JP2008545615A - Ｃｄ６３の表面発現を証明する細胞の細胞毒性仲介 - Google Patents

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Abstract

本発明は、癌性疾患の診断及び治療、特に腫瘍細胞の細胞毒性の仲介に関し、とりわけ、細胞毒性反応を開始する手段として、場合により１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、更に、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
【選択図】図２５

Description

本発明は、癌性疾患の診断及び治療、特に腫瘍細胞の細胞毒性の仲介に関し、とりわけ、細胞毒性反応を開始する手段として、場合により１つ以上の化学療法剤と組み合わせた、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）の使用に関する。本発明は、更に、本発明のＣＤＭＡＢを利用する結合アッセイに関する。
癌におけるＣＤ６３：ＣＤ６３は、テトラスパニンファミリーのＩＩＩ型膜タンパク質であり、その２０個の現行のメンバーは、４個の膜貫通領域の存在により特徴決定されている。幾つかのグループは、単独で、活性化血小板、顆粒球及び黒色腫細胞の全細胞調製物により生じる抗体を使用してＤ６３を同定した。同族糖タンパク質抗原の対応するｃＤＮＡのクローニングは、異なる抗原が同一の分子であるという認識をもたらした。その後、白血球分類の第６回国際ワークショップ（１９９６年）は、これらの抗体をＣＤ６３抗体と分類した。１９９６年のワークショップ以前では、ＣＤ６３は、複数の名称（黒色腫１抗原、眼黒色腫関連抗原、黒色腫関連抗原ＭＥ４９１、リソソーム関連膜糖タンパク質３、グラニュロフィシン、黒色腫関連抗原ＭＬＡ１）で知られており、時々、部分的な特徴決定及び同定をもたらす抗体に関連した。したがって、ＣＤ６３は、また、抗原ＭＥ４９１（ＭＡｂ ＭＥ４９１）、神経腺抗原（ＭＡｂｓ ＬＳ５９、ＬＳ６２、ＬＳ７６、ＬＳ１１３、ＬＳ１４０及びＬＳ１５２）、Ｐｌｔｇｐ４０（ＭＡｂｓ Ｈ５Ｃ６、Ｈ４Ｆ８及びＨ５Ｄ２）、ヒト骨髄間質細胞抗原（ＭＡｂ １２Ｆ１２）、骨芽前駆細胞特異性マーカー（ＭＡｂ ＨＯＰ−２６）、及びインテグリン関連タンパク質（ＭＡｂ ６Ｈ１）と呼ばれていた。ヒトＣＤ６３と交差反応することが判明している他の抗原は、８−１Ｈ、８−２Ａ（ＭＥ４９１と交差反応する）、ＮＫＩ／Ｃ−３及びＮＫＩ／黒色−１３であった（Ｖａｎｎｅｇｏｏｒ ａｎｄ Ｒｕｍｋｅ， １９８６； Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， １９９２； Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９２）。
ＣＤ６３は、最初に、ヒト黒色腫細胞の調製に対して生じた多数の抗体のうちの１つである、ＭＡｂ ＭＥ４９１を使用して、黒色腫ｃＤＮＡライブラリーからクローンされた。ＭＡｂ ＭＥ４９１の反応性は、ヒト黒色腫生検の研究において、黒色腫の進行に対して逆に相関するように思われることが示された。ＭＥ４９１抗体の反応性は、正常なメラニン細部では低く、黒色腫進行の初期（異形成母斑及び放射状増殖相（ＲＧＰ）腫瘍）では高く、垂直増殖相（ＶＧＰ）及び転移性腫瘍のようなより進行した黒色腫の腫瘍では減少しているか、さらには不在であった。
ＣＤ６３は、また、活性化依存性血小板膜５３ｋＤａ糖タンパク質を検出する、（活性化血小板に対して生じる）ＭＡｂ２．２８を使用して、ヒト血小板で見出され、部分的に特徴決定された。この分子は、また、非刺激血小板の内部顆粒の膜と関連した。同じ研究において、ＭＡｂ２．２８も、巨核球及び内皮細胞中の内部顆粒を標識し、そこで、リソソーム区画の既知のマーカーである、酵素カテプシンＤの抗体と共局在化した。抗体クラスター化及び発現クローニングによる追跡調査は、この抗体により認識される抗原のＣＤ６３としての同定をもたらし、更に、リソソーム区画におけるその存在を確認し、そこで、区画特異性マーカーＬＡＭＰ−１及びＬＡＭＰ−２と共局在化していた。この分子のクローニングは、それをＣＤ６３として同定し、テトラスパニンファミリーに含めることを可能にした。
ＣＤ６３の発現は、多くに異なる組織及び細胞型において検出された。細胞レベルでは、血漿膜と関連していることが見出され、また、細胞内後期エンドソーム血管構造にも関連していることが見出された。細胞活性化は、特定の場合において、ＣＤ６３の細胞内ストアの動員により、表面発現の増加をもたらした。ＣＤ６３は、Ｂリンパ球における、特に、エンドソーム、ＭＨＣクラスＩＩ錯体を表面に搬送することに関わるエキソソーム、及び分泌小胞におけるＭＨＣクラスＩＩと、共局在化し、物理的に関連することも見出された。ＣＤ６３は、Ｂ及びＴリンパ球、好中球、乳癌及び黒色腫細胞を含む多様な細胞型において、ＣＤ９、ＣＤ８１、ＣＤ１１（インテグリン鎖αＭ，Ｌ，Ｘ）、ＣＤ１８（インテグリン鎖β２）、ＣＤ４９ｃ（ＶＬＡ−３又はインテグリン鎖α３）、ＣＤ４９ｄ（インテグリン鎖α４）、ＣＤ４９ｆ（ＶＬＡ−６又はインテグリン鎖α６）、及びＣＤ２９（インテグリン鎖β１）のようなテトラスパニンファミリーの他のメンバーと相互作用することが見出された。
癌におけるＣＤ６３の役割は不明である。ＣＤ６３は、最初に、幾つかの独立したグループによって、血小板及び果粒球活性化、ＭＨＣクラスＩＩ依存性抗原の存在、インテグリン依存性細胞接着及び運動性、並びに特定の種類の癌における腫瘍進行のような有害事象に関連することが発見されたが、その機能は未だに完全に解明されていない。現在の証拠が、細胞の多様な生理学的事象におけるその役割を支持しているとしても、これらの機能が、互いに独立しているか、又はＣＤ６３が関わる基礎的な共通の細胞機序が存在するかは、明らかではない。
幾つかのグループが、ＣＤ６３と特定の種類の腫瘍、特に黒色腫との関連を調査した。Ｍａｂ ＭＥ４９１に加えて、多数の他の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体が、多様な進行段階の腫瘍を有する患者から得た癌試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色のために開発された。ＣＤ６３の発現の減少をおそらく最も反映していると著者たちによって解釈される染色の減少は、腫瘍の高度な進行及び転移性と相関することが観察された。より最近の研究は、また、ＣＤ６３を含むテトラスパニンタンパク質ファミリーの幾つかのメンバーの（ｍＲＮＡの定量化後に）減少したと思われる発現レベルと、幾つかの乳癌由来細胞株のインビトロ侵襲性との有意な相関関係を記載する。別の研究は、エストロゲン欠乏に付された培養乳癌細胞中でのディファレンシャルディスプレーにより、ＣＤ６３を同定した。このことは、ＣＤ６３の発現はステロイドホルモン調節的である可能性があり、変えられたＣＤ６３の存在量及び／又は機能も、乳房腫瘍進行と関連する場合があることを示した。
対照的に、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ＦＣ−５．０１による研究は、反応性エピトープが、異なる正常な組織において多様に発現することを明らかにした。この抗体はＣＤ６３を認識することが判明しているが、（ＭＡｂ ＭＥ４９１と異なり）初期と、転移性黒色腫を含むより進行した段階の黒色腫とを区別することはなく、これは、ＣＤ６３抗原がこれらのより進行した腫瘍に存在するが、そのエピトープのうちの幾つかは、異なる段階での腫瘍の細胞において遮断されている場合があることを示唆した。これは、コアＣＤ６３ポリペプチドの変えられた翻訳後修飾に起因するか、又はＣＤ６３と他の分子の相互作用に起因する場合があり、このことは、抗体の認識及び結合における特異的エピトープの利用可能性に影響を与える場合がある。これらの結果は、抗ＣＤ６３ ＭＡｂ ＮＫＩ−Ｃ３による染色が、第一相、放射状増殖相、垂直増殖相及び転移性腫瘍のような進行の異なる段階での黒色腫の組織切片を区別しないという、Ｓｉ及びＨｅｒｓｅｙ（１９９３年）により記載された観察を支持した。他の研究（Ａｄａｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， １９９８； Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９８）おいて、定量ＰＣＲによる乳房及び非小細胞肺ガンのｍＲＮＡの分析は、２つのテトラスパニンファミリーメンバー（ＣＤ９及びＣＤ８２）では、それらの発現レベルと、腫瘍進行及び患者予後との間に有意な相関関係が存在することを明らかにしたが、そのような相関関係は、ＣＤ６３では見出されず、その発現は全ての試料において同様であった。明らかに矛盾したこれら結果により、ＣＤ６３と癌の関連を明確に実証する強力で一貫したデータが欠けている。
現在まで、ＣＤ６３と、この分子の最終的な腫瘍抑制機能との間につながりを確立する試みは、極めて僅かなインビボ研究でしかなされてこなかった。これらの研究のうちの１つでは、胸腺欠損マウスに皮下及び腹腔内の両方で注入されたヒトＣＤ６３過剰発現Ｈ−ｒａｓ−形質転換ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、親非ＣＤ６３過剰発現細胞の挙動と比較すると、腫瘍の大きさ及び転移能の減少により、並びに生存期間の増加により示される、悪性／腫瘍化表現型の減少を明らかにした。このことは、形質転換細胞におけるヒトＣＤ６３の存在が、細胞の悪性挙動を抑制する場合があることを示唆した。つい最近では、ヒトＣＤ６３を発現し、ＣＤ６３に耐性を誘導するように開発されたトランスジェニックマウスモデルによる研究は、ワクチニアウイルスに融合したヒトＣＤ６３により免疫化すると、注入ヒトＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩ（Ｈ−２Ｋｂ）同時形質移入マウス黒色腫細胞株の腫瘍増殖を阻害し、生存を増加できることを示した。腫瘍増殖阻害が、動物に、ＣＤ６３しか形質移入されなかった細胞株ではなく、ＣＤ６３−ＭＨＣクラスＩが同時形質移入された細胞を注入したときだけ起こるので、治療効果はＴリンパ球依存性であること、及び内因性抗ＣＤ６３抗体はこの保護効果に関わっていないと思われることが、著者たちにより示唆された。精製したヒトＣＤ６３で前免疫化され、かつ抗ヒトＣＤ６３抗体を発生したことを示す野生型動物において、腫瘍細胞増殖に対する保護効果がなかったという事実により、この解釈は支持された。ヒトＣＤ６３により形質移入された、最初はヒト由来と思われていたが、後にラット系列であると特徴決定されたＫＭ３細胞株を使用するＲａｄｆｏｒｄら（１９９５年）により記載される研究は、胸腺欠損マウスに皮内注入されたとき、このタンパク質の発現が、親非形質移入ＫＭ３細胞を使用した場合に観察されたものと比較して、細胞の増殖及び転移能を減少したことを示唆したが、種々の形質移入及び非形質移入細胞株のインビトロ増殖速度に有意な差はなかった。これらの観察は、ＣＤ６３の潜在的効果を、インビボとインビトロの両方での腫瘍細胞の増殖速度に影響を与えることが知られている他の腫瘍抑制遺伝子のものと区別した。更に、インビトロアッセイにおいて無秩序運動性を減少することにより同じ細胞に機能効果を持たせることが判明している（Ｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９９７）、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＥ４９１の添加は、インビトロ増殖速度に影響を与えなかった。
この研究は、ＣＤ６３が、ラミニン、フィブロネクチン、コラーゲン及びビトロネクチンのような細胞外マトリックス（ＥＣＭ）誘導化学誘引物質に反応して移動を促進する場合がある、及びこの効果が、β１型インテグリンの機能的関与によって仲介される場合がある、という観察も記載しているが、インテグリンに対する抗体は、これらの効果を阻止することができなかった。しかし、ＣＤ６３形質移入細胞に対する、ビロトネクチン仲介シグナリング（インテグリンαＶβ５の既知のリガンド）の役割と、フィブロネクチン、ラミニン及びコラーゲンのような他のＥＣＭ成分により仲介されるシグナリングの役割との間に拮抗効果が存在すると思われた。このことは、特定の条件下、ＥＣＭ成分の存在下では、ＣＤ６３の発現は、移動の減少をもたらす場合があり、このことは、接着と運動性の微妙なバランスに依存している場合があることを示唆した。別の研究では、抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ７１０Ｆ）はＰＭＡ処理ＨＬ−６０細胞の接着及び延展を増強し、一方、別の抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＭＡｂ ２．２８）は、同様の効果を促進するが、細胞集団のもっと小さい画分に対してであり、もっと大量に添加された場合にだけである。これらの結果は、ＣＤ６３に対する多くの抗体が開発されたが、それらの機能効果は、全く異なる可能性があることを示した。
テトラスパニンは、また、細胞繁殖に関わる場合もある。Ｏｒｅｎら（１９９０年）は、リンパ種細胞株に対する、ＣＤ８１（ＴＡＰＡ−１）を認識するネズミＭＡｂ ５Ａ６の抗繁殖性効果を記載した。別の研究では、ヒトＴリンパ球におけるＣＤ３７と抗体との連結は、ＣＤ３７誘導繁殖を阻止した。さらに最近では、ＣＤ３７の発現が欠乏している動物モデル（ＣＤ３７ノックアウト）による研究は、この動物からのＴリンパ球が、コンカナバリンＡ活性化及びＣＤ３／Ｔ細胞レセプター会合に反応して、野生型動物からのものと比較して過剰繁殖したことを明らかにした。したがって、細胞増殖及び繁殖における機能的役割は、テトラスパニンファミリーの共通の特徴でありうることが提案された。肝芽腫及び肝細胞癌の最近の研究は、これらの細胞と抗ＣＤ８１モノクローナル抗体との会合が、Ｅｒｋ／ＭＡＰキナーゼ経路の活性化をもたらすことを明らかにした。このシグナリング経路は、細胞増殖及び繁殖事象に関与することが示されている。平行した研究において、ヒトＣＤ８１を過剰発現している形質移入細胞株は、偽形質移入対照細胞に対して、増加した繁殖を示した。したがって、入手可能な証拠は、細胞増殖／繁殖に関連し、細胞接着／運動性に関連する事象において、一般にテトラスパニンの役割、特にＣＤ６３の役割を指摘している。これら２種類の細胞事象は、両方とも腫瘍進行及び転移において中心的な役割を演じるので、現在、精力的な研究の対象である。
現在まで、ＣＤ６３発現細胞を特異的に標的にする抗ＣＤ６３抗体又は他の試薬は報告されておらず、腫瘍細胞のインビトロ及びインビボ増殖特性に対して、また、腫瘍細胞増殖の動物モデルにおける生存期間に対して、同時に影響を与えることを示すものはなかった。
アミノ酸配列決定及び分析は、テトラスパニンと他のタンパク質ファミリーとの間、又は以前に特徴決定された機能性モジュールのいずれかとの間に相同性を明示せず、そしてまた以前から知られているあらゆる触媒活性が示唆されることがなかった。その結果、シグナル伝達経路の修飾におけるこのタンパク質ファミリーの役割を調査することが、非常に困難であった。しかし、細胞生理に変化をもたらすテトラスパニン特異性試薬を使用して生成される証拠、及びシグナル伝達経路の修飾に密接に依存していた証拠は、テトラスパニンがシグナル伝達特性を有することを示唆している。ＣＤ６３は、それ自体が二次メッセンジャーシグナルの生成に関わる酵素であるか又はそのような酵素と物理的及び／若しくは機能的に関連する多数の分子と、物理的及び機能的の両方で関連することが示された。
炎症性反応の初期工程のうちの１つであるヒト好中球と内皮細胞との相互作用を制御する機序を分析するように設計された実験は、幾つかの抗ＣＤ６３モノクローナル抗体（ＡＨＮ−１６、ＡＨＮ−１６．１、ＡＨＮ−１６．２、ＡＨＮ−１６．３及びＡＨＮ−１６−５）による好中球の前処理が、培養内皮細胞層へのそれらの接着を促進したことを明らかにした。更にこの効果は、多くの細胞内シグナリング経路の周知のモジュレーターであり、かつ細胞が刺激抗体に暴露されている特定の時間の間制限されている、カルシウムイオン（Ｃａ２＋）の存在に強く依存していた。抗体への長時間の暴露の後、内皮細胞への好中球の接着は、後のＣａ２＋の添加に対して鈍感になり、したがって動的で一時的に調節された（一過性の）事象に関連している。加えて、ＣＤ６３は、ＣＤ１１／ＣＤ１８タンパク質錯体と物理的に相互作用することが見出され、この錯体を特異的に標的にする試薬は、修飾シグナルを仲介した。この研究において、ＣＤ６３は、酵素チロシンキナーゼＬｃｋ及びＨｃｋを含む錯体と関連するか、又はその一部であることが見出された。これらの酵素は、特定の表面レセプターの活性化で細胞内調節シグナルを仲介するのに中心的な役割を演じ、かつ細胞特異性生理学的変化をもたらすシグナリング経路のカスケードの一部である、タンパク質の部類のメンバーである。別の研究は、（ＣＤ６３を含む）テトラスパニンとモノクローナル抗体の共連結が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞のコラーゲン基質への接着により誘導される、酵素焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）のリン酸化又は活性化を増強することができることを示唆した。このことは、インテグリン仲介チロシンキナーゼシグナリング経路の修飾におけるＣＤ６３（及びそのテトラスパニンファミリーメンバー）の直接的な関わりを指摘した。抗ＣＤ６３モノクローナル抗体ＭＡｂ ７１０Ｆによる、表面ＣＤ６３の存在及び連結により機能的に交差する場合がある他のシグナリング経路は、細胞内シグナリング経路の別の周知のモジュレーターである、酵素タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）によるリン酸化の修飾に依存していると思われる。この文脈において、ＭＡｂ ７１０Ｆによる骨髄細胞株ＨＬ−６０における接着及び形態変化の増強は、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）による細胞の前処理に依存するが、ＰＫＣの一時的な関わりは、確定的には実証されなかった。しかし、独立したグループによるその後の研究は、ＰＭＡ誘導ＨＬ−６０分化が、ＰＫＣ活性化依存性であったことを実証し、それは、この酵素の特異的インヒビターである、分子Ｒｏ３１−８２２０がＰＭＡの効果を阻止したからである。
ＣＤ６３及び他のテトラスパニンファミリーメンバーとシグナル伝達経路との関連性を支持する更なる証拠は、ＣＤ６３（またＣＤ５３）分子とチロシンホスファターゼ活性との、直接的か又は超分子複合体の一部としての物理的関連性を記載する研究から生じた。この研究において、抗ＣＤ６３抗体により単離された免疫沈降錯体は、チロシンホスファターゼ活性と関連することが示されたが、チロシンホスファターゼＣＤ４５と関連することが示されているＣＤ５３と異なり、ＣＤ６３関連ホスファターゼを同定することは可能ではなかった。より最近では、テトラスパニンファミリーの幾つかのメンバーも、ＩＩ型ホスファチジルイノシトール４−キナーゼ（ＩＩ型ＰＩ ４−Ｋ）と関連することが見出された（Ｂｅｒｄｉｔｃｈｅｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， １９９７）。この相互作用は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１５１及びＡ１５／ＴＡＬＬＡでしか確認されず、ＣＤ３７、ＣＤ５２、ＣＤ８２又はＮＡＧ−２で起こることが観察されなかったので、極めて特異的であると思われた。加えて、テトラスパニンファミリーメンバーとＰＩ−４Ｋとの関連性は、各ＰＩ−４キナーゼ含有錯体が単一のテトラスパニンファミリーメンバーに限定されているので、相互排他的であった。特にＣＤ６３−ＰＩ−４キナーゼ錯体は、他のテトラスパニンファミリーメンバーにより形成されるものと異なり、脂質ラフト様ドメインにおける細胞内区画で、ほぼ完全に見出された。この観察は、ＰＩ−４キナーゼと相関することが判明しているこのＣＤ６３画分が、二次メッセンジャー分子としての機能（Ｍａｒｔｉｎ， Ｔ．， １９９８）に加えて、膜輸送（エンドサイトーシス及びエキソサイトーシス）及び細胞骨格再構築の調節に関与することがよく知られているホスホイノシチド生合成経路に関連又は依存して、特定の細胞内事象に関連する場合があることを示唆した（Ｃｌａａｓ， Ｃ， ｅｔ ａｌ．， ２００１）。
シグナリング経路の調節における、現在までＣＤ６３が直接的に関与することが判明している全ての酵素の直接的で、重要な関与は、これらの酵素の活性の下流でのレギュレーターとしてか又はエフェクター分子としてのＣＤ６３と、信号伝達経路の修飾との関連性を支持する更なる証拠を提供した。
腫瘍進行をもたらす機序の解明は、明らかに矛盾する観察により頻繁に特徴づけられる、非常に困難かつ複雑な試みであり、その結果、これらの観察がうまく有効な治療になることはまれである。ＣＤ６３と腫瘍進行及び転移との関連、並びに信号伝達機序との関連について現在知られているものを考慮すると、その機能が腫瘍細胞において変わりうることが可能である。
認識された抗原を発現する細胞を結合し、それ自体又は他の分子と関連して、試薬が正常な細胞集団に著しく有害作用を与えることなく、腫瘍細胞増殖、進行及び転移を阻害するように、細胞及びインビボ生理活性を有する、腫瘍細胞に細胞毒性効果を持つ抗原特異性試薬の開発は、潜在的な治療及び診断手段として極めて有益である。
癌治療としてのモノクローナル抗体：癌を示す個人はそれぞれ特有であり、個人の独自性と同じように他の癌と異なる癌を有する。それにも関わらず、大部分の現行の治療は、同じ種類で同じ段階の癌を有する全ての患者を、同じように治療する。これらの患者の少なくとも３０％は、第一次治療に失敗し、したがって、更なる一連の治療をもたらし、治療が失敗し、転移し、最終的には死亡する可能性が増大する。治療の優れた手法は、特定の個人における治療の特別仕様である。それ自体特別仕様につながる広く使用されている唯一の治療は、外科手術である。化学療法及び放射線治療は、患者に合わせることができず、外科手術それ自体は、ほとんどの場合において、治癒を生じるには不十分である。
モノクローナル抗体の出現によって、特別仕様の治療の方法を開発する可能性がより現実的になり、それは、それぞれの抗体を単一のエピトープに向かわせることができるからである。更に、特定の個人の腫瘍を独自に定義するエピトープの配列に方向付けられる、抗体の組み合わせを生じることが可能である。
癌性と正常な細胞との有意な差は、癌性細胞が形質移入細胞に特異性のある抗原を含有することであるという認識を持って、科学界は、癌抗原に特異的に結合することによって、形質移入細胞を特異的に標的にするようにモノクローナル抗体を設計することができると長い間考えてきて、それ故、モノクローナル抗体は、癌細胞を排除する「魔法の弾丸」として役立つことができるという信念を生み出した。しかし、癌の全ての場合に役立つことができる単一のモノクローナル抗体はないこと、及びモノクローナル抗体は、標的癌治療としての分類として展開できることが、現在広く認識されている。本発明の開示された教示に従って単離されたモノクローナル抗体は、例えば腫瘍量を低減することにより患者の利益になる方法で、癌性疾患の過程を修飾することが示されており、癌性疾患修飾抗体（ＣＤＭＡＢ）又は「抗癌」抗体として本明細書でさまざまに参照される。
今のところ、癌患者は、一般に治療の選択肢がほとんどない。癌治療に対する厳格に管理された手法は、世界的な生存率及び罹患率において改善をもたらした。しかし、特定の個人に対しては、これらの改善された統計は、彼らの個人的な状態における改善と必ずしも相関関係がない。
したがって、開業医がそれぞれの腫瘍を同じコホートにおける他の患者とは無関係に治療することができる方法論が提案される場合、それは、ただ１人のために適合された特有の治療手法を許容することになる。そのような治療過程が治癒の比率を増加することができ、より良好な成果を生じることができるのであれば、それは、長年にわたる切実な要求を満たすであろう。
歴史的に、ポリクローナル抗体の使用は、ヒトの癌治療では限られた成果を伴って使用されてきた。リンパ種及び白血病は、ヒト血漿で治療されてきたが、長期間の寛解又は反応はほとんどなかった。更に、化学療法と比較して、再現性が欠如し、追加的な利益がなかった。乳癌、黒色腫及び腎細胞癌のような固形腫瘍も、ヒト血液、チンパンジー血清、ヒト血漿及びウマ血清により治療され、同様に予測不能で効果のない結果を得た。
固形腫瘍においてモノクローナル抗体の多くの診療試験が行われてきた。１９８０年代には、特定の抗原に対する抗体を使用するか、又は組織選択性に基づいて、ヒト乳癌において少なくとも４回の臨床試験が行われ、少なくとも４７人の患者のうち１人しか反応しなかった。１９９８年になって、ヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体（ハーセプチン）をシスプラチンと組み合わせて使用した臨床試験が成功した。この試験では、３７人の患者で反応を評価し、約四分の一が部分的反応率を有し、さらに四分の一が僅かな又は安定した進行を有した。反応者の進行時間の中央値は、８．４か月であり、反応持続時間の中央値は５．３か月であった。
ハーセプチンは、Ｔａｘｏｌ（登録商標）と組み合わせた第一次使用として１９９８年に認可された。臨床研究の結果は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独を摂取した群（３．０か月）と比較して、抗体治療＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）を摂取した群（６．９か月）で進行が減少した時間の中央値が増加したことを示した。生存の中央値で僅かな増加もあり、ハーセプチン＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）の治療類群対Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療群が、２２か月対１８か月であった。加えて、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独と比較した、抗体＋Ｔａｘｏｌ（登録商標）組み合わせ群における完全（８％対２％）及び部分的反応者（３４％対１５％）の両方で数が増加した。しかし、ハーセプチン及びＴａｘｏｌ（登録商標）による治療は、Ｔａｘｏｌ（登録商標）単独の治療と比較して、心毒性の高い発生率をもたらした（それぞれ、１３％対１％）また、ハーセプチン治療は、現在知られている機能又は生物学的に重要なリガンドを持たないレセプターである、ヒト上皮増殖因子レセプター２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）を過剰発現している（免疫組織化学（ＩＨＣ）分析により決定された）患者にしか有効ではなく、転移性乳癌を有する患者のおよそ２５％であった。したがって、乳癌の患者において、依然として満たされない要求が存在する。ハーセプチン治療により利益を受けることができる患者でも、依然として化学療法を必要とし、したがって、依然として、少なくともある程度は、この種類の治療の副作用に対処しなければならない。
結腸直腸癌を調査する臨床試験は、糖タンパク質と糖脂質の両方に対する抗体に関わる。腺癌にいくらかの特異性を有する１７−１Ａのような抗体では、６０人の患者で第ＩＩ相臨床試験を行い、部分的な反応を有する患者が１人だけてあった。別に試験では、１７−１Ａの使用は、追加のシクロホスファミドを使用したプロトコールにおいて、５２人の患者のうち、完全な反応が１人及び僅かな反応が２人だけであった。現在まで、１７−１Ａの第ＩＩＩ相臨床試験は、第ＩＩＩ期結腸癌の補助療法として、改善された効能を実証していない。最初に画像化のために認可されたヒト化ネズミモノクローナル抗体の使用も、腫瘍退縮を生じなかった。
最近になって、モノクローナル抗体の使用による結腸直腸癌臨床研究において肯定的な結果が得られるようになった。２００４年には、エルビタックスが、イリノテカンに基づく化学療法に難治性である、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌の患者における第二次治療のために認可された。２群第ＩＩ相臨床試験と単独群研究の両方の結果は、イリノテカンと組み合わせたエルビタックスが、それぞれ４．１か月と６．５か月の疾患進行の中央値で、それぞれ２３％と１５％の反応率を有したことを示した。２群第ＩＩ相臨床試験及び別の単独群研究の結果は、エルビタックス単独での治療が、それぞれ１．５か月と４．２か月の疾患進行の中央値で、それぞれ１１％と９％の反応率をもたらしたことを示した。
したがって、スイスと米国の両方において、イリノテカンと組み合わせたエルビタックスの治療が、そして米国において、エルビタックス単独の治療が、第一次イリノテカン療法が失敗した結腸癌患者の第二次治療として認可された。したがって、ハーセプチンと同様に、スイスにおける治療は、モノクローナル抗体と化学療法の組み合わせとしてのみ認可されている。加えて、スイスと米国の両方における治療は、患者にとって第二次療法としてのみ認可されている。また２００４年には、アバスチンが、転移性結腸直腸癌の第一次治療として、静脈内５−フルオロウラシルに基づく化学療法と組み合わせての使用が認可された。第ＩＩＩ相臨床研究の結果は、アバチン＋５−フルオロウラシルで治療した患者の生存の中央値が、５−フルオロウラシル単独で治療した患者と比較して延長したことを実証した（それぞれ、２０か月対１６か月）。しかし、この場合もハーセプチン及びエルビタックスと同様に、治療は、モノクローナル抗体と化学路療法の組み合わせとしてのみ認可されている。
