BR112014026755B1

BR112014026755B1 - Anticorpos contra claudin 18.2 úteis no diagnóstico de câncer

Info

Publication number: BR112014026755B1
Application number: BR112014026755-3A
Authority: BR
Inventors: Ugur Sahin; Özlen Türeci; Rita Mitnacht-Kraus; Stefan Wöli
Original assignee: Ganymed Pharmaceuticals Ag; Tron - Translationale Onkologie An Der Johannes Gutenbert-Universität Mainz Gemeinnützige Gmbh
Priority date: 2012-05-09
Filing date: 2013-05-06
Publication date: 2020-06-16
Also published as: DK2847225T3; IL235261A0; CA2869725C; RU2014149332A; CY1122676T1; ES2763965T3; LT2847225T; KR102308812B1; EP3666796A1; PT2847225T; JP2023109883A; JP2018052934A; KR102699503B1; NZ738493A; MX2014013542A; JP6878491B2; KR20150008095A; SI2847225T1; BR112014026755A2; KR20210124501A

Abstract

resumo de patente de invenção para: anticorpos contra claudin 18.2 úteis no diagnóstico de câncer. a invenção se refere a anticorpos dirigidos contra um epítopo localizado dentro da porção c-terminal de cldn18.2, o qual são úteis, por exemplo, no diagnóstico de câncer e / ou para determinar se as células cancerígenas expressam cldn18.2

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção para: “ANTICORPOS CONTRA CLAUDIN 18.2 ÚTEIS NO DIAGNÓSTICO DE CÂNCER”.

[001] Claudinas são proteínas integrais de membrana localizada dentro das junções apertadas do epitélio e endotélio. Claudinas são previstas para ter quatro segmentos transmembranares com dois laços extracelulares, e N e Cterminais localizado no citoplasma. A claudina (CLDN) da família de proteínas de transmembrana desempenha um papel crítico na manutenção das junções apertadas epiteliais e endoteliais e pode também desempenhar um papel na manutenção do citoesqueleto e na sinalização celular.

[002] A molécula de claudina 18 (CLDN 18) é uma proteína integrante transmembrana (tetraspanina) tendo quatro membranas abrangendo regiões hidrofóbicas e dois loops extracelulares (loopl abraçado por uma região hidrofóbica 1 e região hidrofóbica 2; loop2 abraçado por regiões hidrofóbicas 3 e 4). CLDN 18 existe em duas variantes de processamento diferentes, as quais são descritas no rato e no ser humano (Niimi, Mol Cell Biol 21:7380 - 90, 2001) . As variantes de junções (número de acesso Genbank: variante de junção 1(CLDN18.1): NP_057453, NM_016369, e variantes de splicing (2): 18,2 CLDN NM_001002026, NP_001002026) tem um peso molecular de aproximadamente 27,9 / 27,72 kDa. Variantes de junções CLDN18.1 e CLDN18,2 diferem na porção N-terminal que compreende a primeira região da transmembrana (TM) e loopl,

2/118 enquanto que a sequência primária de proteínas do terminal C é idêntica; veja a Figura 1.

[003] CLDN18.1 é seletivamente expressa em células de pulmão normal, enquanto que CLDN18.2 é expresso apenas em células gástricas. No entanto, a expressão de CLDN 18,2 no estômago normal é restrita às células de curta duração diferenciadas do epitélio do estômago. A expressão de CLDN 18,2 foi identificada em vários tecidos tumorais. Por exemplo, CLDN18.2 foi encontrada para ser expressa no carcinoma do pâncreas, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma da mama e tumores ENT. CLDN 18,2 é um alvo valioso para a prevenção e / ou tratamento de tumores primários, como câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão, tal como câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de ovário, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeçapescoço e câncer de vesícula biliar, e as metástases dos mesmos, nomeadamente, a metástase do câncer gástrico, tais como tumores Krukenberg, metástase peritoneal e metástase ganglionar.

[004] A expressão diferencial de CLDN18.2 entre o câncer e as células normais, a sua localização da membrana, a sua ausência, na vasta maioria dos tecidos normais correspondentes de toxicidade, a sua restrição da expressão de uma população de células dispensável no estômago, as

3/118 células gástricas diferenciadas, que podem ser repostas por células tronco alvo-negativo do estômago, torna CLDN18.2 um alvo atrativo para imunoterapia de câncer e o uso de terapias à base de anticorpos para alvejar CLDN18.2 na terapia do câncer promete um elevado nível de especificidade terapêutica.

[005] A aplicação clínica de anticorpos-alvo CLDN18.2 enfrenta o obstáculo que CLDN18.2 humano é altamente homóloga à CLDN18.1 humano. Poderia ser estabelecida com sucesso anticorpos específicos de CLDN18.2 visando o domínio extracelular N-terminal de CLDN18.2 visualizadas diferenças de sequência entre CLDN18.2 humano e CLDN18.1 humano. As tentativas para a produção de anticorpos dirigidos contra a porção N-terminal de CLDN18.2 e que possuem propriedades tornando-os clinicamente aplicável para fins de diagnóstico, por exemplo, para a detecção de expressão de CLDN18.2 em células de secções de tecido de câncer, falharam.

[006] Surpreendentemente, os presentes invençãores verificaram que os anticorpos dirigidos contra um determinado epítopo localizado dentro da porção C-terminal de CLDN18.2 cumpre os critérios para a aplicação de diagnóstico de anticorpos, em particular, para a detecção e identificação de células que expressam CLDN18.2. Surpreendentemente, esses anticorpos, embora dirigido contra uma sequência que é idêntica entre CLDN18.1 e CLDN18.2 não têm como alvo as

4/118 células do pulmão não-cancerígenas.

[007] Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, no diagnóstico de câncer e / ou para determinar se as células de câncer expressam CLDN18.2. De preferência, um câncer ou uma célula de tumor é caracterizado pela expressão da superfície de CLDN18.2. As células cancerosas que expressam CLDN18.2 são alvos adequados para terapias enfocadas CLDN18.2 como a terapia com anticorpos dirigidos contra CLDN18.2. Em uma concretização, as células de câncer expressam de modo aberrante ou CLDN18.2 expressa enquanto que as células normais correspondentes não expressam CLDN18.2 ou CLDN18.2 expressa a um nível inferior. As células que expressam CLDN18.2 são, preferencialmente, selecionados a partir do grupo que consiste em tumorigênico gástrico, do esófago, pâncreas, pulmão, ovário, cólon, hepáticos, cabeçapescoço, e as células de câncer da vesícula biliar. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção se refere a um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígenio, o qual (I) se liga a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ou EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6) e / ou (ii) se liga a claudina 18,2 (CLDN18.2), em que o referido anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno se liga a CLDN18.2 pela ligação de pelo menos um epítopo dentro

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CLDN18.2 tendo a sequência de aminoácidos TEDEVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 5) ou EVQSYPSKHDYV (SEQ ID NO: 6).

[009] Em uma concretização, a dita CLDN18.2 é membrana da superfície celular ligada a CLDN18.2. Em uma concretização, a dita CLDN18.2 está presente em células de câncer, em que as referidas células de câncer são células de câncer que expressam, de preferência, CLDN18.2. Em uma concretização, as referidas células cancerosas são selecionadas a partir do grupo que consiste em células de câncer gástrico, do esófago, pâncreas, pulmão, ovário, cólon, hepáticos, cabeça-pescoço, e as da vesícula biliar. Em uma concretização, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção não se ligam a células não-cancerosas, exceto as células epiteliais do estômago. Em uma concretização, um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno da invenção não se ligam a células do pulmão nãocancerosas. Em uma concretização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo quimérico, humano ou humanizado. Em uma concretização, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo monoclonal.

[0010] Estes e em outros aspectos da presente invenção refere-se a um anticorpo que compreende: (I) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo:

(i) uma sequência de cadeia pesada do anticorpo, de acordo com a SEQ ID NO: 7 ou sua variante,

6/118 (ii) pelo menos um, preferencialmente, dois, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia pesada do anticorpo, de acordo com a SEQ ID NO: 7 ou sua variante, ou (iii) uma sequência de CDR3, de acordo com a SEQ ID NO: 10 ou sua variante, e de preferência, compreendendo ainda uma sequência de CDR1, de acordo com a SEQ ID NO: 8 ou sua variante e / ou uma sequência de CDR2, de acordo com a SEQ ID NO: 9 ou sua variante, e / ou (II) uma cadeia leve de anticorpo, que compreende:

(i) uma sequência de cadeia leve de um anticorpo, de acordo com a SEQ ID NO: 11 ou sua variante, (ii) pelo menos uma, preferencialmente, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia leve do anticorpo, de acordo com a SEQ ID NO: 11 ou sua variante, ou (iii) uma sequência de CDR3, de acordo com a SEQ ID NO: 14 ou uma sua variante, e de preferência, que compreende ainda uma sequência de CDR1, acordo com a SEQ ID NO: 12 ou uma sua variante e / ou uma sequência de CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 13 ou sua variante.

[0011] Nos aspectos anteriores e outros da presente invenção também se refere a um anticorpo que compreende: (I), uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo:

7/118 (i) uma sequência de cadeia pesada de anticorpo de acordo com a SEQ ID NO: 15 ou sua variante, (ii) pelo menos uma, preferencialmente, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia pesada do anticorpo de acordo com a SEQ ID NO: 15 ou sua variante, ou (iii) uma sequência de CDR3, de acordo com a SEQ ID NO: 18 ou uma sua variante, e de preferência, compreende ainda uma sequência de CDR1, acordo com a SEQ ID NO: 16 ou uma sua variante e / ou uma sequência de CDR2, de acordo com a SEQ ID NO: 17 ou um sua variante, e / ou (II) uma cadeia leve de anticorpo, que compreende:

(i) uma sequência de cadeia leve de um anticorpo de acordo com a SEQ ID NO: 19 ou uma sua variante, (ii) pelo menos uma, preferencialmente, duas, mais preferencialmente, todas as três sequências de CDR de uma sequência de cadeia leve do anticorpo de acordo com a SEQ ID NO: 19 ou uma sua variante, ou (iii) uma sequência de CDR3, de acordo com a SEQ ID NO: 22 ou uma sua variante, e, de preferência, compreende ainda uma sequência de CDR1, acordo com a SEQ ID NO: 20 ou sua variante e / ou uma sequência de CDR2, de acordo com a SEQ ID NO: 21 ou sua variante.

[0012] Em concretizações preferidas, um anticorpo da

8/118 invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo que compreende uma cadeia pesada da região constante gama-1, de preferência, uma gama-1 da cadeia pesada da região constante humana e / ou compreende uma cadeia leve de anticorpo que compreende uma região constante de cadeia leve kappa.

[0013] Nos aspectos anteriores e outros, a presente invenção refere-se a um anticorpo produzido por, ou obtido a partir de uma célula de hibridoma depositada na DSMZ (Inhoffenstr 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha) e tendo uma das seguintes designações e os números de acesso:

1. muAB 43-14A, número de acesso. DSM ACC3144, depositado em 6 de outubro de 2011; ou

2. muAB 35-22A, número de acesso. DSM ACC3143, depositado em 6 de Outubro, 2011.

[0014] Os anticorpos da invenção são aqui designados por referência à designação do anticorpo e / ou por referência com o clone que produz o anticorpo, por exemplo, muAB 43-14A.

[0015] Os anticorpos preferidos adicionais são aqueles que possuem a especificidade dos anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos e, em particular, os que compreendem um antígeno ou porção de ligação de antígenos, em particular, ligação a uma região variável, idêntica ou altamente homóloga à dos anticorpos produzidos por e que podem ser obtidos a partir

9/118 dos hibridomas acima descritos. Está contemplado que os anticorpos preferidos são aqueles que possuem as regiões de CDR ou idênticas ou altamente homólogas às regiões CDR de anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos. Por altamente homólogos é contemplado que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como de 1 a 3 ou 1 ou 2 substituições podem ser feitas em cada uma das regiões CDR. Os anticorpos, particularmente, preferidos são as formas quimerizada e humanizadas dos anticorpos produzidos por, e obtido a partir dos hibridomas acima descritos.

[0016] Assim, um anticorpo da invenção pode ser selecionado a partir do grupo que consiste de (i) um anticorpo produzido por, ou obtido a partir de um clone depositado sob o número de acesso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ou DSM ACC3143 (muAB 35-22A), (ii) um anticorpo que é uma forma humanizada quimerizada ou do anticorpo em (i), (iii) um anticorpo que tem a especificidade do anticorpo em (i), e (iv) um anticorpo que compreende a porção de ligação ao antígeno ou local de ligação ao antígeno do anticorpo em (i). A porção ou local de ligação ao antígeno do anticorpo de ligação em (i) antígeno pode compreender a região variável do anticorpo em (i). Além disso englobados pela presente invenção são fragmentos de ligação ao antígeno dos anticorpos aqui descritos.

[0017]

Um anticorpo da presente invenção é, de

10/118 preferência, capaz de se ligar a CLDN18.2 na sua forma nativa, ou seja, que ocorre naturalmente ou do estado de nãodesnaturada, ou no seu estado desnaturado.

[0018] Em uma concretização, um anticorpo da presente invenção é obtido por um método que compreende a etapa de imunização de um animal com um peptídeo que compreende, de preferência, consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, ou um peptídeo equivalente imunologicamente, ou um ácido nucleico ou célula hospedeira que expressa o referido peptídeo. Preferivelmente, o referido peptídeo não compreende mais do que 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou 20 aminoácidos contíguos de CLDN18.2.

[0019] Em uma concretização, um anticorpo da presente invenção é obtido por um método que compreende a etapa de imunização de um animal com um peptídeo que compreende, de preferência, consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, ou um peptídeo equivalente imunologicamente, ou um ácido nucleico ou célula hospedeira que expressa o referido peptídeo. Preferivelmente, o referido peptídeo não compreende mais do que 110, 100, 90, 80, ou 75 aminoácidos contíguos de CLDN18.2.

[0020] Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno da invenção podem ser acoplados, isto é, de forma covalente ou não covalentemente, a outros radicais, tais como marcadores detectáveis.

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[0021] A presente invenção também se refere a uma célula, tal como uma célula de hibridoma que produz um anticorpo como aqui descrito.

[0022] As células de hibridoma são preferidas aquelas depositados na DSMZ (Inhoffenstr 7B, 38124 Braunschweig, Alemanha) e tendo uma das seguintes designações e os números de acesso:

1. muAB 43-14A, número de acesso DSM ACC3144, depositado em 6 de outubro de 2011; ou

2. muAB 35-22A, número de acesso DSM ACC3143, depositado em 6 de outubro de 2011.

[0023] A presente invenção também se refere a um peptídeo que compreende, de preferência, consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, ou um peptídeo imunologicamente equivalente. Preferivelmente, o referido peptídeo não compreende mais do que 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, ou 20 aminoácidos contíguos de CLDN18.2.

[0024] A presente invenção também se refere a um peptídeo que compreende, de preferência, consiste na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 ou SEQ ID NO: 25, ou um peptídeo imunologicamente equivalente, ou um ácido nucleico ou uma célula hospedeira que expressa o referido peptídeo. Preferivelmente, o referido peptídeo não compreende mais do que 110, 100, 90, 80, ou 75 aminoácidos contíguos de

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CLDN18.2.

[0025] A presente invenção também se refere a ácidos nucleicos que compreendem os genes ou sequências de ácidos nucleicos que codificam os anticorpos, ou partes destes, por exemplo, uma cadeia de anticorpo, ou seus fragmentos de ligação ao antígeno, ou peptídeos, como aqui descrito. De preferência, o ácido nucleico da invenção encontra-se operacionalmente ligado aos elementos de controle da expressão permitindo a expressão em células eucariotas ou procariotas. Os elementos de controle que asseguram a expressão em células eucariotas ou procariotas são bem conhecidos dos técnicos versados no assunto.

[0026] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser incluídos em um vetor, por exemplo, um plasmídeo, cosmídeo, vírus, bacteriófago, ou outro vetor utilizado, por exemplo, convencionalmente, em engenharia genética. O vetor pode compreender outros genes, tais como genes marcadores que permitem a seleção do vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controle da expressão que permitem a expressão correta das regiões de codificação em hospedeiros adequados. Tais elementos de controle são conhecidos dos técnicos versados no assunto e podem incluir um promotor, um cassete de junção, e um códon de iniciação da tradução.

[0027]

Os métodos para a construção de moléculas de

13/118 ácidos nucleicos, para a construção de vetores que compreendem as moléculas de ácido nucleico, para a introdução de vetores em células hospedeiras apropriadamente escolhidas, para causar ou atingir a expressão de moléculas de ácidos nucleicos são bem conhecidos no estado da técnica.

[0028] Um outro aspecto da presente invenção se refere a uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico ou vetor, tal como aqui divulgado.

[0029] Um outro aspecto da presente invenção se refere à detecção de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 ou determinação da quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 utilizando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 são detectadas ou a quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 é determinada através da detecção ou a determinação da quantidade de um complexo entre CLDN18.2 e um anticorpo ou fragmento do antígeno de ligação da invenção. A formação de um complexo indica a presença de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2. Tal detecção ou determinação da quantidade pode ser realizada em um número de maneiras, incluindo, mas não limitado a imunodetecção utilizando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Os métodos para a utilização de anticorpos para detectar os peptídeos ou proteínas são bem conhecidas e incluem ELISA, ensaios de ligação competitiva, e outros

14/118 semelhantes. Em geral, tais ensaios usam um fragmento de anticorpo ou anticorpo que se liga especificamente ao peptídeo ou proteína alvo diretamente ou indiretamente ligado a um marcador que fornece para a detecção, por exemplo, enzimas, marcadores radioativos indicadores fluoróforos ou partículas paramagnéticas. Os métodos da invenção permitem avaliações quantitativas e / ou qualitativas, por exemplo, avaliações absolutas e / ou relativas, ou de níveis CLDN18.2 ou de níveis de células que expressam CLDN18.2.

[0030] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para a detecção de CLDN18.2 ou determinar a quantidade de CLDN18.2 em uma amostra, compreendendo as etapas de:

(i) contatar uma amostra com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção ou um conjugado da invenção; e (ii) detectar a formação de um complexo ou a determinação da quantidade de um complexo entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2.

[0031] Em uma concretização, a amostra é uma amostra celular, ou seja, uma amostra compreendendo células, tais como células cancerosas. Nesta concretização, o complexo é, de preferência, formado entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2 expressado

15/118 pelas células na referida amostra.

[0032] Em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para determinar se as células expressam CLDN18.2, em que compreende as etapas de:

(i) contatar uma amostra celular com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção ou um conjugado da invenção e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2 expressado pelas células na referida amostra.

[0033] Em uma concretização, as células na amostra são células cancerosas. O complexo é formado, de preferência, entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2 expressado pelas células na referida amostra.

