CZ20032668A3 - Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů - Google Patents

Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů Download PDF

Info

Publication number
CZ20032668A3
CZ20032668A3 CZ20032668A CZ20032668A CZ20032668A3 CZ 20032668 A3 CZ20032668 A3 CZ 20032668A3 CZ 20032668 A CZ20032668 A CZ 20032668A CZ 20032668 A CZ20032668 A CZ 20032668A CZ 20032668 A3 CZ20032668 A3 CZ 20032668A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
monoclonal antibody
human
light chain
heavy
antibody
Prior art date
Application number
CZ20032668A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ304424B6 (cs
Inventor
De Acosta Del Río Cristina María Mateo
Valladares Josefa Lombardero
Navarro Lourdes Tatiana Roque
Requena Alejandro López
Original Assignee
Centro De Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro De Inmunologia Molecular filed Critical Centro De Inmunologia Molecular
Publication of CZ20032668A3 publication Critical patent/CZ20032668A3/cs
Publication of CZ304424B6 publication Critical patent/CZ304424B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

REKOMBINANTNÍ PROTILÁTKY SOUVISEJÍCÍ S GANGLIOSIDY
A JEJICH POUŽITÍ PŘI DIAGNÓZE A LÉČBĚ NÁDORŮ
Oblast techniky
Předložený vynález se týká oblasti biotechnologie, zejména nových rekombinantních protilátek získaných prostřednictvím genového inženýrství, konkrétně chimerních a humanizovaných protilátek získaných z myší monoklonální protilátky P3 (MAb P3) a její antiidiotypové myší monoklonální protilátky 1E10 (MAbai 1E10).
Konkrétněji se vynález týká protilátek, které se vážou na gangliosidy obsahující N-glykolylovou kyselinu sialovou, ale nikoli s acetylátovanými formami gangliosidů ani s neutrálními glykolipidy. Gangliosidy obsahující N-glykolylovou kyselinu sialovou jsou antigeny hojně exprimované při rakovině prsu a melanomech. Na druhé straně se na experimentálních modelech prokázal protinádorový účinek MAbai 1E10.
Předložený vynález se také týká farmaceutických kompozic, které obsahují dříve popsané rekombinantní protilátky prospěšné při diagnóze a léčbě rakoviny, zejména rakoviny prsu a melanomů.
Dosavadní stav techniky
Gangliosidy jsou glykosfingolipidý, které obsahují kyselinu sialovou a jsou přítomné v plasmatické membráně buněk obratlovců (Stults a spol. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179: 167214). 0 některých z těchto molekul se v literatuře referovalo jako o antigenech souvisejících s nádory nebo markéry nádoru (Hakomori a spol. (1991): Possible functions of tumor associated • · · · • · · ··· · · · • · · · · ··· · · · · • · · · · ···· · · · ···· • · · · · ··· ······ ·· · · · · carbohydrate antigens. Curr. Opin. Imiaunol., 3: 64 6-653), a proto se použití protilátek proti gangliosidům popisovalo jako prospěšné při diagnóze a léčbě rakoviny (Hougton a spol. (1985): Mouše monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242-1246; Zhang a spol. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides,
Int. J. Cancer, 73: 42-49).
Kyseliny sialové častěji exprimdvané u zvířat jsou N-acetyl (NeuAc) a W-glykolyl (NeuGc) (Corfield a spol. (1982):
Occurrence of sialic acids, Cell. Biol, Monogr., 10: 5-50). Obecně se NeuGc neexprimuje v normálních lidských a kuřecích tkáních, ale všeobecně se vyskytuje u jiných obratlovců (Leeden a Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A. a Shengtrund C. L. (editoři), Plenům Press, New York, 1-48; Kawai a spol. (1991): Quantitative determination of W-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lineš as a tumor associated sialic acid by gas chromatographymass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). Nicméně existují studie, které ukazují, že protilátky proti NeuGc rozpoznávají určité lidské nádory a nádorové buněčné linie (Higashi a spol. (1988): Detection of gangliosides as Nglycolylneuraminic acid specific tumor-associated HanganutziuDeicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui a spol. (1989): Detection of glycoproteins as. tumor associated Hangaňutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4/. Biochem, Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Zvýšené koncentrace GM3 (NeuGc) gangliosidu byly nalezené v lidské rakovině prsu (Marquina a spol. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 56: 5165-5171), tento výsledek činí použití ····· ·· · ··· • · · · · · ··· • · · · · · · · · · · t • · · · · ···· · · · ···· • · · · · ··· ······ 93 9 9 9 · této molekuly jako terče pro léčbu rakoviny přitažlivým.
Monoklonální protilátka (MAb) P3 produkovaná buněčnou linií uloženou pod přístupovým číslem ECACC 94113026 (Evropský patent EP 0 657 471 Bl) je myší monoklonální protilátka s IgM isotypem, která se získá, když se spojí myší splenocyty z myši BALB/c imunizované liposomy obsahujícími GM3 (NeuGc) a tetanový toxoid s buněčnou linií P3-X63-Ag8.653; která je myším myelomem. Tato protilátka MAb P3 výrazně reaguje s gangliosidy obsahujícími Nglykolyl sialovou kyselinu, ale nereaguje s acetylovými formami gangliosidů ani s neutrálními glykolipidy. Pomocí imunocytochemických a imunohistochemických studií provedených s buněčnými liniemi a tkáněmi z benigních a neoplastických nádorů se prokázalo, že MAb P3 rozpoznává rakovinu prsu (Vázquez a spol. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14·. 551-556) a melanom.
Monoklonální protilátka MAb P3 indukovala antiidiotypovou imunitní odpověď (Ab2) u myši BALB/c (syngenetický model), dokonce i bez adjuvans a proteinového nosiče, (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody,
Hybridoma, 17: 527-534). Úloha elektronegativních skupin, sialové kyseliny (pro gangliosidy) a SO3 (pro sulfatidy sulfogalaktosylceramidy), v rozpoznávacích vlastnostech této protilátky byla navržena pomocí imunochemických analýz (Mořeno a spol. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705).
Antiidioťypový MAb 1E10 (MAbai 1E10) subtypu IgGl se získal z myši BALB/c imunizované s MAb P3 vázaným na KLH (US patent • · · · • · » · · · · · · ···· · ··· · ··· • · ♦ · ······· ····· • · · · ♦ ··· ······ ·« 9 «· ·
6,063,379, buněčná linie uložená pod přístupovým číslem ECACC 97112901). MAbai 1E10 rozpoznávala MAb P3 a nevázala jiné protilátky IgM proti gangliosidům. Kromě toho MAbai 1E10 inhibovala specifickou vazbu MAb P3 na GM3 (NeuGc) a na buněčnou linii MDA-MB-435 získanou z karcinomu prsních kanálků (pozitivních na vazbu MAb P3). MAbai 1E10 stimulovala silnou imunitní odpověď protilátek Ab3, když se imunizovaly myši ze syngenetických a alogenních modelů, přičemž tyto protilátky Ab3 nevykazovaly stejnou specifitu jako MAb P3, i když nesly idiotypy podobné těm, které nesla protilátka Abl (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534), MAbai 1E10 stimulovala silný protinádorový účinek u syngenetické, jakož i alogenni myši. Růst buněčné linie karcinomu prsních žláz F3II se významně snížil opakovanou dávkou MAbai 1E10 vázanou na KLH ve Freundově adjuvancii, když se myš BALB/c vakcinovala. Po vakcinaci se také snížil počet spontánních plicních metastází. Intravenózní aplikace MAbai 1E10 naočkované myši C57BL/6, 10 až 14 dní po intravenózním naočkování melanomových buněk B16, způsobilo dramatické snížení počtu plicních metastází při srovnání s myší ošetřenou irelevantním IgG. Tyto výsledky naznačují, že se spouští více než jeden mechanismus protinádorového účinku (Vázquez a spol. (2000): Antitumor properties of an antiidiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolylcontaining gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756).
