BR0208676B1

BR0208676B1 - Chemical monoclonal antibody, pharmaceutical composition, and, use of a monoclonal antibody

Info

Publication number: BR0208676B1
Application number: BRPI0208676A
Authority: BR
Inventors: López Requena Alejandro; M Mateo De Acosta Del Río Cristina; Lombardero Valladares Josefa; Tatiana Roque Navarro Lourdes
Original assignee: Ct Inmunologia Molecular
Priority date: 2001-04-06
Filing date: 2002-04-08
Publication date: 2017-11-14
Also published as: CA2441845C; NO20034436L; EA006936B1; ATE406386T1; SK12262003A3; UA76745C2; BR0208676A; CU23007A1; WO2002081496A3; KR100863509B1; NO331533B1; DE60223547T2; CZ20032668A3; KR20030092048A; BG108227A; SK12162003A3; NO20034437D0; UY27242A1; NZ528598A; CN101054417A

Abstract

anticorpo monoclonal quimérico, linhagem celular, composição farmacêutica, e, uso de um anticorpo monoclonal a presente invenção refere-se à obtenção de anticorpos modificados por engenharia genética a partir do anticorpo monoclonal murino p3 (acm p3), produzido pelo hibridoma depositado segundo o tratado de budapeste sob o número ecacc 94113026 e de seu anti-idiotipo 1e10 (acmai 1e10) produzido pelo hibridoma ecacc 97112901, com o objetivo de se obterem anticorpos com as mesmas propriedades de reconhecimento dos originais mas que sejam menos imunógenos que estes. os anticorpos quiméricos, contem os domínios variáveis da imunoglobulina murina e as regiões constantes da imunoglobulina humana; e os humanizados, além de conterem as regiões constantes da imunoglobulina humana, estão modificados na região das estruturas (frs) murinas e em particular naquelas zonas que podem resultar em um sítio antigênico para as células 1, acarretando que algumas posições das frs são humanizadas. estes anticorpos podem ser utilizados em diagnóstico e em terapia de diferentes tipos de tumores.

Description

“ANTICORPO MONOCLONAL QUIMERICO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USO DE UM ANTICORPO MONOCLONAL” Campo técnico A presente invenção refere-se ao campo da biotecnologia, em particular aos novos anticorpos recombinantes obtidos mediante o emprego da engenharia genética, especificamente com os anticorpos quiméricos e humanizado obtidos a partir dos anticorpos monoclonais murinos P3 (AcM P3) e seu anti-idiotipo 1E10 (AcM 1E10).

Mais especificamente, a invenção refere-se aos anticorpos que se ligam especificamente em gangliosídeos portadores de ácido siálico N-glicolilado, mas não nas formas acetiladas dos gangliosídeos nem em glicolipídeos neutros, antígenos expressados em tumores de mama e melanoma. Em adição tem-se demonstrado o efeito anti-tumoral de AcM 1E10 em modelos experimentais. A presente invenção também se refere às composições farmacêuticas que contêm os anticorpos monoclonais recombinantes úteis em diagnóstico e terapêutica do câncer de mama e melanomas, previamente descritos. Técnica anterior Os gangliosídeos são glicoesfingolipídeos que contêm ácido siálico e que estão presentes nas membranas plasmáticas de vertebrados (Stults e colaboradores (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179:167-214). Algumas destas moléculas têm sido relatadas na literatura como antígenos associados a tumores ou marcadores tumorais (Hakomori e colaboradores (1991): Possible fúnctions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3:646-653), pelo que tem-se descrito o uso de anticorpos anti-gangliosídeos como úteis em diagnóstico e terapêutica do câncer (Hougton e colaboradores (1985):—Mouse monõclõnãl ãntibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: a phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246; Zhang e colaboradores (1997): Selection of carbohydrate antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Câncer, 73:42-49).

Os ácido siálicos mais comumente encontrados em animais são o N-acetil (NeuAcO e o N-glicolil (NeuGc) (Corfield e colaboradores (1982): Occurence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr. 10: 5-50). Em geral o NeuGc não é expressado em tecidos normais de humanos e frangos, mas está amplamente distribuído em outros vertebrados (Leeden e Yu (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A. e Shengtrund CL (Eds.). Plenum Press, New York, 1048; Kawai e colaboradores (1991): Quantitative determination of N-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Câncer Research 51: 1242-1246). Não obstante, há relatórios da literatura que mostram que anticorpos anti-NeuGc, reconhecem alguns tumores humanos e linhagens de células tumorais (Higashi e colaboradores (1988): Detection of gangliosides as N-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoglastoma cells, Jpn. J. Câncer Res., 79: 952-956; Fukui e colaboradores (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric câncer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Em adição tem-se encontrado um incremento dos níveis de gangliosídeo GM3 (NeuGc), em câncer de mama humano (Marquina e colaboradores (1996): Gangliosides expressed in human breast câncer, Câncer Research, 1996; 56: 5165-5171), descoberta que toma francamente atrativo o uso desta molécula como branco para a terapia deste tipo de câncer. O anticorpo monoclonal (AcM) P3 é um anticorpo murino de isotipo IgM, que se obtém ao se fundirem esplenócitos de um rato BALB/c imunizado com lipossomas que contêm GM3(NeuGc) e toxóide tetânico, com células de mieloma murino da linhagem P3-X63-Ag8.653. (Linhagem celular depositada com o número de acesso ECACC 94113026, Patente Européia EP 0.657.471 Bl).

