WO2002081496A2 - Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores - Google Patents
Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores Download PDFInfo
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Abstract
La presente invención se relaciona con la obtención de anticuerpos modificados por ingeniería genética a partir del anticuerpo monoclonal murino P3 (AcM P3), producido por el hibridoma depositado según el tratado de Budapest bajo el número ECACC 94113026 y de su anti-idiotipo 1E10 (AcMai 1E10) producido por el hibridoma ECACC 97112901, con el objetivo de lograr anticuerpos con las mismas propiedades de reconocimiento de los originales pero que sean menos inmunogénicos que éstos. Los anticuerpos quiméricos, contienen los dominios variables de la inmunoglobulina murina y las regiones constantes de la inmunoglobulina humana; y los humanizados, además de contener las regiones constantes de la inmunoglobulina humana, son modificados en la región de los marcos (FRs) murinos y en particular en aquellas zonas que pudieran resultar en un sitio antigénico para las células T, por lo que algunas posiciones de los FRS son humanas. Estos anticuerpos pueden ser utilizados en el diagnóstico y la terapia de diferentes tipos de tumores.
Description
ANTICUERPOS RECOMBINANTES ASOCIADOS A GANGLIOSIDOS. SU USO EN EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE TUMORES.
Sector Técnico. La presente invención está relacionada con el campo de la biotecnología, en particular con nuevos anticuerpos recombinantes obtenidos mediante el empleo de la ingeniería genética, específicamente con los anticuerpos quimérico y humanizado obtenidos a partir de los anticuerpos monoclonales murinos P3 (AcM P3) y su anti-idiotipo 1 E10 (AcM 1 E10). Mas específicamente, la invención se relaciona con anticuerpos que se enlazan específicamente a gangliósidos portadores de ácido siálico Λ/-glicolilado, pero no con las formas acetiladas de los gangliósidos ni con gllcolípidos neutros, antígenos expresados en tumores de mama y melanoma. Además se ha demostrado el efecto anti-tumoral del AcM 1 E10 en modelos experimentales. La presente invención también se relaciona con las composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos monoclonales recombinantes útiles en el diagnóstico y terapéutica del cáncer de mama y melanomas, previamente descritos. Técnica anterior.
Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y que están presentes en las membranas plasmáticas de vertebrados (Stults y colaboradores (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179:167-214). Algunas de estas moléculas han sido reportadas en la literatura como antígenos asociados a tumores o marcadores tumorales (Hakomori y colaboradores (1991 ): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens, Curr. Opin. Immunol., 3: 646- 653), por lo que se ha descrito el uso de anticuerpos anti-gangliósidos como útiles en el diagnóstico y terapéutica del cáncer (Hougton y colaboradores (1985): Mouse monoclonal antibody lgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: a phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82:1242-1246; Zhang y colaboradores (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cáncer, 73: 42-49). Los ácidos siálicos más comúnmente encontrados en animales son el Λ/-acetil (NeuAc) y el Λ/-glicolil (NeuGc) (Corfield y colaboradores (1982): Occurence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10: 5-50). En general el NeuGc no está expresado en tejidos normales de humanos y pollos, pero está ampliamente distribuido en otros vertebrados (Leeden y Yu (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A and Shengtrund CL (Eds). Plenum Press, New York, 1-48; Kawai y colaboradores (1991): Quantitative determination of Λ/-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous
tissues and avian lymphoma cell lines as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cáncer Research, 51 : 1242-1246). Sin embargo, hay reportes de la literatura que muestran que anticuerpos anti-NeuGc, reconocen algunos tumores humanos y líneas de células tumorales (Higashi y colaboradores (1988): Detection of gangliosides as Λ/-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu-Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cáncer Res., 79: 952-956; Fukui y colaboradores (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cáncer cell Une, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Se ha encontrado además, un incremento de los niveles del gangliósido GM3 (NeuGc), en cáncer de mama humano (Marquina y colaboradores (1996): Gangliosides expressed in human breast cáncer, Cáncer Research, 1996; 56: 5165-5171), hallazgo que hace francamente atractivo el uso de esta molécula como blanco para la terapia de este tipo de cáncer. El anticuerpo monoclonal (AcM) P3 es un anticuerpo murino de isotipo IgM, que se obtuvo al fundir esplenocitos de un ratón BALB/c inmunizado con liposomas que contenían GM3(NeuGc) y toxoide tetánico, con células de mieloma murino de la línea P3-X63-Ag8.653. (Línea celular depositada con el número de acceso ECACC 94113026, Patente Europea EP 0 657 471 B1 ). Este AcM reacciona fuertemente con gangliósidos portadores de ácido siálico Λ/-glicolilado, pero no con las formas acetiladas de los gangliósidos, ni con los glicolípidos neutros. En estudios inmunocitoquímicos e inmunohistoquímicos, llevados a cabo con líneas celulares, así como con cortes de tejidos de tumores benignos y neoplásicos, se demostró que el AcM P3 reconoce tumores de mama (Vázquez y colaboradores (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for Λ/-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556) y melanoma.