I když se hybridomová technologie během 15 let rozvinula (Kohler a Milstein (1975) : Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity, Nátuře, 256: 495497), a kdy monoklonální protilátky jsou stále velice prospěšné při diagnózách, jakož i ve výzkumu, neprokázala se jejich terapeutická účinnost u lidí. Způsobuje to hlavně jejich krátký poločas života v krvi a to, že myší efektorové funkce selhávají • · · · • · 9 · · · 9 · 9 • · · · · · · · · · 9 9 • · · · · ···· 9 « · 99 99 • 9 9 9 9 * · «
999999 ·· · « « * pro lidský imunitní systém a také kvůli lidské imunitní odpovědi na myší protilátky (HAMA odpověď).
Převrat v eventuální užitečnosti MAb jinak způsobila technologie genového inženýrství, jelikož manipulací genů imunoglobulinů je možné získat modifikované protilátky se sníženou antigenitou a rovněž zlepšit efektorové funkce pro léčbu nebo diagnózy určitých patologií. Způsoby snížení imunogenity imunoglobulinu mají zásadní cíl zmenšit rozdíly mezi myší protilátkou a lidským imunoglobulinem, aniž by se změnila specifita rozpoznávání antigenu (Morrison a Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol., 44: 65-92) .
V poslední době bylo vyvinuto několik způsobů humanizace myších nebo krysích protilátek, a tím snížení xenogenní imunitní odpovědi proti cizím proteinům, když jsou vpíchnuté lidem.
Jedním z prvních přístupů ke snížení antigenity byly chimerní protilátky, ve kterých se variabilní domény myšího proteinu vložily do konstantních domén lidských molekul, které vykazují stejnou specifitu, ale sníženou imunogenitu ve srovnání s jejich myšími protějšky, přičemž se zachovaly humánní efektorové funkce chimerních protilátek, (Morrison a spol. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouše antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81 6851-6855) . I když chimerní protilátky mají stejnou specifitu jako myší protějšky, běžně se pozorovala imunitní odpověď ná hlodavčí variabilní oblasti.
Při pokusu o další snížení imunogenity chimerních protilátek, se transplantovaly pouze oblasti determinující komplementaritu (CDR) z hlodavčí monoklonální protilátky do oblastí lidských základních zbytků a tato hybridní variabilní oblast se exprimovala s lidskými konstantními oblastmi (Jones a « ··· · 9 · · ·« «
9 9 9 9 · · · ···· · 9 9 · 9 9 9 · • 9 9 9 · 9999 · · · 9999 • · 9 · · 9 · ·
9····· · · 9 99 · spol. (1986) : Replacing the comlemntary-determining regions in a human antibody with those from a mouše, Nátuře, 321: 522-524; Verhoeyen a spol. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science, 239; 1534-1536). Tento postup měl nicméně několik nedostatků: výsledná protilátka měla běžně sníženou afinitu a řada základních zbytků se musela pro obnovení vazby zpětně mutovat na odpovídající myší systémy (Rietchmann a spol. (1988) : Reshaping human antibodies for therapy, Nátuře, 332: 323-327; Queen a spol. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest a spol. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respirátory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). Kromě toho se běžně pozorovalo, že imunogenita přetrvávala v protilátkách s transplantovanými CDR.
Mateo a spolupracovníci (US patent číslo US 5 712 120) popsali způsob snížení imunogenity myších protilátek. Podle tohoto způsobu se modifikace omezují na variabilní domény a konkrétně na myší oblasti základních zbytků (FR) chimerních protilátek. Kromě toho se záměny provádějí pouze v těch oblastech FR, které mají amfipatické sekvence, a proto jsou možnými epitopy rozpoznatelnými T buňkami. Způsob zahrnuje uvážlivou záměnu několika málo zbytků aminokyselin lokalizovaných v potenciálních imunogenních epitopech za odpovídající zbytky z lidské sekvence š nejvyšší homologií, musí se však uchovat aminokyseliny, které jsou hlavně odpovědné za kanonické struktury a také zbytky v bezprostředním sousedství oblastí CDR nebo ve Vernierově zóně.
Výsledná protilátka si uchovává svoji specifitu vazby antigenu a je méně imunogenní než buď její myší nebo chimerní předchůdce (Mateo a spol. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Produktion of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma, 19: 4 63• · • · » · · · · • ···· · · ···>· • · · »
471), což jsou vlastnosti, které zvyšují jejich terapeutickou užitečnost. Použitím tohoto nového způsobu se musí provést pouze několik málo mutací a samozřejmě méně genových manipulací.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu jsou rekombinantní protilátky získané technologií genového inženýrství. Konkrétně je předmětem vynálezu chimerní protilátka získaná z myší monoklonální protilátky P3, kterou produkuje buněčná linie hybridomu s depozitním číslem ECACC 94113026. MAb P3 rozpoznává antigen exprimovaný v buňkách nádoru prsu a melanomech. MAb P3 se vyznačuje následujícími sekvencemi hypervariabilních oblastí (CDR) těžkého a lehkého řetězce:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
CDR1: RYSVH
CDR2: MIWGGGŠTDYNSALKS
CDR3: SGVREGRAQAWFAY
LEHKÝ ŘETĚZEC
CDR1: KASQDVáTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT
Sekvence oblastí základních zbytků (FR) těžkého a lehkého řetězce jsou výhodně následující:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG
FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR FR4: WGQGTLV
LEHKÝ ŘETĚZEC
FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLLIY • · · · · · · · · · · · • · · » · ···· · · · *··« • · · · · « · · ······ ·>· · «· ·
FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL
Chimerní protilátka předloženého vynálezu ve výhodném provedení obsahuje konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl a konstantní oblast lehkého řetězce lidského Ck.
