JP2004513602A - 分泌及び膜貫通ポリペプチドとそれをコードしている核酸 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新規ポリペプチド及びこれらペプチドをコードする核酸分子を対象としている。また,ここにおいて提供されるのは、これら核酸配列を含んでなるベクター及び宿主細胞、異種ポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチド分子、本発明のポリペプチド及び本発明のポリペプチドを製造する方法である。
Description
【0001】
(発明の分野)
本発明は、一般的に、新規なDNAの同定及び単離、及び該DNAによりコードされる新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【0002】
(発明の背景)
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照されたい]。
【0003】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。新規な未変性レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
ここで我々は、新規の分泌及び膜貫通ポリペプチド、及びこれらポリペプチドをコードする新規な核酸の同定及び特徴づけを記述する。
【0004】
1.PRO213
ヒト成長停止−特異的遺伝子6(Human growth arrest−specific gene 6)(gas6)は、様々な異なる組織で発現され、血清欠乏期間中に高度に発現されて成長誘導中にネガティブに調節されることが報告されているタンパク質をコードする。Manfioletti等, Mol. Cell. Biol. 13(8):4976−4985(1993)及びStitt等, Cell 80:661−670(1995)を参照されたい。Manfioletti等(1993),前掲は、gas6プロテインが、ビタミンK依存性タンパク質ファミリーのメンバーであることを示唆しており、ここで後者のタンパク質ファミリーメンバー(例えば、プロテインS、プロテインC及びX因子が含まれる)は全て血液凝固経路において調節の役割を担っている。よって、gas6は、成長調節に関連したプロテアーゼカスケードの調節又は血液凝固カスケードにおいてある役割を担っていることが示唆される。
gas6プロテインの生理学的な重要性が分かったため、gas6に相同な新規で未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によりなされている。これらの努力の多くは、新規の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にgas6と相同性を有するもののコード配列を同定するために、哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このようなスクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照されたい]。ここで我々は、gsa6ポリペプチドに対する相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【0005】
2.PRO274
文献においてG−プロテイン共役レセプター(G−protein coupled receptors)とも呼ばれている7−膜貫通(「7TM」)タンパク質又はレセプターは、リガンドの認識と、それらリガンド内に含まれる情報の細胞の機構への続くシグナル伝達のために設計された特殊化されたタンパク質である。細胞表面レセプターの主たる目的は、各細胞が遭遇する様々な細胞外刺激から適切なリガンドを識別し、ついで細胞内シグナルをつくり出すエフェクター系を活性化させ、それによって細胞プロセスを制御することである。[Dohlman, H., Ann. Rev. Biochem., 60:653(1991)]。認識ドメインにリガンドを結合させ、細胞内ドメインに情報をアロステリックに伝達する7TMレセプターの能力は、7TMタンパク質の特殊化された特徴である。[Kenakin, T., Pharmacol. Rev., 48:413(1996)]。7TMレセプター又はG−プロテイン関連レセプターをコードする遺伝子ファミリーは、これらに限定されるものではないが、C5a、インターロイキン8及び関連したケモカインを含む多数のリガンドを認識するレセプターをコードする。この分野における研究では、細胞表面の異なるシグナルが細胞活性化の共通の経路に送られることが示唆されている。[Gerard, C.,及びGerard, N., Curr. Op. Immunol., 6:140(1994)、Gerard, C.及びGerard, N., Ann. Rev. Immunol., 12:775(1994)]。7TM又はG−プロテイン共役レセプターのスーパーファミリーには、光子、イオン及びとりわけアミノ酸のような様々なメッセージを認識可能な数百のメンバーが含まれる[Schwartz, T.W.ら, H., Trends in Pharmacol. Sci., 17(6):213(1996)]。[Dohlman, H., Ann. Rev. Biochem., 60:653(1991)]。[Schwartz, T.W.ら, H., Eur. J. Pharm. Sci., 2:85(1994)]。ここで我々は、7膜貫通セグメントレセプタータンパク質及びFn54タンパク質に対して相同性を有する新規のポリペプチド(ここではPRO274と命名)の同定について記載する。
【0006】
3.PRO300
Diff33プロテインはマウスの精巣腫瘍において過剰発現される。現在、その役割は不明であるが、癌においてある役割を担っていると思われる。癌の生理の理解の医学的な重要性が分かっているので、癌に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力が現在なされている。ここで我々は、ここではPRO300と命名したDiff33に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【0007】
4.PRO284
新規な膜貫通ポリペプチドを同定し特徴づけるための努力が現在なされている。ここで我々は、PRO284と命名した新規の膜貫通ポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0008】
5.PRO296
癌細胞は、しばしは、対応する正常な細胞型では発現されないか、対応する正常な細胞型におけるものとは異なるレベルで発現される数多くのタンパク質を発現する。これらタンパク質の多くは、正常な細胞から癌細胞への形質転換の誘発、又は癌表現型の維持に関与している。このように、癌細胞で発現されるタンパク質を同定し特徴づけることにはかなりの関心がある。ここで我々は、ここでPRO296と命名した肉腫増幅タンパク質SASに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0009】
6.PRO329
免疫グロブリン分子は、多くの重要な哺乳類の生理的プロセスにおいて役割を担っている。免疫グロブリン分子の構造は広範囲に研究されており、無傷の免疫グロブリンは、その一つが免疫グロブリン分子の定常領域又はFc領域である異なるドメインを有していることが十分に実証されている。免疫グロブリンのFcドメインは、抗原の認識と結合に直接には関与してはいないが、その各抗原と複合化されていまいとも複合されていようとも、免疫グロブリン分子の、血清中を循環しているか細胞表面にあるFcレセプターに結合する能力を媒介する。免疫グロブリンのFcレセプター分子への結合能力は、例えば望まれない外来粒子に対する免疫反応をなさせることを含む様々な重要な活性を生じる。このように、新規なFcレセプタータンパク質とそのサブユニットの同定にはかなりの関心がある。ここで我々は、ここにPRO329と命名した、高親和性免疫グロブリンFcレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0010】
7.PRO362
結腸直腸ガン腫は、西側諸国、特に米国において高い発症率を有する悪性新生物疾患である。この種の腫瘍はしばしばリンパ又は導管チャンネルを通して転移し、米国において年間約62000人を死に至らしめる。
モノクローナル抗体A33(mAbA33)は、結腸直腸癌腫に羅患した患者において広範な前臨床分析及び局在化研究を受けたマウス免疫グロブリンである(Welt等, J. Clin. Oncol. 8:1894−1906(1990)及びWelt等, J. Clin. Oncol. 12:1561−1571(1994))。mAbA33は、正常な結腸細胞及び結腸ガン細胞の内部及びその表面で見出される抗原に結合することが分かった。結腸粘膜から派生した癌腫において、A33抗原は、95%を越えるケースで均一に発現している。しかし、A33抗原は、他の広範囲の正常な組織では検出されておらず、すなわちその発現は、むしろ器官特異的であると思われる。従って、A33抗原は結腸直腸ガンの誘発において重要な役割を担っていると思われる。
腫瘍細胞の形成及び/又は増殖におけるA33抗原の明らかな重要性が分かったため、A33抗原の相同体の同定にはかなりの関心がある。この点で、我々は、ここでPRO362と命名した、A33抗原に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけをここに記載する。
【0011】
8.PRO363
細胞表面タンパク質HCARは、アデノウイルスのサブグループC及びコクサッキーウイルスのサクグループBに対するレセプターとして作用する膜結合タンパク質である。よって、HCARは細胞へのウイルス感染を媒介する手段を提供するものであり、細胞表面上にHCARレセプターが存在すると、ウイルス粒子に対する結合部位が提供され、それによってウイルス感染が促進される。
膜結合タンパク質、特にウイルスに対する細胞表面レセプターを提供するものの生理学的重要性に鑑みて、新規で未変性の膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の双方により現在なされている。これらの多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでPRO363と命名した、A33及びガン胎児抗原を含む様々な腫瘍抗原及び細胞表面タンパク質HCARに対して相同性を有する新規な膜結合ポリペプチドポリペプチドをここに記載するもので、このポリペプチドは新規な細胞表面ウイルスレセプター又は腫瘍抗原でありうる。
【0012】
9.PRO868
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死の間のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴づけられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される[例えば、Barr等, Bio/Technology, 12:487−493(1994);Steller等, Science, 267:1445−1449(1995)を参照]。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる[Itoh等, Cell, 66:233−243(1991)]。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、ガン、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している[Thompson, Science, 267:1456−1462(1995)]。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している[Thompson, 上掲を参照されたい]。
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている[Raff, Nature, 356:397−400(1992);Steller, 上掲;Sachsら, Blood, 82:15(1993)]。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る[Watanabe−Fukunaga等, Nature, 356:314−317(1992)]。また、幾つかの同定された発ガン遺伝子、例えばmyc、rel、及びE1A、及び腫瘍サプレッサー、例えばp53が、アポトーシスを誘発する際にある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている[Thompson, 上掲]。
【0013】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子−α(「TNF−α」)、腫瘍壊死因子−β(「TNF−β」又は「リンホトキシン−α」)、リンホトキシン−β(「LT−β」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX−40リガンド、4−1BBリガンド、Apo−1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、及びApo−2リガンド(トレイル(TRAIL)とも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーのメンバーとして同定された[例えば、Gruss及びDower, Blood, 85:3378−3404(1995);Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12687−12690(1996);Wiley等, Immunity, 3:673−682(1995);Browningら, Cell, 72:847−856(1993);Armitage等, Nature, 357:80−82(1992)、1997年1月16日に公開されたWO97/01633;1997年7月17日に公開されたWO97/25428]。これらの分子のなかでも、TNF−α、TNF−β、CD30リガンド、4−1BBリガンド、Apo−1リガンド、及びApo−2リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。TNF−αとTNF−βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている[Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881(1986);Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17:689(1987)]。Zheng等は、TNF−αがCD8ポジティブT細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している[Zheng等, Nature, 377:348−351(1995)]。他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性T細胞の欠失に関与していることを報告している[Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)]。
マウスのFas/Apo−1レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれ1pr及びgldと呼ばれる)における変異は幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Apo−1リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去を調節する役割を担っていることを示している[Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6:279−289(1994);Nagata等, Science, 267:1449−1456(1995)]。また、Apo−1リガンドは、CD4ポジティブTリンパ球及びBリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している[Krammer等, 上掲;Nagata等, 上掲]。Apo−1レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、TNF−αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている[Yonehara等, J. Exp. Med., 169:1747−1756(1989)]。
【0014】
このようなTNFファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約55−kDa(TNFR1)と75−kDa(TNFR2)の2つの異なるTNFレセプターが同定されており[Hohman等, J. Biol. Chem., 264:14927−14934(1989);Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127−3131(1990);1991年3月20日に公開されたEP417563]、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスcDNAが単離され、特徴づけされている[Loetscher等, Cell, 61:351(1990);Schall等, Cell, 61:361(1990);Smith等, Science, 248:1019−1023(1990);Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830−2834(1991);Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11:3020−3026(1991)]。広範な多型性が、双方のTNFレセプター遺伝子に関連している[例えば、Takao等, Immunogenetics, 37:199−203(1993)を参照]。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性TNF結合タンパク質として天然に見出される[Nophar, Y等, EMBO J., 9:3269(1990);及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331(1990)]。更に最近になって、組換え体可溶性TNFレセプターのクローニングがヘイル(Hale)等[J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)]により報告されている。
1型又は2型のTNFR(TNFR1及びTNFR2)の細胞外部分は、NH2末端から出発して、1〜4とされる4つのシステインに富んだドメイン(CRD)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各CRDは約40のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に4〜6のシステイン残基を含んでいる[Schall等, 上掲;Loetscher等, 上掲;Smith等, 上掲;Nophar等, 上掲;Kohno等, 上掲]。TNFR1において、4つのCRDのおおよその境界は次の通りである:CRD1−14から約53までのアミノ酸;CRD2−約54から約97までのアミノ酸;CRD3−約98から約138までのアミノ酸;CRD4−約139から約167までのアミノ酸。TNFR2において、CRD1は、17〜約54までのアミノ酸を、CRD2は約55から約97までのアミノ酸を;CRD3は約98から約140までのアミノ酸を;CRD4は約141から約179までのアミノ酸を含む[Banner等, Cell, 73:431−435(1993)]。また、リガンド結合におけるCRDの可能な役割は前掲のBanner等により記載されている。
【0015】
CRDの類似の反復パターンが、p75神経成長因子レセプター(NGFR)[Johnson等, Cell, 47:545(1986);Radeke等, Nature, 325:593(1987)]、B細胞抗原CD40[Stamenkovic等, EMBO J., 8:1403(1989)]、T細胞抗原OX40[Mallet等, EMBO J., 9:1063(1990)]及びFas抗原[Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66:233−243(1991)]を含むいくつかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、CRDはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型TNFR(sTNFR)様のT2タンパク質にも見出されている[Upton等, Virology, 160:20−29(1987);Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335(1991);Upton等, Virology, 184:370(1991)]。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、TNF/NGFレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。p75NGFRに関する最近の研究では、このドメインにおけるCRD1の欠失[Welcher, A.A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159−163(1991)]又は5−アミノ酸の挿入[Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099−12104(1991)]は、NGF結合には殆ど又は全く影響を持たないことが示されている[Yan. H及びChao, M.V., 上掲]。p75NGFRはNGF結合に関与せず、そのCRD4と膜貫通領域の間に約60のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む[Peetre, C等, Eur. J. Hematol.、41:414−419(1988);Seckinger, P等, J. Biol. Chem., 264:11966−11973(1989);Yan. H及びChao, M.V., 上掲]。同様のプロリンに富んだ領域はTNFR2に見出されているが、TNFR1にはない。
リンフォトキシン−αを除き、今日までに同定されているTNFファミリーのリガンドは、II型の膜貫通タンパク質であり、そのC−末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているTNFレセプター(TNFR)ファミリーのレセプター類はI型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ECD」)において見出されている。TNF−α、Apo−1リガンド及びCD40リガンドを含むTNFファミリーサイトカインの幾つかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され;それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、TNFレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインのインヒビターとして機能し得る可溶性レセプターのECDを放出する。
【0016】
最近、TNFRファミリーの他のメンバーが同定されている。このようなTNFRファミリーの新規に同定されたメンバーには、CAR1、HVEM及びオステオプロテグリン(osteoprotegerin:OPG)[Brojatsch等, Cell, 87:845−855(1996);Montgomery等, Cell, 87:427−436(1996);Marsters等, J. Biol. Chem., 272:14029−14032(1997);Simonet等, Cell, 89:309−319(1997)]が含まれる。他の既知のTNFR様分子と異なり、Simonet等, 上掲,は、OPGは疎水性の膜貫通−スパンニング配列を含んでいないと報告している。
更に、「グルココルチコイド−誘発性腫瘍壊死因子レセプターファミリー−関連遺伝子」に対して「GITR」と呼ばれるレセプターである、TNF/NGFレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにおいて同定されている[Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216−6221(1997)]。マウスGITRレセプターは、正常なマウスの胸腺、脾臓及びリンパ節からのTリンパ球中に発現される228のアミノ酸からなるI型膜貫通タンパク質である。マウスGITRレセプターの発現は、抗CD3抗体、ConA又はホルボール−12−ミリスタート−13−アセタートで活性化されたTリンパ球において誘発される。マウスGITRレセプターはT細胞レセプター−媒介性細胞死に関連していると著者は推測している。
Marsters等,Curr. Biol., 6:750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復につおいてTNFRファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でTNFR1及びCD95に似ており、Apo−3と称される、ヒトのポリペプチドの全長天然配列を開示している[Marsters等,Curr. Biol., 6:1669(1996)]。他の研究者には、Apo−3はDR3、wsl−1及びTRAMPとも称されている[Chinnaiyan等, Science, 274:990(1996);Kitson等, Nature, 384:372(1996);Bodmer等, Immunity, 6:79(1997)]。
【0017】
Pan等は、「DR4」と称される他のTNFレセプターファミリーのメンバーを開示している[Pan等, Science, 276:111−113(1997)]。DR4は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。Pan等は、DR4がApo−2リガンド又はTRAILとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridan等, Science, 277:818−821(1997)及びPan等, Science, 277:815−818(1997)には、Apo−2リガンド(TRAIL)に対するレセプターであると考えられている他の分子が記載されている。その分子はDR5と称されている(またApo−2とも称されている)。同様に、DR4、DR5は細胞質死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグンル伝達しうることが報告されている。
Sheridan等, 上掲,において、DcR1(又はApo−2DcR)と呼ばれるレセプターは、Apo−2リガンド(TRAIL)に対する可能なデコイレセプター(decoy receptor)であるとして開示されている。Sheridan等は、DcR1がApo−2リガンドの機能をインビトロで阻害可能であると報告している。また、TRIDと称されるデコイレセプターの開示については、Pan等, 上掲,が参照される。
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、Gruss及びDower, 上掲を参照されたい。
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも3つの重要な要素−活性化因子、インヒビター及びエフェクターを含む;線虫(C. elegans)において、これらの成分はそれぞれ3つの遺伝子、Ced−4、Ced−9及びCed−3によりコード化されている[Steller, Science, 267:1445(1995);Chinnaiyan等, Science, 275:1122−1126(1997);Wang等, Cell, 90:1−20(1997)]。TNFRファミリーのメンバーの2つ、TNFR1及びFas/Apol(CD95)は、アポトーシス性細胞死を活性化しうる[Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6:555−562(1996);Fraser及びEvan, Cell, 85:781−784(1996)]。また、TNFR1は、転写因子、NF−κBの活性化を媒介することも知られている[Tartaglia等, Cell, 74:845−853(1993);Hsu等, Cell, 84:299−308(1996)]。ある程度のECD相同性に加えて、これら2つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ICD)での相同性を共有する[Tartaglia, 上掲;Nagata, Cell, 88:355(1997)]。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)、及びFADD/MORT1、TRADD及びRIPと称される哺乳動物タンパク質中においても見出されている[Cleaveland及びIhle, Cell, 81:479−482(1995)]。
【0018】
リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、TNFR1とCD95は死亡誘発性シグナル伝達複合体にFADDを補充するものと考えられている。言われるところによれば、CD95はFADDに直接結合する一方、TNFR1はTRADDを介して間接的にFADDに結合する[Chinnaiyan等, Cell, 81:505−512(1995);Boldin等, J. Biol. Chem., 270:387−391(1995);Hsu等, 上掲;Chinnaiyan等, J. Biol. Chem., 271:4961−4965(1996)]。FADDは、Ced−3−関連プロテアーゼ、MACHα/FLICE(カスパーゼ8)を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプターとなることが報告されている[Boldin等, Cell, 85:803−815(1996);Mizio等, Cell, 85:817−827(1996)]。MACHα/FLICEは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン−1β変換酵素(ICE)及びCPP32/Yamaを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる[Fraser及びEvan, 上掲]。
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ced−3、及び哺乳動物のIL−1−変換酵素、ICEに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ICE及びCPP32/Yamaプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、crmAの産物により阻害されうる[Ray等, Cell, 69:597−604(1992);Tewari等, Cell, 81:801−809(1995)]。最近の研究では、CrmAがTNFR1−及びCD95−誘発細胞死を阻害しうることが示されている[Enari等, Nature, 375:78−81(1995);Tewari等, J. Biol. Chem., 270:3255−3260(1995)]。
Tewari等により最近レビューされているように、TNFR1、TNFR2及びCD40は、転写因子、NF−κBの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する[Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6:39−44(1996)]。NF−κBは、そのサブユニットが保存Rel領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である[Verma等, Genes Develop., 9:2723−2735(1996);Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649−681(1996)]。その潜伏形態において、NF−κBはIκBーインヒビターファミリーのメンバーと複合化しており;所定の刺激に反応してIκBの不活性化の際に、放出されたNF−κBが、特異的DNA配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
【0019】
10.PRO382
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々のセリン含有タンパク質に対して特異的な活性を示すセリンプロテアーゼを含む、種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方により現在なされている。これらの努力の多くは、新規な膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照]。我々は、ここでPRO382と命名した、セリンプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0020】
11.PRO545
メルトリン(meltrin)がメンバーである、ADAM[ディスインテグリン(Disintegrin)及びメタロプロテアーゼ]タンパク質ファミリーは、細胞の相互作用及び細胞反応の変調において重要な役割を有しうる。[例えば、Gilpin等, J. Biol. Chem., 273(1):157−166(1998)]。ADAMタンパク質は発ガンに関与していた。メルトリン−α(ADAM12)は細胞融合に必要であると報告されている筋芽細胞遺伝子産物である。[Harris等, J. Cell. Biochem., 67(1):136−142(1997)、Yagami−Hiromasa等, Nature, 377:652−656(1995)]。メルトリンはディスインテグリン及びメタロプロテアーゼを含有し、インテグリン−結合ディスインテグリンドメインを通じて、発達に関与している細胞接着現象に関連しているが、亜鉛依存性メタロプロテアーゼドメインを通して抗接着機能も有している。[Alfandari等, Devel. Biol., 182(2):314−330(1997)]。発ガン及び他の疾患のメカニズムにおける細胞接着及び細胞応答の変調の医学的な重要性が分かっているので、現在、細胞接着及び細胞応答の変調に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここではPRO545と命名した、メルトリンに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0021】
12.PRO617
CD24は、好中球、単球及びある種のリンパ球、例えばBリンパ球を含む、哺乳類の免疫系の種々の異なる細胞の細胞表面に結合しているタンパク質である。CD24は、血小板結合性表面糖タンパクP−セレクチン(また、顆粒膜プロテイン−140すなちGMP−140)に対するリガンドであることが分かっており、該糖タンパク質は血小板及び内皮細胞の両方で構成的に合成され、その細胞が活性化すると血小板表面に現れる。このように、P−セレクチンは、活性化した血小板及び内皮細胞の、P−セレクチン分子に対する一又は複数のリガンド、特にCD24を発現する免疫系の種々の細胞へのカルシウム依存的接着を媒介する。このメカニズムにより、それらが最も必要とされている位置、例えば損傷部位に、免疫系細胞を補充することができる。よって、免疫系細胞の細胞表面抗原に対する相同性を示す新規のポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。ここで我々は、CD24タンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規のポリペプチドはここではPRO617と命名される。
【0022】
13.PRO700
タンパクジスルフィドイソメラーゼ(PDI)は、タンパク質の折り畳み中の異性化及びジスルフィド形成を触媒する酵素である。チオレドキシンに相同な2つのドメイン内に存在する2つの触媒部位を有するもので、その一方はN末端近傍にあり、他方はC末端近傍にある。[例えば、Gilbert HF, J. Biol. Chem., 47:29399−29402(1997)、Mayfield KJ, Science, 278:1954−1957(1997)及びPuig等, J. Biol. Chem., 52:32988−32994(1997)を参照]。PDIは原核細胞で生産されるタンパク質における天然型のジスルフィド結合の形成に有用である。(米国特許第5700659号及び同5700678号も参照のこと)。
よって、PDI及びそれに関連する分子は、特にジスルフィド結合の形成を触媒する能力のために興味がある。更に、これらの分子は、酸化還元反応及び関連プロセスの研究において、一般的に関心を持たれている。更に、PDI及び関連分子は、Darby等, Biochemistry 34, 11725−11735(1995)に記載されている。我々は、ここでPRO700ポリペプチドと命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0023】
14.PRO702
コングルチニンは、当初は脊椎動物のレクチンタンパク質として記載され、4つの特徴あるドメイン、(1)N末端システイン−リッチドメイン、(2)コラーゲン様ドメイン、(3)ネックドメイン及び(4)炭水化物認識ドメイン(CRD)を有するC型レクチンのファミリーに属すウシ血清タンパク質である。最近の報告では、ウシコングルチニンはそのレクチン特性のために、インフルエンザA型ウイルスによる血球凝集を阻害可能であることが実証されている(Eda等, Biochem. J. 316:43−48(1996))。また、コングルチニン等のレクチンは、補体媒介メカニズムであるために、免疫グロブリン非依存性防御分子(defense molecules)として機能しうることが示唆されている。よって、コングルチニンはインビトロにおける免疫複合体の精製、及びインビボにおける患者の血漿からの循環免疫複合体の除去に有用であることが示されている(Lim等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:260−266(1996))。我々は、ここでPRO702と命名した、コングルチニンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0024】
15.PRO703
超長鎖アシル−CoA合成酵素(「VLCAS」)は、長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送において活性な長鎖脂肪酸輸送タンパク質である。[例えば、Uchida等, J. Biochem(Tokyo) 119(3):565−571(1996)及びUchiyama等, J. Biol. Chem 271(48):30360−30365(1996)]。脂肪酸の輸送メカニズムの生物学的な重要性が分かったために、現在、脂肪酸輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO703と命名した、VLCASに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0025】
16.PRO705
グリピカン(glypican)は、その細胞表面局在化とヘパリン硫酸鎖の所有により、多くのヘパリン結合成長因子、細胞接着分子及び細胞外マトリックス成分に対する細胞の応答性を調節することができるグルコシルホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカープロテオグリカンのファミリーである。一つのグリピカンタンパク質における変異がヒト出生欠損症候群の原因であり、これはグリピカンが発育において重要な役割を担っていることを示唆している(Litwack等, Dev. Dyn. 211:72−87(1998))。また、グリピカンは様々な細胞外マトリックスと相互作用しうるため、創傷治癒においても重要な役割を担っている(McGrath等, Pathol. 183:251−252(1997))。更に、グリピカンはニューロン及び神経膠腫細胞中で発現するため、神経系の細胞生存及び細胞分割の調節においても重要な役割を担っている(Liang等, J. Cell. Biol. 139:851−864(1997))。よって、グリピカンがプロテオグリカンの極めて重要なファミリーであることは明らかである。従って、グリピカンファミリーのメンバーに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO705と命名した、K−グリピカンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0026】
17.PRO708
アリールスルファターゼは、アリールスルファターゼA(ASA)、アリールスルファターゼB(ASB)及びアリールスルファターゼC(ASC)を含む、多くの異なるイソ型で存在し、種々の異なる芳香族スルファートを加水分解するように機能する酵素である。アリールスルファターゼは、種々の異なる動物組織及び微生物源から単離され、その構造及び機能は広範囲に研究されている(例えば、Nichol及びRoy, J.Biochem. 55:643−651(1964))。ASA欠乏は、異染性ロイコジストロフィー(MLD)に関連していることが報告されている(Giles等, Prenat. Diagn. 7(4):245−252(1987)及びHerska等, Am. J. Med. Genet. 26(3):629−635(1987))。更に、他のグループはアリールスルファターゼが免疫系のナチュラルキラー細胞において高レベルで見出されていることを報告しており、NK細胞媒介性細胞溶解における、これらの酵素の可能な役割を仮定している(例えば、Zucker−Franklin等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(22):6977−6981(1983))。アリールスルファターゼ酵素の明らかな生理学的な重要性が分かっているため、新規なアリールスルファートに相同なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、アリールスルファターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規なポリペプチドはここではPRO708ポリペプチドと命名される。
【0027】
18.PRO320
フィブリン(fibulin)−1は、基底膜及び結合組織弾性繊維及び血漿タンパク質の、システインに富む、カルシウム結合性細胞外マトリックス(ECM)成分であり、選択的スプライシングにより得られるA〜Dの4つのイソ型を有する。フィブリン−1はアミノ末端アナフィラトキシン様分子に9つの表皮成長因子(EGF)様分子が続き、選択的スプライシングに応じて4つの可能なカルボキシル末端を有するモジュラー糖タンパク質である。フィブリン−2は、フィブロネクチン又はフィブリリンを含むミクロフィブリルと密に結合して頻繁に見出される新規な細胞外マトリックスタンパク質である。それらのRNA先駆物質を選択的にスプライシングするプロセスにより、C末端領域が異なる多様な形態のフィブリン−1が存在する。[例えば、Tran等, Matrix Biol 15(7):479−493(1997)]。
患者から取り出された悪性細胞株及び無胸腺マウスにおいて形成された腫瘍から確立した16細胞株のノーザン及びウエスタンブロット分析により、フィブリン−1Dの低発現性が、腫瘍の形成及び浸潤においてある役割を担っていることを示している[Qing等, Oncogene, 18:2159−2168(1997)]。卵巣ガン細胞は腹腔を自由に浸潤する能力により特徴づけられている。エストラジオールはエストロゲンレセプター(ER)−ポジティブ卵巣ガン細胞の増殖、並びにフィブリン−1の発現を刺激することが実証されている。MDA−MB231乳ガン細胞株の運動性に対するフィブリン−1の効果についての研究により、MDA−MB231細胞の走触性遊走の阻害が示され、著者は、フィブリン−1がインビトロにおけるガン細胞の運動性を阻害しえ、よって腫瘍の浸潤を阻害する可能性を有していると結論付けた。[Hayashido等, Int J Cancer 75(4):654−658(1998)]。
よって、フィブリン及びその関連分子は、特にガンを予防する用途において関心を持たれている。更にこれらの分子は、一般的に結合組織及び付着分子及び関連するメカニズムの研究において関心が持たれている。フィブリン及びその関連分子は、Adams等, J. Mol. Biol., 272(2):226−36(1997);Kielty及びShuttleworth, Microsc. Res. Tech., 38(4):413−27(1997);及びChild. J. Card. Surg. 12(2Supp.):131−5(1997)に更に記載されている。
我々は、ここでPRO320ポリペプチドと命名した、フィブリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0028】
19.PRO324
オキシドレダクターゼは、反応に入る水分子と共に、一方の分子が酸化され、他方の分子が還元されるように化合物の2分子が相互作用する反応を触媒する酵素である。哺乳類生物において非常に重要な生理学的役割を担っている多くの異なる種類のオキシドレダクターゼ酵素がある。最も重要なオキシドレダクターゼには、例えばリアーゼ、ラクターゼ、コレステロールオキシダーゼ等が含まれる。これらの酵素は、消化、シグナル伝達及びイオン的ホメオスタシスの維持等のような必須のプロセスにおいてある役割を担っている。このように、オキシドレダクターゼ酵素には、哺乳類生物における種々の必須の用途が見出されているため、新規なオキシドレダクターゼ酵素の相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO324と命名した、オキシドレダクターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0029】
20.PRO351
プロスタシン(prostasin)はヒト精液から精製されるヒトセリンプロテアーゼである。免疫組織化学的局在化により、プロスタシンは上皮細胞及び前立腺の導管に存在することが明らかにされている。プロスタシンのcDNAはクローニングされ、特徴づけられている。サザンブロット分析と、続く逆転写ポリメラーゼ連鎖反応では、プロスタシンmRNAが前立腺、肝臓、唾液腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、気管支、腎近位尿細管細胞、及び前立腺癌腫LNCaP細胞で発現していることが示されている。プロスタシンmRNAの細胞局在化はインシトゥーのハイブリッド形成組織化学により、ヒトの前立腺の上皮細胞内において同定された。[例えば、Yu等, J. Biol. Chem. (1994) 269(29):18843−18848、及びYu等, J. Biol. Chem. (1994) 270(22):13483−13489を参照]。
よって、プロスタシン及びその関連分子は、前立腺に関与する医学的症状の研究、診断及び治療において特に関心がもたれている。プロスタシン及び関連分子は、Yu等, Genomics (1996) 32(3):334−340にも更に記載されている。我々は、ここでPRO351ポリペプチドと命名した、プロスタシンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0030】
21.PRO352
ブチロフィリン(butyrophilin)は、哺乳類の乳の脂肪球膜に結合した全タンパク質の40%以上を構成している乳糖タンパク質である。ブチロフィリンmRNAの発現は、妊娠終期での乳脂肪の生成の開始と相関しており、乳汁分泌期を通して維持されていることが示されている。ブチロフィリンはウシ、マウス及びヒトにおいて同定されており(Taylor等, Biochim. Biophys. Acta 1306:1−4(1996)、Ishii等, Biochim. Biophys. Acta 1245:285−292(1995)、Mather等, J. Dairy Sci. 76:3832−3850(1993)及びBanghart等, J. Biol. Chem. 273:4171−4179(1998)を参照)、脂肪グロブリン膜内に取り込まれるI型膜貫通タンパク質である。ブチロフィリンは、キサンチンデヒドロゲナーゼ/オキシダーゼ及び授乳の間の尖端表面からの乳脂肪小球の発芽と放出において機能する他のタンパク質との複合体の集合体に対する主要な足場としての役割を果たしうることが示唆されている(Banghart等, 上掲)。
ブチロフィリンは、哺乳類の乳生成において明らかに重要な役割を担っているので、新規なブチロフィリン相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO352と命名した、ブチロフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0031】
22.PRO381
イムノフィリンはサイクロスポリンA、FK506及びラパマイシン等の免疫抑制剤に対するレセプターとして機能するタンパク質ファミリーである。イムノフィリンには、2つの別個のクラス、すなわち(1)FK506及びラパマイシンに結合するFK506−結合タンパク質(FKBP)と、(2)サイクロスポリンAに結合するサイクロフィリンとして生じる。FK506−結合タンパク質に関しては、FK506/FKBP複合体は、セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ2B(カルシニュリン)の活性を阻害する機能を有し、よって免疫抑制活性をもたらすと報告されている。また、FKBPイムノフィリンは哺乳類の神経系で見出されており、免疫抑制をなすプロセスとは独立したメカニズムを通しての中枢神経系における軸索再生に関与していると報告されている(Gold, 上掲)。よって、FKBPイムノフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO381と命名した、FKBPイムノフィリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0032】
23.PRO386
哺乳類の細胞膜は種々の細胞及び組織の構造的完全性及び活性に関する非常に重要な機能を果たす。膜の生理において特に関心があるのは、種々の生理学的、薬理学的及び細胞プロセスを直接制御するように作用する膜貫通イオンチャンネルの研究である。カルシウム(Ca)、ナトリウム(Na)及びカリウム(K)チャンネルを含む数多くのイオンチャンネルが同定されており、各々が詳細に分析されて、脊椎動物及び昆虫の細胞の生理学的プロセスにおけるその役割が決定されている。
細胞膜随伴イオンチャンネルの一タイプであるナトリウムチャンネルは、イオン的ホメオスタシスを維持し、並びに細胞内及び細胞外シグナルを伝達する細胞の能力において極めて重要な役割を担っている。脳ニューロンの電位作動型ナトリウムチャンネルは、孔形成αユニットの、より小さいβ−1及びβ−2サブユニットとの複合体であることが示されている(Isom等, Cell 83:433−442(1995))。細胞ホメオスタシス及び他の重要な生理学的機能におけるナトリウムチャンネルの明らかな重要性が分かっているので、ナトリウムチャンネルサブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO386と命名した、ラットのナトリウムチャンネルのβ−2サブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0033】
24.PRO540
ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼとしても知られているレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ(「LCAT」)は、特にコレステロールの代謝プロセスにおける、高密度リポタンパク質の血管内代謝のキー酵素である。[例えば、Brousseau等, J. Lipid Res., 38(12):2537−2547(1997)、Hill等, Biochem. J., 294:879−884(1993)、及びDrayna等, Nature 327(6123):632−634(1987)]。脂質代謝の医学的な重要性が分かっているため、現在、脂質輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO540と命名した、LCATに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0034】
25.PRO615
シナプトギリン(synaptogyrin)は神経系に均一に分布しているシナプス小胞タンパク質である。シナプトギリンをコードするcDNAはクローニングされ、配列決定されており、その配列により、4つの膜スパンニングドメインを有する25,900Dの分子量のタンパク質であると考えられている。シナプトギリンは、血漿膜まで及び血漿膜からの膜輸送に関連している。Stenius等, J. Cell. Biol. 131(6−2):1801−1809(1995)。加えて、セルギリン(cellugyrin)と称される新規のシナプトギリンの新規なイソ型は、シナプトギリンと配列同一性を示す。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。セルギリンはテストした全ての組織に遍在し、脳組織で最もレベルが低かったが、これに対しシナプトギリンタンパク質は脳でのみ検出可能である。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。シナプス小胞タンパク質であるシナプトギリンは、偏在性タンパク質であるセルギリンが特殊化したものでありえ、2つのタンパク質は構造的類似性を共有しているが、局在化が異なる。この知見は、シナプス小胞を、ジェネリックな輸送オルガネラの単純化及び特殊化形態としての新しい概念を支持する[Janz等, J. Biol. Chem. 273(5):2851−2857(1998)]。ノルウェーラット、ラッタスノルベジカス(Rattus norvegicus)から得られたセルギリンの配列は、受託番号AF039085として1997年12月23日にジェンバンクデータベースに寄託されている。また、Janz等, J. Biol. Chem. 273(1998)、印刷中を参照されたい。
シナプス伝達の医学的な重要性が分かっているため、現在、シナプス小胞の形態の単純化又は特殊化したジェネリックな輸送オルガネラの一部でありうる、新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO615と命名した、シナプトギリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0035】
26.PRO618
エンテロペプチターゼは、トリプシノーゲンから酸性プロペプチドを特異的に開裂させて活性トリプシンを産出させる、腸内の消化カスケードにおけるキー酵素である。この開裂により、多くの膵臓チモーゲンの活性化に至るタンパク分解反応のカスケードが始まる。
例えば、Matsushima等, J. Biol. Chem. 269(31):19976−19982(1994)、Kitamoto等, Proc. Natl. Acad. Sci., 91(16):7588−7592(1994)を参照。エンテロキナーゼ(エンテロペプチターゼ)は、消化、凝固及び繊維素溶解に関連する哺乳類のセリンプロテアーゼに関連している。La Vallie等, J. Biol. Chem., 268(31):23311−23317(1993)。
消化プロセスの医学的な重要性が分かっているため、現在、消化、凝固及び繊維素溶解に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO618と命名された、エンテロペプチターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0036】
27. PRO719
リポタンパクリパーゼは、循環する血漿リポタンパク質中に存在するリン脂質とトリグリセリドの加水分解を媒介するキー酵素である(Dugi等, J. Biol. Chem., 270:25396−25401(1995))。更に、リポタンパクリパーゼは細胞内へのリポタンパク質の取り込みを媒介することが知られており、ここでリポタンパク質の細胞への取り込みは、細胞表面のプロテオグリカン及び低密度リポタンパク質(LDL)レセプター関連タンパク質にリポタンパクリパーゼが結合することから開始される(Krapp等, J. Lipid Res. 36:2362−2373(1995))。よって、リポタンパクリパーゼがリポタンパク質及びコレステロール代謝において極めて重要な役割を担っていることは明らかである。よって、リポタンパクリパーゼと、配列相同性及び/又は生物学的活性を共有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO719と命名された、リポタンパク質リパーゼHに対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0037】
28.PRO724
低密度リポタンパク質(LDL)レセプターは、そのリガンド、アポリポタンパク質(apo)B−100及びapoEに対する高親和結合性により、リポタンパク質粒子の細胞への取り込みを媒介する、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を担っている膜結合タンパク質である。LDLレセプターのリガンド結合ドメインは、約40のアミノ酸からなる7つのシステインリッチの反復部を含み、各反復部は、3つの反復内ジスルフィド結合を形成する6つのシステインを含んでいる。これらの独特の構造的特徴により、LDLレセプターにはapoB−100及びapoEと特異的に相互作用する能力が付与され、これにより細胞膜を通過してこれらのリポタンパク質を輸送すること、及びそれらの成分を代謝することが可能になる。LDLレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片には、その特異的なリポタンパク質リガンドと相互作用する能力が保持されていることが示されている(Simmons等, J. Biol. Chem. 272:25531−25536(1997))。よって、LDLレセプターがコレステロール代謝に係る重要な生理学的活性に密接に関与していることは明らかである。このように、新規なLDLレセプターに相同なタンパク質を同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO724と命名した、ヒトLDLレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0038】
29.PRO772
ヒト遺伝子A4の発現は結腸上皮で多く、インビボにおける結腸上皮細胞の分化で転写的に活性化される(Oliva等, Arch. Biochem. Biophys. 302:183−192(1993)及びOliva等, Am. J. Physiol. 272:C957−C965(1997))。A4cDNAは約17キロダルトンの大きさのポリペプチドであると予想される読み取り枠を含んでいる。A4タンパク質のヒドロパシー分析により、4つの推定膜スパンニングのαヘリックスが明らかになった。A4タンパク質が発現している細胞の免疫細胞化学的研究によれば、発現は小胞体に局在化していた。A4タンパク質の4つの膜スパンニングドメイン及び生物物理学的特徴によれば、それは、その幾つかが多量体化してイオンチャンネルを形成する、プロテオリピドと呼ばれる完全な膜タンパク質のファミリーに属することが示唆される。事実、予備的証拠においても、A4がそれ自身で多量体化し、イオンチャンネルの性質を獲得することが示唆されている(Oliva等, Am. J. Physiol. 272:C957−C965(1997))。細胞ホメオスタシスの維持におけるイオンチャンネルの重要性が分かっているため、既知及び推定のイオンチャンネルに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO772と命名した、推定イオンチャンネルタンパク質、A4に対する相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0039】
30.PRO852
プロテアーゼは哺乳類又は非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。 種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は多くの異なる生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規で未変性のプロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照]。我々は、ここでPRO852ポリペプチドと命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0040】
31.PRO853
細胞のレドックス状態は細胞の運命の重要な決定因子であることが、ある研究において報告されている。更に反応性酸素種は、組織壊死、器官機能不全、アテローム性動脈硬化、不妊症、出生欠損症、時期尚早の加齢、変異及び悪性腫瘍を含む炎症性疾患の原因となる細胞毒性であると報告されている。よって、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧の制御及び予防を含む、悪性腫瘍の発達に関与している多くの理由から重要である。反応性酸素種の水への転化を触媒する、レダクターゼ等の酸化防止酵素のレベルはガン細胞において低いことが示されている。特に、悪性の前立腺上皮はこのような酸化防止酵素の発現を低下させた[Baker等, Prostate 32(4):229−233(1997)]。この点において、レダクターゼには興味がある。加えて、転写因子、NF−κB及びAP−1は酸化還元状態により調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化及び糖尿病の合併症の病因に関与すると考えられる種々の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。さらに、この主題事項について記載した出版物には、Engman等, Anticancer Res. (Greece), 17:4599−4605(1997)、Kelsey等, Br. J. Cancer, 76(7):852−4(1997);FriedrichとWeiss. J. Theor. Biol., 187(4):529−40(1997)及びPieulle等, J. Bacteriol., 179(18):5684−92(1997)が含まれる。インビボにおけるレドックス反応の生理学的な重要性が分かっているため、レドックス反応に関与している新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO853と命名した、レダクターゼに対して配列類似性を有する新規な前立腺特異的ポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0041】
32.PRO860
ニューロファシン(neurofascin)は神経系接着分子の細胞接着分子(「CAM」)ファミリーのL1サブグループのメンバーであり、細胞凝集に関連している。細胞−細胞認識と細胞接触のパターニングは、神経系における経細胞複合体又は幅広い種類の可逆的なアセンブリを媒介する上で重要な役割を有している。ニューロファスシンに結合するアンキリンを変調することにより、細胞の相互作用が調節される。例えば、Tuvia, Proc. Natl. Acad. Sci., 94(24) 12957−12962(1997)を参照。ニューロファスシンは胚発達中の神経突起の伸長に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのL1サブグループのメンバーとして記載され、種々の発育段階で数多くのイソ型が検出されている。また、Hassel等, J. Biol. Chem., 272(45) 28742−28749(1997)、Grumet, Cell. Tissue. Res. 290(2) 423−428(1997)、Garver等, J. Cell. Biol., 137:703−714(1997)、及びLambert等, J. Neurosci., 17:7025−7−36(1997)を参照。
インビボにおける神経系の発達及び細胞接着分子の生理学的な重要性が分かっているため、現在、神経系の細胞相互作用の調節に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO860と命名した、ニューロファシンに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0042】
33.PRO846
CMRF35モノクローナル抗体は、リンパ球細胞株、末梢血液T及びBリンパ球の一部、好中球、単球の表面に存在し、CMRF35と命名された、細胞膜抗原を同定するために使用されていた。CMRF35cDNAは免疫グロブリン(Ig)遺伝子スーパーファミリーの新規で完全な膜糖タンパク質のメンバーをコードする。該分子は、(a)ポリマーIgA及びIgMに対するFcレセプターに顕著に似通った単一の細胞外Ig可変ドメイン、(b)かなりO−グルコシル化されていると考えられている、プロリン、セリン及びスレオニン残基を多量に含有する膜近位ドメイン、(c)グルタミン酸とプロリン残基を含有する珍しい膜貫通アンカー、及び(d)短い細胞質の尾部を含む。CMRF35タンパク質をコードした転写物は、免疫細胞化学の染色結果で確認されているように、初期の単球細胞株、末梢血液T細胞、あるBリンパ芽球状細胞株で検出されている。Jackson等, Eur. J. Immunol. 22(5):1157−1163(1992)。CMRF−35分子は、造血細胞で差次的に発現しており、抗原の発現は、分裂促進剤及びサイトカインによる刺激に、顕著な影響を受けることが示された。例えば、Clark等, Exp. Hematol. 25(8):759(1997)、Daish等, Immunol. 79(1):55−63(1993)、及びClark等, Tissue Antigens 48:461(1996)を参照。
免疫系及び種々の免疫系細胞に付随する抗原の生理学的な重要性が分かっているため、現在、免疫系の種々の細胞で発現する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO846と命名した、CMRF35に対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0043】
34.PRO862
リゾチームは、乳、涙及び唾液を含む分泌液及び幾つかのヒトの組織に幅広く分布しているタンパク質である。それは、N−アセチルグルコサミン間の結合を加水分解することが証明されている。毒性酸素フリーラジカルの生成及び走化性のインヒビターであることが証明されており、また石灰化プロセスにおいてある役割を有している。このように、リゾチームに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、リゾチームに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0044】
35.PRO864
Wnt−4は腎臓管形成(kidney tubulogenesis)に必要で、またこれに関連している分泌糖タンパク質である。Wnt−4活性が欠乏したマウスは、前管細胞(pretubular cell)の集合体を形成できないが;間充織及び尿管発達の他の面に影響を及ぼさない。よって、Wnt−4はネフロン発達の根底にある上皮トランジションに対する間充織の誘発物質として作用するものと思われる。Stark等, Nature;372(6507):679−683(1994)。加えて、Wnt遺伝子ファミリーのメンバーは、細胞間シグナル伝達分子として作用可能で、発達中の脳において差次的に発現する、システインリッチの分泌タンパク質をコードする。Wnt遺伝子、例えばWnt−1は中脳細胞の運命の特定化に必須であることが知られている。Yoshioka等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203(3):1581−1588(1994)。Wntファミリーの分泌因子の幾つかのメンバーは、乳房細胞増殖及び分化の制御因子として強く関連している。Shimizu等, Cell Growth Differ. 8(12) 1349−1358。Wnt−4は妊娠初期において通常発現している。よって、Wnt−4は妊娠中に上皮を分岐させる局部シグナルでありうる。Edwards PA, Biochem Soc Symp. 63:21−34(1998)。また、Lipschutz JH, Am. J. Kidney Dis. 31(3):383−397(1998)を参照。我々は、ここでPRO864と命名した、Wnt−4に対する配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0045】
36.PRO792
少なくとも2つの細胞誘導シグナルが、B細胞で変換する免疫グロブリンアイソタイプの誘発に必要であることが示されている。第1のシグナルは可溶性リンフォカイン、インターロイキン(IL)−4又はIL−13の何れかで、生殖細胞イプシロン転写発現を誘発するものにより付与されるが、これ単独では免疫グロブリンE(IgE)の分泌を引き起こすには不十分である。第2のシグナルはB細胞と活性化T細胞、好塩基球とマスト細胞との物理的相互作用により提供され、CD40/CD40リガンド対合がIgE合成の媒介において重要であることが示されている。更に、IgE合成に関与する表面接着分子の多くの対の中でもCD23/CD21対がIgE生成において重要な役割を担っていると思われる。CD23は、IgE生成を増加又は減少させる因子により、正又は負に調節されるタンパク質である。CD23に対する抗体はインビトロにおいてIL−4誘発性ヒトIgE生成を阻害し、アイソタイプを選択する形で、ラットモデルにおける抗原特異性IgE応答を阻害することが示されている(Bonnefoy等, Eur. Respir. J. Suppl. 22:63S−66S(1996))。CD23はB細胞においてCD21と相互作用し、優先的にIgE生成を推進する。CD23タンパク質が哺乳類IgE応答の誘発において極めて重要な役割を担っているため、CD23に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO792と命名した、CD23に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0046】
37. PRO866
ミンジン(mindin)及びスポンジン(spondin)タンパク質は、互いに構造的に関連した分泌タンパク質であり、種々の生物で同定されている。例えば、Higashijima等, Dev Biol. 192:211−227(1997)はゼブラフィッシュの胚軸のフロアプレート細胞(floor plate cell)におけるスポンジン及びミンジンの発現の特定を報告しており、これによってミンジンとスポンジンタンパク質が、胚の発達において重要な役割を担っていることが示唆される。この同じグループはミンジンとスポンデジタンパク質が基底層に対して高親和性を有する細胞外マトリックスタンパク質として機能することを報告している(同上)。また。F−スポンジンは神経接着及び神経突起伸長を促進する分泌タンパク質であり(Klar等, Cell 69:95−110(1992))、またM−スポンディンはショウジョウバエの筋付着部位に局在化する細胞外マトリックスタンパク質である(Umemiya等, Dev Biol. 186:165−176(1997)ことも報告されている。よって、ミンジンとスポンジンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO866と命名した、ミンジン2及びミンジン1に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0047】
38.PRO871
サイクロフィリンはサイクロスポリンAに結合し、ペプチジル−プロリル−シス−トランスイソメラーゼ活性を有するタンパク質のファミリーである(Sherry等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1758−1763(1998))。加えて、サイクロフィリンは活性化細胞により分泌され、おそらくは細胞表面のサイクロフィリンレセプターを通過するシグナル伝達により、サイトカイン様の形で作用する。宿主細胞誘導性サイクロフィリンAはHIV−1ビリオン中に取り込まれることが示されており、この取り込みはウイルス感染に必須であることも示されている。よって、一又は複数のサイクロフィリンがHIV−1感染に直接関連している可能性がある。サイクロフィリンタンパク質の明らかな重要性が分かったため、一又は複数のサイクロフィリンタンパク質に対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO871と命名した、サイクロフィリン様タンパク質CyP−60に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0048】
39.PRO873
酵素タンパク質は食物の消化、巨大分子の生合成、化学エネルギーの利用及び放出の制御、及び生命維持に必要な他のプロセスに関与する化学反応において重要な役割を担っている。また、酵素は種々の病気及び疾患に抗するという、重要な役割を担っていることも示されている。例えば、肝臓のカルボキシルエステラーゼは、ガンのプロドラッグに対するヒト腫瘍細胞の感作を助成することが報告されている。Danks等は、Rh30ヒト横紋筋肉腫細胞においてカルボキシルエステラーゼをコードするcDNAが安定して発現していると、CPT−11ガンプロドラッグに対する細胞の敏感度が8.1倍増加すると報告している。Cancer Res. (1998)58(1):20−22。著者は、このプロドラッグ/酵素複合体を、ガンシクロビル/単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼと5−フルオロシトシン/シトシンデアミナーゼの組合せを用いた研究下で現在なされているアプローチに類似した形で治療用に利用可能であると提案している。van Pelt等は、55kDのヒト肝臓カルボキシルエステラーゼが、培養中の主要なヒト肝細胞へのプラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)マラリアスポロゾイトの侵入を阻害することを示している。J Hepatol (1997)27(4):688−698。
また、カルボキシルエステラーゼは、薬剤、農薬及び他の生体異物の解毒に重要であることが見出されている。精製されたヒト肝臓カルボキシルエステラーゼは、コカインやヘロインを含む、種々の薬剤の代謝に関与していることが示されている。Prindelらは、コカイン及びヘロインの加水分解を触媒し、ヒト組織におけるこれらの薬剤の分解において重要な役割を担っている、広い基質特異性のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼのクローニング及び精製について記載している。J. Biol. Chem. (1997)6:272(23):14769−14775。Brzenzinskiらはカルボキシルエステラーゼにより代謝される環境エステル又は薬剤の同定に使用される分光光度競合阻害アッセイについて記載している。Drug Metab Dispos(1997)25(9):1089−1096。
カルボキシルエステラーゼによりなされる重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性カルボキシルエステラーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。我々は、ここでPRO873と命名した、カルボキシルエステラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0049】
40.PRO940
CD33は、シアル酸タイプと末端近くの糖へのその結合の両方に対して異なる特異性を有するシアル酸依存性結合を媒介可能なタンパク質のシアロアドヘシン(sialoadhesin)ファミリーのメンバーである細胞表面タンパク質である。CD33は初期の脊髄及び幾つかの単球細胞系において特異的に発現しており、例えば急性非リンパ球性白血病(ANLL)を含む、種々の脊髄腫瘍と強く関連していることが示されてる。このように、CD33はタンパク質の高レベル発現に関連したガンの治療を潜在的な目的として提案されている。よって、CD33に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。事実、CD33相同体の一つ(CD33Lと命名)が既に同定され、記載されている(Takei等, Cytogenet. Cell Genet. 78:295−300(1997))。我々は、ここでPRO940と命名した、CD33に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。ここで記載された新規なポリペプチドは、デイホフ(Dayhoff)データベース(35.45版、Swiss Prot35)においてHSU71382 1及びHSU71383 1と称されるヒトOB結合性タンパク質に対して有意な相同性を示す。
【0050】
41.PRO941
カドヘリンは大きなファミリーの膜貫通タンパク質である。カドヘリンには、事実上、多細胞生物の全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介するように機能するカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーが含まれる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が同定され、特徴づけられている。幾つかの例外はあるが、カドヘリンの機能の中でも、カドヘリンが細胞凝集に関与しており、細胞−細胞接着部位に付随していることが知られている。最近、全てのカドヘリンが、細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられているカドヘリン特異的モチーフの多重反復を分かち持つが、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多様な構造、及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関連していることが報告されている。Suzuki, J. Cell. Biochem., 61(4):531−542(1996)。カドヘリンはさらに、Tanihara等, J. Cell Sci., 107(6):1697−1704(1994)、Aberle等, J. Cell. Biochem., 61(4):514−523(1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26(1994)にも記載されている。我々は、ここでPRO941と命名した、カドヘリンタンパク質に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0051】
42.PRO944
クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)エンテロトキシン(CPE)はC,パーフリンゲンスA型の食中毒の徴候の原因である毒性因子であると考えられており、また他のヒト及び獣医学的病気に関連している可能性もある(McClane, Toxicon. 34:1335−1343(1996))。CPEはクロストリジウム・パーフリンゲンスエンテロトキシンレセプター(CPE−R)と称される約50kDの細胞表面レセプタータンパク質に結合し、細胞表面上に約90,000kDの複合体を形成することにより、その有害な細胞機能を実行していく。CPE−Rタンパク質をコードするcDNAはヒト及びマウスの両方において同定され、特徴づけられている(Katahira等, J. Cell. Biol. 136:1239−1247(1997)及びKatahira等, J. Biol. Chem. 272:26652−26658(1997))。CPE毒素は哺乳類宿主の種々の病気の原因であることが報告されており、これらの病気はCPE−RにCPE毒素が結合することにより始まるので、新規なCPE−R相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO944と命名した、CPE−Rに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0052】
43.PRO983
膜結合タンパク質には細胞表面膜結合タンパク質だけでなく、細胞内小胞体の表面で見出されるタンパク質も含まれる。これらの小胞体は細胞血漿膜と分泌小胞体の融合であるエキソサイトーシスに関与し、2つの主たる機能を有する。一つは、細胞内空間への小胞体内容物の放出であり、第2は血漿膜自体への、新しいタンパク質及び脂質の取り込みである。エキソサイトーシスは構成的であるか調節されうる。全ての真核細胞は、形成後に分泌小胞体が直ちに融合されることで特徴づけられる構成的エキソサイトーシスを示す。これに対し、調節エキソサイトーシスは、小胞体結合膜タンパク質による適切なシグナルを受取次第、血漿膜と融合する分泌小胞体が蓄積する。通常、このシグナルは、サイトゾル中の遊離のCa2+濃度が増加することである。しかしなから、Ca2+と無関係である調節エキソサイトーシスが報告されている(例えば、Fujita−Yoshigaki等, J. Biol. Chem. (1996)31:271(22):13130−13134を参照)。調節エキソサイトーシスは、ニューロン(シナプス小胞体から神経伝達物質を放出)、副腎クロム親和性細胞(アドレナリン分泌)、膵腺房細胞(消化酵素分泌)、膵臓β細胞(インシュリン分泌)、マスト細胞(ヒスタミン分泌)、乳房細胞(乳タンパク質分泌)、精液(酵素分泌)、卵細胞(受精包膜の生成)及び含脂肪細胞(血漿膜へのグルコース輸送体の挿入)を含む多くの特殊化細胞にとって重要なものである。
エキソサイトーシスに関連した疾患が知られている。例えばマスト細胞から放出される炎症媒介物により、喘息を含む種々の疾患に至る。同様に、チェディアック−東症候群(CHS)は、好中球、単球及びリンパ球が巨大な細胞質顆粒を含有する、珍しい常染色体劣性病である。従って、エキソサイトーシスに関与するタンパク質には最大の関心があり、新規な小胞体結合タンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方においてなされている。例えば、Skehel等は、神経伝達物質のエキソサイトーシスに必要な、VAP−33と呼称される、アメフラシの33キロダルトンの膜タンパク質を同定した。Science(1995) 15:269(5230):1580−1583、及びNeuropharmacology (1995)34(11):1379−1385。多くの努力は、新規な小胞体結合膜タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。本発明の目的は、ここでPRO983と命名した、小胞体結合タンパク質、VAP−33に対して相同性を有するタンパク質を提供することである。
【0053】
44.PRO1057
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性度の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照]。我々は、ここでPRO1057と命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0054】
45.PRO1071
トロンボスポジン−1は、トロンビン刺激に応答して血小板α顆粒から放出され、発達しかつ修復している組織における細胞外マトリックスの一過性成分でもある三量体高分子量糖タンパク質である(Adams, Int.J.Biochem.Cell Biol. 29:861−865 (1997)及びQian等, Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 212:199−207 (1996))。種々の因子がトロンボスポジンの発現を調節し、タンパク質が細胞外と細胞内の双方の経路により分解する。トロンボスポジン−1は細胞接着分子として機能し、また細胞移行、細胞増殖、神経突起成長及び血管形成誘導を変調する。このように、トロンボスポジンに対して相同性を持つ新規なポリペプチドを同定することには相当の重要性がある。我々は、ここでPRO1071と命名した、トロンボスポジンと相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0055】
46.PRO1072
細胞のレドックス状態は細胞運命の重要な決定要因であるという研究が報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要であり、悪性腫瘍の発達に関与している。反応性酸素種の水への転化を触媒するレダクターゼのような抗酸化酵素のレベルは、ガン細胞では低いことが分かっている。特に、悪性前立腺上皮はそのような抗酸化酵素の発現を低下させた[Baker等, Prostate 32(4):229−233 (1997)]。この点に関して、レダクターゼが興味深い。また、転写因子、NF−κB及びAP−1は、レドックス状態によって調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病合併症の原因に関与していると思われる非常に多種の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。この主題事項を更に記述している刊行物には、Engman等, Anticancer Res. (Greece), 17:4599−4605 (1997), Kelsey等, Br.J.Cancer, 76(7):852−854 (1997); Friedrich及びWeiss, J.Theor.Biol., 187(4):529−40 (1997)及びPieulle等, J.Bacteriol., 179(18):5684−92 (1997)が含まれる。インビボでのレドックス反応の生理学的重要性が分かったので、現在はレドックス反応に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO1072と命名した、レダクターゼ酵素と配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定をここに記載する。
【0056】
47.PRO1075
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。
ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組み換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに照準が合わされている。スクリーニング法と技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等,Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。我々は、ここでPRO1075と命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをここに記載する。
【0057】
48.PRO181
ショウジョウバエでは、極性卵房の背側−腹側極性が、卵母細胞の背側−腹側隅への卵母細胞核とグルケン(gurken)RNAの局在化に依存する。グルケンタンパク質は卵母細胞を取り囲んでいる卵胞体細胞に発現されるショウジョウバエEGFレセプター(トーピード(torpedo)/DER)に対するリガンドとしておそらく作用する(Roth等,Cell 81:967−978 (1995))。コルニコン(cornichon)、グルケン及びトーピードはまた後卵胞細胞の運命を確立し卵房の背側−腹側極性を特定する早期のシグナル伝達事象においても機能する。これらの遺伝子の何れか又は全てにおける突然変異により、腹側と後側の決定基バイコイド(bicoid)とオスカー(oskar)の適切な局在化と、卵母細胞の非対象な位置決めに対して必要とされる正しく極性化された微小管細胞骨格の形成が妨げられる。従って、コルニコン遺伝子産物が早期の発達において重要な役割を担っていることは明らかである。我々は、ここでPRO181と命名した、コルニコンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0058】
49.PRO195
新規な膜貫通タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでPRO195と命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0059】
50.PRO865
新規な分泌タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでPRO865と命名した、新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0060】
51.PRO827
VLA−2は、マウスとヒトを含む多くの哺乳類生物において同定され特徴づけられた細胞表面インテグリンタンパク質である。VLA−2は、エコーウィルス−1(EV−1)によってVLA−2発現細胞の感染を媒介するEV−1に対する細胞の表面上のレセプターであることが分かった(Zhang等, Virology 235(2):293−301 (1997)及びBergelson等, Science 255:1718−1720 (1992))。VLA−2はまたインビトロ血管形成の間の内皮とのコラーゲンの相互作用を媒介することも分かった(Jackson等, Cell Biol.Int. 18(9):859−867 (1994))。VLA−2と様々な度合いのアミノ酸配列相同性を分かち持つ様々な他のインテグリンタンパク質が様々な哺乳類生物において同定され特徴づけられた。これらのインテグリンは様々な異なった生理学的機能において重要な役割を果たしていることが報告された。それ故に、一又は複数のインテグリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することには顕著な興味がある。我々は、ここでPRO827と命名した、VLA−2インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0061】
52. PRO1114
多くの重要なサイトカインタンパク質が同定され特徴づけられ、特異的細胞表面レセプター複合体を介してシグナル伝達をなうことが示された。例えば、クラスIIサイトカインレセプターファミリー(CRF2)はインターフェロンレセプター、インターロイキン−10レセプター及び組織因子CRFB4を含む(Spencer等,J.Exp.Med. 187:571−578 (1998) 及びKotenko等, EMBO J. 16:5894−5903 (1997))。従って、様々なサイトカインタンパク質が示す多数の生物学的活性は標的細胞の表面上のサイトカインレセプタータンパク質の存在に全面的に依存する。それ故に、一又は複数のサイトカインレセプターファミリーに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることに顕著な興味がある。我々は、ここでPRO1117と命名した、サイトカインレセプターファミリー−4タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
インターフェロン(IFNs)は脊椎動物において生じる多くのファミリーの分泌タンパク質を包含する。インターフェロンはその抗ウィルス活性によって本来は命名されたが、増大する証拠は細胞増殖と分化におけるIFNsの重要な役割を裏付けている(Jaramillo等, Cancer Investigation 13(3):327−338 (1995))。IFNsは正常なものと形質転換した表現型の双方を持つ広範な細胞の成長を阻害する能力を有する負の成長因子のクラスに属する。IFN療法はカポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びヘアリー細胞白血病のようなヒトの悪性腫瘍の治療並びにB型肝炎のような感染症の治療に役立つことが分かった(Gamliel等, Scanning Microscopy 2(1):485−492 (1988), Einhorn等, Med.Oncol. & Tumor Pharmacother. 10:25−29 (1993), Ringenberg等, Missouri Medicine 85(1):21−26 (1988), Saracco等, Journal of Gastroenterology and Hepatology 10:668−673 (1995), Gonzalez−Mateos等, Hepato−Gastroenterology 42:893−899 (1995)及びMalaguarnera等, Pharmacotherapy 17(5):998−1005 (1997))。
【0062】
インターフェロンはその一次配列に基づいて二つの主要なグループに分類することができる。I型インターフェロン、IFN−α及びIFN−βは、IFN−α遺伝子ファミリーからなるイントロンのない遺伝子のスーパーファミリーと共通の祖先遺伝子から生じたと思われる単一のIFN−β遺伝子によりコードされている。I型インターフェロンは殆どの細胞型により生産されうる。II型IFN、又はIFN−γは、リンパ球(T細胞及びナチュラルキラー細胞)に限定され、非特異的T細胞アクチベータ又は特異的抗原によりインビボで刺激される。
I型及びII型IFNsの双方が類似の抗ウィルス及び抗増殖効果をつくりだすけれども、それらは別個の細胞表面レセプターに作用し、結合は一般に種特異的である(Langer等, Immunol. Today 9:393−400 (1988))。IFN−α及びIFN−βの両方とも同一の高親和性型Iレセプターに競合的に結合する一方、IFN−γは別のII型レセプターに結合する。IFNタンパク質の効果が細胞表面インターフェロンレセプターへの結合を介して媒介されることは明らかであるが、細胞表面上のIFNレセプターの存在と数は、IFNへの細胞の感度を一般には反映しない。このように、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけは極めて興味深い。
我々は、ここで「PRO1114インターフェロンレセプター」と命名した、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけをここに記載する。従って、本発明のPRO1114ポリペプチドは新規な細胞表面インターフェロンレセプターを表す。
【0063】
53. PRO237
カルボニックアンヒドラーゼは、二酸化炭素と水から(及びそれらへの)炭酸の合成(及び脱水)を触媒することにより哺乳類の血液系における二酸化炭素の輸送と放出を助ける酵素タンパク質である。従って、カルボニックアンヒドラーゼの作用は哺乳類における様々な重要な生理的反応に対して不可欠である。このように、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけは顕著な興味がある。我々は、ここでPRO237と命名した、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0064】
54. PRO541
数多くのトリプシンインヒビタータンパク質が同定され特徴づけされている(例えばYamakawa等, Biochim.Biophys.Acta 1395:202−208 (1998)及びMizuki等, Mammalian Genome 3:274−280 (1992)を参照されたい)。トリプシンインヒビタータンパク質は、様々な異なった生理学的及び生物学的経路において重要な役割を果たしており、特にタンパク質の分解、消化等々の調節のようなプロセスに関与している。このような酵素タンパク質により果たされる重要な役割が分かると、既知のトリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることには顕著な興味がある。我々は、ここでPRO541と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0065】
55. PRO273
白血球は単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含み、免疫応答に重要な役割を果たしている。これら細胞はT及び/又はBリンパ球により開始される機構において重要であり、他の炎症性細胞を補充し活性化させ組織破壊に寄与するある範囲のサイトカインを分泌する。
従って、白血球がその適切な目的地まで移動し他の細胞と相互作用する調節プロセスの研究は重要である。現在、白血球は血管壁の内皮細胞に沿って転がることにより損傷を受けたあるいは炎症を起こした組織まで移動すると考えられている。この移動は、セレクチンとそのリガンドの間の一過性の相互作用により媒介される。この血液から漏出と管外遊出工程は、またインテグリンとそのリガンドにより媒介される、より安定した白血球−内皮細胞相互作用を促進する細胞活性化を含む。
ケモカインは構造的に関連したポリペプチドサイトカインの大きなファミリーである。これらの分子は白血球の動きを刺激し、異なった炎症状況における白血球の情報交換を説明する。ケモシネシスは内皮細胞上で特定の接着分子の発現を媒介し、それらが特定の細胞型を活性化する化学誘因物質をつくりだす。また、ケモカインは特定の細胞型の増殖を刺激し活性化を調節する。これらの活動の双方において、ケモカインは高度の標的細胞特異性を証明する。
ケモカインファミリーは、二つのアミノ末端システイン残基がが直ぐに隣接しているか(C−C)、1つのアミノ酸によって分離しているか(C−X−C)に従って二つのサブファミリーに分割される。C−X−Cファミリーのケモカインは一般に好中球と線維芽細胞を活性化させる一方、C−Cケモカインは単球/マクロファージ、好塩基球、好酸球及びTリンパ球を含むより広範なグループ標的細胞に作用する。両方のサブファミリーの既知のケモカインは、Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2nd Ed. Academic Press, N.Y.においてレビューされているように、多くの多様な細胞型により合成される。ケモカインはまたSchall TJ (1994) Cehmotactic Cytokines: Targets for Therapeutic Development. International Business Communications, Southborough Mass. pp180−270;及びPaul WE (1993) Fundamental Immunology, 3rd Ed. Raven Press, N.Y. pp822−826においてレビューされている。
【0066】
C−X−Cサブファミリーの既知のケモカインには、マクロファージ炎症タンパクα及びβ(MIP−1及びMIP−2)、インターロイキン−8(IL−8)、及び成長調節タンパク質(GRO−α及びβ)が含まれる。
MIP−2はとして最初はリポ多糖類(LPS)での刺激時にマウスマクロファージ細胞株RAW264.7により分泌される6kDaのヘパリン結合タンパク質として同定された。MIP−2はケモカインのC−X−C(又はCXC)サブファミリーのメンバーである。マウスMIP−2はヒト好中球に対して化学走化性であり、マウスの足の裏に注射した場合、局所的好中球浸潤を誘発する。ラットMIP−2はマウスMIP−2に対して86%のアミノ酸相同性を示し、ラット好中球に対して化学走化性であるが、ラット肺胞マクロファージ又はヒト末梢血好酸球又はリンパ球の遊走を刺激しない。また、MIP−2はラット肺胞内皮細胞の増殖を刺激するが線維芽細胞の増殖は刺激しないことが分かっている。
炎症を生じた又は羅患した組織における異常の診断に対する現在の技術は、臨床的徴候の観察又はホルモン、ポリペプチド又は様々な代謝物に対する体の組織又は流体の血清学的な検査に主に依存している。問題はこれらの診断法にある。第1に、患者は疾患の初期段階では臨床的徴候を表さないであろう。第2に、血清学的試験は浸潤性疾患と遺伝的シンドローム間を必ずしも区別しない。従って、発現されたケモカインの同定は、新規な診断法、効果的な治療法の開発、及び分病原性の理解の助けとしてに重要である。
今日まで、ケモカインは少なくとも次の症状:乾癬、炎症性腸疾患、腎疾患、関節炎、免疫媒介脱毛症、脳卒中、脳炎、MS、肝炎、及びその他に関与していた。また、非ELR含有ケモカインは血管形成誘導の阻害に関与しており、よって、これらのケモカインが腫瘍血管新生及び腫瘍形成においてある役割を有していることを示している。
従って、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質、MIP−1、MIP−2、及びその他の関連タンパク質と配列同一性及び類似性を有するポリペプチド及びこれをコードする核酸を同定することが本発明の目的である。
【0067】
56.PRO701
βニューレキシン及びニューロリギンはニューロン細胞表面上に示される原形質膜タンパク質である。ニューロロゴン1は、Ichtchenko等,Cell,81(3):435−443 (1995)に記載されているように、シナプス原形質膜に濃縮されており、βニューレキシンに対するスプライス部位特異的リガンドとして作用する。ニューロリギンの細胞外配列はアセチルコリンエステラーゼに相同の触媒的に不活性なエステラーゼ領域からなる。ニューロリギン2及び3はニューロリギン1に構造と配列が類似している。全てのニューロリギンは切断シグナルペプチドに大きなエステラーゼ相同領域、高度に保存された単一の膜貫通領域、及び短い細胞質領域が続く特徴を持つN末端疎水性配列を含む。3種のニューロリギンは同一の位置で選択的スプライシングを受け、脳においてのみ高レベルで発現される。βニューレキシンに対する3種のニューロリギンの密着結合はスプライス部位4に挿入断片を欠くβニューレキシンに対してのみ観察される。従って、ニューロリギンは、ニューロン間の認識プロセスを媒介する点でオーバーラップする機能を有する異なったアイソフォームを持つ脳特異的タンパク質の多重遺伝子族を構成する。Ichtchenko等, J.Biol.Chem., 271(5):2676−2682 (1996)を参照されたい。更に、ニューレキシンとニューロリギンは、βニューレキシンの選択的スプライシングによって調節されるCa2+依存性反応において接着分子として機能することが報告されている。Nguyen及びSudhof, J.Biol.Chem., 272(41):26032−26039 (1997)を参照されたい。
上述のことが分かると、膜結合タンパク質は興味深い。より一般的には、膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持に重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例には線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0068】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合レセプタータンパク質、特にニューロリギン1、2及び3と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力の結果はここに提供される。