[0034] Outros aspectos da presente invenção se referem a métodos de diagnóstico ou classificação das doenças por alvejar CLDN18.2 utilizando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Estes métodos proporcionam a detecção seletiva de células que expressam CLDN18.2 diferenciando, assim, estas células a partir de células normais que não expressam CLDN18.2 ou células doentes não expressando CLDN18.2. Doenças caracterizadas por células doentes expressando CLDN18.2 são tratáveis por uma terapia

16/118 alvo de CLDN18.2, tais como terapia com anticorpos terapêuticos dirigidos contra CLDN18.2. Doenças preferidos para a terapia ou diagnóstico são aqueles em que CLDN18.2 é expressa ou expressa de modo aberrante, em doenças cancerosas, em particular, tais como as aqui descritas.

[0035] Em um aspecto, a presente invenção se refere a métodos para diagnóstico, detecção e monitoração, isto é, determinar a regressão, progressão, curso e / ou aparecimento, de uma doença de câncer compreendendo a detecção de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 e / ou determinação da quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 em uma amostra biológica isolada a partir de um paciente utilizando um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção. Tais métodos podem ser usados para detectar se um sujeito tem uma doença de câncer ou está aum risco (aumentado) de desenvolver uma doença de câncer, por exemplo, se um regime de tratamento é eficiente.

[0036] Assim, em um aspecto, a presente invenção se refere a um método para diagnóstico, detecção e monitoração do câncer, compreendendo as etapas de:

(i) contatar uma amostra biológica com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção ou um conjugado da invenção e (ii) detectar a formação de um complexo e / ou determinando a quantidade de um complexo entre o anticorpo, o

17/118 seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2.

[0037] Em uma concretização, a amostra biológica é uma amostra celular, ou seja, uma amostra compreendendo células, tais como células cancerosas. Nesta concretização, o complexo é, de preferência, formado entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2 expressado pelas células na referida amostra.

[0038] Os métodos de controle, de acordo com a invenção compreendem, de preferência, uma detecção e / ou determinação da quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 em uma primeira amostra com um primeiro ponto no tempo e em uma outra amostra em um segundo ponto no tempo, em que a regressão, progressão, curso e / ou aparecimento de uma doença de tumor pode ser determinada por comparação entre as duas amostras.

[0039] Tipicamente, o nível de CLDN18.2 ou nível de células que expressam CLDN18.2 em uma amostra biológica, é comparada com um nível de referência, em que um desvio a partir do referido nível de referência é indicativo da presença e / ou fase de um câncer em uma doença do sujeito. O nível de referência pode ser um nível, tal como determinado em uma amostra de controle (por exemplo, a partir de um tecido saudável ou sujeito, em particular, um paciente sem uma doença de câncer) ou para um nível médio de indivíduos

18/118 saudáveis. Um desvio a partir do referido nível de referência designa uma alteração significativa, tal como um aumento de pelo menos 10%, 20%, ou 30%, preferivelmente, em pelo menos 40% ou 50%, ou mesmo mais.

[0040] De preferência, a presença de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 e / ou uma quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 que é aumentada em relação a um nível de referência, por exemplo, em relação a um paciente, sem a doença do câncer, indica a presença ou o risco de (ou seja, um potencial para um desenvolvimento de) uma doença de câncer no paciente.

[0041] Uma quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 qual é diminuída em comparação com uma amostra biológica tomada mais cedo a partir de um paciente pode indicar uma regressão, um curso positivo, por exemplo, um tratamento bem sucedido, ou uma redução do risco de um aparecimento de um câncer doença em um paciente.

[0042] Uma quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 que está aumentada em comparação com uma amostra biológica tomada mais cedo a partir de um paciente pode indicar uma progressão, um claro negativo, por exemplo, um tratamento bem-sucedida, a recorrência ou o comportamento metastático, um início ou um risco para um início de uma doen de câncer no referido doente.

[0043] Em um aspecto, a presente invenção se refere a

19/118 um método para determinar se um câncer pode ser tratado por uma terapia de câncer alvo CLDN18.2 compreendendo as etapas de:

(I) contatar uma amostra que compreende células cancerosas, com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno da invenção ou um conjugado da invenção, e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2.

[0044] O complexo é formado, de preferência, entre o anticorpo, o seu fragmento de ligação ao antígeno ou o conjugado e CLDN18.2 expressado por células cancerosas em que a referida amostra.

[0045] Tais métodos podem ser usados para detectar se o paciente é adequado para uma terapia que envolve o direcionamento de células que expressam CLDN18.2, tais como terapia com anticorpos exercendo uma ou mais funções efetoras imunes, tais como anticorpos específicos CLDN18.2 citotóxica, por exemplo, anticorpos marcados com uma substância citotóxica, tal como uma toxina ou um marcador radioativo ou um mecanismo de indução de morte celular, tais como CDC ou ADCC. As doenças caracterizadas por células doentes que expressam CLDN18.2 são tratáveis pela terapia alvo CLDN18.2, tais como as doenças de câncer, em especial, as descritas aqui.

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[0046] Em uma concretização de qualquer um dos aspectos acima, a amostra, amostra celular ou amostra biológica, é a partir de um paciente com uma doença de câncer, ser suspeito de ter ou de adoecer com um câncer ou que tem um potencial para uma doença de câncer. Em uma concretização, a amostra, amostra celular ou amostra biológica, é de um tecido ou órgão, em que as células, quando o tecido ou órgão estão livre de câncer não expressando substancialmente CLDN18.2. De preferência, o referido tecido é um tecido diferente do tecido do estômago. De preferência, o referido tecido é o tecido do pulmão, esôfago, pâncreas ou da mama e do tecido ou órgão, opcionalmente, tem já sido diagnosticados como sendo afetado por uma doença do câncer, por exemplo, por inspecção visual ou testes de cultura de células do referido tecido ou órgão. Nesta concretização, a presença de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 e / ou uma quantidade de CLDN18.2 ou células que expressam CLDN18.2 que é melhorada em comparação com um nível de referência, por exemplo, em relação a um paciente, sem um tumor doença, pode indicar que o paciente é adequado para uma terapia que envolve o direcionamento de células que expressam CLDN18.2.

[0047] Em um aspecto, a invenção proporciona composições, por exemplo, composições de diagnóstico, ou kits, compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, ou uma combinação de anticorpos e / ou ou os seus

21/118 fragmentos de ligação ao antígeno aqui descrito. Tais composições de diagnóstico ou kits de teste são úteis nos métodos da invenção, tais como os métodos para diagnóstico, detecção e monitoração da invenção. Esses kits podem compreender, opcionalmente, um marcador detectável, por exemplo, enzimas, marcadores radioativos, indicadores, fluoróforos ou partículas paramagnéticas. Os kits podem incluir manuais informativos, por exemplo, manuais informando como usar reagentes para a prática de um processo aqui descrito.

[0048] Outras características e vantagens da presente invenção serão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada e reivindicações.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0049] Embora a presente invenção seja descrita em detalhe abaixo, é para ser entendido que esta invenção não está limitada a metodologias, protocolos e reagentes particulares descritos aqui, uma vez que estes podem variar. É também para ser compreendido que a terminologia utilizada aqui é para o propósito de descrever apenas concretizações particulares, e não se destina a limitar o escopo da presente invenção que será limitado apenas pelas reivindicações anexas. A menos que definido ao contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm os mesmos significados que comumente entendido por um técnico versado

22/118 no assunto.

[0050] No que se segue, os elementos da presente invenção irão ser descritos. Estes elementos são listados com concretizações específicas, no entanto, deve ser entendido que eles podem ser combinados em qualquer forma e em qualquer número para criar concretizações adicionais. As concretizações variadamente descrevem exemplos preferidos e não devem ser interpretados para limitar a presente invenção apenas a concretizações explicitamente descritas. Esta descrição deve ser entendida para suportar e englobar concretizações que se combinam as concretizações explicitamente descritas, com qualquer número dos elementos descritos e / ou preferidos. Além disso, quaisquer alterações e combinações de todos os elementos descritos neste pedido deverão ser considerados divulgados pela descrição do presente pedido, a menos que o contexto indique o contrário.

[0051] De preferência, os termos aqui utilizados são definidos conforme descrito em Um glossário multilingue de termos biotecnológicos: (Recomendações da IUPAC), HGW Leuenberger, B. Nagel, e H. Kolbl, Eds, Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Suíça.,(1995).

[0052] A prática da presente invenção irá empregar, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de química, bioquímica, biologia celular, imunologia, e técnicas de DNA recombinante que são explicadas na literatura da área

23/118 (cf, por exemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^aEdição, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989) .

[0053] Ao longo deste relatório descritivo e das reivindicações que se seguem, a menos que o contexto exija de outra forma, a palavra compreender, e variações, tais como compreende e compreendendo, serão entendidas como implicando a inclusão de um elemento declarado, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, mas não a exclusão de qualquer outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas, embora em algumas modalidades, tais outro membro, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas podem ser excluídos, ou seja, o objeto consiste na inclusão de um membro indicado, inteiro ou etapa ou grupo de membros, inteiros ou etapas. Os termos um e uma e o e, de referência, semelhante ao utilizado no contexto da descrição da invenção (especialmente, no contexto das reivindicações) devem ser entendidos para cobrir tanto o singular como o plural, a menos que de outro modo aqui indicado ou claramente contradito pelo contexto. Recitação de faixas de valores aqui destina-se apenas a servir como um método abreviado de referir individualmente cada valor separado que cai dentro da gama. A menos que de outro modo aqui indicado, cada valor individual é incorporado no relatório descritivo como se fosse aqui descrito

24/118 individualmente. Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem adequada, a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contradito pelo contexto. O uso de qualquer e todos os exemplos, ou linguagem exemplificativa (por exemplo, como), aqui fornecido é destinado apenas para ilustrar melhor a invenção e não representa uma limitação no alcance da invenção de outra forma reivindicada. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser entendido como indicando qualquer elemento não reivindicado essencial para a prática da invenção.

[0054] Vários documentos são citados ao longo do texto deste relatório descritivo. Cada um dos documentos aqui citados (incluindo todas as patentes, pedidos de patentes, publicações científicas, as especificações do fabricante, instruções, etc.), quer supra ou infra, são aqui incorporados por referência na sua totalidade. Nada aqui contido deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem o direito de antecipar esta divulgação em virtude da invenção anterior.

[0055] O termo recombinante no contexto da presente invenção significa feito por meio da engenharia genética. De preferência, um objeto recombinante, tal como uma célula recombinante, no escopo da presente invenção não é de ocorrência natural.

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[0056] O termo que ocorre naturalmente como aqui utilizado se refere ao fato de um objeto poder ser encontrado na natureza. Por exemplo, um peptídeo ou ácido nucleico que está presente em um organismo (incluindo vírus), e pode ser isolado de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificado pelo homem no laboratório é de ocorrência natural.

[0057] O termo antígeno se refere a um agente que compreende um epítopo contra o qual uma resposta imune é dirigida e / ou está a ser gerada. Preferencialmente, um antígeno no contexto da presente invenção é uma molécula que, opcionalmente, após o processamento, induz uma reação imunológica, que é, de preferência, específica para o antígeno. O termo antígeno inclui, em particular, proteínas, peptídeos, polissacarídeos, ácidos nucleicos, especialmente, RNA e DNA, e nucleotídeos.

[0058] O termo epítopo se refere a um determinante antigéênico de uma molécula, ou seja, para a parte de uma molécula que é reconhecida pelo sistema imunológico, por exemplo, que é reconhecida por um anticorpo. Por exemplo, os epítopos são os locais discretos, tridimensionais em um antígeno, que são reconhecidos pelo sistema imunológico. Os epítopos consistem normalmente em agrupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como aminoácidos ou cadeias laterais de açúcares, geralmente possuem

26/118 características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos pelo fato de a ligação para o primeiro, mas não o último é perdido na presença de solventes desnaturantes. Um epítopo de uma proteína, tal como um CLDN, de preferência, compreende uma porção contínua ou descontínua da referida proteína e é, de preferência, entre 5 e 100, de preferência, entre 5 e 50, mais preferencialmente, entre 8 e 30, mais preferencialmente, entre 10 e 25 aminoácidos de comprimento, por exemplo, o epítopo pode ser, de preferência 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 aminoácidos de comprimento.

[0059] O termo epítopo descontínuo, tal como aqui utilizado, significa um epítopo conformacional em um antígeno de proteína, que é formado a partir de pelo menos duas regiões separadas na sequência primária da proteína.

[0060] Em uma concretização preferida, um antígeno é um antígeno associado a um tumor, tal como CLDN 18,2, ou seja, um componente das células cancerosas que pode ser derivada a partir do citoplasma, a superfície da célula e do núcleo da célula, em particular, os antígenos que são produzidos, de preferência, em grande quantidade, ou intracelular como os antígenos de superfície nas células cancerosas.

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[0061] No contexto da presente invenção, os termos antígeno associado a tumor ou antígeno de tumor se referem a proteínas que estão em condições normais especificamente expressas em um número limitado de tecidos e / ou órgãos ou em fases específicas do desenvolvimento, por exemplo, o antígeno associado ao tumor pode ser sob condições normais especificamente expresso no tecido do estômago, de preferência, na mucosa gástrica, em órgãos reprodutivos, por exemplo, em testículos, em tecido trofoblástico, por exemplo, na placenta, ou em células germinativas, e são expressos ou expressos de forma aberrante em um ou mais tecidos de tumor ou câncer. Neste contexto, um número limitado significa, preferencialmente, não mais do que 3, mais preferivelmente, não mais do que 2 antígenos associados a tumores, no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, antígenos de diferenciação, de preferência, do tipo de célula antígenos de diferenciação específica, ou seja, proteínas que são expressas em condições normais, especialmente, em um determinado tipo de célula em um certo estágio de diferenciação, antígenos de câncer / testis, ou seja, proteínas que estão em condições normais especificamente expressos em testículos e, por vezes, na placenta, e antígenos específicos de linhagem de germe. No contexto da presente invenção, o antígeno associado a um tumor é, de preferência, associado à superfície celular de uma célula

28/118 cancerosa e, de preferência, não é ou apenas raramente expresso em tecidos normais. De preferência, o antígeno associado a um tumor ou a expressão aberrante do antígeno associado ao tumor identifica células cancerosas. No contexto da presente invenção, o antígeno associado a um tumor que é expresso por uma célula de câncer em um sujeito, por exemplo, um paciente que sofra de uma doença do câncer, é, de preferência, uma auto-proteína no referido indivíduo. Em concretizações preferidas, o antígeno associado a um tumor no contexto da presente invenção é expresso sob condições normais especificamente a um tecido ou órgão que é nãoessencial, ou seja, tecidos ou órgãos que quando danificadas pelo sistema imunológico não conduzem à morte do sujeito, ou em órgãos ou estruturas do corpo, os quais não são ou apenas dificilmente acessíveis pelo sistema imunológico. De preferência, a sequência de aminoácidos do antígeno associado a um tumor é idêntica entre o antígeno associado a um tumor que é expresso em tecidos normais e o antígeno associado a um tumor que é expresso em tecidos de câncer.

[0062] Exemplos de antígenos de diferenciação que, idealmente, satisfazem os critérios para os antígenos associados ao tumor como estruturas alvo em imunoterapia tumoral, em particular, na vacinação tumoral estão as proteínas da superfície celular da família claudina, tais como CLDN18.2. Claudinas são uma família de proteínas que são

29/118 os componentes mais importantes de junções apertadas, onde estabelecem a barreira paracelular que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre as células do epitélio. Claudinas são proteínas transmembranares que abrangem a membrana 4 vezes com o N-terminal e a extremidade do terminal C, ambos localizados no citoplasma.

[0063] O termo claudina 18 ou CLDN18 se refere preferencialmente, CLDN18 humano e inclui quaisquer variantes de processamento, tais como CLDN18.1 e CLDN18.2 de CLDN18. CLDN18.1 e CLDN18.2 diferem na porção N-terminal que compreende a primeira região de transmembrana (TM) e loopl, enquanto que a sequência primária de proteínas do terminal C é idêntica.

[0064] O termo CLDN18.1 se refere, preferencialmente, CLDN18.1 humana, e, em particular, para uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos, de acordo com SEQ ID NO: 1 da listagem de sequências de aminoácidos ou uma variante da referida sequência.

[0065] O termo CLDN18.2 se refere, preferencialmente, CLDN18.2 humana, e, em particular, para uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências de aminoácidos ou uma variante da referida sequência.

[0066] O termo variante, de acordo com a invenção se refere, em particular, para os mutantes, variantes de

30/118 splicing, isoformas, conformações, variantes alélicas, variantes de espécie e espécies homólogas, em particular, aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. Sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Uma espécie homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido com uma espécie diferente de origem de que uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos.

[0067] Os termos CLDN, CLDN18, CLDN18.1 e CLDN18.2 abrange todas as variantes pós-traducionalmente modificadas e variantes de conformação.

[0068] CLDN18.2 é seletivamente expressa em tecidos normais em células epiteliais diferenciadas da mucosa gástrica. CLDN18.2 é expressa em cânceres de diversas origens, e é particularmente, adequada como a estrutura alvo para o desenvolvimento de imunoterapia do câncer mediada por anticorpos, devido à sua expressão seletiva (sem expressão na toxicidade em um tecido normal correspondente) e de localização para a membrana plasmática. Por exemplo, CLDN18,2 foi encontrada para ser expressa no carcinoma do pâncreas, carcinoma esofágico, carcinoma gástrico, carcinoma bronquial, carcinoma da mama, tumores e otorrinolaringológicas. CLDN18.2 é um alvo valioso para a prevenção e / ou tratamento de

31/118 tumores primários, como câncer gástrico, câncer de esôfago, câncer pancreático, câncer de pulmão, como o câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de ovário, câncer de cólon, câncer hepático, câncer de cabeça-pescoço e câncer de vesícula biliar, e metástases dos mesmos, em especial, a metástase do câncer gástrico, tais como tumores Krukenberg, metástase peritoneal e metástase ganglionar. As células que expressam CLDN18.2 são, preferencialmente, células de câncer e são, em particular, selecionada a partir do grupo que consiste em tumorigênico gástrico, esófago, pâncreas, pulmão, ovário, cólon, hepáticos, cabeça-pescoço, e as células de câncer da vesícula biliar.

[0069] De acordo com a invenção, uma célula expressando CLDN18.2 é, de preferência, caracterizada por CLDN18.2 ligado à membrana da superfície da célula, ou seja, CLDN18.2 está associado com a superfície da célula. Além disso, de acordo com a invenção, CLDN18.2 celular é, de preferência, CLDN18.2 ligado à membrana da superfície celular. Uma célula expressando CLDN18.2 ou uma célula caracterizada pela associação de CLDN18.2 com a sua superfície da célula é, de preferência, uma célula de câncer, de preferência, uma célula de câncer a partir de um câncer aqui descrito.

[0070] O termo associado com a superfície da célula significa que um antígeno associado a um tumor, tal como

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CLDN18.2 está associado com e localizada na membrana plasmática de uma célula, em que pelo menos uma parte do antígeno associado ao tumor, está virado para o espaço extracelular a referida célula e é acessível a partir do exterior da referida célula, por exemplo, por meio de anticorpos localizados no exterior da célula. Neste contexto, uma parte é, de preferência, pelo menos, 4, de preferência, pelo menos 8, de preferência, pelo menos 12, mais preferencialmente, pelo menos 20 aminoácidos. A associação pode ser direta ou indireta. Por exemplo, a associação pode ser feita por um ou mais domínios de transmembrana, uma ou mais âncoras de lípidos, ou pela interação com qualquer outra proteína, lipídeo, sacarídeo, ou outra estrutura que podem ser encontradas no folheto exterior da membrana plasmática de uma célula. Por exemplo, um antígeno associado a um tumor associado à superfície de uma célula pode ser uma proteína transmembranar tendo uma porção extracelular, ou pode ser uma proteína associada com a superfície de uma célula através da interação com uma outra proteína, que é uma proteína transmembranar.

