UA116445C2 - Антитіло, яке специфічно зв'язується з клаудином 18.2 - Google Patents

Abstract

Винахід стосується антитіла, яке специфічно зв’язується з клаудином 18.2 (CLDN18.2), кон’югата, який містить зазначене антитіло, клітини-хазяїна, яка експресує вказане антитіло, гібридоми, що продукує вказане антитіло, та діагностичного набору, що його містить антитіло.

Description

Клаудини (СІ ОМ) - це інтегральні мембранні білки, які є компонентом щільних міжклітинних контактів в епітелії й ендотелії. Передбачається, що в молекулі клаудину чотири трансмембранні сегменти, дві позаклітинні петлі, а М- і С-кінці перебувають у цитоплазмі.

Трансмембранні білки родини клаудинів відіграють ключову роль у підтримуванні щільних контактів між епітеліальними або ендотеліальними клітинами й, можливо, беруть участь у підтримуванні цитоскелета та у клітинних сигнальних механізмах.

Клаудин 18 (СІ ОМ18) є інтегральним трансмембранним білком (тетраспанін), у молекулі якого є чотири трансмембранні гідрофобні області й дві позаклітинні петлі, з яких перша петля в поліпептидному ланцюзі перебуває між першою й другою гідрофобними областями, а друга петля - між третьою й четвертою гідрофобними областями). Клаудин 18 існує у двох різних сплайс-варіантах, які описані для мишей і людини (Мійті, Мої. СеїІ. ВіоІ. 21:7380-90, 2001). Ці сплайс-варіанти Іваріант 1 (СГ ОМ18.1) - реєстраційний номер в Сепрапк МР 057453,

ММ 016369, варіант 2 (СІ ОМ18.2): ММ 001002026, МР 001002026) мають молекулярну масу приблизно 27,9/27,72 кДа. Білки СІ ОМ18.1 ї СІ ОМ18.2 відрізняться М-кінцевою частиною, яка включає першу трансмембранну (ТМ) область і петлю 1, а первинна структура С-кінцевої частини в них однакова (див. Фіг.1).

Білок СІГОМ18.1 експресується тільки в клітинах нормальної легеневої тканини, а

СІ ОМ18.2 - тільки в клітинах шлунка, причому в здоровому шлунку експресія СІ ОМ18.2 обмежена диференційованими короткоживучими клітинами епітелію шлунка. Встановлено, що експресія СІ ОМ18.2 має місце в різних тканинах пухлин. Наприклад, СІ ОМ18.2 експресується в карциномі підшлункової залози, карциномі стравоходу, карциномі шлунка, карциномі бронхів, карциномі молочної залози й у пухлинах вуха-горла-носа. СГОМ18.2 є цінною мішенню для запобігання й/або лікування первинних пухлин, наприклад раку шлунка, раку стравоходу, раку підшлункової залози, раку легенів (зокрема, недрібноклітинного раку легенів), раку яєчника, раку прямої кишки, раку печінки, раку голови й шиї, раку жовчного міхура та їх метастаз, зокрема метастазуючого раку шлунка (наприклад, при пухлинах Крукенберга), перитонеальних метастаз і метастаз лімфатичних вузлів.

Те, що експресія СГ ОМ18.2 відрізняється в нормальних й у ракових клітинах і при тому обмежена популяцією поновлюваних диференційованих клітин шлунка, які можуть бути заповнені за рахунок стовбурових клітин шлунка, які не несуть мішеней, а також мембранна локалізація цього білка та його відсутність у більшості токсикологічно значимих нормальних тканинах роблять СІ 0ОМ18.2 привабливою мішенню для імунотерапії раку, і використання терапевтичних засобів на основі антитіл, націлених на СГ ОМ18.2, обіцяє високу терапевтичну ефективність при лікуванні раку.

Клінічному застосуванню антитіл, націлених на СІГОМ18.2, перешкоджає висока гомологічність людських СГ ОМ18.1 ії СІ ОМ18.2. Вдається одержати специфічні до СІ ОМ18.2 антитіла, націлені на М-кінцевий позаклітинний домен СІ ОМ18.2, у послідовності якого є відмінності від СІ ОМ18. Спроби одержати антитіла, націлені на М-кінцеву частину СГ ОМ18.2, які проявляють властивості, потрібні для клінічного застосування в діагностичних цілях, наприклад для виявлення експресії СІ ОМ18.2 у клітинах зрізів пухлинної тканини, не мали успіху.

На власний подив автори даного винаходу виявили, що антитіла проти певного епітопа, розташованого в С-кінцевій частині СІОМ18.2, задовольняють критеріям можливості діагностичного застосування антитіл, зокрема для виявлення й ідентифікації клітин, в яких експресується СІ ОМ18.2. Як не дивно, ці антитіла, хоча й спрямовані проти послідовності, яка однакова в СІ ОМ18.1 і в СІ ОМ18.2, не зв'язуються з нераковими клітинами легенів.

Антитіла запропоновані даним винаходом можна використовувати, наприклад, при діагностуванні раку й/або при встановленні експресії СІ ОМ18.2 у ракових клітинах. Краще використання антитіл запропонованих даним винаходом стосується ракових захворювань або ракових клітин, яким властива експресія СІ ОМ18.2 на клітинній поверхні. Мішенню терапії, націленої на СГОМ18.2, наприклад терапії з використанням антитіл проти СГОМ18.2, є ракові клітини, у яких експресується СГ ОМ18.2. В одному із втілень даного винаходу в ракових клітинах має місце експресія або аномальна експресія СІ ОМ18.2, тоді як у нормальних клітинах

СІГОМ18.2 не експресується або експресується дуже мало. Клітини, у яких експресується

СІГОМ18.2, переважно вибирають із групи, яка складається з туморогенних ракових клітин шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчника, прямої кишки, печінки, голови й шиї, жовчного міхура.

Розкриття винаходу

Даний винахід відноситься до антитіла або до антиген-з'єднувального фрагменту, які: (ї) зв'язуються з пептидом, який містить амінокислотну послідовність ТЕСЕМО5ЗУРЗКНОММ бо (ЗЕО ІО МО: 5) або ЕМО5УРБКНОМУМ (ЗЕО ІЮ МО: 6) і/або

(і) зв'язуються із клаудином 18.2 (СІ ОМ18.2), причому зазначене антитіло або його антиген- з'єднувальний фрагмент, зв'язуються з СІ ОМ18.2 шляхом зв'язування із щонайменше одним епітопом у молекулі СІ ОМ18.2, який містить амінокислотну послідовність ТЕРРЕМО5УРЗКНОУМ (ЗЕО ІО МО: 5) або ЕМОБУРБКНОУМ (5ЕО ІО МО: 6).

В одному із втілень даного винаходу зазначений СГ ОМ18.2 є СГ ОМІ18.2, пов'язаним із клітинною мембраною. В одному із втілень даного винаходу зазначений СІ ОМ18.2 присутній на ракових клітинах, причому зазначені ракові клітини переважно є раковими клітинами, у яких експресується СГ ОМ18.2. В одному із втілень даного винаходу зазначені ракові клітини вибирають із групи, яка складається із клітин шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчника, прямої кишки, печінки, голови й шиї, жовчного міхура. В одному із втілень даного винаходу антитіло або його антиген-з'єднувальний фрагмент запропоновані даним винаходом не зв'язується з нераковими клітинами, за винятком епітеліальних клітин шлунка. В одному із втілень даного винаходу антитіло або його антиген-з'єднувальний фрагмент запропоновані даним винаходом не зв'язується з нераковими клітинами легенів. В одному із втілень даного винаходу антитіло запропоноване даним винаходом є химерним, людським або гуманізованим.

В одному із втілень даного винаходу антитіло запропоноване даним винаходом є моноклональним антитілом.

У цьому й інших своїх аспектах даний винахід відноситься до антитіла, яке містить: (І) важкий ланцюг антитіла, який включає () послідовність важкого ланцюга антитіла, що відповідає 5ХЕО ІО МО: 7 або її варіанту, (ї) щонайменше одну, краще дві, ще краще - усі три послідовності СОК амінокислотної послідовності важкого ланцюга молекули антитіла, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 7 або її варіанту, або (ії) послідовність СОКЗ, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 10 або її варіанту, і яка бажано також містить послідовність СОМКІ, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 8 або її варіанту, і/або послідовність

СО, що відповідає ЗЕО ІЮ МО: 9 або її варіанту, імабо (ІЇ) легкий ланцюг антитіла, який включає: (ї) послідовність легкого ланцюга антитіла, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 11 або її варіанту, (ії) щонайменше одну, краще дві, ще краще - усі три послідовності СОК амінокислотної послідовності легкого ланцюга молекули антитіла, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 11 або її варіанту, або (ії) послідовність СОКЗ, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 14 або її варіанту, і яка бажано також містить послідовність СОКІ, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 12 або її варіанту, і/або послідовність

СОК2, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 13 або її варіанту.

У зазначених вище та в інших своїх аспектах даний винахід відноситься також до антитіла, яке містить: (І) важкий ланцюг антитіла, який включає (ї) послідовність важкого ланцюга антитіла, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 15 або її варіанту, (ії) щонайменше одну, краще дві, ще краще - усі три послідовності СОК амінокислотної послідовності важкого ланцюга молекули антитіла, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 15 або її варіанту, або (ії) послідовність СОКЗ, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 18 або її варіанту, і яка бажано також містить послідовність СОКІ1, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 16 або її варіанту, і/або послідовність

СО, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 17 або її варіанту, імабо (ІЇ) легкий ланцюг антитіла, який включає: (ї) послідовність легкого ланцюга антитіла, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 19 або її варіанту, (ї) щонайменше одну, краще дві, ще краще - усі три послідовності СОК амінокислотної послідовності легкого ланцюга молекули антитіла, що відповідає 5ЕО ІЮО МО: 19 або її варіанту, або (ії) послідовність СОКЗ, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 22 або її варіанту, і яка бажано також містить послідовність СОКІ1, що відповідає 5ЕО ІЮ МО: 20 або її варіанту, і/або послідовність

СОК2, що відповідає ЗЕО ІЮО МО: 21 або її варіанту.

У кращих втіленнях даного винаходу антитіло запропоноване даним винаходом містить важкий ланцюг, який включає константну область важкого у1!-ланцюга, бажано константну область важкого у1-ланцюга людського антитіла, і/або антитіло запропоноване даним винаходом містить легкий ланцюг, який включає константну область легкого к-ланцюга.

У зазначених вище й в інших своїх аспектах даний винахід відноситься до антитіла, яке (610) продукується гібридомою (або одержується з неї), депонованою в Німецькому банку мікроорганізмів і клітинних культур (05М2, ІппоПепвіг. 7В, 38124 Брауншвейг, Німеччина), і яка має одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1. тиАВ 43-14А, реєстраційний номер О5БМ АССЗ3144, депоновано 6 жовтня, 2011; або 2. тиАВ 35-22А реєстраційний номер ОБМ АССЗ3143, депоновано 6 жовтня, 2011.

Антитіла запропоновані даним винаходом в даному документі позначаються відповідно до позначення антитіла й/або до позначення клону, який його продукує, наприклад тиАВ 43-144А.

Також кращими з запропонованих даним винаходом антитіл є ті, які проявляють специфічність антитіл, продукованих згаданими вище гібридомами (або одержаними з них) і, зокрема, антитіла, які містять ділянку або сайт зв'язування антигену, зокрема варіабельну область, ідентичну або значною мірою гомологічну до такої антитіл, які продуковані згаданими вище гібридомами (або одержані з них). Передбачається, що кращі з запропонованих даним винаходом антитіл мають області СОК, ідентичні або значною мірою гомологічні до областей

СОК антитіл, продукованих згаданими вище гібридомами (або одержаних з них). Вираз "значною мірою гомологічні" слід розуміти так, що в кожній області СОК може бути від 1 до 5 замін, бажано від 1 до 4, наприклад 1-3 або 1-2. Особливо бажаними є запропоновані даним винаходом химеризовані або гуманізовані форми антитіл, продукованих згаданими вище гібридомами (або одержаних з них).

Таким чином, антитіло запропоноване даним винаходом вибирають із групи, яка складається з (ії) антитіла, продукованого клоном, депонованим під реєстраційним номером

О5М АССЗ3144 (тиАВ 43-14А) або О5М АССЗ3143 (тиАВ 35-22А), або одержаним з них; (ії) антитіла, яке є химеризованою або гуманізованою формою антитіла за пунктом (Її); (іїї) антитіла, яке проявляє специфічність антитіла за пунктом (Її), і (м) антитіла, яке містить ділянку або сайт зв'язування антигену антитіла за пунктом (ії). Ділянка або сайт зв'язування антигену антитіла за пунктом (ї) може бути варіабельною областю антитіла за пунктом (ї). До обсягу даного винаходу включено також антиген-з'єднувальні фрагменти антитіл, описаних у даному документі.

Антитіла запропоновані даним винаходом бажано здатні зв'язуватися із клаудином 18.2 у його нативному вигляді, тобто в природному або не денатурованому вигляді, або ж у денатурованому вигляді.

В одному із втілень даного винаходу антитіла запропоновані даним винаходом одержують способом, який передбачає етап імунізації тварин пептидом, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІО МО: 5 або 5ЕО ІЮ МО: б, та який переважно складається з неї, або імунологічно еквівалентним пептидом, або нуклеїновою кислотою, або клітинами-хазяями, в яких експресується зазначений пептид. Бажано зазначений пептид містить не більше 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, або 20 розташованих підряд амінокислотних залишків СІ ОМ18.2.

В одному із втілень даного винаходу антитіла запропоновані даним винаходом одержують способом, який передбачає етап імунізації тварин пептидом, який містить амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ МО: 24 або 5ЕО ІЮО МО: 25, та, переважно складається із неї, або імунологічно еквівалентним пептидом, або нуклеїновою кислотою, або клітинами-хазяями, у яких експресується зазначений пептид. Бажано зазначений пептид містить не більше 110, 100, 90, 80 або 75 розташованих підряд амінокислотних залишків СІ ОМ18.2.

Антитіла або антиген-з'єднувальні фрагменти, запропоновані даним винаходом можуть бути з'єднані, тобто ковалентно або не ковалентно зв'язані, з іншими молекулами, наприклад с мітками, за якими їх можна виявити.

Даний винахід відноситься також до клітин, наприклад гібридом, які продукують описані в даному документі антитіла.

Кращими запропонованими даним винаходом гібридомами є клітини, депоновані в

Німецькому банку мікроорганізмів і клітинних культур (ОЗМА, Іппоїепвіг. 7В, 38124 Брауншвейг,

Німеччина), які мають одне з наступних позначень і реєстраційних номерів: 1. тиАВ 43-14А, реєстраційний номер О5БМ АССЗ3144, депоновано 6 жовтня, 2011; або 2. тиАВ 35-22А реєстраційний номер ОБМ АССЗ3143, депоновано 6 жовтня, 2011.

Даний винахід відноситься також до пептидів, які містять амінокислотну послідовність 5ЕО

ІЮ МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 6, та, які переважно складаються із неї, або до імунологічно еквівалентних пептидів. Бажано зазначений пептид містить не більше 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, або 20 розташованих підряд амінокислотних залишків СІ ОМ18.2.

Даний винахід відноситься також до пептидів, які містять амінокислотну послідовність 5ЕО

ІЮ МО: 24 або 5ЕО ІО МО: 25, та, які переважно складаються із неї, або до імунологічно еквівалентних пептидів, або нуклеїнових кислот, або клітин-хазяїв, у яких експресується зазначений пептид. Бажано зазначений пептид містить не більше 110, 100, 90, 80 або 75 розташованих підряд амінокислотних залишків СІ ОМ18.2. 10) Даний винахід відноситься також до нуклеїнових кислот, які містять гени або нуклеотидні послідовності, що кодують антитіла або їх частини, наприклад будь-які із ланцюгів молекули антитіла, або антиген-з'єднувальні фрагменти, або пептиди, описані в даному документі.

Бажано нуклеїнова кислота запропонована даним винаходом функціонально з'єднана з елементами, які регулюють експресію в еукаріотичних або прокаріотичних клітинах. Регуляторні елементи, які забезпечують експресію генів в еукаріотичних або прокаріотичних клітинах добре відомі в даній галузі техніки.

Нуклеїнова кислота запропонована даним винаходом може входити до складу вектора, наприклад плазміди, косміди, вірусу, бактеріофага або іншого вектора, який зазвичай використовується в генетичній інженерії. Цей вектор може також містити маркерні гени, які дозволяють здійснювати його відбір у придатних клітинах-хазяїнах і за придатних умов. Також цей вектор може містити елементи, які регулюють експресію, які забезпечують належну експресію кодуючих послідовностей, у придатних організмах-хазяїнах. Такі регуляторні елементи відомі фахівцям у даній галузі техніки; вони включають промотори, сплайсуючі касети й кодони ініціації трансляції.

Методи конструювання молекул нуклеїнових кислот і векторів, які їх містять, методи введення векторів у відповідно обрані клітини-хазяїни й методи ініціювання й забезпечення експресії цих молекул добре відомі в даній галузі техніки.

В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до клітин-хазяїнів, які містять нуклеїнові кислоти або вектори, описані в даному документі.

В іншому своєму аспекті даний винахід відноситься до виявлення СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, або визначення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, з використанням антитіл або антиген-з'єднувального фрагмента, запропонованих даним винаходом. СІ 0ОМ18.2 або клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2, визначають шляхом виявлення або визначення кількості комплексу, утвореного СІ ОМ18.2 і антитілом або антиген-з'єднувальним фрагментом запропонованим даним винаходом.

Утворення такого комплексу вказує на присутність СІ ЮОМ18.2 або клітин, у яких експресується

СІГОМ18.2. Подібне виявлення або визначення кількості може здійснюватися різними шляхами, включаючи імунодетекцію з використанням антитіл або антиген-з'єднувальних фрагментів запропонованих даним винаходом (але не обмежуючись нею). Методи використання антитіл для виявлення пептидів або білків добре відомі; до них відносяться твердофазний імуноферментний аналіз (ЕГІЗА), аналіз конкурентного зв'язування тощо. У принципі в таких методах використовуються антитіла або фрагменти антитіл, що специфічно зв'язуються з мішенню - пептидом або білком, безпосередньо або опосередковано пов'язаним з міткою, що забезпечує виявлення, наприклад з індикаторним ферментом, радіоактивною речовиною, флуорофором або парамагнітними часточками. Способи запропоновані даним винаходом дозволяють якісно й/або кількісно визначити, наприклад вимірювати в абсолютних або відносних одиницях, рівні СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2.

В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способу виявлення СІ ОМ18.2 або визначення кількості СІ ОМ18.2 у зразку, який включає етапи: () контактування зразка з антитілом або антиген-з'єднувальним фрагментом запропонованим даним винаходом або з кон'югатом запропонованим даним винаходом й (і) виявлення утворення комплексу або визначення кількості комплексу, утвореного

СІГОМ18.2 і таким антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом.

В одному із втілень даного винаходу вказаний зразок є клітинним, тобто це зразок, який містить клітини, наприклад ракові клітини. У цьому втіленні комплекс переважно утворюють антитіло, антиген-з'єднувальний фрагмент або кон'югат, з одного боку, і СГ ОМ18.2, який експресується в клітинах зазначеного зразка, з іншого боку.

В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способу визначення експресії

СІ ОМ18.2, який включає етапи: () контактування клітинного зразка з антитілом або антиген-з'єднувальним фрагментом, запропонованими даним винаходом або з кон'югатом запропонованим даним винаходом й (ії) виявлення утворення комплексу, утвореного СІ ОМ18.2, які експресуються в клітинах зазначеного зразка, і антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом.

В одному із втілень даного винаходу клітини зразка є раковими. Комплекс переважно утворюється із СІГОМ18.2, який експресується в клітинах зазначеного зразка, і антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом запропонованими даним винаходом.

В інших своїх аспектах даний винахід відноситься до способів діагностування або класифікування захворювань, в яких використовується СІ ОМ18.2 як мішень та антитіло або антиген-з'єднувальний фрагмент запропоновані даним винаходом. Ці способи забезпечують (610) вибіркове виявлення клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, тим самим дозволяючи відрізнити ці клітини від нормальних клітин, у яких не експресується СІ ЮОМ18.2, або аномальних клітин, у яких не експресується СІ ОМ18.2. Захворювання, які характеризуються тим, що в клітинах, які його зумовлюють експресується СІ ОМ18.2, підлягають лікуванню, під час якого СГ ОМ18.2 служить мішенню, наприклад лікуванню терапевтичними антитілами проти СІ ОМ18.2. Найбільш придатними для такої діагностики або лікування є ті захворювання, при яких має місце експресія або аномальна експресія СІ ОМ18.2, зокрема ракові захворювання, наприклад описані в даному документі.

В одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способів діагностування, виявлення або спостереження за перебігом, тобто визначення регресії, прогресування, динаміки й/або початку, ракового захворювання, які передбачають виявлення СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, і/або визначення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується

СІГОМ18.2, у біологічному зразку, узятому у хворого, за допомогою антитіла або антиген- з'єднувального фрагмента запропонованих даним винаходом. Такі способи можна застосовувати для того, щоб визначити, чи є в пацієнта ракове захворювання або чи підвищений у нього ризик розвитку ракового захворювання, або, наприклад, чи ефективною є схема лікування.

Таким чином, в одному зі своїх аспектів даний винахід відноситься до способу діагностування, виявлення або спостереження раку, який включає етапи: () контактування біологічного зразка з антитілом або антиген-з'єднувальним фрагментом, запропонованими даним винаходом або з кон'югатом запропонованим даним винаходом й (і) виявлення утворення й/або визначення кількості комплексу, утвореного СІ ОМ18.2 і антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом запропонованим даним винаходом.

В одному із втілень даного винаходу біологічний зразок є клітинним зразком, тобто зразком, який містить клітини, наприклад ракові клітини. У цьому втіленні даного винаходу бажано утворюється комплекс із СІОМ18, який експресується в клітинах зазначеного зразка, і антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом запропонованими даним винаходом.

Способи спостереження за перебігом хвороби запропоновані даним винаходом бажано включають виявлення й/або визначення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується

СІГОМ18.2, у першому зразку в перший момент часу й в іншому зразку в інший момент часу, причому регресія, прогресування, динаміка й/або початок пухлинного захворювання можна визначити шляхом порівняння цих двох зразків.

У типовому випадку рівень СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, у біологічному зразку співставляють із деяким рівнем, обраним для порівняння, причому відхилення від цього рівня вказує на наявність або стадію ракового захворювання в даного пацієнта. Рівнем, узятим для порівняння, може бути рівень, визначений у контрольному зразку (наприклад, узятому з нормальної тканини або в здорового індивіда, зокрема в індивіда, який не страждає на рак), або середній рівень за даними для здорових індивідів. Під відхиленням від рівня, узятого для порівняння, розуміють будь-яка значна зміна, наприклад збільшення на щонайменше 1095, 2095 або 3095, бажано щонайменше на 4095 або 5095, або навіть більше.

Переважно присутність СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, і/або збільшення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СГ ОМ18.2, у порівнянні з рівнем, узятим для порівняння, наприклад у порівнянні з індивідом, який не хворіє на рак, указує на наявність або ризик (тобто можливість розвитку) ракового захворювання в даного пацієнта.

Зменшення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, у порівнянні з біологічним зразком, узятим у даного пацієнта раніше, може вказувати на регресію, позитивну динаміку, наприклад на успішність лікування, або на зменшення ризику виникнення ракового захворювання в даного пацієнта.

Збільшення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2, у порівнянні з біологічним зразком, узятим у даного пацієнта раніше, може вказувати на прогресування: негативну динаміку, наприклад на неефективність лікування, рецидив або метастазування, на початок або на ризик виникнення ракового захворювання в даного пацієнта.

В одному із аспектів даний винахід відноситься до способу, який дозволяє визначати, чи підлягає ракове захворювання лікуванню методом з використанням СІ ОМ18.2 як мішені, який включає етапи: (ї) контактування зразка, який містить ракові клітини, з антитілом або антиген-з'єднувальним фрагментом, запропонованими даним винаходом або з кон'югатом запропонованим даним винаходом й

(і) виявлення утворення комплексу з СІОМ18.2 і антитіла, антиген-з'єднувального фрагмента, або кон'югата запропонованих даним винаходом.

