MX2014013542A - Anticuerpos contra claudina 18.2 utiles en el diagnostico de cancer. - Google Patents

Abstract

La invención se relacioria a los anticuerpos dirigidos contra un epítopo localizado en la porción carboxilo terminal de CLDN18.2, los cuales son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de cáncer y/o en la determinación de la expresión de CLDN18.2 en células cancerosas.

Description

ANTICUERPOS CONTRA CLAUDINA 18.2 ÚTILES EN EL DIAGNÓSTICO DE CANCER ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las claudinas son proteínas integrales de membrana localizadas en las zonas de oclusión del epitelio y el endotelio. Se predice que las claudinas poseen cuatro segmentos transmembranales con dos asas extracelulares, y los extremos amino y carboxilo terminales localizados en el citoplasma. La familia Claudina (CLDN) de proteínas transmembranales desempeña un papel en el mantenimiento del citoesqueleto y en señalización celular.

La molécula claudina 18 (CLDN18) es una proteína transmembranal (tetraspanina) que contiene 4 regiones hidrofóbicas que cruzan la membrana y dos asas extracelulares (asal formada por la región hidrofóbica 1 y la región hidrofóbica 2; asa2 formada por la región hidrofóbica 3 y la 4). CLDN18 se presenta en dos variantes por empalme, las cuales son descritas en ratón y en humano (Nii i, Mol. Cell. Biol. 21:7380-90, 2001). Las variantes por empalme (número de acceso de Genbank: variante por empalme 1 (CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, y variante por empalme 2 (CLDN18.2): NM 001002026, NP_001002026) tienen un peso molecular de 27,9 / 27,72 kD. Las variantes por empalme CLDN18.1 y CLDN18.2 difieren en la porción amino terminal la cual comprende la primera región transmembranal (TM) y el asal, mientras que la secuencia proteica primaria del carboxilo terminal es idéntica; véase la Figura 1.

CLDN18.1 se expresa selectivamente en células normales de pulmón, mientras que CLDN18.2 se expresa sólo en células gástricas. Sin embargo, la expresión de CLDN18.2 en el estómago normal está restringida a las células diferenciadas de vida corta del epitelio estomacal. La expresión de CLDN18.2 ha sido identificada en varios tejidos tumorales. Por ejemplo, se ha encontrado que CLDN18.2 se expresa en carcinoma pancreático, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de glándula mamaria y tumores en oido, nariz o garganta (ENT, por sus siglas en inglés). CLDN18.2 es un blanco valioso para la prevención y/o tratamiento de tumores primarios, tales como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de pulmón como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC, por sus siglas en inglés), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer de hígado, cáncer de cabeza-cuello, y cánceres de vesícula biliar, metástasis peritoneal y metástasis de ganglios linfáticos.

La expresión diferencial de CLDN18.2 entre células normales y de cáncer, su localización membranal, su ausencia en la gran mayoría de tejidos normales de toxicidad relevante, su restricción de expresión a poblaciones celulares dispensables en el estómago, células gástricas diferenciadas, las cuales pueden ser restituidas mediante células troncales negativas al blanco, hacen de CLDN18.2 un blanco atractivo para la inmunoterapia en cáncer y el uso de terapia basada en anticuerpos dirigidos a CLDN18.2 en terapias para cáncer promete un alto nivel de especificidad terapéutica.

La aplicación clínica de los anticuerpos dirigidos contra CLDN18.2 enfrenta el obstáculo de que la CLDN18.2 humana es altamente homologa a CLDN18.1 humana. Los anticuerpos específicos contra CLDN18.2 dirigidos contra el dominio extracelular amino terminal de CLDN18.2 mostrando diferencias en la secuencia entre la CLDN18.2 humana y la CLDN18.1 humana pueden establecerse con éxito. Los intentos para producir anticuerpos dirigidos contra la porción amino terminal de CLDN18.2 y que mantengan la propiedades que los hagan clínicamente útiles para propósitos diagnósticos, por ejemplo, detección de expresión de CLDN18.2 en células de secciones de tejido canceroso, han fallado.

De modo sorpresivo, los inventores actuales encontraron que los anticuerpos dirigidos contra cierto epítopo localizado en la porción carboxilo terminal de CLDN18.2 cumplen con los criterios para la aplicabilidad diagnóstica de los anticuerpos, en particular de la detección e identificación de células con expresión de CLDN18.2. Más sorprendente aún, estos anticuerpos no tienen como blanco células cancerosas de pulmón, aunque están dirigidos contra una secuencia que es idéntica en CLDN18.1 y CLDN18.2, Los anticuerpos de la invención son útiles, por ejemplo, en el diagnóstico de cáncer y/o en la determinación de la expresión de CLDN18.2 en células cancerosas. Preferentemente, una enfermedad cancerosa o célula cancerosa se caracteriza por la expresión en superficie de CLDN18.2. Las células cancerosas que expresan CLDN18.2 son blancos adecuados para terapias dirigidas contra CLDN18.2, tal como la terapia con anticuerpos dirigida contra CLDN18.2. En una modalidad, las células cancerosas expresan o expresan aberrantemente CLDN18.2 mientras las células correspondientes normales no expresan CLDN18.2 o expresan CLDN18.2 en un nivel menor. Las células que expresan CLDN18.2 son seleccionadas preferentemente del grupo consistente de células cancerosas gástricas, de esófago, pancreáticas, pulmonares, de ovario, de colon, hepáticas, de cabeza y cuello y de vesícula biliar.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención está relacionada a un anticuerpo o un fragmento del mismo de unión al antigeno, el cual (i) se une a un péptido que contiene la secuencia de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) o EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) y/o (ii) se une a claudina 18.2 (CLDN18.2), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo se une a CLDN18.2 mediante la unión en al menos un epitopo en CLDN18.2 conteniendo la secuencia de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) o EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

En una modalidad, dicha CLDN18.2 es la CLDN18.2 de superficie celular unida a la membrana. En una modalidad, dicha CLDN18.2 está presente en células cancerosas, donde dichas células cancerosas son células cancerosas que expresan preferentemente CLDN18.2. En una modalidad, dichas células cancerosas son seleccionadas de entre un grupo consistente de células cancerosas gástricas, de esófago, pancreáticas, pulmonares, de ovario, de colon, hepáticas, de cabeza y cuello y de vesícula biliar. En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención no se une a células no cancerosas excepto a células epiteliales estomacales. En una modalidad, un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la invención no se une a células de pulmón no cancerosas. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado. En una modalidad, un anticuerpo de la invención es un anticuerpo monoclonal.

En estos aspectos y los siguientes relacionados la presente invención se relaciona a un anticuerpo que comprende: (I) una cadena pesada del anticuerpo que comprende: (i) una secuencia de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma, (ii) al menos una, preferentemente dos, más preferentemente las tres secuencias CDR de una secuencia de una cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con SEQ TD NO: 7 o una variante de la misma, o (iii) una secuencia CDR3 de acuerdo con SEQ ID NO: 10 o una variante de la misma y preferentemente que comprenda una secuencia CDRl de acuerdo con SEQ ID NO: 8 o una variante de la misma y/o una secuencia CDR2 de acuerdo con SEQ ID NO: 9 o una variante de la misma, y/o (II) una cadena ligera del anticuerpo que comprende: (i) una secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 11 o una variante de la misma, (ii) al menos una, preferentemente dos, más preferentemente las tres secuencias CDR de una secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 11 o una variante de la misma, o (iii) una secuencia CDR3 de acuerdo con SEQ ID NO: 14 o una variante de la misma y preferentemente que comprende una secuencia CDR1 de acuerdo con SEQ ID NO: 12 o una variante de la misma y/o una secuencia CDR2 de acuerdo con SEQ ID NO: 13 o una variante de la misma.

En los aspectos anteriores y siguientes la presente invención también se relaciona a un anticuerpo que comprende: (I) una cadena pesada del anticuerpo que comprende: (i) una secuencia de la cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, (ii) al menos una, preferentemente dos, más preferentemente las tres secuencias CDR de una secuencia de una cadena pesada del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 15 o una variante de la misma, o (iii) una secuencia CDR3 de acuerdo con SEQ ID NO: 18 o una variante de la misma y preferentemente que comprenda una secuencia CDR1 de acuerdo con SEQ ID NO: 16 o una variante de la misma y/o una secuencia CDR2 de acuerdo con SEQ ID NO: 17 o una variante de la misma, y/o (II) una cadena ligera del anticuerpo que comprende: (i) una secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, (ii) al menos una, preferentemente dos, más preferentemente las tres secuencias CDR de una secuencia de la cadena ligera del anticuerpo de acuerdo con SEQ ID NO: 19 o una variante de la misma, o (iii) una secuencia CDR3 de acuerdo con SEQ ID NO: 22 o una variante de la misma y preferentemente que comprenda una secuencia CDRl de acuerdo con SEQ ID NO: 20 o una variante de la misma y/o una secuencia CDR2 de acuerdo con SEQ ID NO: 21 o una variante de la misma.

En modalidades preferidas, un anticuerpo de la invención comprende una cadena pesada del anticuerpo que comprende una región constante gama-1 de la cadena pesada, preferentemente una región constante gama-1 de la cadena pesada humana y/o comprende una cadena ligera del anticuerpo que comprende una región constante kappa de la cadena ligera.

En los aspectos anteriores y siguientes la presente invención se relaciona a un anticuerpo producido mediante u obtenido mediante un hibridoma celular depositado en el DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y conteniendo una de las siguientes designaciones y números de acceso: 1. muAB 43-14A, no. acceso DSM ACC3144, depositado el 6 de octubre, 2011; o 2. muAB 35-22A, no. acceso DSM ACC3143, depositado el 6 de octubre, 2011.

Los anticuerpos de la invención son designados aquí refiriéndose a la designación del anticuerpo y/o mediante la referencia al clon que produce el anticuerpo, por ejemplo, muAB 43-14A.

Otros anticuerpos preferentes son aquellos con la especificidad de los anticuerpos producidos y obtenidos mediante los hibridomas arriba descritos y, en particular, aquellos que comprenden una porción de unión al antigeno o sitio de unión al antigeno, en particular una región variable, idéntica o altamente homologa a aquella de los anticuerpos producidos y obtenidos mediante los hibridomas arriba descritos. Se contempla que los anticuerpos preferentes son aquellos que poseen regiones CDR idénticas o altamente homologas a las regiones CDR de los anticuerpos producidos y obtenidos mediante los hibridomas arriba descritos. Por "altamente homólogo" se considera que de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, como de l a 3 o l a 2 sustituciones se pueden realizar en cada región CDR. Los anticuerpos particularmente preferentes son las formas quiméricas y humanizadas de los anticuerpos producidos y obtenidos mediante los hibridomas arriba descritos.

Por lo tanto, un anticuerpo de la invención puede ser seleccionado de entre el grupo que consiste de (i) un anticuerpo producido u obtenido mediante un clon depositado bajo el no. de acceso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) o DSM ACC3143 (muAB 35-22A), (ii) un anticuerpo el cual es una forma quimérica o humanizada del anticuerpo en (i), (iii) un anticuerpo el cual posee la especificidad del anticuerpo en (i), y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión o el sitio de unión al antígeno del anticuerpo en (i). La porción de unión al antígeno o el sitio de unión al antígeno en (i) pueden comprender la región variable del anticuerpo en (i). Además, incluidos -en la presente invención, están los fragmentos de unión al antígeno de los anticuerpos aquí descritos.

Un anticuerpo de la invención es capaz de unirse preferentemente a CLDN18.2 en su estado nativo, es decir, en su estado natural no desnaturalizado, o en su estado desnaturalizado.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención se puede obtener mediante un método que comprende la etapa de inmunizar a un animal con un péptido con, que consiste preferentemente de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, o un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o una célula hospedera que exprese dicho péptido. Dichos péptidos preferentes comprenden no más de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, o 20 aminoácidos contiguos de CLDN18.2.

En una modalidad, un anticuerpo de la invención se puede obtener mediante un método que comprende la etapa de inmunizar a un animal con un péptido con, que consiste preferentemente de la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o una célula hospedera que exprese dicho péptido. Dichos péptidos preferentes comprenden no más de 110, 100, 90, 80, o 75 aminoácidos contiguos de CLDN18.2.

Los anticuerpos o los fragmentos de unión al antigeno de la invención pueden estar acoplados, es decir, ligados covalente o no covalentemente, a otros grupos como marcas detectables.

La presente invención también se relaciona a una célula como la célula de hibridoma que produce un anticuerpo como se describe aquí.

Las células preferentes del hibridoma son aquellas depositadas en el DSMZ (Inhoffenstr.7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y contienen una de las siguientes designaciones y números de acceso: 1. muAB 43-14A, no. acceso DSM ACC3144, depositadas el 6 de octubre, 2011; o 2. muAB 35-22A, no. acceso DSM ACC3143, depositadas el 6 de octubre, 2011.

La presente invención también se relaciona a un péptido que comprende, preferentemente consistente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 6, o a un péptido inmunológicamente equivalente. Dicho péptido preferente comprende no más de 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, o 20 aminoácidos contiguos de CLDN18.2.

La presente invención también se relaciona a un péptido que comprende, preferentemente consistente de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 o SEQ ID NO: 25, o un péptido inmunológicamente equivalente, o un ácido nucleico o una célula hospedera que exprese dicho péptido. Dichos péptidos preferentes comprenden no más de 110, 100, 90, 80, o 75 aminoácidos contiguos de CLDN18.2.

La presente invención también se relaciona a secuencias de ácidos nucleicos que comprenden genes o secuencias de ácidos que codifican anticuerpos o partes del mismo, por ejemplo una cadena de anticuerpo, o fragmentos de unión al antigeno, o péptidos como los aquí descritos. Preferentemente, el ácido nucleico de la invención está unido operativamente a los elementos del control de expresión que permiten la expresión en células eucariontes o procariontes. Los elementos de control que aseguran la expresión en células eucariontes o procariontes son bien conocidos por los téenicos especializados.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar comprendidos en un vector, por ejemplo, un plásmido, cósmido, virus, bateriófago u otro vector utilizado convencionalmente por ejemplo en ingeniería genética. El vector puede comprender otros genes como genes marcadores que permitan la selección del vector en una célula hospedera adecuada y bajo condiciones adecuadas. Además, el vector puede comprender elementos de control de expresión que permitan la expresión correcta de las regiones codificantes en los huéspedes adecuados. Dichos elementos de control son bien conocidos por el especialista y pueden incluir un promotor, un casete de empalme y un codón de inicio de la traducción.

Los métodos de construcción de moléculas de ácidos nucleicos, de construcción de vectores con moléculas de ácidos nucleicos, de introducción de vectores en células huésped elegidas apropiadamente, o de causa o logro de expresión de moléculas de ácido nucleico son bien conocidos por el especialista.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a una célula hospedera que comprende un ácido nucleico o vector como se discute aquí.

Otro aspecto de la presente invención se relaciona a la detección de células con expresión de CLDN18.2 o CLDN18.2 o a la determinación de la cantidad de células con expresión de CLDN18.2 o CLDN18.2 utilizando un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de la invención. Las células con expresión de CLDN18.2 o CLDN18.2 son detectadas o la cantidad de células con expresión de CLDN18.2 o CLDN18.2 es determinada por medio de la detección o determinación de la cantidad de un complejo entre de CLDN18.2 con un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención. La formación de un complejo indica la presencia de células con expresión de CLDN18.2 o CLDN18.2. Dicha detección o determinación de la cantidad debe llevarse a cabo en varios modos, incluyendo pero no limitado a inmunodetección utilizando un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención. Los métodos que utilizan anticuerpos para detectar péptidos o proteínas son bien conocidos e incluyen ELISA, ensayos de unión competitiva y similares. En general, dichos ensayos utilizan un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente al péptido o proteína blanco directa o indirectamente unidos a un marcador que proporciona la detección, por ejemplo, enzimas indicadoras, radioetiquetado, fluoróforos o partículas paramagnéticas. Los métodos de la invención permiten evaluaciones relativas cuantitativas y/o cualitativas de los niveles de células con expresión de CLDN18.2 o de CLDN18.2.

En un aspecto, la presente invención se relaciona a un método para la detección de CLDN18.2 o la determinación de la cantidad de CLDN18.2 en una muestra que comprende las etapas (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención o un conjugado de la invención y (ii) detectar la formación de un complejo o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

En una modalidad, la muestra es una muestra celular, es decir, una muestra que consiste en células tales como células cancerosas. En esta modalidad, el complejo es formado preferentemente entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresado por las células en dicha muestra.

En un aspecto, la presente invención se relaciona a un método para determinar si las células expresan CLDN18.2 que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención o un conjugado de la invención y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresado por las células en dicha muestra.

En una modalidad, las células en la muestra son células cancerosas. El complejo es preferentemente formado entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresado por las células en dicha muestra.

