KR20220024010A - 클라우딘 18a2에 대한 항체 및 그의 용도 - Google Patents

클라우딘 18a2에 대한 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 유도체, 제약 조성물, 및 암의 치료, 진단 및 검출을 위한 상기 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 관련된 용도가 제공된다.

Description

클라우딘 18A2에 대한 항체 및 그의 용도
본 개시내용은 면역학 분야, 더욱 특히 클라우딘 18.2 (CLDN18A2, CLDN18.2)에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 유도체, 제약 조성물, 및 암 치료에서 그의 관련된 용도에 관한 것이다.
클라우딘은 상피 또는 내피 세포 층에서 보이는 극성화된 세포 유형에서 정점 세포-세포 접착 이음과 같은 치밀 이음의 주요 구조 단백질을 포함하는 내재성 막 단백질이다. 치밀 이음은 세포 주위에 연속적인 밀봉을 형성하는 다중-가닥 망상 단백질로 구성되고, 세포주위 공간에서 용질 및 물 수송에 대한 물리적 장벽을 제공하지만, 조정가능하다. 클라우딘의 패밀리는 인간에서 22 내지 34 kDa 범위의 크기를 갖는 적어도 23가지 구성원을 함유한다. 클라우딘이 정상 조직의 기능 및 안정성에 중요하지만, 종양 세포는 종종 비정상적인 치밀 이음 기능을 나타낸다. 이는 종양 세포의 탈분화로 인한 클라우딘의 발현 및/또는 위치의 조절이상, 또는 빠르게 성장하는 암 조직에 의해 비정상적인 혈관형성을 갖는 종양 덩어리에서 영양분의 효과적인 흡수에 대한 요건과 연관이 있을 수 있다 (Morin, 2005, PMID: 16266975). 개별 클라우딘 패밀리 구성원은 특정한 암 유형에서는 상향조절될 수 있지만, 다른 암 유형에서는 하향조절될 수 있다.
클라우딘 18 (CLDN18)은 상피 및 내피의 치밀 이음에 위치하는 약 27.9 KD의 분자량을 갖는 내재성 막 단백질이다. CLDN18은 다른 치밀 이음 단백질과 세포간 치밀 이음을 형성하여, 세포간 공간에서 조직 분자 및 이온의 투과성을 조절하고, 조직 환경의 안정성을 유지한다. 클라우딘 18의 2가지 아형, 스플라이스 변이체 1 (CLDN18A1, CLDN18.1): 진뱅크(GenBank) 수탁 번호 NP_057453 및 NM016369, 및 스플라이스 변이체 2 (CLDN18A2, CLDN18.2): 진뱅크 수탁 번호 NM_001002026 및 NP_001002026이 있는 것으로 공지되어 있다. 정상 세포에서, CLDN18A1은 폐의 상피 세포에서 선택적으로 발현되는 반면에, CLDN18A2는 정상 위 상피 분화 세포에서 특이적으로 발현되고, 세포 분열 활성을 갖는 위 상피 줄기 세포에서는 발현되지 않는다. 그러나, 위암 환자의 75%, 췌장암 환자의 50%, 및 식도암 환자의 30%에서 발견되는 CLDN18A2의 높은 발현과 같이 CLDN18A2는 여러 암 유형의 종양 세포에서, 또한 폐암 및 다른 암 유형에서 과발현된다. 따라서, CLDN18A2에 특이적으로 결합하지만 CLDN18A1에는 결합하지 않는 항체를 발견하는 것은 암의 치료 및 검출에 매우 중요하다.
기존 CLDN18A2 항체 IMAB362는 임상 연구 단계에 들어갔으며, 임상 결과는 높은 CLDN18.2 발현 (종양 세포의 ≥70%가 CLDN18.2 발현 ≥2+임)을 갖는 위암 환자에서 화학요법 단독과 비교하여 화학요법 + IMAB362의 무진행 생존이 6.1 개월에서 9.1 개월로 연장되고 (HR = 0.46); 총 생존 시간이 9.3 개월에서 16.6 개월로 연장되었음을 (HR = 0.44) 나타내었다. 항체 IMAB362 외에도, CLDN18.2 표적에 대해 제조된 CAR-T 또한 임상 연구에 들어갔다. 그러나, 임상 단계에 들어간 이들 항체 (또는 CAR-T에서 항원-결합 단편)는 클라우딘 18.2에 대한 친화도가 낮았다. 따라서, 동일한 용량에서 더 큰 효능을 생성하기 위해 더 큰 친화도를 갖는 CLDN18.2 항체를 계속해서 스크리닝하고 제조할 필요가 남아있다.
본 개시내용은 CLDN18.2에 특이적으로 결합하고 CLDN18.1에는 유의하게 결합하지 않는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, CLDN18.2는 진뱅크 수탁 번호 NP_001002026 (mRNA:NM_001002026)을 갖는 펩티드이다. CLDN18.1은 진뱅크 수탁 번호 NP_057453 (mRNA:NM_016369)을 갖는 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 CLDN18.1 사이에는 유의한 결합이 없다. 일부 예에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN18.2에 대한 결합의 20% 이하의 수준으로 CLDN18.1에 결합한다. 예를 들어, 결합 수준은 CLDN18.2에 대한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합의 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 1% 미만일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN18.1에 대한 결합보다 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 10배, 또는 10배 초과의 더 높은 수준으로 CLDN18.2에 결합한다.
본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 CLDN18.2에 특이적으로 결합할 수 있고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호(SEQ ID NO): 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 HCDR을 포함하고; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 LCDR을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 37, 40, 43, 45, 49, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1; 및 서열식별번호: 38, 41, 46, 48, 50, 52, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR2; 및 서열식별번호: 39, 42, 44, 47, 51, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR3을 포함하고/거나, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 111, 112, 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1; 및 서열식별번호: 93, 94, 95, 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR2; 및 서열식별번호: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR3을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하며, 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고/거나:
서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 및 서열식별번호: 39 또는
서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 42 또는
서열식별번호: 43, 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 44 또는
서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47 또는
서열식별번호: 37, 서열식별번호: 48 및 서열식별번호: 39 또는
서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 51 또는
서열식별번호: 49, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 51 또는
서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 55 또는
서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58 또는
서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 61 또는
서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 64 또는
서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67 또는
서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 70 또는
서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72 및 서열식별번호: 73 또는
서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및 서열식별번호: 76 또는
서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79 또는
서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 82 또는
서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84 및 서열식별번호: 85;
경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다:
서열식별번호: 86, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 97; 또는
서열식별번호: 87, 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 98; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 99; 또는
서열식별번호: 87, 서열식별번호: 95 및 서열식별번호: 100; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 97; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 101; 또는
서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 102; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 100; 또는
서열식별번호: 90, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 103; 또는
서열식별번호: 91, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 104; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 98; 또는
서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 105; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 106; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
서열식별번호: 87, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 108; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 109; 또는
서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
서열식별번호: 111, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
서열식별번호: 112, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
서열식별번호: 113, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
서열식별번호: 111, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
서열식별번호: 112, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
서열식별번호: 113, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110.
본 개시내용의 한 측면에 따라, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 가변 영역은 하기 군 중 하나로부터의 6개의 CDR을 포함하고, 각각의 그룹의 6개의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3의 순서로 배열된다:
(1) 서열식별번호: 37, 38, 39, 86, 93, 97;
(2) 서열식별번호: 40, 41, 42, 87, 94, 98;
(3) 서열식별번호: 43, 41, 44, 88, 93, 99;
(4) 서열식별번호: 45, 46, 47, 87, 95, 100;
(5) 서열식별번호: 37, 48, 39, 88, 93, 97;
(6) 서열식별번호: 49, 50, 51, 88, 93, 101;
(7) 서열식별번호: 49, 52, 51, 89, 93, 102;
(8) 서열식별번호: 53, 54, 55, 88, 93, 100;
(9) 서열식별번호: 56, 57, 58, 90, 93, 103;
(10) 서열식별번호: 59, 60, 61, 91, 96, 104;
(11) 서열식별번호: 62, 63, 64, 88, 93, 98;
(12) 서열식별번호: 65, 66, 67, 92, 93, 105;
(13) 서열식별번호: 68, 69, 70, 88, 93, 106;
(14) 서열식별번호: 71, 72, 73, 88, 93, 107;
(15) 서열식별번호: 74, 75, 76, 88, 93, 106;
(16) 서열식별번호: 77, 78, 79, 87, 93, 108;
(17) 서열식별번호: 80, 81, 82, 88, 93, 109;
(18) 서열식별번호: 83, 84, 85, 88, 93, 110;
(19) 서열식별번호: 71, 72, 73, 111, 93, 107;
(20) 서열식별번호: 71, 72, 73, 112, 93, 107;
(21) 서열식별번호: 71, 72, 73, 113, 93, 107;
(22) 서열식별번호: 83, 84, 85, 111, 93, 110;
(23) 서열식별번호: 83, 84, 85, 112, 93, 110;
(24) 서열식별번호: 83, 84, 85, 113, 93, 110.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고/거나, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 114, 115, 116, 117, 118, 119와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
본 개시내용의 한 측면에 따라, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 포함한다:
(1) 서열식별번호: 1 및 2;
(2) 서열식별번호: 3 및 4;
(3) 서열식별번호: 5 및 6;
(4) 서열식별번호: 7 및 8;
(5) 서열식별번호: 9 및 10;
(6) 서열식별번호: 11 및 12;
(7) 서열식별번호: 13 및 14;
(8) 서열식별번호: 15 및 16;
(9) 서열식별번호: 17 및 18;
(10) 서열식별번호: 19 및 20;
(11) 서열식별번호: 21 및 22;
(12) 서열식별번호: 23 및 24;
(13) 서열식별번호: 25 및 26;
(14) 서열식별번호: 27 및 28;
(15) 서열식별번호: 29 및 30;
(16) 서열식별번호: 31 및 32;
(17) 서열식별번호: 33 및 34;
(18) 서열식별번호: 35 및 36;
(19) 서열식별번호: 27 및 114;
(20) 서열식별번호: 27 및 115;
(21) 서열식별번호: 27 및 116;
(22) 서열식별번호: 35 및 117;
(23) 서열식별번호: 35 및 118;
(24) 서열식별번호: 35 및 119.
일부 바람직한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제공하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 120, 122, 125, 128과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖고/거나, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 121, 123, 124, 126, 127과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
본 개시내용의 한 측면에 따라, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 하기로 이루어진 군 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 서열 동일성을 포함한다:
(1) 서열식별번호: 120 및 121;
(2) 서열식별번호: 120 및 123;
(3) 서열식별번호: 120 및 124;
(4) 서열식별번호: 122 및 121;
(5) 서열식별번호: 125 및 126;
(6) 서열식별번호: 125 및 127;
(7) 서열식별번호: 128 및 126.
일부 바람직한 실시양태에서, 항-CLDN18.2 항체는 모노클로날 항체이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고, 바람직하게는 중쇄 불변 영역은 Fc 또는 변이체 Fc를 포함하고, Fc는 마우스 또는 인간으로부터 유래된다.