Комплекс переважно утворюється із СІ ОМ18.2, який експресується в ракових клітинах зазначеного зразка, і антитілом, антиген-з'єднувальним фрагментом, або кон'югатом запропонованими даним винаходом.

Такі способи можна застосовувати для того, щоб визначити, чи підходить для даного пацієнта лікування, націлене на клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2, наприклад використання антитіл, які проявляють одну або більше імуноефекторних функцій, які наприклад є специфічними до СІГОМ18.2 антитілами, які викликають цитотоксичний ефект, наприклад антитілами, міченими цитотоксичним агентом (токсином або радіоактивним ізотопом), або, які приводять у дію механізми загибелі клітин, наприклад залежну від комплементу цитотоксичність (СОС) або залежну від антитіл клітинно-опосередковану цитоксичність (АОСС). Лікуванню, націленому на СГ ОМ18.2, підлягають захворювання, які характеризуються тим, що в клітинах, які зумовлюють захворювання експресується СІ ОМ18.2, наприклад ракові захворювання, зокрема описані в даному документі.

В одному із втілень даного винаходу в згаданих вище аспектах, зразок, клітинний зразок або біологічний зразок - це зразок, узятий в індивіда з раковим захворюванням, з підозрою на наявність або ймовірність розвитку ракового захворювання. В одному із втілень даного винаходу зразок, клітинний зразок або біологічний зразок беруть із тканини або органа, у клітинах якого за відсутності ракового ураження цієї тканини або органа немає істотної експресії

СІГОМ18.2. Бажано зазначена тканина не є тканиною шлунка. Бажано зазначена тканина є тканиною легенів, стравоходу, підшлункової або молочної залози, причому вже міг бути поставлений діагноз ракового ураження даної тканини або органа, наприклад у результаті огляду або цитологічного дослідження цієї тканини або органа. У цьому втіленні даного винаходу вказівкою на те, що даному індивідові необхідне лікування, націлене на клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2, служить присутність СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується

СІГОМ18.2, і/або збільшення кількості СІ ОМ18.2 або клітин, у яких експресується СІ ЮОМ18.2, у порівнянні з рівнем, узятим для порівняння, наприклад у порівнянні з індивідом, який не має пухлинних захворювань.

В одному з аспектів даного винаходу пропонуються композиції, наприклад діагностичного призначення, або набори, що включають описані в даному документі антитіла або фрагменти, які зв'язують антиген, або комбінація антитіл і/або антиген-з'єднувального фрагмента. Такі діагностичні композиції або набори для аналізу придатні для здійснення способів запропонованих даним винаходом, наприклад способів для діагностування, виявлення або спостереження. Ці набори за необхідності можуть містити мітку, що виявляється, наприклад індикаторний фермент, радіоактивну мітку, флуорофор або парамагнітні часточки. До набору може входити інструкція, яка містить практично корисну інформацію, наприклад відомості про те, як використовувати реагенти для здійснення способу, описаного в даному документі.

Інші ознаки й переваги даного винаходу описані у наведеному нижче розділі "Докладний опис винаходу" і формулі винаходу.

Докладний опис винаходу

Хоча нижче дане винахід описується докладно, слід урахувати, що він не обмежується конкретними методиками, протоколами й реагентами, описаними в даному документі, оскільки вони можуть варіювати. Слід також прийняти до уваги, що термінологія, яка використовується в даному документі, має завданням лише опис конкретних втілень даного винаходу й не повинна обмежувати обсяг даного винаходу, який обмежується тільки прикладеною формулою винаходу. Якщо не вказано іншого, то всі технічні й наукові терміни в даному документі вживаються в тих же значеннях, у яких їх розуміють пересічні фахівці у даній галузі техніки.

Нижче описуються елементи даного винаходу. Ці елементи згадуються у зв'язку з конкретними втіленнями даного винаходу, однак слід урахувати, що їх можна комбінувати будь- яким чином і в будь-якому числі для створення додаткових втілень. Різним чином описані приклади й кращі втілення не слід тлумачити як такі, що обмежують обсяг винаходу тільки конкретно описаними втіленнями. Даний опис слід розуміти як такий, що підтверджує і охоплює втілення даного винаходу, у яких сполучається докладний опис із будь-яким числом описаних або кращих елементів. Також будь-які перестановки й комбінації всіх описаних елементів у даній заявці слід вважати розкритими в даному описі, якщо тільки з контексту не випливає іншого.

Переважно терміни, які вживаються в даному документі мають значення, обумовлені "Багатомовним словником біотехнологічних термінів" - "А тийіПїпдиа! діоззагу ої Біотесппоіодісаї іїептв: (РАС Весоттепааїййоп5)", Н.С.МУ. І епепрегаєг, В. Мадеї, апа Н. Кері, Ед5»., Неїмеїїса

СНітіса Асіа, СН-4010, Базель, Швейцарія (1995).

Практичне здійснення даного винаходу включає, якщо не зазначено іншого, застосування загальноприйнятих хімічних, біохімічних, цитологічних, імунологічних методів і технології рекомбінантних ДНК, освітлених у літературі за даною галуззю техніки (див., наприклад,

Мо!есшаг Сіопіпд: А І арогаїогу Мапиаї!, 274 Едйоп, У. батрбгоок еї а. єав., Соїд бріпа Нагбог

І арогаїогу Ргезв, Соїд Зргіпд Наїбог 1989).

У даному описі й у представленій формулі винаходу, якщо з контексту не випливає іншого, дієслово "містити" і його похідні такі як "який включає" "містить" означають, що зазначений компонент, число або етап або група компонентів, чисел або етапів включаються, але при цьому не виключаються які-небудь інші компоненти, числа або етапи або групи компонентів, чисел іди етапів, хоча в деяких втіленнях даного винаходу такі інші компоненти, числа або етапи або групи компонентів, чисел або етапів можуть виключатися, тобто істотним є включення зазначеного компонента, числа йди етапу або групи компонентів, чисел або етапів. У контексті опису даного винаходу (і особливо в контексті формули винаходу) слова зазначені в однині мають охоплюють як однину, так і множину, якщо тільки не зазначено або з очевидністю не випливає з конкретного контексту інше значення). Наведені в даному документі діапазони значень тієї або іншої величини служать лише для стислості позначення всього набору окремих значень у межах зазначеного діапазону. Кожне із цих окремих значень включається до даного опису, як ніби воно було зазначено буквально (якщо не вказане інше). Усі описані в даному документі способи можна здійснювати в будь-якому зручному порядку, якщо інше не зазначене або не випливає з очевидністю з конкретного контексту. Використання в даному документі прикладів або виразів типу "наприклад", "такі як що переслідує лише мету ілюстрації й не носить обмежувального характеру відносно обсягу даного винаходу, якщо тільки не заявлене інше. Ніякі вирази в даному документі не слід розуміти як такі, що указують на не заявлені елементи, істотні для практичного здійснення даного винаходу.

У даному описі цитується ряд документів. Кожний з них (включаючи всі патенти, патентні заявки, наукові публікації, інструкції й опису виробників тощо) як вище, так і нижче за текстом повністю включається до даного документу шляхом посилання. Ніщо в даному документі не дає підстав для допущення, що даний винахід не має права включати заднім числом такі описи в силу більш раннього створення даного винаходу.

Термін "рекомбінантний" у контексті даного винаходу означає такий, що його "отримано/створено методом генетичної інженерії". У контексті даного винаходу рекомбінантний об'єкт, наприклад рекомбінантні клітини, переважно не існують в природі.

Вираз "існує/зустрічається в природі" або "природний" у даному документі відноситься до того факту, що даний об'єкт можна знайти в природніх умовах у природі. Наприклад, пептиди або нуклеїнові кислоти, які присутні в організмі (включаючи віруси) і можуть бути виділені із природного джерела, а не були навмисно модифікованими людьми в лабораторних умовах, є природними/такими, що зустрічаються в природі.

Термін "антиген" відноситься до агентів, які містять епітоп, проти якого виникає й/або спрямовується імунна відповідь. У контексті даного винаходу антиген - це краща речовина, яка, за необхідності після деяких перетворень, викликає імунологічну реакцію, переважно спрямовану проти цього антигену. Термін "антиген" включає, зокрема, білки, пептиди, полісахариди, нуклеїнові кислоти, у тому числі РНК і ДНК, і нуклеотиди.

Термін "епітоп" відноситься до антигенної детермінанти в молекулі, тобто до тієї її частини, яка розпізнається імунною системою, наприклад, розпізнається антитілами. Наприклад, епітопами є дискретні організовані в трьох вимірах сайти в молекулі антигену, які розпізнаються імунною системою. Епітоп звичайно складається з хімічно активних груп, які розташовуються на поверхні молекули, наприклад амінокислотних залишків або бічних ланцюгів цукрів; епітоп, як правило, має специфічні особливості просторової структури, а також специфічні електричні властивості (заряд). Розрізняють конформаційні й неконформаційні епітопи: перші, на відміну від других, зникають у присутності денатуруючих агентів. Епітоп білка, наприклад клаудину, переважно є безперервною або складеною ділянкою поліпептидного ланцюга довжиною бажано від 5 до 100, краще від 5 до 50, ще краще від 8 до 30, най краще від 10 до 25 амінокислотних залишків; наприклад, епітоп може бути довжиною бажано 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 або 25 амінокислотних залишків.

Термін "складний/дискретний/не безперервний епітоп" у даному документі означає конформаційний епітоп білкового антигену, утворений щонайменше двома не сусідніми ділянками первинної структури (амінокислотної послідовності) даного білка. (610) В одному із кращих втілень даного винаходу антиген є асоційованим з пухлиною, наприклад це СГОМ18.2, тобто компонент ракових клітин, який походить із цитоплазми, клітинної поверхні або ядра, зокрема це може бути антиген, який у великій кількості утворюється переважно всередині або на поверхні ракової клітини.

У контексті даного винаходу термін "антиген, асоційований з пухлиною" або "пухлинний антиген" відноситься до білків, які в нормі експресуються специфічно - тільки в обмеженому числі тканин і/або органів або на певній стадії розвитку, наприклад антиген, асоційований з пухлиною, у нормі експресується в тканині шлунка, переважно в слизовій шлунка, у репродуктивних органах, наприклад у яєчках, у трофобластній тканині (наприклад, у плаценті) або в клітинах зародкової лінії, і експресується або аномально експресується в одній або більше пухлинах або ракових тканинах. У цьому контексті вираз "тільки в обмеженому числі" бажано означає "не більше ніж у трьох", ще краще "не більше ніж у двох". У контексті даного винаходу антигени, асоційовані з пухлинами, включають, наприклад, диференціювальні антигени, переважно диференціювальні антигени, специфічні відносно типу клітин, тобто білки, які в нормі експресуються тільки в клітинах певного типу; ракові/тестикулярні антигени, тобто білки, які в нормі експресуються в яєчках та іноді в плаценті; і антигени, специфічні для клітин зародкової лінії. У контексті даного винаходу антиген, асоційовані з пухлинами, переважно пов'язані з поверхнею ракових клітин і бажано не експресуються або рідко експресуються в нормальних тканинах. Бажано ракові клітини ідентифікуються за антигенами, асоційованими з пухлинами, або за аномальною експресією антигенів, асоційованих з пухлинами. У контексті даного винаходу асоційований з пухлинами антиген, який у даного індивіда, наприклад у хворого на рак, експресується в ракових клітинах, є власним білком організму даного індивіда. У кращих втіленнях даного винаходу антигени, асоційовані з пухлинами, у нормі експресуються тільки в органах або тканинах, які не є абсолютно необхідними, тобто в тих органах або тканинах, ураження яких імунною системою не призведе до смерті індивіда, або в тих органах або тканинах, або структурах організму, які не доступні або лише незначною мірою доступні для імунної системи. Бажано амінокислотні послідовності антигену, асоційованого з пухлиною, який експресується в нормальних тканинах, і антигену, асоційованого з пухлиною, який експресується в раковій тканині, ідентичні.

Прикладами диференціювальних антигенів, які задовольняють критеріям антигену, асоційованого з пухлиною, як мішені протипухлинної імунотерапії, зокрема протипухлинної вакцинації, є білки клітинної поверхні із родини клаудинів, наприклад СІ ОМ18.2. Клаудини - це родина білків, які є найбільш важливими компонентами щільних контактів, що створюють параклітинний бар'єр, який регулює потік речовин у міжклітинному просторі епітелію. Клаудини є трансмембранними білками, поліпептидний ланцюг яких чотири рази перетинає мембрану, причому М- і С-кінці її розташовуються в цитоплазмі.

Назва "клаудин 18" або "СІ ОМ18" переважно відноситься до людського білка СГ ОМ18, включаючи будь-які його сплайс-варіанти, наприклад СІГОМ18.1 ї СІ ОМ18.2. СІ ОМ18.1 і

СГ ОМ18.2 відрізняються в М-кінцевій області, яка містить перший трансмембранний домен і першу петлю, а первинна структура (амінокислотна послідовність) С-кінцевої частини в цих двох білків однакова.

Позначення "СГ ОМ18.1" переважно відноситься до людського білка СІ ОМ18.1, зокрема до білка, який містить амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності «ЕС ІЮ МО: 1 (див. перелік послідовностей) або варіанту зазначеної амінокислотної послідовності.

Позначення "СІ 0ОМ18.2" переважно відноситься до людського білка СІ ОМ18.2 зокрема до білка, який містить амінокислотну послідовність, яка відповідає послідовності ЗЕО ІЮ МО: 2 (див. перелік послідовностей) або варіанту зазначеної амінокислотної послідовності.

Термін "варіант" відповідно до даного винаходу відноситься, зокрема, до мутантних форм, сплайс-варіантів, конформаційних варіантів, ізоформ, алельних варіантів, видових варіантів і видових гомологів, які зокрема існують у природі. Термін "алельний варіант" відноситься до змін нормальної нуклеотидної послідовності гена, значення яких найчастіше неясне. Визначення повної нуклеотидної послідовності гена нерідко виявляє його численні алельні варіанти. Термін "видовий гомолог" означає нуклеотидну або амінокислотну послідовність, наявну у виду живих організмів, відмінного від виду - джерела даної нуклеотидної або амінокислотної послідовності.

Позначення "СІ ОМ", "СС ОМ18", "СГ ОМ18.1" ї "ССОМ18.2" охоплюють будь-які варіанти, які виникають у результаті посттрансляційної модифікації, і конформаційні варіанти.

У нормі СІ ОМ18.2 експресується тільки в диференційованих епітеліальних клітинах слизової шлунка. СГОМ18.2 експресується в ракових пухлинах різного походження, і завдяки вибірковості експресії (у тканинах, які зазнають токсичної дії терапевтичного агента, експресія відсутня) і локалізації в плазматичній мембрані цей білок представляє особливо придатну мішень для (610) опосередкованої антитілами протиракової імунотерапії. Наприклад, експресія СІГОМ18.2 виявлена в карциномі підшлункової залози, карциномі стравоходу, карциномі шлунка, карциномі бронхів, карциномі молочної залози й пухлинах ЕМТ. СІОМ18.2 є цінною мішенню для запобігання й/або лікування первинних пухлин при ракові шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів (у тому числі при недрібноклітинному ракові легенів), яєчника, товстої кишки, печінки, при ракових пухлинах голови й шиї, ракових ураженнях сечового міхура та їх метастазах, зокрема при метастазах раку шлунка. Наприклад, пухлинах Крукенберга, перитонеальних метастазах і метастазах у лімфатичних вузлах. Клітини, в яких експресується

СГ ОМ18.2, переважно є раковими, обраними, зокрема, із групи, яка складається з туморогенних клітин шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчника, товстої кишки, печінки, голови й шиї, сечового міхура.

Клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2, за даним винаходом, бажано відрізняються тим, що СГОМ18.2 пов'язаний з мембраною й локалізований на поверхні клітини, тобто СІ ОМ18.2 асоційований із клітинною поверхнею. Також, клітинний СІ ОМ18.2 за даним винаходом бажано пов'язаний з поверхневою мембраною клітини. Клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2 або клітини, що відрізняються зв'язком СІ ОМ18.2 із клітинною поверхнею, переважно є раковими, бажано клітинами, які обумовлюють ракові захворювання, описані в даному документі.

Вираз "асоційований/пов'язаний із клітинною поверхнею" означає, що антиген, асоційований з пухлиною, наприклад СІГОМ18.2, локалізований на плазматичній мембрані клітини й пов'язаний з нею, причому щонайменше частина молекули антигену, асоційованого з пухлиною, розташовується із зовнішньої сторони даної клітини (у позаклітинному просторі) і доступна зовні, наприклад для антитіл, які перебувають поза клітиною. У цьому сенсі є бажаним, щоб позаклітинна частина антигену складалася із щонайменше чотирьох, бажано щонайменше з 8, краще щонайменше з 12, ще краще щонайменше з 20 амінокислотних залишків. Зв'язок антигену із клітинною поверхнею може бути безпосереднім або ж опосередкованим. Наприклад, цей зв'язок може здійснюватися за рахунок одного або більше трансмембранних доменів, або за допомогою одного або більше ліпідних якірних структур, або шляхом взаємодії з іншим білком, ліпідом, сахаридом або іншою структурою, яка присутня у зовнішньому шарі плазматичної мембрани клітини. Наприклад, асоційований з пухлиною антиген, пов'язаний із клітинною поверхнею, може бути трансмембранним білком, частина якого розташована поза клітиною, або білком, пов'язаним із клітинною поверхнею в результаті взаємодії з іншим білком, який є трансмембранним.

Термін "клітинна поверхня" або "поверхня клітини" уживається в даному документі відповідно до його загальноприйнятого у даній галузі техніки значення й включає зовнішню сторону клітини, доступну для зв'язування з білками й іншими речовинами.

Відповідно до даного винаходу експресія СІ ОМ18.2 у клітинах і зв'язок із клітинною поверхнею є несуттєвими, якщо рівні експресії й цього зв'язку перевищують такі в неракових тканинах, відмінних від тканини шлунка, не більше ніж удвічі, краще в півтора рази, і бажано не перевищують рівні експресії й зв'язку із клітинною поверхнею в зазначених неракових тканинах.

Бажано експресія СІ ОМ18.2 у клітинах і зв'язок із клітинною поверхнею є несуттєвими, якщо рівні експресії й цього зв'язку нижчі від межі детекції й/(або якщо зазначені рівні є занадто низькими, щоб відбувалося зв'язування доданих до клітин антитіл, специфічних у відношенні

СІ ОМ18.2.

Відповідно до даного винаходу експресія СІ ОМ18.2 у клітинах і зв'язок із клітинною поверхнею мають місце, якщо рівні експресії й цього зв'язку перевищують такі в неракових тканинах, відмінних від тканини шлунка, бажано більше ніж удвічі, краще в 10, 100, 1000 або 10 000 разів. Бажано експресія СІ ОМ18.2 у клітинах і зв'язок із клітинною поверхнею мають місце, якщо рівні експресії й цього зв'язку вищі від межі детекції й/або якщо зазначені рівні досить високі, щоб відбувалося зв'язування доданих до клітин антитіл, специфічних у відношенні

СІ ОМ18.2.

Термін "антитіло" відноситься до глікопротеїнів, які містять щонайменше два важкі (Н) ланцюги й два легкі (Г), з'єднаних дисульфідними зв'язками, і включає будь-яку речовину, яка містить ділянку, що зв'язує антиген. Термін "антитіло" включає моноклональні антитіла й фрагменти або похідні антитіл, у тому числі (не обмежуючись перерахованим тут) людські антитіла, гуманізовані антитіла, химеризовані антитіла, одноланцюгові антитіла, наприклад 5СЕм, і фрагменти, які зв'язують антиген, наприклад Раб і Раб", а також усі рекомбінантні форми антитіл, наприклад антитіла, які експресуються у прокаріот, неглікозильовані антитіла й будь-які з'єднувальні антиген фрагменти й похідні антитіл, описані в даному документі. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області (скорочено позначається МН) і константної області.

Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області (скорочено позначається МІ) і 10) константної області. Області МН апа Мі. можна далі підрозділити на гіперваріабельні ділянки, які називаються ділянками, що визначають комплементарність (СОК), які чергуються з більш консервативними ділянками, які називаються каркасними (ЕК). У кожній з областей МН і МІ. є три ділянки СОК і чотири ділянки ЕК, які розташовуються, починаючи від М-кінця до С-кінця ланцюга, у наступному порядку: ЕКТ, СОКІ, ЕК2, СОК2, ЕКЗ, СОКЗ, ЕКА4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять з'єднувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні області можуть брати участь у зв'язуванні молекул імуноглобулінів із тканинами або з якими- небудь факторами, включаючи різні клітини імунної системи (наприклад, ефекторні клітини) і перший компонент системи комплементу (СІд).

Антитіла, описані в даному документі, можуть бути людськими антитілами. Термін "людські антитіла" означає тут антитіла, варіабельні й константні області яких походять (із послідовностей імуноглобулінів людських клітин зародкової лінії. Людські антитіла відповідно до даного винаходу можуть містити амінокислотні залишки, яких немає в послідовностях імуноглобулінів людських клітин зародкової лінії (наприклад, у результаті мутацій, викликаних шляхом випадкового або сайт-специфічного мутагенезу іп міго або шляхом соматичних мутацій іп мімо).

Термін "гуманізовані антитіла" відноситься до імуноглобулінів, у яких сайт зв'язування антигену походить в основному з антитіл видів, відмінних від людини, а в іншій своїй частині дане антитіло має структуру й/або послідовність людського імуноглобуліну. Сайт зв'язування антигену може містити або варіабельні домени повністю, злиті з константними доменами, або тільки ділянки, які визначають комплементарність (СОК), пересаджені на відповідні каркасні ділянки варіабельних доменів. Сайти зв'язування антигену можуть бути дикого типу або ж модифікованими шляхом однієї або більше замін амінокислотних залишків, наприклад модифіковані так, щоб більше походити на людські імуноглобуліни. У деяких формах гуманізованих антитіл зберігаються всі послідовності СОК (наприклад, гуманізоване мишаче антитіло, яке містить усі шість СОК мишачого антитіла). Інші форми гуманізованих антитіл містять один або більше СОР, змінених відповідно до вихідного антитіла.

Термін "химерне антитіло" відноситься до антитіл, у молекулах яких одна частина амінокислотної послідовності кожного з важких і легких ланцюгів є гомологічною до відповідних послідовностей в антитілах живих організмів, дюерелом походження яких є певний вид, або які належать до певного класу, а інша частина цього ланцюга є гомологічною до відповідних послідовностей в антитілах іншого виду або класу. Зазвичай варіабельні області як у легких, так і у важких ланцюгах молекули антитіла імітують варіабельні області антитіл, джерелом походження яких є один вид ссавців, а константні ділянки гомологічні до послідовностей антитіл, джерелом походження яких є інший вид. Одним з очевидних переваг таких химеризованих форм є та зручність, що варіабельну область можна "брати" з відомих на сьогоднішній день джерел, використовуючи легко доступні В-клітини або гібридоми з організмів, відмінних від людини, і скомбінувати її з константними областями, "узятими" з, наприклад, препаратів людських клітин. Варіабельну область порівняно легко одержати, і на її специфічність не впливає джерело, а константна область, будучи людською, викличе імунну відповідь у людини, якій увели такі антитіла, з меншою ймовірністю, ніж константна область із іншого джерела (не людського походження). Втім, наведене визначення не обмежується цим конкретним прикладом.

Термін "антиген з'єднувальна ділянка" молекули антитіла (або просто "з'єднувальна ділянка") або "антиген-з'єднувальний фрагмент" антитіла (або просто "з'єднувальний фрагмент") відноситься до одного або більше фрагментів молекули антитіла, яким властива здатність специфічно зв'язуватися з антигеном. Показано, що така функція антитіла, як зв'язування антигену, може здійснюватися не всією молекулою антитіла, а певними його частинами. Приклади з'єднувальних фрагментів молекули антитіла, які охоплюються терміном "антиген з'єднувальна ділянка", включають: (ї) Рар-фрагменти - моновалентні фрагменти, які складаються із доменів МІ, МН, СІ ї СН; (ії) Е(абБ)г2-фрагменти - бівалентні фрагменти, які складаються із двох фрагментів Ра, з'єднаних дисульфідним містком у шарнірній ділянці; (іїї) Ба-

Фрагменти, які складаються із доменів МН і СН; (ім) Ем-фрагменти, які складаються із доменів МІ. і МН однієї руки молекули антитіла; (м) дАБ-фрагменти (Умага еї а!., (1989) Майшге 341: 544-546), які складаються з домена МН; (мі) ізольовані ділянки, які визначають комплементарність (СОК) і (мії) комбінації із двох або більше ізольованих СОК, які за необхідності можуть бути з'єднані синтетичним лінкером. Також, хоча два домени фрагмента Ем - МІ ї МН - кодуються різними генами, вони можуть бути з'єднані (з використанням методів рекомбінантної ДНК) синтетичним лінкером, завдяки якому вони утворюють єдиний поліпептидний ланцюг, у якому пари ділянок

МІ. ї МН формує моновалентну молекулу; такі форми відомі під назвою одноланцюгових Ем- 6о0 Фрагментів (5сЕм); див., наприклад, Віга еї аї. (1988) Зсіеєпсе 242: 423-426; апа Нивіюоп еї а).