Este AcM reage fortemente com gangliosídeos portadores de ácido siálico N-glicolilado, mas não com as formas acetiladas dos gangliosídeos, nem com os glicolipídeos neutros. Em estudos imunocitoquímicos e imuno-histoquímicos, realizados com linhagens celulares, assim como com cortes de tecidos de tumores benignos e neoplásicos, se demonstrou que o AcM P3 reconhece tumores de mama (Vázquez e colaboradores (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that alto recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14:551-556) e melanoma. O AcM P3 induz uma evidente resposta anti-idiotípica (Ab2) em ratos BALB/c (modelo singênico), ainda que na ausência de adjuvante e proteína transportadora, (Vázquez e colaboradores (1998): Syngenic anti-idiotipic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containg ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Os estudos imunoquímicos realizados sugerem um papel fundamental dos grupos eletronegativos, na forma de ácido siálico (nos gangliosídeos) o do grupo SO3' (nos sulfatídeos), no reconhecimento deste anticorpo (Moreno e colaboradores (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8:695-705). O AcM anti-idiotipo (AcMai) 1E10 de tipo IgGl, se obtém a partir da imunização de ratos BALB/c com 0 AcM P3 acoplado a KLH (Patente Norte-americana US 6.063.379, linhagem celular depositada com o número de acesso ECACC 97112901). Ao se estudar sua especificidade de reconhecimento frente a um painel de AcMs anti-gangliosídeos, reconheceu apenas P3 e não outros AcMs anti-gangliosídeos de isotipo IgM. Em adição, inibiu especificamente a união de P3 em GM3(NeuGc) e a linhagem de carcinoma dutal infiltrante de mama MDA-MB-435 (P3 positiva). O AcMai 1E10 induz uma forte resposta de anticorpos Ab3 nos modelos singênico e alogênico, os citados anticorpos Ab3 não possuem a mesma especificidade que a de AcM P3, mas trazem idiotipos deste AcM Abl (Vázquez e colaboradores (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). O AcMai 1E10 exerce um forte efeito antitumoral em ratos singênicos e alogênicos. A vacinação de ratos BALB/c com doses repetidas de AcMai 1E10 acoplado a KLH em adjuvante de Freund, reduziu significativamente o crescimento tumoral subcutâneo da linhagem de carcinoma mamário F3II, e o número de metástases pulmonares espontâneas. A administração por via intravenosa de AcMai 1E10 em ratos C57BL/6, entre 10 e 14 dias após a inoculação intravenosa de células de melanoma BI6, provocou uma redução dramática do número de metástases pulmonares em comparação com ratos tratados com uma IgG irrelevante. Os resultados obtidos nestes experimentos sugerem a ativação de mais de um mecanismo de resposta antitumoral contra células de tumor mamário e melanoma (Vázquez e colaboradores (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7:751-756, 2000). Depois de mais de 15 anos de desenvolvimento da tecnologia de hibridomas para a obtenção de anticorpos monoclonais murinos (Koehler e Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256:495-497), os mesmos têm se resultado muito úteis no diagnóstico de enfermidades e na investigação básica mas não tem sido demonstrada sua eficácia terapêutica em humanos, o que há sido em grande medida devido à sua curta meia-vida em sangue, bem como ao reconhecimento insatisfatório das funções efetoras murinas pelo sistema imune humano, e além disso pela resposta imunológica que provoca a origem murina dos mesmos ao serem injetados em pacientes (resposta HAMA, sigla em inglês). O desenvolvimento da tecnologia da engenharia genética revolucionou o potencial dos AcMs, já que manipulando-se os genes das imunoglobulinas é possível a realização de modificações nos anticorpos com o objetivo de diminuir ou eliminar a antigenicidade dos mesmos, assim como melhorar suas funções efetoras quando são usados no tratamento ou no diagnóstico de determinadas patologias. Estas manipulações têm como objetivo essencial a diminuição ao máximo das diferenças com respeito às propriedades imunológicas entre o anticorpo murino e uma imunoglobulina humana, sem alteração da especificidade pelo antígeno (Morrison e Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv Immunol., 44:65-92). Recentemente têm sido desenvolvidos vários métodos para humanizar anticorpos de rato ou de rata e desde modo diminuir a resposta xenogênica contra proteínas estranhas ao serem os mesmos injetados em humanos. Um dos primeiros intentos para reduzir a antigenicidade tem sido a geração de anticorpos “quiméricos”, nos quais os domínios variáveis das proteínas murinas se inserem em domínios constantes de moléculas humanas, com o qual não só se obtém a diminuição da imunogenicidade mas também a melhoria das funções efetoras, já que as mesmas são humanas e portanto reconhecidas pelo sistema imune (Morrison e colaboradores (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). Estas molécula quiméricas mantêm as características do anticorpo original em relação com a união no antígeno e sua região constante não é imunogênica, mas mantém a imunogenicidade contra a região variável murina.

Outros autores têm conseguido diminuir ainda mais a imunogenicidade, inserindo as Regiões Determinantes da Complementaridade (CDRs) dos anticorpos alogênicos sobre as estruturas (FRs) de imunoglobulinas humanas (Jones e colaboradores (1986): Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse, Nature 321: 522-524; Verhoeyen e colaboradores (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536). Não obstante este método mostrou diversos inconvenientes, fundamentalmente a perda de afinidade do anticorpo em comparação com sua contrapartida murina, pelo que foi necessário restaurar alguns dos resíduos dos FRs pelos correspondentes na imunoglobulina murina (Rietchmann e colaboradores (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen e colaboradores (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest e colaboradores (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). Em adição, nestes anticorpos observa-se frequentemente imunogenicidade.

Mateo e colaboradores (Patente US 5.712.120) descrevem um procedimento para a redução da imunogenicidade de anticorpos murinos. Segundo mesmo, as modificações estão restringidas aos domínios variáveis e especificamente aos FRs murinos dos anticorpos quiméricos. Mas ainda, as modificações se realizam somente naquelas regiões dos FRs que têm uma estrutura de hélice antipática e que portanto são potenciais epitopos reconhecidos pelas células T. O método propõe substituir os resíduos de aminoácidos murinos dentro das regiões antipáticas pelos aminoácidos que se encontram na mesma posição nas imunoglobulinas humanas, ficando excluídos destas mudanças aqueles resíduos que estão encerrados na estrutura tridimensional do sítio de reconhecimento do antígeno, a saber a zona de Vemier, as estruturas canônicas das CDRs e os aminoácidos na interface entre as cadeias pesada e leve. O anticorpo modificado pelo método descrito por Mateo e colaboradores (Mateo e colaboradores (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71), retém a capacidade de reconhecimento e união no antígeno do anticorpo original e resulta menos imunogênico, o que aumenta sua utilidade terapêutica. Mediante este procedimento se consegue, com um pequeno número de mutações, a obtenção de anticorpos modificados que mostram uma redução da imunogenicidade ao serem comparados com o anticorpo quimérico.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se aos anticorpos recombinantes, obtidos por técnicas de engenharia genética. Especificamente a invenção refere-se a um anticorpo quimérico derivado de anticorpo monoclonal murino P3 produzido pelo hibridoma com número de depósito ECACC 94113026 que reconhece um antígeno expressado em células de tumores de mama e melanomas, caracterizado pelo fato de que as seqüências das regiões hipervariáveis (CDRs) das cadeias pesada e leve são as mostradas a seguir: CADEIA PESADA CDR1: RYSVH

CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY CADEIA LEVE CDR1: KASQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT

Preferivelmente, as seqüências das regiões das estruturas (FRs) das cadeias pesada e leve de citado anticorpo são as mostradas a seguir: CADEIA PESADA

FR1: QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG

FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYVCAR FR4: WGQGTLV CADEIA LEVE

FR1: DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLL1Y FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC FR4: FGGGTKL

Mais preferivelmente será quando o anticorpo quimérico da presente invenção contiver a região constante de cadeia pesada IgGl humana e a região constante de cadeia leve Ck humana.