El AcM P3 indujo una evidente respuesta anti-idiotípica (Ab2) en ratones BALB/c (modelo singénico), aún en ausencia de adyuvante y proteína transportadora, (Vázquez y colaboradores (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc- containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Los estudios inmunoquímicos realizados sugieren el papel fundamental de los grupos electronegativos, en la forma de ácido siálico (en los gangliósidos) o de grupo S03- (en los sulfátidos), en el reconocimiento de este anticuerpo (Moreno y colaboradores (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for Λ/-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705). El AcM anti-idiotipo (AcMai) 1 E10 de tipo lgG1 , se obtuvo a partir de la inmunización de ratones BALB/c con el AcM P3 acoplado a KLH (Patente norteamericana US 6,063,379,
línea celular depositada con el número de acceso ECACC 97112901). Al estudiar su especificidad de reconocimiento frente a un panel de AcMs anti-gangliósidos, reconoció solamente al P3 y no a otros AcMs anti-gangliósidos de isotipo IgM. Además, inhibió específicamente la unión del P3 al GM3(NeuGc) y a la línea de carcinoma ductal infiltrante de mama MDA-MB-435 (P3 positiva). El AcMai 1E10 indujo una fuerte respuesta de anticuerpos Ab3 en los modelos singénico y alogénico, dichos anticuerpos Ab3 no poseen la misma especificidad que el AcM P3, pero sí portan idiotopos de este AcM Ab1 (Vázquez y colaboradores (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc- containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). El AcMai 1 E10 ejerce un fuerte efecto antitumoral en ratones slngénicos y alogénicos. La vacunación de ratones BALB/c con dosis repetidas del AcMai 1 E10 acoplado a KLH en adyuvante de Freund, redujo significativamente el crecimiento tumoral subcutáneo de la línea de carcinoma mamario F3II, y el número de metástasis pulmonares espontáneas. La administración por vía intravenosa del AcMai 1 E10 en ratones C57BL/6, entre 10 y 14 días después de la inoculación intravenosa de células de melanoma B16, provocó una reducción dramática del número de metástasis pulmonares en comparación con ratones tratados con una IgG irrelevante. Los resultados obtenidos en estos experimentos sugieren la activación de más de un mecanismo de respuesta antitumoral contra células de tumor mamario y melanoma (Vázquez y colaboradores (2000): Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to Λ/-glycolyl-containing gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756, 2000). Después de más de 15 años de desarrollada la tecnología de hibridomas para la obtención de anticuerpos monoclonales murinos (Koehler y Milstein (1975): Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity, Nature, 256: 495-497), los mismos han resultado muy útiles en el diagnóstico de enfermedades y en la investigación básica pero no han demostrado su eficacia terapéutica en humanos, lo que ha sido en gran medida debido a su corta vida media en sangre, así como al pobre reconocimiento de las funciones efectoras murinas por el sistema inmune humano, y además por la respuesta inmunológica que provoca el origen murino de los mismos al ser inyectados en pacientes (respuesta HAMA, siglas en inglés). El desarrollo de la tecnología de ingeniería de genes ha revolucionado el potencial de los AcMs, ya que manipulando los genes de las inmunogloblinas es posible hacer modificaciones en los anticuerpos con el objetivo de disminuir o eliminar la antigenicidad de los mismos, así como mejorar sus funciones efectoras cuando son usados en el tratamiento o diagnóstico de determinadas patologías. Estas manipulaciones tienen como objetivo esencial disminuir al máximo las diferencias en cuanto a propiedades inmunológicas entre el
anticuerpo murino y una inmunoglobulina humana, sin alterar la especificidad por el antígeno (Morrison y Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv Immunol., 44: 65-92). Recientemente se han desarrollado varios métodos para humanizar anticuerpos de ratón o de rata y así disminuir la respuesta xenogénica contra proteínas extrañas al ser los mismos inyectados en humanos. Uno de los primeros intentos para reducir la antigenicidad ha sido generar anticuerpos "quiméricos", en los cuales los dominios variables de las proteínas murinas se insertan en dominios constantes de moléculas humanas, con lo cual no sólo se logra la disminución de la inmunogenicidad sino también el mejoramiento de funciones efectoras, ya que las mismas son humanas y por tanto reconocidas por el sistema inmune (Morrison y colaboradores (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouse antigen- binding domains with human constant región domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). Estas moléculas quiméricas mantienen las características del anticuerpo original en relación con la unión al antígeno y su región constante no es inmunogénica, pero mantiene la inmunogenicidad contra la región variable murina. Otros autores han logrado disminuir aún más la inmunogenicidad, insertando las Regiones Determinantes de la Complementariedad (CDRs) de los anticuerpos alogénicos sobre los marcos (FRs) de inmunoglobulinas humanas (Jones y colaboradores (1986): Replacing the complementarity-determining regions ¡n a human antibody with those from a mouse, Nature 321 : 522-524; Verhoeyen y colaboradores (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science 239, 1534-1536). Sin embargo este método mostró diversos inconvenientes, fundamentalmente la pérdida de afinidad del anticuerpo en comparación con su contrapartida murina, por lo que fue necesario restaurar algunos de los residuos de los FRs por los correspondientes en la inmunoglobulina murina (Rietchmann y colaboradores (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nature, 332: 323-327; Queen y colaboradores (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS USA, 86: 10029-10033; Tempest y colaboradores (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respiratory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272), Además, en estos anticuerpos se observa frecuentemente inmunogenicidad. Mateo y colaboradores (US Patent Number US 5 712 120) describen un procedimiento para la reducción de la inmunogenicidad de los anticuerpos murinos. Según el mismo, las modificaciones están restringidas a los dominios variables y específicamente a los FRs murinos de los anticuerpos quiméricos. Mas aún, las modificaciones se realizan solamente en aquellas regiones de los FRs que tienen una estructura de hélice antipática y que por tanto son potenciales epitopos reconocidos por las células T. El método propone sustituir los residuos de amino ácidos murinos dentro de las regiones antipáticas por los
aminoácidos que se encuentren en la misma posición en las inmunoglobulinas humanas, quedando excluidos de estos cambios aquellos residuos que están involucrados en la estructura tridimensional del sitio de reconocimiento del antígeno, es decir la zona de Vernier, las estructuras canónicas de los CDRs y los aminoácidos en la interfase entre las cadenas pesada y ligera.
El anticuerpo modificado por el método descrito por Mateo y colaboradores (Mateo y colaboradores (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma 19: 463-71), retiene la capacidad de reconocimiento y unión al antígeno del anticuerpo original y resulta menos ¡nmunogénico, lo cual incrementa su utilidad terapéutica. Mediante este procedimiento se logra, con un pequeño número de mutaciones, obtener anticuerpos modificados que muestran una reducción de la ¡nmunogenicidad al ser comparados con el anticuerpo quimérico.
Descripción Detallada de la Invención La presente invención se relaciona con anticuerpos recombinantes, obtenidos por técnicas de ingeniería genética. Específicamente la invención se relaciona con un anticuerpo quimérico derivado del anticuerpo monoclonal murino P3 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 941 13026 que reconoce a un antígeno expresado en células de tumores de mama y melanomas, caracterizado porque las secuencias de las regiones hipervariables (CDRs) de las cadenas pesada y ligera son las que se muestran a continuación:
CADENA PESADA CDR1 : RYSVH
CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY
CADENA LIGERA CDR1 : KASQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT Preferiblemente, las secuencias de las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo son las que se muestran a continuación: CADENA PESADA
FR1 : QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS FR2: WVRQPPGKGLEWLG FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV
CADENA LIGERA
FR1 : DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC FR2: WYQQKPGQSPKLLIY
FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC FR4: FGGGTKL
Más preferible cuando el anticuerpo quimérico de la presente invención, contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana.