【0069】
57. PRO704
VIP36はゴルジ体と細胞表面に局在化し、糖タンパク質、糖脂質、又は双方の情報交換に関与しているかも知れない動物分泌経路中のマメ科植物レクチン相同体のファミリーに属している。VIP36は、スフィンゴ糖脂質及び/又はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの糖残基に結合し、細胞質蛋白分離機及び糖脂質ラフトの細胞外/管腔面間の関連性を提供するかもしれない。更にVIP36に関して、細胞質膜とゴルジの間をサイクルするその能力を付与するすると更に内部移行コンセンサス配列に一致するシグナルがそのC末端にあると信じられている。Fiedler等, EMBO J., 13(7):1729−1740 (1994); Fiedler及びSimons, J.Cell Sci., 109(1):271−276 (1996); Itin等, MBO J., 14(10):2250−2256 (1995)を参照されたい。VIP36はヒトGP36bタンパク質と同じかこれに非常に密接に関連していると信じられている。VIP36及び/又はGP36bは興味深い。
更に一般的には、小胞、細胞質、細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質において、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0070】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の小胞、細胞質、分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にVIP36と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0071】
58. PRO706
酸性ホスファターゼタンパク質は、酸性pH条件下で末端リン酸基を脱リン酸化する分泌タンパク質である。酸性ホスファターゼはRHGXRXPアミノ酸配列を含み、これは機構的に重要であると予想されている。酸性ホスファターゼはヒトの疾患の診断と治療において重要な機能を有しうる。例えば、前立腺酸性ホスファターゼは前立腺組織およっび前立腺ガンに独特に発現される分泌タンパク質である。前立腺酸性ホスファターゼのレベルは、Lankford等, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 38(2):327−333 (1997)に記載されているように、放射線療法で治療された前立腺ガン患者における局所的及び生化学的制御に対する潜在的な予後因子である。研究によれば、前立腺酸性ホスファターゼに対する細胞免疫応答が破壊的自己免疫前立腺炎を媒介し、前立腺酸性ホスファターゼの異種型が前立腺ガンの免疫療法に有用であることが示唆されている。Fong等, J.Immunol. 169(7):3113−3117 (1997)を参照されたい。精液前立腺酸性ホスファターゼレベルは、35を越えた個人において非常に低い精子レベル(精子過小症)と有意に相関している。Singh等, Singapore Med.J. 37(6):598−599 (1996)を参照。従って、前立腺酸性ホスファターゼは様々なヒトの疾患に関与しており、これらの疾患の診断と治療において重要な機能を有している。一連のアミノベンジルリン酸化合物は、Beers等, Bioorg.Med.Chem. 4(10):1693−1701 (1996)に記載されているように、前立腺酸性ホスファターゼの非常に有力なインヒビターである。
更に一般的には、細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性タンパク質、特に前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と配列同一性を有するもの、及びある場合には胎性心臓に見出されるDNAと同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0072】
59.PRO707
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。更に、カドヘリンスーパーファミリーの幾つかのメンバーは一般に伝達を含む細胞−細胞相互作用プロセスに関与している。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。
更に一般的には、膜結合タンパク質を含む、全ての新規なタンパク質は興味深い。膜結合タンパク質とレセプターは多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にカドヘリンと同一性を有する膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0073】
60.PRO322
プロテアーゼは、哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与する酵素タンパク質である。様々なセリン含有タンパク質に対して特異的活性を示すセリンプロテアーゼを含む、様々な異なった哺乳類及び非哺乳類生物からの無数の異なったプロテアーゼ酵素が同定されかつ特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は、例えばタンパク質消化、ペプチドホルモン活性の活性化、不活性化、又は変調、及びタンパク質と酵素の物理的性質の変更のような生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。
ニューロプシンは、mRNAが中枢神経系に発現される新規なセリンプロテアーゼである。マウスニューロプシンはクローニングされ、海馬可塑性に慣用することが研究から分かっている。ニューロプシンはまた細胞外マトリックスの改変と細胞遊走に付随していることが示されている。一般的には、Chen等, Neurosci., 7(2):5088−5097 (1995)及びChen等, J.Histochem.Cytochem., 46:313−320 (1998)を参照されたい。
新規な未変性の膜結合又は分泌タンパク質、特にニューロプシン、セリンプロテアーゼ、ニューロシン及びトリプシノーゲンと相同性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0074】
61.PRO526
タンパク質−タンパク質相互作用はレセプター及び抗原複合体及びシグナル伝達機構に関連するものを含む。タンパク質−タンパク質相互作用の基となる構造的及び機能的機構についてよく知られているように、タンパク質−タンパク質相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用の特定の結果を調節するように更に容易に操作することができる。従って、タンパク質−タンパク質相互作用の基となる機構は科学及び医学界にとって興味深い。
ロイシンリッチ反復を含む全てのタンパク質はタンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている。ロイシンリッチ反復は多様な機能を持つ多くのタンパク質と細胞位置に存在する短い配列モチーフである。リボ核酸インヒビタータンパク質の結晶構造から、ロイシンリッチ反復はβ−α構造単位に対応することが明らかになった。これらの単位は、一面が溶媒に暴露された平行なβシートを形成するように配置され、タンパク質は珍しい非球状の形状を獲得する。これらの二つの特徴はロイシンリッチ反復を含むタンパク質のタンパク質結合機能の原因であることが示されている。Kobe及びDeisenhofer, Trends Biochem.Sci., 19(10):415−421 (Oct.1994)を参照されたい。
個体発生の間にコラーゲン原線維を配向し指令する組織オーガナイザーとなり、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍ストローマ形成のような病理プロセスに関与するロイシンリッチプロテオグリカンについて研究が報告されている。Iozzo,R.V., Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 32(2):141−174 (1997)。創傷治癒、組織修復におけるロイシンリッチタンパク質の関与を示す研究は、De La Salle, C.等, Vouv.Rev.Fr.Hematol. (Germany),37(4):215−222 (1995)であり、出血疾患ベルナール−スーリエ症候群に伴う複合体におけるロイシンリッチモチーフの突然変異を報告しており、Chlemetson,K.J., Thromb.Haemost. (Germany),74(1):111−116 (July 1995)は、血小板がロイシンリッチ反復を有していることを報告しており、La Jolla Cancer Research FoundationのRuoslahti, E.I.等の国際公開第9110727−Aは、トランスフォーミング成長因子βに結合するデコリンがガンの治療、創傷治癒及び瘢痕化に関与していることを報告している。結合組織、皮膚及び骨のような組織の再成長に関連する創傷治癒及び付随する治療法において;ヒトと動物における体成長を促進することで;及び他の成長関連プロセスを刺激する点で有用であることにおいて、この群のタンパク質に機能が関連しているのはインスリン様成長因子(IGF)である。IGFの酸不安定サブユニット(ALS)はまたIGFの半減期を増大させインビボのIGF複合体の一部である点で興味深い。ALSはLeong及びBaxter, Mol.Endocrinol., 6(6):870−876 (1992); Baxter, J.Biol.Chem., 264(20):11843−11848 (1989);及びKhosravi等, J.Clin.Endocrinol.Metab., 82(12):3944−3951 (1997)に更に記載されている。
【0075】
ロイシンリッチ反復を有することが報告されている他のタンパク質は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、パーキンソン病のような神経損傷の治療において、及びガンの診断に対して有用であることが報告されているSLITタンパク質である。エール大学のArtavanistsakonas,S.及びRothberg,J.M.の国際公開第9210518−A1を参照。また興味深いのはLIG−1、すなわちマウス脳のグリア細胞中に特異的に発現され、ロイシンリッチ反復及び免疫グロブリン様ドメインを有する膜糖タンパク質である。Suzuki等,J.Biol.Chem.(U.S.),271(37):22522 (1996)。ロイシンリッチ反復を有するタンパク質の生物学的機能を報告している他の研究には:Tayar,N.等, Mol.Cell Endocrinol., (Ireland), 125(1−2):65−70 (Dec.1996)(ゴナドトロピンレセプター関連);Miura,Y.等,Nippon Rinsho (Japan), 54(7):1784−1789 (July 1996)(アポトーシス関連);Harris,P.C.等, J.Am.Soc.Nephrol., 6(4):1125−1133 (Oct.1995)(腎疾患関連)が含まれる。
タンパク質−タンパク質相互作用をよりよく理解するためにロイシンリッチ反復を有する新規なタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。特に興味深いものは、ALSのようなロイシンリッチ反復を有する既知のタンパク質と同一性又は類似性を有するタンパク質である。多くの努力が、ロイシンリッチ反復を有する新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0076】
62.PRO531
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)、Aberle等, J.Cell Biochem., 61(4):514−523 (1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Sano等,EMBO J., 12(6):2249−2256 (1993)を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン3(Pcdh3又はpc3とも称される)が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とPcdh3の更なる特徴についてはSago等, Genomics, 29(3):631−640 (1995)を参照されたい。
【0077】
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、特に3及び4と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【0078】
63.PRO534
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47:28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);及びDesilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、また興味深いものは、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターである。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0079】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってから、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチド及びこれをコードする核酸をここに記載する。
【0080】
64.PRO697
分泌フリズルド(frizzled)関連タンパク質(sFRPs)は膜貫通レセプターのフリズルド(frizzled)ファミリーである。sFRPsはおよそ30kDaの大きさで、それぞれ推定シグナル配列、フリズルド(frizzled)様システインリッチドメイン及び保存された親水性カルボキシ末端ドメインを含む。sFRPsはWntシグナル伝達を変調するように機能し、又はある種のレセプターに対するリガンドとして機能することが報告されている。Rattner等, PNAS USA, 94(7):2859−2863 (1997)。従って、sFRPs及びsFRPsと配列同一性及び/又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
興味深い他の分泌タンパク質は分泌アポトーシス関連タンパク質(SARPs)のファミリーの任意のメンバーである。SARPsの発現はβカテニンの細胞内レベルを変え、SARPsがWnt−フィルズルド(frizzled)タンパク質シグナル伝達経路に緩衝することを示唆している。Melkonyan等,PNAS USA, 94(25):13636−13641 (1997)。従って、SARPs及びSARPsと配列同一性及び/又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
sFRPs及びSARPsに加えて、多くの細胞外タンパク質は興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にsFRP−2とSARP−1と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0081】
65.PRO717
新規な膜貫通レセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【0082】
66.PRO731
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)、Aberle等, J.Cell Biochem., 61(4):514−523 (1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Sano等,EMBO J., 12(6):2249−2256 (1993)を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン3(Pcdh3又はpc3とも称される)が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とPcdh3の更なる特徴についてはSago等, Genomics, 29(3):631−640 (1995)を参照されたい。
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0083】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、とりわけ4、68、43、42、3及び5と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【0084】
67.PRO218
新規な未変性の膜結合タンパク質、特に膜調節タンパク質と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【0085】
68.PRO768
インテグリンは細胞接着を促進する細胞表面糖タンパク質レセプターのスーパーファミリーからなる。各細胞はその細胞接着能力を形成する数多くのレセプターを有している。インテグリンは細胞と他の細胞又はマトリックス成分との間の広範な相互作用に関与する。インテグリンは免疫系細胞の移動と機能の調節において特に重要である。血小板IIb/IIIAインテグリン複合体は血小板凝集の調節において特に重要である。インテグリンファミリーのメンバーであるインテグリンβ−6は、上皮細胞上に発現され上皮炎症を変調する。他のインテグリンである白血球随伴抗原−1(LFA−1)は免疫応答の間のリンパ球の接着において重要である。
特に重要なものは、Song等, J.Cell Biol., 117(3):643−657 (1992)に記載されているように筋形成の間に発生的に調節されるインテグリンα鎖であるH36−α7である。ラミニン結合α7β1インテグリンの発現パターンは骨格、心及び平滑筋において発生的に調節される。Ziober等, Mol.Biol.Cell, 8(9):1723−1734 (1997)。α7−X1/X2インテグリンの発現は、細胞特異的な形でレセプターアフィニティ状態を調節し、筋肉の発達と修復の間のインテグリン依存性事象を変調しうる新規な機構であることが報告されている。上掲。ラミニンがα7インテグリンレセプターを介して骨格筋芽細胞の歩行運動を促進することが更に報告されている。特に、α7β1レセプターは限られた数のラミニンアイソフォームに対する筋芽細胞の接性着と運動性を促進し、再生と分化の間における筋原先駆体補充において重要であることが報告されている。Yao等, J.Cell Sci., 109(13):3139−3150 (1996)。インテグリンα7のスプライシングされた変異体もまたLeung等, Biochem.Biophys.Res.Commun., 243(1):317−325 (1998)及びFornaroとLanguino, Matrix Biol., 16(4):185−193 (1997)に記載されている。更に、インテグリンα7が無いと、ある形の筋ジストロフィーを引き起こすことが報告されている。従って、インテグリン、特にインテグリン7と関連分子に関するものは興味深い。
【0086】
インテグリンに対する興味に加えて、より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるために興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力、特にインテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドを同定するために注がれたものをここに記載する。
【0087】
69.PRO771
テスチカン(testican)は、限定されるものではないが神経筋組織、脳及び生殖組織を含む数多くの組織において発現される多領域精巣プロテオグリカンである。テスチカンは、細胞形、接着、遊走及び増殖のような細胞社会的挙動の修飾因子に似ている。[Bonnet,F.等,J.Biol.Chem., 271(8):4373 (1996), Perin,J.P.等,EXS (Switzerland), 70:191 (1994), Alliel,P.M.等,Eur.J.Biochem., 214(1):346 (1993), Charbonnier,F.等, C.R.Seances Soc.Biol.Fil. (France), 191(1):127 (1997)]。とりわけ、テスチカンはニューロンプロセスに関係し、結合組織の成長に関連しているので、テスチカンと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質が興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果、特にテスチカンと同一性及び/又は類似性を有する分子を同定するために注がれたものは興味深い。
【0088】
70.PRO733
T1/ST2は、細胞シグナル伝達に関与していると信じられている、I型インターロイキン−1レセプターに相同なレセプター様分子である。T1/ST2レセプター及び/又は推定リガンドは更に、Gayle等, J.Biol.Chem., 271(10):5784−5789 (1996), Kumar等, J.Biol.Chem., 270(46):27905−27913 (1995)及びMitcham等, J.Biol.Chem., 271(10):5777−5783 (1996)に記載されている。これらのタンパク質及びそれに関連するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力の結果をここに提供する。
【0089】
71.PRO162
膵臓随伴タンパク質(PAP)は急性膵炎の間に膵臓から過剰発現される分泌タンパク質である。血清PAP濃度は急性膵炎の患者において異常に高いことが分かっている。Pezzilli等, Am.J.Gastroenterol., 92(10):1887−1890 (1997)。
PAPは膵臓炎症のために膵臓により合成され、膵臓の損傷に対する良好な血清マーカーであることが示されている。また、血清PAPレベルはクレアチニンクリアランス測定値と強く相関していると思われる。膵臓−腎臓移植の患者では、PAPは膵臓移植片拒絶の有用な生物学的かつ組織学的マーカーであることが証明されている。Van der Pijl等, Transplantation, 63(7):995−1003 (1997)。更に、PAPは、嚢胞性線維症について新生児をスクリーニングする際に有用であることが分かっている。実際、PAPは現在の免疫反応性トリプシス(trypsis)検査法よりも良好な特異性をもって嚢胞性線維症を判別する。Iovanna等, C.R.Acad.Aci.III, 317(6):561−564。
PAPのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0090】
72. PRO788
抗悪性腫瘍尿タンパク(ANUP)は、マウス又はハムスター由来の幾つかの正常な二倍体細胞株又は腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさないでヒトの腫瘍細胞株に対して抗増殖活性を示すヒトの尿の画分中に存在する主要なタンパク質として同定された。Sloane等,Biochem.J., 234(2):355−362 (1986)。
ANUPはヒトの顆粒球に見出される独特のサイトカインである。N末端アミノ酸配列は独特であることが分かっている。4位と7位にCysを持つ最初の9残基に対応する合成ペプチドは、インビトロの抗腫瘍剤であることが見出されている。RidgeとSloane, Cytokine, 8(1):1−5 (1996)。
ANUPのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0091】
73.PRO1008
Dickkopf−1(dkk−1)は分泌タンパク質のファミリーのメンバーであり、頭部誘導において機能する。Dkk−1は両生類胎仔におけるシュペーマン形成体の誘導物質である。Glinka等, Nature, 391(6665):357−362 (1998)。Dkk−1はWntシグナル伝達の有力なアンタゴニストであり、dkk遺伝子が分泌Wntインヒビターのファミリーをコードしていることを示唆している。従って、dkk−1ファミリーメンバーと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にdkk−1に関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein.,等Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。dkk−1に関連した分子を同定するためのかかる努力の結果をここに提供する。
【0092】
74.PRO1012
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47:28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);及びDesilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定は、これらが多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、通常は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0093】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
特に興味深いものは、小胞体(ER)保持シグナルを有する細胞タンパク質である。これらのタンパク質は細胞に保持され、タンパク質生産において小胞体と密接に機能する。かかるタンパク質は過去に記載されている。すなわち、ShorroshとDixon, Plant J., 2(1):51−58 (1992)を参照されたい。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にER保持シグナルを有する細胞タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力、特にタンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性及び類似性を有する、新規なポリペプチドとこれをコードする核酸の同定の結果がここに提供される。
【0094】
75.PRO1014
酸素フリーラジカルと酸化防止剤は脳虚血及び再灌流後における中枢神経系に重要な役割を果たしていると思われる。更に、虚血及び再灌流に関連した心臓損傷がフリーラジカルの作用によって引き起こされることが報告されている。また、細胞のレドックス状態は細胞運命の中心的な決定要因であることが研究により報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要である。この点において、レダクターゼ、特にオキシドレダクターゼは興味深い。この主題事項を更に記述している刊行物には、Kelsey等, Br.J.Cancer, 76(7):852−854 (1997); FriedrichとWeiss, J.Theor.Biol., 187(4):529−40 (1997)及びPieulle等, J.Bacteriol., 179(18):5684−92 (1997)が含まれる。
特にレダクターゼに加えて、新規なポリペプチドは一般に興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力、特にレダクターゼに対して配列同一性を有するポリペプチド、及びこれをコードする核酸を同定するものの結果がここに提供される。
【0095】
76.PRO1017
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。スルホトランスフェラーゼは、硫酸ドナーからアクセプター基質へ硫酸塩を転移させる酵素、特に末端グルクロン酸を含むものである。HNK−1カルボヒドラーゼエピトープは幾つかの神経接着糖タンパク及び糖脂質上に発現され、細胞相互作用に関与している。グルクロニルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼは、構造の残りが複合糖質においてしばしば生じるので、このエピトープの生合成におけるキーの酵素と考えられる。HNK−1スルホトランスフェラーゼは更にBakker,H.等,J.Biol.Chem., 272(47):29942−29946 (1997)に記載されている。
HNK−1スルホトランスフェラーゼ及びそれに関連する新規なタンパク質に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0096】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にHNK−1と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0097】
77.PRO474
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースのグルコン酸への酸化において機能して代謝的に有用なエネルギーを産生する。PQQ関連グルコースデヒドロゲナーゼの異なった生物における調節はNeijssel等, Antonie Van Leeuwenhoek, 56(1):51−61 (1989)において概説されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、エネルギーストレスの条件下において最大に合成されるので、補助エネルギー発生機構として機能している。グルコースデヒドロゲナーゼに関連した分子に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0098】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特に細胞タンパク質及びデヒドロゲナーゼ又はオキシドレダクターゼに関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0099】
78.PRO1031
サイトカインインターロイキン17(IL−17)は上皮、内皮、及び線維芽細胞を刺激し、IL−6、IL−8のようなサイトカイン、及び顆粒球コロニー刺激因子、並びにプロスタグランジンE2を分泌することが報告されている。更に、IL−17の存在下で培養したとき線維芽細胞が好中球へのCD34+優先成熟の増殖を維持しうることが示されている。しかして、IL−17はT細胞依存性炎症反応の初期イニシエーター及び/又は免疫系を造血へ橋渡しするサイトカインネットワークの要素を構成していることが示唆されている。Yao等, J.Immunol., 155(12):5483−5486 (1995); Fossiez等, J.Exp.Med., 183(6):2593−2603 (1996); Kennedy等, J.Interferon Cytokine Res., 16(8):611−617 (1996)を参照されたい。従って、IL−1に関連したタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての新規なポリペプチドが興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にIL−17に関連したものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0100】
79.PRO938
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47):28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);Desilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996);Freedman等 Trends in Biochem. Sci. 19:331−336 (1994); Bulleid, N.J. Advances in Prot. Chem. 44:125−50 (1993);及びNoiva, R., Prot. Exp. and Purification 5:1−13(1994)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定がまた興味深い。かかるタンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0101】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってからは、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素と多くの異なった用途、例えば組換え的に生産されたタンパク質の正しいリホールディングの収量を増大させる際におけるその潜在的な使用の重要性が分かってからは、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規な未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ相同体のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
我々はここにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけを記載する。
【0102】
80.PRO1082
低密度リポタンパク質(LDL)レセプターは、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす膜結合タンパク質であり、そのリガンド、アポリポタンパク質(アポ)B−100及びアポEに対する高親和性結合によるリポタンパク質の細胞取り込みを媒介する。LDLレセプターのリガンド結合ドメインはおよそ40のアミノ酸のシステインリッチの反復を7つ含み、各反復は6つのシステインを含み、これが3つの反復内ジスルフィド結合を形成する。これらの独特な構造上の特徴がLDLレセプターに、アポB−100及びアポEと特異的に相互作用するその能力を付与し、これらのリポタンパク質粒子の細胞膜を越えての輸送とその成分に対する代謝が可能になる。LDLレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片は、その特異的リポタンパク質リガンドと相互作用する能力を維持していることが分かっている(Simmons等, J.Biol.Chem. 272:25531−25536 (1997))。LDLレセプターはJavitt, FASEB J., 9(13):1378−1381 (1995)及びHerzとWillnow, Ann.Ny Acad.Sci., 737:14−19 (1994)に更に記載されている。従って、LDLレセプターと配列同一性を有するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。特に興味深いものはII型膜貫通ドメインを有する膜結合タンパク質である。
【0103】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、新規な未変性のタンパク質、特にII型膜貫通結合タンパク質を含む膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0104】
81.PRO1083
特に興味深いものは7の膜貫通(7TM)レセプタースーパーファミリーに属する膜結合タンパク質である。これらのレセプターの例にはイオンレセプターのようなGプロテイン共役レセプターが含まれる。7TMレセプタースーパーファミリーのメンバーの他の例は、Osterhoff等, DNA Cell Biol., 16(4):379−389 (1997)に記載されている。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0105】
82.PRO200
細胞の生存、増殖及び/又は分化に関与するポリペプチドは興味深い。細胞の生存、増殖及び/又は分化に関与していることが知られているポリペプチドには、VEGF及び骨形成タンパク質ファミリーのメンバーが含まれる。従って、VEGF又は骨形成タンパク質ファミリーの何れかに関連している新規なポリペプチドが興味深い。
ヘパリン結合内皮細胞成長因子、VEGFは、数年以上前にウシ下垂体濾胞性又は濾胞星状細胞により馴化された培地から同定され精製された。Ferrara等, Biophys.Res.Comm. 161,851 (1989)を参照されたい。VEGFは、顆粒細胞の形態学的によく特徴づけされた集団である濾胞性又は濾胞星状細胞(FC)において生産される天然に生じる化合物である。FCは分泌細胞間に細胞質突起を送る星状細胞である。
VEGFは、選択的RNAスプライシングから生じる多重ホモ二量体型(モノマー当たり121、165、189及び206のアミノ酸)として様々な組織において発現される。VEGF121はヘパリンに結合しない可溶性分裂促進因子である;VEGFの長い型は連続的により高い親和性をもってヘパリンに結合する。VEGFのヘパリン結合型は、プラスミンによりカルボキシ末端で切断でき、VEGFの拡散性型を放出する。プラスミン切断後に同定されたカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列はArg110−Ala111である。アミノ末端「コア」タンパク質である、ホモ二量体として単離されるVEGF(1−110)は、FMS様チロシンキナーゼ(FLT−1)、キナーゼドメイン領域(KDR)及び胎児肝臓キナーゼ(FLK)レセプターの可溶型及び中和モノクローナル抗体(4.6.1及び2E3)に無傷のVEGF165ホモ二量体と比較して類似した親和性で結合する。
【0106】
説明されるように、VEGFは、それぞれKDRとFLT−1レセプターへの結合の原因である二つのドメインを含む。これらのレセプターは内皮(血管)細胞上にのみ存在する。外傷等のために細胞に酸素が欠乏すると、VEGF生産がそのような細胞において増加し、ついで細胞が、最終的には生物学的効果をシグナルするために各レセプターに結合する。その後シグナルが血管透過性を増大させ、細胞が分割され拡大されて新しい血管経路を形成する−血管形成と新血管形成。
しかして、VEGFは、過剰な組織成長のない状態で血管内皮細胞への選択性作用が重要である状態、例えば糖尿病性潰瘍及び皮下創傷のような損傷から生じる血管損傷を治療するのに対して有用である。血管(動脈及び静脈)内皮細胞成長因子であるので、VEGFは損傷を受けた細胞を修復し(血管形成と呼ばれるプロセス)、新しい血管の形成を刺激する(新血管形成と呼ばれるプロセス)。
VEGFにはまた心筋梗塞後の脈管構造の修復の用途、並びに演繹される他の用途が見出される。この点について、特にガン細胞における新血管形成と血管形成のようなプロセスを和らげるためにVEGFのインヒビターが時々望ましい。
【0107】
骨形成タンパク質ファミリーに関しては、このファミリーのメンバーが軟骨の分化及び血管新生と予備成形ヒドロキシアパタイトにおける骨誘導の促進に関与していると報告されている。Zou等, Genes Dev. (U.S.), 11(17):2191 (1997); Levine等, Ann.Plast.Surg., 39(2):158 (1997)。多くの関連した骨形成タンパク質が同定されており、全てが骨形成タンパク質(BMP)ファミリーのメンバーである。骨形成未変性及び変異体タンパク質、それをコードする核酸、レセプターを含む関連化合物、宿主細胞及び用途が、少なくとも米国特許第5,670,338号、同第5,454,419号、同第5,661,007号、同第5,637,480号、同第5,631,142号、同第5,166,058号、同第5,620,867号、同第5,543,394号、同第4,877,864号、同第5,013,649号、同第55,106,748号及び同第5,399,677号に更に記載されている。特に興味深いものは、基質沈着の調節において重要な役割を果たすプロコラーゲンC−プロテイナーゼである骨形成タンパク質1と相同性を有するタンパク質である。
本発明は、VEGF及びBMPファミリーに関連する新規なポリペプチド、特に細胞の生存、増殖及び/又は分化にある役割を果たすポリペプチドを同定することを意図した研究に基づいて断定されたものである。新規なポリペプチドはそれらが相同性を有する既知のポリペプチドと同じ生物活性を有することは期待されていないが、既知のポリペプチドの生物活性を、新規のポリペプチドの相対的生物活性を決定するために使用することができる。特に、ここに記載する新規なポリペプチドは、細胞の生存、増殖又は分化を誘導するポリペプチドの能力を決定することを意図したアッセイに使用することができる。順に、これらのアッセイの結果は従って診断及び治療目的に使用することができる。このような研究の結果が本発明の主題である。
【0108】
83.PRO285及びPRO286
胚性背側−腹側パターンの確立において中心的な役割を果たしている母性効果遺伝子であるショウジョウバエのToll遺伝子のクローニングは、Hashimoto等, Cell 52, 269−279 (1988)によって報告されている。ショウジョウバエToll遺伝子は、803アミノ酸の細胞質外ドメインと269アミノ酸の細胞質ドメインを持つ複合膜タンパク質をコードする。細胞質外ドメインは潜在的な膜貫通セグメントを有し、多くの膜貫通タンパク質に見出される構造モチーフであるロイシンリッチセグメントの多重コピーを含む。Tollタンパク質はショウジョウバエの胚において背側−腹側パターンを調節し、そのリガンドSpatzleへの結合の際に転写因子Dorsalを活性化する(MorisatoとAnderson, Cell 76,677−688 (1994))。成体ショウジョウバエにおいては、Toll/Dorsalシグナル伝達経路は抗真菌免疫応答に関与する(Lenaitre等, Cell 86,973−983 (1996))。
ショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体は、Medzhitov等, Nature 388,394−397 (1997)により記載されている。このヒトTollは、丁度ショウジョウバエTollのように、非LRR領域による分離された21の直列型反復ロイシンリッチモチーフ(ロイシンリッチ領域−LRR)からなる細胞外ドメインと、ヒトインターロイキン−1(IL−1)レセプターの細胞質ドメインに相同な細胞質ドメインとを持つI型膜貫通タンパク質である。ヒト株化細胞内に形質移入されたヒトTollの構成的に活性な変異体は、NF−κBの活性化及び炎症性サイトカインIL−1、IL−6及びIL−8に対するNF−κB調節性遺伝子の発現、並びに未変性T細胞の活性化に必要とされる、同時刺激性分子B7.1の発現を誘導しうることが示された。Tollは脊椎動物において免疫系の非クローンレセプターとして機能し、これが脊椎動物における生得的及び順応免疫応答の双方を活性化するためのシグナルを誘導することができることが示唆されている。上掲のMedzhitov等により報告されたヒトToll遺伝子は脾臓及び末梢血白血球(PBL)に最も強く発現されており、著者は、他の組織におけるその発現はマクロファージ及び樹枝状細胞の存在により、そこでは感染に対する初期警告系として作用しうることを示唆している。公のジェンバンクデータベースは次のToll配列:ランダム配列全長cDNA #HUMRSC786−1と同一であるToll1(DNAX# HSU88540−1);Toll2(DNAX# HSU88878−1);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(上掲のMedzhitov等により報告されたDNA配列と同一であるDNAX# HSU88880−1)を含んでいる。部分Toll配列(Toll5)はDNAX# HSU88881−1としてジェンバンクから入手できる。
更に、Toll様レセプター(huTLRs1−5)と命名されたショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体が最近クローニングされ、ショウジョウバエの対応物の組織分布構造を写していることが示された(Rock等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95,588−593 [1998])。あるヒトTLRの構成的に活性な変異体(Tollタンパク質相同体−Medzhitov等,上掲;TLR4−Rock等,上掲)の過剰発現はNF−κBの活性化及び炎症性サイトカイン及び同時刺激性分子の誘導に至る。Medzhitov等,上掲。
【0109】
84.PRO213−1、PRO1330及びPRO1449
癌は、増殖して腫瘍集団を形成する、正常な組織から誘導された異常な、あるいは新生物の細胞の数の増加、これらの新生物腫瘍細胞による隣接組織の浸襲、及び血液又はリンパ系を介して局所リンパ節まで及び遠い部位まで(転移)最終的に広がる悪性細胞の産生により特徴づけられる。癌の状態では細胞は正常な細胞が成長しない条件下で増殖する。癌は広範な形で現れ、異なった度合いの浸襲性及び病原力により特徴づけられる。
遺伝子発現の変化は全ての癌の共通の特徴である制御されていない細胞増殖及び脱分化に密接に関連している。ある種のよく研究されている腫瘍のゲノムは、悪性腫瘍細胞増殖を通常は防止するように機能する、癌抑制遺伝子と通常呼ばれる劣性遺伝子の発現の減少、及び/又は悪性腫瘍の増殖を促進するように作用する発癌遺伝子のようなある種の優性遺伝子の過剰発現を示すことが見出されている。これらの遺伝子変化の各々は、凝集して完全な新生物表現型を表す幾つかの形質を移入する原因であると思われる(Hunter, Cell 64,1129 [1991]; Bishop, Cell, 235−248 [1991])。
癌細胞における遺伝子(例えば発ガン遺伝子)過剰発現のよく知られた機構は遺伝子増幅である。これは、特定の遺伝子の先祖細胞多重コピーの染色体がつくられるプロセスである。該プロセスは、染色体中に戻される複製セグメントの組換えが続く、遺伝子を構成する染色体領域の予定外の複製を含む(Alitalo等, Adv.Cancer Res. 47,235−281 [1986])。遺伝子の過剰発現は遺伝子増幅と平行する、すなわち作製されたコピーの数に比例する。
【0110】
成長因子及び成長因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳ガンを含む様々なヒトの悪性腫瘍の病因に重要な役割を果たしていることが確認されている。例えば、上皮成長因子レセプター(EGFR)に関連した185kdの膜貫通糖タンパク質レセプター(p185HER2;HER2)をコードするヒトErbB2遺伝子(her2としても知られるerbB2、又はc−erbB−2)が、ヒトの乳ガンの約25%〜30%において過剰発現することが見出されている(Slamon等, Science 235:177−182 [1987]; Slamon等, Science 244:707−712 [1989])。
プロトオンコジーンの遺伝子増幅は典型的には癌の更に悪性の形態に関与する事象であり、臨床結果のプレディクターとして作用しうることが報告されている(Schwab等, Genes Chromosomes Cancer 1, 181−193 [1990]; Alitalo等, 上掲)。従って、erbB2過剰発現は、特に腋窩リンパ節を関与させる原疾患を持つ患者において、不十分な予後のプレディクターと一般に見なされており(Slamon等,[1987]及び[1989],上掲;Ravdin及びChamness, Gene 159:19−27[1995];及びHynes及びStern, Biochem Biophys Acta 1198:165−184 [1994])、CMF(シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリンを含む化学療法及びホルモン療法に対する感応性及び/又は耐性に関連している(Baselga , Oncology 11 (3 Suppl 1): 43−48 [1997])。しかし、erbB2過剰発現が不十分な予後に関連しているにも拘わらず、タキサンでの治療に臨床的に応答するHER2陽性患者の可能性はHER2陰性患者のものの3倍を越えていた(上掲)。組換えヒト化抗ErbB2(抗HER2)モノクローナル抗体(rhuMAbHER2又はハーセプチン7δと称される、マウス抗ErbB2抗体4D5のヒト化バージョン)は、それまでに広範な抗ガン治療を受けたErbB2を過剰発現する転移性乳ガンの患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J.Clin.Oncol. 14:737−744 [1996])。
タンパク質ノッチ(Notch)とその相同体は、様々な発達プロセスにおいて細胞運命を決定する際に重要な調節レセプターである。タンパク質ノッチ−4は、int−3発癌遺伝子としても知られ、マウスの乳腺腫瘍ウィルス(MMVS)中において頻繁な標的として元々は同定された。ノッチ−4は幹細胞の分化能に影響し上皮細胞における新生物増殖に導く導入遺伝子であると信じられている。Shirayoshi等, Genes Cells 2(3):213−224 (1997)。胚形成の間、ノッチ−4の発現は、のような背側大動脈、セグメント間血管、卵黄嚢血管、頭部血管、心臓、鰓弓の血管、及び神経叢毛細血管のような組織を形成する血管の上皮細胞に検出された。これらの組織におけるノッチ−4発現はまた、血管形成と新血管形成の主要な調節遺伝子であるflk−1に付随していた。ノッチ−4は内皮幹細胞の分化中にインビトロでアップレギュレートされる。ノッチ−4の内皮細胞特異的発現パターン、並びにノッチに対するその構造類似性は、ノッチ−4がノッチの内皮細胞特異的相同体であり、血管形成と新血管形成においてある役割を果たしていることを示唆している。
【0111】
85.PRO298
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでPRO298ポリペプチドと命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0112】
86.PRO337
高等脊椎動物におけるニューロンの発達は、途中の別個の細胞環境を成功裡にそのシナプス標的まで航路決定しなければならないプロセスにより特徴づけられる。結果は神経回路の機能的に正確な形成である。精度は、成長円錐経路の発見と標的認識を調節し、後者の洗練とニューロン活性を必要とする現象によるそのような突出の再構築が続く機構から得られるものと信じられている。Goodman及びShatz, Cell/Neuron [Suppl.] 72(10):77−98 (1993)。更に、異なったニューロンが生化学的に区別される神経線維を伸長し、細胞−細胞、細胞−マトリックス、及び走化性相互作用によって提供される特異的案内キューに依存して、その適切なシナプス標的に到達することが明らかである。Goodman等、上掲。
ニューロン細胞表面の多様性がつくり出される一つの特定の手段は、細胞接着分子(CAMs)と称される細胞表面タンパク質の差次的な発現を通してである。ニューロン的に発現されたCAMsは、放射状グリア細胞に沿ったニューロンの遊走を含む、広範な発達プロセスに関与し、神経突起伸長に対して許容できる又は反発性の基質を提供し、また突出経路における軸索の選択的束状化を促進することに関与している。Jessel, Neuron 1:3−13 (1998); Edelman及びCrossin, Annu.Rev.Biochem. 60:155−190 (1991)。成長円錐膜上に存在するCAMsと対向する細胞膜上又は細胞外マトリックス中の分子との間の相互作用は、適切な突出経路に沿って神経線維の成長を方向付ける特異的案内キューを提供すると考えられている。そのような相互作用の結果、神経突起成長を調節する成長円錐内において様々な第2のメッセンジャー系の活性化が生じると思われる。Doherty及びWalsh, Curr.Opin.Neurobiol. 2:595−601 (1992)。
高等脊椎動物において、大抵の神経CAMsはタンパク質の3つの主要な構造ファミリー:インテグリン、カドヘリン、及び免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー(IgSF)のメンバーであることが見出されている。Jessel,上掲;Takeichi, Annu.Rev.Biochem. 59:237−252 (1990); Reichardt及びTomaselli, Annu.Rev.Neurosci. 14:531−570 (1991)。IgSF(又はIg−CAMs)の細胞接着分子は特に、発達の間の神経細胞相互作用及び神経線維成長にしばしば関与しているタンパク質の大きなファミリーを構成している。Salzer及びColman, Dev.Neurosci. 11:377−390 (1989); Bruemmendorf及びRathjen, J.Neurochem. 61:1207−1219 (1993)。しかし、哺乳類Ig−CAMsの大半はあまりに広範に発現されているので航路決定又はシナプス標的を特定できないように思われ、まだ同定されていない他のCAMsがニューロンのこれらの更に選択的な相互作用において役割を果たしていることが示唆される。
【0113】
既知の神経Ig−CAMsの多くはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して原形質膜に結合していることが見出されている。また、多くの研究によれば、GPIアンカータンパク質が特異的経路におけるニューロンの成長の間、特異的案内キューの提供に関与している。バッタの神経系の研究では、細胞の表面からGPI−アンカータンパク質を選択的に除去するホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)での胎仔の治療の結果、開拓している成長円錐のサブセットの間での誤案内及び偽りの航路決定、並びに初期ニューロンのサブセットの阻害遊走パターンが生じる。Chang等, Devel. 114:507−519 (1992)。網膜線維の視蓋への突出は、部分的に33kDaのGPIアンカータンパク質に依存しているように思われるが、このタンパク質の正確な性質は未知である。Stahl等, Neuron 5:735−743 (1990)。
様々なGPIアンカータンパク質の発現は、後根神経節の一次ラットニューロン、頸部神経節の交感ニューロン、上頸神経節の交感ニューロン、及び小脳顆粒ニューロンの異なった集団のなかで特徴づけられている。Rosen等, J.Cell Biol. 117:617−627 (1992)。これらの異なったタイプのニューロンによる全膜タンパク質の発現の類似パターンとは対照に、顕著な差異がこれらのニューロン間でGPIアンカータンパク質の発現において観察された。最近、ニューロトリミン(neurotrimin)として知られている65kDaのタンパク質バンドが発見され、一次ニューロンにより差次的に発現され(Rosen等,上掲)、神経系に制限され、CNSにおいて最も豊富で最も初期に発現されたGPIアンカー種であることが分かった。Struyk等, J.Neuroscience 15(3):2141−2156 (1995)。ニューロトリミンの発見は更に、現在IgLONと名付けられ、それぞれが有意なアミノ酸同一性を分かち持つIg様ドメインを含んでいるIgSFメンバーのファミリーの同定に至った。Struyk等,上掲;Pimenta等,Gene 170(2):189−95 (1996)。
IgLONサブファミリーの更なるメンバーは、オピエート結合細胞接着分子(OBCAM)、Schofield等, EMBO J. 8:489−495 (1989);辺縁随伴膜タンパク質(LAMP)、Pimenta等,上掲;CEPU−1;GP55、Wilson等, J.Cell Sci. 109:3129−3138 (1996); Eur.J.Neurosci. 9(2):334−41 (1997);及びAvGp50、Hancox等,Brain Res.Mol.Brain Res. 44(2):273−85 (1997)を含む。
【0114】
ニューロトリミンの発現は広範であると思われる一方、幾つかの神経回路の発達に相関していると思われる。例えば、E18とP10の間で、前脳内でのニューロチミンmRNAの発現が、発達中の視床、皮質サブプレート、及び皮質のニューロン、特にラミナV及びVI(II、II及びIVでのあまり強くない発現とラミナIでの最小の発現を伴って)において高レベルに維持される。皮質サブプレートニューロンは、皮質内のその最終のシナプス標的までの途中の内に伸びる視床求心性神経に対する初期の一時的な足場を提供する。Allendoerfer及びShatz, Annu.Rev.Neurosci. 17:185−218 (1994)。逆に、サブプレートニューロンは、層Vからの皮質ニューロンがVIを選択して視床内に成長し、層Vからのニューロンが小丘、脳橋、及び脊髄においてその標的を選択するのに必要とされることが示唆されている(McConnell等, J.Neurosci. 14:1892−1907 (1994))。これらの突出の多くにおけるニューロトリミンの高レベルの発現はそれがその発達に関与していることを示唆している。
後脳において、ニューロトリミンメッセージ発現の高レベルは、脳橋核内中に、及び小脳のプルキニエ細胞及び内部顆粒細胞によって観察された。脳橋核はV層の皮質脳橋線維を含む様々なソースから求心性線維の入力を受け取り、顆粒細胞への苔状線維を介しての求心性線維の入力の主要ソースであり、該顆粒細胞は次にプルキニエ細胞への平行線維を介しての求心性線維の入力の主たるソースである。[Palay及びChan−Palay, The cerebellar cortex: cytology and organization. New York: Springer (1974)]。これらニューロトリミンニューロンの高レベルの発現はこれらの回路の確率における強力な関与を示唆している。
ニューロトリミンはまた初期の出生後線条体において段階的な発現パターンを示す。ニューロトリミンの発現の増加はラットの背外側線条体上に横たわって見出される一方、より低いハイブリダイゼーション強さが腹側正中線条体上に横たわって見られる。Struyk等,上掲。より高いニューロトリミンハイブリダイゼーション強さのこの領域は細胞構造的に区別しうる領域に対応せず、むしろ、対側性感覚運動皮質のVI層からの求心性入力の一次領域に対応する(Gerfen, Nature 311:461−464 (1984); Donoghue及びHerkenham, Brain Res. 365:397−403 (1986))。対照的に、腹側正中線条体は鼻周囲及び連合野からその大部分の求心性入力を受け取る。LAMP発現の相補的段階的パターンは線条体において、腹側正中領域において最も高い発現と背外側的に最も低い発現を伴って観察されている。Levitt, Science 223:299−301 (1985); Chesselet等, Neuroscience 40:725−733 (1991)。
【0115】
87.PRO403
シングルパス膜貫通タンパク質としても知られているII型膜貫通タンパク質は細胞質に留まるN末端部分を有する一方、C末端部分は細胞外ドメインに暴露されている。
エンドセリンは、イソペプチド及びその遺伝子(エンドセリン−1、−2及び−3)の存在と構造、遺伝子発現の調節、細胞内プロセシング、特異的エンドセリン変換酵素(ECE)、レセプターサブタイプ(ET−A及びET−B)、レセプター活性化に続く細胞内シグナル伝達等々を含む、その薬理学的、生化学的及び分子生物学的特徴を更に良好に理解するために多くの活動が注がれている血管収縮薬ペプチドのファミリーである。
ペプチドのエンドセリン(ET)ファミリーは、多くのヒトの疾患状態において病態生理学的な重要性を有する有力な血管、心臓及び腎臓作用を有している。ET−1は不活性な212アミノ酸プレプロペプチドとして発現される。プレプロペプチドは最初はArg52−Cys53及びArg92−Ala93で切断され、ついでカルボキシ末端Lys91及びArg92はタンパク質から切り取ってプロペプチドビッグET−1を産生する。
エンドセリンは、エンドセリン変換酵素(ECE)である亜鉛メタロプロテアーゼにより触媒される独特のプロセシング事象により不活性な中間体であるビッグエンドセリンから生産される。ECEは最近クローニングされ、その構造は触媒ドメインと数多くのN−グリコシル化部位を含む長い細胞外C末端と短い細胞内N末端を持つシングルパス膜貫通タンパク質であることが分かった。ECEsはTrp73とVal74の間でエンドセリンプロペプチドを切断して活性なペプチドETを生産し、これが循環ホルモンよりもむしろ局所ホルモンとして機能するように思われる(Rubanyi,G.M.及びPolokoff,M.A., Pharmacological Reviews 46:325−415 (1994))。従って、ECE活性はエンドセリン生産の調節の有力な部位であり、エンドセリン系における治療的介入に対する可能な標的である。ECE活性を遮断することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグET−1の生理学的に活性な形態への転換を阻害して、ET−1の生産を停止することができる。
エンドセリンは、1)循環器病(血管痙攣、高血圧、心筋虚血症;再灌流損傷及び急性心筋梗塞、脳卒中(脳虚血)、鬱血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚);2)腎疾患(急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変);3)肺疾患(気管支喘息、肺性高血圧);4)胃腸障害(胃潰瘍、炎症性腸疾患);5)生殖疾患(早発分娩、月経困難症、子癇前症)及び6)発癌を含む多くの疾患状態の病態生理学における役割を担っている。Rubanyi & Polokoff,上掲。
【0116】
(発明の概要)
1.PRO213
出願人は、本出願において「PRO213」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO213ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig2(配列番号:2)のアミノ酸残基1〜295を持つPRO213をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO213ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO213ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig2(配列番号:2)の残基1〜295を含んでなるアミノ酸を含む。
【0117】
2.PRO274
出願人は、本出願において「PRO274」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO274ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig4(配列番号:7)のアミノ酸残基1〜492を持つPRO274をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO274をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209786として1998年4月21日に寄託されたDNA39987−1184ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO274ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO274ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig4(配列番号:7)の残基1〜492を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はPRO274ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO274ポリペプチドは、ATCC209786として1998年4月21日に寄託されたDNA39987−1184ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:8(ここでDNA17873と命名)、配列番号:9(ここでDNA36157と命名)及び配列番号:10(ここでDNA28929と命名)(それぞれFig5−7を参照されたい)のヌクレオチド配列を含んでなる3種の発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0118】
3.PRO300
出願人は、本出願において「PRO300」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO300ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig9(配列番号:19)のアミノ酸残基1〜457を持つPRO300をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO300をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209788として1998年4月21日に寄託されたDNA40625−1189ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO300ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO300ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig9(配列番号19)の残基1〜457を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はPRO300ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO300ポリペプチドは、ATCC209788として1998年4月21日に寄託されたDNA40625−1189ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0119】
4.PRO284
出願人は、本出願において「PRO284」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO284ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸残基1〜285を持つPRO284をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸残基約25〜285又はFig11(配列番号:28)の1からもしくは約25からX(ここで、XはFig11(配列番号:28)の71〜80の任意のアミノ酸である)を持つPRO284をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO284をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209787として1998年4月21日に寄託されたDNA23318−1211ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO284ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO284ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig11(配列番号:28)の残基1〜285を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸約25〜285又はFig11(配列番号:28)の1からもしくは約25からX(ここで、XはFig11(配列番号:28)の71〜80の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO284ポリペプチドに関している。場合によっては、PRO284ポリペプチドは、ATCC209787として1998年4月21日に寄託されたDNA23318−1211ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号29のヌクレオチド配列を含んでなるDNA12982とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号30のヌクレオチド配列を含んでなるDNA15886とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0120】
5. PRO296
出願人は、本出願において「PRO296」と命名した、肉腫増幅タンパク質SASと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO296ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸残基1〜204を持つPRO296をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸残基約35〜204又はFig15(配列番号:36)のアミノ酸1からもしくは約35からX(ここで、XはFig15(配列番号:36)の42〜51の任意のアミノ酸である)を持つPRO296をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO296をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209789として1998年4月21日に寄託されたDNA39979−1213ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO296ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO296ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig15(配列番号:36)の残基1〜204を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸約35〜204又はFig15(配列番号:36)の1からもしくは約35からX(ここで、XはFig15(配列番号:36)の42〜51の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO296ポリペプチドに関している。場合によっては、PRO296ポリペプチドは、ATCC209789として1998年4月21日に寄託されたDNA39979−1213ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:37のヌクレオチド配列を含んでなるDNA23020とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:38のヌクレオチド配列を含んでなるDNA21971とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:39のヌクレオチド配列を含んでなるDNA29037とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0121】
6. PRO329
出願人は、本出願において「PRO329」と命名した、高親和性免疫グロブリンFcレセプターと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO329ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig20(配列番号:45)のアミノ酸残基1〜359を持つPRO329をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO329をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209617として1998年2月5日に寄託されたDNA40594−1233ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO329ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO329ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig20(配列番号:45)の残基1〜359を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO329ポリペプチドは、ATCC209617として1998年2月5日に寄託されたDNA40594−1233ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0122】
7.PRO362
出願人は、本出願において「PRO362」と命名した、A33抗原及びHCAR膜結合タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig22(配列番号:52)のアミノ酸残基1〜321を持つPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図22(配列番号52)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸271〜280の任意のアミノ酸である)を持つPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO362をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209620として1998年2月5日に寄託されたDNA45416−1251ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO362ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO362ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig22(配列番号:52)の残基1〜321を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig22(配列番号:52)に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1〜X(ここで、Xはアミノ酸271〜280の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO362ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO362ポリペプチドは、ATCC209620として1998年2月5日に寄託されたDNA45416−1251ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0123】
8.PRO363
出願人は、本出願において「PRO363」と命名した、細胞表面レセプタータンパク質HCARと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO363ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig24(配列番号:59)のアミノ酸残基1〜373を持つPRO363ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図24(配列番号59)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸216〜アミノ酸225の任意のアミノ酸である)を持つPRO363細胞外ドメインポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO363をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209616として1998年2月5日に寄託されたDNA45419−1252ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO363ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO363ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig24(配列番号:59)の残基1〜373を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO363ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関しており、該細胞外ドメインは、24(配列番号59)に示される配列のアミノ酸1〜X(ここで、Xはアミノ酸216〜225の任意のアミノ酸である)を含みうる。場合によっては、PRO363ポリペプチドは、ATCC209616として1998年2月5日に寄託されたDNA45419−1252ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0124】
9.PRO868
出願人は、本出願において「PRO868」と命名した、腫瘍壊死因子レセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜655を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸343〜352の任意のアミノ酸である)を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。更に他の側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基X〜655(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸371〜380の任意のアミノ酸である)を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO868をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209679として1998年3月17日に寄託されたDNA52594−1270ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO868ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO868ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig26(配列番号:64)の残基1〜655を含んでなるアミノ酸を含む。他の側面では、単離されたPRO868ポリペプチドは、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸343〜352の任意のアミノ酸である)を含みうる。更に他の側面では、PRO868ポリペプチドは、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基X〜655(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸371〜380の任意のアミノ酸である)を含みうる。場合によっては、PRO868ポリペプチドは、ATCC209679として1998年3月17日に寄託されたDNA52594−1270ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0125】
10.PRO382
出願人は、本出願において「PRO382」と命名した、セリンプロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO382ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig28(配列番号:69)のアミノ酸残基1〜453を持つPRO382ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO382をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209654として1998年3月5日に寄託されたDNA45234−1277ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO382ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO382ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig28(配列番号:69)の残基1〜453を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、シグナルペプチドを持つか持たない、PRO382ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO382ポリペプチドは、ATCC209654として1998年3月5日に寄託されたDNA45234−1277ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0126】
11.PRO545
出願人は、本出願において「PRO545」と命名した、メルトリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO545ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig30(配列番号:74)のアミノ酸残基1〜735を持つPRO545ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO545をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209655として1998年3月5日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO545ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO545ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig30(配列番号:74)の残基1〜735を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO545ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO545ポリペプチドは、ATCC209655として1998年3月5日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:75(Fig31)のヌクレオチド配列を含んでなる、ここでDNA13217と命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0127】
12.PRO617
出願人は、本出願において「PRO617」と命名した、CD24と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO617ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig33(配列番号:85)のアミノ酸残基1〜67を持つPRO617ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO617をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209656として1998年3月5日に寄託されたDNA48309−1280ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO617ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO617ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig33(配列番号:85)の残基1〜67を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO617ポリペプチドは、ATCC209656として1998年3月5日に寄託されたDNA48309−1280ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0128】
13.PRO700
出願人は、本出願において「PRO700」と命名した、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig35(配列番号:90)のアミノ酸残基1〜432を持つPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig35(配列番号:90)の約34〜432のアミノ酸残基を持つPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO700をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209721として1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO700ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO700ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig35(配列番号:90)の残基1〜432を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はFig35(配列番号:90)の約34〜432の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離PRO700ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO700ポリペプチドは、ATCC209721として1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0129】
14.PRO702
出願人は、本出願において「PRO702」と命名した、コングルチニンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基1〜277を持つPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基26〜277を持つPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO702をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209717として1998年3月31日に寄託されたDNA50980−1286ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO702ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO702ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig37(配列番号:97)の残基1〜277を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基26〜277を含んでなる単離されたPRO702ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO702ポリペプチドは、ATCC209717として1998年3月31日に寄託されたDNA50980−1286ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0130】
15. PRO703
出願人は、本出願において「PRO703」と命名した、VLCASと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig39(配列番号:102)のアミノ酸残基1〜730を持つPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig39(配列番号:102)の約43〜730のアミノ酸残基を持つPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO703をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209716として1998年3月31日に寄託されたDNA50913−1287ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO703ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO703ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig39(配列番号:102)の残基1〜730を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はFig39(配列番号:102)の約43〜730の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO703ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO703ポリペプチドは、ATCC209716として1998年3月31日に寄託されたDNA50913−1287ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0131】
16.PRO705
出願人は、本出願において「PRO705」と命名した、K−グリピカンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig41(配列番号:109)のアミノ酸残基1〜555を持つPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig41(配列番号:109)の約24〜555のアミノ酸残基を持つPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO705をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209722として1998年3月31日に寄託されたDNA50914−1289ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO705ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO705ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig41(配列番号:109)の残基1〜555を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Fig41(配列番号:109)の約24〜555のアミノ酸残基を含んでなる単離されたPRO705ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO705ポリペプチドは、ATCC209722として1998年3月31日に寄託されたDNA50914−1289ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0132】
17. PRO708
出願人は、本出願において「PRO708」と命名した、アリールスルファターゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO708ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig43(配列番号:114)のアミノ酸残基1〜515を持つPRO708ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO708をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209668として1998年3月31日に寄託されたDNA48296−1292ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO708ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO708ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig43(配列番号:114)の残基1〜515を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Fig43(配列番号:114)に示すアミノ酸配列の残基38〜515を含んでなるPRO708ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO708ポリペプチドは、ATCC209668として1998年3月11日に寄託されたDNA48296−1292ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0133】
18. PRO320
出願人は、本出願において「PRO320」と命名した、フィブリンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO320ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig45(配列番号:119)のアミノ酸残基1〜338を持つPRO320ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO320をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209670として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO320ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO320ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig45(配列番号:119)の残基1〜338を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO320ポリペプチドは、ATCC209670として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0134】
19.PRO324
出願人は、本出願において「PRO324」と命名した、オキシドレダクターゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig47(配列番号:124)のアミノ酸残基1〜289を持つPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig47(配列番号:124)のアミノ酸残基1又は約32からX(ここで、Xは131〜140の任意のアミノ酸である)を持つPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO324をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209718として1998年3月30日に寄託されたDNA36343−1310ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO324ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO324ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig47(配列番号:124)の残基1〜289を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまたFig47(配列番号:124)の残基1又は約32からX(ここで、Xは約131〜140の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO324ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO324ポリペプチドは、ATCC209718として1998年3月30日に寄託されたDNA36343−1310ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0135】
20.PRO351
出願人は、本出願において「PRO351」と命名した、プロスタシン(prostasin)と配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig49(配列番号:132)のアミノ酸残基1〜571を持つPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig49(配列番号:132)の約16〜571のアミノ酸残基を持つPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO351をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209784として1998年4月21日に寄託されたDNA40571−1315ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO351ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO351ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig49(配列番号:132)の残基1〜571を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、Fig49(配列番号:132)の約16〜571の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO351ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO351ポリペプチドは、ATCC209784として1998年4月21日に寄託されたDNA40571−1315ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0136】
21.PRO352
出願人は、本出願において「PRO352」と命名した、ブチロフィリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig51(配列番号:137)のアミノ酸残基1〜316を持つPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig51(配列番号:137)の約29〜316のアミノ酸残基、又はFig51の1あるいは約29からX(ここで、Xは246〜255の任意のアミノ酸である)を持つPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO352をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209703として1998年3月26日に寄託されたDNA41386−1316ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO352ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO352ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig51(配列番号:137)の残基1〜316を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig51(配列番号:137)の残基約29〜316及びFig51(配列番号:137)の1又は約29からX(ここで、Xは246〜255の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO352ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO352ポリペプチドは、ATCC209703として1998年3月26日に寄託されたDNA41386−1316ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0137】
22.PRO381
出願人は、本出願において「PRO381」と命名した、イムノフィリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig53(配列番号:145)のアミノ酸残基1〜211を持つPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig53(配列番号:145)の約21〜211のアミノ酸残基を持つPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO381をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209808として1998年4月28日に寄託されたDNA44194−1317ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO381ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO381ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig53(配列番号:145)の残基1〜211を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Fig53(配列番号:145)の約21〜211のアミノ酸残基を含んでなるPRO381ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO381ポリペプチドは、ATCC209808として1998年4月28日に寄託されたDNA44194−1317ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0138】
23.PRO386