[0071] Superfície celular ou superfície de uma célula são usadas de acordo com o seu significado normal no estado da técnica arte, e inclui, assim, a parte externa da célula que está acessível para ligação de proteínas e outras moléculas.

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[0072] De acordo com a invenção, CLDN18.2 não é substancialmente expressa em uma célula e não é substancialmente associados com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação excede o nível de expressão e de associação em tecido não canceroso exceto estômago por não mais de 2 vezes, preferencialmente, 1, 5 vezes, e de preferência não exceder o nível de expressão e de associação em que o referido tecido não canceroso. De preferência, CLDN18.2 não é substancialmente expressa em uma célula e não é substancialmente associada com uma superfície celular se o nível de expressão ou da associação é inferior ao limite de detecção e / ou se o nível de expressão ou de associação é muito baixa para permitir a ligação por anticorpos específicos do CLDN18.2 adicionados às células.

[0073] De acordo com a invenção, CLDN18.2 é expresso em uma célula e está associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação excede o nível de expressão e de associação em tecido não canceroso exceto estômago, de preferência, por mais de duas vezes, de preferência, de 10 vezes, 100 vezes, 1000 vezes ou 10000 vezes. De preferência, CLDN18.2 é expresso em uma célula e está associada com uma superfície celular se o nível de expressão e de associação está acima do limite de detecção e / ou se o nível de expressão e de associação é suficientemente alto para permitir a ligação por anticorpos

34/118 específicos - CLDN18.2 adicionados às células.

[0074] O termo anticorpo se refere a uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes dissulfeto, e inclui qualquer molécula que compreende uma porção de ligação de antígeno dos mesmos. O termo anticorpo inclui anticorpos monoclonais e fragmentos ou derivados de anticorpos, incluindo, sem limitação, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia simples, por exemplo, scFv e fragmentos de anticorpos de ligação a antígeno, como os fragmentos Fab e Fab', também inclui todas as formas recombinantes de anticorpos, por exemplo, anticorpos expressos em procariotas, anticorpos não glicosilados, e quaisquer fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno e seus derivados como aqui descrito. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável da cadeia pesada (aqui abreviada como VH) e uma região constante de cadeia pesada. Cada cadeia leve é constituída por uma região variável da cadeia leve (aqui abreviada como VL) e uma região constante de cadeia leve. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, designadas regiões determinantes de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, designadas por regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta por três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino

35/118 para terminal carboxila na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias leves e pesadas contêm um domínio de ligação que interaje com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema do complemento clássico.

[0075] Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos humanos. O termo anticorpo humano, tal como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina da linhagem germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados pelas sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese ao acaso, ou específica do local in vitro ou por mutação somática in vivo) .

[0076] O termo anticorpo humanizado se refere a uma molécula contendo um local de ligação ao antígeno que é substancialmente derivada de uma imunoglobulina de uma espécie não-humana, em que a estrutura da imunoglobulina restantes da molécula é baseada na estrutura e / ou a sequência de uma imunoglobulina humana. O local de ligação ao antígeno pode incluir quer os domínios variáveis completos

36/118 fundidos para os domínios constantes ou apenas as regiões determinantes de complementaridade (CDR) enxertadas em regiões estruturais adequadas nos domínios variáveis. Locais de ligação de antígenos podem ser de tipo selvagem ou modificados por uma ou mais substituições de aminoácidos, por exemplo, modificada para se assemelhar mais de perto as imunoglobulinas humanas. Algumas formas de anticorpos humanizados preservar todas as sequências de CDR (por exemplo, um anticorpo humanizado do rato que contém todas as seis CDR do anticorpo de ratinho). Outras formas têm uma ou mais CDRs que estão alteradas no que diz respeito ao anticorpo original.

[0077] O termo anticorpo quimérico se refere a esses anticorpos, em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas é homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma determinada classe correspondente, enquanto que o restante do segmento da cadeia é homólogo às sequências correspondentes em um outro correspondente. Tipicamente, a região variável de ambas as cadeias leve e pesada, para mimetizar as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto que as porções constantes são homólogas de sequências de anticorpos derivados de uma outra. Uma vantagem clara de tais formas quiméricas é que a região

37/118 variável pode ser convenientemente derivado de fontes presentemente conhecidas usando células B ou hibridomas prontamente disponíveis a partir de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Enquanto a região variável tem a vantagem da facilidade de preparação e a especificidade não é afetado pela fonte, a região constante sendo humana, é menos susceptível de provocar uma resposta imune a um indivíduo humano quando os anticorpos são injectados do que a região constante a partir de uma fonte não humana. No entanto, a definição não está limitada a este exemplo particular.

[0078] Os termos de um anticorpo (ou simplesmente porção de ligação) ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo (ou simplesmente fragmento de ligação) se referem a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a capacidade de porção de ligação ao antígeno ligar-se especificamente a um antígeno. Foi demonstrado que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo de comprimento completo. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo anticorpo de uma porção de ligação ao antígeno incluem (i) os fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consistem de domínios VL, VH, CL e CH; (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreende dois fragmentos Fab ligados por uma

38/118 ponte dissulfeto na região dobradiça; (iii) fragmentos Fd consistindo dos domínios VH e CH; (iv) fragmentos Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) Fragmentos de dAb (Ward et al, (1989) Nature 341:544 - 546), que consiste de um domínio VH; (vi) as regiões determinantes de complementaridade isolada (CDR), e (vii) combinações de dois ou mais isolados CDR que podem opcionalmente ser unidas por um ligante sintético. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos, utilizando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam constituídos por uma única cadeia de proteína, em que os pares de regiões VL e VH formam moléculas monovalentes (conhecido como Fv de cadeia simples (scFv), ver por exemplo, Bird et al (1988) Science 242:423 - 426, e Huston et al (1988) Proc Natl Acad Sci USA. EUA 85:5879 5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a ser englobados no termo fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Um outro exemplo é as proteínas de fusão de imunoglobulina que se liga a um domínio que compreendem (i) um domínio de ligação de polipeptídeo que está fundido com um polipeptídeo da região de chRNAeira da imunoglobulina, (ii) uma cadeia pesada de imunoglobulina CH2 da região constante fundido com a região de dobradiça, e (iii) uma imunoglobulina CH3 de cadeia pesada da região constante fundido com a região

39/118 constante do CH2. O polipeptídeo do domínio de ligação pode ser uma região variável da cadeia pesada ou de uma região variável da cadeia leve. As proteínas de fusão de imunoglobulina que se liga ao domínio estão ainda descritas nos documentos US 2003/01 18592 e US 2003/0133939. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos utilizando técnicas convencionais conhecidas pelos técnicos versados no assunto, e os fragmentos são pesquisados quanto à utilidade do mesmo modo como são os anticorpos intactos.

[0079] Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos monoclonais. O termo anticorpo monoclonal, tal como aqui utilizado se refere a uma preparação de moléculas de anticorpos da composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta uma única especificidade de ligação e afinidade. Em uma concretização, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida a partir de um animal não humano, por exemplo, rato fundido com uma célula imortalizada.

[0080] Os anticorpos aqui descritos podem ser anticorpos recombinantes. O termo anticorpo recombinante, como aqui utilizado, inclui todos os anticorpos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como: (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um ratinho) que é transgênico ou transcromosomal com respeito para os genes de imunoglobulina

40/118 ou um hibridoma preparado a partir dele, (b) anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo, por exemplo, a partir de um transfectoma, (c) os anticorpos isolados a partir de um recombinante, biblioteca de anticorpos combinatória, e (d) os anticorpos preparados , expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem splicing das sequências de genes de imunoglobulina de outras sequências de ADN.

[0081] O termo transfectoma, tal como aqui utilizado, inclui as células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, tais como células CHO, NS / 0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais ou fungos, incluindo células de levedura.

[0082] Tal como aqui utilizado, um anticorpo heterólogo é definido em relação a um organismo transgênico produzindo tal anticorpo. Este termo se refere a um anticorpo possuindo uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácido nucleico de codificação correspondente ao encontrado em um organismo que não seja constituída, o organismo transgénico, e sendo geralmente derivadas a partir de uma excepção, o organismo transgénico espécies.

[0083] Tal como aqui utilizado, um anticorpo heterohíbrido se refere a um anticorpo possuindo cadeias leves e pesadas de diferentes origens organismais. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana

41/118 associada a uma cadeia leve de murino é um anticorpo heterohíbrido.

[0084] A invenção inclui todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tal como aqui descrito, o qual para os fins da presente invenção são englobados pelo termo anticorpo. O termo derivados de anticorpos se refere a qualquer forma modificada de um anticorpo, por exemplo, um conjugado de anticorpo e o outro agente ou o anticorpo, ou um fragmento de anticorpo.

[0085] Os anticorpos aqui descritos são, de preferência isolados. Um anticorpo isolado, tal como aqui utilizado, pretende referir-se a um anticorpo que é substancialmente isento de outros anticorpos que possuem diferentes especificidades antigênicas. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente isento de outro material celular e / ou produtos químicos.

[0086] De acordo com a presente invenção, um anticorpo é capaz de se ligar a um alvo pré-determinado, se ele tem uma afinidade significativa para o referido alvo prédeterminado e se liga à referida predeterminada alvo em ensaios convencionais. Afinidade ou afinidade de ligação é muitas vezes medido pelo constante de equilíbrio de dissociação (KD). De preferência, o termo afinidade significativa refere-se à ligação a um alvo pré-determinado, com uma constante de dissociação (KD) de 10^-5 M ou inferior,

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10^-6 M ou inferior, 10^-7 M ou inferiores, de 10^-8 M ou inferior, 10^-9 M ou inferior, 10^-10 M ou inferior, 10^-11 M ou inferior, ou 10^-12 M ou inferior.

[0087] Um anticorpo não é (substancialmente) capaz de se ligar a um alvo que não tenha qualquer afinidade significativa para o referido alvo e não se liga de forma significativa, em particular, não se liga de forma detectável, ao referido alvo, em ensaios padrão. De preferência, o anticorpo não se ligar de forma detectável para o referido alvo se estiver presente em uma concentração de até 2, de preferência de 10, mais preferivelmente, de 20, em particular de 50 ou 100 pg / mL ou superior. De preferência, um anticorpo não tem afinidade significativa para um alvo que se liga ao referido alvo com um KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 10³ vezes, 10⁴ vezes, 10⁵vezes, ou 10 ⁶ vezes maior do que a Kd para a ligação ao alvo predeterminado para o qual o anticorpo é capaz de se ligar. Por exemplo, se a KD para a ligação de um anticorpo para o alvo para o qual o anticorpo é capaz de ligação é de 10^-7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual o anticorpo não tem qualquer afinidade significativa seria de pelo menos 10^-6 M, 10^-5M, 10^-4 M, 10^-3 M, 10^-2 M, ou 10^-1 M.

[0088] Um anticorpo é específico para um alvo prédeterminado, se for capaz de se ligar ao referido alvo prédeterminado, embora não seja capaz de se ligar a outros

43/118 alvos, ou seja, não tem qualquer afinidade significativa para os outros objectivos e não se liga de forma significativa a outros alvos em ensaios convencionais. De acordo com a invenção, um anticorpo é específico para CLDN18.2 se for capaz de se ligar a CLDN18.2 mas não é (substancialmente) capaz de se ligar a outros alvos, em particular, as proteínas que não sejam proteínas claudina, de preferência proteínas de outros CLDN18, em que outros CLDN18.2 proteínas particulares. De preferência, um anticorpo é específico para CLDN18.2 se a afinidade para a ligação e a quaisquer outros alvos não exceda significativamente a afinidade para ligação a proteínas ou claudina-independentes, tais como albumina de soro bovino (BSA), caseína, albumina do soro humano (HSA) ou proteínas transmembranares não claudina, tais como as moléculas de MHC ou receptor de transferrina ou qualquer outro polipeptídeo especificado. De preferência, um anticorpo é específico para um alvo pré-determinado, se liga ao referido alvo com um Kd que é, pelo menos, 10 vezes, 100 vezes, 10³ vezes, 10⁴ vezes, 105 vezes, ou 106 vezes menor do que a KD para a ligação a um alvo para o qual não é específica. Por exemplo, se a KD para a ligação de um anticorpo para o alvo para o qual é específico é de 10-7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual o anticorpo não tem qualquer afinidade significativa seria de pelo menos 10^-6 M, 10^-5M, 10^-4 M, 10^-3 M, 10^-2 M, ou 10^-1 M.

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[0089] A ligação de um anticorpo para um alvo pode ser determinada experimentalmente utilizando qualquer modo adequado; ver, por exemplo, Berzofsky et al., antígenoanticorpo Interações Em Imunologia Fundamental, Paul, WE, Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Imunologia, WH Freeman and Company New York, NY (1992), e os métodos aqui descritos. Afinidades podem ser facilmente determinadas usando técnicas convencionais, tal como por diálise de equilíbrio; utilizando o instrumento BIAcore 2000, através de procedimentos gerais indicados pelo fabricante; por radioimunoensaio utilizando o antígeno alvo radiomarcado; ou por qualquer outro método conhecido do perito na arte. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard et al., Ann NY Acad. SCL, 51: 660 (1949). A afinidade medida de uma interacção anticorpo-antígeno particular pode variar se medida sob diferentes condições, por exemplo, a concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antígeno, por exemplo, KD, IC50, são de preferência feitos com soluções padronizadas de anticorpo e de antígeno, e um tampão normalizado.

[0090] Tal como aqui utilizado, isotipo se refere a classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes das regiões constantes da cadeia pesada. Os anticorpos, de acordo com a invenção incluem anticorpos

45/118 policlonais e anticorpos monoclonais e incluiem anticorpos IgG2a (por exemplo, IgG2a, κ, ã), IgG2b (p.ex., IgG2b, K, ã), IgG3 (por exemplo, IgG3, κ, ã) e IgM. No entanto, outros isotipos de anticorpos também estão englobados pela invenção, incluindo IgGl, igal, IgA2, IgA segregado, IgD, e IgE.

[0091] Tal como aqui utilizado, comutação de isotipo se refere ao fenômeno pelo qual a classe, ou isotipo, de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma das outras classes Ig.

[0092] O termo rearranjado como aqui utilizado se refere a uma configuração de uma cadeia pesada ou cadeia leve de imunoglobulina em que o locus de um segmento V é posicionado imediatamente adjacente a um segmento J ou D-J em uma conformação codificando essencialmente um domínio de VH ou VL completo, respectivamente. Um locus de imunoglobulina rearranjado (anticorpo) do gene podem ser identificado por comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento homologia heptâmero / nonâmero recombinado.

[0093] O termo configuração da linhagem germinativa ou não rearranjado, tal como aqui utilizado em referência a um segmento V refere-se a configuração em que o segmento V, não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.

[0094]

De acordo com a invenção, os anticorpos podem

46/118 ser derivados de espécies diferentes, incluindo, mas não limitado a camundongos, rato, coelho, cobaia e humano. Os anticorpos também incluem moléculas quiméricas, nas quais uma região constante de anticorpo derivado a partir de uma espécie, de preferência, humano, é combinado com o local de ligação do antígeno derivado de uma outra espécie. Além disso, os anticorpos humanizados incluem moléculas em que os locais de um anticorpo deriva de uma espécie não-humana de ligação ao antígeno são combinadas com as regiões constantes e de esqueleto de origem humana.

[0095] Os anticorpos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia convencional de anticorpo monoclonal, por exemplo, a técnica de hibridização de células somáticas padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora sejam preferidos os procedimentos de hibridização de células somáticas, em princípio, podem ser utilizadas outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais, por exemplo, a transformação oncogênica viral ou de linfócitos B, ou técnicas de exibição em fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpos.

[0096] O sistema de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais é o sistema murino. Produção de Hibridoma no rato é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenitos imunizados para a

47/118 fusão são conhecidos no estado da técnica. Os parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão, também são conhecidos.

[0097] Outros sistemas de animais preferidos para a preparação de hibridomas que segregam anticorpos monoclonais são o rato e o sistema de coelho (por exemplo, descrito em Spieker-POLET et al, Proc Natl Acad Sci EUA 92:9348 (1995), ver também Rossi et al., Am J. Clin Pathol 124:295 (2005)).

[0098] Ainda em outra concretização preferida, os anticorpos monoclonais humanos dirigidos contra CLDN18.2 pode ser gerado utilizando camundongos transgênicos que transportam transcromosomal ou partes do sistema imunológico humano em vez do sistema do rato. Estes camundongos transgênicos e transcromosomico incluem camundongos, conhecidos como camundongos e ratos HuMAb KM, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como camundongos transgênicos. A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos podem ser realizadas como descrito em detalhe por CD20 no documento WO 2004 035607

[0099] No entanto, uma outra estratégia para a produção de anticorpos monoclonais é isolar diretamente genes que codificam anticorpos de linfócitos que produzem anticorpos da especificidade definida; ver, por exemplo Babcock et al, 1996.; Uma estratégia inovadora para a produção de anticorpos monoclonais de linfócitos, individuais

48/118 isolados produzem anticorpos de especificidades definidas. Para mais detalhes de engenharia anticorpo recombinante ver também Welschof e Kraus, antibodes recombinantes para terapia do câncer ISBN-0-89603-918-8 e Benny KC Lo Anticorpo Engenharia ISBN 1-58829-092-1.

[00100] Para gerar anticorpos para CLDN18.2, os ratos podem ser imunizados com os peptídeos conjugados com transportadores derivados da sequência CLDN18.2, uma preparação enriquecida do antígeno CLDN18.2 expressa de forma recombinante ou os seus fragmentos e / ou células que expressam CLDN18.2 ou seus fragmentos, como descrito. Alternativamente, os ratos podem ser imunizados com DNA que codifica comprimento completo CLDN18.2 humana ou seus fragmentos. No caso em que as imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida do antígeno CLDN18.2 não resultar em anticorpos, os ratos podem ser imunizados com células que expressam CLDN18.2, por exemplo, uma linhagem de células para promover respostas imunes.

[00101] A resposta imune pode ser monitorada ao longo do curso do protocolo de imunização com as amostras de plasma e de soro a ser obtido pela veia da cauda ou hemorragias retro-orbital. Os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-CLDN18.2 pode ser utilizado para fusões. Ratos pode ser impulsionado por via intraperitoneal ou por via intravenosa com células expressando CLDN18.2 3-5 dias

49/118 antes do sacrifício e a remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas secretoras de anticorpos específicos.

