UA75393C2 - Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it - Google Patents

Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it Download PDF

Info

Publication number
UA75393C2
UA75393C2 UA2003108989A UA2003108989A UA75393C2 UA 75393 C2 UA75393 C2 UA 75393C2 UA 2003108989 A UA2003108989 A UA 2003108989A UA 2003108989 A UA2003108989 A UA 2003108989A UA 75393 C2 UA75393 C2 UA 75393C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
human
monoclonal antibody
antibodies
chain
mab
Prior art date
Application number
UA2003108989A
Other languages
English (en)
Inventor
De Acosta Del Rio Christ Mateo
Navarro Lurdes Tatiana Roke
Original Assignee
Centro Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro Inmunologia Molecular filed Critical Centro Inmunologia Molecular
Publication of UA75393C2 publication Critical patent/UA75393C2/uk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

Опис винаходу
Цей винахід має відношення до біотехнології, зокрема, до нових рекомбінантних антитіл, які одержують 2 шляхом генної інженерії, зокрема, до химерних та гуманізованих антитіл, які одержують із мишачого моноклонального антитіла РЗ (МАБ РЗ) та його антиіїдіотипового мишачого моноклонального антитіла 1Е10 (МАБаї 1Е10).
Зокрема, цей винахід має відношення до антитіл, які зв'язуються з гангліоозидами, що включають
М-гліколільовану сіалову кислоту, але не з адетильованими формами гангліозидів, а також не з нейтральними 70 гліколіпідами. Гангліозиди, що включають М-гліколільовану сіалову кислоту, є антигенами, які широко експресуються раковими пухлинами молочної залози та меланомами. З іншого боку, протипухлинний ефект
МАваї ІЕ 10 демонстрували також на експериментальних моделях.
Цей винахід має також відношення до фармацевтичних композицій, що включають рекомбінантні антитіла, опис яких наводили раніше, придатних для діагностування та лікування раку, зокрема, раку молочної залози та 79 меланом.
Гангліозиди є глікосфінголіпідами, що включають сіалову кислоту і входять до складу плазматичної мембрани клітин хребетних |Стултс (5І(Ш5) та інші (1989): (СіІусозрПіподоїїріав: вігисійге, бБіоіодісаІ! зоцйгсе апа ргорегіез, Меїйодз Епгутоіоду, 179:167-2141. У літературі повідомлялось, що деякі з цих молекул є антигенами, асоційованими з пухлинами або пухлинними маркерами |Хакоморі (Накотогі) та інші (1991): Роззіріе тупскйопе ої фШштог азвосіаієй сагропуадгайе апіїдепв, Сип. Оріп. Іттипої., 3:646-653|. З цього приводу застосування антигангліозидних антитіл описують, як придатне у діагностиці та терапії раку (Хафтон (Ноцпдюп) та інші (1985): Мойве топосіопа! апіроду ІдсСЗ апіроду адефесіпд ОЗ дападіовіде (о рпазе | іа! іп райепів м/ййп о таїїдпапі теіапота, РМАБ БА, 82:1242-1246; Жанг (2папо) та інші (1997): ЗеїЇесіоп ої сагропудгаїе їштог апідепз аз їагдеїв бог о іттипе оацаскК ивіпд іттипойівіоспетівігу. 1. Босив оп с дапдіовідев, Іпі. 9. Сапсег, 73:42-49). о
Сіаловими кислотами, що частіше експресуються тваринами, є М-ацетилнейрамінова (МецАс) та
М-гліколіллоейрамінова (Мецбс) кислоти ІКорфілд (Сопієеій) та інші (1982): Оссиггепсе ої звіайїйс асіадз, Сеї).
ВіоІ. Мопоадг., 10:5-50). МенСс не експресується нормальними людськими та курячими тканинами взагалі, однак вона є широко розповсюдженою серед інших хребетних |Ліден (І еедеп) та Ю (ми) (1976): Спетівігу апа апаїузіз о ої віайіс асіа. У: Віоіодіса! Коїе ої Зіаїйс Асід. Роземберг А. (Козетрега А.) та Шенгтранд Кл. (ЗПпепдігпа Фу
СІ) (Редактори) Ріепит Ргезз, Мем МогК, 1-48; Каваї (Каугаї) та інші (1991): Оцапійаєйме аейегтіпайоп ої
М-дІусоїуІпеигатіпіс асій ехргезвіоп іп питап сапсегоив (Їізвцез апа аміап М Уутрпота сеїЇ Ппез аз а Штог о азвосіаїей зіайс асій Бу дав спготайдгарпу-тазз зресіготепігу, Сапсег Кевзеагсі, 51:1242-1246)Ї. Існують, Чо однак, повідомлення, які показують, що анти-Мецсс антитіла розпізнають деякі людські пухлини та лінії 3о пухлинних клітин ІХігаші (Нідазпі) та інші (1988): ЮОеїесіоп ої дападіовідевз аз М-діусоїуІпешгатіпіс асій в зресіїс (Шптог-аззосіаїей Напдапиїсіи-Юеїспег апідеп іп питап гейпоріазіота сеїЇв, дрп. У. Сапсег Кезв., 79:952-956; Фукуі (РикКиї) та інші (1989): ЮОе(есіоп ої діусоргоївіпв аз Шютог аззосіаФей Напдапшіи-Оеїспег апіїдеп іп питап давігіс сапсег сеїЇ пе, МОСС4, Віоспет. Віорпуз. Кевз. Соттип., 160: 1149-1154). Підвищені « рівні ЗМ3З (Меисс) гангліозидів були виявлені у ракових пухлинах людської молочної залози (Маркіна (Магаціпа) З 740 та інші (1996): Сападііозідез ехргеззед іп питап Бгеавзі сапсег, Сапсег Кезеагсі, 1996; 56: 5165-5171). Такий с результат робить привабливим застосування цієї молекули як мішені для І лікування раку.
Із» Моноклональне антитіло (МАБ) РЗ продукується лінією клітин, депонованою у ЕСАСС (Європейська колекція культивованих клітин тварин) під Мо94113026 (європейський патент ЕР 0657471 В1). Це мишаче моноклональне антитіло з ізотипом ЯМ, яке одержали шляхом злиття мишачих спленоцитів мишей лінії ВАЇ В/с, імунізованих дліпосомами, що включають ЗМЗ3 (МеийСс) та правцевий анатоксин, із клітинами лінії РЗ-Х63-А98.653, які і представляють собою лінію клітин мишачої мієломи. Це МАБ РЗ активно реагує з гангліозидами, що містять 4! М-гліколільовану сіалову кислоту, і не реагують ні з адметильованими формами гангліозидів, ні з нейтральними гліколіпідами. Дані імуноцитохімічних та імуногістохімічних досліджень, проведених із лініями клітин та о тканинами злоякісних та неопластичних пухлин, продемонстрували, що МАБ РЗ розпізнає рак молочної залози (Те) 20 ІВаскес (Магаце7) та інші (19953): Сепегайоп ої а тигіпе топосіопаі! апіроду зресіс ог
М-діІусоїуІпеигатіпіс асіа-сопіаіпіпд дападійовідчез їйаї або гесодпігез з!ЦМаївй діусоїїрід5, НуБбгідота, с» 14:551-556) та меланому.
МАБ РЗ індукує антиідіотипову імунну відповідь (АБ2) у мишей лінії ВАГ В/с (сингенна модель) навіть без ад'юванту та білка-носія |ВЗаскес (Магаце) та інші (1998): Зупдепеїс апіі-ідіогуріс топосіопа! апііїродіев 29 ап апіі-Меийс-сопіаіїпіпд дапдіювіде топосіопа! апіїроду, Нубгідота, 17:527-534)| Роль електронегативних
ГФ) груп, сіалової кислоти (для гангліозидів) та 5О 3 (для сульфатидів), у розпізнавальних властивостях цього 7 антитіла була встановлена шляхом імунохімічного аналізу Морено (Могепо) та інші (1998): Оеїїпеанйоп ої еріОоре гесодпілгей Бу ап о оапіроду овресіїйс бог М-діусіуІпейгатіпіс асід-сопіаіпіпд / дападііовідев,
Сіусоріоіоду, 8:695-705). 60 Антиідіотипове МАБ 1Е10 (МАБаї 1Е10) підтипу І д31 одержали від мишей лінії ВАЇ В/с, імунізованих МАБ РЗ, сполученим із КІН (гемоціанін лімфи равлика) |патент США Моб,063,379, лінія клітини, депонована у ЕСАСС під
Мо97112901). МАБаї 1Е10 розпізнає конкретно МАБ РЗ ії не зв'язує інші (ДМ антигангліозидні антитіла. Більше того, МАваї 1Е10 пригнічує специфічне зв'язування МАБ РЗ з СМ3З (Меибс) і з лінією клітин МОА-МВ-435, яку одержали з ракової пухлини протоки молочної залози (позитивна на зв'язування МАБ РЗ). МАваї 1Е10 індукує бо активну імунну відповідь (антитіла АБЗ) у разі імунізації мишей сингенних або алогенних моделей; ці антитіла
АрЗ не демонструють тієї саме специфічності, що МАБ РЗ, навіть у тому разі, коли вони несуть набори ідіотипових детермінант, подібні до тих, що переносяться антитілом АБ1 |Васкес (Магдаце) та інші (1998):
Зупдепеїс апіїі-ідіоїуріс топосіопа! апіродіев (о ап апіі-МеиОСс-сопіаіпіпд дападівіде топосіопа! апіїрсаду,
Нубгідота, 17:527-534). МАбБаї 1Е10 індукує сильний протипухлинний ефект як у сингенних, так і у алогенних мишей. Ріст лінії клітин ЕЗІЇ карциноми молочної залози був значно уповільнений повторною дозою МАбаї 1Е10, сполученого з КІН, у ад'юванті Фрейнда у разі імунізації мишей лінії ВА! В/с. Крім того, після імунізації зменшилась кількість спонтанних легеневих метастаз. Інтравенозне введення МАбаї 1Е10 мишам лінії С57ВІ /6 через 10-14 днів після інтравенозного введення останнім клітин меланоми В16, викликало різке зменшення 7/0 Кількості легеневих метастаз, порівняно з мишами, які одержували сторонній Ід. Ці результати дозволяють зробити припущення про те, що відбувається запуск більш ніж одного механізму протипухлинного ефекту
ІВаскес (Магдцег) та інші (2000): Апійштог ргорепіев ої ап апії-ідіогуріс топосіопа! апіроду іп геїакоп
То М-діусоїуІ-сопіаіпіпд дападіовідев, Опсої. Кер., 7:751-756, 2000).