Otros aspectos de la presente invención se relacionan a métodos de diagnóstico o clasificación de las enfermedades mediante la selección de CLDN18.2 como blanco utilizando un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención. Estos métodos proporcionan una detección selectiva de células que expresan CLDN18.2 diferenciando asi estas células de las normales que no expresan CLDN18.2 o células enfermas que no expresan CLDN18.2. Las enfermedades caracterizadas por las células que expresan CLDN18.2 son tratables mediante una terapia dirigida a CLDN18.2 como la terapia con anticuerpos terapéuticos dirigidos contra CLDN18.2. Las enfermedades preferentes para una terapia o diagnóstico son aquellas en las cuales CLDN18.2 se expresa o se expresa aberrantemente, en particular cánceres, como aquellos aquí descritos.

En un aspecto la presente invención se relaciona a métodos de diagnóstico, detección o monitoreo, es decir, la determinación de regresión, progresión, evolución y/o inicio de un cáncer que comprende la detección de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 y/o la determinación de la cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 en una muestra biológica aislada de un paciente utilizando un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención. Dichos métodos pueden ser utilizados para detectar si un sujeto presenta un cáncer o está en un riesgo (elevado) de desarrollar un cáncer o, por ejemplo, si un esquema de tratamiento es eficiente.

Asi, en un aspecto, la presente invención se relaciona a un método de diagnóstico, detección o monitoreo de cáncer, que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra con un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención o un conjugado de la invención y (ii) detectar la formación de un complejo y/o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

En una modalidad, la muestra biológica es una muestra celular, es decir, una muestra que consiste en células tales como células cancerosas. En esta modalidad, el complejo es formado preferentemente entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresado por las células en dicha muestra.

Los métodos de monitoreo de acuerdo con la invención preferentemente comprenden una detección y/o determinación de la cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 en una primera muestra a un primer tiempo clave en el tiempo y en otra muestra a un segundo tiempo clave en el tiempo, donde la regresión, progresión, evolución y/o inicio de una enfermedad neoplásica puede estar determinada por medio de la comparación de las dos muestras.

Normalmente, el nivel de células que expresan CLDN18.2 o CLDNl8.2en una muestra biológica es comparado con un nivel de referencia, donde una desviación de dicho nivel de referencia indica la presencia y/o etapa de un cáncer en un paciente. El nivel de referencia puede ser un nivel determinado en una muestra control (por ejemplo, de un tejido o sujeto sano, en particular un paciente sin un cáncer) o un nivel medio de los sujetos sanos. Una "desviación" de dicho nivel de referencia designa cualquier cambio significativo, como un aumento de al menos 10%, 20%, o 30%, preferentemente por al menos 40% o 50%, o aún más.

Preferentemente, la presencia de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 y/o una cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 que está incrementada comparada con el nivel de referencia, por ejemplo, comparada con un paciente sin cáncer, indica la presencia de o riesgo de (por ejemplo, un potencial para o un desarrollo de) una enfermedad neoplásica en el paciente.

Una cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 que está disminuida comparada con una muestra biológica tomada previamente de un paciente puede indicar regresión, una evolución positiva, por ejemplo, un tratamiento exitoso, o un riesgo reducido de un inicio de un cáncer en un paciente.

Una cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 que está incrementada comparada con una muestra biológica tomada previamente de un paciente puede indicar una progresión, una evolución negativa, por ejemplo, un tratamiento no exitoso, recurrencia o comportamiento metastásico, un inicio o un riesgo de inicio de cáncer en dicho paciente.

En un aspecto, la presente invención se relaciona a un método para determinar sui un cáncer es tratable mediante una terapia dirigida contra CLDN18.2 que comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que consiste en células cancerosas con un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de la invención o un conjugado de la invención y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

El complejo se forma preferentemente entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresado por las células cancerosas en dicha muestra.

Tales métodos pueden ser utilizados para detectar si un paciente es adecuado para someterse a una terapia que involucra la selección de células que expresan CLDN18.2 como blanco, como un a terapia que utiliza anticuerpos que ejercen una o más funciones efectoras como anticuerpos específicos CLDN18.2 citotóxicos, por ejemplo los anticuerpos marcados con una sustancia citotóxica tal como una toxina o un marcador radioactivo o un mecanismo de inducción de muerte celular como CDC o ADCC. Las enfermedades caracterizadas por células enfermas que expresan CLDN18.2 son tratables mediante una terapia dirigida contra CLDN18.2, tales como neoplasias malignas, en particular aquellas aquí descritas.

En una modalidad de alguno de los aspectos anteriores, la muestra, muestra celular o muestra biológica proviene de un paciente con una enfermedad neoplásica, con sospecha de tener o estar enfermo de una neoplasia maligna o con potencial de cáncer.

En una modalidad, la muestra, muestra celular o muestra biológica proviene de un tejido u órgano donde las células no expresan sustancialmente CLDN18.2 cuando el tejido u órgano está libre de cáncer. Preferentemente dicho tejido es un tejido distinto a tejido de tejido de estómago. Preferentemente, dicho tejido es tejido de pulmón, esófago, páncreas o glándula mamaria y el tejido u órgano opcionalmente ya ha sido diagnosticado como afectado por un cáncer, por ejemplo, mediante examen visual o pruebas de células en cultivo de dicho tejido y órgano. En esta modalidad, la presencia de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 y/o una cantidad de células que expresan CLDN18.2 o CLDN18.2 que está incrementada comparada con un nivel de referencia, por ejemplo, comparada con un paciente sin una enfermedad neoplásica, puede indicar que un paciente es adecuado para una terapia que involucra la selección de células que expresan CLDN18.2 como blanco.

En un aspecto, la invención proporciona las composiciones, por ejemplo, composiciones de diagnóstico, o kits, que comprenden un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo o una combinación de anticuerpos y/o o fragmentos de unión al antigeno aquí descritos. Dichas composiciones de diagnóstico o kits de prueba son útiles en los métodos de la invención, tales como los métodos para diagnóstico, detección o monitoreo de la invención. Estos kits pueden consistir opcionalmente de un marcador de detección, por ejemplo enzimas indicadoras, marcas radioactivas, fluoróforos, o partículas paramagnéticas. Los kits pueden incluir folletos informativos, por ejemplo, folletos que informen cómo utilizar los reactivos para llevar a cabo un método aquí discutido.

Otras características y ventajas de la invención actual serán aparentes a partir de la descripción detallada a continuación y las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Alineamiento de secuencias de las proteínas claudina 18 (humana/murina) El alineamiento de secuencias muestra la alta homología entre claudina 8.2 de humano y de ratón y entre Claudina 18.1 y Claudina 18.2 humanas.

Figura 2: Proteína recombinante, incluyendo la parte carboxilo terminal de CLDN18.2 (aal91-261) utilizada para la inmunización de los ratones.

Figura 3: Análisis de secuencia de los anticuerpos 43- 14A y 35-22A.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Aunque la presente invención se describe en detalle a continuación, debe entenderse que esta invención no está limitada a las metodologías particulares, protocolos y reactivos aquí descritos ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología aquí utilizada es con el propósito de describir sólo modalidades particulares y no intenta limitar el alcance de la presente invención la cual será limitada sólo por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos téenicos y científicos aquí utilizados tienen los mismos significados como los que son comúnmente entendidos por un técnico ordinario en la materia.

A continuación, los elementos de la presente invención serán descritos. Estos elementos están enlistados con modalidades específicas, sin embargo, debe entenderse que pueden combinarse de cualquier modo y en cualquier número para crear modalidades adicionales. Los múltiples ejemplos descritos y modalidades preferidas no deberán ser interpretadas para limitar la presente invención a únicamente las modalidades descritas expresamente. Esta descripción deberá ser entendida para apoyar e incluir modalidades que combinen las modalidades explícitamente descritas con cualquier número de los elementos discutidos y/o preferentes. Además, todas las permutaciones y combinaciones de todos los elementos descritos en esta solicitud deberán ser considerados como discutidos por la descripción de la presente solicitud a menos que el contexto indique lo contrario.

Preferentemente, los términos aquí utilizados son definidos como descritos en "A multilingual glossary of biotechnological terms : ( IUPAC Recommendations ) ", H.G.W.

Leuenberger, B. Nagel, and H. Kólbl, Eds., Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza, (1995).

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de téenicas de química, bioquímica, biología celular, inmunología y de ADN recombinante, las cuales son explicadas en la literatura del campo (compare con, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edición, J. Sambrook et al. eds., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor 1989).

A lo largo de esta especificación y las reivindicaciones que se presentan a continuación, a menos que el contexto demande lo contrario, la palabra "comprenden", y variaciones como "comprende" y "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un miembro establecido, integrante o paso o grupo de miembros, integrantes o etapas aunque en algunas modalidades como otro miembro, integrante o etapa o grupo de miembros, integrantes o etapas puedan estar excluidos, es decir, el tema de discusión consiste en la inclusión de un miembro establecido, integrante o etapa o grupo de miembros, integrantes o etapas. Los términos "un/una" y "unos/unas" y "el/la/los/las" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones) serán interpretadas para cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario aquí o sea claramente contradictorio por el contexto. La declaración de los rangos de valores aquí es con el mero propósito de servir como un método abreviado de referirse individualmente a cada valor por separado que cae dentro del rango, A menos que se indique lo contrario aquí, cada valor individual es incorporado en la especificación como si fuera individualmente declarado aquí. Todos los métodos aquí descritos pueden llevarse a cabo en cualquier orden apropiado a menos que se indique lo contrario aquí o que sea claramente contradictorio por el contexto. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o el lenguaje de ejemplos (por ejemplo, "tal como"), aquí provisto tiene la mera intención de ilustrar mejor la invención y no constituye una limitación del alcance de la invención a menos que se indique lo contrario. No deberá interpretarse ningún lenguaje en la especificación como lo indica cualquier elemento no declarado como esencial para la práctica de la invención.

Varios documentos son citados a lo largo del texto de esta especificación. Cada documento aquí citado (incluyendo todas las patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones de fabricación, instrucciones, etc.), ya sea supra o infra, son aquí incorporadas como referencia en su totalidad. Nada de lo presente deberá ser interpretado como un reconocimiento de que la invención no tiene derecho a preceder dicha divulgación en virtud de una invención previa.

El término "recombinante" en el contexto de la presente invención quiere decir "hecho por medio de ingeniería genética". Preferentemente, un "objeto recombinante" como una célula recombinante en el contexto de la presente invención no ocurre naturalmente.

El término "ocurre naturalmente" como aquí se utiliza se refiere al hecho de que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, un péptido o ácido nucleico que está presente en un organismo (incluyendo virus) y puede ser aislado de una fuente en la naturaleza y el cual no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio ocurre naturalmente.

El término "antígeno" se relaciona a un agente que comprende un epítopo contra el cual se dirige y/o genera una respuesta inmunitaria. Preferentemente, un antígeno en el contexto de la presente invención es una molécula que, opcionalmente después de procesada, induce una reacción inmune, la cual es preferentemente específica para el antígeno. El término "antígeno" incluye en particular proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, especialmente ARN y ADN, y nucleótidos.

El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico en una molécula, es decir, a la parte en una molécula que es reconocida por el sistema inmunitario, por ejemplo, que es reconocida por un anticuerpo. Por ejemplo, los epitopos son los sitios discretos, tridimensionales en un antigeno, los cuales son reconocidos por el sistema inmunitario. Los epitopos consisten normalmente de grupos de moléculas químicamente activos, como aminoácidos o cadenas laterales de carbohidratos y normalmente poseen características estructurales tridimensionales específicas, así como características especiales de carga. Los epitopos conformacionales y no conformacionales se distinguen en que el sitio de los primeros pero no de los segundos se pierde en la presencia de solventes desnaturalizantes, Un epítopo de una proteína como CLDN preferentemente comprende una porción continua o discontinua de dicha proteína y preferentemente es de entre 5 y 100, preferentemente entre 5 y 50, más preferentemente entre 8 y 30, mucho más preferentemente entre 10 y 25 aminoácidos de longitud, por ejemplo, el epítopo puede ser preferentemente de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, o 25 aminoácidos de longitud .

El término "epítopo discontinuo" como aquí se utiliza, se refiere a un epítopo conformacional en un antígeno de proteina que está formado de al menos dos regiones separadas en la secuencia primaria de la proteina.

En una modalidad preferida, un antigeno es un antígeno asociado a tumor, como CLDN18.2, es decir, un constituyente de células cancerosas que pueden derivarse del citoplasma, la superficie celular y el núcleo celular, en particular aquellos antígenos que son producidos, preferentemente en grandes cantidades, intracelularmente o como antígenos de superficie en células cancerosas.

En el contexto de la presente invención, los términos "antígeno asociado a tumor" o "antígeno de tumor" se relacionan a las proteínas que bajo condiciones normales se expresan específicamente en un número limitado de órganos y/o tejidos o en etapas del desarrollo específicas, por ejemplo, el antígeno asociado a tumor puede expresarse bajo condiciones normales en el tejido estomacal, preferentemente en la mucosa gástrica, en los órganos reproductivos, por ejemplo, en testículos, tejido trofoblástico, por ejemplo, en placenta, o en células de línea germinal, y están expresadas o aberrantemente expresadas en uno o más tejidos neoplásicos o tumores. En este contexto, "un número limitado" preferentemente significa no más de 3, más preferentemente no más de 2. Los antígenos asociados a tumor en el contexto de la presente invención incluyen, por ejemplo, antigenos de diferenciación, preferentemente antigenos de diferenciación específicos de tipo celular, es decir, proteínas que bajo condiciones normales están expresadas específicamente en un cierto tipo celular en una cierta etapa de diferenciación, antígenos de cáncer/testículos, es decir, proteínas que bajo condiciones normales se expresan específicamente en testículos y a veces en placenta, y antígenos específicos de línea germinal. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor está preferentemente asociado a la superficie celular de una célula cancerosa y no está preferentemente o sólo raramente expresado en tejidos normales. Preferentemente, el antígeno asociado a tumor o la expresión aberrante del antígeno asociado a tumor identifica a las células cancerosas. En el contexto de la presente invención, el antígeno asociado a tumor que está expresado por una célula cancerosa en un sujeto, por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad neoplásica, es preferentemente una proteína propia en dicho sujeto. En modalidades preferidas, el antígeno asociado a tumor en el contexto de la presente invención está expresado bajo condiciones normales específicamente en un tejido u órgano que no es esencial, es decir, tejidos u órganos que cuando se han dañado por el sistema inmunitario no produce la muerte del sujeto, o en órganos o estructuras del cuerpo que no son o son difícilmente accesibles al sistema inmunitario. Preferentemente, la secuencia de aminoácidos del antígeno que se expresa en tejidos normales y el antígeno asociado a tumor que se expresa en tejidos neoplásicos.

Algunos ejemplos de antígenos de diferenciación que cumplen idealmente con los criterios de los antígenos asociados a tumor como estructuras blanco en inmunoterapia de tumores, en particular, en vacunación contra tumores, son las proteínas de superficie celular de la familia Claudina, tal como CLDN18.2. Las claudinas son una familia de proteínas que conforman los componentes más importantes de las zonas de oclusión, donde estas establecen la barrera paracelular que controla el flujo de moléculas en el espacio intercelular entre las células de un epitelio. Las claudinas son proteínas transmembranales que cruzan la membrana 4 veces con los extremos amino y carboxilo terminal localizados en el citoplasma.

El término "claudina 18" o "CLDN18" se relaciona preferentemente a la CLDN18 humana e incluye cualquier variante por empalme, tales como CLDN18.1 y CLDN18.2 de CLDN18. CLDN18.1 y CLDN18.2 difieren en la parte amino terminal la cual comprende la primera región transmembranal (TM) y el asal, mientras que la secuencia primaria de la proteína del carboxilo terminal es idéntica.

El término "CLDN18.1" se relaciona preferentemente a la CLDN18.1 humana, y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1 de la lista de secuencia o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

El término "CLDN18.2" se relaciona preferentemente a la CLDN18.2 humana, y, en particular, a una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 la lista de secuencia o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.

El término "variante" de acuerdo con la invención se refiere, en particular, a los mutantes, variantes por empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos entre especies, en particular aquellas que están presentes naturalmente. Una variante alélica se relaciona a una alteración en la secuencia normal de un gen, significancia que a menudo no es clara. La secuencia completa del gen a menudo identifica muchas variantes alélicas para un gen dado. Un homólogo entre especies es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie de origen diferente de aquella de una secuencia dada de ácido nucleico o aminoácido Los términos "CLON", "CLDN18", "CLDN18.1" y "CLDN18.2" incluirán todas las variantes modificadas post-traduccionalmente y variantes de conformación.