[00102] Para gerar hibridomas que produzem anticorpos monoclonais para CLDN18.2, células de nódulos linfáticos, baço ou medula óssea obtidas a partir de camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos com uma linhagem celular imortalizada apropriada, tal como uma linha de células de mieloma de ratinho. Os hibridomas resultantes podem então ser rastreados para a produção de anticorpos específicos para o antígeno. Poços individuais podem depois ser rastreados por ELISA para anticorpos que segregam hibridomas. Por imunofluorescência e análise de FACS utilizando células expressando CLDN18.2, anticorpos com especificidade para CLDN18.2 pode ser identificado. O anticorpo que segregam hibridomas pode ser novamente semeado, peneirados novamente e se ainda positivo para os anticorpos monoclonais anti-CLDN18.2 podem ser subclonados através de diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivadas in vitro para gerar o anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.

[00103] Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira utilizando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes, tal como são bem conhecidos no estado da técnica (Morrison, S. (1985)

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Science 229: 1202) .

[00104] Por exemplo, em uma concretização, o gene (s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpos pode ser ligados em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica, tal como utilizado pelo sistema de expressão do gene de GS divulgado nos documentos WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338 841 ou de outros sistemas de expressão bem conhecidos no estado da técnica arte. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpos clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, NS / 0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas, como as células derivadas de plantas, fúngica ou de leveduras. O método utilizado para introduzir esses genes podem ser os métodos descritos no estado da técnica, tais como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes do anticorpo nas células hospedeiras, as células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem, em seguida, ser amplificados para o seu nível de expressão e supeu escalado para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e / ou das células.

[00105] Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressão,

51/118 incluindo células procarióticas, tais como microorganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais transgênicos, tais como em leite de ovelhas e coelhos ou em ovos de galinhas, ou em plantas transgênicas; por exemplo, ver Verma, R., et al. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165 - 181; Pollock et al. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., et al. (1999) Biol. Chem. 380:825 - 839.

[00106] Os anticorpos quiméricos são anticorpos, as diferentes partes de que são derivadas de diferentes espécies animais, tais como aqueles que possuem uma região variável derivada de um anticorpo murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Quimerização de anticorpos é conseguido pela união das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpos de murino com a região constante da cadeia pesada e leve humana (por exemplo, conforme descrito por Kraus et al., Em Methods in Molecular Biology, séries de anticorpos recombinantes para câncer ISBN 0-89603-918-8terapia). Em uma concretização preferida, os anticorpos quiméricos são produzidos unindo cadeia leve kapa-região constante de humanos para a região variável da cadeia leve de murino. Em uma concretização também preferida, os anticorpos quiméricos podem ser produzidos unindo cadeia leve lambdaregião constante de humanos para a região variável da cadeia leve de murino. As regiões constantes da cadeia pesada

52/118 preferidas para a produção de anticorpos quiméricos são IgGl, IgG3 e IgG4. Outras regiões constantes de cadeia pesada preferidas para a geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM.

[00107] Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas regiões determinantes de complementaridade de seis cadeias pesadas e leves (CDR). Por esta razão, as sequências de aminoácidos na CDR são mais diversas entre anticorpos individuais do que as sequências das CDRs de fora. como sequências CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitem as propriedades de anticorpos que ocorrem naturalmente específicos através da construção de vetores de expressão que incluem sequências de CDR do anticorpo que ocorre naturalmente enxertado específico sequências estruturais de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. et al (1998) Nature 332:323 - 327; Jones, P. et al (1986) Nature 321: 522-525; and Queen, C. et al.(1989) Proc Natl Acad Sci EUA 86: 10029-10033). Essas sequências de enquadramento podem ser obtidas a partir de bases de dados Publicas de DNA que incluem sequências de genes de anticorpos germinativas. Essas seqüências germinativas será diferente de sequências de genes de anticorpos maduros, porque eles não irão incluir os genes

53/118 variáveis completamente montados, que são formados por V (D) J durante a ligação a maturação de células B. Sequências de genes da linhagem germinativa irá também diferir das sequências de um anticorpo de elevada afinidade reportório secundário em posições individuais de forma uniforme em toda a região variável. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente raras na parte amino-terminal da região de estrutura 1 e da porção terminal carboxi da região de estrutura 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário para se obter a sequência de DNA inteira de um anticorpo particular de modo a recriar um anticorpo recombinante intacto possuindo propriedades de ligação semelhantes às do anticorpo original (ver documento WO 99/45962) . Sequências de cadeia leve e pesada parciais que abrangem as regiões CDR são geralmente suficientes para esta finalidade. A sequência parcial é utilizada para determinar qual a variável e segmentos do gene da linhagem germinal que unem contribuiu para os genes variáveis de anticorpo recombinado. A sequência da linhagem germinativa é então utilizada para encher, em porções das regiões variáveis ausente. Sequências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar as sequências em falta, as sequências de cDNA

54/118 clonadas podem ser combinadas com os oligonucleotídeos sintéticos de ligação ou amplificação por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de curtas, que se sobrepõem, oligonucleotídeos e combinado através de amplificação por PCR para criar um clone da região variável totalmente sintético. Este processo tem certas vantagens, como a eliminação ou inclusão ou particulares sítios de restrição, ou otimização de códons específicos.

[00108] As sequências de nucleotídos dos transcritos da cadeia pesada e leve a partir de hibridomas podem ser utilizadas para conceber um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar sequências sintéticas V com capacidade de codificação de aminoácidos idênticas às sequências naturais. As sequências das cadeias pesada e kappa sintéticos podem diferir das sequências naturais de três formas: cadeias de bases de nucleotídeos repetidos são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeo e amplificação por PCR; sítios de iniciação de tradução ideal são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol Chem 266:19867 - 19870); e locais Hind II! são concebidos a montante dos locais de iniciação da tradução.

[00109] Para ambas as regiões variáveis da cadeia pesada e leve, a codificação correspondente otimizado e não de codificação, sequências de cadeia são divididos em 30 - 50

55/118 nucleotídeos, aproximadamente, no ponto central do oligonucleotídeo não codificante correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em conjuntos duplos sobrepostos irrecuperáveis que abrangem segmentos de 150 - 400 nucleotídeos. A mistura é então usada como moldes para produzir produtos de amplificação de PCR de 150 - 400 nucleotídeos. Normalmente, um único conjunto de oligonucleotídeo de região variável será dividido em dois conjuntos que são amplificados separadamente para gerar dois produtos sobrepostos de PCR. Estes produtos sobrepostos são então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Também pode ser desejável incluir um fragmento de sobreposição da cadeia pesada ou leve constante na região de amplificação por PCR para gerar fragmentos que podem ser facilmente clonados nas construções de vetor de expressão.

[00110] As regiões variáveis da cadeia pesada e leve reconstruído quimerizado ou humanizados são, então, combinados com o promotor clonado, líder, a iniciação da tradução, a região constante, 3 ' não traduzida, poliadenilação, e sequências de terminação de transcrição para formar as construções de expressão do vetor. As construções de expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinadas em um único vetor, co-transfectadas, serialmente transfectadas, ou separadamente transfectadas em células

56/118 hospedeiras que são então fundidas para formar uma célula hospedeira que expressa ambas as cadeias. Os plasmídeos para a utilização na construção de vetores de expressão para IgGK humano são descritos. Os plasmídeos podem ser construídos, de modo a que o PCR amplificado V kappa e pesada V sequências de cDNA de cadeia leve podem ser utilizadas para reconstruir minigenes completos de cadeia pesada e leve. Estes plasmídeos podem ser usadas para expressar completamente humano, ou quimérico IgGl, IgG4 ou Kappa, anticorpos Kappa. Plasmídeos similares podem ser construídos para a expressão de outros isotipos da cadeia pesada, ou para a expressão de anticorpos compreendendo cadeias leves lambda.

[00111] Assim, em um outro aspecto da invenção, as características estruturais dos anticorpos anti-CLDN18.2 aqui descritas, são utilizados para criar anticorpos anti-CLDN18.2 humanizados estruturalmente afins que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tais como ligação para CLDN18.2. Mais especificamente, uma ou mais regiões CDR de anticorpos monoclonais de ratinho podem ser combinadas de forma recombinante com conhecidas regiões de estrutura humanas e CDRs para criar de forma recombinante, engenharia de anticorpos anti-CLDN18.2 adicionais, humanizados.

[00112] A capacidade de um anticorpo para se ligar a CLDN18.2 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação

57/118 convencionais, por exemplo, ELISA, Western Blot, imunofluorescência e análise por citometria de fluxo. ELISA pode ser utilizado para demonstrar a presença de anticorpos no soro de camundongos imunizados ou a ligação de anticorpos monoclonais para proteínas ou peptídeos CLDN18.2. Os peptídeos ou proteínas usados para a imunização podem ser utilizados para determinar a especificidade dos sobrenadantes de hibridoma ou analisar os títulos séricos.

[00113] A fim de demonstrar a presença de anticorpos em soros de camundongos imunizados ou de ligação de anticorpos monoclonais para as células vivas, a citometria de fluxo pode ser usada. As linhagens celulares que expressam naturalmente ou após a transfecção antígenos e controles negativos falta a expressão do antígeno (cultivadas sob condições de crescimento normais) pode ser misturado com várias concentrações de anticorpos monoclonais no sobrenadante de hibridoma ou em PBS contendo 1% de FBS, e pode ser incubado a 4 ° C durante 30 min. Após a lavagem, o anticorpo IgG anti-Alexa647 ou APC- marcado pode ligar-se ao anticorpo monoclonal ligado ao antígeno de acordo com as mesmas condições que a coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por citometria de fluxo com um instrumento FACS utilizando luz e propriedades de dispersão lateral, a porta em células vivas individuais. De modo a distinguir os anticorpos monoclonais específicos para o

58/118 antígeno de ligantes não específicos de uma única medição, o método de co-transfecção pode ser empregue. As células transfectadas transitoriamente com plasmídeos que codificam o antígeno e um marcador fluorescente podem ser coradas, como descrito acima. As células transfectadas pode ser detectada em um canal de fluorescência diferente do que as células marcadas com o anticorpo. Como a maioria das células transfectadas expressam ambos os transgenes, de antígeno Anticorpos monoclonais específicos ligam-se, preferencialmente, a células que expressam o marcador de fluorescência, enquanto que os anticorpos não específicos se ligam em uma proporção comparável de células não transfectadas. Um ensaio alternativo utilizando microscopia de fluorescência pode ser utilizado para além ou em vez do ensaio de citometria de fluxo. As células podem ser coradas exactamente como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência.

[00114] A fim de demonstrar a presença de anticorpos anti-CLDN18.2 em soros de camundongos imunizados ou de ligação de anticorpos monoclonais a células vivas que expressam CLDN18.2, análise de microscopia de imunofluorescência pode ser utilizada. Por exemplo, linhagens celulares que expressam quer espontaneamente ou após CLDN18.2 transfecção e controles negativos faltando expressão CLDN18.2 são crescidas em lâminas de câmara de crescimento, sob

59/118 condições padrão em meio F12 de DMEM, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 2 mM de L -glutamine, 100 UI / ml de penicilina e 100 pl de estreptomicina. As células podem então ser fixadas com metanol ou paraformaldeído ou deixadas sem tratamento. As células podem então reagir com os anticorpos monoclonais contra CLDN18.2 durante 30 min. a 25 ° C. Após a lavagem, as células podem reagir com um anticorpo marcado anti-rato IgG marcado com Alexa555 secundário (Molecular Probes), sob as mesmas condições. As células podem então ser examinadas por microscopia de fluorescência.

[00115] Os níveis totais de CLDN18.2 em células pode ser observado quando as células são fixadas metanol ou paraformaldeído fixadas e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e não-permeabilizadas, células fixas paraformaldeído superfície localização de CLDN18.2 pode ser examinado. Adicionalmente segmentação de CLDN18.2 de junções apertadas pode ser analisada por co-coloração com marcadores de junção apertados tais como ZO-1. Além disso, os efeitos de ligação do anticorpo e localização CLDN18.2 dentro da membrana da célula pode ser examinado.

[00116] Anti-IgG CLDN18.2 pode ser adicionalmente testada quanto à reatividade com o antígeno CLDN18.2 por Western Blotting. Resumidamente, os extratos celulares a partir de células que expressam CLDN18.2 e controles negativos adequados, podem ser preparados e submetidos a

60/118 eletroforese dodecil sulfato de sódio (SDS) em gel de poliacrilamida. Após a eletroforese, os antígenos separados irão ser transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. IgG de ligação pode ser detectada usando peroxidase anti-IgG de ratinho e reveladas com substrato ECL.

[00117] Anti-IgG de ratinho CLDN18.2 pode ser adicionalmente testada quanto à reatividade com o antígeno CLDN18.2 por imunohistoquímica de uma maneira bem conhecida por um técnico versado no assunto, por exemplo, utilizando acetona ou paraformaldeído fixo criossecções ou cortes de tecido embebidos em parafina fixados com paraformaldeído a partir de tecido não-câncer ou amostras de tecido obtidas a partir de pacientes com câncer durante procedimentos cirúrgicos de rotina ou a partir de ratos portadores de tumores xenoenxertados inoculados com linhas de células que expressam espontaneamente ou após a transfecção com CLDN18.2. Para a imunocoloração, anticorpos reativos para CLDN18.2 pode ser incubada seguido de peroxidase de rábano de cabra antirato conjugado ou anticorpos anti-coelho de cabra de acordo com as instruções do fabricantes.

[00118] Uma metodologia particularmente preferida para ensaiar CLDN18.2 nos métodos da invenção é imunohistoquímica ou IHC. A imuno-histoquímica ou IHC se refere ao processo de detecção de antígenos (por exemplo, proteínas) nas células de

61/118 um corte de tecido, por exemplo, as células dos tecidos mencionados aqui. A coloração imunohistoquímica é amplamente utilizado no diagnóstico de células anormais, tais como as encontradas em tumores cancerosos. A visualização de uma interacção anticorpo-antígeno pode ser realizada em um número de maneiras. No caso mais comum, o anticorpo é conjugado com uma enzima, tal como, peroxidase, que pode catalisar uma reação produtora de cor. Alternativamente, o anticorpo pode também ser marcado com um fluoróforo, tais como fluoresceína ou rodamina.

[00119] Preparação da amostra é crítica para manter a morfologia celular, a arquitetura do tecido e a antigenicidade de epítopos alvo. Isso requer coleta de tecido adequado, fixação e corte. Paraformaldeído é geralmente usado com a fixação. Dependendo da finalidade e a espessura da amostra experimental, (cerca de 4-40 μπι) secções finas são cortadas a partir do tecido de interesse, ou se o tecido não é muito espesso e é penetrável é usado todo. O corte é normalmente realizado através da utilização de um micrótomo, e as fatias são montadas em lâminas.

[00120] A amostra pode requerer etapas adicionais para os epítopos disponíveis para a ligação do anticorpo, incluindo desparafinização e recuperação de antígenos. Os detergentes como o Triton X-100 são geralmente utilizados em imuno-histoquímica para reduzir tensão superficial,

62/118 permitindo que menos do reagente a ser utilizado para conseguir uma melhor e uma cobertura mais uniforme da amostra.

[00121] O método direto de coloração imunohistoquímica utiliza um anticorpo marcado, que se liga directamente ao antígeno a ser coradas para. O método indirecto de coloração imuno-histoquímica que é mais comum utiliza um anticorpo contra o antígeno a ser investigado para, e um segundo, marcado, o anticorpo contra o primeiro.

[00122] Para reduzir a coloração de fundo na IHC, as amostras são incubadas com um tampão que bloqueia os locais reativos para a qual os anticorpos primários ou secundários podem ligar-se de outra forma. Os anticorpos primários são criados contra um antígeno de interesse e são geralmente nãoconjugada (não marcado), enquanto que os anticorpos secundários são criados contra as imunoglobulinas da espécie de anticorpo primário. O anticorpo secundário é normalmente conjugado com uma molécula de ligação, tal como biotina, que recruta então moléculas repórter, ou o anticorpo secundário é ligado directamente à própria molécula repórter. Tampões de bloqueio comuns incluem soro normal, leite em pó não gordo, a BSA ou a gelatina, e os amortecedores de bloqueio comerciais.

[00123] Moléculas repórter variam com base na natureza do método de detecção, e os métodos mais populares de detecção são com detecção cromogénica e fluorescência e

63/118 enzimática mediada por fluoróforo, respectivamente. Com repórteres cromogénicos, uma etiqueta de enzima reage com um substrato para produzir um produto intensamente coloridos que podem ser analisadas com um microscópio de luz comum. Embora a lista de substratos de enzima é grande, a fosfatase alcalina (AP) e peroxidase de rábano (HRP) são as duas enzimas utilizadas mais amplamente como marcadores para a detecção da proteína. Uma variedade de substratos cromogénicos, fluorogênicos e quimioluminescentes está disponível para o uso com qualquer uma das enzimas, incluindo DAB ou BCIP / NBT. Repórteres fluorescentes são pequenas moléculas orgânicas utilizadas para a detecção de IHC. Para os métodos de detecção cromogênicas e fluorescentes, análise densitométrica do sinal pode fornecer dados semiquantitativos e totalmente, respectivamente, para correlacionar o nível de sinal de repórter para o nível de expressão da proteína ou de localização.

[00124] Após a coloração imunohistoquímica do antígeno alvo, uma segunda coloração é muitas vezes aplicada para proporcionar contraste que ajuda a coloração principal se destacar. Muitas destas colorações mostram especificidade para compartimentos celulares discretos ou antígenos, enquanto que os outros irão colorir toda a célula. Ambos os corantes cromogênicos e fluorescentes estão disponíveis para a IHQ para proporcionar uma vasta faixa de reagentes para se

64/118 ajustar cada desenho experimental. Hematoxilina, coloração Hoechst e DAPI são comumente usados.

[00125] Mapeamento de epítopos reconhecidos por anticorpos pode ser efetuada, tal como descrito em detalhe em Mapeamento de Epítopos Protocols (Methods in Molecular Biology) por Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 e em Epitope Mapping: A Practical Approach Practical Approach Series, 248 por Olwyn MR Westwood, Frank C. Hay.

[00126] A expressão funções efetoras imunológicas, no contexto da presente invenção inclui todas as funções mediadas por componentes do sistema imunológico que resultam na inibição do crescimento do tumor e / ou a inibição do desenvolvimento do tumor, incluindo a inibição da disseminação de tumores e metástases. Preferencialmente, as funções efetoras imunológicas resultam na morte de células cancerosas. Preferencialmente, as funções efetoras imunológicas no contexto da presente invenção são as funções efetoras mediadas por anticorpos. Tais funções compreendem citotoxicidade dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC), fagocitose mediada por células dependente de anticorpos (ADCP), indução de apoptose nas células que transportam o antígeno associado a um tumor, por exemplo, por ligação do anticorpo a um antígeno de superfície, a inibição da transdução de sinal mediada por CD40L, por exemplo, por

65/118 ligação do anticorpo para o receptor CD40 ou CD40 (CD40L), e / ou a inibição da proliferação das células que transportam o antígeno associado a um tumor, de preferência de ADCC e / ou CDC. Assim, os anticorpos que são capazes de mediar uma ou mais funções efetoras imunes são, de preferência, capazes de mediar a morte de células através da indução de lise, a lise mediada por ADCC, a apoptose, a adesão homotípica, e / ou fagocitose mediada por CDC, de preferência, através da indução de CDC mediada lise e / ou a lise mediada por ADCC. Os anticorpos também podem exercer um efeito simplesmente pela ligação a antígenos associados a tumores, na superfície de uma célula cancerosa. Por exemplo, os anticorpos podem bloquear a função do antígeno associado a um tumor ou induzir a apoptose ligando-se apenas para o antígeno associado a um tumor na superfície de uma célula cancerosa.