Em uma representação preferida, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal murino P3 produzido pelo hibridoma com número de depósito ECACC 94113026, caracterizado pelo fato de conter a região constante de cadeia pesada IgGl humana e a região constante de cadeia leve Ck humana e na região de estruturas da cadeia leve contém pelo menos uma das seguintes mutações: CADEIA PESADA Posição 8: His por Pro Posição 9: Lys por Ser Posição 10: Phe por Ser Posição 11: Met por Leu Posição 13: Thr por Ala Em outro aspecto, a invenção refere-se a um anticorpo quimérico derivado do anticorpo monoclonal murino 1E10 produzido pelo hibridoma com número de depósito ECACC 97112901 que reconhece o AcM murino P3, caracterizado pelo fato de que as seqüências das regiões hipervariáveis (CDRs) das cadeias pesada e leve são as mostradas a seguir: CADEIA PESADA CDR1: SYDIN

CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3 .EDYYDNS YYFDY CADEIA LEVE CDR1: RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT

FR1 :QVQLQQSGAELVKPGAS VKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG

FR3 :KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDS AVYFCAR FR4: WGQGTTL TV CADEIA LEVE

FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLL1Y FR3: VPSRFSGSGSGTDYSL TISNLEQEDIA TYFC FR4: FGGGTKLESK

Em uma representação preferida, a presente invenção refere-se a um anticorpo humanizado derivado de anticorpo monoclonal murino 1E10 produzido pelo hibridoma com número de depósito ECACC 94112901, caracterizado pelo fato de conter a região constante de cadeia pesada IgGl humana e a região constante de cadeia leve Ck humana e nas regiões de estruturas das cadeias pesada e leve contém pelo menos uma das seguintes mutações: CADEIA LEVE

Posição 7: Thr por Ser Posição 8: Thr por Pro Posição 15: Leu por Vai CADEIA PESADA Posição 5: Gin por Vai Posição 40: Arg por Ala Posição 42: Glu por Gly Posição 87 (83 segundo a numeração de Kabat): Thr por Arg Em outro aspecto, a presente invenção refere-se às linhagens celulares que expressam os anticorpos quiméricos e humanizados descritos na mesma, bem como às composições farmacêuticas caracterizadas pelo fato de conterem um dos anticorpos descritos. A invenção portanto refere-se às composições farmacêuticas para o tratamento de tumores malignos de mama, de pulmão, do sistema digestivo, do sistema urogenital, melanomas, sarcomas e tumores de origem neuroectodérmica, suas metástases e recidivas, caracterizadas pelo fato de conterem um dos anticorpos monoclonares descritos e um excipientes apropriado para sua aplicação.

Em outra modalidade da presente invenção, as composições farmacêuticas podem ser usadas para a localização e a identificação in vivo de tumores malignos de mama, de pulmão, do sistema digestivo, do sistema urogenital, melanomas, sarcomas e tumores de origem neuroectodérmica, suas metástases e recidivas. Síntese de ADNc e amplificação por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) das regiões variáveis do anticorpo murino P3 e 1E10. O ARN foi obtido de 106 células de hibridoma de P3 (AcM murino, IgM, que reconhece os gangliosídeos GM3 N-glicolilados) ou de hibridoma de 1E10 (que reconhece ο P3). O método usado para a extração de ARN utilizou o reativo TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY), de acordo com as instruções do fabricante. A síntese de ADN complementar (ADNc) se realizou em uma reação com 5 pg de ARN obtido com 25 pmols de oligo projetado para hibridizar com o princípio da região constante das IgM murinas no caso da VHP3, e com o princípio da região constante da IgGl murina no caso da VH 1E10, e para a região variável de cadeia leve (VK), que hibridiza na região constante kappa murina para ambos anticorpos, 2,5 mM de cada desoxinucleotídeo (dNTPs), 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 75 mM KC1, 10 mM DTT, 8 mM MgCl2 e 15 unidades de inibidor de RNAse em um volume total de 50 pL. Esta mistura foi aquecida a 70°C, por 10 minutos e esfriada lentamente para 37°C. No final se adicionaram 100 unidades de enzima transcriptase reversa e se realizou incubação a 42°C por uma hora. As regiões variáveis VK e VH foram amplificadas pelo método da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). Brevemente, 5 pL de ADNc de VH ou de VK foram misturados com 25 pmols de iniciadores específicos, 2,5 mM de cada dNTP, 5 pL de tampão 10X de Taq DNA polimerase e 1 unidade desta enzima. As amostras foram submetidas a 25 ciclos de PCR em temperaturas de 94°C, 30 segundos; 50°C, 30 segundos; 72°C, 1 minuto, com uma incubação final de 5 minutos a 72°C.

Clonagem e seqüenciamento do ADNc amplificado.

Os produtos das PCRs de VH e de VK (de P3 e de 1E10) foram clonados no vetor TA (TA Cloning kit, Promega, USA). Os clones resultantes foram seqüenciados pelo método dos didesoxinucleotídeos usando T7 ADN Polimerase e o conjunto de reagentes da firma comercial Pharmacia (T7 sequencing kit, Pharmacia, Suécia).

Construção de genes quiméricos.

Os genes da região variável das cadeias pesadas e leves foram obtidos por enzimas de restrição dos construtos intermediários no vetor TA e clonados nos respectivos vetores de expressão (Colomma e colaboradores (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152:89-104).