また、肺、脳、卵巣、膵臓、前立腺及び胃癌において乏しい結果を生じ続けている。非小細胞肺ガンの最近の最も有望な結果は、治療が、化学療法剤タキソテールと組み合わせた細胞死滅薬ドキソルビシンと結合するモノクローナル抗体（ＳＧＮ−１５；ｄｏｘ−ＢＲ９６、抗Ｓｉａｌｙｌ−ＬｅＸ）を含む、第ＩＩ相臨床試験からもたらされた。タキソテールは、は肺癌の第二次治療のために唯一ＦＤＡにより認可された化学療法である。初期データは、タキソテール単独と比較して全体的に改善された生存を示す。研究のために動員された６２人の患者のうち、三分の二は、ＳＧＮ−１５をタキソテールと組み合わせて摂取し、一方、残りの三分の一は、タキソテール単独を摂取した。タキソテールと組み合わせたＳＧＮ−１５を摂取した患者では、全体的な生存の中央値は、タキソテール単独を摂取した患者の５．９か月と比較して、７．３か月であった。１年と１８か月の全体的な生存は、タキソテール単独を摂取した患者でのそれぞれ２４％及び８％と比較して、ＳＧＮ−１５＋タキソテールを摂取した患者では、それぞれ２９％及び１８％であった。更なる臨床試験が計画されている。
前臨床では、黒色腫におけるモノクローナル抗体の使用では、いくらかの限定された成果が得られている。これらの抗体のうちで臨床試験に到達したものはほとんどなく、現在まで、第ＩＩＩ相診療試験で承認されたもの又は好ましい結果を実証したものはない。
疾患を治療する新薬の発見は、疾患の病原に明白に寄与している既知の遺伝子３０、０００個の産物のうちから、関連する標的を同定することの欠如によって妨げられている。腫瘍学研究において、潜在的な薬剤標的は、多くの場合、単に腫瘍細胞で過剰発現しているという事実によって選択される。したがって、同定される標的は、次に多数の化合物との相互作用のためにスクリーニングされる。潜在的な抗体療法において、これらの候補化合物は、通常、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎにより定められた基本的な原則（１９７５， Ｎａｔｕｒｅ， ２５６， ４９５−４９７， Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）に従ったモノクローナル抗体生成の伝統的な方法によって誘導される。脾臓細胞を、抗原（例えば、全細胞、細胞分画、精製抗原）により免疫化したマウスから収集し、不死化ハイブリドーマパートナーと融合する。得られたハイブリドーマを、標的に最も熱心に結合する抗体の分泌のためにスクリーニングし、選択する。ハーセプチン及びリッキシマブを含む、癌細胞に向けられる多くの治療用及び診断用抗体が、これらの方法を使用して産生され、その親和性に基づいて選択されてきた。この戦略の欠点には、２つの部分がある。第１には、治療用又は診断用抗体結合に適切な標的の選択は、組織特異的発癌性経過を取り巻く知識の不足によって、そしてその結果として得られる、それによりこれらの標的が同定される単純な方法、例えば過剰発現による選択によって、制限される。第２には、最大の親和性を持ってレセプターに結合する薬剤分子が、通常、シグナルを開始する又は阻害する最高の確率を有するという前提は、必ずしもそうであるとは限らない場合がある。
乳癌及び結腸癌の治療でいくらかの進展があるにもかかわらず、有効な抗体療法の確認及び開発は、単独の作用物質又は同時治療のいずれにおいても、全ての種類の癌では不十分である。
従来の特許：
特許文献１は、内部移行する癌細胞表面抗原に特異的なモノクローナル抗体を選択する方法、並びに細胞膜に対して抗転写性及び／若しくは抗複製効果を有するモノクローナル抗体を同定する方法を教示する。例としては、ＭＥ４９１抗体は、Ｗ９、ＷＭ３５、ＷＭ９８３黒色腫細胞及びＳＷ９４８結腸直腸癌細胞に内部移行することが示された。加えて、ＭＥ４９１抗体は、ＳＷ９４８細胞において転写及び細胞繁殖を減少することが示された。特許文献２（及びその関連する出願ＷＯ０１７５１７７Ａ３、ＷＯ０１７５１７７Ａ２、ＡＵ０１５３１４０Ａ５）は、ＣＤ６３抗原を含む群から選択される卵巣腫瘍マーカー遺伝子によりコードされる卵巣腫瘍マーカーポリペプチドに結合する抗体によって、卵巣腫瘍の増殖又は転移を阻害する方法を主張する。卵巣癌を使用する遺伝子発現の一連の分析は、卵巣腫瘍マーカー遺伝子を同定するために実施され、候補としてのＣＤ６３の同定をもたらした。特許文献３（及びその関連する出願ＣＮ１３６４８０３Ａ）は、新規ポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原５６．８７を主張する。特許文献４は、新規ポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１４．６３を主張する。特許文献５は、新規ポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１５．０７を主張する。特許文献６は、新規ポリペプチド−ヒトＣＤ６３抗原１１．１１を主張する。これらの特許及び特許出願は、ＣＤ６３抗原及び抗体を同定するが、本発明の単離されたモノクローナル抗体又は本発明の単離されたモノクローナル抗体の有用性を開示していない。
ＭＥ４９１ポリペプチド抗原をコードする遺伝子がクローンされ、その配列が１９８８年２月２４日に発表されており（Ｃａｎ Ｒｅｓ ４８：２９５５， １９８８， Ｊｕｎｅ １）、ＣＤ６３をコードする遺伝子がクローンされ、その配列が１９９１年２月に発表されており（ＪＢＣ ２６６（５）：３２３９−３２４５， １９９１）、出版物は、ＣＤ６３よるＭＥ４９１の同定を明確に示している。
特許文献７（配列番号８９、優先権出願日：２００４年６月２９日）、特許文献８（配列番号１、優先権出願日：２００３年２月１３日（２００３ＷＯ−ＥＰ００１４６１）；他の優先日：２００２年２月１４日（２００２ＧＢ−００００３４８０））、特許文献９（配列番号４０、優先権出願日：２００２年１２月３０日（２００２ＷＯ−ＵＳ０４１７９８）；他の優先日：２００２年１月２日（２００２ＵＳ−０３４５４４４Ｐ））は、全て、ＣＤ６３と１００％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１０（配列番号９７８７及び１２１０１、優先権出願日：２００２年８月１４日（２００２ＷＯ−ＵＳ０２５７６５）；他の優先日：２００１年８月１４日（２００１ＵＳ−０３１２１４７Ｐ）は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸２３７に１００％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１１（配列番号２７、優先権出願日：２００３年２月１８日（２００３ＷＯ−ＵＳ００４９０２）；他の優先日：２００２年２月２０日（２００２ＵＳ−０３５８２７９Ｐ）は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸２２４に９４％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１２（配列番号４１６８及び４９１３、優先権出願日：２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸２０５及びアミノ酸９４にそれぞれ１００％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１３（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｏｓｐＧ＃２６のヒト餌食タンパク質、優先権出願日：２００２年１月１１日（２００２ＷＯ−ＥＰ０００７７７）；他の優先日：２００１年１月１２日（２００１ＵＳ−０２６１１３０Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸１３０に１００％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１４（配列番号７５６、優先権出願日：２０００年３月８日（２０００ＷＯ−ＵＳ００５９１８）；他の優先日：１９９９年３月１２日（９９ＵＳ−０１２４２７０Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸１２７に９９％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１５（配列番号３２０３、優先権出願日：２００１年６月７日（２００１ＷＯ−ＵＳ０１８５６９）；他の優先日：２０００年６月７日（２０００ＵＳ−０２０９４６７Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸１３２に９７％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１６（ヒトＣＤ６３タンパク質の大型細胞外ループ配列、優先権出願日：１９９９年６月１５日（９９ＷＯ−ＵＳ０１３４８０）；他の優先日：１９９８年６月１５日（９８ＵＳ−００８９２２６Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸９９に１００％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１７（配列番号１２０７、優先権出願日：２００２年３月５日（２００２ＷＯ−ＵＳ００５０９５）；他の優先日：２００１年３月５日（２００１ＵＳ−００７９９４５１））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸１０２に８６％の配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
特許文献１８（配列番号４１６９、優先権出願日：２０００年２月２１日（２０００ＥＰ−００２００６１０）；他の優先日：１９９９年２月２６日（９９ＵＳ−０１２２４８７Ｐ））は、ＣＤ６３を含むアミノ酸２３８のアミノ酸７４に１００％配列相同性を有するポリペプチドを主張する。
これらの特許出願は、ＣＤ６３抗原に多様な配列相同性を有するポリペプチドを同定する。ほとんどの場合、これらの出願は、対応するポリペプチド及びそれらの相同体に対する抗体及び抗体誘導体も主張するが、本発明の単離されたモノクローナル抗体、並びに本発明の単離されたモノクローナル抗体の有用性を開示していない。重要なことは、上記の全ての出願は、ＣＤ６３をコードするポリヌクレオチドの配列が発表された後で出願されている。
ＵＳ０５２９６３４８ ＵＳ２００３０２１１４９８Ａ１ ＷＯ０２０５５５５１Ａ１ ＣＮ１３２６９６２Ａ ＣＮ１３２６９５１Ａ ＣＮ１３５１０５４Ａ ＷＯ２００４０４１１７０．８９ ＷＯ２００３０６８２６８−Ａ２ ＷＯ２００３０５７１６０−Ａ２９ ＷＯ２００３０１６４７５−Ａ２ ＷＯ２００３０７０９０２−Ａ２ ＥＰ１０３３４０１−Ａ２ ＷＯ２００２５７３０３−Ａ２ ＷＯ２０００５５１８０−Ａ２ ＷＯ２００２００６７７−Ａ１ ＷＯ９９６６０２７−Ａ１ ＷＯ２００２７０５３９−Ａ２ ＥＰ１０３３４０１−Ａ２
本発明者たちは、以前に、癌性疾患を治療するのに有用である、個人に合わせて特別仕様された抗癌抗体を選択する方法を対象とする、表題が「個人に合わせた患者特異性抗癌抗体」である米国特許第６，１８０，３５７号が付与されている。本文書の目的において、用語「抗体」及び「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、交換可能に使用することができ、ハイブリドーマ（例えば、ネズミ又はヒト）、免疫複合体及び適切であれば免疫グロブリンフラグメントにより産生される無処置の免疫グロブリンを意味し、並びにキメラ及びヒト化免疫グロブリン、Ｆ（ａｂ′）及びＦ（ａｂ′）２フラグメント、単鎖抗体、組み換え免疫グロブリン可変領域（ＦＶ）、融合タンパク質のような前記免疫グロブリンから誘導される組み換えタンパク質を意味する。一部のアミノ酸配列が、タンパク質の構造又は機能に著しく影響を与えることなく、ポリペプチドにおいて変わることができることは、当該技術でよく認識されている。抗体の分子再構成において、骨格領域の核酸又はアミノ酸配列における修飾は、一般に許容されうる。これには、置換（好ましくは、保存的置換）、欠失又は付加が挙げられるが、これらに限定はされない。更に、標準的な化学療法モダリティー、例えば放射性核種と、本発明のＣＤＭＡＢとを結合し、それによって、前記化学療法剤の使用に焦点を当てることは、本発明の範囲内である。ＣＤＭＡＢは、毒素、細胞毒性部分、酵素、例えばビオチン結合酵素又は血行性細胞と結合することもでき、それによって、抗体複合体を形成することができる。
本出願は、癌性疾患修飾モノクローナル抗体をコードするハイブリドーマ細胞株を単離することに関する′３５７特許で教示されている、患者特性抗癌抗体を産生する方法を利用する。これらの抗体は、１つの腫瘍のために特別に作ることができ、したがって、癌治療を特別仕様にすることが可能である。本出願の文脈内で、細胞死滅特性（細胞毒性）又は細胞増殖阻害特性（細胞増殖抑制性）のいずれかを有する抗癌抗体を、本明細書以降では、細胞毒性と呼ぶ。これらの抗体は、癌の病期分類及び診断の助けとして使用することができ、腫瘍転移を治療するために使用できる。伝統的な薬剤発見パラダイムに従って生成された抗体と異なり、本発明のようにして生成された抗体は、以前には悪性組織の増殖及び／若しくは生存と一体として示されていない分子及び経路を標的にすることができる。更に、これらの抗体の結合親和性は、より強力な親和性相互作用に従わない場合がある細胞毒性事象の開始のための要件に適している。
個人に合わせた抗癌治療の展望は、患者を管理する方法に変化をもたらす。起こりそうな臨床シナリオは、診断時に腫瘍試料を得て、保存するということである。この試料から、腫瘍を、既に存在している癌性疾患修飾抗体のパネルによって分類することができる。患者は、都合よく病期分類されるが、患者を更に分類するために、利用可能な抗体を使用することができる。患者を、現存の抗体により直ぐに治療することができる及び／或いは腫瘍に特異的な抗体のパネルを、本明細書で概説された方法を使用するか、又は本明細書で開示されたスクリーニング方法と併せて、ファージディプレーライブラリーを使用することよって、生じることができる。生成された抗体は、全て、抗癌抗体のライブラリーに加えられ、それは、他の腫瘍が、治療されているものとして、同じエピトープのうちの幾つかを持ちうる可能性があるからである。本発明の方法に従って産生された抗体は、これらの抗体に結合する癌を有する何人もの患者において、癌性疾患を治療するのに有用であることができる。
実質的に米国特許第６，１８０，３５７号の方法を使用し、そして米国特許第６，６，５７，０４８号、並びにＳ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されているように（それぞれの内容は、参照として本明細書に組み込まれる）、マウスモノクローナル抗体Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａを、患者の肺（Ｈ４６０−２２−１）又は乳房（７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６）腫瘍生検からの細胞による、以下の、マウスの免疫化に従って得た。Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、異なる組織由来の広範囲なヒト細胞株の細胞表面に発現する。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）及び黒色腫細胞株Ａ２０５８は、インビトロでＨ４６０−２２−１の細胞毒性効果に感受性があった。乳癌細胞株ＭＣＦ−７及び前立腺癌細胞株ＰＣ−３は、インビトロで１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａの細胞毒性効果に感受性があった。
培養中の乳癌細胞に対するＨ４６０−２２−１細胞毒性の結果は、インビボにおけるこの癌適応症に対する抗腫瘍活性によりさらに拡大された。乳癌のインビボモデルでは、特定の免疫細胞を欠いているためにヒト腫瘍細胞を拒絶することができないので、免疫不全マウスの頸の首筋の皮膚の下に、ヒトＭＢ−２３１細胞を移植した。前臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予測判断材料であると考えられる。マウスにおける異種移植片は、間質、中心部壊疽及び新生脈管構造を発生する固形腫瘍として増殖する。乳癌細胞株ＭＢ−２３１を、免疫不全マウスにおけるインビボ異種移植モデルとして評価した。ＭＢ−２３１腫瘍の良好な生着又は「取り込み率」及び標準的な化学療法剤に対する腫瘍の感受性は、これを適切なモデルとして特徴づけた。親細胞株及び細胞株の変異体を異種移植腫瘍モデルにおいて使用し、広範囲の治療剤を評価した。
ヒト乳癌の予防インビボモデルにおいて、Ｈ４６０−２２−１を、腫瘍細胞の移植の１日前に与え、続いて週に１回、７週間注入した。Ｈ４６０−２２−１処置は、Ｈ４６０−２２−１と構造及び大きさが同一であるが、ＭＢ２３１細胞に結合することができないアイソタイプ対照抗体よりも、処置期間における腫瘍増殖の抑制に有意に（ｐ＜０．０００１）効果的であった。処置段階の終了時には、Ｈ４６０−２２−１を与えられたマウスは、対照群の１７．７％しか増殖しなかった腫瘍を有した。後処置の追跡調査期間の間、Ｈ４６０−２２−１の処置効果は持続し、処置群の平均腫瘍容量は、測定段階の終了時まで、対照よりも有意に小型であり続けた。生存を抗体効能の測度として使用すると、対照群は、移植後７４〜８１日目に５０％の死亡率に達した。対照的に、Ｈ４６０−２２−１処置群は、研究の終了時には、５０％の死亡率に達することはなかった。この差は、Ｈ４６０−２２−１とアイソタイプ対照の処置群の間で有意であった（ｐ＜０．００１５）。これらのデータは、Ｈ４６０−２２−１処置が、対照処置群と比較して、生存利益を付与したことを実証した。Ｈ４６０−２２−１処置は、体重の低減及び臨床困難を含む毒性の徴候を誘導しなかったので、安全であると思われた。したがって、Ｈ４６０−２２−１処置は、ヒト乳癌の十分に確立したモデルにおいて、対照処置群と比較して腫瘍増殖を遅延し、また生存を向上させたので、有効であった。これらの結果は、同様の知見がこの種の別の研究で観察されたので、再現性もあり、癌のある人々の治療におけるその関連性及び利益を示唆している。
乳癌の予防インビボ腫瘍モデルの他に、Ｈ４６０−２２−１は、確立したインビボ腫瘍モデルにおいて、ＭＢ−２３１細胞に対して抗腫瘍活性を実証した。この異種移植腫瘍モデルにおいて、ＭＢ−２３１乳癌細胞を、抗体処置の前に腫瘍が臨界の大きさに達するように、免疫不全マウスの皮下に移植した。Ｈ４６０−２２−１による処置を、標準的な化学療法薬シスプラチンと比較し、シスプラチン及びＨ４６０−２２−１処置群は、アイソタイプ対照抗体で処置した群と比較して、有意に（ｐ＜０．００１）小さい平均腫瘍容量を有した。Ｈ４６０−２２−１処置は腫瘍抑制を仲介し、それはシスプラチン化学療法のおよそ三分の二であったが、シスプラチンで観察された有意な体重減少（ｐ＜０．００３）及び臨床困難がなかった。Ｈ４６０−２２−１の抗腫瘍活性及びその最小限の毒性は、それを魅力的な抗癌治療剤にする。
処置後期間では、Ｈ４６０−２２−１は、アイソタイプ対照抗体群と比較して腫瘍増殖を遅延することによって、腫瘍抑制を維持した。処置後３１日目に、Ｈ４６０−２２−１は、アイソタイプ対照群と比較して腫瘍増殖を４２％低減することによって、腫瘍の大きさを制限し、これは、処置の終了時で観察される４８％の低減に匹敵する。乳癌の確立した腫瘍モデルにおいて、これらの結果は、処置段階を越えて腫瘍抑制を維持するＨ４６０−２２−１の潜在能力を示し、哺乳動物において腫瘍量を低減し、かつ生存を向上させる抗体の能力を実証した。
培養中の乳癌及び前立腺癌の細胞に対する１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ細胞毒性の結果は、（それぞれの内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／８９１，８６６、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で開示されているように）インビボにおけるこれらの癌適応症に対するその抗腫瘍活性により更に拡大された。前臨床異種移植腫瘍モデルは、治療有効性の有効な予測判断材料であると考えられる。
それぞれの内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／８９１，８６６、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１において参照されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌の予防インビボモデルにおいて、腫瘍増殖及び腫瘍量を抑えた。モニタリングを処置後３００日間続けた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腫瘍を発達させることはなく、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の８７．５％は、移植後９か月間の間依然として生存していた。逆に、アイソタイプ対照群は、７２日目（処置後２３日目）までに１００％の死亡率を有した。１Ａ２４５．６処置マウスは、処置後１５１日目までに１００％の死亡率に達し、これはアイソタイプ対照処置群よりも６倍を越えて長い。したがって、１Ａ２４５．６及び大部分は７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌モデルにおいて生存を向上し、腫瘍増殖を妨げた（したがって、疾患の進行を遅延した）。
また、それぞれの内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１０／８９１，８６６において記載されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６は、ヒト乳癌の確立したインビボモデルにおいて、有意に、腫瘍増殖を抑制し、腫瘍量を減少した。８０日目（処置後２３日目）には、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスは、アイソタイプ対照群と比較して８３％低い平均腫瘍容量を有した（ｐ＝０．００１）。１Ａ２４５．６処置は、この日に平均腫瘍容量を３５％低減したが、この低減は本試験では有意にはならなかった（ｐ＝０．１３５）。生存を抗体効能の測度として使用して、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群で死亡する危険性は、処置後およそ６０日目でアイソタイプ対照群の約１６％であった（ｐ＝０．０００６）と推定した。アイソタイプ対照群の１００％が、処置後５０日目までに死亡した。比較すると、１Ａ２４５．６処置マウスは、処置後１００日目まで生存し、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の６０％が、処置後１３０日目で依然として生存していた。このデータは、１Ａ２４５．６と７ＢＤ−３３−１１Ａの両方の処置が、対照処置群と比較して、生存利益及び腫瘍量の減少を付与したことを実証した。７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、体重の低減及び臨床困難を含む毒性の徴候を誘導しなかったので、安全であると思われた。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、ヒト乳癌の十分に確立したモデルにおいて、対照処置群と比較して腫瘍増殖を遅延し、また生存を向上させたので、有効であった。
その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１において概説された研究では、化学療法薬（シスプラチン）単独治療又は組み合わせと比較した７ＢＤ−３３−１１Ａの効果を、２つの異なる確立した乳癌異種移植モデルにおいて決定した。ＭＢ−２３１モデルでは、８３日目（処置後２０日目）には、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照処置動物に対して、腫瘍増殖に８３％の低減をもたらした（ｐ＝０．００２）。シスプラチン単独処置では、対照に対して腫瘍の大きさに７７％の低減をもたらし、一方、７ＢＤ−３３−１１Ａと組み合わせたシスプラチンは、対照に対して腫瘍の大きさに８８％の低減をもたらした（ｐ＝０．００６）。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＢ−４６８）モデルにおいて、６２日目（処置後１２日目）に、腫瘍増殖の最大の低減（９７％、ｐ＝０．００１）が、７ＢＤ−３３−１１Ａと組み合わせたシスプラチン処置で観察された。シスプラチン単独処置は、緩衝剤対照と比較して腫瘍増殖に９５％の減少を生じ、一方、７ＢＤ−３３−１１Ａ単独処置は、３７％の低減を示した（ｐ＝０．０４６）。ＭＢ−２３１とＭＢ−４６８の両方のモデルでは、体重を測定すると、７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置は、シスプラチンによる処置と比較して卓越した動物福祉をもたらした。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、ＭＢ−２３１モデルにおいて、シスプラチン単独処置と比較して顕著な効能を有し、両方の乳癌モデルにおいて、シスプラチンよりも体重減少のような有害作用が少ないのでより良好に許容された。
多様な用量での７ＢＤ−３３−１１Ａ処置の効果を決定するために、用量反応実験を、（その内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説され、記載されている）予防乳癌異種移植モデルで実施した。５５日目（処置後５日目）では、０．２ｍｇ／ｋｇ処置群は、アイソタイプ対照処置群に対して腫瘍増殖を８５％妨げた。５５日目では、また、２と２０ｍｇ／ｋｇの両方の処置群が腫瘍を依然として発達させていなかった。２０ｍｇ／ｋｇ処置群が、依然として腫瘍を発達させず、２ｍｇ／ｋｇ処置群が、いくらかの初期腫瘍増殖を有した、類似した結果を１２５日後（処置後７５日目）に得た。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、生存利益も実証した。アイソタイプ対照群の全てのマウスは、１０４日目（処置後５４日目）までに死亡したが、一方、０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群は、１９７日目（処置後１４７日目）まで生存していた。さらに顕著な生存利益が、２．０及び２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群で観察され、２．０ｍｇ／ｋｇ処置群の５０％だけが２９０日目（処置後２４０日目）までに死亡し、一方、２０ｍｇ／ｋｇ処置群のうち、同様に２９０日目までに死亡したものはいなかった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、３用量の全てにおいて、有意な腫瘍増殖の低減及び生存の増加を示し、最高用量で最大の効能を示した。
乳癌の確立したインビボ腫瘍モデルにおける利益効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説されている）予防インビボ前立腺癌モデルにおいて、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性も有した。７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、アイソタイプ対照抗体よりも、処置器官直後に腫瘍増殖を抑制するのに、有意に（それぞれ、ｐ＝０．００１及び０．０１７）有効であった。処置段階の終了時には、７ＢＤ−３３−１１Ａ又は１Ａ２４５．６を与えられたマウスは、アイソタイプ対照群のそれぞれ３１％及び５０％しか増殖しなかった腫瘍を有した。
ＰＣ−３ ＳＣＩＤ異種移植モデルでは、体重を疾患進行の代理指標として使用することができる。５２日目では、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、アイソタイプ対照と比較して、体重の減少をそれぞれ５４％及び２５％有意に（それぞれ、ｐ＝０．００２及び０．００４）妨げた。マウスでは、処置後の生存をモニタリングした。処置後１１日目には、アイソタイプ及び緩衝剤対照マウスでは１００％の死亡率が達成された。逆に、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６では、処置後３８日目に１００％の死亡率が達成され、対照群よりも３倍長かった。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６処置は、ヒト前立腺癌の十分に確立したモデルにおいて、アイソタイプ対照処置群と比較して腫瘍増殖を遅延し、体重減少を妨げ、また生存を延長したので、有効であった。
前立腺癌の予防インビボ腫瘍モデルに加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは、（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説されている）確立したインビボ腫瘍モデルにおいて、ＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性を実証した。７ＢＤ−３３−１１Ａによる処置を、この場合でもアイソタイプ対照と比較した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群が、処置の直後で、アイソタイプ対照処置群と比較して、有意に（ｐ＜０．０２４）小さい平均腫瘍容量を有することを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、アイソタイプ対照群と比較して３６％の腫瘍抑制を仲介した。