일부 바람직한 실시양태에서, 항-CLDN18.2 항체는 전장 항체이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 형태이다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항원-결합 단편에는 Fab, Fv, scFv, F(ab')2, 선형 항체, 및 단일-도메인 항체가 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포획 표지 또는 검출 표지에 커플링시킴으로써 형성된 접합체를 제공한다. 이러한 검출 표지에는 방사성 핵종, 발광 물질 (예를 들어, 플루오레세인), 착색 물질, 또는 효소가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 이중특이적 또는 다중특이적 항체를 제공하고, 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 한 항원-결합 도메인은 본 개시내용의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 항체-약물 접합체를 제공한다. 이러한 항체-약물 접합체의 구조는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 항체-링커-약물 (독소)의 상호연결에 의해 형성된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포외 인식 단위가 상기 기재된 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 언급된 임의의 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산을 제공한다. 본 개시내용의 또 다른 측면에 따르면, 핵산을 포함하는 재조합 벡터가 제공된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 발현 벡터 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산과 통합된 게놈을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 일부 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵생물 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli)일 수 있고; 또한 진핵생물 세포, 예컨대 효모 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 HEK293 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 숙주 세포를 적합한 조건하에 배양하고, 세포로부터 발현 생성물을 정제하는 것을 포함하는, 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLDN18.2-발현 종양 세포를 특이적으로 표적화하는 약물, 예컨대 모노클로날 항체 약물, 항체-약물 접합체, 이중특이적 항체, 또는 다중특이적 항체의 제조를 위한; 또는 키메라 항원 수용체에 의해 변형된 면역 세포의 제조를 위한; 또는 CLDN18.2-발현 종양의 진단을 위한 시약의 제조를 위한 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도를 제공하고; 일부 실시양태에서, CLDN18.2-발현 종양은 위암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 및 담낭암 및 그의 전이, 위암 전이, 예컨대 쿠켄베르크(Kuckenberg) 종양을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 샘플을 상기 언급된 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고; 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CLDN18.2의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 CLDN18.2 발현을 검출하는 방법을 제공하며; 임의적으로, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능하게 표지된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 포함하거나, 또는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산의 유효량을 포함하거나, 또는 코딩 핵산을 포함하는 재조합 벡터의 유효량을 포함하거나, 또는 코딩 핵산을 포함하는 숙주 세포의 유효량을 포함하거나, 또는 본 개시내용의 항체-약물 접합체의 유효량을 포함하거나, 또는 본 개시내용의 키메라 항원 수용체의 유효량을 포함하거나, 또는 본 개시내용의 이중특이적 또는 다중특이적 항체의 유효량을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
일부 바람직한 실시양태에서, 제약 조성물은 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 이러한 추가의 치료제에는 세포독성제, 세포정지제, 항혈관형성제, 항신생물제, 화학치료제, 방사선 치료제, 표적화된 항암제, 생물학적 반응 조절제, 암 백신, 시토카인, 호르몬, 항전이제, 및 면역치료제가 포함된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 용기, 및 용기 내의 본 개시내용의 제약 조성물을 포함하는 약물 박스 또는 키트를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포를 본 개시내용의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CLDN18.2-발현 세포에서 사멸을 유도하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포를 시험관내에서 제약 조성물과 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 세포를 생체내에서 제약 조성물과 접촉시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 고형 종양 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 위암 세포, 식도암 세포, 장암 세포, 췌장암 세포, 신장모세포종 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 간암 세포, 두경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포, 및 담낭암 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 CLDN18.2의 발현과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 개시내용의 제약 조성물에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLDN18.2의 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 질환은 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양은 바람직하게는 위암, 식도암, 장암, 췌장암, 신장모세포종, 폐암, 난소암, 결장암, 직장암, 간암, 두경부암, 만성 골수성 백혈병, 또는 담낭암이다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
본 개시내용의 항체는 화학치료제, 세포독성제, 방사선 치료제, 암 백신, 항신생물제, 표적화된 항암제, 항혈관형성제, 생물학적 반응 조절제, 시토카인, 호르몬, 항전이제, 및 면역치료제를 비롯하여 이로 제한되지 않는 또 다른 추가의 치료제와 조합하여 투여될 수 있다.
일부 바람직한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 조합하여 사용될 수 있는 화학치료제에는 유사분열 억제제, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 나벨빈; 토포아이소머라제 I 억제제, 예컨대 캄프토테신 화합물, 예컨대 이리노테칸, 토포테칸, 및 캄프토테신 및 그의 유사체로부터 유래된 다른 화합물; 포도필로톡신 유도체, 예컨대 에토포시드, 테니포시드, 및 미독시조즈; 알킬화제, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 브리퀴놀리진, 우라실 머스타드, 클로프로펜, 및 다카르바진; 항대사물, 예컨대 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프린, 및 프로카르바진; 항생제, 예컨대 비제한적으로 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미토마이신, 사르코마이신 C, 악티노마이신 D, 록시트로마이신, 아드리아마이신, 라파마이신 및 그의 유도체, 및 다우노마이신; 및 다른 화학치료제, 예컨대 비제한적으로 파클리탁셀, 도세탁셀, 다카르바진, 아자시티딘, 암사콘 멜팔란, 이포스파미드, 및 미톡산트론이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 일부 바람직한 실시양태에서, 추가의 치료제는 에피루비신, 옥살리플라틴, 및 5-플루오로우라실 중 1종 이상으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적화된 항암제에는 거대 분자-표적화된 약물, 소분자-표적화된 약물 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 바람직한 실시양태에서, 거대분자 표적화제에는 표피 성장 인자-표적화제, 예컨대 세툭시맙, 파니투무맙, 및 니모투주맙 등; HER-2 또는 HER-3 신호전달 경로 억제제, 예컨대 트라스투주맙, 페르투주맙, T-DM1 등; 항-혈관 내피 성장 인자 약물, 예컨대 VEGF-TRAP, 베바시주맙, 라무시루맙 등; 또한 PI3K, PARP, PI3Kα, PKB/AKT, 및 STAT3과 같은 표적을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다른 표적을 표적화하는 작용제가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 소분자-표적화제에는 표피 성장 인자 표적화제, 예컨대 에를로티닙 또는 게피티닙 등; HER-2 또는 HER-3 신호전달 경로 억제제, 예컨대 라파티닙 또는 아파티닙 등; 티로신 키나제 억제제, 예컨대 이마티닙 또는 수니티닙 등; 항-혈관 내피 성장 인자 약물, 예컨대 소라페닙, 레고라페닙, 파조파닙, 재조합 인간 엔도스타틴, 아파티닙 등; 표적화 c-Met/ROS1 약물, 예컨대 크리조티닙 등; 및 다른 표적화제, 예컨대 비제한적으로 보리노스타트 및 마리마스타트 등; 표적화 mTOR 약물, 예컨대 에베롤리무스 등; 및 PI3Kα, PKB/AKT, 및 STAT3을 비롯하여 이로 제한되지 않는 다른 표적을 표적화하는 작용제가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 면역치료제에는 면역억제제 및 효능제, 및 면역요법과 연관된 세포 요법이 포함되나 이로 제한되지 않으며, 표적에는 PD-1/PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, IDO, TIM3, TIGIT, CD47, SIRPα, 4-1BB, CSF-1/CSF1R, GITR, OX40, CD40, CD27, CD28, B7H4, B7H3, TGFβ, BTLA, VISTA, ICOS, CD39, CD73, A2AR, KIR, 및 NKG2A 등이 포함된다.
일부 실시양태에서, PD-1/PD-L1을 표적화하는 면역 체크포인트 억제제에는 거대분자 약물 예컨대, 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 신틸리맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙 등; 및 소분자 약물이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, CTLA-4를 표적화하는 면역 체크포인트 억제제에는 이필리무맙 등이 포함되나 이로 제한되지 않고; 시토카인에는 IL-10, IL-15, IL4, 및 IL13 등이 포함되나 이로 제한되지 않고; BRAF를 표적화하는 억제제에는 비니메티닙 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 다른 치료제는 종양용해성 바이러스, 예컨대 파르보바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 알파바이러스, 마라바 바이러스, 레트로바이러스, 및 콕사키 바이러스 등으로부터 선택되고; 대안적으로, 다른 치료제는 암 백신 또는 프로테아제 억제제, 예컨대 보르테조밉 등으로부터 선택된다.
도면은 본 명세서에 개시된 신규한 특징을 추가로 설명한다. 본 명세서에 개시된 특징 및 이점은 도면을 참고하여 더 잘 이해될 것이지만, 이들 도면이 단지 본원에 개시된 원리의 구체적인 실시양태를 설명하는 것이며, 첨부된 청구항의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다.
도 1-5는 유세포 측정에 의해 측정되는 바와 같이 hCLDN18.2로 안정하게 형질전환된 HEK293 세포에 대한 본 개시내용의 18 가지 하이브리도마 세포주로부터의 상청액의 결합을 도시한다.
도 6-11은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포에 대한 본 개시내용의 18 가지 키메라 항체의 결합을 도시한다.
도 12-17은 hCLDN18.2를 천연적으로 발현하는 위암 종양 조직-유래된 세포에 대한 본 개시내용의 18 가지 키메라 항체의 결합을 도시한다.
도 18-23은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 18 가지 키메라 항체의 ADCC 결과를 도시한다.
도 24-29는 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 18 가지 키메라 항체의 CDC 결과를 도시한다.
도 30은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu299B2-S32A의 결합을 도시한다.
도 31은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu253C4-N31Q의 결합을 도시한다.
도 32는 hCLDN18.2를 천연적으로 발현하는 위암 종양 조직-유래된 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu299B2-S32A의 결합을 도시한다.
도 33은 hCLDN18.2를 천연적으로 발현하는 위암 종양 조직-유래된 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu253C4-N31Q의 결합을 도시한다.
도 34는 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu299B2-S32A의 ADCC 결과를 도시한다.
도 35는 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu253C4-N31Q의 ADCC 결과를 도시한다.
도 36은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu299B2-S32A의 CDC 결과를 도시한다.
도 37은 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 hu253C4-N31Q의 CDC 결과를 도시한다.
용어
본 명세서에 언급된 모든 공보, 특허, 및 특허 출원은 각각의 공보 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타낸 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.
본 개시내용을 이후 상세하게 기재하기 전에, 본 개시내용이 본원에 기재된 특정한 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않고, 이들이 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어가 단지 특정한 실시양태를 기재하기 위한 것이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 달리 명시되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시내용이 속하는 기술분야의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에 개시된 특정한 실시양태는 수치 범위를 포함하고, 본 개시내용의 특정한 측면은 범위의 관점에서 기재될 수 있다. 달리 나타내지 않는다면, 수치 범위 및 범위의 기재는 단지 간결함 및 편의를 위한 것이며, 본 개시내용의 범위를 엄격하게 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위 형식의 기재는 모든 가능한 하위 범위, 및 해당 범위 내의 모든 가능한 구체적인 수치가 본원에서 명시적으로 기재된 것과 같이, 이러한 하위 범위 및 수치를 구체적으로 개시하는 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6의 범위의 기재는 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등의 하위 범위, 뿐만 아니라 이들 범위 내의 구체적인 수치, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6을 구체적으로 개시하는 것으로 고려되어야 한다. 상기 원칙은 수치 값의 너비와 무관하게 동등하게 적용가능하다. 범위 기재가 이용되는 경우, 범위에는 범위의 종점이 포함된다.
용어 "약"이 양 및 기간과 같은 측정가능한 값을 지칭할 때, 이는 명시된 값의 ± 20%, 또는 일부 경우에 ± 10%, 또는 일부 경우에 ± 5%, 또는 일부 경우에 ± 1%, 또는 일부 경우에 ± 0.1%를 포함하는 변화를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이 아미노산 3-문자 암호 및 1-문자 암호는 [J. Biol. Chem, 243, p3558(1968)]에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항-클라우딘18.2의 항체", "항-CLDN18.2 항체", 또는 "CLDN18.2에 대한 항체"는 항체가 CLDN18.2를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있도록 충분한 친화도로 CLDN18.2 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 이러한 항체를 지칭한다. 인간-유래된 CLDN18.2 단백질은 hCLDN18.2로 지칭되며, 따라서, "항-인간 클라우딘18.2의 항체", "항-인간 클라우딘18.2 항체", "항-hCLDN18.2의 항체", "항-hCLDN18.2 항체", "hCLDN18.2에 대한 항체"는 특히 항체가 인간 CLDN18.2를 표적화하는 진단제 및/또는 치료제로서 사용될 수 있도록 충분한 친화도로 인간 CLDN18.2 단백질 또는 그의 단편에 결합할 수 있는 이러한 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 전형적으로 공유적인 디술피드 결합 및 비-공유적인 상호작용에 의해 함께 유지되는 2개의 폴리펩티드 중쇄 (H) 및 2개의 폴리펩티드 경쇄 (L)를 포함하는 Y-유형 사량체성 단백질을 지칭한다. 천연 IgG 항체는 이러한 구조를 갖는다. 각각의 경쇄는 1개의 가변 도메인 (VL) 및 1개의 불변 도메인 (CL)으로 구성된다. 각각의 중쇄는 1개의 가변 도메인 (VH) 및 불변 영역을 포함한다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 중쇄 불변 도메인은 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류될 수 있고, 이는 각각 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM으로서 항체의 이소타입을 정의하며, IgG 및 IgA는 상이한 하위 부류로 추가로 분류될 수 있고, IgG는 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4로 세분될 수 있고, IgA는 IgA1 및 IgA2로 세분될 수 있다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 그들의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로 하여 κ 및 λ로 불리는 2가지 별개의 유형 중 하나로 지정될 수 있다.
IgG, IgA, 및 IgD에서, 불변 영역은 CH1, CH2, CH3으로 불리는 3개의 도메인을 포함한다 (IgM 및 IgE는 CH4로 불리는 네번째 도메인을 가짐). IgG, IgA, 및 IgD에서, CH1 및 CH2 도메인은 가변 길이의 프롤린-풍부 및 시스테인-풍부 절편인 가요성 힌지 영역에 의해 분리된다. 각각의 항체 유형은 쌍을 형성한 시스테인 잔기에 의해 형성되는 쇄간 및 쇄내 디술피드 결합을 추가로 포함한다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체마다 아미노산 조성에서의 유의한 변화를 나타내고, 주로 항원 인식 및 결합을 담당한다. 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 온전한 IgG 항체가 2개의 결합 부위를 갖도록 (즉, 2가) 항체 결합 부위를 형성한다. 중쇄 (VH)의 가변 영역 및 경쇄 (VL)의 가변 영역 각각은 초가변 영역 (HVR) 또는 더욱 일반적으로 상보성-결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 극도로 가변성인 3개의 영역을 포함하며, VH 및 VL 각각은 각각 FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 표시되는 4개의 프레임워크 영역 (FR)을 갖는다. 따라서, CDR 및 FR 서열은 전형적으로 중쇄 (VH)의 가변 영역 (또는 경쇄 (VL)의 가변 영역)에서 하기 순서로 발생한다: FR1-HCDR1(LCDR1)-FR2-HCDR2(LCDR2)-FR3-HCDR3 (LCDR3)-FR4.