(1988) Ргос. Маї!. Асад. 5сі. ОБА 85: 5879-5883). Такі одноланцюгові антитіла теж охоплюються терміном "антиген-з'єднувальний фрагмент" антитіла. Інший приклад - злиті імуноглобулінові білки, які включають (ї) поліпептид, який утворює з'єднувальний домен і злитий з поліпептидом, який утворює шарнірну ділянку молекули імуноглобуліну, (її) константну область важкого ланцюга СН2, злиту із шарнірною ділянкою, і (ії) константну область важкого ланцюга СНЗ, злиту з константною областю СН2. Поліпептид, який утворює з'єднувальний домен, може бути варіабельною областю важкого або легкого ланцюга. Такі злиті імуноглобулінові білки, які містять з'єднувальний домен, також описані в заявках на патент США МоМо 2003/0118592 і 2003/0133939. Ці фрагменти антитіл одержують стандартними методами, відомими фахівцям у даній галузі техніки, і перевіряють їхні властивості, які передбачається використовувати, у такий же спосіб, як у випадку інтактних антитіл.

Антитіла, описані в даному документі, можуть бути моноклональними антитілами. Термін "моноклональні антитіла" тут відноситься до препаратів антитіл одного молекулярного складу. У моноклональних антитіл однакова специфічність і спорідненість зв'язування. В одному із втілень даного винаходу моноклональні антитіла продукуються гібридомами, отриманими від злиття В-клітин будь-якої тварини (не людини), наприклад миші, і безсмертних клітин.

Антитіла, описані в даному документі, можуть бути рекомбінантними антитілами. Термін "рекомбінантні антитіла" тут охоплює всі антитіла, які отримані, експресуються, створені або виділені з рекомбінантного виду, наприклад (а) антитіла, виділені з тварини (наприклад, миші), яка є трансгенною або трансхромосомною за генами імуноглобулінів, або з гібридом, отриманих з використанням такої тварини, (б) антитіла, виділені із клітин-хазяїв, трансформованих для експресії цих антитіл, наприклад із трансфектом, (с) антитіла, виділені з комбінаторної бібліотеки антитіл, і (4) антитіла, які отримані, експресовані, створені або виділені будь-якими іншими шляхами з використанням сплайсингу нуклеотидних послідовностей генів імуноглобулінів з іншими послідовностями ДНК.

Термін "трансфектома" у даному документі охоплює рекомбінантні еукаріотичні клітини- хазяїни, в яких експресуються антитіла, наприклад клітини СНО, М5/О, НЕК293, НЕК293Т, рослинні клітини або клітини грибів, включаючи дріжджові клітини.

Термін "гетерологічні антитіла" у даному документі визначається стосовно трансгенного організму, який продукує такі антитіла. Цей термін відноситься до антитіл, амінокислотна послідовність або нуклеотидна послідовність, яка кодує її, яких відповідає наявній в організмі, що не є даним трансгенним організмом, і видове походження якого є іншим, ніж даного трансгенного організму.

Термін "гетерогібридні антитіла" у даному документі відноситься до антитіл, у яких легкі й важкі ланцюги походять із різних організмів. Наприклад, гетерогібридним є антитіло, яке має людські важкі ланцюги й мишачі легкі ланцюги.

Даний винахід включає всі описані в даному документі антитіла й похідні антитіл, які для цілей даного винаходу охоплюються терміном "антитіло". Термін "похідні антитіла" відноситься до будь-яких модифікованих форм даного антитіла, наприклад до його кон'югатів з іншим агентом або антитілом, або фрагментом антитіла.

Антитіла, описані в даному документі, бажано є ізольованими (виділеними). Визначення "Іольоване/виділене" слід розуміти так, що даний препарат антитіла не містить інших антитіл іншої антигенної специфічності. Також ізольовані антитіла в основному не містять іншого клітинного матеріалу і/або хімічних речовин.

Відповідно до даного винаходу антитіло здатне зв'язуватися з певною мішенню, якщо воно має значну спорідненість до цієї мішені й зв'язування з нею відбувається за умов стандартного аналітичного методу. Величина спорідненості або спорідненості зв'язування часто вимірюється константою рівноваги реакції дисоціації (Ко). Бажано термін «значна спорідненість» відноситься до зв'язування з певною мішенню, що характеризується константою дисоціації (Ко) 105 М або менше, 105 М або менше, 107 М або менше, 108 М або менше, 109 М або менше, 10-79 М або менше, 10-! М або менше, 10-72 М або менш.

Антитіло не здатне (власне) зв'язуватися з мішенню, якщо воно не має значної спорідненості до цієї мішені й у значній мірі з ним не зв'язується, зокрема не зв'язується так, щоб це можна було виявити стандартними аналітичними методами. Переважно зв'язування антитіла з певною мішенню не виявляється, якщо воно присутнє в концентрації до 2, бажано 10, ще краще 20, зокрема 50 або 100 мкг/мл або більше. Бажано антитіло не має значної спорідненості до мішені, якщо його зв'язування із цією мішенню характеризується константою дисоціації (Ко), щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 107 рази, 105 разів або 106 разів більшою, ніж Ко, який характеризує зв'язування даного антитіла з певною мішенню, з якою воно 10) здатне зв'язуватися. Наприклад, якщо Ко зв'язування антитіла з мішенню, з якою воно здатне зв'язуватися, становить 10- М, то Ко зв'язування даного антитіла з мішенню, до якої воно не має значної спорідненості, складе щонайменше 105 М, 105 М, 102 М, 103 М, 102 М або 107 М.

Антитіло є специфічним до певної мішені, якщо воно здатне зв'язуватися із цією мішенню, але не здатне зв'язуватися з іншими мішенями, тобто не має значної спорідненості до інших мішеней і не зв'язується значною мірою з іншими мішенями в стандартних аналітичних методах.

Відповідно до даного винаходу антитіло є специфічним до клаудину 18.2 (СІ ОМ18.2), якщо воно здатне зв'язуватися із цим білком, але не здатне (власне) зв'язуватися з іншими мішенями, зокрема з білками, відмінними від клаудинів, бажано відмінними від клаудинів 18, зокрема від

СІ ОМ18.2. Бажано антитіло є специфічним до СІ 0ОМ18.2, якщо спорідненість до інших таких мішеней і зв'язування з ними суттєво не перевищує спорідненості і зв'язування у випадку не споріднених до клаудинів білків, наприклад бичачого сироваткового альбуміну (В5А), казеїну, людського сироваткового альбуміну (НЗА) або трансмембранних білків, відмінних від клаудинів, наприклад молекул МНС або рецептора трансферину, або будь-яких інших відомих поліпептидів. Бажано антитіло є специфічним до певної мішені, якщо його зв'язування з нею характеризується Ко, який щонайменше в 10 разів, 100 разів, 103 рази, 107 рази, 105 разів або 105 разів менше, ніж Ко зв'язування з мішенню, до якої дане антитіло не специфічне.

Наприклад, якщо зв'язування даного антитіла з мішенню, до якої воно є специфічним, характеризується Ко 107 М, то Ко зв'язування даного антитіла з мішенню, до якої воно не є специфічним, складе щонайменше 105 М, 102 М, 107 М, 109 М, 102 М або 107 М.

Зв'язування антитіла з мішенню можна визначити експериментально, застосовуючи будь- який придатний метод; див., наприклад, Веггої5Ку еї аї., "Апіроду-Апіїдеп Іпіегасіопе" п

Еипдатепіа! Іттипоіоду, Раш, МУ. Е., ЕЯ., НБамеп Ргеб55 Мем мок, М М (1984), Кибу, 9Уапів

Іттипоіоду, МУ. Н. Егеетап апа Сотрапу Мем мМоїк, М М (1992), і методи, описані в даному документі. Спорідненість неважка визначити за допомогою загальноприйнятих методик, наприклад шляхом рівноважного діалізу; за допомогою системи ВіАсоге 2000, дотримуючись інструкцій виробника; шляхом радіоіїмунологічного аналізу з використанням радіоактивно міченого антигену-мішені; або будь-яким іншим способом із числа відомих фахівцям у даній галузі техніки. Дані щодо спорідненості можна аналізувати, наприклад, методом, описаним у роботі 5саїснага еї аї., Апп М.У. Асайд. зсі, 51:660 (1949). Результат вимірювання спорідненості для взаємодії конкретних антигену й антитіла може варіювати залежно від умов, наприклад концентрації солей і рН. Тому вимірювати спорідненість або інші параметри зв'язування антигену, наприклад Ко і ІСво, бажано з використанням стандартизованих розчинів антитіла й антигену, а також буферних розчинів.

У даному документі термін "ізотип" відноситься до класу антитіл (наприклад, ДМ або Ідс1), які кодуються генами константної області важких ланцюгів. Антитіла запропоновані даним винаходом включають поліклональні або моноклональні антитіла Ідс2а (наприклад, Ідсга, к, А),

ІЧе26р (наприклад, Ідс2Б, к, А), (93 (наприклад, доз, к, А) і ДМ. Але інші ізотипи антитіл теж охоплюються обсягом даного винаходу, у тому числі Іде, ІДА1, ІдАг, секреторні ІдА, дО і ЧЕ.

У даному документі термін "перемикання ізотипів" відноситься до явища, яке полягає в тому, що клас/ізотип антитіл змінюється з одного на інший клас імуноглобулінів (19).

Термін "перебудований" у даному документі відноситься до конфігурації локусу важких або легких ланцюгів імуноглобулінів, коли сегмент М розташовується в безпосередньому сусідстві із сегментом 0-.) або .) у конформації, яка кодує в основному цілий домен МН або Мі. відповідно.

Перебудований генний локус імуноглобулінів (антитіл) можна ідентифікувати шляхом порівняння із ДНК зародкової лінії у перебудованому локусі є щонайменше один рекомбінантний гомологічний елемент гептамер/нонамер.

Терміни "не перебудований" або "конфігурація зародкової лінії" відносно до сегмента М у даному випадку відносяться до такої конфігурації, коли сегмент М не зазнавав рекомбінації, у результаті якої він виявлявся б у безпосередньому сусідстві із сегментом 0 або .).

Відповідно до даного винаходу антитіла можуть мати різне видове походження, у тому числі бути (не обмежуючись перерахованим тут) мишачими, щурячими, кролячими, морської свинки й людськими. Антитіла також включають гібридні молекули, у яких константна область, яка походить від одного виду, бажано людини, скомбінована із сайтом зв'язування антигену іншого виду живих організмів. Також антитіла включають гуманізовані антитіла, у яких сайт зв'язування антигену не людського походження скомбінований з людськими константною й каркасною областями.

Антитіла можна робити різними способами, включаючи звичайний метод одержання моноклональних антитіл, наприклад стандартну методику гібридизації соматичних клітин (див.

Копіег апа Мміїстеїп, Маїиге 256: 495 (1975). Метод гібридизації соматичних клітин є кращим, але, (610) у принципі, можна застосовувати й інші способи одержання моноклональних антитіл, наприклад шляхом вірусної або онкогенної трансформації В-лімфоцитів або методом фагового дисплея з використанням бібліотек генів антитіл.

Кращою тваринною системою для одержання гібридом, які секретують моноклональні антитіла, є мишача. Одержання гібридом з використанням мишей добре розроблене. Протоколи імунізації й методики виділення спленоцитів для злиття відомі у даній галузі техніки. Також відомі клітини, які є придатними для злиття (наприклад, мишачі мієломні клітини) і методики злиття.

До кращих тваринних систем для одержання гібридом, які секретують моноклональні антитіла, належать щуряча й кроляча системи (наприклад, описані в роботі ЗріеКег-Роїеї еї аї.,

Ргос. Маї!. Асад. сі. 0О.5.А. 92:9348 (1995); див. також Козві еї аїЇ.,, Ат. 9. Сіїп. Райої. 124: 295 (2005)).

В іншому кращому втіленні даного винаходу, людські моноклональні антитіла проти клаудину 18.2 одержують за допомогою трансгенних або трансхромосомних мишей, які несуть елементи імунної системи людини. У числі таких трансгенних і трансхромосомних мишей -- лінії

НиМАБ ї КМ, відповідно; у даному документі вони разом називаються трансгенними мишами.

Використовуючи таких трансгенних мишей, можна одержати людські антитіла так, як це докладно описано для СО20 у публікації УМО 2004035607.

Інший підхід до створення моноклональних антитіл - безпосереднє виділення генів, які кодують антитіла, з лімфоцитів, які продукують антитіла певної специфічності; див., наприклад, роботу ВарсоскК еї аї., 1996. А поме! 5ігаїеду тог депегаїйпд топосіопа! апіїродієз їот віпдіє, ізоїаїеєа Іутрпосуїе5з ргодисіпд апіродіе5 ої аеїйпей 5ресіїйсйе5. Докладно про створення рекомбінантних антитіл див. також УуеІ5спої апа Ктгаи5, Кесотбіпапі апіїродез ог сапсег ІШегару

ІБВМ-0-89603-918-8 і Веппу К.С. І о Апіїбоду Епдіпеегіпу ІЗВМ 1-58829-092-1.

Щоб одержати антитіла до клаудину 18.2, мишей можна імунізувати кон'югатами носія з пептидами, джерелом походження яких є амінокислотна послідовність СІ ОМ18.2, збагачена препаратом антигену СГОМ18.2, який рекомбінантно експресується або його фрагментів і/або клітинами, у яких експресується СІ ОМ18.2 або його фрагментами, як описано в даному документі, або ж мишей можна імунізувати ДНК, яка кодує повністю весь людський СІ ОМ18.2 або його фрагменти. У випадку, якщо імунізація очищеним або збагаченим препаратом антигену СГОМ18.2 не призводить до утворення в мишей антитіл, для стимуляції імунної відповіді їх можна також імунізувати клітинами, у яких експресується СІ ОМ18.2, наприклад якої- небудь клітинної лінії.

Імунну відповідь можна відслідковувати в процесі й після імунізації за зразками плазми й сироватки крові, узятим із хвостової вени або з ретроорбітального венозного сплетіння. Для злиття клітин беруть клітини мишей, у яких досить високий титр імуноглобулінів проти

СІГОМ18.2. Таким тваринам за 3-5 доби до забивання й видалення селезінки для посилення імунної відповіді вводять внутрішньовенно або внутрішньоочеревинно клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2, що підвищує вихід гібридом, які секретують специфічні антитіла.

Для створення гібридом, які продукують моноклональні антитіла проти СІ ОМ18.2, клітини лімфатичних вузлів, селезінки або кісткового мозку, узяті в імунізованих мишей, зливають із безсмертними клітинами придатної лінії, наприклад лінії мишачих мієломних клітин. Отримані гібридоми перевіряють на продукування антитіл, специфічних до даного антигену. Комірки перевіряють на наявність гібридом, які секретують потрібні антитіла, шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІБА). Антитіла, які проявляють специфічність до СІ ОМ18.2, ідентифікують шляхом сортування клітин за флуоресцентними мітками (БАС5) і прямої імунофлуоресценції, використовуючи клітини, у яких експресується СІ ОМ18.2. Гібридоми, які секретують потрібні антитіла збирають, знову перевіряють, і ті, для яких підтвердилося продукування моноклональних антитіл, специфічних до СІ 0ОМ18.2, субклонують, застосовуючи метод граничних розведень. Стабільні субклони культивують іп міїго, так, що потрібні антитіла попадають у культуральне середовище, звідки їх можна виділити й охарактеризувати.

Антитіла запропоновані даним винаходом також можуть бути отримані в трансфікованих клітинах-хазяїнах, шляхом застосування комбінації технології рекомбінантної ДНК і методів трансфекції генів, добре відомих у даній галузі техніки (Моїтізоп, 5. (1985) 5сієепсе 229: 1202).

Наприклад, в одному із втілень даного винаходу, потрібний ген (гени), наприклад гени антитіл, можуть бути вставлені в експресійний вектор, наприклад плазміду еукаріотичної клітини, як це робиться, наприклад, в експресійній системі гена глутамінсинтетази (5), описаній в публікаціях УМО 87/04462 і УМО 89/01036, а також у Європейському патенті Мо 338841, або в інших експресійних системах, відомих у даній галузі техніки. Очищені плазміди із клонованими генами антитіл можна ввести в еукаріотичні клітини-хазяїни, наприклад у клітини 10) СНО, М5/0О, НЕК293Т або НЕК293, або ж в інші еукаріотичні клітини, наприклад у клітини рослинного походження або в клітини грибів, включаючи дріжджі. Для введення зазначених генів може застосовуватися метод із числа описаних у даній галузі техніки, наприклад електропорація, трансфекція з ліпофектином або ліпофектаміном, або будь-якого іншого. Після введення генів антитіл до клітин-хазяїнів, останні перевіряють на наявність антитіл і відбирають клітини, у яких експресуються введені гени. Ці клітини є трансфектомами, у яких можна підвищити рівень експресії, щоб культивувати в потрібній кількості для одержання антитіл. З культурального супернатанта й/або клітин виділяють рекомбінантні антитіла й очищають їх.

Експресію клонованих генів антитіл можна здійснювати й в інших експресійних системах, у тому числі в прокаріотичних клітинах, наприклад таких мікроорганізмів, як Е. соїї. Також зазначені антитіла можуть продукуватися трансгенними тваринами, наприклад у складі молока в овець і кроликів або в складі яєць у курей, або ж трансгенними рослинами; Див., наприклад,

Метта, В., еї а). (1998) У. Іттипої. Мей. 216: 165-181; РоПоскК, еї аї. (1999) 9. Іттипої. Мей. 231: 147-157; апа РізсНег, В., єї а). (1999) ВіоЇ. Снет. 380: 825-839.

Химерні антитіла - це такі антитіла, у яких різні частини молекули походять від різних видів, наприклад варіабельна область є мишачою, а константна - людською. Химеризація антитіл досягається шляхом з'єднання варіабельних областей важких і легких ланцюгів мишачих антитіл з константними областями важких і легких ланцюгів людських антитіл (як це, наприклад, описано в роботі Кгашйз еї аї., іп Меїйодвз іп МоіІесшаг Віоіоду 5егіе5, Весотбіпапі апіїродієв ог сапсег Шегару ІЗВМ-0-89603-918-8). В одному із кращих втілень даного винаходу химерні антитіла одержують, з'єднуючи константну область легкого к-ланцюга людини з варіабельною областю легкого ланцюга мишачого антитіла. В іншому кращому втіленні даного винаходу химерні антитіла одержують, з'єднуючи константну область легкого ХА-ланцюга людини з варіабельною областю легкого ланцюга мишачого антитіла. Для створення химерних антитіл кращими є константні області важких ланцюгів Ідсе1, дез і Ід4. Також для створення химерних антитіл кращими є константні області важких ланцюгів Ідса2, ІдА, дО і зм.

Взаємодія антитіл з антигенами-мішенями відбувається переважно за участі амінокислотних залишків, розташованих у шести ділянках, які визначають комплементарність (СОК), важкого й легкого ланцюгів. Тому різні антитіла більше відрізняються за амінокислотною послідовністю в ділянках СОК, ніж в інших частинах молекули. Оскільки послідовності ділянок СОК визначають в основному взаємодію антиген-антитіло, можливо здійснити експресію антитіл, які імітують властивості певних природних антитіл шляхом створення експресійного вектора, який включає нуклеотидні послідовності, що кодують ділянки СОК із цих природних антитіл, вставлені в нуклеотидні послідовності, які кодують каркасні ділянки з інших антитіл з іншими властивостями (див., наприклад, Кіеспітапп, Г. еї аіІ. (1998) Майшге 332: 323-327; допев, Р. єї аї. (1986) Майте 321: 522-525; апа Оцеєп, б. єї аІ. (1989) Ргос. Май). Асай. сі. Ш. 5. А. 86: 10029-10033).

Нуклеотидні послідовності, які кодують каркасні ділянки антитіл, можна одержати із загальнодоступних баз даних ДНК, що включають послідовності генів антитіл зародкової лінії. Ці послідовності зародкової лінії відрізняються від послідовностей генів зрілих антитіл, оскільки в них немає повністю зібраних варіабельних областей, які утворюються шляхом з'єднання М (0) У у процесі дозрівання В-клітин. Послідовності генів зародкової лінії також відрізняються від послідовностей високоафінних антитіл вторинного репертуару в окремих положеннях, рівномірно розподілених по варіабельній області. Наприклад, в М-кінцевій частині першої каркасної області й у С-кінцевій частині четвертої каркасної області соматичні мутації є відносно рідкісними. Крім того, багато соматичних мутацій не впливають суттєво на з'єднувальні властивості антитіла. Тому, щоб створити інтактне рекомбінантне антитіло, яке проявляє такі ж з'єднувальні властивості, що й вихідне антитіло, немає необхідності одержувати всю повністю нуклеотидну послідовність конкретного антитіла (див. публікацію М/О 99/45962). Для цієї мети звичайно достатньо часткових послідовностей важкого й легкого ланцюгів, які покривають ділянки СОК. Часткова послідовність використовується для того, щоб визначити, які варіабельні й з'єднуючі сегменти генів зародкової лінії дають внесок у варіабельні гени рекомбінантного антитіла. Потім послідовність зародкової лінії використовується для заповнення відсутніх ділянок варіабельних областей. У процесі дозрівання білка лідерні послідовності важких і легких ланцюгів відщеплюються й не впливають на властивості остаточного антитіла. Щоб додати відсутні послідовності, з'єднують клоновані послідовності кДНК із синтетичними олігонуклеотидами шляхом лігування або ПЛР-ампліфікації. Або ж можна синтезувати повну варіабельну область як набір коротких олігонуклеотидів, які перекриваються і, з'єднавши шляхом ПЛР-ампліфікації, клонувати повністю синтетичну варіабельну область. Цей спосіб має певні переваги, серед яких виключення або включення певних сайтів рестрикції або оптимізація певних кодонів. (610) Щоб скласти набір олігонуклеотидів, які перекриваються, для створення синтетичних МУ-

послідовностей, які кодують ті ж амінокислоти, що й природні послідовності, можна використовувати транскрипти нуклеотидних послідовностей, які кодують важкі й легкі ланцюги, з гібридом. Синтетичні послідовності важких і к-ланцюгів можуть відрізнятися від природних послідовностей у трьох відношеннях: ланцюжки повторюваних нуклеотидів перериваються, що полегшує синтез олігонуклеотидів і ПЛР-ампліфікацію; оптимальні сайти ініціації трансляції включаються за Козак (Коак, 1991, У). Віої. Спет. 266: 19867-19870); сайти рестрикції НіпапПІ розташовуються у напрямку 3'-кінця від сайтів ініціації трансляції.

Для варіабельних областей як легких, так й важких ланцюгів оптимізовані кодуючі й відповідні, некодуючі нуклеотидні послідовності розбиваються на 30-50 нуклеотидів приблизно в середині відповідного некодуючого олігонуклеотида. Таким чином, для кожного ланцюга олігонуклеотиди можна зібрати в дволанцюгові набори, які перекриваються, і які покривають сегменти з 150-400 нуклеотидів. Ці пули потім використовують як матриці для одержання продуктів ПЛР-ампліфікації з 150-400 нуклеотидів. Як правило, один набір олігонуклеотидів для варіабельної області розбивається на два пули, які ампліфікують окремо, що дає два ПЛР- продукти, які перекриваються. Ці продукти, що перекриваються, поєднують шляхом ПЛР- ампліфікації, так що виходить повна варіабельна область. Може бути також бажаним включити в ПЛР-ампліфікацію фрагмент константної області, що перекривається, щоб одержати фрагменти, які легко клонувати в експресійних векторних конструкціях.