Незважаючи на те, що технологія моноклональних антитіл розробляється впродовж останніх 15 років |Келер 7/5 (Коепіег) та Мілстайн (Міївівіїп) (1975): Сопіїпиоиз сиМйигез ої їТивзей сеїв зесгейпоу апіроду ої ргедеїпейа зресіїісіу, Маїшцге, 256: 495-497), а також на те, що моноклональні антитіла все ще залишаються дуже корисними у діагностиці та дослідженнях, вони не продемонстрували своєї терапевтичної ефективності на людях. Це обумовлюється, головним чином, їх нетривалим часом напівжиття у крові, тим, що мишачі ефекторні функції виявились непридатними для людської імунної системи, а також людською імунною відповіддю, що полягає у продукуванні антимишачих антитіл.
Окрім того, генно-інженерна технологія революціонізувала потенціал придатності моноклональних антитіл, оскільки завдяки маніпулюванню імуноглобуліновими генами можна одержати модифіковані антитіла послабленої антигенності, а також поліпшити їх ефекторні функції для лікування або діагностування певних патологій. Головна мета способів послаблення імуногенності імуноглобулінів полягає у зменшені різниць між сч
Дб Мишачим антитілом та людським імуноглобуліном, без зміни антигенної розпізнавальної специфічності |Моррісон (Могтізоп) та УЇї (ОЇ) (1989): Сепеїйіса|у епдіпеегей апіроду тоіесціев, Аду. Іттипої., 44:65-921. і)
Нещодавно було розроблено декілька способів гуманізації мишачих або щурячих антитіл і, таким чином, послаблення ксеногенної імунної відповіді проти чужорідних білків, у разі їх введення людям. Одним із перших варіантів підходу до послаблення антигенних властивостей були химерні антитіла, у яких варіабельні домени с зо Мишачого білка вставляють до константних доменів людських молекул, що демонструють таку саме специфічність, але послаблену імуногенність, порівняно з їх мишачими двійниками, причому химерні антитіла Ме зберігають людські ефекторні функції (Моррісон (Могтізоп) та інші (1984): Спітегіс питап апіїроду тоїіесціезв: с
Моизе апіідепріпаїпд дотаїпе м йй питап сопвіапі гедіоп дотаїпз, РМА5 ОА, 81:6851-6855). Навіть у тому разі, коли химерні антитіла мають таку саме специфічність, що і мишачі двійники, на варіабельні ділянки гризунів о
Зв Часто спостерігається імунна відповідь. ї-
З метою додаткового послаблення імуногенності химерних антитіл, до людських остовних ділянок трансплантували лише гіперваріабельні ділянки моноклонального антитіла гризунів і ця гібридна варіабельна ділянка експресувалась разом із людськими константними ділянками Джонс (допевз) та інші (1986): Керіасіпд Те сотріетепіагу-дегепгтіпіпу гедіопе іп а питап апіїроду м/йй (Шозе їот а тоизе, Маїцге 321:522-524: Верхейєн « (Метоеуеп) та інші (1988): Кевзпаріпу ПпПитап апіїродіев: огайпо ап апШузогуте асімйу, Зсіепсе 239, с 1534-1536). Цей варіант підходу, однак, має декілька недоліків: головний з них полягає у тому, що одержане антитіло втрачає афінність, порівняно з мишачим двійником, унаслідок чого деякі залишки основних ділянок ;» необхідно відновлювати відповідниками у мишачому імуноглобуліні (Річман (Кіеісптапп) та інші (1988):
Кезпаріпд питап апііродіез їТог (Шегару, Майте, 332: 323-327; Куіїн (Оцееп) та інші (1989): А ПпПитапігей апчбоду (Шаг ріпа (о (Ше іпіепеиКіп 2 гесеріоб РМАЗ ОЗА, 86:10029-10033; Темпест (Тетрев5|) та інші -І (1991): Кезпаріпд а питап топосіопа! апіроду (о іппірії питап гезрігаїогу зупсуйа! мігив іптесіоп іп мімо,
ВіоїесппоЇоду, 9:266-272). На додаток до цього, у антитіл із трансплантованими гіперваріабельними ділянками о часто спостерігається стійка імуногенність. 2) Матео (Маїео) та співробітники (патент США Мо57121201| навели опис | способу послаблення імуногенності 5р Мишачих антитіл. За цим способом модифікації обмежуються варіабельними доменами і, конкретно, мишачими і, остовними ділянками химерних антитіл. Більше того, заміни здійснюються лише на тих частинах остовних 4) ділянок, які мають амфіпатичні послідовності, і, таким чином, є потенційними антигенними детермінантами, що розпізнаються Т-клітинами. Згаданий спосіб включає розважливу заміну декількох амінокислотних залишків, розміщених у потенційно імуногенних антигенних детермінантах, відповідними залишками найгомологічнішої людської послідовності; подібній заміні не підлягають амінокислоти, які, головним чином, несуть відповідальність за канонічні структури, а також залишки, що знаходяться у безпосередній близькості до
Ф) гіперваріабельних ділянок або у зоні Верн'є. ка Одержане антитіло зберігає свою антиген-зв'язувальну специфічність і є менш імуногенним, аніж його мишачий або химерний попередник (Матео (Маїео) та інші (2000): Кетома! ої Т сеїЇ еріюрез їот депеїйісаї у бо епдіпеегей апцродіез: Ргодисноп ої тойШей іттиподіорийп5 м/п о гедисей іттиподепісйу, НубБбгідота 19:463-71|; ці властивості підвищують їх терапевтичну придатність. За цим способом необхідно здійснювати лише нечисленні мутації та вдаватись, звичайно, до меншого обсягу генетичних маніпуляцій.
Цей винахід має відношення до рекомбінантних антитіл, одержаних засобами генної інженерії. Зокрема, цей винахід має відношення до химерного антитіла, що одержують із мишачого моноклонального антитіла РЗ, яке 65 продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під Мо94113026. МАБ РЗ розпізнає антиген, що експресується клітинами пухлини молочної залози та меланомами. МАБ РЗ відрізняється такими послідовностями гіперваріабельних ділянок (СОКз) важкого та легкого ланцюгів:
Важкий ланцюг: сок: ЕУ5УН
СсОок2: МІММОООТОММЗАЇ К5
СОКЗ: БОМКЕСКАОАУУБАХ
Легкий ланцюг:
СОМ: КАБООМЗТАМА
СОК2: ЗАБУКМТ СОКУ: ООНУЗТРУУТ 70 За варіантом, якому віддається перевага, послідовності остовних ділянок важкого та легкого ланцюга є такими:
Важкий ланцюг:
ЕКТ: ОМО КЕБОРОЇ МАРБЗОЗІ БІТСТУБОЕ5І 5
ЕК2: МУМКОРРОКОГ ЕМ о
ЕКЗ: АГ ЗІЗКОМЗКБОМРІ КМУ ОТООТАМУМСАК
ЕК4: МОСТІ М
Легкий ланцюг:
ЕК: ОІММТОЗНКЕМЗТЗУОКУЗІТС
ЕК2: МУСОКРООЗБРКО ЛУ
ЕКЗ: СМРОКЕТОЗОБОТОЕТЕТІЗЗМОАЕОІ АМУУС
ЕК4ЯА: ЕСООСТКІ.