CLDN18.2 está expresada selectivamente en tejidos normales en células epiteliales diferenciadas de la mucosa gástrica. CLDN18.2 está expresada en neoplasias de varios orígenes, y es particularmente adecuado como estructura blanco para el desarrollo de la inmunoterapia de cáncer mediada por anticuerpo debido a su expresión selectiva (sin expresión en un tejido normal de toxicidad relevante) y localización a la membrana plasmática. Por ejemplo, se ha encontrado que CLDN18.2 se expresa en carcinoma pancreático, carcinoma de esófago, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma de glándula mamaria y tumores ENT. CLDN18.2 es un blanco valioso para la prevención y/o tratamiento de tumores primarios, como cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer pancreático, cáncer de pulmón como cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC), cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer hepático, cáncer de cabeza y cuello, y cáncer de vesícula biliar y metástasis de los mismos, en particular cáncer metastásico gástrico como tumores de Krukenberg, metástasis peritoneal y metástasis a ganglios linfáticos. Las células que expresan CLDN18.2 son preferentemente células cancerosas y están seleccionadas de un grupo que consiste en células cancerosas tumorigénicas gástricas, de esófago, pancreáticas, de pulmón, de ovario, hepáticas, de cabeza-cuello y de vesícula biliar.

De acuerdo con la invención, una célula que expresa CLDN18.2 se caracteriza preferentemente por CLDN18.2 de superficie celular unida a la membrana, es decir, CLDN18.2 está asociada con la superficie celular. Además, de acuerdo con la invención, la CLDN18.2 celular es CLDN18.2 preferentemente de superficie celular, unida a la membrana. Una célula que expresa CLDN18.2 o una célula caracterizada por asociación de CLDN18.2 con su superficie celular es preferentemente una célula cancerosa, preferentemente una célula cancerosa de un cáncer aquí descrito.

El término "asociado a la superficie celular" quiere decir que un antígeno asociado a tumor como CLDN18.2 está asociado con y localizado en la membrana plasmática de una célula, donde al menos una parte del antígeno asociado al tumor se orienta hacia el espacio extracelular de dicha célula y es accesible desde fuera de dicha célula, por ejemplo, a anticuerpos localizados fuera de la célula. En este contexto, una parte es preferentemente de al menos 4, preferentemente de al menos 8, preferentemente de al menos 12, más preferentemente de al menos 20 aminoácidos. La asociación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, la asociación puede ser mediante uno o más dominios transmembranales, uno o más anclajes lipidíeos, o medíante la interacción con cualquier otra proteína, lípido, sacárido u otra estructura que pueda encontrarse en la cara externa de la membrana plasmática de una célula. Por ejemplo, un antígeno asociado a tumor asociado con la superficie de una célula puede ser una proteína transmembranal con una porción extracelular o quizá una proteína asociada con la superficie de una célula mediante interacción con otra proteína que es una proteína transmembranal.

"Superficie celular" o "superficie de una célula" son utilizados de acuerdo con su significado normal en el campo, y por lo tanto incluye el exterior de la célula, el cual es accesible a proteínas de unión y otras moléculas.

De acuerdo con la invención, CLDN18.2 no se expresa sustancialmente en una célula y no está sustancialmente asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación sobrepasa el nivel de expresión y asociación en tejido no canceroso distinto a estómago por no más de 2 veces, 1.5 veces preferentemente, y preferentemente no sobrepasa el nivel de expresión y asociación en dicho tejido no canceroso. Preferentemente, CLDN18.2 no está sustancialmente expresada en una célula y no está sustancialmente asociada con una superficie celular si el nivel de expresión o asociación está por debajo el límite de detección y/o si el nivel de expresión o asociación es muy bajo como para permitir la unión de anticuerpos específicos contra CLDN18.2 agregados a las células.

De acuerdo con la invención, CLDN18.2 se expresa en una célula y está asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación sobrepasa el nivel de expresión y asociación en tejido no canceroso distinto al de estómago, preferentemente por no más de 2 veces, preferentemente 10 veces, 100 veces, 1000 veces o 10000 veces. Preferentemente, CLDN18.2 se expresa en una célula y está asociada con una superficie celular si el nivel de expresión y asociación es lo suficientemente alto como para permitir una unión por medio de anticuerpos específicos contra CLDN18.2 añadidos a las células.

El término "anticuerpo" se refiere a una glucoproteína que comprenda al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, e incluye, sin limitación, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos de una sola cadena, por ejemplo, scFv y fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno tales como fragmentos Fab y Fab' y además incluye todas las formas recombinantes de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos expresados en procariontes, anticuerpos no glucosilados, y todos los fragmentos de anticuerpo de unión al antígeno y derivados, tal como aquí se describe. Cada cadena pesada está comprendida de una región de cadena pesada variable (aquí abreviada como VH) y una región de cadena pesada constante. Cada cadena ligera está comprendida de una región de cadena ligera variable (aquí abreviada como VL) y una región de cadena ligera constante. Las regiones VH y VL pueden ser además subdividirse en regiones de hipervariabilidad, determinadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas cono regiones que son más conservadas, determinadas regiones de armazón (FR). Cada VH y VL está compuesta de tres CDR y cuatro FR, con un arreglo del amino terminal al carboxilo terminal en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con el antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina y los tejidos o factores del hospedero, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema clásico del complemento.

Los anticuerpos aquí descritos pueden ser anticuerpos humanos. El término "anticuerpo humano", tal como aquí se utiliza, tiene la intención de incluir anticuerpos que contienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal de humano (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vi tro o por mutación somática in vivo) .

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a una molécula que tiene un sitio de unión de antígeno que está sustancialmente derivado de una inmunoglobulina proveniente de una especie no humana, donde la estructura restante de la inmunoglobulina de la molécula se basa en la estructura y/o secuencia de una inmunoglobulina humana. El sitio de unión al antígeno puede comprender ya sea dominios variables completos fusionados en regiones de armazón constantes o sólo las regiones determinantes de complementariedad (CDR) insertadas en regiones de armazón apropiadas en los dominios variables. Los sitios de unión al antígeno pueden ser de tipo natural o modificados mediante una o más sustituciones de aminoácidos, por ejemplo, modificados para parecerse más a las inmunoglobulinas humanas. Algunas formas de anticuerpos humanizados preservan todas las secuencias CDR (por ejemplo un anticuerpo humanizado de ratón contiene las 6 CDR del anticuerpo de ratón). Otras formas tienen una o más CDR, las cuales están alteradas con respecto al anticuerpo original.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a aquellos anticuerpos donde una porción de cada una de las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera es homólogo a las secuencias correspondientes en los anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase particular, mientras que el segmento restante de la cadena es homólogo a las secuencias correspondientes en otra. Normalmente, la región variable de las cadenas ligera y pesada imitan las regiones variables de los anticuerpos derivados de una especie de mamíferos, mientras las porciones constantes son homologas a las secuencias de anticuerpos derivados de otra. Una ventaja clara de dichas formas quiméricas es que la región variable puede derivarse convenientemente de fuentes conocidas presentes utilizando células B disponibles inmediatamente o hibridomas provenientes de organismos huésped no humanos en combinación con regiones constantes derivadas de, por ejemplo, preparaciones celulares de humano. Mientras la región variable tiene la ventaja de facilitar la preparación y la especificidad no es afectada por la fuente, al presentarse el hecho de que la región constante sea humana, es menos probable que provoque una respuesta inmunitaria de un sujeto humano cuando los anticuerpos sean inyectados, como sucedería si la región constante proviniera de una fuente no humana. Sin embargo, la definición no se limita a este ejemplo particular.

Los términos "porción de unión al antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de unión") o "fragmento de unión al antigeno" de un anticuerpo (o simplemente "fragmento de unión") se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que mantiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Se ha mostrado que la función de unión al antigeno de un anticuerpo puede llevarse a cabo por fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Los ejemplos de fragmentos de unión incluidos en el término "porción de unión al antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en los dominios VL, VH, CL y CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos divalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en los dominios VH y CH; (iv) fragmentos Fv que consisten en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) fragmentos dAb (ard et al., (1989) Nature 341: 544-546), que consisten en un dominio VH; (vi) regiones determinantes de complementariedad (CDR) aisladas, y (vii) combinaciones de dos o más CDR aisladas que pueden estar unidas mediante un conector sintético. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH están codificados por genes separados, se pueden unir utilizando métodos recombinantes, mediante un conector sintético que les permita conformarse como una sola cadena de proteina en la cual el par de regiones VL y VH forman moléculas monovalentes (conocidas como cadena sencilla FV (scFv); véase por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Se tiene la intención de que dichos anticuerpos de cadena sencilla también se incluyan en el término "fragmento de unión al antigeno" de un anticuerpo. Un ejemplo adicional es el dominio de unión de las proteínas de fusión de inmunoglobulina que comprende (i) un polipéptido de dominio de unión fusionado al de un polipéptido de región de bisagra de inmunoglobulina, (ii) una región constante CH2 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada a la región de bisagra, y (iii) una región constante CH3 de cadena pesada de inmunoglobulina fusionada la región constante CH2 . El polipéptido del dominio de unión puede ser una región de cadena pesada variable o una región de cadena ligera variable. Las proteínas de fusión de dominio de unión de inmunoglobulina son posteriormente discutidas en US 2003/0118592 y US 2003/0133939. Estos fragmentos de anticuerpo son obtenidos utilizando téenicas convencionales conocidas por los técnicos especializados, y los fragmentos son evaluados por su utilidad del mismo modo que se hace con los anticuerpos intactos.

Los anticuerpos aquí descritos pueden ser anticuerpos monoclonales. El término "anticuerpo monoclonal" como aquí se utiliza, se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una sola composición molecular, Un anticuerpo monoclonal muestra una sola especificidad y afinidad. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano, por ejemplo, ratón, fusionado a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos aquí descritos pueden ser anticuerpos recombinantes. El término "anticuerpo recombinante", como aquí se utiliza, incluye todos los anticuerpos que son preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico o transcromocosomal con respecto a los genes de inmunoglobulina o un hibridoma preparado a partir de él, (b) anticuerpos aislados de una célula hospedera transformada para expresar el anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca combinatoria de anticuerpos recombinantes, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por algún otro medio que involuere empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina con otras secuencias de ADN.

El término "transfectoma", como aquí se utiliza, incluye células eucariontes hospederas recombinantes, que expresen un anticuerpo, tales como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetales, u hongos, incluyendo levaduras.

Como aquí se utiliza, un "anticuerpo heterólogo" se define en relación a un organismo transgénico que produce un anticuerpo como tal. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia codificadora de ácidos nucleicos que corresponde a la encontrada en un organismo que no consiste en el organismo transgénico, y que es generalmente derivada de otra especie distinta a la del organismo transgénico.

Como aquí se utiliza, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene una cadena ligera y una pesada de organismos de origen diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada de humano que se asocia con una cadena ligera murina es un anticuerpo heterohíbrido.

La invención incluye todos los anticuerpos y derivados de anticuerpos como aquí se describe, los cuales para los propósitos de la invención se incluyen en el término "anticuerpo". El término "derivados de anticuerpo" se refiere a cualquier forma modificada de un anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos aquí descritos son preferentemente aislados. Un "anticuerpo aislado", como aquí se utiliza, tiene como objeto referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades antigénicas distintas. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o de sustancias químicas.

De acuerdo con la presente invención, un anticuerpo es capaz de unirse a un blanco determinado si tiene una afinidad significativa por dicho blanco predeterminado y se uno a dicho blanco predeterminado en ensayos estándar. "Afinidad" o "afinidad de unión" es a menudo medida mediante la constante de equilibrio de disociación (KD). Preferentemente, el término "afinidad significativa" se refiere a la unión a un blanco predeterminado con una constante de disociación (KD) de 1CT5 M o menor, 106 M o menor, 107 M o menor, 1CT8 M o menor, 10~9M o menor, 1010M o menor, 1CT11M o menor, o 1012M o menor.

Un anticuerpo no es (sustancialmente) capaz de unirse a un blanco si no posee una afinidad significativa por dicho blanco y no se une significativamente, en particular no se une de manera detectable a dicho blanco en ensayos estándar. Preferentemente, el anticuerpo no es detectablemente unido a dicho blando si está presente en una concentración de hasta 2, preferentemente 10, más preferentemente 20, en particular 50 o 100 mg/ml o mayor. Preferentemente, un anticuerpo no posee afinidad significativa por un blanco si se une a dicho blanco con una KD que es de al menos 10 veces más, 100 veces más, 103 veces más, 104 veces más, 105 veces más, o 106 veces más que la KD de la unión al blanco predeterminado al cual el anticuerpo es capaz de unirse. Por ejemplo, si la KD de unión de un anticuerpo al blanco al cual el anticuerpo es capaz de unirse es de 107 M, la KD de unión a un blanco para el cual el anticuerpo no tiene afinidad significativa seria de al menos 106 M, 1CT5 M, 104 M, 103 M, 10~2 M, o 101 M.

Un anticuerpo es especifico para un blanco predeterminado si es capaz de unirse a dicho blanco predeterminado mientras no es capaz de unirse a otros blancos, es decir, no tiene afinidad significativa por otros blancos y no se une significativamente a otros blancos en ensayos estándar. De acuerdo con la invención, un anticuerpo es especifico para CLDN18.2 si es capaz de unirse a CLDN18.2 pero no es (sustancialmente) capaz de unirse a otros blancos, en particular otras proteínas distintas a las proteínas de la familia de Claudina, preferentemente otras proteínas distintas a CLDN18, en particular otras proteínas distintas a CLDN18.2. Preferentemente, un anticuerpo es específico para CLDN18.2 si la afinidad por y la unión a otros blancos no excede significativamente la afinidad por o la unión a proteínas no relacionadas a Claudina tal como albúmina sérica bovina (BSA), caseína, albúmina sérica humana (HSA) o proteínas transmembranales distintas a Claudina, tal como moléculas de MHC o receptor de transferrina o a cualquier otro polipéptido especificado. Preferentemente, un anticuerpo es específico para un blanco predeterminado sí se une a dicho blanco con una KD de al menos 10 veces, 100 veces, 103 veces, 104 veces, 105 veces, o 106 veces menos que la KD de unión a un blanco para el cual no es específico. Por ejemplo, si la KD de unión de un anticuerpo al blanco para el cual es específico es de 10~7 M, la KD de unión a un blanco para el cuela no es específico sería de al menos 106 M, 105 M, 10-4 M, 103 M, 10~2 M, o 101 M.

La unión de un anticuerpo a un blanco puede ser determinada experimentalmente utilizando cualquier método adecuado; véase, por ejemplo, Berzofsky et al., "Anticuerpo-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company Nueva York, N Y (1992), y los métodos aquí descritos. Las afinidades pueden ser inmediatamente determinadas utilizando téenicas convencionales, tales como diálisis en equilibrio; mediante el uso del instrumento BIAcore 2000, utilizando procedimientos generales resumidos por el fabricante; mediante radioinmunoensayo utilizando antigeno marcado radiactivamente; o mediante otros método conocido por el técnico especializado. Los datos de afinidad podrán ser analizados, por ejemplo, por el método de Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). La afinidad medida de una interacción anticuerpo-antigeno particular puede variar si se mide bajo distintas condiciones, por ejemplo, concentración de sales, pH. De este modo, las medidas de afinidad y otros parámetros de unión al antigeno, por ejemplo, KD, IC50, son preferentemente llevados a cabo con soluciones estandarizadas de anticuerpo y de antígeno, y un amortiguador estandarizado.

Como aquí se utiliza, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (por ejemplo, IgM o IgGl) que es codificado por los genes de la región de cadena pesada constante. Los anticuerpos de acuerdo con la invención incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales e incluyen anticuerpos IgG2a (por ejemplo, IgG2a, k, l), IgG2b (por ejemplo, IgG2b, k, l), IgG3 (por ejemplo, IgG3, k, l) e IgM. Sin embargo, otros isotipos de anticuerpo también son incluidos por la invención, incluyendo anticuerpos IgGl, IgAl, IgA2, IgA de secreción, IgD, e IgE.

Como aquí se utiliza, "cambio de isotipo" se refiere al fenómeno por el cual la clase o isotpio del anticuerpo cambia de una clase de Ig a alguna otra de las clases de Ig.

El término "rearreglado" como aquí se utiliza, se refiere a una configuración de un locus de cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina, donde un segmento V está posicionado inmediatamente adyacente a un segmento D-J o J en una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus de un gen de inmunoglobulina rearreglada (anticuerpo) puede identificarse mediante una comparación con el ADN de la linea germinal; un locus rearreglado tendrá al menos un elemento de homología heptamérico/nonamérico recombinado.

El término "sin rearreglo" o "configuración de línea germinal" como aquí se utiliza en referencia a un segmento V se refiere a la configuración donde el segmento V no está recombinado, de tal modo que se encuentra adyacente inmediatamente a un segmento D o J.

De acuerdo con la invención, los anticuerpos pueden derivar de diferentes especies, incluyendo pero no limitado a ratón, rata, conejo, conejillo de indias y humano. Los anticuerpos también incluyen moléculas quiméricas en las cuales la región constante de un anticuerpo derivada de una especie, preferentemente humano, es combinada con el sitio de unión al antigeno derivado de otra especie. Además, los anticuerpos incluyen moléculas humanizadas en las cuales los sitios de unión al antigeno de un anticuerpo derivado de especies no humanas son combinados con regiones constantes y de armazón de origen humano.