용어 "Fc"는 불변 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 본원에서 사용된다. 이 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5thEd.Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 지수로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템을 따른다.
본원에서 사용된 바와 같이, 넓은 의미에서 "항체"의 유형에는 예를 들어, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라 항체, 인간화 및 영장류화 항체, CDR-그래프팅된 항체, 인간 항체 (예컨대, 재조합에 의해 생성된 인간 항체), 재조합에 의해 생성된 항체, 세포내 항체, 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 1가 항체, 다가 항체, 항-이디오타입 항체, 합성 항체 (예컨대, 뮤테인 및 의 변이체) 등이 포함될 수 있다.
용어 "전장 항체" 및 "온전한 항체"는 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 Fc 영역을 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "모노클로날 항체" (또는 "mAb")는 특정한 항원성 에피토프에 대해서만 지시되는 단일 세포 클론에 의해 생성된 실질적으로 균질한 항체를 지칭한다. 모노클로날 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 하이브리도마 기술, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 트랜스제닉 동물, 합성 기술, 또는 이들의 조합을 이용하여 제조될 수 있다.
용어 "키메라 항체"는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터의 또는 특정한 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분이 또 다른 종으로부터의 또는 또 다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체에서 상응하는 서열, 및 이러한 항체의 단편에서 상응하는 서열과 동일하거나 또는 상동성인 구축물이다. 좁은 의미에서, 키메라 항체는 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역에 작동가능하게 연결된 모든 또는 대부분의 선택된 뮤린 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 불변 영역 서열, 또는 그의 변이체 또는 유도체를 개시된 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 작동가능하게 회합시켜, 그 자체로 사용될 수 있거나 또는 본 개시내용에 포함될 수 있는 전장 항-CLDN18.2 항체를 제공할 수 있다.
용어 "인간화 항체"는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 가장 작은 서열을 함유하는 혼성체 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 그의 단편이다. 대부분의 경우에, 인간화 항체는 수용자의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화도, 및 성질을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 영장류의 CDR로부터의 잔기로 대체된 것인 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 면역글로불린의 프레임워크 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 일부 경우에, "역 돌연변이"는 수용자 인간 항체의 가변 영역의 1개 이상의 FR에서의 잔기가 비-인간 종 공여자 항체로부터의 상응하는 잔기로 대체된 것인 인간화 항체에 도입될 수 있다. 이러한 역 돌연변이는 1개 이상의 그래프팅된 CDR의 적절한 3차원 배치를 유지하는데 도움이 되어, 친화도 및 항체 안정성을 개선시킬 수 있다. 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-인간 영장류를 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 공여자 종으로부터의 항체가 사용될 수 있다. 또한, 인간화 항체는 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 새로운 잔기를 함유할 수 있다.
본 개시내용의 모노클로날 항체의 가변 영역에서 CDR 및 FR의 분할이 카바트(Kabat) 정의에 따라 결정된다는 것을 주목한다. 그러나, 다른 명명 및 넘버링 시스템, 예컨대 코티아(Chothia), IMGT, 또는 AHo 또한 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있다. 따라서, 본 개시내용의 모노클로날 항체 서열을 기반으로 하여 임의의 명명 시스템으로부터 유래된 1개 이상의 CDR을 포함하는 인간화 항체는 명백히 본 개시내용의 범위 내에서 유지된다.
용어 "서열 동일성" 또는 "서열 유사성" 또는 "서열 상동성"은 최대 % 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬시킨 후에 (필요에 따라 갭을 도입시킴) 기준 폴리펩티드 서열에서 동일한 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율을 지칭하며, 임의의 보존적인 치환은 서열 동일성의 일부로 고려되지 않는다. 서열 정렬은 % 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위해 관련 기술분야의 다양한 접근법을 이용하여, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, 또는 MEGALIGN (DNASTAR) 소프트웨어를 이용하여 수행될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 측정 정렬에 대한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
용어 "항체 단편"은 온전한 항체의 적어도 일부분을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항체 분자의 "단편"은 항체의 "항원-결합 단편"을 포함하며, 용어 "항원-결합 단편"은 선택된 항원 또는 그의 항원성 에피토프에 특이적으로 결합하거나 또는 그와 반응하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편, 또는 상기 단편으로부터 추가로 유래된 융합 단백질 생성물, 예를 들어 단일-쇄 항체, 키메라 항원 수용체에서의 세포외 결합 영역 등을 지칭한다. 예시적인 항체 단편 또는 그의 항원-결합 단편에는 경쇄 가변 단편 (VL), 중쇄 가변 단편 (VH), Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체, 선형 항체, 단일-쇄 항체 (scFv), 및 항체 단편으로부터 형성된 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "Fab 단편"은 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역을 포함하고, 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 제1 불변 영역 CH1 또한 포함하며, 이는 1가 항체 단편이다. 용어 "F(ab')2 단편"은 2개의 Fab 단편 뿐만 아니라 힌지 영역을 포함하며, 이는 2가 항체 단편이다.
용어 "Fd 단편"은 일반적으로 중쇄 가변 영역 및 불변 영역 CH1을 포함하고; 용어 "Fv 단편"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역을 갖지만 불변 영역은 갖지 않으며, 모든 항원-결합 부위를 보유하는 가장 작은 항체 단편이다.
용어 "scFv"는 경쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편 및 중쇄의 가변 영역을 포함하는 적어도 1개의 항체 단편을 포함하는 융합 단백질을 지칭하며, 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은 연결되고 (예를 들어, 합성 링커, 예컨대 짧은 가요성 폴리펩티드 링커를 통해), 단일-쇄 폴리펩티드로 표현될 수 있으며, scFv는 그가 유래된 온전한 항체의 특이성을 보유한다. 달리 명시되지 않는다면, scFv는 (예를 들어, 폴리펩티드의 N-말단 및 C-말단에 대해) 임의의 순서로 기재된 VL 및 VH 가변 영역을 가질 수 있고, scFv는 VL-링커-VH를 포함할 수 있거나 또는 VH-링커-VL을 포함할 수 있다.
용어 "다중특이적 항체"는 2개 초과의 상이한 부위 및/또는 표적에 결합하는 신규한 항체 구축물에 관한 것이며, 이는 항체를 하나 이상의 다른 결합 분자에 기능적으로 연결하여 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유적인 결합, 또는 다른 방법) 형성된다. 더욱 일반적인 다중특이적 항체는 "이중특이적 항체"이며, 이는 구체적으로 2개의 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 항체 구축물을 지칭한다. 전형적으로, 이중특이적 또는 다중특이적 항체는 적어도 2개의 항원-결합 도메인을 포함한다.
용어 "항원"은 항체 또는 항체-결합 단편에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 물질을 지칭하고, 광범위하게 항원은 단일 에피토프, 다중-에피토프, 단일 도메인, 다중 도메인, 또는 전체 세포외 도메인 (ECD) 또는 단백질을 비롯하여 선택된 표적의 임의의 면역원성 단편 또는 결정소를 포함할 수 있다. 펩티드, 단백질, 당단백질, 다당류 및 지질, 이들의 일부분, 및 이들의 조합물은 항원을 구성할 수 있다. 비제한적인 예시적인 항원에는 종양 항원 또는 병원체 항원 등이 포함된다. "항원"은 또한 면역 반응을 촉발시키는 분자를 지칭할 수 있다. 임의의 형태의 항원, 또는 항원을 함유하는 세포 또는 제제를 이용하여 항원성 결정소에 대해 특이적인 항체를 생성할 수 있다. 항원은 단리된 전장 단백질, 세포 표면 단백질 (예를 들어, 그의 표면 상에서 항원의 적어도 일부분을 발현하는 세포에 의해 면역화됨), 또는 가용성 단백질 (예를 들어, 단백질의 ECD 부분에 의해서만 면역화됨), 또는 단백질 구축물 (예를 들어, Fc 항원)일 수 있다. 항원은 유전자 변형된 세포에서 생성될 수 있다. 임의의 상기 항원을 단독으로 또는 관련 기술분야에 공지된 하나 이상의 면역원성-증강 아주반트와 조합하여 사용할 수 있다. 항원을 코딩하는 DNA는 게놈 또는 비-게놈 (예를 들어, cDNA)일 수 있고, 면역원성 반응을 촉발시키는데 충분한 ECD의 적어도 일부분을 코딩할 수 있다. 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 플라스미드, 및 비-바이러스 벡터, 예컨대 양이온성 지질을 비롯하여 이로 제한되지 않는 임의의 벡터를 사용하여, 항원이 발현되는 세포를 형질전환시킬 수 있다.
용어 "에피토프"는 면역글로불린 또는 항체에 특이적으로 결합하는 항원의 부위를 지칭한다. 에피토프는 연속 아미노산으로부터 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치된 비연속 아미노산으로부터 형성될 수 있다. 연속 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출시 유지되는 반면에, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 변성 용매로 처리시 전형적으로 상실된다. 에피토프는 전형적으로 고유의 공간 형태에서 적어도 3-15개의 아미노산을 포함한다. 면역블롯팅 및 면역침전 검출 검정을 비롯하여 주어진 항체가 결합하는 에피토프를 결정하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 에피토프의 공간 형태를 결정하는 방법에는 본원에 기재된 관련 기술분야의 기술, 예컨대 X-선 결정학, 2차원 핵 자기 공명 등이 포함된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형, 환형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산, 특히 보존적으로 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이는 비-아미노산에 의해 개재될 수 있다. 상기 용어는 또한 변형된 아미노산 중합체, 예컨대 황산화, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 아이오딘화, 메틸화, 산화, 단백질 분해 가공, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 전달 RNA (tRNA)-매개된 아미노 부가, 예컨대 아르기닐화, 유비퀴틴화, 또는 임의의 다른 작업, 예컨대 표지화 성분에 대한 부착에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 천연 및/또는 비-천연 또는 합성 아미노산, 예컨대 글리신 및 D 또는 L 광학 이성질체, 뿐만 아니라 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체를 지칭한다. 주어진 단백질"로부터 유래된" 폴리펩티드 또는 아미노산 서열은 폴리펩티드의 공급원을 지칭한다. 상기 용어는 또한 명시된 핵산 서열로부터 발현된 폴리펩티드를 포함한다.
용어 "아미노산 변형" (또는 "변형된 아미노산")에는 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실이 포함된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모 폴리펩티드 서열의 특정한 위치의 아미노산을 또 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 치환 S32A는 위치 32의 세린이 알라닌으로 대체된 것을 의미한다.
인간 수용체 가변 영역에 대한 인간화 항체 가변 영역의 서열 동일성 또는 상동성은 본원에서 논의된 바와 같이 결정될 수 있으며, 이러한 방식으로 측정되는 경우, 이들 둘은 바람직하게는 적어도 60% 또는 65% 서열 동일성, 더 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 93%, 95%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 공유할 것이다. 바람직하게는, 동일하지 않은 잔기 위치는 보존적인 아미노산 치환에 의해 상이하다. "보존적인 치환"은 한 아미노산 잔기가 유사한 화학적 성질 (예를 들어, 전하 또는 소수성)을 갖는 측쇄 (R 기)를 가진 또 다른 아미노산 잔기로 대체되는 것인 아미노산 치환이다. 일반적으로, 보존적인 아미노산 치환은 단백질의 기능적 성질을 실질적으로 변경시키지 않는다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 패밀리는 관련 기술분야에 정의되어 있다. 이들 패밀리에는 염기성 측쇄 (예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은 극성 측쇄 (예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비-극성 측쇄 (예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), β 분지된 측쇄 (예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신), 및 방향족 측쇄 (예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 함유하는 아미노산이 포함된다. 따라서, 본 개시내용의 항체의 CDR 영역 또는 프레임워크 영역에서 1개 이상의 아미노산 잔기는 다른 유사한 측쇄의 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적인 치환에 의해 서로 상이한 경우, % 서열 동일성 또는 유사성 정도는 치환의 보존적인 성질을 보정하기 위해 상향 조정될 수 있다.