出願人は、本出願において「PRO386」と命名した、ナトリウムチャネルのβ−2サブユニットと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸残基1〜215を持つPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸残基約21〜215又は1もしくは約21からX(ここで、XはFig55(配列番号:150)の156〜165の任意のアミノ酸である)を持つPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO386をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209810として1998年4月28日に寄託されたDNA45415−1318ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO386ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO386ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig55(配列番号:150)の残基1〜215を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸約21〜215及びFig55(配列番号:150)の1もしくは約21からX(ここで、XはFig55(配列番号:150)の156〜165の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO386ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO386ポリペプチドは、ATCC209810として1998年4月28日に寄託されたDNA45415−1318ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号151のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供し、これはDNA23350とここで命名したESTに対応する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号152のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供し、これはDNA23536とここで命名したESTに対応する。
【0139】
24.PRO540
出願人は、本出願において「PRO540」と命名した、LCATと配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig59(配列番号:157)のアミノ酸残基1〜412を持つPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig59(配列番号:157)の約29〜412のアミノ酸残基を持つPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO540をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209699として1998年3月26日に寄託されたDNA44189−1322ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO540ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO540ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig59(配列番号:157)の残基1〜412を含んでなるアミノ酸を含む。本発明はまた単離されたPRO540ポリペプチドを提供し、これは一実施態様では、Fig59(配列番号:157)の約29〜412の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO540ポリペプチドは、ATCC209699として1998年3月26日に寄託されたDNA44189−1322ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0140】
25.PRO615
出願人は、本出願において「PRO615」と命名した、シナプトジリン(synaptogyrin)と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基1〜224を持つPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基約X〜224(ここで、Xは157〜166の任意のアミノ酸である)を持つPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO615をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209811として1998年4月28日に寄託されたDNA48304−1323ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO615ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO615ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig61(配列番号:162)の残基1〜224を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基X〜224(ここで、XはFig61(配列番号:162)の157〜166の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO615ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO615ポリペプチドは、ATCC209811として1998年4月28日に寄託されたDNA48304−1323ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0141】
26.PRO618
出願人は、本出願において「PRO618」と命名した、エンテロペプチダーゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO618ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig63(配列番号:169)のアミノ酸残基1〜802を持つPRO618ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig63(配列番号:169)のアミノ酸残基X〜802(ここで、XはFig63(配列番号:169)の63〜72の任意のアミノ酸である)を持つPRO618ポリペプチドの単離された細胞外ドメインをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO618をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209813として1998年4月28日に寄託されたDNA49152−1324ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO618ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO618ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig63(配列番号:169)の残基1〜802を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、アミノ酸X〜802(ここで、XはFig63(配列番号:169)の63〜72の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO618ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO618ポリペプチドは、ATCC209813として1998年4月28日に寄託されたDNA49152−1324ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA35597と命名された、配列番号170のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する(Fig64を参照されたい)。
【0142】
27.PRO719
出願人は、本出願において「PRO719」と命名した、リポタンパク質リパーゼHと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig66(配列番号:178)のアミノ酸残基1〜354を持つPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig66(配列番号178)のアミノ酸残基約17〜354を持つPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO719をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209705として1998年3月26日に寄託されたDNA49646−1327ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO719ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO719ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig66(配列番号:178)の残基1〜354を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig66(配列番号:178)の約17〜354の残基を含んでなる単離されたPRO719ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO719ポリペプチドは、ATCC209705として1998年3月26日に寄託されたDNA49646−1327ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0143】
28.PRO724
出願人は、本出願において「PRO724」と命名した、LDLレセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig68(配列番号:183)のアミノ酸残基1〜713を持つPRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig68(配列番号:183)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸437〜446の任意のアミノ酸である)を持つ可溶性PRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。上記の二種のポリペプチドはシグナルペプチドを含んでいても含んでいなくともよい。単離された核酸配列は、PRO724をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209806として1998年4月28日に寄託されたDNA49631−1328ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO724ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO724ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig68(配列番号:183)の残基1〜713を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、単離された可溶性PRO724ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された可溶性PRO724ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では、Fig68(配列番号:183)の残基1〜X(ここで、Xは図68(配列番号183)に示される配列の437〜446の任意のアミノ酸である)を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO724ポリペプチドは、ATCC209806として1998年4月28日に寄託されたDNA49631−1328ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0144】
29.PRO772
出願人は、本出願において「PRO772」と命名した、A4プロテインと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸残基1〜152を持つPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig70(配列番号:190)の21〜30の任意のアミノ酸である)を持つPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO772をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209809として1998年4月28日に寄託されたDNA49645−1347ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO772ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO772ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では図70(配列番号:190)の残基1〜152を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸1〜X(ここで、XはFig70(配列番号:190)の21〜30の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO772ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO772ポリペプチドは、ATCC209809として1998年4月28日に寄託されたDNA49645−1347ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA43509と命名された、配列番号:191のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する(Fig71)。
【0145】
30.PRO852
出願人は、本出願において「PRO852」と命名した、様々なプロテアーゼ酵素と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸残基1〜518を持つPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸残基約21〜518又はFig73(配列番号:196)の1あるいは約21からX(ここで、XはFig73(配列番号:196)のアミノ酸461〜アミノ酸470の任意のアミノ酸である)を持つPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO852をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209805として1998年4月28日に寄託されたDNA45493−1349ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO852ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO852ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig73(配列番号:196)の残基1〜518を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、PRO852は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸約21〜アミノ酸518あるいはFig73(配列番号:196)のアミノ酸1又は約21からX(ここで、XはFig73(配列番号:196)のアミノ酸461〜アミノ酸470の任意のアミノ酸である)を含んでなる。場合によっては、PRO852ポリペプチドは、ATCC209805として1998年4月28日に寄託されたDNA45493−1349ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0146】
31.PRO853
出願人は、本出願において「PRO853」と命名した、レダクターゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig75(配列番号:206)のアミノ酸残基1〜377を持つPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig75(配列番号:206)のアミノ酸残基約17〜377を持つPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO853をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209812として1998年4月28日に寄託されたDNA48227−1350ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO853ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO853ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig75(配列番号:206)の残基1〜377を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、本発明は、Fig75(配列番号:206)の残基約17〜377を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナルペプチドを欠いた単離されたPRO853ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO853ポリペプチドは、ATCC209812として1998年4月28日に寄託されたDNA48227−1350ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0147】
32.PRO860
出願人は、本出願において「PRO860」と命名した、ニューロファシン(neurofascin)と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig77(配列番号:211)のアミノ酸残基1〜985を持つPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig77(配列番号:211)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig77(配列番号:211)のアミノ酸443〜452の任意のアミノ酸である)を持つPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO860をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209844として1998年5月6日に寄託されたDNA41404−1352ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO860ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO860ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig77(配列番号:211)の残基1〜985を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig77(配列番号:211)の残基1〜X(ここで、XはFig77(配列番号:211)の443〜452の任意のアミノ酸残基である)を含んでなるアミノ酸配列を含む単離されたPRO860ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO860ポリペプチドは、ATCC209844として1998年5月6日に寄託されたDNA41404−1352ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0148】
33.PRO846
出願人は、本出願において「PRO846」と命名した、CMRF35と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig79(配列番号:216)のアミノ酸残基1〜332を持つPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig79(配列番号:216)のアミノ酸残基約18〜332又は配列番号:216の1あるいは約18からX(ここで、XはFig79(配列番号:216)の243〜252の任意のアミノ酸である)を持つPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO846をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209847として1998年5月6日に寄託されたDNA44196−1353ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO846ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO846ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig79(配列番号:216)の残基1〜332を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig79(配列番号:216)の残基約18〜332を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO846ポリペプチドを提供する。本発明の更なる実施態様は、Fig79(配列番号:216)の1又は約18からX(ここで、XはFig79(配列番号:216)の243〜252の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO846に関する。場合によっては、PRO846ポリペプチドは、ATCC209847として1998年5月6日に寄託されたDNA44196−1353ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0149】
34.PRO862
出願人は、本出願において「PRO862」と命名した、リゾチームと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig81(配列番号:221)のアミノ酸残基1〜146を持つPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig81(配列番号:221)のアミノ酸残基約19〜146を持つPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO862をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209845として1998年5月6日に寄託されたDNA52187−1354ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO862ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO862ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig81(配列番号:221)の残基1〜146を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig81(配列番号:221)の残基約19〜146を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO862ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO862ポリペプチドは、ATCC209845として1998年5月6日に寄託されたDNA52187−1354ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0150】
35.PRO864
出願人は、本出願において「PRO864」と命名した、Wnt−4と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig83(配列番号:226)のアミノ酸残基1〜351を持つPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig83(配列番号:226)のアミノ酸残基約23〜351を持つPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO864をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209843として1998年5月6日に寄託されたDNA48328−1355ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO864ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO864ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig83(配列番号:226)の残基1〜351を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig83(配列番号:226)の残基約23〜351を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO864ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO864ポリペプチドは、ATCC209843として1998年5月6日に寄託されたDNA48328−1355ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0151】
36.PRO792
出願人は、本出願において「PRO792」と命名した、CD23と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸残基1〜293を持つPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸残基X〜293(ここで、XはFig85(配列番号:231)の50〜59の任意のアミノ酸である)を持つPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO792をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209846として1998年5月6日に寄託されたDNA56352−1358ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO792ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO792ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig85(配列番号:231)の残基1〜293を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸X〜293(ここで、XはFig85(配列番号:231)の50〜59の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO792ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO792ポリペプチドは、ATCC209846として1998年5月6日に寄託されたDNA56352−1358ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0152】
37.PRO866
出願人は、本出願において「PRO866」と命名した、ミンジン(mindin)及びスポンジン(spondin)タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸残基1〜331を持つPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸残基約27〜229を持つPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO866をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209750として1998年4月7日に寄託されたDNA53971−1359ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO866ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO866ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig87(配列番号:236)の残基1〜331を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸約27〜331を含んでなるPRO866ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO866ポリペプチドは、ATCC209750として1998年4月7日に寄託されたDNA53971−1359ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0153】
38.PRO871
出願人は、本出願において「PRO871」と命名した、CyP−60と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸残基1〜472を持つPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸残基約22〜472を持つPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO871をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209848として1998年5月6日に寄託されたDNA50919−1361ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO871ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO871ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig89(配列番号:245)の残基1〜472を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸約22〜472を含んでなるPRO871ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO871ポリペプチドは、ATCC209848として1998年5月6日に寄託されたDNA50919−1361ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0154】
39.PRO873
出願人は、本出願において「PRO873」と命名した、カルボキシエステラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸残基1〜545を持つPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸残基約30〜545を持つPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO873をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209851として1998年5月6日に寄託されたDNA44179−1362ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO873ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO873ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig91(配列番号:254)の残基1〜545を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸約30〜545を含んでなるPRO873ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO873ポリペプチドは、ATCC209851として1998年5月6日に寄託されたDNA44179−1362ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0155】
40.PRO940
出願人は、本出願において「PRO940」と命名した、CD33及びOB結合プロテイン−2と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸残基1〜544を持つPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸残基約16〜544あるいはFig93(配列番号:259)の1又は約16からX(ここで、XはFig93(配列番号:259)の394〜403の任意のアミノ酸である)を持つPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO940をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209754として1998年4月7日に寄託されたDNA54002−1367ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO940ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO940ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig93(配列番号:259)の残基1〜544を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸約16〜544あるいはFig93(配列番号:259)の1又は約16からX(ここで、XはFig93(配列番号:259)の394〜403の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO940ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO940ポリペプチドは、ATCC209754として1998年4月7日に寄託されたDNA54002−1367ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0156】
41.PRO941
出願人は、本出願において「PRO941」と命名した、カドヘリンタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸残基1〜772を持つPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸残基約22〜772あるいはFig95(配列番号:264)の1又は約22からX(ここで、XはFig95(配列番号:264)の592〜601の任意のアミノ酸である)を持つPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO941をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209747として1998年4月7日に寄託されたDNA53906−1368ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO941ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO941ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig95(配列番号:264)の残基1〜772を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸約21〜772あるいはFig95(配列番号:264)の1又は約22からX(ここで、XはFig95(配列番号:264)の592〜601の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO941ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO941ポリペプチドは、ATCC209747として1998年4月7日に寄託されたDNA53906−1368ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA6415と命名された、Fig96(配列番号:265)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0157】
42.PRO944
出願人は、本出願において「PRO944」と命名した、ウェルシュ菌エンテロトキシンレセプター(CPE−R)と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸残基1〜211を持つPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸残基約22〜229あるいはFig98(配列番号:270)の1又は約22からX(ここで、XはFig98(配列番号:270)の77〜80の任意のアミノ酸である)を持つPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO944をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209861として1998年5月14日に寄託されたDNA52185−1370ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO944ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO944ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig98(配列番号:270)の残基1〜211を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸約22〜211あるいは図98(配列番号270)の1又は約22からX(ここで、XはFig98(配列番号:270)の77〜86の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO944ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO944ポリペプチドは、ATCC209861として1998年5月14日に寄託されたDNA52185−1370ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA14007と命名された、Fig99(配列番号:271)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12733と命名された、Fig100(配列番号:272)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12746と命名された、Fig101(配列番号:273)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12834と命名された、Fig102(配列番号:274)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12846と命名された、Fig103(配列番号:275)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13104と命名された、Fig104(配列番号:276)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13259と命名された、Fig105(配列番号:277)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13959と命名された、Fig106(配列番号:278)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13961と命名された、Fig107(配列番号:279)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0158】
43.PRO983
出願人は、本出願において「PRO983」と命名した、小胞関連タンパク質VAP−33と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸残基1〜243を持つPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig109(配列番号:284)の219〜228の任意のアミノ酸である)を持つPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO983をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209862として1998年5月14日に寄託されたDNA53977−1371ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO983ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO983ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig109(配列番号:284)の残基1〜243を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸1〜X(ここで、XはFig109(配列番号:284)の219〜228の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO983ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO983ポリペプチドは、ATCC209862として1998年5月14日に寄託されたDNA53977−1371ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA17130と命名された、Fig110(配列番号:285)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA23466と命名された、Fig111(配列番号:286)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA26818と命名された、Fig112(配列番号:287)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA37618と命名された、Fig113(配列番号:288)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA41732と命名された、Fig114(配列番号:289)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA45980と命名された、Fig115(配列番号:290)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA46372と命名された、Fig116(配列番号:291)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0159】
44.PRO1057
出願人は、本出願において「PRO1057」と命名した、プロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸残基1〜413を持つPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸残基約17〜413を持つPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1057をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209867として1998年5月14日に寄託されたDNA57253−1382ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1057ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1057ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig118(配列番号:296)の残基1〜413を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸約17〜413を含んでなるPRO1057ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1057ポリペプチドは、ATCC209867として1998年5月14日に寄託されたDNA57253−1382ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0160】
45.PRO1071
出願人は、本出願において「PRO1071」と命名した、トロンボスポンジンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸残基1〜525を持つPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸残基約26〜525を持つPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1071をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209879として1998年5月20日に寄託されたDNA58847−1383ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1071ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1071ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig120(配列番号:301)の残基1〜525を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸約26〜525を含んでなるPRO1071ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1071ポリペプチドは、ATCC209879として1998年5月20日に寄託されたDNA58847−1383ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0161】
46.PRO1072
出願人は、本出願において「PRO1072」と命名した、レダクターゼタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸残基1〜336を持つPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸残基約22〜336を持つPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1072をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209868として1998年5月14日に寄託されたDNA58747−1384ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1072ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1072ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig122(配列番号:303)の残基1〜336を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸約22〜336を含んでなるPRO1072ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1072ポリペプチドは、ATCC209868として1998年5月14日に寄託されたDNA58747−1384ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA40210と命名された、Fig123(配列番号:304)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0162】
47.PRO1075
出願人は、本出願において「PRO1075」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸残基1〜406を持つPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸残基約30〜406を持つPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1075をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209869として1998年5月14日に寄託されたDNA57689−1385ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1075ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1075ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig125(配列番号:309)の残基1〜406を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸約30〜406を含んでなるPRO1075ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1075ポリペプチドは、ATCC209869として1998年5月14日に寄託されたDNA57689−1385ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13059と命名された、Fig126(配列番号:310)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA19463と命名された、Fig127(配列番号:311)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0163】
48.PRO181
出願人は、本出願において「PRO181」と命名した、コルニコン(cornichon)タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸残基1〜144を持つPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸残基約21〜144又はFig129(配列番号:322)のアミノ酸1もしくは約21からX(ここで、XはFig129(配列番号:322)の52〜61の任意のアミノ酸である)を持つPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO181をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209775として1998年4月14日に寄託されたDNA23330−1390ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO181ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO181ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig129(配列番号:322)の残基1〜144を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸約21〜144あるいはFig129(配列番号:322)のアミノ酸1又は約21からX(ここで、XはFig129(配列番号:322)の52〜61の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO181ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO181ポリペプチドは、ATCC209775として1998年4月14日に寄託されたDNA23330−1390ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13242と命名された、Fig130(配列番号:323)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0164】
49.PRO195
出願人は、本出願において「PRO195」と命名した新規な膜貫通ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸残基1〜323を持つPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸残基約32〜323又はFig132(配列番号:330)のアミノ酸1もしくは約32からX(ここで、XはFig132(配列番号:330)の236〜245の任意のアミノ酸である)を持つPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO195をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209772として1998年4月14日に寄託されたDNA26847−1395ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO195ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO195ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig132(配列番号:330)の残基1〜323を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸約32〜323あるいはFig132(配列番号:330)のアミノ酸1又は約32からX(ここで、XはFig132(配列番号:330)の236〜245の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO195ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO195ポリペプチドは、ATCC209772として1998年4月14日に寄託されたDNA26847−1395ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA15062と命名された、Fig133(配列番号:331)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13199と命名された、Fig134(配列番号:332)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0165】
50.PRO865
出願人は、本出願において「PRO865」と命名した新規な分泌ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸残基1〜468を持つPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸残基約24〜229を持つPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO865をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209774として1998年4月14日に寄託されたDNA53974−1401ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO865ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO865ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig136(配列番号:337)の残基1〜468を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸約24〜468を含んでなるPRO865ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO865ポリペプチドは、ATCC209774として1998年4月14日に寄託されたDNA53974−1401ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA37642と命名された、Fig137(配列番号:338)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0166】
51.PRO827
出願人は、本出願において「PRO827」と命名した、インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸残基1〜124を持つPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸残基約23〜124を持つPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO827をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209777として1998年4月14日に寄託されたDNA57039−1402ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO827ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO827ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig139(配列番号:346)の残基1〜124を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸約23〜124を含んでなるPRO827ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO827ポリペプチドは、ATCC209777として1998年4月14日に寄託されたDNA57039−1402ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0167】
52.PRO1114
出願人は、本出願において「PRO1114」と命名した、サイトカインレセプターファミリー−4タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1〜311を持つPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基約30〜311又はFig142(配列番号:352)のアミノ酸1もしくは約30からX(ここで、XはFig142(配列番号:352)の225〜234の任意のアミノ酸である)を持つPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1114をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209905として1998年5月27日に寄託されたDNA57033−1403ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1114ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1114ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig142(配列番号:352)の残基1〜311を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸約30〜311あるいはFig142(配列番号:352)のアミノ酸1又は約30からX(ここで、XはFig142(配列番号:352)の225〜234の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO1114ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1114ポリペプチドは、ATCC209905として1998年5月27日に寄託されたDNA57033−1403ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA48466と命名された、Fig143(配列番号:353)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0168】
本出願において「PRO1114インターフェロンレセプター」と命名した新規なインターフェロンレセプターポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA57033−1403)が同定された。
一実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸は、(a)Fig142(配列番号:352)の約1又は約30から約311までのアミノ酸残基の配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる。
他の側面では、本発明は、Fig141(配列番号:351)のヌクレオチド約250又は約337と約1182の間で核酸の補体にハイブリダイズするDNAを含んでなるPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしている単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。
更なる側面では、本発明は、(a)ATCC寄託番号209905(DNA57033−1403)のヒトタンパク質cDNAによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子又は(b)(a)の核酸分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離核酸分子に関する。好適な実施態様では、核酸はATCC寄託番号209905(DNA57033−1403)のヒトタンパク質cDNAによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる。
なお更なる側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNAの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
更なる側面では、本発明は、少なくとも10のヌクレオチドを有し、被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有していれば、被験DNA分子を単離することにより生産される単離核酸分子に関する。
ある特定の側面では、本発明は、N末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを伴うか伴わない、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNAを含んでなる単離核酸分子、及びその可溶性、すなわち膜貫通ドメイン欠失又は不活性化変異体、又はそのようなコード核酸分子に相補的なものを提供する。シグナルペプチドはFig142(配列番号:352)の配列において約1のアミノ酸位置から約29のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された。膜貫通ドメインはPRO1114インターフェロンレセプターアミノ酸配列において約230のアミノ酸位置から約255のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された(Fig142、配列番号:352)。
他の側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNAの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
【0169】
他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途が見出されるPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドコード配列の断片に関する。そのような核酸断片は約20〜約80ヌクレオチド長、好ましくは約20〜約60ヌクレオチド長、より好ましくは約20〜約50ヌクレオチド長、最も好ましくは約20〜約40ヌクレオチド長のものであり、図141(配列番号351)し示されたヌクレオチド配列から引き出される。
他の実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターをコードするDNAを含んでなるベクター又はその変異体を提供する。ベクターは上において特定した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母である。PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを製造する方法が更に提供され、これは、PRO1114インターフェロンレセプターの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からPRO1114インターフェロンレセプターを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離核酸配列の任意のものによってコードされた単離PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
ある特定の側面では、本発明は、ある実施態様では、Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311までを含んでなるアミノ酸配列を含む、単離された未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
他の側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
更なる側面では、本発明は、Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド、又は抗PRO1114インターフェロンレセプター抗体に対して結合部位を提供するのに十分なその断片に関する。好ましくは、PRO1114インターフェロン断片は未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【0170】
また更なる側面では、本発明は、(i)被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311までの配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有していれば、(ii)被験DNA分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、(iii)細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合したPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドが含まれる。
他の実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明は未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO1114インターフェロンレセプター抗体である。
更なる実施態様では、本発明は、未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを候補分子と接触させ、該ポリペプチドにより媒介される生物活性をモニターすることにより、未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド、又は上記において記載したアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて含有する組成物に関する。
【0171】
53.PRO237
出願人は、本出願において「PRO237」と命名した、炭酸脱水酵素と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸残基1〜328を持つPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸残基約24〜328又はFig145(配列番号:358)のアミノ酸1もしくは約24からX(ここで、XはFig145(配列番号:358)の172〜181の任意のアミノ酸である)を持つPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO237をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209855として1998年5月12日に寄託されたDNA34353−1428ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO237ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO237ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig145(配列番号:358)の残基1〜328を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸約24〜328あるいはFig145(配列番号:358)のアミノ酸1又は約24からX(ここで、XはFig145(配列番号:358)の172〜181の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO237ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO237ポリペプチドは、ATCC209855として1998年5月12日に寄託されたDNA34353−1428ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0172】
54.PRO541
出願人は、本出願において「PRO541」と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸残基1〜500を持つPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸残基約21〜500を持つPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO541をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209910として1998年5月27日に寄託されたDNA45417−1432ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO541ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO541ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig147(配列番号:363)の残基1〜500を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸約21〜500を含んでなるPRO541ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO541ポリペプチドは、ATCC209910として1998年5月27日に寄託されたDNA45417−1432ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0173】
55.PRO273
出願人は、本出願において「PRO273」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO273ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig149(配列番号:370)のアミノ酸残基1〜111を持つPRO273ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO273ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO273ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig149(配列番号:370)の残基1〜111を含んでなるアミノ酸配列を含む。
【0174】
56.PRO701
出願人は、本出願において「PRO701」と命名した、ニューロリジン(neuroligin)1、2、及び3と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO701ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig151(配列番号:375)のアミノ酸残基1〜816を持つPRO701ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO701をコードするヌクレオチド配列を含む1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO701ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO701ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig151(配列番号:375)の残基1〜816を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO701ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO701ポリペプチドは、1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0175】
57.PRO704
出願人は、本出願において「PRO704」と命名した、VIP36と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO704ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig153(配列番号:380)のアミノ酸残基1〜348を持つPRO704ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO704をコードするヌクレオチド配列を含む、DNA50911−1288としてATCCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO704ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO704ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig153(配列番号:380)の残基1〜348を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO704ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO704ポリペプチドは、DNA50911−1288としてATCCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0176】
58.PRO706
出願人は、本出願において「PRO706」と命名した、前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO706ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig155(配列番号:385)のアミノ酸残基1〜480を持つPRO706ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO706をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48329−1290としてATCCに1998年4月21日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO706ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO706ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig155(配列番号:385)の残基1〜480を含んでなるか、Fig155(配列番号:385)の残基19〜480を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO706ポリペプチドは、DNA48329−1290としてATCCに1998年4月21日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0177】
59.PRO707
出願人は、本出願において「PRO707」と命名した、カドヘリン、特にカドヘリンFIB3と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO707ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig157(配列番号:390)のアミノ酸残基1〜916を持つPRO707ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO707をコードするヌクレオチド配列を含むATCCにDNA48306−1291として1998年5月27日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO707ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO707ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig157(配列番号:390)の残基1〜916を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO707ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO707ポリペプチドは、ATCCにDNA48306−1291として1998年5月27日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0178】
60.PRO322
出願人は、本出願において「PRO322」と命名した、ニューロプシンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO322ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig159(配列番号:395)のアミノ酸残基1又は24から260を持つPRO322ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO322をコードするヌクレオチド配列を含むATCC番号209669として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO322ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO322ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig159(配列番号:395)の残基1又は24から260を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO322ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO322ポリペプチドは、ATCC番号209669として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0179】
61.PRO526
出願人は、本出願において「PRO526」と命名した、ALSと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO526ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig161(配列番号:400)のアミノ酸残基1〜473を持つPRO526ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO526をコードするヌクレオチド配列を含むDNA44184−1319としてATCCに1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO526ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO526ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig161(配列番号:400)の残基1〜473を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO526ポリペプチドはDNA44184−1319としてATCCに1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0180】
62.PRO531
出願人は、本出願において「PRO531」と命名した、プロトカドヘリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO531ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig163(配列番号:405)のアミノ酸残基1〜789を持つPRO531ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO531をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48314−1320として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO531ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO531ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig163(配列番号:405)の残基1〜789を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO531ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO531ポリペプチドは、DNA48314−1320として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0181】
63.PRO534
出願人は、本出願において「PRO534」と命名した、ジスルフィドイソメラーゼ(ここではしばしばプロテインジスルフィドイソメラーゼと呼ぶ)と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO534ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig165(配列番号:410)のアミノ酸残基1〜360を持つPRO534ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO534をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48333−1321として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO534ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO534ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig165(配列番号:410)の残基1〜360を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO534ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO534ポリペプチドは、DNA48333−1321として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0182】
64.PRO697
出願人は、本出願において「PRO697」と命名した、sFRPsと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO697ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig167(配列番号:415)のアミノ酸残基1〜295を持つPRO697ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO697をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50920−1325として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO697ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO697ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig167(配列番号:415)の残基1〜295を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO697ポリペプチドは、DNA50920−1325として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0183】
65.PRO717
出願人は、本出願において「PRO717」と命名した新規な12膜貫通ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO717ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig169(配列番号:420)のアミノ酸残基1〜560を持つPRO717ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO717をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50988−1326としてATTCに1998年4月28日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO717ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO717ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig169(配列番号:420)の残基1〜560を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO717ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO717ポリペプチドは、DNA50988−1326として1998年4月28日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0184】
66.PRO731
出願人は、本出願において「PRO731」と命名した、プロトカドヘリン4と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO731ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig171(配列番号:425)のアミノ酸残基1〜1184を持つPRO731ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO731をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48331−1329としてATTCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO731ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO731ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig171(配列番号:425)の残基1〜1184を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO731ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO731ポリペプチドは、DNA48331−1329として1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0185】
67.PRO218
出願人は、本出願において「PRO218」と命名した、膜調節タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO218ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig173(配列番号:430)のアミノ酸残基1〜455を持つPRO218ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO218をコードするヌクレオチド配列を含むDNA30867−1335としてATTCに1998年4月28日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO218ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO218ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig173(配列番号:430)の残基1〜455を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO218ポリペプチドは、DNA30867−1335として1998年4月28日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA14472と命名された、Fig174(配列番号:431)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA15846と命名された、Fig175(配列番号:432)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0186】
68.PRO768
出願人は、本出願において「PRO768」と命名した、インテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO768ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig177(配列番号:437)のアミノ酸残基1〜1141を持つPRO768ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO768をコードするヌクレオチド配列を含むDNA55737−1345として1998年4月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO768ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO768ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig177(配列番号:437)の残基1〜1141を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO768ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO768ポリペプチドは、DNA55737−1345として1998年4月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0187】
69.PRO771
出願人は、本出願において「PRO771」と命名した、テスチカンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO771ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig179(配列番号:442)のアミノ酸残基1〜436を持つPRO771ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO771をコードするヌクレオチド配列を含むDNA49829−1346としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO771ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO771ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig179(配列番号:442)の残基1〜436を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO771ポリペプチドは、DNA49829−1346としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0188】
70.PRO733
出願人は、本出願において「PRO733」と命名した、T1/ST2レセプター結合タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO733ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig181(配列番号:447)のアミノ酸残基1〜229を持つPRO733ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO733をコードするヌクレオチド配列を含むDNA52196−1348としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO733ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO733ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig181(配列番号:447)の残基1〜229を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO733ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO733ポリペプチドは、DNA52196−1348として1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0189】
71.PRO162
出願人は、本出願において「PRO162」と命名した、膵炎随伴タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO162ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig183(配列番号:452)のアミノ酸残基1〜175を持つPRO162ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO162をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56965−1356としてATTCに1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO162ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO162ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig183(配列番号:452)の残基1〜175を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO162ポリペプチドは、DNA56965−1356として1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0190】
72.PRO788
出願人は、本出願において「PRO788」と命名した、抗悪性腫瘍尿タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO788ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig185(配列番号:454)のアミノ酸残基1〜125を持つPRO788ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO788をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56405−1357としてATTCに1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO788ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO788ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig185(配列番号:454)の残基1〜125を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO788ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO788ポリペプチドは、DNA56405−1357として1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0191】
73.PRO1008
出願人は、本出願において「PRO1008」と命名した、dickkopf−1(dkk−1)と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1008ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig187(配列番号:456)のアミノ酸残基1〜266を持つPRO1008ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1008をコードするヌクレオチド配列を含むDNA57530−1375としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1008ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1008ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig187(配列番号:456)の残基1〜266を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1008ポリペプチドは、DNA57530−1375として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA16508と命名された、Fig188(配列番号:457)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0192】
74.PRO1012
出願人は、本出願において「PRO1012」と命名した、ジスルフィドイソメレアーゼ及びホスホリパーゼCと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1012ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig190(配列番号:459)のアミノ酸残基1〜747を持つPRO1012ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1012をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56439−1376としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1012ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1012ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig190(配列番号:459)の残基1〜747を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1012ポリペプチドは、DNA56439−1376として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0193】
75.PRO1014
出願人は、本出願において「PRO1014」と命名した、レダクターゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1014ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig192(配列番号:464)のアミノ酸残基1〜300を持つPRO1014ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1014をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56409−1377としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1014ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1014ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig192(配列番号:464)の残基1〜300を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1014ポリペプチドは、DNA56409−1377として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0194】
76.PRO1017