Os genes VH foram cortados do vetor TA por digestão enzimática com EcoRV e Nhel e clonados em um vetor de expressão (PAH 4604), que tem incluída uma região variável IgGl humana e como marcador de seleção o gene de resistência a histidinol. A construção resultante é o P3VH-PAH4604 ou o 1E10VH-PAH4604. Os genes VK foram cortados do vetor TA por digestão com as enzimas EcoRV e Sall, para serem clonados no vetor PAG4622. Este vetor tem um gene de resistência ao ácido micofenólico e a região constante kappa humana incluída. A construção genética resultante é o P3VK-PAG4622 e o 1E10VK-PAG4622.

Expressão do anticorpo quimérico de P3 e de 1Έ10. Células NS-0 foram eletroporadas com 10 pg de P3VK-PAG4622 ou 1E10VK-PAG4622, e após a obtenção do produtor de clone de cadeia leve kappa humana, este foi transfectado com 10 pg de P3VH-PAH4604 ou com 1E10VH-PAH4604, linearizados com enzima Pvul em ambos os casos. Os ADNs precipitados com etanol foram dissolvidos em 50 pL de PBS. Aproximadamente 107 células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 0,5 mL de PBS juntamente com o ADN em uma cubeta de eletroporação. Após 10 minutos em gelo as células foram submetidas a um pulso de 200 volts e 960 pFaraday e deixadas em gelo por 10 minutos. As células foram cultivadas em placas de 96 cavidades com meio suplementado com soro fetal de temeiro a 10%. Aos dois e quatro dias foi adicionado meio seletivo (D’MEM F12 com ácido micofenólico 0,45 pg/mL ou histidinol 10 mM, respectivamente). Os clones transfectados foram visíveis aos 10 dias da adição do meio seletivo. A presença de anticorpo humano nas placas foi detectada por ELISA. As placas foram revestidas com um anticorpo obtido em cabra que reconhece especificamente a cadeia gama humana, as cavidades foram lavadas com PBS-T (solução salina tamponada de fosfato que contém 0,05% de Tween 20), sobrenadante diluído do meio de cultivo foi adicionado em cada cavidade das placas de ELISA e deixados uma hora a 37°C. As cavidades foram lavadas com PBS-T e foi adicionado um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia kappa humana e que está conjugado com peroxidase de rábano picante (para o produtor de clone de cadeia kappa humana) ou um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina (para o produtor de clone de anticorpo completo), e foram deixados na temperatura ambiente por uma hora. As cavidades foram lavadas com PBS-T e receberam adição de solução tampão que continha o substrato o-fenileno-diamina mais peróxido de hidrogênio ou dietanol-amina, respectivamente. Após meia hora, a absorbância foi medida a 492 nm ou 405 nm, respectivamente.

Construção do anticorpo humanizado P3hu e lElOhu por humanização de epitopos T. Predição de epitopos T.

As seqüências dos domínios variáveis de Pe e de 1E10 foram analisadas com o Programa AMPHI (Margalit e colaboradores (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229), o qual permite a identificação de segmentos de 7 ou 11 aminoácidos com uma estrutura de hélice antipática, à qual está relacionada a imunogenicidade T. Em adição foi usado o programa SOHHA que também prediz zonas de hélices hidrofóbicas. (Elliot e colaboradores (1987): An hypothesis on the binding of an amphipatic, alfa helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). Estes algoritmos permitiram predizer nas seqüências das regiões variáveis das cadeias pesadas e leves dos anticorpos monoclonais murinos P3 e 1E10, os fragmentos relacionados com a apresentação de epitopos T no complexo de moléculas MHC II.

Análise de homologia com imunoglobulinas humanas.

As seqüências de aminoácidos dos domínios variáveis de P3 e de 1E10, foram comparadas com as seqüências de regiões variáveis de imunoglobulinas humanas relatadas, para identificar a imunoglobulina humana de maior homologia com a molécula murina submetida à análise.

Os dados das seqüências humanas utilizadas foram as relatadas em GenBank e EMBL, ambos as bancos de dados se encontram-se disponíveis na Internet. Para a busca de homologia foi utilizado o programa PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi.

Análise para a redução de imunogenicidade. A essência do método baseia-se na obtenção de uma redução da imunogenicidade pela humanização dos possíveis epitopos T, este com um mínimo de mutações nas FRs, especificamente naqueles segmentos que têm uma estrutura de hélice anfipática, ficando excluídas aquelas posições compreendendo as estruturas canônicas, a zona de vemier ou o sítio de reconhecimento do antígeno.

Segundo o método, são comparadas as seqüências das regiões variáveis de VH e de VL da imunoglobulina murina com a humana mais homóloga e são identificados os resíduos que diferem entre a seqüência murina e a seqüência humana, somente nos segmentos anfipáticos que ficam dentro da região das estruturas ou “frameworks” (FRs) (Kabat (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), estes resíduos “murinos” foram suscetíveis de serem mutados por aqueles que se encontram na mesma posição na seqüência humana. As substituições foram feitas por técnicas convencionais de mutagênese dirigida.

Os resíduos que se encontram nas posições das FRs responsáveis das estruturas canônicas ou na zona de Vemier, não puderam ser mutados, porque poderíam afetar a estrutura tridimensional do domínio variável do anticorpo e portanto afetar sua união com o antígeno. Informação adicional sobre a influência das substituições feitas na estrutura temária, podem ser obtidas por modelagem molecular das regiões variáveis.

Dado que nas análises das mutações podem ser considerados elementos tais como a presença de resíduos de prolina na hélice antipática, ou o fato de que um determinado resíduo murino não apareça na mesma posição na seqüência humana mais homóloga mas seja ffeqüente em outras imunoglobulinas humanas, é possível a obtenção de uma versão que contenha um máximo de mutações, a saber, na qual se mutam todos os resíduos murinos, mas podem ser obtidas outras versões com diferentes combinações de mutações. As mutações se realizam por superposições de PCRs.

Clonagem e expressão do anticorpo humanizado P3hu e lElOhu.

