MX2007008123A

MX2007008123A - Mediacion de la citotoxicidad de las celulas que evidencian la expresion superficial de cd63.

Info

Publication number: MX2007008123A
Application number: MX2007008123A
Authority: MX
Inventors: Susan E Hahn; Helen P Findlay; David S F Young; Luis A G Da Cruz
Original assignee: Arius Res Inc
Priority date: 2005-01-03
Filing date: 2005-12-30
Publication date: 2007-09-07
Also published as: CN101189266A; ZA200705259B; US7431923B2; CA2594143A1; IL184302A0; AU2005324259A1; WO2006072166A1; US20060204497A1; EP1841795A4; EP1841795A1; JP2008545615A; TW200637875A

Abstract

Esta invencion se refiere al diagnostico y tratamiento de padecimientos cancerosos, particularmente a la mediacion de la citotoxicidad de las celulas tumorales; y mas particularmente al uso de anticuerpos que modifican los padecimientos cancerosos (CDMAB), opcionalmente en combinacion con uno o mas agente quimioterapeuticos, como un medio para iniciar la respuesta citotoxica. La invencion ademas se refiere a ensayos de enlace que utilizan los CDMABs de la presente invencion.

Description

MEDIACIÓN DE LA CITOTQXICIDAD DE LAS CÉLULAS QUE EVIDENCIAN LA EXPRESIÓN SUPERFICIAL DE CD63 CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de padecimientos cancerosos, particularmente a la mediación de la citotoxicidad de las células tumorales; y más particularmente al uso de anticuerpos que modifican los padecimientos cancerosos (CDMAB) , opcionalmente en combinación con uno o más agentes quimioterapéuticos, como un medio para iniciar la respuesta citotóxica. La invención además se refiere a ensayos de enlace que utilizan los CD ABs de la presente invención. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El CD63 en el Cáncer: el CD63 es una proteína de membrana de Tipo III de la familia de la tetraspanina cuyos 20 miembros actuales se caracterizan por la presencia de cuatro segmentos de transmembrana. Varios grupos identificaron el CD63 de manera independiente, usando anticuerpos cultivados para preparaciones celulares de plaquetas activadas, granulocitos, y células de melanoma. La clonación de los ADNcs respectivos de sus antígenos análogos de glicoproteína llevo' al reconocimiento que los diferentes antígenos eran uno y la misma molécula. El Sexto Seminario Internacional en Tipificación de Leucocitos (1996) subsecuentemente categorizó estos anticuerpos como anticuerpos CD63. Antes del Seminario de 1996, el CD63 se conocía por nombres múltiples (antígeno de melanoma 1, antígeno asociado al melanoma ocular, antígeno ME491 asociado al melanoma, glicoproteína 3 de membrana asociada al lisosoma, granulofisina, antígeno MLAl asociado al melanoma) , los cuales algunas veces se relacionaron a anticuerpos que llevaron a su caracterización parcial e identificación. Así, el CD63 también se designó como el antígeno ME491 (MAb ME491) , antígeno neuroglandular (MAbs LS59, LS62, LS76, LS113, LS140 y LS152), Pltgp40 (MAbs H5C6, H4F8 y H5D2) , antígeno celular de estroma de médula ósea humana (MAb 12F12) , marcador osteoprogenitor específico (MAb H0P-26) , y proteína asociada a la integrina (MAb 6H1) . Otros anticuerpos que se encontraron reaccionan de manera cruzada con la CD63 humana fueron el 8-1H, 8-2A (reactividad cruzada con el ME491) , NKI/C-3 y NKI/negro-13 (Vannegoor and Rumke, 1986; Demetrick et al., 1992; Wang et al., 1992). El CD63 inicialmente se clonó a partir de una genoteca de ADNc del melanoma usando el MAb ME491, uno de un número de anticuerpos cultivados contra una preparación de células del melanoma humano. Esto mostró que la reactividad del MAb ME491 se correlacionó de manera inversa con la progresión del melanoma en un estudio de biopsias del melanoma humano. La reactividad del anticuerpo ME491 fue baja en melanocitos normales, superior en fases tempranas de progresión del melanoma (tumores de vasos sanguíneos displásticos y tumores en Fase de crecimiento radial (RGP) ) y disminuyó o incluso estuvo ausente en tumores del melanoma más avanzados como aquéllos en la Fase de crecimiento vertical (VGP) y en tumores metastásicos . El CD63 también se encontró y se caracterizo de manera parcial en plaquetas humanas usando el MAb 2.28 (cultivado contra plaquetas activadas) que detecto una glicoproteína de 53 kDa de membrana en la plaqueta dependiente de la activación. Esta molécula también se asoció a la membrana de granulos internos en plaquetas no estimuladas. En el mismo estudio el MAb 2.28 también clasifico los granulos internos en megacariocitos y células endoteliales, dónde éste se localizó junto con los anticuerpos a la enzima catepsina D, un marcador conocido de compartimientos lisosomales. Continuando con los estudios, la agrupación del anticuerpo y la clonación de la expresión, llevaron a la identificación del antígeno reconocido por este anticuerpo como el CD63, y se confirmo además su presencia en compartimientos lisosomales dónde éste se localizó junto con los marcadores de compartimiento específicos LAMP-1 y LAMP-2. La clonación de esta molécula la identificó como CD63 y permitió su inclusión en la familia de la tetraspanina .

La expresión del CD63 se detectó en muchos tejidos diferentes y tipos de células. A nivel celular se encontró asociado con la membrana de plasma y también con las estructuras vesiculares de endosomas tardíos intracelulares . La activación celular llevó, en ciertos casos, a la expresión superficial aumentada por la movilización de provisiones intracelulares de CD63. El CD63 también se encontró localizado junto, y físicamente asociado, con el MHC de clase II linfocitos B, particularmente en endosomas, en exosomas involucrados en exportar complejos de MHC de clase II a la superficie, y en vesículas secretadas. El CD63 se encontró que interactúa con otros miembros de la familia de la tetraspanina, como el CD9, CD81, CDll (cadena de integrina O¡M,L,X) CD18 (cadena de integrina ß2) , CD49c (VLA-3 o cadena de integrina 3) , CD49d (cadena de integrina a4) , CD49f (VLA-6 o cadena de integrina o¡6) y CD29 (cadena de integrina ßi) , en una variedad de tipos celulares incluyendo los linfocitos B- y T-, neutrófilos, cáncer de seno y células del melanoma. El papel del CD63 en el cáncer ha sido incierto. Aunque el CD63 se descubrió inicialmente por varios grupos independientes involucrados en casos diversos tales como la activación de las plaquetas y de granulocitos, la presentación del antígeno MHC dependiente de la clase II, la adhesión y motilidad celular dependiente de la integrina, y la progresión del tumor en ciertos tipos de cánceres, su función tiene que ser elucidada todavía totalmente. Aunque cuando la evidencia actual sustenta su papel en una variedad de eventos fisiológicos celulares, no está claro si estas funciones son independientes una de la otra o si hay un mecanismo celular común subyacente en el que el CD63 está involucrado. Varios grupos han investigado la asociación entre el CD63 y la progresión de ciertos tipos de tumores, particularmente los melanomas. Un número de otros anticuerpos monoclonales anti-CD63, además del Mab ME491, se desarrollaron para el teñido inmunohistoquímico (IHC) de muestras de cáncer obtenidas de pacientes con tumores en varias etapas de progresión. Se observó que el teñido disminuido, interpretado por los autores como el reflejo más probable de expresión disminuida del CD63, se correlacionó con la progresión avanzada y con las características metastásicas de los tumores. Un estudio más reciente, también describió una correlación significante entre los niveles de expresión disminuidos aparentes (después de la cuantificación de ARNm) de varios miembros de la familia de la proteína tetraspanina, incluyendo el CD63, y la invasividad in vi tro de varias líneas celulares derivadas del carcinoma mamario. Otro estudio identificó el CD63, por despliegue diferencial, en células de cáncer de seno cultivadas sometidas a suspensión del estrógeno. Este indicó que la expresión del CD63 se puede regular por hormonas esteroides y que la abundancia y/o la función del CD63 alterado también pueden asociarse con la progresión del tumor de seno. En contraste, trabajo con anticuerpo monoclonal anti-CD63 MAb FC-5.01 reveló que su epítope reactivo se expresó variablemente en diferentes tejidos normales. Aunque se encontró que este anticuerpo reconoce el CD63 , éste no distingue entre melanomas de etapa temprana o más avanzada, incluyendo melanomas metastásicos (diferentes al MAb ME491) lo cual sugirió que el antígeno CD63 estaba presente en éstos tumores más avanzados, pero que algunos de su epítopes pudieron haber sido enmascarados en las células de los tumores en las diferentes fases o etapas. Esto pudo haber sido debido a modificaciones post-traduccionales alteradas del núcleo del polipéptido del CD63, o a la interacción del CD63 con otras moléculas que podrían haber afectado la disponibilidad de epítopes específicos para el reconocimiento y enlace del anticuerpo. Estos resultados apoyaron la observación, descrita por Si y Hersey (1993) , acerca de que el teñido con el anti-CD63 MAb NKI-C3, no distingue entre las secciones de tejido de los melanomas a diferentes fases o etapas de progresión, tales como la primaria, la fase de crecimiento radial, la fase de crecimiento vertical, y melanomas metastásicos. Aunque en otros estudios (Adachi et al., 1998; Huang et al., 1998) el análisis de ARNm de seno, y de cánceres de pulmón de células no pequeñas, por PCR cuantitativo, reveló que para dos miembros (CD9 y CD82) de la familia de la tetraspanina hubo una correlación significante entre sus niveles de expresión y progresión del tumor y prognosis del paciente, tal correlación no se encontró para el CD63 , en que su expresión fue similar en todas las muestras. Como un resultado de esto, aparentemente contradictorio, existe la falta de datos fuertes y consistentes que demostrarían definitivamente la asociación del CD63 con el cáncer. Hasta la fecha muy pocos estudios in vivo han intentado establecer una relación entre el CD63 y una función de supresor del tumor eventual de esta molécula. En uno de estos estudios, las células ?IH-3T3 transformadas con H-ras que sobre-expresan el CD63 humano inyectadas de manera subcutánea y de manera intraperitonal en ratones atímicos, reveló un fenotipo maligno/tumorigénico disminuido, tal como se indica por el tamaño del tumor disminuido y el potencial metastático así como por el tiempo de supervivencia aumentado, cuando se comparo al comportamiento de las células que no sobre-expresan el CD63 paternal. Esto sugiere que la presencia de CD63 humano en las células transformadas puede suprimir su conducta maligna. Más recientemente, trabajo con un modelo de ratón transgénico que expresa el CD63 humano, y desarrollado para inducir la tolerancia al CD63, indicó que podría inhibirse el crecimiento del tumor de una línea celular de melanoma murino co-transfectada (H-2Kb) de CD63-HMC clase I humana, inyectada, y que incrementaría la supervivencia, luego de la inmunización con CD63 humano fusionado al virus vaccinia. Se sugirió por los autores que el efecto terapéutico fue dependiente de los linfocitos T y que los anticuerpos anti-CD63 endógenos no parecían estar involucrados en este efecto protectivo, ya que la inhibición del crecimiento de tumor sólo ocurrió cuando los animales se inyectaron con las células co-transfectadas CD63-MHC clase I y no con la línea celular únicamente transfectada con el CD63. Esta interpretación se apoyó por el hecho de que en los animales del tipo nativo, pre-inmunizados con CD63 humano purificado y que mostraron haber desarrollados anticuerpos CD63 anti-humanos, no hubo efecto protector contra el crecimiento celular tumoral. Trabajo descrito por Radford et al. (1995) usando la línea celular KM3 , que inicialmente se creía de origen humano pero que después se caracterizó como de linaje de rata, transfectada con CD63 humano, sugirió que la expresión de esta proteína disminuyó el crecimiento y el potencial metastásico de estas células, con relación a aquella observada usando las células KM3 no transfectadas parentales, cuando se inyectaron de manera intradermal en ratones atímicos, aunque no hubo diferencia significante entre las velocidades de crecimiento in vi tro de las varias líneas celulares transfectadas y no transfectadas. Estas observaciones distinguieron el efecto potencial del CD63 de aquel de otros genes supresores de tumores conocidos por afectar las velocidades de crecimiento in vi tro e in vivo de las células tumorales. Por otro lado, además del anticuerpo monoclonal anti-CD63 ME491, el cual se encontró que tiene un efecto funcional en las mismas células disminuyendo su motilidad aleatoria en un ensayo in vitro (Radford et al., 1997), no impactó sus velocidades de crecimiento in vi tro . Este estudio también describió la observación de que el CD63 puede promover la migración en respuesta a los quimioatrayentes derivados de la matriz extracelular (ECM) tales como la laminina, fibronectina, colágeno y vitronectina, y que este efecto puede mediarse por el envolvimiento funcional de las integrinas del tipo ß1# aunque los anticuerpos para las integrinas fueron incapaces de bloquear estos efectos. Sin embargo, parecía haber un efecto antagónico entre el papel de la señalización mediada por la vitronectina (un enlazando conocido para la integrina avßs) y aquel de la señalización mediada por otros componentes de la ECM tales como la fibronectina, laminina y el colágeno en las células transfectadas con el CD63. Esto sugirió que bajo condiciones específicas, en la presencia de componentes de la ECM, la expresión del CD63 pueda llevar a la migración disminuida, y que esto puede ser dependiente en un equilibrio fino entre la adhesión y la motilidad. En otro estudio, un anticuerpo monoclonal anti-CD63 (MAb 710F) reforzó la adhesión y la propagación de las células HL-60 tratadas con PMA, mientras que otro anticuerpo monoclonal anti-CD63 (MAb 2.28), promovió un efecto similar, pero sólo en una fracción mucho más pequeña de la población celular, y sólo cuando se agregó en cantidades mucho más grandes. Estos resultados mostraron que aunque se han desarrollado muchos anticuerpos para el CD63, sus efectos funcionales pueden ser bastante diferentes. Las tetraspaninas también pueden estar involucradas en la proliferación celular. Oren et al. (1990) describió efectos antiproliferativas del MAb 5A6 de murino, que reconoce el CD81 (TAPA-1) , en líneas celulares del linfoma. En otro estudio, la ligación del CD37 en linfocitos T humanos con los anticuerpos bloqueo la proliferación inducida por el CD37. Más recientemente, un estudio con un modelo animal deficiente en la expresión del CD37 (alelo nulo en CD37) reveló que los linfocitos T de este animal fueron hiperproliferativos en comparación a aquéllos de los animales de tipo salvaje en respuesta a la activación de la concanavalina y al acoplamiento del receptor celular CD3/T. Por lo tanto se propuso que un papel funcional en el crecimiento y la proliferación celular podría ser un rasgo común de la familia de la tetraspanina. Estudios recientes con células de carcionoma de hepatoblastoma y hepatocelular revelaron que el acoplamiento de estas células con anticuerpos monoclonales anti-CD81 lleva a la activación de la trayectoria cinasa Erk/MAP. Esta trayectoria de señalización ha mostrado estar involucrada con eventos de crecimiento celular y proliferación. En trabajo paralelo, líneas de células transfectadas que sobre-expresan el CD81 humano exhibieron proliferación aumentada en relación a células de control transfectadas con mock. Por consiguiente, la evidencia disponible ha apuntado en general a un papel de las tetraspaninas, y del CD63 en particular, en eventos asociados con la proliferación del crecimiento celular y con la adhesión/motilidad celular. Estos dos tipos de eventos celulares son actualmente el objetivo de intensa investigación puesto que ambos juegan un papel central en la progresión del tumor y la metástasis. Hasta ahora, ningún anticuerpo anti-CD63, u otros reactivos que específicamente tienen como objetivo las células que expresan el CD63 , se ha reportado y mostrado tener un impacto simultáneo en las características de crecimiento in vi tro e in vivo de las células tumorales, y también en el tiempo de supervivencia de modelos animales de crecimiento celular del tumor. La determinación y análisis de la secuencia del aminoácido no revelan homología entre las tetraspaninas y otras familias de proteínas, o con algunos módulos funcionales previamente caracterizados, ni ha sugerido alguna actividad enzimática previamente conocida. Como un resultado ha sido muy difícil investigar el papel de esta familia de proteínas en la modulación de las trayectorias de transducción de la señal . Sin embargo, la evidencia generada usando reactivos de tetraspanina específicos que llevan a cambios en la fisiología celular, y qué fueron íntimamente dependientes en la modulación de las trayectorias de transducción de señal, sugiere que las tetraspaninas tienen propiedades de transducción de señal. El CD63 mostró estar asociado, físicamente y funcionalmente, con un número de moléculas que están ellas mismas o con enzimas involucradas en la generación de señales mensajeras secundarias, o están asociadas físicamente y/o funcionalmente con tales enzimas. Experimentos diseñados para disecar el mecanismo que controla la interacción de neutrófilos humanos con células endoteliales, el cual es uno de los pasos iniciales de la respuesta inflamatoria, revelaron que el pre-tratamiento de neutrofilos con varios anticuerpos monoclonales anti-CD63 (AHN-16, AHN-16.1, AHN-16.2, AHN-16.3 y AHN-16-5) promovió su adhesión a capas de células endoteliales cultivadas. Además, este efecto fue fuertemente dependiente de la presencia del ion de calcio (Ca2+) , un modulador bien conocido de muchas trayectorias de señalización intracelular y el cual se restringió a un período específico de tiempo durante el cual las células se expusieron a los anticuerpos estimulantes. Después de la exposición más larga al anticuerpo, la adhesión de los neutrofilos a las células endoteliales llego a ser insensible a la adición posterior de Ca2+, implicando por lo tanto un evento dinámico y temporalmente regulado (transitorio) . Además, se encontró que el CD63 interactúa físicamente con el complejo proteínico CD11/CD18, y que los reactivos que específicamente tienen como objetivo este complejo median una señal moduladora. En este estudio se encontró que el CD63 se encuentra también físicamente asociado con, o que es parte de, un complejo que incluye la enzima de tirosina cinasa Lck y Hck. Estas enzimas son miembros de una clase de proteínas que juegan un papel central en la mediación de las señales reguladoras intracelulares luego de la activación de receptores superficiales específicos y son parte de cascadas de trayectorias de señalización que resultan en cambios fisiológicos de células específicas. Otro estudio sugirió que la co-ligación de las tetraspaninas (incluyendo el CD63) con anticuerpos monoclonales puede reforzar la fosforilación o la actividad de la enzima cinasa de adhesión focal (FAK) que se indujo por adhesión de células de cáncer de seno MDA-MB-231 a sustrato de colágeno. Esto apuntó a un complicación directa del CD63 (y de otros miembros de la familia de las tetraspaninas) en la modulación de las trayectorias de señalización de la tirosina cinasa mediadas con integrina. Otras trayectorias de señalización que pueden cruzarse funcionalmente con la presencia y ligación de CD63 superficial por el anticuerpo monoclonal anti-CD63 MAb 710F parecen ser aquellos dependientes de la modulación de la fosforilación por la enzima proteína cinasa C (PKC) , otro modulador bien conocido de las trayectorias de señalización intracelulares. En este contexto, el reforzamiento de la adhesión y de cambios morfológicos en la línea celular mieloide HL-60 por el MAb 710F dependió del pre-tratamiento de las células con acetato de miristato de forbol (PMA) aunque el envolvimiento temporal de la PKC no se demostró concluyentemente . Sin embargo, trabajo posterior por un grupo independiente demostró que la diferenciación de la HL-60 inducida por el PMA dependió de la PKC dado que la molécula Ro31-8220, un inhibidor específico de esta enzima, bloqueó el efecto del PMA.

Evidencia adicional que apoya la asociación del CD63, y otros miembros de la familia de la tetraspanina, con trayectorias de transducción de señal, surgen de trabajo que describió una asociación física, ya sea directa o como parte de un complejo supramolecular, entre moléculas del CD63 (y también del CD53) con la actividad de la tirosina fosfatasa. En este estudio, complejos inmunoprecipitados aislados con los anticuerpos anti-CD63 mostraron estar asociados con la actividad de la tirosina fosfatasa, aunque al contrario para el CD53 el cual mostró estar asociado con el CD45 de la tirosina fosfatasa, no fue posible identificar la fosfatasa asociada al CD63. Más recientemente también se encontraron que varios miembros de la familia de la tetraspanina se encuentran asociados con una fosfatidilinositol 4-cinasa de tipo II (Pl 4-K de tipo II) (Berditchevski et al., 1997). Esta interacción pareció ser muy específica dado que se identificó únicamente para el CD9, CD63, CD81, CD151 y A15/TALLA, y no se observo que ocurriera con el CD37, CD52 , CD82, o NAG-2. Además, la asociación entre los miembros de la familia de la tetraspanina y la PI-4K fue mutuamente exclusiva dado que cada complejo que contiene la cinasa PI-4 se limitó a un solo miembro de la familia de la tetraspanina. Los complejos de cinasa del CD63-PI-4, en particular, se encontraron, casi completamente, en compartimientos intracelulares en dominios similares a balsas de lípidos, diferentes de aquéllos formados con los otros miembros de la tetraspanina. Esta observación sugirió que esta fracción del CD63 , encontrada por interactuar con la cinasa PI-4, podría haber estado involucrada en eventos intracelulares específicos (Claas, C, et al., 2001) relacionados a, o dependientes de, las trayectorias de biosíntesis de la fosfoinositida, las cuales son bien conocidas por su implicación en la regulación del transito de la membrana (endocitosis y exocitosis) y de la reorganización del citoesqueleto, además de su función como moléculas mensajeras secundarias (Martin, T., 1998). La implicación directa e importante de todas las enzimas que hasta ahora se ha encontrado que están directamente asociadas con el CD63, en la regulación de las trayectorias de señalización proporciona evidencia adicional en apoyo de la asociación del CD63 con la modulación de trayectorias de transducción de señal, ya sea como una molécula reguladora o efectora corriente abajo de la actividad de la actividad de estas enzimas. La elucidación de los mecanismos que llevan a la progresión del tumor es un esfuerzo muy difícil y complejo frecuentemente marcado por observaciones aparentemente contradictorias y, como resultado, es raro que aquellas observaciones se traduzcan con éxito en terapias eficaces. En vista de que actualmente se conoce acerca de la asociación del CD63 con la progresión del tumor y la metástasis y con los mecanismos de transducción de señal, es posible que su función pueda alterarse, en las células tumorales. El desarrollo de reactivos antígeno específicos con efectos citotóxicos sobre las células tumorales que enlazan las células que expresan el (los) antígeno (s) reconocido (s) y qué solos, o asociados con otras moléculas, tienen actividad celular y fisiológica in vivo de manera que estos reactivos inhiben el crecimiento celular tumoral, la progresión y metástasis, sin efectos deletéreos significantes en las poblaciones de células normales, sería sumamente beneficioso como una herramienta terapéutica potencial y o de diagnóstico.

Anticuerpos Monoclonales como Terapia contra el Cáncer: Cada individuo que se presenta con cáncer es único y tiene un cáncer que es tan diferente de otros cánceres como aquella identidad de la persona. A pesar de esto, la mayoría de las terapias actuales tratan a todos los pacientes con el mismo tipo de cáncer, en la misma fase, de la misma manera. Al menos 30 por ciento de estos pacientes fracasarán en la primera línea de terapia, conduciendo así a otras rondas de tratamiento y a la probabilidad aumentada de fracaso del tratamiento, metástasis, y finalmente, la muerte. Una aproximación superior al tratamiento sería la personalización de la terapia para el individuo particular. La única terapia ampliamente usada la cual que se presta a la personalización es la cirugía. El tratamiento por quimioterapia y radiación no puede tolerarse por el paciente, y la cirugía por si misma, en la mayoría de los casos, es inadecuada para producir remedios. Con el advenimiento de anticuerpos monoclonales, la posibilidad de desarrollar métodos para terapia personalizada ha llegado a ser más realista dado que cada anticuerpo puede dirigirse a un solo epítope. Además, es posible producir una combinación de anticuerpos que se dirigen a la constelación de epítopes que definen singularmente un tumor particular del individuo. Habiendo reconocido que una diferencia significante entre las células cancerosas y las normales es que las células cancerosas contienen antígenos que son específicos para células transformadas, la comunidad científica ha sostenido mucho tiempo que los anticuerpos monoclonales se pueden diseñar para tener como objetivo específicamente las células transformadas enlazando específicamente a éstos antígenos cancerosos; de esta manera dando realce a la creencia de que los anticuerpos monoclonales pueden servir como "Balas Mágicas" para eliminar las células cancerosas. Sin embargo, se reconoce ahora ampliamente que ningún anticuerpo monoclonal puede servir en todos los casos de cáncer, y que los anticuerpos monoclonales pueden desplegarse, como una clase, como tratamiento contra el cáncer objetivo. Anticuerpos monoclonales aislados de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención divulgada han mostrado modificar el proceso del padecimiento canceroso de una manera que es beneficiosa para el paciente, por ejemplo reduciendo la carga del tumor, y se referirán aquí de manera variada como anticuerpos que modifican el padecimiento canceroso (CDMAB) o anticuerpos "anti-cáncer" . En la actualidad, el paciente con cáncer normalmente tiene pocas opciones de tratamiento. La aproximación regimentada para la terapia contra el cáncer ha producido mejoras en la supervivencia global y las velocidades de morbosidad. Sin embargo, para el individuo particular, estas estadísticas mejoradas no necesariamente se correlacionan con una mejora en su situación personal. Así, si se estableciera una metodología qué posibilitará al practicante a tratar cada tumor de manera independiente del paciente en la misma cohorte, esto permitiría el único acercamiento de entallar la terapia a sólo aquella persona. Si un curso de terapia tal pudiera aumentar la proporción de curas, y producir buenos resultados, satisfaría una necesidad largamente percibida.