出願人は、本出願において「PRO1017」と命名した、HNK−1スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1017ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig194(配列番号:466)のアミノ酸残基1〜414を持つPRO1017ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1017をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56112−1379としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1017ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1017ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig194(配列番号:466)の残基1〜414を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1017ポリペプチドは、DNA56112−1379として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0195】
77.PRO474
出願人は、本出願において「PRO474」と命名した、デヒドロゲナーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO474ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig196(配列番号:468)のアミノ酸残基1〜270を持つPRO474ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO474をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56045−1380としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO474ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO474ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig196(配列番号:468)の残基1〜270を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO474ポリペプチドは、DNA56045−1380として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0196】
78.PRO1031
出願人は、本出願において「PRO1031」と命名した、IL−17と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1031ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig198(配列番号:470)のアミノ酸残基1〜180を持つPRO1031ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1031をコードするヌクレオチド配列を含むDNA59294−1381としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1031ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1031ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig198(配列番号:470)の残基1〜180を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1031ポリペプチドは、DNA59294−1381として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0197】
79.PRO938
出願人は、本出願において「PRO938」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸残基1〜349を持つPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸残基約23〜349又はFig200(配列番号:472)のアミノ酸1もしくは約23からX(ここで、XはFig200(配列番号:472)の186〜195の任意のアミノ酸である)を持つPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO938をコードするヌクレオチド配列を含むATCC受託番号209857として1998年5月12日に寄託されたDNA56433−1406ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO938ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO938ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig200(配列番号:472)の残基1〜349を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸約23〜349あるいはFig200(配列番号:472)のアミノ酸1又は約23からX(ここで、XはFig200(配列番号:472)の186〜195の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO938ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO938ポリペプチドは、ATCC受託番号209857として1998年5月12日に寄託されたDNA56433−1406ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0198】
80.PRO1082
出願人は、本出願において「PRO1082」と命名した、レクチン様酸化LDLレセプターと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1082ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig202(配列番号:477)のアミノ酸残基1〜201を持つPRO1082ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1082をコードするヌクレオチド配列を含むDNA53912−1457としてATCCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1082ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1082ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig202(配列番号:477)の残基1〜201を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、細胞外ドメインを除く、PRO1082ポリペプチドの単離されたドメインに関する。場合によっては、PRO1082ポリペプチドは、DNA53912−1457としてATCCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0199】
81.PRO1083
出願人は、本出願において「PRO1083」と命名した、7TMレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質1、及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1083ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig204(配列番号:483)のアミノ酸残基1〜693を持つPRO1083ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1083をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50921−1458としてATCCに1998年5月12日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1083ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1083ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig204(配列番号:483)の残基1〜693を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様はPRO1083ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO1083ポリペプチドは、DNA50921−1458としてATCCに1998年5月12日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA24256と命名された、Fig205(配列番号:484)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0200】
82.PRO200
上記において一般的に記載した本発明の目的は、ここでPRO200とも命名した新規なポリペプチドであるVEGF−E(配列番号:488)、及びそれをコードする核、配列番号:487、残基259〜1293の提供による少なくとも部分的には達成される。
一実施態様では、本発明はVEGF−EポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig207(配列番号:488)のアミノ酸残基1〜345を持つVEGF−EポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の実施態様では、VEGF−E核酸が単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
他の実施態様では、本発明は単離されたVEGF−Eポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列VEGF−Eポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig207(配列番号:488)の残基1〜345を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、VEGF−Eポリペプチドが単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合してここに記載したVEGF−Eポリペプチドを治療的に有効量含有する、細胞の増殖、生存及び/又は分化が望まれる適応症を治療するために有用な組成物に関する。
本発明は、VEGF−Eと同じ生物活性を有する修飾VEGF−Eポリペプチド及び修飾変異体のようなVEGF−Eの関連する実施態様、及びこれらを含有する製薬組成物を更に含む。VEGF−Eのインヒビターもまた提供される。
【0201】
83.PRO285及びPRO286
出願人は、本出願においてPRO285(DNA40021−1154によりコード)及びPRO286(DNA42663−1154によりコード)と命名した、新規なヒトTollポリペプチドをコードする二種の新規なcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig209(配列番号:496)のアミノ酸残基27〜839を有するPRO285ポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(b)Fig211(配列番号:498)のアミノ酸残基27〜825を有するPRO286ポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(c)(a)もしくは(b)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig209(配列番号:496)のアミノ酸1〜839の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するか;Fig211(配列番号:498)のアミノ酸1〜1041の配列を含んでなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる。
特定の実施態様では、本発明は、N末端シグナル配列を持つか持たず、各全長配列の膜貫通領域を持つか持たない、未変性又は変異体PRO285及びPRO286ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig209(配列番号:496)のアミノ酸残基1〜1049及びFig211(配列番号:498)のアミノ酸残基1〜1041を持つ成熟全長未変性PRO285又はPRO286ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的である。他の側面では、本発明は、N末端シグナル配列を持たない未変性PRO285又はPRO286をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸に相補的である単離された核酸分子に関する。更に他の実施態様では、本発明は全長未変性PRO285又はPRO286タンパク質の膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型をコードする核酸に関する。
他の実施態様では、単離された核酸分子は、ATCC番号209389として1997年10月17日に寄託されたクローン(DNA40021−1154);又はATCC番号209386として1997年10月17日に寄託されたクローン(DNA42663−1154)を含んでなる。
更に他の実施態様では、本発明はPRO285又はPRO286をコードするDNAを含んでなるベクター、又はその変異体を提供する。しかして、ベクターは、上述した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
【0202】
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO285及びPRO286ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO285及びPRO286ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig209及び211(配列番号:496及び498)の残基1〜1049及び1〜1041を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまた上に記載した単離核酸分子の任意のものによりコードされるPRO285及びPRO286の変異体も提供する。特定の変異体には、これらに限定されるものではないが、各N末端シグナル配列を欠くか及び/又はその各膜貫通及び/又は細胞質ドメインが欠失もしくは不活性化された全長未変性配列PRO285及びPRO286ポリペプチドの欠失(切り詰め)変異体が含まれる。
本発明はまた二重特異性を持つ抗体、例えば一を越えるTollペプチドに結合する二重特異的抗体を特に含む。
更に他の実施態様では、本発明は未変性PRO285及びPRO286ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO285又は抗PRO286抗体である。
更なる実施態様では、本発明は未変性のPRO285及びPRO286ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するスクリーニング検定法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて、PRO285又はPRO286ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニストを含有してなる組成物に関する。
本発明はまたPRO285又はPRO286ポリペプチドのアンタゴニストの有効量を患者に投与することを含んでなる感染性ショックを治療する方法に関する。特定の実施態様では、アンタゴニストは未変性PRO285又はPRO286ポリペプチドを特異的に結合する阻止抗体である。
【0203】
84.PRO213−1、PRO1330及びPRO1449
本発明は、ヒトを含む哺乳類における腫瘍性細胞成長及び増殖の診断と治療のための組成物と方法に関する。本発明は腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅される遺伝子の同定に基づく。そのような遺伝子増幅には遺伝子産物の過剰発現が付随し腫瘍形成に寄与すると予想される。従って、増幅された遺伝子によりコードされるタンパク質は、ある種のガンの診断及び/又は治療(予防を含む)に対する有用な標的であると信じられ、腫瘍治療の予後のプレディクターとして作用しうる。
一実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸分子は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273を有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、1998年4月21日に寄託されたDNA30943−1163(ATTC209791)、1998年9月9日に寄託されたDNA64907−1163−1(ATTC203242)及び/又は1998年9月9日に寄託されたDNA64908−1163−1(ATTC203243)と命名されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は、(a)Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273をそれぞれ有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する単離された核酸分子を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig213(配列番号:506)の残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273をそれぞれ含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドは、DNA30943−1163(ATTC209791)、DNA64907−1163−1(ATTC203242)又はDNA64908−1163−1(ATTC203243)のcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の側面では、本発明は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273に少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273を含んでなる、単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチド、又は抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体を提供するのに十分なその断片を提供する。好ましくは、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449断片は未変性のPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【0204】
更なる側面では、本発明は、Fig213(配列番号:506)の残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273のアミノ酸配列とそれぞれ比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、(i)被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig213(配列番号:506)の1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273のアミノ酸残基を有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをそれぞれコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性を有していれば、(ii)被験DNA分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、(iii)細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
一実施態様では、本発明はPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。一側面では、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを過剰発現する細胞の死を誘導する。他の側面では、抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)酸基を有する。抗体は標識されても固体支持体上に固定化されてもよい。更なる側面では、抗体は抗体断片、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合して、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに結合する抗体を含有する組成物に関する。一側面では、組成物は治療的に有効量の抗体を含有する。他の側面では、組成物は更に活性成分を含有し、この成分は例えば更なる抗体又は細胞毒性もしくは化学療法剤でありうる。好ましくは組成物は無菌である。
更なる実施態様では、本発明は抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。
本発明は更にPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの機能又は活性の一又は複数を阻害するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドのアンタゴニスト及びアゴニストに関する。
更なる実施態様では、本発明はPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードする核酸分子の補体にハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。核酸分子は好ましくはDNAであり、ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件下で生じる。そのような核酸分子は、ここで同定された増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用し、これにより、各増幅遺伝子の変調における用途、あるいは増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出される。更に、そのような配列はリボザイム及び/又は三重らせん体配列の一部として使用でき、これにより、増幅遺伝子の調節に使用されうる。
他の実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを含む疑いのある細胞を抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体に暴露し、細胞への抗体の結合性を測定することを含んでなる、ポリペプチドPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの有無を測定する方法に関する。
更に他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料と(b)同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料中で、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関し、ここで、被験試料の高い発現レベルが、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。
【0205】
他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料に抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体を接触させ、(b)被験試料中における抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体とPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの間の複合体の生成を検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関する。検出は定量的とも定性的ともしえ、同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料における複合体の生成をモニターして比較しながらなされる。被験試料中に生成された多量の複合体が、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。抗体は好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体生成は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、あるいは他の当該分野で知られている方法によりモニターすることができる。被験試料は通常は腫瘍細成長又は増殖(例えば癌細胞)を有する疑いのある個人から得られる。
他の実施態様では、本発明は、抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体と担体(例えばバッファー)を適当な包装中に含んでなるガン診断キットに関する。好ましくはキットはPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための指示を含む。
更なる他の実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを過剰発現する細胞を、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害する有効量の薬剤に暴露することを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。該薬剤は好ましくは抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体、小さい無機及び有機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、あるいは三重らせん体分子である。特定の側面では、該薬剤、例えば抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体は細胞死を誘導する。更なる側面では、腫瘍細胞は放射線治療及び/又は細胞毒性又は化学療法剤に更に暴露される。
更なる実施態様において、本発明は、
a) 容器;
b) 容器上のラベル;及び
c) 容器内に含まれる活性剤を含有する組成物を含んでなる、製造物品に関し、ここで組成物は、腫瘍細胞の増殖を阻止するのに有効であり、容器上のラベルには、組成物がPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの過剰発現により特徴づけられる症状を治療するために使用でき、組成物中の活性剤は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害する薬剤であることが示される。好適な側面では、活性剤は、抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体である。
また更なる実施態様では、本発明は、候補化合物をPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドと、これら二つの化合物が相互作用するのに十分な条件と時間の間接触させることを含んでなる、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法を提供する。特定の側面では、候補化合物かPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの何れかが固体支持体上に固定化される。他の側面では、非固定化成分が検出可能な標識を担持する。
【0206】
85.PRO298
出願人は新規なポリペプチドをコードするcDNAを同定した。DNAは本出願において「PRO298」と称される、新規な多膜貫通タンパク質をコードする「DNA39975−1210」と命名した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig219(配列番号:515)のアミノ酸1〜364の配列を含んでなるPRO298をコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、図219(配列番号515)のアミノ酸残基1〜364を持つPRO298ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
更なる実施態様では、本発明は、(a)ATCC寄託番号209783(DNA39975−1210)のヒトタンパク質cDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と少なくとも80%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、ATCC寄託番号209783(DNA39975−1210)のヒトタンパク質cDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子を含んでなる核酸に関する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO298ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO298ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig219(配列番号:515)の残基1〜364を含んでなるアミノ酸配列を含む。
多の実施態様では、本発明はFig220(配列番号:516)のヌクレオチド配列を含んでなるDNA26832と命名された、発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0207】
86.PRO337
出願人は、本出願において「PRO337」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA43316−1237)を同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig222(配列番号:523)のアミノ酸1〜344の配列を含んでなるPRO337ポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約85%、より好ましくは約90%、最も好ましくは約95%である。一側面では、単離された核酸は、図222(配列番号523)のアミノ酸残基1〜344を持つポリペプチドと少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%(96、97、98及び99%を含む)の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、免疫グロブリン及び主要組織適合性ドメイン(図222、配列番号523のアミノ酸113〜130)内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig222(配列番号:523)のアミノ酸残基約1〜344を持つニューロトリミンポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ATCC209487でATTCに寄託されたクローンDNA43316−1237の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ATCC209487で寄託されたクローンDNA43316−1237のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたPRO337ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO337ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig222(配列番号:523)の残基1〜344を含んでなるアミノ酸配列を含む。未変性シグナル配列を持つか持たず(Fig222(配列番号:523)のアミノ酸1〜約28)、開始メチオニンを持つか持たない未変性PRO337ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ATCC209487で寄託された核酸によりコードされるPRO337ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はDNA42301(配列番号:524)としてFig223において同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)及び他の配列断片を提供する。
【0208】
87.PRO403
出願人は、本出願において「PRO403」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA55800−1263)を同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig225(配列番号:526)のアミノ酸1〜736の配列を含んでなるPRO403ポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約85%、より好ましくは約90%、最も好ましくは約95%である。一側面では、単離された核酸は、図225(配列番号526)のアミノ酸残基1〜736を持つポリペプチドと少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、(1)推定上のNグリコシル化部位(アミノ酸残基132、136、177、237、282、349、505、598及び606);(2)Kell血液型タンパク質ファミリー(アミノ酸残基65、70、88及び96)及び推定上の亜鉛結合モチーフ(アミノ酸残基570−579)が保存されたCys残基内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig225(配列番号:526)のアミノ酸残基約1〜736を持つPRO403ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ATCC209680でATTCに寄託されたクローンDNA55800−1263の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ATCC209680で寄託されたクローンDNA55800−1263のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたPRO403ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO403ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig225(配列番号:526)の残基1〜736を含んでなるアミノ酸配列を含む。開始メチオニンを持つか持たない未変性PRO403ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ATCC209680で寄託された核酸によりコードされるPRO403ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はここにDNA34415(Fig226A−B;配列番号:527);DNA49830(Fig227;配列番号:528)及びDNA49831(Fig228;配列番号:529)として同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)及び他の配列断片を提供する。
【0209】
88.更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母である。上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明はゲノム及びcDNAヌクレオチド配列を単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これらプローブは上述したあるいは後記するヌクレオチド配列の任意のものから取り出されうる。
【0210】
他の実施態様では、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一側面においては、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン,又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
他の側面においては、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されている全長PROポリペプチドcDNAのコード化配列を含んでなるDNA分子、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード化配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片のコード化配列、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【0211】
さらなる側面においては、本発明は、(a)ここに開示されているATCCへ寄託されている全てのヒトタンパク質cDNAによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
その他の側面において、本発明は、PROポリペプチドの膜貫通タンパク質がここにおいて開示されていて、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化となっているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなヌクレオチド配列に対して相補的なを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【0212】
その他の実施態様では、例えば、抗−PRO抗体の結合部位を含むポリペプチドを選択的にコードするPROポリペプチドのコード化断片のためのハイブリダイゼーションプローブ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての使用を見出すことができるPROポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体について向けられている。そのような核酸断片は、文脈において「約」という語句が引用されているヌクレオチド配列の長さのプラス又はマイナス10%を意味していて、通常少なくとも約20ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約80ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約90ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約100ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約110ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約120ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約130ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約140ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約150ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約160ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約170ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約180ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約190ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約200ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約250ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約300ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約350ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約400ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約450ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約500ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約600ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約700ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約800ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約900ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約1000ヌクレオチド長である。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規の断片は、任意の良く知られた配列アライメントプログラムを使用し、PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の既知のヌクレオチド配列を整列させ、どのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるのかを決定することによる日常的方法によって決定が可能であることは注目される。全てのそのようなPROポリペプチドコード化配列はが、本出願において検討される。さらに、検討されるのは、これらヌクレオチド配列断片によってコードされているPROポリペプチド、好ましくは抗−PRO抗体の結合部位を含むこれらPROポリペプチド断片である。
【0213】
その他の実施態様では、本発明は、上文において特定された全ての単離された核酸配列によってコードされている単離されたPROポリペプチドを提供する。
ある側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有する全長PROポリペプチド、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されたATCCへ寄託された全てのヒトタンパク質cDNAによってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
【0214】
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有するPROポリペプチドのアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片と比較して、少なくとも約80%の陽性(ポジティブ)、好ましくは少なくとも約81%の陽性(ポジティブ)、さらに好ましくは少なくとも約82%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも83%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも84%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも85%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも86%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも87%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも88%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも89%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも90%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも91%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも92%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも93%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも94%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも95%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも96%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも97%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも98%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも99%の陽性(ポジティブ)のスコアのアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
特別な側面においては、本発明は、N−末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを含まず、前記に記載したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている単離されたPROポリペプチドを提供する。PROポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びPROポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたPROポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
【0215】
その他の側面においては、本発明は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性の単離されたPROポリペプチドを提供する。PROポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びPROポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたPROポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
さらなるその他の実施態様においては、ここにおいて開示される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様においては、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様においては、PROポリペプチドを候補化合物と接触せしめ、そして前記PROポリペプチドによって仲介される生物活性を監視することを含むPROポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
さらにさらなる実施態様においては、本発明は、PROポリペプチド、又はここに開示されるPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、抗−PRO抗体を含んでなる製造品で容器との組合せに関する。選択的には、容器は、製薬的に許容しうるものである。
本発明のその他の実施態様は、PROポリペプチドの使用、又はPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト或いは抗−PRO抗体に対して反応性のある条件の治療に有効な薬剤の調製のための前文に記載したようなPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−PRO抗体を対象としている。
【0216】
(好適な実施態様の詳細な説明)
I.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/数字)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「PRO/数字ポリペプチド」及び「PRO/数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここの記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列PROポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているPROポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置1において示されている一方で、図のアミノ酸位置1より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、PROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【0217】
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約5を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC−末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1−6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683−4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのC−末端境界の何れかの側の約5アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【0218】
「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN−又はC−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、より多くは少なくとも約20アミノ酸長、より多くは少なくとも約30アミノ酸長、より多くは少なくとも約40アミノ酸長、より多くは少なくとも約50アミノ酸長、より多くは少なくとも約60アミノ酸長、より多くは少なくとも約70アミノ酸長、より多くは少なくとも約80アミノ酸長、より多くは少なくとも約90アミノ酸長、より多くは少なくとも約100アミノ酸長、より多くは少なくとも約150アミノ酸長、より多くは少なくとも約200アミノ酸長、より多くは少なくとも約300アミノ酸長、又はそれ以上である。
【0219】
ここに定義されるPROポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラムALIGN−2を使用することによって得られ。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0220】
アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、「PRO」が対象となる仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「X」、「Y」及び「Z」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表2及び3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【0221】
特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%アミノ酸配列同一性値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU−BLAST−2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
【0222】
また、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0223】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性PROポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。通常は、PRO変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約60ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約90ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約120ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約150ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約180ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約210ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約240ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約270ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約300ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約450ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約600ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【0224】
ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、PRO配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラALIGN−2を使用することによって得られ。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所,Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0225】
核酸配列比較にALIGN−2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。
核酸配列Cの長さがアミノ酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、「PRO−DNA」が対象となる仮説的PROコード化核酸配列を表し、「比較DNA」が対象となる「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「N」、「L」及び「V」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表4及び5が「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
【0226】
特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性値は、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2が用いられた場合、%核酸配列同一性値は、(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子が比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU−BLAST−2によって決定した一致する同一核酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Aが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【0227】
また、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
核酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、PRO変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【0228】
「陽性(ポジティブ)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基(例えば、保存的置換の結果として、下記の表6参照)を含む。ここでの目的のために、陽性の%値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列)との間の、WU−BLAST−2のBLOSUM62マトリクス内でポジティブな値を記録したアミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の%値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。WU−BLAST−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、ALIGN−2及びNCBI−BLAST2について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表6に定義)であるものである。
ALIGN−2又はNCBI−BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する陽性の%値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2又はNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%陽性は、BのAに対する%陽性とは異なることが理解されるであろう。
【0229】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸は、同定され、PROポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するPROポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるPROポリペプチド核酸分子を含む。
【0230】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0231】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗−PROポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗−PRO抗体組成物、一本鎖抗−PRO抗体、及び抗−PRO抗体の断片を包含している(下記参照)。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【0232】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【0233】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【0234】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PROによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、PROポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【0235】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下(減少)させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
【0236】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【0237】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ(disbodies);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057−1062 [1995]);一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab’)2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VLに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRsが抗体にたいする抗原結合特異性を持つ。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab断片と相違する。ここで、Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab’を表す。F(ab’)2抗体断片は、最初はFab’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【0238】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、
IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により十分に記載されている。
【0239】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリ法(Lowry method)で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【0240】
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子−E」又は「VEGF−E」は、Fig207のヒトアミノ酸配列を含むここに記載する哺乳動物成長因子、VEGF及び骨形成タンパク質1と相同性を持つ、及びVEGFの生物学的活性に必要なことが示されたVEGFの全システイン残基の完全変換を含む配列を意味する。VEGF−E発現は、ヒト胎児骨、胸腺、及び胃腸管における発現を含む。天然VEGF−Eの生物学的活性は、その任意の類似物又は変異体に共有され、それは、臍静脈内皮細胞の選択的成長及び/又は生存を促進でき、多能性繊維芽細胞の分化を誘発し、ヒト内皮細胞系における初期遺伝子c−fosを誘発し、心臓細胞において筋細胞肥大を生ずる、又は対応する天然VEGF−Eの少なくとも1つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。ここで、ヒトVEGF−Eは、種に渡っての保存を示すラット及びマウスに対して活性である。さらに、ここのVEGF−Eは、成長板領域で発現され、胎児筋細胞を包含することが示された。
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子」又は「VEGF」は、米国特許第5,332,671号に定義されている哺乳動物成長因子を意味する。天然VEGFの生物学的活性は、それらの類似物又は変異体によって共有され、それらは血管内皮細胞の選択的成長促進できるが、ウシ角膜内皮細胞、レンズ内皮細胞、副腎皮質細胞、BHK−21繊維芽、又はケラチノサイトはせず、又は対応する天然VEGFの少なくとも1つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。
【0241】
用語「VEGF−Eポリペプチド」及び「VEGF−E」は、ここで用いる場合、天然配列VEGF−Eポリペプチド及びVEGF−Eポリペプチド変異体(ここで更に定義する)を含む。VEGF−Eポリペプチドは、ヒト組織型等の種々の供給源から、又は他の供給源から単離しても、組換え又は合成方法により調製してもよい。
VEGF−Eの阻害剤は、VEGF−Eの発現又は活性を減じる或いは阻害するものを含み、そしてアンチセンス分子を含む。
略語「KDR」は、VEGF分子のキナーゼドメイン領域に相当する。VEGF−Eは、このドメインにおいてVEGFとの相同性を有しない。
略語「FLT−1」は、対応するFLT−1受容体と結合することが知られているFMS様チロシンキナーゼ結合ドメインに相当する。
「Tollレセプター2」、「TLR2」及び「huTLR2」は交換可能に用いられ、Rock等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588−593 (1998)により「huTLR2」と命名されたヒトTollレセプターを意味する。
【0242】
「リポ多糖」又は「LPS」は、ここで「エンドトキシン」の同義語として用いられる。リポ多糖(LPS)は、グラム陰性菌、例えば大腸菌の外膜の特徴的成分である。それらは多糖部分と脂質Aと呼ばれる脂肪部分とからなる。一細菌種から他に変化する多糖は、O−特異的鎖(3〜8糖の繰り返し単位から構成される)及び2部コアからなる。脂質Aは実際に、リン酸及び種々の数の脂肪酸で修飾された2つのグルコサミン糖を常に含む。さらなる情報については、例えば、Rietschel及びBrade, Scientific American August 1992, 54−62を参照のこと。
「敗血性ショック」は、ここでは最も広い意味で用いられ、Bone, Ann. Intern Med. 114, 332−333 (1991)に記載された全ての定義を含む。特に、敗血性ショックは、感染に対する全身性反応で始まる、敗血症と呼ばれる症候群である。この症候群は低血圧及び器官不全をもたらし、それは敗血性ショックと呼ばれる。敗血性ショックは、グラム陽性生物及び真菌、並びにエンドトキシン含有グラム陰性生物によって開始されうる。従って、この定義は「エンドトキシンショック」に限定されない。
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。複製された領域(増幅されたDNAの伸展)は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーRNA(mRNA)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【0243】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90及びRe186)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【0244】
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アドリアマイシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール、Bristol−Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア、Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、特にここに定義される遺伝子を過剰発現している癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害薬は、S相においてそのような遺伝子を過剰発現している細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を(S相以外の位置で)阻止する薬剤、例えば、G1停止及びM相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM相ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S相停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル及びAra−Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael,編集, Chapter 1, Murakamiによる表題「Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出される。
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。
【0245】
用語「サイトカイン」は、一の細胞集団により放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質のための一般的用語である。このようなサイトカインの例は、リンカイン、モノカイン、及び伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;甲状腺ホルモン;チロキシン;インシュリン;プロインシュリン;リラキシン;プロリラキシン;等である。ここで用いられるように、用語サイトカインは天然供給源から又は組換え細胞培地からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的等価物を含む。
【0246】
【0247】
【0248】
【0249】
【0250】
【0251】
【0252】
【0253】
【0254】
【0255】
【0256】
【0257】
【0258】
【0259】
【0260】
【0261】
【0262】
【0263】
【0264】
【0265】
【0266】
【0267】
II. 本発明の組成物と方法
A.全長PROポリペプチド
本発明は、本出願でPROポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0268】
1.全長PRO213ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO213と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO213ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO213ポリペプチドの一部がヒト腫瘍停止特異的6(gas6)タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO213ポリペプチドがgas6タンパク質と同一又は類似の活性を有すると考えられている。
2.全長PRO274ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO274と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO274ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO274ポリペプチドの種々の部分が7膜貫通セグメントレセプター及びFn54タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO274ポリペプチドが7膜貫通セグメントレセプター及び/又はFn54タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0269】
3.全長PRO300ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO300と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO300ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO300ポリペプチドの種々の部分がヒトDiff33タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO300ポリペプチドがDiff33ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
4.全長PRO284ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO284と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO284ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、UNQ247(DNA23318−1211)核酸配列が新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【0270】
5.全長PRO296ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO296と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO296ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO296ポリペプチドが肉腫増幅SASタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO296ポリペプチドが新たに同定されたSASタンパク質相同体であると考えられている。
6.全長PRO329ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO329と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO329ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO329ポリペプチドが高親和性免疫グロブリンFcレセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO329ポリペプチドが新たに同定されたFcレセプター相同体であると考えられている。
【0271】
7.全長PRO362ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO362と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO362ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO362ポリペプチドがA33抗原タンパク質並びにHCARタンパク質及びNrCAM関連細胞接着分子と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO362ポリペプチドが新たなA33抗原及びHCARタンパク質相同体であると考えられている。
8.全長PRO363ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO363と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO363ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO363ポリペプチドが細胞表面タンパク質HCARと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO363ポリペプチドが新たなHCAR相同体であると考えられている。
【0272】
9.全長PRO868ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO868と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO868ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO868ポリペプチドが腫瘍壊死因子レセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO868ポリペプチドがタンパク質の腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
10.全長PRO382ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO382と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO382ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、天然PRO382ポリペプチドが種々のセリンプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。また本出願人は、PRO382ポリペプチドをコードするDNAが種々のセリンプロテアーゼタンパク質をコードする核酸と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO382ポリペプチドが新たに同定されたセリンプロテアーゼ質相同体であると考えられている。
【0273】
11.全長PRO545ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO545と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO545ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO545ポリペプチドが、ヒトメタロプロテイナーゼ(「P_W01825」)、マウスメルトリンアルファ(「S60257」)、メタロプロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−アルファ(「GEN13695」)、ADAM13−アフリカツメガエル(「XLU66003_1」)、マウスメルトリンベータ(「S60258」)、ウサギメタロトロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−ベータ(「GEN13696」)、ヒトメルトリンS(「AF023477_1」)、ヒトメルトリン前駆体(「AF023476_1」)、ヒトADAM21(「AF029900_1」)、及びヒトADAM20(「AF029899_1」)と命名され同定された配列と有意な類似性を有していることを見出し、それによりPRO545は新規なメルトリンタンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO545ポリペプチドがメルトリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、メタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインを有するメルトリンタンパク質に典型的な細胞接着を有すると考えられている。
12.全長PRO617ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO617と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO617ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO617ポリペプチドがCD24タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また本出願人は、PRO617ポリペプチドをコードするDNAがCD24タンパク質をコードするDNAと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO617ポリペプチドが新たに同定されたCD24相同体であると考えられている。
【0274】
13.全長PRO700ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO700と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO700ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO700ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO700ポリペプチドの種々の部分が種々のジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有している事を示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO700アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;タンパク質イソメラーゼ活性を持つポリペプチド、(「P_P80664」)と命名、ヒトPDI、(「P_R51696」)と命名、ヒトPDI、(「P_R25297」)と命名、可能なタンパク質イソメラーゼer−60前駆体、(「ER60_SCHMA」)と命名、タンパク質イソメラーゼ前駆体−ショウジョウバエ、(「PDI_DROME」)と命名、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ−回旋糸状虫、(「OVU12440_1」)と命名、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質5、(「HSU79278_1」)、及びタンパク質イソメラーゼ前駆体/プロリル4−ヒドロキシ、(「PDI_HUMAN」)と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO700が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO700ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なジスルフィド結合の形成を触媒する能力を有していると考えられている。
【0275】
14.全長PRO702ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO702と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO702ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO702ポリペプチドがコングルチニン(conglutinin)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO702ポリペプチドが新たに同定されたコングルチニン相同体であると考えられている。
【0276】
15.全長PRO703ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO703と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO703ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO703ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO703ポリペプチドの種々の部分がVLCASタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO703が新規なVLSACタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO703アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;超長鎖アシル−CoAに対するヒトmRNA、(「D88308」)、超長鎖アシル−CoAシンセターゼに対するラットmRNA、(「D85100」)、マウス脂肪酸輸送タンパク質、(「MMU15976」)、ヒト超長鎖アシル−CoAシンターゼ、(「D88308_1」)、マウス超長鎖アシル−CoAシンターゼ、(「AF033031_1」)、超長鎖アシル−CoAシンターゼ−Rattus、(「D85100_1」)、ラット長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FATP_RAT」)、マウス長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FATP_MOUSE」)、可能な長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FAT1_YEAST」)、及び脂肪酸輸送タンパク質、(「CHY15839_2」)、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO703が新規なVLCASであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO703ポリペプチドがVLCASファミリーの新たに同定されたメンバーであり、VLCASファミリーに典型的な長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送を促進する能力を有していると考えられている。
【0277】
16.全長PRO705ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO705と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO705ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO705ポリペプチドがK−グリピカン(glypican)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO705ポリペプチドがプロテオグリカンタンパク質のグリピカンファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
17.全長PRO708ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO708と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO708ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO708ポリペプチドがアリールスルファターゼタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO708ポリペプチドが新たに同定されたアリールスルファターゼ相同体であると考えられている。
【0278】
18.全長PRO320ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO320と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO320ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO320ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO320ポリペプチドの種々の部分がフィブリンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO320アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;ヒトフィブリン−2前駆体、「FBL2_HUMAN」と命名、ヒトフィブリン−1アイソフォーム前駆体、「FBLA_HUMAN」と命名、ZK783.1−線虫、「CELZK783_1」と命名、ヒト−notch2、「HSU77493_1」と命名、NeI部分前駆体−rattus norvegicus、「NEL_RAT」と命名、マウス細胞表面タンパク質、「D32210_1」と命名、マウス(断片)NotchBタンパク質、「A49175」と命名、C50H2.3a−線虫、「CEC50H2_3」と命名、MEC−9L−線虫、「CEU33933_1」と命名、及びマウスnotch4、「10MMMHC29N7_2」と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO320が新規なフィブリン又はフィブリン様タンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO320ポリペプチドがフィブリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、フィブリンファミリーに典型的な生物学的活性を有していると考えられている。
【0279】
19.全長PRO324ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO324と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO324ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO324ポリペプチドがオキシドレダクターゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO324ポリペプチドが新たに同定されたオキシドレダクターゼ相同体であると考えられている。
【0280】
20.全長PRO351ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO351と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO351ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO351ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO351ポリペプチドの種々の部分がプロシタシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO351アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AC003965_1」、「CELC07G1_7」、「GEN12917」、「HEPS_HUMAN」、「GEN14584」、「MCT6_MOUSE」、「HSU75329_1」、「PLMN_ERIEU」、「TRYB_HUMAN」及び「P_W22987」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO351ポリペプチドがプロスタシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロスタシンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【0281】
21.全長PRO352ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO352と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO352ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO352ポリペプチドがブチロフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO352ポリペプチドが新たに同定されたブチロフィリン相同体であると考えられている。
22.全長PRO381ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO381と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO381ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO381ポリペプチドがイムノフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO381ポリペプチドが新たに同定されたFKBPイムノフィリン相同体であると考えられている。
【0282】
23.全長PRO386ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO386と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO386ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO386ポリペプチドがナトリウムチャンネルタンパク質のベータ−2サブユニットと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO386ポリペプチドが哺乳動物細胞で発現されたナトリウムチャンネルのベータ−2サブユニットの相同体であると考えられている。
【0283】
24.全長PRO540ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO540と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO540ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO540ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO540ポリペプチドの種々の部分がLCATタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO540が新規なLCATタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO540アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼ、「LCAT_HUMAN」と命名、マクロテトロリド耐性タンパク質−ストレプトミセス、「JH0655」と命名、T細胞レセプターデルタ鎖前駆体「C30583」と命名、アカゲザルkringle2、「P_W07551」と命名、RAGE−1ORF5、「HSU46191_3」と命名、ヒトIgカッパ鎖VKIII−JK3、「HSU07466_1」と命名、及びアルストロメリアインドラ逆転写酵素、「ALI223606_1」と命名、との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO540ポリペプチドがLCATタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、LCATファミリーに典型的な脂質輸送能力を有していると考えられている。
【0284】
25.全長PRO615ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO615と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO615ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO615ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO615ポリペプチドの種々の部分がヒトシナプトギリン(synaptogyrin)タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO615アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AF039085_1」、「RNU39549_1」、「CELT08A9_8」、「FSU62028_1」、「S73645」、「Y348_MYCPN」、「AC000103_5」、「」、「RT12_LEITA」及び「EBVLMP218_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO615ポリペプチドがシナプトギリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、シナプトギリンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【0285】
26.全長PRO618ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO618と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO618ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO618ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO618ポリペプチドの種々の部分がエンテロペプチダーゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO618が新規なエンテロペプチダーゼであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO618アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_W22987」、「KAL_HUMAN」、「AC003965_1」、「GEN12917」、「ENTK_HUMAN」、「FA11_HUMAN」、「HSU75329_1」、「P_W22986」、及び「PLMN_HORSE」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO618ポリペプチドがエンテロペプチダーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、エンテロペプチダーゼファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【0286】
27.全長PRO719ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO719と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO719ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO719ポリペプチドがリポタンパク質リパーゼHタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO719ポリペプチドが新たに同定されたリポタンパク質リパーゼH相同体であると考えられている。
28.全長PRO724ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO724と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO724ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO724ポリペプチドが低密度リポタンパク質(LDL)レセプタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO724ポリペプチドが新たに同定されたLDLレセプターH相同体であると考えられている。
【0287】
29.全長PRO772ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO772と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO772ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO772ポリペプチドがヒトA4タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO772ポリペプチドが新たに同定されたA4タンパク質相同体であると考えられている。
30.全長PRO852ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO852と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO852ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO852ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO852ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ酵素相同体であると考えられている。
【0288】
31.全長PRO853ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO853と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO853ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO853ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO853ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO853が新規なレダクターゼであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO853アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_W03198」、「CEC15H11_6」、「MTV030_12」、「P_W15759」、「S42651」、「ATAC00234314」、「MTV022_13」、「SCU43704_1」、「CELE04F6_7」及び「ALFA_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO853ポリペプチドがレダクターゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、レダクターゼファミリーに典型的な抗酸化酵素活性を有していると考えられている。
【0289】