En una representación preferida, la presente invención se relaciona con un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal murino P3 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 941 13026, caracterizado porque contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana y en la región de los marcos de la cadena ligera contiene al menos una de las siguientes mutaciones: CADENA LIGERA:
Posición 8: His por Pro Posición 9: Lys por Ser Posición 10: Phe por Ser Posición 11 : Met por Leu Posición 13: Thr por Ala
En otro aspecto, la invención se relaciona con un anticuerpo quimérico derivado del anticuerpo monoclonal murino 1 E10 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 97112901 que reconoce al AcM murino P3, caracterizado porque las secuencias de las regiones hipervariables (CDRs) de las cadenas pesada y ligera son las que se muestran a continuación:
CADENA PESADA CDR1 : SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3: EDYYDNSYYFDY CADENA LIGERA
CDR1 : RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT Preferiblemente, las secuencias de las regiones de los marcos (FRs) de las cadenas pesada y ligera de dicho anticuerpo son las que se muestran a continuación:
CADENA PESADA
FR1 : QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV
CADENA LIGERA
FR1 : DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK
Más preferible es cuando el anticuerpo quimérico de la presente invención, contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana.
En una representación preferida, la presente invención se relaciona con un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal murino 1E10 producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 971 12901 , caracterizado porque contiene la región constante de cadena pesada lgG1 humana y la región constante de cadena ligera Ck humana y en las regiones de los marcos de las cadenas pesada y ligera contiene al menos una de las siguientes mutaciones: CADENA LIGERA:
Posición 7: Thr por Ser Posición 8: Thr por Pro Posición 15: Leu por Val CADENA PESADA Posición 5: Gln por Val
Posición 40: Arg por Ala Posición 42: Glu por Gly
Posición 87 (83 según la numeración de Kabat): Thr por Arg En otro aspecto, la presente invención se relaciona con las líneas celulares que expresan los anticuerpos quiméricos y humanizados descritos en la misma, así como con composiciones farmacéuticas caracterizadas porque contienen uno de los anticuerpos descritos.
La invención por tanto se relaciona con composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores malignos de mama, pulmón, sistema digestivo, sistema urogenital, melanomas, sarcomas y tumores de origen neuroectodérmico, sus metástasis y recidivas, caracterizadas
porque contienen uno de los anticuerpos monoclonales descritos y un excipiente apropiado para su aplicación.
En otra representación de la presente invención, las composiciones farmacéuticas se pueden usar para la localización e identificación "in vivo" de tumores malignos de mama, pulmón, sistema digestivo, sistema urogenital, melanomas, sarcomas y tumores de origen neuroectodérmico, sus metástasis y recidivas.
Síntesis de cDNA y amplificación por PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) de las regiones variables del anticuerpo murino P3 y 1E10.
El ARN fue obtenido de 106 células de hibridoma del P3 (AcM murino, IgM, que reconoce a los gangliósidos GM3 N-glicolilados) o del hibridoma del 1E10 (que reconoce al P3). El método usado para la extracción del ARN fue usando el reactivo TRIZOL (GIBCO BRL,
Grand Island, NY), de acuerdo a las instrucciones del fabricante.
La síntesis de ADN complementario (ADNc) se realizó en una reacción con 5μg del ARN obtenido con 25 pmoles del oligo diseñado para hibridar con el principio de la región constante de las IgM murinas para el caso de la VHP3, y con el principio de la región constante de la lgG1 murina para el caso de la VH 1E10, y para la región variable de cadena ligera (VK), que hibride en región constante kappa murina para ambos anticuerpos,
2.5 mM de cada deoxinucleótido (dNTPs), 50 mM Tris-Hcl pH 7.5, 75 mM KCI, 10 mM DTT,
8 mM MgCI2 y 15 unidades de inhibidor de RNAsa en un volumen total de 50 μl. Esta mezcla es calentada a 70°C, por 10 minutos y enfriada lentamente hasta 37°C. Al final se añaden 100 unidades de enzima transcriptasa reversa y se incuba a 42°C por una hora.
Las regiones variables VK y VH fueron amplificadas por el método de la Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR). Brevemente, 5 μl de ADNc de VH o de VK se mezclan con
25 pmoles de primers específicos, 2.5 mM de cada dNTP, 5 μl de buffer 10X de Taq DNA polimerasa y 1 unidad de esta enzima. Las muestras fueron sometidas a 25 ciclos de PCR con temperaturas de 94°C, 30 seg; 50°C, 30 seg; 72°C, 1 min, con una incubación final de 5 minutos a 72°C.
Clonaje y secuenciación del ADNc amplificado.
Los productos de las PCRs de VH y VK (del P3 y del 1E10) fueron clonados en el vector TA (TA Cloning kit. Promega, USA). Los clones resultantes fueron secuenciados por el método de los dideoxinucleótidos usando T7 ADN Polimerasa y el juego de reactivos de la casa comercial Pharmacia (T7 sequencing kit, Pharmacia, Sweden).
Construcción de genes quiméricos.
Los genes de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras fueron obtenidos por restricciones enzimáticas de las construcciones intermedias en el vector TA y clonados en los respectivos vectores de expresión (Coloma y colaboradores (1992): Novel vectors for the
expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104).
Los genes VH fueron cortados del vector TA por digestión enzimática con EcoRV y Nhel y clonados en un vector de expresión (PAH 4604), que tiene incluida una región variable lgG1 humana y como marcador de selección el gen de resistencia al histidinol. La construcción resultante es el P3VH-PAH4604 o el 1E10VH-PAH4604 . Los genes VK fueron cortados del vector TA por digestión con las enzimas EcoRV y Salí, para ser clonados en el vector PAG4622. Este vector tiene un gen de resistencia al ácido micofenólico y la región constante kappa humana incluida. La construcción genética resultante es el P3VK-PAG4622 o el 1E10VK-PAG4622.
Expresión del anticuerpo quimérico del P3 y del 1E10.