[00127] ADCC descreve a capacidade de matar células de células efetoras, em particular, linfócitos, o que requer, de preferência, a célula alvo a ser marcada por um anticorpo. ADCC preferencialmente, ocorre quando os anticorpos se ligam a antígenos em células de câncer e os domínios de Fe de anticorpos envolvem receptores de Fc (FcR) na superfície de células efetoras imunológicas. Várias famílias de receptores Fe foram identificadas, e populações de células específicas caracteristicamente expressam definido receptores Fc. ADCC pode ser visto como um mecanismo para induzir diretamente um

66/118 grau variável de destruição do tumor imediato que conduz também a apresentação de antígeno e a indução de respostas de células T dirigida ao tumor. De um modo preferido, in vivo, a indução de ADCC irá levar a respostas de células T dirigida ao tumor e outras respostas de anticorpos derivados do hospedeiro.

[00128] CDC é outro método de matar células que pode ser dirigida por anticorpos. IgM é o isótopo mais eficaz para a ativação do complemento. IgGl e IgG3 também são muito eficazes na direcção CDC por meio da via clássica de ativação do complemento. De preferência, nesta cascata, a formação de complexos antígeno-anticorpo resulta na desvelamento de sítios de ligação múltipla CLQ em estreita proximidade nos domínios CH2 de participar moléculas de anticorpos, tais como as moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl). De preferência, estes locais de ligação de Clq desencobertos convertem a interação Clq-IgG anteriormente baixa afinidade a um de elevada avidez, o que desencadeia uma cascata de acontecimentos que envolvem uma série de outras proteínas do complemento e leva à liberação proteolítica dos quimiotáticos de célula efetora / agentes de ativação C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque da membrana, o que cria poros na membrana da célula que facilitam a passagem livre de água e de solutos para dentro e para fora da célula e pode

67/118 conduzir a apoptose.

[00129] O termo células efetoras imunológicas, no contexto da presente invenção se refere a células que exercem funções efetoras durante uma reação imune. Por exemplo, tais células secretam citocinas e / ou quimiocinas, matam micróbios, secretam anticorpos, reconhecem as células cancerosas, e opcionalmente, eliminam essas células. Por exemplo, as células efetoras imunes incluem as células T (células T citotóxicas, células T auxiliares, as células T infiltrantes de tumor), as células-B, células assassinas naturais, neutrófilos, macrófagos e células dendríticas.

[00130] Um ácido nucleico está, de acordo com a invenção, de preferência, o ácido desoxirribonucleico (DNA) ou de ácido ribonucleico (RNA), mais preferencialmente, RNA, mais preferencialmente, em RNA transcrito in vitro (RNA IVT). Os ácidos nucleicos incluem, a de acordo com a invenção, o ADN genómico, ADNc, RNAm, preparadas por via recombinante e moléculas quimicamente sintetizadas. Um ácido nucleico pode, de acordo com a invenção estar na forma de uma molécula que é de cadeia simples ou dupla e lineares ou covalentemente fechadas para formar um círculo. Um ácido nucleico pode ser utilizado para introdução, isto é, a transfecção de células, por exemplo, sob a forma de RNA, que podem ser preparados por transcrição in vitro a partir de um molde de DNA. O RNA pode ainda ser modificado antes da aplicação através da

68/118 estabilização de sequências, capping e poliadenilação.

[00131] Os ácidos nucleicos aqui descritos podem ser incluídos em um vetor. O termo vetor, tal como aqui utilizado, inclui quaisquer vetores conhecidos dos técnicos versados no assunto, incluindo vetores de plasmídeo, vetores cosmídicos, vetores de fagos, tais como fagos lambda, os vetores virais, tais como vetores de adenovírus ou de baculovírus, ou vetores de cromossomas artificiais tal como cromossomas artificiais bacterianos (BAC), cromossomas artificiais de levedura (YAC), cromossomas artificiais ou de PI (PAC). Os referidos vetores de expressão incluem, bem como vetores de clonagem. Os vetores de expressão incluem plasmídeos, bem como vetores virais e, geralmente, contêm uma sequência de codificação desejada e sequências de DNA necessárias para a expressão adequada da sequência de codificação operativamente ligada em um organismo hospedeiro particular (por exemplo, bactérias, leveduras, plantas, insectos, ou de mamífero) ou em sistemas de expressão in vitro. Os vetores de clonagem são geralmente utilizados para a engenharia e amplificar um determinado fragmento de ADN desejado e podem não ter sequências funcionais necessários para a expressão dos fragmentos de ADN desejados.

[00132] Como o vetor para a expressão de um anticorpo, ou de um tipo de vetor, em que as cadeias de anticorpo estão presentes em diferentes vetores ou um tipo de vetor, em que

69/118 as cadeias de anticorpo estão presentes no mesmo vetor pode ser utilizado.

[00133] Tal como aqui utilizado, o termo RNA significa uma molécula que compreende pelo menos um resíduo de ribonucleotídeo. Por ribonucleotídeo entende-se um nucleotídeo com um grupo hidroxila na posição 2 ' de um radical-beta-D-ribo-furanose. O termo inclui RNA de cadeia dupla, RNA de cadeia simples, RNA isolado, tal como RNA parcialmente purificado, RNA, essencialmente puro, RNA sintético, RNA produzido por via recombinante, assim como, RNA alterado que difere do RNA que ocorre naturalmente pela adição, deleção, substituição e / ou alteração de um ou mais nucleotídeos. Tais modificações podem incluir a adição de material não-nucleotídeo, tal como para a extremidade (s) de um RNA ou internamente, por exemplo, em um ou mais nucleotídeos do RNA. Nucleotídeos de moléculas de RNA pode ainda compreender nucleotídeos não convencionais, tais como os nucleotídeos de ocorrência não natural ou nucleotídeos sintetizados quimicamente ou desoxinucleotídeos. Estes RNAs alterados podem ser referidos como análogos ou análogos de RNA de ocorrência natural.

[00134] De acordo com a presente invenção, o termo RNA inclui, e, de preferência, se refere a mRNA, que significa RNA mensageiro e se refere a uma transcrição, que pode ser produzido usando como molde de DNA e codifica um

70/118 peptídeo ou proteína. RNAm compreende tipicamente região não traduzida, uma proteína ou um peptídeo e uma região de codificação 3' de uma região não traduzida 5. RNAm tem uma meia-vida limitado nas células e in vitro.

[00135] No contexto da presente invenção, o termo transcrição se refere a um processo, em que o código genético em uma sequência de DNA é transcrito dentro do RNA.

[00136] Os ácidos nucleicos descritos, de acordo com a invenção têm sido, de preferência, isolado. O termo ácido nucleico isolado significa, de acordo com a invenção, que o ácido nucleico foi (i) amplificado in vitro, por exemplo, por reação em cadeia da polimerase (PCR), (ii) produzido recombinantemente através de clonagem, (iii) purificado, por exemplo, pela clivagem e fracionamento por eletroforese em gel, ou (iv) sintetizado, por exemplo, por síntese química. Um ácido nucleico isolado é um ácido nucleico que está disponível para a manipulação por meio de técnicas de DNA recombinante.

[00137] Os ácidos nucleicos podem, de acordo com a invenção, estar presente sozinho ou em combinação com outros ácidos nucleicos, os quais pode ser homóloga ou heteróloga. Em concretizações preferidas, um ácido nucleico que está funcionalmente ligado a sequências de controle de expressão, pode ser homóloga ou heteróloga em relação ao referido ácido nucleico. O termo homólogo significa que os ácidos

71/118 nucleicos são também funcionalmente ligados naturalmente e o termo heterólogo indica que os ácidos nucleicos não são funcionalmente ligados naturalmente.

[00138] Um ácido nucleico e uma sequência de controle de expressão estão funcionalmente ligados uns aos outros, se eles estão covalentemente ligados um ao outro, de tal maneira que a expressão ou a transcrição do referido ácido nucleico está sob o controle ou sob a influência da referida sequência de controle de expressão. Se o ácido nucleico é para ser traduzido em uma proteína funcional, em seguida, com uma sequência de controle da expressão funcionalmente ligado a uma sequência de codificação, a indução do referido resultados de sequências de controle de expressão na transcrição do referido ácido nucleico, sem causar uma mudança de enquadramento na sequência de codificação ou a referida sequência de codificação de não ser capaz de ser traduzida para a proteína ou peptídeo desejado.

[00139] O termo sequência de controle de expressão ou elemento de controle de expressão compreende, de acordo com a invenção, os promotores, ribossomas, locais potenciadores e outros elementos de controle que regulam a transcrição de um gene ou de tradução de um RNAm de ligação. Em concretizações particulares da invenção, as sequências de controle de expressão pode ser regulada. A estrutura exata das sequências de controle de expressão podem variar em

72/118 função do tipo de espécies ou de células, mas em geral compreende 5'-transcrita e 5'-e sequências 3 'não traduzidas que são envolvidas na iniciação da transcrição e tradução, respectivamente, tais como TATA BOX, sequência capping; Sequência CAAT, e semelhantes. Mais especificamente, as sequências de controle de expressão não transcrita 5' compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para controle da transcrição do ácido nucleico funcionalmente ligadas. As sequências de controle de expressão podem também incluir sequências potenciadoras ou sequências ativadoras a montante.

[00140] De acordo com a invenção, o termo promotor ou região de promotor se refere a uma sequência de ácido nucleico, que está localizado a montante (5') com a sequência de ácido nucleico a ser expressa e controla a expressão da sequência de fornecimento de um reconhecimento e local de ligação para o RNA-polimerase. A região promotora pode incluir ainda reconhecimento e sítios de ligação para outros fatores que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser indutível e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser constitutivo se a transcrição não é controlada por um agente indutor. Um gene que está sob o controlo de um promotor induzível não é expresso, ou

73/118 expressa apenas em pequena medida, se um agente indutor está ausente. Na presença do agente de indução do gene é ligado ou o nível de transcrição é aumentada. Este é mediada, em geral, por meio da ligação de um factor de transcrição específico.

[00141] Os promotores que são preferidos de acordo com o invenção incluem os promotores de polimerase SP6, T3 e T7, U6 Promotor humano RA, o promotor de CMV, e promotores híbridos artificiais dos mesmos (por exemplo, CMV), onde uma ou mais partes são fundidas com uma parte ou partes de promotores dos genes de outras proteínas celulares, tais como, por exemplo, de GAPDH humano (gliceraldeído-3-fosfatodesidrogenase), e incluindo ou não (um) íntron (ões) adicionais.

[00142] O termo expressão é aqui utilizado no seu sentido mais amplo e inclui a produção de RNA ou de RNA e de proteína ou peptídeo. No que diz respeito ao RNA, o termo expressão ou tradução se refere, em particular, para a produção de peptídeos ou proteínas. A expressão pode ser transitória ou podem ser estáveis. De acordo com a invenção, o termo expressão também inclui uma expressão aberrante ou expressão anormal.

[00143] Expressão aberrante ou expressão anormal significa, de acordo com a invenção, de que a expressão seja alterada, de preferência, aumentada, em comparação com uma referência, por exemplo, um estado em um sujeito não tem uma

74/118 doença associada com a expressão aberrante ou anormal de uma determinada proteína, por exemplo, um antígeno associado a um tumor. Um aumento da expressão se refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular, pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%, ou mais. Em uma concretização, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão de um tecido saudável é reprimida.

[00144] O termo especificamente expressado significa que uma proteína é essencialmente expressada apenas em um tecido ou órgão específico. Por exemplo, um antígeno associado a um tumor especificamente expressado em meio de mucosa gástrica, que a referida proteína é expressada principalmente na mucosa gástrica, e não é expressa em outros tecidos ou não é expresso de forma significativa em outros tipos de tecidos ou de órgãos. Assim, uma proteína que é exclusivamente expressa em células da mucosa gástrica e uma menor proporção de forma significativa, em qualquer outro tecido é especificamente expressa em células da mucosa gástrica. Em algumas concretizações, um antígeno associado a um tumor pode também ser expresso especificamente em condições normais, em mais do que um tipo de tecido ou órgão, tal como em dois ou três tipos de tecidos ou órgãos, mas, de preferência, em não mais do que três diferentes tipos de tecidos ou de órgãos. Neste caso, o antígeno associado a um tumor é então, especificamente expressado nestes órgãos.

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[00145] O termo conversão, de acordo com a invenção relaciona-se com o processo nos ribossomas de uma célula, através da qual uma cadeia de RNA mensageiro dirige a montagem de uma sequência de aminoácidos para produzir uma proteína ou peptídeo.

[00146] De acordo com a invenção, o termo ácido nucleico que codifica significa que o ácido nucleico, se presente no meio apropriado, de preferência, dentro de uma célula pode ser expresso para produzir uma proteína ou um peptídeo que codifica.

[00147] O termo peptídeo inclui oligo- e polipeptídeos e se refere a substâncias que compreendem dois ou mais, de preferência, 3 ou mais, preferencialmente, 4 ou mais, preferencialmente, 6 ou mais, preferencialmente, de 8 ou mais, preferencialmente, de 9 ou mais, de preferência, 10 ou mais, de preferência, 13 ou mais, de preferência, 16 ou mais, de preferência, 21 ou mais, e, de preferência até 8, 10, 20, 30, 40 ou 50, em particular, 100 aminoácidos ligados de forma covalente através de ligações peptídicas. O termo proteína se refere a peptídeos grandes, de preferência, para os peptídeos com mais de 100 resíduos de aminoácidos, mas, em geral, os termos peptídeos e proteínas são sinônimos e são usados aqui indiscriminadamente.

[00148] De preferência, as proteínas e peptídeos descritos de acordo com a invenção foram isolados. Os termos

76/118 proteína isolada ou peptídicos isolado significa que a proteína ou o peptídeo foi separado do seu ambiente natural. Uma proteína ou peptídeo isolado pode estar em um estado essencialmente purificada. O termo essencialmente purificado significa que a proteína ou peptídeo é essencialmente livre de outras substâncias com as quais está associada na natureza ou in vivo.

[00149] O ensinamento aqui dada com respeito a sequências de aminoácidos específicas, por exemplo, aquelas mostradas na listagem de sequências, é para ser interpretado de modo a também se relacionar com alterações, isto é, variantes, das referidas sequências específicas que resultam em sequências que sejam funcionalmente equivalentes as diats sequências específicas, por exemplo, as sequências de aminoácidos que exibem propriedades idênticas ou similares às das sequências de aminoácidos específicas. Uma propriedade importante é a de reter a ligação de um anticorpo ao seu alvo. De preferência, uma sequência modificada no que diz respeito a uma sequência específica, quando se substitui a sequência específica de um anticorpo retém a ligação do referido anticorpo para o alvo.

[00150] Será apreciado por técnicos versados no assunto que, em particular, as sequências das sequências de CDR, regiões hipervariáveis e variáveis podem ser modificadas sem perder a capacidade de se ligar a um alvo. Por exemplo,

77/118 sequências de CDR serão idênticas ou altamente homólogas com as sequências de CDR aqui especificados.

[00151] Por altamente homólogos é contemplado que de 1 a 5, de preferência, de 1 a 4, tal como de 1 a 3, ou 1 ou 2 podem ser feitas substituições.

[00152] O termo variante, de acordo com a invenção também inclui mutantes, variantes de splicing, isoformas, as conformações, variantes alélicas, variantes de espécie e homólogos de espécies, em particular, aqueles que estão naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração da sequência normal de um gene, o significado dos quais é frequentemente pouco claro. Sequenciamento genético completo, muitas vezes identifica inúmeras variantes alélicas de um determinado gene. Uma espécie homóloga é uma sequência de ácido nucleico ou aminoácido com uma espécie diferente de origem de que uma dada sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos.

[00153] Para os fins da presente invenção, variantes de uma sequência de aminoácidos compreendem variantes de inserção de aminoácido, as variantes de adição de aminoácido, variantes de deleção de aminoácidos e / ou variantes de substituição de aminoácidos. Variantes de deleção de aminoácidos que compreende a deleção no N-terminal e / ou Cterminal da proteína são também chamadas variantes de truncagem C-terminal e / ou N-terminal.

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[00154] Variantes de inserção de aminoácidos compreendem inserções simples ou de dois ou mais aminoácidos em uma sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes de inserção de sequência de aminoácidos, um ou mais resíduos de aminoácidos são introduzidos em um sítio particular em uma sequência de aminoácidos, ainda que a inserção ao acaso, com rastreio apropriado do produto resultante também é possível.

[00155] Variantes de adição de aminoácidos compreendem fusões amino e / ou carboxi-terminal de ou mais aminoácidos, como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ou mais aminoácidos.

[00156] Variantes de deleção de aminoácido são caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da sequência, tais como por remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ou mais aminoácidos. As deleções podem estar em qualquer posição da proteína.

[00157] As variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência a ser removida e outro resíduo a ser inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações estando em posições na sequência de aminoácidos que não são conservadas entre as proteínas ou peptídeos homólogos e / ou a substituição de aminoácidos com outros que têm propriedades semelhantes. De preferência, as alterações de aminoácidos nas variantes proteicas são as alterações de aminoácidos conservativas,

79/118 isto é, substituições de aminoácidos semelhante carregadas ou não carregadas. Uma mudança de aminoácidos conservativa envolve a substituição de uma de uma família de aminoácidos que estão relacionados nas suas cadeias laterais. Aminoácidos que ocorrem naturalmente são geralmente divididos em quatro famílias: ácido (aspartato, glutamato), básicos (lisina, arginina, histidina), não-polares (alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), e não carregados polar (glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina) aminoácidos. Fenilalanina, triptofano e tirosina são por vezes classificadas em conjunto como aminoácidos aromáticos.

[00158] De preferência, o grau de semelhança, preferivelmente identidade entre uma dada sequência de aminoácidos e uma sequência de aminoácidos que é uma variante da dita dada sequência de aminoácidos seja pelo menos cerca de 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82 %, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99%. O grau de semelhança ou de identidade é dada preferência para uma região de aminoácidos que é pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 20%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 90% ou cerca de 100% de todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. Por exemplo, se a

80/118 sequência de aminoácidos de referência é constituída por 200 aminoácidos, o grau de semelhança ou de identidade é dada preferência, por pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180, ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência os aminoácidos contínuos. Em concretizações preferidas, o grau de semelhança ou de identidade é determinada por todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência. O alinhamento para determinar semelhança de sequência, de preferência de identidade de sequência pode ser realizada com as ferramentas da arte conhecida, utilizando de preferência o melhor alinhamento de sequências, por exemplo, utilizando Align, usando configurações padrão, de preferência EMBOSS :: needle, Matriz: Blosum62, Gap Abrir 10,0, Gap Estender 0,5.

[00159] Similaridade de sequência indica a percentagem de aminoácidos que ou são idênticos ou que representam substituições de aminoácidos conservativas. Identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos indica a percentagem de aminoácidos idênticos entre as sequências.