모노클로날 항체의 생성에서, 다양한 번역후 변형 (PTM) 변이체, 예컨대 글리코실화, 산화, 당화, 탈아미드화, 이성질체화, 및 말단기 고리화는 상이한 물리적 및 화학적 인자에 의해 용이하게 생성된다. 이들 PTM은 항체의 물리적 및 화학적 성질에서 변화를 유발하고, 항체의 Fc 수용체와의 상호작용을 변경시키고, 표적 항원과의 결합 활성에 영향을 미칠 수 있으며; 일부 PTM의 발생은 심지어 항체 안정성을 감소시키고, 면역원성 등을 유발할 수 있다 (JARASCH et al., JOURNAL OF PHARMACEUTICAL SCIENCES, 2015). 부정적인 효과는 PTM 부위에 대한 아미노산 변형, 예컨대 보존적인 치환에 의해 제거될 수 있다. PTM을 변형시키기 위한 항체 CDR에 대한 아미노산 치환 또한 명백히 본 개시내용의 범위 내에 유지된다.
용어 "항체-의존적인 세포-매개된 세포독성" (ADCC)은 바이러스-감염된 세포 또는 종양 세포의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭하며, Fc 단편은 킬러 세포를 매개하여 표적 세포를 직접 사멸시키기 위해 킬러 세포 (NK 세포, 및 대식세포 등) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합한다.
용어 "보체-의존적인 세포독성" (CDC)은 보체 존재하의 세포독성 효과, 즉, 상응하는 막 표면 항원에 대해 특이적인 항체의 결합에 의해 형성된 복합체에 의해 개시되는 고전적인 보체 경로의 활성화에 의해 형성된 막 공격 복합체에 의한 표적 세포의 용해를 지칭한다.
본 개시내용의 항체는 또한 변경된 약동학, 증가된 혈청 반감기, 증가된 결합 친화도, 감소된 면역원성, 증가된 수율, Fc 수용체 (FcR)에 대한 변경된 Fc 리간드 결합, 증가된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC, 변경된 글리코실화 및/또는 디술피드 결합, 및 변형된 결합 특이성을 비롯하여 이로 제한되지 않는 바람직한 특징을 갖는 화합물을 생성하는 아미노산 잔기 치환, 돌연변이, 및/또는 변형을 비롯하여 이로 제한되지 않는 불변 영역 (예를 들어, Fc)의 치환 또는 변형을 포함할 수 있다.
용어 "친화도" 또는 "결합 친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 모든 비-공유적인 상호작용의 합계의 강도를 지칭한다. 용어 "KD"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 지칭한다. 결합 친화도는 관련 기술분야에 공지된 다양한 기술, 예컨대 표면 플라즈몬 공명, 바이오레이어 간섭계, 이중-편광 간섭계, 정적 광 산란, 동적 광 산란, 등온 적정 열량계, ELISA, 분석용 초원심분리, 및 유세포 측정 등을 이용하여 결정될 수 있다.
용어 "경쟁적인 결합" 또는 "경쟁적인 항체"는 일반적으로 본 개시내용의 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 지칭하며, 상기 결합은 에피토프에 대한 본 개시내용의 항체의 결합이 억제되거나 또는 차단되게 하고, 경쟁적인 억제 정도는 경쟁 검정에서 수득할 수 있다.
용어 "제약 조성물"은 그에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 하는 형태로 존재하고, 제형이 투여되는 대상체에 대해 허용 불가능한 독성을 갖는 추가의 성분을 함유하지 않는 제형을 지칭한다.
용어 "제약학적 담체" 또는 "제약상 허용가능한 담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 아주반트 (예를 들어, 프로인트(Freund) 아주반트 (완전 및 불완전)), 부형제 또는 비히클을 지칭한다.
용어 "유효량"은 환자에게 단일 또는 다중 용량으로 투여될 때 치료되는 환자에서 원하는 효과를 생성하는 본 개시내용의 항체 또는 단편의 제약학적 제형의 용량을 지칭한다. 유효량은 하기 인자를 고려하여 관련 기술분야의 기술자로서 의사에 의해 용이하게 결정될 수 있다: 예를 들어, 인간 종의 차이; 체중, 연령, 및 건강; 관련된 구체적인 질환; 질환의 중증도; 개별 환자의 반응; 투여되는 구체적인 항체; 투여 방식; 투여된 제형의 생체이용률 특징; 선택된 투여 레지멘; 및 임의의 병용 요법의 사용.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환적으로 사용되고, 외인성 핵산이 도입되는 세포, 예컨대 이러한 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되며, 여기에는 일차적으로 형질전환된 세포, 및 계대와 횟수와 무관하게 그로부터 유래된 자손이 포함된다. 자손은 모 세포와 핵산 함량이 정확하게 동일하지 않지만, 돌연변이를 함유할 수 있다. 초기에 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이성 자손이 본원에 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "형질감염"은 진핵생물 세포에 외인성 핵산의 도입을 지칭한다. 형질감염은 인산칼슘-DNA 공침, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 폴리브렌-매개된 형질감염, 전기천공, 미량주사, 리포솜 융합, 지질 형질감염, 원형질체 융합, 레트로바이러스 감염, 및 유전자총법을 비롯하여 관련 기술분야에 공지된 다양한 수단을 이용하여 달성될 수 있다.
용어 "안정한 형질감염" 또는 "ST"는 형질감염된 세포의 게놈에 외인성 핵산, DNA, 또는 RNA의 도입 및 통합을 지칭한다. 용어 "안정한 형질감염체"는 게놈 DNA에 외래 DNA를 안정하게 통합시킨 세포를 지칭한다.
용어 "코딩 핵산 분자", "코딩 DNA 서열" 및 "코딩 DNA"는 데옥시리보핵산의 가닥을 따라 데옥시리보뉴클레오티드의 순서를 지칭한다. 이들 데옥시리보뉴클레오티드의 순서는 폴리펩티드 (단백질) 쇄를 따라 아미노산의 순서를 결정한다. 따라서, 핵산 서열은 아미노산 서열을 코딩한다.
항체 및 항원-결합 단편을 생성하고 정제하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 [Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory]의 챕터 5-8 및 15에서 확인할 수 있다. 본 개시내용의 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 비-인간 기원의 CDR 영역에 하나 이상의 인간 FR 영역을 부가하도록 유전자 조작된다. 인간 FR 생식계열 서열은 이뮤노제네틱스(ImMunoGeneTics) (IMGT)의 웹사이트 http://imgt.cines.fr, 또는 [J. Immunoglobulin, (2001) ISBN: 012441351]로부터 입수할 수 있다.
본 개시내용의 조작된 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 통상적인 방법에 의해 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA 서열은 클로닝되고, 발현 벡터로 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포를 안정하게 형질감염시킬 수 있다. 더욱 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단에서 항체를 글리코실화시킬 수 있다. 안정한 클론은 인간 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시킴으로써 수득된다. 양성 클론은 항체를 생성하기 위해 생물반응기에서 무혈청 배지에서 확장 배양된다. 통상적인 기술을 이용하여 항체-분비 배지를 정제하고 수집할 수 있다. 통상적인 방법을 이용하여 여과에 의해 항체를 농축시킬 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체 또한 통상적인 방법, 예컨대 분자 체, 이온 교환 등에 의해 제거될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "개체" 또는 "대상체"는 임의의 동물, 예컨대 포유동물 또는 주머니 동물을 지칭한다. 본 개시내용의 개체에는 인간, 비-인간 영장류 (예를 들어, 시노몰구스 또는 레수스 원숭이 또는 다른 유형의 마카크), 마우스, 돼지, 말, 당나귀, 소, 양, 래트, 및 임의의 종류의 가금류가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "항체-약물 접합체" (ADC)는 치료 활성 물질 또는 활성 약물 성분 (API)이 항체의 결합 표적에 표적화되어 그의 약리학적 기능을 나타낼 수 있도록 치료 활성 물질 또는 활성 약물 성분 (API)에 공유적으로 커플링된 항체를 지칭한다. 치료 활성 물질 또는 활성 제약 성분은 ADC-표적화된 세포, 바람직하게는 악성 또는 암성 세포를 사멸시킬 수 있는 세포독소일 수 있다. 치료 활성 물질, 활성 제약 성분, 또는 세포독소의 공유적인 부착은 페이로드를 리신 또는 시스테인 잔기에 커플링시키는 표준 화학적 링커를 이용하여 비-부위-특이적인 방식으로 수행될 수 있거나, 또는 바람직하게는 접합은 생성된 ADC의 접합 부위 및 약물 대 항체 비의 완전한 제어를 가능하게 하는 부위-특이적인 방식으로 수행된다.
용어 "키메라 항원 수용체" (CAR)는 임의의 특이성을 면역 이펙터 세포에 이식하는 조작된 수용체이다. 전형적으로, 이들 수용자를 이용하여 모노클로날 항체의 특이성을 T 세포에 이식하고; 그들의 코딩 서열의 전달은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 또는 트랜스포손에 의해 용이해진다. CAR-조작된 T 세포 (CAR-T 세포로도 약칭됨)는 키메라 수용체를 보유하는 유전자 조작된 T 세포이며, 그의 세포외 인식 단위는 항체-유래된 인식 도메인을 포함하고, 그의 세포내 영역은 림프구 자극 모이어티로부터 유래된다. 프로토타입 CAR의 구조는 모듈식이고, 다양한 기능적 도메인을 수용하도록 설계되어, 특이성의 선택 및 T 세포 활성화의 제어를 가능하게 한다. 바람직한 항체-유래된 인식 단위는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 특이성 및 결합 잔기를 조합하는 단일-쇄 가변 단편 (scFv)이다. 가장 일반적인 림프구 활성화 모이어티는 T-세포 촉발 (예를 들어, CD3ζ) 모이어티와 함께 T-세포 공동자극 (예를 들어, CD28) 도메인을 포함한다. 이펙터 림프구 (예를 들어, T 세포 및 천연 킬러 세포)를 이러한 키메라 수용체로 무장시킴으로써, 조작된 세포를 비-HLA-제한된 방식으로 임의의 원하는 표적 항원에 대한 미리 정의된 특이성으로 재지정시킨다. CAR 구축물은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스 벡터 또는 트랜스포손을 이용하여 주어진 환자의 말초 림프구로부터의 T 세포에 생체외에서 도입된다. 생성된 CAR-조작된 T 세포를 환자에게 다시 주입한 후, 이들은 이동하여 그들의 표적 부위에 도달하고, 그들의 표적 세포 또는 조직과 상호작용시에, 이들은 활성화되어 그들의 미리 정의된 이펙터 기능을 수행한다. CAR 접근법에 대한 치료 표적에는 암 및 HIV-감염된 세포, 또는 자가면역 이펙터 세포가 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "종양"은 세포 또는 조직의 병리학적 증식, 및 다른 조직 또는 장기로 후속적인 이동 또는 침윤을 특징으로 하는 질환을 지칭한다. 종양의 성장은 일반적으로 제어되지 않고, 진행성이며, 정상 세포 증식을 유도하지 않거나 또는 억제한다. 종양은 방광, 골, 뇌, 유방, 연골, 신경교 세포, 식도, 나팔관, 담낭, 심장, 장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기도, 요도, 요관, 요도, 자궁, 질 장기, 또는 조직 또는 상응하는 세포를 비롯하여 이로 제한되지 않는 다양한 세포, 조직 또는 장기에 영향을 미칠 수 있다. 종양에는 암, 예컨대 육종, 암종, 또는 형질세포종 (형질 세포의 악성 종양)이 포함된다. 본 개시내용에 따른 종양에는 백혈병 (예를 들어 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 전골수구성 백혈병, 급성 골수-단핵구성 백혈병, 급성 단핵구성 백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 진성 다혈구증), 림프종 (호지킨(Hodgkin) 질환, 비-호지킨 질환), 원발성 마크로글로불린혈증, 중쇄 질환, 고형 종양, 예컨대 육종 및 암 (예를 들어 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 척삭종, 내피 육종, 림프관육종, 혈관육종, 림프관내피모세포종, 중피종, 유잉(Ewing) 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장암, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선암종, 피지선암종, 유두상 암종, 유두상 선암종, 기관지 암종, 골수암, 신세포 암종, 간암, 나일관 암종, 융모암종, 정상피종, 배아암, 신장모세포종, 자궁경부암, 자궁암, 고환암, 폐암, 소세포 폐암, 방광암, 상피암, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 슈반세포종, 수막종, 흑색종, 신경모세포종, 망막모세포종), 식도암, 담낭암, 신장암, 다발성 골수종이 포함될 수 있으나 이로 제한되지 않는다. 바람직하게는, "종양"에는 췌장암, 간암, 폐암, 위암, 식도암, 두경부 편평상피 세포 암종, 전립선암, 결장암, 유방암, 림프종, 담낭암, 신장암, 백혈병, 다발성 골수종, 난소암, 자궁경부암, 및 신경교종이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "질환" 또는 "상태" 또는 "장애" 등은 세포, 조직, 또는 장기의 정상 기능을 손상시키거나 또는 방해하는 임의의 변경 또는 장애를 지칭한다. 예를 들어, "질환"에는 종양, 병원체 감염, 자가면역 질환, T-세포 기능장애, 또는 면역 관용 결핍 (예를 들어, 이식 거부)이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 예방적으로 또는 임상적으로 병리학적으로 개체 또는 치료된 세포에 의해 유발된 질환을 변경시키려는 시도에서 임상적 개입을 지칭한다. 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 완화, 임의의 질환의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 예방, 질환 진행 속도의 늦춤, 상태의 개선 또는 관해, 예후의 관해 또는 개선 등이 포함되나 이로 제한되지 않는다.