Células NS-0 fueron electroporadas con 10 μg de P3VK-PAG4622 o 1 E10VK-PAG4622, y luego de obtenido el clon productor de cadena ligera kappa humana, este fue transfectado con 10 μg de P3VH-PAH4604 o 1E10VH-PAH4604, linealizados con enzima Pvul en ambos casos. Los ADNs precipitados con etanol fueron disueltos en 50 μl de PBS. Aproximadamente 107 células fueron colectadas por centrifugación y resuspendidas en 0.5 mi de PBS junto con el ADN en una cubeta de electroporación. Después de 10 minutos en hielo las células fueron sometidas a un pulso de 200 volts y 960 μFaradios y dejadas en hielo por 10 minutos. Las células se cultivan placas de 96 pocilios con medio suplementado con suero fetal de ternera al 10%. A los dos y cuatro días se añade medio selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45 μg/mL o histidinol 10mM, respectivamente). Los clones transfectados se hicieron visibles a los 10 días de añadido el medio selectivo. La presencia del anticuerpo humano en las placas fue detectada por ELISA. Las placas fueron recubiertas con un anticuerpo obtenido en chiva que reconoce específicamente cadena gamma humana, los pozos fueron lavadas con PBS-T (solución salina tamponada de fosfato que contiene 0.05% de Tween 20), sobrenadante diluido del medio de cultivo fueron añadidos a cada pozo de las placas de ELISA y dejados una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se le añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena kappa humana y que está conjugado con peroxidasa de rábano picante (para el clon productor de cadena kappa humana) o un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina (para el clon productor del anticuerpo completo), y se dejó a temperatura ambiente por una hora. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato o-fenilendiamina más peróxido de hidrógeno o dietanolamina, respectivamente. Después de media hora, la absorbancia fue medida a 492 o 405 nm, respectivamente.
Construcción del anticuerpo humanizado P3hu y 1E10hu por humanización de epitopos T. Predicción de epitopos T.
Las secuencias de los dominios variables del P3 y del 1 E10 fueron analizadas con el Programa AMPHI (Margalit y colaboradores (1987): Prediction of ¡mmunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229), el cual permite la identificación de segmentos de 7 ó de 11 aminoácidos con una estructura de hélice antipática, a la cual se ha relacionado la inmunogenicidad T. Además se usó el programa SOHHA que predice también zonas de hélices hidrofóbicas. (Elliot y colaboradores (1987) An hypothesis on the binding of an amphipatic, alfa helical sequence in I i to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). Estos algoritmos permitieron predecir en las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales murinos P3 y 1 E10, fragmentos relacionados con la presentación de epitopos T al complejo de moléculas MHC II. Análisis de Homología con inmunoglobulinas humanas. Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables del P3 y 1 E10, fueron comparadas con las secuencias de regiones variables de inmunoglobulinas humanas reportadas, para identificar la inmunoglobulina humana de mayor homología con la molécula murina sometida a análisis. Las bases de secuencias humanas utilizadas fueron las reportadas en GeneBank y EMBL, ambas bases de datos se encuentran disponibles en Internet. Para la búsqueda de homología se usó el programa PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00, Hitachi. Análisis para la reducción de inmunogenicidad.
La esencia del método radica en lograr una reducción de la inmunogenicidad por la humanización de los posibles epitopos T, esto con un mínimo de mutaciones en los FRs, específicamente en aquellos segmentos que tienen una estructura de hélice antipática, quedando excluidas aquellas posiciones involucradas con las estructuras canónicas, la zona de vernier o el sitio de reconocimiento del antígeno.
Según el método, se compararon las secuencias de las regiones variables de VH y VL de la inmunoglobulina murina con la humana más homologa y se identificaron los residuos que difieren entre la secuencia murina y la secuencia humana, sólo en los segmentos antipáticos que quedan dentro de la región de los marcos o "frameworks" (FRs) (Kabat (1991), Sequences of proteins of inmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), estos residuos "murinos" fueron los susceptibles de ser mutados por aquellos que se encuentran en la misma posición en la secuencia humana. Las sustituciones se hicieron por las técnicas convencionales de mutagénesis dirigida.
Los residuos que se encuentran en las posiciones de los FRs responsables de las estructuras canónicas o en la zona de Vernier, no pueden ser mutados, porque pudieran afectar la estructura tridimensional del dominio variable del anticuerpo y por tanto afectar su unión al antígeno. Información adicional sobre la influencia de las sustituciones que se hacen en la estructura terciaria, pueden ser obtenidas por modelaje molecular de las regiones variables.
Dado que en el análisis de las mutaciones pueden tenerse en cuenta elementos tales como la presencia de residuos prolina en la hélice antipática, o el hecho de que un determinado residuo murino no aparezca en la misma posición en la secuencia humana más homologa pero sea frecuente en otras inmunoglobulinas humanas, es posible obtener una versión que contenga un máximo de mutaciones, es decir, donde se muten todos los residuos murinos, pero pueden obtenerse otras versiones con diferentes combinaciones de mutaciones. Las mutaciones se realizan por sobrelapamientos de PCRs. Clonaje y expresión del anticuerpo humanizado P3hu y 1E10hu Una vez obtenidas las construcciones genéticas correspondientes al P3hu o al 1 E10hu, por el método descrito anteriormente, estas fueron clonadas en los vectores de expresión, de manera similar a la descrita anteriormente en el caso de la construcción del anticuerpo quimérico, obteniéndose las construcciones genéticas siguientes: P3VKhu-PAG4622 o 1 E10Vkhu-PAG4622 y P3VHhu-PAH4604 y 1 E10VHhu-PAH4604. La transfección de estos genes a las células NS-0 fue exactamente con las mismas condiciones que las descritas anteriormente en el caso del anticuerpo quimérico. Purificación de los anticuerpos recombinantes.
Los anticuerpos recombinantes fueron purificados po cromatografía de afinidad con proteína A (Pharmacia, Upssala, Sweden). Actividad biológica.