За варіантом, якому віддається перевага, химерне антитіло за цим винаходом включає константну ділянку важкого ланцюга людського ІдС1 і константну ділянку легкого ланцюга людського СК. За іншим аспектом, цей винахід має відношення до гуманізованого антитіла, яке одержують із МАБ РЗ, що продукується лінією клітин сч гібридоми, депонованою у ЕСАСС під Мо94113026, що відрізняється тим, що включає константну ділянку важкого ланцюга людського ІдО11 та константну ділянку легкого ланцюга людського СК і остовні ділянки легкого ланцюга і) включають будь-яку з наведених далі точкових мутацій:
Легкий ланцюг:
Положення 8: Нів на Рго с зо Положення 9: І уз на Зег
Положення 10: РНе на Зег Ме
Положення 11: Меї на І еи с
Положення 13: Тпиг на Аа
За іншим аспектом, цей винахід має відношення до химерного антитіла, яке одержують із мишачого Щео,
З5 Моноклонального антитіла 1Е1О0, що продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під ї-
Мо97112901, і яке є антиідіотиповим антитілом, що розпізнає МАБ РЗ. МАбБраї 1Е10 відрізняється такими послідовностями гіперваріабельних ділянок (СОК) важкого та легкого ланцюгів:
Важкий Ланцюг: сок: ЗУрІМ «
СОоК2г: УЛЕРООСЗТКУМЕКЕКО в с СОКЗ: ЕОММОМЗУМЕрУ
Й Легкий ланцюг: и? СОМ: КАБЗОВІЗМУІ М сОок2: МТЗ НЗОо
СОокКЗ: ООСМТ РУТ -І За варіантом, якому віддається перевага, послідовності остовних ділянок важкого та легкого ланцюга є такими: о Важкий ланцюг: оо ЕІ: ОМОГ ОО5ОАЕЇ МКРОАЗУКІ ЗСКАЗОУТЕТ
ЕК2: МУКОКРЕОСІ ЕУЛО і, ЕКЗ: КАТТТОКЗЗЗТАУМОЇ ЗКІ ТЗЕОЗАМУЕСАК сю ЕКа: МувОостТт ТМ
Легкий ланцюг:
ЕК: СІЮОМТОТТ55І БАБІ СОМКМТІЗС 5Б ЕК2: МУООКРОСТУКІ ГУ
ЕКЗ: МРЗКЕЗОБОЗОТОМБІ ТІЗМ ЕОЕВІАТУЕС (Ф, ЕКЯ: ЕСОСТКІ ЕК ка За варіантом, якому віддається перевага, химерне антитіло за цим винаходом включає константну ділянку важкого ланцюга людського ІдС1 і константну ділянку легкого ланцюга людського СК. За іншим аспектом, цей во винахід має відношення до гуманізованого антитіла, яке одержують з МАБ 1Е10, що продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під Мо97112901, що відрізняється тим, що включає константну ділянку важкого ланцюга людського ІДС1 та константну ділянку легкого ланцюга людського СК і остовні ділянки важкого та легкого ланцюга включають будь-яку з наведених далі точкових мутацій:
Легкий ланцюг: 65 Положення 7: Тиг на бег
Положення 8: ТНиг на Рго
Положення 15: І еи на Маї
Важкий ланцюг:
Положення 5: біп на Ма!
Положення 40: Аго на Аа
Положення 42: Сім на Су
Положення 87 (83 за нумерацією Кабата (Кабай): Тиг на Ага
За іншим аспектом, цей винахід має відношення до ліній клітин, що експресують химерні та гуманізовані антитіла, опис яких наведено; на додаток до цього, винахід має відношення до фармацевтичних композицій, що 7/0 Містять антитіла, опис яких наведено.
За варіантом, якому віддається перевага, цей винахід має відношення до фармацевтичних композицій для лікування пухлин молочної залози, легень, шлунково-кишкової системи, сечово-статевої системи, меланом, сарком та пухлин нейроектодермічного походження, їхніх метастаз та рецидивів, що містять антитіла, опис яких наведено, та відповідний наповнювач.
За іншим варіантом втілення цього винаходу фармацевтичні композиції можуть застосовуватись для локалізації та діагнозу іп мімо пухлин молочної залози, легень, шлунково-кишкової системи, сечово-статевої системи, меланом, сарком та пухлин нейроектодермічного походження, їхніх метастаз та рецидивів, і включати антитіла, опис яких наведено.
Синтез кДНК та ампліфікація засобами полімеразної ланцюгової реакції (РСК) варіабельної ділянки МАБ РЗ го та МАБаї ЛЕТО
Цитоплазматичну РНК екстрагували із приблизно 105 клітин гібридоми РЗ (мишаче ДМ Маб, що розпізнає
ОМ3З М-гліколільований гангліозид) або 1Е10 (антиідіотипове анти-РЗ антитіло). РНК екстрагували за допомогою реактиву ТВІ7ОЇ (фірма СІВСО ВР, Сгапа Ізіапа, Нью-Йорк) за інструкціями виробника.
Реакцію синтезу кКДНК здійснювали шляхом змішування мкг РНК, 25пмоль МА (комплементарного до Га
Константної ділянки мишачого (ЯМ для МНРЗ та константної ділянки мишачого ІДС! для МН 1Е10) або УК (комплементарного до константної мишачої каппа-ділянки для обох антитіл) 2,5ММ розчину о дезоксинуклеозид-5'-трифосфату (аМТР), 5О0ММ розчину трис-НСІ (рН 7,5), 75мМ розчину КСІ, 10ММ розчину дитіотреїтолу (ОТ), 8ММ розчину МоСіо та 15 одиниць інгібітору РНКази у 5Омкл реакційної суміші. Суміш нагрівали при температурі 709 впродовж 10хв. і повільно охолоджували до температури 3720. Після цього со додавали 100 одиниць РНК-залежної ДНК-полімерази, і інкубування продовжували при температурі 42 С впродовж год. Ф
Варіабельні ділянки МК та МН кДНК ампліфікували засобами полімеразної ланцюгової реакції. Стисло, бмкл. со
КДНК МН або УК змішували з 25пмоль специфічного праймера, 2,5мММ розчином аМТР, 5мкл складових буфера ю 10Х Тад-полімерази та 1 одиницею цього ферменту. Зразки піддавали 25 термічним циклам при температурі 949С, ЗОс.; 502, ЗОс.; 722, хв. і, нарешті, інкубуванню впродовж 5хв. при температурі 7296. -
Клонування та секвенування ампліфікованої каНК
Продукти РСК МН та МК (РЗ та 1Е10, відповідно) клонували до вектора ТА (набір для клонування Та Сіопіпад
КІ, фірма Рготеда, США). Одержані клони секвенували дидезокси методом встановлення первинної структури «
ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (набір для секвенування Т7 зедцепсіпа Кії, фірма Ріпагтасіа, Швеція).
Конструювання химерних генів З с Гени варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів (МН та МК) вирізували з векторів ТА шляхом "» ферментативного розщеплення і клонували до відповідних векторів експресії (Колома (СоІота) та інші (1992): " Моме! месіоге Тог (Ше ехргеззіоп ої апіроду тоіесціез ивіпд магіабіе гедіопе депегаївд ру роїутегазе сНаїп геасііоп, 9. Іттипої. Мейй., 152: 89-104|.
Гени МН вирізували з вектора ТА шляхом ферментативного розщеплення за допомогою ЕсокМ та Мнеї і і клонували до вектора експресії (РАН 4604), що включав варіабельну ділянку людського ІдС1 і ген стійкості до с гістидинолу. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як РЗМН-РАН4АФ6О4 та 1ЛЕТОУМН-РАНЯАбОЯ4.
Гени МК вирізували з вектора ТА шляхом ферментативного розщеплення за допомогою ЕсокМ та заї і о клонували до вектора експресії (РАС4622). Цей вектор включав ген стійкості до мікофенолової кислоти та со 250 людську константну каппа-ділянку. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як РЗМК-РАС4622 та 1ЕТЛОМК-РАС4622. сю Експресія химерних антитіл, одержаних із МАБ РЗ та МАБаї 1Е10
Клітини М5-0 піддавали електропорації 7Омкг РЗМК-РАС4622 або 1Е1ОМУМК-РАС4622К; клони, що експресували людські легкі каппа-ланцюги, трансфікували 10мкг РУМН-РАН4б604 або ТЛЕЛОУН-РАНАбОЯ.
ДНК лінеаризували шляхом розщеплення ферментом Руці, осаджували етанолом та розчиняли у 5Омкл
Ф! забуференого фосфатом фізіологічного розчину. Приблизно 10" клітин збирали шляхом центрифугування і юю ресуспендували у 0О,бмл забуференого фосфатом фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 1Охв. на льоду клітини піддавались імпульсу електричного току (2008, 9бОмкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 10хв. Після цього клітини розподіляли до 96-лункового планшета з 60 модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла Е12 плюс 1095 фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла Е12 з мікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або гіслидинолом (10ММ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним оком через 14 днів.
Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали бо шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ЕПІЗА). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або антилюдськими до (специфічними для гамма-ланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами.
Після промивання РВЗ-Т (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,0595 Твін-20) розбавлене Культуральне середовище лунок, що містять трансофектанти, додавали до кожної лунки титраційного мікропланшета на год при температурі 372. Лунки промивали РВ5-Т, додавали козячий антилюдський легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський ІдС, кон'югований із лужною фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при температурі 37 «С впродовж год. Лунки промивали РВ5-Ї і додавали субстратний буфер, що містив о-фенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, 70 Відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492нм або 405нм, відповідно.
Конструювання гуманізованих антитіл РЗпи та 1ЛЕТОпи шляхом гуманізації антигенних детермінант Т-клітин.