乳癌及び前立腺癌のインビボ腫瘍モデルにおける利益効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、予防インビボ膵癌モデルにおいて、ＢｘＰＣ−３細胞に対して抗腫瘍活性も有した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照よりも、処置期間の直ぐ後で腫瘍増殖を抑制するのに有意に有効（７１％、ｐ＝０．０００９）であった。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照処置群と比較して、生存利益を付与した。７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群において、マウスの４０％は、緩衝剤対照群のマウスが全て死亡した後、２週間を越えて依然として生存していた。
乳癌、前立腺癌及び膵癌のインビボ腫瘍モデルにおける利益効果に加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、２つの別々の予防インビボ黒色種の癌モデルにおいて、Ａ２０５８及びＡ３７５細胞に対して抗腫瘍活性も有した。Ａ２０５８とＡ３７５の両方のモデルにおいて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照よりも、腫瘍増殖を抑制するのに有意に有効（それぞれ、７２％、ｐ＝０．０１１及び６３％、ｐ＝０．０００６）であった。黒色種、並びに乳癌、前立腺癌及び膵癌モデルにおける７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性は、それを、魅力的な抗癌治療剤にする。
７ＢＤ−３３−１１Ａによりインビボにおいて実証される効能が、ＡＤＣＣ活性に全体的に又は部分的に起因しているかを決定するために、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗腫瘍活性を、確立した腫瘍モデルにおいて、ＮＯＤ ＳＣＩＤとＳＣＩＤの両方のマウスでＭＢ−２３１細胞に対して測定した。ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスは、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が機能的に不足しており、かつ循環区画及び機能的に未熟なマクロファージ集団を欠いているが、一方、ＳＣＩＤマウスは、完全であり頑強でもあるＮＫ細胞活性を有している。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ネズミＩｇＧ２ａモノクローナル抗体であり、したがって、インビボでＡＤＣＣ活性が可能である。７ＢＤ−３３−１１Ａの抗腫瘍活性を、緩衝剤対照と、アイソタイプに基づいたＡＤＣＣを介する活性を示すべきではないネズミＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＨ４６０−２２−１の両方と比較した。５４日目（最終処置後４日目）では、ＳＣＩＤ処置群において、７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＨ４６０−２２−１処置マウスは、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量のそれぞれ１．９％及び３．６％の腫瘍しか発達させなかった。逆に、ＮＯＤ ＳＣＩＤ処置群において、この場合でも５４日目（最終処置後４日目）では、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスは、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量の６７％の腫瘍増殖を有した。Ｈ４６０−２２−１処置マウスは、ＳＣＩＤマウスと同様の効果を示し、腫瘍増殖は、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量の１．４％であった。したがって、インビボでの７ＢＤ−３３−１１Ａ活性は、部分的にはＡＤＣＣ活性に起因していると思われ、一方、Ｈ４６０−２２−１の抗腫瘍効果は、ＡＤＣＣから独立していると思われる。
薬剤標的としてＨ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａエピトープを確認するために、正常なヒト組織におけるこれらの標的抗原の発現を決定した。それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で部分的に考察及び概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６の正常なヒト組織への結合を決定した。ＩＨＣ染色によると、腎臓、心臓及び肺のような重要な臓器を含む大部分の組織は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現しなかった。７ＢＤ−３３−１１Ａは、唾液腺、肝臓、膵臓、胃、前立腺及び十二指腸を染色し、扁桃腺を強く染色した。組織染色の結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが多様な細胞型への限定された結合を示すが、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有したことを示した。Ｈ４６０−２２−１と１Ａ２４５．６の両方では、広範囲の組織が陽性染色された。大部分の場合において、染色は、上皮又は浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞に限定されていた。しかし、陽性染色は、心筋及び肝細胞の両方で見られた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６は、膜及び細胞質の両方の染色パターンを示した。
その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で考察及び概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａを、市販の抗ＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６）と比較した。正常なヒト組織の染色の結果は、この場合でも、７ＢＤ−３３−１１Ａが多様な細胞型への限定された結合を示すが、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有したことを示した。ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗体は、互いに比較すると、類似した染色パターンを示した。しかし、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の両方の染色パターンは、７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されるものとかなり異なっていた。具体的には、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体の両方は、広範囲な正常組織に結合し、７ＢＤ−３３−１１Ａも陽性である組織において、通常、より高い染色強度を有し、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞ばかりでなく、大多数の組織の上皮にも結合した。
Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の局在化、並びに乳癌患者のような集団内での蔓延の決定は、これらの抗原の治療上の使用を評価する及び効果的な臨床試験を設計するのに重要である。癌患者からの乳房腫瘍におけるＨ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現に取り組むため、９８人の乳癌患者の腫瘍組織試料では、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現をスクリーニングし（５０人の患者の結果は、それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で以前に記載されている）、５０人の患者の腫瘍組織試料では、１Ａ２４５．６（その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６で記載されている）及びＨ４６０−２２−１抗原をスクリーニングした。
これらの研究の結果は、組織試料の３７％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性染色されたことを示した。患者の試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限定されているので、癌細胞に特異的であると思われた。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者の正常な組織の０〜２０個を染色した。一方、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６は、乳癌組織試料のそれぞれ９２％及び９８％を染色した。Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６は、また、乳癌患者の正常組織の１０個の試料のうち９個を染色した。しかしこの染色は、一般に、乳癌組織試料で観察されるものよりもかなり弱く、一般に、浸潤性線維芽細胞に限定されていた。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６抗原の乳房腫瘍発現は、悪性細胞の細胞膜及び細胞質に局在化していると思われ、治療においてＣＤ６３が魅力的な標的となる。
その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で考察及び概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａを、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６と、並びに抗Ｈｅｒ２抗体（ｃ−ｅｒｂＢ−２）と比較した。現行の研究の結果は、以前の結果と類似しており、腫瘍組織試料の３６％が、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性に染色され、一方、乳房腫瘍組織の９４％及び８５％が、それぞれＨ５Ｃ６及びＲＦＡＣ４エピトープでは陽性であったことを示した。患者の試料内での７ＢＤ−３３−１１Ａの発現は、染色が悪性細胞に限定されているので、癌細胞に特異的であると思われた。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者の正常組織の試料の０〜１０個を染色し、一方、Ｈ５Ｃ６とＲＦＡＣ４の両方は、正常な乳房組織の８個の試料のうち７個を染色した。ｃ−ｅｒｂＢ−２と比較すると、７ＢＤ−３３−１１Ａは、完全に異なる染色プロフィールを示し、ここで、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性の乳房腫瘍組織試料の半分が、Ｈｅｒ２発現では陰性であり、これは、７ＢＤ−３３−１１Ａが、現存の抗体療法では役に立たない患者集団を標的にしていることを示した。また、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２の両方で陽性である乳房腫瘍組織切片間の染色強度に差があった。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、正常な乳房組織切片のうちの１つを陽性染色した。
それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で部分的に考察されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６発現を、乳房腫瘍の発達、治療、及び予後に重要な役割を演じるホルモンであるエストロゲン及びプロゲステロンのためのレセプターの乳房腫瘍発現に基づいて、更に評価した。１Ａ２４５．６抗原と、エストロゲン又はプロゲステロンのいずれかのためのレセプターの発現との間の相関関係は、明白ではなかった。エストロゲンレセプターの不在及びプロゲステロンレセプターの存在と、７ＢＤ３３−１１Ａ抗原発現との間、並びにエストロゲンとプロゲステロンの両方のレセプターの存在と、Ｈ４６０−２２−１抗原発現との間に僅かな相関関係があった。腫瘍をその病期又は癌の進行程度に基づいて分析したとき、結果は、７ＢＤ−３３−１１ＡとＨ４６０−２２−１の両方において、腫瘍の病期が高いとより顕著な陽性発現に向かう傾向を示唆した。ＲＦＡＣ４で同様の結果を得た。Ｈ５Ｃ６も、エストロゲン又はプロゲステロンレセプター発現と極めて僅かな相関関係を示したが、腫瘍の病期と明白な相関関係がなく、しかし、この結論は、小規模な標本サイズによって限定されていた。
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の局在化及び前立腺癌患者内のその蔓延は、前立腺癌の患者への７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の利益を評価する及び効果的な臨床試験を設計するのに重要である。癌患者からの前立腺腫瘍における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現を取り扱うため、５１人の前立腺癌の患者からの腫瘍組織試料では、（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説され、考察されているように）７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現をスクリーニングした。この研究の結果は、組織試料の８８％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性染色されたことを示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常組織切片を同様に高い強度で染色したが、正常試料と比較して、腫瘍組織試料においてより高度に膜を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で染色されなかったのは、胎児性横紋筋肉腫組織試料１つであった。試験された小規模な標本サイズにおいて、腫瘍病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関関係があるとは思われなかった。
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の局在化及び黒色種患者内のその蔓延は、黒色種の患者への７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫療法の利益を評価する及び効果的な臨床試験を設計するのに重要である。癌患者からの黒色種の腫瘍における７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現を取り扱うため、３９人の黒色種患者からの腫瘍組織試料では、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の発現をスクリーニングした。この研究の結果は、組織試料の９０％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性染色されたことを示した。この小規模な標本サイズにおいて、ここでも、腫瘍病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関関係があるとは思われなかった。
７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６の潜在的な治療利益を更に広げるために、多様なヒト癌組織内の抗原の頻度及び局在性も、（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１ＡについてはＳ．Ｎ．１０／６０３，００６において概説され、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１で参照されたように）決定した。乳癌及び前立腺癌に加えて幾つかの癌の種類が、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原を発現した。陽性ヒト癌の種類には、皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、子宮（４／４）及び腎臓（３／３）が挙げられる。一部の癌は抗原を発現せず、これらには、卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）及びリンパ節（０／２）が挙げられる。正常ヒト組織アレイと同様に、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６では、多様な種類のヒト組織からの多数の癌が陽性染色された。より著しい染色が、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓、胃及び膀胱の悪性細胞において見られた。ヒト乳癌、前立腺癌及び黒色種の癌組織と同様に、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６の局在化は、これらの腫瘍細胞の膜上と細胞質内の両方で起こった。したがって、インビトロでの癌細胞株へのＨ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体の結合に加えて、抗原がヒト及び多くの種類の癌で発現する証拠が存在する。
その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１において、７ＢＤ−３３−１１Ａが、そして本明細書において１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１が概説されているように、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａにより認識される抗原はＣＤ６３であることを、生化学データも示している。これは、ＣＤ６３に対して反応性であるモノクローナル抗体ＲＦＡＣ４が、免疫沈降により７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１又は１Ａ２４５．６に結合するタンパク質を同定することを示す研究によって支持される加えて、細菌発現研究は、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３の細胞外ループ２に結合することを解明した。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６エピトープも、立体構造依存性であることによって識別された。これらのＩＨＣ及び生化学的な結果は、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３抗原に結合することを実証した。したがって、圧倒的な証拠が、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＣＤ６３に存在する特有の立体構造エピトープとの連結を介して、抗癌効果を仲介することを示している。本発明の目的において、前記エピトープは、ハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１、その抗原結合フラグメント又はその抗体複合体によりコードされるモノクローナル抗体と結合するその能力によって特徴決定される、「ＣＤ６３抗原部分」と定義される。
全体として、このデータは、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が、癌関連抗原であり、ヒトにおいて発現し、病原関連癌標的であることを実証する。更に、このデータは、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原のヒト癌組織への結合も実証し、診断的、治療予測的、又は予後的であることができるアッセイのために適切に使用することができる。加えて、この抗原の細胞膜局在性は、最も非悪性細胞における抗原の発現の相対的低頻度によって、細胞の癌状態を示しており、この観察は、診断的、治療予測的又は予後的であることができるアッセイで使用されるこの抗体、その遺伝子又は誘導体、そのタンパク質又はその変異体の使用を容認する。
本発明は、米国特許第６，１８０，３５７号で記載された方法により開発され、その効果が、細胞毒性アッセイ、動物モデルにおける確立されていない及び確立された腫瘍増殖、並びに癌性疾患に罹患しているものでの延長された生存期間において確認された、Ｈ４６０−２２−１、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６の開発及び使用を記載する。本発明は、標的分子ＣＤ６３に存在するエピトープに特異的に結合し、かつ悪性腫瘍細胞に対してインビトロ細胞毒性の特性も有するが、正常な細胞には有さず、また、腫瘍増殖の阻害及びヒト癌のインビボモデルにおける生存期間の延長を直接仲介する試薬を初めて記載する、癌治療の分野における進歩を示す。これは、同様の特性を示すものがなかったので、以前に記載された他のあらゆる抗ＣＤ６３抗体に対する進歩である。特定の種類の腫瘍の増殖及び発達に関連する事象においてＣＤ６３の直接的な関与を明確に、かつ初めて実証したので、この分野における進歩も提供する。ヒトの患者において同様の抗癌特性を示す潜在能力を有するので、癌治療における進歩も示す。更なる進歩は、これらの抗体を抗癌抗体のライブラリーに含めることが、腫瘍の増殖及び発達を標的にし、かつ阻害するのに最も有効なものを発見するため、異なる抗癌抗体の適切な組み合わせを決定することにより、異なる抗原マーカーを発現する腫瘍を標的にする可能性を向上させることである。
全体として、本発明は、投与されたとき、哺乳動物においで抗原を発現している癌の腫瘍量を低減することができ、かつ治療された動物の生存期間の延長をもたらすこともできる治療剤の標的としての、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の使用を教示する。本発明は、また、それらの抗原を標的にして、哺乳動物において抗原を発現する癌の腫瘍量を低減するため、及びこの抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の生存期間を延長するための、ＣＤＭＡＢ（Ｈ４６０−２２−１、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６）、それらの誘導体、及びそれらの抗原結合フラグメントの使用を教示する。更に、本発明は、癌性細胞においてＨ４６０−２２−１、７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６抗原を検出することの使用も教示し、これは、この抗原を発現する腫瘍を持つ哺乳動物の診断、治療予測及び予後のために有用であることができる。
患者が治療の初期過程に難治性であるか、又は転移が発生する場合、腫瘍に特異的な抗体を生成する方法を再治療のために繰り返すことができる。更に、抗癌抗体を、患者又は適合するドナーから得た赤血球と結合して、転移の治療のために再注入することができる。転移性癌の対する有効な治療はほとんどなく、転移は、通常、死亡をもたらす不良転帰の前兆である。しかし、転移性癌は、通常、十分に血管新生化されており、赤血球による抗癌抗体の送達は、腫瘍部位へ抗体を集中させる効果を有することができる。転移の前でさえも、ほとんどの癌細胞は、その生存を宿主の血液供給に依存し、赤血球と結合した抗癌抗体は、原位置の腫瘍に対しても有効であることができる。あるいは、抗体は、他の血行性細胞、例えば、リンパ球、マクロファージ、単球、ナチュラルキラー細胞などと結合することができる。
５種類の抗体があり、それぞれその重鎖により付与される機能と関連している。一般に、裸抗体による癌細胞死滅は、抗体依存性細胞仲介細胞毒性（ＡＤＣＣ）又は区画依存性細胞毒性（ＣＤＣ）のいずれかによって仲介されると考えられる。例えば、ネズミＩｇＭ及びＩｇＧ２ａ抗体は、補体系のＣ−１成分の結合によりヒト補体を活性化することができ、それによって、腫瘍溶解をもたらすことができる、補体活性化の古典的経路を活性化することができる。ヒト抗体では、最も効果的な補体活性抗体は、一般にＩｇＭ及びＩｇＧ１である。ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ３アイソタイプのネズミ抗体は、単球、マクロファージ、顆粒球及び特定のリンパ球による細胞死滅をもたらすＦｃレセプターを有する細胞毒性細胞を動員するのに有効である。ヒト抗体のＩｇＧ１とＩｇＧ３の両方のアイソタイプはＡＤＣＣを仲介する。
抗体仲介癌死滅の別の可能な機序は、細胞膜及びその関連する糖タンパク質又は糖脂質における多様な化学的結合の加水分解を触媒するように機能する抗体、いわゆる触媒抗体の使用を介することでありうる。
抗体仲介癌細胞死滅の２つの追加的な機序があり、それらはより広範囲に受け入れられている。第１は、癌細胞に存在する推定抗原に対して免疫反応を生じるように体を誘導する、ワクチンとしての抗体の使用である。第２は、増殖レセプターを標的にし、その機能を妨害する、又は機能が効果的に失われるようにそのレセプターを下方制御する、抗体の使用である。
制癌剤の臨床的有用性は、患者の許容されるリスクプロフィール下の薬剤の利益に基づく。癌療法において、生存は、一般に最も追求される利益であるが、延命に加えて他の十分に認識されている利益が多数存在する。治療が生存に有害な効果を与えないこれらの他の利益には、症状緩和、有害事情に対する保護、再発するまでの時間又は無病生存期間の延長、及び進行するまでの時間の延長が挙げられる。これらの基準は、一般に受け入れられており、米国食品医薬品局（Ｆ．Ｄ．Ａ．）のような規制機関は、これらの利益を生じる薬剤を認可している（Ｈｉｒｓｃｈｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ． Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｈｅｍａｔｏｌｇｙ ４２：１３７−１４３ ２００２）。これらの基準に加えて、これらの種類の利益を予感することができる他の終点があることは、十分に認識されている。部分的には、米国ＦＤＡにより許可された加速承認方法は、患者の利益を予測すると思われる代用薬があることを認めている。年末（２００３年）には、この方法により１６種の薬剤が認可され、それらのうち４種が完全に承認され、すなわち、追跡調査が、代用薬終点により予測された直接的な患者の利益を実証した。固形腫瘍における薬剤効果を決定する一つの重要な終点は、処置に対する反応を測定することにより腫瘍量を評価することである（Ｔｈｅｒａｓｓｅ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ９２（３）：２０５−２１６ ２０００）。そのような評価の臨床基準（ＲＥＣＩＳＴ基準）は、国際的な癌専門家のグループであるＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐにより公表されてきた。適切な対照群と比較して、ＲＥＣＩＳＴ基準に従った他覚的反応により示された、腫瘍量に対する効果を実証した薬剤は、最終的に、直接的な患者利益を生じる傾向がある。前臨床設定において、腫瘍量は、一般に評価及び文書化に対してより直接的である。そこでは、前臨床試験は臨床設定に転換することができ、前臨床モデルにおける生存期間の延長を生じる薬剤は、最大の予測臨床的有用性を有する。臨床治療に陽性反応を生じることと同様に、前臨床設定において腫瘍量を低減する薬剤は、疾患に対して著しく直接的な影響を有することもできる。生存期間の延長が制癌剤治療で最も追求される臨床結果であるが、臨床的有用性を有する他の利益が存在し、疾患進行の遅延、延長した生存期間又はその両方に相関することがある腫瘍量の低減が、直接的な利益をもたらし、臨床的な影響を与えることもできることが明白である（Ｅｃｋｈａｒｄｔ ｅｔ ａｌ． Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ： Ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ ａｎｄ Ｆａｉｌｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ Ｄｅｓｉｇｎｓ ｏｆ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ； ＡＳＣＯ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｂｏｏｋ， ３９ｔｈ Ａｎｎｕａｌ Ｍｅｅｔｉｎｇ， ２００３， ｐａｇｅｓ ２０９−２１９）。
したがって、癌細胞に対して細胞毒性であり、同時に、ハイブリドーマ細胞株及び対応する単離モノクローナル抗体、並びに前記ハイブリドーマ細胞株がコードされているその抗原結合フラグメントを単離するために、非癌性細胞に対して相対的に非毒性である、特定の個人から誘導した細胞からの癌性疾患修飾抗体を産生する方法を利用することが、本発明の目的である。
ＣＤＭＡＢ及びその抗原結合フラグメントを教示することが、本発明の追加的な目的である。