La actividad biológica de los anticuerpos recombinantes fue ensayada por su unión a los respectivos antígenos en placas de ELISA. Para las variantes del anticuerpo P3, las placas fueron recubiertas con el gangliósido GM3(NeuGc), se lavaron con tampón Tris-HCI, y se bloquearon para eliminar las uniones inespecíficas con Tris-HCI con albúmina de suero bovina (BSA) al 1 %, incubándose a 37°C una hora. Al cabo de ese tiempo se volvieron a lavar y se les añadió el anticuerpo P3 recombinante purificado, incubando otra hora. Luego después de lavadas se les añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina, y se incubó una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con Tris-HCI y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato dietanolamina. Después de media hora la absorbancia fue medida a 405 ó 492 nm. Para las versiones recombinantes del 1E10, se realizó un ensayo similar, pero recubriendo
las placas de ELISA con AcM murino P3 y lavando las placas con PBS-T (solución salina tamponada de fosfato que contiene 0.05% de Tween 20).
Ejemplos de Realización.
En los siguientes ejemplos todas las enzimas de restricción o modificación utilizadas, así como reactivos y materiales fueron obtenidos de fuentes comerciales a menos que se especifique lo contrario.
Ejemplo 1. Obtención del Anticuerpo Monoclonal Quimérico P3.
El ADNc del AcM P3 se obtiene por la reacción de la enzima transcriptasa reversa a partir del ARN extraído del hibridoma productor de dicho anticuerpo, según se explica en la descripción detallada de la invención. La secuencia de los cebadores específicos utilizados en esta reacción se muestran a continuación
Para VH:
5 ' AGGTCTAGAA(CT)CTCCACACACAGG(AG)(AG)CCAGTGGATAGAC 3'
Para VK: 5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3'
El ADNc de las cadenas VHP3 y VKP3 fueron amplificadas por PCR con la enzima Taq polimerasa y utilizando oligonucleótidos específicos con sitios de restricción ECORV /NHEI, para VH y ECORV/SALI para VK. Los oligonucleótidos específicos usados como cebadores de esta reacción fueron: Para VH:
Oligonucleótido 1 (híbrida por el péptido señal):
5'GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
Oligonucleótido 2 (híbrida por el CH1 ):
5' GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3' Para VK:
Oligonucleótidol (hibrida por el péptido señal):
5' GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3'
Oligonucleótido 2 (hibrida por Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3' El producto de la PCR fue clonado en el vector TA (TA cloning kit, Invitrogen). Doce clones independientes fueron secuenciados por el método del dideóxido utilizando T7 DNA Pol
(Pharmacia). Las secuencias de VHP3 y VKP3 (Figuras 1 y 2) tienen alta relación con el subgrupo IB y V, respectivamente según la clasificación de Kabat.
Posteriormente, la cadena VHP3 fue digerida con las enzimas ECORV y NHEI y la VKP3 con ECORV y SALÍ, y clonadas en los vectores previamente digeridos con las mismas enzimas PAH4604 y PAG4622, para VH y VK respectivamente. Estos vectores fueron
donados por Sherie Morrison (UCLA, California, USA). Los mismos son usados para la expresión de inmunoglobulinas en células superiores. El vector PAH 4604 tiene incluida la región constante humana lgG1 y el PAG 4622 humana Ck (Coloma y colaboradores (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104) Una vez clonadas la regiones VH y VK del P3 en los vectores anteriores, se formaron las construcciones VHP3-PAH4604 y VKP3-PAG4622.
Células NS-0 fueron electroporadas con 10 μg de P3VK-PAG4622, y luego de obtenido el clon productor de cadena ligera kappa humana, este fue transfectado con 10 μg de P3VH- PAH4604, linealizados con enzima Pvul en ambos casos. Los ADNs precipitados con etanol fueron disueltos en 50 μl de PBS. Aproximadamente 107 células fueron colectadas por centrifugación y resuspendidas en 0.5 mi de PBS junto con el ADN en una cubeta de electroporación. Después de 10 minutos en hielo las células fueron sometidas a un pulso de 200 voltios y 960 μFaradios y dejadas en hielo por 10 minutos. Las células se cultivan placas de 96 pocilios con suplementado con suero fetal de ternera al 10%. A los dos y cuatro días se añade medio selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45 μg/mL o histidinol 10mM, respectivamente). Los clones transfectados se hicieron visibles a los 10 días de añadido el medio selectivo. La presencia del anticuerpo humano en las placas fue detectada por ELISA. Las placas fueron recubiertas con un anticuerpo obtenido en chiva que reconoce específicamente cadena gamma humana, los pozos fueron lavadas con PBS-T (solución salina tamponada de fosfato que contiene 0.05% de Tween 20), sobrenadante diluido del medio de cultivo fue añadido a cada pozo de las placas de ELISA y dejado una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se le añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena kappa humana y que está conjugado con peroxidasa de rábano picante (para el clon productor de cadena kappa humana) o un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina (para el clon productor del anticuerpo completo), y se dejó a temperatura ambiente por una hora. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato o-fenilendiamina más peróxido de hidrógeno o dietanolamina, respectivamente. Después de media hora la absorbancia fue medida a 492 o 405 nm, respectivamente.
Ejemplo 2. Obtención de diferentes versiones del Anticuerpo Humanizado P3. Las secuencia de VHP3 y VKP3 (Figuras 1 y 2) fueron comparadas con una base de datos de secuencias humanas, obteniéndose la secuencia humana de mayor homología con el anticuerpo P3 (Figuras 3 y 4). Posteriormente en ambas secuencias (VH y VK) se determinaron las regiones antipáticas o posibles epitopos T. Se determinaron las
mutaciones a realizar para romper o humanizar los potenciales epitopos T dentro de dichas secuencias.
En el caso de la región VHP3 no se introdujeron mutaciones. Como se muestra en la figura
3, se encontraron 2 segmentos antipáticos. Los mismos incluyen el CDR1 , FR2 y parte del CDR2, así como el final del FR3 y el CDR3 completo. No se proponen mutaciones porque las diferencias entre la secuencia murina VHP3 y la humana de mas homología sólo se encuentran en los CDRs, que no se pueden cambiar o involucran aminoácidos de la zona de
Vernier o son posiciones claves en el reconocimiento del antigeno.