Uma vez obtidas os construtos genéticos correspondentes a P3hu ou a lElOhu, pelo método descrito anteriormente, estas foram clonadas nos vetores de expressão, de maneira semelhante à descrita anteriormente no caso da construção de anticorpo quimérico, obtendo-se as seguintes construções genéticas: P3VKhu-PAG4622 ou lE10VKhu-PAG4622 e P3VHhu-PAH4604 e lE10VHhu-PAH4604. A transfecção destes genes nas células NS-0 foram exatamente nas mesmas condições descritas anteriormente no caso de anticorpo quimérico.

Purificação dos anticorpos recombinantes.

Os anticorpos recombinantes foram purificados por cromatografia de afinidade com proteína A (Pharmacia, Upssala, Suécia).

Atividade biológica. A atividade biológica dos anticorpos recombinantes foi ensaiada para sua união com os respectivos antígenos em placas de ELISA. Para as variantes do anticorpo P3, as placas foram revestidas com o gangliosídeo GM3(NeuGc), foram lavadas com tampão Tris-HCl, e bloqueadas para eliminar as uniões não específicas com Tris-HCl com albumina de soro bovino (BSA) a 1%, foram incubadas a 37°C por uma hora. Após este tempo foram novamente lavadas e receberam adição de anticorpo P3 recombinante purificado, e incubadas mais uma hora. Logo após a lavagem receberam adição de um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina, e foram incubadas a 37°C por uma hora. As cavidades foram lavadas com Tris-HCl e receberam adição de uma solução tampão que contém o substrato dietanol-amina. Depois de meia hora a absorbância foi medida a 405 nm ou 492 nm. Para as versões recombinantes de 1E10, foi realizado um ensaio semelhante, porém as placas de ELISA foram revestidas com AcM murino P3 e lavadas com PBS-T (solução salina tamponada de fosfato que contém 0,05% de Tween 20).

Exemplos de realização.

Nos seguintes exemplos todas as enzimas de restrição ou modificação utilizadas, bem como os reagentes e materiais foram obtidos de fontes comerciais a não ser que se especifique ao contrário.

Exemplo 1. Obtenção de anticorpo monoclonal quimérico P3. O ADNc de AcM P3 foi obtido pela reação da enzima transcriptase reversa a partir de ARN extraído do hibridoma produtor de citado anticorpo, segundo o explicado na descrição detalhada da invenção. As sequências dos iniciadores específicos utilizados nesta reação são mostradas a seguir: Para VH: 5’AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCA GTGGATAGAC 3’ Para VK: 5 ’GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG3 ’ O ADNc das cadeias VHP3 e VKP3 foram amplificados por PCR com a enzima Taq polimerase e utilizando oligonucleotídeos específicos com sítios de restrição ECORV INHEI, para VH e ECORV/SALI para VK. Os oligonucleotídeos específicos usados como iniciadores desta reação foram: Para VH: Oligonucleotídeo 1 (hibridiza pelo peptídeo de sinal): 5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)G T(CA)AT(CG)CTCTT3 ’ Oligonucleotídeo 2 (hibridiza pelo CHI): 5’GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT3’ Para VK: Oligonucleotídeo 1 (hibridiza pelo peptídeo de sinal): 5’GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTC AGGTCTTT(GA)T3 ’ Oligonucleotídeo 2 (hibridiza por Ck): 5’AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT) GTCCC3’ O produto da PCR foi clonado no vetor TA (TA cloning kit, Invitrogen). Doze clones independentes foram seqüenciados pelo método de didesóxido utilizando T7 DNA Pol (Pharmacia). As seqüências de VHP3 e VKP3 (Figuras 1 e 2) apresentam alta relação com o subgrupo IB e V, respectivamente segundo a classificação de Kabat.

Posteriormente, a cadeia VHP3 foi digerida com as enzimas ECORV e NHEI e a VKP3 com ECORV e SALI, e clonadas nos vetores previamente digeridos com as mesmas enzimas PAH4604 e PAG4622, para VH e VK respectivamente. Estes vetores foram doados por Sherie Morrison (UCLA, Califórnia, USA). Os mesmos foram usados para a expressão de imunoglobulinas em células superiores. O vetor PAH 4604 tem incluída a região constante humana IgGl e PAG 4622 humana Ck (Coloma e colaboradores (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Uma vez clonadas as regiões VH e VK de P3 nos vetores anteriores, foram formadas os construtos VHP3-PAH4604 e VKP3-PAG4622. Células NS-0 foram eletroporadas com 10 pg de P3VK-PAG4622, e logo que obtido o produtor de clone de cadeia leve kappa humana, este foi transfectado com 10 pg de P3VH-PAH4604, linearizados com enzima Pvul em ambos os casos. Os ADNs precipitados com etanol foram dissolvidos em 50 pL de PBS. Aproximadamente 107 células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 0,5 mL de PBS juntamente com o ADN em uma cubeta de eletroporação. Após 10 minutos em gelo as células foram submetidas a um pulso de 200 volts e 960 pFaraday e deixadas em gelo por 10 minutos. As células foram cultivadas em placas de 96 cavidades com meio suplementado com soro fetal de temeiro a 10%. Aos dois e quatro dias foi adicionado meio seletivo (D’MEM F12 com ácido micofenólico 0,45 pg/mL ou histidinol 10 mM, respectivamente). Os clones transfectados foram visíveis após 10 dias da adição do meio seletivo. A presença de anticorpo humano nas placas foi detectada por ELISA. As placas foram revestidas com um anticorpo obtido em cabra que reconhece especificamente a cadeia gama humana, as cavidades foram lavadas com PBS-T (solução salina tamponada de fosfato que contém 0,05% de Tween 20), sobrenadante diluído do meio de cultivo foi adicionado em cada cavidade das placas de ELISA e deixados uma hora a 37°C. As cavidades foram lavadas com PBS-T e foi adicionado um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia kappa humana e que está conjugado com peroxidase de rábano picante (para o produtor de clone de cadeia kappa humana) ou um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina (para o produtor de clone de anticorpo completo), e foram deixados na temperatura ambiente por uma hora. As cavidades foram lavadas com PBS-T e receberam adição de solução tampão que continha o substrato o-fenileno-diamina mas peróxido de hidrogênio ou dietanol-amina, respectivamente. Após meia hora, a absorbância foi medida a 492 nm ou 405 nm, respectivamente.