V dalším aspektu je předmětem předloženého vynálezu humanizovaná protilátka odvozená z MAb P3, kterou produkuje buněčná linie hybridomu s depozitním číslem ECACC 94113026 vyznačující se tím, že obsahuje konstantní oblast lidského těžkého řetězce IgGl a konstantní oblast lidského lehkého řetězce Ck a že oblasti FR lehkého řetězce obsahují kteroukoli z následujících bodových mutací:
LEHKÝ ŘETĚZEC:
pozice 8: His za Pro
pozice 9: Lys za Ser
pozice 10 : Phe za Ser
pozice 11 : Met za Leu
pozice 13 : Thr za Ala
V jiném aspektu je předmětem předloženého vynálezu chimerní protilátka odvozená z myší monoklonální protilátky 1E10, kterou produkuje buněčná linie hybridomu s depozitním číslem ECACC 97112901 a která je antiidiotypovou protilátkou rozpoznávající MAb P3. MAbai 1E10 se vyznačuje následujícími sekvencemi hypervariabilních oblastí (CDR) těžkého a lehkého řetězce:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
CDR1: SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
CDR3: EDYYDNSYYFDY
LEHKÝ ŘETĚZEC
CDR1: RASQDISNYLN
CDR2 :. YTSRLHSG
• · · ·
CDR3: QQGNTLPWT
Sekvence oblastí FR těžkého a lehkého řetězce jsou výhodně následující:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT
FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR
FR4: WGQGTTLTV
LEHKÝ ŘETĚZEC
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC
FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC
FR4: FGGGTKLESK
Ve výhodném provedení obsahuje chimerní protilátka předloženého vynálezu konstantní oblast těžkého řetězce lidského IgGl a konstantní oblast lehkého řetězce lidského Ck. V dalším aspektu je předmětem předloženého vynálezu humanizovaná protilátka získaná z MAb 1E10, kterou produkuje buněčná linie hybridomu s depozitním číslem ECACC 97112901, vyznačující se tím, že obsahuje konstantní oblast lidského těžkého řetězce IgGl a konstantní oblast lidského lehkého řetězce Ck a že oblasti FR těžkého a lehkého řetězce obsahují kteroukoli z následujících bodových mutací:
LEHKÝ ŘETĚZEC
pozice 7: Thr za Ser
pozice 8: Thr za Pro
pozice 15: Leu za Val
TĚŽKÝ I ŘETĚZEC
pozice 5: Gin za Val
pozice 40: Arg za Ala
pozice 42: Glu za Gly
• ··4· ··· ·· · • 4 4 · · · «·· • · · · · · · · « ··» • · · · 4 444· 11 1 1199 • ···· · · « ······ ·· · « · · pozice 87 (83 podle Kabatova číslování): Thr za Arg
V dalším aspektu jsou předmětem předloženého vynálezu buněčné linie, které exprimují popsané chimerní a humanizované protilátky. Předmětem předloženého vynálezu jsou navíc farmaceutické kompozice obsahující popsané protilátky.
Výhodně jsou předmětem vynálezu farmaceutické kompozice pro léčbu nádorů prsu, plic, trávící soustavy, urogenitálního systému, melanomů, sarkomů a neuroektodermatických nádorů, jejich metastází a relapsů obsahující popsané protilátky a vhodnou pomocnou látku.
Dalším předmětem reprezentace předloženého vynálezu je možnost použít farmaceutické kompozice pro lokalizaci a diagnózy nádorů prsu, plic, trávící soustavy, urogenitálního systému, melanomů, sarkomů a neuroektodermatických nádorů, jejich metastází a relapsů in vivo.
Syntéza cDNA a amplifikace genu pomocí PCR (řetězové polymerasové reakce) variabilních oblastí MAb P3 a MAbai 1E10.
Cytoplasmatická RNA se extrahovala z asi 106 buněk hybridomu P3 (myší IgM MAb, která rozpoznává GM3 N-glykolový gangliosid) nebo 1E10 (protilátka antiidiotypu proti P3) . RNA se extrahovala s použitím reagencie TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY), podle instrukcí výrobce.
Reakce syntézy cDNA se provedla smíšením 5 |ig RNA, 25 pmolů VH (komplementární ke konstantní oblasti myší IgM pro VH P3 a ke konstantní oblasti myší IgGl pro VH 1E10) nebo VK (komplementární ke konstantní myší kapa oblasti pro obě protilátky), 2,5 mM každého dNTP, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KC1, 10 mM DTT, 8 mM MgCl2 a 15 jednotek inhibitoru RNA • · A · • A
AAA
A AA A A polymerasy v 50 pL reakční směsi. Deset minut se směs zahřívala na 70 °C a pomalu se ochladila na 37 °C. Potom se přidalo 100 jednotek enzymu MLV reversní transkriptasy a inkubace pokračovala při 42 °C jednu hodinu.
Variabilní oblasti VK a VH cDNA se amplifikovaly pomocí PCR. Krátce, 5 pL cADN VH nebo VK se smíchalo s 25 pmoly specifických primerů, 2,5 mM každé dNTP, 5 pL složek 10X pufru Taq DNA polymerasy a 1 jednotkou tohoto enzymu. Vzorky se podrobily 25 teplotním cyklům při 94 °C, 30 sekund; při 50 °C 30 sekund; při 72 °C, 1 minutu a poslední : inkubaci při 72 °C po dobu 5 minut.
Klonování a sekvenování simplifikované cDNA.
PCR produkty VH a VK (z P3 a z 1E10) se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Promega, USA). Výsledné klony se sekvenovaly pomocí dideoxy způsobu s použitím T7 DNA polymerasy (T7 sekvenovací souprava, Pharmacia, Švédsko).
Konstrukce chimerních genů.
Geny VH a VK se vystřihly z TA vektorů enzymatickou digescí a klonovaly se do odpovídajících expresních vektorů (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using yariable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
Geny VH se vystřihly z TA vektoru pomocí enzymatické digesce s EcoRV.a Nhel a klonovaly se do expresního vektoru (PAH 4604), který zahrnoval variabilní region lidské IgGl a geny resistentní k histidinolu. Výsledné konstrukce byly P3VH-PAH4604 a 1E10VH-PAH4604. Geny VK se vystřihly z TA vektoru pomocí enzymatické digesce s EcoRV a Sall a klonovaly se do expresního ··· • · · · • ···· · · • ·· · · • 4» vektoru (PAG4622). Tento vektor obsahoval resistentní geny k mykofenolové kyselině a lidskou kapa konstantní oblast. Výsledné konstrukce byly P3VK-PAG4622 a 1E10VK-PAG4622.
Exprese chimernich protilátek získaných z MAb P3 a MAbid 1E10.
Buňky NS-0 se podrobily elektroporaci s 10 pg P3VK-PAG4622 nebo 1E10VK-PAG4622, klony exprimující lidské kapa lehké řetězce se transfektovaly s 10 pg P3VH-PAH4604 nebo 1E10VH-PAH4604.
DNA se linearizovaly digescí s enzymem Pvul, precipitovaly ethanolem a rozpustily v 50 pL PBS. Odstředěním se sklidilo přibližně 107 buněk a resuspendovaly se v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po desetiminutovém ponechání na ledu byly buňky vystaveny impulsu 200 Voltů a 960 pF a ponechaly se na ledu dalších deset minut. Buňky se distribuovaly na 96 jamkovou destičku s D'MEM F12 s 10 % fetálním telecím sérem. Po dvou až čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL mykofenolové kyseliny nebo 10 mM histidinolu). Transfektované klony byly po 14 dnech viditelné pouhým okem.
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících trasfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se smočily kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem.tlumený roztok obsahující 0,05 % Tweenu 20) se na jednu hodinu při 37 °C přidalo do každé mikrotitrační jamky zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty. Jamky se promyly s PBS-T a přidala se kozí protilátka proti lidskému kapa lehkému řetězci konjugovaná křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) ··«♦· ··· ·· · *· · · · · · · · • ·«· · ··· · · · · • 9 9 9 9 9999 9 9 9 ····
9 9 9 9 9 9 9
99 99 9 9 9 9 9 9 · konjugovaný alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo p-nitrofenyl-fosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Konstrukce humanizovaných protilátek P3hu a lElOhu pomoci humanizace epitopů T buněk. Predikce epitopů T buněk.