[00160] O termo percentagem de identidade se destina a denotar uma percentagem de resíduos de aminoácidos que são idênticos entre as duas sequências a serem comparadas, obtida

81/118 após o melhor alinhamento, sendo esta percentagem puramente estatística e as diferenças entre as duas sequências a serem distribuídos aleatoriamente e ao longo todo o seu comprimento. A comparação de sequências entre duas sequências de aminoácidos são convencionalmente realizada por comparação destas sequências, depois de ter alinhado optimamente deles, referida comparação ser efetuada pelo segmento ou pelo janela de comparação para identificar e comparar regiões locais de similaridade de sequência. O alinhamento ideal das sequências para comparação pode ser produzido, além manualmente, por meio do algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, 1981, anúncios App. Math. 2, 482, por meio do algoritmo de homologia local de Neddleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, por meio do método de busca de similaridade de Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sei. EUA 85, 2444, ou por meio de programas de computador que usam esses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N e TFASTA em Wisconsin Genetics Software, Genetics Computer Group, 575 Ciência Drive, Madison, Wisconsin).

[00161] A percentagem de identidade é calculada determinando o número de posições idênticas entre as duas sequências a serem comparadas, dividindo este valor pelo número de posições de comparação e multiplicando o resultado obtido por 100, de modo a obter a percentagem de identidade entre estas duas sequências.

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[00162] Sequências Homóloga de aminoácidos exibem de acordo com a invenção, pelo menos 40%, em particular pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% e de preferência pelo menos 95%, pelo menos 98 ou, pelo menos, 99% de identidade dos resíduos de aminoácidos.

[00163] As variantes de sequência de aminoácidos aqui descritos podem ser facilmente preparadas pelo técnico versado do assuntoi, por exemplo, por manipulação do DNA recombinante. A manipulação de sequências de DNA para a preparação de proteínas e peptídeos que possuem substituições, adições, inserções ou deleções, é descrita em detalhe em Sambrook et al. (1989), por exemplo. Além disso, os peptídeos e as variantes de aminoácidos aqui descritos podem ser facilmente preparados com o auxílio de técnicas de síntese de peptídeos conhecidos, tais como, por exemplo, por síntese em fase sólida e métodos semelhantes.

[00164] A invenção abrange os derivados dos peptídeos ou proteínas aqui descritas, que são compostos pelos termos peptídeo e proteína. De acordo com a invenção, derivados de proteínas e peptídeos são as formas de proteínas e peptídeos modificados. Essas modificações incluem qualquer modificação química e compreendem substituições simples ou múltiplas, deleções e / ou adições de qualquer molécula associada com a proteína ou peptídeo, tal como

83/118 hidratos de carbono, lípidos e / ou proteínas ou peptídeos. Em uma concretização, derivados de proteínas ou peptídeos incluem os análogos modificados resultantes da glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, palmitoilação, miristoilação, isoprenilação, lipidação, alquilação, derivatização, introdução de grupos de bloqueio / protecção, a clivagem proteolítica ou de se ligar a um anticorpo ou a outro ligando celular. O termo derivado também se estende a todos os equivalentes químicos funcionais das referidas proteínas e peptídeos. Preferencialmente, um peptídeo modificado tem uma maior estabilidade e / ou aumento da imunogenicidade.

[00165] De acordo com a invenção, uma sua variante, derivado, forma modificada, fragmento, uma parte ou porção de uma sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína, de preferência tem uma propriedade funcional da sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir do qual ela foi derivada, ou seja, que é funcionalmente equivalente. Em uma concretização, uma variante, derivado, forma modificada, fragmento, uma parte ou porção de uma sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína é imunologicamente equivalente à sequência de aminoácido, peptídeo ou proteína, respectivamente, a partir da qual foi derivada. Em uma forma de realizao, a propriedade funcional é uma propriedade imunológica.

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[00166] O termo derivado significa de acordo com a invenção que uma entidade particular, em particular uma sequência em particular, está presente no objecto a partir do qual é derivado, em particular um organismo ou molécula. No caso de sequências de aminoácidos, em especial as regiões de sequências específicas, derivados, em particular, significa que a sequência de aminoácidos relevante é derivada de uma sequência de aminoácidos na qual está presente.

[00167] O termo célula ou célula hospedeira é, de preferência, uma célula intacta, isto é, uma célula com uma membrana intacta que não libere os seus componentes intracelulares normais, tais como enzimas, organelos, ou material genético. Uma célula intacta é de preferência uma célula viável, isto é, uma célula viva capaz de levar a cabo as suas funções metabólicas normais. O termo célula inclui de acordo com a invenção as células procariotas (por exemplo, E. coli) ou células eucarióticas (por exemplo, células dendríticas, células B, células CHO, células COS, células K562, células HEK293, células HeLa, células de levedura, e células de insecto). As células de mamífero são, particularmente preferidos, tais como as células de seres humanos, ratos, hamsters, porcos, cabras e primatas. As células podem ser derivadas a partir de um grande número de tipos de tecidos e incluem as células primárias e as linhas de células. O termo célula inclui células e células

85/118 cancerígenas não-cancerosas, tais como células dos tipos de câncer aqui revelados.

[00168] Uma célula que compreende uma molécula de ácido nucleico, de preferência, expressar o peptídeo ou a proteína codificada pelo ácido nucleico.

[00169] Célula-alvo, uma célula que é alvo de uma resposta imune, como um anticorpo. As células alvo incluem qualquer célula indesejável tal como uma célula de câncer, tal como aqui descrito. Em concretizações preferidas, a célula alvo é uma célula que expressa CLDN18.2. As células que expressam CLDN18.2 tipicamente incluem células cancerosas.

[00170] Os termos animal transgênico se refere a um animal com um genoma que compreende um ou mais transgenes, de preferência anticorpos transgenes de cadeia pesada e / ou leve, ou transchromosomes (ou integrados ou não integrados no DNA genômico natural dos animais) e que é, de preferência, capaz de expressar os transgenes. Por exemplo, um ratinho transgênico pode ter um transgene humano de cadeia leve e pesada humana, quer um transgene de cadeia humana ou transcromossoma de cadeia pesada, de tal modo que o rato produz anticorpos anti-CLDN18.2 humanos quando imunizados com antígeno CLDN18.2 e / ou células que expressam CLDN18.2. O transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no ADN cromossómico do rato, como é o caso para os camundongos

86/118 transgénicos, por exemplo, os camundongos HuMAb, tais como camundongos ou HCo7 HCol2, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extracromossomicamente, como é o caso para transchromosomal (por exemplo, KM) camundongos, tal como descrito em WO 02/43478. Tais camundongos transgénicos e transchromosomal podem ser capazes de produzir vários isotipos de anticorpos monoclonais humanos para CLDN18.2 (por exemplo, IgG, IgA e / ou IgE) por sofrer uma recombinação VDJ e isotipo.

[00171] O termo imunologicamente equivalente significa que a molécula imunologicamente equivalente, tal como a sequência de aminoácidos imunologicamente equivalente exibe a mesma ou essencialmente a mesma propriedades imunológicas e / ou exerce a mesma ou essencialmente os mesmos efeitos imunológicos, por exemplo, no que diz respeito ao tipo de o efeito imunológico, tais como a indução de uma reacção imune humoral, a força e / ou a duração da reacção imune induzida, ou a especificidade da reacção imunitária. No contexto da presente invenção, o termo imunologicamente equivalentes é utilizado de preferência em relação aos efeitos imunológicos ou propriedades de um peptídeo ou variante de peptídeo utilizado para a imunização, ou um anticorpo. Uma propriedade imunológica específica é a capacidade de se ligar a anticorpos e, se necessário, produzir uma resposta imunitária, de preferência, através da

87/118 estimulação da produção de anticorpos. Por exemplo, uma sequência de aminoácidos é imunologicamente equivalente a uma sequência de aminoácidos de referência, se a referida sequência de aminoácidos quando expostos ao sistema imunológico de um indivíduo induz a uma reação imunológica, preferencialmente os anticorpos, que tem uma especificidade de reacção, com a sequência de aminoácidos de referência, tal como a sequência de referência de ácido amino formando parte de CLDN18.2.

[00172] A invenção fornece métodos para detectar a presença do antígeno em uma amostra CLDN18.2, ou medindo a quantidade de antígeno CLDN18.2, compreendendo contatar a amostra, e, opcionalmente, uma amostra de controle, com um anticorpo da invenção que se liga ao CLDN18.2, sob condições que permitam a formação de um complexo entre o anticorpo e CLDN18.2. A formação de um complexo é então detectada, em que uma diferença na formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controlo, é indicativo da presença de antígeno na amostra CLDN18.2.

[00173] Métodos como descrito acima são úteis, em especial, para o diagnóstico de doenças relacionadas com a CLDN18.2 tais como doenças cancerosas. De preferência, uma quantidade de CLDN18.2 em uma amostra, que é mais elevada do que a quantidade de CLDN18.2 em uma amostra de referência ou controlo é indicativo da presença de uma doença relacionada

88/118 com a CLDN18.2 em um sujeito, em particular um humano, a partir do qual a amostra é derivada.

[00174] Quando utilizada em métodos conforme acima descrito, um anticorpo aqui descrito, pode ser fornecido com uma marcação que funciona para: (i) proporcionar um sinal detectável; (Ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecida pela primeira ou segunda marcação, por exemplo, TERF (transferência de energia de ressonância de fluorescência); (iii) afetar a mobilidade, por exemplo, a mobilidade eletroforética, por carga, hidrofobicidade, a forma, ou outros parâmetros físicos, ou (iv) proporcionar uma unidade de captura, por exemplo, afinidade, anticorpo / antígeno, ou a complexação iônica. Indicado como marcador são estruturas, tais como marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisótopos, marcadores isotópicos, marcadores isotópicas estáveis, de preferência, marcadores isobáricos, marcadores enzimáticos, marcadores de partículas, em especial, marcadores de partículas de metal, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas de polímero, moléculas orgânicas pequenas, tais como biotina, ligantes de receptores ou moléculas de ligação, tais como as proteínas de adesão celular ou lectinas, sequências marcadoras que compreendem os ácidos nucleicos e / ou os resíduos de aminoácidos que podem ser detectados por uso de agentes de

89/118 ligação, etc. Marcadores compreendem, de forma não limitativa, sulfato de bário, ácido iocetamico, ácido iopanóico, ipodato de cálcio, diatrizoato de sódio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, tiropanoato de sódio e rádiodiagnóstico, incluindo emissores de pósitrons, como fluorina- 18 e carbono 11, emissores gama, como iodo 123, tecnécio-99m, iodo-131 e indio-111, para os nuclídeos de ressonância magnética nuclear, tal como flúor e gadolínio.

[00175] De acordo com a invenção, uma referência, tais como uma amostra de referência ou organismo de referência pode ser utilizado para correlacionar e comparar os resultados obtidos nos métodos da invenção a partir de uma amostra de teste ou organismo de teste. Tipicamente, o organismo de referência é um organismo saudável, em particular, de um organismo que não sofra de uma doença tal como uma doença do câncer. Um valor de referência ou nível de referência pode ser determinada empiricamente a partir de uma referência através da medição de um número suficientemente grande de referências. De preferência, o valor de referência é determinado por medição de pelo menos 2, preferencialmente, pelo menos 3, de preferência, pelo menos, 5, de preferência pelo menos 8, de preferência pelo menos 12, preferencialmente pelo menos 20, preferencialmente pelo menos 30, preferencialmente pelo menos 50, ou, de preferência, pelo menos 100 referências.

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[00176] Reduzir ou inibir, como aqui utilizado, significa a capacidade para causar uma diminuição global, de preferência, de 5% ou superior, 10% ou mais, 20% ou mais, mais preferivelmente, de 50% ou maior, e com maior preferência de 75% ou superior, do nível. O termo inibição ou frases semelhantes inclui uma inibição completa ou essencialmente completa, isto é, uma redução a zero ou essencialmente zero.

[00177] Termos tais como aumentar ou melhorar se referem, de preferência, um aumento ou melhoria de pelo menos cerca de 10%, de preferência pelo menos 20%, de preferência, pelo menos 30%, mais preferencialmente, pelo menos 40%, mais preferencialmente, pelo menos 50%, ainda mais preferencialmente, pelo menos 80%, e mais preferivelmente, pelo menos 100%.

[00178] Os agentes, composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para diagnosticar um paciente com uma doença. As doenças que podem ser diagnosticadas englobar todas as doenças que expressam CLDN18.2. Doenças Particularmente preferidas são as doenças cancerosas, tais como as doenças cancerosas aqui descritas.

[00179] De acordo com a invenção, o termo doente se refere a qualquer estado patológico, incluindo doenças do câncer, em particular, as formas de doenças cancerosas aqui descritas.

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[00180] O termo normal, como as utilizadas nos termos de tecido normal ou condições normais refere-se ao tecido saudável ou as condições em um indivíduo saudável, ou seja, situações não patológicas, em que saudável, de preferência, significa não-cancerosas.

[00181] A doença que envolve as células que expressam CLDN18.2 significa, de acordo com a invenção que a expressão de CLDN18.2 em células de um tecido doente ou órgão é de preferência um aumento em relação ao estado em um tecido saudável ou órgão. Um aumento se refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, Pelo menos 500%, pelo menos, 1000% o, pelo menos, 10000% ) ou mesmo mais. Em uma concretização, a expressão é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão de um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, as doenças que envolvam ou ser associados com as células que expressam CLDN18.2 incluem doenças cancerosas, em particular as formas de câncer aqui descritos.

[00182] De acordo com a invenção, o termo tumor ou doença tumoral se refere a um inchaço ou lesão formada por um crescimento anormal de células (chamadas células neoplásicas e células tumorais). Por células de tumor entende-se uma célula anormal que cresce por um rápido, proliferação celular descontrolada e continua a crescer após

92/118 os estímulos que iniciaram o novo crescimento de cessar. Tumores mostrar falta parcial ou completa de organização estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e geralmente forma uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.

[00183] Um tumor benigno é um tumor que carece de todas as três propriedades malignas de um câncer. Assim, por definição, um tumor benigno não cresce de uma maneira ilimitada, agressivo, não invade os tecidos circundantes, e não se espalha para os tecidos não adjacentes (metástases). Exemplos comuns de tumores benignos incluem verrugas e miomas uterinos.

[00184] O termo benigno implica uma doença leve e não progressiva, e, na verdade, muitos tipos de tumores benignos são inofensivos para a saúde. No entanto, algumas neoplasias que são definidas como tumores benignos, porque elas não têm as propriedades invasivas de câncer, ainda podem produzir efeitos negativos na saúde. Exemplos disso incluem tumores que produzem um efeito de massa (compressão de órgãos vitais, como os vasos sanguíneos), ou tumores funcionais dos tecidos endócrinos, que pode produzir mais certos hormônios (os exemplos incluem adenomas da tiróide, adenomas adrenocorticais e adenomas hipofisários).

[00185] Os tumores benignos geralmente estão rodeados por uma superfície exterior que inibe a sua capacidade de se

93/118 comportar de forma maligna. Em alguns casos, certos tumores “benignos podem mais tarde dar origem a cânceres malignos, que resultam de alterações genéticas adicionais de uma subpopulação de células neoplásicas do tumor. Um exemplo proeminente desse fenômeno é o adenoma tubular, um tipo comum de pólipo de cólon, que é um importante precursor para o câncer do cólon. As células em adenomas tubulares, como a maioria dos tumores que frequentemente evoluem para o câncer mostram certas anormalidades de maturação celular e aparência coletivamente conhecida como displasia. Essas anormalidades celulares não são vistas em tumores benignos que raramente ou nunca se tornar cancerosos, mas são vistos em outras anormalidades do tecido pré-canceroso que não formam massas discretas, tais como lesões pré-cancerosas do colo do útero. Algumas autoridades preferem se referir a tumores displásicos como pré-malignas, e reservar o termo benigno para os tumores que raramente ou nunca dão origem ao câncer.

[00186] Neoplasia é uma massa anormal de tecido, como um resultado da neoplasia. Neoplasia (novo crescimento em grego) é a proliferação anormal de células. O crescimento das células excede e é descoordenado com o do tecido normal em torno dele. O crescimento persiste do mesmo modo excessivo, mesmo após a cessação do estímulo. Geralmente causa um nódulo ou tumor. Neoplasias podem ser benignas, pré-malignas ou malignas.

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[00187] Crescimento do tumor ou crescimento tumoral, de acordo com a invenção se refere à tendência de um tumor para aumentar o seu tamanho e / ou a tendência de células tumorais para proliferar.

[00188] Câncer (termo médico: neoplasia maligna) é uma classe de doenças nas quais um grupo de células apresentam crescimento descontrolado (divisão além dos limites normais), invasão (intrusão e destruição dos tecidos adjacentes), e às vezes metástase (disseminação para outros locais em o corpo através da linfa ou do sangue). Essas três propriedades malignas do câncer o diferencia dos tumores benignos, que são auto-limitadas e não invadem ou metástase. A maioria dos cânceres formam um tumor, mas alguns, como a leucemia, não. De acordo com a invenção, os termos câncer e tumorais ou doença do câncer e doença tumoral são geralmente utilizados alternadamente aqui para referir-se a doenças nas quais as células exibem um crescimento descontrolado e invasão e / ou metástase, opcionalmente.

[00189] De preferência, uma doença de câncer de acordo com a invenção é caracterizado por células que expressam CLDN18.2. Uma célula que expressa CLDN18.2, preferencialmente, é uma célula de câncer, de preferência, de tumores e cânceres aqui descritos. De preferência, tal célula é uma célula que não uma célula de estômago.

[00190] Os cânceres são classificadas pelo tipo de

95/118 célula que se assemelha ao tumor e, portanto, o tecido que se presume ser a origem do tumor. Estas são a histologia e o local, respectivamente.

[00191] O termo câncer, de acordo com a invenção compreende leucemias, seminomas, melanomas, teratomas, linfomas, neuroblastomas, gliomas, câncer retal, câncer de endométrio, câncer de rim, câncer de adrenal, câncer de tireóide, câncer de sangue, câncer de pele, câncer de cérebro, câncer cervical, câncer intestinal, câncer de rim, câncer de cólon, câncer de estômago, câncer de intestino, câncer de cabeça e pescoço, câncer gastrointestinal, câncer do sistema linfático, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer de pâncreas, ouvido, nariz e garganta (ENT) câncer, de mama câncer, câncer de próstata, câncer de útero, câncer de ovário e câncer de pulmão e as metástases dos mesmos. Exemplos destes são os carcinomas do pulmão, carcinomas mamma, carcinomas da próstata, carcinomas do cólon, os carcinomas das células renais, carcinomas do colo do útero, ou metástases do câncer ou os tipos de tumores descritos acima. O termo câncer de acordo com a invenção também compreende as metástases cancerosas.

[00192] Os principais tipos de câncer de pulmão são o carcinoma de pequenas células do pulmão (SCLC) e carcinoma de pulmão não-pequenas células (NSCLC). Existem três sub-tipos principais de não-pequenas do carcinoma pulmonar de células:

96/118 carcinoma do pulmão de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma do pulmão de células grandes. Os adenocarcinomas representam cerca de 10% dos cânceres do pulmão. Esse tipo de câncer geralmente é visto na periferia dos pulmões, ao contrário do câncer de pulmão de pequenas células e câncer de pulmão de células escamosas, que ambos tendem a ser mais central.