Los anticuerpos pueden ser producidos mediante varias téenicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica estándar de hibridización de células somáticas de Kohler y Milstein, Nature 256: 495 (1975). Aunque los procedimientos de hibridización de células somáticas son preferidos, en principio, otras técnicas de producción de anticuerpos monoclonales pueden ser empleadas, por ejemplo, transformación viral u oncogénica de linfocitos B o expresión en fagos utilizando bibliotecas de genes de anticuerpos.

El sistema animal preferente para la preparación de hibridomas que secreten anticuerpos monoclonales es el sistema murino. La producción de hibridomas en ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos de inmunización y técnicas de aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión son conocidos en la técnica. Los compañeros de fusión (por ejemplo, células de mieloma murino) y los procedimientos de fusión son también conocidos.

Otros sistemas animales preferentes para la preparación de hibridoomas que secreten anticuerpos monoclonales son el sistema de rata y de conejo (por ejemplo, descrito en Spieker-Polet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.92:9348 (1995), véase también Rossi et al., Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

Aún en otra modalidad preferida, los anticuerpos monoclonales dirigidos contra CLDN18.2 pueden ser generados utilizando ratones transgénicos o transcromosomales que acarreen partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos o transcromosomales incluyen ratones conocidos como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y son referidos en conjunto aquí como "ratones transgénicos". La producción de anticuerpos humanos en dichos ratones transgénicos puede realizarse como se describe en detalle para CD20 en W02004 035607.

Aún otra estrategia para generar anticuerpos monoclonales es aislar directamente genes que codifican anticuerpos mediante linfocitos que producen anticuerpos de especificidad definida; véase por ejemplo Babcock et al., 1996; Una estrategia innovadora para generar anticuerpos monoclonales a partir de linfocitos únicos y aislados produce anticuerpos de especificidades definidas. Para detalles de ingeniería de anticuerpos recombinantes véase también Welschof and Kraus, Recombinant antibodes for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8 y Benny K.C. Lo Anticuerpo Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Para generar anticuerpos para CLDN18.2, los ratones pueden ser inmunizados con péptidos conjugados portadores derivados de la secuencia de CLDN18.2, una preparación enriquecida del antígeno CLDN18.2 expresado recombinantemente o fragmentos del mismo y/o células que expresan CLDN18.2 o fragmentos del mismo, como se describió. De modo alternativo, los ratones pueden ser inmunizados con ADN que codifica para la CLDN18.2 humana de tamaño completo o fragmentos de la misma. En el caso de que la inmunización utilizando una preparación purificada o enriquecida de antígeno de CLDN18.2 no resulte en la producción de anticuerpos, los ratones pueden ser también inmunizados con células que expresan CLDN18.2, por ejemplo, una línea celular, para promover respuestas inmunitarias.

La respuesta inmunitaria puede vigilarse durante el curso del protocolo de inmunización obteniéndose las muestras de plasma y suero de la vena de la cola o sangrados retroorbitales. Los ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina anti CLDN18.2 pueden ser utilizados para fusiones. Los ratones pueden ser estimulados intraperitonealmente o intravenosamente con células que expresan CLDN18.23-5 dias antes de sacrificarse y de remover el bazo para aumentar la proporción de hibridomas secretoras de anticuerpo especifico.

Para generar hibridomas que produzcan anticuerpos monoclonales para CLDN18.2, las células de los ganglios linfáticos, bazos o médula ósea obtenidos de ratones inmunizados pueden ser aislados y fusionados con una linea celular inmortalizada apropiada, tal como una linea celular de mieloma de ratón. Los hibridomas resultantes pueden ser después seleccionados por la producción de anticuerpos específicos al antígeno. Los pozos individuales pueden seleccionarse mediante ELISA para identificar hibridomas con secreción de anticuerpo. Mediante inmunofluorescencia y análisis por FACS utilizando células con expresión de CLDN18.2, los anticuerpos con especificidad por CLDN18.2pueden ser identificados. Los hibridomas con secreción de anticuerpo pueden ser subclonados mediante dilución limitante. Después, los subclones estables pueden ser cultivados in vitro para generar anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización.

Los anticuerpos de la invención pueden ser también producidos en un transfectoma de célula hospedera, por ejemplo, una combinación de téenicas de recombinación de ADN y métodos de transfección de genes son bien conocidos en el campo (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, en una modalidad, el o los genes de interés, por ejemplo, genes de anticuerpo, pueden ser ligados en un vector de expresión como un plásmido de expresión eucarionte tal como se utiliza en el sistema de expresión de genes GS, discutido en WO 87/04462, WO 89/01036 y EP 338841 o en otros sistemas de expresión bien conocidos en el campo. El plásmido purificado con los genes de anticuerpos clonados puede ser introducido en células huésped eucariontes como células CHO, células NS/0, células HEK293T o células HEK293 o alternativamente otras células eucariontes como células derivadas de plantas, hongos o levaduras. El método utilizado para introducir estos genes puede ser cualquier método descrito en el campo, como electroporación, lipofectina, lipofectamina u otros. Tras la introducción de estos genes de anticuerpo en las células huésped, las células que expresan el anticuerpo pueden identificarse y seleccionarse. Estas células representan los transfectomas que pueden ser posteriormente amplificados por su nivel de expresión y escalados para producir anticuerpos, Los anticuerpos recombinantes pueden ser aislados y purificados de estos sobrenadantes de cultivo y/o células.

De modo alternativo, los genes de anticuerpo clonados pueden expresarse en otros sistemas de expresión, incluyendo células procariontes, como microorganismos, por ejemplo E. coli. Además los anticuerpos pueden producirse en animales transgénicos no humanos, como en leche de oveja o conejo o en huevos de gallinas, o en plantas transgénicas, véase por ejemplo Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth.216: 165-181; Pollock, et al. (1999) J. Immunol. Meth.231: 147-157; y Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem.380: 825-839.

Los anticuerpos quiméricos son anticuerpos, cuyas distintas porciones se derivan de distintas especies animales, como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo murino y una región constante de inmunoglobulina humana. La quimerización de anticuerpos es lograda mediante la unión de las regiones variables de la cadena pesada y ligera del anticuerpo murino con la región constante de la cadena pesada y ligera humana (por ejemplo, como se describe por Kraus et al., en Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cáncer therapy ISBN-0-89603-918-8). En una modalidad preferida, los anticuerpos quiméricos se generan mediante la unión de la región constante de la cadena ligera kappa a la región variable de la cadena ligera murina. También en una modalidad preferida, los anticuerpos quiméricos pueden ser generados mediante la unión de la región constante de la cadena ligera lambda humana con la región variable de la cadena ligera murina. Las regiones constantes de la cadena pesada preferente para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgGl, IgG3 e IgG4. Otras regiones constantes de la cadena pesada para la generación de los anticuerpos quiméricos son IgG2, IgA, IgD e Ig .

Los anticuerpos interactúan con antigenos blanco predominantemente mediante los residuos de aminoácidos que se localizan en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de las cadenas ligera y pesada. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos en las CDR son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de los CDR. Ya que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones antígeno-anticuerpo, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imiten las propiedades de anticuerpos específicos de ocurrencia natural mediante la construcción de vectores de expresión que incluyan secuencias CDR de un anticuerpo específico de ocurrencia natural insertadas en secuencias de armazón de un anticuerpo diferente con propiedades distintas (véase por ejemplo, Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; y Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. U. S. A.86: 10029-10033). Dichas secuencias de armazón pueden ser obtenidas de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de genes de anticuerpo de linea germinal. Estas secuencias de linea germinal diferirán de las secuencias del gen de anticuerpo maduro porque no incluirán genes variables completamente ensamblados, los cuales son formados por la unión de V (D) J durante la maduración de las células B. Las secuencias de linea germinal también difieren de las secuencias de un repertorio secundario de gran afinidad del anticuerpo en posiciones individuales distribuidas en la región variable. Por ejemplo, las mutaciones somáticas son relativamente poco frecuentes en la porción amino terminal de la región 1 de armazón y en la porción carboxilo terminal de la región 4 de armazón. Además, muchas mutaciones somáticas no alteran significativamente las propiedades de unión del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener la secuencia completa de ADN de un anticuerpo particular para recrear un anticuerpo recombinante intacto que tenga las propiedades de unión similares a aquellas del anticuerpo original (véase WO 99/45962). Las secuencias de cadenas ligera y pesada parciales distribuidas en las regiones CDR son suficientes para este propósito. La secuencia parcial es utilizada para determinar cuál variable de linea germinal y segmentos de genes de unión contribuyen a los genes variables del anticuerpo recombinante. La secuencia de linea germinal es después utilizada para rellenar las porciones faltantes de las regiones variables. Las secuencias líder de las cadenas pesada y ligera son cortadas durante la maduración de la proteina y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Para añadir secuencias faltantes, pueden combinarse secuencias de cADN clonadas con oligonucleótidos sintéticos mediante ligación o amplificación por PCR. De modo alternativo, toda la región variable puede ser sintetizada como un grupo de oligonucleótidos cortos y superpuestos y combinarse mediante amplificación por PCR para crear una clona de región variable sintética completa. Este proceso posee ciertas ventajas, como eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares, u optimización de codones particulares.

Las secuencias de nucleótidos de los transcritos de las cadenas pesada y ligera provenientes de los hibridomas pueden utilizarse para diseñar un grupo superpuesto de oligonucleótidos sintéticos para crear secuencias sintéticas V con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas a las de secuencias naturales. Las secuencias de la cadena sintética pesada y kappa pueden diferir de las secuencias naturales en tres maneras: las cadenas de bases nucleotídicas repetida se interrumpen para facilitar la síntesis de oligonucleótidos y la amplificación por PCR; los sitios de inicio de la traducción óptimos son incorporados de acuerdo con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Bíol. Chem. 266: 19867-19870); y los sitios HindIII se insertan cadena arriba de los sitios de inicio de la traducción.

Tanto para las regiones variables de la cadena ligera como de la pesada, las secuencias optimizadas codificadas optimizadas y las no codificantes correspondientes son cortadas en fragmentos de 30-50 nucleótidos aproximadamente a la mitad del oligonucleótido no codificante correspondiente. Asi, para cada cadena, los oligonucleótidos pueden ensamblarse en grupos de segmentos de doble cadena que se superponen, abarcando segmentos de 150-400 nucleótidos. Los conjuntos son utilizados después como templados para producir productos de amplificación de PCR de 150-5400 nucleótidos. Normalmente, un solo grupo de oligonucleótidos de región variable será separado en dos conjuntos que son amplificados por separado para generar dos productos de PCR de superposición. Estos productos de superposición son después combinados mediante amplificación por PCR para formar la región variable completa. También puede ser deseable incluir un fragmento un fragmento de superposición de la región constante de la cadena pesada o ligera en la amplificación por PCR para generar fragmentos que pueden ser clonados fácilmente en las construcciones de vectores de expresión.

Las regiones variables de las cadenas ligera y pesada reconstruidas por quimerización o humanizadas son después combinadas con secuencias promotoras de clonación, lideres, de inicio de la traducción, de región constante, no traducibles 3', de poliadenilación y término de transcripción, para formar las construcciones del vector de expresión. Las construcciones de expresión de cadena ligera y pesada pueden combinarse en un solo vector, cotransfectadas, transíectadas en serie, o transfectadas por separado en células huésped que son después fusionadas para formar una célula hospedera que exprese ambas cadenas. Los plásmidos utilizados para la construcción de vectores de expresión para IgGx humana son descritos. Los plásmidos pueden ser construidos de tal manera que en la PCR se amplifiquen las secuencias de cADN de las cadenas V pesada y V kappa ligera y puedan utilizarse para reconstruir los minigenes completos de la cadena pesada y ligera. Estos plásmidos pueden utilizarse para expresar anticuerpos IgGl, Kappa o IgG4, Kappa completamente humanos o quiméricos. Plásmidos similares pueden construirse para la expresión de otros isotipos de cadena pesada, o para la expresión de anticuerpos que comprendan cadenas ligeras lambda.

Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de los anticuerpos contra CLDN18.2 aquí descritas, son utilizadas para crear anticuerpos humanizados estructuralmente relacionados contra CLDN18.2 que mantienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, como la unión a CLDN18.2. Más específicamente, una o más regiones CDR de los anticuerpos monoclonales de ratón pueden combinarse por recombinación con regiones de armazón y CDR conocidas para crear anticuerpos contra CLDN18.2 adicionales, recombinantes y humanizados.

La capacidad de un anticuerpo de unirse a CLDN18.2 puede determinarse utilizando ensayos de unión estándar, por ejemplo, ELISA, Western Blot, inmunofluorescencia y análisis por citometría de flujo.

Puede utilizarse un ELISA para demostrar la presencia de anticuerpos en sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a la proteína o péptidos de CLDN18.2. Los péptidos o la proteína utilizada para inmunización pueden ser utilizados para la determinación de la especificidad de los sobrenadantes de hibridoma o el análisis de títulos de suero.

Para demostrar la presencia de anticuerpos en los sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas, puede utilizarse citometría de flujo. Líneas celulares con expresión natural o después de una transfección de antígeno y controles negativos sin expresión del antigeno (crecidos bajo condiciones estándar de crecimiento) pueden mezclarse con diversas concentraciones de anticuerpos monoclonales en sobrenadantes de hibridoma o en PBS con 1% FBS, e incubarse a 4°C por 30 min. Después de un lavado, el anticuerpo marcado con APC o Alexa647 anti IgG puede unirse al anticuerpo monoclonal unido al antigeno bajo las mismas condiciones que la tinción del anticuerpo primario. Las muestras pueden ser analizadas mediante citometria de flujo con un instrumento de FACS utilizando la luz y las propiedades de dispersión de contornos para dejar pasar células únicas y vivas. Para distinguir anticuerpos monoclonales específicos para el antígeno de uniones no específicas en una sola medición, el método de cotransfeccíón puede ser utilizado. Las células transíectadas transitoriamente con plásmidos que codifican para el antígeno y un marcador fluorescente pueden ser teñidas como se describe anteriormente. Las células transíectadas pueden detectarse en un canal de fluorescencia distinto al de las células teñidas con anticuerpo. Ya que la mayoría de las células transíectadas expresan ambos transgenes, los anticuerpos monoclonales específicos al antígeno se unen preferentemente a las células que expresan el marcador de fluorescencia, mientras que los anticuerpos no específicos se unen en una proporción comparable a las células no transíectadas. Un ensayo alternativo utilizando microscopía de fluorescencia puede utilizarse además de o en lugar del ensayo de citometría de flujo. Las células pueden ser teñidas exactamente como se describe anteriormente y examinadas por microscopía de fluorescencia.

Para demostrar la presencia de anticuerpos contra CLDN18.2 en los sueros de ratones inmunizados o la unión de anticuerpos monoclonales a células vivas que expresan CLDN18.2, se puede utilizar el análisis por microscopía de inmunofluorescencia. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan CLDN18.2, ya sea espontáneamente o después de una transíección, y controles negativos que carecen de expresión de CLDN18.2 son crecidas en portaobjetos con cámara bajo condiciones estándar de cultivo en medio DMEM/F12 suplementado con 10% de suero fetal bovino (FCS, por sus siglas en inglés) 2 mM de L-glutamina, 100 IU/ml de penicilina y 100 gg/ml de estreptomicina. Las células pueden ser fijadas con metanol o paraformaldehído o dejar sin tratar. Las células pueden entonces colocarse con los anticuerpos monoclonales contra CLDN18.2 por 30 min. a 25°C. Después de un lavado, las células pueden colocarse con un anticuerpo IgG secundario anti-ratón marcado con Alexa555.

Las células pueden entonces ser examinadas mediante microscopía de fluorescencia.

Los niveles totales de CLDN18.2 en las células pueden ser observados cuando las células son fijadas con metanol o fijadas con paraformaldehído y permeabilizadas con Tritón X-100. En células vivas y células fijadas con paraformaldehído y no permeabilizadas la localización de CLDN18.2 en la superficie de la célula puede ser examinada. Adicionalmente, la determinación de CLDN18.2 en las zonas de oclusión puede analizarse mediante una tinción simultánea con marcadores de zonas de oclusión como ZO-1. Además, los efectos de la unión del anticuerpo y la localización de CLDN18.2 en la membrana celular pueden ser examinados.

La reactividad de la IgG anti CLDN18.2 puede además ser probada con el antígeno CLDN18.2 mediante Western Blot. Brevemente, extractos celulares obtenidos de células que expresan CLDN18.2 y los controles negativos apropiados pueden ser preparados y sometidos a una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS). Después de la electroforesis, los antígenos separados serán transferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados, y probados contra los anticuerpos monoclonales a evaluarse. La unión de IgG puede detectarse utilizando una IgG peroxidasa antiratón y revelada con sustrato ECL.