32.全長PRO860ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO860と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO860ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO860ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO860ポリペプチドの種々の部分がニューロファシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO860が新規なニューロファシンであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO860アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AF040990_1」、「AF041053_1」、「CELZK377_2」、「RNU81035_1」、「D86983_1」、「S26180」、「MMBIG2A_1」、「S46216」、及び「RNU68726_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO860ポリペプチドがニューロファシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロファシンファミリーに典型的な細胞接着特性を有していると考えられている。
【0290】
33.全長PRO846ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO846と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO846ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO846ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO846ポリペプチドの種々の部分がCMRF35タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO846が新規なCMRF35タンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO846アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「CM35_HUMAN」、「AF035963_1」、「PIGR_RABIT」、「AF043724_1」、「RNU89744_1」、「A52091_1」、「S48841」、「ELK06A9_3」、及び「AF049588_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO846ポリペプチドがCMRF35タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、CMRF35タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【0291】
34.全長PRO862ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO862と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO862ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO862ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO862ポリペプチドの種々の部分がリソザイムタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO862が新規なリソザイムタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO862アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_P90343」及び「LYC_HUMAN」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO862ポリペプチドがリソザイムファミリーの新たに同定されたメンバーであり、リソザイムファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【0292】
35.全長PRO864ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO864と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO864ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO864ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO864ポリペプチドの種々の部分がWnt−4タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO864が新規なWnt−4タンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO864アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「WNT4_MOUSE」、「WNT3_MOUSE」、「WN5A_HUMAN」、「WN7B_MOUSE」、「WN3A_MOUSE」、「XLU66288_1」、「WN13_HUMAN」、「WN5B_ORYLA」、「WNT2_MOUSE」、及び「WN7A_MOUSE」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO864ポリペプチドがWnt−4タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Wnt−4タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【0293】
36.全長PRO792ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO792と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO792ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO792ポリペプチドがCD23タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO792ポリペプチドが新たに同定されたCD23相同体であると考えられている。
37.全長PRO866ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO866と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO866ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO866ポリペプチドが種々のミンジン及びスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO866ポリペプチドが新たに同定されたミンジン/スポンジン相同体であると考えられている。
【0294】
38.全長PRO871ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO871と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO871ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO871ポリペプチドがCyp−60タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO871ポリペプチドがCyp−60タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【0295】
39.全長PRO873ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO873と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO873ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO873ポリペプチドがヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO873ポリペプチドがカルボキシエステラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カルボキシルエステラーゼファミリーに典型的な触媒活性を有すると考えられている。
40.全長PRO940ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO940と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO940ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO940ポリペプチドがCD33及びOB結合タンパク質−2と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO940ポリペプチドが新たなCD33及び/又はOB結合タンパク質−2相同体であると考えられている。
【0296】
41.全長PRO941ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO941と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO941ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO941ポリペプチドが一又は複数のカドヘリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO941ポリペプチドが新たに同定されたカドヘリン相同体であると考えられている。
42.全長PRO944ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO944と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO944ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO944ポリペプチドがCPE−R細胞表面タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO944ポリペプチドが新たに同定されたCPE−R相同体であると考えられている。
【0297】
43.全長PRO983ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO983と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO983ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO983ポリペプチドが小胞関連タンパク質VAP−33と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO983ポリペプチドが小胞関連膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、小胞関連膜タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
44.全長PRO1057ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1057と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1057ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1057ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1057ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ相同体であると考えられている。
【0298】
45.全長PRO1071ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1071と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1071ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1071ポリペプチドがトロンボスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1071ポリペプチドが新たに同定されたトロンボスポンジン相同体であると考えられている。
46.全長PRO1072ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1072と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1072ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1072ポリペプチドが種々のレダクターゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1072ポリペプチドがレダクターゼタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0299】
47.全長PRO1075ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1075と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1075ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1075ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1075ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【0300】
48.全長PRO181ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO181と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO181ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO181ポリペプチドがコルニコン(cornichon)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO181ポリペプチドが新たに同定されたコルニコン相同体であると考えられている。
49.全長PRO195ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO195と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO195ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO195コード化クローンがヒト胎児胎盤ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、UNQ169(DNA26847−1395)核酸配列は新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【0301】
50.全長PRO865ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO865と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO865ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO865コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。PRO865コード化クローンは分泌されたタンパク質をコードする。本出願人の知識では、UNQ434(DNA53974−1401)核酸配列は新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
51.全長PRO827ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO827と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO827ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO827ポリペプチドがVLA−2及び種々の他のインテグリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO827ポリペプチドが新たなインテグリンタンパク質又はそのスプライシング変異体であると考えられている。
【0302】
52.全長PRO1114ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1114と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1114ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1114ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1114ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
本発明は、本出願においてPRO1114インターフェロンレセプター(UNQ557)と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるPRO番号で与えられたが、UNQ番号は任意の与えられたDNA及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではDNA57033−1403にコードされるタンパク質並びにPRO1114インターフェロンレセプターの上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「PRO1114インターフェロンレセプター」と呼ぶ。
WU−BLAST配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド(Fig142及び配列番号:352に示す)が、他の公知のインターフェロンレセプターと配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、PRO1114インターフェロンレセプターが他のインターフェロンレセプターに典型的な活性を有すると考えられている。
【0303】
53.全長PRO237ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO237と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO237ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO237ポリペプチドが脱炭酸酵素と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO237ポリペプチドが新たに同定された脱炭酸酵素相同体であると考えられている。
54.全長PRO541ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO541と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO541ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO541ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO541ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0304】
55.全長PRO273ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO273と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO273ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO273ポリペプチドが種々のケモカインと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO273ポリペプチドがケモカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ケモカインファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
56.全長PRO701ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO701と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO701ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO701ポリペプチドがニューロリジン(neuroligin)1、2及び3及びカルボキシエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO701ポリペプチドがニューロリジンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロリジンに典型的なようにニューロン間の認識プロセスの媒介及び/又は機能に接着因子として含まれると考えられている。
【0305】
57.全長PRO704ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO704と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO704ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO704ポリペプチドがVIP36及びGP36bと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO704ポリペプチドが小胞複合膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な糖への結合及び原形質膜とゴルジの間をサイクルする能力を有すると考えられている。
58.全長PRO706ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO706と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO706ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO706ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体及びヒトリソソーム酸ホスファターゼ前駆体と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO706ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、酸ホスファターゼファミリーに典型的なホスファターゼを有すると考えられている。
【0306】
59.全長PRO707ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO707と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO707ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO707273ポリペプチドの種々の部分がカドヘリン、特に繊維芽細胞に見られるカドヘリンFIB3と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO707ポリペプチドがカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カドヘリンファミリーに典型的な細胞相互作用シグナル伝達を有すると考えられている。
60.全長PRO322ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO322と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO322ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO322ポリペプチドの種々の部分がヒトニューロプシン(neuropsin)、セリンプロテアーゼ、ニューロシン(neurosin)及びトリプシノーゲンと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO322ポリペプチドがセリンプロテアーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。また、PRO322は海馬可塑性に含まれ、細胞外マトリクス変性及び細胞泳動を伴うとも考えられている。
【0307】
61.全長PRO526ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO526と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO526ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO526ポリペプチドの種々の部分がインシュリン様成長因子複合体(ALS)の酸安定性サブユニット、並びにカルボキシペプチダーゼ、SLIT、及び血小板糖タンパク質Vと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO526ポリペプチドがロイシン−リピートリッチスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なタンパク質−タンパク質相互作用能力を有すると考えられている。
62.全長PRO531ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO531と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO531ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO531ポリペプチドの種々の部分がカドヘリンスーパーファミリー、特にプロトカドヘリン3と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO531ポリペプチドがカドヘリンスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロトカドヘリンであると考えられている。PRO531は細胞外カドヘリンモチーフを持つ膜貫通タンパク質である。PRO531は細胞−細胞活性、特に細胞シグナル伝達に含まれると考えられる。
【0308】
63.全長PRO534ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO534と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO534ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO534ポリペプチドの種々の部分が推定ジスルフィドイソメラーゼerp38前駆体及びチオレドキシンc−3と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO534ポリペプチドがジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な中間又は不正な折りたたみパターンの認識及び解読をする能力を有すると考えられている。
64.全長PRO697ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO697と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO697ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO697ポリペプチドの種々の部分がsFRP−2、sFRP−1及びSARP−1、−2及び−3と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO697ポリペプチドがsFRPファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Wntシグナル経路に関連する活性を有すると考えられている。
【0309】
65.全長PRO717ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO717と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO717ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。本出願人の知識では、UNQ385(DNA50988−1326)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のヒトタンパク質と有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
66.全長PRO731ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO731と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO731ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO731ポリペプチドの種々の部分がプロトカドヘリン4、68、43、42、3及び5と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO731ポリペプチドがプロトカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞−細胞凝集又はシグナル伝達活性又はシグナル伝達関与を有すると考えられている。
【0310】
67.全長PRO218ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO218と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO218ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO218コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから単離された。本出願人の知識では、UNQ192(DNA30867−1335)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と有意な配列同一性がないことが明らかとなった。膜調節タンパク質と幾分の配列同一性が見られ、PRO218が膜調節器として機能しうることを示している。
68.全長PRO768ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO768と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO768ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO768ポリペプチドの種々の部分がインテグリン7及び6を含むインテグリンと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO768ポリペプチドがインテグリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、インテグリイン7の相同体又はスプライシング変異体のいずれかであり、筋細胞及び細胞外マトリクス間の細胞接着及び連絡に含まれると考えられている。
【0311】
69.全長PRO771ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO771と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO771ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO771ポリペプチドの種々の部分がテスチカン(testican)と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO771ポリペプチドがテスチカンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞シグナル伝達、結合、又は接着特性を有すると考えられている。
70.全長PRO733ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO733と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO733ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO733ポリペプチドの種々の部分がT1/STレセプター結合タンパク質と有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO733ポリペプチドがインターロイキン様ファミリー結合タンパク質の新たに同定されたメンバーであり、サイトカインであり、そして細胞シグナル伝達に含まれる。PRO733はApoAIV相同体であると思われる。
【0312】
71.全長PRO162ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO162と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO162ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO162ポリペプチドの種々の部分がヒト膵炎関連タンパク質(PAP)と顕著な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、PRO162ポリペプチドをコードするDNAがウシlithostathine前駆体及びウシ膵臓繊維状タンパク質(PAP)と有意な相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO162ポリペプチドが膵炎関連タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、膵炎関連タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられる。
72.全長PRO788ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO788と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO788ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO788ポリペプチドの種々の部分が抗悪性腫瘍尿タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、PRO788ポリペプチドをコードするDNAがヒトE48抗原、ヒトコンポーネントBタンパク質、及びヒト前立腺幹細胞抗原と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO788ポリペプチドが抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーに典型的な抗悪性腫瘍活性を有すると考えられる。
【0313】
73.全長PRO1008ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1008と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1008ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1008ポリペプチドの種々の部分がマウスdkk−1(mdkk−1)と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1008ポリペプチドがdkk−1ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な頭部誘発活性を有すると考えられる。
74.全長PRO1012ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1012と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1012ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1012ポリペプチドの種々の部分がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1012ポリペプチドがER保有タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なポリペプチドのプロセシング、生成及び/又は折りたたみに関連する活性を有すると考えられる。
【0314】
75.全長PRO1014ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1014と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1014ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1014ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼ及びデヒドロゲナーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1014ポリペプチドがレダクターゼスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な還元能力を有すると考えられる。
76.全長PRO1017ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1017と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1017ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1017ポリペプチドの種々の部分がHNK−1スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1017ポリペプチドがHNK−1スルホトランスフェラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なHNK−1炭水化物エピトープの合成に含まれると考えられる。
【0315】
77.全長PRO474ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO474と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO474ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO474ポリペプチドの種々の部分がデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO474ポリペプチドがデヒドロゲナーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、グルコースの酸化に含まれると考えられる。
78.全長PRO1031ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1031と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1031ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1031ポリペプチドの種々の部分がIL−17及びCTLA−8と配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1031ポリペプチドがサイトカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、よって炎症及び/又は免疫系に含まれると考えられる。
【0316】
79.全長PRO938ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO938と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO938ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO938ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO937ポリペプチドがチオレドキシンファミリータンパク質の新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに典型的な活性を有すると考えられる。
80.全長PRO1082ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1082と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1082ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1082ポリペプチドの種々の部分がデータベースに「AB010710_1」として現れるレクチン様酸化LDLレセプターと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1082ポリペプチドがLDLレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられる。
【0317】
81.全長PRO1083ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1083と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1083ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO1083コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから分泌されるタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、UNQ540(DNA50921−1458)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、7TMレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質1及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質との幾分の配列同一性が見られた。Fig204に示すキナーゼリン酸化部位及びG−結合レセプタードメインは、PRO1083が7TMレセプタースーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
82.全長PRO200ポリペプチド
本発明は、本出願においてVEGF−Eと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、VEGF−EポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、VEGF−EポリペプチドがVEGF及び骨形成タンパク質1と有意な相同性を有していることを見出した。特に、VEGF−EのcDNA配列はVEGFと24%のアミノ酸類似性を示し、構造的保存を有している。さらに、VEGF−EはVEGFに存在しないN−末端半分を含み骨形成タンパク質1と28%の相同性を有する。
【0318】
83.全長PRO285及びPRO286ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO285及びPRO286と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定及び単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO285及びPRO286ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO285及びPRO286がGenBamkデータベースのDNA配列HSU88540_1、HSU88878_1、HSU88879_1、HSU88880_1、及びHSU88881_1と高度な相同性を有していることを見出した。
従って、現在では、本出願で開示されるPRO285及び286タンパク質がショウジョウバエタンパク質Tollの新たに同定されたヒト相同体メンバーであり、獲得免疫において重要な役割を果たすであろうと考えられている。より詳細には、PRO285及びPRO286は、炎症、敗血性ショック、及び病原に対する反応に含まれ、免疫反応によって増悪する様々な医学的状態、例えば糖尿病、ALS、癌、慢性関節リウマチ、及び潰瘍などにおいて役割を果たす可能性がある。PRO285及びPRO286の病原パターン認識レセプターとしての役割は、微生物に存在する保存された分子構造の存在の感知は、本出願に開示するデータにより更に支持され、公知のヒトToll様レセプター、TLR2がLPSシグナル伝達の直接的メディエータであることを示している。
【0319】
84.全長PRO213−1、PRO1330及びPRO1449ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるPRO番号で与えられたが、UNQ番号は任意の与えられたDNA及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではDNA30943−1163−1、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1にコードされるタンパク質並びにPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449の上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449」と呼ぶ。
85.全長PRO298ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO298と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。(PRO298はFig218、配列番号:514に示した核酸にコードされ、Fig219、配列番号:515に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の任意の命名であることを記しておく。さらに、同じアミノ酸配列を持ち異なる発現ラウンドで発現されるタンパク質は異なる「PRO」番号で与えられる。)
特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に記載されるPRO298をコードするcDNAを同定し単離した。BLASTX2.0aMP−WashUコンピュータプログラム、スコアリングパラメータT=12、S=68、S2=36、マトリクス:BLOSUM62を用い、本出願人は、ここに特に記載するPRO298タンパク質が、GenBankデータベースに見られる以下の配列:S59392(可能な膜タンパク質YLR246w−酵母);S58154(仮説タンパク質SPAC2F7.10−酵母);CELF33D11_9(F33D11.9b−線虫);YO41_CAEEL(仮説68.7kdタンパク質zk57.1);CEAC3_5(AC3.4−線虫);S52691(可能な膜タンパク質YDR126w−酵母);ATT12H17_14(タンパク質−シロイヌナズナ);S55963(可能な膜タンパク質YNL326c−酵母);CELC43H6_2(C43H6.7−線虫);TMO18A10_14(A_TMO18A10.8−シロイヌナズナ)と限られた配列同一性(27−38%)を示すことを見出した。
【0320】
86.全長PRO337ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO337と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO337ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST、BLAST−2及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列PRO337が、ラットニューロトリミンと97%の配列同一性、チキンCEPUと85%の配列同一性、チキンG55と73%の配列同一性、ヒトLAMPと59%の相同性、及びヒトOPCAMと84%の相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO337が免疫グロブリンスーパーファミリーのIgLONサブファミリーの新たに同定されたメンバーであり、神経突起成長及び分化可能特性を有すると考えられる。
87.全長PRO403ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO403と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO403ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST、BLAST−2及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列PRO403がウシECE−2と94%の同一性及びヒトECE−1と64%の同一性を有していることを見出した。従って、現在では、PRO403がECEタンパク質ファミリーの新規なメンバーであり、活性エンドセリンを生成する能力を有すると考えられている。
【0321】
B.PROポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列PRO又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROと比較してPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【0322】
PROポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、N−末端又はC−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’ 及び3’ プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表1に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表1に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【0323】
【0324】
PROポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cuningham及びWells, Science, 244: 1081−1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0325】
C.PROの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)−ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79−86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【0326】
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROに見られる1又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない1又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、1又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O−結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【0327】
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981)に記載されている。
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【0328】
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly−his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 (1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547−553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204−1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192−194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163−15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz−Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393−6397 (1990)]を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えてPROポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0329】
D.PROの調製
以下の説明は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid−Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149−2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
【0330】
1.PROをコードするDNAの単離
PROをコードするDNAは、PROmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPRO−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
【0331】
下記の実施例には、cDNAライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【0332】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編(IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456−457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527−537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348−352 (1988)を参照のこと。
【0333】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompTkanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF−lac)169 degP ompT rbs7ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【0334】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383);クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968−975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98−8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265−278 [1988]);カンジダ;トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259−5263 [1979]);シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日発行のEP 394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行のWO 91/00357);及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284−289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205−221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475−479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【0335】
グリコシル化PROの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 (1980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【0336】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PROをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO−コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダアルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【0337】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【0338】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PRO−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4−1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO−コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【0339】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【0340】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【0341】
より高等の真核生物による所望のPROをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROコード化配列の5’ 又は3’ 位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’ 位に位置する。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’ 、時には3’ の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620−625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40−46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【0342】
4.遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201−5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRODNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【0343】
5.ポリペプチドの精製
PROの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン−X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
【0344】
E.PROの用途
PROをコードする核酸配列(又はそれらの補体)は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。また、PRO核酸も、ここに記載される組換え技術によるPROポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列PRO遺伝子又はその一部は、全長PROcDNAの単離又はここに開示したPRO配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、PROの天然発生変異体又は他の種からのPROをコードするもの)の単離のためのcDNAライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列PROのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、PROポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、32P又は35S等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン/ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリフォスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のPROポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【0345】
本出願で開示する任意のESTはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
PRO核酸の他の有用な断片は、標的PROmRNA(センス)又はPRODNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRODNAのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen(CancerRes. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PROタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【0346】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−(L−リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO4−媒介DNA形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM−MuLVから誘導されるもの、N2(M−MuLVから誘導されたレトロウイルス)、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター(WO 90/13641参照)を含む。
【0347】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンスRNA又はDNA分子は一般に少なくとも約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、あるいはそれ以上である。
【0348】
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPROコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、PROをコードするヌクレオチド配列は、そのPROをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
PROのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、PROがレセプターである場合)、PROは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターPROは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然PRO又はPROのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【0349】
また、PRO又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施形態では、PROをコードするcDNAは、確立された技術によりPROをコードするゲノムDNAをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、PROをコードするDNAを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのPRO導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたPROコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はPROをコードするDNAの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【0350】
あるいは、PROの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたPROをコードする変更ゲノムDNAと、PROをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、PROをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するPRO「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、PROをコードするcDNAは、確立された技術に従い、PROをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。PROをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5’ と3’ 末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択される[例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113−152参照]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、PROポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【0351】
また、PROポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、1回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの1回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143−4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である(Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205−210(1993))。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び/又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429−4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808−813 (1992)を参照のこと。
【0352】
ここに記載したPROポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよいし、単離された核酸配列は、これらのマーカーの組み換え発現に使用しもよい。
ここに記載したPROポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各PRO核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のPROポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPROポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。PRO核酸分子は、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したPROポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のPROポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このPRO生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(残基数10個未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0353】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42−96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【0354】
PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり1日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている;例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
PROポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPROポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PROポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン−(rhIFN−)、インターロイキン−2、及びMNrgp120で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795−799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221−1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755−758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439−462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5,564,010号。
【0355】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸(PLGA)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1−41。
本発明は、PROポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はPROポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【0356】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPROポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるPROポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【0357】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPROポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245−246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578−9582 (1991)]に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789−5793 (1991)]に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2−ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1−lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。2−ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【0358】
ここで同定されたPROポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる:通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら2つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第3の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、PROポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、PROポリペプチド存在下での対象とする活性を阻害する化合物の能力が化合物がPROポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、PROポリペプチド及び膜結合PROポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。PROポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したPROポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化RNAがPROポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このRNAから生成されたcDNAライブラリがプールに分配され、COS細胞又はPROポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したPROポリペプチドに暴露する。PROポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【0359】
レセプター同定の代替的方法として、標識下PROポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はPAGEに溶解させ、X線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なPROポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA作成物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNAは、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟PROポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の5’コード化部分は、約10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりPROポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリッド形成してmRNA分子のPROポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスRNA又はDNAをインビボで発現させて、PROポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【0360】
潜在的アンタゴニストは、PROポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPROポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469−471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【0361】
PRO213ポリペプチド及びその一部は、成長誘発カスケード及び/又は血液凝集カスケードを調節する能力を持ち、インビボ及びインビトロでそのような目的のために用いることができる。当業者はPRO213ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド274及びその一部は、7TMタンパク質及びFn54に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規な7TMタンパク質及びFn54様分子の同定は多数のヒト疾患に関連し、それはリガンドの認識及びそれに続くリガンドに含まれる細胞プロセスの制御のための情報のシグナル伝達を含む。即ち、新たな7TMタンパク質及びFn54様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO274などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
PROポリペプチド300及びその一部は、Diff33に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なDiff33様分子の同定は癌の生理学などの多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなDiff33様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO300などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0362】
本発明のPRO296ポリペプチドは、肉腫増幅SASタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO296ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO329ポリペプチドは、免疫グロブリンFcレセプタータンパク質又はそのサブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO329ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO362ポリペプチドは、A33抗原タンパク質、HCARタンパク質又はNrCAM関連細胞接着分子に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。
【0363】
本発明のPRO363ポリペプチドは、細胞表面HCARタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO363ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。特に、PROポリペプチドから誘導される細胞外ドメインは、ウイルス感染の影響を低下させるためにインビボで治療的に使用できる。
本発明のPRO868ポリペプチドは、腫瘍壊死因子タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO868ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO382ポリペプチドは、セリンプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO382ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0364】
PROポリペプチド545及びその一部は、メルトリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。細胞接着に関連する新規な分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。メルトリンタンパク質が多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなメルトリンタンパク質及びメルトリン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO545などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO617ポリペプチドは、CD24タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO617ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド700及びその一部は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。ジスルフィド結合の形成及びタンパク質折りたたみが多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO700などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0365】
本発明のPRO702ポリペプチドは、コングルチニンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO702ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。コングルチニン活性を持つPRO702ポリペプチドは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集活性を阻害することができ及び及び/又は補体媒介機構の結果として免疫グロブリン非依存性防御分子として機能すると予測される。
本発明のPRO703ポリペプチドは、VLCASタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO703ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド703及びその一部は、VLCASに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なVLCASタンパク質及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなVLCASタンパク質及びVLCASタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO703などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0366】
本発明のPRO705ポリペプチドは、K−グリピカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO705ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO708ポリペプチドは、アリールスルファターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO708ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO320ポリペプチドは、フィブリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO320ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド320及びその一部は、フィブリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なフィブリンタンパク質及び関連分子の同定は、癌などの多数のヒト疾患又は結合組織、接着分子及び関連機構を含むものに関連する。即ち、新たなフィブリンタンパク質及びフィブリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO320などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0367】
本発明のPRO324ポリペプチドは、オキシドレダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO324ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO351ポリペプチドは、プロスタシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO351ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド351及びその一部は、プロスタシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なプロスタシンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなプロスタシンタンパク質及びプロスタシンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO351などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0368】
本発明のPRO352ポリペプチドは、ブチロフィリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO352ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO381ポリペプチドは、FKPBイムノフィリンタンパク質の一又は複数に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方、例えば、免疫抑制活性の促進及び/又は軸索再生に用いられる。当業者は本発明のPRO381ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO386ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されるナトリウムチャンネルのベータ−2サブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO386ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0369】
本発明のPRO540ポリペプチドは、LCATタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO540ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO615ポリペプチドは、シナプトギリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO615ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド615及びその一部は、シナプトギリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なシナプトギリンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなシナプトギリンタンパク質及びシナプトギリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO615などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0370】
本発明のPRO618ポリペプチドは、エンテロペプチダーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO618ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド618及びその一部は、エンテロペプチダーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なエンテロペプチダーゼタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなエンテロペプチダーゼタンパク質及びエンテロペプチダーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO618などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO719ポリペプチドは、リポタンパク質リパーゼHタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO719ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0371】
本発明のPRO724ポリペプチドは、ヒトLDLレセプタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO724ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO772ポリペプチドは、ヒトA4タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO772ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO852ポリペプチドは、或る種のプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO852ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0372】
本発明のPRO853ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO853ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド853及びその一部は、レダクターゼタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。酸素フリーラジカル及び酸化防止剤が多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことがわかったので、新規なレダクターゼタンパク質及びレダクターゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO853などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO860ポリペプチドは、ニューロファシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO860ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド860及びその一部は、ニューロファシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なニューロファシンタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなニューロファシンタンパク質及びニューロファシン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO860などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0373】
本発明のPRO846ポリペプチドは、CMRF35タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO846ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド846及びその一部は、CMRF35タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なCMRF35タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなCMRF35タンパク質及びCMRF35タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO846などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO862ポリペプチドは、リソザイムタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO862ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド862及びその一部は、リソザイムタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なリソザイムタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなリソザイムタンパク質及びリソザイム様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO862などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0374】
本発明のPRO864ポリペプチドは、Wnt−4タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO864ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド864及びその一部は、Wnt−4タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なWnt−4タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなWnt−4タンパク質及びWnt−4タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO860などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO792ポリペプチドは、CD23タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO792ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0375】
本発明のPRO866ポリペプチドは、ミンジン及び/又はスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO866ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のPRO871ポリペプチドは、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO871ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO873ポリペプチドは、カルボキシルエステラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。例えば、それらはプロドラッグと組み合わされ、プロドラッグをその活性形態に変換するのに用いられる(Danks等, 上掲参照)。それらは、パラサイト感染の阻害に用いてもよい(van Pelt等, 上掲参照)。本発明のPRO873ポリペプチドをそれら又は他の用途に用いる方法は、当業者には容易に理解されるであろう。
【0376】
本発明のPRO940ポリペプチドは、CD33タンパク質及び/又はOB結合タンパク質−2に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO940ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO941ポリペプチドは、カドヘリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO941ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO944ポリペプチドは、CPE−Rタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO944ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。ウェルシュ菌エンテロトキシン(CPE)に結合する機能を持つ本発明のPRO944ポリペプチドは、CPEエンドトキシンによる感染の有効な治療に用途が見出される。
【0377】
本発明のPRO983ポリペプチドは、小胞関連膜タンパク質、VAP−33に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO983ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1057ポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1057ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1071ポリペプチドは、トロンボスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1071ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0378】
本発明のPRO1072ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1072ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1075ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1075ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のPRO181ポリペプチドは、コルニコンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO181ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0379】
本発明のPRO827ポリペプチドは、種々のインテグリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO827ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1114ポリペプチドは、タンパク質のサイトカインレセプターファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1114ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
上記に加えて、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両方で、インターフェロンリガンドへの結合能力が望まれる用途で用いられる。このような応用はこの分野の技術常識である。
本発明のPRO237ポリペプチドは、脱炭酸酵素タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO237ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0380】
本発明のPRO541ポリペプチドは、トリプシンインヒビタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO541ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO273ポリペプチドは、他のケモカインが競合的アッセイの実施に用いられるアッセイにおいて用いることができる。結果はしかるべく用いることができる。
本発明のPRO701ポリペプチドは、ニューロリジンファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO701ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO701は、ニューロンでのアッセイに用いることができ、それに対する活性をニューロリジン1、2及び3と比較することができる。結果はしかるべく適用できる。
【0381】
本発明のPRO704ポリペプチドは、小胞複合膜タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO704ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO704は、それが同一性を有するポリペプチドでアッセイでき、相対的活性を決定できる。結果はしかるべく適用できる。PRO704はエンドサイトーシス活性を測定するための活性についてタグ又は測定でき、それによりエンドサイトーシスに影響する薬剤をスクリーニングできる。
本発明のPRO706ポリペプチドは、内因性前立腺酸ホスファターゼ前駆体に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO706ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO706は、ヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ホスファターゼでのアッセイに使用でき、それらに対する活性をヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ヒスファターゼと比較する。結果はしかるべく適用できる。
【0382】