その細胞毒性がＡＤＣＣによって仲介されるＣＤＭＡＢを産生することが、本発明の更なる目的である。
その細胞毒性がＣＤＣによって仲介されるＣＤＭＡＢを産生することが、本発明のさらに追加的な目的である。
その細胞毒性が細胞の化学的結合の加水分解を触媒する能力の機能であるＣＤＭＡＢを産生することが、本発明のなお更なる目的である。
癌の診断、予後及びモニタリングのための結合アッセイに有用であるＣＤＭＡＢを産生することが、本発明のなお更なる目的である。
本発明の他の目的及び利点は、以下の記載によって明らかとなり、例示及び実施例によって、本発明の特定の実施態様が記載される。
（図面の簡単な説明）
特許又は出願ファイルには、カラーで作製した少なくとも１枚の図面が含まれる。カラー図面の本特許又は特許出願公開のコピーは、要請があり、必要な費用が支払われたら特許庁によって提供される。
図１は、７ＢＤ−３３−１１Ａでプローブした（パネルＡ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞体溶解質（レーン１）若しくは膜（レーン２及び３）、又はアイソタイプ対照（パネルＢ）のウエスタンブロットである。分子量目盛りを左側に示す。
図２は、７ＢＤ−３３−１１ＡでプローブしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のエスタンブロットである。レーン１：還元条件下で実施した膜。レーン２：非還元条件下で実施した膜。分子量目盛りを左側に示す。
図３は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への７ＢＤ−３３−１１Ａの結合に対する脱グリコシルの効果である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜を、グリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｏ−グリカナーゼ及びシアリダーゼの組み合わせ（レーン４）、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ及びグルコサミニダーゼの組み合わせ（レーン５）又は緩衝剤対照（レーン６）による処置に付した。分子量目盛りを左側に示す。
図４は、７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）及びウエスタンブロット（パネルＢ）である。レーンＡ：アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質、レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質、及びレーンＴＭ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質。長方形の箱は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンＢ及びウエスタンブロットのレーンＴＭからの同じ帯域を描いている。分子量目盛りを左側に示す。
図５は、Ｐｒｏｆｏｕｎｄ検索概略表である。
図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索概略表である。
図７ａは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーンＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）免疫沈降タンパク質；レーンＤ：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質及びレーンＥ：ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量目盛りを左側に示す。
図７ｂは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーンＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）免疫沈降タンパク質；レーンＤ：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質及びレーンＥ：ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量目盛りを左側に示す。
図８は、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＥ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１〜５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質を含み、レーン６〜１０は、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質を含む。レーン１及び６：ＮａＣｌなし、レーン２及び７：１５０ｍＭのＮａＣｌ、レーン３及び８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レーン４及び９：２０００ｍＭのＮａＣｌ及びレーン５及び１０：ＰＩＰＡ緩衝剤。
図９は、７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）及びクーマシーコロイドブルータンパク質染色（パネルＥ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：非誘導ベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１及びレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量目盛りを左側に示す。
図１０は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗ＣＤ４４（クローンＨ４６０−１６−２）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）、１Ａ２４５．６、並びにＨ４６０−２２−１でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：総膜画分（レーン１）、レーン２：Ｈ４６０−１６−２で免疫沈降した物質、レーン３：７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降した物質、レーン４：Ｈ４６０−２２−１で免疫沈降した物質、レーン５：１Ａ２４５．６で免疫沈降した物質、レーン６：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で免疫沈降した物質、及びレーン７：ＩｇＧ１アイソタイプ対照で免疫沈降した物質。分子量目盛りを左側に示す。
図１１は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗ＣＤ４４（クローンＨ４６０−１６−２）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）、１Ａ２４５．６、並びにＨ４６０−２２−１でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：非誘導ＧＳＴベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ＧＳＴベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１及びレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量目盛りを左側に示す。
図１２は、幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられた７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図１３は、幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられた１Ａ２４５．６、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図１４は、幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられたＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。
図１５は、ヒトの正常な心臓でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、ヒトの正常な脳でＢは１Ａ２４５．６、ＣはＨ４６０−２２−１、ヒトの正常な心臓でＤは陽性対照、ヒトの正常な脳でＥは陽性対照である。倍率は２００×である。
図１６は、ヒトの胃噴門でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＢはＨ４６０−２２−１、Ｃは１Ａ２４５．６、Ｄは陰性アイソタイプ対照である。倍率は２００×である。
図１７は、ヒト乳癌腫瘍（浸潤性乳管癌）に結合している、Ａ．７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂ．１Ａ２４５．６及びＣ．Ｈ４６０−２２−１、並びにＤ．陰性アイソタイプ対照の代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
図１８は、ヒトの正常な乳房組織に結合している、Ａ．７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂ．陽性対照の代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。
図１９は、ヒト乳癌組織アレイからの浸潤性乳管癌の組織切片において、７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体又は抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）により得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗体と比較して腫瘍細胞で弱い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
図２０は、ヒト乳癌組織アレイからの浸潤性乳管癌の組織切片において、７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）又は抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）により得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、陰性染色を示した抗Ｈｅｒ２抗体と比較して腫瘍細胞で強い陽性染色を示した。倍率は２００×である。
図２１は、ヒトの前立腺癌の組織アレイからの前立腺腺癌（Ａ）又は正常な前立腺（Ｂ）の組織切片において７ＢＤ−３３−１１Ａにより得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片における腫瘍細胞で強い陽性膜染色を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常な前立腺組織切片における腺上皮の膜と細胞質の両方で染色を示した。倍率は２００×である。
図２２は、原発性悪性黒色種でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ（黒色矢印は、腫瘍細胞の陽性染色を示し、緑色の矢印は、間質の染色の不在を示す）、Ｂは陰性アイソタイプ対照である。倍率は４００×である。
図２３は、腎細胞癌でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂは１Ａ２４５．６、ＣはＨ４６０−２２−１、Ｄは陰性アイソタイプ対照である。倍率は２００×である。
図２４は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。
図２５は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図２６は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける生存に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。
図２７は、確立しＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図２８は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖抑制（％Ｔ／Ｃ）に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。
図２９は、確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。
図３０は、予防Ａ２０５８黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図３１は、予防Ａ２０５８黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。
図３２は、確立したＡ２０５８黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ対緩衝剤対照の効果である。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図３３は、確立したＡ２０５８黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。
図３４は、予防Ａ３７５黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図３５は、予防Ａ３７５黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。
図３６は、確立したＡ３７５黒色腫モデルにおける、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ及びダカルバジンの単独の及び組み合わせの効果である。ＡＲ７ＢＤ−３３１１Ａ及びリン酸緩衝生理食塩水（対照）は、２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に１週間に３回で３週間投与した。ダカルバジンは、９０ｍｇ／ｋｇ（このモデルにおける最大耐量の１／２）を腹腔内に毎日１回で、５日間連続して投与した。群の腫瘍増殖及び生存の中央値（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット）の曲線を示す。
図３７は、予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。
図３８は、予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。
図３９は、予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌ＳＣＩＤ又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１又は緩衝剤対照の効果である。
実施例１
ウエスタンイムノブロッティングによる７ＢＤ−３３−１１Ａ結合タンパク質の同定
その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説され、考察されているように、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａにより認識されている抗原を同定するために、細胞膜調製物をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付して、膜に移した。後者を抗体７ＢＤ−３３−１１Ａでプローブして、この抗体により検出されるタンパク質を可視化した。
１．０．全細胞溶解質及び総膜画分調製物
１．１．全細胞溶解質調製物
ＦＡＣＳによる以前の研究は、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１）への抗体７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を実証した。その結果、この細胞株から得た総細胞膜調製物及び全細胞溶解質を、抗原同定及び特徴決定に使用した。ＭＢ−２３１細胞からの総細胞溶解質を次のように調製した：ＭＢ−２３１細胞ペレット（１．５ｇ）を、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００、０．０２％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウ、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ； Ｍａｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有する２ｍＬの溶解緩衝剤に再懸濁した。ペレットをガラスホモジナイザーで均質化し、４℃で１時間、撹拌しながらインキュベートした。次に試料を４℃で１５分間遠心分離（２０，０００ｇ）に付して、洗浄剤不溶物質を除去した。上澄みを収集し、アリコートに分け、−８０℃で凍結した。細胞溶解質中のタンパク質濃度を、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ； Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ．）で決定した。
１．２．総細胞膜画分調製物
総細胞膜を、ＭＢ−２３１乳癌細胞のコンフルエント培養から調製した。培地を細胞スタックから除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞を、プラットフォーム振とう機により、解離緩衝剤（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ； Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ， ＮＹ）を用いて３７℃で２０分間解離した。細胞を収集し、４℃で１０分間、９００ｇで遠心分離した。遠心分離の後、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁して洗浄し、再び４℃で１０分間、９００ｇで遠心分離した。次にペレットを必要になるまで−８０℃で保存した。膜を調製するために、細胞ペレットを解凍し、細胞１ｇあたり３ｍＬの緩衝剤の比率で５０ｍＬあたり１錠の完全プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ； Ｌａｖａｌ ＱＣ）を含有する均質化緩衝剤に再懸濁した。細胞懸濁液を、ポリトロンホモジナイザーを氷上で使用して均質化に付して、細胞を溶解した。細胞ホモジネートを４℃で１０分間、１５，０００ｇで遠心分離して、核粒子を除去した。上澄みを採取し、管に分け、次に４℃で９０分間、７５，６００ｇで遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、膜ペレットをそれぞれ約５ｍＬの均質化緩衝剤に再懸濁した。全ての管の膜ペレットを合わせ、もう１回分けて、４℃で９０分間、７５，６００ｇで遠心分離した。上澄みを注意深く除去し、ペレットを計量した。１％トリトンＸ−１００を含有する可溶化緩衝剤を、膜ペレット１ｇあたり３ｍＬの緩衝剤の比率でペレットに加えた。膜を、プラットフォーム振とう機により３００ｒｐｍで１時間、氷上で振とうして可溶化した。膜懸濁液を７５，６００ｇで遠心分離して、不溶物質をペレット化した。可溶性膜タンパク質を含有する上澄みを管から注意深く取り出し、タンパク質濃度をアッセイし、−８０℃で保存した。
２．０ 一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンイムノブロッティング
ＭＢ−２３１細胞の総膜画分及び全細胞溶解質からのタンパク質を一次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、それぞれ５％及び１０％の濃縮及び離ゲルに分けた。タンパク質を、電気ブロッティングにより、４℃で一晩かけてＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ； Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ， ＭＡ）に移した。完全な移動は、着色分子量マーカーの膜への移動を評価して決定した。移動の後、膜を、ＴＢＳＴ中の５％（ｗ／ｖ）スキムミルクにより室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、次に２つの複製ブロットを次のようにプローブした：１つのブロットを、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ（５μｇ／ｍＬ、ＴＢＳＴ中の５％スキムミルク）でプローブし、複製ブロットをＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（５μｇ／ｍＬ、ＴＢＳＴ中の５％スキムミルク）でプローブした。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、次にホースラディッシュＨＲＰ複合ヤギ抗ネズミＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ； Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）と共にＲＴで１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで３回それぞれ１０分間洗浄した後、ブロットを、製造会社の使用説明書に従って、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ； Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ， ＣＡ）により展開した。ブロットを水ですすぎ、画像をゲル記録系で得た（図１及び２）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ； Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）。ブロットを、カメラの焦点、絞り、及び画像取得時間が同じ条件下で画像化した。図１において、７ＢＤ−３３−１１Ａは、２０〜８０ｋＤａ範囲でタンパク質に明確に結合しており、その反応性は、全細胞溶解質及び総膜画分を含有するレーンで検出された。アイソタイプ対照は、ＭＢ−２３１溶解質又は膜画分においてどのタンパク質にも結合せず、７ＢＤ−３３−１１Ａの結合が特異的であったことを示した。図２は、ウエスタンブロットでの７ＢＤ−３３−１１Ａ結合に対する試料還元の効果を実証した。この抗体の反応性は、試料が非還元条件下で調製されたときにのみ検出された（レーン２）。ＤＴＴ又はβ−メルカプトエタノールのような還元剤が結合を完全に排除し（レーン１）、７ＢＤ−３３−１１Ａの認識及び天然タンパク質上のそのエピトープへの結合が、ジスルフィド結合の存在に依存していることが示された。
ウエスタンイムノブロッティングにより検出された抗原の拡散特性が、不均質グリコシル化に起因するかを決定するために、総膜画分を、特定の炭水化物基を除去する幾つかのグリコシダーゼ（グリコペプチダーゼＦ、ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ及びグルコサミニダーゼ）による処置に付した。処置の後、試料を１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングに付した。一部の酵素が、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａにより確認される抗体の集団で有意な量を占める炭水化物の一部を除去する場合、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより差を検出することが可能であることが予測された。図３は、認識された抗原の集団に有意な減少をもたらした、ＭＢ−２３１細胞からの総膜画分のグリコシダーゼ処置を示す。これは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体により認識された抗原が、少なくとも１つの糖タンパク質から構成されることを示した。抗原の移動性における有意なシフトは、幾つかの酵素が一緒に使用されたときにおいてのみ起こるという事実は、少なくとも一部の炭水化物部分が、複合Ｎ結合炭水化物から構成されることを示した。グリコシダーゼによる膜の処置は、分子量シフトをもたらしたが、結合の強度を低減しなかった。このことは、抗体は、糖タンパク質の主にポリペプチド部分に結合することを示唆した。
実施例２
７ＢＤ−３３−１１Ａで結合した抗原の同定
この実施例で詳述されるデータは、その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で以前に記載されている。
１．０ ＭＢ−２３１総膜画分からの抗原の免疫沈降
総膜抽出物（総タンパク質５ｍｇ）を、適切な容量の１×溶解緩衝剤（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．０２％ＮａＮ３、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭフッ化ナトリウム、及びプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｍａｎｈｅｉｍ， Ｇｅｒｍａｎｙ））により、並びに最終１×ＲＩＰＡ緩衝剤濃度を得るために、適切な容量の２×ＲＩＰＡ緩衝剤（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％コール酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００及び０．０２％ＮａＮ３）により、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬに稀釈した。抽出物を、タンパク質Ｇセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）により４℃で２時間前清澄した。総膜抽出物を除去し、ストックＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて、０．５ｍｇ／ｍＬの最終ＢＳＡ濃度にした。抽出物を前清澄している間、抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズ（タンパク質Ｇセファロース３０μｌに化学的に架橋された抗体６０μｇ）を、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ １ｍＬと共に、４℃で２時間インキュベートしてブロックした。ブロックした後、抗体結合ビーズを、１×ＲＩＰＡ緩衝剤で５分間、２回洗浄した。次に抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズを、ＢＡＳ含有総膜抽出物に加え、転倒型回転器により４℃で３時間インキュベートした。４℃で１０秒間、２０，０００ｇでの遠心分離の後、非結合画分を除去及び廃棄し、ビーズを、各洗浄工程でＲＩＰＡ緩衝剤１ｍＬにより５分間、３回洗浄した。次にビーズをＰＢＳ １．５ｍＬで１回すすいだ。７ＢＤ−３３−１１Ａ結合タンパク質Ｇセファロースによる上記で記載された免疫沈降（ＩＰ）を、タンパク質ＧセファロースビーズがＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）と化学的架橋している同様のＩＰと平行して実施した。この工程は、免疫複合体へのタンパク質の非特異性結合を評価することができるように実施した。ＰＢＳを完全に排出した後、ビーズを非還元試料緩衝剤４０μｌ中で沸騰させ、試料を１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてゲルの一部分をウエスタンイムノブロッティングにより、ゲルの残りの部分をクーマシーコロイドブルーでの染色により分析した。４０μｌのうち、画分（８μｌ）を、ウエスタンブロッティングのためにＳＤＳ−ＰＡＧＥに添加し、残りの画分（３２μｌ）を、クーマシーコロイドブルーでの染色のために同じゲルの別のレーンに添加した。タンパク質染色に指定したゲルの部分を、クーマシーコロイドブルー染色と共に一晩インキュベートした。ウエスタンブロッティングに指定したゲルの部分をＰＶＤＦ膜に３２０ｍＡで２時間移動させ、脱イオン水ですすぎ、ＴＢＳＴ中の５％ミルクによりＲＴで１時間ブロックし、次にＴＢＳＴ中の５％ミルク中で、７ＢＤ−３３−１１Ａと共に４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、次にＴＢＳＴ中の５％ミルク中で、ＨＲＰ結合Ｆｃ特異性ヤギ抗ネズミＩｇＧ（１：５０００）と共に、室温で１時間インキュベートした。次にブロットを１０分間、３回洗浄し、包装に挿入された使用説明書に従って、ＴＭＢペルオキシダーゼ基質キットにより展開した。図４で示されているように、ウエスタンイムノブロット及びクーマシーコロイドブルー染色ゲルを、分子量マーカーを基準として使用して並べた。クーマシーコロイドブルーで染色した主帯域が、ウエスタンブロットで７ＢＤ−３３−１１Ａと反応した主帯域と並んだ。図４においてこの部分を強調した（長方形の挿入）。