Прогнозування антигенних детермінант Т-клітин
Послідовності варіабельних ділянок РЗ та 1Е10 аналізували за допомогою алгоритму АМРНІ (Маргаліт (Магодайю та інші (1987): Ргедісйоп ої іттиподотіпапі еїІрег Т сеїЇ апіїдепіс вйез їїот (Пе ргітагу 75 ведцепсе, у). іттипої., 138:2213-2229)|. За його допомогою розшукують спіральні амфілатичні сегменти з 7-11 амінокислотними залишками, які асоціюються з Т-імуногенністю. Спіральні гідрофобні сегменти прогнозували також за допомогою програми ЗОННА ГЕлліот (ЄП) та інші (1987). Ап Пуроїпевзіз оп (Пе бБіпаїпд ої ап атрпіраїйіс, аїрпа Пеїїсаї зедиепсе іп Її о (Ше адезоїоре ої сіазв || апідеп, У. Іттипої., 138: 2449-2952).
Обидва алгоритми прогнозували, які сегменти з послідовностей варіабельних ділянок антитіл РЗ та 1Е10 могли б бути презентовані Т-клітинам-помічникам у контексті молекул ІЇ класу головного комплексу гістосумісності.
Аналіз гомології з людськими імуноглобулінами
Амінокислотні послідовності мишачих варіабельних ділянок порівнювали з імуноглобуліновими послідовностями, включеними до бази даних СепеВапк та ЕМВІ (доступна у Інтернеті). Для кожного антитіла було визначено найгомологічнішу послідовність людської варіабельної ділянки. Для пошуку гомологічних Га послідовностей було використано програмне забезпечення РО-ТУО НІВЮ РКОЗІЗ 06-00 (Нігасні).
Аналіз на послаблення імуногенності і)
Метою способу є послаблення імуногенності шляхом руйнування або гуманізації потенційних імуногенних
Т-антигенних детермінант із мінімальною кількістю мутацій. Згаданий спосіб включає розважливу заміну декількох амінокислотних залишків, що знаходяться у межах спіральних амфіпатичних сегментів. Амінокислоти, со які несуть, головним чином, відповідальність за канонічні структури, а також залишки у безпосередній близькості до гіперваріабельних ділянок або у зоні Верн'є, повинні зберігатись. о
За цим способом порівнюють послідовності варіабельних ділянок важких та легких ланцюгів мишачого со імуноглобуліну з найгомологічнішими людськими послідовностями з ідентифікуваням залишків, якими різняться мишача та людська послідовності, лише у амфіпатичних сегментів, що знаходяться у межах остовних ділянок юю (|Кабат (Кара) (1991), Зедцепсевз ої ргоїеїіпв ої іттипоіодіса! іпіегеві, п'яте видання, Національний Інститут ч-
Здоров'я (США)). Раніше визначені залишки замінювали залишками, присутніми у найгомологічнішій людській послідовності. Заміни здійснювали методами прямого мутагенезу.
Залишки, залучені до тривимірної структури місця зв'язування, мутаціям не піддавали; це могло негативно « вплинути на розпізнавання антигену. Додаткову інформацію відносно впливу замін у третинній структурі можна одержати шляхом молекулярного моделювання місця зв'язування антигену. - с Слід звернути увагу на присутність пролінових залишків у спіральному амфіпатичному сегменті, а також на ц те, що певні мишачі залишки не з'являються у тому саме положенні у найгомологічнішій людській послідовності, "» однак часто зустрічаються у інших людських імуноглобулінах. Із цієї причини не існує унікального набору мишачих амінокислот до заміни у основних ділянках. Можна одержати різні варіанти модифікованого антитіла з різною кількістю замін. Мутації здійснювали шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій. -І Клонування та експресія гуманізованих антитіл РЗпи та ТЛЕТОпи
Генно-інженерні конструкції, що відповідали РЗпи та ТЕТ1Опи, клонували у векторах експресії за способом,
Мн опис якого наведено для химерних антитіл. Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як о РЗУКпи-Рад4і622 або 1ЕТ1ОУкКпи-РАС4622 та РУМНІПшШ-РАНАб6О4 і ТЛЕТОМНІпшШ-РАНА4б6О4. Вони були трансфіковані до клітин М5-0 за методикою, опис якої було наведено перед тим для химерних антитіл. ї-о Очищення рекомбінантних антитіл с» Рекомбінантні антитіла очищали засобами афінної хроматографії із застосуванням білка А (фірма РНаптасіа,
Орззаїа, Швеція).
Біологічна активність
Біологічну активність рекомбінантних антитіл перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що визначали шляхом ЕГІЗА. о Для рекомбінантного МАБ РЗ, титрувальні мікропланшети сенсибілізували розчином ЗМЗ3(Мецсс) гангліозиду ко у метанолі. Після просушування впродовж 1год., неспецифічне зв'язування блокували 195 розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (ВЗА) у трис-НСІ та інкубували впродовж год. при температурі 6о З72С. Лунки промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином та інкубували впродовж год. при температурі 372С з очищеним рекомбінантним МАБ РЗ. Лунки промивали трис-НСІ, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкубували при температурі 372С впродовж год.
І, нарешті, лунки промивали та додавали субстратний буфер, що включав р-нітрофенілфосфат. Через півгодини визначали оптичну густину при 405нм або 492нм, відповідно. 65 Для рекомбінантного МАбБаї ТЕ1ТО ЕГІЗА здійснювали подібним же чином, за виключенням того, що лунки сенсибілізували МАБ РЗ і промивали РВ5-0,05905 Твін-20.
Приклади
У наведених далі прикладах усі використані ферменти, а також реактиви і матеріали були одержані з комерційних джерел, якщо не вказано інше.
Приклад 1. Одержання химерного МАБ РЗ
Синтез кКДНК відбувався шляхом реакції з ревертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що продукує МАБ
РЗ, як описувалось раніше. Показана послідовність специфічних праймерів, що були використані у цій реакції:
Для МН: 5 АСОТСТАСАА(СТ)СТССАСАСАСАСО(АСХАС)ССАСТОСАТАСАС 3 70 Для МК: 5 ОСОТСТАСААСТОСАТОСТООСААСАТОО 3
КДНК МНРЗ та кКДНК МКРЗ ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням
Тад-полімерази та специфічних праймерів. Сайтами рестрикції, що включались до праймерів, були ЕСОКМ/МНЕЇ для МН та ЕСОКМ)/5АЇ І для МУК. Були використані такі праймерні послідовності:
Для МН:
Праймер 1 (сигнальний пептид): 5 СОБОАТАТССАССАТОС(АСІАТО(СОЛДОСТО(ТО)СТ(САЗАТСОСТСТТ 3
Праймер 2 (СНІ): 5 ВОбОСТАОСТОСАСАСАСАСТОАССАСАСТ 3!
Для МК:
Праймер 1 (сигнальний пептид): 5 СОБОАТАТССАССАТОСАС(ТА)САСА(СТуТА)СТСАООТСТТ (САТ З"
Праймер 2 (СК): 5 АОСОТСОАСТТАСОСТТПТОХЗАТТТССА(САХСТТСТОТССС 3 с
Продукти полімеразної ланцюгової реакції клонували до вектора ТА (набір для клонування ТА сіопіпоу Кії, фірма Іпмийгодеп). Дванадцять незалежних клонів секвенували дидезокси методом встановлення первинної і) структури ДНК із застосуванням 77 ДНК-полімерази (фірма РНагтасіа). Аналізом пошуку гомологій визначили найгомологічнішу послідовність для МНРЗ та МКРЗ. Послідовності МНРЗ та МКРЗ (Фіг.1 та Фіг.2) мають високу гомологію з групами ІВ та М, відповідно, за класифікацією Кабата. с зо Після розщеплення рестриктазами ЕСОКМ та МНЕЇ для МНРЗ та ЕСОКУ і БА для МКРЗ, їх клонували до векторів експресії попередньо розщеплених тими саме ферментами, РАН460О4 та РАС4622 для МН та МУК, Ме відповідно. Ці вектори експресії були подаровані Шері Моррісон (Зпегіе Могтізоп) (ОСІ А, Каліфорнія, США); с вони є придатними для експресії імуноглобулінів у клітинах ссавців. Вектор РАН 4604 включав константну ділянку людського І дО1, а вектор РАС 4622 включав людську СК (Колома (СоІота) та інші (1992): Момеї! месіюогв о ірг «(пе ехргевзвіоп ої апіброду тоіесцевз ивіпуд магіаріе гедіопз депегаїей ру роїутегазе спаїп геасійп, 4. ї-
Іттипої. Меїй., 152: 89-104). Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як РЗУМН-РАН4бО4 та
РЗМК-РАСА4622.
Клітини МЗ-0 трансфікували 1Омкг РЗМК-РАС4622, клон, що експресував легкий ланцюг, трансфікували 1Омкг
РЗУН-РАНЯ4б604; у обох випадках ДНК лінеаризували за допомогою Рмиі, осаджували етанолом та розчиняли у « бОмкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину перед трансфекцією. з с Приблизно 107 клітин збирали шляхом центрифугування і ресуспендували у 0,5мл забуференого фосфатом ц фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 1Охв. на льоду, клітини "» піддавались імпульсу електричного току (2008, 9бОмкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 1Охв. Після цього клітини розподіляли до 9б-лункового планшета з модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла Е12 плюс 1095 фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне -І середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла Е12 із мікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або гістидинолом (10ММ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним іні оком через 14 днів. оз Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували ї-о козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або с» антилюдськими до (специфічними для гамма-ланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами.