Exemplo 2. Obtenção de diferentes versões de anticorpo humanizado P3. A sequência de VHP3 e de VKP3 (Figuras 1 e 2) foram comparadas com um banco de dados de seqüências humanas, obtendo-se a seqüência humana de maior homologia com o anticorpo P3 (Figuras 3 e 4). Posteriormente em ambas as seqüências (VH e VK) foram determinadas as regiões anfipáticas ou possíveis epitopos T. Foram determinadas as mutações a serem realizadas para se romperem ou humanizarem os potenciais epitopos T dentro das citadas seqüências.

No caso da região VH3 não foram introduzidas mutações. Como se mostra na figura 3, são comparados 2 segmentos antipáticos. Os mesmos incluem em CDR1, FR2 e parte de CDR2, bem como o final de FR3 e a CDR3 completa. Não são propostas mutações porque as diferenças entre a seqüência murina VHP3 e a humana da homologia maior apenas se encontram nas CDRs, que não podem ser mudados ou contêm aminoácidos da zona de Vemier ou não posições chave no reconhecimento do antígeno.

Para a cadeia VK, foram encontrados 2 fragmentos anfipáticos, um iniciador bloco na FR1 e um segundo bloco que engloba a CDR2 e parte de FR3. É proposta a mudança dos aminoácidos das posições 8, 9,10,11 e 13. Nestas posições são encontrados os aminoácidos His, Lys, Phe, Met e Thr, que são substituídos por Pro, Ser, Ser, Leu e Ala, respectivamente.

Estas mutações foram realizadas por superposições de PCRs usando os oligonucleotídeos 1 e 2 e 3 e 4 (Kamman e colaboradores (1989) Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404). A seguir são descritas as seqüências dos oligonucleotídeos utilizados. Esta construção genética foi chamada de P3VKhu.

Oligonucleotídeos para as mutações 8, 9, 10, 11 e 13, da cadeia leve.

Oligo 1: 5 ’ATGACCC AGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC3 ’ Oligo 2: 5 ’ AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3 ’ Oligo 3 : 5 ’GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT3 ’ Oligo 4: 5’GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA) T3’ Uma vez realizadas as mutações, estas foram verificadas por seqüência. As cadeias VH quiméricas e VK humanizadas foram clonadas em vetores PAG4622 e PAH4604, formando os construtos P3VH-PAH4604 e P3VKhu-PAG4622, respectivamente. O processo de eletroporação e detecção dos clones que expressavam o anticorpo humanizado P3h foi idêntico ao descrito para o anticorpo quimérico.

Exemplo 3. Atividade biológica do anticorpo quimérico P3. A atividade biológica do anticorpo quimérico foi ensaiada para sua união com o antígeno mediante a técnica de ELISA. Para o anticorpo quimérico P3, as placas foram revestidas com o gangliosídeo GM3(NeuGc), lavadas com Tris-HCl, e bloqueadas para eliminar as uniões não específicas com Tris-HCl com albumina de soro bovino (BSA) a 1%, incubadas a 37°C por uma hora. Após este tempo foram novamente lavadas e receberam adição de anticorpo P3 quimérico purificado, e foram incubadas mais uma hora. Logo após a lavagem receberam adição de um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina, e foram incubadas a 37°C por uma hora. As cavidades foram lavadas com Tris-HCl e receberam adição de uma solução tampão que contém o substrato dietanol-amina. Depois de meia hora a absorbância foi medida a 405 nm ou 492 nm. O anticorpo TI foi usado neste ensaio como controle negativo. Na Figura 5 é mostrada a união específica do anticorpo quimérico P3 em antígeno.

Exemplo 4. Obtenção de anticorpo monoclonal quimérico 1E10.

As cadeias VH1E10 e VK1E10 foram amplificadas por PCR com a enzima Taq polimerase e utilizando os oligômeros específicos com sítios de restrição ECORV/NHEI, para VH e ECORV/SALI para VK. Os oligômeros específicos utilizados como iniciadores foram: Para VH: 5’GGGGCT AGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3’ Para VK: 5’GCGTCT AGAACTGGATGGTGGGAAGA TGGA 3’ O ADNc das cadeias VH1E10 e VK1E10 foi amplificado usando a reação em cadeia da polimerase (PCR), os oligonucleotídeos específicos utilizados como iniciadores nesta reação de amplificação foram: Para VH: Oligonucleotídeo 1 (hibridiza pelo peptídeo de sinal): 5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CT TT3’ Oligonucleotídeo 2 (hibridiza pelo CHI): 5 OGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3 ’ Para VK: Oligonucleotideo 1 (hibridiza pelo peptídeo de sinal): 5’GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT( TGGG(GA)3’ Oligonucleotideo 2 (hibridiza pelo Ck): 5 ’ AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3 ’ O produto da PCR foi clonado no vetor TA (TA cloning kit da Invitrogen). Doze clones independentes foram seqüenciados pelo método de didesóxido utilizando T7 DNA Pol (Pharmacia). As seqüências de VH1E10 e VK1E10 têm alta relação com o subgrupo miscelânea e V, respectivamente, segundo a classificação de Kabat (Figuras 6 e 7).