２．０ ペプチドマッピング及び質量分析法による抗原同定
上記の実験から、次にウエスタンブロットで最も強く反応した部分と並んだクーマシーコロイドブルー染色ゲルの帯域を切り出し、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ， Ｒｏｃｋｆｏｒｄ， ＩＬ）を使用してゲル内トリプシン消化に付した。消化のアリコートを、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ ＰＢＳＩＩｃ読み取り機（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）による質量分析に付した。簡潔に、消化のアリコートをＨ４チップ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）上に手作業でスポットした。乾燥した後、ＣＨＣＡマトリックス（α−シアノ４−ヒドロキシケイ皮酸；Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．， Ｆｒｅｅｍｏｎｔ， ＣＡ）のアリコートを、チップ上の同じスポットに加え、乾燥させた。次に試料をＰＢＳＩＩｃ読み取り機で分析した。アイソタイプ対照レーン及びブランクゲル領域と平行している領域の同様の大きさの帯域を、７ＢＤ−３３−１１Ａにより免疫沈降した抗原の消化により生じた独自のペプチドフラグメントを決定することができるように、７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰのゲルプラグと並行して処理した。独自のペプチドフラグメントの集団を、質量スペクトルの情報を使用してタンパク質配列データベースを検索する公的にアクセス可能なオンラインツールであるＰＲＯＦＯＵＮＤを使用して、検索した。次に７ＢＤ−３３−１１Ａ ＩＰ消化の試料における独自のペプチドを、ＰＢＳＩＩｃ読み取り機で既に分析された同じ試料スポットの分析を可能にするインターフェースを備えた、ＱＳＴＡＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ）によるＭＳ／ＭＳ分析に付した。次にＭＳ／ＭＳデータを、ＭＳ／ＭＳスペクトルの情報を使用してタンパク質配列データベースを検索する公的にアクセス可能なオンラインツールであるＭＡＳＣＯＴにより分析した。図５は、ＰｒｏＦｏｕｎｄ検索の結果による表の概略である。大きな信頼度を持って推定される候補として示唆された唯一のタンパク質は、ＣＤ６３であった。図６は、ＭＡＳＣＯＴ検索の結果による表の概略である。高い確率を持って同定された唯一のタンパク質はＣＤ６３であり、ペプチドマップフィンガープリント法による仮の同定を支持した。
３．０ ７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原ＩＤの確認
７ＢＤ−３３−１１Ａの推定抗原のＩＤの確認は、既知の抗ヒトＣＤ６３モノクローナル抗体であるＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＬＴＤ， Ｈａｎｔｓ， ＵＫ）及びＨ５Ｃ６（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）が、７ＢＤ−３３−１１Ａにより免疫沈降したタンパク質と反応するか、またその逆も同様であるかを決定することによって、実施した。更なる確認は、ヒトＣＤ６３の細胞外ドメインのグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合作成物により形質転換された誘導及び非誘導細菌からの総溶解質のウエスタンイムノブロッティングによって、実施した。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６により、並びにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）アイソタイプ対照により調製されたＭＢ−２３１総膜からの免疫沈降を、１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてウエスタンイムノブロッティングによって分析した。各免疫複合体試料からの等容量の画分を複製ゲルで分析した。ＰＶＤＦ膜への電気ブロッティングの後、複製ゲルのブロットを、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４、Ｈ５Ｃ６より、並びにＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１アイソタイプ対照により、並行してプローブした。図７ａは、試験モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＲＦＡＣ４それぞれによって免疫沈降した物質をウエスタンイムノブロッティングにより分析した、交差ＩＰ実験の結果を示す。図７ｂは、試験モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＨ５Ｃ６それぞれによって免疫沈降した物質をウエスタンイムノブロッティングにより分析した、交差ＩＰ実験の結果を示す。モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ５それぞれは、７ＢＤ−３３−１１Ａにより免疫沈降した同様の抗原と交差反応した。加えて、ウエスタンブロットでは、７ＢＤ−３３−１１ＡはＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６により免疫沈降した同様の抗原と、２０〜８０ｋＤａの範囲で交差反応したが、アイソタイプ対照抗体で調製した免疫複合体とは交差反応しなかった。アイソタイプ対照抗体でプローブしたブロットは、完全に陰性であった。このデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ応対で認識されるエピトープがＣＤ６３抗原の中に含まれていたことを示した。
交差反応性が全ての抗体により認識されている同じ分子に起因するか、又は同じ集団と相互作用する分子の存在に起因するかを決定するために、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａによる免疫沈降を、緩衝剤の緊密性を増加する条件下（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１％トリトンＸ−１００、及び多様な濃度のＮａＣｌ：０、１５０、５００及び２０００ｍＭ；また、上記で記載されたとおりであるが５００ｍＭのＮａＣｌを含有するＲＩＰＡ緩衝剤）で実施した。次に得られた免疫複合体を、ウエスタンイムノブロッティングにおいて、モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６及びＲＦＡＣ４により、並びにアイソタイプ対照ＩｇＧ２ａ及びＩｇＧ１によりプローブした。図８は、ＩＰ条件の厳密性を変えても、免疫複合体の形成に検出可能な影響を何も与えなかったことを示し、それは、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａにより認識される分子も抗ＣＤ６３抗体により認識され、その逆もまた同様であることを示した。
７ＢＤ−３３−１１ＡがヒトＣＤ６３抗原に直接結合することを更に確認するために、その反応性を、ヒトＣＤ６３の細胞外ドメイン（ループＥＣ１及びＥＣ２）を含む組み換え融合ポリペプチドを発現する大腸菌の溶解質に対して、ウエスタンイムノブロッティングにより評価した。この研究のため、ＣＤ６３の細胞外ループ（ループ１及びループ２−それぞれＥＣ１及びＥＣ２）のＧＳＴ融合作成物を、適切なｃＤＮＡフラグメントを細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）にサブクローニングして産生した。ループをコードするｃＤＮＡフラグメントを、完全長ヒトｃＤＮＡをテンプレートとして使用した（クローンＭＧＣ−８３３９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）により得た。ＥＣ１ループをコードするｃＤＮＡを以下のＰＣＲプライマーを使用して得た：
５′プライマー（ＥＣ１＿５′）、５′ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧ３′及び
３′プライマー（ＥＣ１＿３′）、５′ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣ３′。
ＥＣ２ループをコードするｃＤＮＡを以下のＰＣＲプライマーを使用して得た：
５′プライマー（ＥＣ２＿５′）、５′ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ３′及び
３′プライマー（ＥＣ２＿３′）、５′ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣ３′。
ＰＣＲ反応の条件は次であった：５′プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、３′プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、テンプレートＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６ｍｇ／ｍＬ）０．２μＬ及びＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）４５．８μＬ。ＰＣＲ反応は、次のようにして実施した：９４℃で５分間、続いて、１サイクルあたり、９４℃で３０秒間の溶融、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸展、を３０サイクル。
サブクローニングの後、ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独陰性対照（ベクターにｃＤＮＡフラグメントがサブクローンされていない）を含む作成物を、大腸菌に形質転換した（ＢＬ−２１株）。それぞれの形質転換からの単独のアンピシリン耐性コロニーを増殖し、対応する挿入ｃＤＮＡを配列決定した。ｃＤＮＡ配列が正しいことを確認した後、それぞれのクローンを液体培養中で増殖させ、ＧＳＴ融合作成物の発現を、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）の添加により誘導した。２時間のインキュベーションの後、細菌培養を室温で５分間、２０００ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、細菌ペレットを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤中で沸騰させた。次に試料を、前記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（それぞれ、５％及び１２％のポリアクリルアミド濃縮及び分離ゲル）並びにウエスタンイムノブロッティングにより分析した。ブロット膜を７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ５Ｃ６、ＲＦＡＣ４により、又はＩｇＧ２ａアイソタイプ対照によりプローブした。図９で示される結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが、ヒトＣＤ６３のループ２（アミノ酸１０８−２０２）を特異的に認識し（７ＢＤ−３３−１１Ａでプローブしたレーン６のブロット）、ループ１（アミノ酸３４−５２）を認識しないことを明らかにした。細菌溶解質に対する抗体の特異性は、２つの十分に特徴決定された抗ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６）も、ＥＣ２融合ポリペプチドを発現する誘導大腸菌からの溶解質のみで、同様の大きさの帯域を認識するという観察によって、更に確認された。上記の結果は、全て、７ＢＤ−３３−１１Ａが、ヒトＣＤ６３を認識し、アミノ酸１０８−２０２を包含する細胞外領域に特異的に、直接結合することを実証する。
実施例３
１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１により結合する抗原の同定
１．０ ＭＢ−２３１総膜画分からの抗原の免疫沈降
総膜抽出物（総タンパク質１ｍｇ）を、適切な容量の１×溶解緩衝剤（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．０２％ＮａＮ３、２ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、５０ｍＭ ＮａＦ及びプロテアーゼインヒビターカクテル）により、並びに最終１×ＲＩＰＡ緩衝剤濃度を得るために、適切な容量の２×ＲＩＰＡ緩衝剤（５０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１．０％コール酸ナトリウム、０．２％ＳＤＳ、１％トリトンＸ−１００及び０．０２％ＮａＮ３）により、最終タンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬに稀釈した。抽出物を、タンパク質Ｇセファロースビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｉｃｉｅｎｃｅｓ； Ｕｐｐｓａｌａ， Ｓｗｅｄｅｎ）により４℃で２時間前清澄した。総膜抽出物を除去し、ストックＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）を加えて、０．５ｍｇ／ｍＬの最終ＢＳＡ濃度にした。抽出物を前清澄している間、抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズ（タンパク質Ｇセファロース３０μｇに化学的に架橋された抗体６０μｇ）を、０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ １ｍＬと共に、４℃で２時間インキュベートしてブロックした。ブロックした後、抗体結合ビーズを、１×ＲＩＰＡ緩衝剤で５分間、２回洗浄した。次に抗体結合タンパク質Ｇセファロースビーズを、ＢＡＳ含有総膜抽出物に加え、転倒型回転器により４℃で３時間インキュベートした。４℃で１０秒間、２０，０００ｇでの遠心分離の後、非結合画分を除去及び廃棄し、ビーズを、各洗浄工程でＲＩＰＡ緩衝剤１ｍＬにより５分間、３回洗浄した。次にビーズをＰＢＳ １．５ｍＬで１回すすいだ。タンパク質Ｇ−セファロースビーズ結合モノクローナル抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、Ｈ４６０−２２−１、ＩｇＧ１アイソタイプ対照、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照及びＨ４６０−１６−２（後者は、ＣＤ４４を特異的に認識することが知られている、十分に特徴決定されている抗体である）による免疫沈降（ＩＰ）を並行して実施した。ＰＢＳを完全に排出した後、ビーズを非還元試料緩衝剤４０μｌ中で沸騰させ、試料を１Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、続いてウエスタンイムノブロッティングにより、分析した。複製ゲルを、ＰＶＤＦ膜に３２０ｍＡで２時間移動させた。次に膜を脱イオン水ですすぎ、ＴＢＳＴ中の５％ミルクによりＲＴで１時間ブロックした。複製膜を、ＴＢＳＴ中の５％ミルク中、モノクローナル抗体ＲＦＡＣ４（抗ＣＤ６３）、１Ａ２４５．６、Ｈ４６０−２２−１、Ｈ４６０−１６−２と共に、並びにアイソタイプ対照ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａと共に、４℃で一晩インキュベートした。ブロットをＴＢＳＴ中で１０分間、３回洗浄し、次にＴＢＳＴ中の５％ミルク中で、ＨＲＰ結合Ｆｃ特異性ヤギ抗ネズミＩｇＧ（１：５０００稀釈）と共に、室温で１時間インキュベートした。次にブロットを１０分間、３回洗浄し、ＨＲＰのＴＭＢ基質の標準的手順に従って展開した。図１０で示されているように、抗体ＲＦＡＣ４（抗ＣＤ６３）、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１によりプローブしたブロットは、反応性の同一パターンを明示した。３つの抗体は全て、抗体７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６により免疫沈降した物質（それぞれレーン３、４及び５）と交差反応し、２０〜８０ｋＤａの明白な分子量の範囲での反応性により特徴づけられた。また同様の反応性パターンを、未分画総膜洗浄剤抽出物を添加したレーン（レーン１）で観察することができる。加えて、これらの抗体のうち、抗ＣＤ４４抗体Ｈ４６０−１６−２により免疫沈降した物質（レーン２）と交差反応するものはなく、後者は、Ｈ４６０−１６−２以外の抗体により免疫沈降した物質（レーン３、４及び５）を認識しなかった。非特異性交差反応性は、アイソタイプ対照抗体によりプローブした複製ブロットでは検出されなかった。したがって、これらの結果は、抗体１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１が、抗体ＲＦＡＣ４及び７ＢＤ−３３−１１Ａと同じ抗原分子、ＣＤ６３を認識したことを強く示唆した。
２．０ １Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１抗原ＩＤの確認
１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１がヒトＣＤ６３抗原に直接結合することを確認するために、その反応性を、ヒトＣＤ６３の細胞外ドメイン（ループＥＣ１及びＥＣ２）を含む組み換え融合ポリペプチドを発現する大腸菌の溶解質に対して、ウエスタンイムノブロッティングにより評価した。この研究のため、ＣＤ６３の細胞外ループ（ループ１及びループ２−それぞれＥＣ１及びＥＣ２）のＧＳＴ融合作成物を、適切なｃＤＮＡフラグメントを細菌発現ベクターＰＧＥＸ−４Ｔ−２（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）にサブクローニングして産生した。ループをコードするｃＤＮＡフラグメントを、完全長ヒトｃＤＮＡをテンプレートとして使用した（クローンＭＧＣ−８３３９、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ）ポリメラーゼ連鎖反応増幅（ＰＣＲ）により得た。ＥＣ１ループをコードするｃＤＮＡを以下のＰＣＲプライマーを使用して得た：
５′プライマー（ＥＣ１＿５′）；５′ＧＣＣＧＴＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧ３′及び
３′プライマー（ＥＣ１＿３′）、５′ＧＡＴＧＡＣＧＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＧＧＧＧＴＡＧＣ３′。
ＥＣ２ループをコードするｃＤＮＡを以下のＰＣＲプライマーを使用して得た：
５′プライマー（ＥＣ２＿５′）、５′ＧＧＣＴＡＴＧＧＡＴＣＣＡＧＡＧＡＴＡＡＧＧＴＧＡＴＧ３′及び
３′プライマー（ＥＣ２＿３′）、５′ＴＡＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣ３′。
ＰＣＲ反応の条件は次であった：５′プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、３′プライマー（２５ｐｍｏｌ／μＬ）２μＬ、テンプレートＤＮＡ（ｐＯＴＢ−ＣＤ６３、０．７６ｍｇ／ｍＬ）０．２μＬ及びＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）４５．８μＬ。ＰＣＲ反応は、次のようにして実施した：９４℃で５分間、続いて、１サイクルあたり、９４℃で３０秒間の溶融、５５℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸展、を３０サイクル。
サブクローニングの後、ＰＧＥＸ−４Ｔ−２ベクター単独陰性対照（ベクターにｃＤＮＡフラグメントがサブクローンされていない）を含む作成物を、大腸菌に形質転換した（ＢＬ−２１株）。それぞれの形質転換からの単独のアンピシリン耐性コロニーを増殖し、対応する挿入ｃＤＮＡを配列決定した。ｃＤＮＡ配列が正しいことを確認した後、それぞれのクローンを液体培養中で増殖させ、ＧＳＴ融合作成物の発現を、１ｍＭのＩＰＴＣ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ； Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）の添加により誘導した。２時間のインキュベーションの後、細菌培養を室温で５分間、２０００ｇで遠心分離した。上澄みを廃棄し、細菌ペレットを、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝剤中で沸騰させた。次に試料を、前記のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（それぞれ、５％及び１２％のポリアクリルアミド濃縮及び分離ゲル）並びにウエスタンイムノブロッティングにより分析した。ブロット膜を、１Ａ２４５．６、Ｈ４６０−２２−１、ＲＦＡＣ４、Ｈ４６０−１６−２、並びにＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照によりプローブした。抗体は、全て５μｇ／ｍＬの濃度で使用した。図１１で示されている結果は、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１がヒトＣＤ６３のループ２（アミノ酸１０８−２０２）を特異的に認識し（１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１によりプローブしたレーン６のブロット）、ループ１（アミノ酸３４−５２）もＧＳＴベクター単独も認識しないことを明らかにした。細菌溶解質に対する抗体の特異性は、十分に特徴決定された抗ヒトＣＤ６３抗体（ＲＦＡＣ４）も、ＧＳＴ−ＥＣ２融合ポリペプチドを発現する大腸菌からの溶解質のみで、同様の大きさの帯域を認識するという観察によって、更に確認された。加えて、ヒトＣＤ４４（Ｈ４６０−１６−２）を認識する抗体は、この実験で発現した組み換えタンパク質のいずれも認識しなかった。上記の結果は、全て、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１が、ヒトＣＤ６３を認識し、アミノ酸１０８−２０２を包含する細胞外領域に特異的に、直接結合することを示した。
実施例４
ハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６については、それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１０／８９１，８６６において、ハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１については本明細書において概説されているように、３つのハイブリドーマクローンを、ブダペスト条約に従って、Ｈ４６０−２２−１は受入番号ＰＴＡ−４６２２で２００３年９月４日に、そして１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａはそれぞれ受入番号ＰＴＡ−４８８９及びＰＴＡ−４８９０で２００３年１月８日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ， １０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡ ２０１１０−２２０９に寄託した。３７ ＣＦＲ １．８０８に従って、寄託者は、寄託物質の公共利用性に対して課せられている全ての制限が、特許の付与にあたって変更不能に解除されることを確認する。
抗体産生
Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及び７ＢＤ−３３−１１Ａモノクローナル抗体は、ＣＬ−１０００フラスコ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）中で、週に２回収集し、再接種して、ハイブリドーマを培養することにより産生した。抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂａｉｅ ｄ’Ｕｒｆｅ， ＱＣ）により、標準的な抗体精製手順に従って精製した。
７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６については、それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１０／８９１，８６６で既に記載され、Ｈ４６０−２２−１については本明細書で概説されているように、３つの抗体を、細胞毒アッセイにおいて、多数の陽性（抗Ｆａｓ（ＥＯＳ９．１、ＩｇＭ、κ、２０μｇ／ｍＬ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＩｇＧ１、κ、１０μｇ／ｍＬ、Ｉｎｔｅｒ Ｍｅｄｉｃｏ， Ｍａｒｋｈａｍ， ＯＮ）、抗ＥＧＦＲ（Ｃ２２５、ＩｇＧ１、κ、５μｍｏｌ／ｍＬ、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ， Ｈｏｒｎｂｙ， ＯＮ）、シクロヘキシミド（１００μｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）、ＮａＮ３（０．１％、Ｓｉｇｍａ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ））と陰性（１０７．３（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ１、κ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）、Ｇ１５５−１７８（抗ＴＮＰ、ＩｇＧ２ａ、κ、２０μｇ／ｍＬ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）、ＭＰＣ−１１（抗原特異性は不明、ＩｇＧ２ｂ、κ、２０μｇ／ｍＬ）、Ｊ６０６（抗フルクトサン、ＩｇＧ３、κ、２０μｇ／ｍＬ）、ＩｇＧ緩衝剤（２％））の対照の両方を比較した（表１及び２）。乳癌（ＭＢ−２３１、ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）、結腸癌（ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６、ＳＷ６２０）、肺ガン（ＮＣＩ Ｈ４６０）、卵巣癌（ＯＶＣＡＲ）、前立腺癌（ＰＣ−３）、黒色腫（Ａ２０５８、Ａ３５７及びＡ５４９）、並びに非癌（Ｈｓ５７８．Ｂｓｔ、ＣＣＤ ２７ｓｋ、Ｈｓ８８８ Ｌｕ）の細胞株を試験した（全て、ＡＴＣＣ， Ｍａｎａｓｓａｓ， ＶＡからのもの）。生存／死亡細胞毒性アッセイを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）から得た。アッセイを、製造会社の使用説明書に従い、下記に概説するように変えて実施した。細胞を、アッセイの前に、所定の適切な密度で平板培養した。２日後、精製抗体又は対照を、培地中で稀釈し、次に、１００μＬを細胞板に移し、５％ＣＯ２インキュベーターで５日間インキュベートした。板を反転して空にし、吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有する室温ＤＰＢＳを、多チャンネルスクイーズボトルからそれぞれのウエルに分配し、３回軽く叩き、反転して空にし、次に吸い取って乾燥した。ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２を含有するＤＰＢＳで稀釈した蛍光カルセイン染料５０μＬをそれぞれのウエルに加え、５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で３０分間インキュベートした。板をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＨＴＳ７０００蛍光平板読み取り機で読み取り、データをマイクロソフトのエクセルで分析し、結果を表１及び２において作表した。データは、三重に試験した４回の実験の平均を表し、次の方法で定量的に表した：実験の４／４が細胞毒性閾値よりも大きい（＋＋＋）、実験の３／４が細胞毒性閾値よりも大きい（＋＋）、実験の２／４が細胞毒性閾値よりも大きい（＋）。表１でマークのない細胞は、一貫性がないことを表すか、又は効果が細胞毒性閾値未満であることを表す。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体は、乳房及び前立腺腫瘍細胞株において選択的に細胞毒性を示すが、非形質転換正常細胞に影響を与えなかった。７ＢＤ−３３−１１Ａ及び１Ａ２４５．６は、前立腺癌細胞株に対して、対照抗Ｆａｓ又は抗ＥＧＦＲ抗体より大きな死滅を示した。Ｈ４６０−２２−１は、ＭＢ−２３１細胞株に対して、対照抗Ｆａｓ又は抗ＥＧＦＲ抗体より大きな死滅を示した。化学細胞毒性剤は、その予測される細胞毒性を誘導したが、比較のために含まれる多数の他の抗体も、生物学的細胞アッセイの制限を考慮すると、予測されたように機能した。全体として、７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１抗体が、多数の癌の細胞型に細胞毒性を有したことを示した。これらの抗体は、全ての癌の細胞型に感受性があったわけではないので、その活性は選択的であった。更に、抗体は、非癌細胞型に対して細胞毒性を生じることがなかったので、機能的な特異性を実証し、このことは、治療状況において重要な要因である。