Після промивання РВЗ-Т (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,0595 Твін-20) розбавлене культуральне середовище лунок, що містять трансфектанти, додавали до кожної лунки титраційного Мікропланшета на год. при температурі 372. Лунки промивали РВЗ-Т, додавали козячий антилюдський легкий каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський ІдС, кон'югований із лужною
ІФ) фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній температурі впродовж год. Лунки ко промивали РВОЗ-ЇТ і додавали субстратний буфер, що включав о-фенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492нм або 405нм, відповідно. 60 Приклад 2. Одержання різних варіантів туманізованого антитіла РЗ
Послідовності мишачих МНРЗ та МКРЗ (Фіг.1 та Фіг.2) порівнювали з людськими послідовностями. На Фіг.З та
Фіг.А4 показані найгомологічніші людські послідовності. На послідовностях варіабельної ділянки мишачого РЗ відшукували спіральні амфіпатичні ділянки або потенційні Т-клітинні антигенні детермінанти і за згаданим способом визначали розважливу стратегію заміни амінокислот із метою руйнування або гуманізації потенційних 65 Т-клітинних антигенних детермінант у межах мишачих послідовностей.
Аналіз МНРЗ виявив (Фіг.3) 2 амфіпатичні сегменти, перший з яких охоплює СОКІ, ЕК2 та деякі залишки
СО, у той час як другий охоплює кінець ЕКЗ та СОКЗ. Головні різниці мишачої послідовності, порівняно з найгомологічнішою людською послідовністю, були знайдені у гіперваріабельних ділянках або залишках, залучених до тривимірної структури сайту зв'язування. З цієї причини було вирішено не замінювати жодної амінокислоти у мишачій МНРЗ.
Аналіз МКРЗ також виявив 2 амфіпатичні сегменти (Фіг.4), перший з яких охоплює ЕК1, другий охоплює СОК2 та деякі залишки ЕКЗ. Було вирішено замінити залишки у положеннях 8, 9, 10, 11 та 13 залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти Нівз, Гуз, Рпе, Меї та Тиг були замінені на
Роо, Зег, Зег, І еи та Аа, відповідно. Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій 7/0 ІКамманн (Каттапп) та інші (1989): Карій іпзепіопа! тиадепевіз ої ОМА ру роїутегазе снаїп геасіоп (РСК),
Мисієїс Асідз Кез., 17:5404) із застосуванням праймерів 1 та 2 і З та 4, послідовності яких виглядають таким чином:
Праймер 1: 5 АТОАСССАСТСТОСТТСТТСТСТТТССОСОТСАСТАСОСАСАС 3
Праймер 2: 5 АОСОТСОАСТТАСОСТТПТОХЗАТТТССА(САХСТТСТОТССС 3
Праймер 3: 5 СТСТССТАСТОАСОСОСАААСАСААСААОСАСАСТОООСТСАТ 3"
Праймер 4:
БОБОБАТАТССАССАТОСАС(ТА)ХСАСА(СТХТА)СТСАООТСТТ (ОА)
Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як
РЗМКПи і клонована до вектора експресії РАС 4622. Одержали генно-інженерну конструкцію РУМКпи-РАС4622.
Для експресії гуманізованого антитіла РЗ клітини М5-0 трансфікували РЗМН-РАНАб6бО4 та РУМКПи-РАСА622.
Антитіло РЗпи трансфікували за тією саме методикою електропорації та виявлення, опис якої було наведено сч г перед тим для химерних антитіл.
Приклад З: Біолопчна активність химерного МАБ РЗ і)
Біологічну активність химерного МАБ РЗ перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що визначали шляхом ЕГІЗА.
Для рекомбінантного МАБ РЗ, титрувальні мікропланшети сенсибілізували розчином ЗМЗ3(Мецсс) гангліозиду с зо У метанолі. Після просушування впродовж год. при температурі 372С, неспецифічне зв'язування блокували 190 розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (В5А) у трис-НСІ буфері та інкубували впродовж год. іа при температурі 372С. Лунки промивали забуференим фосфатом фізіологічним розчином та інкубували «95 впродовж год. при температурі 3723 з очищеним рекомбінантним МАБ РЗ. Лунки промивали трис-НСІ, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з лужною фосфатазою та інкубували при температурі 3723 впродовж о год. І, нарешті, лунки промивали трис-НСІ і додавали субстратний буфер, що включав р-нітрофенілфосфат. їх
Через півгодини визначали оптичну густину при 405нм.
Химерне МАБ Т1 використовували як негативний контроль.
На Фіг.5 зображено специфічне зв'язування химерного МАБ РЗ з антигеном. «
Приклад 4. Одержання химерного МАВ 1Е10
Синтез кДНК відбувався шляхом реакції з ревертазою, із започаткування з РНК гібридоми, що продукує МАБ - с 1Е10, як описувалось раніше. Далі показана послідовність специфічних праймерів, що були використані у цій и реакції: ,» Для МН: 5 ВОбОСТАОСТОАОСАСАСТОТОАСАСТОСТ 3
Для МУК: -і 5 ОСОТСТАСААСТОСАТОСТООСОСААСАТОСА 3" сл КДНК МНІЄЕТО та кДднНК МКтТЕТ1ТО ампліфікували за допомогою полімеразної ланцюгової реакції із застосуванням Тад-полімерази та специфічних праймерів (95) Для УН: с 50 Праймер 1 (сигнальний пептид): 5 СОБОАТАТССАССАТОС(АСІАТО(СОЛДОСТО(ТО)СТ(САЗАТСОСТСТТ 3 сб» Праймер 2 (СНІ): 5 ВОбОСТАОСТОАОСАСАСТОТОАСАСТОСТ 3
Для МК:
Праймер 1 (сигнальний пептид): о 5 ОБОСТТААССАССАТОАДОС(СТ)СССС(АТСТСАС(СТ(СТСТ(ТО)БО(ОА) 3"
Праймер 2 (Сю): ко 5 АОСОТСОАСТТАСОСТТПТОХЗАТТТССА(САХСТТСТОТССС 3
Продукти полімеразної ланцюгової реакції клонували до вектора ТА (набір для клонування ТА сіопіпоу Кії, 60 фірма Іпмийгодеп). Дванадцять незалежних клонів секвенували (Фіг.7 та Фіг.8) дидезокси методом встановлення первинної структури ДНК із застосуванням Т7 ДНК-полімерази (фірма РІіагтасіа). Аналізом пошуку гомологій визначили найгомологічнішу послідовність для МНІЕ1О та МК1ТЕ10. Послідовності МНІЕ1О та МКТЕ10 мають високу гомологію з різними групами та групою У, відповідно, за класифікацією Кабата.
Після розщеплення рестриктазами ЕСОКМ та МНЕЇ для УНІЕТ0 та Ніпаї і ЗБАГІ для МК1ЕТ10, їх клонували до 65 векторів експресії, попередньо розщеплених придатними ферментами, РАН4б6О4 та РАС4622 для МН та МУК, відповідно. Ці вектори експресії були подаровані Шері Моррісон (Зпегіе Могтізоп) (ОСІ А, Каліфорнія, США);
вони є придатними для експресії імуноглобулінів у клітинах ссавців. Вектор РАН 4604 включав константну ділянку людського І дО1, а вектор РАС 4622 включав людську СК (Колома (СоІота) та інші (1992): Момеї! месіюогв їог (Ше ехргезвіоп ої апіроду тоіесціев ивіпд магіабіе гедіопе депегаїей Бу роїутегазе спаїп геасійп, 3.
Іттипої. Меїй., 152: 89-104). Одержані генно-інженерні конструкції були позначені як ТЕТОМН-РАН4б6О04 та 1ЕТЛОМК-РАС4622.
Клітини М5-0 трансфікували 1Омкг ТЛЕТОУК-РАС4622, клон, що експресував легкий ланцюг, трансфікували 10мкг ТЕТОМН-РАН4б604; у обох випадках ДНК лінеаризували за допомогою Руці, осаджували етанолом та розчиняли у 5Хомкл забуференого фосфатом фізіологічного розчину перед трансфекцією. 70 Приблизно 107 клітин збирали шляхом центрифугування і ресуспендували у 0,5мл забуференого фосфатом фізіологічного розчину разом із розщепленою ДНК у електропораційній кюветі. Після 1Охв. на льоду, клітини піддавались імпульсу електричного току (2008, 9бОмкФ) і залишались на льоду додатково впродовж 1Охв. Після цього клітини розподіляли до 9б-лункового планшета з модифікованим за способом Дульбекко живильним середовищем Ігла Е12 плюс 1095 фетальної телячої сироватки. Через два або чотири дні додавали селективне 75 середовище (модифіковане за способом Дульбекко живильне середовище Ігла Е12 із мікофеноловою кислотою (0,45мкг/мл) або гістидинолом (10ММ розчин), відповідно). Трансфіковані клони спостерігались неозброєним оком через 14 днів.