本発明のPRO707ポリペプチドは、カドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO707ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO707は、他のカドヘリン、特にカドヘリンFIB3に対するその活性を決定するアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO322ポリペプチドは、ニューロプシンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO322ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO322は、ニューロピリン、トリプシノーゲン、セリンプロテアーゼ及びニューロシンに対するその活性を決定するアッセイに使用でき、結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO526ポリペプチドは、タンパク質−タンパク質結合タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO526ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO526がそれに結合するか及びその結合により半減期が向上するかを決定する複合体を形成することが知られた成長因子及び他のタンパク質でアッセイを実施できる。結果はしかるべく用いられる。
【0383】
本発明のPRO531ポリペプチドは、プロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO531ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO531は、それらの相対的活性を決定するために、プロトカドヘリン3及び他のプロトカドヘリンに対するアッセイに用いることができる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO534ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO534ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO534は、相対的活性を決定するためにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO697ポリペプチドは、sFRPファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO697ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO697は、相対的活性を決定するためにsFRP及びSARPでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
【0384】
本発明のPRO731ポリペプチドは、任意のプロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO731ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO731は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO768ポリペプチドは、インテグリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO768ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO768は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO771ポリペプチドは、テスチカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO771ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO771は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0385】
本発明のPRO733ポリペプチドは、T1/ST2レセプターに結合するタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO733ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO733は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO162ポリペプチドは、膵臓関連タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO162ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO162は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO788ポリペプチドは、抗悪性腫瘍尿タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO788ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO788は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0386】
本発明のPRO1008ポリペプチドは、dkk−1に関連する生物学的活性を有しインビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1008ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1008は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1012ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1012ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
PRO1012は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1014ポリペプチドは、レダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1014ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1014は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。PRO1014の阻害剤が特に好ましい。結果はしかるべく適用できる。
【0387】
本発明のPRO1017ポリペプチドは、スルホトランスフェラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1017ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1017は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO474ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO474ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO474は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1031ポリペプチドは、IL−17に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1031ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1031は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0388】
本発明のPRO938ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO938ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1082ポリペプチドは、LDLレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1082ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1082は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。またPRO1082は、レセプターを変調させる候補薬剤を同定するアッセイに使用できる。
本発明のPRO1083ポリペプチドは、7TMレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1083ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
特にPRO1083は、PRO1083を制御又は変調させる、即ちレセプターに影響を与える候補薬剤を決定するアッセイに使用できる。
【0389】
ここで、VEGF−E分子は、細胞の生存、増殖及び/又は分化に関連する多くの治療的用途を有する。このような用途は、VEGF−Eがヒト臍静脈内皮細胞の生存を増大させる能力が示されたという観点から、臍静脈内皮細胞の治療を含む。治療は、静脈が損傷を受けた場合、又は例えば臍静脈の生存を促進するための人工的手段が用いられた状況、例えば、人工的マトリクスに基づいて又は人工的な環境においてにおいてそれが弱体化、疾患となっている状況で必要とされる。VEGF−Eの選択的分裂促進特性に基づいて向上されうる他の生理学的状態もここに含まれる。また、用途は、VEGF−Eが繊維芽細胞の増殖及び筋細胞肥大を誘発する能力が示されたという観点から、繊維芽細胞及び筋細胞の治療も含む。特に、VEGF−Eは創傷治癒、組織成長及び筋生成及び再生に使用できる。
上記した徴候のために、VEGF−E分子を製剤し、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、VEGF−Eの送達部位、投与方法、及び実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する形式で投与される。即ち、ここでの目的について、VEGF−Eの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び/又は分化を促進するのに十分な量である。
【0390】
天然VEGFに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性であるVEGF−Eアミノ酸変異体配列及び誘導体は、標準として、又は標識された場合には競合試薬としてについてのVEGF−Eについてのイムノアッセイに有用である。
VEGF−Eは、適当な純度を持つVEGF−Eを任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することにより貯蔵又は投与のために調製される。このような材料は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性である。VEGF−Eが水溶性である場合、それはクエン酸塩又は他の有機酸塩などのバッファー中に、好ましくは約7から8のpHで製剤される。VEGF−Eが水に一部しか溶解しない場合、それを0.04−0.05%(w/v)の量のTween、Pluronics又はPEG等の非イオン性界面活性剤、例えばTween80とともに製剤して溶解性を向上させ、マイクロエマルションとして調製してもよい。
場合によっては、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン;セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;及びマンニトール又はソルビトール等の糖といった他の成分を添加してもよい。
【0391】
治療投与に用いられるVEGF−Eは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)を通すことにより容易に達成される。VEGF−Eは通常は凍結乾燥形態又は熱的及び酸化的変性に対して安定性が高い場合には水溶液中に貯蔵される。VEGF−E製剤のpHは典型的には約6から8であるが、より高い又は低いpH値が適している場合もある。上記した或る種の賦形剤、担体又は安定化剤を用いることによりVEGF−Eの塩が形成されることは理解されるであろう。
VEGF−Eが非経口で用いられる場合、VEGF−Eを含有する治療用組成物は一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。
一般に、疾患が許すならば、VEGF−Eを部位特異的輸送のために製剤し投与すべきである。これは、創傷及び腫瘍の場合に便利である。
また、持続放出製剤を調製することもでき、マイクロカプセル粒子及びインプラント可能な物品の形成も含む。持続放出VEGF−E組成物を調製するために、VEGF−Eは好ましくは生分解性マトリクス又はマイクロカプセルに導入される。この目的に適した材料はポリアクチドであるが、ポリ−(a−ヒドロキシカルボン酸)のポリマー、例えばポリ−D−(−)−3−ヒドロキシブチル酸(EP 133,988A)を用いることもできる。他の生分解性ポリマーは、ポリ(ラクトン)、ポリ(オルトエステル)、又はポリ(オルトカーボネート)を含む。ここで最初に考慮するのは、担体自身又はその分解生成物が標的組織に非毒性であり、状態を悪化させないことである。これは、標的とする疾患の動物モデル、もしそのようなモデルが入手不能ならば正常な動物における日常的なスクリーニングによって決定できる。多数の科学出版物がそのような動物モデルを記録している。
【0392】
持続性放出組成物については、米国特許第3,773,919号、EP 58,481A、米国特許第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ国特許番号1176565、U. Sidman等, Biopolymers 22, 547 (1983)、及びR. Langer等, Chem. Tech. 12, 98[1982]を参照のこと。
局所適用する場合、VEGF−Eは好適には他の成分、例えば担体及び/又はアジュバントと組み合わされる。そのような他の成分の性質には、それらの意図している投与について製薬的に許容可能かつ有効であり、組成物の活性成分の活性を低下させないこと以外に制限はない。適当な媒体の例には、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液を含み、精製コラーゲンを含んでも含まなくてもよい。また、組成物は経皮パッチ、プラスター、及びバンドに、好ましくは液体又は半液体形態で含浸させてもよい。
【0393】
ゲル製剤を得るために、液体組成物に製剤したVEGF−Eを、有効量の水溶性多糖類又はポリエチレングリコールなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース;デンプン及び分別デンプン;寒天;アルギン酸及びアルギン酸塩;アラビアゴム;プルラン;アガロース;カラゲナン;デキストラン;デキストリン;フルクタン;インシュリン;マンナン;キシラン;アラビナン;キトサン;グリコーゲン;グルカン;及び合成バイオポリマー;並びにゴム、例えばキサンタンゴム;グアールゴム;イナゴマメゴム;アラビアゴム;トラガカントゴム;及びカラヤゴム;及びこれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が単純で、なおかつ緩すぎず粘りすぎず、そしてそこに保持されるVEGF−Eを不安定化させないものである。
好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定義され、精製され、米国特許に記載されたものであり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低及び高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量400−600のポリエチレングリコールと分子量1500のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
【0394】
多糖類及びポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物も含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換の程度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当たりに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当たりに少なくとも0.35のエーテル基というエーテル置換度が一般的には十分である。さらに、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばLi、Na、K、又はCs塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約2−5%、より好ましくは約3%を含み、VEGFはゲル1ml当たりに約300−1000mgの量で存在する。
【0395】
用いられる投与量は上記の要因に依存する。一般的な提案として、VEGF−Eは、組織において約0.1ng/ccより大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのVEGF−Eレベルを確立することのできる投与量で製剤され標的部位又は組織に輸送される。この細胞内濃度は、もし可能ならば、連続的吸入、持続放出、局所適用、又は経験的に決められる頻度での注射により維持されるべきである。
ここで、VEGF−E治療を、細胞増殖、生存、分化及び再生の促進において、VEGF−Eを含む任意の成長因子の活性を向上させるための他の新規な又は従来からの治療薬(例えば、VEGF、aFGF、bFGF、PDGF、IGF、NGF、タンパク同化ステロイド、EGF又はTGF−a等の成長因子)と組み合わせるのも範囲内である。これらの協働治療薬は、それ自体が本発明の組成物に含まれる必要はないが、それらの薬剤がタンパク質性であるのが便利である。そのような混合物は、VEGF−Eが単独で用いられるのと同様の方式及び同様の目的で適切に投与される。VEGF−Eのそれら二次的成長因子に対する有用なモル比は、典型的には1:0.1−10であり、およそ等モル量が好ましい。
【0396】
本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従って処方でき、それによりPROポリペプチドが製薬的に許容可能な担体媒体との混合物に混合される。好適な担体媒体及びその処方は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含むが、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Osol等編集に記載されており、その開示は参考としてここに取り入れる。ここで、VEGF−Eは、心臓血管疾患又は状態に罹った患者に非経口で投与してもよく、又は血流への有効形態での輸送を確実にする他の方法によってもよい。
本発明の実施に用いられるVEGF−Eの臨床投与に特に良く適した組成物は、例えば、無菌の水溶液、又は凍結乾燥タンパク質のような無菌の水和可能な粉末を含む。一般的に好ましいのは、製剤中に適量の、一般的には製剤を等張にするのに十分な量の製薬的に許容可能な塩をさらに含むことである。また、アルギニン塩基、及びリン酸などのpH調節剤は、典型的には適当なpH、一般的には5.5から7.5に維持するのに十分な量が含まれる。さらに、水性製剤の有効期間又は安定性を向上させるために、グリセロールなどの薬剤を更に含有するのも望ましい。このようにして、種々のt−PA製剤が非経口投与、特に静脈内投与に適したものとされる。
【0397】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬剤濃度は、特に意図される用途に応じて変化する。例えば、静脈深部の血栓症又は末梢血管疾患の治療においては、「ボーラス」投与が典型的には好ましく、それに続く投与は、およそ一定な血液レベル、好ましくは約3μg/mlのオーダーに維持するように与えられる。
しかしながら、吸入能力は一般に利用できない救急医療ケア設備に関連する用途では、横たわる疾患(例えば塞栓症、亀裂骨折)の一般的な緊急性のために、幾分多めの初期投与量、例えば静脈内ボーラスを与えるのが一般的に望ましい。
ここの化合物について述べた種々の徴候のために、VEGF−E分子は、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、輸送部位、投与方法、及び対応する分野の実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する方式で製剤され投与される。即ち、ここでの目的について、VEGF−Eの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び/又は分化を促進するのに十分な量である。一般的に、治療すべき治療的徴候の対象である組織において約0.1ng/cm3より大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのVEGF−Eレベルを確立することのできる投与量が採用される。組織内投与は、ここの化合物の或る種の治療的徴候のための選択肢であると考えられる。
【0398】
本発明のヒトTollタンパク質も、Toll媒介シグナル伝達に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに使用できる。例えば、PRO285及びPRO286は、ヒトTollレセプターの未だ知られていない天然リガンド、又はヒトTollレセプターを介する活性化及び/又はシグナル伝達に(直接又は間接的に)参加する他の因子、例えば潜在的Tollレセプター関連キナーゼなどを同定するのに有用である。さらに、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤(インヒビター)も同定できる。そのような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、結合性相互作用のペプチド又は小分子インヒビター又はアゴニストのスクリーニングにも使用できる。
スクリーニングアッセイは、天然Tollポリペプチド又は天然Tollポリペプチドのリガンドの生物学的活性に類似するリード化合物を見出すのに設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子薬剤候補の同定のために特に適したものにする。考えられる小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施され、それらはこの分野で良く特徴付けされている。
【0399】
インビトロアッセイは、Tollレセプターポリペプチドを含む成分の混合物を用いるが、それは他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出又は固着などのためのタグとの融合生成物の一部であってもよい。アッセイ混合物は、(結合アッセイのために)天然細胞内又は細胞外Toll結合標的(例えば、Tollリガンド、又はTollレセプターを介して活性化及び/又はシグナル伝達することが知られた他の分子)をさらに含有してよい。天然結合標的を用いてもよいが、そのような結合標的の一部(例えばペプチド)が、主題のTollタンパク質に対してアッセイで便利に測定可能な結合親和性及び結合活性を与える限り、その一部を用いるのが好ましい場合が多い。また、アッセイ混合物は、候補の薬理学的薬剤も含有する。候補薬剤は多くの化学的分類を含み、典型的には有機化合物、好ましくは小型有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られるものに渡る。種々の他の試薬、例えば、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物薬等も含有してよい。
インビトロ結合アッセイにおいて、得られた混合物は、候補分子の存在を別にすれば、Tollタンパク質が細胞結合標的、一部又は類似物に、参照結合親和性で特異的に結合する条件下でインキュベートする。混合物成分は、必要な結合を与える任意の順序で添加でき、インキュベーションは最適の結合を促進する温度で実施する。インキュベーション時間は、同様に最適な結合のために選択するが、迅速な高スループットスクリーニングを促進するために最短とする。
【0400】
インキュベーションの後、Tollタンパク質と一又は複数の結合標的との間の薬剤を介する結合が任意の便利な技術により検出される。細胞無しの結合型アッセイのために、分離工程は結合した成分を結合していない成分から分離するのにしばしば用いられる。分離は、沈殿(例えばTCA沈殿、免疫沈降など)、固定化(例えば、固体基体上)等、次いで洗浄、例えば、膜濾過(例えばWhatman’s P−18イオン交換紙、Polyfiltronic’s 疎水性GFC膜など)、ゲルクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過、親和性など)によってなされる。Toll依存性転写アッセイでは、結合はToll依存性リポーターの発言における変化により検出される。
検出は任意の従来法でなされる。細胞無し結合アッセイでは、成分の一つが通常は標識を含むか結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度としての直接検出、又はエピトープタグ、酵素などの間接的検出を与える。標識及び他のアッセイ成分の性質に応じて、例えば光学又は電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー移動等を通して、又は間接的に検出される抗体抱合などで、種々の標識検出方法が用いられる。
また、ここに開示したTollポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療に用いてもよい。遺伝子治療用途においては、遺伝子が細胞に導入され、例えば欠陥遺伝子を置換するために、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」とは、1回の治療で長期間の効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はRNAを1回又は繰り返し投与することを含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、或る種の遺伝子のインビボ発現を阻止するための治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入でき、それらの細胞膜による取り込みが少ないために生ずる細胞内低濃度にもかかわらず、そこでインヒビターとして作用することが既に示されている。(Zamnecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143−4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステルを非荷電基に置換することにより、それらの取り込みを促進するような修飾をすることができる。
【0401】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子導入技術は、ウィルス(典型的にはレトロウィルス)ベクター及びウィスル被覆リポソーム媒介形質移入を含む(Dzau等, Trends in in Biotechnology 11, 205−210 [1993])。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、即ち標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び/又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429−4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3410−3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808−813 (1992)を参照のこと。
ここにTollタンパク質に関連して列挙した種々の用途は、天然Tollレセプターの少なくとも1つの生物学的活性が類似している天然Tollレセプターのアゴニストにも利用可能である。
【0402】
ニューロトリミン並びに免疫グロブリンスーパーファミリーのIgLONサブファミリーの他のメンバーは、神経パターニング、分化、成熟及び成長に影響を与えることが同定された。その結果、PRO337というヒトニューロトリミン相同体ポリペプチドは、神経不全を特徴とする疾患において有用性を持つ。例えば、筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリグ病)、ベル麻痺、及び棘筋萎縮又は麻痺を含む種々の状態を含む運動神経疾患である。本発明のNGF変異体製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、感音難聴、及びメニエール病などのヒト神経変性疾患の治療に使用できる。さらにPRO337ポリペプチドは、特に上記の疾患に伴うもののような痴呆又は障害において学習を促進するための認識促進剤として使用できる。
さらに、PRO337ポリペプチドは神経障害、特に末梢神経障害の治療に用いられる。「末梢神経障害」は、末梢神経系に影響を与える疾患を指し、運動、感覚、運動感覚、又は自律神経の1つ又は複数の機能障害として現れることが多い。末梢神経障害によって現れる広範な形態は、各々が同様に多くの原因の一つによる。例えば、末梢神経障害は、遺伝子的に獲得され、全身性疾患によりもたらされ、又は毒性薬により誘発されることもある。例としては、これらに限られないが、糖尿病性末梢神経障害、遠位感覚運動神経障害、又は胃腸管の運動低下又は膀胱のアトニーなどの自律神経障害を含む。全身性疾患に伴う神経障害の例は、ポスト−ポリオ症候群又はAIDS関連神経障害を含み;遺伝性神経障害は、シャルコー‐マリー‐ツース病、レフサム病、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ‐ソッタ症候群を含み;毒性薬に誘発される神経障害の例は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、又は3’−アジド−3’−でオキシチミジンなどの化学治療薬での処理により生じるものを含む。同様に、ニューロトリミンアンタゴニストは、過剰なニューロン活性を特徴とする疾患において有用性を持つと予想される。
【0403】
エンドセリンは、不活性な中間体、ビッグエンドセリンから、亜鉛メタロプロテアーゼ、エンドセリン変換酵素(ECE)によって触媒される独特なプロセシング事象によって生成される。ECEは細菌クローニングされ、その構造が単一経路の膜貫通タンパク質であり、短い細胞内Nー末端及び長い細胞外C−末端を持ち、それが触媒ドメインと多数のN−グリコシル化部位を含むことが示された。ECEはTrp73及びVal74の間のエンドセリンプロペプチドを切断し、活性なペプチドであるETを生成し、それは循環ホルモンではなく局所的に作用することがわかった(Rubanyi, G.M. & Polokoff, M.A., Pharmachological Review 46: 325−415 (1994))。即ち、ECE活性はエンドセリン生成の調節の潜在的部位であり、エンドセリン系における治療的介入の可能な標的である。ECE活性を阻止することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグET−1の生理学的に活性な形態への変換を阻止することにより、ET−1の生成を停止することができる。
【0404】
ECE−2は、アミノ酸レベルでウシECE−2と64%同一である。ECE−2はECE−1(63%同一、80%保存)、、エンドペプチダーゼ24.11及びKell血液グループタンパク質と密接に関連している。ウシECE−2は、トランス−ゴルジネットワークに局在化したII型膜結合メタロプロテイナーゼであり、そこで内因性ビッグエンドセリン−1を活性エンドセリンに変換する細胞内酵素として作用する(Emoto, N. 及び Yanangisawa, M., J. Biol. Chem. 270: 15262−15268 (1995))。ウシECE−2mRNAの発現は、脳の一部、大脳皮質、小脳及び副腎髄質で最も高い。それは、子宮筋層(mymetrium)、精巣、卵巣、及び内皮細胞で低レベルで発現される。ウシECE−2及びECE−1はともに、基質としてET−2又はET−3よりもET−1に対して活性である、Emoto及びYanangisawa, 上掲。
ヒトECE−2は736アミノ酸長で、31残基アミノ末端尾部、23残基膜貫通へリックス、及び682カルボキシ末端ドメインを持つ。それはウシECE−2に94%同一であり、ヒトECE−1に64%同一である。予想される膜貫通ドメインは、ヒト及びウシECE−2タンパク質間及びヒトECE−1及びヒトECE−2間で高度に保存され、これは推定N−結合グリコシル化部位と同様であり、Cys残基は中性エンドペプチダーゼ24.11及びKell血液グループタンパク質及び推定亜鉛結合部位に保存されている。配列は、NEP−ECE−Kellファミリーの他の膜と同様に、ヒトECE−2はII型膜貫通亜鉛結合メタロプロテイナーゼをコードし、それは、ウシECE−2について知られているものから外挿することにより、細胞内生産されたビッグET−1を持つ分泌経路内に局在化した細胞内酵素であるが、分泌小胞にとどまることを示唆している。EmotoおよびYnangisawa, 上掲。
【0405】
ECE−2の発現パターンは、ECE−1で観察されたものとは異なる。mRNAレベルのノーザンブロット分析は、成人脳(小脳、被殻、髄質および側頭葉で最も高く、大脳皮質、後頭葉、および前頭葉で低い)、脊髄、肺および膵臓での3.3kb転写物の低レベル発現、および胎児脳および腎臓における高レベル4.5kbを示した。2つの転写物サイズは、おそらくウシECE−2(Emoto及びYanangisawa, 上掲)及びECE−1(Xu等, Cell 78: 473−485 (1994))で観察されたような代替的ポリアデニル化部位の使用を表している。cDNAライブラリに対するPCRは、胎児脳、胎児腎臓、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓、胎児肺及び成人膵臓は、全て陰性であった。
ペプチドのエンドセリン(ET)ファミリーは、潜在的な血管、心臓及び腎臓活性を有し、それは多くのヒト疾患状態において病理生理学的に重要である。ET−1は不活性212アミノ酸プレペプチドとして発現される。プレペプチドは、最初にArg52−Cys53及びArg92−Ala93において切断され、次いでカルボキシ末端Lys91及びArg92がタンパク質から削除されてプロペプチドビッグET−−1を生成する。ECEは、次いでTrp73及びVal74の間で切断され、活性なペプチドETを生じ、それは循環ホルモンではなく局所で機能することがわかった(Rubany及びPolokoff, Pharma. R. 46: 325−415 (1994))。
エンドセリンは、1)心臓血管疾患(血管痙攣、高血圧、心筋虚血;再灌流障害及び急性心筋梗塞、発作(大脳虚血)、うっ血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管狭窄);2)腎臓疾患(急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変);3)肺疾患(気管支喘息、肺高血圧症);4)胃腸疾患(胃潰瘍、炎症性腸疾患);5)生殖疾患(早産、月経困難症、子癇前症);及び6)発癌を含む多くの疾患の病理生理において役割を果たす。Rubany及びPolokoff, 上掲。
【0406】
疾患は、1)ET生産の増加;2)ETの反応性向上;及び/又は3)ETレセプター、アンタゴニスト、抗体又はECEインヒビターの有効性を試験することにより、それに対するETの衝撃について評価することができる。従前の基準に対する応答は、ETが、クモ膜下出血、高血圧(劇症/合併症)、急性腎不全及びうっ血性心臓疾患に続く大脳血管痙攣において役割を果たすと思われることを示唆している。ET生産又は活性のインヒビターは、冠状血管痙攣、急性心筋梗塞、及びアテローム性動脈硬化症のモデルで使用されていないが、それらは、上昇したETレベル及びETに対する向上した反応性を有している。ショック及び肺性の高血圧も、上昇したETレベルを示す(Rubany及びPolokoff, 上掲)。これらの状態におけるECEの阻害は治療的価値があると思われる。
ECE−2の発現パターンは、ECE−1で観察されたものとは異なる。ノーザンブロット分析によると、ECE−2は、成人脳、肺および膵臓では低レベルで、胎児脳および腎臓では高レベルで観察された(Fig8)。PCRは、さらなる組織:胎児肺、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓は陰性であった。類似の発現パターンはウシECE−2について報告されている(Emoto及びYanangisawa, 上掲)。それは脳組織(大脳皮質、小脳及び側頭葉)、子宮筋層及び精巣で発現され、卵巣では低レベルで、他の多くの組織では極めて低レベルである。ウシECE−1(Xu等, 上掲)は、より広く多く発現される。それは、殆どの器官の血管内皮細胞及び幾つかの実質細胞で観察される。脳での発現では、ECE−2mRNAはECE−1より低レベルで存在した。本出願人は、ECE−2が、クモ膜下出血及び発作に続く大脳血管痙攣などの疾患の治療的介入のための特に良好な標的であると信じる。
また、ここに開示された分子の使用は、下記に開示及び記載されている陽性機能アッセイヒットに基づいてよい。
【0407】
F.抗−PROポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗−PROポリペプチド抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
抗−PROポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0408】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗−PROポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59−103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【0409】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51−63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【0410】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【0411】
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrison等, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0412】
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−PROポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323−329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。
【0413】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323−327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534−1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991) ]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
【0414】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はPRO211、PRO228、PRO538、PRO172、又はPRO182に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537−539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655−3656 (1991)に開示されている。
【0415】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はトレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【0416】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab’−TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’−チオールに再転換し、他のFab’−TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab’断片を直接回収し、化学的に結合して二重特異性抗体を形成してもよい。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217−225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ErbB2レセプターを過剰発現している細胞及び正常なヒトT細胞に結合でき、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性をトリガーする。
【0417】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547−1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab’部分に結合された。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(sFv)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方法もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【0418】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるPROポリペプチド上の2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−PROポリペプチドアームは、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28又はB7)等の白血球上のトリガー分子、又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgGのFcレセプター(FcγR)に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のPROポリペプチド発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、細胞毒性薬を特定のPROポリペプチドを発現する細胞に局在化させるのに使用してもよい。これらの抗体は、PRO−結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、PROポリペプチドに結合し、さらに組織因子(TF)に結合する。
【0419】
5.ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【0420】
6.エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191−1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918−2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560−2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Fc領域を有し、よって増強された補体溶解及びADCC能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti−cancer Drug Design 3:219−230 (1989)を参照。
【0421】
7.免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性抱合)に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
【0422】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス−アジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6−ジイソシアネート等)、及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【0423】
8.免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体などは免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG−誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286−288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0424】
9.抗体の製薬組成物
ここで同定されるPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PROポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889−7893 (1993)を参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
【0425】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸及びγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−(D)−3−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【0426】
G.抗−PRO抗体の用途
本発明の抗−PRO抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−PRO抗体は、PROの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147−158]等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 144:945 (1962);David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗−PRO抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのPROのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、PROに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するPROを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したPRO以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、PROを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。【0427】
(実施例)
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【0428】
実施例1:新規なポリペプチド及びそれをコードするcDNAを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss−Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(必要ならな、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び独自に開発したデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムWU−BLAST−2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の6フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(全てではない)WU−BLAST−2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及びPROポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向(.f)及び逆方向(.r)PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるために設計される。プローブ(.p)配列は、典型的に40−55bp長である。或る場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、PCRプライマー対でのPCRによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適切なクローニングベクター(pRKB又はpRK5D等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【0429】
実施例2:アミラーゼスクリーニングによるcDNAクローンの単離
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを対象とするヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターpRK5DにおけるオリゴdTプライムしたcDNAの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAは1000bpを越えるサイズ分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dを、sp6転写開始部位、それに続くSfiI制限酵素部位、さらにXhiI/NotIcDNAクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
2.ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5’ 末端を優先的に表現するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上記の)一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST−AMY.0におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid system)からの試薬及びプロ値コールを用いたランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500−1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレーム単位で融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【0430】
3.形質転換及び検出
上記2パラグラフに記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔た。次いで、SOC培地(Life Technplogies、1ml)を添加し、この混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む20標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl−勾配を用いてDNAを単離した。精製DNAは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56−5A(ATCC−90785)であった。この株は以下の遺伝子型:MATアルファー、ura3−52、leu2−3、leu2−112、his3−11、his3−15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び/又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p、SSA1p−4p)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なYEPDブロス(500ml)中におよそ2x106細胞/ml(約OD600=0.1)に希釈し、1x107細胞/ml(約OD600=0.4−0.5)まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで5分間のSorval GS3 ローターのGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして50mlのファルコン管内で、Beckman GS−6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE(10ml, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのLi2OOCCH3)で続けて洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精子DNA(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換DNA(1μg, vol.< 10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl, 40%のポリエチレングリコール−4000, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLiOOCCH3, pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5−10秒間遠心分離し、デカント及びTE(500μl, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を1回の大規模反応で実施したが、しやくの量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208−210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体は30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176−179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red−120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD−Ura寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した(最終濃度50−100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD−Ura寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【0431】
4.PCR増幅によるDNAの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、96ウェルプレートにおいて無菌水(30μl)に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート(5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μlの10mM dNTP(Perkin Elmer−Cetus); 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるPCR反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド1の配列は:
5’− TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT −3’
(配列番号:324)
逆方向オリゴヌクレオチド2の配列は:
5’− CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT−3’
(配列番号:325)
次いで、PCRは以下の通り実施した:
下線を施した領域は、各々ADHプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターpSST−AMY.0からの307bp領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの5’ 末端の最初の18ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのPCR反応の全生成物は343bpであった。しかしながら、シグナル配列融合cDNAは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
PCRに続いて、反応のアリコート(5μl)を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス−ボレーと−EDTA(TBE)緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。400bpより大きな単一で強いPCR産物をもたらすクローンを、96Qiaquick PCR 清浄化カラム(Quagen Inc., Charsworth, CA)での精製の後にDNA配列によりさらに分析した。
【0432】
実施例3:ヒトPRO213をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA28735と命名される。DNA28735コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO213の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
一組のPCRプライマー(正及び逆方向)が合成された:
正方向PCRプライマー 5’−TGGAGCAGCAATATGCCAGCC−3’(配列番号:3)
逆方向PCRプライマー 5’−TTTTCCACTCCTGTCGGGTTGG−3’(配列番号:4)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つDNA28735配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGACACTTGCCAGTCAGATGTGGATGAATGCAGTGCTAGGAGGG−3’(配列番号:5)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO213遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO213の全長DNA配列[ここで、UNQ187(DNA30943−1163)と命名される](配列番号:1)及びPRO213の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ187(DNA30943−1163)の全核酸配列をFig1(配列番号:1)に示す。クローンUNQ187(DNA30943−1163)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置336−338に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1221−1223の停止コドンで終端する(Fig1)。予測されるポリペプチド前駆体は295アミノ酸長である(Fig2)。クローンUNQ187(DNA30943−1163)はATCCに寄託されている。
全長PRO213ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止特異的遺伝子6タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO213アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSMHC3W5A_6及びB48089 との間の有意な相同性を明らかにした。
【0433】
実施例4:ヒトPRO274をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36469と命名される。DNA36469コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO274の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ジェネンテクが所有するESTをコンセンサスす構築に用いた。ESTはFig5−7に示し、ここで各々DNA17873、DNA36157及びDNA28929と命名する。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(36469.f1) 5’−CTGATCCGGTTCTTGGTGCCCCTG−3’
(配列番号:11)
正方向PCRプライマー2(36469.f2) 5’−GCTCTGTCACTCACGCTC−3’
(配列番号:12)
正方向PCRプライマー3(36469.f3) 5’−TCATCTCTTCCCTCTCCC−3’
(配列番号:13)
正方向PCRプライマー4(36469.f4) 5’−CCTTCCGCCACGGAGTTC−3’
(配列番号:14)
逆方向PCRプライマー1(36469.r1) 5’−GGCAAAGTCCACTCCGATGATGTC−3’
(配列番号:15)
逆方向PCRプライマー2(36469.r2) 5’−GCCTGCTGTGGTCACAGGTCTCCG−3’
(配列番号:16)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36469配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(36469.p1)
5’−TCGGGGAGCAGGCCTTGAACCGGGGCATTGCTGCTGTCAAGGAGG−3’(配列番号:17)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO274遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO274の全長DNA配列[ここで、UNQ241(DNA39987−1184)と命名される](配列番号:1)及びPRO274の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ241(DNA39987−1184)の全核酸配列をFig3(配列番号:6)に示す。クローンUNQ241(DNA39987−1184)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置83−85に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1559−1561の停止コドンで終端する(Fig3)。予測されるポリペプチド前駆体は492アミノ酸長であり(Fig4)、約54,241ダルトンの見積もられた分子量及び約8.21の見積もられたpIを持つ。クローンUNQ241(DNA39987−1184)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209786が付与されている。
全長PRO274ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがFn54タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO274アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、MMFN54S2_1, MMFN54S1_1, CELF48C1_8, CEF38B7_6, PRP3_RAT, INL3_PIG, MTCY07A7_13, YNAX_KLEAE, A47234, 及びHME2_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0434】
実施例5:ヒトPRO300をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35930と命名される。DNA35930コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO300の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35930f1) 5’−GCCGCCTCATCTTCACGTTCTTCC−3’
(配列番号:20)
正方向PCRプライマー2(35930.f2) 5’−TCATCCAGCTGGTGCTGCTC−3’
(配列番号:21)
正方向PCRプライマー3(35930.f3) 5’−CTTCTTCCACTTCTGCCTGG−3’
(配列番号:22)
正方向PCRプライマー4(35930.f4) 5’−CCTGGGCAAAAATGCAAC−3’
(配列番号:23)
逆方向PCRプライマー1(35930.r1) 5’−CAGGAATGTAGAAGGCACCCACGG−3’
(配列番号:24)
逆方向PCRプライマー2(35930.r2) 5’−TGGCACAGATCTTCACCCACACGG−3’
(配列番号:25)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35930配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35930.p1)
5’−TGTCCATCATTATGCTGAGCCCGGGCGTGGAGAGTCAGCTCTACAAGCTG−3’
(配列番号:26)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO300遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO300の全長DNA配列[ここで、UNQ263(DNA40625−1189)と命名される](配列番号:18)及びPRO300の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ263(DNA40625−1189)の全核酸配列をFig8(配列番号:18に示す。クローンUNQ263(DNA40625−1189)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置45−47に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1416−1418の停止コドンで終端する(Fig8)。予測されるポリペプチド前駆体は457アミノ酸長である(Fig9)。クローンUNQ263(DNA40625−1189)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209788が付与されている。
全長PRO300ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がDiff33タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO300アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU49188_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0435】
実施例6:ヒトPRO284をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて2つのcDNA配列が単離され、これらを、ここにDNA12982(Fig12参照;ヒト胎盤由来)及びDNA15886(Fig13参照;ヒト唾液腺由来)と命名する。DNA12982及びDNA15886配列は、次いでクラスター形成して整列させ、ここにDNA18832と命名するコンセンサス核酸配列を生じさせた。
DNA18832コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)をスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(18832.est.f) 5’−TCGTACAGTTACGCTCTCCC−3’
(配列番号:31)
正方向PCRプライマー2(18832.f) 5’−CTTGAGGAGCGTCAGAAGCG−3’
(配列番号:32)
逆方向PCRプライマー(18832.r) 5’−ATAACGAATGAAGCCTCGTG−3’
(配列番号:33)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つDNA18832配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(18832.p)
5’−GCTAATATCTGTAAGACGGCAGCTACAGCAGGCATCATTG−3’(配列番号:34)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO284遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1022−1024の停止コドンで終端する(Fig10;配列番号:27)。予測されるポリペプチド前駆体は285アミノ酸長であり、約32,190の計算された分子量及び約9.03の見積もられたpIを有する。Fig11(配列番号:28)に示した全長PRO284の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸24のシグナルペプチド、約アミノ酸76〜約アミノ酸96及び約アミノ酸171〜約アミノ酸195の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸153〜約156の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ247(DNA23318−1211)は1998年4月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209787が付与されている。
全長PRO284ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO284アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、JQ0124,CELE04A4_5, AB006451_1, AF030162_1, IM23_YEAST, S71194, NIA_CUCMA, IM17_YEAST, I50479及びHUMZFHP_1との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0436】
実施例7:ヒトPRO296をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列は、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、肉腫関連タンパク質SASをコードする核酸配列と配列同一性を有することがわかった。このcDNA配列を、ここにDNA23020(Fig16参照)と命名する。DNA23020配列は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発したデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA35858と命名する。構築において2つの独自に開発したジェネンテクESTを用い、これらのEST配列を、ここでDNA21971(Fig17;配列番号:38)及びDNA29037(Fig18;配列番号:39)と命名する。
DNA35858コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ(LIB228)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−128(1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35858.f1) 5’−ACCCACGTCTGCGTTGCTGCC−3’
(配列番号:40)
正方向PCRプライマー2(35858.f2) 5’−GAGAATATGCTGGAGAGG−3’
(配列番号:41)
逆方向PCRプライマー(35858.r1) 5’−AGGAATGCACTAGGATTCGCGCGG−3’
(配列番号:42)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35858配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35858.p1)
5’−GGCCCCAAAGGCAAGGACAAAGCAGCTGTCAGGGAACCTCCGCCG−3’(配列番号:43)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO296遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置786−788の停止コドンで終端する(Fig14;配列番号:35)。予測されるポリペプチド前駆体は204アミノ酸長であり、約22,147の計算された分子量及び約8.37の見積もられたpIを有する。Fig15(配列番号:36)に示した全長PRO296の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸34のシグナルペプチド、約アミノ酸47〜約アミノ酸63、約アミノ酸72〜約アミノ酸95及び約アミノ酸162〜約アミノ酸182の膜貫通ドメイン。クローンUNQ260(DNA39979−1213)は1998年4月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209789が付与されている。
全長PRO296ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが肉腫−増幅SASタンパク質と有意な配列類似性を持ち、それによりPRO2296が新規なSAS類似物となりうることを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO296アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、I58391, GEN11061, SSC2B04_1, HSU81031_2, CD63_RAT, CD63_MOUSE, CD63_HUMAN, AF022813_1, CD63_RABIT及びCO02_HUMANとの間に有意な相同性があることを明らかにした。
【0437】
実施例8:ヒトPRO329をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35612と命名される。DNA35612コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO329の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35612f1) 5’−TGGGCTGTGTCCTCATGG−3’
(配列番号:46)
正方向PCRプライマー2(35612.f2) 5’−TTTCCAGCGCCAATTCTC−3’
(配列番号:47)
逆方向PCRプライマー1(35612.r1) 5’−AGTTCTTGGACTGTGATAGCCAC−3’
(配列番号:48)
逆方向PCRプライマー2(35612.r2) 5’−AAACTTGGTTGTCCTCAGTGGCTG−3’
(配列番号:49)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35612配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35612.p1)
5’−GTGAGGGACCTGTCTGCACTGAGGAGAGCAGCTGCCACACGGAGG−3’(配列番号:50)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO329遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB6)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO329の全長DNA配列[ここで、UNQ291(DNA40594−1233)と命名される](配列番号:44)及びPRO329の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ291(DNA40594−1233)の全核酸配列をFig19(配列番号:44)に示す。クローンUNQ291(DNA40594−1233)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置9−11に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1086−1088の停止コドンで終端する(Fig19)。予測されるポリペプチド前駆体は359アミノ酸長である(Fig20)。Fig20に示した全長PRO329タンパク質は、約38,899の分子量及び約5.21のpIを有する。クローンUNQ291(DNA40594−1233)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209617が付与されている。
全長PRO329ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが高親和性免疫グロブリンFcレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO329アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、FCG1_HUMAN, FCG0_HUMAN, P_R91439, P_R22549, P_R91438, P_W00859, P_R20811, P_R25550, HUMCD6406_1及びFCG1_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0438】
実施例9:ヒトPRO362をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42257と命名される。DNA42257コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO362の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(42257.f1) 5’−TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG−3’
(配列番号:53)
正方向PCRプライマー2(42257.f2) 5’−GTCGGAAGACATCCCAACAAG−3’
(配列番号:54)
逆方向PCRプライマー1(42257.r1) 5’−CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC−3’
(配列番号:55)
逆方向PCRプライマー2(42257.r2) 5’−AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC−3’
(配列番号:56)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42257配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(42257.p1)
5’−TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT−3’(配列番号:57)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO362遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO362の全長DNA配列[ここで、UNQ317(DNA45416−1251)と命名される](配列番号:51)及びPRO362の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ317(DNA45416−1251)の全核酸配列をFig21(配列番号:51)に示す。クローンUNQ317(DNA45416−1251)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1082−1084の停止コドンで終端する(Fig21)。予測されるポリペプチド前駆体は321アミノ酸長である(Fig22)。Fig2に示した全長PRO362タンパク質は、約35,544の分子量及び約8.51のpIを有する。Fig22に示すように、全長PRO362ポリペプチドの分析は、およそアミノ酸149からおよそアミノ酸152におけるグリコサミノグリカン結合部位及び約アミノ酸276〜約アミノ酸306の膜貫通ドメインの存在を明らかにした。クローンUNQ317(DNA45416−1251)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209620が付与されている。
全長PRO362ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがA33抗原タンパク質及びHCARタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO362アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB002341_1, HSU55258_1, HSC7NRCAM_1, RNU81037_1, A33_HUMAN, P_W14158, NMNCAMRI_1, HSTITINN2_1, S71824_1及びHSU63041_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0439】
実施例10:ヒトPRO363をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42828と命名される。DNA42828コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO363の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(42828.f1) 5’−CCAGTGCACAGCAGGCAACGAAGC−3’
(配列番号:60)
逆方向PCRプライマー(42828.r1) 5’−ACTAGGCTGTATGCCTGGGTGGGC−3’
(配列番号:61)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42828配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(42828.p1)
5’−GTATGTACAAAGCATCGGCATGGTTGCAGGAGCAGTGACAGGC−3’(配列番号:62)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO363遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO363の全長DNA配列[ここで、UNQ318(DNA45419−1252)と命名される](配列番号:58)及びPRO363の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ318(DNA45419−1252)の全核酸配列をFig23(配列番号:58)に示す。クローンUNQ318(DNA45419−1252)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置190−192に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1309−1311の停止コドンで終端する(Fig23)。予測されるポリペプチド前駆体は373アミノ酸長である(Fig24)。Fig24に示した全長PRO363タンパク質は、約41.281の分子量及び約8.33のpIを有する。Fig24(配列番号:59)に示したアミノ酸配列のアミノ酸221〜254に膜貫通ドメインが存在する。またPRO363ポリペプチドは、約アミノ酸15〜56及び約アミノ酸87〜116に少なくとも2つのミエリンP0タンパク質ドメインを有する。クローンUNQ318(DNA45419−1252)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209616が付与されている。
全長PRO363ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが細胞表面タンパク質HCARと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO363が新規なHCAR相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO363アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HS46KDA_1, HSU90716_1, MMCARH_1, MMCARHOM_1, A33_HUMAN, P_W14146, P_W14158, A42632,及びB42632との間の有意な相同性を明らかにした。
【0440】
実施例11:ヒトPRO868をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38133と命名される。DNA38133コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO868の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(38133.f1) 5’−GTAGCAGTGCACATGGGGTGTTGG−3’
(配列番号:65)
逆方向PCRプライマー(38133.r1) 5’−ACCGCACATCCTCAGTCTCTGTCC−3’
(配列番号:66)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38133配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(38133.p1)
5’−ACGATGATCGCGGGCTCCCTTCTCCTGCTTGGATTCCTTAGCACCACCAC−3’
(配列番号:67)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO868遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO868の全長DNA配列[ここで、UNQ437(DNA52594−1270)と命名される](配列番号:63)及びPRO868の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ437(DNA52594−1270)の全核酸配列をFig25(配列番号:63)に示す。クローンUNQ437(DNA52594−1270)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置325−327に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2290−2292の停止コドンで終端する(Fig25)。予測されるポリペプチド前駆体は655アミノ酸長である(Fig26)。Fig26に示した全長PRO868タンパク質は、約71,845の分子量及び約8.22のpIを有する。全長PRO868ポリペプチド配列の分析は、Fig26(配列番号:3)に示した配列の約アミノ酸66〜約アミノ酸78及び約アミノ酸123〜約アミノ酸134の保存されたシステイン含有ドメイン、約アミノ酸85〜薬アミノ酸110のTNFR死亡ドメイン、約アミノ酸159〜約アミノ酸175のFASA_マウス死亡ドメイン及び約アミノ酸347〜約アミノ酸375の膜貫通ドメインの存在を示している。クローンUNQ437(DNA52594−1270)は、1998年3月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209679が付与されている。
全長PRO868ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが腫瘍壊死因子レセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO868が腫瘍壊死因子ファミリーの新規なメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO868アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、RNU94330_1, P_R99933, P_R99945, P_R99950, HSU94332_1, CD40_HUMAN, S63368_1, TNR2_HUMAN, MVU87844_1及びCVU87837_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0441】
実施例12:ヒトPRO382をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30892と命名される。DNA30892コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO382の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGACATCGCCCTTATGAAGCTGGC−3’(配列番号:70)
逆方向PCRプライマー 5’−TACACGTCCCTGTGGTTGCAGATC−3’(配列番号:71)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30892配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGTTCAATGCAGAAATGATCCAGCCTGTGTGCCTGCCCAACTCTGAAGAG−3’(配列番号:72)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO382遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO382の全長DNA配列[ここで、UNQ323(DNA45234−1277)と命名される](配列番号:68)及びPRO382の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ323(DNA45234−1277)の全核酸配列をFig27(配列番号:68)に示す。クローンUNQ323(DNA45234−1277)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置126−128に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1485−1487の停止コドンで終端する(Fig27)。予測されるポリペプチド前駆体は453アミノ酸長である(Fig28)。Fig28に示した全長PRO382タンパク質は、約49,334の分子量及び約6.32のpIを有する。Fig28(配列番号:69)に示した全長PRO382ポリペプチド配列の分析は、約アミノ酸240〜約アミノ酸284の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸1〜約アミノ酸20の推定シグナルペプチド、約アミノ酸386〜約アミノ酸419の推定アップルドメイン、約アミノ酸394〜約アミノ酸406の推定クリングル(Krngle)ドメイン及び約アミノ酸253〜約アミノ酸258のヒスチジン含有プロテアーゼ活性部位の存在を示している。クローンUNQ323(DNA45234−1277)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209654が付与されている。
全長PRO382ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがセリンプロテアーゼタンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO382が新規なセリンプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO382アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU75329_1, ENTK_MOUSE, HEPS_HUMAN, AF030065_1, HEPS_RAT, PLMN_PIG, P_R89430, P_R89435, PLMN_HORSE, PLMN_BOVIN及びP_R83959との間の有意な相同性を明らかにした。
【0442】
実施例13:ヒトPRO545をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44706と命名される。ジェネンテクが独自に開発したESTをコンセンサス構築に用い、ここにDNA13217(Fig31;配列番号:75)と命名する。DNA44706コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO545の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GTCTCAGCACGTGTTCTGGTCTCAGGG−3’
(配列番号:76)
正方向PCRプライマー2 5’−CATGAGCATGTGCACGGC−3’ (配列番号:77)
正方向PCRプライマー3 5’−TACCTGCACGATGGGCAC−3’ (配列番号:78)
正方向PCRプライマー4 5’−CACTGGGCACCTCCCTTC−3’ (配列番号:79)
逆方向PCRプライマー1 5’−CTCCAGGCTGGTCTCCAAGTCCTTCC−3’
(配列番号:80)
逆方向PCRプライマー2 5’−TCCCTGTTGGACTCTGCAGCTTCC−3’(配列番号:81)
逆方向PCRプライマー3 5’−CTTCGCTGGGAAGAGTTTG−3’(配列番号:82)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44706配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGCAACCAACAGATACAAACTCTTCCCAGCGAAGAAGCTGAAAAGCGTC−3’(配列番号:83)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO545遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎盤組織(LIB90)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO545の全長DNA配列[ここで、UNQ346(DNA49624−1279)と命名される](配列番号:73)及びPRO545の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ346(DNA49624−1279)の全核酸配列をFig29(配列番号:73)に示す。クローンUNQ346(DNA49624−1279)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置311−313に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2516−2518の停止コドンで終端する(Fig29)。予測されるポリペプチド前駆体は753アミノ酸長である(Fig30)。Fig30に示した全長PRO545タンパク質は、約80,177ダルトンの見積もり分子量及び約7.08のpIを有する。PRO545アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸1−28に相当するシグナルペプチド、およそアミノ酸111−114、アミノ酸146−149、アミノ酸348−351、アミノ酸449−452、及びアミノ酸648−651に相当する5つの潜在的N−−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸344−353の中性亜鉛メタロペプチダーゼ、亜鉛結合領域シグネーチャー配列を含む。クローンUNQ346(DNA49624−1279)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209655が付与されている。
【0443】
実施例14:ヒトPRO617をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42798と命名される。DNA42798配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO617の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACGGGCACACTGGATCCCAAATG−3’(配列番号:86)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTAGAGATGTAGAAGGGCAAGCAAGACC−3’
(配列番号:87)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42798配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCTCCCTACCCGTGCAGGTTTCTTCATTTGTTCCTTTAACCAGTATGCCG−3’(配列番号:88)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO617遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO617の全長DNA配列[ここで、UNQ353(DNA48309−1280)と命名される](配列番号:1)及びPRO617の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ353(DNA48309−1280)の全核酸配列をFig32(配列番号:84)に示す。クローンUNQ353(DNA48309−1280)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置723−725に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置924−926の停止コドンで終端する(Fig32)。予測されるポリペプチド前駆体は67アミノ酸長である(Fig33)。Fig33に示した全長PRO617タンパク質は、約6,981ダルトンの分子量及び約7.47のpIを有する。また、PRO617アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸15〜約アミノ酸27の推定シグナルペプチド及び約アミノ酸41〜約アミノ酸43の推定タンパク質キナーゼCリン酸化部位の存在を明示している。クローンUNQ353(DNA48309−1280)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209656が付与されている。
全長PRO617ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD24タンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO617が新規なCD24相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO617アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CD24_HUMAN, CD24_MOUSE, S15785, CD24_RAT, VGE BPG4, MSE5_HUMAN, HSMHC3W36A_2, MLU15184_8, P R85075, SEPL_HUMAN及びMTCY63_13との間の有意な相同性を明らかにした。
【0444】
実施例15:ヒトPRO700をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30837と命名される。DNA30837配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO700の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−ATGTTCTTCGCGCCCTGGTG−3’(配列番号:91)
正方向PCRプライマー2 5’−CCAAGCCAACACACTCTACAG−3’(配列番号:92)
逆方向PCRプライマー1 5’−AAGTGGTCGCCTTGTGCAACGTGC−3’(配列番号:93)
逆方向PCRプライマー2 5’−GGTCAAAGGGGATATATCGCCAC−3’(配列番号:94)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30837配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCATGGAAGATGCCAAAGTCTATGTGGCTAAAGTGGACTGCACGGCCCA−3’(配列番号:95)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO700遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO700の全長DNA配列[ここで、UNQ364(DNA46776−1284)と命名される](配列番号:89)及びPRO700の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ364(DNA46776−1284)の全核酸配列をFig34(配列番号:89)に示す。クローンUNQ364(DNA46776−1284)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置33−35に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1329−1331の停止コドンで終端する(Fig34)。予測されるポリペプチド前駆体は432アミノ酸長である(Fig35)。Fig35に示した全長PRO700タンパク質は、約47,629ダルトンの見積もり分子量及び約5.90のpIを有する。PRO700のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸1〜33に相当するシグナルペプチド、アミノ酸約82−99、210−255及び345−360に相当するジスルフィドイソメラーゼに相同な領域、アミノ酸約143−151に相当するチロシンキナーゼリン酸化部位、アミノ酸約429−432に相当する小胞体標的化配列を含む。クローンUNQ364(DNA46776−1284)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209721が付与されている。