용어 "약물 박스" 또는 "키트"는 본 개시내용의 제약 조성물의 1개 이상의 단위 투여 형태의 유효량을 포함한다. 일부 실시양태에서, 약물 박스는 멸균 용기를 포함하며; 이러한 용기는 박스, 앰풀, 보틀, 바이알, 튜브, 백, 블리스터 팩, 또는 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 용기의 형태를 가질 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이, 금속 호일, 또는 의약을 담기에 적합한 다른 물질로 제조될 수 있다. 또한, 약물 박스는 본 개시내용의 제약 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지침서도 포함한다. 지침서는 일반적으로 질환을 치료하기 위해 본 개시내용의 제약 조성물을 사용하는 방법을 포함한다.
실시예
본 개시내용은 구체적인 예시와 관련하여 하기에 상세하게 기재될 것이다. 이들 실시예가 단지 본 개시내용을 설명하기 위해 사용되며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음을 이해해야 한다. 구체적인 조건이 명시되지 않은 하기 실시예에서 실험 방법은 일반적으로 통상적인 조건, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual(Third Edition) by J. Sambrook et al., Science Press, 2002]에 따라 또는 제조자에 의해 권장되는 조건에 따라 수행된다.
실시예 1 동물 면역화
항-CLDN18.2 항체를 생성하기 위해, 표준 생물학적 프로토콜을 이용하여 검정 절차를 수행하였다. 상이한 계통의 총 15 마리의 마우스를 면역원으로서 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 CHO-K1 세포 (CHO-K1/hCLDN18.2) 및 hCLDN18.2를 코딩하는 DNA 벡터로 면역화시켰다.
면역화의 후기 단계에서, 안각 정맥으로부터 혈액을 수집하여 혈장 샘플을 수득하고, 면역 혈청의 역가를 ELISA 및 FACS에 의해 검출하여 동물의 면역 반응을 결정하였다. 4회 면역화시킨 후, 6 마리의 마우스를 안락사를 위해 선택하여, 하이브리도마 세포를 제조하였다.
실시예 2 항-CLDN18.2 모노클로날 항체에 대한 하이브리도마 세포의 생성
항-CLDN18.2 모노클로날 항체에 대한 하이브리도마 세포를 생성하기 위해, 6 마리의 마우스를 이산화탄소로 안락사시키고, 시린지에 의해 피더 세포를 별도로 수확하고, 피더 세포 현탁액을 준비된 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 특정한 개수의 골수종 세포 및 비장 세포를 세포 융합을 위해 비례적으로 혼합하였다. HAT 배지 (1 mL 100 x HT 보충제 + 1 mL 아미노프테린 + 10 mL FBS + 88 mL DMEM)를 융합된 세포에 첨가하고, 잘 혼합하여, 세포 현탁액을 제조하였다. 이어서, 세포 현탁액을 배양 접시에 붓고, 잘 혼합하고, 다중채널 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 96-웰 피더 플레이트에 플레이팅하였다. 융합된 피더 세포 플레이트를 인큐베이터에 넣고, 37℃의 일정한 온도, 5.5% CO2에서 7-10 일 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 항-CLDN18.2 양성 클론을 ELISA 및 FACS에 의해 스크리닝하였다. 스크리닝한 양성 클론을 제한 희석 검정에 의해 서브클로닝하여, 안정한 단일 하이브리도마 세포를 수득하였다. hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 (HEK293-hCLDN18.2)를 사용하여 FACS에 의해 서브클로닝 세포 상청액을 스크리닝하였다. 명세서의 도 1-5에 도시된 바와 같이, hCLDN18.2에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하기 위해 18 가지 하이브리도마 세포주를 최종적으로 수득하였다.
스크리닝에 의해 수득된 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 배양하고, 통상적인 생물학적 방법에 의해 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 프라임스크립트(PrimeScript)TM 1st 가닥 cDNA 합성 키트 (다카라(TAKARA))를 사용하여 역전사를 통해 총 RNA 주형으로부터 cDNA를 합성하였다. 이어서, cDNA는 항체 불변 영역 프라이머를 사용하는 증폭에서 주형으로서 사용되었다. PCR 생성물을 아가로스 겔 전기영동에 의해 분리한 후, DNA 단편을 정제하고, 회수하고, 본 개시내용의 18 가지 모노클로날 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 시퀀싱에 의해 수득하였고, 결과를 표 1에 나타내었다:
표 1 18 가지 모노클로날 항체의 가변 영역의 아미노산 서열
Figure pct00001
상기 아미노산 서열을 기반으로 하여, 항체의 가변 영역의 CDR 및 FR을 카바트 넘버링 규칙을 이용하여 분할하고, 각각의 항체의 6개의 CDR 서열의 조성을 하기 표 2에 나타내었으며, 표 2에서 괄호 안의 숫자는 서열 번호를 나타내고, 예를 들어 (37)은 서열식별번호: 37을 나타낸다.
표 2 18 가지 모노클로날 항체의 CDR
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 3 항-CLDN18.2 키메라 항체의 구축 및 진핵생물 세포에서 그의 일시적인 형질감염 발현
본 개시내용의 시퀀싱된 모노클로날 항체 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 스플라이싱한 후에 생성된 표적 유전자 단편을 pcDNA3.4 발현 벡터에 클로닝하여, 형질감염-등급 발현 플라스미드를 제조하였다. Expi293FTM 세포 (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 무혈청 배지에서 배양하고, 진탕 플라스크 (코닝 인크.(Corning Inc.))에서 시딩하고, 진탕 테이블 상에서 37℃, 8% CO2의 환경에서 배양하였다. 세포 밀도를 조정하고, 표적 유전자 단편을 함유하는 재조합 발현 벡터 및 엑스피펙타민(ExpiFectamine)™ 293 형질감염 시약을 적절한 비율로 혼합하고, 세포 배양 진탕 플라스크에 첨가하고, 16-18 시간 동안 형질감염시킨 후에, 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 1 및 엑스피펙타민™ 293 형질감염 인핸서 2를 첨가하고, 세포 배양 6 일 후에 상청액을 수집하고 정제하고, 최종적으로 정제된 키메라 항체를 SDS-PAGE 순도 분석 및 A280 농도 결정에 적용하였다. 원래의 하이브리도마 클론을 기반으로 하여 접두사 ch-가 추가되는 방식으로 키메라 항체를 명명하였다.
실시예 4 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합 검정
A. hCLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합
FACS를 이용하여 hCLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 (HEK293-hCLDN18.2) 및 hCLDN18.2를 천연적으로 발현하는 위암 종양 조직-유래된 세포 (PDX-hCLDN18.2)에 대한 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합을 검출하였다.
HEK293-hCLDN18.2 또는 PDX-hCLDN18.2 세포를 수확하고, PBS에 재현탁시켜, 세포 농도를 조정하고, 구배 희석된 항체를 첨가하였으며, 무관한 인간 IgG는 음성 대조군이고, 특허 CN103509110B로부터의 키메라 항체 ch-175D10은 양성 대조군 (기준 항체)이다. 4℃ 진탕 테이블에서 50 min-1 h 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척하고, 형광 표지된 항-인간 IgG 이차 항체를 100 μL/웰로 첨가하고; 4℃ 진탕 테이블에서 40 min-1 h 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척한 다음, 제조된 샘플을 유세포 측정기 상에서 검출하고; 각각의 농도에 대한 평균 형광 강도 (이후 MFI로 지칭됨)를 소프트웨어에 의해 계산한 다음, 절반 결합 농도 (이후 EC50으로 지칭됨) 및 평균 최대 형광 강도 (최고 MFI)를 그래프패드(GraphPad) 소프트웨어에 의해 계산하고, 결과를 표 3에 나타내었다.
표 3 hCLDN18.2에 대한 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합
Figure pct00004
표 3 및 도 6-17은 각각 HEK293-hCLDN18.2 세포 및 PDX-hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 친화도 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음을 나타내었다: HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체의 결합은 5586-12203의 평균 최대 형광 강도를 나타낸 반면에, 동일한 반응 조건하에 HEK293-hCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 단지 5451의 평균 최대 형광 강도를 나타내었다. PDX-hCLDN18.2에 대한 키메라 항체의 결합은 7616-19876의 평균 최대 형광 강도, 4.554-96.23 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타낸 반면에, 동일한 반응 조건하에 PDX-hCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 단지 7160의 평균 최대 형광 강도 및 단지 63.85 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었다. 따라서, hCLDN18.2 항원에 대한 본 개시내용의 대부분의 키메라 항체의 결합은 ch-175D10에 비해 더 강력하였다.
B. 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합 선택성
FACS를 이용하여 뮤린 CLDN18.2를 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 (HEK293-mCLDN18.2) 및 인간 CLDN18.1을 발현하는 안정하게 형질감염된 HEK293 세포 (HEK293-hCLDN18.1)에 대한 본 개시내용의 키메라 항체의 결합을 검출하였다.
HEK293-mCLDN18.2 및 HEK293-hCLDN18.1 세포를 별도로 수확하고, PBS에 재현탁시켜, 세포 농도를 조정하고, 구배 희석된 키메라 항체를 첨가하였으며, 무관한 인간 IgG는 음성 대조군으로 사용되고, ch-175D10은 여전히 양성 대조군 (기준 항체)으로 사용되었다. 4℃ 진탕 테이블에서 50 분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척하고, 형광 표지된 항-인간 IgG 이차 항체를 100 μL/웰로 첨가하고; 4℃ 진탕 테이블에서 40 분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척한 다음, 제조된 샘플을 유세포 측정기 상에서 검출하고; 절반 결합 농도 (EC50) 및 평균 최대 형광 강도 (최고 MFI)를 그래프패드 소프트웨어에 의해 계산하고, 결과를 표 4에 나타내었다.
표 4 각각 mCLDN18.2 및 hCLDN18.1에 대한 항-CLDN18.2 키메라 항체의 결합
Figure pct00005
표 4는 각각 HEK293-mCLDN18.2 세포 및 HEK293-hCLDN18.1 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 친화도 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음을 나타내었다: 본 개시내용의 키메라 항체는 기준 항체 ch-175D10과 동일하였고, 둘 다 mCLDN18.2 항원에 결합하였으며, HEK293-mCLDN18.2에 대한 키메라 항체의 결합은 6093-14768의 평균 최대 형광 강도 및 0.573-1.763 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었고, 동일한 반응 조건하에 HEK293-mCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 4187의 평균 최대 형광 강도 및 1.014 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었으며, 이는 키메라 항체가 기준 항체에 필적하는 결합 EC50을 나타내고, 최대 결합이 기준 항체보다 더 높음을 나타낸다. 더욱이, 키메라 항체는 기준 항체 ch-175D10과 동일하였고, 둘 다 hCLDN18.1 항원에 결합하지 않았다.
실시예 5 항-CLDN18.2 키메라 항체의 시험관내 기능 검정
A. 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성 (ADCC)
CHO-K1/hCLDN18.2 세포를 표적 세포로서 사용하였고, 158V/V 유형 FcγRⅢa 유전자로 형질감염된 NK 세포 (NK92/FcRγ3a.158V/V)를 이펙터 세포로서 사용하였으며, 세포에서 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출을 세포독성 검정 키트 (로슈(Roche))에 의해 검출하고, 세포 사멸 효과의 지표로서 사용하였다.
CHO-K1/hCLDN18.2 세포를 원심분리에 의해 수확하고, 상청액을 폐기하고, 세포를 ADCC 완충제에 재현탁시켜, 세포 밀도를 조정하고, 96-웰 검정 플레이트로 옮겼다. 키메라 항체, 대조군 샘플 작업 용액, 또는 ADCC 완충제를 상이한 농도 구배에서 96-웰 플레이트로 옮기고, 세포 인큐베이터 (37℃/5% CO2)에서 약 30 분 동안 인큐베이션하고, 이펙터 세포, ADCC 완충제, 또는 세포 용해물을 96-웰 검정 플레이트로 옮기고, 세포 인큐베이터 (37℃/5%CO2)에서 추가 약 6 시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 후에, 96-웰 검정 플레이트를 제거하고, 낮은 회전 속도에서 원심분리하고, 상청액을 주의해서 피펫팅하고, 새로운 96-웰 검정 플레이트로 옮기고, LDH 검출 작업 용액을 첨가하고, 플레이트를 실온에서 약 10-30 분 동안 인큐베이션하고, OD 값을 마이크로플레이트 판독기 상에서 검출하였으며, 검출 파장은 492 nm이고, 기준 파장은 650 nm이었다.