Históricamente, el uso de anticuerpos policlonales se ha usado con el éxito limitado en el tratamiento de cánceres humanos. Los linfomas y leucemias se han tratado con plasma humano, pero ha habido pocas remisiones o respuestas prolongadas. Además hubo una falta de reproducibilidad y no hubo beneficio adicional en comparación a la quimioterapia. Los tumores sólidos tales como los cánceres de seno, melanomas y los carcinomas de células renales se han tratado también con sangre humana, suero de chimpancé, plasma humano y suero de caballo con resultados correspondientemente imprevisibles e ineficaces . Ha habido muchos ensayos clínicos de anticuerpos monoclonales para los tumores sólidos. En los años ochenta hubo al menos 4 ensayos clínicos para cáncer de seno humano que produjeron sólo 1 respondedor de al menos 47 pacientes usando anticuerpos contra antígenos específicos o en base en la selectividad del tejido. No fue hasta 1998 que hubo un ensayo clínico exitoso usando un anticuerpo anti-Her2/neu humanizado (Herceptina) en combinación con Cisplatina. En este ensayo se evaluaron 37 pacientes para las respuestas de los cuales aproximadamente un cuarto tuvieron una proporción de respuesta parcial y un cuarto adicional tuvieron progresión del padecimiento menor o estable. El tiempo medio para la progresión entre los respondedores fue de 8.4 meses con duración de respuesta media de 5.3 meses. La Herceptina se aprobó en 1998 para primer uso de línea en combinación con Taxol®. Los resultados del estudio clínico mostraron un aumento en el tiempo medio para la progresión del padecimiento para aquéllos que recibieron la terapia con el anticuerpo más el Taxol® (6.9 meses) en comparación al grupo que recibió únicamente Taxol® (3.0 meses) . También hubo un aumento ligero en la supervivencia media; 22 contra 18 meses para el tratamiento con Herceptina más una etapa de tratamiento con el Taxol® contra el tratamiento solo con la etapa de Taxol®. Además hubo un aumento, en el número de ambos respondedores totales (8 contra 2 por ciento) y parciales (34 contra 15 por ciento) en el grupo de combinación anticuerpo más Taxol® en comparación con Taxol® solo. Sin embargo, el tratamiento con Herceptina y Taxol® lleva a una incidencia mayor de cardiotoxicidad en comparación con el tratamiento de Taxol® solo (13 contra 1 por ciento respectivamente) . También, la terapia con el Herceptina fue eficaz únicamente para los pacientes quienes sobre expresan (como se determina a través del análisis de inmunohistoquímica (IHC) ) el receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Her2/neu) , un receptor, qué actualmente no tiene ninguna función conocida o enlazando biológicamente importante; aproximadamente 25 por ciento de pacientes quienes tienen cáncer seno metastásico. Por lo tanto, todavía hay una grande necesidad no satisfecha para pacientes con cáncer de seno. Aún aquéllos que pueden beneficiarse del tratamiento con Herceptina aún requerirán de quimioterapia y por consiguiente todavía tendrán que tratar con, al menos hasta cierto punto, los efectos laterales de este tipo de tratamiento. Los ensayos clínicos que investigan el cáncer colorectal involucran anticuerpos contra ambos objetivos de glicoproteína y de glicolípidos . Los anticuerpos como el 17-1A los cuales tienen alguna especificidad para los adenocarcinomas han experimentado ensayos clínicos en la Fase 2 en más de 60 pacientes con sólo 1 paciente teniendo una respuesta parcial . En otros ensayos, el uso del 17 -1A produjo sólo 1 respuesta completa y 2 respuestas menores entre 52 pacientes en protocolos que usan ciclofosfamida adicional. Hasta la fecha, los ensayos clínicos en Fase III del 17-1A no han demostrado eficacia mejorada como terapia adyuvante para el cáncer del colon en la Fase III. El uso de un anticuerpo monoclonal de murino humanizado, inicialmente aprobado para la formación de imagen tampoco produjo la regresión del tumor. Recientemente solo ha habido algunos resultados positivos de estudios clínicos de cáncer colorectal con el uso de anticuerpos monoclonales. En el 2004, se aprobó el ERBITUX para el segundo tratamiento de línea de pacientes con cáncer colorectal metastásico que expresa EGFR que son inmunes a la quimioterapia a base de irinotecan. Los resultados de ambos, un estudio clínico de fase II de dos etapas y un estudio de una etapa mostraron que el ERBITUX en combinación con el irinotecan tienen una velocidad de respuesta de 23 y 15 por ciento respectivamente con un tiempo mediano a la progresión del padecimiento de 4.1 y 6.5 meses respectivamente. Los resultados del mismo estudio clínico en la fase II de dos etapas y de otro estudio solo una etapa mostraron que el tratamiento con ERBITUX resultó solo en una velocidad de de 11 y 9 por ciento respectivamente con un tiempo a la progresión del padecimiento de 1.5 y 4.2 meses respectivamente. Consecuentemente tanto en Suiza como en los Estados Unidos se ha aprobado, el tratamiento con ERBITUX en combinación con el irinotecan, y en los Estados Unidos, el tratamiento solo con ERBITUX, se ha aprobado como un segundo tratamiento de línea de pacientes con cáncer de colon quienes han fracasado con la terapia con irinotecan de primera línea. Por consiguiente, igual que con la Herceptina, el tratamiento en Suiza únicamente se ha aprobado solo como una combinación de anticuerpo monoclonal y quimioterapia. Además, el tratamiento en Suiza y los Estados Unidos únicamente se ha aprobado para pacientes como una terapia de segunda línea.

También en el 2004, se aprobó el Avastin para usarse en combinación con la quimioterapia a base de 5-fluorouracilo intravenoso como un tratamiento de primera línea de cáncer colorectal metastásico. Los resultados del estudio clínico en Fase III demostraron una prolongación en la supervivencia media de pacientes tratados con Avastin más 5-fluorouracilo en comparación a pacientes tratados con 5-fluourouracilo solo (20 meses contra 16 meses respectivamente) . Sin embargo, de nuevo como para el Herceptin y el ERBITUX, el tratamiento únicamente se aprobó como una combinación del anticuerpo monoclonal y la quimioterapia . También continúan habiendo resultados pobres para el cáncer de pulmón, cerebro, ovarios, pancreático, de próstata, y de estómago. Resultados recientes más prometedores para el cáncer pulmonar de células no pequeñas viene de ensayo clínico en Fase III dónde el tratamiento involucró un anticuerpo monoclonal (SGN-15; dox-BR96, anti-Sialyl-LeX) conjugado al fármaco que mata las células, doxorubicin en combinación con el agente quimioterapéutico Taxótero. El Taxótero es la única quimioterapia aprobada por la FDA para el tratamiento de segunda línea de cáncer pulmonar. Los datos iniciales indican una supervivencia global mejorada comparada a la del Taxótero solo. Fuera de los 62 pacientes quienes se reclutaron para el estudio, dos tercios recibieron SGN-15 en combinación con el Taxótero mientras que el resto, un tercio recibió solo Taxótero. Para los pacientes que recibieron el SGN-15 en combinación con el Taxótero, la supervivencia global media fue de 7.3 meses en comparación con 5.9 meses para los pacientes que recibieron solo Taxótero. La supervivencia global a 1 año y 18 meses fue de 29 y 18 por ciento respectivamente para los pacientes que recibieron el SNG-15 más el Taxótero comparada a 24 y 8 por ciento respectivamente para los pacientes que recibieron solo el Taxótero. Están planeados más ensayos clínicos. De manera preclínica, ha habido algún éxito limitado en el uso de anticuerpos monoclonales para el melanoma. Muy pocos de estos anticuerpos han alcanzado ensayos clínicos y hasta la fecha ninguno se ha aprobado o ha mostrado resultados favorables en ensayos clínicos en la Fase III. El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar el padecimiento se obstaculiza por la falta de identificación de objetivos pertinentes, entre los productos de 30,000 genes conocidos, que inequívocamente contribuyen a la patogénesis del padecimiento. En investigación de la oncología, los objetivos de fármacos potenciales se seleccionan frecuentemente simplemente debido al hecho de que ellos se sobre-expresan en células tumorales. Los objetivos así identificados se seleccionan entonces por la interacción con una multitud de compuestos. En el caso de terapias con anticuerpos potenciales, éstos compuestos candidatos normalmente se derivan de métodos tradicionales de generación del anticuerpo monoclonal de acuerdo a los principios fundamentales establecidos por Kohler y Milstein (1975, Nature, 256, 495-497, Kohler and Milstein) . Las células del bazo se coleccionan de ratones inmunizados con el antígeno (por ejemplo células enteras, fragmentos de células, antígeno purificado) y se fusionan con los compañeros del hibridoma inmortalizados. Los hibridomas resultantes se escudriñan y seleccionan para la secreción de anticuerpos los cuales enlazan de manera más ávida al objetivo. Se han producido muchos anticuerpos terapéuticas y de diagnóstico dirigidos contra las células cancerígenas, incluyendo el HERCEPTIN y el RITUXIMAB, usando estos métodos y se han seleccionado en base a su afinidad. Las fallas en esta estrategia son dos. Primeramente, la elección de objetivos apropiados para el enlace del anticuerpo terapéutico o de diagnóstico se limita por la escasez de conocimiento alrededor de los procesos carcinogénicos específicos del tejido y de los métodos simplistas resultantes, tal como la selección por sobre-expresión, mediante la cual se identifican estos objetivos. En segundo lugar, la suposición de que la molécula del fármaco que enlaza al receptor con la mayor afinidad normalmente tiene la mayor probabilidad para comenzar o inhibir un señal, puede no siempre ser el caso. A pesar de algún progreso con el tratamiento de cáncer de seno y de colon, la identificación y desarrollo de terapias con anticuerpos eficaces, ya sea como agentes solos o como co-tratamientos, ha sido inadecuado para todos los tipos de cáncer. Patentes anteriores : La US05296348 enseña métodos para seleccionar anticuerpos monoclonales específicos para antígenos superficiales de células cancerígenas que se internalizan, y para identificar anticuerpos monoclonales que tienen efectos anti-transcripcionales y/o anti-replicacionales en el metabolismo celular. A manera de ejemplo el anticuerpo ME491 mostró internalizarse en células de melanoma W9, WM35, WM983 melanoma células, y células de carcinoma colorectal SW948. Además el anticuerpo ME491 mostró disminuir la transcripción y la proliferación celular en las células SW948. La solicitud de patente US20030211498A1 (y sus solicitudes relacionadas: WO0175177A3, WO0175177A2, AU0153140A5) indican un método de inhibición del crecimiento o metástasis de un tumor ovárico con un anticuerpo que enlaza un polipéptido marcador del tumor ovárico codificado por un gen marcador de tumor ovárico seleccionado de entre un grupo que incluye el antígeno del CD63. Análisis de la serie de expresión del gen usando cáncer ovárico se llevó a cabo para identificar genes marcadores de tumores ováricos que llevan a la identificación del CD63 como un candidato. La solicitud de patente WO02055551A1 (y su solicitud relacionada CN1364803A) indica un nuevo antígeno 56.87 del CD63 de polipéptido humano. La solicitud de patente CN1326962A indica un nuevo antígeno 14.63 del CD63 de polipéptido humano. La solicitud de patente CN1326951A indica un nuevo antígeno 15.07 del CD63 de polipéptido humano. La solicitud de patente CN1351054A indica un nuevo antígeno 11.11 del CD63 de polipéptido humano. Estas patentes y las solicitudes de patentes identifican los antígenos del CD63 y los anticuerpos pero no divulgan el anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención, o la utilidad del anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención. Se clonó el gen que codifica el antígeno del polipéptido ME491 y la secuencia se recibió para la publicación el 24 de Febrero de 1988 (Can Res 48:2955, 1988, 1 de junio); se clono el gen que codifica el CD63 y la secuencia se publicó en Febrero de 1991 (JBC 266 (5) : 3239-3245 , 1991) y la publicación indicó claramente la identidad del ME491 con el CD63. La WO2004041170.89 (Secuencia ID No.: 89, fecha de presentación de prioridad: 29-JUN- 2004) , WO2003068268-A2 (Secuencia ID) No.: 1, fecha de presentación de prioridad: 13- FEB-2003 (2003WO-EP001461) ; otra fecha de prioridad: 14-FEB-2002 (2002GB-00003480) ) , WO2003057160-A29 (Secuencia ID No.: 40, fecha de presentación de prioridad: 30-DIC-2002 (2002WO-US041798) ; otra fecha de prioridad: 02-ENE-2002 (2002US-0345444P) ) todas indican polipéptidos que tienen 100% de homología de Secuencia al CD63. La WO2003016475-A2 (Secuencia ID No.: 9787&12101, fecha de presentación de prioridad: 14-AGO-2002 (2002WO-US025765) ; otra fecha de prioridad: 14-AGO-2001 (2001US - 0312147P) indican polipéptidos que tienen 100% de homología de Secuencia con 237 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63.

La WO2003070902-A2 (Secuencia ID No. :27, fecha de presentación de prioridad: 18-FEB-2003 (2003WO-US004902) ; otra fecha de prioridad: 20-FEB-2002 (2002US-0358279P) ) indica polipéptidos que tienen 94% de homología de Secuencia con 224 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La EP1033401-A2 (Secuencia ID No.: 4168&4913, fecha de presentación de prioridad: 21-FEB-2000 (2000EP-00200610) ; otra fecha de prioridad: 26-FEB-1999 (99US-0122487P) ) indica polipéptidos que tienen 100% de homología de Secuencia con 205 aminoácidos y con 94 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63, respectivamente. La WO200257303-A2 (proteína de presa Humana para Shigella ospG#26, fecha de presentación de prioridad: 11-ENE- 2002 (2002WO-EP000777) ; otra fecha de prioridad: 12-ENE-2001 (2001US-0261130P) ) indica polipéptidos que tienen una homología de Secuencia del 100% con 130 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La WO200055180-A2 (Secuencia ID No.: 756, fecha de presentación de prioridad: 08-MAR-2000 (2000WO-US005918) ; otra fecha de prioridad: 12-MAR-1999 (99US-0124270P) ) indica polipéptidos que tienen una homología de Secuencia del 99% con 127 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La WO200200677-A1 (Secuencia ID No.:3203, fecha de presentación de prioridad: 07-JUN-2001 (2001WO-US018569) ; otra fecha de prioridad: 07-JUN-2000 (2000US-0209467P) ) indica polipéptidos que tienen una homología de Secuencia de 97% con 132 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La WO9966027-A1 (Secuencia de curva extracelular Lara de la proteína del CD63 humano, fecha de presentación de prioridad: 15-JUN-1999 (99WO-US013480) ; otra fecha de prioridad: 15-JUN-1998 (98US-0089226P) ) indica polipéptidos que tiene una homología de Secuencia de 100% con 99 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La WO200270539-A2 (Secuencia ID No.: 1207, fecha de presentación de prioridad: 05-MAR-2002 (2002WO-US005095) ; otra fecha de prioridad: 05-MAR-2001 (2001US-00799451) ) indica polipéptidos que tienen una homología de Secuencia de 86% con 102 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. La EP1033401-A2 (Secuencia ID No.: 4169, 21-FEB- 2000 (2000EP-00200610) ; otra fecha de prioridad: 26-FEB-1999 (99US-0122487P) ) indica polipéptidos que tienen una homología de Secuencia de 100% con 74 aminoácidos de 238 aminoácidos que comprende el CD63. Estas solicitudes de patente identifican polipéptidos que tienen una homología de secuencia variante al antígeno CD63. En la mayoría de los casos esta solicitud también indica anticuerpos y anticuerpos derivados al polipéptido correspondiente y sus homólogos pero no divulga el anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención, o la utilidad del anticuerpo monoclonal aislado de la presente invención. De manera importante, todas las solicitudes anteriores se expidieron después de la publicación de la secuencia del polinucleótido que codifica el CD63. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Los presentes inventores se han previamente adjudicado la Patente Norteamericana 6,180,357 titulada "Anticuerpos Anti-Cáncer Específicos para Pacientes Individualizados" dirigida para seleccionar de manera individual anticuerpos anti-cáncer personalizados, los cuales son útiles en el tratamiento de un padecimiento canceroso. Para el propósito de este documento, los términos "anticuerpo" y "anticuerpo monoclonal" (mAb) pueden usarse de manera intercambiable y referirse a inmunoglobulinas intactas producidas por hibridomas (por ejemplo de murino o humano) , inmunoconjugados y, cuando es apropiado, fragmentos de inmunoglobulina y proteínas recombinantes derivadas de dichas inmunoglobulinas, tales como inmunoglobulinas quiméricas y humanizadas, fragmentos F(ab') y F(ab'), anticuerpos de una sola cadena, regiones variables de la inmunoglobulina recombinante (Fv)s, proteínas de fusión, etc. Es bien reconocido en el arte que alguna secuencia del aminoácido puede variarse en un polipéptido sin efecto significante en la estructura o función de la proteína. En la reestructuración molecular de los anticuerpos, generalmente pueden tolerarse modificaciones en la secuencia del ácido nucleico o del aminoácido de la región de la cadena principal. Éstas incluyen, pero no se limitan a, substituciones (se prefieren substituciones conservadoras) , eliminaciones o sumas. Además, está dentro del alcance de esta invención conjugar modalidades de quimioterapéuticos estándar, por ejemplo radionúclidos, con el CDMAB de la presente invención, enfocando por medio de esto el uso de dichos quimioterapéuticos. El CDMAB también puede conjugarse a las toxinas, radicales citotóxicos, enzimas, por ejemplo enzimas conjugadas con biotina, o células hematógenas, formando por medio de esto un anticuerpo conjugado. Esta solicitud utiliza el método por producir anticuerpos anti-cáncer específicos para pacientes como el divulgado en la patente '357 para aislar líneas celulares del hibridoma las cuales codifican los anticuerpos monoclonales que modifican el padecimiento canceroso. Estos anticuerpos pueden hacerse específicamente para un tumor y de esta manera pueden hacerse posible la personalización de la terapia contra el cáncer. Dentro del contexto de esta solicitud, los anticuerpos anticáncer que tienen propiedades para asesinar células (citotóxicas) o de inhibición del crecimiento celular (citostáticas) serán referidas de aquí en adelante como citotóxicos. Estos anticuerpos pueden usarse en la determinación de la etapa y diagnóstico de un cáncer, y puede usarse para tratar la metástasis del tumor. A diferencia de los anticuerpos generados de acuerdo a los paradigmas de descubrimiento de fármacos tradicionales, los anticuerpos generados de esta manera pueden tener como objetivo las moléculas y trayectorias previamente no mostradas por ser integrales al crecimiento y/o supervivencia del tejido maligno. Además, la afinidad de enlace de estos anticuerpos es conveniente para los requerimientos para la iniciación de eventos citotóxicos que pueden no ser dóciles a interacciones de afinidad más fuertes. La perspectiva del tratamiento anti-cáncer individualizado provocará un cambio en la manera en la que se maneja un paciente. Un escenario clínico probable es que se obtenga una muestra del tumor al momento de la presentación, y se almacene. A partir de esta muestra, el tumor puede tipificarse desde un panel de anticuerpos que modifican el padecimiento canceroso pre-existente. El paciente será clasificado en una etapa pero los anticuerpos disponibles pueden usarse en otra etapa del paciente. El paciente puede tratarse inmediatamente con los anticuerpos existentes y/o un panel de anticuerpos específicos al tumor pueden producirse ya sea usando los métodos bosquejados aquí o a través del uso de genotecas de despliegue de fagos junto con los métodos de selección aquí divulgados. Se agregarán todos los anticuerpos generados a la genoteca de anticuerpos anti-cáncer ya que existe la posibilidad de que otros tumores puedan sufrir alguno de los mismos epítopes como el que se esta tratando. Los anticuerpos producidos de acuerdo a este método pueden ser útiles para tratar la enfermedad cancerosa en cualquier número de pacientes que tienen cánceres que enlazan a estos anticuerpos .

Usando substancialmente el proceso de la patente Norteamericana 6,180,357, y como se divulga en patente Norteamericana 6,657,048 y en S.N. 10/348,231, S .N.10/603 , 006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia, los anticuerpos monoclonales de ratón, H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A, se obtuvieron siguiendo la inmunización de ratones con células de una biopsia de un tumor de pulmón (H460-22-1) o de seno (7BD-33-UA y 1A245.6) del paciente. El antígeno del H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A se expresó en la superficie celular de un rango amplio de líneas de células humanas de diferentes orígenes del tejido. La línea celular del cáncer de seno MDA-MB-231 (MB-231) y la línea celular de melanoma A2058 fueron susceptibles al efecto citotóxico del H460-22-1 in vi tro . La línea celular de cáncer de seno MCF-7 y la línea celular de cáncer de próstata PC-3 fueron susceptibles a los efectos citotóxicos del 1A245.6 y 7BD-33-11A in vi tro . El resultado de la citotoxicidad del H460-22-1 contra las células de cáncer de seno en cultivo se extendió más por su actividad anti-tumor hacia esta indicación de cáncer in vivo . En un modelo de cáncer de seno in vivo, las células MB-231 humanas se implantaron bajo la piel del pescuezo en la garganta de ratones inmunodeficientes, puesto que eran incapaces de rechazar las células de tumor humanas debido a una falta de ciertas células inmunes. Los modelos de tumor de xenoinjerto pre-clínicos se consideran predictores válidos de eficacia terapéutica. Los xenoinjertos en los ratones crecen como tumores sólidos que desarrollan estroma, necrosis central y neo-vasculatura. La línea celular de tumor mamario MB-231 se ha evaluado como un modelo de xenoinjerto in vivo en ratones inmuno-deficientes. El injerto bueno o la "cantidad tomada" de los tumores MB-231 y la sensibilidad de los tumores a los agentes quimioterapéuticos estándar lo ha caracterizado como un modelo conveniente. La línea celular paternal y variantes de la línea celular se han utilizado en modelos de tumor de xenoinjerto para evaluar una gama amplia de agentes terapéuticos . En el modelo preventivo in vivo de cáncer de seno humano, el H460-22-1 se dio a ratones un día antes de la implantación de células tumorales seguido por inyecciones semanales por un período de 7 semanas. El tratamiento con H460-22-1 fue significativamente (p <0.0001) más eficaz suprimiendo el crecimiento del tumor durante el período de tratamiento que un anticuerpo de control de isotipo, que fue idéntico al H460-22-1 en la estructura y tamaño pero incapaz de enlazar las células MB-231. Al final de la fase de tratamiento, a los ratones que se les dio el H460-22-1 tuvieron tumores que crecieron a sólo 17.7 por ciento del grupo de control. Durante el período seguido por el post-tratamiento, los efectos del tratamiento del H460-22-1 se sostuvieron y el volumen medio del tumor en el grupo tratado continuó siendo significativamente más pequeño que los controles hasta el fin de la fase de medición. Usando la supervivencia como una medida de eficacia del anticuerpo, el grupo de control alcanzó 50 por ciento de mortalidad entre el día 74-81 después de la implantación. En contraste, el grupo tratado con H460-22-1 no alcanzó el 50 por ciento de mortalidad en el momento de terminación del estudio. Esta diferencia fue significante entre el H460-22-1 y control de control de isotipo tratado (p <0.0015) . Estos datos demostraron que el tratamiento con H460-22-1 confirió un beneficio de supervivencia en comparación al grupo de control tratado. El tratamiento con H460-22-1 parecía seguro, puesto que no indujo signos de toxicidad, incluyendo disminución del peso del cuerpo y dolor clínico. Así, el tratamiento con el H460-22-1 fue eficaz puesto que retardo el crecimiento del tumor y aumento la supervivencia en comparación al grupo de control tratado en modelo bien establecido de cáncer de seno humano. Estos resultados también fueron reproducibles mientras que se observaron hallazgos similares en otro estudio de este tipo y sugieren su relevancia y beneficio al tratamiento de las personas con cáncer.