【0445】
実施例16:ヒトPRO702をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36623と命名される。DNA36623コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO702の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(36623.f1) 5’−CGCTGACTATGTTGCCAAGAGTGG−3’
(配列番号:98)
逆方向PCRプライマー(36623.r1) 5’−GATGATGGAGGCTCCATACCTCAG−3’
(配列番号:99)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36623配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(36623.p1)
5’−GTGTTCATTGGCGTGAATGACCTTGAAAGGGAGGGACAGTACATGTTCAC−3’
(配列番号:100)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO702遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO702の全長DNA配列[ここで、UNQ366(DNA50980−1286)と命名される](配列番号:96)及びPRO702の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ366(DNA50980−1286)の全核酸配列をFig36(配列番号:96)に示す。クローンUNQ366(DNA50980−1286)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置22−24に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置853−855の停止コドンで終端する(Fig36)。予測されるポリペプチド前駆体は277アミノ酸長である(Fig37)。Fig37に示した全長PRO702タンパク質は、約30,645ダルトンの見積もり分子量及び約7.47のpIを有する。また、PRO702アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸25の推定シグナルペプチド、約アミノ酸230〜約アミノ酸233及び約アミノ酸258〜約アミノ酸261の潜在的N−グリコシル化部位、及び約アミノ酸248〜約アミノ酸270のC型レクチンドメインシグネーチャー配列の存在を明示している。クローンUNQ366(DNA50980−1286)は、1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209717が付与されている。
全長PRO702ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコングルチニンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO702が新規なコングルチニン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO702アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S32436, P_R75642, P_W18780, P_W18781, A53330, AC002528_1, HSPPA2IC0_1, CA21_HUMAN, CA14_HUMAN及びA61262との間の有意な相同性を明らかにした。
【0446】
実施例17:ヒトPRO703をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43047と命名される。DNA43047コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO703の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GAGAGCCATGGGGCTCCACCTG−3’(配列番号:103)
逆方向PCRプライマー1 5’−GGAGAATGTGGCCACAAC−3’(配列番号:104)
逆方向PCRプライマー2 5’−GCCCTGGCACAGTGACTCCATAGACG−3’
(配列番号:105)
逆方向PCRプライマー3 5’−ATCCACTTCAGCGGACAC−3’(配列番号:106)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAGTGCCAGGATACCTCTCTTCCCCCCAGAGCATAACAGACACG−3’(配列番号:107)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO703遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO703の全長DNA配列[ここで、UNQ367(DNA50913−1287)と命名される](配列番号:101)及びPRO703の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ367(DNA50913−1287)の全核酸配列をFig38(配列番号:101)に示す。クローンUNQ367(DNA50913−1287)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置115−117に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2305−2307の停止コドンで終端する(Fig38)。予測されるポリペプチド前駆体は730アミノ酸長である(Fig39)。Fig39に示した全長PRO703タンパク質は、約78,644ダルトンの見積もり分子量及び約7.65のpIを有する。PRO703アミノ酸配列の重要な領域は、シグナル配列、cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、CUBドメインタンパク質モチーフ、N−グリコシル化部位及び推定AMP−結合ドメインシグネーチャーを含む。クローンUNQ367(DNA50913−1287)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209716が付与されている。
【0447】
実施例18:ヒトPRO705をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43437と命名される。DNA43437コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO705の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AAGCGTGACAGCGGGCACGTC−3’(配列番号:110)
逆方向PCRプライマー 5’−TGCACAGTCTCTGCAGTGCCCAGG−3’(配列番号:111)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43437配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(43437.p1)
5’−GAATGCTGGAACGGGCACAGCAAAGCCAGATACTTGCCTG−3’(配列番号:112)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO705遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO705の全長DNA配列[ここで、UNQ369(DNA50914−1289)と命名される](配列番号:108)及びPRO705の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ369(DNA50914−1289)の全核酸配列をFig40(配列番号:108)に示す。クローンUNQ369(DNA50914−1289)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置556−568に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2231−2233の停止コドンで終端する(Fig40)。予測されるポリペプチド前駆体は555アミノ酸長である(Fig41)。Fig41に示した全長PRO705タンパク質は、約62,736ダルトンの見積もり分子量及び約5.36のpIを有する。Fig41に示した全長PRO705配列の分析は、以下のものの存在を明示した:約アミノ酸1〜約アミノ酸23に対応するシグナルペプチド、約アミノ酸418〜約アミノ酸436の真核生物DNAトポイソメラーゼI活性部位、及び約アミノ酸237〜約アミノ酸279、約アミノ酸421〜約アミノ酸458、約アミノ酸53〜約アミノ酸74、約アミノ酸466〜約アミノ酸504、約アミノ酸308〜約アミノ酸355、約アミノ酸104〜約アミノ酸156、及び約アミノ酸379〜約アミノ酸410の種々のグリピカンタンパク質に相同な種々の領域。クローンUNQ369(DNA50914−1289)は、1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209722が付与されている。
全長PRO705ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがK−グリピカンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO705が新規なグリピカンタンパク質のメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO705アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、GPCK_MOUSE, GLYP_CHICK, GLYP_RAT, GLYP_HUMAN, GPC2_RAT, GPC5_HUMAN, GPC3_HUMAN, GPC3_RAT, P_R30168及びCEC03H12_2との間の有意な相同性を明らかにした。
【0448】
実施例19:ヒトPRO708をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34024と命名される。DNA34024コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO708の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCAACCCAACTGTTTACCTCTGG−3’(配列番号:115)
逆方向PCRプライマー 5’−CTCTCTGAGTGTACATCTGTGTGG−3’(配列番号:116)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34024配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCACCCTACCTCAGAAACTGAAGGAGGTTGGNTATTCAACGCATATGGTCGG−3’
(配列番号:117)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO708遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO708の全長DNA配列[ここで、UNQ372(DNA48296−1292)と命名される](配列番号:113)及びPRO708の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ372(DNA48296−1292)の全核酸配列をFig42A−B(配列番号:113)に示す。クローンUNQ372(DNA48296−1292)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置891−893に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2436−2438の停止コドンで終端する(Fig42A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は515アミノ酸長である(Fig43)。Fig43に示した全長PRO708タンパク質は、約56,885ダルトンの見積もり分子量及び約6.49のpIを有する。Fig43に示した全長PRO708アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸37の推定シグナルペプチド、約アミノ酸120〜約アミノ酸132及び約アミノ酸168〜約アミノ酸177の推定スルファターゼシグネーチャー配列、約アミノ酸163〜約アミノ酸169の推定チロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸157〜約アミノ酸160、約アミノ酸306〜約アミノ酸309、及び約アミノ酸318〜約アミノ酸321の推定N−グリコシル化部位の存在を実証している。クローンUNQ372(DNA48296−1292)は、1998年3月11日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209668が付与されている。
全長PRO708ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがアリールスルファターゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO708が新規なアリールスルファターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO708アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、ARSB_HUMAN, CELC54D2_2, G02857, STS_HUMAN, I37186, I37187, GEN12648, CELD1014_7, GA6S_HUMAN及びSPHM_HUMANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0449】
実施例20:ヒトPRO320をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA28739と命名される。DNA28739コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO320の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTCAGTGGCCACATGCTCATG−3’(配列番号:120)
逆方向PCRプライマー 5’−GGCTGCACGTATGGCTATCCATAG−3’(配列番号:121)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA28739配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GATAAACTGTCAGTACAGCTGTGAAGACACAGAAGAAGGGCCACAGTGCC−3’(配列番号:122)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO320遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB25)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO320の全長DNA配列[ここで、UNQ281(DNA32284−1307)と命名される](配列番号:118)及びPRO320の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ281(DNA32284−1307)の全核酸配列をFig44(配列番号:118)に示す。クローンUNQ281(DNA32284−1307)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置135−137に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1149−1151の停止コドンで終端する(Fig44)。予測されるポリペプチド前駆体は338アミノ酸長である(Fig45)。Fig45に示した全長PRO320タンパク質は、約37,143ダルトンの見積もり分子量及び約8.92のpIを有する。PRO320アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸1−21に相当するシグナルペプチド、アミノ酸80−91に相当するEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャー、各々アミノ酸103−124、230−151及び185−206に相当する3つのカルシウム結合EGF様ドメインを含む。クローンUNQ281(DNA32284−1307)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209670が付与されている。
【0450】
実施例21:ヒトPRO324をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34347と命名される。DNA34347コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO324の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GCAATGAACTGGGAGCTGC−3’ (配列番号:125)
正方向PCRプライマー2 5’−CTGTGAATAGCATCCTGGG−3’ (配列番号:126)
正方向PCRプライマー3 5’−CTTTTCAAGCCACTGGAGGG−3’(配列番号:127)
逆方向PCRプライマー1 5’−CTGTAGACATCCAAGCTGGTATCC−3’
(配列番号:128)
逆方向PCRプライマー2 5’−AAGAGTCTGCATCCACACCACTC−3’(配列番号:129)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34347配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ACCTGACGCTACTATGGGCCGAGTGGCAGGGACGACGCCCAGAATG−3’(配列番号:130)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO324遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB6)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO324の全長DNA配列[ここで、UNQ285(DNA36343−1310)と命名される](配列番号:123)及びPRO324の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ285(DNA36343−1310)の全核酸配列をFig46(配列番号:123)に示す。クローンUNQ285(DNA36343−1310)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置144−146に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1011−1013の停止コドンで終端する(Fig46)。予測されるポリペプチド前駆体は289アミノ酸長である(Fig47)。Fig47に示した全長PRO324タンパク質は、約32,268ダルトンの見積もり分子量及び約9.21のpIを有する。Fig47(配列番号:124)に示した全長PRO324アミノ酸配列の分析は以下のものの存在を実証している:約アミノ酸1〜約アミノ酸31のシグナルペプチド、約アミノ酸136〜約アミノ酸157の膜貫通ドメイン、約アミノ酸106又は約アミノ酸107〜約アミノ酸113のチロシンキナーゼリン酸化部位、約アミノ酸80〜約アミノ酸90、約アミノ酸131〜約アミノ酸168、約アミノ酸1〜約アミノ酸13、及び約アミノ酸176〜約アミノ酸185の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ領域に相同な領域。クローンUNQ285(DNA36343−1310)は、1998年3月30日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209718が付与されている。
全長PRO324ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがオキシドレダクターゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO324が新規なオキシドレダクターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO324アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、B61209, A69965, YQJQ_BACSU, D69930, S76124, FABG_ECOLI, C70023, S77280, FABG_VIBHA,及びMTV013_6との間の有意な相同性を明らかにした。
【0451】
実施例22:ヒトPRO351をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35950と命名される。DNA35950コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO351の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTGTGCTGTGCCTCGAGCCTGAC−3’(配列番号:133)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGGGCAGCAGTTAGCACCGCCTC−3’(配列番号:134)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35950配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGCTGGCATCATCAGCTTTGCATCAAGCTGTGCCCAGGAGGACGC−3’(配列番号:135)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO351遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB230)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO351の全長DNA配列[ここで、UNQ308(DNA40571−1315)と命名される](配列番号:131)及びPRO351の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ308(DNA40571−1315)の全核酸配列をFig48(配列番号:131)に示す。クローンUNQ308(DNA40571−1315)は、2つのオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置189−191に見かけの翻訳開始部位を持ち、第2のオープンリーディングフレームはヌクレオチド470で開始され、2つのオープンリーディングフレームは、各々ヌクレオチド位置363−365及び2009−2011の停止コドンで終端する(Fig48)。予測されるポリペプチド前駆体は571アミノ酸長である(Fig49)。PRO351のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、トリプシンファミリーのセリンプロテアーゼと配列類似性を持つ領域、2つのN−グリコシル化部位、及びクリングルドメインを含む。クローンUNQ308(DNA40571−1315)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209784が付与されている。
【0452】
実施例23:ヒトPRO352をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36950と命名される。DNA36950コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO352の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CTGGCACAGCTCAACCTCATCTGG−3’
(配列番号:138)
正方向PCRプライマー2 5’−GCTGTCTGTCTGTCTCATTG−3’(配列番号:139)
正方向PCRプライマー3 5’−GGACACAGTATACTGACCAC−3’(配列番号:140)
逆方向PCRプライマー1 5’−TGCGAACCAGGCAGCTGTAAGTGC−3’
(配列番号:141)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGGAAGAAGAGGGTGGTGATGTGG−3’
(配列番号:142)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36950配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCTGACAGACACCAAACAGCTGGTGCACAGTTTCACCGAAGGC−3’ (配列番号:143)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO352遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO352の全長DNA配列[ここで、UNQ309(DNA41386−1316)と命名される](配列番号:136)及びPRO352の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ309(DNA41386−1316)の全核酸配列をFig50(配列番号:136)に示す。クローンUNQ309(DNA41386−1316)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置152−154に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1100−1102の停止コドンで終端する(Fig50)。予測されるポリペプチド前駆体は316アミノ酸長である(Fig51)。Fig2に示した全長PRO352タンパク質は、約4.62の見積もられたpIを有する。全長PRO352配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸28のシグナルペプチド、約アミノ酸251〜約アミノ酸270の膜貫通ドメイン、約アミノ酸91〜約アミノ酸94、約104〜約アミノ酸107、約アミノ酸189〜約アミノ酸192及びアミノ酸215〜約アミノ酸218のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸217〜約アミノ酸234の免疫グロブリン及びMHCに相同性を有する領域の存在を実証している。クローンUNQ309(DNA41386−1316)は、1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209703が付与されている。
全長PRO352ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがブチロフィリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO352が新規なブチロフィリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO352アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、BUTY_HUMAN, HSB73_1, GGCD80_1, I46690, A33_HUMAN, P_R67988, CD86_MOUSE, P_R71360, B39371, 及びD50558_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0453】
実施例24:ヒトPRO381をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39651と命名される。DNA39651コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO381の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTTCCTTGCTTCAGCAACATGAGGC−3’
(配列番号:146)
逆方向PCRプライマー 5’−GCCCAGAGCAGGAGGAATGATGAGC−3’(配列番号:147)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39651配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGAACGCGGTCTTGACTCTGTTCGTCACTTCTTTGATTGGGGCTTTG−3’(配列番号:148)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO381遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO381の全長DNA配列[ここで、UNQ322(DNA44194−1317)と命名される](配列番号:144)及びPRO381の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ322(DNA44194−1317)の全核酸配列をFig52(配列番号:144)に示す。クローンUNQ322(DNA44194−1317)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置807−809の停止コドンで終端する(Fig52)。予測されるポリペプチド前駆体は211アミノ酸長である(Fig53)。Fig53に示した全長PRO381タンパク質は、約24,172ダルトンの見積もり分子量及び約5.99のpIを有する。Fig53(配列番号:145)に示した全長PRO381ポリペプチドの分析は、以下のものの存在を実証した:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸176〜約アミノ酸179の潜在的N−グリコシル化部位、膜貫通ドメイン、約アミノ酸143〜約アミノ酸146、約156〜約アミノ酸159、約アミノ酸178〜約アミノ酸181及びアミノ酸200〜約アミノ酸203の潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位、約アミノ酸78〜約アミノ酸114及び約アミノ酸118〜約アミノ酸131のFKBP−型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ部位、約アミノ酸191〜約アミノ酸203、約アミノ酸184〜約アミノ酸203及び約アミノ酸140〜約アミノ酸159のEF−腕カルシウム結合ドメイン、及び約アミノ酸183〜約アミノ酸203のS−100/ICaBP型カルシウム結合ドメイン。クローンUNQ322(DNA44194−1317)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209808が付与されている。
全長PRO381ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがFKBP免疫グロブリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO381が新規なFKBP免疫グロブリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO381アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF40252_1, I49669, P_R93551, S71238, CEL05C8_1, CEU27353_1, MIP_TRYCR, CEZC455_3, FKB4_HUMAN及びI40718との間の有意な相同性を明らかにした。
【0454】
実施例25:ヒトPRO386をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40674と命名される。2つのジェネンテクが独自に開発したEST配列をコンセンサス構築に使用し、これらEST配列は、ここにDNA23350(Fig56;配列番号:151)及びDNA23536(Fig57;配列番号:152)と命名する。DNA40674コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO386の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACGGAGCATGGAGGTCCACAGTAC−3’(配列番号:153)
逆方向PCRプライマー 5’−GCACGTTTCTCAGCATCACCGAC−3’(配列番号:154)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40674配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGCCTGCCCTGCACCTTCAACTCCTGCTACACAGTGAACCACAAACAGTT−3’
(配列番号:155)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO386遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO386の全長DNA配列[ここで、UNQ326(DNA45415−1318)と命名される](配列番号:149)及びPRO386の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ326(DNA45415−1318)の全核酸配列をFig54(配列番号:149)に示す。クローンUNQ326(DNA45415−1318)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置146−148に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置791−793の停止コドンで終端する(Fig54)。予測されるポリペプチド前駆体は215アミノ酸長である(Fig55)。Fig55に示した全長PRO386タンパク質は、約24,326の見積もり分子量及び約6.32のpIを有する。Fig55(配列番号:150)に示した全長PRO386配列の分析は、以下のものの存在を実証した:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸161〜約アミノ酸179の膜貫通ドメイン、約アミノ酸83〜約アミノ酸127の免疫グロブリン様折りたたみ、及び約42〜約アミノ酸45、約アミノ酸66〜約アミノ酸69及びアミノ酸74〜約アミノ酸77の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ326(DNA45415−1318)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209810が付与されている。
全長PRO386ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがナトリウムチャンネルベータ−2サブユニットと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO386がその新規な相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO386アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、A57843, MYP0_HUMAN, GEN14531, JC4024, HS46KDA_1, HSU90716_1, D8996_2, MUSIGLVD_1, DMU42768_1, 及びS19247との間の有意な相同性を明らかにした。
【0455】
実施例26:ヒトPRO540をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39631と命名される。DNA39631コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO540の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTGGGGCTACACACGGGGTGAGG−3’(配列番号:158)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTGCCGCTGCAGAAAGTAGAGCG−3’(配列番号:159)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCCCAAATGAAAACGGGCCCTACTTCCTGGCCCTCCGCGAGATG−3’(配列番号:160)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO540遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO540の全長DNA配列[ここで、UNQ341(DNA44189−1322)と命名される](配列番号:156)及びPRO540の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ341(DNA44189−1322)の全核酸配列をFig58(配列番号:156)に示す。クローンUNQ341(DNA44189−1322)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置21−23に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1257−1259の停止コドンで終端する(Fig58)。予測されるポリペプチド前駆体は412アミノ酸長である(Fig59)。Fig59に示した全長PRO540タンパク質は、約46,658ダルトンの見積もり分子量及び約6.65のpIを有する。PRO540のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、潜在的N−グリコシル化部位、潜在的脂肪基質結合部位、リパーゼ及びセリンタンパク質に典型的な配列、及びベータ伝達ファミリーTrp−Aspリピートを含む。クローンUNQ341(DNA44189−1322)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209699が付与されている。
【0456】
実施例27:ヒトPRO615をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42240と命名される。DNA42240コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO615の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGTCTTCGCCTTGATCGTGTTCT−3’(配列番号:163)
正方向PCRプライマー 5’−GTGTACTGAGCGGCGGTTAG−3’ (配列番号:164)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGAAGGTGATGGCTGCCCTCAC−3’ (配列番号:165)
逆方向PCRプライマー 5’−CCAGGAGGCTCATGGGAAAGTCC−3’ (配列番号:166)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42240配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCACGAGTCTAAGCAGATGTACTGCGTGTTCAACCGCAACGAGGATGCCT−3’
(配列番号:167)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO615遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO615の全長DNA配列[ここで、UNQ352(DNA48304−1323)と命名される](配列番号:161)及びPRO615の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ352(DNA48304−1323)の全核酸配列をFig60(配列番号:161)に示す。クローンUNQ352(DNA48304−1323)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置723−725の停止コドンで終端する(Fig60)。予測されるポリペプチド前駆体は224アミノ酸長である(Fig61)。Fig61に示した全長PRO615タンパク質は、約24,810ダルトンの見積もり分子量及び約4.75のpIを有する。PRO615のアミノ酸配列の重量な領域は、約アミノ酸24−43に相当するII型膜貫通ドメイン、各々約アミノ酸74−90,108−126及び145−161に相当する他の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸97−100に相当する潜在的N−グリコシル化部位を含む。クローンUNQ352(DNA48304−1323)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209811が付与されている。
【0457】
実施例28:ヒトPRO618をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30900と命名される。DNA30900コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO618の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TAACAGCTGCCCACTGCTTCCAGG−3’(配列番号:171)
逆方向PCRプライマー 5’−TAATCCAGCAGTGCAGGCCGGG−3’(配列番号:172)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30900配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATGGCCTCCACGGTGCTGTGGACCGTGTTCCTGGGCAAGGTGTGGCAGAA−3’
(配列番号:173)
上記のライブラリのスクリーニングは、ここでDNA35597(配列番号:170)と命名される部分的cDNAクローンを生じた。この配列のBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いた発現は、ここでDNA43335と命名される核酸配列を生じた。次いで、DNA43335コンセンサス配列に基づいて以下のプライマーを調製した。
正方向PCRプライマー 5’−TGCCTATGCACTGAGGAGGCAGAAG−3’(配列番号:174)
逆方向PCRプライマー 5’−AGGCAGGGACACAGAGTCCATTCAC−3’(配列番号:175)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43335配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGTATGATTTGCCGTGCACCCAGGGCCAGTGGACGATCCAGAACAGGAGG−3’
(配列番号:176)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO618遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO618の全長DNA配列[ここで、UNQ354(DNA49152−1324)と命名される](配列番号:168)及びPRO618の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ354(DNA49152−1324)の全核酸配列をFig62(配列番号:168)に示す。クローンUNQ354(DNA49152−1324)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置73−75に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2479−2481の停止コドンで終端する(Fig62)。予測されるポリペプチド前駆体は802アミノ酸長である(Fig63)。Fig63に示した全長PRO618タンパク質は、約88,846ダルトンの見積もり分子量及び約6.41のpIを有する。PRO618のアミノ酸配列の重量な領域は、II型膜貫通ドメイン、プロテアーゼに典型的な配列、トリプシンファミリー、ヒスチジン活性部位、複数のN−グリコシル化部位、2つのクリングルドメインに典型的な配列、2つのカリクレイン軽鎖に類似する配列を持つ領域、及び低密度リポタンパク質レセプターに類似する配列を持つ領域を含む。クローンUNQ354(DNA49152−1324)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209813が付与されている。
【0458】
実施例29:ヒトPRO719をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44851と命名される。DNA44851コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO719の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTGAGCATGAGCGAGCCGTCCAC−3’(配列番号:179)
逆方向PCRプライマー 5’−GCTATTACAACGGTTCTTGCGGCAGC−3’
(配列番号:180)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44851配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTGACTCTCTGGTGAATCAGGACAAGCCGAGTTTTGCCTTCCAG−3’(配列番号:181)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO719遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎盤組織(LIB90)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO719の全長DNA配列[ここで、UNQ387(DNA49646−1327)と命名される](配列番号:177)及びPRO719の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ387(DNA49646−1327)の全核酸配列をFig65(配列番号:177)に示す。クローンUNQ387(DNA49646−1327)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置223−225に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1285−1287の停止コドンで終端する(Fig65)。予測されるポリペプチド前駆体は354アミノ酸長である(Fig66)。Fig66に示した全長PRO719タンパク質は、約39,362ダルトンの見積もり分子量及び約8.35のpIを有する。全長PRO719配列の分析は、Fig66(配列番号:178)に示したように約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸163〜約アミノ酸172のリパーゼ関連セリン含有活性部位、及び約アミノ酸80〜約アミノ酸83及び約アミノ酸136〜約アミノ酸139の2つの潜在的N−グリコシル化部位の存在を明らかにした。クローンUNQ387(DNA49646−1327)は、1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209705が付与されている。
全長PRO719ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがリポタンパク質リパーゼHタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO719が新規なリポタンパク質リパーゼ相同体となりうることが示されている。より詳細にはDayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO719アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、LIPL_HUMAN, LIPH_HUMAN, D83548_1, A24059_1, P_R30740, D88666_1, A43357, A46696, B43357及びA49488との間の有意な相同性を明らかにした。
【0459】
実施例30:ヒトPRO724をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35603と命名される。DNA35603コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO724の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GGCTGTCACTGTGGAGACAC−3’(配列番号:184)
正方向PCRプライマー2 5’−GCAAGGTCATTACAGCTG−3’(配列番号:185)
逆方向PCRプライマー1 5’−AGAACATAGGAGCAGTCCCACTC−3’(配列番号:186)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGCCTGCTGCTGCACAATCTCAG−3’(配列番号:187)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35603配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGCTATTGCTTGCCTTGGGACAGACCCTGTGGCTTAGGCTCTGGC−3’(配列番号:188)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO724遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO724の全長DNA配列[ここで、UNQ389(DNA49631−1328)と命名される](配列番号:182)及びPRO724の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ389(DNA49631−1328)の全核酸配列をFig67(配列番号:182)に示す。クローンUNQ389(DNA49631−1328)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置546−548に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2685−2687の停止コドンで終端する(Fig67)。予測されるポリペプチド前駆体は713アミノ酸長である(Fig68)。Fig68に示した全長PRO724タンパク質は、約76,193ダルトンの見積もり分子量及び約5.42のpIを有する。Fig68(配列番号:183)に示した全長PRO724配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸442〜約アミノ酸462の膜貫通ドメイン、約アミノ酸152〜約アミノ酸171、約アミノ酸331〜約アミノ酸350、約アミノ酸374〜約アミノ酸393及び約アミノ酸441〜約アミノ酸430のLDLレセプタークラスAドメイン領域。クローンUNQ389(DNA49631−1328)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209806が付与されている。
全長PRO724ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトLDLレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO724が新規なLDLレセプター相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO724アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_R48547, MMAM2R_1, LRP2_RAT, P_R60517, P_R47861, P_R0553, A44513_1, A30363, P_R74692, 及びLMLIPOPHO_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0460】
実施例31:ヒトPRO772をコードするcDNAクローンの単離
実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて1つのcDNA配列が単離され、このcDNA配列を、ここにDNA43509(Fig71参照)と命名する。DNA43509配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎児肺ライブラリ(LIB25)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
DNA43509配列に基づいてPCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CGTTTTGCAGAACCTACTCAGGCAG−3’(配列番号:192)
逆方向PCRプライマー 5’−CCTCCACCAACTGTCAATGTTGTGG−3’(配列番号:193)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43509配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AAAGTGCTGCTGCTGGGTCTGCAGACGCGATGGATAACGT−3’(配列番号:194)
上記のプライマー及びライブラリを用いて全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置131−133に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置587−589に見られる停止コドンで終端する(Fig69;配列番号:189)。予測されるポリペプチド前駆体は152アミノ酸長であり、約17,170ダルトンの計算上の分子量及び約9.62の見積もられたpIを有する。Fig70(配列番号:190)に示した全長PRO772配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸26〜約アミノ酸42の潜在的II型膜貫通ドメイン、約アミノ酸44〜約アミノ酸65、約アミノ酸81〜約アミノ酸101及び約アミノ酸109〜約アミノ酸129の他の膜貫通ドメイン、約アミノ酸78〜約アミノ酸99及び約アミノ酸85〜約アミノ酸106のロイシンジッパーパターン配列。クローンUNQ410(DNA49645−1347)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209809が付与されている。
全長PRO772ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトA4タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO772が新規なA4タンパク質相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO772アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU93305_1, A4P_HUMAN, CELB0454_2, VPU_JSRV, CELC12D_2, OCCM_AGT1, LBPHIG1E_50, YIGK_ECOLI, S76245及びP_R59807との間の有意な相同性を明らかにした。
【0461】
実施例32:ヒトPRO852をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34364と命名される。DNA34364コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO852の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CGCAGAAGCTACAGATTCTCG−3’(配列番号:197)
正方向PCRプライマー2 5’−GGAAATTGGAGGCCAAAGC−3’(配列番号:198)
正方向PCRプライマー3 5’−GGATGTAGCCAGCAACTGTG−3’(配列番号:199)
正方向PCRプライマー4 5’−GCCTTGGCTCGTTCTCTTC−3’(配列番号:200)
正方向PCRプライマー5 5’−GGTCCTGTGCCTGGATGG−3’(配列番号:201)
逆方向PCRプライマー1 5’−GACAAGACTACCTCCGTTGGTC−3’(配列番号:202)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGATGCACAGTTCAGCACCTGTTG−3’
(配列番号:203)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34364配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGCTCCAAGGGCTTTGACGTCACAGTGAAGTACACACAAGGAAGCTG−3’(配列番号:204)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO852遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO852の全長DNA配列[ここで、UNQ418(DNA45493−1349)と命名される](配列番号:195)及びPRO852の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ418(DNA45493−1349)の全核酸配列をFig72(配列番号:195)に示す。クローンUNQ418(DNA45493−1349)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置94−96に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置16748−1650の停止コドンで終端する(Fig72)。予測されるポリペプチド前駆体は518アミノ酸長である(Fig73)。Fig73に示した全長PRO852タンパク質は、約56,180ダルトンの見積もり分子量及び約5.08のpIを有する。Fig73(配列番号:196)に示した全長PRO852配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸466〜約アミノ酸494の膜貫通ドメイン、約アミノ酸170〜約アミノ酸173及び約アミノ酸366〜約アミノ酸369のN−グリコシル化部位、約アミノ酸10〜約アミノ酸31及び約アミノ酸197〜約アミノ酸218のロイシンジッパー配列パターンブロック、及び約アミノ酸109〜約アミノ酸118、約アミノ酸252〜約アミノ酸261及び約アミノ酸298〜約アミノ酸310の真核生物及びウイルスアスパラギン酸プロテアーゼに相同な配列を有するアミノ酸のブロック。クローンUNQ418(DNA45493−1349)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209805が付与されている。
全長PRO852ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO852が新規なプロテアーゼタンパク質又はその相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO852アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、PEPC_HUMAN, S66516, S66517, PEPE_CHICK, CATD_HUMAN, P_R74207, CARP_YEAST, PEP2_RABIT, CATE_HUMAN及びRENI_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0462】
実施例33:ヒトPRO853をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43050と命名される。DNA43050コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO853の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTCATGGCCTTGGACTTGGCCAG−3’(配列番号:207)
逆方向PCRプライマー 5’−ACGCCAGTGGCCTCAAGCTGGTTG−3’(配列番号:208)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43050配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTTTCTGAGCTCTGAGCCACGGTTGGACATCCTCATCCACAATGC−3’(配列番号:209)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO853遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO853の全長DNA配列[ここで、UNQ419(DNA48227−1350)と命名される](配列番号:205)及びPRO853の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ419(DNA48227−1350)の全核酸配列をFig74(配列番号:205)に示す。クローンUNQ419(DNA48227−1350)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置128−130に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1259−1261の停止コドンで終端する(Fig74)。予測されるポリペプチド前駆体は377アミノ酸長である(Fig75)。Fig75に示した全長PRO853タンパク質は、約40,849ダルトンの見積もり分子量及び約7.98のpIを有する。PRO852配列のアミノ酸配列の重要な領域は、配列番号:206の約アミノ酸1〜約アミノ酸16に相当するシグナルペプチド、配列番号:206の約アミノ酸46〜約アミノ酸49に相当するグリコサミノグリカン結合部位、配列番号206の約アミノ酸37〜約アミノ酸49及び約114〜約124に各々相当する2つの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに典型的な配列を含む。クローンUNQ419(DNA48227−1350)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209812が付与されている。
【0463】
実施例34:ヒトPRO860をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38137と命名される。DNA38137コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO860の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GAAGGGACCTACATGTGTGTGGCC−3’(配列番号:212)
逆方向PCRプライマー 5’−ACTGACCTTCCAGCTGAGCCACAC−3’(配列番号:213)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGGACTACACGGAGCCTGTGGAGCTTCTGGCTGTGCGAATTCAGCTGGAA−3’
(配列番号:214)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO852遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO860の全長DNA配列[ここで、UNQ421(DNA41404−1352)と命名される](配列番号:210)及びPRO860の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ421(DNA41404−1352)の全核酸配列をFig76A−B(配列番号:210)に示す。クローンUNQ421(DNA41404−1352)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置58−60に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3013−3015の停止コドンで終端する(Fig76A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は985アミノ酸長である(Fig77)。Fig77に示した全長PRO860タンパク質は、約105,336ダルトンの見積もり分子量及び約6.55のpIを有する。PRO860のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸448−467に相当する膜貫通ドメイン、約アミノ酸1−447に相当する細胞外ドメイン、幾つかのN−グリコシル化部位、多数のN−ミリストイル化部位およびホスホチロシン相互作用ドメインタンパク質に典型的な配列を含む。クローンUNQ421(DN A41404−1352)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209844が付与されている。
【0464】
実施例35:ヒトPRO846をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39949と命名される。DNA39949コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO846の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG−3’(配列番号:217)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG−3’(配列番号:218)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39949配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC−3’(配列番号:219)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO846遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO846の全長DNA配列[ここで、UNQ422(DNA44196−1353)と命名される](配列番号:215)及びPRO846の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ422(DNA44196−1353)の全核酸配列をFig78(配列番号:215)に示す。クローンUNQ422(DNA44195−1353)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置25−27に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1021−1023の停止コドンで終端する(Fig78)。予測されるポリペプチド前駆体は332アミノ酸長である(Fig79)。Fig79に示した全長PRO846タンパク質は、約36,143ダルトンの見積もり分子量及び約5.89のpIを有する。PRO846のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig79に示したように、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、N−グリコシル化部位、フィブリノーゲンベータ及びガンマ鎖C末端ドメインに典型的な配列、及びIg様V型ドメインに典型的な配列を含む。クローンUNQ422(DNA44196−1353)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209847が付与されている。
【0465】
実施例36:ヒトPRO862をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47370と命名される。DNA47370コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO862の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGGATCATGTTGTTGGCCCTGGTC−3’(配列番号:222)
逆方向PCRプライマー 5’−GCAAGGCAGACCCAGTCAGCCAG−3’(配列番号:223)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47370配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTGCCTGCTACCCTCCAAGTGAGGCCAAGCTCTACGGTCGTTGTG−3’(配列番号:225)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO862遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト膵臓組織(LIB55)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO862の全長DNA配列[ここで、UNQ424(DNA52187−1354)と命名される](配列番号:220)及びPRO862の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ424(DNA52187−1354)の全核酸配列をFig80(配列番号:220)に示す。クローンUNQ424(DNA52187−1354)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置410−412に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置848−850の停止コドンで終端する(Fig80)。予測されるポリペプチド前駆体は146アミノ酸長である(Fig81)。Fig81に示した全長PRO862タンパク質は、約16,430ダルトンの分子量及び約5.05のpIを有する。PRO862のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig81に示したように、シグナルペプチド、N−ミリストイル化部位、及びアルファ−ラクトアルブミン/リソザイムCタンパク質の領域と類似性を持つ配列を含む。クローンUNQ424(DNA52187−1354)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209845が付与されている。
【0466】
実施例37:ヒトPRO864をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40666と命名される。DNA40666コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO864の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCTGCAGCTGCAAATTCCACTGG−3’(配列番号:227)
逆方向PCRプライマー 5’−TGGTGGGAGACTGTTTAAATTATCGGCC−3’
(配列番号:228)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40666配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TGCTTCGTCAAGTGCCGGCAGTGCCAGCGGCTCGTGGAGTT−3’(配列番号:229)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO864遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO864の全長DNA配列[ここで、UNQ426(DNA48328−1355)と命名される](配列番号:225)及びPRO864の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ426(DNA48328−1355)の全核酸配列をFig82(配列番号:225)に示す。クローンUNQ426(DNA48328−1355)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置37−39に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1090−10920の停止コドンで終端する(Fig82)。予測されるポリペプチド前駆体は351アミノ酸長である(Fig83)。Fig83に示した全長PRO864タンパク質は、約39,052ダルトンの分子量及び約8.97のpIを有する。PRO864のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig83に示したように、シグナルペプチド、N−グリコシル化部位、Wntファミリーシグネーチャー配列、Wnt−1ファミリータンパク質に相同な配列領域を含む。クローンUNQ426(DNA48328−1355)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209843が付与されている。
【0467】
実施例38:ヒトPRO792をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38106と命名される。DNA38106コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO792の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCGAGAACTGTGTCATGATGCTGC−3’(配列番号:232)
逆方向PCRプライマー 5’−GTTTCTGAGACTCAGCAGCGGTGG−3’(配列番号:233)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38106配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CACCGTGTGACAGCGAGAAGGACGGCTGGATCTGTGAGAAAAGGCACAAC−3’
(配列番号:234)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO792遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO792の全長DNA配列[ここで、UNQ431(DNA56352−1358)と命名される](配列番号:230)及びPRO792の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ431(DNA56352−1358)の全核酸配列をFig84(配列番号:230)に示す。クローンUNQ431(DNA56352−1358)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置67−69に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置946−948の停止コドンで終端する(Fig84)。予測されるポリペプチド前駆体は293アミノ酸長である(Fig85)。Fig85に示した全長PRO792タンパク質は、約32,562ダルトンの見積もり分子量及び約6.53のpIを有する。Fig85(配列番号:231)に示した全長PRO792配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸31〜約アミノ酸54のII型膜貫通ドメイン、約アミノ酸73〜約アミノ酸76及び約アミノ酸159〜約アミノ酸162の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸102〜約アミノ酸123のロイシンジッパーアミノ酸配列パターン、約アミノ酸18〜約アミノ酸23、約アミノ酸133〜約アミノ酸138及び約アミノ酸242〜約アミノ酸247のN−ミリストル化部位、及び約アミノ酸264〜約アミノ酸287のC型レクチンドメインシグネーチャーブロック。クローンUNQ431(DNA56352−1358)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209846が付与されている。
全長PRO792ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD23タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO792が新規なCD23相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO792アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S34198, A07100_1, A05303_1, P_R41689, P_P82839, A10871_1, P_R12796, P_R47199, A46274及びP_R32188との間の有意な相同性を明らかにした。
【0468】
実施例39:ヒトPRO866をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44708と命名される。DNA44708コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO866の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CAGCACTGCCAGGGGAAGAGGG−3’(配列番号:237)
正方向PCRプライマー2 5’−CAGGACTCGCTACGTCCG−3’(配列番号:238)
正方向PCRプライマー3 5’−CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCC−3’
(配列番号:239)
逆方向PCRプライマー1 5’−GCAGTTATCAGGGACGCACTCAGCC−3’
(配列番号:240)
逆方向PCRプライマー2 5’−CCAGCGAGAGGCAGATAG−3’(配列番号:241)
逆方向PCRプライマー3 5’−CGGTCACCGTGTCCTGCGGGATG−3’(配列番号:242)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44708配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCCACGTCCTATCTGCCTCTC−3’(配列番号:243)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO866遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO866の全長DNA配列[ここで、UNQ435(DNA53971−1359)と命名される](配列番号:235)及びPRO866の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ435(DNA53971−1359)の全核酸配列をFig86(配列番号:235)に示す。クローンUNQ435(DNA53971−1359)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1268−1270の停止コドンで終端する(Fig86)。予測されるポリペプチド前駆体は331アミノ酸長である(Fig87)。Fig87に示した全長PRO866タンパク質は、約35,844ダルトンの見積もり分子量及び約5.45のpIを有する。Fig87(配列番号:236)に示した全長PRO866配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸26のシグナルペプチド。クローンUNQ435(DNA53971−1359)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209750が付与されている。
全長PRO866ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがミンジン(mindin)/スポンジン(spondin)ファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO866が新規なミンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO866アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB006085_1, AB006084_1, AB006086_1, AF01267_1, CWU42213_1, AC004160_1, CPMICRP_1, S49108, A48569及びI46687との間の有意な相同性を明らかにした。
【0469】
実施例40:ヒトPRO871をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40324と命名される。DNA40324コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO871の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−TGCGGAGATCCTACTGGCACAGGG−3’
(配列番号:246)
正方向PCRプライマー2 5’−CGAGTTAGTCAGAGCATG−3’(配列番号:247)
正方向PCRプライマー3 5’−CAGATGGTGCTGTTGCCG−3’(配列番号:248)
逆方向PCRプライマー1 5’−CAACTGGAACAGGAACTGAGATGTGGATC−3’
(配列番号:249)
逆方向PCRプライマー2 5’−CTGGTTCAGCAGTGCAAGGGTCTG−3’
(配列番号:250)
逆方向PCRプライマー3 5’−CCTCTCCGATTAAAACGC−3’(配列番号:251)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40324配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAGAGGACTGGTTGCCATGGCAAATGCTGGTTCTCATGATAATGG−3’(配列番号:252)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO871遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO871の全長DNA配列[ここで、UNQ438(DNA50919−1361)と命名される](配列番号:244)及びPRO871の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ438(DNA50919−1361)の全核酸配列をFig88(配列番号:244)に示す。クローンUNQ438(DNA50919−1361)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置191−193に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1607−1609の停止コドンで終端する(Fig88)。予測されるポリペプチド前駆体は472アミノ酸長である(Fig89)。Fig89に示した全長PRO871タンパク質は、約53,847ダルトンの見積もり分子量及び約5.75のpIを有する。Fig89(配列番号:245)に示した全長PRO871配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸109〜約アミノ酸112及び約アミノ酸201〜約アミノ酸204の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸49〜約アミノ酸66のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼシグネーチャー配列、及び、約アミノ酸96〜約アミノ酸140、約アミノ酸49〜約アミノ酸89及び約アミノ酸22〜約アミノ酸51のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼに相同な領域。クローンUNQ438(DNA50919−1361)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209848が付与されている。
全長PRO871ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のサイクロフィリンファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO871が新規なサイクロフィリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO871アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、SPBC16H5_5, S64705, YAL5_SCHPO, CYP4 CAEEL, CELC34D4_7, CYPA_CAEEL, HUMORF006_1, CYPI_MYCTU, AF043642_1及びHSSRCYP_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0470】
実施例41:ヒトPRO873をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39621と命名される。DNA39621コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO873の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGGTGCCTGCAGGAGTCCTGGGG−3’(配列番号:255)
逆方向PCRプライマー 5’−CCACCTCAGGAAGCCGAAGATGCC−3’(配列番号:256)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39621配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAACGGTACAAGTGGCTGCGCTTCAGCGAGGACTGTCTGTACCTG−3’(配列番号:257)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO873遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO873の全長DNA配列[ここで、UNQ440(DNA44179−1362)と命名される](配列番号:253)及びPRO873の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ440(DNA44179−1362)の全核酸配列をFig90(配列番号:253)に示す。クローンUNQ440(DNA44179−1362)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置139−141に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1774−1776の停止コドンで終端する(Fig90)。予測されるポリペプチド前駆体は545アミノ酸長である(Fig91)。Fig91に示した全長PRO873タンパク質は、約58,934ダルトンの見積もり分子量及び約9.45のpIを有する。Fig91(配列番号:254)に示した全長PRO873配列の分析は、以下の特徴の存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド;約アミノ酸312〜約アミノ酸327のカルボキシルエステラーゼB型セリン活性部位;約アミノ酸218〜約アミノ酸228のカルボキシエステラーゼB型シグネーチャー2モチーフ;及び各々約アミノ酸318〜約アミノ酸321、約アミノ酸380〜約アミノ酸383及び約アミノ酸465〜約アミノ酸468の3つのN−グリコシル化部位。クローンUNQ440(DNA44179−1362)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209851が付与されている。
全長PRO873ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO873が新規なカルボキシルエステラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO873アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:ES10_RAT, GEN12405, AB10633_1, EST4_RAT, A48809, SASB_ANAPL, RNU41662_1, RNU22952_1, BAL_RAT, GEN13522との間の有意な相同性を明らかにした。
【0471】
実施例42:ヒトPRO940をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47442と命名される。DNA47442コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO940の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAAAGCCTGCGCCTGGTCTGTG−3’(配列番号:260)
逆方向PCRプライマー 5’−TTCTGGAGCCCAGAGGGTGCTGAG−3’(配列番号:262)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47442配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGAGCTGCCACCCATTCAAATGGAGCACGAAGGAGAGTTCACCTG−3’(配列番号:263)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO940遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO940の全長DNA配列[ここで、UNQ477(DNA54002−1367)と命名される](配列番号:258)及びPRO940の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ477(DNA54002−1367)の全核酸配列をFig92(配列番号:258)に示す。クローンUNQ477(DNA54002−1367)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置46−48に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1678−1680の停止コドンで終端する(Fig92)。予測されるポリペプチド前駆体は544アミノ酸長である(Fig93)。Fig93に示した全長PRO940タンパク質は、約60,268ダルトンの見積もり分子量及び約9.53のpIを有する。Fig93(配列番号:259)に示した全長PRO940配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸15のシグナルペプチド、約アミノ酸100〜約アミノ酸103、約アミノ酸297〜約アミノ酸300及び約アミノ酸306〜約アミノ酸309のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸365〜約アミノ酸371の免疫グロブリン及び主要組織適合性複合体シグネーチャー配列ブロック。クローンUNQ477(DNA54002−1367)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209754が付与されている。
全長PRO940ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD33及びOB結合タンパク質−2と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO940アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CD33_HUMAN, HSU71382_1, HSU71383_1, D86359_1, PGBM_HUMAN, MAGS_MOUSE, D86983_1, C22B_HUMAN, P_W01002及びHVU24116_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0472】
実施例43:ヒトPRO941をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35941と命名される。ジェネンテクが独自に開発したEST配列を構築に使用し、それはここにDNA6415(Fig96;配列番号:265)と命名する。DNA35941コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO941の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTGACTGTCTCTGAATCTGCACCC−3’(配列番号:266)
逆方向PCRプライマー 5’−AAGTGGTGGAAGCCTCCAGTGTGG−3’(配列番号:267)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35941配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCACTACGGTATTAGAGCAAAAGTTAAAAACCATCATGGTTCCTGGAGCAGC−3’
(配列番号:268)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO941遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO941の全長DNA配列[ここで、UNQ478(DNA53906−1368)と命名される](配列番号:263)及びPRO941の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ478(DNA53906−1368)の全核酸配列をFig94(配列番号:263)に示す。クローンUNQ478(DNA53906−1368)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置37−39に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2353−2355の停止コドンで終端する(Fig94)。予測されるポリペプチド前駆体は772アミノ酸長である(Fig95)。Fig95に示した全長PRO941タンパク質は、約87,002ダルトンの見積もり分子量及び約4.64のpIを有する。Fig95(配列番号:264)に示した全長PRO941配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸57〜約アミノ酸60、約アミノ酸74〜約アミノ酸77、約アミノ酸419〜約アミノ酸422、約アミノ酸437〜約アミノ酸440、約アミノ酸508〜約アミノ酸511、約アミノ酸515〜約アミノ酸518、約アミノ酸516〜約アミノ酸519及び約アミノ酸534〜約アミノ酸537の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸136〜約アミノ酸146及び約アミノ酸244〜約アミノ酸254のカドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列。クローンUNQ478(DNA53906−1368)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209747が付与されている。
全長PRO941ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがカドヘリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO941が新規なカドヘリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO941アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、I50180, CADA_CHICK, I50178, GEN12782, CADC_HUMAN, P_W25637, A38992, P R49731, D38992及びG02678との間の有意な相同性を明らかにした。
【0473】
実施例44:ヒトPRO944をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47374と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のEST配列を構築に使用し、それはFig99−107に示した。DNA47374コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO944の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CGAGCGAGTCATGGCCAACGC−3’(配列番号:280)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGTCACACGTAGTCTTTCCCGCTGG−3’
(配列番号:281)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47374配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTGCAGCTGTTGGGCTTCATTCTCGCCTTCCTGGGATGGATCG−3’(配列番号:282)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO944遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO944の全長DNA配列[ここで、UNQ481(DNA52185−1370)と命名される](配列番号:269)及びPRO944の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ481(DNA52185−1370)の全核酸配列をFig97(配列番号:269)に示す。クローンUNQ481(DNA52185−1370)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置219−221に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置852−854の停止コドンで終端する(Fig97)。予測されるポリペプチド前駆体は211アミノ酸長である(Fig98)。Fig98に示した全長PRO944タンパク質は、約22,744ダルトンの見積もり分子量及び約8.51のpIを有する。Fig98(配列番号:270)に示した全長PRO944配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸82〜約アミノ酸102、約アミノ酸118〜約アミノ酸142及び約アミノ酸161〜約アミノ酸187の膜貫通ドメイン、約アミノ酸72〜約アミノ酸75のN−グリコシル化部位、約アミノ酸70〜約アミノ酸111のタンパク質のPMP−22/EMP/MP20ファミリーに相同性を持つ配列ブロック、及び約アミノ酸119〜約アミノ酸133のABC−2型膜貫通系複合膜タンパク質。クローンUNQ481(DNA5218 5−1370)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209861が付与されている。