ADCC 효과에 의해 유발된 세포 용해의 백분율은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
% 세포 용해 = 100% x (샘플 방출-표적 세포/이펙터 세포 혼합된 방출)/(최대 방출-표적 세포 방출)
여기서, 최대 방출은 트리톤(Triton) X-100으로 처리된 표적 세포의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 표적 세포/이펙터 세포 혼합된 방출은 표적 세포 및 이펙터 세포 혼합물의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 표적 세포 방출은 표적 세포만을 함유하는 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 샘플 방출은 키메라 항체, 표적 세포, 및 이펙터 세포 혼합물의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, EC50 및 최대 용해는 그래프패드 소프트웨어에 의해 계산되었으며, 결과를 표 5에 나타내었다.
표 5 항-CLDN18.2 키메라 항체의 ADCC 활성
Figure pct00006
표 5 및 도 18-23은 CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 ADCC 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음을 나타내었다: CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체의 최대 ADCC 효과는 29.06%-48.46%이고, 동일한 반응 조건하에 기준 항체 ch-175D10의 ADCC 효과는 31.81%이었다. 50% ADCC 효과를 생성하는 본 개시내용의 키메라 항체의 농도 (EC50)는 0.010-0.064 μg/mL이고, 동일한 반응 조건하에 50% ADCC 효과를 생성하는 ch-175D10의 농도 (EC50)는 0.021 μg/mL이었다. 상기 결과는 본 개시내용의 키메라 항체가 ADCC 활성에 있어서 기준 항체 ch-175D10에 필적하였음을 입증하였다.
B. 보체-의존적인 세포독성 (CDC)
표적 세포로서 CHO-K1/hCLDN18.2 및 보체 공급원으로서 풀링된 정상 인간 혈청 (PNHS)을 사용하여 셀타이터-글로(CellTiter-Glo)® 화학발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가(Promega))에 의해 세포 생존율을 측정하였다.
CHO-K1/hCLDN18.2 세포를 수확하고, CDC 완충제에 재현탁시켜, 세포 밀도를 조정하고, 384-웰 세포 플레이트에 20 μL/웰로 시딩하여, 4배 농도의 샘플 용액을 제조하였고, 이를 (대조군으로 CDC 완충제) 384-웰 세포 플레이트의 상응하는 웰에 10 μL/웰로 옮기고, 플레이트를 실온에서 약 30 분 동안 인큐베이션하고, 풀링된 정상 인간 혈청 (PNHS)을 CDC 완충제를 사용하여 4배 작업 농도로 희석하였다. 희석된 PNHS를 인큐베이션된 384-웰 플레이트의 상응하는 웰에 10 μL/웰로 옮기고, 플레이트를 세포 인큐베이터 (37℃ / 5% CO2)에서 약 4 시간 동안 인큐베이션하고, 384-웰 플레이트를 제거하고, 셀타이터-글로® 화학발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가)에 의해 검정하고, 페라스타 플러스 소프트웨어를 이용하여 결과를 판독하였다.
CDC 검정에서 키메라 항체에 의해 유발된 세포 용해율은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
% 세포 용해 = 100% x (1-(시험 웰-혈청 대조군 웰) / (세포 + 혈청 웰-혈청 대조군 웰))
실험 대조군은 다음과 같다: 혈청 대조군 웰: 혈청 단독 (즉, 30 μL 완충제 + 10 μL 희석된 혈청). 세포 + 혈청 웰: 혈청을 CHO-K1/hCLDN18.2 세포 현탁액의 웰에 첨가하였다 (즉, 20 μL 세포 현탁액 + 10 μL 완충제 + 10 μL 희석된 혈청). 시험 웰: 혈청 및 키메라 항체를 CHO-K1/hCLDN18.2 세포 현탁액의 웰에 첨가하였다 (즉, 20 μL 세포 현탁액 + 10 μL 항체 + 10 μL 희석된 혈청).
그래프패드 소프트웨어를 이용하여 EC50 및 최대 용해를 계산하였고, 결과를 표 6에 나타내었다.
표 6 항-CLDN18.2 키메라 항체의 CDC 활성
Figure pct00007
표 6 및 도 24-29는 CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 CDC 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음과 같았다: CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 키메라 항체의 최대 CDC 효과는 89.08%-97.11%이었고, 동일한 반응 조건하에 기준 항체 ch-175D10의 최대 CDC 효과는 87.41%이었다. 50% CDC 효과를 생성하는 본 개시내용의 키메라 항체의 농도 (EC50)는 0.038-0.380 μg/mL이고, 동일한 반응 조건하에 50% CDC 효과를 생성하는 ch-175D10의 농도 (EC50)는 1 μg/mL보다 높았다. 대부분의 항체의 CDC 활성이 기준 항체에 비해 더 강하였음을 알 수 있다.
실시예 6 항-CLDN18.2 키메라 항체의 변이체의 제조
본 개시내용에 의해 개시된 모노클로날 항체의 번역후 변형 (PTM) 분석을 통해, 1개의 탈아미드화 부위가 299B2 및 253C4의 두 가변 영역 모두에 존재하였음이 확인되었고; 299B2의 경쇄의 가변 영역에서 31번째, 또는 32번째, 또는 33번째 아미노산에 대해 단일 부위-지정된 돌연변이 유발을 수행하여 299B2의 3 가지 돌연변이체: 각각 299B2-N31Q, 299B2-S32A, 및 299B2-G33A를 제조하였다.
그리고, 253C4의 경쇄의 가변 영역의 31번째, 또는 32번째, 또는 33번째 아미노산에 대해 단일 부위-지정된 돌연변이 유발을 수행하여 253C4의 3 가지 돌연변이체: 각각 253C4-N31Q, 253C4-S32A, 및 253C4-G33A를 제조하였다.
299B2-N31Q, 299B2-S32A, 및 299B2-G33A의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 299B2의 것과 동일하였고, 253C4-N31Q, 253C4-S32A, 및 253C4-G33A의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 253C4의 것과 동일하였다. 상기 기재된 6 가지 변이체의 가변 영역 CDR 서열 및 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 각각 표 7 및 8에 나타내었다.
표 7 항체 299B2 및 253C4 및 그의 변이체의 CDR 서열
Figure pct00008
표 8 항체 299B2 및 253C4 및 그의 변이체의 가변 영역 서열
Figure pct00009
실시예 3에 기재된 바와 같이, 상기 기재된 6 가지 변이체 가변 영역과 인간 IgG1 불변 영역을 스플라이싱하여 생성된 표적 유전자 단편을 발현 벡터에 서브클로닝함으로써 키메라 항체를 구축하였으며, "하이브리도마 클론-돌연변이 부위"를 기반으로 하여 접두사 ch-를 부가하는 방식으로 변이체의 키메라 항체를 명명하였으며, 예를 들어 299B2-N31Q의 키메라 항체는 ch-299B2-N31Q로 지정되었다. 포유동물 세포주에서 일시적인 발현 후에, HEK293-hCLDN18.2 세포를 사용하여 친화도 검정을 수행하고, 모노클로날 세포 상청액을 FACS에 의해 스크리닝하였다. 항체 ch-299B2 및 ch-253C4의 변이체에 대한 친화도 결과는 표 9에 나타내었다.
표 9 항체 ch-299B2 및 ch-253C4의 변이체의 친화도
Figure pct00010
* 최대 농도가 최대 결합에 도달하지 않았고, 곡선이 핏팅될 수 없었다.
실시예 7 인간화 항체의 제조
A. 항체 299B2-S32A의 인간화 설계 및 발현
서열 유사성 비교를 통해, 299B2와 가장 높은 유사성을 갖는 항체 생식계열이 항체 주형으로서 선택되었다. 이 실시예에서, IMGT 데이터베이스 IGHV1-46*01은 299B2-S32A의 중쇄에 대한 항체 주형으로서 선택되었고, IGKV4-1*01은 299B2-S32A의 경쇄에 대한 항체 주형으로서 선택되었고, 항체 주형의 CDR 영역은 299B2-S32A의 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역으로 대체되었다.
뮤린 항체 가변 영역 서열의 상동성 모델링을 수행하였다. 뮤린 항체 가변 영역의 서열을 기반으로 하여 PDB 항체 데이터베이스에서 최상의 모델링 주형을 조사하였고, 74% 상동성을 갖는 2GKI가 주형으로서 선택되었다. 2GKI의 공간 구조를 기반으로 하여, CDR-그래프팅된 서열의 프레임워크 영역에서 아미노산 잔기를 하기 기준에 따라 역-돌연변이시켰다: 1. 프레임워크 영역에서 고전적인 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 2. 프레임워크 영역에서 소수성 코어 영역의 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 3. 중쇄/경쇄 상호작용 계면에서의 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 4. 낮은 우선순위 역 돌연변이를 위해 유사한 잔기 또한 선택되었다.
299B2-S32A를 인간화시켜 4 가지 인간화 항체 hu299B2-S32A-1, hu299B2-S32A-2, hu299B2-S32A-3, 및 hu299B2-S32A-4를 수득하였고, 상기 언급된 299B2-S32A의 모든 인간화 항체의 서열은 표 10에 나타내었다.
인간화 항체 hu299B2-S32A 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 스플라이싱함으로써 생성된 표적 유전자 단편을 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 표준 방법을 통해 pcDNA3.4 발현 벡터에 서브클로닝하였고, 대수 성장기에서 Expi293FTM 세포를 엑스피펙타민™ 293 형질감염 시약에 의해 일시적으로 형질감염시키고, 배양물 상청액을 수집하고, 친화도 정제에 적용하였고, 최종 정제된 항체를 SDS-PAGE 순도 분석 및 A280 농도 결정에 적용하였다.
B. 항체 253C4-N31Q의 인간화 설계 및 발현
서열 유사성 비교를 통해, 253C4와 가장 높은 유사성을 갖는 항체 생식계열이 항체 주형으로서 선택되었다. 이 실시예에서, IMGT 데이터베이스 IGKV4-1*01은 253C4-N31Q의 중쇄에 대한 항체 주형으로서 선택되었고, IGHV1-2*06은 253C4-N31Q의 경쇄에 대한 항체 주형으로서 선택되었고, 항체 주형의 CDR 영역은 253C4-N31Q의 경쇄 및 중쇄의 CDR 영역으로 대체되었다.
뮤린 항체 가변 영역 서열의 상동성 모델링을 수행하였다. 뮤린 항체 가변 영역의 서열을 기반으로 하여 PDB 항체 데이터베이스에서 최상의 모델링 주형을 조사하였고, 74% 상동성을 갖는 2GKI가 주형으로서 선택되었다. 2GKI의 공간 구조를 기반으로 하여, CDR-그래프팅된 서열의 프레임워크 영역에서 아미노산 잔기를 하기 기준에 따라 역-돌연변이시켰다: 1. 프레임워크 영역에서 고전적인 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 2. 프레임워크 영역에서 소수성 코어 영역의 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 3. 중쇄/경쇄 상호작용 계면에서의 잔기는 역 돌연변이를 위해 선택되었고; 4. 낮은 우선순위 역 돌연변이를 위해 유사한 잔기 또한 선택되었다.
253C4-N31Q를 인간화시켜 3 가지 인간화 항체 hu253C4-N31Q-1, hu253C4-N31Q-2, 및 hu253C4-N31Q-3을 수득하였고, 모든 253C4-N31Q 인간화 항체의 서열을 표 10에 나타내었다.
인간화 항체 hu253C4-N31Q 가변 영역 및 인간 IgG1 불변 영역을 스플라이싱함으로써 생성된 표적 유전자 단편을 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 표준 방법을 통해 pcDNA3.4 발현 벡터에 서브클로닝시켰고, 대수 성장기에서 Expi293FTM 세포를 엑스피펙타민™ 293 형질감염 시약에 의해 일시적으로 형질감염시키고, 배양물 상청액을 수집하고, 친화도 정제에 적용하였고, 최종 정제된 항체를 SDS-PAGE 순도 분석 및 A280 농도 결정에 적용하였다.