Реконструйовані нуклеотидні послідовності, що кодують варіабельні області химеризованих або гуманізованих важких і легких ланцюгів, потім з'єднують із клонованими промотором, лідерною послідовністю, сайтом ініціації трансляції, послідовністю, яка кодує константну область, 3'-нетрансльованою областю, сайтом поліаденілювання й сайтом термінації транскрипції, одержуючи конструкцію експресійного вектора. Конструкції для експресії важкого й легкого ланцюгів можна об'єднати в єдиний вектор, трансфекувати спільно або послідовно або ж трансфекувати окремо в клітини-хазяїни, які потім зливають, одержуючи клітини, у яких експресуються й ті, і інші ланцюги. Стосовно конструювання експресійних векторів для людського бід описані плазміди. Плазміни можна сконструювати таким чином, щоб ПЛР- ампліфіковані послідовності КДНК М-генів важких ланцюгів і легких к-ланцюгів можна було використовувати для реконструювання повних мінігенів важких і легких ланцюгів. Ці плазміди можна використовувати для експресії повністю людських або химерних антитіл ІдДС1-к або Ідс4- к. Подібні плазміди можна сконструювати для експресії інших ізотипів важких ланцюгів або для експресії антитіл, які містять легкі А-ланцюги.

В іншому аспекті даного винаходу структурні властивості описаних у даному документі антитіл проти клаудину 18.2 використовуються для створення структурно близьких гуманізованих антитіл проти клаудину 18.2, які зберігають щонайменше одну функціональну властивість антитіл запропонованих даним винаходом, наприклад здатність зв'язуватися з

СІОМ18.2. А саме, одну або більше ділянок СОК моноклональних мишачих антитіл рекомбінантним шляхом з'єднують із відомими каркасними областями й СОК людських антитіл, одержуючи додаткові рекомбінантні гуманізовані антитіла проти СІ ОМ18.2.

Здатність антитіл зв'язуватися із клаудином 18.2 можна визначити за допомогою стандартних аналітичних методів, наприклад твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА), вестерн-блотингу, імунофлуоресценції й проточної цитометрії. Метод ЕГІ5ЗА застосовують для того, щоб продемонструвати присутність антитіл у сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл із клаудином 18.2 або його пептидами. Пептиди або білок, які використовували для імунізації можна використовувати для визначення специфічності супернатантів від гібридом або титрів сироватки.

Для того, щоб продемонструвати присутність антитіл у сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, можна застосовувати метод проточної цитометрії. Клітини ліній, у яких від природи або після трансфекції експресується антиген, або негативний контроль -- клітини, у яких цей антиген не експресується (які ростуть за стандартних умов культивування) змішують із моноклональними антитілами (у різних концентраціях) із супернатанта від гібридом або з фізіологічним розчином, забуференим фосфатом (РВ5), що містять 1 95 ембріональної телячої сироватки (ЕВ5), та інкубують за температури 4 "С протягом 30 хвилин. Після промивання здійснюють зв'язування антитіл проти /дсСс, мічених алофікоцианіном (АРС) або флуоресцентним барвником АїІехаб47, з моноклональними антитілами, пов'язаними з антигеном, за тих же умов, за яких проходила взаємодія з первинними антитілами. Зразки аналізують методом проточної цитометрії за допомогою цитофлуориметра ЕБАС5, використовуючи дані прямого і бічного світлорозсіювання для реєстрації одиничних живих клітин. Для того, щоб при вимірюванні відрізнити моноклональні 10) антитіла, специфічні до даного антигену, від неспецифічних агентів, що зв'язуються, можна застосовувати метод спільної трансфекції. Клітини, транзиторно трансфіковані плазмідами, які кодують антиген і флуоресцентний маркер, фарбують, як описано вище. Трансфіковані клітини й клітини, «пофарбовані» антитілами, виявляються в різних каналах флуоресценції. Оскільки в більшості трансфікованих клітин експресуються обидва трансгени, моноклональні антитіла, специфічні до даного антигену, зв'язуються бажано із клітинами, у яких експресується флуоресцентний маркер, тоді як не специфічні до цього антигену антитіла зв'язуються в співрозмірним співвідношенням з не трансфікованими клітинами. На додачу до проточної цитометрії або замість неї можна застосовувати флуоресцентну мікроскопію. Клітини фарбують точно так само, як описано вище, і досліджують за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

Для того, щоб продемонструвати присутність антитіл проти клаудину 18.2 у сироватці імунізованих мишей або зв'язування моноклональних антитіл з живими клітинами, у яких експресується клаудин 18.2, можна застосовувати метод імунофлуоресцентної мікроскопії.

Наприклад, клітини ліній, у яких спонтанно або після трансфекції експресується СІ ОМ18.2 і негативний контроль -- клітини, у яких немає експресії СІ ОМ18.2 - вирощують у слайд-камерах за стандартних умов культивування в середовищі ОМЕМ/Е12, у яке додані ЕС5 (1095), 1 - глутамін (2 мМ), пеніцилін (100 МЕ/мл) і стрептоміцин (100 мкг/мл). Потім клітини фіксують метанолом або параформальдегідом або залишають необробленими. Клітини інкубують з моноклональними антитілами проти СІ ОМ18.2 протягом 30 хвилин за температури 25 "С. Після промивання на клітини впливають вторинними антитілами - антимишачими Ідс, міченими

АІїехаб55 (МоІесшаг Ргоре5), за тих же умов, після чого досліджують за допомогою флуоресцентного мікроскопа.

Для виявлення сумарного рівня СІ ОМ18.2 у клітинах їх фіксують метанолом або параформальдегідом і обробляють детергентом Тгйоп Х-100. У живих клітинах і в клітинах, фіксованих параформальдегідом. але з не порушеною проникністю, можна спостерігати локалізацію СІ ОМ18.2 на клітинній поверхні. Для виявлення зв'язку СІ ОМ18.2 із щільними контактами застосовують спільне фарбування з маркером щільних контактів, наприклад 720О-1.

Також можна досліджувати ефекти зв'язування антитіл і локалізацію СГ ОМ18.2 у клітинній мембрані.

Іо проти СГОМ18.2 перевіряють на взаємодію з антигеном СГ ОМ18.2 шляхом вестерн- блотингу. Загалом, роблять наступне: одержують екстракти клітин, у яких експресується

СІГОМ18.2, і відповідні негативні контролі і проводять із ними гель-електрофорез у поліакриламідному гелі з додецилсульфатом натрію (505). Після електрофорезу антигени, що розділилися, переносять на нітроцелюлозні мембрани, блокують і впливають, досліджуваними моноклональними антитілами. Зв'язування (дО виявляють за допомогою антимишачих ІДС з пероксидазою і субстрату для електрохемілюмінісцентної (ЕСІ) детекції.

Мишачі Іде проти СІ ОМ18.2 далі перевіряють на взаємодію з антигеном СІ ОМ18.2 шляхом імуногістохімічного аналізу способами, відомими фахівцям у даній галузі техніки, наприклад, використовуючи кріозрізи тканинних зразків, фіксованих параформальдегідом або ацетоном, або парафінові зрізи зразків, фіксованих параформальдегідом, нормальних і ракових тканин, узятих у хворих у ході хірургічних втручань, або в мишей з пухлинними ксенотрансплантатами, яким уводили клітини ліній, у яких спонтанно або після трансфекції експресується СІ ОМ18.2.

Для імунологічного фарбування антитіла, які взаємодіють з СІ ОМ18.2, інкубують з козячими антимишачими або антикролячими антитілами, кон'югованими з пероксидазою хріну, відповідно до інструкцій виробника.

Відповідно до даного винаходу, одним із кращих підходів до аналітичного дослідження

СІГОМ18.2 є імуногістохімічний (ІНС). Цей підхід припускає виявлення антигенів (наприклад, білків) у клітинах тканинних зрізів, наприклад у клітинах тканин, що згадуються в даному документі. Імуногістохімічне фарбування широко використовується для діагностування аномальних клітин, наприклад присутніх у ракових пухлинах. Візуалізації взаємодії антитіла з антигеном можна досягти декількома шляхами. Найчастіше застосовується кон'югація антитіл з ферментом, наприклад з пероксидазою, який каталізує "кольорову" реакцію. Або ж до антитіл приєднують флуорофор, наприклад флуоресцеїн або родамін.

Процес виготовлення зразка має вирішальне значення для збереження морфології клітин, будови тканини й антигенності епітопів мішені. Необхідно належним чином відібрати тканину, зафіксувати її й зробити зрізи. Для фіксації звичайно використовують параформальдегід.

Залежно від цілей експерименту й товщини зразка роблять або тонкі (близько 4-40 мкм) зрізи потрібної тканини, або - якщо тканина не дуже щільна й досить проникна - зразок використовують повністю. Зрізи звичайно одержують за допомогою мікротома й розміщують їх у бажаному середовищі на предметних скельцях. 10) Щоб забезпечити доступність епітопів для зв'язування з антитілами, можуть знадобитися додаткові маніпуляції зі зразком, у тому числі депарафінізація й демаскування антигену. В імуногістохімічних дослідженнях для зменшення поверхневого натягу звичайно використовують детергенти, наприклад Тітйоп Х-100; це дозволяє досягати кращого й більш рівномірного покривання зразка з меншою кількістю реагенту.

При прямому імуногістохімічному фарбуванні використовується одне мічене антитіло, яке безпосередньо зв'язується з антигеном, який потрібно виявити фарбуванням. При непрямому імуногістохімічному фарбуванні, яке застосовується частіше, використовуються два антитіла: перше антитіло проти шуканого антигену, а друге, мічене - проти першого антитіла.

Для зменшення фонового фарбування зразки інкубують з буферним розчином, який блокує реакційноздатні сайти, з якими могли б зв'язуватися первинні або вторинні антитіла. Первинні антитіла спрямовані проти шуканого антигену й вони звичайно немічені (не кон'юговані), а вторинні антитіла спрямовані проти імуноглобулінів того виду тварин, якому належать первинні антитіла. Вторинне антитіло зазвичай кон'юговане із проміжною зв'язувальною речовиною, наприклад біотином, яка потім приєднує репортерну речовину; або ж вторинне антитіло безпосередньо пов'язане з репортерною речовиною. Як блокувальний розчин найчастіше використовуються нормальна сироватка, нежирне сухе молоко, бичачий сироватковий альбумін або желатин, а також наявні у продажу готові блокувальні розчини.

Як репортерні речовини використовуються різні сполуки залежно від методу детекції; найбільш популярними є методи хромогенної або флуоресцентної детекції, опосередкованої ферментами й флуорофорами, відповідно. У випадку хромогенного репортера фермент-мітка взаємодіє із субстратом так, що утворюється інтенсивно пофарбований продукт, який можна спостерігати за допомогою звичайного світлового мікроскопа. Субстратів для ферментів багато, але найчастіше як мітку для виявлення білків використовують лужну фосфатазу (АР) і пероксидазу хріну (НКР). Для кожного із цих ферментів доступний ряд хромогенних, флуорогенних і хемілюмінесцентних субстратів, включаючи 3,3'-диамінобензидин (САВ) або 5- бром-4-хлор-3-індолілфосфат/нітросиній тетразолій хлорид (ВСІР/МВТ). Флуоресцентні репортери, які використовуються в імуногістохімічних дослідженнях - це невеликі органічні сполуки. При хромогенній й флуоресцентній детекції денситометричний аналіз сигналу дозволяє одержати кількісні й напівкількісні дані, за якими можна співставити рівень сигналу від репортерної речовини з рівнем експресії білка або з його локалізацією.

Нерідко опісля імуногістохімічного фарбування антигену-мішені застосовують друге фарбування для одержання контрасту, що допомагає виділити перше. Багато із цих барвників проявляють специфічність у відношенні окремих компартментів клітини або антигенів, а інші фарбують усю клітину. Практично для будь-якого експерименту найдеться придатний набір із широкого спектра доступних хромогенних і флуоресцентних барвників. Часто використовується гематоксилін, барвники групи Хехст (Ноесп5і) і 4,6-диамідино-2-феніліндол дигідрохлорид (САРІ).

Картування епітопів, які розпізнаються антитілами, можна проводити, як докладно описано в роботах Сіепп Е. Моїті5 "Ерйоре Марріпуд Ргоїосої5 (Метоа5 іп МоїІесшіаг Віоіоду) ІЗВМ-089603- 375-9 і Оїмууп М. К. УУезімоойа, Ргапк С. Нау "Ерйоре Марріпод: А Ргасіїса! Арргоасі" Ргасіїса!

Арргоасі! 5егівв, 248.

Термін "ефекторні імунні функції" у контексті даного винаходу включає будь-які функції, які опосередковані компонентами імунної системи, і результатом яких є пригнічення пухлинного росту й/або пригнічення розвитку пухлин, у тому числі пригнічення дисемінації й утворення метастаз пухлини. Бажано результатом ефекторних імунних функцій є загибель ракових клітин.

Бажано ефекторні імунні функції в контексті даного винаходу опосередковані антитілами. Такі функції включають цитотоксичність, яка залежить від комплементу (СОС); залежну від антитіл клітинно-опосередковану цитотоксичність (АЮБСС); залежний від антитіл клітинно- опосередкований фагоцитоз (АЮСР); індукцію апоптозу в клітинах, які несуть антиген, асоційований з пухлиною, наприклад шляхом зв'язування антитіла з антигеном клітинної поверхні; пригнічення опосередкованої СО40І. передачі сигналу, наприклад шляхом зв'язування антитіла з СО 40-рецептором або лігандом СО40 (СО401І)); і/або пригнічення проліферації клітин, що несуть антиген, асоційований з пухлиною, переважно АЮСС і/або СОС. Таким чином, антитіла, які здатні опосередковувати одну або більше ефекторних імунних функцій бажано здатні опосередковувати загибель клітин, викликаючи лізис за допомогою СОсС-, лізис за допомогою АЮСС, апоптоз, гомотипову адгезію й/(або фагоцитоз, бажано викликаючи лізис, опосередкований СОС і/або АЮСС. Антитіла можуть також діяти, просто зв'язуючись із антигенами, асоційованими з пухлинами, на поверхні ракових клітин. Наприклад, антитіла можуть блокувати функцію антигену, асоційованого з пухлиною, або викликати апоптоз просто (610) шляхом зв'язування з антигеном, асоційованим з пухлиною, на поверхні ракових клітин.

Цитотоксичність, залежна від антитіл і опосередкована клітинами (АОСС), характеризує здатність ефекторних клітин, зокрема лімфоцитів, викликати загибель клітин і бажано припускає, що клітина-мішень "позначена" антитілом. АОСС переважно має місце, коли антитіла зв'язуються з антигенами на ракових клітинах і домен Ес антитіла займає рецептори Ес (ЕсК) на поверхні ефекторних клітин. Ідентифіковано кілька родин рецепторів Ес; певним групам клітин властива експресія певних рецепторів Ес. АОСС можна розглядати як механізм, який безпосередньо викликає негайне руйнування пухлини (тією чи іншою мірою), що також веде до представлення антигену й індукції Т-клітинної відповіді, спрямованої проти пухлини. Бажано іп мімо індукція АОСС приводить до Т-клітинної відповіді, спрямованої проти пухлини, і подальшим антитільним реакціям організму-хазяїна.

Інший шлях знищення клітин, що направляється антитілами, - це цитотоксичність, залежна від комплементу (СОС). Для активації комплементу найбільш ефективним є ізотип антитіл ДМ.

Також досить ефективними є Ідс1 і доз, які спрямовують СОС класичним шляхом активації комплементу. Бажано в цьому каскаді утворення комплексів антиген-антитіло призводить до демаскування багатьох сайтів зв'язування С1д поблизу від доменів Сн2 задіяних молекул антитіл, наприклад Ідс (С14 - це один із трьох субкомпонентів компонента С1 комплемента).

Бажано ці демасковані сайти зв'язування С14 роблять до того моменту низькоафінну взаємодію

Ста-дс високоафінною, що пускає в хід каскад подій, у яких бере участь ряд інших білків комплементу й веде до протеолітичного вивільнення хемотаксичних/активуючих агентів, ефекторних клітин СЗа й Сб5а. Бажано каскад комплементу закінчується утворенням комплексу, який атакує мембрану, і виникненню пор у клітинній мембрані, які полегшують вільний перехід води й розчинених речовин у клітину і з неї, і веде до апоптозу.

Термін "ефекторні клітини імунної системи" у контексті даного винаходу відноситься до клітин, які здійснюють ефекторні функції в процесі імунологічної реакції організму. Наприклад, такі клітини виділяють цитокіни й/або хемокіни, убивають мікробів, виділяють антитіла, розпізнають і за необхідності знищують ракові клітини. Ефекторні клітини імунної системи включають, наприклад, Т-лімфоцити (цитотоксичні, хелперні, інфільтруючі пухлину), В- лімфоцити, МК-клітини ("природні кілери"), нейтрофіли, макрофаги й дендритні клітини.

Нуклеїнові кислоти запропоновані даним винаходом - це переважно дезоксирибонуклеїнова кислота (ДНК) або рибонуклеїнова кислота (РНК), більш переважно РНК, найбільш переважно

РНК, транскрибована іп міїго. Нуклеїнові кислоти запропоновані даним винаходом включають геномну ДНК, комплементарну ДНК (кКДНК), матричну РНК (мРНК), отримані шляхом рекомбінації або хімічного синтезу. Нуклеїнова кислота відповідно до даного винаходу може мати дволанцюгову або одноланцюгову форму, лінійну або ковалентно замкнену в кільце.

Нуклеїнова кислота відповідно до даного винаходу може використовуватися для введення в клітини, тобто трансфекції; це, наприклад, РНК, отримана шляхом транскрипції ДНК-матриці іп міо. Ця РНК до використання може бути модифікована шляхом стабілізації послідовності, кепірування або поліаденілювання.

Нуклеїнові кислоти, описані в даному документі, можуть бути включені до складу векторів.

Термін "вектор" у даному документі включає будь-які вектори, відомі фахівцям у даній галузі техніки, у тому числі плазміди, косміди, фаги (наприклад, фаг А), віруси (наприклад, аденовірусні або бакуловірусні вектори) або штучні хромосоми, наприклад бактеріальні штучні хромосоми (ВАС), дріжджові штучні хромосоми (МАС) або штучні хромосоми Р1 (РАС).

Зазначені вектори включають як експресійні, так і клонуючі вектори. Експресійні вектори включають плазміди, а також вірусні вектори; вони звичайно містять потрібну кодуючу нуклеотидну послідовність і послідовності ДНК, необхідні для експресії функціонально зв'язаної кодуючої послідовності в певному організмі-хазяїні (наприклад, у бактеріях, дріжджах, рослинах, комахах або ссавцях) або в експресійній системі іп мійго. Клонуючі вектори звичайно використовуються для конструювання й ампліфікації певних потрібних фрагментів ДНК і в них може не бути функціональних нуклеотидних послідовностей, необхідних для експресії цих фрагментів ДНК.

Як вектор для експресії антитіл можна використовувати вектор такого типу, в якому ланцюги антитіла знаходяться в різних векторах, або такого типу, в якому ланцюги антитіла знаходяться у тому самому векторі.

Термін "РНК" у даному документі позначає речовину, яка містить щонайменше один рибонуклеотидний залишок. Рибонуклеотид - це нуклеотид, у якому присутня гідроксильна група в положенні 2 залишку В-ЮО-рибофуранози. Цей термін включає РНК дволанцюгову, одноланцюгову, ізольовану (наприклад, частково очищену, практично чисту), синтетичну, отриману в рекомбінантному вигляді, а також змінену РНК, яку отримують з природної РНК 10) шляхом добавки, делеції, заміни й/або зміни одного або більше нуклеотидів. Такі зміни можуть включати додавання компонентів, відмінних від нуклеотидів (наприклад, приєднання до кінців ланцюга РНК або протягом одного або більше її рибонуклеотидів). Серед нуклеотидів РНК також можуть бути нестандартні нуклеотиди, які наприклад не зустрічаються в природі або синтезовані хімічним шляхом, або є дезоксинуклеотидами. Ці змінені РНК можна вважати аналогами або аналогами природних РНК.

Відповідно до даного винаходу, термін ""НК" включає матричну РНК (мРНК) (і бажано відноситься до неї) і відноситься до транскрипту, який можна одержати, використовуючи як матрицю ДНК і який кодує пептид або білок. Матрична РНК звичайно містить 5'-ч-етрансльовану область, область, яка кодує білок, або пептид, і 3"- нетрансльовану область. Як у клітинах, так і іп міго МРНК існує лише обмежений час.

У контексті даного винаходу термін «транскрипція» відноситься до процесу синтезу молекули РНК відповідно до ДНК-матриці (перекодування генетичної інформації із ДНК на РНК).

Нуклеїнові кислоти відповідно до даного винаходу, описані в даному документі, є переважно ізольованими (виділеними). Термін "ізольована/виділена нуклеїнова кислота" тут означає, що ця нуклеїнова кислота була (ї) ампліфікована іп мйго, наприклад шляхом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), (її) отримана в рекомбінантному вигляді й клонована, (ії) очищена, наприклад шляхом розщеплення й гель-електрофоретичного фракціонування, або (ім) синтезована, наприклад хімічним шляхом. Ізольована/виділена нуклеїнова кислота доступна для використання за технологією рекомбінантної ДНК.

Відповідно до даного винаходу, нуклеїнова кислота може бути взята окремо або ж у комбінації з іншими нуклесновими кислотами, які можуть бути гомологічними або гетерологічними. У кращих втіленнях даного винаходу нуклеїнова кислота функціонально зв'язана з нуклеотидними послідовностями й послідовностями, які регулюють експресію, які можуть бути гомологічним або гетерологічними до зазначеної нуклеїнової кислоти. Термін "гомологічна" тут означає, що дана нуклеїнова кислота в природі функціонально зв'язана з ними, а термін "гетерологічна" - що в природі вона з ними не зв'язана.

Нуклеїнова кислота й нуклеотидні послідовності, що регулюють експресію, є функціонально зв'язаними одні з одними, якщо вони з'єднані ковалентно таким чином, що експресія або транскрипція зазначеної нуклеїнової кислоти контролюється зазначеними регуляторними послідовностями або перебуває під їхнім впливом. Якщо нуклеїнова кислота повинна транслюватися з утворенням функціонального білка, то за наявності послідовностей регулюючих експресію, функціонально пов'язаних з кодуючою нуклеотидною послідовністю, індукція вказаних регуляторних послідовностей приводить до транскрипції зазначеної нуклеїнової кислоти без зміщення рамки зчитування кодуючої послідовності або зазначена кодуюча послідовність транслюється з утворенням бажаного білка або пептиду.

Термін "послідовність, яка регулює експресію" або "елемент, який регулює експресію" відповідно до даного винаходу, включає промотори, сайти зв'язування рибосоми, енхансери й інші регуляторні елементи, які забезпечують транскрипцію гена або трансляцію мРНК. У конкретних втіленнях даного винаходу можна регулювати послідовності, які регулюють експресію. Детальна структура послідовностей, які регулюють експресію, може варіювати залежно від видової належності або типу клітини, але, як правило, у них є 5'-четранскрибована послідовність, а також 5- і 3'-нетрансльовані послідовності, які беруть участь в ініціації відповідно транскрипції й трансляції, наприклад ТАТА-бокс, кеп, послідовність СААТ та ін.

Говорячи конкретніше, 5'-нетранскрибовані послідовності, які регулюють експресію, містять промоторну область, яка включає промоторну послідовність для керування транскрипцією функціонально зв'язаної з нею нуклеїнової кислоти. Послідовності, які регулюють експресію, можуть також містити енхансерні послідовності або активаторні послідовності, розташовані ближче до 5'-кінця.

Термін "промотор" або "промоторна область" відповідно до даного винаходу, відноситься до нуклеотидної послідовності, розташованої ближче до 5'-кінця, ніж та нуклеотидна послідовність, яка повинна експресуватися, і регулює експресію, забезпечуючи сайт розпізнавання й зв'язування для РНК-полімерази. Промоторна область може включати сайти розпізнавання й зв'язування для інших факторів, які беруть участь у регуляції транскрипції гена. Промотор може регулювати транскрипцію прокаріотичного або еукаріотичного гена. Крім того, промотор може бути індуцибельним -- це значить, що він ініціює транскрипцію у відповідь на якийсь індукуючий агент; або ж промотор є конститутивним - це значить, що транскрипція не залежить від якого- небудь індукуючого агента. Ген, що перебуває під контролем індуцибельного промотору, за відсутності індукуючого агента не експресується або експресується лише незначною мірою. У присутності індукуючого агента ген "включається" або рівень транскрипції підвищується. Як (610) правило, це опосередковано зв'язуванням певного фактора транскрипції.