Figure 2008545615
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７ＢＤ−３３−１１Ａの、上記の癌及び正常細胞株のパネルへの、並びに次の追加的な癌細胞株：結腸（ＬＯＶＯ）、膵臓（ＢｘＰＣ−３）、卵巣（ＥＳ−２、ＯＣＣ−１）及び前立腺（ＤＵ−１４５）と、次の正常細胞株（ＣＣＤ−１１２）への結合を、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ、それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で参照されている）により評価した。１Ａ２４５．６（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／３４８，２３１、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１及びＳ．Ｎ．１０／８９１，８６６で参照されている）及びＨ４６０−２２−１の、上記の癌及び正常細胞株への結合もＦＡＣＳによって評価した。細胞は、最初に細胞単層をＤＰＢＳにより（Ｃａ＋＋及びＭｇ＋＋を用いないで）洗浄することによって、ＦＡＣＳで調製した。次に細胞解離緩衝剤（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ， Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ， ＯＮ）を使用して、３７℃で細胞培養板から細胞を取り出した。遠心分離及び収集した後、細胞を、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２及び２又は２５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を４℃で含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（洗浄媒質）に再懸濁し、カウントし、適切な細胞密度にアリコートし、遠心沈殿し、７ＢＤ−３３−１１Ａ又は対照抗体（アイソタイプ対照若しくは抗ＥＧＦＲ）を含有する染色媒質（ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２＋／−２％ＦＢＳを含有するＤＰＢＳ）に２０μｇ／ｍＬで３０分間、氷上で再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合二次抗体の添加の前に、細胞を洗浄媒質で１回洗浄した。次に染色媒質中のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合抗体を、２０〜３０分間加えた。次に細胞を最後に洗浄し、１μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム又は１．５％のパラホルムアルデヒドを含有する染色媒質に再懸濁した。細胞のフローサイトメトリー取得を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウエア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＦＡＣＳｃａｎに試料をかけて評価した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）及び側面散乱（ＳＳＣ）、をＦＳＣ及びＳＳＣ検出器の電圧及び振幅利得を調節して設定した。３つの蛍光チャンネル（ＦＬ１、ＦＬ２及びＦＬ３）を、細胞が約１〜５単位の蛍光強度中央値の均一ピークを有するように、精製アイソタイプ対照抗体で染色された実行中の細胞により、続いてＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合二次抗体により調整した。生存細胞を、ＦＳＣでのゲーティング及び（使用される場合）ヨウ化プロピジウム排除により得た。それぞれの試料では、約１０，０００個の生存細胞を分析のために得て、結果を表３、４及び５に表した。表３、４及び５は、それぞれ７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１の、上記のアイソタイプ対照に対する蛍光強度倍増の中央値を表にし、５未満（−）；５〜５０（＋）；５０〜１００（＋＋）；１００を越える（＋＋＋）として定量的に表し、括弧内は、染色された細胞の率を表す。
７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１抗体の代表的なヒストグラムを、図１２、１３及び１４にそれぞれまとめた。７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳房（ＭＢ−２３１及びＭＣＦ−７）、結腸（ＨＴ−２９、ＳＷ１１１６及びＳＷ５２０）、肺、卵巣、膵臓及び前立腺（ＰＣ−３）由来の癌系に対して類似的結合を示し、乳房（ＭＢ−４６８）、結腸（ＬＯＶＯ）及び前立腺（ＤＵ−１４５）癌細胞株のうちの１つに差次的結合を示す。１Ａ２４５．６は、乳房（ＭＢ−２３１、ＭＢ−４６８及びＭＣＦ−７）、結腸（ＳＷ１１１６及びＳＷ５２０）、肺、卵巣及び前立腺由来の癌系に対して類似的結合を示し、結腸（ＨＴ−２９）癌細胞株のうちの１つに差次的結合を示す。Ｈ４６０−２２−１は、試験癌細胞株に類似的結合を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１の非癌細胞への結合も存在したが、その結合は細胞毒性を生じなかった。このことは、結合が、抗体のその同族抗原との連結の結果を必ずしも予測するものではなく、明白な知見ではなかったことの更なる証拠であった。これは、異なる細胞における抗体連結の脈絡は、単に抗体結合ではなく細胞毒性を決定したことを示唆した。
Figure 2008545615
Figure 2008545615
Figure 2008545615
実施例５
正常なヒト組織の染色
ＩＨＣ研究は、ヒトにおける７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６抗原の分布を特徴決定するために実施した。これらのデータは、７ＢＤ−３３−１１Ａ（それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ．１０／６０３，００６、Ｓ．Ｎ．１０／８１０，７５１）及び１Ａ２４５．６（その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６）について以前に考察されている。更なる実験の条件を決定するために、ＩＨＣ最適化研究を予め実施した。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６モノクローナル抗体を、上記で記載されたように産生及び精製した。
組織切片をオーブンにより５８℃で１時間乾燥して脱パラフィン処理し、Ｃｏｐｌｉｎジャー中のキシレンにそれぞれ４分間で５回浸漬して脱ロウした。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％から７５％）による処置の後、切片を水中で再水和した。スライドを、ｐＨ６のクエン酸緩衝剤（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）１０ｍＭに浸漬し、次に高、中及び低設定でそれぞれ５分間マイクロ波照射し、最後に冷ＰＢＳに浸漬した。次にスライドを３％過酸化水素溶液に６分間浸漬し、ＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、乾燥し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロック溶液（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）と共に室温で５分間インキュベートした。７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６、Ｈ４６０−２２−１、モノクローナルマウス抗ビメンチン（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている）を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）で稀釈して、処理濃度（各抗体で５μｇ／ｍＬ）にし、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５から１００％）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填媒質（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）を使用して微視的に調べ、デジタル画像を得て、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ）を使用して保存した。結果を、組織病理学者が読み取り、評価し、解釈した。
５９個の正常なヒト組織への抗体の結合を、ヒトの正常な臓器組織アレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用して実施した。表６は、正常なヒト組織アレイの７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６染色の結果のまとめを表す。表から、３種類の組織染色が存在する。１群の組織は完全に陰性であった。これらの組織には、７ＢＤ−３３−１１Ａでは、正常な皮膚、脳、卵巣、胸腺、甲状腺、小腸、食道、心臓（図１５Ａ）、胆嚢及びリンパ節が含まれた。Ｈ４６０−２２−１では、完全に陰性の組織は、皮下脂肪及び脳（図１５Ｃ）から構成された。１Ａ２４５．６では、完全に陰性の組織は、皮膚、皮下脂肪、食道及び脳（図１５Ｂ）から構成された。第２群は、陽性染色を示した組織を含んだ。これらには、７ＢＤ−３３−１１Ａでは、肝臓及び膵臓が含まれた。扁桃腺は、この抗体によって最も強く染色された。Ｈ４６０−２２−１では、陽性染色は、肝臓、心臓、扁桃腺、甲状腺、副腎及び子宮筋層で起こった。Ｈ４６０−２２−１と同様に、１Ａ２４５．６の陽性染色は、肝臓、心臓、扁桃腺、甲状腺、副腎及び子宮筋層で起こった。７ＢＤ−３３−１１Ａのように、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６は、扁桃腺を最も強く染色した。第３群の組織には、染色が組織切片では陽性であるが、浸潤性マクロファージ、リンパ球、線維芽細胞又は上皮に限定されていた組織が含まれ、例えば７ＢＤ−３３−１１Ａ、１Ａ２４５．６及びＨ４６０−２２−１（それぞれ図１６Ａ及びＢ及びＣ）では胃である。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、腎臓、心臓（図１５Ａ）及び肺を含む幾つかの重要な臓器の細胞に存在しないことを留意するべきである。全体として、７ＢＤ−３３−１１Ａは、陽性である組織において弱から中程度の結合を有するＨ４６０−２２−１と１Ａ２４５．６の両方と比較して、正常なヒト組織のより小さなサブセットに結合する。Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６染色は、また、より広範囲であるにもかかわらず、一般に強度が弱から中程度である。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａの抗原は、正常な組織に広く発現することがなく、抗体は、限定された数のヒト組織に特異的に結合することを示唆している。加えて、Ｈ４６０−２２−１と１Ａ２４５．６の両方の抗原は、心臓及び肝臓に存在していることの他に、上皮、並びに浸潤性リンパ球、マクロファージ及び線維芽細胞に限定されている。
Figure 2008545615
その内容が参照として本明細書に組み込まれる１０／８１０，７５１で概説され、考察されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、生化学的な方法により以前に決定されているように、ＣＤ６３であるので、研究は、７ＢＤ−３３−１１Ａと、ＣＤ６３に向けられた２つの抗体（ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６）とを比較した。２４個の正常なヒト組織への抗体の結合を、ヒトの正常な臓器組織アレイ（Ｃｌｉｎｏｍｉｃｓ， Ｗａｔｅｒｖｌｉｅｔ， ＮＹ）を使用して実施した。全ての一次抗体（７ＢＤ−３３−１１Ａ；ＲＦＡＣ４（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．， Ｈａｎｔｓ， ＵＫ）及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）；並びにマウス ＩｇＧ１陰性対照（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ））を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）で稀釈して、（前の最適化工程で最適な濃度であることが判明している）５μｇ／ｍＬの濃度にした。陰性対照抗体は、製造会社によって、全ての哺乳類組織で陰性であることが示されている。ＩＨＣの手順は上記で記載されたとおりであった。
組織切片をオーブンにより５８℃で１時間乾燥して脱パラフィン処理し、Ｃｏｐｌｉｎジャー中のキシレンにそれぞれ４分間で５回浸漬して脱ロウした。一連の段階的なエタノール洗浄（１００％から７５％）による処置の後、切片を水中で再水和した。スライドを、ｐＨ６のクエン酸緩衝剤（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）１０ｍＭに浸漬し、次に高、中及び低設定でそれぞれ５分間マイクロ波照射し、最後に冷ＰＢＳに浸漬した。次にスライドを３％過酸化水素溶液に６分間浸漬し、ＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、乾燥し、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌブロック溶液（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）と共に室温で５分間インキュベートした。７ＢＤ−３３−１１Ａ、モノクローナルマウス抗ＣＤ６３（Ｃｙｍｂｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．， Ｈａｎｔｓ， ＵＫ ｏｒ Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）又はアイソタイプ対照抗体（哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼに向けられている）を、抗体稀釈緩衝剤（Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）で稀釈して、処理濃度（各抗体で５μｇ／ｍＬ）にし、室温で１時間インキュベートした。スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄した。一次抗体の免疫反応性を、供給されたＨＲＰ結合二次抗体（Ｄａｋｏ Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）により室温で３０分間検出／可視化した。この工程の後、スライドをＰＢＳによりそれぞれ５分間で３回洗浄し、免疫ペルオキシダーゼ染色のために、ＤＡＢ（３，３′−ジアミノベンジジンテトラヒドラクロリド、Ｄａｋｏ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）発色基質溶液を室温で１０分間加えて、呈色反応を起こした。スライドを水道水で洗浄して、発色反応を止めた。マイヤー・ヘマトキシリン（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ， Ｏａｋｖｉｌｌｅ， ＯＮ）による対比染色の後、スライドを段階的なエタノール（７５から１００％）で脱水し、キシレンで清澄にした。装填媒質（Ｄａｋｏ Ｆａｒａｍｏｕｎｔ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， Ｏｎｔａｒｉｏ）を使用して、スライドをカバーガラスで覆った。スライドを、Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００（Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ， Ｔｏｒｏｎｔｏ， ＯＮ）を使用して微視的に調べ、デジタル画像を得て、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ， ＯＮ）を使用して保存した。結果を、病理学者が読み取り、評価し、解釈した。
表７は、正常なヒト組織の試験アレイの７ＢＤ−３３−１１Ａ、並びにＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３染色の結果のまとめを表す。７ＢＤ−３３−１１Ａによる組織の染色は、以前に記載されたもの（その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／６０３，００６）と類似している。７ＢＤ−３３−１１Ａが多様な細胞型への限定された結合を示すが、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞への結合を有したことを、ここでも留意するべきである。ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗体は、互いに比較すると、類似した染色パターンを示した。しかし、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６の両方の染色パターンは、７ＢＤ−３３−１１Ａで観察されるものとかなり異なっていた。具体的には、ＲＦＡＣ４とＨ５Ｃ６抗体の両方は、広範囲な正常組織に結合し、７ＢＤ−３３−１１Ａも陽性である組織において、通常、より高い染色強度を有し、浸潤性マクロファージ、リンパ球及び線維芽細胞ばかりでなく、大多数の組織の上皮にも結合した。
７ＢＤ−３３−１１Ａで陽性であった組織は、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗ＣＤ６３抗体によっても陽性であった。７ＢＤ−３３−１１Ａで陰性であった組織は、一般にＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６で陰性ではなかった。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗ＣＤ６３抗体により認識される組織のより小さなサブセットに結合すること、及び染色の強度もいくらか低い組織内に結合することを実証した。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａのエピトープは、正常な組織に広く発現することがなく、抗体は、限定された数のヒト組織に特異的に結合することを示した。これは、また、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗体により認識されているものと異なるエピトープがこれらのＩＨＣ研究で使用されているにもかかわらず、７ＢＤ−３３−１１ＡがＣＤ６３のエピトープに向けられているという、生化学的証拠を支持した。
Figure 2008545615
実施例６
ヒト乳房腫瘍組織の染色
それぞれその内容が参照として本明細書に組み込まれる、Ｓ．Ｎ１０／６０３，００６及びＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で部分的に概説され、考察されているように、ＩＨＣ研究を行って、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６抗原とヒト乳癌との癌関連性を決定し、抗体がヒトの癌を認識する可能性を決定した。ビメンチン（陽性対照）と抗体と、哺乳類組織に存在せず、誘導もされない酵素である、アスペルギルスニガーグルコースオキシダーゼ（陰性対照）との比較を行った。５０人の乳癌患者からの誘導した乳癌組織アレイ及び乳癌患者からの非腫瘍性乳房組織から誘導した１０個の試料（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を３つの抗体の全てにより染色した。それぞれの患者から年齢、性別及び診断を得た。実施例５のＩＨＣ手順に従った。抗体は、全て５μｇ／ｍＬの処理濃度で使用した。表８ａは、このアレイの７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６抗体染色のまとめを提供する。
追加の４８個の乳癌（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及び９個の正常な乳房組織試料を、７ＢＤ−３３−１１Ａで試験した（表８ｂで示されている）。７ＢＤ−３３−１１Ａで染色した９８個の切片全てを統合した結果が、表１１で参照される。全体として、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６でそれぞれ試験した５０人の患者の９２％及び９８％と比較して（それぞれ図１７Ｃ及びＢ）、試験した９８人の患者の３７％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原では陽性であった（図１７Ａ）。７ＢＤ−３３−１１Ａでは、乳癌患者からの正常な乳房組織試料の１９個のうち０個が、陽性であった（図１８Ａ）逆に、正常な乳房組織試料の１０個のうち９個が、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６の両方で陽性であった。しかし、染色は、大多数の場合で浸潤性線維芽細胞に起因していた（それぞれ図１８Ｃ及びＢ）。表１１で示されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａの、エストロゲンレセプター陰性乳癌、プロゲステロン陽性乳癌及び進行乳癌（Ｔ３及びＴ４）へのより高い結合の傾向がある。
エストロゲンとプロゲステロンのレセプターの状態の相関関係は、１Ａ２４５．６では明白ではなかったが、組織染色の強度は、より高い腫瘍病期と相関していると思われた（表９）。僅かに多い数の、Ｈ４６０−２２−１で陽性の組織も、エストロゲン及びプロゲステロンレセプター陽性であり、腫瘍病期が高いと陽性発現が顕著になる傾向があった（表１０）。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６染色は、癌性細胞に特異的であり、染色は、膜と細胞質内の両方で起こった。７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６の染色パターンは、患者の試料において、抗体が悪性細胞に対して高度に特異的であり、対応する抗原が細胞膜に存在し、それによって、魅力的な投薬可能標的となることを示した。
Figure 2008545615
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その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１で概説され、考察されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３、ｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２（Ａ０４８５、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ， Ｍｉｓｓｉｓｓａｇｕａ， ＯＮ）抗体を使用して、比較を実施した。５０人の乳癌患者からの誘導した乳癌組織アレイ及び乳癌患者からの非腫瘍性乳房組織から誘導した１０個の試料（Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使用した。次の情報をそれぞれの患者から得た：年齢、性別、アメリカ癌合同委員会（ＡＪＣＣ）腫瘍病期、リンパ節、エストロゲンレセプター（ＥＲ）及びプロゲステロンレセプター（ＲＰ）の状態。実施例５のＩＨＣ手順に従った。１．５μｇ／ｍＬの濃度で使用した抗Ｈｅｒ２抗体を除いて、全ての抗体を５μｇ／ｍＬの処理濃度で使用した。
表１１、１２、１３及び１４は、それぞれ、乳癌組織アレイの７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体染色のまとめを提供する。全体として、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体でそれぞれ８５及び９４％であるのと比較して、試験した５０人の患者の３６％が７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で陽性であった。７ＢＤ−３３−１１Ａと、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体の両方が、同じ組織を染色した場合、７ＢＤ−３３−１１Ａと比較して、試料の９７％が、ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体の両方でより高い強度の染色を有した（図１９）。７ＢＤ−３３−１１Ａでは、乳癌患者からの正常な乳房組織試料の１０個のうち０個が、陽性であった。ＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６抗ＣＤ６３抗体の両方では、乳癌患者からの正常な乳房組織試料の８個のうち７個が、陽性であった（２個の試料は、代表的ではなかった）。上記のように、エストロゲン又はプロゲステロンレセプター発現と、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原発現との間に僅かな相互関係があり、いずれかのレセプター発現のある組織は、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の僅かに高い発現を有した。腫瘍をその病期又は癌の進行程度に基づいて分析したとき、結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａでは、腫瘍の病期が高いとより顕著な陽性発現に向かう傾向を示唆した。ＲＦＡＣ４で同様の結果を得た。Ｈ５Ｃ６も、エストロゲン又はプロゲステロンレセプター発現と極めて僅かな相関関係を示したが、腫瘍の病期と明白な相関関係はなかった。しかし、３つの抗体全てにおいて、結果は、小規模な標本サイズによって限定されていた。
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間質細胞が明らかに陰性であり、悪性細胞のシートが陽性であったので、７ＢＤ−３３−１１Ａ染色は、正常細胞と比較して癌性細胞に特異的であった。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で見られる細胞局在パターンは、細胞膜及び細胞質に限定されていた。同様の膜及び細胞質染色結果を、乳房腫瘍組織試料に対する抗ＣＤ６３抗体のＲＦＡＣ４及びＨ５Ｃ６で得た。加えて、これらの抗体は、両方とも、７ＢＤ−３３−１１Ａが陰性である正常な乳房組織試料に対して、この染色局在パターンを示した。
ｃ−ｅｒｂＢ−２抗Ｈｅｒ２と比較して、７ＢＤ−３３−１１Ａは、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原では陽性の乳房腫瘍組織試料の１８個のうち９個がＨｅｒ２では陰性であるという完全に異なる染色特徴を示し、乳癌患者にとって治療上の要求が依然として満たされていないこと示した（表１５、図２０）。７ＢＤ−３３−１１ＡとＨｅｒ２の両方で陽性である乳房腫瘍組織切片間で染色の強度に差が存在し、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で極めて陽性であった一部の乳房腫瘍組織切片は、Ｈｅｒ２では中程度でしか陽性ではなく、その逆もまた同様であり、この場合でも、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳癌患者の異なるコホートを治療的に標的にすることを示した。ｃ−ｅｒｂＢ−２抗体も、正常な乳房組織切片のうちの１つを陽性染色した。
これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａの抗原は、乳癌患者のおよそ三分の二で発現することがあり、これらの半分が、Ｈｅｒ２抗原で完全に陰性であった。染色パターンは、患者の試料において、抗原が悪性細胞に対して高度に特異的であり、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が細胞膜に存在し、それによって、魅力的な投薬可能標的となることを示した。はるかに限定されているが、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗ＣＤ６３抗体に対する７ＢＤ−３３−１１Ａの同様の染色が、ここでも、７ＢＤ−３３−１１ＡエピトープがＣＤ６３に対してより制限的なエピトープである可能性を実証している。