표 10 인간화 항체 hu299B2-S32A 및 hu253C4-N31Q의 가변 영역 서열
Figure pct00011
실시예 8 인간화 항체 hu299B2 및 hu253C4의 결합 활성
A. hCLDN18.2를 발현하는 세포에 대한 인간화 항체의 결합
결합 활성 검정은 실시예 4A를 참고하여 HEK293-hCLDN18.2 및 PDX-hCLDN18.2 세포를 사용하여 수행하였고, 무관한 인간 IgG는 음성 대조군이고, 특허 CN103509110B로부터의 키메라 항체 ch-175D10은 양성 대조군 (기준 항체)이다. 유세포 측정을 이용하여, 각각의 농도에 대한 평균 형광 강도 (이후 MFI로 지칭됨)를 소프트웨어에 의해 계산한 다음, 절반 결합 농도 (EC50) 및 평균 최대 형광 강도 (최고 MFI)를 그래프패드 소프트웨어에 의해 계산하고, 결과를 표 11에 나타내었다.
표 11 hCLDN18.2에 대한 항-CLDN18.2 인간화 항체의 결합
Figure pct00012
표 11 및 도 30-33은 각각 HEK293-hCLDN18.2 세포 및 PDX-hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 친화도 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음과 같았다: HEK293-hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 hu299B2-S32A 인간화 항체의 결합은 29529-39986의 평균 최대 형광 강도를 나타낸 반면에, 동일한 반응 조건하에 HEK293-hCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 단지 26921의 평균 최대 형광 강도를 나타내었으며, 이는 HEK293-hCLDN18.2에 대한 인간화 항체 hu299B2-S32A의 친화도가 기준 항체 ch-175D10보다 우수하였음을 나타낸다. HEK293-hCLDN18.2에 대한 hu253C4-N31Q의 결합은 기준 항체 ch-175D10에 필적하는 평균 최대 형광 강도를 나타내었고, EC50은 기준 항체 ch-175D10보다 우수하였다.
PDX-hCLDN18.2에 대한 본 개시내용의 hu299B2-S32A 및 hu253C4-N31Q의 결합은 15585-25189의 평균 최대 형광 강도, 11.42-29.68 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타낸 반면에, 동일한 반응 조건하에 PDX-hCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 단지 5703의 평균 최대 형광 강도, 및 24.89 nM의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었다. 천연 hCLDN18.2 항원에 대한 본 개시내용의 인간화 항체의 최대 결합이 ch-175D10에 비해 강하였고, EC50이 ch-175D10에 필적하였음을 알 수 있다.
B. 인간화 항체의 결합 선택성
HEK293-mCLDN18.2 세포 및 HEK293-hCLDN18.1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체의 결합은 실시예 4B에 기재된 방법에 따라 FACS를 이용하여 실험하였다.
HEK293-mCLDN18.2 및 HEK293-hCLDN18.1 세포를 별도로 수확하고, PBS에 재현탁시켜, 세포 농도를 조정하고, 구배 희석된 인간화 항체를 첨가하였으며, 무관한 인간 IgG는 음성 대조군으로 사용되고, ch-175D10은 여전히 양성 대조군 (기준 항체)으로 사용되었다. 4℃ 진탕 테이블에서 50 분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척하고, 형광 표지된 항-인간 IgG 이차 항체를 100 μL/웰로 첨가하고; 4℃ 진탕 테이블에서 40 분 동안 인큐베이션한 후에, 혼합물을 인산염 완충제 용액으로 원심분리에 의해 2회 세척한 다음, 제조된 샘플을 유세포 측정기 상에서 검출하고; 절반 결합 농도 (EC50) 및 평균 최대 형광 강도 (최고 MFI)를 그래프패드 소프트웨어에 의해 계산하고, 결과를 표 12에 나타내었다.
표 12 각각 mCLDN18.2 및 hCLDN18.1에 대한 항-CLDN18.2 인간화 항체의 결합
Figure pct00013
표 12는 각각 HEK293-mCLDN18.2 세포 및 HEK293-hCLDN18.1 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 친화도 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음과 같았다: 본 개시내용의 인간화 항체는 기준 항체 ch-175D10과 동일하였고, 둘 다 mCLDN18.2 항원에 결합하였으며, HEK293-mCLDN18.2에 대한 인간화 항체의 결합은 36841-102785의 평균 최대 형광 강도 및 0.026-0.342 μg/mL의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었고, 동일한 반응 조건하에 HEK293-mCLDN18.2에 대한 기준 항체 ch-175D10의 결합은 86407의 평균 최대 형광 강도 및 0.136 μg/mL의 절반 결합 농도 (EC50)를 나타내었으며, 이는 mCLDN18.2에 대한 인간화 항체의 결합이 기준 항체에 필적하였음을 나타낸다. 더욱이, 인간화 항체는 기준 항체 ch-175D10과 동일하였으며, 둘 다 hCLDN18.1 항원에 결합하지 않았다.
실시예 9 인간화 항체의 시험관내 기능 검정
A. 항체-의존적인 세포-매개된 세포독성 (ADCC)
실시예 5A에 기재된 방법에 따라, CHO-K1/hCLDN18.2 세포를 표적 세포로서 사용하였고, 158V/V 유형 FcγRⅢa 유전자로 형질감염된 NK 세포 (NK92/FcRγ3a.158V/V)를 이펙터 세포로서 사용하였으며, 세포에서 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출을 세포독성 검정 키트 (로슈)에 의해 검출하고, 세포 사멸 효과의 지표로서 사용하였다.
ADCC 효과에 의해 유발된 세포 용해의 백분율은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
% 세포 용해 = 100% x(샘플 방출-표적 세포/이펙터 세포 혼합된 방출)/(최대 방출-표적 세포 방출)
여기서, 최대 방출은 트리톤 X-100으로 처리된 표적 세포의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 표적 세포/이펙터 세포 혼합된 방출은 표적 세포 및 이펙터 세포 혼합물의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 표적 세포 방출은 표적 세포만을 함유하는 웰에서 생성된 흡광도 값이고, 샘플 방출은 인간화 항체, 표적 세포, 및 이펙터 세포 혼합물의 웰에서 생성된 흡광도 값이고, EC50 및 최대 용해는 그래프패드 소프트웨어에 의해 계산되었으며, 결과를 표 13에 나타내었다.
표 13 인간화 항-CLDN18.2 항체의 ADCC 활성
Figure pct00014
표 13 및 도 34-35는 CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 ADCC 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음을 나타내었다: CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체의 최대 ADCC 효과는 54.85%-70.26%이고, 동일한 반응 조건하에 기준 항체 ch-175D10의 ADCC 효과는 약 50%이었다. 50% ADCC 효과를 생성하는 본 개시내용의 인간화 항체의 농도 (EC50)는 0.022-0.038 μg/mL이고, 동일한 반응 조건하에 50% ADCC 효과를 생성하는 ch-175D10의 농도 (EC50)는 0.040 μg/mL이었다. 상기 결과는 본 개시내용의 인간화 항체가 ADCC 활성에 있어서 기준 항체 ch-175D10에 필적하였음을 입증하였다.
B. 보체-의존적인 세포독성 (CDC)
실시예 5B에 기재된 방법에 따라, 표적 세포로서 CHO-K1/hCLDN18.2 및 보체 공급원으로서 풀링된 정상 인간 혈청 (PNHS)을 사용하여 셀타이터-글로® 화학발광 세포 생존율 검정 키트 (프로메가)에 의해 세포 생존율을 측정하고, 결과를 페라스타 플러스(PHERAstar Plus) 소프트웨어를 사용하여 판독하였다.
CDC 검정에서 인간화 항체에 의해 유발된 세포 용해율은 하기 식을 이용하여 계산하였다:
% 세포 용해 = 100% x (1-(시험 웰-혈청 대조군 웰)/(세포 + 혈청 웰-혈청 대조군 웰))
실험 대조군은 다음과 같다: 혈청 대조군 웰: 혈청 단독 (즉, 30 μL 완충제 + 10 μL 희석된 혈청). 세포 + 혈청 웰: 혈청을 CHO-K1/hCLDN18.2 세포 현탁액의 웰에 첨가하였다 (즉, 20 μL 세포 현탁액 + 10 μL 완충제 + 10 μL 희석된 혈청). 시험 웰: 혈청 및 키메라 항체를 CHO-K1/hCLDN18.2 세포 현탁액의 웰에 첨가하였다 (즉, 20 μL 세포 현탁액 + 10 μL 항체 + 10 μL 희석된 혈청).
그래프패드 소프트웨어를 이용하여 EC50 및 최대 용해를 계산하였고, 결과를 표 14에 나타내었다.
표 14 인간화 항-CLDN18.2 항체의 CDC 활성
Figure pct00015
표 14 및 도 36-37은 CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체 및 기준 항체 ch-175D10의 CDC 결과를 나타내었다. 실험 결과는 다음과 같았다: CHO-K1/hCLDN18.2 세포에 대한 본 개시내용의 인간화 항체의 최대 CDC 효과는 96.11%-99.87%이고, 동일한 반응 조건하에 기준 항체 ch-175D10의 최대 CDC 효과는 87.76%이었다. 50% CDC 효과를 생성하는 본 개시내용의 키메라 항체의 농도 (EC50)는 0.092-0.175 μg/mL이고, 동일한 반응 조건하에 50% CDC 효과를 생성하는 ch-175D10의 농도 (EC50)는 1 μg/mL보다 높았다. 모든 인간화 항체의 CDC 활성이 기준 항체보다 강하였음을 알 수 있다.
상기 기재된 본 개시내용의 실시양태는 단순히 예시적인 것으로 의도되며, 수많은 구체적인 화합물, 물질 및 작업의 등가물이 과도한 실험 없이도 관련 기술분야의 기술자에 의해 인식되거나 또는 결정될 수 있다. 이러한 모든 등가물은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도되고, 청구항에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> QILU PHARMACEUTICAL CO., LTD. <120> ANTIBODY AGAINST CLAUDIN 18A2 AND USE THEREOF <160> 128 <170> SIPOSequenceListing 1.0 <210> 1 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Leu Lys Gln Arg Pro Arg His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Leu Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Val Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Gly Leu Arg Gly Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 2 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Ser Tyr Leu Thr 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Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr His Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met 100 105 110 Lys <210> 117 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 117 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 118 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 118 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 119 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 119 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Thr Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Leu Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Ala Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Glu Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 120 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 120 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Lys Gly Asn Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 121 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 121 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 122 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 122 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Thr Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Glu Gly Tyr Gly Lys Gly Asn Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 123 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 123 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 124 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 124 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ala 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gln Asn 85 90 95 Ala Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 125 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 125 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Gly Tyr Gly Lys Gly Asn Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 126 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 126 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 127 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 127 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Gln Ser 20 25 30 Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Val Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn 85 90 95 Asp Tyr Tyr Phe Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 128 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 128 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Thr Gly Thr Ala Tyr Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 Glu Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Lys Gly Asn Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120

Claims (49)

  1. 하기를 포함하는 CLDN18.2에 특이적으로 결합할 수 있는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 서열식별번호: 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 HCDR을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (2) 서열식별번호: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 LCDR을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  2. 하기를 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 서열식별번호: 37, 40, 43, 45, 49, 53, 56, 59, 62, 65, 68, 71, 74, 77, 80, 83으로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1; 및 서열식별번호: 38, 41, 46, 48, 50, 52, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR2; 및 서열식별번호: 39, 42, 44, 47, 51, 55, 58, 61, 64, 67, 70, 73, 76, 79, 82, 85로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변 영역; 및/또는
    (2) 서열식별번호: 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 111, 112, 113으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1; 및 서열식별번호: 93, 94, 95, 96으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR2; 및 서열식별번호: 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110으로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변 영역.
  3. 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하고/거나:
    서열식별번호: 37, 서열식별번호: 38 및 서열식별번호: 39 또는
    서열식별번호: 40, 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 42 또는
    서열식별번호: 43, 서열식별번호: 41 및 서열식별번호: 44 또는
    서열식별번호: 45, 서열식별번호: 46 및 서열식별번호: 47 또는
    서열식별번호: 37, 서열식별번호: 48 및 서열식별번호: 39 또는
    서열식별번호: 49, 서열식별번호: 50 및 서열식별번호: 51 또는
    서열식별번호: 49, 서열식별번호: 52 및 서열식별번호: 51 또는
    서열식별번호: 53, 서열식별번호: 54 및 서열식별번호: 55 또는
    서열식별번호: 56, 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58 또는
    서열식별번호: 59, 서열식별번호: 60 및 서열식별번호: 61 또는
    서열식별번호: 62, 서열식별번호: 63 및 서열식별번호: 64 또는
    서열식별번호: 65, 서열식별번호: 66 및 서열식별번호: 67 또는
    서열식별번호: 68, 서열식별번호: 69 및 서열식별번호: 70 또는
    서열식별번호: 71, 서열식별번호: 72 및 서열식별번호: 73 또는
    서열식별번호: 74, 서열식별번호: 75 및 서열식별번호: 76 또는
    서열식별번호: 77, 서열식별번호: 78 및 서열식별번호: 79 또는
    서열식별번호: 80, 서열식별번호: 81 및 서열식별번호: 82 또는
    서열식별번호: 83, 서열식별번호: 84 및 서열식별번호: 85;
    경쇄 가변 영역은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 것인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    서열식별번호: 86, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 97; 또는
    서열식별번호: 87, 서열식별번호: 94 및 서열식별번호: 98; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 99; 또는
    서열식별번호: 87, 서열식별번호: 95 및 서열식별번호: 100; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 97; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 101; 또는
    서열식별번호: 89, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 102; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 100; 또는
    서열식별번호: 90, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 103; 또는
    서열식별번호: 91, 서열식별번호: 96 및 서열식별번호: 104; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 98; 또는
    서열식별번호: 92, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 105; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 106; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
    서열식별번호: 87, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 108; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 109; 또는
    서열식별번호: 88, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
    서열식별번호: 111, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
    서열식별번호: 112, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
    서열식별번호: 113, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 107; 또는
    서열식별번호: 111, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
    서열식별번호: 112, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110; 또는
    서열식별번호: 113, 서열식별번호: 93 및 서열식별번호: 110.