También puede probarse la reactividad de las IgG anti CLDN18.2 de ratón con el antigeno CLDN18.2 mediante inmunohistoquimica mediante un método bien conocido para el téenico especializado, por ejemplo, utilizando criosecciones fijadas con paraformaldehído o acetona o secciones de tejido embebido en parafina fijado con paraformaldehído provenientes de muestras de tejido no canceroso o de tejido canceroso obtenidas de pacientes durante procedimientos quirúrgicos de rutina o de ratones que presenten tumores xenotrasplantados inoculados con lineas celulares que expresen CLDN18.2 espontáneamente o después de transfectarse. Para inmunotinción, los anticuerpos reactivos a CLDN18.2 pueden ser incubados seguidos de anticuerpos conjugados con peroxidasa de rábano, cabra antiratón o cabra anticonejo, de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

Una metodología preferida para las pruebas con CLDN18.2 en los métodos de la invención es inmunohistoquimica o IHC. Inmunohistoquimica o IHC se refiere al proceso de detectar antígenos (por ejemplo, proteínas) en células de una sección de tejido, por ejemplo, células de los tejidos aquí mencionados. La tinción inmunohistoquimica es ampliamente utilizada en el diagnóstico de células anormales tal como aquellas encontradas en tumores cancerosos. La visualización de una interacción antígeno-anticuerpo puede lograrse de varias maneras. En el ejemplo más común, un anticuerpo es conjugado a una enzima, como peroxidasa, que pueda catalizar una reacción que produzca color. De manera alternativa, el anticuerpo también puede ser marcado con un fluoróforo, co o fluoresceina o rodamina.

La preparación de la muestra es critica para mantener la morfología de la célula, la arquitectura del tejido y la antigenicidad de los epítopos blanco. Esto requiere una recolección adecuada del tejido, fijación y corte. El paraformaldehído es normalmente utilizado con la fijación, Dependiendo del propósito y el grosor de la muestra experimental, ya sea que secciones delgadas (alrededor de 4-40 pm) sean cortadas del tejido de interés, o si el tejido no es muy grueso y penetrable es utilizado completo. El corte es normalmente logrado utilizando un micrótomo y las rebanadas son montadas en portaobjetos.

La muestra puede requerir etapas adicionales para que los epítopos estén disponibles para la unión del anticuerpo, incluyendo el retiro de parafina, y la recuperación del antígeno. Los detergentes como Tritón X-100 son utilizados generalmente en inmunohistoquimica para reducir la tensión superficial, permitiendo que se utilice menos reactivo para lograr una mayor y mejor cobertura de la muestra.

El método directo de tinción inmunohistoquimica utiliza un anticuerpo marcado, el cual se une directamente al antigeno que será teñido. El método indirecto de la tinción inmunohistoquímica, el cual es más común, utiliza un anticuerpo contra el antigeno que se está probando y un segundo anticuerpo marcado contra el primero.

Para reducir la tinción de fondo en la IHC, las muestras son incubadas con un amortiguador que bloquea los sitios reactivos a los cuales los anticuerpos primario o secundario podrían unirse de otro modo. Los anticuerpos primarios son creados contra un antígeno de interés y son típicamente no conjugados (no marcados), mientras que los anticuerpos secundarios son creados contra las in unoglobulinas de las especies del anticuerpo primario. El anticuerpo secundario es normalmente conjugado a una molécula conectora, como biotina, que después recluta moléculas reporteras, o el anticuerpo secundario está directamente unido a la molécula reportera. Los amortiguadores de bloque comunes incluyen suero normal, leche en polvo sin grasa, BSA o gelatina, y amortiguadores de bloqueo comerciales.

Las moléculas reporteras varían basándose en la naturaleza del método de detección, y los métodos más populares de detección son aquellos con detección cromogénica mediada por enzimas y fluoróforos y detección de fluorescencia, respectivamente. Con los reporteros cromogénicos, un marcador enzimático reacciona con un sustrato para dar lugar a un producto intensamente coloreado que puede ser analizado con un microscopio de luz ordinario. Mientras que la lista de sustratos enzimáticos es extensiva, la fosfatasa alcalina (AP, por sus siglas en inglés) y la peroxidasa de rábano (HRP, por sus siglas en inglés) son las dos enzimas más utilizadas como marcas para la detección de proteínas. Un arreglo de sustratos cromogénicos, fluorogénicos y quimioluminiscentes está disponible para su uso con cualquier enzima, incluyendo DAB o BCIP/NBT. Los reporteros fluorescentes son moléculas pequeñas, orgánicas utilizadas para la detección por IHC. Para los métodos de detección cromogénicos y fluorescentes, el análisis densítométríco de la señal puede proporcionar datos semi y completamente cuantitativos, respectivamente, para correlacionar el nivel de señal del reportero con el nivel de expresión o localización de la proteína.

Después de la tinción inmunohistoquímica del antígeno blanco, una segunda tinción se aplica a menudo para proporcionar contraste que ayude a la tinción primaria a resaltarse. Muchas de estas tinciones muestran especificidad para compartimentos celulares discretos o antígenos, mientras otras teñirán la célula completa. Tanto los tintes cromogénicos como los fluorescentes están disponibles para la IHC para proporcionar un gran arreglo de reactivos para adecuarse a todos los diseños experimentales. Hematoxilina, tinción de Hoechst y DAPI son comúnmente utilizados.

El mapeo de epitopos reconocidos por los anticuerpos puede llevarse a cabo como se describe en detalle en "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 y en "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248 por Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

El término "funciones efectoras inmunitarias" en el contexto de la presente invención incluye cualquier función mediada por componentes del sistema inmunitario que resulta en la inhibición del crecimiento del tumor y/o inhibición del desarrollo del tumor, incluyendo inhibición de diseminación del tumor y metástasis. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias resultan en la muerte de las células cancerosas. Preferentemente, las funciones efectoras inmunitarias en el contexto de la presente invención son funciones efectoras mediadas por anticuerpo. Dichas funciones comprenden citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC, por sus siglas en inglés), fagocitosis mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCP, por sus siglas en inglés), inducción de apoptosis en las células con el antígeno asociado al tumor, por ejemplo, mediante unión del anticuerpo a un antigeno de superficie, inhibición de transducción de la señal mediada por CD40L, por ejemplo, mediante la unión del anticuerpo al receptor CD40 o al ligando de CD40 (CD40L), e/o inhibición de proliferación de las células con el antigeno asociado al tumor, preferentemente ADCC y/o CDC. Por lo tanto, los anticuerpos que son capaces de mediar una o más funciones efectoras son preferentemente capaces de mediar la muerte de las células induciendo lisis mediada por CDC, lisis mediada por ADCC, apoptosis, adhesión homotipica y/o fagocitosis, preferentemente mediante la inducción de lisis mediada por CDC y/o lisis mediada por ADCC. Los anticuerpos también pueden ejercer un efecto simplemente mediante la unión a antigenos asociados al tumor en la superficie de una célula cancerosa. Por ejemplo, los anticuerpos pueden bloquear la función del antigeno asociado al tumor o inducir apoptosis sólo mediante la unión al antigeno asociado al tumor en la superficie de una célula cancerosa.

La ADCC describe la habilidad de muerte celular de las células efectoras, en particular linfocitos, los cuales preferentemente requieren que la célula blanco esté marcada por un anticuerpo. La ADCC preferentemente ocurre cuando los anticuerpos unidos a los antigenos en las células cancerosas y los dominios Fe del anticuerpo activan a los receptores Fe (FcR) en la superficie de las células inmunitarias efectoras. Muchas familias de receptores Fe se han identificado, y poblaciones especificas de células expresan característicamente receptores Fe definidos. La ADCC puede ser vista como un mecanismo para inducir directamente un grado variable de destrucción inmediata del tumor que además conduce a la presentación del antígeno y la inducción de respuestas de células T dirigidas al tumor. Preferentemente, la inducción in vivo de ACC conducirá a respuestas de células T dirigidas al tumor y otras respuestas de anticuerpo derivadas del hospedero.

La CDC es otro método de muerte celular que puede ser dirigido por anticuerpos. El isotipo IgM es el más efectivo para la activación del complemento. Tanto IgGl como IgG3 son también muy efectivas dirigiendo la CDC por medio de la vía de activación de complemento clásica. Preferentemente, en esta cascada, la formación de los complejos antígeno-anticuerpo resulta en la exposición de múltiples sitios de unión de Clq en proximidad cercaba en los dominios CH2 de las moléculas de anticuerpo participantes como las moléculas de IgG (Clq es uno de los tres componentes del complemento Cl). Preferentemente estos sitios de unión de Clq expuestos convierten la interacción Clq-IgG de baja afinidad en una de alta afinidad, lo cual desencadena una cascada de eventos que involucran una serie de otras proteínas del complemento y lleva a la liberación proteolitica de los agentes C3a y C5a, activadores/quimiotácticos de células efectoras. Preferentemente, la cascada del complemento termina con la formación de un complejo de ataque a la membrana, el cual crea poros en la membrana celular que facilitan la etapa libre de agua y solutos hacia adentro y afuera de la célula y puede desencadenar en apoptosis.

El término "células inmunitarias efectoras" en el contexto de la presente invención se relaciona a las células que ejercen funciones efectoras durante una reacción inmunitaria. Por ejemplo, dichas células secretan citoquinas y/o quimiocinas, matan microbios, secretan anticuerpos, reconocen células cancerosas, y opcionalmente eliminan dichas células. Por ejemplo, las células inmunitarias efectoras comprenden células T (células T citotóxicas, células T cooperadoras, células T de infiltración a tumor), células B, linfocitos citolíticos naturales, neutrófilos, macrófagos, macrófagos y células dendríticas.

Un ácido nucleico es de acuerdo con la invención preferentemente ácido desoxiribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), más preferentemente ARN, más preferentemente ARN transcrito in vitro (IVT ARN). Los ácidos nucleicos incluyen de acuerdo con la invención ADN genómico, cADN, mARN, moléculas preparadas recombinantemente y químicamente sintetizadas. De acuerdo con la invención, un ácido nucleico puede estar en forma de una molécula que es de una hebra o de doble hebra y lineal o cerrada covalentemente para formar un círculo. Un nucleico puede emplearse para la introducción de, es decir, transfección de células, por ejemplo, en forma de ARN el cual puede ser preparado mediante transcripción in vitro a partir de un templado de ADN. El ARN puede ser modificado antes de su aplicación mediante secuencias estabilizadoras y poliadenilación.

Los ácidos nucleicos aquí descritos pueden estar comprendidos en un vector. El término "vector" como aquí se utiliza incluye cualquier vector conocido por el téenico especializado incluyendo vectores de plásmidos, vectores de cósmidos, vectores de fagos como el fago lambda, vectores virales como vectores adenovirales o baculoví rales, o vectores de cromosoma artificial, como cromosomas artificiales como cromosomas artificiales bacterianos (BAC, por sus siglas en inglés), cromosomas artificiales de levaduras (YAC, por sus siglas en inglés), o cromosomas artificiales Pl (PAC, por sus siglas en inglés). Dichos vectores incluyen vectores de expresión y vectores de clonación. Los vectores de expresión comprenden plásmidos y vectores virales y generalmente contienen una secuencia codificante deseada u secuencias de ADN apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante ligada y operable en un organismo huésped particular (por ejemplo, bacterias, levaduras, plantas, insectos o mamíferos) o en sistemas de expresión in vitro. Los vectores de clonación son generalmente utilizados para el diseño y amplificación de cierto fragmento de ADN deseado y puede carecer de secuencias funcionales necesarias para la expresión de los fragmentos de ADN deseados.

En cuanto al vector de expresión de un anticuerpo, pueden utilizarse el tipo de vector en el cual las cadenas del anticuerpo están presentes en vectores diferentes o el tipo de vector en el cual las cadenas del anticuerpo estén presentes en el mismo vector.

Como aquí se utiliza, el término "ARN" quiere decir una molécula que comprende al menos un residuo de ribonucleótido. Por "ribonucleótido" se entiende un nucleótido con un grupo hidroxilo en la posición 2' de la porción de beta-D-ribofuranosa. El término incluye ARN de doble cadena, ARN de cadena sencilla, ARN aislado como ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético, ARN producido por recombinación, así como ARN alterado que difiere del ARN que ocurre naturalmente mediante la adición, eliminación, sustitución y/o alteración de uno o más nucleótidos. Dichas alteraciones pueden incluir la adición de material no nucleotidico, como en el final o finales de un ARN o internamente, por ejemplo a uno o más nucleótidos del ARN. Los nucleótidos en las moléculas de ARN pueden también comprender nucleótidos no estándar, como nucleótidos que no ocurren naturalmente o nucleótidos químicamente sintetizados o desoxinucleótidos. Estos ARN alterados pueden ser referidos como análogos o análogos de ARN que ocurre naturalmente.

De acuerdo con la presente invención, el término "ARN" incluye y se relaciona preferentemente al "mARN" el cual quiere decir "ARN mensajero" y se relaciona a un "transcrito" el cual puede ser producido utilizando ADN como templado y codifica para un péptido o proteina. El mARN comprende normalmente una región 5' no traducida, una región codificante de una proteína o péptido y una región 3' no traducida. El mARN tiene una vida media limitada en células e ín vitro.

En el contexto de la presente invención, el término "transcripción" se relaciona a un proceso, donde el código genético en una secuencia de ADN es transcrito en ARN.

Los ácidos nucleicos descritos de acuerdo con la invención han sido preferentemente aislados. El término "ácido nucleico aislado" se refiere, de acuerdo con la invención, a que el ácido nucleico fue (i) amplificado in vitro, por ejemplo mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) producido recombinantemente mediante clonación, (iii) purificado, por ejemplo, mediante corte y fraccionamiento electroforático en gel, o (iv) sintetizado, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para su manipulación mediante téenicas de ADN recombinante.

Los ácidos nucleicos, de acuerdo con la invención, pueden estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, los cuales pueden ser homólogos o heterólogos. En las modalidades preferidas, un ácido nucleico está funcionalmente ligado a las secuencias de control de expresión las cuales pueden ser homologas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. El término "homólogo" significa que los ácidos nucleicos están también naturalmente ligados funcionalmente y el término "heterólogo" significa que los ácidos nucleicos no están naturalmente ligados funcionalmente.

Un ácido nucleico y una secuencia de control de expresión están ligados ''funcionalmente" el uno con el otro si están ligados covalentemente el uno con el otro de tal manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de expresión. Si el ácido nucleico será traducido en una proteina, entonces, con una secuencia de control de expresión ligada funcionalmente a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de expresión resulta en la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un cambio de marco de lectura en la secuencia codificante o dicha secuencia codificante siendo incapaz de traducirse en la proteina o péptido deseados.

El término "secuencia de control de expresión" o "elemento de control de expresión" comprende, de acuerdo con la invención, promotores, sitios de unión de ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un mARN. En modalidades particulares de la invención, las secuencias de control de expresión pueden ser reguladas. La estructura exacta de las secuencias de control de expresión puede variar debido a la especie o al tipo celular, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas las cuales están involucradas en el inicio de la transcripción y de la traducción, respectivamente, tales como la caja TATA, secuencia de casquete, secuencia CAAT, y similares. Más específicamente, las secuencias de control de expresión no transcritas del extremo 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico ligado funcionalmente. Las secuencias de control de expresión pueden también comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba.

De acuerdo con la invención, el término "promotor" o "región promotora" se relaciona a una secuencia de ácido nucleico que está localizada cadena arriba (5') de la secuencia de ácido nucleico expresado y controla la expresión de la secuencia proporcionando un sitio de reconocimiento y de unión para la ARN polimerasa. La "región promotora" puede incluir otros sitios de reconocimiento y de unión para otros factores que están involucrados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen eucarionte o procarionte. Además, un promotor puede ser "inducidle" y puede iniciar la transcripción como respuesta a un agente inductor o puede ser "constitutivo" si la transcripción no es controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o no sólo se expresa en una pequeña extensión si un agente inductor está ausente. En presencia del agente inductor el gen es encendido o el nivel de transcripción se incrementa. Esto es mediado, en general, mediante la unión de un factor de transcripción especifico.

Los promotores preferentes de acuerdo con la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV, y promotores híbridos artificiales de los mismos (por ejemplo, CMV), donde una parte o partes se fusionan a una parte o partes de los promotores de genes de otras proteínas celulares, tales como por ejemplo, GAPDH humana (deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato), y que incluyen o no incluyen uno o varios intrones adicionales.

El término "expresión" es aquí utilizado en su sentido más amplio y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína o péptido. Con respecto al ARN, el término "expresión" o "traducción" se relaciona en particular a la producción de péptidos o proteínas. La expresión puede ser transitoria o puede ser estable. De acuerdo con la invención, el término expresión además incluye una "expresión aberrante" o "expresión anormal".