[00193] De acordo com a invenção, um carcinoma é um tumor maligno derivadas de células epiteliais. Este grupo representa os cânceres mais comuns, incluindo as formas mais comuns de câncer de mama, próstata, pulmão e câncer de cólon.

[00194] Por metástases significa-se a propagação de células de câncer a partir do seu local de origem de uma outra parte do corpo. A formação de metástases é um processo muito complexo e depende de desprendimento de células malignas do tumor primário, invasão da matriz extracelular, a penetração das membranas basais endoteliais a entrar na cavidade do corpo e vasos, e em seguida, depois de ser transportado pelo sangue, a infiltração de órgãos alvo. Por fim, o crescimento de um novo tumor, ou seja, um tumor secundário, ou metástase de tumor, no local alvo depende da angiogénese. Metástase de tumor muitas vezes ocorre mesmo após a remoção do tumor primário, porque as células tumorais ou componentes podem permanecer e desenvolver o potencial metastático. Em uma concretização, o termo metástase, de

97/118 acordo com a invenção se refere a metástase a que uma metástase remota que é a partir do tumor primário e o sistema de linfonodo regional.

[00195] As células de um tumor secundário ou metastático são aqueles em que o tumor original. Isto significa, por exemplo, que, no caso do câncer do ovário forma metástases para o rim, o tumor secundário é constituído por células de ovário anormais, não de células hepáticas. O tumor no rim é então chamado de câncer metastático do ovário e não câncer do rim.

[00196] A recaída ou recorrência ocorre quando uma pessoa é afetada novamente por uma condição que os afetou no passado. Por exemplo, se um paciente sofreu de uma doença de câncer, recebeu um tratamento bem sucedido da referida doença e novamente desenvolve a referida doença, a referida doença recentemente desenvolvido pode ser considerado como de recaída ou uma nova ocorrência. No entanto, de acordo com a invenção, uma recaída ou a recorrência de uma doença do câncer podem, mas não necessariamente, ocorrer no local da doença do câncer inicial. Assim, por exemplo, se um paciente sofreu de tumor de ovário e recebeu um tratamento bem sucedido, uma recaída ou uma nova ocorrência pode ser a ocorrência de um tumor do ovário ou a ocorrência de um tumor em um local diferente ao ovário. A recaída ou recorrência de um tumor inclui também situações em que um tumor ocorre em um

98/118 local diferente do local do tumor original, bem como no local do tumor original. De preferência, o tumor original para a qual o doente recebeu um tratamento de um tumor primário e o tumor a um local diferente do local do tumor original é um tumor secundário, ou metástase.

[00197] Por tratar entende-se a administrar um composto ou composição a um paciente, a fim de evitar ou eliminar uma doença, incluindo a redução do tamanho de um tumor ou no número de tumores em um sujeito; deter ou retardar uma doença em um sujeito; inibir ou retardar o desenvolvimento de uma nova doença em um sujeito; diminuir a freqüência ou severidade dos sintomas e / ou recorrências em um assunto que atualmente tem ou que já teve uma doença; e / ou prolongar, ou seja, aumentar a vida útil do assunto.

[00198] Em particular, o termo tratamento de uma doença inclui cura, encurtando da duração, melhorar, prevenção, abrandar ou inibir a progressão ou agravamento de, ou prevenir ou retardar o aparecimento de uma doença ou dos seus sintomas.

[00199] Por estando em risco entende-se um sujeito, isto é, um paciente, que é identificado como tendo uma probabilidade maior do que o normal de desenvolver uma doença, em particular, câncer, em comparação com a população em geral. Além disso, um sujeito que tem tido, ou que tem atualmente, uma doença, em particular, o câncer é um sujeito

99/118 que tem um risco aumentado para o desenvolvimento de uma doença, uma vez que tal sujeito pode continuar a desenvolver a doença. Os indivíduos que têm atualmente, ou que tiveram um câncer também têm um risco aumentado de metástases do câncer.

[00200] O termo imunoterapia se refere a um tratamento que envolva uma reação imunológica específica. No contexto da presente invenção, os termos como proteger, prevenir, profilática, prevenção ou protetora se referem à prevenção ou tratamento ou ambos da ocorrência e / ou a propagação de uma doença em um sujeito e, em particular, para minimizar a possibilidade de que um indivíduo venha a desenvolver uma doença ou para atrasar o desenvolvimento de uma doença. Por exemplo, uma pessoa em risco de um tumor, como descrito acima, seria um candidato para a terapia para evitar um tumor. A imunoterapia pode ser realizada utilizando qualquer de uma variedade de técnicas, em que os agentes têm a função de remover as células que expressam o antígeno a partir de um paciente.

[00201] Dentro de certas concretizações, a imunoterapia pode ser imunoterapia ativa, na qual o tratamento se baseia na estimulação in vivo do sistema imunológico do hospedeiro endógeno para reagir contra células doentes com a administração de agentes modificadores de resposta imune (por exemplo, peptídeos imunorreativos e ácidos nucleicos).

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[00202] Dentro de outras concretizações, a imunoterapia pode ser imunoterapia passiva, na qual o tratamento envolve a administração de agentes com reatividade imunológica tumoral estabelecida (tais como, anticorpos) que podem, direta ou indiretamente mediar efeitos antitumorais e não depende, necessariamente, de um sistema imunológico do hospedeiro intacto.

[00203] O termo in vivo se relaciona com a situação de um sujeito.

[00204] Os termos sujeito, indivíduo, organismo ou paciente são usados alternadamente e se relacionam com os vertebrados, de preferência, mamíferos. Por exemplo, mamíferos, no contexto da presente invenção são os seres humanos, primatas não humanos, animais domésticos, tais como cães, gatos, ovelhas, gado, cabras, porcos, cavalos, etc, os animais de laboratório, tais como camundongos, ratos, coelhos, cobaias, etc., bem como os animais em cativeiro como animais de zoológicos. O termo animal, tal como aqui utilizado também inclui seres humanos. O termo sujeito pode também incluir um paciente, isto é, um animal, de preferência, um ser humano com uma doença, preferivelmente, uma doença, tal como aqui descrito.

[00205] De acordo com a invenção, uma amostra pode ser qualquer amostra útil, de acordo com a presente invenção, em particular, uma amostra biológica de uma amostra desse

101/118 tecido, incluindo fluidos do corpo, e / ou uma amostra celular e pode ser obtido da forma convencional, tal como por biópsia de tecido, incluindo a biópsia, e tomando o sangue, aspirado brônquico, escarro, urina, fezes e outros fluidos corporais. De acordo com a invenção, o termo amostra inclui também amostras ou fracções tais como isolados de amostras biológicas, por exemplo, ácido nucleico de peptídeo e proteína processada / isolados. De preferência, contém uma amostra de células ou tecido do órgão que está a ser examinado, por exemplo, o que está a ser diagnosticado por câncer. Por exemplo, se o câncer a ser diagnosticado câncer do pulmão é uma amostra pode conter células ou tecidos obtidos a partir dos pulmões.

[00206] De acordo com a invenção, uma amostra pode ser uma amostra, tal como uma amostra corporal proveniente de um paciente, contendo ou sendo esperado que contém células tumorais ou cancerosas. A amostra corporal pode ser qualquer amostra de tecido, tal como sangue, uma amostra de tecido obtida a partir do tumor primário ou a partir de metástases de tumores ou outras células que contêm amostras de tumor ou câncer.

[00207] A presente invenção é descrita em detalhe pelas figuras e exemplos que se seguem, que são usados apenas para fins de ilustração e não se destinam a ser limitantes. Dada a descrição e os exemplos, outras concretizações que são

102/118 igualmente incluídos na invenção estão disponíveis para o técnico versado no assunto.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00208] A Figura 1 mostra o alinhamento de sequências de proteínas claudin 18 (humano / murino). O alinhamento da seqüência mostra a homologia entre o humano eo rato claudin 18,2 e 18,1 claudin humano e Claudin 18.2.

[00209] A Figura 2 mostra a proteína recombinante, incluindo a porção C-terminal de CLDN18.2 (aal91-261) utilizada para a imunização de camundongos

[00210] A Figura 3 mostra as análises das Sequência de anticorpos 43-14A e 35-22A EXEMPLOS

[00211] As técnicas e métodos aqui utilizados são aqui descritos ou realizados de uma maneira conhecida per se e como descrito, por exemplo, em Sambrook et al, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque. Todos os métodos, incluindo o uso de kits e reagentes são realizados de acordo com informações do fabricante, salvo se especificamente indicado.

Exemplo 1: Geração de anticorpos monoclonais

[00212] O objetivo deste projeto foi o de gerar anticorpos monoclonal específicos para CLDN18 de murino capazes de detectar CLDN18.2 que expressam células tumorais

103/118 no estômago CA, esôfago CA, pâncreas CA e pulmão CA e tecidos FFEP CA.

[00213] Para gerar uma elevada afinidade de anticorpos CLDN18.2 de diagnóstico altamente específica que foi essencial para iniciar protocolos de imunização com uma grande variação de diferentes imunogênios e adjuvantes. Durante o projeto cerca de 100 ratos (C57B1 / 6 e Balb / c) foram inoculados, usando várias estratégias de imunização para acionar uma resposta imunológica a -CLDN18.

[00214] Para acionar o sistema imunológico do rato e para superar a tolerância imunológica usamos -partículas semelhantes a vírus (VLP), Pepti de-conjugados e proteínas recombinantes que codificam para diferentes partes do CLDN18.2 humano expressa como proteínas de fusão recombinantes, com diferentes parceiros de expressão (tags).

[00215] Das 13 diferentes estratégias de imunização, os melhores resultados foram obtidos pelo tratamento de camundongos com a proteína marcada com His C-recombinante CLDN18 termal (ver Figura 2; Imunização # 20), em combinação com vários adjuvantes (ver Tabela 1, abaixo, fusão 35).

[00216] Um candidato (35 - 22A) resultou de uma estratégia de 4 etapas de imunização (30 dias) . Um outro candidato (43 - 14A) foi gerado seguindo um protocolo de 7etapas de imunização (79 dias) (ver Tabela 1, abaixo, fusão 43).

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[00217] Dois dias antes da esplenectomia, os camundongos foram reforçados para ativar as células B alvejadas.

[00218] No dia da fusão dos esplenócitos de rato foram isolados e fundidos com uma linhagem celular de mieloma de ratinho Ag8.653. Para a fusão de células de camundongo para o mieloma foi seguido o protocolo padrão publicado pela Ohler e Milstein 1975. Depois de sobrenadantes de seleção HAT foram testados em ELISA para a secreção de anticorpos que reconhecem o antígeno utilizado para a imunização.

[00219] As células de hibridoma sobrenadantes positivos de ELISA foram subclonadas para gerar hibridomas monoclonais e os sobrenadantes das células de hibridoma subclonadas foram novamente testados em ELISA. As células de hibridoma de clones positivos foram expandidos e sobrenadantes analisados adiante.

Exemplo 2: Seleção por Western Blot de sobrenadantes dos hibridomas monoclonais

[00220] Para responder à pergunta se os anticorpos ELISA-positivos nos sobrenadantes são capazes de se ligar a qualquer claudin 18 recombinante ou lisados de proteína estável de claudin 18 transfectadas que expressam células HEK293 por análise de Western Blot foi realizada. Os anticorpos que foram capazes de ligar-se especificamente a claudina 18 em uma análise de Western Blot, foram expandidos.

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As células foram crioconservadas e anticorpos purificados através MabSelect (FPLC). Os anticorpos selecionados pela triagem de Western Blot foram purificados e avaliados quanto à sua capacidade para se ligarem ao seu antígeno em tecidos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) por imunohistoquímica.

Exemplo 3: Análise histológica - primeira seleção de anticorpos positivos por Western Blot

[00221] O objetivo deste trabalho foi verificar a especificidade CLDN18 e sensibilidade dos anticorpos. Isso foi feito usando CLDN18 expressando FFPE tecido do estômago normal.

[00222] Em uma primeira experiência, os anticorpos purificados testados por Western Blot foram analisados a uma concentração de 0,5 pg / ml em secções FFPE no estômago humano. Anticorpos que tiveram um bom desempenho e não produzem grandes quantidades de fundo foram ainda titulados para 0,2 e 0,1 pg / ml em vários tecidos normais do estômago para testar a sensibilidade e especificidade. No desenvolvimento posterior encena os anticorpos recém-gerados foram testados diretamente em uma concentração de 0,2 pg / ml, pois o melhor anticorpo já foi realizado muito bem a 0,2 pg / ml e serviu como um ponto de referência. Anticorpos gerando fortes sinais no epitélio da mucosa dos tecidos do estômago humano testados e nenhum fundo sobre os tecidos da

106/118 mucosa adjacentes foram selecionadas para novas experiências de titulação e análise de especificidade. Dois anticorpos tiveram excelente execução: 35 - 22A e 43 - 14A; ver Tabelas 2 e 3, abaixo.

[00223] Os anticorpos que produzem sinais fortes no tecido do estômago normais testados foram analisados em tecidos de câncer. As células de hibridoma correspondentes foram adaptados a meios livres de soro. Os sinais produzidos usando muMAb 43 - 14A eram ligeiramente mais forte do que os sinais produzidos usando muMAb 35-22A; ver Tabela 4, abaixo. Exemplo 4: Análise histológica em profundidade e caracterização de anticorpos

[00224] Os anticorpos produzidos isentos de soro foram usados para colorir microarranjos de tecidos do estômago CA (TMA). A quantidade de casos corados foi analisados a intensidade do sinal e a quantidade de células tumorais positivas.

[00225] As intensidades de coloração dos mumAbs 35 -22 A e 43-14A foram excelentes. Não foram detectadas diferenças significativas no padrão de coloração e apenas pequenas diferenças nas intensidades de coloração entre os anticorpos testados 35-22A e 43-14A.

Exemplo 5: Análise da especificidade do anticorpo utilizando um painel de tecidos normais

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[00226] Os anticorpos selecionados foram testados em vários tecidos normais necessários para garantir a elevada especificidade CLDN18 alvo; ver Tabelas 5A e 5B, abaixo.

[00227] Não houve diferenças significativas no padrão de coloração e intensidade de coloração dos anticorpos 35-22A e 43-14A eram visíveis nas experiências anteriores. Por conseguinte, os anticorpos foram submetidos a experiências de coloração com um protocolo mais orientados clinicamente. Para simular os processos de coloração aplicados em laboratórios de patologia padrão um One-Day-Protocolo com um curto (1 hora) anticorpo primário passo de incubação foi estabelecida.

[00228] Em todos os casos analisados muMAb 43-14A realizada extremamente bom e ainda melhor em comparação com muMAb 35-22A; ver Tabela 6, abaixo.

Exemplo 6: Análise aprofundada sobre tecido relevante epitélio respiratório

[00229] muMAb 43-14A foi adicionalmente analisada em vários tecidos respiratórios relevantes para assegurar a sua especificidade, especialmente, em tecidos alvo dos pulmões / trato brônquico. Para estes tecidos foi relatado a expressão de CLDN18.1. Para analisar se o anticorpo do diagnóstico cruza reage com o pulmão / brônquios expressando isoforma de CLDN18.1 todo pulmão disponível / tecidos bronquiais foram selecionados. Não há sinais que foram detectados com pulmão e nos tecidos dos brônquios; ver Tabela 7, abaixo. A isoforma

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CLDN18 expressada nesses tecidos respiratórios não é reconhecido pelo anticorpo 43-14A.

Exemplo 7: Mapeamento de epítopos do mumAbs 43 - 14A e 35 22A

[00230] Peptídeo ELISA foi realizado para identificar os epítopos de ligação de anticorpos no CLDN18.2. Cada anticorpo purificado foi testado em peptídeos sobrepostos cobrindo a sequência do terminal C da CLDN18.2. 35-22A e 4314A. Ambos mostraram ligação específica a um mapeamento de epítopos para o peptídeo TEDEVQSYPSKHDYV. A seqüência a seguir foi determinada como a sequência reativa: EVQSYPSKHDYV.

Exemplo 8: Análise de Sequência da mumAbs 43 - 14A e 35 - 22A

[00231] A análise da sequência dos anticorpos 43-14A e 35-22A é mostrado na Figura 3.

Exemplo 9: Coloração de diferentes tecidos de câncer

[00232] A imunohistoquímica (IHQ) foi realizada em lâminas de 4% das amostras em parafina fixadas em formalina tamponada. Parafina foi realizada de acordo com protocolos padrão.

[00233] Após desparafinização, as lâminas foram submetidas a recuperação de antígenos por ebulição em ácido cítrico a 10 mM suplementado com 0,05% de Tween-20 (pH 6,0) a 120 ° C durante 10 minutos, extinguiu-se subsequentemente (por 2% de H202) e incubaram-se bloqueado durante a noite a 4

109/118 ° C, com 0,2 a 0,5 pg / ml de anticorpo monoclonal antianticorpo CLNDN18.2 43-14A diagnóstico ou 35-22A. A ligação do anticorpo foi visualizada com anticorpos secundários rábano-marcados com peroxidase, utilizando o anticorpo Powervision à base de polímero (Power Vision HRP de cabra-arato; Imunológica, Duiven, The Netherlands) e uma solução de substrato-cromogénio (VetorRed; Vetor Labs, Burlingame, EUA). Os cortes foram, posteriormente, contra-coradas com hematoxilina de Mayer (Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Alemanha) e submetidos à avaliação pelos avaliadores.

Avaliação histológica

[00234] Todas as amostras foram analisadas em relação à proporção relativa de células tumorais coradas positivas em relação a todas as células tumorais visíveis para cada seção. A intensidade da coloração foi classificada como negativa (), fracamente positivos (1 +), forma positiva (2 +) e fortemente positiva (3 +). Apenas a coloração das membranas foi considerado como positivo. Tecido do estômago humano serviu como controle positivo para cada coloração. Desde PanIN (neoplasia intraepitelial pancreática) são frequentemente encontrados fortemente positivo, essas áreas também foram considerados como referência intensidade de coloração interna para positividade forte (3 +).

[00235] Fortes sinais membranosos foram gerados por ambos os anticorpos nos tecidos cancerosos do pâncreas,

110/118 estômago e esofágica (Tabela 8) ou com anticorpo no tecido canceroso do pulmão 43-14A (Tabela 9). O número de células tumorais positivas variou interindividualmente entre os diferentes casos de tumor. A maior parte das amostras analisadas foi de 2 + para 3 + positiva.