Sekvence variabilních oblastí P3 a 1E10 se analyzovaly algoritmem AMPHI (Margalit a spol. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138; 2213-2229). Vyhledávaly se spirálovité amfipatické segmenty se sedmi nebo jedenácti zbytky aminokyselin, které byly spojené s T imunogenitou. Program SOHHA také předpovídal spirálovité hydrofobní segmenty. (Elliot a spol. (1987): An hypothesis on the binding of an amphipathic, alpha helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). Oba programy předpovídají, které segmenty ze sekvencí variabilní oblasti protilátky P3 a 1E10 by mohly být prezentovány T pomocným buňkám v kontextu molekul MHC třídy II.
Analýza homologie s lidskými imunoglobuliny.
Sekvence aminokyselin myších variabilních oblastí se porovnaly se sekvencemi imunoglobulinů v databázích GeneBank a EMBL (přístupných na internetu). Pro každou protilátku se stanovily lidské variabilní oblasti s nejvyšší homologií. Pro vyhledávání homologie sekvencí se použil software PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00.
Analýza snížení imunogenity.
Cílem způsobu je snížení imunogenity zmírněním nebo ··· ··· · · · • ··· · ··· · · · · • · · · · ···· · · « ··*· • · · · · ··· ······ · · ·· · humanizováním potenciálních imunogenních T epitopů s minimálními změnami. Způsob zahrnuje uvážlivé nahrazení několika málo zbytků aminokyselin umístěných v spirálovitých amfipatitických segmentech. Aminokyseliny, které hlavně odpovídají za kanonické struktury a také zbytky v bezprostředním sousedství sekvencí CDR nebo ve Vernierově zóně, se musí zachovat.
Sekvence myší variabilní oblasti se podle tohoto způsobu porovnaly s lidskými sekvencemi s nejvyšší homologií a identifikovaly se rozličné zbytky aminokyselin v každé pozici mezi myší MAb a lidskou sekvencí s nejvyšší homologií, přičemž se braly do úvahy pouze zbytky ve FR (Kabat a spol. (1991), Sequences of proteins of inanunological interest, páté vydání, National Institute of Health) , a předtím definované zbytky se nahradily těmi zbytky, které se nacházejí v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Nahrazení se provedlo řízenými technikami mutageneze.
Zbytky zapojené do třírozměrné struktury vazebného místa se nemutovaly; mohly by ovlivnit rozpoznání antigenů. Další informace o vlivu náhrad v terciární struktuře lze získat molekulárním modelováním vazebného místa antigenů.
Musí se pamatovat na přítomnost zbytků prolinu ve spirálovitém amfipatickém segmentu a na skutečnost, že určité myší zbytky se neobjeví ve stejné pozici v lidské sekvenci s nejvyšší homologií, ale jsou hojné v dalších lidských imunoglobulinech. Z tohoto důvodu neexistuje jedinečný soubor myších aminokyselin, který by se vyměnil v systémech. Je možné získat rozličné verze modifikované protilátky s rozličným počtem náhrad. Mutace se prováděly překrývajícími se reakcemi PCR.
• 9 9 · ·· · 9· · • 9 9 · · · · · · • 999 · 9 9 · 9 9 9 9 > · 9 9 9 9999 · 9 9 9999 • 999* 9*9
999··· 9 9 * ·· «
Klonování a exprese humanizovaných protilátek P3hu a lElOhu.
Genové konstrukce odpovídající P3hu a lElOhu se klonovaly expresními vektory způsobem popsaným pro chimerní protilátky. Resultující konstrukce byly P3VKhu-PAG4622 nebo lE10VKhu-PAG4622 a P3VHhu-PAH4604 a lE10VHhu-PAH4604. Tyto konstrukce se transfektovaly do buněk NS-0 podle dříve popsaného protokolu pro chimerní protilátky.
Čištění rekombinantních protilátek.
Rekombinantní protilátky se čistily s použitím afinitní chromatografie s proteinem A (Pharmacia, Upssala, Švédsko).
Biologická aktivita.
Biologická aktivita rekombinantních protilátek se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELISA.
Pro rekombinantní MAb P3 se mikrotitrační destička smočila GM3(NeuGc) gangliosidem v methanolu. Po jednohodinovém sušení se nespecifické vazby blokovaly 1 % hovězím sérovým albuminem (BSA) v Tris-HCl pufru inkubací po dobu jedné hodiny při 37 °C. Jamky se promyly PBS a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb P3. Jamky se promyly Tris-HCl a přidala se kozí antilidská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Nakonec se jamky promyly a přidal se substrátový pufr obsahující p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřily absorbance při 405 nebo 492 nm.
Pro rekombinantní MAbai 1E10 byla zkouška ELISA podobná, s výjimkou, že se jamky smočily MAb P3 a promývání se provádělo v PBS s 0,05 % Tweenu 20.
9 · • 9 · « • · · 9 · * < ·99 9 · · « · «99 • 9999 9999 99 9 9999
9 9·· ··· ······ ·· * «
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: VHP3 DNA a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslováni (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 2: VKP3 a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 3: VHP3 se přidaly k lidské sekvenci s nej vyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 4: VKP3 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 5: Specifická vazba chimerní MAb P3 k GM3(NeuGc). Rozličné koncentrace MAb P3 a MAb TI (negativní kontrola) se testovaly pomocí ELISA. Mikrotitrační destičky se smočily s gangliosidy GM3(NeuGc) a GM3(NeuAc) (negativní kontrola) v methanolu a měřila se specifická vazba. (Značení bodů: ♦ - GM3-P3, chimerní GM3(NeuGc)-P3, ▲ - chimerní GM3(NeuGc)-TI, · - chimerní GM3-T1)
Obr. 6: VH1E10 DNA a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, *···
National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 7: VK1E10 a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslováni (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 8: VH1E10 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 9: VK1E10 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 10: Specifická vazba myší MAb P3 chimerní MAb 1E10.
Rozličné koncentrace MAb 1E10 a MAb C5 (negativní kontrola) se testovaly pomocí ELISA. Mikrotitračni destičky se smočily s MAb P3 a MAb A3 (negativní kontrola) a měřila se specifická vazba. (Značení bodů: ♦ - chimerní MAb P3-1E10, - chimerní MAb A31E10, ▲ - chimerní MAb P3-C5, x - chimerní MAb A3-C5)
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech se všechny použité enzymy, jakož i reagencie a materiály získaly z komerčních zdrojů, pokud se neuvádí něco j iného.
Příklad 1: Získání chimerní MAb P3.
Syntéza cDNA se provedla reakcí s enzymem reversní transkriptasy, když se vycházelo z RNA z hybridomu, který • 9 9
9
• 9«9 • 9 9 · · • 99
9999 99 9999«
9 9 9 9 produkuje MAb P3, jak se popsalo výše. Sekvence specifických primerů použitých v této reakci byly:
Pro VH:
5' AGGTCTAGAA (CT) CTCCACACACAGG (AG) (AG) CCAGTGGATAGAC 3'
Pro VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' cDNA VHP3 a cDNA VKP3 se amplifikovaly pomocí PCR s použitím Taq Polymerasy a specifických primerů. Restrikční místa zahrnutá v primerech byly ECORV/NHEI pro VH a ECORV/SALI pro VK. Použité primerové sekvence byly následující:
Pro VH:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3' Primer 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3'
Pro VK:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGGAG (TA) CACA(GT) (TA) CTCAGGTCTTT (GA) T 3 '
Primer 2 (Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR produkty se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Invitrogen). Dvanáct nezávislých klonů se sekvenovalo dideoxy způsobem s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Vyhledávací analýzou homologie se stanovila sekvenční skupina s nejvyšší homologií pro VHP3 a VKP3. Sekvence VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) mají vysokou homologii s odpovídajícími skupinami IB a V podle Kabatovy klasifikace.