"Expresión aberrante" o "expresión anormal" significa de acuerdo con la invención que la expresión está alterada, preferentemente incrementada, comparada con una referencia, por ejemplo, un estado en un sujeto que no tiene la enfermedad asociada con la expresión aberrante o anormal de cierta proteína, por ejemplo, un antígeno asociado a tumor. Un aumento en la expresión se refiere a un aumento de por lo menos 10%, en particular al menos de 20%, al menos de 50% o al menos de 100%, o más. En una modalidad, la expresión sólo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido sano es reprimida.

El término "expresado específicamente" significa que una proteína se expresa esencialmente sólo en un tejido u órgano específico. Por ejemplo, un antígeno asociado a tumor expresado específicamente en la mucosa gástrica quiere decir que dicha proteína se expresa principalmente en la mucosa gástrica y no se expresa en otros tejidos o no se expresa en gran medida en otros tipos de tejidos o de órganos. Por lo tanto, una proteína que se expresa exclusivamente en las células de la mucosa gástrica y en significativamente menor medida en cualquier otro tejido, se expresa específicamente en las células de la mucosa gástrica. En algunas modalidades, un antígeno asociado al tumor también puede expresarse específicamente en condiciones normales en más de un tipo de órgano o tejido, tal como en 2 o 3 tipos de tejidos u órganos, pero preferiblemente en no más de 3 diferentes tipos de tejidos o de órganos. En este caso, el antígeno asociado a tumor se expresa entonces específicamente en estos órganos.

El término "traducción" de acuerdo con la invención se refiere al proceso en los ribosomas de una célula mediante el cual una hebra de ARN mensajero dirige el ensamblaje de una secuencia de aminoácidos para formar una proteína o péptido.

De acuerdo con la invención, el término "ácido nucleico codificante" significa que el ácido nucleico, si está presente en el entorno apropiado, preferiblemente dentro de una célula, se puede expresar para producir una proteína o péptido para el cual codifica.

El término "péptido" comprende oligo y polipéptidos y se refiere a sustancias que comprenden dos o más, preferentemente 3 o más, preferentemente 4 o más, preferentemente 6 o más, preferentemente 8 o más, preferentemente 9 o más, preferentemente 10 o más, preferentemente 13 o más, preferentemente 16 más, preferentemente 21 o más, y preferentemente hasta 8, 10, 20, 30, 40 o 50, en particular de 100 aminoácidos unidos covalentemente por enlaces peptídicos. El término "proteína" se refiere a péptidos grandes, preferiblemente a los péptidos con más de 100 residuos de aminoácidos, pero en general los términos "péptidos" y "proteínas" son sinónimos y se usan indistintamente en este documento.

Preferentemente, las proteínas y péptidos descritos se han aislado de acuerdo con la invención. Los términos "proteína aislada" o "péptido aislado" significa que la proteína o péptido se ha separado de su entorno natural. Una proteína o péptido aislado pueden estar en un estado esencialmente purificado. El término "esencialmente purificado" significa que la proteina o péptido está esencialmente libre de otras sustancias con las que se asocia en la naturaleza o in vivo.

La enseñanza aquí ofrecida con respecto a las secuencias de aminoácidos específicos, por ejemplo, las que se muestran en la lista de secuencias, será interpretada como también las modificaciones, es decir, variantes, de dichas secuencias específicas que resultan en secuencias que son funcionalmente equivalentes a dichas secuencias específicas, por ejemplo, secuencias de aminoácidos que exhiben propiedades idénticas o similares a las de las secuencias de aminoácidos específicos. Una propiedad importante es conservar la unión de un anticuerpo a su blanco. Preferentemente, cuando se reemplaza la secuencia específica en un anticuerpo, una secuencia modificada con respecto a una secuencia específica retiene la unión de dicho anticuerpo al blanco.

Se apreciará por los téenicos expertos que, en particular, las secuencias de las secuencias de CDR, las regiones hipervariables y variables pueden ser modificadas sin perder la capacidad de unirse a un blanco. Por ejemplo, las secuencias de CDR serán idénticas o altamente homologas a las secuencias de CDR aquí especificadas.

Por "altamente homologa" se contempla que se pueden hacer sustituciones de 1 a 5, preferentemente de 1 a 4, tal como de l a 3 o l o 2 .

El término "variante" de acuerdo con la invención también incluye mutantes, variantes por empalme, conformaciones, isoformas, variantes alélicas, variantes de especies y homólogos de especies, en particular los que están presentes de forma natural. Una variante alélica se refiere a una alteración en la secuencia normal de un gen, cuyo significancia es a menudo poco clara. La secuenciación completa del gen a menudo identifica numerosas variantes alélicas de un gen determinado. Un homólogo de especie es una secuencia de ácido nucleico o aminoácido con una especie diferente de la de origen de una secuencia de ácido nucleico o aminoácido dado.

Para los propósitos de la presente invención, "variantes" de una secuencia de aminoácidos comprende variantes de inserción de aminoácidos, variantes de adición de aminoácidos, variantes de eliminación de aminoácidos y/o variantes de sustitución de aminoácidos. Las variantes de eliminación de aminoácidos que comprenden la eliminación en el extremo amino terminal y/o carboxilo terminal son también llamadas variantes truncadas amino terminal y/o carboxilo terminal.

Las variantes de inserción de aminoácidos comprenden inserciones de uno o dos o más aminoácidos en una secuencia de aminoácidos particular. En el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que tiene una inserción, uno o más residuos de aminoácidos se insertan en un sitio particular en una secuencia de aminoácidos, aunque la inserción aleatoria con la selección adecuada del producto resultante también es posible.

Las variantes de adición de aminoácidos comprenden fusiones amino y/o carboxilo terminales de uno o más aminoácidos, como de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos.

Las variantes de eliminación de aminoácidos se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de la secuencia, tal como mediante la eliminación de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, o más aminoácidos. Las eliminaciones pueden estar en cualquier posición de la proteina.

Las variantes de sustitución de aminoácidos se caracterizan por al menos un residuo en la secuencia que se retira y se inserta otro residuo en su lugar. Se da preferencia a las modificaciones en posiciones en la secuencia de aminoácidos que no están conservadas entre las proteínas o péptidos homólogos y/o a la sustitución de aminoácidos con otros que tienen propiedades similares. Preferentemente, los cambios de aminoácidos en las variantes de proteínas son cambios de aminoácidos conservativos, es decir, sustituciones con aminoácidos similares cargados o no cargados. Un cambio conservativo de aminoácido implica la sustitución de uno de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos de origen natural se dividen generalmente en cuatro familias: ácidos (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), no polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), y polares no cargados (glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina). Fenilalanina, triptófano y tirosina se clasifican a veces conjuntamente como aminoácidos aromáticos.

Preferentemente, el grado de similitud, preferentemente identidad, entre una secuencia de aminoácidos dada y una secuencia de aminoácidos que es una variante de dicha secuencia de aminoácidos dada será al menos alrededor de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%. El grado de similitud o identidad se da preferentemente para una región de aminoácidos que es al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60 %, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90% o alrededor de 100% de toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia. Por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos de referencia consta de 200 aminoácidos, el grado de similitud o identidad se da preferiblemente durante al menos alrededor de 20, al menos alrededor de 40, al menos alrededor de 60, al menos alrededor de 80, al menos alrededor de 100, al menos alrededor de 120, al menos alrededor de 140, al menos alrededor de 160, al menos alrededor de 180, o alrededor de 200 aminoácidos, preferentemente aminoácidos continuos. En modalidades preferidas, el grado de similitud o identidad se da para toda la longitud de la secuencia de aminoácidos de referencia. La alineación para determinar la similitud de secuencia, preferiblemente de identidad de secuencia se puede realizar con herramientas conocidas en la téenica, preferentemente utilizando la mejor alineación de la secuencia, por ejemplo, usando Align, utilizando los parámetros estándar, preferiblemente EMBOSS::aguja, Matriz: Blosum62, Abertura de Espacio 10.0, Extensión de Espacio 0.5.

La "similitud de secuencia" indica el porcentaje de aminoácidos que o bien son idénticos o que representan sustituciones conservativas de aminoácidos. La "identidad de secuencia" entre dos secuencias de aminoácidos indica el porcentaje de aminoácidos que son idénticos entre las secuencias .

El término "porcentaje de identidad" tiene como objeto denotar un porcentaje de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando las diferencias entre las dos secuencias distribuidas aleatoriamente a lo largo de toda su longitud. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente mediante la comparación de estas secuencias después de haberlas alineado de manera óptima, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede producir, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de S ith and Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, por medio del algoritmo de homología local de Neddleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nati Acad. Sci. USA 85, 2444, o por medio de programas de computadora que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Orive, Madison, Wis.).

El porcentaje de identidad se calcula determinando el número de posiciones idénticas entre las dos secuencias que se comparan, dividiendo este número entre el número de posiciones comparadas y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Secuencias homologas de aminoácidos exhiben de acuerdo con la invención, al menos 40%, en particular al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90% y preferiblemente al menos 95%, al menos 98 o al menos 99% de identidad de los residuos de aminoácidos.

Las variantes de la secuencia de aminoácidos aquí descritos pueden prepararse fácilmente por el experto, por ejemplo, mediante la manipulación de ADN recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para la preparación de proteínas y péptidos que tienen sustituciones, adiciones, inserciones o eliminaciones, se describe en detalle en Sa brook et al. (1989), por ejemplo. Además, los péptidos y variantes de aminoácidos descritos en este documento pueden prepararse fácilmente con la ayuda de téenicas conocidas de síntesis de péptidos tales como, por ejemplo, mediante síntesis en fase sólida y métodos similares.

La invención incluye derivados de los péptidos o proteínas aquí descritos que están comprendidas en los términos "péptido" y "proteína". De acuerdo con la invención, los " "ddeerriivvaaddooss"" de las proteínas y péptidos son formas modificadas de las proteínas y péptidos. Tales modificaciones incluyen cualquier modificación química y comprenden sustituciones únicas o múltiples, eliminaciones y/o adiciones de cualquier molécula asociada con la proteína o péptido, tales como carbohidratos, lípidos y/o proteínas o péptidos. En una modalidad, los "derivados" de las proteínas o péptidos incluyen aquellos análogos modificados resultantes de glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, palmitoilación, miristoilación, isoprenilación, lipidación, alquilación, derivación, introducción de grupos protectores/bloqueadores, corte proteolítico o unión de un anticuerpo u otro ligando celular. El término "derivado" también se extiende a todos los equivalentes químicos funcionales de dichas proteínas y péptidos. Preferentemente, un péptido modificado posee mayor estabilidad y/o mayor inmunogenicidad.

De acuerdo con la invención, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, péptido o proteína tiene preferentemente una propiedad funcional de la secuencia de aminoácido, péptido o proteína, respectivamente, de la que se ha derivado, es decir, que es funcionalmente equivalente. En una modalidad, una variante, derivado, forma modificada, fragmento, parte o porción de una secuencia de aminoácidos, el péptido o proteína es inmunológicamente equivalente a la secuencia de aminoácidos, el péptido o proteina, respectivamente, de la que se ha derivado. En una modalidad, la propiedad funcional es una propiedad inmunológica.

El término "derivado" significa, según la invención, que una entidad particular, en particular una secuencia particular, está presente en el objeto del que se deriva, en particular, un organismo o molécula. En el caso de secuencias de aminoácidos, especialmente las regiones de secuencia particulares, "derivado" en particular significa que la secuencia de aminoácidos correspondiente se deriva de una secuencia de aminoácidos en la que está presente.

El término "célula" o "célula hospedera" preferentemente es una célula intacta, es decir, una célula con una membrana intacta que no ha liberado sus componentes intracelulares normales tales como enzimas, organelos, o material genético. Preferentemente una célula intacta es una célula viable, es decir, una célula viva capaz de llevar a cabo sus funciones metabólicas normales. El término "célula" incluye las células procariontes de acuerdo con la invención (por ejemplo, E. coli) o a las células eucariontes (por ejemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HeLa, células de levadura, y células de insecto). Las células de mamíferos son particularmente preferidas, tales como las células de humanos, ratones, hámster, cerdos, cabras y primates. Las células pueden derivar de un gran número de tipos de tejidos e incluyen células primarias y líneas celulares. El término "célula" incluye células no cancerosas y células cancerosas como las células de los tipos de cáncer aquí descritos.

Una célula que comprende una molécula de ácido nucleico expresa preferentemente el péptido o la proteína codificada por el ácido nucleico.

"Célula blanco" significa una célula que es un objetivo para una respuesta inmunitaria, tal como un anticuerpo. Las células blanco incluyen cualquier célula indeseable, tal como una célula de cáncer como aquí se describe. En modalidades preferidas, la célula blanco es una célula que expresa CLDN18.2. Las células que expresan CLDN18.2 incluyen normalmente células cancerosas.

El término "animal transgénico" se refiere a un animal que tiene un genoma que comprende uno o más transgenes, preferentemente transgenes de cadena pesada y/o ligera, o transcromosomas (ya sean integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que es capaz preferentemente de expresar los transgenes. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera humana y un transgen de cadena pesada humana o un transcromosoma de cadena pesada humana, de forma que el ratón produce anticuerpos anti-CLDN18.2 humana cuando se inmunizan con el antigeno CLDN18.2 y/o células que expresan CLDN18.2. El transgen de la cadena pesada humana puede integrarse en el ADN cromosómico del ratón, como es el caso para ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, como ratones HCo7 o HCol2, o el transgen de la cadena pesada humana puede mantenerse extracromosómicamente, como es el caso para los ratones transcromosómico (por ejemplo, KM) ratones como se describe en WO 02/43478. Tales ratones transgénicos y transcromosómicos pueden ser capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para CLDN18.2 (por ejemplo, IgG, IgA e/o IgE) sometiéndose a recombinación VDJ y a cambio de isotipo.

El término "inmunológicamente equivalente" significa que la molécula inmunológicamente equivalente como la secuencia de aminoácidos inmunológicamente equivalente exhibe la misma o esencialmente las mismas propiedades inmunológicas y/o ejerce esencialmente el mismo o los mismos efectos inmunológicos, por ejemplo, con respecto al tipo de el efecto inmunológico, tal como la inducción de una reacción inmunitaria humoral, la potencia y/o duración de la reacción inmunitaria inducida, o la especificidad de la reacción inmune. En el contexto de la presente invención, el término "inmunológicamente equivalente" se usa preferentemente con respecto a los efectos inmunológicos o propiedades de un péptido o una variante de péptido utilizado para la inmunización o un anticuerpo. Una propiedad inmunológica particular es la capacidad para unirse a anticuerpos y, en su caso, generar una respuesta inmunitaria, preferentemente mediante la estimulación de la generación de anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia de aminoácidos es inmunológicamente equivalente a una secuencia de aminoácidos de referencia si dicha secuencia de aminoácidos, cuando se expone al sistema inmunitario de un sujeto, induce una reacción inmunitaria, preferentemente anticuerpos, con una especificidad de reaccionar con la secuencia de aminoácidos de referencia, tal como la secuencia de aminoácidos de referencia que forma parte de CLDN18.2.

La invención proporciona métodos para detectar la presencia del antigeno CLDN18.2 en una muestra, o medir la cantidad del antigeno CLDN18.2, lo cual comprende poner en contacto la muestra y, opcionalmente, una muestra control, con un anticuerpo de la invención que se une a CLDN18.2, bajo condiciones que permitan la formación de un complejo entre el anticuerpo y CLDN18.2. Después se detecta la formación de un complejo, donde una diferencia en la formación del complejo entre la muestra comparada con una muestra control es indicativa de la presencia de antigeno CLDN18.2 en la muestra.

Los métodos como se describieron anteriormente son útiles, en particular, para el diagnóstico de enfermedades relacionadas con CLDN18.2, como las enfermedades neoplásicas. Preferentemente, una cantidad de CLDN18.2 en una muestra que es mayor que la cantidad de CLDN18.2 en una muestra de referencia o de control es indicativo de la presencia de una enfermedad relacionada con CLDN18.2 en un sujeto, en particular un ser humano, del cual la muestra se deriva.

Cuando se utiliza en los métodos descritos anteriormente, un anticuerpo aquí descrito puede estar provisto de un marcador que sirve para: (i) proporcionar una señal detectable; (ii) interactuar con un segundo marcador para modificar la señal detectable proporcionada por la primera o la segunda marca, por ejemplo, FRET (transferencia de energía de resonancia fluorescente); (iii) afectar a la movilidad, por ejemplo movilidad electroforética, por la carga, hidrofobicidad, forma, u otros parámetros físicos, o (iv) proporcionar una porción de captura, por ejemplo, afinidad, anticuerpo/antígeno, o formación de complejo iónico. Tan adecuadas son las estructuras como los marcadores, como marcadores fluorescentes, marcadores luminiscentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, marcadores isotópicos preferentemente estables, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, en particular los marcadores de partículas de metal, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas de polímero, moléculas orgánicas pequeñas tales como biotina, ligandos de receptores o moléculas de unión tales como proteínas de adhesión celular o lectinas, secuencias como marcadores que comprenden ácidos nucleicos y/o residuos de aminoácidos que pueden ser detectados mediante el uso de agentes de unión, etc. Los marcadores comprenden, de modo no limitante, sulfato de bario, ácido iocetámico, ácido iopanoico, ipodato de calcio, diatrizoato de sodio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sodio y radio de diagnóstico, incluyendo emisores de positrones tales como flúor-18 y carbono-11, emisores gamma tales como yodo-123, teenecio-99m, yodo-131 e indio-111, núclidos para resonancia magnética nuclear, tales como flúor y gadolinio.

