineó con la secuencia
humana más homóloga. Los segmentos anfipáticos están subrayados y
las CDRs están en negrita.
Figura 10: Unión específica de Mab P3 murino por
Mab 1E10 quimérico. Diferentes concentraciones de Mab 1E10 y MAb C5
(control negativo) fueron ensayadas mediante ELISA. Se recubrieron
placas de microtítulo con Mab P3 y Mab A3 (control negativo) y se
midió la unión específica.
<110> Centro de Inmunología Molecular
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos recombinantes asociados
a gangliósidos y el uso de los mismos en la diagnosis y el
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptratamiento de tumores
\hfill
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P66417EP00
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP02759752.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
08-04-2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> CU 84/2001
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
06-04-2001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 59
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
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<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 7
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<210> 8
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<211> 14
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 32
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 9
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
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<210> 11
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<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 17
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\hskip1cm
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<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<210> 22
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<211> 14
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
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<400> 25
\hskip1cm
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<210> 26
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
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<400> 27
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<210> 28
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<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus musculus
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\hskip1cm
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<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MAb P3 para VH
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaggtctagaa yctccacaca caggrrccag tggatagac
\hfill39
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<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MAb P3 para VK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgcgtctagaa ctggatggtg ggaagatgg
\hfill29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 (péptido señal) para
VH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggatatcc accatggrat gsagctgkgt matsctctt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 2 (CH1) para VH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggctagct gcagagacag tgaccagagt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 (péptido señal) para
VK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggatatcc accatggagw cacakwctca ggtctttrt
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 2 (Ck) para VK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtcgact tacgtttkat ttccarcttk gtccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 Anticuerpo humanizado
P3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipatgacccagt ctccttcttc tctttccgcg tcagtaggag ac
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3 Anticuerpo humanizado
P3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtctcctact gacgcggaaa gagaagaagg agactgggtc at
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador MAb 1E10 para VH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggctagct gaggagactg tgagagtggt
\hfill30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 (péptido señal) para
VK
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggttaacc accatgaggk ccccwgctca gytyctkggr
\hfill40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 Anticuerpo humanizado 1E10
posición 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcaggttcagc tggtgcagtc tggagct
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3 Anticuerpo humanizado 1E10
posición 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagctccagac tgcaccagct gaacctg
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 Anticuerpo humanizado 1E10
posiciones 40 y 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgggtgaggc aggcgcctgg gcagggactt gag
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3 Anticuerpo humanizado 1E10
posiciones 40 y 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcaagtccc tgcccaggcg cctgcctcac cca
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 Anticuerpo humanizado 1E10
posición 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctcagcaggc tgcggtctga ggactct
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3 Anticuerpo humanizado 1E10
posición 87
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagagtcctca gaccgcagcc tgctgag
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 1 Anticuerpo humanizado
VK1E10 posiciones 7, 8 y 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcagatgacac agtctccttc ctccctgtct gcctctgtgg gagacagagt c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 2 Anticuerpo humanizado
VK1E10 posiciones 7, 8 y 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipagcgtcgact tacgtttkat ttccarcttk gtccc
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador 3 Anticuerpo humanizado
VK1E10 posiciones 7, 8 y 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgactctgtct cccacagagg cagacaggga ggaaggagac tgtgtcatct g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 354
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(354)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VHP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 312
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(312)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VKP3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 104
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(357)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VH 1E10
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 119
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(321)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> VK 1E10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 126
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 107
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
Claims (6)
1. Un anticuerpo monoclonal quimérico derivado
del anticuerpo monoclonal murino Mab P3 que reconoce gangliósidos
que contienen ácido siálico N-glicolilado, y que es
producido por la línea de células de hibridoma con el número de
depósito ECACC 94113026, en el que los dominios hipervariables de
las cadenas pesada y ligera de Mab P3 comprenden las siguientes
secuencias:
CADENA PESADA
- CDR1: RYSVH
- CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
- CDR3: SGVREGRAQAWFAY
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA LIGERA
- CDR1: KASQDVSTAVA
- CDR2: SASYRYT
- CDR3: QQHYSTPWT;
las regiones de entramado (FRs) de las cadenas
pesada y ligera de Mab P3 comprenden las siguientes secuencias:
CADENA PESADA
- FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
- FR2: WVRQPPGKGLEWLG
- FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
- FR4: WGQGTLV
\vskip1.000000\baselineskip
CADENA LIGERA
- FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
- FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
- FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
- FR4: FGGGTKL;
en donde el anticuerpo monoclonal quimérico,
para su humanización y la preservación de las propiedades de unión
con el antígeno, incluye las siguientes sustituciones en la región
FR1 de la cadena ligera:
CADENA LIGERA:
- Posición 8: His por Pro
- Posición 9: Lys por Ser
- Posición 10: Phe por Ser
- Posición 11: Met por Leu
- Posición 13: Thr por Ala
2. Un anticuerpo monoclonal según la
reivindicación 1, en el que la región constante de la cadena pesada
comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena
gamma-1 y la región constante de la cadena ligera
comprende la secuencia de aminoácidos de una cadena kappa, ambas
derivadas de inmunoglobulinas humanas.
3. Una línea de células que produce cualquiera
de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones 1 y 2.
4. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis
y sus recidivas, que comprende cualquiera de los anticuerpos
monoclonales según las reivindicaciones 1 y 2.
5. Una composición farmacéutica para la
localización e identificación in vivo de tumores malignos de
mama y melanomas, sus metástasis y sus recidivas, que comprende
cualquiera de los anticuerpos monoclonales según las
reivindicaciones 1 y 2.
6. El uso de un anticuerpo monoclonal según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para la preparación de un
medicamento útil para el tratamiento de tumores malignos de mama y
melanomas, sus metástasis y sus recidivas.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CU2001008420010084A CU23007A1 (es) | 2001-04-06 | 2001-04-06 | Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos |
| CU842001 | 2001-04-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2296986T3 true ES2296986T3 (es) | 2008-05-01 |
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ID=40291118
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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