Además del modelo de tumor preventivo in vivo de cáncer de seno, el H460-22-1 demostró actividad anti-tumor contra las células MB-231 en un modelo de tumor establecido in vivo . En este modelo de tumor de xenoinjerto, las células de cáncer de seno MB-231 se trasplantaron hipodérmicamente en ratones inmunodeficientes de manera que el tumor alcanzó un tamaño crítico antes del tratamiento con el anticuerpo. El tratamiento con el H460-22-1 se comparó al fármaco quimioterapéutico estándar, cisplatina, y esto mostró que los grupos de tratamiento con cisplatina y H460-22-1 tuvieron volúmenes del tumor medio significativamente (p <0.001) más pequeños en comparación con el grupo tratado con el anticuerpo de control de isotipo. El tratamiento con el H460-22-1 medió la supresión del tumor que fue aproximadamente dos tercios que el de la quimioterapia con cisplatina pero sin la pérdida (p <0.003) de peso significante y el dolor clínico observado con la cisplatina. La actividad anti-tumor del H460-22-1 y su toxicidad mínima lo hacen un agente terapéutico anti-cáncer atractivo. En el período de post-tratamiento, el H460-22-1 mantuvo la supresión del tumor retardando el crecimiento del tumor en comparación al grupo con anticuerpos de control de isotipo. A 31 días del post-tratamiento, el H460-22-1 limitó el tamaño del tumor reduciendo el crecimiento del tumor por 42 por ciento en comparación al grupo de control de isotipo, el cual es comparable al 48 por ciento de reducción observado al final del tratamiento. En el modelo de tumor establecido de cáncer de seno, estos resultados indicaron el potencial del H460-22-1 para mantener la supresión del tumor después de la fase de tratamiento y demostraron la capacidad del anticuerpo para reducir la carga del tumor y reforzar la supervivencia en un mamífero . El resultado de la citotoxicidad del 1A245.6 y del 7BD-33-11A contra células de cáncer de seno y próstata en cultivo fue más prolongada por su actividad anti-tumor hacia éstas indicaciones de cáncer in vivo (como se divulga en S.N. 10/348,231, S.N. 10/891,866, S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia) . Los modelos de tumores de xenoinjerto pre-clínicos se consideran predictores válidos de eficacia terapéutica. Como se hizo referencia en S.N. 10/348,231, S.N. 10/891,866, S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia, el 7BD-33-11A y 1A245.6 previnieron el crecimiento del tumor y la carga del tumor en un modelo preventivo in vivo de cáncer de seno humano. El monitoreo continuo pasados 300 días después del tratamiento. El 7BD-33-11A nunca desarrolló tumores y el 87.5 por ciento del grupo con tratamiento de 7BD-33-11 todavía vivió durante 9 meses después de la implantación. Contrariamente, el grupo de control de isotipo tuvo mortalidad de 100 por ciento por el día 72 (23 días después del tratamiento). Los ratones tratados con el 1A245.6 alcanzaron la mortalidad de 100 por ciento por el día 151 después del tratamiento, lo cual es más de 6 veces más que el grupo con tratamiento de control de isotipo. Por consiguiente el 1A245.6, y a una magnitud mayor el 7BD-33-11A reforzaron la supervivencia y previnieron el crecimiento del tumor (retardando de esta manera la progresión del padecimiento) en un modelo de cáncer de seno. También, como se describió en S.N. 10/348,231, S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 y S.N. 10/891,866, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporados aquí como referencia, el 7BD-33-11A y el 1A245.6 suprimieron de manera significativa el crecimiento del tumor y disminuyeron la carga del tumor en un modelo establecido in vivo de cáncer de seno humano. Por el día 80 (23 días después del tratamiento) , los ratones tratados con el 7BD-33-11A tuvieron volúmenes de tumor medios menores al 83 por ciento en comparación con el grupo de control de isotipo (p=0.001). El tratamiento con 1A245.6 redujo los volúmenes de tumor medios en este día por 35 por ciento, sin embargo, la reducción no alcanzó importancia en este experimento (p=0.135). Usando la supervivencia como una medida de la eficacia del anticuerpo, se estimo que el riesgo de muerte en el grupo de tratamiento con 7BD-33-11A fue de aproximadamente 16 por ciento del grupo de control de isotipo (p=0.0006) en alrededor de 60 días después del tratamiento. El 100 por ciento del grupo de control de isotipo murió por los 50 días después del tratamiento. En la comparación, los ratones tratados con el 1A245.6 sobrevivieron hasta 100 días después del tratamiento y el 60 por ciento de los grupos de tratamiento con 7BD-33-11A vivieron aún hasta los 130 días después del tratamiento. Estos datos demostraron que ambos tratamientos con el 1A245.6 y el 7BD-33-11A confirieron un beneficio de supervivencia y una carga de tumor reducida en comparación al grupo de control tratado. El tratamiento con el 7BD-33-11A y el 1A245.6 parecieron seguros, puesto que no indujeron señales de toxicidad, incluyendo peso del cuerpo reducido y dolor clínico. Así, los tratamientos con el 7BD-33-11A y con el 1A245.6 fueron eficaces ya que ambos retardaron el crecimiento del tumor y reforzaron la supervivencia en comparación al grupo de control tratado en un modelo bien establecido de cáncer de seno humano. En un estudio esbozado en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se encuentran incorporados aquí como referencia, se determinó el efecto del 7BD-33-11A en comparación al tratamiento solo o en combinación con fármaco (Cisplatina) quimioterapéutico en dos diferentes modelos de xenoinjerto de cáncer de seno establecidos. En el modelo MB-231, en el día 83 (20 días después del tratamiento) , el tratamiento con el 7BD-33-11A resulto en una reducción del 83 por ciento en el crecimiento del tumor en relación a los animales tratados de control amortiguador (p=0.002) . El tratamiento con Cisplatina solo resulto en una reducción del 77 por ciento en el tamaño de tumor en relación al control, mientras que la Cisplatina en combinación con el 7BD-33-11A resulto en una reducción del 88 por ciento en el tamaño del tumor en relación al control (p=0.006). En el modelo MDA-MB-468 (MB-468) , en el día 62 (12 días después del tratamiento) se observó la mayor reducción en el crecimiento del tumor (97 por ciento, p=0.001) con el tratamiento con Cisplatina en combinación con el 7BD-33-11A. El tratamiento con Cisplatina solo produjo una disminución del 95 por ciento en el crecimiento del tumor en comparación con el control amortiguador mientras que el tratamiento con 7BD-33-11A solo mostró una reducción del 37 por ciento (p=0.046). En ambos modelos, el MB-231 y el MB-468, el tratamiento con el 7BD-33-11A llevo un bienestar del animal mayor en comparación con el tratamiento con Cisplatina cuando se midió por el peso del cuerpo. Estos resultados indicaron que el tratamiento con el 7BD-33-11A tuvo mayor eficacia en comparación con el tratamiento con Cisplatina solo en el modelo MB-231 y se toleró mejor con menos efectos adversos, tales como la pérdida de peso, que la Cisplatina en ambos modelos de cáncer de seno. Para determinar los efectos del tratamiento con 7BD-33-HA a varias dosis, se realizó un experimento de respuesta a la dosificación en un modelo de xenoinjerto de cáncer de seno preventivo (como se bosqueja y describe en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se encuentran incorporadas aquí como referencia) . En el día 55 (5 días después del tratamiento) , el grupo de tratamiento con 0.2 mg/kg previno el crecimiento del tumor por 85 por ciento en relación al grupo tratado de control de isotipo. También en el día 55, ambos grupos de tratamiento de 2 y 20 mg/kg tenían que desarrollar los tumores todavía. Después del día 125 (75 días después del tratamiento) se obtuvieron resultados similares, dónde el grupo de tratamiento de 20 mg/kg no desarrollo aún tumores y el grupo de tratamiento de 2 mg/kg tuvo un poco de crecimiento de tumor inicial. El tratamiento con el 7BD-33-11A también demostró un beneficio de supervivencia. Todos los ratones del grupo de control de isotipo murieron por el día 104 de día (54 días después del tratamiento) mientras que el grupo de tratamiento con 7BD-33-11A de 0.2 mg/kg sobrevivió hasta el día 197 (147 días después del tratamiento) . Se observaron aún mayores beneficios de supervivencia con los grupos de tratamiento con 7BD-33-11A de 2.0 y 20 mg/kg; sólo 50 por ciento del grupo de tratamiento de 2.0 mg/kg murieron por el día 290 (240 días después del tratamiento) mientras que ninguno del grupo de tratamiento de 20 mg/kg murió también por el día 290. Por consiguiente, el tratamiento con 7BD-33-11A mostró una reducción del crecimiento de tumor significante e incremento la supervivencia con las tres dosis exhibiendo el mayor grado de eficacia la dosis más alta. Además de los efectos benéficos en el modelo de tumor establecido in vivo de cáncer de seno, el tratamiento con 7BD-33-11A y 1A245.6 tuvo también actividad anti-tumor contra las células PC-3 en un modelo de cáncer de próstata preventivo in vivo (bosquejado en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia) . El tratamiento con 7BD-33-11A y 1A245.6 fueron significativamente (p=0.001 y 0.017 respectivamente) más eficaces suprimiendo el crecimiento del tumor poco después del período de tratamiento que un anticuerpo de control de isotipo. Al final de la fase de tratamiento, a los ratones que se les dieron el 7BD-33-11A o el 1A245.6 tuvieron tumores que crecieron a sólo 31 y 50 por ciento del grupo de control de isotipo respectivamente. Para los modelos de xenoinjerto de PC-3 SCID, el peso del cuerpo puede usarse como un indicador substituto de la progresión del padecimiento. En el día 52, el tratamiento con 7BD-33-11A y 1A245.6 previnieron significativamente (p=0.002 y 0.004 respectivamente) la pérdida de peso del cuerpo por 54 y 25 por ciento respectivamente en comparación con el control de isotipo. Se supervisaron los ratones para su supervivencia después del tratamiento. A los 11 días después del tratamiento, el isotipo y los ratones de control amortiguador alcanzaron el 100 por ciento de mortalidad. Contrariamente, el 7BD-33-11A y el 1A245.6 alcanzaron el 100 por ciento de mortalidad en el día 38 después del tratamiento, 3 veces más que los grupos de control. Así, el tratamiento con 7BD-33-11A y 1A245.6 fueron eficaces puesto que ambos retardaron el crecimiento del tumor, previnieron la pérdida de peso del cuerpo y prolongaron la supervivencia en comparación al grupo tratado de control de isotipo en un modelo bien establecido de cáncer de próstata humano. Además del modelo de tumor preventivo in vivo de cáncer de la próstata, el 7BD-33-11A demostró actividad anti-tumor contra las células PC-3 en un modelo de tumor establecido in vivo (bosquejado en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia) . El tratamiento con el 7BD-33-11A nuevamente se comparó al control de isotipo. Se mostró que el grupo de tratamiento con 7BD-33-11A tuvo volúmenes de tumor medios significativamente (p <0.024) más pequeños en comparación con el grupo tratado de control de isotipo inmediatamente después del tratamiento. El tratamiento con 7BD-33-11A medió la supresión del tumor por 36 por ciento en comparación al grupo de control de isotipo. Además de los efectos benéficos en los modelos de tumor in vivo de cáncer seno y de próstata, el tratamiento con 7BD-33-11A también tuvo actividad anti-tumor contra las células BxPC-3 en un modelo de cáncer pancreático preventivo in vivo. El tratamiento con el 7BD-33-11A fue significativamente más eficaz suprimiendo el crecimiento del tumor (71 por ciento, p=0.0009) poco después del período de tratamiento que el control amortiguador. Además, el tratamiento con el 7BD-33-11A confirió un beneficio de supervivencia en comparación al grupo de tratamiento de control amortiguador. En el grupo tratado con el 7BD-33-11A, 40 por ciento de los ratones siguieron vivos durante 2 semanas después de que todos los ratones del grupo de control amortiguador habían muerto. Además de los efectos benéficos en los modelos de tumor in vivo de cáncer de seno, próstata y pancreático, el tratamiento con el 7BD-33-11A también tuvo actividad antitumor contra las células A2058 y A375 en dos modelos de cáncer de melanoma preventivos in vivo separados. En ambos modelos, A2058 y A375, el tratamiento con el 7BD-33-11A fue significativamente más eficaz suprimiendo el crecimiento del tumor (72 por ciento, p=0.011 y 63 por ciento, p=0.0006 respectivamente) que el control amortiguador. Las actividades anti-tumor del 7BD-33-11A en el melanoma así como en modelos de cáncer de seno, próstata y pancreático lo hace un agente terapéutico anti-cáncer atractivo. Para determinar si la eficacia demostrada por el 7BD-33-11A in vivo se debe totalmente o en parte a la actividad del ADCC, se midió la actividad anti-tumor del 7BD-33-11A contra las células MB-231 en un modelo de tumor establecido en ambos, ratones con NOD SCID y con SCID. Los ratones con NOD SCID son funcionalmente deficientes en células asesinas (NK) naturales y carecen del complemento circulante y de una población de macrófagos funcionalmente inmaduros mientras que los ratones con SCID tienen ambos, el complemento y la actividad celular NK robusta. El 7BD-33-11A es un anticuerpo monoclonal IgG2a de murino y por consiguiente es capaz de actividad de ADCC in vivo . La actividad anti-tumor del 7BD-33-11A se comparó a un control amortiguador y al H460-22-1, un anticuerpo monoclonal IgGl de murino que no debe exhibir su actividad a través del ADCC basado en su isotipo. En el día 54 (4 días después del último tratamiento) , en el grupo tratado con SCID, los ratones tratados con el 7BD-33-11A y el H460-22-1 desarrollaron tumores que fueron sólo 1.9 y 3.6 por ciento respectivamente el volumen de tumor medio de los ratones de control amortiguador tratados. Contrariamente, en el grupo tratado con NOD SCID, de nuevo en el día 54 (4 días después del último tratamiento), los ratones tratados con el 7BD-33-11A tuvieron crecimiento de tumor que fue 67 por ciento del volumen de tumor medio de los ratones de control amortiguador tratados. Los ratones tratados con el H460-22-1 exhibieron un efecto similar que en los ratones de SCID; el crecimiento del tumor fue de 1.4 por ciento del volumen de tumor medio de los ratones de control amortiguador tratados. Por consiguiente, la actividad del 7BD-33-11A in vivo parece ser en parte debido a la actividad del ADCC mientras que el efecto anti-tumor del H460-22-1 parece ser independiente del ADCC. Para validar el epítope del H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-HA como un objetivo del fármaco, se determino la expresión de sus antígenos objetivos en tejidos normales humanos. Como parcialmente se discutió y bosquejo en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia, se determino el enlace del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 hacia los tejidos humanos normales. Mediante el teñido del HIC, la mayoría de los tejidos no expresaron el antígeno 7BD-33-11A, incluyendo los órganos vitales, tales como el riñon, corazón, y pulmón. El 7BD-33-11A tiñó la glándula salival, el hígado, el páncreas, el estómago, la próstata y el duodeno, y tiñó fuertemente la amígdala. Los resultados del teñido del tejido indicaron que el 7BD-33-11A mostró enlace restringido a varios tipos de células pero tuvo enlace a los macrófagos de infiltración, linfocitos, y fibroblastos. Para ambos, el H460-22-1 y el 1A245.6, se tiñó positivamente un rango más amplio de tejidos. Para la mayoría de casos, el teñido se restringió al epitelio o a los macrófagos de infiltración, linfocitos, y fibroblastos. Sin embargo, se observo teñido positivo en ambos, el músculo cardíaco y los hepatocitos. El 7BD-33-11A, el H460-22-1 y el 1A245.6 desplegaron ambos, patrones de teñido de membrana y citoplásmicos. Como se discutió y bosquejó en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, se comparó el 7BD-33-11A con anticuerpos anti-CD63 comercialmente disponibles (RFAC4 y H5C6) . Los resultados del teñido de tejido humano normal indicaron que el 7BD-33-11A nuevamente mostró un enlace restringido a varios tipos de células pero tuvo enlace a los macrófagos de infiltración, linfocitos, y fibroblastos. Los anticuerpos RFAC4 y H5C6 mostraron un patrón de teñido similar en comparación de uno con otro. Sin embargo, el patrón de teñido de ambos, RFAC4 y H5C6 fue bastante diferente al observado con el 7BD-33-11A. Específicamente, ambos anticuerpos RFAC4 y H5C6 enlazan a un rango más amplio de tejidos normales, normalmente tuvieron una intensidad de teñido mayor en tejidos dónde el 7BD-33-11A también fue positivo y no sólo enlazaron a los macrófagos de infiltración, linfocitos y fibroblastos sino también al epitelio en una mayoría de los tejidos. La localización del antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A y la determinación de su predominio dentro de la población, tal como entre pacientes con cáncer de seno, es importante en la evaluación del uso terapéutico de estos anticuerpos y la designación efectiva de los ensayos clínicos. Para localizar la expresión del antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A en los tumores de seno de pacientes con cáncer, se seleccionaron muestras del tejido del tumor de 98 pacientes con cáncer de seno individuales para la expresión del antígeno 7BD-33-1A (los resultados de 50 pacientes se han descrito previamente en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia) y se seleccionaron muestras de tejido del tumor de 50 pacientes para el antígeno 1A245.6 (discutido en S.N. 10/603,006, los contenidos de la cual se incorporan como referencia) y el H460-22-1. Los resultados de estos estudios mostraron que 37 por ciento de las muestras de tejido tiñeron positivamente para el antígeno 7BD-33-11A. La expresión del 7BD-33-11A dentro de las muestras de pacientes pareció específica para las células cancerígenas mientras que el teñido se restringió a las células malignas. Además, el 7BD-33-11A tiñó 0 de 20 muestras de tejido normal de pacientes con cáncer de seno. Por otro lado, el H460-22-1 y el 1A245.6 tiñeron 92 por ciento y 98 por ciento de muestras de tejido de cáncer de seno respectivamente. El H460-22-1 y el 1A245.6 también tiñeron 9 de 10 muestras de tejido normal de pacientes con cáncer de seno. Sin embargo, este teñido fue generalmente mucho más débil que aquel observado con las muestras de tejido de cáncer de seno y generalmente se restringió a los fibroblastos de infiltración. La expresión del tumor de seno del antígeno 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 pareció localizarse hacia la membrana celular y el citoplasma de las células malignas, haciendo al CD63 un objetivo atractivo para la terapia. Como se discutió y bosquejó en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, se comparó el 7BD-33-11A al RFAC4 y al H5C6 y a un anticuerpo anti-Her2 (c-erbB-2) . Los resultados del estudio actual fueron similares a los resultados anteriores y mostraron que el 36 por ciento de las muestras de tejido de tumor se tiñeron positivos para el antígeno 7BD-33-11A mientras que el 94 y 85 por ciento de tejidos de tumor de seno fueron positivos para los epítopes H5C6 y RFAC4 respectivamente. La expresión del 7BD-33-11A dentro de muestras de los pacientes pareció específica para las células cancerígenas mientras que el teñido se restringió a las células malignas. Además, el 7BD-33-11A tino 0 de 10 muestras de tejido normal de los pacientes con cáncer de seno mientras que ambos, el H5C6 y el RFAC4 tiñeron 7 de 8 muestras de tejido de seno normal. En comparación con el c-erbB-2, el 7BD-33-11A mostró un perfil de teñido completamente diferente dónde la mitad de las muestras de tejido de tumor de seno que fueron positivas para el antígeno 7BD-33-11A fueron negativas para la expresión del Her2 que indica que el 7BD-33-11A tiene como objetivos una población de pacientes que no se sirve a través de terapias de anticuerpos existentes. También hubo diferencias en la intensidad del teñido entre las secciones de tejido de tumor de seno que fueron positivas para ambos, el 7BD-33-11A y el Her2. El anticuerpo c-erbB-2 también tino de manera positiva una de las secciones de tejido de seno normales. Como parcialmente se discutió en S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia, se evaluaron las expresiones del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 con base en la expresión del tumor de seno de los receptores para las hormonas estrógeno y progesterona, las cuales juegan un papel importante en el desarrollo, tratamiento, y prognosis de los tumores de seno. Ninguna correlación fue aparente entre la expresión del antígeno 1A245.6 y la expresión de los receptores para estrógeno o progesterona. Hubo una correlación ligera entre la ausencia de receptores de estrógeno y la presencia de receptores de progesterona y la expresión del antígeno 7BD33-11A y la presencia de ambos receptores de estrógeno y progesterona y la expresión del antígeno H460-22-1. Cuando se analizaron los tumores con base en su etapa, o grado al cual avanzo el cáncer, los resultados sugirieron una tendencia hacia la expresión positiva mayor con la etapa del tumor más alta para ambos, el 7BD-33-11A y el H460-22-1. Se obtuvieron resultados similares con el RFAC4. El H5C6 también mostró una correlación muy ligera con la expresión del receptor de estrógeno o progesterona pero no hubo ninguna correlación aparente con la etapa del tumor, sin embargo, las conclusiones se limitaron por el tamaño de la muestra pequeño.