Po digesci s restrikčními enzymy ECORV a NHEI pro VHP3 a ECORV a SÁLI pro VKP3 se klonovaly v expresních vektorech, které se dříve digestovaly se stejnými enzymy, PAH4604 pro VH a ····
999 999 «· · • 9 9
9 9
9 9 • ···· · • ·
PAG4622 pro VK. Tyto expresní vektory vhodné pro expresi imunoglobulinů v savčích buňkách byly darem od Sherie Morrison (UCLA, Kalifornie, USA). Vektor PAH 4604 zahrnoval lidskou konstantní oblast IgGl a PAG 4622 lidskou variabilní oblast (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase Chain reaktion, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Výsledné konstrukty byly P3VH-PAH4604 a P3VK-PAG4622.
Buňky NA-0 se transfektovaly s 10 pg P3VK-PAG4622, klon exprimující lehký řetězec se transfektoval s 10 pg P3VH-PAH4604, v obou případech se DNA před transfekcí linearizovala s Pvul, precipitovala ethanolem a rozpustila v 50 pL PBS.
Přibližně 107 buněk se sklidilo centrifugací a resuspendovalo se v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po uložení na deset minut na led byly buňky vystaveny pulsu 200 V a 960 pF a ponechaly se v ledu dalších deset minut. Buňky se rozdělily do 96 jamek destičky s D'MEM F12 plus s 10 % fetálním telecím sérem. Po dvou nebo čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolové nebo 10 mM histidinolu). Transfektované klony byly viditelné po čtrnácti dnech pouhým okem.
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících trasfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se smočily kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem tlumený roztok obsahující 0,05 % Tweenu 20) se do každé mikrotitrační jamky při 37 °C na jednu hodinu přidalo zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty. Jamky se promyly PBST a přidala se kozí protilátka proti • · · · • ···· · · • · · · · lidskému kapa lehkému řetězci konjugovaná křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) konjugovaný s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při laboratorní teplotě. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Příklad 2: Získání rozličných verzí humanizované protilátky P3.
Sekvence myších VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) se porovnaly s lidskými sekvencemi. Na obr. 3 a 4 jsou ukázané lidské sekvence s nejvyšší homologií. Spirálovité amfipatické oblasti nebo potenciální T buněčné epitopy se vyhledávaly v sekvencích myší P3 variabilní oblasti a ve shodě se způsobem uvážlivé strategie se stanovily náhrady aminokyselin, aby se narušily nebo humanizovaly potenciální T buněčné epitopy v myších sekvencích.
Analýza VHP3 poskytla (obr. 3) dva amfipatické segmenty, první zahrnoval CDR1, FR2 a několik zbytků CDR2, druhý zahrnoval konec FR3 a CDR3. Hlavní rozdíly myších sekvencí ve srovnání s lidskými sekvence s nejvyšší homologií byly nalezeny v sekvencích CDR nebo zbytcích zapojených do třírozměrné struktury vazebného místa. Z tohoto důvodu bylo rozhodnuto nenahrazovat žádnou aminokyselinu v myším VHP3.
Analýza VKP3 poskytla také dva amfipatické segmenty (obr. 4), první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR2 a několik zbytků FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 8, 9, 10, 11 a 13 za zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Aminokyseliny His, Lys, Phe, Met a Thr se nahradily aminokyselinami Pro, Ser, Ser, Leu a Ala. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic • ··· · ··· ♦ ··· • · · · ····*·» · ♦·· · • · » * · ··· ·····« ·· · · * ·
Acids Res., 17: 5404) s použitím primerů 1, 2, 3, 4, sekvence kterých jsou následující:
Primer 1:
5' ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3'
Primer 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Primer 3:
5' GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT 3 '
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGGAG (TA) CACA (GT) (TA) CTCAGGTCTTT (GA) T 3 '
Body mutace se verifikovaly sekvenováním. Výsledný konstrukt byl P3VKhu a klonoval se do expresního vektoru PAG 4662. Výsledný konstrukt byl P3VKhu-PAG4622. Pro expresi humanizované protilátky P3 se buňky NS-0 transfektovaly s P3VHPAH4604 a P3VKhu-PAG4622.
Protilátka P3hu se transfektovala podle stejného postupu elektroporace a detekce, jak se popisuje výše pro chimerní protilátky.
Příklad 3: Biologická aktivita chimerní MAb P3.
Biologická aktivita chimerní MAb P3 se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELISA.
Pro rekombinantní MAb P3 se mikrotitrační destička smočila gangliosidem GM3(NeuGc) v methanolu. Po jednohodinovém sušení při 37 °C se nespecifické vazby blokovaly 1 % hovězím sérovým albuminem (BSA) v Tris-HCl pufru inkubací po dobu jedné hodiny pří 37 °C. Jamky se promyly PBS a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb P3. Jamky se promyly Tris-HCl a přidala se kozí anti-lidská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu.se inkubovaly při 37 °C.
• · • · · • · · · · • ···· · 9 • ·
Nakonec se jamky promyly s Tris-HCl a přidal se substrátový pufr obsahující p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřila absorbance při 405 nm.
Jako negativní kontrola se použila chimerní MAb TI. Specifickou vazbu chimerní MAb P3 na antigen ukazuje obr. 5.
Příklad 4: Získání chimerní MAb 1E10.
Syntéza cDNA se provedla reakcí s,enzymem reversní transkriptasy, když se vycházelo z RNA z hybridomu, který produkuje MAb 1E10, jak se popsalo výše. Sekvence specifických primerů použitých v této reakci byly:
Pro VH:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Pro VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3' cDNA VH1E10 a cDNA VK1E10 se amplifikovaly pomocí PCR s použitím Taq Pol a specifických primerů.
Pro VH:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3' Primer 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Pro VK:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGTTAACCACCATGAGG (GT) CCCC (AT) GCTCAG (CT) T (CT) CT (TG)GG(GA) 3' Primer 2 (Ck) :
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR produkty se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Invitrogen). Dvanáct nezávislých klonů se sekvenovalo • ·
9 9
9 · 9 9 9 ·· • ··· · · · · 99
999 999999« 9 · 9 · 9 9 9 • 9 9 9· 9 99 9 99 (obr. 7 a 8) dideoxy způsobem s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Vyhledávací analýzou homologie se stanovila sekvenční skupina s nejvyšší homologií pro VH1E10 a VK1E10. Sekvence VH1E10 a VK1E10 mají vysokou homologií s odpovídajícími různorodými skupinami a V podle Kabatovy klasifikace.
Po digesci s restrikčními enzymy ECORV a NHEI pro VH1E10 a s HincII a SÁLI pro VK1E10 se klonovaly v expresních vektorech po dřívější digesci se stejnými enzymy, PAH4604 pro VH a PAG4622 pro VK. Tyto expresní vektory vhodné pro expresi imunoglobulinů v savčích buňkách byly darem od Sherie Morrison (UCLA, Kalifornie, USA). Vektor PAH 4604 zahrnoval lidskou konstantní oblast IgGl a PAG 4622 lidskou variabilní oblast (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaktion,
J. Immunol. Meth.f 152: 89-104). Výsledné konstrukty byly 1E10VH-PAH4604 a 1E10VK-PAG4622.
Buňky NA-0 se transfektovaly s 10 pg 1E10VK-PAG4622, klon exprimující lehký řetězec se transfektoval s 10 pg 1E10VHPAH4604, v obou případech se před transfekcí DNA linearizovala s Pvul, precipitovala ethanolem a rozpustila v 50 pL PBS.