Posteriormente, a cadeia VH1E10 foi digerida com as enzimas ECORV e NHEI e a VH1E10 com HincII e SALI, e clonadas nos vetores previamente digeridos com as enzimas apropriadas PAH4604 e PAG4622, para VH e VK respectivamente. Estes vetores foram doados por Sherie Morrison (UCLA, Califórnia, USA). Os mesmos foram usados para a expressão de imunoglobulinas em células superiores. O vetor PAH 4604 tem incluída a região constante humana IgGl e PAG 4622 humana Ck (Coloma e colaboradores (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Uma vez clonadas as regiões VH e VK de 1E10 nos vetores anteriores, foram formadas os construtos VH1E10-PAH4604 e VK1E10-PAG4622. Células NS-0 foram eletroporadas com 10 pg de P3VK-PAG4622 ou 1E10VK-PAG4622, e logo que obtido o produtor de clone de cadeia leve kappa humana, este foi transfectado com 10 pg de P3VH-PAH4604 ou 1E10VH-PAH4604, linearizados com enzima Pvul em ambos os casos. Os ADNs precipitados com etanol foram dissolvidos em 50 pL de PBS. Aproximadamente 107 células foram coletadas por centrifugação e ressuspensas em 0,5 mL de PBS juntamente com o ADN em uma cubeta de eletroporação. Após 10 minutos em gelo as células foram submetidas a um pulso de 200 volts e 960 pFaraday e deixadas em gelo por 10 minutos. As células foram cultivadas em placas de 96 cavidades com meio suplementado com soro fetal de temeiro a 10%. Aos dois e quatro dias foi adicionado meio seletivo (D’MEM F12 com ácido micofenólico 0,45 pg/mL ou histidinol 10 mM, respectivamente). Os clones transfectados foram visíveis aos 10 dias da adição do meio seletivo. A presença de anticorpo humano nas placas foi detectada por ELISA. As placas foram revestidas com um anticorpo obtido em cabra que reconhece especifícamente a cadeia gama humana, as cavidades foram lavadas com PBS-T (solução salina tamponada de fosfato que contém 0,05% de Tween 20), sobrenadante diluído do meio de cultivo foi adicionado em cada cavidade das placas de ELISA e deixados uma hora a 37°C. As cavidades foram lavadas com PBS-T e foi adicionado um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia kappa humana e que está conjugado com peroxidase de rábano picante (para o produtor de clone de cadeia kappa humana) ou um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina (para o produtor de clone de anticorpo completo), e foram deixados na temperatura ambiente por uma hora. As cavidades foram lavadas com PBS-T e receberam adição de solução tampão que continha o substrato o-fenileno-diamina mais peróxido de hidrogênio ou dietanol-amina, respectivamente. Após meia hora, a absorbância foi medida a 492 nm ou 405 nm, respectivamente.

Exemplo 5. Obtenção de diferentes versões de anticorpo humanizado 1E10. A seqüência de VH1E10 e de VK1E10 (Figuras 6 e 7) foram comparadas com um banco de dados de seqüências humanas, obtendo-se a seqüência humana de maior homologia com o anticorpo 1E10 (Figuras 8 e 9).

Posteriormente em ambas as seqüências (VH e VK) foram determinadas as regiões antipáticas ou possíveis epitopos T. Posteriormente, foram determinadas as mutações a serem realizadas para se converter a seqüência de VH e de VK murinas em humanizadas por este método. A seguir assinalamos o máximo de mutações possíveis, que podem ser realizadas. Há alguns aminoácidos assinalados que formam parte dos blocos anfipáticos nos quais se incluem Pro e Lys, (que como se sabe não devem formar parte das hélices antipáticas, porque podem ser falsos positivos). Isto mesmo se sucede na análise posterior que se faz com a VK.

No caso da região VH foram introduzidas mutações nas posições 5, que pertencem a um bloco antipático que engloba a maior parte de FR1, nas 40 e 42, de um bloco antipático que se encontra em FR2 e parte de CDR3, e na posição 87 do bloco que engloba a FR3. Foram substituídos os aminoácidos Gin, Arg, Glu e Thr por Vai, Ala, Gly e Arg, respectivamente. Estas mutações foram realizadas por superposições de PCRs usando os oligonucleotídeos 1 e 2 e 3 e 4, em um iniciador de PCR e depois se superpôs o resultado dos mesmos em outra PCR, usando apenas os oligonucleotídeos 2 e 4 cujas seqüências são mostradas a seguir (Kammann e colaboradores (1989): Rapid insertional mutageneseis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res, 17: 5404).

Os oligonucleotídeos para a mutação 5 da cadeia pesada.

Oligo 1: 5 ’CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT3 ’ Oligo 2: 5 OGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3 ’ Oligo 3: 5 ’ AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG3 ’ Oligo 4: 5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG) CTCTT3’ Uma vez seqüenciada e verificada a mutação anterior nos ADNs que portavam a mesma, são introduzidas nos mesmos as mutações correspondentes nas posições 40 e 42. A seguir são mostrados os oligonucleotídeos 1 e 2 e 3 e 4, descritos para esta mutação. A superposição dos produtos das PCRs foi feita na mesma maneira que a descrita anteriormente. As mutações foram verificadas por seqüenciamento.

Oligonucleotídeos para as mutações 40 e 42 da cadeia pesada: Oligo 1: 5’ TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3’ Oligo 2: 5 OGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3 ’ Oligo 3: 5 ’CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA3 ’ Oligo 4: 5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG) CTCTT3’ Uma vez seqüenciadas e verificadas as mutações anteriores nos ADNs que portavam as mesmas, foi introduzida nos mesmos as mutação correspondente à posição 87. A seguir são mostrados os oligonucleotídeos 1 e 2 e 3 e 4, descritos para esta mutação. A superposição dos produtos das PCRs foi feita na mesma maneira descrita anteriormente. As mutações foram verificadas por seqüenciamento.

Oligonucleotídeos para a mutação 87 da cadeia pesada: Oligo 1: 5’ CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT3 ’ Oligo 2: 5 OGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT3 ’ Oligo 3: 5’ AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3’ Oligo 4: 5’GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG) CTCTT3’ Oligo 1: 5’CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGAC AGAGTC3’ Esta construção final se chama lElOVHhu.

No caso da cadeia pesada, há aminoácidos diferentes entre a cadeia VH1E10 e a humana mais parecida e entretanto estes não foram substituídos, porque as substituições englobam aminoácidos da zona de Vemier ou são posições chave no reconhecimento de antígeno.

Para a cadeia VK, foram realizadas mutações nas posições 7, 8 e 15 substituindo Thr, Thr e Leu por Ser, Pro e Vai, respectivamente.

As mutações foram introduzidas na mesma maneira que a descrita na cadeia pesada, a seguir são mostradas as seqüências dos oligonucleotídeos utilizados. Este construto genético foi chamado de lElOVKhu.

Oligonucleotídeos para as mutações 7,8 e 15 da cadeia leve: Oligo 1: 5’CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGAC AGAGTC3’ Oligo 2: 5’AGCGTCGACTT ACGTTT(TG)A TTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3 ’ Oligo 3: 5’ACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGT CATCTG3’ 01igo4: 5'GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(T G)GG(GA)3’ Uma vez realizadas as mutações, estas foram verificadas por seqüenciamento. Este construto resultante foi chamado de lElOVKhu.

As cadeias VK e VH humanizadas foram clonadas nos vetores PAG 4622 e PAH4604, formando os construtos lE10VHhu-PAH4604 e lE10VKhu-PAG4622 respectivamente. O processo de eletroporação e de detecção dos clones que expressavam o anticorpo humanizado lElOh foi idêntico ao descrito para o anticorpo quimérico.