La localización del antígeno 7BD-33-11A y su predominio dentro de pacientes con cáncer de próstata es importante en la evaluación de los beneficios de la inmunoterapia con el 7BD-33-11A para los pacientes con cáncer de próstata y la designación de los ensayos clínicos efectivos. Para ubicar la expresión del antígeno 7BD-33-11A en tumores de próstata de pacientes con cáncer, se seleccionaron muestras de tejido de tumor de 51 pacientes con cáncer de próstata individuales para la expresión del antígeno 7BD-33-11A (como se bosquejo y discutió en S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia) . Los resultados del estudio mostraron que el 88 por ciento de las muestras de tejido tiñeron positivas para el antígeno 7BD-33-11A. Aunque el 7BD-33-11A tiñó las secciones del tejido normales con la intensidad alta también, hubo un grado más alto de teñido membranoso en las muestras del tejido de tumor en comparación con las muestras normales. Hubo una muestra de tejido de rabdomiosarcoma embrional que no se tiñó para el antígeno 7BD-33-11A. En el tamaño de la muestra pequeño probado no pareció haber ninguna correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno 7BD-33-11A. La localización del antígeno 7BD-33-11A y su predominio en pacientes con cáncer de melanoma es importante en la evaluación de los beneficios de la inmunoterapia con 7BD-33-11A para los pacientes con melanoma y para el diseño de ensayos clínicos eficaces. Para dirigir la expresión del antígeno 7BD-33-11A en tumores de melanoma de pacientes con cáncer, se seleccionaron muestras de tejido de tumor de 39 pacientes con melanoma individuales para la expresión del antígeno 7BD-33-11A. Los resultados del estudio mostraron que el 90 por ciento de las muestras de tejido se tiñeron positivas para el antígeno 7BD-33-11A. En esta muestra pequeña, no pareció haber correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno 7BD-33-11A. También se determinó a un grado más el beneficio terapéutico potencial del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6, la frecuencia y la localización del antígeno en varios tejidos cancerígenos humanos (bosquejado en S.N. 10/603,006 para el 1A245.6 y 7BD33-11A y referenciado en S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporadas aquí como referencia) . Varios tipos de cáncer, además del cáncer de seno y próstata, expresaron el antígeno 7BD-33-11A. Los tipos de cáncer humanos positivos incluyeron de piel (1/2) , pulmón (3/4) , hígado (2/3) , estómago (4/5) , tiroides (2/2) , útero (4/4) y riñon (3/3) . Algunos cánceres no expresaron el antígeno; estos incluyen de ovario (0/3), testículos (0/1) , cerebro (0/2) y nodos linfáticos (0/2) . Para el H460-22-1 y el 1A245.6, como con el arreglo de tejido humano normal, se tiñeron de manera positiva una multitud de cánceres de varios tipos de tejido humano. El teñido mayor se observó en las células malignas de la piel, pulmón, hígado, útero, riñon, estómago y vejiga. Mientras que con tejido canceroso de seno, próstata y melanoma humano, la localización de 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 ocurrieron en ambas, la membrana y dentro del citoplasma de éstas células tumorales. Por consiguiente, además del enlace de los anticuerpos H460- 22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A a líneas de células cancerígenas in vi tro, existe la evidencia que el antígeno se expresa en humanos, y en tipos múltiples de cánceres. Como se bosquejó en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, para 7BD-33-11A y aquí para el 1A245.6 y H460-22-1, los datos bioquímicos también indican que el antígeno reconocido por el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A es el CD63. Esto se sustenta por los estudios que muestran que el anticuerpo monoclonal RFAC4 , reactivo contra el CD63, identifica las proteínas que enlazan al 7BD-33-11A, H460-22-1 o al 1A245.6 por inmunoprecipitación . Además, los estudios de expresión bacteriana elucidaron que el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A enlazaron al bucle extracelular 2 del CD63. El epítope del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 también se distinguieron por depender de la conformación. Estos resultados IHC y bioquímicos demostraron que el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A enlazaron al antígeno CD63. Así, la preponderancia de evidencia mostró que el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A median los efectos anti-cáncer a través de la ligación de epítope (s) conformacionales únicos presentes en CD63. Para el propósito de esta invención, dicho epítope se define como un "radical antigénico del CD63" caracterizado por su habilidad de enlazar con un anticuerpo monoclonal codificado por la línea celular del hibridoma del 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, fragmentos de enlace antigénicos de los mismos o conjugados de anticuerpos de los mismos . Totalmente, estos datos demuestran que el antígeno H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A son antígenos asociados al cáncer y que se expresan en humanos, y que son objetivos de cáncer patológicamente relevantes. Además, estos datos también demuestran que el enlace del anticuerpo del H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A a los tejidos cancerígenos humanos, y pueden usarse apropiadamente para ensayos que pueden ser de diagnóstico, predicativos de terapias, o de pronostico. Además, la localización de la membrana celular de este antígeno es indicativa de estado canceroso de la célula debido a la no frecuencia o infrecuencia relativa de la expresión del antígeno en la mayoría de las células no malignas, y esta observación permite el uso de este antígeno, su gen o derivados, sus proteínas o sus variantes para utilizarse para ensayos que pueden ser de diagnóstico, de predicción de terapia, o de pronostico. La presente invención describe el desarrollo y uso del H460-22-1, 7BD-33-11A y 1A245.6, desarrollados por el proceso descrito en la patente Norteamericana, 6,180,357 e identificada, por, su efecto, en un ensayo citotóxico, en el crecimiento de tumor establecido y no establecido en modelos animales y en la prolongación del tiempo de supervivencia en aquellos que sufren del padecimiento canceroso. Esta invención representa un adelanto en el campo del tratamiento del cáncer ya que describe, por primera vez, reactivos que enlazan específicamente a un epítope o epítopes presentes en la molécula designada, CD63, y ya que tienen también propiedades citotóxicas in vi tro contra las células tumorales malignas pero no contra las células normales, y los cuales también median directamente la inhibición del crecimiento del tumor y la prolongación de la supervivencia en modelos in vivo de cáncer humano. Esto es un adelanto en relación a cualquier otro anticuerpo anti-CD63 previamente descrito, dado que ninguno había mostrado tener propiedades similares. Ésta también proporciona un adelanto en el campo dado que demuestra claramente, y por primera vez, el envolvimiento directo del CD63 en eventos asociados con el crecimiento y desarrollo de ciertos tipos de tumores. Ésta también representa un adelanto en la terapia contra el cáncer dado que tiene el potencial para desplegar propiedades anti-cáncer similares en los pacientes humanos. Un adelanto más es que la inclusión de estos anticuerpos en una genoteca de anticuerpos anti-cáncer reforzará la posibilidad de tener como objetivos los tumores que expresan diferentes marcadores de antígenos mediante la determinación de la combinación apropiada de anticuerpos anti- cáncer diferentes, para encontrar el más eficaz en dirigirse al objetivo y la inhibición del crecimiento y desarrollo de los tumores . En total, esta invención enseña el uso del antígeno 7BD-33-11A como un objetivo para un agente terapéutico que cuando se administra puede reducir la carga del tumor de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero, y también puede llevar a una supervivencia prolongada del mamífero tratado. Esta invención también enseña el uso de los CDMABs (H460-22-1, 7BD-33-11A y 1A245.6), y sus derivados, y los fragmentos de enlace del de los mismos, para dirigir su antígeno para reducir la carga del tumor de un cáncer que expresa el antígeno en un mamífero, y para prolongar la supervivencia de un mamífero que padece de tumores que expresan este antígeno. Además, esta invención también enseña el uso de la detección del antígeno H460-22-1, 7BD-33-11A y 1A245.6 en células cancerosas que pueden ser útiles para el diagnóstico, la predicción de terapia, y prognosis de mamíferos que padecen tumores expresan este antígeno. Si un paciente es inmune o refractario al curso inicial de terapia o desarrollo de la metástasis, el proceso de generación de los anticuerpos específicos al tumor puede repetirse para el re-tratamiento. Además, los anticuerpos anti-cáncer pueden conjugarse a las células de sanguíneas rojas obtenidas de aquel paciente, o de un donador compatible, y volver a infundirse para el tratamiento de la metástasis. Ha habido pocos tratamientos eficaces para cáncer metastásico y la metástasis normalmente pronostica un resultado pobre que resulta en la muerte. Sin embargo, los cánceres metastásicos son normalmente bien vascularizados y la liberación de anticuerpos anti-cáncer por las células sanguíneas rojas puede tener el efecto de concentrar los anticuerpos en el sitio del tumor. Aún antes de la metástasis, la mayoría de las células cancerosas son dependientes del suministro de sangre del huésped para su supervivencia y los anticuerpos anti-cáncer conjugados a las células sanguíneas rojas también puede ser eficaces contra en los tumores in si tu . Alternativamente, los anticuerpos pueden conjugarse a otras células hematógenas, por ejemplo, los linfocitos, macrófagos, monocitos, las células asesinas naturales, etc. Hay cinco clases de anticuerpos y cada uno se asocia con una función que se confiere por su cadena pesada. Generalmente se piensa que la matanza de las células cancerosas por anticuerpos desnudos se media ya sea a través de la citotoxicidad mediada por la célula dependiente del anticuerpo (ADCC) o por la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Por ejemplo los anticuerpos IgM e IgG2a de murino pueden activar el complemento humano enlazando el componente C-1 del sistema complementario activa por medio de este la trayectoria clásica de la activación del complemento, la cual puede llevar a la lisis del tumor. Para los anticuerpos humanos, los anticuerpos de activación del complemento más eficaces son generalmente el IgM e IgGl . Los anticuerpos de murino del isotipo IgG2a e IgG3 son eficaces en el reclutamiento de células citotóxicas que tienen receptores Fe los cuales llevan a la matanza celular por los monocitos, macrófagos, granulocitos y ciertos linfocitos. Los anticuerpos humanos de ambos isotipos IgGl e IgG3 ADCC median la ADCC. Otro posible mecanismo de la matanza del cáncer mediada por el anticuerpo puede ser a través del uso de los anticuerpos que funcionan para catalizar la hidrólisis de varios enlaces químicos en la membrana celular y su glicoproteinas asociadas o glicolípidos, también llamados anticuerpos catalíticos. Hay dos mecanismos adicionales de la matanza de células cancerosas mediada por los anticuerpos, los cuales se aceptan más ampliamente. El primero es el uso de anticuerpos como una vacuna para inducir al cuerpo a producir una respuesta inmune contra el antígeno putativo que reside en la célula cancerosa. El segundo es el uso de anticuerpos para tener como objetivos los receptores de crecimiento e interferir con su función o para regular a aquel receptor de manera que su función se pierda de manera efectiva. La utilidad clínica de un fármaco contra el cáncer se basa en el beneficio del fármaco bajo un perfil de riesgo aceptable para el paciente. En la terapia contra el cáncer, generalmente se ha buscado más la supervivencia antes que el beneficio, sin embargo hay un número de otros beneficios bien reconocidos además de la prolongación de la vida. Estos otros beneficios dónde el tratamiento no afecta de manera adversa la supervivencia, incluyen el alivio del síntoma, la protección contra los eventos adversos, prolongación del tiempo a la recurrencia, o la supervivencia libre del padecimiento, y la prolongación del tiempo a la progresión. Éstos criterios son generalmente aceptados y las grupos reguladores tales como la Food and Drug Administration (F.D.A.) de los Estado Unidos aprueban los fármacos que producen estos beneficios (Hirschfeld et al . Critical Reviews in Oncology/Hematology 42:137-143 2002) . Además de estos criterios es bien reconocido que hay otros puntos finales que pueden pronosticar estos tipos de beneficios. En parte, el proceso de aprobación acelerado concedido por la F.D.A de los Estados Unidos reconoce que hay substitutos que probablemente vaticinaran beneficios para el paciente. A partir del fin del año (2003), se han aprobado dieciséis fármacos bajo este proceso, y de éstos, cuatro van en aprobación total, es decir, estudios continuos han demostrado beneficio para el paciente directo tal como se predijo por puntos finales substitutos. Un punto final importante para determinar los efectos de los fármacos en tumores sólidos es la valoración de la carga del tumor midiendo la respuesta al tratamiento (Therasse et al . Journal of the National Cáncer Institute 92 (3) : 205-216 2000). El criterio clínico (criterio RECIST) para tal evaluación se ha promulgado por el Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group, un grupo de expertos internacionales en el cáncer. Los fármacos con un efecto demostrado en la carga del tumor, como se muestra por las respuestas objetivas de acuerdo al criterio RECIST, en comparación con el grupo del control apropiado tienden a, finalmente, producir un beneficio al paciente directo. En las determinaciones pre-clínicas es generalmente más directo evaluar y documentar la carga del tumor. En aquellos estudios pre-clínicos pueden traducirse a los ajustes o determinaciones clínicas, los fármacos que producen supervivencia prolongada en modelos preclínicos tienen la mayor utilidad clínica anticipada. Análogo a producir respuestas positivas al tratamiento clínico, los fármacos que reducen la carga del tumor en las determinaciones pre-clínicas pueden tener también un impacto directo significante en el padecimiento. Aunque la prolongación de la supervivencia se busca más antes que el resultado clínico del tratamiento con el fármaco contra cáncer, hay otros beneficios que tienen utilidad clínica y es claro que la reducción de la carga del tumor, la cual se puede correlacionar a un retraso en la progresión del padecimiento, prolonga la supervivencia o ambos, también puede llevar a dirigir los beneficios y tener impacto clínico (Eckhardt et al . Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds; ASCO Educational Book, 39° Encuentro Anual, 2003, páginas 209-219) . De conformidad, es un objetivo de la invención utilizar un método por producir anticuerpos que modifican el padecimiento canceroso a partir de células derivadas de un individuo particular, las cuales son citotóxicas con respecto a las células cancerosas mientras que de manera simultánea son células relativamente no tóxicas o no cancerosas, para aislar líneas celulares del hibridoma y los anticuerpos monoclonales aislados correspondientes y los fragmentos de enlace del antígeno de los mismos para los cuales dichas líneas celulares del hibridoma se codifican. Es un objetivo adicional de la invención enseñar el CDMAB y el antígeno que enlaza los fragmentos del mismo. Es un objetivo más de la presente invención producir el CDMAB cuya citotoxicidad se medie a través de la ADCC.

Es todavía un objetivo más de la presente invención, producir el CDMAB cuya citotoxicidad se media a través del CDC. Es aún un objetivo más de la presente invención, producir el CDMAB cuya citotoxicidad es una función de su capacidad para catalizar la hidrólisis de los enlaces químicos celulares . Todavía un objetivo más de la presente invención es producir el CDMAB, el cual es útil en un ensayo de enlace para el diagnóstico, la prognosis, y el monitoreo del cáncer. Otros objetivos y ventajas de esta invención serán claras a partir de la siguiente descripción, en donde, a manera de ilustración y ejemplo, se establecen ciertas modalidades de esta invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS El expediente de patente o de solicitud contiene al menos un dibujo realizado a color. Las copias de esta publicación de patente o solicitud de patente o patente con dibujo (s) a color se proporcionarán por la Oficina según se requiera y se pague la cuota necesaria. Figura 1. Manchado Western del MDA-MB-231 cuyos lisados de células (Trayectoria 1) o membranas (Trayectorias 2 y 3) sondeadas con 7BD-33-11A (Panel A) o el control de isotipo (Panel B) . A la izquierda se indican los marcadores de peso molecular. Figura 2. Manchado Western de membranas de MDA-MB-231 sondeadas con el 7BD-33-11A. Trayectoria 1: La membrana corre bajo condiciones reducidas. Trayectoria 2: La membranas corren bajo condiciones no reducidas. A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 3. Efecto de la desglicosilación en el enlace del 7BD-33-11A a las membranas del MDA-MB-231. Las membranas de MDA-MB-231 se sometieron a tratamiento con glicopeptidasa F (PNGase F; Trayectoria 1) , O-glicanasa (Trayectoria 2) , sialidasa (Trayectoria 3) , la combinación de PNGase F, 0-glicanasa y sialidasa (Trayectoria 4), la combinación de PNGase F, O-glicanasa, sialidasa, galactosidasa y glucosaminidasa (Trayectoria 5) o control amortiguador (Trayectoria 6) . A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 4. PÁGINA del SDS (Panel A) y Manchado Western (Panel B) de las proteínas de membrana MDA-MB-231 inmunoprecipitadas con el 7BD-33-11A. Trayectoria A proteínas de control de isotipo inmunoprecipitadas, Trayectoria B: proteínas inmunoprecipitadas 7BD-33-11A y Trayectoria TM: Proteínas de la membrana MDA-MB-231 totales. El marco rectangular delinea la misma banda de la Trayectoria B en la SDS-PAGE y la Trayectoria TM en el manchado Western. A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 5. Tabla de resumen de búsqueda profunda. Figura 6. Tabla de resumen de búsqueda de MASCOT. Figura 7a: Manchados Western de proteínas sondeadas con el 7BD-33-11A (Panel A), anti-CD63 (clon de RFAC4 , Panel B) , control de isotipo IgG2a (Panel C) y control de isotipo IgGi (Panel D) . Trayectoria A: Proteínas de la membrana MDA-MB-231 totales; Trayectoria B: proteínas inmunoprecipitadas 7BD-33-HA; Trayectoria C: Proteínas inmunoprecipitadas anti-CD63 (RFAC4) , Trayectoria D: Proteínas de control inmunoprecipitadas de isotipo IgG2a y Trayectoria E: Proteínas de control inmunoprecipitadas de isotipo IgGi . A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 7b: Manchados Western de proteínas sondeadas con el 7BD-33-11A (Panel A), anti-CD63 (clon de H5C6, Panel B) , control de isotipo IgG2a (Panel C) y control de isotipo IgG? (Panel D) . Trayectoria A: Proteínas de membrana MDA-MB-231 totales; Trayectoria B: proteínas inmunoprecipitadas del 7BD-33-11A; Trayectoria C: Proteínas inmunoprecipitadas del anti-CD63 (H5C6) , Trayectoria D: Proteínas de control inmunoprecipitadas de isotipo IgG2a y Trayectoria E: Proteínas de control inmunoprecipitadas de isotipo IgGI . A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular.

Figura 8. Manchados Western de proteínas sondeadas con el 7BD-33-11A (Panel A), anti-CD63 (clon RFAC4 , Panel B) , anti-CD63 (clon H5C6, Panel C) , control de isotipo IgG2a (Panel D) y control de isotipo IgGi (Panel E) . Las trayectorias 1-5 contienen proteínas inmunoprecipitadas 7BD-33-11A y las Trayectorias 6-10 contienen proteínas de control inmunoprecipitadas de isotipo IgG2a. Trayectorias 1 y 6: sin NaCl , trayectorias 2 y 7: 150 mM de NaCl , trayectorias 3 y 8: 500 mM de NaCl , trayectorias 4 y 9: 2000 mM de NaCl y las trayectorias 5 y 10: amortiguador RIPA. Figura 9. Manchados Western de proteínas sondeadas con 7BD-33-11A (Panel A), anti-CD63 (clon de RFAC4 , Panel B) , anti-CD63 (clon de H5C6, C dPanel) , control de isotipo IgG2a (Panel D) y teñido de proteína Azul Coloidal de Coomassie (Panel E) . Trayectoria 1: vector solo no inducido, Trayectoria 2: GST-EC1 no inducido, Trayectoria 3: GST-EC2 no inducido, Trayectoria 4: vector solo inducido, Trayectoria 5: GST-ECl inducido y Trayectoria 6: GST-EC2 inducido. A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 10. Manchados Western de proteínas sondeadas con control de isotipo IgG? e IgG2a, anti-CD44 (clon de H460-16-2) , anti-CD63 (RFAC4) , 1A245.6 y H460- 22-1. Trayectoria 1: fracción de membrana total (Trayectoria 1), Trayectoria 2: material inmunoprecipitado con H460-16-2, Trayectoria 3: material inmunoprecipitado con el 7BD-33-11A, Trayectoria 4: material inmunoprecipitado con el H460-22-1, Trayectoria 5: material inmunoprecipitado con el 1A245. 6, Trayectoria 6: material inmunoprecipitado con el control de isotipo IgG2a y Trayectoria 7 : material inmunoprecipitado con el control de isotipo IgGi . A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 11. Manchados Western de proteínas sondeadas con el control de isotipo IgGi e IgG2a, anti-CD44 (clon de H460-16-2), anti-CD63 (RFAC4), 1A245.6 y H460-22-1. Trayectoria 1: vector GST solo no inducido, Trayectoria 2: GST-EC1 no inducido, Trayectoria 3: GST-EC2 no inducido, Trayectoria 4: vector GST solo inducido, Trayectoria 5: GST-EC1 inducido, Trayectoria 6: GST-EC2 inducido. A la izquierda se indican los marcadores del peso molecular. Figura 12. Histogramas de FACS representativos del 7BD-33-11A, los controles de isotipo y el anti-EGFR dirigidos contra varias líneas celulares cancerosas y células no cancerosas . Figura 13. Histogramas de FACS representativos del 1A245.6, los controles de isotipo y el anti-EGFR dirigidos contra varias líneas celulares cancerosas y células no cancerosas .

Figura 14. Histogramas de FACS representativos del H460-22-1, los controles de isotipo y el anti-EGFR dirigidos contra varias líneas celulares cancerosas y células no cancerosas. Figura 15. Corazón Humano normal. A. 7BD-33-11A. Cerebro Humano normal. B. 1A245.6. C. H460-22-1. Corazón Humano normal. D. Control Positivo. Cerebro Humano normal. E. Control positivo. La amplificación es de 200X. Figura 16. Cavidad del Estómago Humano normal. A. 7BD-33-11A. B. H460-22-1. C. 1A245.6. D. Control de isotipo Negativo. La amplificación es de 200X. Figura 17. Micrografía representativa de A. 7BD-33-11A, B. 1A245.6 y C. H460-22-1 que enlaza al tumor de cáncer de seno humano (infiltración del carcinoma ductal) . D. Control de Isotipo Negativo. La amplificación es 200X. Figura 18. Micrografía representativa de A. 7BD-33-11A, B. Enlace de control positivo al tejido de seno normal humano. La amplificación es 200X. Figura 19. Micrografías representativas que muestran el patrón de enlace obtenido con el 7BD-33-11A (A) , control de isotipo negativo (B) , el anticuerpo anti-CD63 (RFAC4) o el anticuerpo anti-CD63 (H5C6) (D) en las secciones del tejido del carcinoma ductal infiltrativo de una orden de tejido con cáncer de seno humano. El 7BD-33-11A exhibió teñido positivo más débil para las células del tumor en comparación con el anticuerpo RFAC4 o H5C6. La amplificación es de 200X. Figura 20. Micrografías representativas que muestran el patrón de enlace obtenido con el 7BD-33-11A (A) o el anticuerpo anti-Her2 (c-erbB-2) (B) en las secciones de los tejidos del carcinoma ductal infiltrativo de una orden de tejido con cáncer de seno humana. El 7BD-33-11A exhibió teñido positivo fuerte para las células del tumor en comparación con el anticuerpo anti-Her2, el cual exhibió teñido negativo. La amplificación es de 200X. Figura 21. Micrografías representativas que muestran el patrón de enlace obtenido con el 7BD-33-11A en las secciones del tejido de adenocarcinoma de próstata (A) o próstata normal (B) de una orden de tejido con cáncer de próstata humano. El 7BD-33-11A exhibió teñido membranoso positivo fuerte para las células del tumor en la sección del tejido del adenocarcinoma.

El 7BD-33-11A mostró ambos, teñido membranoso y citoplásmico del epitelio glandular en la sección de tejido de próstata normal. La amplificación es de 200X. Figura 22. Melanoma Maligno Primario. A. 7BD-33-11A (la flecha negra indica teñido positivo de células tumorales y la flecha verde indica una ausencia de teñido de estroma) . B.

Control de isotipo negativo. La amplificación es de 400X.

Figura 23. Carcinoma Celular renal. A. 7BD-33-11A. B. 1A245.6. C. H460-22-1. D. Control de isotipo negativo. La amplificación es de 200X. Figura 24. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o control amortiguador en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231 preventivo. Figura 25. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231 preventivo. La línea discontinua indica el período durante el cual se administro el anticuerpo. Los puntos de los datos representan la media + / -SEM. Figura 26. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o control amortiguador en la supervivencia en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231 preventivo. La línea discontinua indica el período durante el cual se administro el anticuerpo.

Figura 27. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o cisplatina en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231 establecido. La línea discontinua indica el período durante el cual se administró el anticuerpo. Los puntos de los datos representan la media + / - SEM. Figura 28. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o cisplatina en la supresión del crecimiento del tumor (% T/C) en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231 establecido. La línea discontinua indica el período durante el cual se administro el anticuerpo. Figura 29. Efecto del H460-22-1, control de isotipo o cisplatina en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer de seno de MDA-MB-231. Figura 30. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de seno de A2058 preventivo. Las líneas discontinuas indican el período durante el cual se administro el anticuerpo. Los puntos de los datos representan la media + / - SEM. Figura 31. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer de melanoma de A2058 preventivo. Figura 32. Efecto del 7BD-33-11A contra el control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de melanoma de A2058 establecido. Los puntos de los datos representan la media + / - SEM. Figura 33. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer de melanoma de A2058 establecido. Figura 34. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer de melanoma del A375 preventivo. La línea discontinua indica el período durante el cual se administro el anticuerpo. Los puntos de los datos representan la media + / - SEM. Figura 35. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer de melanoma del A375 preventivo. Figura 36. Efecto del 7BD-33-11A y dacarbacina, solos y en combinación, en un modelo de melanoma del A375 establecido. El AR7BD-3311A y solución salina amortiguada de fosfato (controles) se administraron i.p. a 20 mg/kg tres veces por semana durante tres semanas. La dacarbacina se administró i.p. a 90 mg/kg (1/2 la dosis tolerada máxima en este modelo) una vez diariamente durante cinco días consecutivos. Se muestran las curvas del crecimiento del tumor medio y la supervivencia del grupo (gráfica Kaplan-Meier) . Figura 37. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer pancreático del BxPC-3 preventivo. La línea discontinua indica el período durante el cual se administro el anticuerpo. Los puntos de los datos representan la media +/- SEM. Figura 38. Efecto del 7BD-33-11A o control amortiguador en el peso del cuerpo en un modelo de cáncer pancreático del BxPC-3 preventivo.