Para la cadena VK, se encontraron 2 fragmentos antipáticos, un primer bloque en el FR1 y un segundo bloque que abarca el CDR2 y parte del FR3. Se proponen cambiar los aminoácidos de las posiciones 8,9,10,11y13. En estas posiciones se encuentran los aminoácidos His, Lys, Phe, Met y Thr, que se sustituyen por Pro, Ser, Ser, Leu, y Ala, respectivamente. Estas mutaciones se realizaron por sobrelapamientos de PCRs usando los oligonucleótidos 1 y 2 y 3 y 4 (Kammann y colaboradores (1989) Rapid insertional mutagénesis of DNA by polymerase chaln reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404).
A continuación se describen las secuencias de los oligonucleótidos utilizados. Esta construcción genética se le nombró P3VKhu.
Oligonucleótidos para las mutaciones 8,9,10,11 y 13, de la cadena ligera.
Oligo 1 : 5' ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3'
Oligo 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Oligo 3:
5' GTCTCCTACTGACGCGGAAAGAGAAGAAGGAGACTGGGTCAT 3' Oligo 4:
5'GGGGATATCCACCATGGAG(TA)CACA(GT)(TA)CTCAGGTCTTT(GA)T 3'
Una vez realizadas las mutaciones, estas fueron verificadas por secuencia.
Las cadenas VH quimérica y VK humanizadas fueron clonadas en los vectores PAG 4622 y
PAH4604, formando las construcciones P3VH-PAH4604 y P3VKhu-PAG4622, respectivamente.
El proceso de electro poración y detección de los clones que expresaban el anticuerpo humanizado P3h fue idéntico al descrito para el anticuerpo quimérico.
Ejemplo 3: Actividad Biológica del Anticuerpo Quimérico P3.
La actividad biológica del anticuerpo quimérico fue ensayada por su unión al antígeno mediante la técnica de ELISA. Para el anticuerpo quimérico P3, las placas fueron recubiertas con el gangliósido GM3(NeuGc), se lavaron con tampón Tris-HCI, y se
bloquearon para eliminar las uniones inespecíficas con Tris-HCI con albúmina de suero bovina (BSA) al 1%, incubándose a 37°C una hora. Al cabo de ese tiempo se volvieron a lavar y se les añadió el anticuerpo P3 quimérico purificado, incubándose otra hora. Luego después de lavadas se les añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina, y se incubó una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con Tris-HCI y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato dietanolamina. Después de media hora la absorbancia fue medida a 405 nm.
El anticuerpo T1 se usó en este ensayo como control negativo.
En la Figura 5 se muestra la unión específica del anticuerpo quimérico P3 al antígeno.. Ejemplo 4. Obtención del Anticuerpo Monoclonal Quimérico 1E10.
Las cadenas VH1 E10 y VK1 E10 fueron amplificadas por (PCR) con la enzima Taq polimerasa y utilizando oligonucleótidos específicos con sitios de restricción ECORV /NHEI, para VH y ECORV/SALI para VK. Los oligonucleótidos específicos usados como cebadores fueron: Para VH:
5'GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Para VK:
5OCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3'
El ADNc de las cadenas VH1 E10 y VK1 E10 fue amplificado usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los oligonucleótidos específicos usados como cebadores en esta reacción de amplificación fueron:
Para VH:
Oligonucleótido 1 (hibrida por el péptido señal):
5'GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3' Oligonucleótido 2 (hibrida por el CH1):
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Para VK:
Oligonucleótidol (hibrida por el péptido señal):
5'GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA)3' Oligonucleótido 2 (hibrida por el Ck):
5'AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC3'
El producto de la PCR fue clonado en el vector TA (TA cloning kit de la Invitrogen). Doce clones independientes fueron secuenciados por el método del dideóxido utilizando T7 DNA
Pol (Pharmacia). Las secuencias de VH1E10 y VK1 E10 tienen alta relación con el subgrupo misceláneas y V, respectivamente, según la clasificación de Kabat. (Figuras 6 y 7).
Posteriormente, la cadena VH1E10 fue digerida con las enzimas ECORV y NHEI y la VK1 E10 con Hincll y SALÍ, y clonadas en los vectores previamente digeridos con las enzimas apropiadas PAH4604 y PAG4622, para VH y VK respectivamente. Estos vectores fueron donados por Sherie Morrison (UCLA, California, USA). Los mismos son usados para la expresión de inmunoglobulinas en células superiores. El vector PAH 4604 tiene incluida la región constante humana lgG1 y el PAG 4622 humana Ck (Coloma y colaboradores (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89-104) Una vez clonadas la regiones VH y VK del 1 E10 en los vectores anteriores, se formaron las construcciones VH1E10- PAH4604 y VK1 E 10-PAG4622.
Células NS-0 fueron electroporadas con 10 μg de P3VK-PAG4622 o 1 E10VK-PAG4622, y luego de obtenido el clon productor de cadena ligera kappa humana, este fue transfectado con 10 μg de P3VH-PAH4604 o 1E10VH-PAH4604, linealizados con enzima Pvul en ambos casos. Los ADNs precipitados con etanol fueron disueltos en 50 μl de PBS. Aproximadamente 107 células fueron colectadas por centrifugación y resuspendidas en 0.5 mi de PBS junto con el ADN en una cubeta de electroporación. Después de 10 minutos en hielo las células fueron sometidas a un pulso de 200 volts y 960 μFaradios y dejadas en hielo por 10 minutos. Las células se cultivan placas de 96 pocilios con suplementado con suero fetal de ternera al 10%. A los dos y cuatro días se añade medio selectivo (D'MEM F12 con ácido micofenólico 0,45 μg/mL o histidinol 10mM, respectivamente). Los clones transfectados se hicieron visibles a los 10 días de añadido el medio selectivo. La presencia del anticuerpo humano en las placas fue detectada por ELISA. Las placas fueron recubiertas con un anticuerpo obtenido en chiva que reconoce específicamente cadena gamma humana, los pozos fueron lavadas con PBS-T (solución salina tamponada de fosfato que contiene 0.05% de Tween 20), sobrenadante diluido del medio de cultivo fueron añadidos a cada pozo de las placas de ELISA y dejados una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se le añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena kappa humana y que está conjugado con peroxidasa de rábano picante (para el clon productor de cadena kappa humana) o un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina (para el clon productor del anticuerpo completo), y se dejó a temperatura ambiente por una hora. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato o-fenilendiamina más peróxido de hidrógeno o dietanolamina, respectivamente. Después de media hora la absorbancia fue medida a 492 o 405 nm, respectivamente.