Присутність людського антитіла у живильному середовищі лунок, що містили трансфіковані клони, визначали шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА). Лунки титраційного мікропланшета сенсибілізували козячим антилюдським легким каппа-ланцюгом (для клонів, що продукують людський каппа-ланцюг) або антилюдськими до (специфічними для гамма-ланцюга) (для клонів, що продукують повне антитіло) антитілами.
Після промивання РВЗ-Т (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,0595 Твін-20) розбавлене культуральне середовище лунок, що містять трансфектанти, додавали до кожної лунки титраційного мікропланшета на год. при температурі 3720. Лунки промивали РВ5-Т, додавали козячий антилюдський легкий су каппа-ланцюг, кон'югований із пероксидазою із хрону або козячий антилюдський ІдсС, кон'югований з лужною о фосфатазою (специфічний для гамма-ланцюга), та інкубували при кімнатній температурі впродовж год. Лунки промивали РВЗ-Ї, і додавали субстратний буфер, що містив о-фенілендіамін або р-нітрофенілфосфат, відповідно. Через півгодини визначали оптичну густину при 492нм або 405нм, відповідно.
Приклад 5. Одержання різних варіантів гуманізованого антитіла 1Е10 со
Послідовності мишачих МНТЕ10 та МК1ТЕ10 (Фіг.б та Фіг.7) порівнювали з людськими послідовностями. На
Фіг.8 та Фіг.9 показані найгомологічніші людські послідовності. На послідовностях варіабельної ділянки о мишачого 1Е10 відшукували спіральні амфіпатичні ділянки або потенційні Т-клітинні антигенні детермінанти, і со за згаданим способом визначали розважливу стратегію заміни амінокислот із метою руйнування або гуманізації потенційних Т-клітинних антигенних детермінант у межах мишачих послідовностей. о
Аналіз МНТЕ1О виявив (Фіг.8) З амфіпатичні сегменти, перший з яких охоплює ЕК1, другий охоплює ЕКЗ, їч- третій охоплює ЕКЗ. Було вирішено замінити залишки у положеннях 5, 40, 42 та 87 (83 за нумерацією Кабата) залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти (іп, Аго, іш та ТАг були замінені на Маї, Аа, Су та Аго, відповідно. «
Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій (Камманн (Каттапп) та інші (1989): Раріа іпвепіопа! тиїадепевзіз ої ОМА Бу роїутегазе спаіп геасіоп (РСЕ), Мисієїс Асідв5 Кев., 17:5404| 2-2 с із застосуванням різних наборів праймерів. з» Праймерами для мутації у положенні 5 важкого ланцюга були праймери 1, 2, З та 4, послідовності яких , виглядають таким чином:
Праймер 1: 5 САОСТТСАОСТООТОСАСТСТОСАССТ 3 - | Праймер 2: 5 ВОбОСТАОСТОАОСАСАСТОТОАСАСТОСТ 3 і-й Праймер 3: (9) 5 АССТССАСАСТОСАССАССТОААССТО 3
Праймер 4: і 5 СОБОАТАТССАССАТОС(АСІАТО(СОЛДОСТО(ТО)СТ(САЗАТСОСТСТТ 3 сю» Після секвенування точкової мутації у положенні 5, були здійснені мутації у положеннях 40 та 42.
Праймер для мутацій у положеннях 40 та 42 важкого ланцюга:
Праймер 1: 5 ТООбТОАвОСАвОСОССсТОООСАСОСАСТТОАО 3
Праймер 2: о 5 ВОбОСТАОСТОАОСАСАСТОТОАСАСТОСТ 3 ко Праймер 3: 5 СТСААСТСССТОСССАОСОССТОССТСАСССА 3" 60 Праймер 4: 5 СОБОАТАТССАССАТОС(АСІАТО(СОЛДОСТО(ТО)СТ(САЗАТСОСТСТТ 3
Після секвенування точкової мутації у положеннях 40 та 42, була здійснена мутація у положенні 87 (83 за нумерацією Кабата).
Праймер для мутації у положенні 87 (83 за нумерацією Кабата) важкого ланцюга: 65 Праймер 1: 5 СТСАССАСОСТОСООСТСТОАООАСТСТ 3
Праймер 2:
ВОбОСТАОСТОАОСАСАСТОТОАСАСТОСТ 3
Праймер 3: 5 5 АСАСТОСТСАСАССОСАСССТОСтТОдО 3
Праймер 4: 5 СОБОАТАТССАССАТОС(АСІАТО(СОЛДОСТО(ТО)СТ(САЗАТСОСТСТТ 3
Інші заміни не робили, оскільки залишки були залучені до тривимірної структури сайту зв'язування.
Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як 7/0. ЛЕЛОМНпи ї клонована до вектора експресії РАН4АбО4. Одержали генно-інженерну конструкцію ТЕЛОМН-РАНАбОА.
Аналіз МКТЕ1О також виявив З амфіпатичні сегменти (Фіг.9), перший з яких охоплює ЕК1, другий охоплює
СОК, третій охоплює ЕКЗ. Було вирішено замінити залишки у положеннях 7, 8 та 15 залишками у тому саме положенні найгомологічнішої людської послідовності. Амінокислоти ТНг, ТНг та І еи були замінені на Зег, Рго та
Маї, відповідно. Заміну здійснили шляхом перекривання полімеразних ланцюгових реакцій (Камманн (Каттапп) /5 та інші (1989): Карій іпвепіопа! тиадепезіз ої ОМА ру роїутегазе спаїп геасіоп (РСК), Мисівіс Асідз Кев., 17:5404) із застосуванням праймерів 1, 2, З та 4, послідовності яких виглядають таким чином:
Праймери для мутації у положеннях 7, 8 та 15 легкого ланцюга:
Праймер 1: 5 САСАТОАСАСАСТСТОСТТССТоССТОТСТОССТСТОТООбАСАСАСАСТС 3
Праймер 2: 5 АОСОТСОАСТТАСОСТТПТОХЗАТТТССА(САХСТТСТОТССС 3
Праймер 3: 5 САСТСТОТСТОССАСАСАООСАСАСАСОСАСОААОСАСАСТОТОТСАТСТО 3
Праймер 4: с 5 ОБОСТТААССАССАТОАДОС(СТ)СССС(АТСТСАС(СТ(СТСТ(ТО)БО(ОА) 3"
Точкові мутації були перевірені секвенуванням. Одержана генно-інженерна конструкція була позначена як і) 1ЕТОМКпи і оклонована до вектора експресії РАС 4622. Одержали генно-інженерну конструкцію
ІЕММКпи-РАСА4622.
Для експресії гуманізованого антитіла 1Е10О0, клітини М5-0 трансфікували ТЕ1ОМНпш-РАН4-б6ЄО4 та с
ЛЕЛОМКНи-РАС4622.
Антитіло ТЛЕТОпйи трансфікували за тією саме методикою електропорації та виявлення, опис якої було Ме наведено перед тим для химерних антитіл. со
Приклад 6: Біологічна активність химерного МАВ 1Е10
Біологічну активність химерного МАВ 1Е1О перевіряли за специфічним зв'язуванням з антигеном, що о
Зв ВвИиЗНачали шляхом ЕПЗА. ї-
Для рекомбінантного МАВ 1Е10, титрувальні мікропланшети сенсибілізували МАБ РЗ. Після промивання
РВЗ-Т (забуферений фосфатом фізіологічний розчин, що включає 0,0595 Твін-20), неспецифічне зв'язування блокували 195 розчином сироваткового альбуміну великої рогатої худоби (В5А) у РВ5-Т та інкубували впродовж 1год. при температурі 3720. Лунки промивали, та інкубували впродовж Тгод. при температурі 372С з очищеним « рекомбінантним МАБ 1Е10. Лунки пррмивали РВ5-Т, додавали козяче антилюдське антитіло, кон'юговане з шщ с лужною фосфатазою та інкубували при температурі 3723 впродовж год. І, нарешті, лунки промивали РВ5-1 і ц додавали субстратний буфер, що містив р-нітрофенілфосфат. Через півгодини визначали оптичну густину при ,» дОБнм.
Химерне МАБ С5 використовували як негативний контроль.
На Фіг.10 показано специфічне зв'язування химерного МАБ 1Е10 з МАБ РЗ. -І Фіг.1: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла
РІЗ. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата ІКабат (Кара) та інші (1991). Зедцепсез ої ргоїгеіп5
Мн ої іттипоіодіса! іпіегеві, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки о позначені штрих-пунктирними лініями.
Фіг.2: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла ї-о РІЗ. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата ІКабат (Кара) та інші (1991). Зедцепсез ої ргоїгеіп5 с» ої іттипоіодіса! іпіегеві, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями.
Фіг.3: Порівняльний аналіз МНРЗ із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом.
Фіг4: Порівняльний аналіз МКРЗ із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти о підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом. ко Фіг.5: Специфічне зв'язування химерного МАБ РЗ з СМЗ3(МецОс). Шляхом ЕГІЗА випробували різні концентрації МАЮ РЗ та МАБ Т1 (негативний контроль). Титраційні мікропланшети сенсибілізували розчином 6о ОМ (Меисс) та ОМЗ(МецАс) (негативний контроль) гангліозиду у метанолі і визначали специфічне зв'язування.