Figura 39. Efecto del 7BD-33-11A, H460-22-1 o control amortiguador en el crecimiento del tumor en un modelo de cáncer del SCID o NOD/SCID del MDA-MB-231 preventivo. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1 Identificación de las proteínas de unión 7BD-33-11A mediante Inmunomanchado Western Como se esbozó y discutió en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, para identificar el (los) antígeno (s) reconocido por el anticuerpo 7BD-33-11A, preparaciones de membrana celulares se sometieron a electroforesis en gel con poliacrilamida de dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), y se transfirieron a las membranas. La última se sondeo con el anticuerpo 7BD-33-11A para visualizar las proteínas detectadas por este anticuerpo. 1.0. Lisado Celular Completo y Preparación de la Fracción de Membrana Total 1.1. Preparación del Lisado Celular completo Trabajo previo por FACS demostró el enlace del anticuerpo 7BD-33-11A a la línea de células de cáncer de seno MDA-MB-231 (MB-231) . Como un resultado las preparaciones de la membrana celulares totales y los lisados celulares completos obtenidos a partir de esta línea celular se usaron para la identificación y caracterización del antígeno. El lisado celular total de las células MB-231 se preparó de la siguiente manera: pelotillas de células MB-231 (1.5 g) se resuspendieron en 2 mL de amortiguador de lisis conteniendo 20 mM de Tris, de pH de 7.4, 150 mM de NaCl , Tritón X-100 al 1% (v/v), azida de sodio al 0.02% (p/v), 2 mM de ortovanadato de sodio, 50 mM de fluoruro de sodio, y un cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics; Manheim, Alemania) . La pelotilla se homogeneizó con un homogeneizador de vidrio y se incubó con agitación, por 1 hr a 4°C. Las muestras se sometieron entonces a centrifugación (20,000g) por 15 min a 4°C, para quitar el material insoluble detergente. Los sobrenadantes se recolectaron, se dividieron en alícuotas, y se congelaron a -80°C. La concentración de la proteína en el lisado celular se determino por el ensayo (Pierce; Rockford, IL.) con el BCA (ácido bicinconínico) . 1.2. Preparación de la Fracción de Membrana Celular Total Las membranas celulares totales se prepararon a partir de cultivos confluentes de células de cáncer de seno MB-231. El medio se retiro de las pilas de células y las células se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) . Las células se disociaron con amortiguador de disociación (Gibco-BRL; Grand Island, NY) por 20 min a 37°C en un agitador de plataforma. Las células se recolectaron y centrifugaron a 900g por 10 min a 4°C. Después de la centrifugación, las pelotillas de células se enjuagaron mediante la resuspensión en PBS y se centrifugaron nuevamente a 900g por 10 min a 4°C. Las pelotillas se almacenaron entonces a -80°C hasta que se requirió. Para preparar las membranas, se deshelaron las pelotillas celulares y se resuspendieron en amortiguador de homogeneización conteniendo 1 tableta por 50 mL de cóctel inhibidor de la proteasa completo (Roche; Laval QC) a una proporción de 3 mL de amortiguador por gramo de células. La suspensión celular se sometió a homogeneización usando un homogeneizador de politron en hielo para lisar las células. El homogenado celular se centrifugó a 15,000g por 10 min a 4°C para quitar las partículas del núcleo. El sobrenadante se cultivó, se dividió en tubos y se centrifugó entonces a 75,600g por 90 min a 4°C. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y cada pelotilla de la membrana se resuspendió en aproximadamente 5 mL de amortiguador de homogeneización. Las pelotillas de la membrana de todos los tubos se combinaron, se dividieron una vez más, y se centrifugaron a 75,600g por 90 min a 4°C. El sobrenadante se retiró cuidadosamente y las pelotillas se pesaron. A las pelotillas se les agrego amortiguador de solubilización conteniendo Tritón X-100 al 1% a una proporción de 3 mL de amortiguador por gramo de pelotilla de la membrana. Las membranas se solubilizaron mediante agitación en un agitador de plataforma a 300 rpm, por 1 hr en hielo. La suspensión de la membrana se centrifugó a 75,600g a material insoluble en pelotillas. El sobrenadante, conteniendo las proteínas de la membrana solubilizada, se retiró cuidadosamente de los tubos, se ensayo para la concentración de la proteína, y se almacenó a -80°C. 2.0 1 - SDS-PAGE Dimensional e Inmunomanchado Western Se separaron las proteínas de la fracción de la membrana total y el lisado celular completo de células MB-231 por el SDS-PAGE dimensional 1 (ID SDS-PAGE) , en un apilado y separación en gel de 5 y 10 por ciento, respectivamente. Las proteínas se transfirieron durante, a 4°C, mediante electromanchado en membranas de PVDF (Millipore; Billerica, MA) . La transferencia completa se determino evaluando la transferencia de los marcadores de peso molecular preteñidos en la membrana. Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con leche descremada al 5 por ciento (p/v) en TBST, por 1 hr a la temperatura ambiente (RT) , y dos manchas de replicación se sondearon entonces de la siguiente manera: se sondeo un manchado con el anticuerpo 7BD-33-11A (5 µg/mL, en leche descremada al 5 por ciento en TBST) y el manchado de replicación se sondeo con un control de isotipo IgG2a (5 µg/mL, en leche descremada al 5 por ciento en TBST) . Los manchados se lavaron 3 veces por 10 min en TBST y se incubaron entonces con IgG (Fe) anti -ratón de cabra conjugado con HRP de rábano picante (Bio-Rad Laboratories; Hércules, CA) , para 1 hr en RT. Después de lavar 3 veces por 10 min cada uno con TBST, los manchados se desarrollaron con el kit de sustrato de peroxidasa TMB (Vector Laboratories; Burlingame, CA) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los manchados se enjuagaron con agua se adquirieron las imágenes con un sistema de documentación en gel (Figura 1 y 2) (Bio-Rad; Hércules, CA) . Las imágenes de los manchados se realizaron bajo las mismas condiciones de enfoque de la cámara, abertura y tiempo de adquisición de la imagen. En Figura 1, el 7BD-33-11A claramente enlaza a las proteínas en el rango de 20-80 kDa, y su reactividad se detecto en las trayectorias que contienen el lisado celular entero y la fracción de la membrana de total. El control de isotipo no enlazo a ninguna proteína en las fracciones del lisado MB-231 o de la membrana, indicando que el enlace para el 7BD-33-11A fue específico. La figura mostró efecto de reducción de la muestra en el enlace del 7BD-33-11A, en un manchado Western. La reactividad de este anticuerpo sólo se detecto cuando las muestras se prepararon bajo condiciones no reducidas (Trayectoria 2) . Los agentes de reducción teles como el DTT o el ß-mercaptoetanol eliminaron completamente el enlace (Trayectoria 1) , indicando que el reconocimiento y el enlace del 7BD-33-11A a su epítope en la proteína nativa depende de la presencia de enlaces de disulfuro. 0 Para determinar si la naturaleza dispersa del antígeno, como se detecto por el inmunomanchado Western, se debió a la glicosilación heterogénea, se sometieron las fracciones de la membrana totales a tratamiento con varias glicosidasas (glicopeptidasa F, o-glicanasa, sialidasa, galactosidasa y glucosaminidasa) las cuales removieron grupos de carbohidratos específicos. Después del tratamiento las muestras se sometieron a SDS-PAGE ID y a teñido Western. Se esperaba que si algunas de las enzimas removían una porción del carbohidrato que se considero para una cantidad significante de la masa del antígeno (s) reconocido por el anticuerpo 7BD-33-11A, sería posible detectar aquella diferencia mediante SDS-PAGE. La figura 3 muestra que el tratamiento con glicosidasa de las fracciones de la membrana totales de las células MB-231 resulto en una disminución significante en la masa del (los) antígeno (s) reconocido (s) . Esto indicó que el antígeno reconocido por el anticuerpo 7BD-33-11A estaba comprendido de al menos una glicoproteína. El hecho que ocurriera una cambio significativo en la movilidad del antígeno (s) sólo cuando se usaron varias enzimas juntas indica que al menos algunas de las fracciones del carbohidrato consistió de un carbohidrato N enlazado complejo. Aunque el tratamiento de la membrana con glicosidasas resulto en un cambio peso molecular, esto no redujo la intensidad del enlace. Esto sugirió que el anticuerpo enlaza principalmente a la porción del polipéptido de la glicoproteína. Ejemplo 2 Identificación del Enlace de los Antígenos por el 7BD-33-11A Los datos detallados en este ejemplo se han descrito previamente en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia. 1.0 Inmunoprecipitación de Antígenos a partir de la Fracción de la Membrana Total MB-231 Los extractos de la membrana total (5 mg de la proteína total) se diluyeron a una concentración de proteína final de 1 mg/mL con el volumen apropiado de amortiguador de lisis lx (50 mM de Tris pH 7.4, 150 mM de NaCl , Tritón X-100 al 1%, NaN3 al 0.02%, 2 mM de ortovanadato de sodio, 50 mM de fluoruro de sodio, y cóctel inhibidor de la proteasa (Roche Diagnostics, Manheim, Alemania) ) , y con el volumen apropiado de amortiguador RIPA 2x (50 M de Tris de pH de 7.4, 150 mM de NaCl, colato de sodio al 1.0%, SDS al 0.2%, Tritón X-100 al 1% y NaN3 al 0.02%) para obtener una concentración del amortiguador de RIPA lx. Los extractos se pre-clarificaron por 2 hr con cuentas de proteína G-Sefarosa (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) a 4°C. Los extractos de membrana total se removieron y se agrego el BSA del material (10 mg/mL) a una concentración de BSA final de 0.5 mg/mL. Mientras que los extractos se pre-clarificaron, las cuentas anticuerpo-proteína G-Sefarosa conjugadas (60 µg de anticuerpo reticulado químicamente a 30µl de proteína G-Sefarosa) se bloquearon con 1 mL de BSA a 0.5 mg/mL, mediante incubación a 4°C, también por 2 hr. Después del bloqueo, las cuentas-anticuerpo conjugadas se lavaron dos veces por 5 min con amortiguador de RIPA lx. Entonces se agregaron las cuentas de proteína G-Sefarosa conjugada con el anticuerpo a los extractos de membrana conteniendo el BSA, y se incubaron por 3 hr, a 4°C, en rotador extremo sobre extremo. Después de la centrifugación a 20,000g, por 10 seg, a 4°C, la fracción no enlazada se removió y desecho y las cuentas se lavaron 3 veces por 5 min, con 1 mL de amortiguador RIPA en cada paso de lavado. Entonces las cuentas se enjuagaron una vez con 1.5 mL de PBS. La inmunoprecipitación (IP) descrita anteriormente, con la proteína de G Sefarosa conjugada con el 7BD-33-11A se llevó a cabo en paralelo con un IP similar en el que las cuentas de proteína G-Sefarosa se reticularon químicamente con un control de isotipo IgG2a (BD Biosciences, San Diego, CA) . Este paso se llevó a cabo para habilitar valoración de enlace no específico de las proteínas a los inmunocomplejos . Después de drenar completamente el PBS, las cuentas se hirvieron en 40 µl de amortiguador de la muestra sin reducir y las muestras se analizaron por ID SDS-PAGE seguido por inmunomanchado Western de una porción del gel, y el teñido con Azul Coloidal de Coomassie de la porción restante del gel. De los 40 µl, se cargo una fracción (8 µl) en el SDS-PAGE para el teñido Western y la fracción restante (32 µl) se cargo en una trayectoria separada del mismo gel para el teñido de la proteína con Azul Coloidal de Coomassie. La porción del gel designada por el teñido de la proteína se incubó toda la noche con el teñido del Azul Coloidal de Coomassie. La porción del gel designada por el teñido Western se transfirió en una membrana PVDF por 2 hr a 320 mA, se enjuagó con agua desionizada, y se bloqueó por 1 hr a TA con leche al cinco por ciento en TBST y entonces se incubó toda la noche a 4°C con 7BD-33-11A en leches al 5 por ciento en TBST. Los manchados se lavaron 3 veces por 10 minutos en TBST y se incubaron con un IgG anti-ratón de cabra Fe específico conjugado con HRP (1:5000) en leche al 5 por ciento en TBST, por 1 hr a temperatura ambiente. Los manchados se lavaron entonces 3 veces por 10 minutos y se desarrollaron con el kit o equipo de sustrato de peroxidasa TMB de acuerdo a las instrucciones dentro del paquete. Como se desplegó en la Figura 4, el inmunomanchado Western y el gel teñido con el Azul Coloidal de Coomassie se revistieron, usando los marcadores de peso molecular como referencia. La banda principal que se tino con el Azul Coloidal de Coomassie se revistió con la banda principal que reaccionó con el 7BD-33-11A en el manchado Western. Esta sección se resalta (rectángulo insertado) en la Figura 4. 2.0 Correlación del Péptido e Identificación del Antígeno mediante Espectrometría de Masas A partir del experimento anterior, la banda en el gel teñido con Azul Coloidal de Coomassie que se revistió con la reactividad más intensa en el manchado Western se corto entonces y se sometió a digestión tríptica en gel usando un kit disponible comercialmente (Pierce, Rockford, IL) . Alícuotas del digesto se sometieron a análisis por espectrometría de masas en un lector PBSIIc Ciphergen SELDI-TOF (Ciphergen Biosystems Inc., Freemont , CA) . Brevemente, una alícuota del digesto se marcó manualmente en un microcircuito H4 (Ciphergen Biosystems Inc., Freemont, CA) . Después del secado, se agrego una alícuota de la matriz CHCA (ácido a-ciano 4-hidroxi cinnaminico; Ciphergen Biosystems Inc., Freemont, CA) en la misma marca en el microcircuito y se le dejo secar. La muestra se analizó entonces en el lector PBSIIc. Bandas de tamaño similar de regiones paralelas en las trayectorias de control de isotipo y de región del gel en blanco se procesaron lado por lado con el tapón de gel del IP 7BD-33-11A a fin de posibilitar la determinación de fragmentos de péptido únicos generados por la digestión del antígeno inmunoprecipitado por el 7BD-33-11A. Las masas de los fragmentos de péptido únicos se exploraron usando PROFUND, una herramienta en línea accesible públicamente para buscar bases de datos de secuencias de proteínas usando información de espectro de masas. Los péptidos únicos en la muestra del digesto de IP 7BD-33-11A se sometieron entonces a análisis de MS/MS en un QSTAR (Applied Biosystems, Foster City, CA) equipado con una interfaz que habilita el análisis de los mismos manchados de muestra que se analizaron previamente en el lector PBSIIc. Los datos del MS/MS se analizaron entonces con MASCOT, una herramienta en línea accesible públicamente para buscar bases de datos de proteínas usando información del espectro MS/MS. La figura 5 es un resumen de la tabla que resultó de la búsqueda ProFound. La única proteína que se sugirió como un candidato putativo, con grado significativo de confidencia fue el CD63. La figura 6 es una tabla de resumen que resulto de la búsqueda MASCOT. La única proteína que se identifico con un grado alto de probabilidad fue la CD63, soportando la identificación tentativa previa by impresión de huellas del mapa del péptido. 3.0 Confirmación ID del Antígeno 7BD-33-11A La confirmación del ID del antígeno putativo por el 7BD-33-11A se llevo acabo a través de la determinación de si los anticuerpos monoclonales anti -humanos CD63 conocidos, RFAC4 (Cymbus Biotechnology LTD, Hants, UK) y el H5C6 (BD Biosciences, San Diego, CA) reaccionarán con la proteínas (s) inmunoprecipitadas por el 7BD-33-11A, y viceversa. Además, se llevo acabo la confirmación cabo mediante inmunomanchado Western de usados a partir de bacterias inducidas y no inducidas transformadas con estructuras de fusión de (GST) de glutationa S-transferasa de los dominios extracelulares de CD63 humano. Los inmunoprecipitados de la membrana total MB-231 preparados con los anticuerpos monoclonales 7BD-33-11A, RFAC4, H5C6, y con los controles de isotipo IgG2a e IgG? (BD Biosciences, San Diego, CA) , se analizaron mediante ID SDS-PAGE seguido por inmunomanchado Western. Se analizaron volúmenes de fracciones iguales de cada muestra del inmunocomplejo en geles de replicación. Después del electromanchado en las membranas PVDF, los manchados de los geles de replicación se examinaron en paralelo con los anticuerpos monoclonales 7BD-33-11A, RFAC4 , H5C6, y con los controles de isotipo IgG2a y I Gi . La figura 7a demuestra el resultado de los experimentos de cruce de IP en los cuales el material inmunoprecipitado mediante cada uno de los anticuerpos monoclonales de prueba 7BD-33-11A y RFAC4 se analizaron mediante inmunomanchado Western. La figura 7b despliega el resultado de los experimentos de cruce IP en los cuales el material inmunoprecipitado mediante cada uno de los anticuerpos monoclonales de prueba 7BD-33-11A y H5C6 se analizaron mediante inmunomanchado Western. Cada uno de los anticuerpos monoclonales 7BD-33-11A, RFAC4 y H5C6 se hicieron reaccionar con el antígeno (s) similar inmunoprecipitado mediante el 7BD-33-11A. Además, el 7BD-33-11A se hizo reaccionar sobre un manchado Western, con antígeno (s) similar inmunoprecipitado mediante el RFAC4 y el H5C6, en el rango de 20-80 kDa, pero no con los inmunocomplejos preparados con los anticuerpos de control de isotipo. Los manchados probados con los anticuerpos de control de isotipo fueron completamente negativos. Este dato indica que el epítope reconocido por el anticuerpo 7BD-33-11A se encontró dentro del antígeno CD63. Para determinar si la reactividad cruzada se puede deber a las mismas moléculas que se reconocen por todos los anticuerpos, o si se debe a la presencia de moléculas que interactúan con masas similares, las inmunoprecipitaciones con el anticuerpo 7BD-33-11A se llevaron acabo en condiciones de severidad del amortiguador incrementada (50 mM de Tris pH 7.4, Tritón X-100 al 1%, y concentraciones variadas de NaCl : 0, 150, 500 y 2000mM; y además con amortiguador RIPA como se describió anteriormente pero conteniendo 500 mM de NaCl) . Los inmunocomplejos resultantes se probaron entonces por inmunomanchado Western con los anticuerpos monoclonales 7BD-33-11A, H5C6 y RFAC4 y con los controles de isotipo IgG2a y IgGj.. La figura 8 muestra que la variación de la severidad de las condiciones IP no tienen ningún impacto detectable en la formación de los inmunocomplejos, lo cual indica que la molécula (s) reconocida por el anticuerpo 7BD-33-11A se reconoció también por los anticuerpos anti-CD63 y viceversa. Para confirmar que el 7BD-33-11A se unió directamente al antígeno humano CD63, se evaluó su reactividad, mediante inmunomanchado Western contra los lisados de E. coli que expresan los polipéptidos de fusión recombinante que contienen los dominantes extracelulares (bucles ECl y EC2) del CD63 humano. Para este trabajo, se generaron las estructuras de fusión del GST de los bucles extracelulares del CD63 (bucle 1 y bucle 2- ECl y EC2 , respectivamente) subclonando los fragmentos de ADNc apropiados en el vector PGEX-4T-2 de expresión bacterial (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) . Los fragmentos de ADNc codifican los bucles se obtuvieron mediante la amplificación de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) , usando ADNc humano de longitud total como una plantilla (clone MGC-8339, American Type Culture Collection Manassas, VA) El ADNc que codifica el bucle ECl se obtuvo usando los siguientes cebadores PCR: cebador 5 ' (EC1_5 ' ) , 5 ' GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3 ' y cebador 3' (ECl 3'), 5 ' GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3 ' .

El ADNc que codifica el bucle EC2 se obtuvo usando los siguientes cebadores de la PCR: cebador 5' (EC_5'), 5 ' GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3 ' y cebador 3' (EC2_3'), 5 ' TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3 ' . Las condiciones para las reacciones de PCR fueron las siguientes: 2uL de cebador 5' (25 pmol/uL) , 2uL de cebador 3' (25 pmol/uL) , 0.2 uL del ADN de plantilla (pOTB-CD63, 0.76 mg/mL), y 45.8 uL del PCR de SuperMezcla de Alta Fidelidad (Invitrogen, Burlington, ON) . La reacción PCR se lleva acabo de la siguiente manera: 94 °C por 5 minutos seguido por 30 ciclos de: fusión a 94°C por 30 segundos, templado a 55°C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 1 minuto, por ciclo. Después de la subclonación, las construcciones, incluyendo un control negativo solo del vector PGEX-4T-2 (sin fragmento de ADNc subclonado en el vector) , se transformaron en E. coli (cepa BL_21) . Creció solo una colonia resistente a la ampicilina de cada transformación y las inserciones de ADNc respectivas fueron secuenciadas. Después de confirmar que la secuencia del ADNc fue correcta, cada uno de los clones creció en cultivo liquido y la expresión de las estructuras de fusión GST fueron inducidas mediante la adición de 1 mM de IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosida) (Gibco-BRL; Rockville, MD) . Después de una incubación de 2 horas, el cultivo bacteriano se centrifugo a 2000g, por 5 min, a temperatura ambiente. La sobrenadante se descarto y las pelotillas de bacterias se hirvieron en amortiguador de muestra SDS-PAGE sin reducción. Las muestras se analizaron posteriormente mediante apilamiento de poliacrilamida SDS-PAGE (5 y 12 por ciento) y los separación de geles respectivamente) e inmunomanchado Western, como se describió previamente. Las membranas manchadas se examinaron con el 7BD-33-11A, H5C6, RFAC4 , o con un control de isotipo IgG2a. Los resultados ilustrados por la figura 9 revelaron que el 7BD-33-11A reconoce específicamente el bucle 2 (108-202 aminoácidos) del CD63 humano (trayectoria 6 del manchado examinado con el 7BD-33-11A) , y no reconoce el bucle 1 (34-52 aminoácidos) . La especificidad del anticuerpo contra los lisados bacteriales se confirmaron mediante la observación de que dos anticuerpos (RFAC4 y H5C6) de CD63 anti -humano bien caracterizados también reconocieron una banda de tamaño similar, solo en los lisados de E. coli que expresa el polipéptido de fusión EC2. Todos los resultados anteriores demuestran que el 7BD-33-11A reconocido y enlazo directamente al CD63 humano, y específicamente a la región extracelular que comprende 108-202 aminoácidos. Ej emplo 3 Identificación de Antígenos Enlazados por el 1A245.6 y H460-22-1 1.0 Inmunoprecipitación de Antígenos a partir de la Fracción de la Membrana Total MB-231. Los extractos de la membrana total (1 mg de proteína total) se diluyeron por una concentración de proteína final del mg/mL con el volumen apropiado de amortiguador de lisis de lx (50 mM de Tris de pH 7.4, 150 mM de NaCl , Tritón X-100 al 1%, NaN3 al 0.02%, 2mM de ortovanadato de sodio, 50 mM de NaF, y cóctel inhibidor de proteasa) , y con el volumen apropiado de amortiguador RIPA 2x (50mM de Tris de pH 7.4, 150 mM de NaCl, NaCholate al 1.0%, SDS al 0.2%, Tritón X-100 al 1% y NaN3 al 0.02%), para obtener una concentración final de amortiguador RIPA lx. Los extractos se pre-clarificaron por 2 horas con cuentas de proteína de G-Sefarosa (Amersham Biosciences; Uppsala, Suecia) a 4°C. Los extractos de la membrana total se removieron y se agrego el BSA madre (lOmg/mL) a una concentración de BSA final de 0.5 mg/mL. Mientras que los extractos se pre-clarificaron, las cuentas de proteína G-Sefarosa conjugada con el anticuerpo (60 µg del anticuerpo químicamente reticulado a 30 µl de proteína Sefarosa-G) se bloquearon con 1 mL de BSA a 0.5 mg/mL, mediante incubación a 4°C, también por 2 horas. Después del bloqueo, las cuentas conjugadas con el anticuerpo se lavaron dos veces por 5 min con amortiguador RIPA lx. Las cuentas de proteína Sefarosa-G conjugada con el anticuerpo se agregaron entonces a los extractos de la membrana total conteniendo el BSA, y se incubaron por 3 hrs, a 4°C, en un rotador extremo sobre extremo. Después de la centrifugación a 20,000g, por 10 segundos, a 4°C, se removió la fracción no enlazada y se desecho, y se lavaron las cuentas 3 veces por 5 min, con 1 mL de amortiguador RIPA en cada paso de lavado. Las cuentas se enjuagaron posteriormente con 1.5 mL de PBS. Las inmunoprecipitaciones (IP) con los anticuerpos monoclonales conjugados con la proteína G-Sefarosa 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, el control de isotipo IgGi, el control de isotipo IgGa y el H460-16-2 (el último es un anticuerpo bien caracterizado conocido por reconocer de manera especifica al CD44) , se llevaron acabo en paralelo. Después se drenar completamente el PBS, las cuentas se hirvieron en 40 µl de amortiguador de muestra sin reducción y las muestras se analizaron por ID SDS-PAGE seguido por el inmunomanchado Western. Los geles de replicación se transfirieron en las membranas de PVDF por 2 hrs a 320 mA. Las membranas posteriormente se enjuagaron con agua desionizada, se bloquearon por 1 h a TA con leche al 5% en TBST. Las membranas de replicación se incubaron durante la noche a 4°C con los anticuerpos monoclonales RFAC4 (anti-CD63), 1A245.6, H460-22-1, H460-16-2, y con los controles de isotipo IgGi e IgG2a, en leche al 5% en TBST. Los manchados se lavaron 3 veces por 10 min en TBST y se incubaron con un IgG anti -ratón de cabra Fe específico conjugado con HRP (dilución de 1:5000) en leche al 5% en TBST, por 1 h a temperatura ambiente. Los manchados se lavaron entonces 3 veces por 10 minutos y se desarrollaron de acuerdo al procedimiento estándar del substrato TMB para HRP. Como se desplegó en la figura 10, los manchados examinados con los anticuerpos RFAC4 (anti-CD63), 1A245.6 y H460-22-1 revelaron patrones idénticos de reactividad. Todos los tres anticuerpos se hicieron reaccionar de manera cruzada con material inmunoprecipitado con los anticuerpos 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 (trayectorias 3, 4 y 5, respectivamente), y se caracterizaron por la reactividad en un rango de peso molecular aparente de 20 a 80kDa. También puede observarse un patrón de reactividad similar en la trayectoria cargada con el extracto detergente de la membrana total sin fraccionar (trayectoria 1) . Además, ninguno de estos anticuerpos reaccionados de manera cruzada con material inmunoprecipitado mediante el anticuerpo anti-CD44 H460-16-2 (trayectoria 2) , y el último no reconocen el material inmunoprecipitado por los anticuerpos diferentes del H460-16-2 (trayectorias 3, 4 y 5) . No se detecto reactividad cruzada no específica en los manchados de replicación examinados con los anticuerpos de control de isotipo. Por lo tanto, estos resultados sugieren fuertemente que los anticuerpos 1A245.6 y H460-22-1 reconocen la misma molécula del antígeno como los anticuerpos RFAC4 y 7BD-33-11A, CD63. 2.0 Confirmación de ID del Antígeno 1A245.6 y H460-22-1 Para confirmar que el 1A245.6 y el H460-22-1 enlazaron directamente al antígeno CD63 humano, se evalúo su reactividad, mediante inmunomanchado Western, contra lisados de E. coli que expresan polipéptidos de fusión recombinantes conteniendo los dominios extracelulares (bucles ECl y EC2) de CD63 humano. Para este trabajo, las estructuras de fusión GST de los bucles extracelulares de CD63 (bucle 1 y bucle 2 - ECl y EC2 , respectivamente) se generaron subclonando los fragmentos de ADNc apropiados en el vector PGEX-4T-2 de expresión bacterial (Amesham Biosciences, Piscataway, NJ) . Los fragmentos de ADNc que codifican los bucles se obtuvieron mediante la amplificación de la reacción de la cadena de polimerasa (PCR) , usando el ADNc humano de longitud total como una plantilla (clon MGC-8339, American Type Culture Collection Manassas, VA) . El ADNc que codifica el bucle ECl se obtuvo usando los siguientes cebadores de la PCR: cebador 5' (EC1_5'), 5 ' GCCGTGGGATCCGGGGCACAGCTTGTCCTG3 ' y cebador 3' (EC1_3'), 5' GATGACGAATTCTCACAGAGAGCCAGGGGTAGC3 ' . El ADNc que codifica el bucle EC2 se obtuvo usando los siguientes cebadores de la PCR: cebador 5 ' (EC2_5 ' ) , 5 ' GGCTATGGATCCAGAGATAAGGTGATG3 ' y cebador 3 ' (EC2_3 ' ) , 5 ' TACCAGAATTCAATTTTTCCTCAGCCAGCC3 ' . Las condiciones para las reacciones de la PCR fueron las siguientes: 2 µL del cebador 5' (25 pmol/uL) , 2µL del cebador 3' (25 pmol/µL) , 0.2µL de plantilla de ADN (pOTB-CD63, 0.76 mg/mL), y 45.8 µL de PCR SuperMezcla de Alta Fidelidad (Invitrogen) . La reacción PCR se llevo acabo de la siguiente manera: 94 °C por 5 min seguido por 30 ciclos de: fundición a 94°C por 30 seg, templado a 55°C por 30 seg y extensión a 72°C por 1 min, por ciclo. Después de la subclonación, las estructuras, incluyendo un control negativo solo del vector PGEX-4T-2 (sin fragmento de ADNc subclonado en el vector) , se transformaron en E. coli (cepa BL-21) . De cada transformación creció una sola colonia resistente a la ampicilina y las inserciones de ADNc respectivas fueron secuenciadas. Después de confirmar que la secuencia de ADNc fue correcta cada uno de estos clones creció en un cultivo liquido y la expresión de las estructuras de fusión GST se indujeron mediante la adición de 1 mM de IPTG (isopropil-ß-D-tiogalactopiranosido) (Gibco-BRL; Rockville, MD) . Después de una incubación de 2 hrs, el cultivo bacteriano se centrifugo a 2000g, por 5 min, a temperatura ambiente. El sobrenadante se descarto y las pelotillas de bacterias se hirvieron en amortiguador de muestra SDS-PAGE sin reducción. Las muestras se analizaron posteriormente por SDS-PAGE (apilamiento de poliacrilamida y separación de geles de separación al 5% y 12%, respectivamente) e inmunomanchado Western, como se describió previamente. Las membranas manchadas se examinaron con el 1A245.6, H460-22-1, RFAC4 , H460-16-2 y los controles de isotipo IgGi e IgG2a. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de 5 µg/mL. Los resultados ilustrados por la figura 11 revelan que el 1A245.6 y el H460-22-1 reconocen de manera especifica el bucle 2 (108-202 aminoácidos) del CD63 humano (trayectoria 6 de los manchados examinados con 1A245.6 y el H460-22-1), y no reconocieron el bucle 1 (34-52 aminoácidos) ni el vector GST solo. La especificidad del anticuerpo contra los lisados bacteriales se confirmaron además mediante la observación de que un anticuerpo CD63 anti-humano bien caracterizado (RFAC4) también reconoció una banda de tamaño similar, únicamente en los lisados de E. coli que expresan el polipéptido de fusión GST-EC2. Además un anticuerpo que reconoce el CD44 humano (H460-16-2) no reconoce ninguna de las proteínas recombinantes expresadas en este experimento. Todos los resultados anteriores muestran que el 1A245.6 y el H460-22-1 reconocieron y se unieron directamente al CD63 humano, y específicamente a la región extracelular que comprende 108-202 aminoácidos.