Figure 2008545615
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実施例７
ヒト前立腺組織の染色
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が、乳癌に加えて、他のヒトの癌組織に発現するかを決定するために、ヒト前立腺腫瘍組織アレイを、７ＢＤ−３３−１１Ａでプローブした。（その内容が参照として本明細書に組み込まれるＳ．Ｎ．１０／８１０，７５１；Ｉｍｇｅｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）。使用された染色手順は実施例５で概説されたものと同一であった。ビメンチンを陽性対照抗体として使用し、ヒト乳房腫瘍組織アレイで記載されたものと同じ陰性対照抗体を使用した。抗体は、全て５μｇ／ｍＬの処理濃度で使用した。
表１６で概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト前立腺癌の８８％を染色した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常組織切片を同様に高い強度で染色したが、正常試料と比較して、腫瘍組織試料ではより高度な膜染色が存在した。７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原で染色されなかったのは、胎児性横紋筋肉腫組織試料１つであった。ここでも、腫瘍病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関関係があるとは思われなかった。しかし、結果は小規模な標本サイズによって限定されていた。この場合でも、７ＢＤ−３３−１１Ａによって、前立腺腫瘍組織試料では膜と細胞質の両方に染色が観察された。しかし、乳房腫瘍試料で見られるものに対して、膜染色の程度は増加していた（図２１）。正常な前立腺組織試料では、膜染色の度合いにおけるこの増加は観察されなかった。
Figure 2008545615
したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原は、乳癌の膜だけでなく前立腺癌の膜にも見出されたことが、明らかとなった。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａが、乳房のほかの腫瘍型において治療薬として潜在能力があることを示した。
実施例８
ヒト黒色腫組織の染色
７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が乳癌及び前立腺癌に加えて他のヒトの癌組織に発現するかを決定するために、ヒト黒色腫腫瘍組織アレイを７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ｔｒｉｓｔａｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ， ＬＬＣ， Ｂｅｔｈｅｓｄａ， ＭＤ）でプローブした。使用された染色手順は、ＤＡＢの代わりにＡＥＣを色原体として使用する以外は、実施例５で概説されたものと同一であった。ＲＦＡＣ４及びＮＫＩ／Ｃ３を陽性対照抗体として使用し、ヒト乳房腫瘍組織アレイで記載されたものと同じ陰性対照抗体を使用した。０．４μｇ／ｍＬの濃度で使用したＮＫＩ／Ｃ３を除いて、全ての抗体を５μｇ／ｍＬの処理濃度で使用した。
表１７で概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ヒト黒色腫癌の９０％を染色した（図２２）。限定された数の試験試料において、ここでも、腫瘍病期と７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原の存在との間に直接的な相関関係があるとは思われなかった。この場合でも、７ＢＤ−３３−１１Ａによって、黒色腫腫瘍組織試料では膜と細胞質の両方に染色が観察された。
Figure 2008545615
実施例９
ヒト腫瘍組織の染色
その内容が参照として本明細書に組み込まれる１０／６０３，００６で部分的に概説され、考察されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１又は１Ａ２４５．６のいずれかの抗原が、乳癌に加えて他のヒト癌組織に発現するかを決定するために、抗体を、多発性ヒト腫瘍組織アレイ（Ｉｍｇｅｎｅｘ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）で個別に試験した。次の情報をそれぞれの患者から得た：年齢、性別、臓器及び診断。使用された染色手順は実施例５で概説されたものと同一であった。ビメンチンを陽性対照抗体として使用し、ヒト乳房腫瘍組織アレイで記載されたものと同じ陰性対照抗体を使用した。抗体は、全て５μｇ／ｍＬの処理濃度で使用した。
表１８で概説されているように、７ＢＤ−３３−１１Ａは、乳房の他に、多数の多様なヒトの癌を染色した。次の腫瘍型は、７ＢＤ−３３−１１Ａで陽性であった：皮膚（１／２）、肺（３／４）、肝臓（２／３）、胃（４／５）、甲状腺（２／２）、前立腺（１／１）、子宮（４／４）及び腎臓（３／３）（図２３Ａ）。幾つかの他の腫瘍型も場合によって陽性に染色された。他の腫瘍組織では７ＢＤ−３３−１１Ａ発現が陰性であった：卵巣（０／３）、精巣（０／１）、脳（０／２）及びリンパ節（０／２）。逆に、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６は、試験されたあらゆる腫瘍型組織を染色した。しかし、染色は強度が異なっており、最も強い染色の幾つかは、皮膚、肺、肝臓、子宮、腎臓（各図２３Ｂ及びＣ）、胃及び膀胱の悪性細胞で見られた。乳癌及び前立腺癌（７ＢＤ−３３−１１Ａのみ）で見られるように、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６染色は、癌性細胞の膜及び細胞質内に局在化した。
したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６抗原は、乳癌、前立腺癌及び黒色腫の癌の膜だけでなく、腫瘍型の大型変種の膜にも見出されると思われる。これらの結果は、７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１及び１Ａ２４５．６が、乳癌及び前立腺癌に加えて、多種多様な腫瘍型に治療薬として潜在能力を有することを示す。
Figure 2008545615
実施例１０
カニクイザル及びアカゲザル正常組織へのＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲＨ４６０−２２−１及びＡＲ１Ａ２４５．６の結合
非ヒト霊長類の種における抗原の発現を評価するために、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＡＲＨ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６及びＨ５Ｃ６（市販の抗ＣＤ６３）抗体結合を、２種類の霊長類種からの正常な組織においてＩＨＣにより試験した。カニクイザル及びアカゲザルからの正常な組織アレイを、ＢｉｏＣｈａｉｎ， Ｈａｙｗａｒｄ， ＣＡから得て、実施例５で概説された手順に従って染色した。陽性（抗アクチン抗体）及び陰性対照も試験した。アレイは、次の９個の代表的な臓器の切片から構成された：心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、脾臓、小腸、骨格筋及び膵臓。
ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体結合は、限定されており、ヒト組織で観察されたものに匹敵していた。表１９及び２０で示されているように、抗体は、心臓、脳又は骨格筋に結合せず、強い結合が観察された肺マクロファージ及び膵臓組織を除いた他の試験組織に、弱から中程度の結合を示した。結合は、２種類の非ヒト霊長類種の間で同様であるが、２つの注意点があった。アカゲザルの小腸切片において、少数の線維芽細胞への不確かな結合が存在していたが、対応するカニクイザル切片は、代表的ではなく、したがって評価することができなかった。肝臓及び腎臓切片へのＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ結合は、カニクイザルよりもアカゲザル試料において強力であった。
Figure 2008545615
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霊長類種へのＡＲＨ４６０−２２−１の結合も、ヒト組織で観察されたものに匹敵していた。表２１及び２２で見られるように、対応するアカゲザルでは陰性であるカニクイザル脳試料で観察された不確かな結合を除いて、ＡＲＨ４６０−２２−１結合は、２種類の非ヒト霊長類種の間で同様であった。
Figure 2008545615
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霊長類種へのＡＲ１Ａ２４５．６の結合も、ヒト組織で観察されたものに匹敵していた。表２３及び２４で示されているように、ＡＲ１Ａ２４５．６組織結合は、以下を例外として、２種類の霊長類種で同様であった：骨格筋（アカゲザルでは陰性であり、カニクイザルでは不確かであった）、心筋（カニクイザルよりもアカゲザルで強力であった）及び脳（アカゲザルよりもカニクイザルで強力であった）。
Figure 2008545615
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ヒト組織で観察されたように、（表２５及び２６で概説されている）Ｈ５Ｃ６結合は、Ｈ４６０−２２−１及びＡＲ１Ａ２４５．６と同様の結合パターンを示し、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａよりも広い範囲の組織に結合した。４つの抗ＣＤ６３抗体の全てにおいて、細胞局在は主に細胞質においてであり、粒子状染色パターンを有していた。
Figure 2008545615
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これらのデータは、Ｈ４６０−２２−１、ＡＲ１Ａ２４５．６、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＨ５Ｃ６の抗原が、ヒトとカニクイザル及びアカゲザルとで同様に発現する、並びにこれらの非ヒト霊長類の種が、Ｈ４６０−２２−１、１Ａ２４５．６又はＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ投与の安全性及び薬物動態を研究する潜在的なインビボモデルを表す、という証拠を提供する。
実施例１１
インビボＭＤＡ−ＭＢ−２３１予防腫瘍実験
図２４及び２５で示されているデータを参照して、４〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の５百万のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。マウスを無作為に１０匹の処置群に３分割した。移植の前日に、２０ｍｇ／ｋｇのＨ４６０−２２−１試験抗体、抗体緩衝剤又は（ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）アイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００μＬの容量で腹腔内投与した。次に抗体を、１週間に１度で７週間同じ方法により投与した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で１０週間まで、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで、若しくは１２０日目まで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
この研究で表されたデータは、縦データセットの典型的な例である。通常、そのようなデータセットでは、時点間で高い相関関係があり、より高い相関関係が、より近接する時点間で観察される。このため、分散の反復測定分析（Ｒｅｐ． ＡＮＯＶＡ）を使用して、処置間の差を決定し、共分散の分析方法を使用して、差が起こる時点の決定に使用した。後者は、それぞれの時点での群間の差が、群だけに起因するのではなく、前の時点に起因する場合に、適切な方法である。
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、福祉及び繁栄失敗の代用であった。図２４は、研究期間にわたる３群のマウスの平均体重を表す。それぞれの群内で体重は経時的に増加した。Ｒｅｐ． ＡＮＯＶＡは、群間に有意な差がなく、平均プロフィールは、アイソタイプ対照、抗体緩衝剤又はＨ４６０−２２−１で処置された群の時点において異なっていなかった。
実験全体にわたってＲｅｐ． ＡＮＯＶＡを使用して、以下の結果が注目された。Ｒｅｐ． ＡＮＯＶＡ法は、群の平均が異なっている（ｐ＜０．００１）ばかりでなく、平均プロフィールの形状も互いに異なっていることを示した。図２５で見ることができるように、処置群Ｈ４６０−２２−１は、他の群と比較して優れた効果を有すると思われた。加えて、アイソタイプ対照処置群と抗体緩衝剤処置群との差は、統計的に有意ではなかった。共分散の分析によると、有意な差が、アイソタイプ及び緩衝剤処置群がＨ４６０−２２−１処置群と異なっていた１８日目に初めて起こった。５３日目に、Ｈ４６０−２２−１で処置された群の腫瘍容量（処置の中止後の最初の腫瘍容量測定）は、抗体対照処置群の１７．７％であり（ｐ＜０．０００１）、それによって、腫瘍量を抑えるのに有効であることを実証した。Ｈ４６０−２２−１による処置によって、対応する生存利益（図２６）も存在した。生存の向上は効能の重要な指標である。３群全てを、後処置７０日を越えて追跡した。これらのデータは、対照処置群と比較して、試験抗体による処置が生存利益を付与したことを実証した。対照群は、移植後７４〜８１日目に５０％の死亡率に達した。対照的に、Ｈ４６０−２２−１処置群は、研究の終了時（移植後１２０日目）には、５０％の死亡率に達することはなかった。アイソタイプ対照群処置群は、移植後１０２日目に１００％の死亡率に達した。対照的に、Ｈ４６０−２２−１処置動物は、研究の終了時には６０％の生存率を示した。
まとめると、Ｈ４６０−２２−１抗体処置は、ヒト癌疾患の十分に認識されたモデルにおいて、対照抗体と比較して腫瘍量を抑え、生存率を増加した。これらの結果は、ヒトを含む他の哺乳動物における療法としての、この抗体（Ｈ４６０−２２−１）の潜在的な薬理学的及び薬学的利益を示唆している。
実施例１２
インビボＭＤＡ−ＭＢ−２３１確立腫瘍の実験
５〜６週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の５百万のＭＢ−２３１乳癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。腫瘍の増殖をカリパスで毎週測定した。コホートの大部分が移植後３４日目に１００ｍｍ３（７０〜１３０ｍｍ３の範囲）の腫瘍量に達したとき、１２匹のマウスをそれぞれ３つの処置群に無作為化した。Ｈ４６０−２２−１又は（ＭＢ−２３１細胞に結合しないことが知られている）アイソタイプ対照抗体を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、１５０μＬの容量で、１５ｍｇ／ｋｇ／用量により静脈内投与し、シスプラチンを９ｍｇ／ｋｇ／用量（生理食塩水で稀釈）により３００μＬで腹腔内投与した。次に抗体を、１週間に３回で合計１０用量を同じ方法により移植後４８日目まで投与した。シスプラチンを４日毎に３用量投与した。腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日毎で試験の間、又は個々の動物がＣＣＡＣ終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
無作為化の時点で、平均腫瘍量及び標準偏差はそれぞれの群において類似していた：アイソタイプ対照（９７．６０＋／−１８．３３）；Ｈ４６０−２２−１（９４．０６＋／−１７．７７）；シスプラチン（９８．００＋／−１８．９３）。図２７で示されているように、抗体Ｈ４６０−２２−１は、３週間の処置期間の終了時に腫瘍増殖を有意に抑制することができた。３群の平均腫瘍容量の比較は、群間の差が極めて有意であることを示した（表２７）。
Figure 2008545615
効能の更なる評価は、増殖阻害を反映しているＴ／Ｃ比（アイソタイプ対照〔Ｃ〕の腫瘍容量の中央値の百分率としての処置〔Ｔ〕の腫瘍容量の中央値）を計算することにより査定した。Ｈ４６０−２２−１抗体は、対照の４８％に等しい腫瘍容量中央値を得た（図２８）。図２７は、Ｈ４６０−２２−１処置が、アイソタイプ対照と比較したときに腫瘍増殖に著しい抑制をもたらしたこと、その抑制が、最大耐量（ＭＴＤ）で与えられたがシスプラチンに付随する毒性又は死亡を伴わないシスプラチンの２／３であったことを、更に示す。
実験の継続期間中に毎週記録した体重を、安全性及び毒性の評価の代用として使用した。表２８で概説され、図２９で示されているように、アイソタイプ対照又はＨ４６０−２２−１で処置された群において体重に最小限の差しかなかった。対照的に、処置期間中、シスプラチン群おいて有意な（ｐ＜０．００３）悪液質が観察された。この群において、体重減少は初期体重の１９．２％に達し、脱水及び嗜眠に起因する逆毛、皮膚の着色のような臨床困難の追加的な証拠が生じた。シスプラチン処置群で２匹の死亡が観察されたことに比べると、Ｈ４６０−２２−１処置群では死亡はなかった。
Figure 2008545615
まとめると、Ｈ４６０−２２−１は、ＳＣＩＤマウスでの乳癌の確立した異種移植腫瘍モデルにおいて、腫瘍増殖を抑制するのにアイソタイプ対照抗体よりも有意に有効である。３週間の処置期間にわたって、Ｈ４６０−２２−１は対照に対して５０％未満のＴ／Ｃ腫瘍中央値を達成した。加えて、Ｈ４６０−２２−１は抑制をもたらし、それは、ＭＴＤで与えられるが化学療法薬で観察される毒性又は死亡の徴候がないシスプラチンの三分の二であった。
したがって、Ｈ４６０−２２−１による処置は、ヒト疾患の十分に認識されたモデルにおいて、対照抗体と比較して確立した腫瘍の腫瘍量を有意に減少した。
実施例１３
インビボＡ２０５８予防腫瘍の実験
図３０及び３１で示されているデータを参照して、４〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の０．７５百万のＡ２０５８ヒト黒色腫癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００μＬの容量で腹腔内投与した。次に抗体又は緩衝剤対照を、１週間に１度で７週間同じ方法により投与した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で１０週間まで、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照による処置と比較して、腫瘍増殖に減少をもたらした（図３１）。５５日目（処置の終了後５日目）では、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照の２８％であった（ｐ＝．０１１２、独立ｔ−検定）。体重で確認すると、毒性の臨床徴候はなかった（図３０）。５５日目では、また、緩衝剤対照処置群に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均体重において有意な差はなかった（ｐ＝０．３３５１、独立ｔ−検定）。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、安全であると思われ、ヒト癌の乳房、前立腺、さらに黒色腫のインビボモデルの処置において効能を示した。
実施例１４
インビボＡ２０５８確立腫瘍の実験
図３２及び３３で示されているデータを参照して、４〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の５×１０５百万のＡ２０５８ヒト黒色腫癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。腫瘍が約７５ｍｍ３に達すると、マウスを無作為に７匹の群に２分割した。試験群マウスを、ビヒクル対照緩衝剤（ＭｇＣｌ２及びＣａＣｌ２のないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水）３００μＬに稀釈した１５ｍｇ／ｋｇのＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａにより、１週間に３回、合計１０用量で処置した。対照群マウスは、同じスケジュールに従ってビヒクル対照緩衝剤のみを摂取した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で試験の間、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。生存は研究の終点ではなかった。
腫瘍増殖は、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群において有意に阻害された。この群の平均腫瘍容量は、対照群測定値の３０．８７％（ｐ＜０４４３）であった（図３２）２群で記録された平均体重に有意な差は観察されなかった（図３３）。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、安全であると思われ、確立したヒト癌の乳房、さらに黒色腫のインビボモデルの処置において効能を示した。
実施例１５
インビボＡ３７５予防腫瘍の実験
図３４及び３５を参照して、４〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の百万のＡ３７５ヒト黒色腫癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００μＬの容量で腹腔内投与した。次に抗体又は緩衝剤対照を、１週間に１度で７週間同じ方法により投与した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で１０週間まで、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤による処置と比較して、腫瘍増殖に減少をもたらした（図３４）。４１日目（処置の終了前９日目）では、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照の３７％であった（ｐ＝．０００６、独立ｔ−検定）。体重で確認すると、毒性の臨床徴候はなかった（図３５）。４１日目では、また、緩衝剤対照処置群に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均体重において有意な差はなかった（ｐ＝０．５６５６、独立ｔ−検定）。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照マウスと比較して、生存期間を延長した。緩衝剤対照マウスは、全て、ＣＣＡＣ終点によって４１日目（処置の終了の９日前）に安楽死させたが、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスは、全て、５５日目（処置の終了の５日後）で依然として生存していた。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、この場合でも安全であると思われ、ヒト癌の乳房、前立腺、さらに黒色腫のインビボモデルの処置において効能を示し、生存期間を延長した。
実施例１６
インビボＡ３７５確立腫瘍の実験
ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａは、また、確立した黒色腫のインビボモデルにおいて、単独及びダカルバジンと一緒に試験した。図３６で示されているデータを参照して、胸腺欠損ヌードマウスで維持されているＡ３７５黒色腫系から誘導した１ｍｍ３腫瘍フラグメントを、試験マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒからの胸腺欠損ヌードマウス、研究の１日目では１４〜１５週齢）の側腹部に皮下移植した。腫瘍を毎週２回モニタリングし、その容量が８０〜１２０ｍｍ３に近づいてくると毎日モニタリングした。動物を、腫瘍のサイズが６２．５〜１４４．０ｍｍ３の処置群と、腫瘍の平均サイズが１０１．０〜１０２．２ｍｍ３の群に分けた。ＡＲ７ＢＤ−３３１１Ａは、２０ｍｇ／ｋｇを１週間に３回で３週間腹腔内投与し、ダカルバジンは、９０ｍｇ／ｋｇ（このモデルにおける最大耐量の１／２）を毎日１回で５日間連続して腹腔内投与した。対照群は、０．２ｍＬ／２０ｇ体重のリン酸緩衝生理食塩水、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａビヒクルを、１週間に３回で３週間摂取した。処置は、確立した（〜１０２ｍｍ３）黒色腫を持つ１０匹のヌードマウスの群において１日目から始めた。腫瘍の大きさを、腫瘍が２，０００ｍｍ３終点容量に達するまで、毎週２回測定した。この終点に達すると、マウスを安楽死させた。この試験は８７日目に終了した。ログランクテストは、薬剤処置群とビヒクル処置群のエンドポイントまでの時間（ＴＴＥ）値の間に有意な差（ｐ＜０．０５）が存在するかを決定した。動物の体重を試験の間記録し、マウスを、あらゆる有害な薬剤関連副作用の明らかな徴候のために、頻繁に試験した。
ビヒクル処置は、ＴＴＥ中央値の１５．８日間を生じた。１匹の対照マウスは、試験期間の終了時に検出可能な腫瘍がなく、それは、１群あたり１つの不十分な腫瘍生着のバックグラウンドを示し、１匹の対照マウスが非処置関連の原因で死亡した。無視できる最大平均体重減少（＜５％）が対照群で観察された。
ダカルバジン単独療法は、対照マウスと比較して、腫瘍増殖の１２２％の遅延に相当する３５．１日間のＴＴＥ中央値を生じた。しかし、この減少は有意ではなく、この群で８７日目まで生存したマウスはいなかった。３匹のマウスが非処置関連の原因で死亡し、除外したマウスのうち２匹が完全な腫瘍反応を経験した。この群において観察された最大平均体重減少は、７日目で５．２％であった。
腫瘍増殖における有意ではない遅延及び無視できる最大平均体重減少（＜５％）が、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ単独療法で観察された。
ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ／ダカルバジン組み合わせ処置群において、腫瘍増殖の有意な（Ｐ＜０．０１）１４７％の遅延に相当する３９．１日間のＴＴＥ中央値が観察された。この組み合わせ処置は、３匹の部分的な反応及び２匹の完全な反応を生じ、８７日間生存した３匹のうち２匹は、研究の終了時まで腫瘍がない状態を保った。１匹のマウスが、非処置関連の原因で死亡した。この群において観察された最大平均体重減少は、７日目で３．１％であった。中毒性の死亡は、この研究ではいずれの群でも観察されなかった。
まとめると、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ処置単独は、このモデルにおいてＡ３７５黒色腫増殖に対して影響を与えなかったが、ダカルバジンの最大耐量半減の効能を増大して、有意な活性、生存期間の増大及び退縮反応の数の増加を生じた。重要なことには、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａを含めることは、ダカルバジンの毒性を調節しなかった。この結果は、Ｒ７ＢＤ−３３−１１Ａを、他の潜在的により毒性のある抗癌剤の効能を増強するために使用することができ、必要な薬剤投与量を低減し、同時に腫瘍反応及び毒性レベルの維持を可能にすることを示唆している。
実施例１７
インビボＢｘＰＣ−３予防腫瘍の実験
図３７及び３８を参照して、４〜８週齢の雌ＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の５百万のＢｘＰＣ−３ヒト黒色腫癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。マウスを無作為に５匹の処置群に２分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００μＬの容量で腹腔内投与した。次に抗体又は緩衝剤対照を、１週間に１度で７週間同じ方法により投与した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で１０週間まで、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照による処置と比較して、腫瘍増殖に減少をもたらした（図３７）。５５日目（処置の終了後５日目）では、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均腫瘍容量は、緩衝剤対照の２９％であった（ｐ＝．０００９、独立ｔ−検定）。体重で確認すると、毒性の臨床徴候はなかった（図３８）。５５日目では、また、緩衝剤対照処置群に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ処置群の平均体重に有意な差はなかった（ｐ＝０．５３６８、独立ｔ−検定）。加えて、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、緩衝剤対照マウスと比較して、生存期間を延長した。緩衝剤対照マウスは、全て、ＣＣＡＣ終点によって５５日目（処置の終了の５日前）に安楽死させたが、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスの８０％は、７０日目（処置の終了の２０日後）で依然として生存していた。したがって、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置は、この場合でも安全であると思われ、ヒト癌の乳房、前立腺、黒色腫、さらに膵臓のインビボモデルの処置において効能を示し、生存期間を延長した。