De acuerdo con la invención, una "referencia" tal como una muestra de referencia u organismo de referencia se puede utilizar para correlacionar y comparar los resultados obtenidos en los métodos de la invención obtenidos en una muestra de ensayo u organismo de prueba. Típicamente, el organismo de referencia es un organismo sano, en particular, un organismo que no sufre de una enfermedad tal como una enfermedad neoplásica. Un "valor de referencia" o "nivel de referencia" se pueden determinar empíricamente a partir de una referencia mediante la medición de un número suficientemente grande de referencias. Preferentemente, el valor de referencia se determina mediante la medición de al menos 2, preferentemente al menos 3, preferentemente al menos 5, preferentemente al menos 8, preferentemente al menos 12, preferentemente al menos 20, preferentemente al menos 30, preferentemente al menos 50, o preferentemente al menos 100 referencias.

"Reduce" o "inhibe" como aquí se utiliza, significa la capacidad para causar un decremento general, preferentemente del 5% o mayor, 10% o mayor, 20% o mayor, más preferentemente de 50% o mayor y mucho más preferentemente de 75% o mayor, en el nivel. El término "inhibe" o frases similares incluye una inhibición completa o esencialmente completa, es decir, una reducción a cero o a esencialmente cero.

Términos como "incrementa" o "aumenta" preferentemente se relacionan a un incremento o aumento de al menos alrededor de 10%, preferentemente al menos de 20%, preferentemente al menos de 30%, más preferentemente al menos de 40%, más preferentemente al menos de 50%, aún más preferentemente al menos de 80%, y mucho más preferentemente al menos de 100%.

Los agentes, composiciones, y métodos aquí descritos pueden utilizarse para diagnosticar a un sujeto con una enfermedad. Las enfermedades que pueden ser diagnosticadas incluyen todas las enfermedades que expresan CLDN18.2. Las enfermedades particularmente preferentes son enfermedades neoplásicas como los cánceres aquí descritos.

De acuerdo con la invención, el término "enfermedad" se refiere a cualquier estado patológico, incluyendo enfermedades neoplásicas, en particular aquellas formas de cánceres aquí descritas.

El término "normal" tal como se utiliza en los términos "tejido normal" o "condiciones normales" se refiere a tejidos sanos o las condiciones en un sujeto sano, es decir, condiciones no patológicas, donde "sano" preferentemente quiere decir no canceroso.

"Enfermedad que involucra células que expresan CLDN18.2" quiere decir de acuerdo con la invención que la expresión de CLDN18.2 en las células de un tejido u órgano enfermo es preferentemente aumentado al compararse con el estado en un tejido u órgano sano. Un aumento se refiere a un aumento de al menos 10%, en particular al menos 20%, al menos 50%, al menos 100%, al menos 200%, al menos 500%, al menos 1000%, al menos 10000%, o incluso más. En una modalidad, la expresión sólo se encuentra en un tejido enfermo, mientras que la expresión en un tejido en un tejido sano está reprimida. De acuerdo con la invención, las enfermedades que involucran o están asociadas con células que expresan CLDN18.2 incluyen enfermedades neoplásicas, en particular aquellas formas de cáncer aquí descritas.

De acuerdo con la invención, el término "tumor" o "enfermedad neoplásica" se refiere a una tumefacción o lesión formada por un crecimiento anormal de células (llamadas células neoplásicas o células de tumor). Por "célula de tumor" se entiende una célula anormal que crece por una proliferación celular rápida, incontrolada y continúa creciendo después de los estímulos que iniciaron el nuevo alto crecimiento. Los tumores muestran una carencia parcial o completa de organización estructural y coordinación funcional con el tejido normal, y usualmente forman una masa distinta de tejido, que puede ser benigno, pre-maligno o maligno.

Un tumor benigno es un tumor que carece de las tres propiedades malignas de un cáncer. Así, por definición, un tumor benigno no crece de manera ilimitada, agresiva, no invade los tejidos circundantes, y no se extiende a los tejidos no adyacentes (metástasis). Los ejemplos más comunes de tumores benignos son los lunares y los fibromas uterinos.

El término "benigno" implica una enfermedad leve y no progresiva y, de hecho, muchos tipos de tumores benignos son inofensivos para la salud. Sin embargo, algunos tumores gue se definen como "tumores benignos" porque carecen de las propiedades invasivas de un cáncer, todavía pueden producir efectos negativos para la salud. Ejemplos de esto incluyen los tumores que producen un "efecto de masa" (compresión de órganos vitales, como los vasos sanguíneos), o tumores "funcionales" de los tejidos endocrinos, que pueden producir un exceso de ciertas hormonas (los ejemplos incluyen los adenomas de la tiroides, adenomas suprarrenales, y adenomas hipofisarios).

Los tumores benignos normalmente están rodeados por una superficie exterior que inhibe su capacidad para comportarse de una manera maligna. En algunos casos, ciertos tumores "benignos" pueden dar lugar más tarde a los cánceres malignos, los cuales resultan de los cambios genéticos adicionales en una subpoblación de células neoplásicas del tumor. Un ejemplo destacado de este fenómeno es el adenoma tubular, un tipo común de pólipo de colon que es un importante precursor de cáncer de colon. Las células en los adenomas tubulares, como la mayoría de los tumores que con frecuencia progresan a cáncer, muestran apariencia y ciertas anomalías de maduración de las células colectivamente conocidas como displasia. Estas anormalidades celulares no se ven en los tumores benignos que rara vez o nunca se vuelven cancerosos, pero se ven en otras anormalidades en el tejido precanceroso que no forman masas discretas, tales como lesiones pre-cancerosas del cuello uterino. Algunas autoridades prefieren referirse a los tumores displásicos como "pre-malignos", y reservan el término "benigno" para los tumores que rara vez o nunca dan lugar a cáncer.

Neoplasma es una masa anormal de tejido como resultado de la neoplasia. Neoplasia (nuevo crecimiento en griego) es la proliferación anormal de células. El crecimiento de las células supera a y no está coordinado con el de los tejidos normales a su alrededor. El crecimiento persiste de la misma manera excesiva incluso después de cesar los estímulos. Por lo general causa un bulto o tumor. Los neoplasmas pueden ser benignos, pre-malignos o malignos.

"Crecimiento de un tumor" o "crecimiento del tumor" de acuerdo con la invención se refiere a la tendencia de un tumor para aumentar su tamaño y/o a la tendencia de las células tumorales a proliferar.

Cáncer (término médico: neoplasia maligna) es una clase de enfermedades en las que un grupo de células presentan un crecimiento descontrolado (división más allá de los límites normales), la invasión (intrusión y destrucción de los tejidos adyacentes), y a veces la metástasis (diseminación a otras localizaciones en el cuerpo a través de la linfa o la sangre). Estas tres propiedades malignas del cáncer lo diferencian de los tumores benignos, los cuales son auto-limitados y no invaden o hacen metástasis. La mayoría de los cánceres forman un tumor, pero algunos, como la leucemia, no lo hacen. Según la invención, los términos "cáncer" y "tumor" o "enfermedad cancerosa" y "enfermedad neoplásica" se utilizan generalmente de forma intercambiable en este documento para referirse a enfermedades en las que las células muestran un crecimiento descontrolado y, opcionalmente, invasión y/o metástasis.

Preferentemente, una "enfermedad cancerosa" de acuerdo con la invención se caracteriza por células que expresan CLDN18.2. Una célula que expresa CLDN18.2 es preferentemente una célula cancerosa, preferentemente de los tumores y cánceres aquí descritos. Preferentemente, dicha célula es una célula distinta a una célula de estómago.

Los cánceres se clasifican por el tipo de células que al que se parezca el tumor y, por lo tanto, al tejido que se presume como originario del tumor. Estas son la histología y la localización, respectivamente.

El término "cáncer" de acuerdo con la invención comprende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas cáncer, rectal, cáncer endometrial, cáncer de riñón, cáncer adrenal, cáncer de tiroides, cáncer de la sangre, cáncer de piel, cáncer del cerebro, cáncer cervical, cáncer intestinal, cáncer de hígado, cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de intestino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gastrointestinal, cáncer de ganglios linfáticos, cáncer de esófago, cáncer colorectal, cáncer de páncreas, cáncer de oído, nariz y garganta (ENT), cáncer de glándula mamaría, cáncer de próstata, cáncer de útero, cáncer de ovario y cáncer de pulmón y las metástasis de los mismos. Los ejemplos de los mismos son carcinomas de pulmón, carcinomas de glándula mamaria, carcinomas de próstata, carcinomas de colon, carcinomas de células renales, carcinomas cervicales, o metástasis de los tipos de cáncer o tumores descritos anteriormente. El término cáncer de acuerdo con la invención también comprende metástasis de cáncer.

Los principales tipos de cáncer de pulmón son el carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) y el carcinoma de pulmón de células no pequeñas (CPNM). Hay tres subtipos principales de los carcinomas de pulmón de células no pequeñas: carcinoma de pulmón de células escamosas, adenocarcinoma y carcinoma de pulmón de células grandes. Los adenocarcinomas representan aproximadamente el 10% de los cánceres de pulmón. Este tipo de cáncer generalmente se observa en la periferia de los pulmones, en comparación con el cáncer de pulmón de células pequeñas y el cáncer de pulmón de células escamosas, los cuales tienden a estar localizados más centralmente.

De acuerdo con la invención, un "carcinoma" es un tumor maligno derivado de células epiteliales. Este grupo representa los cánceres más comunes, incluyendo las formas comunes de cáncer de glándula mamaria, próstata, pulmón y colon.

Por "metástasis" se entiende la propagación de células cancerosas desde su sitio original hacia otra parte del cuerpo. La formación de metástasis es un proceso muy complejo y depende de la separación de las células malignas del tumor primario, invasión de la matriz extracelular, la penetración de las membranas básales endoteliales para entrar en la cavidad del cuerpo y los vasos, y luego, después de haber sido transportados por la sangre, infiltración a los órganos blanco. Finalmente, el crecimiento de un nuevo tumor, es decir, un tumor secundario o tumor metastásico, en el sitio blanco depende de la angiogénesis. La metástasis tumoral a menudo se produce incluso después de la eliminación del tumor primario porque las células tumorales o componentes pueden permanecer y desarrollar el potencial metastásico. En una modalidad, el término "metástasis" de acuerdo con la invención se refiere a "metástasis distante", que se refiere a una metástasis que está alejada del tumor primario y el sistema de ganglios linfáticos de la región.

Las células de un tumor secundario o metastásico son como aquellas encontradas en el tumor original. Esto significa, por ejemplo, que si el cáncer de ovario metastatiza al hígado, el tumor secundario está conformado de células de ovario anormales, no de células anormales de hígado. El tumor en el hígado es entonces llamado cáncer de ovario metastásico, no cáncer de hígado.

Una recaída o recurrencia se produce cuando una persona se ve afectada de nuevo por una condición que le afectó en el pasado. Por ejemplo, si un paciente ha sufrido de una enfermedad neoplásica, ha recibido un tratamiento exitoso para dicha enfermedad y de nuevo desarrolla dicha enfermedad, dicha enfermedad recientemente desarrollada se puede considerar como recaída o recurrencia. Sin embargo, de acuerdo con la invención, una recaída o recurrencia de una enfermedad cancerosa puede ocurrir pero no necesariamente en el sitio de la enfermedad neoplásica original. Así, por ejemplo, si un paciente ha sufrido de tumor de ovario y ha recibido un tratamiento exitoso, una recaída o recurrencia pueden ser la aparición de un tumor de ovario o la aparición de un tumor en un sitio diferente al ovario. Una recaída o recurrencia de un tumor también incluye situaciones en las que un tumor se produce en un sitio diferente al sitio del tumor original, asi como en el sitio del tumor original. Preferentemente, el tumor original para el que el paciente ha recibido un tratamiento es un tumor primario y el tumor en un sitio diferente al sitio del tumor original es un tumor secundario o metastásico.

Por "tratar" se entiende administrar un compuesto o composición a un sujeto con el fin de prevenir o eliminar una enfermedad, incluyendo la reducción del tamaño de un tumor o el número de tumores en un sujeto; detener o retrasar una enfermedad en un sujeto; inhibir o retrasar el desarrollo de una nueva enfermedad en un sujeto; disminuir la frecuencia o la gravedad de los síntomas y/o recurrencias en un sujeto que actualmente tiene o que previamente ha tenido una enfermedad; y/o prolongar, es decir, aumentar la esperanza de vida del sujeto.

En particular, el término "tratamiento de una enfermedad" incluye cura, reducción de la duración, mejoría, prevención, ralentización o inhibición de la progresión o empeoramiento, o prevención o retraso del inicio de una enfermedad o síntomas de la misma.

Por "estar en riesgo" se entiende un sujeto, es decir, un paciente, que se identifica como con una probabilidad mayor de lo normal de desarrollar una enfermedad, en particular el cáncer, en comparación con la población general. Además, un sujeto que ha tenido o que actualmente tiene una enfermedad, cáncer en particular, es un sujeto que tiene un mayor riesgo de desarrollar una enfermedad, asi como un sujeto de este tipo puede continuar desarrollando una enfermedad. Los sujetos que actualmente tienen o han tenido un cáncer, también tienen un mayor riesgo de metástasis del cáncer.

El término "inmunoterapia" se refiere a un tratamiento que implica una reacción inmunitaria especifica. En el contexto de la presente invención, los términos tales como "proteger", "prevenir", "profiláctico", "preventivo" o "protector" se refieren a la prevención o el tratamiento o ambos de la ocurrencia y/o la propagación de una enfermedad en un sujeto y, en particular, de reducir al mínimo la probabilidad de que un sujeto desarrolle una enfermedad o para retrasar el desarrollo de una enfermedad. Por ejemplo, una persona en riesgo de un tumor, como se describió anteriormente, sería un candidato para la terapia para prevenir un tumor. La inmunoterapia puede llevarse a cabo utilizando cualquiera de entre una variedad de téenicas, en las que los agentes funcionan para eliminar las células que expresan el antígeno de un paciente.

En ciertas modalidades, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia activa, en la que el tratamiento se basa en la estimulación in vivo del sistema inmunitario endógeno del huésped para reaccionar contra las células enfermas con la administración de agentes modificadores de la respuesta inmunitaria (tales como péptidos inmunorreactivos y ácidos nucleicos).

En otras modalidades, la inmunoterapia puede ser inmunoterapia pasiva, en la que el tratamiento involucra la entrega de agentes con reactividad inmune tumoral establecida (como los anticuerpos) que pueden mediar directa o indirectamente efectos antitu orales y que no depende necesariamente de un sistema inmunitario intacto del hospedero.

El término "in vivo" se relaciona a la situación en un sujeto.

Los términos "sujeto", "individuo", "organismo" o "paciente" se usan indistintamente y se relacionan a los vertebrados, preferentemente mamíferos. Por ejemplo, los mamíferos en el contexto de la presente invención son seres humanos, primates no humanos, animales domésticos como perros, gatos, ovejas, vacas, cabras, cerdos, caballos, etc., animales de laboratorio, tales como ratones, ratas, conejos, conejillos de indias, etc., así como animales en cautiverio, tales como animales de zoológicos. El término "animal" como se usa en este documento también incluye a los humanos. El término "sujeto" también puede incluir un paciente, es decir, un animal, preferentemente un ser humano que tiene una enfermedad, preferentemente una enfermedad como aquí se describe.

Según la invención, una "muestra" puede ser cualquier muestra útil de acuerdo con la presente invención, en particular una muestra biológica como una muestra de tejido, incluyendo fluidos corporales, y/o una muestra celular y puede ser obtenida del modo convencional, como mediante biopsia de tejido, incluyendo biopsia en sacabocados, y mediante toma de sangre, aspirado bronquial, esputo, orina, heces u otros fluidos corporales. De acuerdo con la invención, el término "muestra" también incluye muestras procesadas tales como fracciones o aislados de muestras biológicas, por ejemplo, aislados de ácido nucleico y péptido/proteína. Preferentemente una muestra contiene células o tejidos del órgano que se examinará, por ejemplo, que ha de ser diagnosticado de cáncer. Por ejemplo, si el cáncer a diagnosticar es cáncer de pulmón, una muestra puede contener células o tejido obtenido de pulmón.

De acuerdo con la invención, una muestra puede ser una muestra como una muestra corporalmente derivada de un paciente que tenga o se espera que tenga tumor o células cancerosas. La muestra corporal puede ser cualquier muestra de tejido como sangre, una muestra de tejido obtenida del tumor primario o de metástasis de tumor o alguna otra muestra que contenga tumor o células cancerosas.