Přibližně 107 buněk se sklidilo centrifugací a resuspendovalo v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po uložení na deset minut na led se buňky vystavily pulsu 200 V a 960 pF a ponechaly se v ledu dalších deset minut. Buňky se rozdělily do 96 jamek destičky s D'MEM F12 plus s 10 % fetálním telecím sérem. Po dvou nebo čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolové nebo 10 mM histidinolu). Transfektované klony byly viditelné po čtrnácti dnech pouhým okem.
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících •44 4 4 4 · · ·
4444 4 444 4 444 • 4444 4444 4 · 4 444 • 4 4 4 · 4 4 · • 44 ·44 44 4 44 · trasfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se smočily kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem tlumený roztok obsahující 0,05 % Tween 20) se do každé mikrotitrační jamky při 37 °C na jednu hodinu přidalo zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty.
Jamky se promyly PBST a přidala se kozí protilátka proti lidskému kapa lehkému řetězci konjugované křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) konjugovaný s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při laboratorní teplotě. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo pnitrofenylfosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Příklad 5: Získání rozličných verzí humanizované protilátky 1E10.
Sekvence myší VH1E10 a VK1E10 (obr. 6 a 7) se porovnaly s lidskými sekvencemi. Lidské sekvence s nejvyšší homologií ukazují obr. 8 a 9. Spirálovité amfipatické oblasti nebo potenciální T buněčné epitopy se vyhledávaly v sekvencích myší 1E10 variabilní oblasti a ve shodě se způsobem uvážlivé strategie se stanovily náhrady aminokyselin, aby se narušily nebo humanizovaly potenciální T buněčné epitopy v myších sekvencích.
Analýza VH1E10 poskytla (obr. 8) tři amfipatické segmenty, první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval FR2 a třetí zahrnoval FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 5, 40, 42 a 87 (83 podle Kabatova číslování) zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Aminokyseliny Gin, Arg, Glu a Thr • · · · ·· · · · · · * · ···· · ··♦ · ··· • fc · · ······· · ·*· • · · » * · · · ···«·« · * · * · se nahradily aminokyselinami Val, Ala, Gly a Arg. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím rozličných sad primerů.
Primery pro mutaci v pozici 5 těžkého řetězce byly 1, 2, 3 a 4, sekvence kterých jsou následující:
Primer 1:
5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3'
Po ověření pomocí sekvence bodu mutace v pozici 5, se zavedly mutace v pozicích 40 a 42.
Primer pro mutace v pozicích 40 a 42 těžkého řetězce:
Primer 1:
5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3'
Po ověření pomocí sekvence bodu mutace v pozicích 40 a 42, se zavedla mutace v pozici 87 (83 podle Kabatova číslování).
• · » «· · • · ···· · ··♦ · ··♦ • · · 9 9 9 9·9 9 9 · · · ♦ · « * * · » ···
99 99 9 9 9 9 · » ·
Primer pro mutace v pozici 87 (83 podle Kabatova číslování) těžkého řetězce:
Primer 1:
5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3'
Další náhrady se neprovedly, protože zbytky byly zapojeny v třírozměrné struktuře vazebného místa.
Body mutace se verifikovaly sekvenováním. Výsledný konstrukt byl lElOVHhu a klonoval se v PAH4604 expresním vektoru. Výsledný konstrukt byl 1E10VH-PAH4604.
Analýza pro VK1E10 poskytla také tři amfipatické segmenty (obr. 9), první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR1 a třetí zahrnoval FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 7, 8a 15 zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Aminokyseliny Thr, Thr a Leu se nahradily aminokyselinami Ser, Pro a Val. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím primerů 1, 2, 3 a 4, kterých sekvence jsou následující:
Primery pro mutace v pozicích 7, 8 a 15 lehkého řetězce:
Primer 1:
' CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3 '
Primer 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3' • · · · tu
Primer 3:
5' GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3 '
Primer 4:
5' GGGGTTAACCACCATGAGG (GT) CCCC (AT) GCTCAG (CT) T (CT) CT (TG) GG (GA) 3'
Body mutací se ověřily sekvenováním. Výsledný konstrukt byl lElOVKhu a klonoval se v expresním vektoru PAG 4622. Výsledný konstrukt byl lE10VKhu-PAG4662.
Pro expresi humanizované protilátky 1E10 se buňky NS-0 transfektovaly lE10VHhu-PAH4604 a lE10VKhu-PAG4662.
Protilátka lElOhu se transfektovala stejným postupem elektroporace a detekce, jak byl výše popsán pro chimerní protilátky.
Příklad 6: Biologická aktivita chimerní MAb 1E10.
Biologická aktivita chimerní MAb 1E10 se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELISA.
Pro rekombinantní MAb 1E10 se mikrotitrační destička smočila MAb P3. Po promytí s PBST (roztok solného fosfátového pufru obsahující 0,05 % Tweenu 20) se nespecifické vazby blokovaly 1 % hovězím sérovým albuminem (BSA) v PBST inkubací po dobu jedné hodiny při 37 °C. Jamky se promyly a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb 1E10. Jamky se promyly PBST a přidala se antilidská kozí protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Nakonec se jamky promyly PBST a přidal se substrátový pufr obsahující p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřily odpovídající absorbance při 405 nm.
« · · ·
9 9 9 ·
Jako negativní kontrola se použila chimerní MAb C5. Specifickou vazbu chimerní MAb 1E10 na MAb P3 ukazuje obr. 10.

Claims (16)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Chimerní monoklonální protilátka odvozená z myší monoklonální protilátky MAb P3, která rozpoznává gangliosidy obsahující N-glykolovou kyselinu sialovou a která se produkuje buněčnou linií hybridomu s depozitním číslem ECACC 94113026, vyznačující se tím, že hypervariabilní domény jejich těžkých a lehkých řetězců obsahují následující sekvence:
    TĚŽKÝ ŘETĚZEC
    CDR1: RYSVH
    CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS
    CDR3: SGVREGRAQAWFAY
    LEHKÝ ŘETĚZEC
    CDR1: KA.SQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT
  2. 2. Chimerní monoklonální protilátka podle nároku 1 vyznačující se tím, že oblasti základních zbytků (FR) jejich těžkých a lehkých řetězců obsahují následující sekvence:
    TĚŽKÝ ŘETĚZEC
    FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG
    FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR FR4: WGQGTLV
    LEHKÝ ŘETĚZEC
    FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
    FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
    FR4: FGGGTKL
  3. 3. Monoklonální protilátka podle nároků 1 a 2 vyznačující se tím, že pro svoji humanizaci a zachování vazebných • *
    00 · · 0 vlastností k antigenu zahrnuje přinejmenším jednu z následujících substitucí:
    LEHKÝ ŘETĚZEC
    pozice 8 : His za Pro pozice 9: Lys za Ser pozice 10 : Phe za Ser pozice 11 : Met za Leu pozice 13 : Thr za Ala.