Кращі запропоновані даним винаходом промотори включають промотори для полімераз фагів 5Рб, ТЗ і 77, промотор гена Шб6-РНК людини, промотор цитомегаловіруса (СММУ) і штучні гібридні промотори, у яких частина або частини зазначених (наприклад, СММ) злиті із частиною або частинами промоторів генів інших клітинних білків, наприклад людської гліцеральдегід -3- фосфатдегідрогенази (ЗСАРОН), включаючи або не включаючи додаткові інтрони.

Термін "експресія" у даному документі вживається в його найбільш широкому значенні і позначає утворення РНК або РНК і білка або пептиду. Що стосується РНК, то терміни "експресія" і "трансляція" відносяться зокрема до утворення пептидів або білків. Експресія може бути тимчасовою або постійною. Відповідно до даного винаходу, експресія включає також змінену або аномальну експресію.

Визначення "змінена" або "аномальна" стосовно експресії відповідно до даного винаходу, означають, що рівень експресії змінився, переважно збільшився відносно рівня, узятого для порівняння, який наприклад мав місце у індивіда, який не страждає на захворювання, при якому змінюється або є аномальною експресія певного білка, наприклад антигену, асоційованого з пухлиною. Під підвищенням рівня експресії розуміють його збільшення щонайменше на 10 95, зокрема на щонайменше на 20 95, щонайменше на 50 95 або щонайменше на 100 95 або більше.

В одному із втілень даного винаходу експресія спостерігається тільки в ураженій тканині, а в здорових тканинах вона пригнічена.

Термін "специфічна експресія" ("тканиноспецифічна/органоспецифічна") означає, що білок експресується практично тільки в певних тканинах або органах. Наприклад, специфічна експресія антигену, асоційованого з пухлиною, у слизовій шлунка означає, що зазначений білок експресується переважно в клітинах слизової шлунка й не експресується або лише незначною мірою експресується в інших тканинах або органах. Таким чином, експресія білка, який експресується винятково в клітинах слизової шлунка, а в будь-якій іншій тканині він експресується набагато менше, є специфічною для слизової шлунка. У деяких втіленнях даного винаходу антиген, асоційований з пухлиною, також може специфічно експресуватися за нормальних умов більш ніж в одній тканині або органі, наприклад у двох-трьох тканинах або органах, але переважно не більше ніж у трьох різних тканинах або органах. У такому випадку говорять про специфічність експресії даного антигену, асоційованого з пухлиною, у цих органах або тканинах.

Термін "трансляція" відповідно до даного винаходу, відноситься до процесу, який відбувається в рибосомах клітини, і який полягає в тому, що матрична РНК спрямовує складання амінокислотної послідовності з утворенням білка або пептиду.

Термін "кодуюча нуклеотидна послідовністьл/кодуюча нуклеїнова кислота" відповідно до даного винаходу, означає, що дана послідовністьєддана молекула нуклеїнової кислоти за придатних умов, краще усередині клітини, може експресуватися, тобто утворюється кодований нею білок або пептид.

Термін "пептид" включає олігопептиди й поліпептиди й відноситься до речовин, які містять 2 або більше, бажано З або більше, бажано 4 або більше, бажано 6 або більше, бажано 8 або більше, бажано 9 або більше, бажано 10 або більше, бажано 13 або більше, бажано 16 або більше, бажано 21 або більше, бажано до 8, 10, 20, 30, 40 або 50, зокрема до 100 амінокислот, з'єднаних ковалентно пептидними зв'язками. Термін "білок" відноситься до великих пептидів, переважно до пептидів, які містять більш ніж 100 амінокислотних залишків, але в принципі терміни "пептид" і "білок" є синонімами й уживаються в даному документі взаємозамінні.

Бажано білки й пептиди запропоновані даним винаходом є ізольованими/виділеними.

Визначення "ізольований/виділений" стосовно білка або пептиду відповідно до даного винаходу, означає, що даний білок або пептид виділений 3 його природнього оточення.

Ізольований/виділений білок або пептид може бути практично очищеним. Визначення "очищений" стосовно білка або пептиду означає, що в препараті даного білка або пептиду практично немає інших речовин, в оточенні яких він перебуває іп мімо.

Інформація щодо певних амінокислотних послідовностей яка приводиться в даному документі, наприклад тих, які наведені в переліку послідовностей, слід уважати за таку, що стосується також модифікацій цих послідовностей, тобто варіантів, які функціонально до них еквівалентні, наприклад модифікована амінокислотна послідовність має такі ж або подібні властивості, що й дана послідовність. Одна з важливих властивостей - зв'язування антитіла з його мішенню. Бажано при заміні даної амінокислотної послідовності в молекулі антитіла модифікованою послідовністю зв'язування зазначеного антитіла з його мішенню зберігається.

Для фахівців у даній галузі техніки є немаловажним, що, зокрема, послідовності СОК, гіперваріабельні й варіабельні області можуть бути модифіковані без втрати здатності 10) зв'язуватися з мішенню. Наприклад, послідовності СОК повинні бути ідентичні або високо гомологічні до послідовностей СОК, наведених у даному документі.

Термін "високий ступінь гомології/високогомологічні послідовності" означає, що можливі від 1 до 5 замін амінокислот, бажано від 1 до 4, наприклад 1-3 або 1-2 заміни.

Термін "варіант" відповідно до даного винаходу, також включає мутантні форми. Варіанти, які є результатом різного сплайсингу, конформаційні варіанти, ізоформи, алельні варіанти, видові варіанти й міжвидові гомологи, які зокрема існують у природі. Алельні варіанти - це результат змін у нормальній нуклеотидній послідовності гена, значення яких часто залишається неясним. Нерідко при визначенні повної нуклеотидної послідовності того або іншого гена ідентифікують численні алельні варіанти даного гена. Міжвидові гомологи - це нуклеотидні або амінокислотні послідовності іншого, ніж дана послідовність, видового походження.

Для цілей даного винаходу варіанти амінокислотної послідовності включають варіанти, які виникли в результаті вставки, додатки, делеції й/або заміни амінокислот. Варіанти, які є результатом делеції амінокислотних залишків на М- і/або С-кінці поліпептидного ланцюга, називаються також відповідно М- або С-укороченими варіантами.

У варіантах, які є результатом вставки, у певне місце даної амінокислотної послідовності додано один, два або більше амінокислотних залишків; можлива також вставка у випадкові місця послідовності (у цьому випадку потрібен відповідний аналіз продукту).

Варіанти, які є результатом додатка, включають послідовності, у яких до М- або С-кінця даної амінокислотної послідовності приєднано один або більше амінокислотних залишків, наприклад 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 або більше.

У варіантах, які є результатом делеції, у даній амінокислотній послідовності відсутні 1, 2, З, 5, 10, 20, 30, 50 або більше амінокислотних залишків. Делеція може мати місце в будь-якому положенні протягом поліпептидного ланцюга.

У варіантах, які є результатом заміни, у даній амінокислотній послідовності на місці щонайменше одного амінокислотного залишку перебуває інший. Така модифікація краща в тих положеннях амінокислотної послідовності, які не є консервативними, тобто не належать до областей, однакових у гомологічних білках; і/або амінокислотні залишки заміняються на подібні за властивостями. Бажано заміни амінокислот у варіантах білка є консервативними, тобто на місці заміненого амінокислотного залишку стоїть амінокислотний залишок з такими ж електричними властивостями (який несе заряд або не несе заряду). Консервативні амінокислотні заміни включають заміни в межах груп амінокислот із близькими за властивостями бічними ланцюгами. Амінокислоти, які існують в природі, можна розділити на чотири групи: кислі (аспарагінова й глутамінова кислоти), основні (лізин, аргінін, гістидин), неполярні (аланін, валін, лейцин, ізолейцин, пролін, фенілаланін, метіонін, триптофан) і незаряджені полярні (гліцин, аспарагін, глутамін, цистеїн, серин, треонін, тирозин). Іноді фенілаланін, триптофан і тирозин поєднують у групу ароматичних амінокислот.

Бажано ступінь подібності, краще, ідентичності між даною амінокислотною послідовністю й послідовністю, яка є її варіантом, становить щонайменше близько 60 95, 65 905, 70 95, 80 95, 81 95, 82 Фо, 83 У, 84 95, 85 95, 86 90, 87 о, 88 о, 89 95, 90 90, 91 У, 92 90, 93 Фо, 94 Фо, 95 90, 96 90, 97 о, 98 95, або 99 95. Ступінь подібності або ідентичності бажано дається для області амінокислотної послідовності, частка якої становить щонайменше близько 10 95, щонайменше близько 20 95, щонайменше близько 30 95, щонайменше близько 40 95, щонайменше близько 50 95, щонайменше близько 60 95, щонайменше близько 70 95, щонайменше близько 80 95, щонайменше близько 90 956 або близько 100 95 усієї довжини амінокислотної послідовності, з якою проводиться порівняння. Наприклад, якщо послідовність, з якою проводиться порівняння, складається з 200 амінокислотних залишків, то ступінь подібності або ідентичності дається переважно для щонайменше близько 20, щонайменше близько 40, щонайменше близько 60, щонайменше близько 80, щонайменше близько 100, щонайменше близько 120, щонайменше близько 140, щонайменше близько 160, щонайменше близько 180 або близько 200 амінокислотних залишків, бажано розташованих підряд. У кращих втіленнях даного винаходу ступінь подібності або ідентичності дається для всієї довжини амінокислотної послідовності, з якою проводитися порівняння. Вирівнювання послідовностей для визначення їх подібності, бажано ідентичності, можливо за допомогою відомих у даній галузі техніки способів і засобів, бажано з використанням найкращого вирівнювання, наприклад з використанням АЇідп, стандартних налаштувань програми Мееаіе з пакета ЕМВО55 (матриця мас амінокислотних замін ВГОБИОМб2; штраф за відкриття делеції - 10,0; штраф за продовження делеції - 0,5).

Подібність послідовностей виражається як частка (у відсотках) однакових амінокислотних залишків або консервативних замін у порівнюваних амінокислотних послідовностях.

Ідентичність послідовностей виражається як частка (у відсотках) амінокислотних залишків, 10) однакових у порівнюваних послідовностях.

Термін "відсоток ідентичності" позначає частку (у відсотках) амінокислотних залишків, однакових у двох порівнюваних послідовностях, отриману після найкращого вирівнювання; ця величина є чисто статистичною, і відмінності між двома порівнюваними послідовностями розподіляються випадковим чином опо всій довжині послідовності. Порівняння двох амінокислотних послідовностей звичайно проводиться шляхом їхнього співставлення після оптимального вирівнювання, причому зазначене порівняння здійснюється по сегментах або за допомогою "вікна", щоб ідентифікувати й порівняти локальні області подібності. Оптимальне вирівнювання послідовностей для їхнього порівняння можна робити не тільки вручну, але за допомогою алгоритмів локальної гомології Сміта-Ватермана (Зтйй апа Умаїегтап, 1981, да

Арр. Ма. 2, 482), Нідлмана-Вунша (Медаієтап апа Ууипси, 1970, 9. Мої. ВіоїЇ. 48, 443), за допомогою подібного методу аналізу Пірсона й Ліпмана (Реагхоп апа Гіртап, 1988, Ргос. Май!

Асад. сі. О5А 85, 2444) або за допомогою комп'ютерних програм, у яких використовуються ці алгоритми (САР, ВЕЗТРЇІТ, ЕАЗТА, ВІ АБ5Т Р, ВІ АБ5Т М їі ТЕА5ТА у пакеті Ум5сопвзіп Сепеїіс5 зопмаге РасКаде, Сепеїїс5 Сотршиїег сгоир, 575 зЗсіепсе Огіме, Мадісон, шт. Вісконсин, США).

Відсоток ідентичності розраховують шляхом визначення числа ідентичних положень у двох порівнюваних послідовностях, яке ділять на число порівняних положень і множать результат на 100, що дає процентне вираження ідентичності цих двох послідовностей.

Гомологічні амінокислотні послідовності відповідно до даного винаходу, ідентичні щонайменше на 40 95, зокрема щонайменше на 50 95, щонайменше на 60 95, щонайменше на 70

Фо, щонайменше на 80 95, щонайменше на 90 95 і краще щонайменше на 95 9565, щонайменше на 98 або щонайменше на 99 95 амінокислотних залишків.

Варіанти амінокислотних послідовностей, описані в даному документі, фахівцеві у даній галузі техніки неважко одержати за допомогою, наприклад, методів рекомбінантної ДНК.

Операції з послідовностями ДНК із метою одержання білків і пептидів, у яких є заміни, добавки, вставки або делеції, докладно описані, наприклад, у роботі ЗатргооК еї аїЇ. (1989). Також варіанти пептидів і білків, описані в даному документі, можна порівняно легко одержати за допомогою відомих методів пептидного синтезу, наприклад шляхом твердофазного синтезу або подібних методів.

Даний винахід включає похідні пептидів і білків, описаних у даному документі, охоплювані термінами "білок" і "пептид". Відповідно до даного винаходу, похідні білків і пептидів - це модифіковані форми цих білків і пептидів. Такі модифікації включають будь-які хімічні модифікації, у тому числі одиничні або множинні заміни, делеції й/або додатка будь-яких речовин, що зв'язуються з білками або пептидами, наприклад вуглеводів, ліпідів і/або білків або пептидів. В одному із втілень даного винаходу похідні білків або пептидів включають модифіковані їхні аналоги, що утворювалися в результаті глікозилювання, ацетилювання, фосфорилювання, амідування, пальмітування, міристолювання, ізопренілювання, ліпідування, алкілювання, дериватизації уведення захисних/блокувальних груп, протеолітичного розщеплення або зв'язування з антитілами або іншими клітинними лігандами. Термін "похідне" також охоплює всі функціональні хімічні еквіваленти зазначених білків і пептидів. Бажано модифікований пептид має підвищену стабільність і/або збільшену імуногенність.

Запропоновані даним винаходом варіанти, похідні, модифіковані форми, фрагменти, частини або ділянки амінокислотної послідовності, пептиду або білка мають функціональні властивості амінокислотної послідовності, пептиду або білка, відповідно, з яких вони походять, тобто функціонально еквівалентні. В одному із втілень даного винаходу варіанти, похідні, модифіковані форми, фрагменти, частини або ділянки амінокислотної послідовності, пептиду або білка імунологічно еквівалентні до амінокислотної послідовності, пептиду або білка, відповідно, з якого вони походять. В одному із втілень даного винаходу функціональна властивість є імунологічною властивістю.

Визначення "який походить" відповідно до даного винаходу, означає, що даний об'єкт, зокрема конкретна послідовність, присутній в іншому об'єкті, зокрема в організмі або молекулі, з якого перший об'єкт походить. У випадку амінокислотних послідовностей, зокрема областей послідовностей, "які походять", зокрема, означає, що амінокислотна послідовність, про яку мова йде, походить із амінокислотної послідовності, у якій вона присутня.

Термін "клітина" або "клітина-хазяїн" бажано відноситься до інтактних клітин, тобто до клітини з непорушеною мембраною, яка не виділяє свої нормальні внутрішньоклітинні компоненти, наприклад ферменти, органелли або генетичний матеріал. Інтактна клітина переважно є життєздатною, тобто це жива клітина, здатна здійснювати свої нормальні метаболічні функції. Відповідно до даного винаходу, термін «клітина» включає прокаріотичні клітини (наприклад, ЕзспПегіспіа соїї) або еукаріотичні клітини (наприклад, дендритні клітини, В- 10) клітини, клітини СНО, клітини СО5, клітини К562, клітини НЕК293, клітини НЕГА, дріжджові клітини й клітини комах). Особливо кращими є клітини ссавців, наприклад клітини приматів, у тому числі людини, мишей, хом'яків, свиней і кіз. Зазначені клітини можуть походити із тканин багатьох різних типів і включають первинні клітини й клітинні лінії. Термін "клітина" включає не лише ракові клітини, але також ракові клітини, наприклад клітини описаних у даному документі ракових пухлин.

У клітині, яка містить яку-небудь нуклеїнову кислоту, бажано експресується пептид або білок, кодований цією нуклеїновою кислотою.

Термін "клітина-мішень" означає клітину, яка є мішенню імунної відповіді, наприклад антитіла. Клітини-мішені включають будь-які небажані клітини, наприклад ракові клітини, описані в даному документі. У кращих втіленнях даного винаходу клітина-мішень - це клітина, у якій експресується клаудин 18.2. Клітини, у яких експресується клаудин 18.2, є, як правило, раковими.

Термін "трансгенна тварина" відноситься до тварин, геном яких включає один або більше трансгенів, бажано трансгенів важких і/або легких ланцюгів антитіл, або трансхромосом (інтегрованих або не інтегрованих у природну геномну ДНК даної тварини) і в яких ці трансгени бажано можуть експресуватися. Наприклад, у трансгенної миші може бути людський трансген легкого ланцюга й або людський трансген важкого ланцюга, або трансхромосома із цим геном, так що в цієї миші в результаті імунізації антигеном клаудину 18.2 і/або клітинами, у яких експресується клаудин 18.2, можуть утворюватися людські антитіла проти цього білка.

Людський трансген важкого ланцюга може бути інтегрований у хромосомну ДНК миші, як у випадку трансгенних мишей, наприклад мишей НиМАБ - НСо7 або НсСоїі2, або людський трансген важкого ланцюга може існувати поза клітисними хромосомами, як у випадку трансхромосомних мишей (наприклад, КМ), описаних у публікації МО 02/43478. Такі трансгенні й трансхромосомні миші мають здатність до утворення багатьох ізотипів людських моноклональних антитіл проти СІ ОМ18.2 (наприклад, Ідс, ІдА і/або ІДЕ) завдяки рекомбінації М- 0-У і перемиканню ізотипів.

Вираз "імунологічно еквівалентна" означає, що імунологічно еквівалентна молекулярна структура, наприклад імунологічно еквівалентна амінокислотна послідовність проявляє такі ж або практично такі ж імунологічні властивості й/(або викликає такі ж або практично такі ж імунологічні ефекти, наприклад за типом імунологічного ефекту (індукція гуморальної імунної відповіді, інтенсивність і/або тривалість викликаної імунної відповіді або специфічність цієї імунної відповіді). У контексті даного винаходу вираз "імунологічно еквівалентна" вживається переважно щодо імунологічних ефектів або властивостей пептиду або варіанта пептиду, який використовувався для імунізації, або антитіла. Конкретною імунологічною властивістю є здатність зв'язувати антитіла й за необхідності генерувати імунну відповідь, переважно шляхом стимуляції утворення антитіл. Наприклад, амінокислотна послідовність імунологічно еквівалентна до іншої амінокислотної послідовності, узятої для порівняння, якщо зазначена амінокислотна послідовність, будучи пред'явленою імунній системі індивіда, викликає імунну відповідь, бажано утворення антитіл, які специфічно взаємодіють з амінокислотною послідовністю, узятою для порівняння, наприклад з послідовністю, яка формує частину клаудину 18.2.

Даним винаходом пропонуються способи виявлення присутності антигену СГ ОМ18.2 у зразку або вимірювання кількості антигену СІ ОМ18.2, які передбачають контактування зразка й за необхідності контрольного зразка з антитілами запропонованими даним винаходом, які зв'язуються з СІ ОМ18.2, за умов, що роблять можливим утворення комплексу зазначених антитіл з СІ ОМ18.2. Потім виявляється утворення комплексу, причому різниця в утворенні цього комплексу між аналізованим зразком і контрольним указує на присутність антигену СІ ОМ18.2 в аналізованому зразку.

Зазначені вище способи є корисними, зокрема, для діагностування захворювань, до яких має відношення клаудин 18.2, наприклад ракових захворювань. Бажано, якщо кількість

СІГОМ18.2 у зразку, узятому в обстежуваного індивіда (зокрема, людини), перевищує таку в контрольному зразку, то це вказує на наявність у даного індивіда захворювання, пов'язаного із клаудином 18.2.

При використанні в зазначених вище способах до антитіл, описаних в даному документі, можуть бути приєднані мітки, роль яких полягає в тому, щоб (ї) забезпечити детектований сигнал; (її) взаємодіяти із другою міткою, щоб змінити детектований сигнал, який дається першою або другою міткою, наприклад шляхом флуоресцентного резонансного перенесення енергії (ЕКЕТ); (ії) вплинути на рухливість, наприклад на електрофоретичну рухливість, змінюючи заряд, гідрофобність, форму або інші фізичні параметри, або (ім) забезпечити (610) структуру-"пастку", яка здійснює утворення комплексу за спорідненістю, антиген-антитіло або іонного. Як мітки можна використати структури, які можуть бути виявленими за допомогою агентів, які зв'язуються з ними: флуоресцентні мітки, люмінесцентні мітки, хромофори, радіоактивні ізотопи, ізотопні мітки, бажано стабільні ізотопні мітки, ізобарні мітки, ферменти, часточки, зокрема часточки металів, магнітні часточки, полімерні часточки, невеликі органічні сполуки, наприклад біотин, ліганди рецепторів або з'єднувальні агенти, наприклад білки клітинної адгезії або лектини, мітки-послідовності, які містять нуклеїнові кислоти й/або амінокислотні залишки. Мітки включають (даний перелік не має обмежувального характеру) сульфат барію, йоцетамову кислоту, йопаноєву кислоту, іподат кальцію, диатризоат натрію, меглуміну диатризоат, тиропаноат натрію й агенти для променевої діагностики, включаючи джерела позитронів, наприклад фтор-18 і вуглець-11, джерела гамма-випромінювання, наприклад йод-123, технецій-99т, йод-131 та індій-111, нукліди для ядерного магнітного резонансу, наприклад фтор і гадоліній.

Відповідно до даного винаходу, вираз "для порівняння" або "контрольний", наприклад "зразок, узятий для порівняння/контрольний зразок" або "організм, узятий для порівняння" вживаються тоді, коли потрібно співставити й порівняти результати, отримані способами запропонованими даним винаходом, для досліджуваного зразка або організму. Як правило, організм для порівняння - це здоровий/нормальний організм, зокрема організм, який не страждає на яке-небудь захворювання, наприклад рак. Величина для порівняння або рівень для порівняння можуть бути визначені відповідно до об'єкту для порівняння емпірично шляхом їхнього вимірювання у досить великої кількості об'єктів для порівняння. Бажано величину для порівняння визначають шляхом вимірювання щонайменше 2, бажано щонайменше 3, бажано щонайменше 5, бажано щонайменше 8, бажано щонайменше 12, бажано щонайменше 20, бажано щонайменше 30, бажано щонайменше 50 або бажано щонайменше 100 об'єктів для порівняння.

Слова "зменшувати" або "інгібувати" у даному документі відносяться до здатності викликати загальне зниження рівня переважно на 5 95 або більше, 10 95 або більше, 20 95 або більше, краще на 5095 або більше, найкраще на 7595 або більше. Інгібування (або подібні за значенням вирази) передбачає повне або практично повне інгібування, тобто зменшення до нуля або практично до нуля.

Вираз "підвищувати/підсилювати/збільшувати" переважно відноситься до "підвищення/посилення/збільшення" на приблизно щонайменше 10 95, бажано щонайменше 20 ую, бажано щонайменше 30 95, бажано щонайменше 40 95, краще щонайменше 50 95, ще краще щонайменше 80 9о, найкраще щонайменше 100 95.

Описані в даному документі агенти, композиції й способи можна використовувати для діагностування захворювання в індивіда. Захворювання, що підлягають такому діагностуванню, включають усі захворювання, при яких експресується СІ ОМ18.2. Переважно мова йде про ті з них, які є раковими захворюваннями, наприклад тими раковими захворюваннями, які описані в даному документі.

Термін "захворювання/хвороба" відповідно до даного винаходу, відноситься до будь-якого патологічного стану, включаючи ракові захворювання, зокрема ті форми ракових захворювань, які описані в даному документі.