Фіг.6: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки важкого ланцюга антитіла 1Е10. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Кара) та інші (1991). Зедиепсев ої ргоїеіпе ої іттипоіодіса! іпіегезі, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями. 65 Фіг.7: Визначені нуклеотидні та амінокислотні послідовності варіабельної ділянки легкого ланцюга антитіла 1Е10. Нумерація амінокислот відповідає класифікації Кабата (Кабат (Кара) та інші (1991). Зедиепсев ої ргоїеіпе ої іттипоіодіса! іпіегезі, п'яте видання, Національний Інститут Здоров'я (США)). Гіперваріабельні ділянки позначені штрих-пунктирними лініями.
Фіг.8: Порівняльний аналіз МНІ1ТЕ10 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом.
Фіг.9: Порівняльний аналіз МКТЕ10 із найгомологічнішою людською послідовністю. Амфіпатичні сегменти підкреслені, гіперваріабельні ділянки позначені жирним шрифтом.
Фіг.10: Специфічне зв'язування мишачого МАБ РЗ з химерним МАБ 1Е10. Шляхом ЕГІЗА випробували різні концентрації МАБ 1Е10 та МАБ С5 (негативний контроль). Титраційні мікропланшети сенсибілізували МАБ РЗ та 7/0 МАБ АЗ (негативний контроль) і визначали специфічне зв'язування.

Claims (7)

Формула винаходу
1. Химерне моноклональне антитіло, одержане із мишачого моноклонального антитіла МАБ РЗ, що розпізнає гангліозиди, які включають М-гліколільовану сіалову кислоту, яке продукується лінією клітин гібридоми, депонованою у ЕСАСС під Мо 94113026, причому гіперваріабельні домени важкого та легкого ланцюгів згаданого антитіла мають такі послідовності: важкий ланцюг: сок: ЕУ5УН СсОок2: МІММОООТОММЗАЇ К5 СОКЗ: БОМКЕСКАОАУУБАХ легкий ланцюг: СОКІ1: КАБООМЗТАМА сч СОК2: БАБУКУТ СОтЗ: ООНУЗТРМТ о і причому каркасні ділянки (ЕКзв) його важкого та легкого ланцюгів включають такі послідовності: важкий ланцюг: ЕК!: ОМОЇ КЕЗБОРОЇ МАРЗОБІ БІТСТУБОВЕ5І 5 со зо ЕК2: МУМКОРРОКОГ ЕМ о ЕКЗ: АГ ЗІЗКОМЗКБОМРІ КМУ ОТООТАМУМСАК (2) ЕК4: МОСТІ М со легкий ланцюг: ЕК: ОІММТОЗНКЕМЗТЗУОКУЗІТС ів) ЕК2: МУСОКРООЗБРКО ЛУ їч- ЕКЗ: СМРОКЕТОЗОБОТОЕТЕТІЗЗМОАЕОІ АМУУС ЕК4: ЕСОСТКІ..
2. Моноклональне антитіло за п. 1, причому воно включає щонайменше одну з наведених далі замін для його гуманізації та збереження властивостей зв'язування з антигеном: « 20 легкий ланцюг: | ш-в с Положення 8: Ніз на Рго Положення 9: І уз на Зег з Положення 10: Рре на Зег Положення 11: Меї на І ец Положення 13: ТНг на Аа. -І З. Моноклональне антитіло за п. 1 або 2, причому константна ділянка важкого ланцюга включає амінокислотну послідовність ланцюга гамма-1ї і константна ділянка легкого ланцюга включає амінокислотну о послідовність каппа-ланцюга, та обидві ці амінокислотні послідовності одержані з людських імуноглобулінів.
с
4. Лінія клітин, що продукує будь-яке з моноклональних антитіл за пп. 1-3.
5. Фармацевтична композиція для лікування злоякісних пухлин молочної залози та меланом, їхніх метастазів іс) та рецидивів, що включає будь-яке з моноклональних антитіл за пп. 1-3. с»
6. Фармацевтична композиція для локалізації та ідентифікації іп мімо злоякісних пухлин молочної залози та меланом, їхніх метастазів та рецидивів, яка містить будь-яке з моноклональних антитіл за пп. 1-3.
7. Застосування моноклонального антитіла за будь-яким із пп. 1-3 для виготовлення лікарського засобу, вв придатного для лікування злоякісних пухлин молочної залози та меланом, їхніх метастазів та рецидивів. Ф) іме) 60 б5
UA2003108989A 2001-04-06 2002-08-04 Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it UA75393C2 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2001008420010084A CU23007A1 (es) 2001-04-06 2001-04-06 Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos
PCT/CU2002/000003 WO2002081496A2 (es) 2001-04-06 2002-04-08 Anticuerpos recombinantes asociados a gangliósidos. su uso en el diagnóstico y tratamiento de tumores

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA75393C2 true UA75393C2 (en) 2006-04-17

Family

ID=40291118

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2003108989A UA75393C2 (en) 2001-04-06 2002-08-04 Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it
UA2003108988A UA76745C2 (uk) 2001-04-06 2002-08-04 Імунотерапевтичні комбінації для лікування пухлин, які надекспресують гангліозиди
UAA200512270A UA86768C2 (uk) 2001-04-06 2005-12-20 ХИМЕРНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ОДЕРЖАНЕ ІЗ МИШАЧОГО АНТИІДІОТИПІЧНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТІЛА 1Е10, ЩО РОЗПІЗНАЄ МИШАЧЕ MAbP3

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UA2003108988A UA76745C2 (uk) 2001-04-06 2002-08-04 Імунотерапевтичні комбінації для лікування пухлин, які надекспресують гангліозиди
UAA200512270A UA86768C2 (uk) 2001-04-06 2005-12-20 ХИМЕРНЕ МОНОКЛОНАЛЬНЕ АНТИТІЛО, ОДЕРЖАНЕ ІЗ МИШАЧОГО АНТИІДІОТИПІЧНОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО АНТИТІЛА 1Е10, ЩО РОЗПІЗНАЄ МИШАЧЕ MAbP3

Country Status (37)

Country Link
US (3) US20050069535A1 (uk)
EP (3) EP1384726B1 (uk)
JP (2) JP4366080B2 (uk)
KR (3) KR100863509B1 (uk)
CN (3) CN101054417B (uk)
AR (2) AR033123A1 (uk)
AT (3) ATE477279T1 (uk)
AU (3) AU2002308348B2 (uk)
BG (2) BG66293B1 (uk)
BR (3) BR0208676B1 (uk)
CA (2) CA2443372C (uk)
CU (1) CU23007A1 (uk)
CZ (2) CZ296276B6 (uk)
DE (2) DE60223547T2 (uk)
DK (2) DK1384726T3 (uk)
EA (2) EA006936B1 (uk)
EC (2) ECSP034788A (uk)
ES (2) ES2296986T3 (uk)
HK (3) HK1066818A1 (uk)
HR (2) HRP20030806B1 (uk)
HU (2) HU228106B1 (uk)
IL (2) IL158246A0 (uk)
IS (2) IS6965A (uk)
MX (2) MXPA03008739A (uk)
MY (3) MY145703A (uk)
NO (2) NO20034437L (uk)
NZ (2) NZ528598A (uk)
PE (1) PE20020972A1 (uk)
PL (2) PL208109B1 (uk)
PT (2) PT1384726E (uk)
SG (1) SG161737A1 (uk)
SI (2) SI1411064T1 (uk)
SK (2) SK287783B6 (uk)
UA (3) UA75393C2 (uk)
UY (2) UY27242A1 (uk)
WO (2) WO2002081496A2 (uk)
ZA (2) ZA200307585B (uk)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
CN101111260B (zh) * 2005-02-04 2013-03-20 萨瓦克公司 存活蛋白肽疫苗
FI20055398A0 (fi) 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
EP2594591B1 (en) * 2005-08-11 2018-06-06 Arpi Matossian-Rogers Tcr-v-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease
JP5415071B2 (ja) * 2005-08-19 2014-02-12 ワイス・エルエルシー Ｇｄｆ−８に対するアンタゴニスト抗体ならびにａｌｓおよびその他のｇｄｆ−８関連障害の処置における使用
ITFI20060163A1 (it) * 2006-06-29 2006-09-28 Menarini Internat Operations Luxembourg Sa Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio
TWI434855B (zh) 2006-11-21 2014-04-21 Hoffmann La Roche 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途
WO2009104649A1 (ja) * 2008-02-22 2009-08-27 片山化学工業株式会社 合成糖脂質含有リポソーム
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
NZ594985A (en) * 2009-03-10 2013-07-26 Biogen Idec Inc Anti-bcma (b-cell maturation antigen, cd269, tnfrsf17) antibodies
SG174992A1 (en) 2009-04-01 2011-11-28 Genentech Inc Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
CU23736A1 (es) * 2009-05-04 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso
WO2011026242A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Vancouver Biotech Ltd. Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor
WO2012096994A2 (en) * 2011-01-10 2012-07-19 Emory University Antibodies directed against influenza