  4. 하기 군 중 어느 하나로부터의 6개의 CDR을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 각각의 군의 6개의 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2, LCDR3의 순서로 배열되는 것인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 서열식별번호: 37, 38, 39, 86, 93, 97;
    (2) 서열식별번호: 40, 41, 42, 87, 94, 98;
    (3) 서열식별번호: 43, 41, 44, 88, 93, 99;
    (4) 서열식별번호: 45, 46, 47, 87, 95, 100;
    (5) 서열식별번호: 37, 48, 39, 88, 93, 97;
    (6) 서열식별번호: 49, 50, 51, 88, 93, 101;
    (7) 서열식별번호: 49, 52, 51, 89, 93, 102;
    (8) 서열식별번호: 53, 54, 55, 88, 93, 100;
    (9) 서열식별번호: 56, 57, 58, 90, 93, 103;
    (10) 서열식별번호: 59, 60, 61, 91, 96, 104;
    (11) 서열식별번호: 62, 63, 64, 88, 93, 98;
    (12) 서열식별번호: 65, 66, 67, 92, 93, 105;
    (13) 서열식별번호: 68, 69, 70, 88, 93, 106;
    (14) 서열식별번호: 71, 72, 73, 88, 93, 107;
    (15) 서열식별번호: 74, 75, 76, 88, 93, 106;
    (16) 서열식별번호: 77, 78, 79, 87, 93, 108;
    (17) 서열식별번호: 80, 81, 82, 88, 93, 109;
    (18) 서열식별번호: 83, 84, 85, 88, 93, 110;
    (19) 서열식별번호: 71, 72, 73, 111, 93, 107;
    (20) 서열식별번호: 71, 72, 73, 112, 93, 107;
    (21) 서열식별번호: 71, 72, 73, 113, 93, 107;
    (22) 서열식별번호: 83, 84, 85, 111, 93, 110;
    (23) 서열식별번호: 83, 84, 85, 112, 93, 110;
    (24) 서열식별번호: 83, 84, 85, 113, 93, 110.
  5. 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며,
    (1) 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35와 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖고/거나;
    (2) 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 114, 115, 116, 117, 118, 119와 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 것인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  6. 하기로 이루어진 군 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 서열식별번호: 1 및 2;
    (2) 서열식별번호: 3 및 4;
    (3) 서열식별번호: 5 및 6;
    (4) 서열식별번호: 7 및 8;
    (5) 서열식별번호: 9 및 10;
    (6) 서열식별번호: 11 및 12;
    (7) 서열식별번호: 13 및 14;
    (8) 서열식별번호: 15 및 16;
    (9) 서열식별번호: 17 및 18;
    (10) 서열식별번호: 19 및 20;
    (11) 서열식별번호: 21 및 22;
    (12) 서열식별번호: 23 및 24;
    (13) 서열식별번호: 25 및 26;
    (14) 서열식별번호: 27 및 28;
    (15) 서열식별번호: 29 및 30;
    (16) 서열식별번호: 31 및 32;
    (17) 서열식별번호: 33 및 34;
    (18) 서열식별번호: 35 및 36;
    (19) 서열식별번호: 27 및 114;
    (20) 서열식별번호: 27 및 115;
    (21) 서열식별번호: 27 및 116;
    (22) 서열식별번호: 35 및 117;
    (23) 서열식별번호: 35 및 118;
    (24) 서열식별번호: 35 및 119.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 인간화 항체인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  8. 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함하며, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 120, 122, 125, 128과 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖고/거나; 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 121, 123, 124, 126, 127과 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 갖는 것인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  9. 하기로 이루어진 군 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역과 적어도 80% 내지 100% 서열 동일성을 포함하는 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편:
    (1) 서열식별번호: 120 및 121;
    (2) 서열식별번호: 120 및 123;
    (3) 서열식별번호: 120 및 124;
    (4) 서열식별번호: 122 및 121;
    (5) 서열식별번호: 125 및 126;
    (6) 서열식별번호: 125 및 127;
    (7) 서열식별번호: 128 및 126.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 추가로 포하하며, 바람직하게는 중쇄 불변 영역이 Fc 또는 변이체 Fc를 포함하고, Fc가 뮤린 또는 인간의 것으로부터 유래된 것인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인 항-CLDN18.2 항체.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4의 형태인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원-결합 단편이 Fab, Fv, scFv, F(ab')2, 선형 항체, 단일-도메인 항체인 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포획 표지 또는 검출 표지에 커플링시킴으로써 형성되며, 검출 표지는 방사성 핵종, 발광 물질, 착색 물질, 또는 효소를 포함하는 것인 접합체.
  16. 한 항원-결합 도메인이 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 이중특이적 항체.
  17. 한 항원-결합 도메인이 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 다중특이적 항체.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하며, 항체-링커-독소 상호연결에 의해 형성되는 항체-약물 접합체.
  19. 세포외 인식 단위가 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것인 키메라 항원 수용체.
  20. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 핵산.
  21. 제20항의 핵산을 포함하는 재조합 벡터.
  22. 제21항의 재조합 벡터 또는 게놈에 통합된 제20항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 원핵생물 세포, 예컨대 이. 콜라이이거나; 또는 진핵생물 세포, 예컨대 효모, 또는 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포 또는 HEK293 세포인 숙주 세포.
  24. 제22항 또는 제23항의 숙주 세포를 적합한 조건하에 배양하고, 세포로부터 발현 생성물을 정제하는 것을 포함하는, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 제조하는 방법.
  25. CLDN18.2-발현 종양 세포를 특이적으로 표적화하기 위한 약물의 제조에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
  26. 위암, 췌장암, 식도암, 폐암, 난소암, 결장암, 간암, 두경부암, 및 담낭암 및 그의 전이, 위암 전이, 예컨대 쿠켄베르크 종양을 포함하는 CLDN18.2-발현 종양에 대한 진단 시약의 제조에서 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 용도.
  27. (1) 샘플을 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편과 접촉시키고;
    (2) 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편 및 CLDN18.2의 복합체의 형성을 검출하는 것을 포함하는, 샘플에서 CLDN18.2의 발현을 검출하는 방법이며,
    임의적으로, 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 검출가능하게 표지되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 항-CLDN18.2 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 유효량을 포함하거나, 또는 제16항의 이중특이적 항체의 유효량을 포함하거나, 또는 제17항의 다중특이적 항체의 유효량을 포함하거나, 또는 제18항의 항체-약물 접합체의 유효량을 포함하거나, 또는 제19항의 키메라 항원 수용체의 유효량을 포함하거나, 또는 제20항의 핵산의 유효량을 포함하거나, 또는 제21항의 재조합 벡터의 유효량을 포함하거나, 또는 제22항 또는 제23항의 숙주 세포의 유효량을 포함하는 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 제약상 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
  31. 제29항에 있어서, 1종 이상의 추가의 치료제가 화학치료제, 세포독성제, 방사선 치료제, 암 백신, 항신생물제, 표적화된 항암제, 항혈관형성제, 생물학적 반응 조절제, 시토카인, 호르몬, 항전이제, 및 면역치료제를 포함하는 것인 제약 조성물.
  32. 용기, 및 용기 내의 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 제약 조성물을 포함하는 약물 박스 또는 키트.
  33. CLDN18.2-발현 세포를 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항의 제약 조성물과 접촉시키는 것을 포함하는, CLDN18.2-발현 세포의 세포 사멸을 유도하는 방법이며, CLDN18.2-발현 세포가 암 세포인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 세포가 위암 세포, 식도암 세포, 장암 세포, 췌장암 세포, 신장모세포종 세포, 폐암 세포, 난소암 세포, 결장암 세포, 직장암 세포, 간암 세포, 두경부암 세포, 만성 골수성 백혈병 세포, 및 담낭암 세포를 비롯한 고형 종양 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  35. CLDN18.2의 발현과 연관된 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제28항 또는 제29항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 CLDN18.2의 발현과 연관된 질환을 치료하는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 질환이 종양, 바람직하게는 위암, 식도암, 장암, 췌장암, 신장모세포종, 폐암, 난소암, 결장암, 직장암, 간암, 두경부암, 만성 골수성 백혈병, 또는 담낭암인 방법.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  38. 제35항에 있어서, 추가의 치료제가 화학치료제, 세포독성제, 방사선 치료제, 암 백신, 항신생물제, 표적화된 항암제, 항혈관형성제, 생물학적 반응 조절제, 시토카인, 호르몬, 항전이제, 및 면역치료제를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 화학치료제가 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 나벨빈, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 테니포시드, 미독시조즈, 시스플라틴, 카르보플라틴, 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 트리메틸렌티오포스포르아미드, 카르무스틴, 부술판, 클로람부실, 브리퀴놀리진, 우라실 머스타드, 클로프로펜, 다카르바진, 시타라빈, 5-플루오로우라실, 메토트렉세이트, 머캅토퓨린, 아자티오프린, 프로카르바진, 독소루비신, 블레오마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 미토마이신, 사르코마이신 C, 악티노마이신 D, 록시트로마이신, 아드리아마이신, 라파마이신, 다우노마이신, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다카르바진, 아자시티딘, 암사콘, 멜팔란, 이포스파미드, 및 미톡산트론을 포함하는 것인 방법.
  40. 제37항에 있어서, 추가의 치료제가 에피루비신, 옥살리플라틴, 및 5-플루오로우라실 중 1종 이상으로부터 선택되는 것인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 시토카인이 IL-10, IL-15, IL4, 및 IL13을 포함하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 표적화된 항암제가 거대분자 표적화된 약물 및 소분자 표적화된 약물을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 거대분자 표적화된 약물이 세툭시맙, 파니투무맙, 니모투주맙, 트라스투주맙, 페르투주맙, T-DM1, 베바시주맙, VEGF-TRAP, 및 라무시루맙을 포함하는 것인 방법.
  44. 제42항에 있어서, 소분자-표적화된 약물이 에를로티닙, 게피티닙, 라파티닙, 아파티닙, 이마티닙, 수니티닙, 소라페닙, 레고라페닙, 파조파닙, 아파티닙, 크리조티닙, 보리노스타트, 마리마스타트, 및 에베롤리무스; 및 PI3Kα, PKB/AKT 및 STAT3 표적을 비롯한 다른 표적을 표적화하는 소분자 약물을 포함하는 것인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 면역치료제가 PD-1/PD-L1, PD-L2, CTLA-4, LAG-3, IDO, TIM3, TIGIT, CD47, SIRPα, 4-1BB, CSF-1/CSF1R, GITR, OX40, CD40, CD27, CD28, B7H4, B7H3, TGFβ, BTLA, VISTA, ICOS, CD39, CD73, A2AR, KIR 및 NKG2A로 이루어진 군으로부터 선택된 면역-관련 표적에 대해 지정된 거대분자 또는 소분자 약물; 및 면역요법과 연관된 세포 요법인 방법.
  46. 제45항에 있어서, PD-1/PD-L1을 표적화하는 면역 체크포인트 억제제가 펨브롤리주맙, 니볼루맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 신틸리맙, 세미플리맙, 및 두르발루맙을 포함하는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, CTLA-4를 표적화하는 면역 체크포인트 억제제가 이필리무맙을 포함하는 것인 방법.
  48. 제37항에 있어서, 추가의 치료제가 파르보바이러스, 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 폭스바이러스, 폴리오바이러스, 레오바이러스, 알파바이러스, 마라바 바이러스, 레트로바이러스, 및 콕사키바이러스를 비롯한 종양용해성 바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  49. 제37항에 있어서, 추가의 치료제가 암 백신 또는 보르테조밉인 프로테아제 억제제로부터 선택되는 것인 방법.
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