Визначення "нормальний", наприклад "нормальна тканина" або "нормальні умови", відноситься до здорових тканин або до умов в організмі здорового індивіда, тобто до не патологічних умов, причому "здоровий" бажано означає "не раковий/не хворий на рак".

Вираз "захворювання за участю клітин, у яких експресується СІ ОМ18.2" відповідно до даного винаходу, означає, що експресія СОМ18.2 у клітинах ураженої тканини або органа переважно посилена в порівнянні зі здоровою тканиною або органом. Збільшенням уважається перевищення щонайменше на 10 95, зокрема щонайменше на 20 95, щонайменше на 50 95, щонайменше на 100 95, щонайменше на 200 95, щонайменше на 500 95, щонайменше на 1000 до, щонайменше на 10 000 95 або навіть більше. В одному із втілень даного винаходу експресія має місце тільки в ураженій тканині, а в нормальній тканині вона подавлена. Відповідно до даного винаходу, захворювання за участю клітин, у яких експресується СІГОМ18.2, або асоційовані з такими клітинами включають ракові захворювання, зокрема ракові захворювання, описані в даному документі.

Відповідно до даного винаходу, термін "пухлина" або "пухлинне захворювання" відноситься до об'ємного утворення або ураження, зумовленого аномальним розмноженням клітин (які називаються неопластичними або пухлинними). Термін "пухлинна клітина" позначає аномальну клітину, яка швидко безконтрольно розмножується, причому цей клітинний ріст триває й після припинення дії цього фактора, що його викликав. Пухлини частково або повністю позбавлені (610) структурної організації й функціонально не координуються з нормальною тканиною, утворюючи звичайно відмінну від неї клітинну масу, і це утворення може бути доброякісним, передзлоякісним або злоякісним.

Доброякісна пухлина - це така пухлина, у якої немає всіх трьох злоякісних властивостей, властивих раку. А саме, ріст доброякісної пухлини не має необмеженого агресивного характеру, не є інвазивним стосовно навколишньої тканини й не поширюється за її межі в інші тканини (пухлина не утворює метастаз). Прикладами доброякісних пухлин, що часто зустрічаються, є міхуровий занос і фіброїди матки.

Визначення "доброякісний" означає помірне не прогресуюче захворювання; багато доброякісних пухлин є нешкідливими. Однак деякі неопластичні утворення, які характеризуються як доброякісні через відсутність інвазивних властивостей, властивих раку, можуть, проте, негативно впливати на здоров'я. Приклади таких утворень включають пухлини, які здавлюють життєво важливі органи, наприклад судини, або так звані функціональні пухлини ендокринних тканин, які можуть продукувати у надмірних кількостях деякі гормони (приклади таких пухлин - аденома щитовидної залози, аденома кори надниркової залози, аденома гіпофіза).

Доброякісна пухлина часто буває оточена капсулою зі сполучної тканини, яка позбавляє пухлину здатності "поводитися" як злоякісна. Іноді деякі початково доброякісні пухлини згодом дають початок злоякісному раковому росту; це відбувається внаслідок подальших генетичних змін у якійсь з субпопуляцій неопластичних клітин. Яскравий приклад такого явища - трубчаста аденома товстої кишки, яка представляє собою форму поліпа, що часто зустрічається; ця пухлина нерідко стає попередником раку товстої кишки. Клітини тубулярної аденоми, як і більшості пухлин, що часто перероджуються на рак, мають певні аномалії дозрівання й зовнішнього вигляду, які у сукупності називаються дисплазією. Ці аномалії не спостерігаються в доброякісних пухлинах, які лише дуже рідко перетворюються на ракові (або ніколи не перетворюються на ракові), але зустрічаються в інших предракових змінених тканинах, які не утворюють окремої маси, наприклад у передракових ураженнях шийки матки. Деякі фахівці вважають за краще називати диспластичні пухлини передзлоякісними, залишаючи визначення «доброякісні» для пухлин, які ніколи не дають початок раку або тільки вкрай рідко.

Неоплазма - це аномальна маса тканини, яка виникла в результаті неоплазії. Неоплазією (новий ріст" грецькою) називається аномальна проліферація клітин: клітинний ріст інтенсивніший від нормального й який не координується з ростом навколишньої тканини, причому інтенсивність росту підвищена навіть після припинення дії того фактора, який його стимулював. У результаті неоплазії утворюється вузол або пухлина. Неоплазми бувають доброякісні, передзлоякісні й злоякісні.

Вираз "ріст пухлини/пухлинний ріст" відповідно до даного винаходу, відноситься до тенденції збільшення розмірів пухлини й/або тенденції до проліферації пухлинних клітин.

Рак (злоякісна неоплазма) - це група захворювань, при яких спостерігається неконтрольований клітинний ріст (деякі клітини діляться за межами норми), інвазія (проростання в сусідні тканини і їх руйнування) і іноді метастази (поширення через кров або лімфу в інші місця організму). Ці три злоякісні властивості відрізняють ракові пухлини від доброякісних, ріст і розвиток яких обмежений сам по собі й не супроводжується інвазією або утворенням метастаз. При більшості ракових захворювань утворюється пухлина, але при деяких, наприклад при лейкозах, пухлині немає. Відповідно до даного винаходу, терміни "рак" і "пухлина" або "ракове захворювання" і "пухлинне захворювання" уживаються в даному документі в основному як взаємозамінні стосовно захворювань, при яких має місце неконтрольований клітинний ріст і можуть бути інвазія й/або метастази.

Переважно ракове захворювання відповідно до даного винаходу, відрізняється присутністю клітин, у яких експресується клаудин 18.2. Клітини, у яких експресується клаудин 18.2, є переважно раковими клітинами, переважно описаних у даному документі пухлин і ракових уражень. Бажано ці клітини не є клітинами шлунка.

Ракові захворювання класифікують за типом клітин, що утворюють пухлину, і за тканиною/органом, де утворилася первинна пухлина. Це, відповідно, гістологічна характеристика й локалізація.

Термін "рак" відповідно до даного винаходу, включає лейкози, семіноми, меланоми, тератоми, лімфоми, нейробластоми, гліоми, ректальний рак, рак ендометрію, рак нирок, рак надниркової залози, рак щитовидної залози, рак крові, рак шкіри, рак головного мозку, рак шийки матки, рак кишечнику, рак печінки, рак товстої кишки, рак шлунка, рак голови й шиї, рак шлунково-кишкового тракту, рак лімфатичних вузлів, рак стравоходу, колоректальний рак, рак підшлункової залози, рак вуха/горла/носа, рак молочної залози, рак передміхурової залози, рак (610) матки, рак яєчника, рак легенів та їх метастази. Прикладами перерахованих вище ракових уражень є карциноми легенів, карциноми молочної залози, карциноми передміхурової залози, ниркоклітинні карциноми, карциноми шийки матки або метастази перерахованих вище або пухлини, описані вище. Термін "рак" відповідно до даного винаходу, включає також метастази.

Основними типами раку легенів є дрібноклітинна карцинома легенів (ЗСІС) і недрібноклітинна карцинома легенів (МЗС С). Існують три основні підтипи недрібноклітинних карцином легенів: плоскоклітинна карцинома легенів, аденокарцинома й крупноклітинна карцинома легенів. Частка аденокарцином становить приблизно 1095 випадків раку легені. Це ракове ураження зазвичай має місце в периферійній області легенів - на відміну від дрібноклітинного й плоскоклітинного рака легенів, локалізованих звичайно ближче до центру органа.

Відповідно до даного винаходу, карцинома - це злоякісна пухлина, яка походить з епітеліальних клітин. Карциноми, у тому числі молочної залози, передміхурової залози, легенів і товстої кишки, є раковими захворюваннями, які зустрічаються найбільш часто.

Термін "метастаза" позначає поширення ракових клітин з місця первинного розташування в інші частини тіла. Утворення метастазів - дуже складний процес, що залежить від відділення злоякісних клітин від первинної пухлини, інвазії в позаклітинний матрикс, проникнення крізь базальну мембрану на границі ендотелію в просвіт судин і в порожнину тіла, потім транспортування із кров'ю й інфільтрації в органі-мішені. Нарешті, ріст нової пухлини, тобто вторинної (метастатичної) пухлини, у новому місці залежить від ангіогенезу. Метастази пухлин нерідко утворюються навіть після того, як вилучена первинна пухлина, тому що пухлинні клітини або компоненти можуть залишитися й знайти метастатичний потенціал. В одному із втілень даного винаходу термін "метастаза" відноситься до віддалених метастаз, які перебувають відносно далеко від первинної пухлини й регіонарних лімфатичних вузлів.

Клітини вторинної, або метастатичної пухлини подібні до клітин первинної пухлини. Це значить, що, наприклад, якщо рак яєчника утворює метастази у печінці, то вторинна пухлина буде утворена аномальними клітинами яєчника, а не печінки. Така пухлина в печінці називається метастазом раку яєчника, але не раком печінки.

Рецидив або активізація раку трапляється, коли індивід потрапляє знову в умови, які спровокували захворювання в минулому. Наприклад, якщо хворий, який страждав раковим захворюванням, успішно вилікувався, але потім воно в нього розвинулося знову, то це захворювання, яке виникло заново розглядається як рецидив або активізація захворювання.

Однак відповідно до даного винаходу, рецидив або активізація ракового захворювання може відбутися не в тому місці, де воно проявлялося спочатку. Так, наприклад, якщо хвора, яка страждала від пухлини яєчника й з успіхом пройшла лікування, то рецидив або активізація захворювання можуть виражатися виникненням пухлини яєчника ж або утворенням пухлини в іншому місці. До рецидивів або активації захворювання відносяться також ситуації, коли пухлина виникає в місці, відмінному від локалізації первинної пухлини, або в тій же локалізації.

Переважно первісна пухлина, із приводу якої хворий одержував лікування, є первинною, а пухлина, яка виникла в місці, відмінному від локалізації первинної пухлини - вторинною, або метастатичною.

Під лікуванням розуміють введення індивідові речовин або композицій з метою запобігти або ліквідувати захворювання, включаючи зменшення розмірів пухлини або кількості пухлин в організмі даного індивіда; зупинення або уповільнення прогресу захворювання у даного індивіда; пригнічення або вповільнення розвитку нового захворювання в даного індивіда; скорочення частоти або зменшення ступеня важкості симптомів і/або загострень/рецидивів захворювання у хворого або індивіда, що раніше страждав на цю хворобу; і/або продовження життя, тобто збільшення його тривалості в даного індивіда.

Зокрема під лікуванням захворювання розуміють лікування, скорочення тривалості, полегшення, запобігання, уповільнення або пригнічення прогресування або погіршення, запобігання або відтермінування виникнення захворювання або його симптомів.

Вираз "ризик захворювання" означає, що для даного індивіда встановлена підвищена проти нормальної ймовірність розвитку захворювання, зокрема раку, у порівнянні з популяцією в цілому. Також якщо в індивіда є або недавно було захворювання, зокрема рак, то для нього існує підвищений ризик розвитку цього захворювання, оскільки воно може продовжувати розвиватися. Також для індивідів, хворих або тих, що хворіли на рак, є підвищеним ризик виникнення метастазів рака.

Термін "імунотерапія" відноситься до лікування, яке включає специфічні імунологічні реакції.

У контексті даного винаходу вирази типу "захищати", "запобігати", "профілактичний", "превентивний" або "захисний/протективний" відносяться до запобігання або лікування (або до 10) того й іншого разом) виникнення й/або поширення захворювання в індивіда й, зокрема, до зниження ймовірності або до затримування розвитку захворювання в даного індивіда.

Наприклад, людей, для яких є ризик виникнення пухлини із числа згаданих вище, є кандидатами на одержання імунотерапії для запобігання пухлини. Імунотерапія може здійснюватися шляхом застосування кожного з багатьох різноманітних методів з використанням агентів, які в організмі пацієнта ліквідують клітини, в яких експресується певний антиген.

У деяких втіленнях даного винаходу імунотерапія може бути активною, тобто лікування базується на тому, щоб іп мімо стимулювати ендогенну імунну систему організму-хазяїна до реакції проти уражених клітин шляхом уведення агентів, що модифікують імунну відповідь (наприклад, імунореактивних пептидів і нуклеїнових кислот).

В інших втіленнях даного винаходу імунотерапія може бути пасивною, тобто лікування включає доставку агентів із установленою протипухлинною імунореактивністю (наприклад, антитіл), які можуть безпосередньо або опосередковано проявляти протипухлинну дію й для яких не обов'язкова участь інтактної імунної системи організму-хазяїна.

Термін "іп мімо" відноситься до того, що відбувається в організмі індивіда.

Слова "індивід", "особина", "пацієнт", "хворий" або "організм' у даному документі вживаються як взаємозамінні й відносяться до хребетних тварин, бажано ссавців. Наприклад, у контексті даного винаходу ссавці - це люди й інші примати, свійські тварини (наприклад, собаки, кішки, вівці, велика рогата худоба, кози, свині, коні тощо), лабораторні тварини (наприклад, миші, пацюки, кролики, морські свинки тощо), а також тварини, які утримуються в неволі, наприклад мешканці зоопарків. Термін "тварина" у даному документі включає й людину. Термін "Індивід" може також включати хворого/пацієнта, тобто тварину, бажано людину, яка страждає на захворювання, переважно захворювання із числа описаних у даному документі.

У контексті даного винаходу зразок - це будь-який зразок, який можна використовувати відповідно до даного винаходу, зокрема біологічний зразок, наприклад зразок тканини, включаючи рідини тіла, і/або клітинний зразок, який можна одержати звичайними способами, наприклад шляхом біопсії у тому числі пункційної/штанцевої шляхом відбору крові, бронхіального аспірата, мокротиння, сечі, калу тощо. Відповідно до даного винаходу, термін "зразок" також включає зразки, які пройшли ту або іншу обробку, наприклад фракції або ізоляти біологічних зразків, наприклад виділені нуклеїнові кислоти й пептиди/білки. Бажано зразок містить клітини або тканину органа, який необхідно дослідити, наприклад, для діагностування раку. Наприклад, якщо потрібно діагностувати рак легенів, зразок може містити клітини або тканину, отримані з легенів.

Відповідно до даного винаходу, зразок може бути тілесним зразком, узятим в індивіда, який має або ймовірно може мати пухлину або ракові клітини. Тілесний зразок може бути зразком будь-якої тканини, наприклад крові, зразком тканини первинної пухлини або метастазу, або будь-яким іншим зразком, який містить пухлину або пухлинні клітини.

Нижче даний винахід описується докладно за допомогою фігур і прикладів, які наведені лише з ілюстративною метою й не мають обмежувального характеру. Завдяки опису й прикладам фахівцям у даній галузі техніки доступні й інші варіанти здійснення винаходу, які також включені до його обсягу.

Фігури

Фіг. 1. Вирівнювання амінокислотних послідовностей клаудинів 18 людини й миші.

Вирівнювання амінокислотних послідовностей показує високий ступінь гомології між людським і мишачим клаудинами 18.2 і людськими клаудинами 18.1 і 18.2.

Фіг. 2. Рекомбінантний білок, який включає С-кінцеву частину СГ ОМ18.2 (амінокислотні залишки від 191 до 261), який використовували для імунізації мишей.

Фіг. 3. Аналіз амінокислотних послідовностей антитіл 43-14А і 35-22А.

Приклади

Методики й способи, які використовувалися відповідно до даного винаходу, описані в даному документі або здійснювалися відомим у даній галузі техніки чином, як описано, наприклад, у роботі Затьгоок еї аї., МоїІесшаг СіІопіпд: А І арогаїгу Мапиаї, 274 Едйіоп (1989) бої ріпа Натбог Іарогаїюгу Ргевз5, Соїй бргіпд Нагброг, М.М. Усі методи, які включають використання готових наборів і реагентів, здійснювалися згідно з інформацією, наданою їхнім виробником, якщо тільки спеціально не зазначене інше.

Приклад 1. Одержання моноклональних антитіл

Завданням цієї частини досліджень було одержання мишачих моноклональних антитіл, специфічних щодо СІОМ18 і здатних виявляти пухлинні клітини, у яких експресується

СГОМ18.2, у фіксованих формаліном і залитих парафіном (ЕЕРЕ) тканинах карциноми шлунка, стравоходу, підшлункової залози й легенів. (610) Щоб добитися утворення високоспецифічних високоафінних діагностичних антитіл проти

СГ ОМ18.2, потрібно було почати імунізацію із широкого спектра різних імуногенів і ад'ювантів. У ході цієї роботи близько 100 мишей (ліній С57ВІ/6 і ВаїІБр/с) імунізували відповідно до різних протоколів для досягнення імунної відповіді проти а«-СІ ОМ18.

Щоб стимулювати мишачу імунну систему й подолати імунну толерантність автори винаходу використовували вірусоподібні часточки (МІ Р), кон'югати з пептидами й рекомбінантні білки, які відповідають різним частинам людського СІ ОМ18.2, які були експресовані як рекомбінантні злиті білки з різними експресійними "партнерами" (мітками).

З 13 різних варіантів імунізації найкращі результати були отримані в результаті обробки мишей рекомбінантним білком, який має С-кінцеву частину СГ ОМІ18 ії гістидинову мітку (НІ5-

ТА) (див. Фіг. 2; імунізація Ж20) у комбінації з різними ад'ютантами (див. таблицю 1, внизу, злиття 35)

Один з кандидатів (35-22А) був отриманий після імунізації в 4 етапи (30 доби). Інший кандидат (43-14А) був отриманий після імунізації в 7 етапів (79 діб); див. таблицю 1 (внизу, злиття 43).

За дві доби до спленектомії, мишам робили бустер-ін'єкцію для активації В-клітин.

У день злиття в мишей виділяли спленоцити й зливали їх з мишачими мієломними клітинами лінії Ад98.653. Для злиття мишачих клітин з мієломними застосовували стандартний протокол, наведений у роботі Копіег апа Міїсїеіп 1975. Проводили відбір шляхом непрямого антиглобулінового тесту (НАТ) НАТ і супернатанти перевіряли шляхом твердофазного імуноферментного аналізу (ЕГІЗА) на наявність антитіл, які розпізнають антиген, який використовувався для імунізації.

Гібридоми, які відповідають тим супернатантам, які дали позитивну реакцію при ЕГІ5А, субклонували для одержання моноклональних гібридом і супернатанти від субклонованих гібридомних клітин перевіряли шляхом ЕГІ5ЗА. Гібридомні клітини клонів, які дали позитивну реакцію, розмножували й проводили подальше дослідження супернатантів.

Приклад 2. Перевірка супернатантів моноклональних гібридом методом вестерн-блотингу

Щоб установити, чи здатні антитіла в супернатантах, які дали позитивну реакцію при перевірці методом ЕГІЗА, зв'язуватися з рекомбінантним клаудином 18 або з білковими лізатами стабільно трансфікованих клітин НЕК293, у яких експресується клаудин 18, проводили аналіз методом вестерн-блотингу. Антитіла, які виявилися здатними специфічно зв'язуватися із клаудином 18, одержували у великій кількості. Клітини піддавали кріоконсервації й проводили очищення антитіл шляхом швидкої спорідненої хроматографії білків (ЕРІ С) із сорбентом

МАВзеїесі. Антитіла, відібрані після аналізу методом вестерн-блотингу, очищали й імуногістохімічним шляхом визначали їхню здатність зв'язувати антиген у зразках тканин, фіксованих формаліном і залитих парафіном (ЕЕРЕ).

Приклад 3. Гістологічний аналіз - перший рівень антитіл, які дали позитивний результат при вестерн-блотингу

Метою цього експерименту було перевірити специфічність і чутливість антитіл проти

СІГОМ18. Для цього використовували ЕЕРЕ-зразки нормальної тканини шлунка, у яких був експресований СІ ОМ18.

У першому досліді антитіла, перевірені методом вестерн-блотингу й очищені, брали в концентрації 0,5 мкг/мл і визначали зв'язування, використовуючи ЕЕРЕ-зрізи шлунка людину.

Антитіла, які проявляли достатнє зв'язування, і які не давали високого тла, далі розбавляли до концентрації 0,2 і 0,1 мкг/мл і для визначення їх чутливості й специфічності брали різні нормальні тканини шлунка. На більш пізніх стадіях розробки антитіла відразу після одержання брали в концентрації 0,2 мкг/мл, оскільки найкращі антитіла вже виявили себе досить добре при концентрації 0,2 мкг/мл, що служило орієнтиром. Для подальшого титрування й визначення специфічності відбирали антитіла, з якими було отримано найбільш сильний сигнал в епітелії слизової шлунка людини й не було тла в сусідніх шарах слизової. Виділялися два антитіла - 35- 22А і 43-144А; див. таблиці 2 і З нижче.

Антитіла, з якими було отримано досить інтенсивний сигнал у нормальній тканині шлунка, далі перевіряли на ракових тканинах. Відповідні гібридомні клітини адаптували до безсивороточного середовища. З антитілами титАБ 43-14А сигнал був дещо сильнішим, чим з титАб 35-22А; див. таблицю 4 нижче.

Приклад 4. Поглиблений гістологічний аналіз і характеристика антитіл

Антитіла, отримані без сироватки, використовували для фарбування мікрозразків ракової тканини шлунка (ТМА). Аналізували кількість випадків фарбування, інтенсивність сигналу й кількість клітин пухлин, що дали позитивну реакцію.

З антитілами 35-22А і 43-14А фарбування було досить інтенсивним. Між цими двома (610) антитілами не спостерігалося істотних відмінностей у розподілі фарбування й лише слабкі відмінності в його інтенсивності.

Приклад 5. Аналіз специфічності антитіл стосовно нормальних тканин

Відібрані антитіла випробовували на різних нормальних тканинах з метою перевірити їхню високу специфічність до мішені (СІ ОМ18); див. таблиці 5А и 5В нижче.

У попередніх експериментах не виявлялося істотної різниці щодо розподілу і інтенсивності фарбування при використанні антитіл 35-22А і 43-14А. Тому ці антитіла далі використовували в експериментах з фарбування тканин з більш клінічно-орієнтованим протоколом. Щоб імітувати процедури фарбування, які застосовуються звичайно в патологоанатомічних лабораторіях, був запропонований «одноденний» протокол експерименту, у якому був короткий (1 година) етап інкубації первинних антитіл.

У всіх проаналізованих випадках з антитілами титАб 43-14А виходили відмінні результати й з титАбр 35-22А лише небагато гірше; див. таблицю 6 нижче.

Приклад 6. Поглиблений аналіз стосовно епітелію дихальних шляхів

Додатково антитіла титАб 43-14А з метою перевірити їхню специфічність випробовували на різних тканинах дихальних шляхів, особливо на тканинах-мішенях легенів і бронхів.

Повідомлялося про експресію СІ ОМ18.1 у цих тканинах. Щоб визначити, чи присутня перехресна реактивність діагностичних антитіл запропонованих даним винаходом та і зоформою

СІОМ18.1, яка експресується в легенях/бронхах, перевіряли всі доступні тканини легенів/бронхів. У жодному із цих випадків сигнал не визначався; див. таблицю 7 нижче.

Ізоформа СІ ОМІ18, яка експресується у вивчених тканинах дихальних шляхів, не розпізнавалась антитілами 43-14А.

Приклад 7. Картування епітопів титАб 43-14А і титАбр 35-22А

З метою ідентифікування епітопів СІ ОМ18.2, які зв'язуються з антитілами, був проведений аналіз пептидів методом ЕГІЗА. Для кожного з очищених антитіл аналізували пептиди, які перекриваються, і охоплюють С-кінцеву частину амінокислотної послідовності СІ ОМ18.2.

Антитіла 35-22А і 43-14А специфічно зв'язувалися з пептидом ТЕОЕМО5УРЗКНОУМ.

Послідовність ЕМО5УРЗКНОУМ була визначена як імунореактивна.

Приклад 8. Аналіз амінокислотної послідовності титАб 43-14А і титАб 35-22А

Результати аналізу амінокислотних послідовностей антитіл 43-14А і 35-22А представлені на зо Фіг. 3.

Приклад 9. Фарбування різних ракових тканин

Для імуногістохімічного аналізу використовували зафіксовані 4950-ним забуференим формаліном і залиті парафіном зразки на предметних скельцях. Заливання парафіном робили відповідно до стандартних протоколів.