CU24070B1 (es) * 2011-12-27 2015-01-29 Ct De Inmunología Molecular Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3)
EP2641916A1 (en) * 2012-03-23 2013-09-25 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof
MY177331A (en) 2012-06-15 2020-09-12 Pfizer Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
UA120753C2 (uk) 2013-12-17 2020-02-10 Дженентек, Інк. Біспецифічне антитіло до сd3 та cd20
JP2017512759A (ja) * 2014-04-10 2017-05-25 オービーアイ ファーマ インコーポレイテッド 抗体、前記抗体を産生するハイブリドーマ、前記抗体を含む薬学的組成物及びその用途
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
CA2986928A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Genentech, Inc. Humanized and affinity matured antibodies to fcrh5 and methods of use
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
CA3044664C (en) 2016-11-30 2022-11-22 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of cancer comprising tigit-binding agents
CU20170173A7 (es) * 2017-12-27 2019-11-04 Ct Inmunologia Molecular Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2754206B2 (ja) * 1987-11-17 1998-05-20 メクト株式会社 α２→３結合を認識するモノクローナル抗体
US6051225A (en) * 1988-10-19 2000-04-18 The Dow Chemical Company Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
EP0586002B1 (en) * 1992-08-18 2000-01-19 CENTRO de IMMUNOLOGIA MOLECULAR Monoclonal antibodies recognizing the epidermal growth factor receptor, cells and methods for their production and compositions containing them
JPH07101999A (ja) * 1993-10-06 1995-04-18 Hagiwara Yoshihide 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列
US6063379A (en) * 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
CU22702A1 (es) * 1997-10-21 2001-07-31 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales anti - idiotipo, su uso en la inmunoterapia activa de tumores malignos, hibridoma que los produce y composiciones que los contienen
EP0657471B1 (en) * 1993-12-09 2001-10-24 Centro de Inmunologia Molecular Anti ganglioside monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumours
CU22420A1 (es) * 1993-12-29 1996-01-31 Centro Inmunologia Molecular Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer
US6149921A (en) * 1993-12-29 2000-11-21 Centro De Inmunologia Molecular Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment
CU22615A1 (es) * 1994-06-30 2000-02-10 Centro Inmunologia Molecular Procedimiento de obtención de anticuerpos monoclonales murinos menos inmunogénicos. anticuerpos monoclonales obtenidos
CU22731A1 (es) * 1998-02-05 2002-02-28 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
CA2441845C (en) 2011-06-07
NO20034436L (no) 2003-12-02
EA006936B1 (ru) 2006-06-30
ATE406386T1 (de) 2008-09-15
SK12262003A3 (sk) 2004-08-03
UA76745C2 (uk) 2006-09-15
BR0208676A (pt) 2008-04-08
CU23007A1 (es) 2004-12-17
WO2002081496A3 (es) 2004-02-19
KR100863509B1 (ko) 2008-10-15
NO331533B1 (no) 2012-01-23
DE60223547T2 (de) 2008-09-18
CZ20032668A3 (cs) 2004-07-14
KR20030092048A (ko) 2003-12-03
BG108227A (bg) 2005-04-30
SK12162003A3 (sk) 2004-05-04
NO20034437D0 (no) 2003-10-03
UY27242A1 (es) 2002-07-31
NZ528598A (en) 2005-03-24
CN101054417A (zh) 2007-10-17
MY157372A (en) 2016-06-15
SI1384726T1 (sl) 2009-04-30
KR20080080680A (ko) 2008-09-04
DK1411064T3 (da) 2008-03-25
CA2441845A1 (en) 2002-10-17
CN1535282A (zh) 2004-10-06
AU2002308347B2 (en) 2006-09-14
MY137078A (en) 2008-12-31
EP1798243A2 (en) 2007-06-20
BRPI0208675B1 (pt) 2018-03-13
KR100919617B1 (ko) 2009-09-29
CN1319991C (zh) 2007-06-06
DE60223547D1 (de) 2007-12-27
EA200301097A1 (ru) 2004-02-26
NO20034436D0 (no) 2003-10-03
PL208109B1 (pl) 2011-03-31
CZ20032641A3 (cs) 2004-07-14
HK1070080A1 (en) 2005-06-10
NZ528599A (en) 2005-03-24
US20050069535A1 (en) 2005-03-31
SK287783B6 (sk) 2011-09-05
JP2004528033A (ja) 2004-09-16
IL158246A (en) 2010-05-31
IS2701B (is) 2010-11-15
IL158246A0 (en) 2004-05-12
EA006310B1 (ru) 2005-10-27
ATE477279T1 (de) 2010-08-15
HUP0401695A3 (en) 2012-05-29
IS6964A (is) 2003-09-23
EA200301098A1 (ru) 2004-04-29
JP4366080B2 (ja) 2009-11-18
AU2007231687B2 (en) 2010-09-30
CZ304424B6 (cs) 2014-04-30
EP1411064A2 (en) 2004-04-21
BR0208676B1 (pt) 2017-11-14
EP1411064B1 (en) 2007-11-14
NO20034437L (no) 2003-12-02
CN101054417B (zh) 2012-07-11
AR033122A1 (es) 2003-12-03
ECSP034787A (es) 2004-01-28
PT1411064E (pt) 2008-02-12
WO2002081496A2 (es) 2002-10-17
AR033123A1 (es) 2003-12-03
AU2007231687A1 (en) 2007-11-22
DE60228561D1 (de) 2008-10-09
IS6965A (is) 2003-09-23
MXPA03008739A (es) 2003-12-11
UY27243A1 (es) 2002-09-30
MXPA03008738A (es) 2003-12-11
EP1798243A3 (en) 2007-10-17
CN100349920C (zh) 2007-11-21
HUP0401355A2 (hu) 2004-10-28
EP1798243B1 (en) 2010-08-11
HRP20030806B1 (en) 2011-11-30
BG108228A (bg) 2005-04-30
PL371770A1 (en) 2005-06-27
BG66293B1 (en) 2013-02-28
CA2443372C (en) 2013-05-28
MY145703A (en) 2012-03-30
CZ296276B6 (cs) 2006-02-15
US20100297008A1 (en) 2010-11-25
PT1384726E (pt) 2008-12-05
US20040253233A1 (en) 2004-12-16
ZA200307585B (en) 2004-09-16
SG161737A1 (en) 2010-06-29
SI1411064T1 (sl) 2008-04-30
HK1066818A1 (uk) 2005-04-01
WO2002081661A3 (es) 2003-01-03
HUP0401695A2 (en) 2006-08-28
JP2004525953A (ja) 2004-08-26
HK1109160A1 (en) 2008-05-30
HU228106B1 (en) 2012-11-28
HRP20030805B1 (en) 2011-11-30
ZA200307679B (en) 2005-03-30
KR100946168B1 (ko) 2010-03-11
HUP0401355A3 (en) 2012-05-29
EP1384726A2 (en) 2004-01-28
US8758753B2 (en) 2014-06-24
HU228105B1 (en) 2012-11-28
ES2312610T3 (es) 2009-03-01
EP1384726B1 (en) 2008-08-27
ES2296986T3 (es) 2008-05-01
AU2002308348B2 (en) 2007-11-22
HRP20030806A2 (en) 2005-08-31
HRP20030805A2 (en) 2005-08-31
ATE378356T1 (de) 2007-11-15
BR0208675A (pt) 2004-08-03
PL371937A1 (en) 2005-07-11
SK287914B6 (sk) 2012-03-02
BG66304B1 (bg) 2013-03-29
UA86768C2 (uk) 2009-05-25
CN1507452A (zh) 2004-06-23
PE20020972A1 (es) 2003-01-02
DK1384726T3 (da) 2008-12-15
KR20030087053A (ko) 2003-11-12
WO2002081661A2 (es) 2002-10-17
CA2443372A1 (en) 2002-10-17
ECSP034788A (es) 2004-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA75393C2 (en) Chimeric monoclonal antibody, identifying gangliosides containing n-glycolyl sialic acid, cells line producing it and pharmaceutical compositions containing it
EP1623997B1 (en) Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours
US5610281A (en) Antibodies for modulating heterotypic E-cadherin interactions with human T lymphocytes
UA125593C2 (uk) Антитіло в7-н3, його антигензв'язуючий фрагмент та його медичне застосування
MX2014013542A (es) Anticuerpos contra claudina 18.2 utiles en el diagnostico de cancer.
MX2012015131A (es) Terapia contra el cancer que utiliza anticuerpos dirigidos a la cldn6 objetivo in vivo.
KR100301189B1 (ko) 당단백질피(p)에대한단일클론항체
JP5977936B2 (ja) 膵構造から誘導される糖ペプチド、抗体ならびに診断および治療におけるそれらの応用
KR20110005887A (ko) 세포 외 기질 단백질의 아미노산 서열 ｒｇｄ에 특이적인 인간화된 항체 및 그의 용도
US7932043B2 (en) Use of monoclonal antibodies to distinguish protein conformational isoforms
US8617829B2 (en) Humanized antibodies specific for amino acid sequence RGD of an extracellular matrix protein and the uses thereof
JP5611210B2 (ja) 抗拡張ｉ型スフィンゴ糖脂質抗体、その誘導体および使用
JP7010704B2 (ja) Ａｍｌ抗原及びその使用
JPH02174691A (ja) モノクローナル抗体
Tomitaa et al. Generation of monoclonal antibodies directed against peptide sequences by a B cell targeting
JPS61238800A (ja) モノクロ−ナル抗体ａｍｆ及びその製造法