La presente invención es descrita en detalle por las figuras y ejemplos a continuación, las cuales se utilizan sólo con propósitos de ilustración y no pretenden ser limitantes. Debido a la descripción y los ejemplos, otras modalidades que sean igualmente incluidas en la invención son accesibles al téenico especializado.

EJEMPLOS Las técnicas y métodos aquí utilizados se describen aquí o son llevados a cabo de modo conocido per se y tal como se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., Molecular Cloning: ? Laboratory Manual, 2a Edición (1989) Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. Todos los métodos incluyendo la utilización de kits y reactivos son llevados a cabo de acuerdo a la información del fabricante a menos que se indique específicamente lo contrario.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales El objetivo de este proyecto fue generar anticuerpos monoclonales merinos específicos para CLDN18, capaces de detectar células tumorales con expresión de CLDN18.2 en tejidos de CA de estómago, CA de esófago, CA de páncreas y CA de pulmón FFPE.

Para generar un anticuerpo altamente específico, con gran afinidad, de diagnóstico de CLDN18.2, era esencial comenzar con los protocolos de inmunización con una gran variación de distintos inmunógenos y adyuvantes. Durante el proyecto, se inocularon alrededor de 100 ratones (C57B1/6 y Balb/c), utilizando diversas estrategias de inmunización para desencadenar una respuesta inmunitaria contra CLDN18.

Para desencadenar el sistema inmunitario del ratón y para sobreponerse a la tolerancia inmunitaria, utilizamos partículas similares a virus (VLP, por sus siglas en inglés), conjugados de péptidos y proteínas recombinantes que codifican para distintas partes de CLDN18.2 humana expresados como proteínas recombinantes de fusión con distintos patrones de expresión (marcas).

De 13 estrategias distintas de inmunización, los mejores resultados se lograron tratando ratones con una proteína recombinante del carboxilo terminal de CLDN18 marcada con HIS (véase Figura 2; Inmunización #20) en combinación con varios adyuvantes (ver Tabla 1, abajo, fusión 35).

Un candidato (35-22A) resultó de una estrategia de inmunización de 4 etapas (30 días). Un candidato (43-14A) fue generado siguiendo un protocolo de inmunización de 7 pasos (79 dias) (véase Tabla 1, abajo, fusión 43).

Dos dias antes de la esplenectomia, los ratones fueron estimulados para activar las células B-blanco.

El día de fusión los esplenocitos de ratón se aislaron y fusionaron a una linea celular de mieloma de ratón Ag8.653. Para la fusión de células de ratón a las de mieloma se siguió el protocolo estándar publicado por Kóhler y Milstein 1975. Después de una selección HAT, se probó la secreción de anticuerpos que reconocieran el antigeno utilizado para las inmunizaciones en los sobrenadantes, mediante ELISA.

Las células de hibridoma con sobrenadantes positivos mediante ELISA fueron subclonadas para generar hibridomas monoclonales y los sobrenadantes de las células de hibridoma subclonadas fueron evaluados nuevamente mediante ELISA. Las células de hibridoma de clonas positivas fueron expandidas y los sobrenadantes se analizaron posteriormente.

Ejemplo 2: Análisis por Western Blot de sobrenadantes de hibridoma monoclonal Para responder a la pregunta de si los anticuerpos positivos en ELISA en el sobrenadante son capaces de unirse a Claudina 18 recombinante o a U sados de proteínas de células HEK293 estables transíectadas con expresión de claudina 18, se realizó un análisis por Western Blot. Los anticuerpos que fueron capaces de unirse específicamente a Claudina 18 en un análisis por Western Blot fueron expandidos. Las células se congelaron y los anticuerpos se purificaron mediante MABselect (FPLC). Los anticuerpos seleccionados por análisis de Western Blot fueron purificados y evaluados por su habilidad para unirse a su antígeno en tejidos embebidos en parafina fijados con formalina (FFPE, por sus siglas en inglés) mediante inmunohistoquímica.

Ejemplo 3: Análisis histológico - primer análisis de anticuerpos positivos por Western Blot El objetivo de este experimento fue revisar la especificidad y sensibilidad de los anticuerpos CLDN18. Esto se realizó utilizando tejido de estómago normal con expresión de CLDN18 mediante FFPE.

En un primer experimento, los anticuerpos purificados probados por Western Blot se analizaron a una concentración de 0.5 g/ml en secciones de FFPE de estómago humano. Los anticuerpos que obtuvieron buenos resultados y no produjeron altas cantidades de fondo se titularon a 0.2 y 0.1 mg/ml en varios tejidos normales de estómago para probar la sensibilidad y especificidad. En el desarrollo de etapas posteriores, los anticuerpos recién generados fueron probados directamente a una concentración de 0.2 mg/ml ya que el mejor anticuerpo tuvo un desempeño muy bueno a 0.2 mg/ml y sirvió como punto de referencia. Los anticuerpos que generan fuertes señales en el epitelio de la mucosa de los tejidos de estómago humano probados y sin fondo en los tejidos de la mucosa adyacentes fueron seleccionados para experimentos adicionales de titulación y análisis de la especificidad. Dos anticuerpos presentaron un desempeño destacado: 35-22A y 43-14A; véanse los cuadros 2 y 3, a continuación.

Los anticuerpos que producen señales fuertes en el tejido normal de estómago probado fueron analizados en tejidos de cáncer. Las células de hibridoma correspondientes se adaptaron a medio libre de suero. Las señales producidas usando muMAb 43-14A fueron ligeramente más fuertes que las señales producidas usando muMAb 35-22A; véase la Tabla 4, abajo.

Ejemplo 4: Histología en análisis profundo y caracterización del anticuerpo Los anticuerpos producidos libres de suero se utilizaron para teñir microarreglos de te tejido de CA de estómago (TMA por sus siglas en inglés). Se analizaron la cantidad de casos de tinción, la fuerza de la señal y la cantidad de células tumorales positivas.

Las intensidades de la tinción de mumAbs 35-22A y de 43-14A fueron excelentes. No se detectaron diferencias significativas en el patrón de teñido y sólo se encontraron ligeras diferencias en las intensidades de tinción entre los anticuerpos probados 35-22A y 43-14A.

Ejemplo 5: Análisis de especificidad del anticuerpo utilizando un panel de tejido normal Los anticuerpos seleccionados fueron probados en varios tejidos normales y relevantes, para asegurar la alta especificidad por el blanco CLDN18; véanse las Tablas 5A y 5B, abajo.

No fueron visibles diferencias significativas en el patrón de tinción y las intensidades de tinción de los anticuerpos 35-22A y 43-14A en los experimentos anteriores. Por lo tanto los anticuerpos se sometieron a experimentos de tinción con un protocolo de orientación más clínica. Para simular los procesos de tinción aplicados en laboratorios de patología estándar, se estableció un Protocolo de un día con una etapa de incubación corta (1 hora) con el anticuerpo primario.

En todos los casos analizados, muMAb 43-14A se comporta muy bien e incluso mejor en comparación a mu Ab 35-22A; véase la Tabla 6, abajo.

Ejemplo 6: Análisis profundo interno de tejido relevante -epitelio respiratorio muMAb 43-14A fue analizado adicionalmente en varios tejidos respiratorios pertinentes para asegurar su especificidad, especialmente en los tejidos blanco del pulmón/tracto bronquial. Para estos tejidos se reportó la expresión de CLDN18.1. Para analizar si el anticuerpo de diagnóstico tiene una reacción cruzada con la isoforma de pulmón/bronquial de CLDN18.1, se evaluaron todos los tejidos disponibles de pulmón/bronquios. No se detectaron señales con tejidos de pulmón o bronquiales; véase la Tabla 7, abajo. La isoforma CLDN18 expresada en estos tejidos respiratorios no es reconocida por el Anticuerpo 43-14A.

Ejemplo 7: Mapeo del epitopo de mumAbs 43-14A y de 35-22A Se realizó un ELISA con péptido para identificar los epítopos de unión del anticuerpo en CLDN18.2. Cada anticuerpo purificado se probó en péptidos traslapados que cubren la secuencia carboxilo terminal de CLDN18.2. Tanto 35-22A como 43-14A mostraron una unión especifica a un mapeo de epítopos al péptido TEDEVQSYPSKHDYV. La siguiente secuencia se determinó como la secuencia reactiva: EVQSYPSKHDYV.

Ejemplo 8: Análisis de s cuencia d mumAbs 43-14A y 35-22A Un análisis de la secuencia de los anticuerpos 43-14A y 35-22A se muestra en la Figura 3.

Ejemplo 9: Tinción de diferentes tejidos de cáncer La inmunohistoquimica se realizó en muestras en portaobjetos, embebidas en parafina y fijadas con 4% de formalina amortiguadora. El embebido en parafina fue realizado de acuerdo con los protocolos estándar.

Después de la remoción de la parafina, todos los portaobjetos fueron sujetos a una recuperación de antigeno hirviendo en ácido cítrico 10 m suplementado con 0.05% Tween-20 (pH 6.0) a 120°C durante 10 min., blanqueados (usando 2% H202), bloqueados e incubados toda la noche a 4°C con 0.2 - 0.5 qg/ml de anticuerpo monoclonal de ratón para diagnóstico contra CLNDN18.2, 43-14A o 35-22A. La unión al anticuerpo fue visualizada con anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano, utilizando el anticuerpo basado en polímero Powervision (Power Vision HRP cabra anti ratón; Immunologic, Duiven, Países Bajos) y una solución de sustrato cromógeno (VectorRed; Vector Labs, Burlíngame, EUA). Las secciones fueron posteriormente contra-teñidas con hematoxilina de Mayer (Cari Roth GmbH, Karlsruhe, Alemania) y se sometieron a evaluación por parte de los evaluadores.

Evaluación histológica Todas las muestras se analizaron de acuerdo a la proporción relativa de células tumorales positivas teñidas en relación con todas las células tumorales visibles para cada sección. La intensidad de la tinción se clasificó como negativa (-), débilmente positiva (1+), medianamente positiva (2+) y fuertemente positiva (3+). Sólo la tinción membranosa fue considerada como positiva. Para cada tinción, el tejido de estómago humano sirvió como control positivo. Ya que la PanlN (neoplasia intraepitelial pancreática) es frecuentemente positiva, dichas áreas fueron también consideradas como referencia de intensidad de tinción interna para positividad fuerte (3 +).

Se generaron señales membranosas y fuertes con ambos anticuerpos en tejidos cancerosos de páncreas, esófago y estómago (Tabla 8), o con el anticuerpo 43-14A en tejidos cancerosos de pulmón (Tabla 9). El número de células tumorales positivas variaron entre-individuos entre los diferentes casos de tumores. La mayor parte de las muestras analizadas fueron positivas de 2+ a 3+.

Tabla 1: Esquemas de inmunización para los anticuerpos Ratón 5 Inmunización #20 - Fusión 35 Ratón 4 Inmunización #20 - Fusión 43 Ch Tabla 2: Anticuerpos mumAbs positivos seleccionados mediante análisis por Western Blot Tabla 3: Comparación de los dos anticuerpos 35-22A y 43-14A en tejido FFPE normal de estómago humano Tabla 4: Análisis de tejido de cáncer - TMA127A 00 U1 o Ln fu IP > S H u>· H- W g (D· ft (D m· o m 3 0 9 S W (D 6IT en o en OZl en o n H P» s> s P>' H H- tn H- (A + (D H· 8 W 3 0 9 P» H (D (0 1 ?d h O rt O O O H O (D 3 3 izi Tabla 7: Análisis de tejidos respiratorios normales h-1 > > Tabla 8: Análisis de expresión de CLDN18.2 en tejidos cancerosos esofágicos, pancreáticos y estomacales, utilizando los anticuerpos onoclonales murinos 43-14A y 35-22A PDAC = adenocarcinoma de conducto pancreático Tabla 9: Análisis de xpresión de CLDN18.2em t jidos pulmonares cancerosos , utilizando el anticuerpo monoclonal murino 43-14A Referencia de archivo del No. de solicitud internacional solicitante o agente 342-70 PCT _ PCT/EP2013/001331 _ INDICACIONES RELACIONADDAS A MICROORGANISMO DEPOSITADO U OTRO MATERIAL BIOLÓGICO (Regla 13 bis PCT) , .

D. ESTADOS DESIGNADOS PARA LOS CUALES ESTÁN HECHAS LAS INDICACIONES (sitas Las indicaciones listadas a continuación serán sometidas a la Oficina Internacional más tarde (especificada naturaleza general de las indicaciones, por ejemplo, “Número de Acceso del Depósito") Formato PCT/RO/134 (Julio 1998; reimpresión Enero 2004) Hoja adicional para material biológico Identificación para depósitos posteriores: 1) El Nombre y el Domicilio de la institución depositaría para los depósitos son: DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH Inhoffenstr. 7 B 38124 Braunschweig DE Indicaciones adicionales para todos los depósitos arriba mencionados: - Ag8.653 de mieloma de ratón (Mus musculus) fusionadas con esplenocitos de ratón (Mus musculus) Hibridoma con secreción de anticuerpo contra CLDN18.2 humana 2) Depositante: Todas las deposiciones arriba mencionadas fueron hechas por: Ganymed Pharmaceuticals AG Freiligrathstrahe 12 55131 Mainz DE

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo, caracterizado porque (i) se une a un péptido con la secuencia de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) o EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) y/o (ii) se une a claudina 18.2 (CLDN18.2), donde dicho anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo se une a CLDN18.2 mediante la unión de al menos a un epitopo de CLDN18.2 con la secuencia de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) o EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

2. El anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque dicha CLDN18.2 es CLDN18.2 de superficie de unión a membrana.

3. El anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha CLDN18.2 está presente en células cancerosas

4. El anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque dichas células cancerosas son células cancerosas que expresan CLDN18.2.

5. El anticuerpo o fragmento de unión al antigeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque dichas células cancerosas son seleccionadas del grupo que consiste de células cancerosas gástricas, de esófago, pancreáticas, de pulmón, de ovario, de colon, hepáticas, de cabeza-cuello, y de vesícula biliar.

6. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque no se une a células no cancerosas excepto a células epiteliales de estómago.

7. El anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque no se une a células de pulmón no cancerosas .

8. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.

9. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal.

10. Un anticuerpo, caracterizado porque es seleccionado de entre el grupo que consiste en: (i) un anticuerpo producido mediante u obtenible a partir de un clon depositado bajo el no. de acceso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) o DSM ACC3143 (muAB 35-22A), (ii) un anticuerpo que es una forma quimérica o humanizada del anticuerpo bajo (i), (iii) un anticuerpo que tiene la especificidad del anticuerpo bajo (i), y (iv) un anticuerpo que comprende la porción de unión al antigeno o el sitio de unión al antigeno del anticuerpo bajo (i), o un fragmento de unión del antigeno del anticuerpo bajo cualquiera de (i) a (iv).

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la porción de unión al antigeno o el sitio de unión al antigeno del anticuerpo bajo (i) comprende la región variable del anticuerpo bajo (i).

12. Un conjugado, caracterizado porque comprende un anticuerpo o fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquier reivindicación de 1 a 11 acoplado al menos a un marcador detectable.

13. Un hibridoma, caracterizado porque es capaz de producir el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Un hibridoma, caracterizado porque es depositado bajo el no. de acceso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) o DSM ACC3143 (muAB 35-22A).

15. Un método para detectar CLDN18.2 o determinar la cantidad de CLDN18.2 en una muestra, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra con el anticuerpo o el fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el conjugado de conformidad con la reivindicación 12 y (ii) detectar la formación de un complejo o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

16. Un método para determinar si las células expresan CLDN18.2, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra celular con el anticuerpo o el fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el conjugado de conformidad con la reivindicación 12 y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2 expresada por las células en dicha muestra.

17. Un método de diagnóstico, detección o monitoreo de cáncer, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra biológica con el anticuerpo o el fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el conjugado de conformidad con la reivindicación 12 y (ii) detectar la formación de un complejo y/o determinar la cantidad de un complejo entre el anticuerpo, el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

18. Un método para determinar si un cáncer es tratable mediante una terapia dirigida contra CLDN18.2, caracterizado porque comprende las etapas de: (i) poner en contacto una muestra que comprende células cancerosas con el anticuerpo o el fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el conjugado de conformidad con la reivindicación 12 y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo el fragmento de unión al antigeno o el conjugado y CLDN18.2.

19. Un kit de prueba de diagnóstico, caracterizado porque comprende el anticuerpo o el fragmento de unión al antigeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o el conjugado de conformidad con la reivindicación 12.

20. El anticuerpo o el fragmento de unión al antígeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el conjugado de conformidad con la reivindicación 12, el hibridoma de conformidad con la reivindicación 13 o 14, o el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque dicha CLDN18.2 comprende la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 del listado de secuencia o una variante de dicha secuencia de aminoácidos.