Ejemplo 4 Como se subrayó en S.N. 10/348,231, S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 y S.N. 10/891,866, los contenidos de cada una de las cuales están incorporados aquí como referencia, para la línea celular del hibridoma 7BD-33-11A y 1A245.6 y aquí para la línea celular del hibridoma H460-22-1, los tres clones del hibridoma se depositaron, de acuerdo con el tratado de Budapest, con la American Type Culture Collection, 10801 University BIvd., Manassas, VA 20110-2209 el 4 de Septiembre, 2003 bajo Numero de Acceso PTA-4622 para el H460-22-1 y el 8 de Enero, 2003, bajo Numero de acceso PTA-4889 y PTA-4890 para el 1A245.6 y el 7BD-33-11A, respectivamente. De acuerdo con el 37 CFR 1.808, los depositantes aseguran que todas las restricciones impuestas en la disponibilidad al público de los materiales depositados serán irrevocablemente removidas luego del otorgamiento de una patente. Producción de Anticuerpo: Los anticuerpos monoclonales H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A se produjeron mediante el cultivo de los hibridomas en frascos CL-1000 (BD Biosciences, Oakville, ON) con colecciones y resembrado que ocurren dos veces por semana. Los anticuerpos se purificaron de acuerdo a los procedimientos de purificación de anticuerpos estándar con flujo rápido de proteína G-sefarosa 4 (Amersham Bioscences, Baie d'Urfe, QC) .

Como se describió previamente en S.N. 10/348,231, S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751 y S.N. 10/891,866, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporados aquí como referencia, para el 7BD-33-11A y lA245.6.y como se subrayo aquí para el H460-22-1, los tres anticuerpos se compararon a un número de controles positivos (anti-Fas (EOS9.1, IgM, kappa, 20 microgramos/mL, eBioscience, San Diego, CA) , anti-Her2/neu (IgGl, kappa, 10 microgram/mL, ínter Medico, Markham, ON) , anti-EGFR (C225, IgGl, kappa, 5 microgram/mL, Cedarlane, Hornby, ON) , Cicloheximida (100 micromolar, Sigma, Oakville, ON) , NaN3 (0.1%, Sigma, Oakville, ON) ) y negativos (107.3 (anti-TNP, IgGl, kappa, 20 microgram/mL, BD Biosciences, Oakville, ON) , G155-178 (anti-TNP, IgG2a, kappa, 20 microgram/mL, BD Biosciences, Oakville, ON) , MPC-11 (especificidad antigenica desconocida, IgG2b, kappa, 20 microgram/ml) , J606 (anti-fructosan, IgG3 , kappa, 20 microgram/mL) , amortiguador IgG (al 2%) ) en un ensayo de citotoxicidad (Tablas 1 y 2) . Se probaron líneas de células de cáncer de seno (MB-231, MB-468, MCF-7) , cáncer de colon (HT-29, SW1116, SW620) , cáncer de pulmón (NCI H460) , cáncer de ovario (OVCAR) , cáncer de próstata (PC-3), melanoma (A2058, A357 y A549) y sin cáncer (Hs578.Bst, CCD 27sk, Hs888 Lu) (todas de ATCC, Manassas, VA) . El ensayo de citotoxicidad vida/muerte se obtuvo de sondas moleculares (Eugene, OR) . Los ensayos se realizaron de acuerdo a las instrucciones del fabricante con los cambios subrayados más adelante. Las células se colocaron en placas antes del ensayo a la densidad apropiada predeterminada. Después de 2 días, los anticuerpos o controles purificados se diluyeron en el medio, y después se transfirieron 100 µL se transfirieron a las placas de células y se incubaron en un incubador con C0 al 5 por ciento por 5 días . La placa posteriormente se vació por inversión y secado del manchado. Se dispenso DPBS a temperatura ambiente conteniendo MgCl2 y CaCl2 en cada pozo de una botella de presión multicanales, se perforo tres veces, y se vació por inversión y posteriormente se seco el manchado. 50 µL de tinta de calceína fluorescente diluidos en DPBS conteniendo MgCl2 y CaCl2 se adicionaron a cada pozo y se incubo a 37 °C en una incubador de C02 al 5% por 30 minutos. Las placas se leyeron en un lector de placa fluorescente HTS7000 Perkin-Elmer y los datos se analizaron en Microsoft Excel y los resultados se tabularon en las tablas 1 y 2. Los datos representan un promedio de 4 experimentos probados por triplicado y se presentan de manera cualitativa en la siguiente forma: 4/4 experimentos más que la citotoxicidad umbral (+++) , 3/4 experimentos más que la citotoxicidad (++) , 2/4 experimentos más que la citotoxicidad umbral (+) . Las células sin marca en la tabla 1 representan menos inconsistencias o efectos que la citotoxicidad umbral. El anticuerpo 7BD-33-11A demostró citotoxicidad en una línea celular de tumor de seno y próstata selectivamente, mientras que no tiene efecto en células normales sin transformación. El 7BD-33-11A y el 1A245.6 demostraron mayor matanza que el anticuerpo anti -Fas o anti-EGFR de control en la línea celular de cáncer de próstata. El H460 demostró mayor matanza que el anti-Fas o anti-EGFR en la línea celular MB-231. Los agentes citotóxicos químicos indujeron su citotoxicidad esperada mientras que un número de otros anticuerpos que no se incluyeron para la comparación también la realizaron como se esperaba dando los límites de los ensayos biológicos. En total, se mostró que los anticuerpos 7BD-33-11A, 1A245.6 y el H460-22-1 tienen actividad citotóxica contra un número de tipos de células cancerosas. Estos anticuerpos fueron selectivos en su actividad dado que no todos los tipos de células cancerosas fueron susceptibles. Además, los anticuerpos demostraron especificidad funcional ya que no produjeron citotoxicidad contra tipos de células no cancerosas, lo cual es un factor importante en una situación terapéutica.

Cp o Cp o Tabla 1 Tabla 2 Se evaluó el enlace del 7BD-33-11A al panel mencionado anteriormente de líneas de células cancerosas y normales y a las siguientes líneas de células cancerígenas adicionales; colon (LOVO) , pancreática (BxPC-3), ovario (ES-2, OCC-l) y próstata (DU-145) y la siguiente línea de células normales adicionales (CCD-112) mediante citometría de flujo (FACS, referenciada en S.N. 10/348,231, S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporados aquí como referencia) . El enlace del 1A245.6 (como se hace referencia en S.N. 10/348,231, S.N. 10/603,006 y S.N. 10/810,751 y S.N. 10/891,866, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporados aquí como referencia) y el H460-22-1 al panel anteriormente mencionado de líneas de células cancerígenas y normales también se evaluó mediante FACS. Las células se prepararon por FACS inicialmente mediante lavado de la monocapa celular con DPBS (sin Ca++ y Mg++) . El amortiguador de disociación celular (INVITROGEN, Burlington, ON) posteriormente se uso para desalojar las células de sus placas de cultivo celular a 37 °C. Después de la centrifugación y la colección, las células se resuspendieron en solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco conteniendo MgCl2, CaCl2 y suero de bovino fetal (FBS) al 2 o 25 por ciento a 4°C (medio de lavado) y se contaron, se sacaron alícuotas a la densidad celular apropiada, centrifugando las células a pelotillas y se resuspendieron en medio de teñido (DPBS conteniendo MgCl2 y CaCl2 +/- FBS al 2%) conteniendo el 7BD-33-11A o los anticuerpos de control (control de isotipo o anti-EGFR) en 20 µg/mL en hielo por 30 min. Antes de la adición del anticuerpo secundario conjugado con Flúor 488 Alexa, las células se lavaron una vez con el medio de lavado. El anticuerpo-Flúor 488 Alexa conjugado en el medio de teñido se agrego entonces por 20 a 30 min. Las células se lavaron posteriormente para el tiempo final y se resuspendieron en el medio de teñido conteniendo 1 µg/mL de yoduro de propidio o paraformaldeido al 1.5 %. Se evaluó la adquisición citométrica de flujo de las células corriendo las muestras en un FACScan usando el programa de computadora CellQuest (BD Biosciences) . El difusor delantero (FSC) y lateral (SSC) de las células se estableció ajustando el voltaje y la amplitud ganados en los detectores del FSC y SSC. Los detectores para los tres canales de fluorescencia (FL1, FL2, y FL3) se ajustaron corriendo las células teñidas con el anticuerpo de control de isotipo purificado seguido por el anticuerpo secundario conjugado con el Flúor 488 Alexa de manera que las células tuvieron un pico uniforme con una intensidad de fluorescencia media de aproximadamente 1-5 unidades. Las células con vida se adquirieron mediante selección por FCS y exclusión de ioduro de propidio (cuando se usaron) . Por cada muestra, se adquirieron aproximadamente 10,000 células vivas para análisis y los resultados se presentan en las Tablas 3, 4 y 5. Las Tablas 3, 4 y 5 tabulan el incremento doble de la intensidad de fluorescencia media por arriba del control de isotipo para el 7BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1, respectivamente, y se presenta cualitativamente como: menor que 5 ( - ) ; 5 a 50 (+); 50 a 100 (++); por arriba de 100 (+++) y en paréntesis, el porcentaje de células teñidas. Histogramas representativos de los anticuerpos 7BD-33-HA, 1A245.6 y H460-22-1 se compilaron por las figuras 12, 13 y 14 respectivamente. El 7BD-33-11A desplegó enlace similar a líneas cancerosas de origen de seno (MB-231 y MCF-7) , colon (HT-29, SW1116 y SW520) , pulmón, ovario, pancreático y próstata (PC-3) y enlace diferencial a una de las líneas de células cancerígenas de seno (MB-468) , colon (LOVO) y próstata (DU-145) . El 1A245.6 desplegó un enlace similar a líneas cancerosas de origen de seno (MB-231, MB-468 y MCF-7) , colon (SW1116 y SW520) , pulmón, ovario, y próstata y enlace diferencial a una de las líneas de células cancerígenas de colon (HT-29) . El H460-22-1 desplegó un enlace similar a las líneas de células con cáncer probadas. Hubo también enlace del 7BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1 a células no cancerígenas, sin embargo aquel enlace no produjo citotoxicidad. Esto fue evidencia de que el enlace no necesariamente fue predictivo del resultado de la ligación del anticuerpo de su antígeno cognado, y fue un hallazgo no obvio. Esto sugirió que el contexto de la ligación del anticuerpo en diferentes células determino la citoxicidad, en lugar de solo enlazar el anticuerpo. Tabla 3 Cp o Cp Tabla 4 o Tabla 5 Ejemplo 5 Teñido del Tejido Humano Normal Los estudios IHC se condujeron para caracterizar la distribución de los antígenos 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 en los humanos. Estos datos se discutieron previamente para el 7BD-33-11A (S.N. 10/603,006, S.N. 10/810,751, los contenidos de cada una de las cuales se encuentran incorporados aquí como referencia) y el 1A245.6 (S.N. 10/603,006, los contenidos de la cual se encuentran incorporados aquí como referencia) . Los estudios de optimización IHC se realizaron previamente en para determinar las condiciones para más experimentos. Los anticuerpos monoclonales 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A254.6 se produjeron y purificaron como se describió anteriormente. Secciones de tejido se desparafinaron mediante secado en un horno a 58 °C por 1 hora y se eliminó la cera por inmersión en xileno 5 veces por 5 min cada uno en jarras Coplin. El tratamiento siguió a través de una serie de lavados con etanol de grado (100%-75%) , las secciones se rehidrataron en agua. Los portaobjetos se sumergieron en 10 mM de amortiguador citrato a pH 6 (Dako, Toronto, Ontario) entonces se sometieron a microondas a ajustes de energía alta, media y baja por 5 min cada uno y finalmente se sumergieron en PBS frío. Los portaobjetos se sumergieron entonces en una solución de peróxido de hidrogeno al 3% por 6 minutos, se lavaron con PBS tres veces por 5 minutos cada uno, se secaron, e incubaron con una solución de bloqueo Universal (Dako, Toronto, Ontario) por 5 minutos a temperatura ambiente. El 7BD-33-11A, 1A245.6, H460-22-1, anti-vimentin de ratón monoclonal (Dako, Toronto, Ontario) o anticuerpo de control de isotipo (dirigido hacia la glucosa oxidasa del Aspergillus níge, una enzima la cual nunca esta presente ni se puede inducir en tejidos de mamíferos; Dako, Toronto, Ontario) se diluyeron en amortiguador de dilución del anticuerpo (Dako, Toronto, Ontario) a su concentración de trabajo (5 µg/mL para cada anticuerpo) y se incubaron por una hora a temperatura ambiente . Los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces por 5 minutos cada uno. La inmuno-reactividad de los anticuerpos primarios se detecto/visualizo con anticuerpos secundarios conjugados con HRP mientras se suministraron (Dako Envision System, Toronto, Ontario) por 30 minutos a temperatura ambiente. Siguiendo este paso los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces por 5 minutos cada uno y se desarrollo una reacción de color agregando solución de substrato de cromogen DAB (tetrahidrocloruro de 3 , 3 ' -diaminobencidina, Dako, Toronto, Ontario) para el teñido con inmunoperoxidasa por 10 min a temperatura ambiente. La reacción cromogénica se terminó lavando los portaobjetos con agua potable. Siguiendo el contrateñido con Hematoxilino de Meyer (Sigma Diagnostics, Oakville, ON) , los portaobjetos se deshidrataron con etanol de grado (75-100%) y se clarificaron con xileno. Los portaobjetos se colocaron uno sobre otro usando medio de montaje (Dako Faramount, Toronto, Ontario) . Los portaobjetos se examinaron de manera microscópica usando un Axisvert 200 (Zeiss Canadá, Toronto, ON) y se adquirieron imágenes digitales y se almacenaron usando Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON) . Los resultados se leyeron, se marcaron e interpretaron por un histopatólogo. El enlace de los anticuerpos a 59 tejidos humanos normales se realizó usando un arreglo de tejido de órgano normal, humano, (Imgenex, San Diego, CA) . La Tabla 6 presenta un resumen de los resultados del teñido del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 de un arreglo de tejidos humanos normales. En la tabla, hay 3 categorías de teñido de tejido. Un grupo de tejidos fue completamente negativo. Estos tejidos incluyeron de piel normal, cerebro, ovario, timo, tiroides, intestino delgado, esófago, corazón (Figura 15A) , vesícula y nodo linfoide para el 7BD-33-11A. Para el H460-22-1, los tejidos completamente negativos estuvieron comprendidos de la grasa sub-cutánea y el cerebro (Figura 15C) . Para el 1A245.6, los tejidos completamente negativos estuvieron comprendidos de piel, grasa sub-cutánea, esófago y cerebro (Figura 15B) . Un segundo grupo comprendido de tejidos que demostraron teñido positivo. Estos incluyeron el hígado y el páncreas para el 7BD- 33 - 11A . La amígdala tuvo el teñido más fuerte con este anticuerpo . Para el H460 -22 - 1 , ocurrió teñido positivo en el hígado , corazón, testículos , tiroides , glándula adrenal y miometrio . Igual que para el H460 -22 - 1 , ocurrió teñido positivo para el 1A245 . 6 en el hígado , corazón, testículos , tiroides , glándula adrenal y miometrio . Como con el 7BD-33 - 11A, el H460-22-1 y el 1A245.6 tiñeron más fuerte la amígdala. Un tercer grupo de tejidos incluyeron tej idos en los cuales el teñido fue positivo en la sección del tejido, pero se limito a los macrófagos de infiltración, linfocitos, fibroblastos o el epitelio, por ejemplo el estómago para el 7BD-33-11A, 1A245.6 y H460-22-1 (Figura 16A y B y C respectivamente) . Debe notarse que el antígeno 7BD-33-11A no se encuentra presente en células de varios de los órganos vitales, incluyendo el riñon, el corazón (Figura 15A) y el pulmón. En total , el 7BD-33-11A enlaza un subconjunto más pequeño de tej idos humanos normales en comparación a ambos, el H460-22-1 y el 1A245.6 con enlace débil a moderado en los tej idos que son positivos . El teñido del H460-22-1 y del 1A245.6, aunque es más extenso, es también generalmente débil a moderado en intensidad. Estos resultados sugieren que el antígeno para el 7BD-33-11A no se expresa ampliamente en tejidos normales, y que el anticuerpo enlazará específicamente a un número limitado de tejidos en humanos . Además, el antígeno para ambos, el H460-22-1 y el 1A254.6, además de que esta presente en el corazón y en el hígado, se limita al epitelio y los linfocitos de infiltración, macrófagos y fibroblastos .

Cp o Cp Tabla 6: Resumen del IHC del H460-22-1, 1A245.6 y del 7BD-33-11A en una Serie de Tejido Humano Normal .

IV) Cp o Cp IV) Cp o p co I-1 o Cp O rv> Cp o cp Abreviaciones: NR: La sección no fue representativa, CS : La sección se desprendió completamente, *: La sección se pigmento originalmente en el estrato basal, **: La sección tuvo teñido de fondo citoplásmico endógeno, ***: Cavidad estomacal (no cuerpo del estómago), ****: únicamente estroma de ovario Como se subrayó y discutió en 10/810,751, los contenidos la cual se incorporan aquí como referencia, los estudios compararon el 7BD-33-11A a dos anticuerpos dirigidos contra el CD63 (RFAC4 y el H5C6) dado que el antígeno 7BD-33-11A es el CD63 como se determinó previamente por métodos químicos. Se realizó el enlace de anticuerpos a 24 tejidos humanos normales usando un arreglo de tejido de órgano normal humano (Clinomics, atervliet, NY) . Todos los anticuerpos primarios (7BD-33-11A; RFAC4 (Cymbus Biotechnology Ltd., Hants, UK) y el anti-CD63 H5C6 (BD PharMingen, Oakville, ON) ; y el control negativo de IgGl de ratón (Dako, Toronto, ON) ) se diluyeron en amortiguador de dilución del anticuerpo (Dako, Toronto, ON) a una concentración de 5 µg/mL (siendo la concentración óptima encontrada en etapas de optimización previas) . El anticuerpo de control negativo ha mostrado ser negativo a todos los tejidos de mamíferos por los fabricantes. El procedimiento para el IHC se estableció anteriormente. Las secciones de tejido se desparafinaron mediante secado en un horno a 58 °C por 1 hora y se eliminó la cera sumergiéndolo en xileno 5 veces por 4 min a cada una en jarras Coplin. Siguiendo el tratamiento a través de una serie de lavados con etanol de grado (100-75%) las secciones se rehidrataron en agua. Los portaobjetos se sumergieron en lOmM de amortiguador de citrato a pH 6 (Dako, Toronto, Ontario) entonces se sometieron a microondas a ajustes de energía alta, media y baja por 5 minutos cada una y finalmente se sumergieron en PBS frío. Los portaobjetos se sumergieron entonces en solución de peróxido de hidrógeno al 3% por 6 min, se lavaron con PBS tres veces por 5 minutos cada uno, se secaron, e incubaron con una solución de bloqueo Universal (Dako, Toronto, Ontario) por 5 minutos a temperatura ambiente. El 7BD-33-11A, el anti-CD63 de ratón monoclonal (Cymbus Biotechnology Ltd., Hants, UK o Dako, Toronto, Ontario) o el anticuerpo de control de isotipo (dirigidos hacia la glucosa oxidasa Aspergillus níger, una enzima la cual no esta presente ni puede ser inducida en tejidos de mamíferos.; Dako, Toronto, Ontario) se diluyeron en un amortiguador de dilución del anticuerpo (Dako, Toronto, Ontario) hasta su concentración de trabajo (5 µg/mL por cada anticuerpo) y se incubaron por 1 h a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces por 5 minutos cada uno. La inmuno-reactividad de los anticuerpos primarios se detectó/visualizo con anticuerpos secundarios conjugados con HRP mientras se suministraron (Dako Envision System, Toronto, Ontario) por 30 minutos a temperatura ambiente. Siguiendo este paso, los portaobjetos se lavaron con PBS 3 veces por 5 minutos cada uno y se desarrolló una reacción de color mediante la adición de solución de substrato de cromogen DAB (tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobencidina, Dako, Toronto, Ontario) para el teñido de inmunoperoxidasa por 10 minutos a temperatura ambiente. Lavando los portaobjetos con agua potable se termino la reacción cromogénica. Siguiendo el contrateñido con Hematoxilina de Meyer (Sigma Diagnostics, Oakville, ON) , los portaobjetos se deshidrataron con etanoles de grado (75-100%) y se clarificaron con xileno. Usando medios de montaje (Dako Faramount, Toronto, Ontario) se sobreponen los portaobjetos. Los portaobjetos se examinaron microscópicamente usando un Axiovert 200 (Zeiss Canadá, Toronto, ON) y se adquirieron imágenes digitales adquiridas y se almacenaron usando Northern Eclipse Imaging Software (Mississauga, ON) . Los resultados se leyeron, marcaron e interpretaron por un patólogo. La tabla 7 presenta un resumen de los resultados del teñido anti-CD63 del 7BD-33-11A y RFAC4 y H5C6 de una serie de prueba de tejidos humanos normales. El teñido de los tejidos con el 7BD-33-11A es similar a aquel descrito previamente (S.N. 10/603,006, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia) . Nuevamente debe notarse que el 7BD-33-11A mostró enlace restringido a varios tipos de células pero tuvo enlace a los macrófagos de infiltración, linfocitos y fibroblastos. Los anticuerpos RFAC4 y H5C6 mostraron un patrón de teñido similar en comparación de uno con otro. Sin embargo, el patrón de teñido de ambos, el RFAC4 y el H5C6 fueron ligeramente diferentes que el observado con el 7BD-33-11A. Específicamente, ambos anticuerpos RFAC4 y el H5C6 se enlazan a un rango más amplio de tejidos normales, usualmente tuvieron mayor intensidad de teñido en tejidos donde el 7BD-33-11A fue también positivo y enlazaron no únicamente a los macrófagos de infiltración, linfocitos y fibroblastos sino también al epitelio en una mayoría de tejidos. Los tejidos que fueron positivos para el 7BD-33-11A fueron también positivos para cualquiera de los anticuerpos anti-CD63 RFAC4 o H5C6. Los tejidos que fueron negativos para el 7BD-33-11A fueron generalmente no negativos para el RFAC4 o H5C6. Estos resultados demostraron que el 7BD-33-11A enlaza a un subconjunto más pequeño de los tejidos reconocidos por cualquier anticuerpo ant i -CD- 63, RFAC4 o H5C6 y en los tejidos la intensidad del teñido fue también algunas veces menor. Estos resultados mostraron que el epítope para el 7BD-33-11A no fue ampliamente expresado en tejidos normales, y que el anticuerpo enlaza específicamente a un número limitado de tejidos humanos. Además se soporta la evidencia bioquímica de que el 7BD-33-11A se dirigió contra un epítope del CD63, aunque a un epítope diferente que el reconocido por cualquiera de los anticuerpos RFAC4 o H5C6 usados por estos estudios IHC. ro Cp o Tabla 7: Comparación del IHC anti-CD63 RFAC4 y H5C6 y el 7BD-33-11A en Tejido Normal Humano O NJ O cp N NJ Cp O Cp NJ NJ NJ Cp O Cp O NO O Ejemplo 6 Teñido de Tejido de Tumor de Seno Humano Como se subrayó y discutió parcialmente en S .N.10/603 , 006 y S .N.10/810, 751 , los contenidos de cada una de las cuales se incorporan aquí como referencia, los estudios IHC se emprendieron para determinar la asociación del cáncer del antígeno 7BD-33-11A, H460-22-1 y el 1A245.6 con los cánceres de seno humano y si los anticuerpos fueron capaces de reconocer los cánceres humanos. Se hizo una comparación con el vimentin (control positivo) y un anticuerpo contra la glucosa oxidasa de Aspergillus níger, una enzima la cual no esta presenta ni puede inducirse en tejidos de mamíferos (control negativo) . Se tiñó una serie de tejido de cáncer de seno derivado de 50 pacientes con cáncer de seno y 10 muestras derivadas de tejido de seno no neoplástico en pacientes con cáncer de seno (Imgenex Corporation, San Diego, CA) con los tres anticuerpos. Se proporcionaron, edad, sexo, y diagnóstico por cada paciente. Se siguió el procedimiento para el IHC del ejemplo 5. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de trabajo de 5 µg/mL. La Tabla 8a proporciona un resumen del teñido de los anticuerpos 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 de esta serie. Se probó una muestra adicional de 48 tejidos de cáncer de seno (Imgenex Corporation) y 9 muestras de tejido de seno normales con el 7BD-33-11A (mostrado en la tabla 8b) . En la Tabla 11 se encuentran referenciados los resultados agrupados de las 98 secciones teñidas con el 7BD-33-11A. En general, el 37% de los 98 pacientes probados fueron positivos para el antígeno 7BD-33-11A (Figura 17A) en comparación al 92% y 98% de los 50 pacientes probados para el H460-22-1 y el 1A245.6 respectivamente (Figuras 17C y B respectivamente) . Para el 7BD-33-11A, 0 de 19 muestras de tejido de seno normal de pacientes con cáncer de seno fueron positivas (Figura 18A) . Contrariamente, 9 de 10 muestras de tejido de seno normal fueron positivas para ambos, el H460-22-1 y el 1A245.6. Sin embargo, el teñido se debió a los fibroblastos de infiltración en la mayoría de los casos (Figura 18C y B respectivamente) . Como se mostró en la Tabla 11, hay una tendencia de mayor enlace del 7BD-33-11A a cánceres de seno negativos receptores de estrógeno, canceres de seno positivos de progesterona y canceres de seno avanzados (T3 & T4) . No fue evidente ninguna correlación entre el estatus del receptor del estrógeno y la progesterona para el 1A254.6 pero la intensidad del teñido del tejido pareció correlacionarse con la etapa del tumor mayor (Tabla 9) . Un número ligeramente más alto de tejidos positivos para el H460-22-1 también fueron positivos para el receptor de estrógeno y progesterona y hubo una tendencia a expresión positiva mayor con la etapa de tumor mayor (Tabla 10) . El teñido del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 fue específico para las células cancerosas y el teñido ocurrió en ambos, la membrana y dentro del citoplasma. El patrón de teñido, del 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6, mostró que en las muestras de los pacientes, el anticuerpo es altamente específico a las células malignas y los antígenos respectivos están presentes en la membrana celular haciéndolo por medio de esto un objetivo atractivo por medio de fármacos.