Ejemplo 5. Obtención de diferentes versiones del Anticuerpo Humanizado 1E10.
Las secuencia de VH1 E10 y VK1 E10 (Figuras 6 y 7) fueron comparadas con una base de datos de secuencias humanas, obteniéndose la secuencia humana de mayor homología con el anticuerpo 1 E10 (Figuras 8 y 9). Posteriormente en ambas secuencias (VH y VK) se determinaron las regiones antipáticas o posibles epitopos T. Posteriormente se determinaron las mutaciones a realizar para convertir la secuencia de VH y VK murinas en humanizadas por este método. Señalamos a continuación el máximo de mutaciones posibles, que se pueden hacer.
Hay algunos de los aminoácidos señalados que forman parte de bloques antipáticos donde se incluyen Pro y Lys, (que se sabe que no deben formar parte de hélices antipáticas, pues pueden ser falsos positivos). Esto mismo sucede en el análisis posterior que se hizo con la
VK.
En el caso de la región VH se introdujeron mutaciones en las posiciones 5, que pertenece a un bloque antipático que abarca la mayor parte del FR1 , en las 40 y 42, de un bloque antipático que se encuentra en el FR2 y parte del CDR3, y en la posición 87 del bloque que abarca el FR3. Se sustituyeron los aminoácidos Gln, Arg, Glu y Thr por Val, Ala, Gly y Arg, respectivamente. Estas mutaciones se realizaron por sobrelapamientos de PCRs usando los oligonucleótidos 1 y 2 y 3 y 4, en un primer PCR y después se sobrelapó el resultado de los mismos en otro PCR, usando solo los oligonucleótidos 2 y 4 cuyas secuencias se muestran a continuación (Kammann y colaboradores (1989) Rapid insertional mutagénesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404).
Oligonucleótidos para la mutación 5 de la cadena pesada.
Oligo 1 :
5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3' Oligo 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Oligo 3:
5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3'
Oligo 4: 5'GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
Una vez secuenciada y verificada la anterior mutación a los DNAs que portaban la misma, se les introdujo las mutaciones correspondientes a las posiciones 40 y 42.
A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2 y 3 y 4, descritos para esta mutación.
El sobrelapamiento de los productos de los PCRs se hizo de la misma manera descrita anteriormente. Las mutaciones fueron verificadas por secuencia.
Oligonucleótidos para las mutaciones 40 y 42 de la cadena pesada:
Oligo 1 :
5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3'
Oligo 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3' Oligo 3:
5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3'
Oligo 4:
5'GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
Una vez secuenciada y verificada las anteriores mutaciones a los ADNs que portaban las mismas, se les introdujo la mutación correspondiente a la posición 87.
A continuación se muestran los oligonucleótidos 1 y 2 y 3 y 4, descritos para esta mutación.
El sobrelapamiento de los productos de los PCRs se hizo de la misma manera descrita anteriormente. Las mutaciones fueron verificadas por secuencia.
Oligonucleótidos para la mutación 87 de la cadena pesada: Oligo 1 :
5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3'
Oligo 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Oligo 3: 5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3'
Oligo 4:
5'GGGGATATCCACCATGG(AG)ATG(CG)AGCTG(TG)GT(CA)AT(CG)CTCTT 3'
A esta construcción final se le llama 1 E10VHhu.
En el caso de la cadena pesada, hay aminoácidos diferentes entre la cadena VH1 E10 y la humana más parecida y sin embargo estos no fueron cambiados, porque estas sustituciones involucran aminoácidos de la zona de Vernier o son posiciones claves en el reconocimiento del antígeno.
Para la cadena VK, se realizaron mutaciones en las posiciones 7,8 y 15 sustituyendo Thr,
Thr y Leu por Ser, Pro y Val, respectivamente. Las mutaciones fueron introducidas de la misma manera que en la cadena pesada, a continuación se decriben las secuencias de los oligonucleótidos utilizados. Esta construcción genética se le nombró 1 E10VKhu.
Oligonucleótidos para las mutaciones 7,8 y 15 de la cadena ligera:
Oligo 1 : 5'CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3'
Oligo 2:
5'AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Oligo 3:
5'GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3'
Oligo 4: 5'GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
Una vez realizadas las mutaciones, estas fueron verificadas por secuencia. A esta construcción resultante se le llamó 1 E10VKhu.
Las cadenas VK y VH humanizadas fueron clonadas en los vectores PAG 4622 y PAH4604, formando las construcciones 1 E10VHhu-PAH4604 y 1 E10VKhu-PAG4622 respectivamente. El proceso de electroporación y detección de los clones que expresaban el anticuerpo humanizado 1 E10h fue idéntico al descrito para el anticuerpo quimérico.
Ejemplo 6: Actividad Biológica del Anticuerpo Quimérico 1E10.
La actividad biológica del anticuerpo 1E10 quimérico fue ensayada por ELISA. Las placas fueron recubiertas con el AcM murino P3, se lavaron con PBS-T (solución salina tamponada de fosfato que contiene 0.05% de Tween 20), sobrenadante diluido del medio de cultivo fue añadido a cada pozo de las placas de ELISA y se incubó una hora a 37°C. Luego después de lavadas se les añadió un anticuerpo de chiva que reconoce cadena gamma humana y que está conjugado con fosfatasa alcalina, y se incubó una hora a 37°C. Los pozos fueron lavados con PBS-T y se les añadió la solución tampón que contiene el sustrato dietanolamina. Después de media hora la absorbancia fue medida a 405 nm. Los resultados se muestran en la Figura 10.
El AcM C5 quimérico se usó como control negativo
Breve descripción de las figuras
Figura 1 : Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducidas de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo P3. Los aminoácidos están numerados de acuerdo a Kabat y colaboradores (Kabat y colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), y aparecen sobre el codón que los codifica. Los CDRs están señalados con líneas discontinuas.
Figura 2: Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducida de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo P3. Los aminoácidos están numerados de acuerdo a Kabat y colaboradores (Kabat y colaboradores (1991), Sequences of proteins of ¡mmunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), y aparecen sobre el codón que los codifica. Los CDRs están señalados con líneas discontinuas.