  4. 4. Monoklonální protilátka podle nároků 1 až 3 vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce obsahuje sekvenci aminokyselin gama-1 řetězce a konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje sekvenci aminokyselin kapa řetězce, obě odvozené z lidských imunoglobulinů.
  5. 5. Buněčná linie vyznačující se tím, že produkuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 1 až 4.
  6. 6. Farmaceutická kompozice pro léčbu maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů vyznačující se tím, že obsahuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 1 až 4.
  7. 7. Farmaceutická kompozice pro lokalizaci a identifikaci maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů „in vivo vyznačující se tím, že obsahuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 1 až 4.
  8. 8. Použití monoklonální protilátky z kterékoli z nároků 1 až 4 pro výrobu léku prospěšného pro léčbu maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů.
  9. 9. Chimerní monoklonální protilátka odvozená z myší antiidiotypové monoklonální protilátky 1E10, která rozpoznává myší MAb P3 a která se produkuje buněčnou linií hybridomu s depozitním číslem ECACC 97112901, vyznačující se • ♦ · ♦ • · · 999 9 9 9
    9 9 9 9 · 9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 999· 9 · · ·9·
    9 99 ·» · 9 9 · * * · tím, že hypervariabilní oblasti jejich těžkých a lehkých řetězců obsahují následující sekvence:
    TĚŽKÝ ŘETĚZEC
    CDR1: SYDIN
    CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG
    CDR3: EDYYDNSYYFDY
    LEHKÝ ŘETĚZEC
    CDR1: RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT
  10. 10. Monoklonální protilátka podle nároku 9 vyznačující se tím, že oblasti základních zbytků (FR) jejich těžkých a lehkých řetězců obsahují následující sekvence:
    TĚŽKÝ ŘETĚZEC
    FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG
    FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV
    LEHKÝ ŘETĚZEC
    FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
    FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK
  11. 11. Monoklonální protilátka podle nároků 9 a 10 vyznačující se tím, že pro svoji humanizaci a zachování vazebných vlastností k antigenu zahrnuje přinejmenším jednu z následujících substitucí:
    LEHKÝ ŘETĚZEC pozice 7: Thr za Ser pozice 8: Thr za Pro pozice 15: Leu za Val • · 9 9 ·····« · • ·»» * · • · 9 • 99 · · • ·
    TĚŽKÝ ŘETĚZEC pozice 5: Gin za Val pozice 40: Arg za Ala pozice 42: Glu za Gly pozice 87 (83 podle Kabatova číslování): Thr za Arg
  12. 12. Monoklonální protilátka podle nároků 9 až 11 vyznačující se tím, že konstantní oblast těžkého řetězce obsahuje sekvenci aminokyselin gama-1 řetězce a konstantní oblast lehkého řetězce obsahuje sekvenci aminokyselin kapa řetězce, obě odvozené z lidských imunoglobulinů.
  13. 13. Buněčná linie vyznačující se tím, že produkuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 9 až 12.
  14. 14. Farmaceutická kompozice pro léčbu maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů vyznačující se tím, že obsahuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 9 až 12.
  15. 15. Farmaceutická kompozice pro lokalizaci a identifikaci maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů „in vivo'' vyznačující se tím, že obsahuje kteroukoli z monoklonálních protilátek podle nároků 9 až 12.
  16. 16. Použití monoklonální protilátky z kterékoli z nároků 9 až 12 pro výrobu léku prospěšného pro léčbu maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů.
CZ2003-2668A 2001-04-06 2002-04-08 Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů CZ304424B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2001008420010084A CU23007A1 (es) 2001-04-06 2001-04-06 Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20032668A3 true CZ20032668A3 (cs) 2004-07-14
CZ304424B6 CZ304424B6 (cs) 2014-04-30

Family

ID=40291118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032641A CZ296276B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutické kombinace pro lécbu nádoru, nadmerne exprimujících gangliosidy
CZ2003-2668A CZ304424B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032641A CZ296276B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutické kombinace pro lécbu nádoru, nadmerne exprimujících gangliosidy

Country Status (37)

Country Link
US (3) US20050069535A1 (cs)
EP (3) EP1384726B1 (cs)
JP (2) JP4366080B2 (cs)
KR (3) KR100863509B1 (cs)
CN (3) CN101054417B (cs)
AR (2) AR033123A1 (cs)
AT (3) ATE477279T1 (cs)
AU (3) AU2002308348B2 (cs)
BG (2) BG66293B1 (cs)
BR (3) BR0208676B1 (cs)
CA (2) CA2443372C (cs)
CU (1) CU23007A1 (cs)
CZ (2) CZ296276B6 (cs)
DE (2) DE60223547T2 (cs)
DK (2) DK1384726T3 (cs)
EA (2) EA006936B1 (cs)
EC (2) ECSP034788A (cs)
ES (2) ES2296986T3 (cs)
HK (3) HK1066818A1 (cs)
HR (2) HRP20030806B1 (cs)
HU (2) HU228106B1 (cs)
IL (2) IL158246A0 (cs)
IS (2) IS6965A (cs)
MX (2) MXPA03008739A (cs)
MY (3) MY145703A (cs)
NO (2) NO20034437L (cs)
NZ (2) NZ528598A (cs)
PE (1) PE20020972A1 (cs)
PL (2) PL208109B1 (cs)
PT (2) PT1384726E (cs)
SG (1) SG161737A1 (cs)
SI (2) SI1411064T1 (cs)
SK (2) SK287783B6 (cs)
UA (3) UA75393C2 (cs)
UY (2) UY27242A1 (cs)
WO (2) WO2002081496A2 (cs)
ZA (2) ZA200307585B (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
CN101111260B (zh) * 2005-02-04 2013-03-20 萨瓦克公司 存活蛋白肽疫苗
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
EP2594591B1 (en) * 2005-08-11 2018-06-06 Arpi Matossian-Rogers Tcr-v-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease
JP5415071B2 (ja) * 2005-08-19 2014-02-12 ワイス・エルエルシー Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用
ITFI20060163A1 (it) * 2006-06-29 2006-09-28 Menarini Internat Operations Luxembourg Sa Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio
TWI434855B (zh) 2006-11-21 2014-04-21 Hoffmann La Roche 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途
WO2009104649A1 (ja) * 2008-02-22 2009-08-27 片山化学工業株式会社 合成糖脂質含有リポソーム
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
NZ594985A (en) * 2009-03-10 2013-07-26 Biogen Idec Inc Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies
SG174992A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CU23736A1 (es) * 2009-05-04 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso
WO2011026242A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Vancouver Biotech Ltd. Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor
WO2012096994A2 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 Emory University Antibodies directed against influenza
CU24070B1 (es) * 2011-12-27 2015-01-29 Ct De Inmunología Molecular Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3)
EP2641916A1 (en) * 2012-03-23 2013-09-25 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof
MY177331A (en) 2012-06-15 2020-09-12 Pfizer Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
UA120753C2 (uk) 2013-12-17 2020-02-10 Дженентек, Інк. Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
JP2017512759A (ja) * 2014-04-10 2017-05-25 オービーアイ ファーマ インコーポレイテッド 抗体、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体を含む薬学的組成物及びその用途
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
CA2986928A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
CA3044664C (en) 2016-11-30 2022-11-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of cancer comprising tigit-binding agents
CU20170173A7 (es) * 2017-12-27 2019-11-04 Ct Inmunologia Molecular Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2754206B2 (ja) * 1987-11-17 1998-05-20 メクト株式会社 α２→３結合を認識するモノクローナル抗体
US6051225A (en) * 1988-10-19 2000-04-18 The Dow Chemical Company Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
EP0586002B1 (en) * 1992-08-18 2000-01-19 CENTRO de IMMUNOLOGIA MOLECULAR Monoclonal antibodies recognizing the epidermal growth factor receptor, cells and methods for their production and compositions containing them
JPH07101999A (ja) * 1993-10-06 1995-04-18 Hagiwara Yoshihide 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列
US6063379A (en) * 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
CU22702A1 (es) * 1997-10-21 2001-07-31 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen
EP0657471B1 (en) * 1993-12-09 2001-10-24 Centro de Inmunologia Molecular Anti ganglioside monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumours
CU22420A1 (es) * 1993-12-29 1996-01-31 Centro Inmunologia Molecular Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer
US6149921A (en) * 1993-12-29 2000-11-21 Centro De Inmunologia Molecular Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
CU22731A1 (es) * 1998-02-05 2002-02-28 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CA2441845C (en) 2011-06-07
NO20034436L (no) 2003-12-02
EA006936B1 (ru) 2006-06-30
ATE406386T1 (de) 2008-09-15
SK12262003A3 (sk) 2004-08-03
UA76745C2 (uk) 2006-09-15
BR0208676A (pt) 2008-04-08
CU23007A1 (es) 2004-12-17
WO2002081496A3 (es) 2004-02-19
KR100863509B1 (ko) 2008-10-15
NO331533B1 (no) 2012-01-23
DE60223547T2 (de) 2008-09-18
KR20030092048A (ko) 2003-12-03
BG108227A (bg) 2005-04-30
SK12162003A3 (sk) 2004-05-04
NO20034437D0 (no) 2003-10-03
UY27242A1 (es) 2002-07-31
NZ528598A (en) 2005-03-24
CN101054417A (zh) 2007-10-17
MY157372A (en) 2016-06-15
SI1384726T1 (sl) 2009-04-30
KR20080080680A (ko) 2008-09-04
DK1411064T3 (da) 2008-03-25
CA2441845A1 (en) 2002-10-17
CN1535282A (zh) 2004-10-06
AU2002308347B2 (en) 2006-09-14
MY137078A (en) 2008-12-31
EP1798243A2 (en) 2007-06-20
BRPI0208675B1 (pt) 2018-03-13
KR100919617B1 (ko) 2009-09-29
CN1319991C (zh) 2007-06-06
DE60223547D1 (de) 2007-12-27
EA200301097A1 (ru) 2004-02-26
NO20034436D0 (no) 2003-10-03
PL208109B1 (pl) 2011-03-31
CZ20032641A3 (cs) 2004-07-14
HK1070080A1 (en) 2005-06-10
NZ528599A (en) 2005-03-24
US20050069535A1 (en) 2005-03-31
SK287783B6 (sk) 2011-09-05
JP2004528033A (ja) 2004-09-16
IL158246A (en) 2010-05-31
IS2701B (is) 2010-11-15
IL158246A0 (en) 2004-05-12
EA006310B1 (ru) 2005-10-27
ATE477279T1 (de) 2010-08-15
HUP0401695A3 (en) 2012-05-29
IS6964A (is) 2003-09-23
EA200301098A1 (ru) 2004-04-29
JP4366080B2 (ja) 2009-11-18
AU2007231687B2 (en) 2010-09-30
CZ304424B6 (cs) 2014-04-30
EP1411064A2 (en) 2004-04-21
BR0208676B1 (pt) 2017-11-14
EP1411064B1 (en) 2007-11-14
NO20034437L (no) 2003-12-02
CN101054417B (zh) 2012-07-11
AR033122A1 (es) 2003-12-03
ECSP034787A (es) 2004-01-28
PT1411064E (pt) 2008-02-12
WO2002081496A2 (es) 2002-10-17
AR033123A1 (es) 2003-12-03
AU2007231687A1 (en) 2007-11-22
DE60228561D1 (de) 2008-10-09
IS6965A (is) 2003-09-23
MXPA03008739A (es) 2003-12-11
UY27243A1 (es) 2002-09-30
MXPA03008738A (es) 2003-12-11
EP1798243A3 (en) 2007-10-17
CN100349920C (zh) 2007-11-21
HUP0401355A2 (hu) 2004-10-28
EP1798243B1 (en) 2010-08-11
HRP20030806B1 (en) 2011-11-30
BG108228A (bg) 2005-04-30
PL371770A1 (en) 2005-06-27
BG66293B1 (en) 2013-02-28
CA2443372C (en) 2013-05-28
MY145703A (en) 2012-03-30
CZ296276B6 (cs) 2006-02-15
US20100297008A1 (en) 2010-11-25
PT1384726E (pt) 2008-12-05
US20040253233A1 (en) 2004-12-16
ZA200307585B (en) 2004-09-16
SG161737A1 (en) 2010-06-29
SI1411064T1 (sl) 2008-04-30
HK1066818A1 (cs) 2005-04-01
WO2002081661A3 (es) 2003-01-03
UA75393C2 (en) 2006-04-17
HUP0401695A2 (en) 2006-08-28
JP2004525953A (ja) 2004-08-26
HK1109160A1 (en) 2008-05-30
HU228106B1 (en) 2012-11-28
HRP20030805B1 (en) 2011-11-30
ZA200307679B (en) 2005-03-30
KR100946168B1 (ko) 2010-03-11
HUP0401355A3 (en) 2012-05-29
EP1384726A2 (en) 2004-01-28
US8758753B2 (en) 2014-06-24
HU228105B1 (en) 2012-11-28
ES2312610T3 (es) 2009-03-01
EP1384726B1 (en) 2008-08-27
ES2296986T3 (es) 2008-05-01
AU2002308348B2 (en) 2007-11-22
HRP20030806A2 (en) 2005-08-31
HRP20030805A2 (en) 2005-08-31
ATE378356T1 (de) 2007-11-15
BR0208675A (pt) 2004-08-03
PL371937A1 (en) 2005-07-11
SK287914B6 (sk) 2012-03-02
BG66304B1 (bg) 2013-03-29
UA86768C2 (ru) 2009-05-25
CN1507452A (zh) 2004-06-23
PE20020972A1 (es) 2003-01-02
DK1384726T3 (da) 2008-12-15
KR20030087053A (ko) 2003-11-12
WO2002081661A2 (es) 2002-10-17
CA2443372A1 (en) 2002-10-17
ECSP034788A (es) 2004-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8758753B2 (en) Ganglioside associated recombinant antibodies and the use thereof in the treatment of tumors
EP1623997B1 (en) Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours
EP3473649A1 (en) Anti-cd47 monoclonal antibody and application thereof
JP5631733B2 (ja) 抗ＥｐＣＡＭ抗体およびその使用
US20210395369A1 (en) Anti-b7-h3 monoclonal antibody and use thereof in cell therapy
WO2021052307A1 (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
WO2019238074A1 (zh) 一种高亲和力高生物活性的lag-3抗体及其应用
EP3778632A1 (en) Anti-human lag-3 monoclonal antibody and use thereof
JP2004520376A (ja) 物（ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ）
CN115838424A (zh) 靶向tigit的单克隆抗体
TW201906869A (zh) 抗globo h之人類化抗體及其於治療癌症之用途
US20220185911A1 (en) Therapeutic antibodies for treating lung cancer

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180408