NJ O Cp Tabla 8a: Resumen IHC para el H460, 1A245.6 y 7BD-33-11A en 50 Secciones de Tejido de Tumor de Seno Humano y 10 Secciones de Tejido Normal NO NJ O Cp O NJ OO NJ O Cp NO U3 NO Cp O Cp co o NJ Cp O Cp Abreviaturas: M: Teñido mitocondrial, C: Teñido citoplásmico.

Tabla 8b: Resumen IHC para el 7BD-33-11 en 48 Secciones de Tejido de Tumor de Seno Humano y 9 de Tejido Normal NJ O O Tabla 9: Resumen del IHC de Tumor de Seno Humano para el 1A245.6 co NO Cp O Tabla 10: Resumen del IHC de Tumor de Seno Humano para el H460-22-1 o Cp NO Cp O Cp O Tabla 11: Resumen IHC de Tumor de Seno Humano por el 7BD-33-11" co Como se subrayo y discutió en S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, se llevó a cabo una comparación usando los anticuerpos anti-CD63, 7BD-33-11A, RFAC4 y H5C6 y anti-Her2 c-erbB-2 (A0485, DakoCytomation, Mississagua, ON) . Se usó una serie de tejido de cáncer de seno derivada de 50 pacientes con cáncer de seno y 10 muestras derivadas de tejido de seno no neoplástico en pacientes con cáncer de seno (Imgenex Corporation, San Diego, CA) . La siguiente información se proporciono por cada paciente: edad, sexo, etapa del tumor del American Joint Commite on Cáncer (AJCC) , nodo linfoide, receptor de estrógeno (ER) y el estatus del receptor de progesterona (PR) . Se siguió el procedimiento para el IHC del Ejemplo 5. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de trabajo de 5 µg/mL excepto para el anticuerpo anti-Her2 donde se uso una concentración de 1.5 µg/mL. Las Tablas 11, 12, 13 y 14 proporcionan los resúmenes del teñido del anticuerpo anti-CD63, 7BD-33-11A, RFAC4 y H5C6 de series de tejido de cáncer de seno respectivamente. En general, el 36 por ciento de los 50 pacientes probados fueron positivos para el antígeno 7BD-33-11A en comparación al 85% y 94% para los anticuerpos anti-CD63 RFCA4 y H5C6 respectivamente. En casos donde ambos anticuerpos anti-CD63 7BD-33-11A y RFAC4 o H5C6 tiñeron el mismo tejido, el 97 por ciento de las muestras tuvieron teñido de intensidad mayor con ambos anti-CD63, el RFAC4 y el H5C6 en comparación al 7BD-33-11A (Figura 19) . Para el 7BD-33-11A, 0 de 10 muestras de tejido de seno normal de pacientes con cáncer de seno fueron positivas. Para ambos antígenos anti-CD63, el RFAC4 y el H5C6, 7 de 8 muestras de tejido de seno normal de pacientes con cáncer de seno fueron positivas (2 muestras no fueron representativas) . Como se mencionó anteriormente, hubo una ligera correlación entre la expresión del receptor de estrógeno o progesterona y la expresión del antígeno 7BD-33-11A; los tejidos con cualquier expresión del receptor tuvieron una expresión del antígeno 7BD-33-11A ligeramente mayor. Cuando los tumores se analizaron en base a su etapa, o grado al cual el cáncer avanzó, los resultados sugirieron una tendencia hacia una expresión positiva mayor con la etapa del tumor mayor por el 7BD-33-11A. Se obtuvieron resultados similares con el RFAC4 , el H5C6 también mostró una correlación muy ligera con la expresión del receptor de estrógeno o progesterona pero no hubo correlación aparente con la etapa del tumor. Sin embargo, para los tres anticuerpos, los resultados fueron limitados por al tamaño de la muestra pequeña .

Tabla 12 : Resumen IHC de Tumor de Seno Humano por el RFAC4 Tabla 13: Resumen IHC para Tumor de Seno Humano por el H5C6 El teñido del 7BD-33-11A fue específico para las células cancerosas en comparación a las células normales donde las células del estroma fueron claramente negativas y las hojas de las células malignas fueron positivas. El patrón de localización celular visto con el antígeno 7BD-33-11A se confino a la membrana celular y el citoplasma. Se obtuvieron resultados de teñido membranoso y citoplásmico similares con los anticuerpos anti-CD63, RFAC4 y H5C6 en las muestras de tejido de tumor de seno. Adicionalmente, ambos anticuerpos mostraron este patrón de localización de teñido en muestras de tejido de seno normal mientras que el 7BD-33-11A fue negativo.

En comparación al anti-Her2 c-erbB-2, el 7BD-33-11A mostró un perfil de teñido completamente diferente en donde 9 de 18 muestras de tejido de tumor de seno que fueron positivas para el antígeno 7BD-33-11A fueron negativas para la expresión del Her2 indicando una necesidad terapéutica dirigida al objetivo aún insatisfecha por pacientes con cáncer de seno (Tabla 15, Figura 20) . Hubo también diferencias en la intensidad del teñido entre las secciones de tejido de tumor de seno que fueron positivas para ambos, el 7BD-33-11A y el Her2 ; algunas secciones de tejido de tumor de seno que fueron altamente positivas para el antígeno 7BD-33-11A fueron solo medianamente positivas para el Her2 y viceversa ilustrando nuevamente que el 7BD-33-11A tendrán como objetivo terapéuticamente un grupo humano diferente de pacientes con cáncer de seno. El anticuerpo c-erbB-2 también tino positivamente una de las secciones de tejido de seno normal.

Estos resultados sugirieron que el antígeno para el 7BD-33-11A puede expresarse por aproximadamente dos tercios de pacientes con cáncer de seno y la mitad de aquellos fueron completamente negativos para el antígeno Her2. El patrón de teñido mostró que en las muestras de pacientes, el anticuerpo es altamente específico para células malignas y el antígeno 7BD-33-11A estuvo presente en la membrana celular haciéndolo por medio de esto un objetivo con fármacos atractivo. El teñido mucho más limitado aunque similar del 7BD-33-11A contra el del anticuerpo anti-CD63 RFAC4 o el del H5C6 demostró nuevamente la probabilidad de que el epítope del 7BD-33-11A sea un epítope más restrictivo en el CD63. Tabla 14 : Comparación del IHC del anti-CD63 RFAC4 y H5C6 y el 7BD-33-11A en Tejido de Tumor Humano y Tejido de Seno Normal Abreviaturas: NR: la muestra no es representativa y F: la sección se duplico .

Tabla 15 : Comparación del IHC del anti-Her2 c-erbB-2 y el 7BD-33-11A en Tejido de Tumor humano y de Seno Normal Ejemplo 7 Teñido del Tejido de Próstata Humana Para determinar si el antígeno 7BD-33-11A se expreso en otros tejidos de cáncer humanos además de cáncer de seno, se probo una serie de tejido de tumor de próstata humana con el 7BD-33-11A (S.N. 10/810,751, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia; Imgenex Corporation, San Diego, CA) . El procedimiento de teñido usado fue el mismo que el esbozado en el ejemplo 5. Se usó el vimentin como un anticuerpo de control positivo y se usó el mismo anticuerpo de control negativo que se describió para la serie de tejido de tumor de seno humano. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de trabajo de 5 µg/ML. Como describió en la tabla 16, el 7BD-33-11A tiñó el 88 % de los canceres de próstata humanos. Aunque el 7BD-33-11A tiñó las secciones de tejido normal con alta intensidad también, hubo un grado mayor de teñido membranoso en las muestras de tejido de tumor en comparación a las muestras normales. Hubo una muestra de tejido rabdomiosarcoma embrional que no se tiñó por el antígeno 7BD-33-11A. También, pareció no haber correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno 7BD-33-11A. Sin embargo, los resultados se limitaron por el tamaño de la muestra pequeño. Nuevamente con el 7BD-33-11A hubo teñido membranoso y citoplásmico observado en las muestras de tejido de tumor de próstata. Sin embargo hubo un incremento en el grado de teñido membranoso en relación a aquel visto con las muestras de tejido de tumor de seno (Figura 21). Para las muestras de tejido de próstata normal, no se observo este incremento en el grado de teñido membranoso .

Tabla 16: Resumen IHC de Tumor de Próstata Humano por el 7BD-33-11A Por lo tanto, pareció que el antígeno 7BD-33-11A no se encontró solamente en las membranas de los cánceres de seno si no también en la membrana de los cánceres de próstata. Estos resultados indican que el 7BD-33-11A tiene potencial como un fármaco terapéutico en más tipos de tumores además del de seno. Ejemplo ,8 Teñido de Tejido de Melanoma Humano. Para determinar si el antígeno 7BD-33-11A se expreso en otros tejidos cancerosos humanos además del cáncer de seno y próstata, se probo una serie de tejido de tumor de melanoma humano con el 7BD-33-11A (Tristar Technology Group, LLC, Bethesda, MD) . El procedimiento de teñido usado fue el mismo que el esbozado en el Ejemplo 5 con la excepción del AEC que se uso como el cromógeno en lugar del DAB. El RFAC4 y el NKI/C3 se usaron como anticuerpos de control positivo y el mismo anticuerpo de control negativo se uso como se describió para la serie de tejido de tumor seno humano. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de trabajo de 5 µg/mL excepto para el NKI/C3 el cual se uso a 0.4 µg/mL. Como esbozo en la tabla 17, el 7BD-33-I1A tino el 90 por ciento de los cánceres de melanoma humano (Figura 22). En el número límite de muestras probadas, tampoco pareció haber una correlación directa entre la etapa del tumor y la presencia del antígeno 7BD-33-11A. Nuevamente con el 7BD-33-11A se observaron ambos teñidos, membranoso y citoplásmico en las muestras de tejido de tumor de melanoma. Tabla 17 : Resumen IHC de Tumor de Melanoma Humano por el 7BD- Ejemplo 9 Teñido de Tej ido de Tumor Humano Como se esbozo y discutió parcialmente en 10/603,006, los contenidos de la cual se incorporan aquí como referencia, para determinar si cualquiera de los antígenos 7BD-33-11A, H460-22-1 o 1A245.6 se expresan en otros tejidos cancerosos humanos además de cáncer de seno, los anticuerpos se probaron individualmente en una serie de tejido de tumor humano múltiple (Imgenex, San Diego, CA) . La siguiente información se proporcionó por cada paciente: edad, sexo, órgano y diagnosis. El procedimiento de teñido usado fue el mismo que el esbozado en el ejemplo 5. Se uso Vimentin como un anticuerpo de control positivo y se uso el mismo anticuerpo de control negativo según lo descrito para la serie de tejido de tumor de seno humano. Todos los anticuerpos se usaron a una concentración de trabajo de 5 µg/mL. Como se esbozó en la tabla 18, el 7BD-33-11A tiñó un número de varios cánceres humanos además del de seno. Los siguientes tipos de tumores fueron positivos para el 7BD-33-HA: piel (1/2), pulmón (3/4), hígado (2/3), estómago (4/5), tiroides (2/2), próstata (l/l), útero (4/4) y riñon (3/3) (figura 23A) . Ocasionalmente también se tiñeron varios tipos de tumores positivamente. Otros tejidos de tumor fueron negativos para la expresión del 7BD-33-1IA; ovario (0/3), testículos (0/1) , cerebro (0/2) y nodo linfoide o linfático (0/2). Contrariamente, el H460-22-1 y el 1A245.6 tiñeron todos los tipos de tejido de tumor probados. Sin embargo, el teñido varió en intensidad, con algo de teñido más fuerte visto en las células malignas de la piel, del pulmón, del hígado, del útero, del riñon (figura 23B y C respectivamente) , del estómago y de la vejiga. Como se vio con los cánceres de seno y de próstata (solamente 7BD-33-11A) , el teñido del 7BD-33-1IA, el H460-22-1 y el 1A245.6 se localizó en la membrana y dentro del citoplasma de las células cancerosas. Por lo tanto, parece que los antígenos 7BD-33-11A, H460-22-1 y 1A245.6 no se encontraron únicamente en las membranas de los cánceres de seno, próstata y melanoma sino también en la membrana de una gran variedad de tipos de tumores. Estos resultados indican que el 7BD-33-11A, H40O-22-1 y 1A245.6 y 1A245.6 tienen potencial como fármacos terapéuticos en una amplia variedad de tipos de tumores además de cáncer de seno y de próstata.

Tabla 18: Resumen IHC para el H460-22-1, 1A245.6 y 7BD-33-11A en una Serie de Tejido Muí i-Tumor Humano Abreviaturas : NR: La sección no fue representativa, CS : La sección se desprendió totalmente. M: Teñido mitocondrial. C: Teñido citoplásmico.

Ejemplo 10 AR7BD-33-11A, ARH460-22-1 y AR1A245.6 que Enlazan a Tejidos Normales de Monos Cynomolgus y Rhesus . Para evaluar la expresión del antígeno en especies de primates no humanos, se probó el enlace de los anticuerpos AR7BD-33-11A, ARH460-22-1, 1A245.6 y H5C6 (un anti-CD63 comercialmente disponible) por IHC en tejidos normales de 2 especies de primates. Las series de tejido normal de monos Cynomolgus y Rhesus se obtuvieron de BioChain, Hayward, CA, y se tiñeron según el procedimiento esbozado en el ejemplo 5. También se probaron controles positivos (anticuerpo anti- actin) y negativos. Las series estuvieron comprendidas de secciones de los siguientes 9 órganos representativos: corazón, cerebro, riñon, hígado, pulmón, bazo, intestino delgado, músculo esquelético y páncreas.

El enlace del anticuerpo AR7BD-33-11A fue limitado y compatible con aquel observado con tejidos humanos. Como se muestra en las tablas 19 y 20, el anticuerpo no enlazó al corazón, al cerebro o al músculo esquelético y mostró enlace débil a moderado en otros tejidos probados excepto para los macrófagos del pulmón y el tejido pancreático donde se observo un enlace fuerte. El enlace fue similar entre las dos especies de primates no humanas con dos advertencias. En la sección del intestino delgado del Rhesus, hubo un enlace equivoco de unos cuantos fibroblastos, sin embargo, la sección correspondiente del Cynomolgus no fue representativa y por lo tanto no pudo evaluarse. El enlace del AR7BD-33-11A a las secciones del hígado y del riñon fue más fuerte con la muestra del Rhesus que con la del Cynomolugus . Tabla 19. Resultados del teñido IHC del AR7BD-33-11A de las Secciones de Tejido del Mono Cynomolgus El registro o puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-) , Teñido incierto (+/-), Teñido débil (+). Teñido moderado (++), Teñido mas fuerte (+++) . Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D) , Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). * Únicamente tejido adiposo Tabla 20. Resultados del Teñido IHC del AR7BD-33-11A de Secciones de Tejido de Mono Rhesus El score de la sección final depende de la intensidad del teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-) , Teñido incierto ( +/-), Teñido débil (+ ) . Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte (+++). Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difuso (D) , Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). Solamente tejido adiposo El enlace del ARH460-22-1 a las especies de primates también fue compatible con aquel que se observo en tejidos humanos. Como se ve en las tablas 21 y 22, excepto para el enlace equivoco observado en la muestra de cerebro del Cynomolgus la cual fue negativa en la sección del Rhesus correspondiente, el enlace del ARH460-22-1 fue similar entre las dos especies de primates no humanas. Tabla 21. Resultados del Teñido IHC del ARH460-22-1 de las Secciones de Tejido de Mono Cynomolgus El registro o puntaje de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-) , Teñido incierto (+/-), Teñido débil (+) . Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte (+++). Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D), Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). * Solamente tejido adiposo Tabla 22 Resultados de Teñido IHC del ARH460-22-1 de Secciones de Tejido del Rhesus El registro o puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-), Teñido incierto (+/-), Teñido débil (+) , Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte (+++). Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D), Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de Células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). : Solamente tejido adiposo El enlace del AR1A245.6 a las especies de primates también fue compatible con aquella que se observó en tejidos humanos. Como se muestra en las tablas 23 y 24, el enlace del tejido por el AR1A245.6 fue similar entre las dos especies con las siguientes excepciones: músculo esquelético (negativo en el Rhesus, incierto en el Cynomolgus), músculo cardiaco (más fuerte en el Rhesus que en el Cynomolgus) y cerebro (más fuerte en el Cynomolgus que en el Rhesus) .

Tabla 23. Resultados del Teñido IHC del AR1A245.6 de Secciones de Tejido de Mono Cynomolgus El registro o puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-) , Teñido incierto ( +/-) , Teñido débil ( + ) . Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte (+++). Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D), Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de Células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). * Solamente tejido adiposo Tabla 24: Resultados de Teñido IHC del ARIA245.6 de Secciones de Tejido del Mono Rhesus El registro o puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-) , Teñido incierto ( + /-), Teñido débil ( + ) . Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte (+++). Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D) , Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de Células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). * Solamente tejido adiposo Como se observó con los tejidos humanos, el enlace del H5C6 (esbozado en la tabla 25 y 26) presentó un patrón de enlace similar a aquellos del H460-22-1 y AR1A245.6, que enlazan un amplio rango de tejidos que el del AR7BD-33-11A.

Para los cuatro anticuerpos ant?-CD63, la localización celular fue principalmente citoplásmica con patrón de teñido granular. Tabla 25: Resultados de Teñido IHC del H5C6 de Secciones de Tejido del Mono Cynomolgus El registro de puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-), Teñido incierto (+/-), Teñido débil (+) . Teñido moderado (++), Teñido mas fuerte (+++) . Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D) , Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de Células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%). * Solamente te] ido adiposo 1 Tabla 26: Resultados de Teñido IHC del H5C6 de Secciones de Tejido del Mono Rhesus El registro o puntuación de la sección final depende de la intensidad de teñido más fuerte de las células como sigue: Teñido negativo (-), Teñido incierto ( + /-) , Teñido débil ( + ) . Teñido moderado (++) , Teñido mas fuerte ( +++) . Localización celular: Membranosa (M) , Citoplásmica (C) , Difusa (D) , Granular (G) , Focal esporádica (SF) . % de Células teñidas aproximado: < 10% (1-9%), 10%, < 50% (11-49%), 50%, >50% (51-100%) .

Estos datos proporcionan evidencia de que el antigeno para el H460-22-1, AR1A245.6, AR7BD-33-11A y H5C6 se expresa de manera similar en el hombre y en los monos Rhesus y Cynomolgus, y que estas especies no humanas de primates ' presentan modelos potenciales in vivo para estudiar la seguridad y la farmacocinética de la administración del H460- 22-1, 1A245.6 o del AR7BD-33-11A. Ejemplo 11 Experimentos de Tumores Preventivos MDA-MB-231 in vivo Con referencia a los datos que se muestran en las Figuras 24 y 25, a las 4 a 8 semanas de edad, a ratones SCID hembras se les implantaron 5 millones de células de cáncer de seno humanas MB-231 en 100 µL de solución salina inyectada de manera subcutánea en la garganta del cuello. Los ratones se dividieron de manera aleatoria en 3 grupos de tratamiento de 10. Un día antes de la implantación se administraron de manera intraperitoneal 20 mg/kg de anticuerpo de prueba H460-22-1, amortiguador de anticuerpo o anticuerpo de control de isotipo (que se sabe que no enlaza las células MB-231) en un volumen de 300 µL después de la dilución de la concentración madre con un diluyente que contuvo 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04, 137 M de NaCl y 20 mM de Na2HP04. Los anticuerpos se administraron entonces una vez por semana por un período de 7 semanas en la misma manera. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 1 ° día con calibradores hasta por 10 semanas o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales establecidos por el Canadian Council for Animal Care (CCAC) o día 120. Los pesos corporales de los animales se registraron durante la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. La información presentada en este estudio es un ejemplo típico de un conjunto de datos longitudinales. Usualmente, en tales conjuntos de datos hay correlaciones altas entre puntos de tiempo y correlaciones más altas se observan entre puntos de tiempo más cercanos. Debido a esto, se usó el análisis de varianza con medidas repetidas (Rep. ANOVA) para determinar las diferencias entre los tratamientos y el método de análisis de covarianza se uso para determinar los puntos de tiempo cuando ocurrieron diferencias. El último es un método conveniente cuando las diferencias entre los grupos en cada tiempo-punto podrían no deberse solo a los grupos sino que podrían deberse a los puntos de tiempo anteriores. ?o hubo signos clínicos de toxicidad en todo el estudio. El peso corporal medido a intervalos semanales fue un sustituto para el bienestar y falla en prosperar. La Figura 24 representa el peso corporal medio de los ratones para los 3 grupos durante el período de estudio. Los pesos corporales en cada grupo se incrementaron a lo largo del tiempo. El Rep.

ANOVA indicó que no hubo diferencia significativa entre grupos y que los perfiles medios no difirieron durante los puntos de tiempo para los grupos tratados con el control de isotipo, el amortiguador de anticuerpo o el H460-22-1. Usando el Rep. ANOVA para el experimento completo, los resultados siguientes fueron notables. El método del rep. ANOVA indicó que no sólo las medias de los grupos fueron diferentes (p< 0.001) sino que también las formas de los perfiles medios difirieron uno del otro. Como puede observarse en la Figura 25, el grupo de tratamiento con H460-22-1 parece tener un efecto superior en comparación con los otros grupos. Además, la diferencia entre el grupo tratado con el control de isotipo y el grupo tratado con el amortiguador de anticuerpo no fue estadísticamente significativa. A partir del análisis de covarianza, ocurrieron diferencias significativas por primera vez en el día 18, donde los grupos de tratamiento con amortiguador e isotipo difirieron del grupo de tratamiento con el H460-22-1. En el día 53, (la primera medida del volumen del tumor después de cesar el tratamiento) el volumen del tumor del grupo tratado con H460-22-1 fue de 17.7% del grupo tratado con el control de anticuerpo (p< 0.0001) demostrando por medio de esto eficacia en la prevención de la carga del tumor.

Además, hubo un beneficio de supervivencia correspondiente (Figura 26) del tratamiento con el H460-22-1. La supervivencia mejorada es un valioso indicador de eficacia. Se siguieron a los 3 grupos por más de 70 días después del tratamiento. Estos datos demuestran que el tratamiento con el anticuerpo de prueba confiere una ventaja de supervivencia en comparación a los grupos de control tratados. Los grupos de control alcanzaron 50 por ciento de mortalidad entre el día 74-81 después de la implantación. En cambio, el grupo tratado con el H460-22-1 no alcanzó el 50 por ciento de mortalidad a la hora de la terminación del estudio (120 días después de la implantación) . El grupo de tratamiento del grupo de control de isotipo alcanzó el 100 por ciento de mortalidad por el día 102 después de la implantación. En contraste, los animales tratados con el H460-22-1 presentaron una supervivencia del 60 por ciento al final del estudio. Resumiendo, el tratamiento con el anticuerpo H460-22-1 previno la carga del tumor y aumentó la supervivencia en comparación a un anticuerpo de control en un modelo bien reconocido de padecimiento de cáncer humano. Estos resultados sugieren un beneficio farmacológico y farmacéutico potencial de este anticuerpo (H460-22-1) como una terapia en otros mamíferos, incluyendo al hombre. Ejemplo 12 Experimentos de Tumores Establecidos MDA-MB-231 in vivo A ratones SCID hembras de 5 a 6 semanas de edad, se les implantaron 5 millones de células de cáncer de seno MB-231 en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. El crecimiento del tumor se midió con los calibradores cada semana. Cuando la mayoría del grupo o cohorte alcanzó un volumen de tumor de 100 mm3 (rango de 70-130 mm3) a los 34 días después de la implantación, 12 ratones se seleccionaron al azar en cada uno de tres grupos de tratamiento. El anticuerpo H460-22-1 o el de control de isotipo (conocido por no enlazar células MB-231) se administró de manera intravenosa con 15 mg/kg/dosis a un volumen de 150 µL después de realizó una dilución de la concentración madre con un diluyente que contenía 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 20 mM de Na2HP04; se administró cisplatin a 9 mg/kg/dosis (diluido en solución salina) de manera intraperitoneal en el 300 µL. Los anticuerpos se administraron entonces 3 veces por semana para un total de 10 dosis en la misma manera hasta el día 48 después de la implantación. Se administró cisplatin cada cuatro días con 3 dosis. Se midió el crecimiento del tumor cada 1 ° día con calibradores por la duración del estudio o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales de la CCAC. Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. A la hora de la selección aleatoria los volúmenes de tumor medios y las desviaciones estándar en cada grupo fueron similares: el control de isotipo, (97.60+/-18.33) ; H460-22-1 (94.06+/-17.77) ; cisplatin (98.00+/-18.93) . Como se muestra en la Figura 27 el anticuerpo H460-22-1 fue capaz de suprimir significativamente el crecimiento del tumor al final del período de tratamiento de 3 semanas. Las comparaciones del volumen medio del tumor entre los 3 grupos demostraron que las diferencias entre los grupos fueron altamente significativas (Tabla 27) . Tabla 27: Comparación del Volumen del Tumor Medio al Final del Tratamiento rLa diferencia media es significativa en el nivel 0.05.