[00236] Table 1: Esquemas de Imunização para anticorpos

Mouse 5 Imunização #20 - Fusion 35

Data	Dia	Evento	Cepa	Rato ID	Antígeno	Adjuvante	Administração
[μΐ]	[gg]	Code	[μ1]/[μδ]	Code	Rota	Volume
27. Oct. 2010	0	1. Imunização	C57BL/6	M5	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
4. Nov. 2010	7	2. Imunização	C57BL/6	M5	100	100	C-terminal GC182 -HIS	50/50	CpG-PTO	i.p.	200ul
10. Nov. 2010	14	3. Imunização	C57BL/6	M5	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
17. Nov. 2010	21	4. Imunização	C57BL/6	M5	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
24. Nov. 2010	28	Reforço	C57BL/6	M5	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
26. Nov. 2010	30	Fusion #35	C57BL/6	M5

Mouse 4 - Imunização #20 - Fusão 43

Data	Dia	Evento	Cepa	Rato ID	Antígeno	Adjuvante	Administração
[μΐ]	[μδ]	Code	[μ1]/[μδ]	Code	Rota	Volume
27. Oct. 2010	0	1. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
10. Nov. 2010	14	2. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
17. Nov. 2010	21	3. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
24. Nov. 2010	28	4. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
08. Dec. 2010	42	5. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
22. Dec. 2010	56	6. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
5. Jan. 2011	70	7. Imunização	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
12. Jan. 2011	77	Reforço	BALB/c	M4	100	100	C-terminal GC182 -HIS	100	Gerbu MM	i.p.	200ul
14. Jan. 2011	79	Fussão #43	BALB/c	M4

Tabela 2: mumAbs positivos selecionados por análise de Western Blot

111/118

Número de sliede	Tecido	Anticorpo	conc. do anticorpo	Cryo- / Parafina	Epitélio da mucosa	Padrão subcelular	% pcélulas positivas	bg na lamina propria	Linfócitos	Vasos	Musculatura lisa
11_413	estomago	35-22A	0,5pg/ml	Parafinaa	+++	m	90	-	-	-	-
ll_910	estomago humano	43-14A	0,2pg/ml	Parafina	+++	m	90	-	-	-	-

Tabela 3: Comparação de dois anticorpos 35-22A e 43-14A no tecido FFPE do estomago normal humano

Slide ID

Detalhes do tecido

Anticorpo

conc. anticorpo

Desenvolvimento

Mucisa epitelial

Padrão subescupular

% células positivas

bg & células na lã,mina propria

Lyinfócitos

Tecido fibroso

Vasos

Musculatura lisa

comentários

11_413

estomago 5

35- 22A

0,5pg/ml

1:30 min

+++

m

90

-

muito forte coloração das membranas do epitélio da mucosa, não bg no estroma, vasos e músculos

The 43-14A não foi testado a 0,5pg/ml, porque ο 35-22A nao foi executado muito bem a 0,2 Lig/ml não serve como uma uma regra.

11-975

estomago 1

35- 22A

0,1 pg/nil

2:30 min

+++

m

90

-

strong membranous staining of the mucosa epithelium, no bg on stroma, muscles, vasos or lamina propria

11-975

estomago 1

43- 14A

0,1 pg/nil

2:30 min

+++

m

90

-

forte coloração das membranas do epitélio da mucosa, não bg no estroma, músculos, vasos ou lâmina própria

11-907

estomago 5

35- 22A

0,2 pg/iiil

2:30 min

+++

m

90

-

forte coloração das membranas do epitélio da mucosa, não bg no estroma, músculos, vasos ou lâmina

112/118

													própria
ll_910	estomago 5	43- 14A	0,2pg/ml	2:30 min	+++	m	90	-	-	-	-	-	forte coloração das membranas do epitélio da mucosa, não bg no estroma, músculos, vasos ou lâmina própria

Tabela 4: Análise de tecidos cancerosos - TMA127A

slide em umber

Detalhes do tecido

Id tecidual

Anticorpo

conc. anticorpo

Crio- / Parafina

desenvolvimento

Células tumorais

Padrao Subcellular

% células positivas

Células do epitélio normal

Tecido fibroso

Vasos

Musculatura lisa

11-474

Estomago CA (+++)

B04/01221 II

35-22A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

++/+++

m

90

n.a.

-

11-474

Estomago CA (++)

B06/09514(5

35-22A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

(+)/+

c/m

10

n.a.

-

11-474

Estomago CA (+)

B05/09809 (4

35-22A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

-

n.a.

0

n.a.

-

11-474

Renal CA

B08/13471 (3

35-22A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

-

n.a.

0

n.a.

-

n.a.

11-475

Estomago CA (+++)

B04/01221 II

43-14A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

+++

m

90

n.a.

-

11-475

Estomago CA (++)

B06/09514(5

43-14A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

(+)/+

m/c

10

n.a.

-

11-475

Estomago CA (+)

B05/09809 (4

43-14A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

-

0

n.a.

-

11-475

Renal CA

B08/13471 (3

43-14A

0,lpg/ml

Parafina

2:30 min

-

n.a.

0

n.a.

-

n.a.

Tabela 5A: Análise de tecido Normal

slide em umber

Tecido

Id tecidual

Anticorpo

Anticorpo conc.

Crio- / Parafina

desenvolvimento

Células do epitélio normal e Tecido funcional

Padrão subcelular

% células positivas

Linfócitos

Tecido fibroso

Vasos

Musculatura lisa

Tecidos graxos

11-577

Estomago

Estomago 9

35-22A

0,2 μg/m 1

Parafina

00:50

++/+++

m

90

-

n.a.

11-1756

Estomago

Estomago 9

43-14A

0,2 μg/m 1

Parafina

00:50

+++

m

>90

-

n.a.

11-580

Colon

Colon 2

35-22A

0,2 μg/m 1

Parafina

02:15

-

n.a.

-

n.a.

11-1753

Colon

Colon 2

43-14A

0.2pg/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11-586

Rim

Rim 2

35-22A

0,2 μg/m 1

Parafina

02:15

-

n.a.

-

n.a.

11-1754

Rim

Rim 2

43-14A

0.2pg/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11-589

Pulmão

Pulmão 2

35-22A

0,2 μg/m 1

Parafina

02:15

-

n.a.

-

n.a.

11-1663

Pulmão

Pulmão 2

43-14A

0,2 μg/m 1

Parafina

03:00

-

n.a.

-

n.a.

11-595

Pâncreas

Pâncreas 3

35-22A

0,2 μ g/m 1

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11-1749

Pâncreas

Pâncreas3

43-14A

0.2pg/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11-599

Figado

Figado 1

35-22A

0,2 μg/m 1

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11-1751

Figado

Figado 1

43-14A

0.2pg/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

113/118

Tabela 5B: Análise de tecido normal - 43-14 A

slide em umber

Tecido

Tecido id

Anticorpo

Anticorpo conc.

Crio- / Parafina

Desenvolvimento

Normal epithelial cells and functional tecido

Padrão subcelular

% células positivas

Linfócitos

Tecido fibroso

Vasos

Musculatura lisa

Tecido graxo

11_1748

Pâncreas

Pâncreas 5

43-14A SF

0.2ug/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11_1750

Figado

Figado 4.5

43-14A SF

0.2ug/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11_1755

Rim

Rim 3

43-14A SF

0.2ug/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11_1757

Estomago

Estomago 12

43-14A SF

0.2ug/ml

Parafina

02:15

+++

m

>90

-

n.a.

11_1758

Coração

Coração 1

43-14A SF

0.2ug/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

11_1759

Coração

Coração 2

43-14A SF

0.2pg/ml

Parafina

02:15

-

n.a.

-

Tabela 6: Análise de tecido normal - Protocolo de um dia

slide em umber

Tecido

Tecido id

Anticorpo

Anticorpo conc.

desenvolvimento

Tecido funcional

tumor tecidua!

Padrão Subcelular

% células positivas

Linfócitos

Tecido fibroso

Vasos

Musculatura lisa

Tecido graxos

11_2092

Estomago

Estomago 9

43-14 A

0,1pg/ml

03:30

++/+++

n.a.

m

>90

-

11_2092

Estomago

Estomago 9

35-22 A

0,1pg/ml

03:30

+/++

n.a.

m

>90

-

11_2093

Estomago

Estomago 9

43-14 A SF

0,1pg/ml

03:30

+++

n.a.

m

>90

-

11_2093

Estomago

Estomago 9

35-22 A SF

0,1pg/ml

03:30

+

n.a.

m

7080

-

11_2094

TMA 127 A

43-14 A

0,1pg/ml

03:30

n.a.

+/++

m

90

-

n.a.

11_2094

TMA 127 A

35-22 A

0,1pg/ml

03:30

n.a.

+

m

<5

-

n.a.

11 2095

TMA 127 A

43-14 A SF

0,1gg/ml

03:30

n.a.

+/++

m

90

-

n.a.

11_2095

TMA 127 A

35-22 A SF

0,1pg/ml

03:30

n.a.

-/(+)

c

<5

-

n.a.

Tabela 7: Análise de tecidos respiratórios normais

slide em umber	Tecido id	Anticorpo	Anticorpo conc.	Células do epitélio normal	Padrão Subcelular	% células positivas	Linfócitos	Tecido fibroso	Vasos	Musculatura lisa
11_1660	pulmão 1	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	n.a.	-	-	-
11_1660	pulmão 1	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	n.a.	-	-	-
11_1663	pulmão 2	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1663	pulmão 2	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1666	pulmão 3	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1666	pulmão 3	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1669	pulmão 4	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1669	pulmão 4	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1672	pulmão 5	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-

114/118

11_1672	pulmão 5	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1675	brônquios 1	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1675	brônquios 1	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1678	brônquios 2	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1678	brônquios 2	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1681	brônquios 3	muAb 43-14A	0,2pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1681	brônquios 3	muAb 43-14A	0,5pg/ml	-	-	-	-	-	-	-
11_1684	estomago 9	muAb 43-14A	0,2pg/ml	+++	m	>90	-	n.a.	-	-

Tabela 8: Analise de expressão de CLDN18.2 em tecidos cancerosos esofágico, pancreático e estomago usando os anticorpos monoclonais murino 43-14A e 35-22A

Tecido ID	Ab	Tecido	Detalhes do subtipo	Celulas tumorais	% células positivas
H/2010/10869 IVG	43- 14A	pâncreas CA	carcinoma celular Acinar	-	0
1125005.22	43- 14A	pâncreas CA	Carcinoma Neuroendócrino	+ +	70
H/2006/22797** IA	43- 14A	pâncreas CA	Carcinoma Neuroendócrino	-	0
B08/6284-VC	3522A	pâncreas CA	Carcinoma Neuroendócrino, NET G1	-	0
B08/8549-4	3522A	pâncreas CA	Carcinoma Neuroendócrino, NET G1	-	0
B05/8523-3	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ +	1
B06/16136-NP2	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ +	50
B07/14168	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ +	80
B07/14935	3522A	pâncreas CA	PDAC	-	0
B07/2633-III3	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	90
B07/7430	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ +	90
B08/5618-2	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	80
B10/14198-VC	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	80
B10/706-VC3	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	60
B11/2059-D	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	80
B11/4084	3522A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	90
1125005.30	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	-	0
1125005.27	43-	pâncreas	PDAC	+ +	10

115/118

	14A	CA
1125005.24	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ +	50
1125005.23	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ +	100
1125005.25	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	30
1125005.28	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	80
H/2008/13074	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	40
H/2008/13194	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	50
H/2008/380	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	90
H/2009/11847	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	15
H/2009/20336	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	90
H/2009/23598 VII B	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	40
H/2010/11569	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	80
H/2011/17191 VA	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	60
H/2009/4917	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	70
H/2010/15941	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	50
H/2010/6709	43- 14A	pâncreas CA	PDAC	+ + +	70
1125005.19	43- 14A	esôfago CA	adenocarcinoma	+ +	50
B09/1491-III-2	43- 14A	esôfago CA	adenocarcinoma	-	0
06/14957-2	43- 14A	esôfago CA	adenocarcinoma	+ +	30
1125005.17	43- 14A	esôfago CA	adenocarcinoma	+ + +	70
1083435B	43- 14A	esôfago CA	adenocarcinoma	+ +	70
10b06684-II-3	43- 14A	estomago CA	adenocarcinoma	+ + +	80
1125005.10	43- 14A	estomago CA	adenocarcinoma	+ +	30
1125005.6	43- 14A	estomago CA	adenocarcinoma	+ +	90

PDAC = adenocarcinoma do duto pancreático

116/118

Table 9: Analise da expressão de CLDN18.2 em tecidos cancerosos do pulmão usando anticorpo monoclonal de murine 43-14A

			Tumor cells
B09/147583	0,2pg/ml	tipo brônquioalveolar	-	-
B09/18323IV5	0,2pg/ml	tipo brônquioalveolar	-	-
B10/13211- VC4	0,2pg/ml	tipo brônquioalveolar	+++	80%
B07/4771-3	0,2pg/ml	carcinóide	-	-
B07/5358 II2	0,2pg/ml	carcinóide	-	-
B08/3382-1	0,2pg/ml	carcinóide	-	-
B08/8898- II6	0,2pg/ml	carcinoma celular claro	+	/12- <1o
B09/12293 II2	0,2pg/ml	carcinoma, spinocellular	-	-
B06/12562- III3	0,2pg/ml	Carcinoma, de células grandes	-	-
B06/10820II2	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	-	-
B06/108762	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	-	-
B06/16831I3	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	+++	80%
B07/03255 IV5	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	+++	5%
B07/2296-3	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	-	-
B07/709 II4	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	++	<5%
B10/12713II1	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	++	<5%
B10/141972	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	-	-
B10/16367- V2	0,2pg/ml	carcinoma, adeno	+	1 21 %
B09/1743 II3	0,2pg/ml	carcinoma, adeno, escamoso	-	-
B09/179161	0,2pg/ml	carcinoma, células grandes	-	-
B10/108143	0,2pg/ml	carcinoma, células grandes	+	1 21 %

117/118

		neuro endocrine
B010/10646	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B06/3204-2	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B08/292-2	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	++	<5%
B08/7434IV	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B09/45-2	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B10/10-2	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	+	/12- <1o
B10/11714	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B10/15779	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B10/17043	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B10/18106	0,2pg/ml	carcinoma, celular escamoso	-	-
B07/6782-1	0,2pg/ml	carcinoma; adeno, células claras	++	/12- <1o
B07/9741-5	0,2pg/ml	carcinoma; adeno, cpelulas claras	-	-
B08/164252	0,2pg/ml	neuro-endócrino de células grandes	++	<5%
B08/3019- V3	0,2pg/ml	non-small cell CA	-	-
B08/1099 V3	0,2pg/ml	nt small cell long CA	-	/12- <1o
B08/120102	0,2pg/ml	nt small cell long CA	++	/12- <1o

118/118

B10/17662- III3

0,2pg/ml

Carcinoma celular pequeno

-

1/6

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno caracterizado pelo fato de que (i) se liga a um peptídeo possuindo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6 e / ou (ii) liga-se a claudina 18.2 (CLDN18.2), em que o referido anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno se liga a CLDN18.2 por ligação de pelo menos a um epitopo dentro CLDN18.2 tendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 6, em que o anticorpo compreende (A) um anticorpo de cadeia pesada compreendendo: uma sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO: 8, uma sequência de CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:9, e uma sequência de CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:10, e um anticorpo de cadeia leve compreendendo: uma sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:12, uma sequência de CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 13,e uma sequência de CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:14, ou (B) uma anticorpo de cadeia pesada compreendendo:

uma sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:16, uma sequência de CDR2 de acordo com a SEQ ID NO:17, e uma sequência de CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:18,

Petição 870200031947, de 09/03/2020, pág. 14/26
2/6 e

uma anticorpo de cadeia leve compreendendo:

uma sequência de CDR1 de acordo com a SEQ ID NO:20, uma sequência de CDR2 de acordo com a SEQ ID NO: 21,e uma sequência de CDR3 de acordo com a SEQ ID NO:22.

2. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido CLDN18.2 é ligado à membrana da superfície celular de CLDN18.2.
3. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido CLDN18.2 está presente em células cancerígenas.
4. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que as referidas células cancerígenas são células cancerígenas expressando CLDN18.2.
5. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que as referidas células cancerígenas são selecionadas a partir do grupo que consiste em células cancerígenas gástricas, do esôfago, pâncreas, pulmão, ovário, cólon, hepáticos, cabeça-pescoço, e da vesícula biliar.
6. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que não se ligam a células nãocancerígenas excepto células epiteliais do estômago.

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3/6
7. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que não se ligam a células pulmunares não-cancerígenas.
8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
9. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo monoclonal.
10. Anticorpo caracterizado pelo fato de que é selecionado de entre o grupo consistindo de:

(i) um anticorpo produzido por ou obtenível a partir de um clone depositado sob o n° de acesso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ou DSM ACC3143 (muAB 35-22A), (ii) um anticorpo que é uma forma humanizada ou quimerizada do anticorpo em (i), (iii) um anticorpo que possui a especificidade do anticorpo sob (i), e (iv) um anticorpo compreendendo a porção de ligação ao antígeno ou local de ligação do antígeno do anticorpo em (i), ou um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo em qualquer dos itens (i) a (iv) .
11. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a porção de ligação ao antígeno ou local de ligação ao antígeno do anticorpo em

Petição 870200031947, de 09/03/2020, pág. 16/26

4/6 (i) compreende a região variável do anticorpo em (i).
12. Conjugado caracterizado pelo fato de que compreende um anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, juntamente com pelo menos um marcador detectável.
13. Hibridoma caracterizado pelo fato de que depositado sob o n° de acesso DSM ACC3144 (muAB 43-14A) ou DSM ACC3143 (muAB 35-22A).
14. Método para a detecção de CLDN18.2 ou determinar a quantidade de CLDN18.2 em uma amostra caracterizado pelo fato de que compreendendo as etapas de:

(i) contatar uma amostra com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 e (ii) detectar a formação de um complexo ou a determinação da quantidade de um complexo entre o anticorpo, o fragmento de ligação ao antigeno ou o conjugado e CLDN18.2.
15. Método para determinar se as células expressam CLDN18.2 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(i) contatar uma amostra celular com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 e (ii) detectar a formação de um complexo entre o

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5/6 anticorpo, fragmento de ligação ao antigeno ou o conjugado e CLDN18.2 expresso pelas células na referida amostra.
16. Método para o diagnóstico, monitoração ou detecção de câncer caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(i) contatar uma amostra biológica com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 e (ii) detectar a formação de um complexo e/ou determinar a quantidade de um complexo entre o anticorpo, o fragmento de ligação ao antigeno ou o conjugado e CLDN18.2.
17. Método para determinar se um câncer é tratável por uma terapia de câncer alvejando CLDN18.2 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

(i) contatar uma amostra compreendendo as células cancerígenas com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11 ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 e (ii) detectar a formação de um complexo entre o anticorpo, o fragmento de ligação ao antigeno ou o conjugado e CLDN18.2.
18. Kit de teste de diagnóstico caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo ou fragmento de ligação ao antigeno conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou o conjugado conforme definido

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6/6 pela reivindicação 12.
19. Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno conforme definido pelas reivindicações 1 a 11, o conjugado conforme definido pela reivindicação 12, o hibridoma conforme definido pela reivindicação 13, ou o método conforme definido por qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que o referido CLDN18.2 compreende a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 2 da listagem de sequências ou uma variante da referida sequência de aminoácidos.
20. Uso do anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição de diagnóstico para um método de diagnóstico, monitoração ou detecção de câncer.
21. Uso do anticorpo conforme definido por qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou o conjugado conforme definido pela reivindicação 12 caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para determinar se um câncer de um paciente pode ser tratado por uma terapia de câncer alvejando CLDN18.2.