Препарати зразків депарафінізували й проводили демаскування антигенів шляхом кип'ятіння в розчині лимонної кислоти (10 мМ), який містить 0,05 956 Тмееп-20 (рН 6,0) за температури 120 "С протягом 10 хвилин, після чого блокували 2 9Уо-ним розчином НгО» та інкубували протягом ночі за температури 4 "С з діагностичними мишачими моноклональними антитілами проти СІ МОМ18.2 43-14А або 35-22А у концентрації 0,2-0,5 мкг/мл. Зв'язування антитіл візуалізували за допомогою вторинних антитіл, мічених перкосидазою хріну, використовуючи полімерну технологію із системою Ромегмізіоп (антимишачі козячі НЕР- антитіла Ромег Мібвіоп; Іттипоїіодісє, Дуівен, Нідерланди) і розчин хромогенного субстрату (уУесіоітед; Месіог Гарх, Берлінгем, США). Потім проводили контрастне фарбування зрізів гематоксиліном Майера (Сагі Коїт СтрнН, Карлсрує, Німеччина), результати якого піддавали експертній оцінці.

Гістологічна оцінка

Усі зразки аналізували, розглядаючи відносну частку пухлинних клітин, які фарбуються, відносно всіх видимих пухлинних клітин у даному зрізі. Інтенсивність фарбування оцінювали як негативну (-), слабо позитивну (1-4), помірно позитивну (2-4) або сильно позитивну (З).

Позитивним вважали лише фарбування мембран. Контролем (позитивним) у кожному випадку служила нормальна тканина шлунка людини. Оскільки при |інтраепітеліальній неоплазії підшлункової залози (Рапім) часто має місце інтенсивне фарбування ураженої тканини, ці області брали як внутрішній стандарт інтенсивності фарбування для сильно позитивної реакції (З-).

З обома дослідними антитілами було отримане сильне фарбування клітинних мембран у раковій тканині підшлункової залози, стравоходу й шлунка (таблиця 8), а також з антитілами 43- 14А у раковій тканині легенів (таблиця 9). Число "позитивних" пухлинних клітин варіювало у різних індивідів і в різних випадках пухлин. Переважна більшість зразків була "позитивними" (2) -(3). бо

Таблиця 1

Схеми імунізації для антитіл

Миша 5 Імунізація 220 - Злиття 35 прое! 30001011 Антен | Адювант | Уведення -

Дата Лінія . мМкл/ ра МИШІ | мклі| мкг | Позн. МКГ Позн. | Шлях | Об'єм

С-кінце- 1. вий Сетри 200 27.10. 2010 Імунізація С57ВІ/6| М5 |100)| 100 сс1в2- 100 ММ в/б мкл

НІЗ

С-кінце- 2. вий Сра- 200 4.11. 2010 7 Імунізація С57ВІ/6| М5 |100)| 100 сс1в2- 50/50 РТО в/б мкл

НІЗ

С-кінце- 3. вий Сетри 200 10.11.2010| 14 Імунізація С57ВІ/6| М5 |100)| 100 сс1в2- 100 ММ в/б мкл

НІЗ

С-кінце- 4. вий Сетри 200 17.11.2010| 21 Імунізація С57ВІ/6| М5 |100)| 100 сс1в2- 100 ММ в/б мкл

НІЗ

С-кінце-

Бустер- вий Сетри 200 24.11.2010| 28 ін'єкція С57ВІ/6| М5 |100)| 100 сс1в2- 100 ММ в/б мкл

НІЗ вв звхв| 111 11

Зо

Миша 5 Імунізація 220 - Злиття 43

Дата Процедура Лінія мкл зер лек ее пок | штяк | оон, пи С-кінцевий Сетри 200 до С-кінцевий Сегтби 200 до С-кінцевий Сегтби 200 до С-кінцевий Сегтби 200 5. С-кінцевий Сетри 200 с- 05.01.2011 7. Імунізація ВАЇ В/с кінцевийсС182 Согри -НІ5

Бустер- Сегтби 200 12.01.2011 77 ін'єкція ВАЇ В/с МА 1001 100 100 ММ в/б мкл

Таблиця 2 титАб (т), відібрані шляхом вестерн-блотингу . Суб- |.

Номер Анти: ; Епіте- клітин Тлоу лм. ; препа- Ткани- (|Анти- |тіло Кріо- / лій ний пози- власній фоци- Суди- ) Гладкі р на тіло конкуру- | Парафін | слизо- тивних |пластин- Вис |ни м'язи рату М розпо- й . ти юче вої й клітин |Ці діл псиз век росех зантя ляже ст | 50111 11. 910 43-14А|0,2 мг/мл|Парафін| я |т | 90 | - | - | - | -

Таблиця З

Порівняння антитіл 35-22А і 43-14А на нормальній тканині шлунка людини (ЕЕРЕ) т - мембрана, с- цитоплазма, п.а. - ядерна зона тТкани- Концен- Епіте- |Субклі-| 95 Спо-

Препа-| на, (|Анти-| трація |Про-| лій |тинний |(--)- атіпа|/Лімфо-|лучна |Суди-| Гладкі Примітки рат ІО |доклад-| тіло |(антитіла| яв |слизо-| розпо- |клі-І ргоргіа| цити |ткани-| ни | м'язи р но вої діло |тин на

Дуже сильне фарбування мембран в епітелії шлунок! З35- 0,5 1:30 -, 11 413 5 22д Ммкг/мло хво 77 т слизової; у стромі, судинах і м'язах тла немає

Продовження таблиці З

Антитіла 43-14А не перевіряли в концентрації 0,5 мкг/мл, тому що антитіла 35-22А були ефективними вже в концентрації 0,2 мкг/мл, що служило орієнтиром

Сильне фарбування мембран в епітелії й слизової; 11 оув|ШЛунок 35 01 12301 т у стромі, 1 22А | мкг/мл | хв. судинах, м'язах або власній пластинці тла немає

Сильне фарбування мембран в епітелії слизової; шлунок | 43- 0,1 2:30 г 11 975 1 14 мкг/мло хво | т у стромі, судинах, м'язах або власній пластинці тла немає шлунок! З35- 0,2 2:30 Сильне 11-907 5 22А | мкг/мл | хв. | 77 т фарбування мембран в епітелії слизової;

Й й у стромі, 11 910 плрох й про 7во ж т судинах і

І м'язах або власній пластинці тла немає

Таблиця 4

Аналіз ракових тканин - ТМА127А т - мембрана, с - цитоплазма, п.а. - ядерна зона) й Суб- о Нор- Й

Номер Концен- | Кріо/ Пух. клітин- їь мальні Спо -

Тканина, -| Анти- - линні - (9)- --: | лучна | Суди- | Гладкі препа- Тканина їй - трація | пара- | Прояв - ний - | епітелі- , докладно тіло - : кліти- клі- - |ткани-| ни м'язи рату антитіла| фін Розпо- альні ни й тин : на діл клітини

Шлунок |ВО4/01221 Й Пара-!| 5. 11 474 РАК (в) 35-22А (0, мкг/мл фін 2:30 хв. | ---/--- т ЕЕ п.а. шишищи

Шлунок |806/09514 Й Пара-!| 5. 11 474 РАК (1-5) 35-22А (0, мкг/мл фін 2:30 хв. | ()/ с/т 10 п.а. шишищи

Шлунок І|ВО5/09809 Й Пара-!| ,,.

Нирка І|808/13471 Й Пара-!| 5. тоатар мере ДРОВ 35-22А (0, мкг/мл фін 2:30 хв. щи п.а. о п.а. шищ п.а.

Шлунок |ВО4/01221 Й Пара-!| 5. 11 475 РАК (т) 43-14А 0, 1мкг/мл фін 2:30 хв. | ян т ЕЕ п.а. шишищи

Шлунок |806/09514 Й Пара-!| 5. 11 475 РАК (1-5) 43-14А (0, 1мкг/мл фін 2:30 хв. | ()/ т/с 10 п.а. шишищи

Шлунок І|ВО5/09809 Й Пара-!| ,,. потінюкавнтв рн лях рляен тре зюю| ста о 11

Таблиця 5А

Аналіз нормальних тканин (т - мембрана, с - цитоплазма, п.а. - ядерна зона)

Номе Антитіло пнсл клин: Сполуч- Жиро- р Тканина | Анти- |конкуру-!| Кріо- / - Ще | 96 (ю)- ІЛімфо- У Су- |ІГладкії ва препа- |Тканина Я - - |Прояв |клітини і| ний - на ' іа тіло юче |Парафін клітин | цити дини| м'язи | ткани- рату функц. розпо- тканина на тканина| діл пови Пон етрею рвая явні ни п 51111

Шлунок 02 ; .

Ко о зо но я с НечИ НЕЗН С НЕ НОРИ НЯ НЕ Я

Товста | Товста 02 - й

Кк Но С ННІ КИ НС НЕ ННЯ НЕ НЕ Я

КЕ ее ее он я З Ше УЧИ НЯ НЕ НН НН НЕ НЕ кишка | кишка 2 мкг/мл плов, ниж |никаг вся он тен (тет пхстя пнха (ника ення нови ляноніетв| тла 1211 пово лиття Петя ся ноя Пяненіоєт| (тата полка лення Ілиенит нет ори ення лет 2212119

Підшл. | Підшл. Й 02 - ,

У рост са НК У СС КИ СІ НЕ НИ НЕ ПЕНІ НЕ

Підшл. | Підшл. Й 02 - ,

Ко ркккса во Не я С ШЕ КІ ЧИС НОРИ НЯ НЕ МЕН пово печна Печнатвягя моя Пяненіогт| |та - Печінка 02 ; . пл пенал тя ори евнон елв| | тала 1211

Таблиця 58

Аналіз нормальних тканин - 43-14 А

Н Концен- Норм. | Суб- оо Спо- Жи- омер й - епітел. |клітин- й й

Тканина - трація Кріо/ - - - | (-)- ІЛімфо- /лучна| Су- Гладкі рова препара-| Тканина й Антитіло : - |Прояв |клітини і| ний й , іа антитіла. | парафін клі- | цити / тка- |дини| м'язи | тка- ту функц. |розпо- й тин нина нина тканина| діл

Підшл. | Підшл. | 43-14А - й 11 1748 запоза | запоза 5 оЕ 0,2 мкг/мл |Парафін| 02:15 п.а. | па.| па. по ох ше| 111111 43-14А - , 11 1755| Нирка |) Нирка З ФЕ 0,2 мкг/мл |Парафін| 02:15 п.а. | па.| па. пот оно ртногя МО шв| ит, 111 43-14А - й 11 1758| Серце | Серце 1 оЕ 0,2 мкг/мл |Парафін| 02:15 п.а. | па.| па. 43-14А - й 11 1759| Серце | Серце 2 оЕ 0,2 мкг/мл |Парафін| 02:15 п.а. | па.| па. т - мембрана, с- цитоплазма, п.а. - ядерна зона

Таблиця 6

Аналіз нормальних тканин - "одноденний" протокол препа- : .: антиті- нальна на нии . на ' на на ій ТІЛО яв - КЛІТИН цити ни м'язи | тканина рату ла. тканина |тканина| розподіл тканина 11 2092) Шлу- (Шлунок 43741 01 93:30| з/нни | па. т 590 нок 9 А |мкг/мл

Шлу- Шлунок 35-22| 0,1 ,

Шлу- Шлунок 43-14|. 01 .

Шлу- Шлунок 35-22|.01 , сире ни НН НН З НЕІ НЕНІ НЕ МЕНІ ШЕ

ТМА | ТМА /|438-14| 01 ,

ТМА | ТМА /|35-22| 01 ,

ТМА | ТМА /|438-14| 01 ,

ТМА | ТМА /|35-22| 01 , т- мембрана, с- цитоплазма, п.а. - ядерна зона

Таблиця 7

Аналіз нормальних тканин дихальних шляхів т - мембрана, с- цитоплазма, п.а. - ядерна зона

Номе Кон мальні Суб- Кк Спо- р Ткани- Анти- ц. : клітин- (- Лімфо- лучна | Суди- | Гладкі препа- Я Я антиті- епіте- - й ' ату на іа тіло па піальні ний клі- цити ткани- ни м'язи р й розподіл тин на клітини легеня тиАВ 02 легеня тиАВ 0,5 легеня тиАВ 02 легеня тиАВ 0,5 легеня тиАВ 02 легеня тиАВ 0,5 легеня тиАВ 02 легеня тиАВ 0,5 легеня тиАВ 02 легеня тиАВ 0,5

Продовження таблиці 7 тиАв43- 02 птете|врон доми) 7171111 тиАВ 0,5 тете|вронхит зрад меми) 7170 тиАВ 0,2 и-лете бронниг ла | мн| 71071111 тиАВ 0,5 оптете|оронхио дзтад о меми| 7170 тиАВ 0,2 леви |оронхиз зад о меми| 71171 тиАВ 0,5 леви |оронхиз зад меми) 71171 тиАВ 0,2 повели |і 11911411

Таблиця 8

Аналіз експресії СІ ОМ18.2 у ракових тканинах стравоходу, підшлункової залози й шлунка з використанням мишачих моноклональних антитіл 43-14А і 35-22А клітини -)- клітин

Рак Ацинарна н/гот10/110869 Ма 43-14А | підшлункової карцинома залози 1125005.22 43-14А піді ї | Нейроендокринна . - підшлункової карцинома ж 70 залози

Рак Нейроендокринна нН/2006/227977Д|А 43-14А | підшлункової карцинома залози

Рак Нейроендокринна вов/6284-МУС 35-22А | підшлункової карцинома, залози МЕТ С11

Рак Нейроендокринна вов8/8549-4 35-22А | підшлункової карцинома, залози МЕТ С1

Рак во5/8523-3 35-22А | підшлункової РОАС в 1 залози

Рак воб/16136-МР2 35-22А |підшлункової |РОАС ни 50 залози

Рак во7/14168 35-22А | підшлункової РОАС ж залози

Рак вО7/14935 35-22А | підшлункової РОАС залози

Рак вО7/2633-ПІЗ 35-22А | підшлункової РОАС з залози

Рак во7/7430 35-22А | підшлункової РОАС ж залози

Рак во8/5618-2 35-22А | підшлункової РОАС з залози

Рак в10/14198-уУС 35-22А | підшлункової РОАС з залози велехох | веж (шен 60001101 підшлункової

Таблиця 8

Аналіз експресії СІ ОМ18.2 у ракових тканинах стравоходу, підшлункової залози й шлунка з використанням мишачих моноклональних антитіл 43-14А і 35-22А клітини --)- клітин пили І ПЕТ ЕТ ПОЛЯ ПОЛОН КО

Рак

В11/2059-0 35-22А підшлункової РОАС ж залози

Рак вВ11/4084 35-22А підшлункової РОАС ж залози

Рак 1125005.30 43-14А |підшлункової РОАС залози

Рак 1125005.27 43-14А підшлункової РОАС ж 10 залози

Рак 1125005.24 43-14А підшлункової РОАС ж 50 залози

Рак 1125005.23 43-14А підшлункової РОАС ж 100 залози

Рак 1125005.25 43-14А підшлункової РОАС ж Ко) залози

Рак 1125005.28 43-14А підшлункової РОАС ж залози

Рак

Нн/2008/13074 43-14А |підшлункової РОАС ння 40 залози

Рак

Нн/2008/13194 43-14А |підшлункової РОАС нини 50 залози

Рак

Нн/2г008/380 43-14А |підшлункової РОАС з залози

Рак

Н/2009/11847 43-14А |підшлункової РОАС ж 15 залози

Рак н/2009/20336 43-14А |підшлункової РОАС з залози

Рак

Н/2009/23598 МИ В 43-14А |підшлункової РОАС ння 40 залози

Рак

Нн/2010/11569 43-14А |підшлункової РОАС з залози

Рак

Н/2011/17191 МА 43-14А |підшлункової РОАС ння залози

Рак нН/2009/4917 43-14А підшлункової РОАС ж 70 залози

Рак нН/2010/15941 43-14А |підшлункової РОАС нини 50 залози

Рак нНн/2010/6709 43-14А підшлункової РОАС ж 70 залози (вое/1491-П-2 | 493-14А І|Ракстравоходу|Аденокарцинома | - - | 0

Таблиця 8

Аналіз експресії СІ ОМ18.2 у ракових тканинах стравоходу, підшлункової залози й шлунка з використанням мишачих моноклональних антитіл 43-14А і 35-22А 10ро6684-П-3 | 43-14А |Ракшлунка |Аденокарцинома | (з //| 8071 (1125005.6 | 43-14А |Ракшлунка |Аденокарцинома | з | 90

РОАС-протокова аденокарцинома підшлункової залози

Таблиця 9

Аналіз експресії СІ ОМ18.2 у раковій тканині легенів з використанням мишачих моноклональних антитіл 43-14А

Вовлаьва | ой мклмло | бронхоальвеолярні 30000312

Вовлезазлув | бо мклмло | бронхоальвеолярні 11110111 вола 00 | бамкимл 0 карциноїд 00101101

Вотвават? | бамкимло | харциноїд 33331111 вовіззват 001 бамклмло | хардиюїд 33333001

Вовлогезт | одмкимло | карцинома, спиноклтинна 21010131

Вобловвотія | оо мкмло | карцинома, крупноклтинна 10310121 овобловао-ле | бамк/имло | аденокарцинома.//-/:/Ї1117 111111 вовловуєт | бомклмло | аденокарцинома 11111111

Вотераєв 00 б меумло | аденокарцинома 11111111

Свтолата? 00 | бамсмло | аденожарцинома 11011111 вВовлтазиз 00 бо мсумло | аденокарцинома, плоскоклтинна 11012301 овозлуетвї 00 | бомку/мл | карцинома крупнокллиннад/ 17777111 вотоловіє 00 оо меумло | карцинома, плоскоклітинна 10100020

Вовізгого 00 бо мсумло | карцинома, плоскоклітинна 11011102 овов/лазаМ | бомку/мл | карцинома плоскоклітиннадГ 17777111

Вовяво 000 | бмеумло | карцинома, плоскоклтинна 10117102

Свтліма 0001 бомсмло | карцинома, плоскоклітинна 11011111 ов'олбте | бомку/мл | карцинома плоскокліиннадГ 17777111 ов'олтоє | бомку/мл | карцинома плоскоклітиннад 17777111

Свтолетює 000 | бмс/мло | карцинома, плоскоклтинна 10117102

Продовження таблиці 9 вотетатв | оамкомл | аденокарцинома світлоклтинна 133331: во8/16425-2 крупноклітинна нейроендокринна

ВОВ8/3019-У3 недрібноклітинний рак 7-11 вов8/1099 УЗ недрібноклітинний рак легені кв вов8в/12010-2 недрібноклітинний рак легені в10/17662-1З дрібноклітинна карцинома виш

ПЕРЕЛІК ПОСЛЕІДОВНОСТЕЙ

«ЗНІ» ГАНІВЕД ФАРМАСЬКТІКАЛІ АГ «120х АНТИТІЛА ПРОТИ КЛАУДИНУ 18.2 ДЛЯ ДІАГНОСТИКИ РАКУ «1305 342-970 вт «1505 ВСТ/ЕР2О12/001991, «151» 2012-05-09 «160» 25 «370» Патентована версія 3.5 «ів 1 «гії» 261 «812» Білок «2132 Номо барів «М З мес зег тйг тик тик Сув аїй уві Ууаї Аїда ве реч цеу б5ег ї16 гео 1 З и) 15 сім бен Аіа сім Сух Та Аа А1Зз тТнеК о сіу Мет Авромеє твор обБек о тнг 20 25 30 сіп А5р бен туг Ар о Аз Рго Уаї ТйгоБегомаї Ре ої тує біо у 35 40 45

Мем тер Ага бБає о Су уаїЇ ага бій бег о беб сіу ве так обі Суб Ако 50 55 Бо

Рро тує вве тТВг о їІ1е ей бі бер ркго АТ Ме вен бів АТа ма! Аго 55 70 75 о

АТа бен Мет її уаі б1у 16 маї без С1Уу Аїз Ж1е Су мбеб бе» ма! 85 зо а

Зек х18 р АТ Бен вух Субх їі дго Хе пі Зег меє бін Ар 5ег ою МК 1

АТа фу Аїд Аби Мет ТРгосец ТвК бак Сту ЇТе Ме Ре ї1їе чУаї Зег 115 120 125 біу бен Суб Аіа те АТ віх чаї зег чаї Ре Аїа Ап мет цен ха 135 140

Те оди Не тер меж зак о тнг о АТа адап мет тук тк осіу мет ту соїу 145 150 155 160

Мебє ма! бів Тиг Уа! бій тиг оАгО тує те вве ОЇУ Аїд Аїд ре Ре 165 170 175 тУаї оту Тктроуа! АТа біу біу фец тре ойец тів Ту біу Ууді Меж мес 180 185 196 су ІТе Аа Суб ака бі сецз Аза вго біб біц тТВк оахв тує вух дід 195 200 205

Уа бек Туг Ні Аїа зег у Ні Зег ма! Аїа Туг бух Рко біж у 216 24. 220

Ре сух Ай Бек Тк біу не С1у Бек Ази Тиг цу Авп ув Ку т1є 225 230 235 240

Тук аборту Б1у АТа Аго твк о бім Ахр бій Уа! бій Зек тує рго Зев 245 250 255 ув Ні а5р Тук чаї «БО «2 «2І1їх Б «Й52» Білок «213» Ново зарієть «а

Мет АТЗ Уа! те о АТа Си біп біУу їн біу впе УЗ! Уві Заг Кей Те 1 5 юю 15

Фі жш16 Аа б1у тТе Іїе АТа АТа тиг о сСух Меї Авр біп Тер Бек Те 20 25 30 сів Ар осец Тук Ап дяп реко Уа! ТК о АТа чаї Ре деп тує сій Фу 35 40 45 іекн тго Агу бек сСуз Уа Аг бід бЗег бег біу Бе те біб сСуз Аго зо 55 БО сіу ТУук БМе ТИг Бей їец 01 зер вко А1а Меї бен біб Аза ма? Ако 65 7а 75 Ко

Аїа це мек Хіє чаї 6ТУу ЇїТе ма! сен біу Аїа Хіе сім бем бен Уві 85 90 55

Бек ХТе Ре Аїд ен му5 Сми5 Та Аго ї1е б1у бек Меб піц АБр бег 100 105 310 аТа фу діа аз Мет Тиг оїец Тнгобеє біу Ті мет Ре Же Уаї 5Зег 120 125 су бен Сух діа ї1іе діа біу маї бек уаї Ре Аї3 Ази Меї Ген ма шле ї35 1

Трг АВ РНе Тгр Меб его ТВе Аїа Ай меж Туг твг сту Ме біжЖ бік 145 150 155 160 меж жа! біп твк Уа! бій тйг ага туго Тве рНе б1іу Аїя аАТа ву вна

Ме 179 175 ча! сі Тер Уа? Аа сі бі без теє Мен Хі біу Єї» Уа! Меж мес 180 155 не)

Сук Ії діа Сує Ага бі» без «їз вго бін бій таБодха тук гу діа 395 Жов 5 маї ес тує нія АЇя его сіє Ні Бек уаї Аа Тут щує рго сі бів «юю 235 220

Ме кує Аа бек Тие о біу РМе бі бек дбав Тк руб Ачи ух ув Се ха ЗИ ха 4

Туг Ар обі сіу аТа ага твгоєїш дер бім ма! сбіп бег тує рго бек 45 2 «5 ів нів ар Тут Уві с «2Айх З «11 64 «Без БіЛоК «213» Мих те5сеіце «М» і ет бек ві п Аїа бух іп Біу веб біу ве чаї чаї бег бен їв 1 З і10д 15

СТУ Ре Аїя бі ків тів Аа Аїа ве Сує Мет Ар бів тро ек тн за сій звів Тв Аза Аза ро маї тк о Афа за! Ре Ап тує бів Ту зо 45 сен тер Агу Бег бує Уві Ага бі чек як біу вве ТВк бів Суб Аго зо 55. о сі тв вве Твг о беб рен біУ сеу го Аа Мет чер біп Аіа Уві Ага

З та 75 ВО «іа гец меж хів чаї 51 І1е УВІ меи біт жа! Хе сту її кеш мяї 85 Фо 9 са їіє ве аїа гай ітєЄ суб Та лез Ка СТУ Заг о мек леру вро бак 100 106 116 ліз уз аїа ву Меє ТВг рен Твг бек біу ХТе рей бе її ке заг 115 120 135 сі Хо Сух АЇа І1е 3фе біу ча! чек ма! вне дія АБА Мет ви хаї їза 115 140

Ти Ап РНе Ткр МЕї бБегє Тне Аа Ал о Мек Тугб Зак обіє МеК ЄСТУ 15 145 ва їх їі650 мет 1 сі мет чаї сій тако Фаф бів те аг тує Те Ре біу АТа 165 їі 175

Аїд іс рве хаї біу тер уві аа су б1уУ ей те бен тів Ту оту і5о їй 19о чаї меє Мет СеУ5 Ті Аза сСуз агРО бІж Кеш Те орга аеро Абр Заг АсЙ 205 пе іт вів шкі Звбеотекє ні Аа вк обі бів аа Уа! АТ туго йго ій 215 220 его біу Бі рве куб Аїа Зак тр осіх Ре щу Зак дай ТАР аку Ас е я 240

Гуз м Хе тУук дв бу Офж Аа Ага ївае бів зв азр обі бій баг

Ї -а5 ай «й

Нія гга тВЕ кує ту дяр тує тд 20 «ее 4 «їй ЗК «ей Білок | Й «132 штучна постідовність «ий» й «йаЯ» Кеансенсусня послідовнасть «ав. єЕйіх віЗн' властивості «ее БАБІ «геї» Змінні міноакислоти «Нх 4 мет зе чаї Ти" вій Суб Бій сіру меш сіро кне ма! уаії зве без ї1е і 5 10 Ії сім хай іа бі хів хЇе Аїд АТа твг Су Меї Ар сія Теробеє Те 2 25 30 іп аАхр раю туго Ахп Ав РКО ді ТР ОАТа МЖ) Ре ахи Туг сій Су іви Тероагоа бег Ст уаї агРШ бін бек бее БТУ Бе о тве бів Суб АгО 5 ер біж тег овнє те обу вес сту ібн Рг Аза мег ей сів Ата та? Ако 65 то ї5 | що

Аз мезо мет їі Ууаї сі кТе мя! Гей бі Аїа ХТе Бім сем о ївш ха! чо 95

Зег Хів Рве Аа зем вуз Су Ті дго 126 біх б5ек мет біц ар оБає 120 105 мо аід гує Аїа деп мет Те ви тве Заг бі ЇТ1іе мес ва ї1е ма баг їх го 125 сіУ ви Сх АТЯ І1е від сім мі бек оув! вне ад деп меж би чаї і30 135 140

Те абап не Те беж зав те Аїа два Мет ЦО сі меж сію біж 145 ї50 155 їй

Мет ма! біл отве Уа! бів Тв Ага Тек тТве ре 1 АТа Аа ре ве 155 кН) 185 ма! щік Тер Уа Аза сїУ бі ей ТВг без тів 61 бі жаї Мес Ммеї 180 155 ї90

Сує тів Ата сСує Аго біУ мен АТа кро дію бій ТАг дай Тук губ Аа 5 о 205 маї ек ТуУук нія Аа бег бі Ні зег жа! АЇа Туг сух РгО бу бу кА) 815 22

Ре ім Аа Зак тТвк обі1у ве спіу бБег Аєп ТВг о Буз Ап уз ж ї1е в: 3 235 ад тТуг Ахп сф біх аїа аго тако біШ Абробів ма? бій баг тую вго Зег г45 25 «я

Суб Ні Аєр о тує ча!