Exemplo 6: Atividade biológica do anticorpo quimérico 1E10. A atividade biológica do anticorpo 1E10 quimérico foi ensaiada por ELISA. As placas foram revestidas com o AcM murino P3, lavadas com PBS-T (solução salina tamponada de fosfato que contém 0,05% de Tween 20), o sobrenadante diluído do meio de cultivo foi adicionado em cada cavidade das placas de ELISA e foi incubado uma hora a 37°C. Logo após sua lavagem foi adicionado nas mesmas um anticorpo de cabra que reconhece a cadeia gama humana e que está conjugado com fosfatase alcalina, e foi realizada incubação por uma hora a 37°C. As cavidades foram lavadas com PBS-T e depois foi adicionada a solução tampão que contém o substrato dietanol-amina. Depois de meia hora a absorbância foi medida a 405 nm. Os resultados são mostrados na Figura 10. O AcM C5 quimérico foi usado como controle negativo.

Breve descrição das figuras Figura 1. Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidas da região variável da cadeia pesada do anticorpo P3. Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat e colaboradores (Kabat e colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), e parecem sobre o códon que os codifica. As CDRs estão assinaladas com linhas descontínuas.

Figura 2. Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidas da região variável da cadeia leve do anticorpo P3. Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat e colaboradores (Kabat e colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), e parecem sobre o códon que os codifica. As CDRs estão assinaladas com linhas descontínuas.

Figura 3. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de VHP3 com a humana mais homóloga. Os segmentos antipáticos estão sublinhados e as CDRs estão em negrito.

Figura 4. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de VKP3 com a humana mais homóloga. Os segmentos antipáticos estão sublinhados e as CDRs estão em negrito.

Figura 5. Reconhecimento especifico de GM3(NeuGc) pelo anticorpo P3 quimérico. Se defrontaram diferentes concentrações dos anticorpos quiméricos P3 e TI (irrelevante) nas placas de ELISA revestidas com GM3(NeuGc) e GM3(NeuAc), e foi medida a ligação específica.

Figura 6. Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidas da região variável da cadeia pesada do anticorpo 1E10. Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat e colaboradores (Kabat e colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), e parecem sobre o códon que os codifica. As CDRs estão assinaladas com linhas descontínuas.

Figura 7. Seqüências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidas da região variável da cadeia leve do anticorpo 1E10. Os aminoácidos estão numerados de acordo com Kabat e colaboradores (Kabat e colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), e parecem sobre o códon que os codifica. As CDRs estão assinaladas com linhas descontínuas.

Figura 8. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de VH1E10 com a humana mais homóloga. Os segmentos anfipáticos estão sublinhados e as CDRs estão em negrito.

Figura 9. Alinhamento da seqüência de aminoácidos de VK1E10 com a humana mais homóloga. Os segmentos anfipáticos estão sublinhados e as CDRs estão em negrito.

Figura 10. Reconhecimento especifico de AcM murino P3 pelo anticorpo 1E10 quimérico. Se defrontaram diferentes concentrações dos anticorpos quiméricos 1E10 e C5 (irrelevante) nas placas de ELISA revestidas com AcM P3 e AcM A3, e foi medida a ligação específica.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Anticorpo monoclonal quimérico derivado do anticorpo monoclonal antiidiotipo murino AcM 1E10 que reconhece o AcM murino P3 e que é produzido pelo hibridoma com número de depósito ECACC 97112901, caracterizado pelo fato de que os domínios hipervariáveis de duas cadeias pesada e leve compreendem as seguintes sequências: CADEIA PESADA CDR1: SYDIN (SEQ ID NO: 15) CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG (SEQ ID NO: 16) CDR3:EDYYDNSYYFDY (SEQ ID NO: 17) CADEIA LEVE CDR1: RASQDISNYLN (SEQ ID NO: 18) CDR2: YTSRLHSG (SEQ ID NO: 19) CDR3: QQGNTLPWT (SEQ IDNO: 20)

2. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as regiões de estruturas (FRs) de suas cadeias pesada e leve compreendem as seguintes sequências: CADEIA PESADA FR1 :QVQLQQSGAELVKPGAS VKLSCKASGYTFT (SEQ IDNO: 21) FR2: WVRQRPEQGLEWIG (SEQ ID NO: 22) FR3 :KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDS AVYFCAR (SEQ ID NO: 23) FR4: WGQGTTLTV (SEQ ID NO: 24) CADEIA LEVE FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC (SEQ ID NO: 25) FR2: WYQQKPDGTVKLLIY (SEQ ID NO: 26) FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC (SEQ ID NO: 27) FR4: FGGGTKLESK (SEQID NO: 28)

3. Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que para sua humanização e preservação de sua afinidade pelo antígeno, inclui pelo menos uma das seguintes substituições: CADEIA LEVE Posição 7 da SEQ ID NO: 25: Thr por Ser Posição 8 da SEQ ID NO: 25: Thr por Pro Posição 15 da SEQ ID NO: 25: Leu por Vai CADEIA PESADA Posição 5 da SEQ ID NO: 21: Gin por Vai Posição 5 da SEQ ID NO: 22: Arg por Ala Posição 7 da SEQ ID NO: 22: Glu por Gly Posição 21 da SEQ ID NO: 23: Thr por Arg

4. Anticorpo monoclonal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a região constante de sua cadeia pesada compreende a seqüência de aminoácidos da região constante da cadeia pesada gama-1 e a região constante de sua cadeia leve compreende a seqüência de aminoácidos da região constante da cadeia kappa, ambas provenientes de imunoglobulinas humanas.

5. Composição farmacêutica para o tratamento de tumores malignos de mama e de melanomas, de suas metástases e recidivas, caracterizada pelo fato de compreender qualquer um dos anticorpos monoclonais como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

6. Composição farmacêutica para a localização e a identificação in vivo de tumores malignos de mama e de melanomas, de suas metástases e recidivas, caracterizada pelo fato de compreender qualquer um dos anticorpos monoclonais como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 4.

7. Uso de um anticorpo monoclonal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento útil para o tratamento de tumores malignos de mama e de melanomas, de suas metástases e recidivas.