Figura 3: Alineación de la secuencia aminoacídica de VHP3 con la humana más homologa. Los segmentos antipáticos están subrayados y los CDRs en negritas cursivas.
Figura 4: Alineación de la secuencia aminoacídica de VKP3 con la humana más homologa. Los segmentos antipáticos están subrayados y los CDRs en negritas cursivas. Figura 5: Reconocimiento específico del GM3(NeuGc) por el anticuerpo P3 quimérico. Se enfrentaron diferentes concentraciones de los anticuerpos quiméricos P3 y T1 (irrelevante) a placas de ELISA recubiertas con GM3(NeuGc) y GM3(NeuAc), y se midió la unión específica.
Figura 6: Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducida de las región variable de la cadena pesada del anticuerpo 1 E10. Los aminoácidos están numerados de acuerdo a Kabat y colaboradores (Kabat y colaboradores (1991 ), Sequences of proteins of immunological interest, Fifth Edition, National Institute of Health), y aparecen sobre el codón que los codifica. Los CDRs están señalados con líneas discontinuas.
Figura 7: Secuencias nucleotídica y aminoacídica deducida de las región variable de la cadena ligera del anticuerpo 1 E10. Los aminoácidos están numerados de acuerdo a Kabat y colaboradores (Kabat y colaboradores (1991), Sequences of proteins of immunological ¡nterest, Fifth Edition, National Institute of Health), y aparecen sobre el codón que los codifica. Los CDRs están señalados con líneas discontinuas.
Figura 8: Alineación de la secuencia aminoacídica de VH1 E10 con la humana más homologa. Los segmentos antipáticos están subrayados y los CDRs en negritas cursivas. Figura 9: Alineación de la secuencia aminoacídica de VK1 E10 con la humana más homologa. Los segmentos antipáticos están subrayados y los CDRs en negritas cursivas. Figura 10: Reconocimiento específico del AcM murino P3 por el anticuerpo 1 E10 quimérico. Se enfrentaron diferentes concentraciones de los anticuerpos quiméricos 1 E10 y C5 (irrelevante) a placas de ELISA recubiertas con AcM P3 y AcM A3, y se midió la unión específica.
Claims
1.- Un anticuerpo monoclonal quimérico, derivado del anticuerpo monoclonal murino AcM P3 que reconoce gangliosidos N-glicolilados y que es producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 94113026, caracterizado porque los dominios hipervariables de sus cadenas pesada y ligera comprenden las siguientes secuencias: CADENA PESADA CDR1 : RYSVH
CDR2: MIWGGGSTDYNSALKS CDR3: SGVREGRAQAWFAY CADENA LIGERA
CDR1 : KASQDVSTAVA CDR2: SASYRYT CDR3: QQHYSTPWT
2.- Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1 , caracterizado porque las regiones de los marcos (FRs) de sus cadenas pesada y ligera comprenden las siguientes secuencias:
CADENA PESADA
FR1 : QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLS
FR2: WVRQPPGKGLEWLG FR3: RLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCAR
FR4: WGQGTLV
CADENA LIGERA
FR1 : DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC
FR2: WYQQKPGQSPKLLIY FR3: GVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYC
FR4: FGGGTKL
3.- Un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque para su humanización y preservación de su afinidad por el antígeno, incluye al menos una de las siguientes sustituciones:
CADENA LIGERA:
Posición 8: His por Pro
Posición 9: Lys por Ser
Posición 10: Phe por Ser Posición 11 : Met por Leu
Posición 13: Thr por Ala
4.- Un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones de la 1 a la 3, caracterizado porque la región constante de su cadena pesada comprende la secuencia de amino ácidos de la región constante de la cadena pesada gamma-1 y la región constante de su cadena ligera comprende la secuencia de amino ácidos de la región constante de la cadena capa, ambas provenientes de inmunoglobulinas humanas.
5.- Una línea celular caracterizada porque produce cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 1 a la 4.
6.- Una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas caracterizada porque comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 1 a la 4.
7.- Una composición farmacéutica para la localización e identificación "in vivo" de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas caracterizada porque comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 1 a la 4.
8.- Uso del anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas.
9.- Un anticuerpo monoclonal quimérico derivado del anticuerpo monoclonal antiidiotipo murino AcM 1 E10 que reconoce al AcM murino P3 y que es producido por el hibridoma con número de depósito ECACC 97112901 , caracterizado porque los dominios hipervariables de sus cadenas pesada y ligera comprenden las siguientes secuencias:
CADENA PESADA
CDR1 : SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3: EDYYDNSYYFDY
CADENA LIGERA
CDR1 : RASQDISNYLN
CDR2: YTSRLHSG
CDR3: QQGNTLPWT
10.- Un anticuerpo monoclonal según la reivindicación 9, caracterizado porque las regiones de los marcos (FRs) de sus cadenas pesada y ligera comprenden las siguientes secuencias: CADENA PESADA
FR1 : QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV CADENA LIGERA
FR1 : DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY
FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK
11.- Un anticuerpo monoclonal según las reivindicaciones 9 y 10, caracterizado porque para su humanización y preservación de su afinidad por el antígeno, incluye al menos una de las siguientes sustituciones:
CADENA LIGERA:
Posición 7: Thr por Ser
Posición 8: Thr por Pro Posición 15: Leu por Val
CADENA PESADA
Posición 5: Gln por Val
Posición 40: Arg por Ala
Posición 42: Glu por Gly Posición 87: Thr por Arg
12.- Un anticuerpo monoclonal según reivindicaciones de la 9 a la 11 , caracterizado porque la región constante de su cadena pesada comprende la secuencia de amino ácidos de la región constante de la cadena pesada gamma-1 y la región constante de su cadena ligera comprende la secuencia de amino ácidos de la región constante de la cadena capa, ambas provenientes de inmunoglobulinas humanas.
13.- Una línea celular caracterizada porque produce cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 9 a la 12.
14.- Una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas caracterizada porque comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 9 a la 12.
15.- Una composición farmacéutica para la localización e identificación "in vivo" de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas caracterizada porque comprende cualquiera de los anticuerpos monoclonales de las reivindicaciones de la 9 a la 12.
16.- Uso del anticuerpo monoclonal de las reivindicaciones de la 9 a la 12 para la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de tumores malignos de mama y melanomas, sus metástasis y recidivas.
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