ОО

«іх чаї ІЗ «віж» Білок «еї3» Штучна послідовність «й «фи3» пептид для імунізації «Ой» 5

Тве біш Ажробін о ма! бій бек тує Рко Звгогже Ні й5ш тує та 1 х З їх «М «31 45

«афй» /Білок «213» Штучна ПОСЛІДОВНІСТЬ

Бе: , , І «иаЗз ПепПтид для їмунізації «а005 й січ чаї бій Зее Ус ро Зег бує нів абр оту чаї 1 5 16 «ЩЕ «21їз 3 «ее Білок й . «ЇЯю мив пресу «ах мет Ата тер оУа1 ТРА тТву цей без рМе еп Мет АТа Аа АТа бій зе 1 я 10 15

Те бів аїа бій Хі сфукією а! Сів ек обі го зів ем вих рук 20 25 за пе сі бін Жне таї уз ті Зек обу гу Аїд Зегобію тує Твк РКа 15 чо 45

Те дер тує зЗвге її мі Теромаі вуз бія в'я Кг сіу мух Су це

Бо рун тгромеї сіє тгротіе дей отвк біз ті сїу жаї вро те тув Аза 05 та та 8 яр азо ве У сіу аго Ре АТ вне ек рей біш тик Заг АТа бег 5 за 95

Те Аза тУуг без обі лів ал ази ж їз Аа бій ар оте АТа тве 100 15 ца

Туб РМе Суб АТа ад оаго Тв бу РНе АБО тує тгросіу сій бі тв 115 20 125

ТВКоїеш тнє маї Звгояег 130 «0: В «їі» 8 «ЖІїз» Білок «2135 Мия висии «400» й

Бім тут тТпг вів тве ар отуг баг 1 5 «а З «її» й

«217» Білок й «Ії» Мує висоти «й» З

Ті лев тТве осв тТвг одіх Уві вка 1 ю «ве 1 «кі» В «Ф21й2е Білок ! «Вії» Ми песити5 «а 30

А1а ага дго те об1ім ебе йвротук ії 5 «кшШ «ФМ» 132 «ій» Білок «213» Миз вивсцічя «й» 1

Меї Аг Не щег аїа бій бе Кей обі Бенц вер а мем Тер одї1е вго 1 2 10 Що с1у зЗев ТНК АТа ав Хе уз! мес те БІ АТЗ Аза Ре бек ХТа вкоа 90 25 о

Уаі те ївн біу Те зекодій ев її бег Се АР бек заг о гуя вяп «0 «5 мем іен нів бек ар йіу їіє ТВР ТУР вец Туг Тер оТує без СТА аеФ ща а БО го сїу біп Зеє вго бій Бец ім Ті Туг дид ув! бек деп сви А1а 65 7 т5 80 его діу Уаї Рго аб ага вре бек сту бегобіц хек осі тНе Або РБе в ЗО ч5

ТВи сем ага ІТе бег аг о Маї Бі Аа біб аеро оуа! бім маї тує тук мю ї05 шо сСуз чаї сій ма) баб ту їв вро рве тв вне бі бік бБіу Тв ж 115 120 125 севос1ів Хе ув 130 «М» 12 «ех ЇВ «217» Білок шо «и1їх Мох шия

«й 1 . ууз й сен овен Мія Зак ар бі Ха так туге ї 5 за «их 3 «Ії» з «Мі» Білок й «аїЯх Ми5 виземіця «ай 13

Ага чаї зе і «Ме 15 «їх З «ай Білок «813» Ми5 визсміце «ай 18 чаї сій мя! іец бі: сен веб ее те

Е КІ

«210» 15 «іїз й «ай БІЛОК «213 Ми висі «ап 15

Меї аяп рНе Фі Бер бек бен ті бе ре ма! себо хв! ви су сту

Е Ж и; ї5 маї бій Се біш жа) ніз без жі бів; бег сіу б1ж бТу ем маї уз

КО 25 за вго бік біж бек ве; су сви его Сух АТЗ а1а Зекобіу Ре тн вне 15 чо 45

Зек зег Тук Аа Мет Зег Тер Уа! кб осів тк оРго би уз АКо ви в 5 бо бій тер Уа? АЗа тег отів бек Аєр сіу б1у бек о тук бег туК Ту орга

Б то То КО

АвроАБи Ма? уз бім лго рве Твг о Кіе звго Ага хр оАвва АЇЯ рух Ач «і Ух дви ей стук ке ЯМ зер дес Ні сей вже їек зіва ази тк Аа Хе 109 105 ца тТуг ТУуг Суб АЇ3 АКО АЗр озер Туг Тег дер АВ Зег туго таї ага Адр іїх 120 325

Тут тер бБіу бів біу Тве о ївк бе Тс Уаї бек зве л7е 135 143 «вх 16 «ії» б заійе Білок ще ха135 Мих пибсміня «а0йх 1 пі вне Тс інж его зво Туг АТа ії 5 «ЕМ І ке й «ит» Білок Й «1їх Мих торент «Оп» 17

Її6 Бек яр сію б'ю Заг Тугб Зег ї ї «М» 46 ка «ЯБЯ» Білок І «Її Мих визеціце «аю ЗЕ

АТ Ага А Зак ТУК о ТУуг дер аби Зек Тек УА Аграр тТМк ї 5 10 «іа 19 кеїії» 157 «ей» Білок й «аїїх Ми шиеесВіце «ше ІЙ

Ммеє аго Тк ого АТа бів вне фен бі Тіє їеб ем без тгр вне вко 1 5 то її см Жіе ух Си» дер ХТе а Мет тег сій Зег о рго Зеб озвб МеК тує 20 Ка за аТдж бег бен бі біз ага уаі бег Ж12 ТВ Суб буз АТ бек бів Абр; 15 40 45

Те ази твг об Тен обег о тго ле сіл бів їух Рго о біу Сух его его 52 БО іа Тв іє Хі Тег ат тьк Аза АгЯ рей ї1іс Азр о бву А ко пек що 70 З ко

АКо кв дек сію бек біу чек обію бій Або Тек бер овен тек те бек 5 БЕ ча его мен Ар Ту біО ар мес сію Хе Ту Тег се веб бій Тук вер їй їі о сш фе ко іем тк Ре сім Аїд бік тігогме ев обім Мер ом 31 120 125 «Щі» 0 «г» є «аж Білок «2115 Ми5 пювебТи» «ай» 0 сів аар тів дя тв Ре ї Б. «їйх 81 «з З «Їйх Білок «Ії» Муи5 вести х «00» «1

Аго ти АБИ 1 «НЕ Во «аз З «212» Білок «їз Ви висі «Ще 48 іев сів тук Ар сін Ре го веб тТНе 1 є «ев 4 «Вії» 330 «аї2» ДНК Й Й «ії» Штучна послідовнЯєть. «ее | Й І щ «йі3х Неклеїнава кислота, яка кодиє пептид для зи зак «ах й зІсасплетї стсатсятся ТсвІсаЕсЗЕ сосакодетя дсаєдастою тподасвосаа ЕН зідеоотсодо аїстовасоя сракзасові заодаєсоах ододаєссяя дстсововта 120 аатосаєсо ссеассадод ссковсаєса сазодазаєса астасазаує суттє 150 свтсестсай ассзсааках тосстасайо сетодаочоєт ссзаовссву састацех о сп ссваса ссавааасай давдатаєає часоваодвто сссасаєвов ддасвадеєа вч слатсітаєс сттссавоса соастатато 30 «РАМ 24 «аз М «їй» Білок | й «21» тжчна вБосСлідевність «ей

«223» пептид для імунізації «00: тя меї Ага сію зег нів нів Ні ніх мів Мів сік Меї А1а Зек меж тк

Із х хв їз сію бі бБіп бів Меї бік Аго Ав осей Туг АЗроабр Ар др ух АБр 20 ях З

Агротеробік его от бен бій меж Мес суб ків АТЯ Суб ага ТУ гей 35 СК 45

Аїя вго біб бів твк оди Тує гук АТа ма! Зег оте Ні АТа заг су

ВТ; з БО

Ніз Зег ма! АТа туго вуз Рг б1у с1у Ре су АТа Зег ТВ Б1У Ре 65 7 75 о бін бег аби Тг ор дБ ре ім5 Ї15 Тук авроБіх б1у Аа Аго те 85 чо За сім ар осіш Узі сів бевб Те рго 5еає їує Ні5 дер теє Ма 100 КН що «ШК 8 каїї» 71 «адез Білок і . «8Ї5» шШтуУчма посадові єть кое «нах пептид для інумізації «0» 25 мес мес су ЖІе ата Су ако б1ж Бей ата РРО сто 10 ТВР одн туК 1 5 10 їх їуз Аїд за! зеготує іє ій зек обі нія зебомаї від тує бух РКО

Ке 25 30 ій Бі бе без дій ее те ос1у вне біу ве ойхп Те су аз ру я «а вує Ії тує др Бі біу аа дк тве бів бр обіш Уа! бій бек тує 1; 55 КО вро век реа НЕя дере м пу то

Claims (16)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, яке: (і) зв'язується з пептидом, який містить амінокислотну послідовність ТЕВЕМО5БУРБЗКНОМУМ (5ЕО ІО МО: 5) або ЕМОБУРЗКНОММУ (5ЕО І МО: 6), і/або (і) зв'язується із клаудином 18.2 (СІ ОМ18.2), причому зазначене антитіло, або його антиген- з'єднувальний фрагмент зв'язується з СІ ОМ18.2 шляхом зв'язування щонайменше одного епітопа в молекулі СІ ОМ18.2, амінокислотна послідовність якого ТЕОЕМОЗУРЗКНОММ (5ЕО І МО: 5) або ЕМОБУРБОКНОУМ (5ЕО ІО МО: 6), де вказане антитіло містить: (А) -к . . важкий ланцюг антитіла, що містить: послідовність СОВІ1 згідно з ФЕО ІЮО МО: 8, послідовність СОВ2 згідно з ФЕО ІЮО МО: 9, послідовність СОВЗ згідно з ФЕО ІЮО МО: 10, та легкий ланцюг антитіла, що містить: послідовність СОВІ1 згідно з ФЕО ІЮ МО: 12, послідовність СОВ2 згідно з ФЕО ІО МО: 13, та послідовність СОВЗ згідно з ФЕО ІЮО МО: 14, чи (В) важкий ланцюг антитіла, що містить: послідовність СОВІ1 згідно з ФЕО ІО МО: 16, послідовність СОВ2 згідно з ФЕО ІЮО МО: 17, послідовність СОВЗ згідно з ФЕО ІЮО МО: 18, та легкий ланцюг антитіла, що містить: послідовність СОВІ1 згідно з ФЕО ІЮО МО: 20, послідовність СОВ2 згідно з ФЕО ІО МО: 21, та послідовність СОВЗ згідно з ФЕО ІЮО МО: 22.

2. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за пунктом 1, яке відрізняється тим, що зазначений СІ ОМ18.2 є пов'язаним із клітинною мембраною СІ ОМ18.2.

3. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за пунктом 1 або 2, яке відрізняється тим, що зазначений СІ ОМ18.2 присутній на ракових клітинах.

4. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за пунктом 3, яке відрізняється тим, що зазначені ракові клітини є раковими клітинами, у яких експресується СІ ОМ18.2.

5. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за пунктом З або 4, яке відрізняється тим, що зазначені ракові клітини вибирають із групи, яка складається з ракових клітин шлунка, стравоходу, підшлункової залози, легенів, яєчників, товстої кишки, печінки, голови-шиї й жовчного міхура.

6. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за кожним з пунктів 1-5, яке відрізняється тим, що воно не зв'язується з нераковими клітинами, за винятком епітеліальних клітин шлунка.

7. Антитіло, або його антигензв'язувальний фрагмент, за кожним з пунктів 1-6, яке відрізняється тим, що воно не зв'язується з нераковими клітинами легенів.

8. Антитіло за кожним з пунктів 1-5, яке є химеризованим, людським або гуманізованим.

9. Антитіло за кожним з пунктів 1-8, яке відрізняється тим, що воно є моноклональним.

10. Антитіло, яке вибирається із групи, яка складається з: () антитіла, продукованого клоном, депонованим під реєстраційним номером О5М АССЗ3144 (тиАВ 43-14А) або ОБМ АССЗ3143 (тиАВ 35-22А), або одержаних з нього; (і) антитіла, яке є химеризованою або гуманізованою формою антитіла за пунктом (Її), (ії) антитіла, яке проявляє специфічність антитіла за пунктом (Її), і (м) антитіла, яке містить антигензв'язувальну частину молекули або антигензв'язувальний сайт антитіла за пунктом (ї), або антигензв'язувальний фрагмент антитіла за кожним з пунктів (1)-(ім).

11. Антитіло за пунктом 10, яке відрізняється тим, що антигенз'єднувальна частина молекули або антигензв'язувальний сайт антитіла за пунктом (ї) містить варіабельну область антитіла за пунктом (І).

12. Кон'югат, який містить антитіло або антигенз'єднувальний фрагмент, за кожним з пунктів 1- 11, приєднаний до щонайменше однієї мітки, яку можна виявити.

13. Рекомбінантна клітина, що експресує антитіло за кожним з пунктів 1-11.

14. Гібридома, депонована під реєстраційним номером О5М АССЗ3144 (тиАВ 43-14А) або ОБМ АССЗ143 (тиАВ 35-22А).

15. Діагностичний набір, що включає антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за кожним з пп. 1-11 або кон'югат за п. 12.

16. Антитіло або антигензв'язувальний фрагмент за кожним з пунктів 1-11 або кон'югат за пунктом 12, клітина за п. 13, гібридома за пунктом 14, де зазначений СІ ОМ18.2 містить амінокислотну послідовність, представлену 5ЕО 10 МО: 2, або варіант зазначеної амінокислотної послідовності, який містить амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮО МО: 5 або 5ЕО ІО МО: 6. 1 тМвеіїіїх За насій1в.1 Метт ТОУМА БОЬБЗІБсОВвВО СІЛАТОМОМИ БТОбЬТОМеУ КВУКОТЕСЬК несІі418.3 МАУ цАСОСІи КУУЬІСКАЮ ХТААТОМОЙНЯ БТОВЬУММЕУ ТАУККХОСЬМ месіб18.2 МБУТАСОСЬС ЕУХОЬІСЕКАС ІЛАТОМОСЯ ЗІ0ОБЬКУМРУ ТАУККУОСТЯ Сопсепвихя мзУтасодія КБУУіЇОхАЄ ЗІПАТСМОдИ БТОПЬТаМеУ кавер Нзсіді8.у КЗСУВОВООК ТЕСВРУЕЖІ:Ь СОБРАМУОАУВ АЦМІУЧІУЬО АТСЬКУВТЕА нНасічіВ. 2 вЕСУВЕЛяСЕ ТЕСВОТЕТЬ; СЬРАМІСВУК АЦМІУСТЬО АТХ, Мегіаї8.2 ВСЕ ЕщОК ТЕСНОХЕЖЬЬ ОСКАМООВБУК АЦМІЧОТУЬО МЕСТМЕІВА повнепвиї ВЕСУВеяБОЮ ТЕСВОЖЕТІ: ЧЕРАМІОАУВ АМЕУСХУВаУ ВІСТІ КА 101 ! ТМвнеїїх ї 150 насій1Я.1 БЕСІНІСЯМЕ ПБАКАМИТЕТ СЦІМКІУВОЬ САТАСУВЕА МУ ТМЕИМХ Насі(і8.2 КСІВІСяМЕ ОХАКАММТЬТ ЗІМЕТУВСЬ САХТАСУЛУКА МЬУТНЕМНХ Месі(18.2 1ЖСтВІс5МО ОсАКАКМТЬТ яЦББІТОСЕ СЛІТСОВУЮА ЮРА МЕНМО Сопвейяцв ВКСТВІСВМе ОБАКАЛМЖОТ ЯпівКтУЖСІ СаіАЄУВУКЬ МУПЛТТМЕЧМЕ 15 ТМвеїіх ОО НазСі1418.В ТАММЕТОМОС М---УОТУСТ ВУТРОААЬЕМ ПИМАОСЬТЬІ ОСУММСЗАЄВ, Б8аСІ118.2 ТаммттоМмо М---МОТУЄТ КЖТКСААБКУ сжУдесьтТьІ ссУКМСЗАСЕ Месібка.й ТАМШМтУВОМОС МОСМУФТМОТ пЕуТЕСАЛЬНУ СЕУДеСЬТЬІ пОУММОЗАСВ Созаежлаца ТАММУСОМОЇ М... МОСК ВУТРОААЬКМУ СИМАССЬТЬ ОСПУММСТАСВ, віз ай ЩасС1О18.1 БАРЕЕТКХК АУЗУНАЗОНЕ МАТКЕОУЗККА ЗІОКОЗМТВМ ККІХООоАВТ ЕвВСІАНчіной ЗМБАВЕЕТКУК АМБУНАБОНІ МАКРО ВА БЕОКОСБВІКК ККІХрОЗАВТ Меасічій. СеТеО0еОМЕК АУДТНАЯСОМ УАХВРОбЕКА БІБКОБМІВИ КХТУрОСАВТ Сопаепвив біареєекмук ЗУВХНАШСнНА УАХКРОСЕКА дТОБОяМІКМ ККІУОСОВКТ 251 254 нзсічін.ї БОБУСсХВОК НОЖУ Нзсіаїв.2 БОЕУОВБУВОХ НОЖЕ маосі(15.5 жОрКОЗНеТК пу Совзевзив ЕбетОосувнК ВОТУ

Фіг. 1 5О0

Н Н : НЕтад СЬОМІВІ О-тенче іва 593-2Б і Е | ч Н х ПО ОКХ КК КК Х : що БЕ вен зо Е я ї х жеф сф є все сяє бек сет сабо сщу каб дує зу феї ВУЄ аб моб сус пев сад сей зу фах ої г Відетах ЧТ ков їО фісккЕ З : б вовк в вв вок юх в з яо» з й? се здат сох яке да ЯЖЕ дис баб слж аж сне ОЗ ах шо ду жк фа кове боє ве ее У Ї Хришча Ерікоре і хв ап ах й г чт «в в а в в юю ж ее в в ; Св СІМ Таз 04) 0 тб аясехухчюекияях «їх ІЗ жк суд бо се уся джя йза баз всо вес ос ва зсс ше боб хе баб ою кп юс сяк йо Н жи ж ЗЕ шк: ж и з з и: зи Є Є и М з и а по п С Міхауютутетсяскячитьиеяєчяххя» фен сіни іа Едісон яєткказесяснуй їі зм че Бек сас аа осо де цу Ох асо ще ес ст юр БЕ кру шо щас ев вам мах ак ма І х х ями к а є г т в а в НЕ З "Ех К ва и Шеуххеи тити чухкнсталатухтлноя вий Сент СІНЯХ ках 49 я 2 пикжччакижечкичлуччивейхжнчняии 1 вве тек ве пов цу вс сук во фер фо Шеф ЦО аа тт ше БЕЖ Кше вену сас дет тах ДЕ : і ХУ ГУ « 5 з є х Кк їх Ж «У ч Г-Я У ї г-Я Ек ї З т і ї Фуукиятихячуюуютсяткхчххнтятях блю КВН яз НИНІ зигиччухчухнвмгаєємиккихтаижкх ка км дно

Фіг. 2

Ії. « Бажкий ланцюг 1 Підер н-Яа-ї1йА а МАЙКА МААМОТОАО ТОоМмчоВОорЕЬ КЕРОБТІМНІЗ СкАОЮЖТКТО сові в-Зв-йзА І МЕС ВЬІКІ УБУБКОУОСВ тНБУЮВОССЇ УКВОЗНСКСЕ СААІЮЕТЕНК 9-41 4А 2 че неУККАВ ес СКиИМОМІ МТБТОтРИХА ПОКВИВКАКВ БЕТБАВІАТХ ней АТ тах свиУкОте ЕКВОЕМУАТВ чОООще ОМУКОКВЕТХВ ВОМЕЕМИХ Є 101 | ЕВ 150 н-Ях- І13А а ІМ КНВОоХ ВІХЕСАВАТО Епос -- В ДОСТУ Педан АЮ ОМС КОВОХ лІХУСЬКОЗу УПМ УВИУМ СОТ Легкий ланцюг 1 Лідер ай вш-аз-14А, ОМЕКБЕАОКІС ТАЙОМІВСАЖА рІУМТОвАКЕ СрУТЬСТВАВ БЕСВЕШКММ ОСОБ їм-зч-лй мВ тТрРАСКТЄЕ БІРЖЕФОІВ: СІКУТОЗехо МЕАЛІЕНУВ ТТСКаОЕМ ТА нн Сове 10 йШк-яя-іяА рнарсІжрек УДОоврОСЕУ ЇЇ вУвКьвА ЖОУРНЕЕБИВ ЕНОТОКТСКЕ Ме ЗЧ А (сш Бчх кООКрИСКаКК ТОІЗВІМНОХ ОСУЄУВРНОВ пере аикх 01 ОК 137 Ге-аї-14й БВУБАБОУСУ ЖУТЬ ТКС КЬЕ ТК їн-Яйнанй 0 ЗВО УКОМИї хУДеаТОЖЕе ТЕОСАВбТВВ ОК

Фіг. З