La evaluación adicional de la eficacia se evaluó calculando los cocientes T/C (volumen del tumor medio de tratado [T] como un porcentaje del volumen del tumor medio del control de isotipo [C] ) lo cual refleja la inhibición del crecimiento. El anticuerpo H460-22-1 logró un volumen de tumor medio igual a 48 por ciento del de control (Figura 28) . La Figura 27 muestra además que el tratamiento con el H460-22-1 dio lugar a la supresión marcada del crecimiento del tumor cuando se comparó al control de isotipo y que la supresión fue 2/3 la del cisplatin dado a su dosis máxima tolerada (MTD) pero sin la que la toxicidad o la muerte acompañe al cisplatin. Los pesos corporales registrados semanalmente por la duración del experimento se utilizaron como sustitutos para la evaluación de la seguridad y de la toxicidad. Como se esbozó en la Tabla 28 y se desplegó en el Figura 29, hubo una diferencia mínima en el peso para los grupos tratados con el control de isotipo o el H460-22-1. En cambio, durante el período de tratamiento, hubo una caquexia significativa (p<0.003) observada en el grupo del cisplatin. En este grupo, la pérdida de peso alcanzó 19.2% del peso corporal inicial y evidencia adicional de dolor clínico tal como la piel rizada, piel lechina o abierta debida a la deshidratación y al letargo ocurrido. No hubo muertes en el grupo tratado con el H460-22-1 en comparación con 2 muertes observadas en el grupo tratado con el cisplatin. Tabla 28: Cambios en el Peso del Cuerpo y la Supresión del Crecimiento del Tumor (%T/C) al Final del Tratamiento * Dosis administrada i.v. 3 x por semana por 3 semanas ** Dosis administrada i.p. 1 x cada 4 días por 3 dosis Resumiendo, el H460-22-1 es significativamente más eficaz que el anticuerpo de control de isotipo en la supresión del crecimiento del tumor en un modelo de xenoinjerto de tumor de cáncer de seno establecido en ratones SCID. Durante el período de tratamiento de 3 semanas, el H460-22-1 logro un tumor de T/C medio de menos del 50 por ciento en relación al de control. Además, el H460-22-1 dio lugar a la supresión que fue de dos tercios la del cisplatin dado a la MTD pero sin los signos de toxicidad o muerte observados con el fármaco quimioterapéutico.

Por lo tanto, el tratamiento con el H460-22-1 disminuyó significativamente la carga del tumor de tumores establecido con respecto a un anticuerpo de control en un modelo bien reconocido del padecimiento humano que sugiere beneficios farmacológicos y farmacéuticos de este anticuerpo para terapia en otros mamíferos, incluyendo el hombre. Ejemplo 13 Experimentos de Tumores Preventivos A2058 in vivo Con referencia a los datos mostrados en las Figuras 30 y 31, a ratones SCID hembras de 4 a 8 semanas de edad, se les implantó 0.75 millones de células de cáncer de melanoma humanas A2058 en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. Los ratones se dividieron de manera aleatoria en 2 grupos de tratamiento de 5. Un día después de la implantación se les administro de manera intraperitoneal 20 mg/kg del anticuerpo de prueba 7BD-33-11A o el control amortiguador en un volumen de 300 µL después se realizo la dilución de la concentración madre con un diluyente que contenía 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 20 mM de Na2HP04. El anticuerpo o control amortiguador se administraron entonces una vez por semana por un período de 7 semanas en la misma manera. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 7o día con calibradores hasta por 10 semanas o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales del Canadian Council for Animal Care (CCAC) . Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. El tratamiento del 7BD-33-11A dio lugar a crecimiento de tumor disminuido en comparación al tratamiento con el control amortiguador (Figura 31) . En el día 55 (5 días después del final del tratamiento) , el volumen del tumor medio en el grupo tratado con el 7BD-33-11A fue 28 por ciento del control amortiguador (p=.0112, prueba t no apareada). No hubo señales clínicas de toxicidad como se determinó por el peso corporal (Figura 30) . También en el día 55, no hubo diferencia significativa entre el peso corporal medio del grupo de tratamiento con el 7BD-33-11A contra el grupo del tratamiento del control amortiguador (p=0.3351, prueba t no apareada). Por lo tanto, el tratamiento con el 7BD-33-11A pareció seguro y presento eficacia en el tratamiento de modelos in vivo de seno, próstata y ahora melanoma de cáncer humano. Ejemplo 14 Experimentos de Tumores Establecidos A2058 in vivo Con referencia a los datos mostrados en las Figuras 32 y 33, a ratones SCID hembras de 4 a 8 semanas de edad, se les implantó 5 x 105 millones de células de cáncer de melanoma humano A2058 en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. Una vez que los tumores alcanzaron aproximadamente 75 mm3, los ratones se dividieron de manera aleatoria en 2 grupos de 7. Los ratones del grupo de prueba se trataron con 15 mg/kg de AR7BD-33-11A, diluidos con 300 µL en el vehículo del amortiguador de control (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco sin CaCl2 y MgCl2) , 3 veces por semana para un total de 10 dosis. Los ratones del grupo de control recibieron solo el vehículo del amortiguador de control de acuerdo al mismo programa. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 1 ° día con calibradores por la duración del estudio o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales del Canadian Council for Animal Care (CCAC) . Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. La supervivencia no fue un punto final del estudio. El crecimiento del tumor se inhibió significativamente en el grupo del tratamiento con el AR7BD-33-11A. El volumen del tumor medio en este grupo fue 30.87% (p<0443) de la medida del grupo de control (Figura 32) . No se observó ninguna diferencia significativa en los pesos corporales medios registrados para los 2 grupos (Figura 33) . Por lo tanto, el tratamiento con el 7BD-33-11A pareció seguro y presentó eficacia en el tratamiento de modelos in vivo de seno y ahora de melanoma de cáncer humano establecido. Ejemplo 15 Experimentos preventivos del tumor A375 in vivo Con referencia a las Figuras 34 y 35, a ratones SCID hembras de 4 a 8 semanas de edad, se les implantó 1 millón de células de cáncer de melanoma humanas A375 en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. Los ratones se dividieron de manera aleatoria en 2 grupos de tratamiento de 5. Un día después de la implantación se administraron de manera intraperitoneal 20 mg/kg del anticuerpo de prueba 7BD-33-11A o del control amortiguador en un volumen de 300 µL después se realizó la dilución de la concentración madre con un diluyente que contenía 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04/ 137 mM de NaCl y 20 mM Na2HP04. El anticuerpo o el control amortiguador posteriormente se administraron una vez por semana por un período de 7 semanas en la misma manera. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 1 ° día con calibradores hasta por 10 semanas o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales del Canadian Council for Animal Care (CCAC) . Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. El tratamiento con el 7BD-33-11A resultó en crecimiento del tumor disminuido en comparación al tratamiento con el control amortiguador (Figura 34) . En el día 41 (9 días antes del final del tratamiento) , el volumen medio del tumor en el grupo tratado con el 7BD-33-11A fue del 37 por ciento del control amortiguador (p=.0006, prueba t no apareada) . No hubo señales clínicas de toxicidad como se determinó por el peso corporal (Figura 35) . También en el día 41, no hubo diferencia significativa entre el peso corporal medio del grupo de tratamiento con 7BD-33-11A contra el grupo del tratamiento con control amortiguador (p=0.5656, prueba t no apareada). Además, el tratamiento con el 7BD-33-11A extendió la supervivencia en comparación al ratón del control amortiguador. Todos los ratones del control amortiguador se sacrificaron debido a los límites o puntos extremos del CCAC en el día 41 (9 días antes del final del tratamiento) mientras que todos los ratones tratados con el 7BD-33-11A siguieron vivos en el día 55 (5 días después del final del tratamiento) . Por lo tanto, el tratamiento con el 7BD-33-11A nuevamente pareció seguro y presentó eficacia y prolongó la supervivencia en el tratamiento de modelos in vivo de seno, próstata y ahora de melanoma de cáncer humano.

Ejemplo 16 Experimentos del Tumor Establecido A375 in vivo El AR7BD-33-11A también se ha probado solo y en conjunto con la dacarbacina en un modelo in vivo de melanoma establecido. Con referencia a los datos mostrados en la Figura 36, fragmentos del tumor de 1 mm3 derivados de la línea de melanoma A375 mantenida en ratones desnudos atimicos, se implantaron s.c. en los costados de los ratones de prueba (desnudo atímico de Charles River, de 14-15 semanas de edad en el Día 1 del estudio) . Los tumores se supervisaron dos veces a la semana y posteriormente diariamente conforme sus volúmenes se aproximaron a 80-120 mm3. Los animales se sortearon en grupos de tratamiento con tamaños de tumor de 62.5-144.0 mm3 y tamaños de tumor medio por grupo de 101.0-102.2 mm3. El AR7BD-3311A se administró i.p. a 20 mg/kg tres veces por semana por tres semanas y la dacarbacina se administró i.p. a 90 mg/kg (1/2 de máximamente tolerada hecha en este modelo) una vez diariamente por cinco días consecutivos. El grupo de control recibió 0.2mL/20g de peso corporal de solución salina amortiguada con fosfato, el vehículo del AR7BD-33-11A, tres veces por semana durante tres semanas . Los tratamientos comenzaron en el día 1 en grupos de diez ratones desnudos que llevaban los melanomas establecidos (-102-mm3) . Las dimensiones del tumor se midieron dos veces semanalmente hasta que los tumores lograron el volumen de punto final de 2,000 mm3. Los ratones se sacrificaron una vez que alcanzaron este punto final. El estudio se termino en el día 87. Las pruebas de Logrank determinaron que existió una diferencia significativa (P < 0.05) entre los valores del tiempo a punto final (TTE) de grupos tratados con el fármaco y los tratados con el vehículo. Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio y los ratones se les examino frecuentemente por signos evidentes de cualquier efecto lateral adverso relacionado al fármaco. El tratamiento con el vehículo produjo un TTE medio de 15.8 días. Un ratón de control no tuvo ningún tumor detectable al final del período del estudio, indicando un antecedente de un injerto de tumor no satisfactorio por grupo, y un ratón de control murió de causas no relacionadas con el tratamiento. En el grupo de control se pérdida de peso corporal media máxima insignificante (<5%) . La monoterapia con la dacarbacina produjo un TTE medio de 35.1 días que corresponden a un retraso de 122% en el crecimiento del tumor en comparación con el ratón de control. Sin embargo, este decremento fue insignificante, y ningún ratón en este grupo sobrevivió hasta el día 87. Tres ratones murieron de causas no relacionadas con el tratamiento; dos de los ratones excluidos experimentaron respuestas al tumor completas . La perdida del peso corporal medio máxima observada en este grupo fue del 5.2% en el Día 7. No se observó ningún retraso significativo en el crecimiento del tumor y en la pérdida de peso corporal media máxima (<5%) con la monoterapia con el AR7BD-33 -HA. En el grupo de tratamiento de combinación de AR7BD-33-HA/dacarbacina, se observó un TTE mediano de 39.1 días, correspondiente a un retraso significativo de 147% en el crecimiento del tumor (P < 0.01) . El tratamiento de combinación rindió 3 respuestas parciales y 2 respuestas completas, con dos de tres sobrevivientes al día 87 restantes libres del tumor al final del estudio. Un ratón murió de causas no relacionadas con el tratamiento. La pérdida de peso corporal media máxima observada en este grupo fue del 3.1% en el Día 7. No se observaron muertes tóxicas en ninguno de los grupos en el estudio. Resumiendo, aunque el tratamiento solo del AR7BD-33-11A no afectó el crecimiento del melanoma A375 en este modelo, aumentó la eficacia de la mitad de la dosis máxima tolerada de dacarbacina, produciendo actividad significativa, un aumento en la supervivencia, y un número creciente de respuestas de regresión. De manera importante, la inclusión del AR7BD-33-11A no modula la toxicidad de la dacarbacina. Los resultados sugieren que el AR7BD-33-11A puede ser usado para mejorar la eficacia de otros agentes anti-cáncer, potencialmente más tóxicos permitiendo la reducción de las dosificaciones del fármaco requeridas mientras que mantiene la respuesta al tumor y los niveles de toxicidad. Ejemplo 17 Experimentos de Tumores Preventivos BxPC-3 In Vivo Con referencia a las Figuras 37 y 38, a ratones SCID hembras de 4 a 8 semanas de edad se les implantó 5 millones de células de cáncer de melanoma humanas BxPC-3 en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. Los ratones se dividieron de manera aleatoria en 2 grupos de tratamiento de 5. Un día después de la implantación se administraron de manera intraperitoneal 20 mg/kg del anticuerpo de prueba 7BD-33-11A o el control amortiguador en un volumen de 300 µL después de la dilución de la concentración madre con un diluyente que contenía 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 20 mM de Na2HP04. El anticuerpo o control amortiguador se administraron posteriormente una vez por semana por un período de 7 semanas en la misma manera. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 7o día con calibradores hasta por 10 semanas o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales del Canadian Council for Animal Care (CCAC) . Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. El tratamiento con el 7BD-33-11A resultó en el crecimiento de tumor disminuido en comparación al tratamiento con el control amortiguador (Figura 37) . En el día 55 (5 días después del final del tratamiento) , el volumen del tumor medio en el grupo tratado con el 7BD-33-11A fue 29 por ciento del control amortiguador (p=0.0009, prueba t no apareada). No hubo signos clínicos de toxicidad como se determinó por el peso corporal (Figura 38) . También en el día 55, no hubo diferencia significativa entre el peso corporal medio del grupo tratado con el 7BD-33-11A contra el grupo de tratamiento con el control amortiguador (p=0.5368, prueba t no apareada). Además, el tratamiento con el 7BD-33-11A prolongo la supervivencia en comparación a los ratones tratados con el control amortiguador. Todos los ratones del control amortiguador se sacrificaron debido a los puntos límites del CCAC en el día 55 (5 días después del final del tratamiento) mientras que el 80 por ciento de los ratones tratados con el 7BD-33-11A siguieron vivos hasta el día 70 (20 días después del final del tratamiento) . Por lo tanto, el tratamiento con el 7BD-33-11A pareció seguro nuevamente y presentó eficacia y prolongó la supervivencia en el tratamiento de modelos in vivo de cáncer de seno, próstata, melanoma y ahora pancreático de cáncer humano . Ejemplo 18 Experimento de Tumor Preventivo In Vivo NOD SCID versus SCID Con referencia a los datos mostrados en el Figura 39, a ratones NOD SCID y SCID hembras se les implantó 5 millones de células de cáncer de seno humanas MB-23I en 100 µL de solución salina inyectada subcutáneamente en la garganta del cuello. Cada grupo de ratones se dividió de manera aleatoria en 3 grupos de tratamiento de 10. Un día después de la implantación se administraron de manera intraperitoneal 20 mg/kg del anticuerpo de prueba H460-22-1, 0.2 mg/kg del anticuerpo de prueba 7BD-33-11A o del control amortiguador en un volumen de 300 mL después de la dilución de la concentración madre con un diluyente que contuvo 2.7 mM de KCl, 1 mM de KH2P04, 137 mM de NaCl y 20 mM de Na2HP04. Los anticuerpos posteriormente se administraron una vez por la semana por un período de 7 semanas en la misma manera. El crecimiento del tumor se midió aproximadamente cada 1 ° día con calibradores hasta por 10 semanas o hasta que los animales individuales alcanzaron los puntos finales del Canadian Council for Animal Care (CCAC) . Los pesos corporales de los animales se registraron por la duración del estudio. Al final del estudio todos los animales se sacrificaron de acuerdo a las directrices del CCAC. No hubo signos clínicos de la toxicidad en todo el estudio. El peso corporal medido a intervalos semanales fue un sustituto para el bienestar y falla en prosperar. Los pesos corporales en cada grupo aumentaron con el tiempo. Como se ilustra en la Figura 39, en el día 54 (4 días después del tratamiento pasado) , en el grupo tratado con el SCID, los ratones tratados con el 7BD-33-11A y el H460-22-1 desarrollaron tumores que fueron solamente 1.9 y 3.6 por ciento respectivamente el volumen de tumor medio de los ratones tratados con el control amortiguador. Contrariamente, en el grupo tratado con el NOD SCID, otra vez en el día 54 (4 días después del tratamiento pasado) , los ratones tratados con el 7BD-33-11A tuvieron crecimiento de tumor que fue del 67 por ciento el volumen de tumor medio el de los ratones tratados con el control amortiguador. Aunque esto sigue siendo una disminución en el volumen medio del tumor en comparación al del control amortiguador en los ratones NOD SCID (p=0.0710, prueba t no apareada) , es también una disminución en la eficacia cuando se compara a aquella observada en los ratones SCID. Los ratones tratados con el H460-22-1 exhibieron un efecto similar al de los ratones SCID; el crecimiento del tumor fue de 1.4 por ciento el volumen de tumor medio de los ratones tratados con el control amortiguador. Consecuentemente, la actividad in vivo del 7BD-33-11A parece deberse en parte a la actividad del ADCC mientras que el efecto anti-tumor del H460-22-1 parece ser independiente del ADCC . La preponderancia de evidencia muestra que el 7BD-33-11A media efectos' anti-cáncer a través de la ligación de un epítope presente en el lazo o circuito 2 extracelular en el CD63. Se ha demostrado, en el ejemplo 2, que el anticuerpo 7BD-33-11A puede ser utilizado para inmunoprecipitar el antígeno cognado de las células de expresión tales como las células MDA-MB-231. Además, puede mostrarse que el anticuerpo 7BD-33-11A puede utilizarse en la detección de células y/o de tejidos que expresan una fracción antigénica del CD63 los cuales se enlazan específicamente al mismo, utilizando técnicas ilustradas mediante, pero sin limitarse a FACS, ELISA celular o IHC. De esta manera, puede mostrarse que el antígeno 7BD-33-11A inmunoprecipitado puede inhibir el enlazamiento del 7BD-33-11A a tales células o tejidos usando FACS, ELISA de células o ensayos de IHC. Además, como con el anticuerpo 7BD-33-I1A, otros anticuerpos anti-CD63 pueden utilizarse para inmunoprecipitar y aislar otras formas del antígeno CD63, y el antígeno también se puede utilizar para inhibir el enlazamiento de aquellos anticuerpos a las células o a los tejidos que expresan el antígeno usando los mismos tipos de ensayos . Ejemplo 19 Determinación de la Afinidad de Enlace del Antígeno 7BD33-11A, ARH460-22-1, y AR1A245.6 mediante Análisis BIAcore Las afinidades de enlace del antígeno 7BD33-11A, ARH460-22-1, y AR1 A245.6 se determinaron mediante análisis BIAcore. Todos los experimentos se condujeron a una razón de flujo de 5µl/min con solución salina amortiguada con Hanks como amortiguador en movimiento (20 mM de Hepes a pH 7.4, 150 mM de NaCl, 3.4 mM de EDTA, 0.005% tween 20). Primero se inmovilizó el anticuerpo de S-transferasa anti-glutationa (GST) usando un procedimiento de acoplamiento de amina estándar. En resumen, se activó el microcircuito del detector CM5 inyectando 35 µl de una mezcla que contenía N-hidroxisuccinimida 0.05M y 1-etill-3- (3-dimetilaminopropil) carbodimida 0.2M en H20 seguido por el anticuerpo anti-GST a una concentración de 30 µg/ml en 10 mM de acetato de sodio de pH de 5.0 hasta que se capturaron 50,000 a 100.000 RU. Finalmente, se inyectaron 35 µl de etanolamina-HCl l.OM de pH de 8.5 para bloquear cualquier sitio activado en la superficie del microcircuito del detector. Posteriormente se inyectaron 25 µL de GST-EC2 (polipéptido de fusión recombinante de GST con el dominio terminal C total del CD63) en 5µg/ml seguido por una inyección de 25-50 µl del anticuerpo de prueba. La regeneración de la superficie del microcircuito del detector para inyecciones subsecuentes se logro por dos pulsos de 10 µl de 20mM de glicina de pH de 2.2. Los anticuerpos de prueba se inyectaron de manera serial en una concentración que va de 12.5 a 200 nM. Como un control, cada concentración del anticuerpo se inyecto sobre una superficie donde se capturo el GST en lugar del GST-EC2. La afinidad de los diversos anticuerpos para el dominio EC2 se calculo a partir de los niveles de enlace en estado estable medidos. Para cada sensorgrama, se tomo un punto de reporte 20 segundos antes de termino de la inyección del anticuerpo (unidades de resonancia en equilibrio o Req) . Para cada concentración del anticuerpo, el Req obtenido cuando se inyecto el anticuerpo sobre el GST se sustrajo del Req obtenido cuando se inyecto el anticuerpo sobre el GST-EC2. Las constantes de asociación (KA) , calculadas a partir de la pendiente de una gráfica Req/Conc . vs Req., se muestran en la Tabla 29. Las constantes de disociación (KD) , también mostradas en la Tabla 29 se calcularon como las reciprócales de KA. Tabla 29: Afinidades del Enlace del Antígeno 7BD33-11A, ARH460-22-1, y AR1A245.6 del Análisis BIAcore * Los datos son el promedio y el SEM de al menos tres experimentos independientes.

Todas las patentes y publicaciones mencionadas en esta especificación son indicativas de los niveles de aquellos expertos en el arte a quienes la invención pertenece. Todas las patentes y publicaciones se encuentran incorporadas aquí como referencia al mismo grado que si cada publicación individual se especificara e indicara individualmente para incorporarse como referencia. Debe entenderse que mientras se ilustra una cierta forma de la invención, ésta no debe limitarse a la forma específica o al arreglo de partes aquí descritas y mostrados. Será evidente para aquellos expertos en el arte que pueden hacerse varios cambios sin salir del alcance de la invención y que la invención no debe considerarse limitada a aquello que se demuestra y se describe en la especificación. Un experto en el arte apreciará fácilmente que la presente invención se adapta bien para llevar a cabo los objetivos y para obtener las finalidades y las ventajas mencionadas, además de aquellas inherentes en esta. Cualquier oligonucleótido, péptido, polipéptido, compuestos biológicamente relacionados, métodos, procedimientos y técnicas descritas aquí son actualmente representativas de las modalidades preferidas, pretenden ser ejemplares y no se pretenden como limitantes en el alcance. Cambios en ésta y otros usos ocurrirán por aquellos expertos en el arte los cuales se encuentran incluidos dentro del espíritu de la invención y se definen por el alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque la invención se ha descrito en conexión modalidades preferidas específicas, debe entenderse que la invención como se reivindica no debe limitarse indebidamente a tales modalidades específicas. De hecho, se pretende que varias modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, las cuales obvias para aquellos expertos en el arte se encuentren dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal reacciona con el mismo epítope o epítopes de CD63 humano como el anticuerpo monoclonal obtenible a partir de una línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622.
2. Un anticuerpo monoclonal capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal reacciona con el mismo epítope o epítopes del CD63 humano como el anticuerpo monoclonal obtenible a partir de una línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4889.
3. Un anticuerpo monoclonal capaz de enlazar específicamente al CD63 humano, caracterizado porque el anticuerpo monoclonal reacciona con el mismo epítope o epítopes de CD63 humano como el anticuerpo monoclonal obtenible a partir de una línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4890.
4. Un anticuerpo monoclonal caracterizado porque reconoce el mismo epítope o epítopes que aquellos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622, línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4889, y línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4890.
5. Uso de los anticuerpos monoclonales para la reducción de la carga del tumor en cánceres humanos que expresan el antígeno CD63 que comprende: proporcionar al menos un anticuerpo monoclonal que reconoce el mismo epítope o epítopes como aquellos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622, línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4889, y línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4890; en donde el enlace de dicho epítope o epítopes es eficaz en la reducción de la carga del tumor.
6. Uso de los anticuerpos monoclonales para tratar un tumor canceroso humano que expresa el antígeno CD63 humano que comprende : proporcionar al menos un anticuerpo monoclonal que reconoce el mismo epítope o epítopes como aquellos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622, línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4889, y la línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4890; en conjunción con al menos un agente quimioterapéutico; por lo que la carga del tumor se reduce.
7. Un ensayo de enlace para determinar una presencia de células las cuales expresan un epítope o epítopes de CD63 en una muestra de tejido de primate, caracterizado porque comprende : proporcionar una muestra de tejido de dicho primate; proporcionar al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace del antígeno que reconoce el mismo epítope o epítopes como aquellos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622, línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4889, y la línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4890; el clon depositado en el ATCC con el No. de Acceso PTA-4890; poner en contacto dicho al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace del anticuerpo del mismo con dicha muestra de tejido de primate; y determinar el enlace de dicho al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace del antígeno del mismo con dicha muestra de tejido de primate; por medio lo cual se indica la presencia de dichas células en dicha muestra de tejido de primate.
8. Un ensayo de enlace para determinar una presencia de células cancerosas las cuales expresan un epítope o epítopes de CD63 en una muestra de tejido seleccionada de un tumor humano, caracterizado porque comprende: proporcionar una muestra de tejido de dicho tumor humano; proporcionar al menos un anticuerpo monoclonal o un fragmento de enlace del antígeno que reconoce el mismo epítope o epítopes como aquellos reconocidos por un anticuerpo monoclonal producido por hibridoma seleccionado del grupo que consiste de la línea celular del hibridoma H460-22-1 que tiene No. de Acceso ATCC PTA-4622, línea celular del hibridoma 1A245.6 que tiene NO. de Acceso ATCC PTA-4889 y línea celular del hibridoma 7BD-33-11A que tiene No. de Acceso ATCC PTA- 4890, el clon se depositó en el ATCC con el número de acceso PTA-4890; poner en contacto dicho al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace del antígeno del mismo con dicha muestra del tejido; y determinar el enlace de dicho al menos un anticuerpo monoclonal o fragmento de enlace del antígeno del mismo con dicha muestra de tejido; por medio de lo cual se indica la presencia de dichas células cancerosas en dicha muestra de tejido.