実施例１８
ＮＯＤ ＳＣＩＤ対ＳＣＩＤインビボ予防腫瘍の実験
図３９で示されているデータを参照して、４〜６週齢の雌ＮＯＤ ＳＣＩＤ及びＳＣＩＤマウスに、生理食塩水１００μＬ中の５百万のＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞を、頸の首筋の皮下に注入して移植した。各群のマウスを、無作為に１０匹の処置群に３分割した。移植した当日に、２０ｍｇ／ｋｇのＨ４６０−２２−１試験抗体、０．２ｍｇ／ｋｇの７ＢＤ−３３−１１Ａ試験抗体又は緩衝剤対照を、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ ＮａＣｌ及び２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４を含有する稀釈剤で保存濃縮物から稀釈した後、３００μＬの容量で腹腔内投与した。次に抗体を、１週間に１度で７週間同じ方法により投与した。
腫瘍の増殖を、カリパスによりおよそ７日目毎で１０週間まで、又は個々の動物がＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｆｏｒ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ（ＣＣＡＣ）終点に達するまで測定した。動物の体重をこの研究の間記録した。研究の終了時に、全ての動物をＣＣＡＣ指針に従って安楽死させた。
研究の全体を通して毒性の臨床徴候はなかった。１週間の間隔をおいて測定した体重は、福祉及び繁栄失敗の代用であった。それぞれの群内で体重は経時的に増加した。
図３９で示されているように、５４日目（最終処置後４日目）では、ＳＣＩＤ処置群において、７ＢＤ−３３−１１Ａ及びＨ４６０−２２−１処置マウスは、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量のそれぞれ１．９％及び３．６％の腫瘍しか発達させなかった。逆に、ＮＯＤ ＳＣＩＤ処置群において、この場合でも５４日目（最終処置後４日目）では、７ＢＤ−３３−１１Ａ処置マウスは、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量の６７％の腫瘍増殖を有した。これは、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウスにおいて緩衝剤対照と比較すると、平均腫瘍容量の減少ではあるが（ｐ＝０．０７１０、独立ｔ−検定）、ＳＣＩＤマウスにおいて観察されるものと比較すると、効能の減少でもある。Ｈ４６０−２２−１処置マウスは、ＳＣＩＤマウスと同様の効果を示し、腫瘍増殖は、緩衝剤対照処置マウスの平均腫瘍容量の１．４％であった。したがって、インビボでの７ＢＤ−３３−１１Ａ活性は、部分的にはＡＤＣＣ活性に起因していると思われ、一方、Ｈ４６０−２２−１の抗腫瘍効果は、ＡＤＣＣから独立していると思われる。
圧倒的な証拠が、７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＣＤ６３の細胞外ループ２に存在するエピトープとの連結を介して、抗癌効果を仲介することを示している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞のような発現細胞から同族抗原を免疫沈降するために、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体を使用できることが、実施例２において示されている。更に、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣにより示されるがこれらに限定されない技術を利用して、特異的に結合するＣＤ６３抗原部分を発現する細胞及び／又は組織の検出に、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体を使用できることを示すことができる。
したがって、ＦＡＣＳ、細胞ＥＬＩＳＡ又はＩＨＣアッセイを使用して、そのような細胞又は組織への７ＢＤ−３３−１１Ａの結合を免疫沈降７ＢＤ−３３−１１Ａ抗原が阻害できることを示すことができる。更に、７ＢＤ−３３−１１Ａ抗体と同様に、他の抗ＣＤ６３抗体も、他の形態のＣＤ６３抗原を免疫沈降及び単離するのに使用することができ、抗原は、また、同じ種類のアッセイを使用して、抗原を発現する細胞又は組織へのこれらの抗体の結合を阻害することに使用できる。
実施例１９
ＢＩＡｃｏｒｅ分析による７ＢＤ３３−１１Ａ、ＡＲＨ４６０−２２−１及びＡＲ１Ａ２４５．６抗原結合親和性の決定
７ＢＤ３３−１１Ａ、ＡＲＨ４６０−２２−１及びＡＲ１Ａ２４５．６の抗原結合親和性をＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定した。全ての実験は、処理緩衝剤としてハンクス緩衝生理食塩水（２０ｍＭヘペス、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ツイーン２０）により５μｌ／分の流量で実施した。抗グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）抗体を、最初に、標準的なアミンカップリング手順を使用して固定した。簡素には、Ｈ２Ｏ中に０．０５Ｍ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び０．２Ｍ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを含有する混合物３５μｌを注入し、続いて抗ＧＳＴ抗体を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中３０μｇ／ｍｌの濃度で、５０，０００〜１００，０００ＲＵを得るまで注入して、ＣＭ５センサーチップを活性化した。最後に、１．０Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５ ３５μｌを注入して、センサーチップ表面のあらゆる活性化部位をブロックした。次に２５μｌのＧＳＴ−ＥＣ２（ＣＤ６３のＣ末端ドメイン全体を有するＧＳＴの組み換え融合ポリペプチド）を５μｇ／ｍｌで注入し、続いて試験抗体２５〜５０μｌを注入した。続く注入によるセンサーチップ表面の再生は、２０ｍＭグリシンの２つの１０μｌパルスによりｐＨ２．２で達成された。試験抗体を、１２．５〜２００ｎＭの範囲の濃度で連続して注入した。対照として、それぞれの抗体濃度を、ＧＳＴ−ＥＣ２の代わりにＧＳＴを得た表面の全体にわたって注入した。
ＥＣ２ドメインへの異なる抗体の親和性を、定常状態結合レベルで測定して計算した。各センサーグラムにおいて、報告ポイントを、抗体注入の終了の２０秒前にとった（平衡状態での共鳴単位又はＲｅｑ）。各抗体濃度において、抗体がＧＳＴに対して注入されたときに得たＲｅｑを、抗体がＧＳＴ−ＥＣ２に対して注入されたときに得たＲｅｑから差し引いた。Ｒｅｑ／Ｃｏｎｃ．対Ｒｅｑプロットの勾配から計算される会合定数（ＫＡ）を表２９に示す。また表２９で示されている解離定数（ＫＤ）は、ＫＡの逆数として計算した。
Figure 2008545615
本明細書で記述されている全ての特許及び出版物は、本発明が関わる当業者のレベルを示している。全ての特許及び出版物は、それぞれ個別の出版物が明確かつ個別に参照として本明細書に組み込まれることを示すかのように、同じ程度で参照として本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の形態が例示されているが、本明細書に記載され、示されている部分の特定の形態又は配置に限定されないことを理解するべきである。本発明の範囲から逸脱することなく多様な変更を行うことができ、本発明を、明細書に示され、記載されているものに限定することが考慮されないことは、当業者には明白である。当業者は、本発明が目的を実行するために十分に適合されることを容易に理解し、記述される目的と利点、並びにそれらに固有のものを容易に得るであろう。本明細書で記載されているオリゴヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、生物学的に関連する化合物、方法、手順及び技術のいずれも、好ましい実施の現在の代表例であり、例示的であることが意図され、範囲を制限するものとして意図されてはいない。本明細書の変更及び他の使用を当業者は考えつき、それは本発明の精神の範囲内に包含され、添付の請求項の範囲によって定義される。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施例に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、本発明を実施するために記載された様式の多様な修正は、当業者には明白であり、請求項の範囲内であることが意図される。
特許又は出願ファイルには、カラーで作製した少なくとも１枚の図面が含まれる。カラー図面の本特許又は特許出願公開のコピーは、要請があり、必要な費用が支払われたら特許庁によって提供される。
７ＢＤ−３３−１１Ａでプローブした（パネルＡ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１全細胞体溶解質（レーン１）若しくは膜（レーン２及び３）、又はアイソタイプ対照（パネルＢ）のウエスタンブロットである。分子量目盛りを左側に示す。 ７ＢＤ−３３−１１ＡでプローブしたＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜のエスタンブロットである。レーン１：還元条件下で実施した膜。レーン２：非還元条件下で実施した膜。分子量目盛りを左側に示す。 ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜への７ＢＤ−３３−１１Ａの結合に対する脱グリコシルの効果である。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜を、グリコペプチダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ Ｆ、レーン１）、Ｏ−グリカナーゼ（レーン２）、シアリダーゼ（レーン３）、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｏ−グリカナーゼ及びシアリダーゼの組み合わせ（レーン４）、ＰＮＧａｓｅ Ｆ、Ｏ−グリカナーゼ、シアリダーゼ、ガラクトシダーゼ及びグルコサミニダーゼの組み合わせ（レーン５）又は緩衝剤対照（レーン６）による処置に付した。分子量目盛りを左側に示す。 ７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降したＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（パネルＡ）及びウエスタンブロット（パネルＢ）である。レーンＡ：アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質、レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質、及びレーンＴＭ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質。長方形の箱は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのレーンＢ及びウエスタンブロットのレーンＴＭからの同じ帯域を描いている。分子量目盛りを左側に示す。 Ｐｒｏｆｏｕｎｄ検索概略表である。 ＭＡＳＣＯＴ検索概略表である。 ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーンＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質；レーンＣ：抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）免疫沈降タンパク質；レーンＤ：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質及びレーンＥ：ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量目盛りを左側に示す。 ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＢ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＣ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＤ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーンＡ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１膜総タンパク質；レーンＢ：７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質；レーンＣ：抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）免疫沈降タンパク質；レーンＤ：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質及びレーンＥ：ＩｇＧ１アイソタイプ対照免疫沈降タンパク質。分子量目盛りを左側に示す。 ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）及びＩｇＧ１アイソタイプ対照（パネルＥ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１〜５は、７ＢＤ−３３−１１Ａ免疫沈降タンパク質を含み、レーン６〜１０は、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照免疫沈降タンパク質を含む。レーン１及び６：ＮａＣｌなし、レーン２及び７：１５０ｍＭのＮａＣｌ、レーン３及び８：５００ｍＭのＮａＣｌ、レーン４及び９：２０００ｍＭのＮａＣｌ及びレーン５及び１０：ＰＩＰＡ緩衝剤。 ７ＢＤ−３３−１１Ａ（パネルＡ）、抗ＣＤ６３（クローンＲＦＡＣ４、パネルＢ）、抗ＣＤ６３（クローンＨ５Ｃ６、パネルＣ）、ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（パネルＤ）及びクーマシーコロイドブルータンパク質染色（パネルＥ）でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：非誘導ベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１及びレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量目盛りを左側に示す。 ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗ＣＤ４４（クローンＨ４６０−１６−２）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）、１Ａ２４５．６、並びにＨ４６０−２２−１でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：総膜画分（レーン１）、レーン２：Ｈ４６０−１６−２で免疫沈降した物質、レーン３：７ＢＤ−３３−１１Ａで免疫沈降した物質、レーン４：Ｈ４６０−２２−１で免疫沈降した物質、レーン５：１Ａ２４５．６で免疫沈降した物質、レーン６：ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で免疫沈降した物質、及びレーン７：ＩｇＧ１アイソタイプ対照で免疫沈降した物質。分子量目盛りを左側に示す。 ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗ＣＤ４４（クローンＨ４６０−１６−２）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）、１Ａ２４５．６、並びにＨ４６０−２２−１でプローブしたタンパク質のウエスタンブロットである。レーン１：非誘導ＧＳＴベクター単独、レーン２：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ１、レーン３：非誘導ＧＳＴ−ＥＣ２、レーン４：誘導ＧＳＴベクター単独、レーン５：誘導ＧＳＴ−ＥＣ１及びレーン６：誘導ＧＳＴ−ＥＣ２。分子量目盛りを左側に示す。 幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられた７ＢＤ−３３−１１Ａ、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。 幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられた１Ａ２４５．６、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。 幾つかの癌細胞株及び非癌細胞に対して向けられたＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照及び抗ＥＧＦＲの代表的なＦＡＣＳヒストグラムである。 ヒトの正常な心臓でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、ヒトの正常な脳でＢは１Ａ２４５．６、ＣはＨ４６０−２２−１、ヒトの正常な心臓でＤは陽性対照、ヒトの正常な脳でＥは陽性対照である。倍率は２００×である。 ヒトの胃噴門でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、ＢはＨ４６０−２２−１、Ｃは１Ａ２４５．６、Ｄは陰性アイソタイプ対照である。倍率は２００×である。 ヒト乳癌腫瘍（浸潤性乳管癌）に結合している、Ａ．７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂ．１Ａ２４５．６及びＣ．Ｈ４６０−２２−１、並びにＤ．陰性アイソタイプ対照の代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。 ヒトの正常な乳房組織に結合している、Ａ．７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂ．陽性対照の代表的な顕微鏡写真である。倍率は２００×である。 ヒト乳癌組織アレイからの浸潤性乳管癌の組織切片において、７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）、アイソタイプ陰性対照（Ｂ）、抗ＣＤ６３（ＲＦＡＣ４）抗体又は抗ＣＤ６３（Ｈ５Ｃ６）抗体（Ｄ）により得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、ＲＦＡＣ４又はＨ５Ｃ６のいずれかの抗体と比較して腫瘍細胞で弱い陽性染色を示した。倍率は２００×である。 ヒト乳癌組織アレイからの浸潤性乳管癌の組織切片において、７ＢＤ−３３−１１Ａ（Ａ）又は抗Ｈｅｒ２（ｃ−ｅｒｂＢ−２）抗体（Ｂ）により得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、陰性染色を示した抗Ｈｅｒ２抗体と比較して腫瘍細胞で強い陽性染色を示した。倍率は２００×である。 ヒトの前立腺癌の組織アレイからの前立腺腺癌（Ａ）又は正常な前立腺（Ｂ）の組織切片において７ＢＤ−３３−１１Ａにより得た結合パターンを示す代表的な顕微鏡写真である。７ＢＤ−３３−１１Ａは、腺癌組織切片における腫瘍細胞で強い陽性膜染色を示した。７ＢＤ−３３−１１Ａは、正常な前立腺組織切片における腺上皮の膜と細胞質の両方で染色を示した。倍率は２００×である。 原発性悪性黒色種でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ（黒色矢印は、腫瘍細胞の陽性染色を示し、緑色の矢印は、間質の染色の不在を示す）、Ｂは陰性アイソタイプ対照である。倍率は４００×である。 腎細胞癌でＡは７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｂは１Ａ２４５．６、ＣはＨ４６０−２２−１、Ｄは陰性アイソタイプ対照である。倍率は２００×である。 予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。 予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける生存に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。 確立しＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける腫瘍増殖抑制（％Ｔ／Ｃ）に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。 確立したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌モデルにおける体重に対するＨ４６０−２２−１、アイソタイプ対照又はシスプラチンの効果である。 予防Ａ２０５８黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 予防Ａ２０５８黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。 確立したＡ２０５８黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ対緩衝剤対照の効果である。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 確立したＡ２０５８黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。 予防Ａ３７５黒色腫癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 予防Ａ３７５黒色腫癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。 確立したＡ３７５黒色腫モデルにおける、ＡＲ７ＢＤ−３３−１１Ａ及びダカルバジンの単独の及び組み合わせの効果である。ＡＲ７ＢＤ−３３１１Ａ及びリン酸緩衝生理食塩水（対照）は、２０ｍｇ／ｋｇを腹腔内に１週間に３回で３週間投与した。ダカルバジンは、９０ｍｇ／ｋｇ（このモデルにおける最大耐量の１／２）を腹腔内に毎日１回で、５日間連続して投与した。群の腫瘍増殖及び生存の中央値（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒプロット）の曲線を示す。 予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。破線は、抗体が投与された期間を示す。データポイントは平均＋／−ＳＥＭを表す。 予防ＢｘＰＣ−３膵癌モデルにおける体重に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ又は緩衝剤対照の効果である。 予防ＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌ＳＣＩＤ又はＮＯＤ／ＳＣＩＤ癌モデルにおける腫瘍増殖に対する７ＢＤ−３３−１１Ａ、Ｈ４６０−２２−１又は緩衝剤対照の効果である。

Claims (8)

  1. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１から得られるモノクローナル抗体としてヒトＣＤ６３の同じエピトープと反応する、ヒトＣＤ６３に特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
  2. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６から得られるモノクローナル抗体としてヒトＣＤ６３の同じエピトープと反応する、ヒトＣＤ６３に特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
  3. モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａから得られるモノクローナル抗体としてヒトＣＤ６３の同じエピトープと反応する、ヒトＣＤ６３に特異的に結合することができるモノクローナル抗体。
  4. ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６、及びＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａからなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープを認識する、モノクローナル抗体。
  5. ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６、及びＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａからなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープを認識する、少なくとも１つのモノクローナル抗体を提供することを含む
    ＣＤ６３抗原を発現するヒト癌の腫瘍量の低減におけるモノクローナル抗体の使用であって、
    前記エピトープの結合部位が、腫瘍量を低減することに有効である前記使用。
  6. ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６、及びＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａからなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープを認識する、少なくとも１つのモノクローナル抗体を、少なくとも１つの化学療法剤と一緒に提供することを含む
    ヒトＣＤ６３抗原を発現するヒト癌性腫瘍を治療するためのモノクローナル抗体の使用であって、
    それによって、腫瘍量が低減する前記使用。
  7. 霊長類からの組織試料を提供すること；
    ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６、及びそのクローンが受入番号ＰＴＡ−４８９０でＡＴＣＣに寄託されている、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａからなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープを認識する、少なくとも１のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを提供すること；
    前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを、前記霊長類組織試料と接触させること；及び
    前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと、前記霊長類組織試料との結合を決定すること
    を含む、霊長類組織試料においてＣＤ６３のエピトープを発現する細胞の存在を決定する結合アッセイであって、
    それによって、前記霊長類組織試料において前記細胞の存在が示される前記結合アッセイ。
  8. ヒト腫瘍からの組織試料を提供すること；
    ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２２を有するハイブリドーマ細胞株Ｈ４６０−２２−１、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８８９を有するハイブリドーマ細胞株１Ａ２４５．６、及びそのクローンが受入番号ＰＴＡ−４８９０でＡＴＣＣに寄託されている、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４８９０を有するハイブリドーマ細胞株７ＢＤ−３３−１１Ａからなる群より選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体によって認識されるものと同じエピトープを認識する、少なくとも１のモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを提供すること；
    前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントを、前記組織試料と接触させること；及び
    前記少なくとも１つのモノクローナル抗体又は抗原結合フラグメントと、前記組織試料との結合を決定すること
    を含む、ヒト腫瘍から選択される組織試料においてＣＤ６３のエピトープを発現する癌性細胞の存在を決定する結合アッセイであって、
    それによって、前記組織試料において前記細胞の存在が示される前記結合アッセイ。
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