全長PRO944ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCPE−Rタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO944が新規なCPE−R相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO944アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB000713_1, AB000 714_1, AF035814_1, AF000959_1, HSU89916_1, EMP2_HUMAN, JC5732, CELF53B3_6, PM22_MOUSE及びCGU49797_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0474】
実施例45:ヒトPRO983をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47473と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のEST配列を構築に使用し、それらのEST配列はFig110−116に示した。DNA47473コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO983の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCACCACCGTAGGTACTTGTGTGAGGC−3’
(配列番号:292)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCACCAGAGCCAAGAGCCGGG−3’(配列番号:293)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47473配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCGGAATCATCGATGCAGGGGCCTCAATTAATGTATCTGTGATGTTAC−3’
(配列番号:294)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO983遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄(LIB256)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO983の全長DNA配列[ここで、UNQ484(DNA53977−1371)と命名される](配列番号:283)及びPRO983の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ484(DNA53977−1371)の全核酸配列をFig108(配列番号:283)に示す。クローンUNQ484(DNA53977−1371)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置234−236に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置963−965の停止コドンで終端する(Fig108)。予測されるポリペプチド前駆体は243アミノ酸長である(Fig109)。Fig109に示した全長PRO983タンパク質は、約27,228ダルトンの見積もり分子量及び約7.43のpIを有する。Fig109(配列番号:284)に示した全長PRO983配列の分析は以下の特徴の存在を明示している:約アミノ酸224〜約アミノ酸239の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸68〜約アミノ酸71の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸59〜約アミノ酸64、約アミノ酸64〜約アミノ酸69及び約アミノ酸235〜約アミノ酸240の3つの潜在的N−ミリストイル化部位。クローンUNQ484(DNA53977−1371)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209862が付与されている。
全長PRO983ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞関連タンパク質、VAP−33と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO983が新規な小胞関連膜タンパク質となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO983アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、VP33_APLCA, CELF33D11_12, CELF42G2_2, S50623, YDFC_SCHPO, CELF54H5_2, CELZC196_8, CEF57A10_3, MSP3_GLORO, CEC15H11_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0475】
実施例46:ヒトPRO1057をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA49808と命名される。DNA49808コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1057の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCATCTGCAGGAGAGAGCGAAGGG−3’(配列番号:297)
逆方向PCRプライマー 5’−CATCGTTCCCGTGAATCCAGAGGC−3’(配列番号:298)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49808配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAAGGGAGGCCTTCCTTTCAGTGGACCCGGGTCAAGAATACCCAC−3’(配列番号:299)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1057遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1057の全長DNA配列[ここで、UNQ522(DNA57253−1382)と命名される](配列番号:295)及びPRO1057の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ522(DNA57253−1382)の全核酸配列をFig117(配列番号:295)に示す。クローンUNQ522(DNA57253−1382)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1514−1516の停止コドンで終端する(Fig117)。予測されるポリペプチド前駆体は413アミノ酸長である(Fig118)。Fig118に示した全長PRO1057タンパク質は、約47,070ダルトンの見積もり分子量及び約9.92のpIを有する。Fig118(配列番号:296)に示した全長PRO1057配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸90〜約アミノ酸93、約アミノ酸110〜約アミノ酸113及び約アミノ酸193〜約アミノ酸196の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸236〜約アミノ酸239のグリコサミノグリカン結合部位、及び約アミノ酸165〜約アミノ酸170のセリンプロテアーゼヒスチジン含有活性部位。クローンUNQ522(DNA57253−1382)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209867が付与されている。
全長PRO1057ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1057が新規なプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1057アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、TRYE_DROER, P_R14159, A69660, EBN1_EBV, S65494, GEN12688, A51084_1, P_R99571, A57514及びAF003200_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0476】
実施例47:ヒトPRO1071をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA53035と命名される。DNA53035コンセンサス配列に基づいて、コンセンサス配列が、概観したところ全長タンパク質をコードすることがわかったクローンであるIncyteのESTクローン番号2872569と有意な配列同一性を有していることが同定された。そのようにして、IncyteのESTクローン番号2872569を購入し、その挿入物を得て配列決定し、正しい配列を確認した。この配列を、ここにUNQ528又はDNA58847−1383と命名する。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1071の全長DNA配列[ここで、UNQ528(DNA58847−1383)と命名される](配列番号:300)及びPRO1071の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ528(DNA58847−1383)の全核酸配列をFig119(配列番号:300)に示す。クローンUNQ528(DNA58847−1383)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置133−135に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1708−1710の停止コドンで終端する(Fig119)。予測されるポリペプチド前駆体は525アミノ酸長である(Fig120)。Fig120に示した全長PRO1071タンパク質は、約58,416ダルトンの見積もり分子量及び約6.62のpIを有する。Fig120(配列番号:301)に示した全長PRO1071配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸25のシグナルペプチド、約アミノ酸251〜約アミノ酸254の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸385〜約アミノ酸399のトロンボスポンジン−1相同ブロック、約アミノ酸385〜約アミノ酸399、約アミノ酸445〜約アミノ酸459及び約アミノ酸42〜約アミノ酸56のウィリブランズ(Willibrands)因子C型相同ブロック。クローンUNQ528(DNA58847−1383)は、1998年5月20日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209879が付与されている。
全長PRO10717ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のトロンボスポンジンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1071が新規なトロンボスポンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1071アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB002364_1, D67076_1, BTPCINPGN_1, CET13H10_1, CEF25H8_5, CEF53B6_2, CEC26C6_6, HSSEMG_1, CET21B6_4及びBTY08561_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0477】
実施例48:ヒトPRO1072をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA53125と命名される。DNA53125コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1072の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCAGGAAATGCTCCAGGAAGAGCC−3’(配列番号:305)
逆方向PCRプライマー 5’−GCCCATGACACCAAATTGAAGAGTGG−3’
(配列番号:306)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA53125配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AACGCAGGGATCTTCCAGTGCCCTTACATGAAGACTGAAGATGGG−3’(配列番号:307)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1072遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1072の全長DNA配列[ここで、UNQ529(DNA58747−1384)と命名される](配列番号:302)及びPRO1072の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ529(DNA58747−1384)の全核酸配列をFig121(配列番号:302)に示す。クローンUNQ529(DNA58747−1384)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置65−67に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1073−1075の停止コドンで終端する(Fig121)。予測されるポリペプチド前駆体は336アミノ酸長である(Fig122)。Fig122に示した全長PRO1072タンパク質は、約36,865ダルトンの見積もり分子量及び約9.15のpIを有する。Fig122(配列番号:303)に示した全長PRO1072配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸134〜約アミノ酸144、約アミノ酸44〜約アミノ酸56及び約アミノ酸239〜約アミノ酸248の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質相同ブロック、及び約アミノ酸212〜約アミノ酸215及び約アミノ酸239〜約アミノ酸242の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ529(DNA58747−1384)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209868が付与されている。
全長PRO1072ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のレダクターゼファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1072が新規なレダクターゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1072アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W03198, P_W15759, P_R60800, MTV037_3, CEC15H11_6, ATAC00234314, MTV022_13, SCU43704_1, OXIR_STRAT及びCELC01G8_3との間の有意な相同性を明らかにした。
【0478】
実施例49:ヒトPRO1075をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34363と命名される。DNA34363配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1075の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGAGAGGCCTCTCTGGAAGTTG−3’(配列番号:312)
正方向PCRプライマー 5’−GTCAGCGATCAGTGAAAGC−3’ (配列番号:313)
正方向PCRプライマー 5’−CCAGAATGAAGTAGCTCGGC−3’ (配列番号:314)
正方向PCRプライマー 5’−CCGACTCAAAATGCATTGTC−3’ (配列番号:315)
正方向PCRプライマー 5’−CATTTGGCAGGAATTGTCC−3’ (配列番号:316)
正方向PCRプライマー 5’−GGTGCTATAGGCCAAGGG−3’ (配列番号:317)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGTATCTCTGGGCTATGTCAGAG−3’ (配列番号:318)
逆方向PCRプライマー 5’−CTACATATAATGGCACATGTCAGCC−3’(配列番号:319)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34363配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGTCTTCCTATCCTTACCCGACCTCAGATGCTCCCTTCTGCTCCTG−3’(配列番号:320)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1075遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト皮膚腫瘍組織(LIB324)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1075の全長DNA配列[ここで、UNQ532(DNA57689−1385)と命名される](配列番号:308)及びPRO1075の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ532(DNA57689−1385)の全核酸配列をFig124(配列番号:308)に示す。クローンUNQ532(DNA57689−1385)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置137−139に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1355−1357の停止コドンで終端する(Fig124)。予測されるポリペプチド前駆体は406アミノ酸長である(Fig125)。Fig125に示した全長PRO1075タンパク質は、約46,927ダルトンの見積もり分子量及び約5.21のpIを有する。Fig125(配列番号:309)に示した全長PRO1075配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド、約アミノ酸403〜約アミノ酸406の小胞標的化配列、約アミノ酸203〜約アミノ酸211のチロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸50〜約アミノ酸66のタンパク質のチオレドキシンファミリーに相同性を持つ配列ブロック。クローンUNQ532(DNA57689−1385)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209869が付与されている。
全長PRO1075ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1075が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1075アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CELC30H7_2, CELC06A6_3, CELF42G8_3, S57942, ER72_CAEEL, CELC07A12_3, CEH06O01_4及びP_R51696との間の有意な相同性を明らかにした。
【0479】
実施例50:ヒトPRO181をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、コルニコン(cornichon)タンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA13242(Fig130;配列番号:323)と命名する。相同性に基づいて、DNA13242分子の配列からオリゴヌクレオチドプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは次のものを含む:
正方向PCRプライマー 5’−GTGCAGCAGAGTGGCTTACA−3’(配列番号:326)
逆方向PCRプライマー 5’−ACTGGACCAATTCTTCTGTG−3’(配列番号:327)
ハイブリッド形成プローブ
5’−GATATTCTAGCATATTGTCAGAAGGAAGGATGGTGCAAATTAGCT−3’(配列番号:328)
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置14−16に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置446−448に見られる停止コドンで終端する(Fig128;配列番号:321)。予測されるポリペプチド前駆体は144アミノ酸長であり、約16,699ダルトンの計算上の分子量及び約5.6の見積もられたpIを有する。Fig129(配列番号:322)に示した全長PRO181配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸11〜約アミノ酸31の推定II型膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸57〜約アミノ酸77及び約アミノ酸123〜約アミノ酸143の他の膜貫通ドメイン。クローンUNQ155(DNA23330−139 0)は、1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209775が付与されている。
全長PRO181ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコルニコンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO181が新規なコルニコン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO181アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF022811_1, CET09 E8_3, S64058, YGF4_TEAST, YB60_YEAST, EBU89455_1, SIU36383及びPH1371との間の有意な相同性を明らかにした。
【0480】
実施例51:ヒトPRO195をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいてcDNA配列を単離し、ここでDNA13199(Fig134;配列番号:332)と命名した。DNA13199配列は、次いで、公的ESTデータベース(例えば、GenBank)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap. docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA22778と命名する。
DNA22778配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACAAGCTGAGCTGCTGTGACAG−3’(配列番号:333)
逆方向PCRプライマー 5’−TGATTCTGGCAACCAAGATGGC−3’(配列番号:334)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA22778配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATGGCCTTGGCCGGAGGTTCGGGGACCGCTTCGGCTGAAG−3’(配列番号:335)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO195遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置70−72に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1039−1041の停止コドンで終端する(Fig132;配列番号:330)。予測されるポリペプチド前駆体は323アミノ酸長であり、約36,223の計算された分子量及び約5.06の見積もられたpIを有する。Fig132(配列番号:330)に示した全長PRO195の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸31のシグナルペプチド、約アミノ酸241〜約アミノ酸260の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸90〜約アミノ酸93の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ169(DNA26847−1395)は1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209772が付与されている。
全長PRO195ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO195アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_P91380, AF035118_1, HUMTROPCS_1, NOUD_SALTY及びE70002との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0481】
実施例52:ヒトPRO865をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列を、ここにDNA37642(Fig137;配列番号:338)と命名する。DNA37642配列は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発したデータベース(LIFESEQ<SUP>TM</SUP>、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、それらの間に存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。得られたコンセンサス配列を、ここでDNA48615と命名する。
DNA48615コンセンサス配列に基づいてプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ(LIB227)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−AAGCTGCCGGAGCTGCAATG−3’ (配列番号:339)
正方向PCRプライマー2 5’−TTGCTTCTTAATCCTGAGCGC−3’(配列番号:340)
正方向PCRプライマー3 5’−AAAGGAGGACTTTCGACTGC−3’ (配列番号:341)
逆方向PCRプライマー1 5’−AGAGATTCATCCACTGCTCCAAGTCG−3’
(配列番号:342)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGTCCAGAAACAGGCACATATCAGC−3’
(配列番号:343)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA48615配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGACAGCGGCACAGAGGTGCTTCTGCCAGGTTAGTGGTTACTTGGATGAT−3’(配列番号:344)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO865遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1577−1579の停止コドンで終端する(Fig135;配列番号:336)。予測されるポリペプチド前駆体は468アミノ酸長であり、約54,393の計算された分子量及び約5.63の見積もられたpIを有する。Fig136(配列番号:337)に示した全長PRO865の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド、約アミノ酸280〜約アミノ酸283及び約アミノ酸384〜約アミノ酸387の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸94〜約アミノ酸97の潜在的アミド化部位、約アミノ酸20〜約アミノ酸23及び約アミノ酸223〜約アミノ酸226のグリコサミノグリカン結合部位、約アミノ酸216〜約アミノ酸222のアミノトランスフェラーゼクラスVピリドキシルホスフェートアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸338〜約アミノ酸343のインターロイキン−7に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロック。クローンUNQ434(DNA53974−1401)は1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209774が付与されている。
全長PRO865ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO865アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、YMN0_YEAST, ATFCA4_43, S44168, P_W14549及びRABTCRG4_1との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0482】
実施例53:ヒトPRO827をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、種々のインテグリンタンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA47751(Fig140;配列番号:347)と命名する。配列相同性に基づいて、DNA47751分子の配列からプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎児色素上皮ライブラリ(LIB113)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGGGACAGAGGCCAGAGGACTTC−3’ (配列番号:348)
逆方向PCRプライマー 5’−CAGGTGCATATTCACAGCAGGATG−3’(配列番号:349)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47751配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGAACTCCCCTTCGTCACTCACCTGTTCTTGCCCCTGGTGTTCCT−3’(配列番号:350)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO827遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置506−508に見られる停止コドンで終端する(Fig138;配列番号:345)。予測されるポリペプチド前駆体は124アミノ酸長であり、約13,352ダルトンの計算上の分子量及び約5.99の見積もられたpIを有する。Fig139(配列番号:346)に示した全長PRO827配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸22のシグナルペプチド、約アミノ酸70〜約アミノ酸72の細胞接着配列、約アミノ酸98〜約アミノ酸101のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸67〜約アミノ酸81のインテグリンアルファ鎖タンパク質相同配列。クローンUNQ468(DNA57039−1402)は、1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209777が付与されている。
全長PRO827ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがVLA−2インテグリンタンパク質及び他の種々のインテグリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO827が新規なインテグリン又はそのスプライシング変異体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO827アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S44142, ITA2_ HUMAN, ITA1_RAT, ITA1_HUMAN, ITA4_HUMAN, ITA9_HUMAN, AF03108_1, ITAM_MOUSE, ITA8_CHICK及びITA6_CHICKとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0483】
実施例54:ヒトPRO1114をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、WU−BLAST配列アラインメントコンピュータプログラムにより、他の公知のインターフェロンレセプターと或る程度の配列同一性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA48466(Fig143;配列番号:352)と命名する。配列相同性に基づいて、DNA48466分子の配列からプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト乳癌ライブラリー(LIB135)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り:
正方向PCRプライマー 5’−AGGCTTCGCTGCGACTAGACCTC−3’ (配列番号:354)
逆方向PCRプライマー 5’−CCAGGTCGGGTAAGGATGGTTGAG−3’(配列番号:355)
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTTCTACGCATTGATTCCATGTTTGCTCACAGATGAAGTGGCCATTCTGC−3’
(配列番号:356)
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置250−252に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1183−1185に見られる停止コドンで終端する(Fig141;配列番号:351)。予測されるポリペプチド前駆体は311アミノ酸長であり、約35,076ダルトンの計算上の分子量及び約5.04の見積もられたpIを有する。Fig142(配列番号:352)に示した全長PRO1114配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド、約アミノ酸230〜約アミノ酸255の膜貫通ドメイン、約アミノ酸40〜約アミノ酸43及び約アミノ酸134〜約アミノ酸137の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸92〜約アミノ酸119の組織因子タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸232〜約アミノ酸262のインテグリンアルファ鎖タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンUNQ557(DNA57033−1403)は、1998年5月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209905が付与されている。
Fig142(配列番号:352)に示した全長配列の、WU−BLAST2配列アラインメント分析を用いた、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析は、PRO1114インターフェロンレセプターアミノ酸配列と以下のDayhoff配列:G01418, INR1_MOUSE, P_R71035, INGS_HUMAN, A26595_1, A26593_1, I56215及びTF_HUMANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0484】
実施例55:ヒトPRO237をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30905と命名される。DNA30905コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO237の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TCTGCTGAGGTGCAGCTCATTCAC−3’(配列番号:359)
逆方向PCRプライマー 5’−GAGGCTCTGGAAGATCTGAGATGG−3’(配列番号:360)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30905配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCTCTTTGTCAACGTTGCCAGTACCTCTAACCCATTCCTCAGTCGCCTC−3’
(配列番号:361)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1075遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO237の全長DNA配列[ここで、UNQ211(DNA34353−1428)と命名される](配列番号:357)及びPRO237の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ211(DNA34353−1428)の全核酸配列をFig144(配列番号:357)に示す。クローンUNQ211(DNA34353−1428)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置586−588に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1570−1572の停止コドンで終端する(Fig144)。予測されるポリペプチド前駆体は328アミノ酸長である(Fig145)。Fig145に示した全長PRO237タンパク質は、約36,238ダルトンの見積もり分子量及び約9.90のpIを有する。Fig145(配列番号:358)に示した全長PRO237配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド、約アミノ酸177〜約アミノ酸199の膜貫通ドメイン、約アミノ酸118〜約アミノ酸121、約アミノ酸170〜約アミノ酸173及び約アミノ酸260〜約アミノ酸263のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸222〜約アミノ酸270、約アミノ酸128〜約アミノ酸164及び約アミノ酸45〜約アミノ酸92の真核生物型炭酸脱水酵素配列相同性ブロック。クローンUNQ211(DNA34353−1428)は、1998年5月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209855が付与されている。
全長PRO237ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが炭酸脱水酵素タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO237アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF0550106_1, OACALP_1, CELD1022_8, CAH2_HUMAN, 1CAC, CAH5_HUMAN, CAHP_HUMAN, CAH3_HUMAN, CAH1_HUMAN及び2CABとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0485】
実施例56:ヒトPRO541をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42259と命名される。DNA42259コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO541の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGACAGAATTTGGGAGCACACTGG−3’ (配列番号:364)
正方向PCRプライマー 5’−CCAAGAGTATACTGTCCTCG−3’ (配列番号:365)
逆方向PCRプライマー 5’−AGCACAGATTTTCTCTACAGCCCCC−3’(配列番号:366)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCACTCCAGCATGTACTGCTGC−3’ (配列番号:367)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42259配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCATTCAGGTGTTCTGGCCCTGTATGTACACATTATACACAGGTCGTGTG−3’(配列番号:368)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO541遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO541の全長DNA配列[ここで、UNQ342(DNA45417−1432)と命名される](配列番号:362)及びPRO541の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ342(DNA45417−1432)の全核酸配列をFig146(配列番号:362)に示す。クローンUNQ342(DNA45417−1432)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置469−471に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1969−1971の停止コドンで終端する(Fig146)。予測されるポリペプチド前駆体は500アミノ酸長である(Fig147)。Fig147に示した全長PRO541タンパク質は、約56,888ダルトンの見積もり分子量及び約8.53のpIを有する。Fig147(配列番号:363)に示した全長PRO541配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸165〜約アミノ酸186、約アミノ酸196〜約アミノ酸218、約アミノ酸134〜約アミノ酸146、約アミノ酸96〜約アミノ酸108及び約アミノ酸58〜約アミノ酸77の細胞外タンパク質SCP/Tpx−1/PR−1/Sc7に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸28〜約アミノ酸31のN−グリコシル化部位。クローンUNQ342(DNA45417−1432)は、1998年5月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209910が付与されている。
全長PRO541ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO541が新規なトリプシンインヒビターとなりうることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO541アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、D45027_1, AB009609_1, JC5308, CRS3_HORSE, TPX1_HUMAN, HELO_HELHO, GEN14351, A28112_1, CET05A10_1及びP_W11485との間の有意な相同性を明らかにした。
【0486】
実施例57:ヒトPRO273をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36465と命名される。DNA36464コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO273の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCGCCCTCCCCATGTCCCTG−3’ (配列番号:371)
逆方向PCRプライマー 5’−TCCCAACTGGTTTGGAGTTTTCCC−3’(配列番号:372)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36465配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTCCGGTCAGCATGAGGCTCCTGGCGGCCGCTGCTCCTGCTGCTG−3’(配列番号:373)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO273遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO273の全長DNA配列[ここで、UNQ240(DNA39523−1192)と命名される](配列番号:369)及びPRO273の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ240(DNA39523−1192)の全核酸配列をFig148(配列番号:369)に示す。クローンUNQ240(DNA39423−1192)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置500−502の停止コドンで終端する(Fig148)。予測されるポリペプチド前駆体は111アミノ酸長である(Fig149)。クローンUNQ240(DNA39423−1192)はATCCに寄託されている。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。さらに、ここに提供された配列及び全遺伝子コードの知識が与えられれば、任意の与えられたアミノ酸についての対応するヌクレオチドは日常的に同定でき、その逆も可能である。
全長PRO273ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒトマクロファージ炎症タンパク質−2、サイトカイン誘発性ニューロフィル化学誘引物質2、及びニューロフィル化学誘引因子2−ベータと配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO273が新規なケモカインであることを示している。
後で更に議論するように、cDNAはバキュロウイルスベクターにサブクローニングされ、C−末端タグIgG融合タンパク質として発現される。得られたタンパク質のN−末端配列は、77アミノ酸の成熟ポリペプチドを生成するシグナル配列切断部位を決定する。成熟配列は、他のヒトCXCケモカインと31−40%の同一性を示し、4つの正準システイン残基を含むがELRモチーフを欠く。ノーザン分析は、少なくとも小腸、結腸、脾臓、リンパ節及び腎臓での発現を示した。これも後で詳細に記載するインサイツハイブリッド形成によると、mRNAは、腸絨毛の固有層及び尿細管に局在化している。
【0487】
実施例58:ヒトPRO701をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39848と命名される。DNA39848コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO701の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCAAGCTACGGAAACGTCATCGTG−3’(配列番号:376)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCCCCGAGCCAAAAGATGGTCAC−3’(配列番号:377)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39848配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTACCGGTGACCAGGCAGCAAAAGGCAACTATGGGCTCCTGGATCAG−3’(配列番号:378)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO701遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO701の全長DNA配列[ここで、UNQ365(DNA44205−1285)と命名される](配列番号:374)及びPRO701の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ365(DNA44205−1285)の全核酸配列をFig150(配列番号:374)に示す。クローンUNQ365(DNA44205−1285)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置50−52に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2498−3000の停止コドンで終端する(Fig150)。予測されるポリペプチド前駆体は816アミノ酸長である(Fig151)。Fig151に示した全長PRO701タンパク質は、約91,794ダルトンの見積もり分子量及び約5.88のpIを有し、NX(S/T)は4であった。クローンUNQ365(DNA44205− 1285)は、1998年3月31日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
さらに、Fig151に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸25に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置83、511、716及び803に潜在的N−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼB型シグネーチャー2配列は、およそ残基125〜135である。カルボキシルエステラーゼB型に相同な領域は、およそ残基54−74、197−212及び221−261である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸671〜およそ700に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
全長PRO701ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがクマネズミ属ノルベギカス(norvigicus)からのニューロリジン(neuroligin)と有意な配列類似性を有することを示唆し、PRO701が新規なヒトニューロリジンであることを示している。
【0488】
実施例59:ヒトPRO704をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43033と命名される。DNA43033コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO704の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTTGGGTCGTGGCAGCAGTGG−3’(配列番号:381)
逆方向PCRプライマー 5’−CACTCTCCAGGCTGCATGCTCAGG−3’(配列番号:382)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43033配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTCAAACGTTCGAGTACTTGAAACGGGAGCACTCGCTGTCGAAGC−3’(配列番号:383)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO704遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO704の全長DNA配列[ここで、UNQ368(DNA50911−1288)と命名される](配列番号:379)及びPRO704の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ368(DNA50911−1288)の全核酸配列をFig152(配列番号:379)に示す。クローンUNQ368(DNA50911−1288)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置8−10に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1052−1054の停止コドンで終端する(Fig152)。予測されるポリペプチド前駆体は348アミノ酸長である(Fig153)。Fig153に示した全長PRO704タンパク質は、約39,711ダルトンの見積もり分子量及び約8.7のpIを有する。クローンUNQ368(DNA50911−1288)は、1998年3月31日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
全長PRO704ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞複合膜タンパク質36と有意な配列相同性を有することを示唆し、PRO704が新規な小胞複合膜タンパク質となりうることを示している。
配列番号:380のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:380のおよそアミノ酸1−39である。膜貫通ドメインは、配列番号:380のアミノ酸310−335である。潜在的N−グリコシル化部位は、配列番号:380のおよそアミノ酸180−183である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列が与えられれば日常的に決定できる。
【0489】
実施例60:ヒトPRO706をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40669と命名される。DNA40669コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO706の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCAAGCAGCTTAGAGCTCCAGACC−3’(配列番号:386)
逆方向PCRプライマー 5’−TTCCCTATGCTCTGTATTGGCATGG−3’(配列番号:387)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40669配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCACTTCTGCCACAATGTCAGCTTTCCCTGTACCAGAAATGGCTGTGTT−3’
(配列番号:388)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO706遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO706の全長DNA配列[ここで、UNQ370(DNA48329−1290)と命名される](配列番号:384)及びPRO706の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ370(DNA48329−1290)の全核酸配列をFig154(配列番号:384)に示す。クローンUNQ370(DNA48329−1290)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置279−281に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1719−1721の停止コドンで終端する(Fig154)。予測されるポリペプチド前駆体は480アミノ酸長である(Fig155)。Fig155に示した全長PRO706タンパク質は、約55,239ダルトンの見積もり分子量及び約9.30のpIを有する。クローンUNQ370(DNA48329−1290)は、1998年4月21日にATCCに寄託された。
さらに、Fig155に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸19に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置305及び354に潜在的N−グリコシル化部位が存在する。潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位は、およそアミノ酸333に存在する。ヒスチジン酸ホスファターゼと相同な領域は、およそ残基87−102である。対応する核酸領域は提供された配列が与えられれば日常的に決定できる、即ち、コドンは与えられた特定の名称のアミノ酸から決定できる。
全長PRO706ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO706が新規なヒト前立腺酸ホスファターゼとなりうることを示している。
【0490】
実施例61:ヒトPRO707をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42775と命名される。DNA42775に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO707の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TCCGTCTCTGTGAACCGCCCCAC−3’ (配列番号:391)
逆方向PCRプライマー 5’−CTCGGGCGCATTGTCGTTCTGGTC−3’(配列番号:392)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42775配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCGACTGTGAAAGAGAACGCCCCAGATCCACTTGTTCCCC−3’(配列番号:393)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO707遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO707の全長DNA配列[ここで、UNQ371(DNA48306−1291)と命名される](配列番号:389)及びPRO707の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ371(DNA48306−1291)の全核酸配列をFig156(配列番号:389)に示す。クローンUNQ371(DNA48306−1291)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号:389のヌクレオチド位置371−373に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3119−3121の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は916アミノ酸長である(Fig157)。Fig157に示した全長PRO707タンパク質は、約100,204ダルトンの見積もり分子量及び約4.92のpIを有する。クローンUNQ371(DNA48306−1291)は、1998年5月27日にATCCに寄託された。クローンUNQ371はPRO707をコードし、そして、ここの配列は、些細な誤差を生ずるかもしれない現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
アミノ酸配列の分析に関して、シグナル配列は配列番号:390のおよそ1〜30に現れる。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列は、配列番号:390のおよそアミノ酸121−131、230−240、335−345、440−450及び550−560である。チロシンキナーゼリン酸化部位は、配列番号:390のおよそアミノ酸124−132及び580−586である。潜在的膜貫通ドメインは、およそアミノ酸682−715±5である。核酸位置は、命名されたアミノ酸の対応するコドンを参照して誘導できる。
全長PRO707ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ヒト繊維芽細胞で発現されるカドヘリンFIB3タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO707が新規なカドヘリンとなりうることを示している。
【0491】
実施例62:ヒトPRO322をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA48336と命名される。DNA48336コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO322の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCCTACAGAATAAAGATGGCCC−3’(配列番号:396)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTGCAATGATCTGCCAGGCTGAT−3’(配列番号:397)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA48336コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGAAATACCTGTGGTTCAGTCCATCCCAAACCCCTGCTACAACAGCAG−3’
(配列番号:398)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO322遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO322の全長DNA配列[ここで、UNQ283(DNA48336−1309)と命名される](配列番号:394)及びPRO322の誘導タンパク質配列を与えた。UNQ283(DNA48336−1309)は実際にPRO322をコードし、配列番号:394はこの分野で知られた配列技術に基づく配列の代表例であると理解される。
UNQ283(DNA48336−1309)の全核酸配列をFig158(配列番号:394)に示す。クローンUNQ283(DNA48336−1309)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置166−168に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置946−948の停止コドンで終端する(Fig158)。予測されるポリペプチド前駆体は260アミノ酸長である(Fig159)。Fig159に示した全長PRO322タンパク質は、約28,028ダルトンの見積もり分子量及び約7.87のpIを有する。クローンUNQ283(DNA48336−1309)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209669が付与されている。
Fig159のアミノ酸配列に関して、潜在的N−グリコシル化部位は配列番号:395のアミノ酸110である。セリンプロテアーゼ、チロシンファミリー及びヒスチジン活性部位は、配列番号:395のアミノ酸69〜74に同定され、コンセンサス配列は配列番号:395のアミノ酸207〜217に同定される。クリングルドメインタンパク質モチーフは、配列番号:395のアミノ酸205〜217に同定される。推定シグナルペプチドは、およそアミノ酸1−23でコードされる。
全長PRO322ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ニューロプシン及び他のセリンプロテアーゼと有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO322が新規なセリンプロテアーゼ関連ニューロプシンとなりうることを示している。
【0492】
実施例63:ヒトPRO526をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39626と命名される。DNA39626コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO526の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGCTGCCCTGCAGTACCTCTACC−3’(配列番号:401)
逆方向PCRプライマー 5’−CCCTGCAGGTCATTGGCAGCTAGG−3’(配列番号:402)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39626コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGGCACTGCCTGATGACACCTTCCGCGACCTGGGCAACCTCACAC−3’(配列番号:403)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO526遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO526の全長DNA配列[ここで、UNQ330(DNA44184−1319)と命名される](配列番号:399)及びPRO526の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ330(DNA44184−1319)の全核酸配列をFig160(配列番号:399)に示す。クローンUNQ330(DNA44184−1319)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置514−516に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1933−1935の停止コドンで終端する(Fig160)。予測されるポリペプチド前駆体は473アミノ酸長である(Fig161)。Fig161に示した全長PRO526タンパク質は、約50,708ダルトンの見積もり分子量及び約9.28のpIを有する。クローンUNQ330(DNA44184−1319)は1998年3月26日にATCCに寄託された。このクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO526ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ALS、SLIT、カルボキシペプチダーゼ及び血小板糖タンパク質Vを含むロイシンリピート豊富なタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO526がタンパク質−タンパク質相互作用に含まれる新規なタンパク質であることを示している。
配列番号:400の更なる分析により、シグナルペプチドはおよそアミノ酸1−26にある。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸135−156にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸436−439にある。N−グリコシル化部位は、およそアミノ酸82−85、179−182、237−240及び423−426にある。フォンウィルブランド因子(VWF)型Cドメインは、およそアミノ酸411−425に見られる。当業者は、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸に対応するヌクレオチドを理解できる。
【0493】
実施例64:ヒトPRO531をコードするcDNAクローンの単離
ECDデータベースを検索し、プロトカドヘリン3と相同性を示す発現配列タグ(EST)をLIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAから同定した。この配列に基づいて、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として検索を実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/ phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。
他のEST配列に対してphrapを用いてコンセンサス配列を構築した。得られたコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO531の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTGAGAACGCGCCTGAAACTGTG−3’(配列番号:406)
逆方向PCRプライマー 5’−AGCGTTGTCATTGACATCGGCG−3’ (配列番号:407)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTAGTTGCTCCATTCAGGAGGATCTACCCTTCCTCCTGAAATCCGCGGAA−3’
(配列番号:408)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でのPCR増幅でスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO531遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, Caからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照にこと)に、独特のXol及びNotI部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO531の全長DNA配列[ここで、UNQ332(DNA48314−1320)と命名される](配列番号:404)及びPRO531の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ332(DNA48314−1320)の全代表的核酸配列をFig162(配列番号:404)に示す。実際の配列は、ATCCにDNA48314−1320として寄託されたクローン内にあると理解される。クローンUNQ332(DNA48314−1320)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置171−173に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2565−2567の停止コドンで終端する(Fig162)。予測されるポリペプチド前駆体は789アミノ酸長である(Fig163)。Fig163に示した全長PRO531タンパク質は、約87,552ダルトンの見積もり分子量及び約4.84のpIを有する。クローンUNQ332(DNA48314−1320)は1998年3月26日にATCCに寄託された。
全長PRO531ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、プロトカドヘリン3と有意な相同性を有することを示唆している。さらに、PRO531は他のプロトカドヘリンと同様に脳に見出され、それによりPRO531がカドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
配列番号:405の更なる分析により、カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは、配列番号:405のおよそアミノ酸122−132、231−241、336−346、439−449及び549−559に見られる。ATP/GTP結合部位モチーフ(P−ループ)は、配列番号:405のおよそアミノ酸285−292に見られる。N−グリコシル化部位は、配列番号:405のおよそアミノ酸567−570、786−790、418−421及び336−339に見られる。シグナルペプチドは配列番号:405のおよそアミノ酸1−26、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸685−712にある。
【0494】
実施例65:ヒトPRO534をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43038と命名される。DNA43048コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO534の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CACAGAGCCAGAAGTGGCGGAATC−3’(配列番号:411)
逆方向PCRプライマー 5’−CCACATGTTCCTGCTCTTGTCCTGG−3’(配列番号:412)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43038配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGGTAGTGACTGTACTCTAGTCCTGTTTTACACCCCGTGGTGCCG−3’(配列番号:413)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO534遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO534の全長DNA配列[ここで、UNQ335(DNA48333−1321)と命名される](配列番号:409)及びPRO534の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ335(DNA48333−1321)の全核酸配列をFig164(配列番号:409)に示す。クローンUNQ335(DNA48333−1321)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置87−89に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1167−1169の停止コドンで終端する(Fig164)。予測されるポリペプチド前駆体は360アミノ酸長である(Fig165)。Fig165に示した全長PRO534タンパク質は、約39,885ダルトンの見積もり分子量及び約4.79のpIを有する。クローンUNQ335(DNA48333−1321)は1998年3月26日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO534ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO534が新規なジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。
PRO534のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:410のおよそアミノ酸1−25である。膜貫通ドメインは配列番号:410のおよそアミノ酸321−340である。ジスルフィドイソメラーゼ対応領域は配列番号:410のおよそアミノ酸212−302である。チオレドキシンドメインは配列番号:410のおよそ亜物酸211−227である。N−グリコシル化部位は、配列番号:410の165−168、181−184、187−190、194−197、206−209、278−281及び293−296にある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。PRO534は、他のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと同様にER保持ペプチドではなく膜貫通ドメインを有する。さらに、PRO534は5プライム末端にイントロンを有してもよい。
【0495】
実施例66:ヒトPRO697をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43052と命名される。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO697の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTGGCTCGCTGCTGCTGCTC−3’ (配列番号:416)
逆方向PCRプライマー 5’−CCTCACAGGTGCACTGCAAGCTGTC−3’(配列番号:417)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43052配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTCTTCCTCTTTGGCCAGCCCGACTTCTCCTACAAGCGCAGAATTGC−3’(配列番号:418)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO697遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO697の全長DNA配列[ここで、UNQ361(DNA50920−1325)と命名される](配列番号:414)及びPRO697の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ361(DNA50920−1325)の全核酸配列をFig166(配列番号:414)に示す。クローンUNQ361(DNA50920−1325)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置44−46に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置929−931の停止コドンで終端する(Fig166)。予測されるポリペプチド前駆体は295アミノ酸長である(Fig167)。Fig167に示した全長PRO697タンパク質は、約33,518ダルトンの見積もり分子量及び約7.74のpIを有する。クローンUNQ361(DNA50920−1325)は1998年3月26日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO697ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、sFRPsと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO697が新規なsFRPファミリーメンバーとなりうることを示している。
PRO697のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:415のおよそアミノ酸1−20である。縮れた(frizzled)N−末端と同一性を持つシステイン富化ドメインは配列番号:415のおよそアミノ酸6−153である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0496】
実施例67:ヒトPRO717をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42829と命名される。DNA42829コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO717の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGCTTCTCAGCCCTCCTGGAGCAG−3’(配列番号:421)
逆方向PCRプライマー 5’−CGGGTCAATAAACCTGGACGCTTGG−3’(配列番号:422)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42829配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TATGTGGACCGGACCAAGCACTTCACTGAGGCCACCAAGATTG−3’(配列番号:423)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO717遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO717の全長DNA配列[ここで、UNQ385(DNA50988−1326)と命名される](配列番号:419)及びPRO717の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ385(DNA50988−1326)の全核酸配列をFig168(配列番号:419)に示す。クローンUNQ385(DNA50988−1326)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置17−19に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1697−1699の停止コドンで終端する(Fig168)。予測されるポリペプチド前駆体は560アミノ酸長である(Fig169)。Fig169に示した全長PRO717タンパク質は、約58,427ダルトンの見積もり分子量及び約6.86のpIを有する。クローンUNQ385(DNA50988−1326)は1998年4月28日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づいていると理解される。
全長PRO717ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO717が新規な12膜貫通レセプターとなりうることを示している。DNA50988の逆補体鎖は、ヒト調節性ミオシン軽鎖と同一的に適合する伸展を有する。
配列番号:420のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号:420のおよそアミノ酸30−50、61−79、98−112、126−146、169−182、201−215、248−268、280−300、318−337、341−357、375−387、及び420−441である。N−グリコシル化部位は配列番号:420のおよそアミノ酸40−43及び43−46である。グリコサミノグリカン結合部位は配列番号:420のおよそアミノ酸468−471である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0497】
実施例68:ヒトPRO731をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)データベースの検索にデータベースを使用した。ここで用いたESTデータベースは、独自に開発されたEST DNAデータベース、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAである。Incyteクローン2581326を、ここでDNA42801と命名する。DNA42801配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO731の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTAAGCACATGCCTCCAGAGGTGC−3’(配列番号:426)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGACGTGGATGCTTGGGATGTTG−3’(配列番号:427)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42801配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TGGACACCTTCAGTATTGATGCCAAGACAGGCCAGGTCATTCTGCGTCGA−3’
(配列番号:428)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO731遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等,Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXol及びNotI部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO731の全長DNA配列[ここで、UNQ395(DNA48331−1329)と命名される](配列番号:424)及びPRO731の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ395(DNA48331−1329)の全核酸配列をFig170A−B(配列番号:424)に示す。クローンUNQ395(DNA48331−1329)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置329−331に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3881−3883の停止コドンで終端する(Fig170A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は1184アミノ酸長である(Fig171)。Fig171に示した全長PRO731タンパク質は、約129,022ダルトンの見積もり分子量及び約5.2のpIを有する。クローンUNQ395(DNA48331−1329)は1998年3月31日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO731ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、多数のプロトカドヘリンファミリーと有意な同一性及び類似性を有することを示唆し、それによりPRO731が新規なプロトカドヘリンとなりうることを示している。
配列番号:425のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:425のおよそアミノ酸1−13である。膜貫通ドメインは配列番号:425のおよそアミノ酸719−739である。配列番号:425のN−グリコシル化部位は次の通りである:415−418、582−586、659−662、662−665及び857−860。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは(配列番号:425の)およそアミノ酸123−133、232−242、340−350、448−458及び553−563である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0498】
実施例69:ヒトPRO218をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA17411と命名される。2つの独自に開発したジェネンテクEST配列をコンセンサス構築に使用し、それらをFig174及び175に示した。DNA17411コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO218の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AAGTGGAGCCGGAGCCTTCC−3’(配列番号:433)
逆方向PCRプライマー 5’−TCGTTGTTTATGCAGTAGTCGG−3’(配列番号:434)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA17411配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATTGTTTAAAGACTATGAGATACGTCAGTATGTTGTACAGG−3’(配列番号:435)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO218遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB28)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO218の全長DNA配列[ここで、UNQ192(DNA30867−1335)と命名される](配列番号:429)及びPRO218の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ192(DNA30867−1335)の全核酸配列をFig172(配列番号:429)に示す。クローンUNQ192(DNA30867−1335)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置150−152に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1515−1517の停止コドンで終端する(Fig172)。予測されるポリペプチド前駆体は455アミノ酸長である(Fig173)。Fig173に示した全長PRO218タンパク質は、約52,917ダルトンの見積もり分子量及び約9.5のpIを有する。クローンUNQ192(DNA30867−1335)は1998年4月28日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO218ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO218が新規な膜貫通タンパク質となりうることを示している。
配列番号:430のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:430のおよそアミノ酸1〜23である。膜貫通ドメインは潜在的に配列番号:430のおよそアミノ酸37−55、81−102、150−168、288−311、338−356、375−398及び425−444である。N−グリコシル化部位は配列番号:430のおよそアミノ酸67、180及び243にある。真核生物コバラミン(cobalamin)結合タンパク質は配列番号:430のおよそアミノ酸151−160である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0499】
実施例70:ヒトPRO768をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43448と命名される。DNA43448コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO768の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCTGACACCGCAGTGCTCTTCAG−3’(配列番号:438)
逆方向PCRプライマー 5’−GCTGCTGGGGACTGCAATGTAGCT−3’(配列番号:439)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43448配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CATCCTCCATGTCTCCCATGAGGTCTCTATTGCTCCACGAAGCATC−3’(配列番号:440)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO768遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO768の全長DNA配列[ここで、UNQ406(DNA55737−1345)と命名される](配列番号:436)及びPRO768の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ406(DNA55737−1345)の全核酸配列をFig176A−B(配列番号:436)に示す。クローンUNQ406(DNA55737−1345)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置20−22に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3443−3445の停止コドンで終端する(Fig176A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は1141アミノ酸長である(Fig177)。Fig177に示した全長PRO768タンパク質は、約124,671ダルトンの見積もり分子量及び約5.82のpIを有する。クローンUNQ406(DNA55737−1345)は1998年4月6日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO768ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がインテグリン7と有意な配列同一性及び類似性を有することを示唆している。
配列番号:437のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:437のおよそアミノ酸1−33である。膜貫通ドメインは配列番号:437のアミノ酸1039−1064にある。N−グリコシル化部位は配列番号:437のアミノ酸:86−89、746−749、949−952、985−988、及び1005−1008にある。インテグリンアルファ鎖タンパク質ドメインは配列番号:437のおよそアミノ酸:1064−1071、384−409、1041−1071、317−346、443−465、385−407、215−224、634−647、85−99、322−346、470−479、442−466、379−408及び1031−1047である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0500】
実施例71:ヒトPRO771をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43330と命名される。DNA43330配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO771の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCAATATTCAGAAGCGGCAAGGG−3’(配列番号:443)
逆方向PCRプライマー 5’−CATCATGGTCATCACCACCATCATCATC−3’
(配列番号:444)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43330コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTTACTACAAGCCAACACAATGTCATGGCAGTGTTGGACAGTGCTGG−3’ (配列番号:445)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO771遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB28)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO771の全長DNA配列[ここで、UNQ409(DNA49829−1346)と命名される](配列番号:441)及びPRO771の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ409(DNA49829−1346)の全核酸配列をFig178(配列番号:441)に示す。クローンUNQ409(DNA49829−1346)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1442−1444の停止コドンで終端する(Fig178)。予測されるポリペプチド前駆体は436アミノ酸長である(Fig179)。Fig179に示した全長PRO771タンパク質は、約49,429ダルトンの見積もり分子量及び約4.8のpIを有する。クローンUNQ409(DNA49829−1346)は1998年4月7日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO771ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がテスチカ(testican)タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO771が新規なテスチカン相同体となりうることを示している。
配列番号:442のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、ロイシンジッパーパターン、N−ミリストイル化部位、及びチログロブリン(thyroglobulin)1型リピートもFig179に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0501】
実施例72:ヒトPRO733をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA45600と命名される。DNA45600コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO733の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCAGCAGGGATGGGCGACAAGA−3’(配列番号:448)
逆方向PCRプライマー 5’−GTCTTCCAGTTTCATATCCAATA−3’(配列番号:449)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA45600コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAGAAGGAGCACGGGGAAGGGCAGCCAGATCTTGTCGCCCAT−3’(配列番号:450)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO733遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO733の全長DNA配列[ここで、UNQ411(DNA52196−1348)と命名される](配列番号:446)及びPRO733の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ411(DNA52196−1348)の全核酸配列をFig180A−B(配列番号:446)に示す。クローンUNQ411(DNA52196−1348)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置793−795の停止コドンで終端する(Fig180A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は229アミノ酸長である(Fig181)。Fig181に示した全長PRO733タンパク質は、約26,017ダルトンの見積もり分子量及び約4.73のpIを有する。クローンUNQ411(DNA52196−1348)は1998年4月7日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO733ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がT1/ST2レセプター結合タンパク質前駆体と有意な配列同一性及び類似性を有し、従って細胞シグナル伝達において類似の機能を有することを示唆している。それがサイトカインである場合、炎症及び癌の治療に有用であろう。
配列番号:447のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、N−ミリストイル化部位、及びチロシンキナーゼ部位もFig181に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0502】
実施例73:ヒトPRO162をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベースを検索し、ヒト膵炎関連タンパク質と相同性を示すEST AA397543を同定した。EST AA397543コール(cole)を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig182(配列番号:451)に示した。
PRO162の全核酸配列をFig182(配列番号:451)に示す。このクローンのDNA配列は、PRO162の全長DNA配列[ここで、UNQ429(DNA56965−1356)と命名される](配列番号:451)及びPRO162の誘導タンパク質配列を与えた。クローンUNQ429(DNA56965−1356)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置86−88に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置611−613の停止コドンで終端する(Fig182)。予測されるポリペプチド前駆体は175アミノ酸長である(Fig183)。Fig183に示した全長PRO162タンパク質は、約19,330ダルトンの見積もり分子量及び約7.25のpIを有する。クローンUNQ429(DNA56965−1356)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO162ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト膵炎関連タンパク質と有意な相同性する事を示唆し、それによりPRO162が新規な膵炎関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号:452のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:452のおよそアミノ酸1−26である。C型レクチンドメインシグネーチャーは配列番号:452のおよそアミノ酸146−171である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0503】
実施例74:ヒトPRO788をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列(ここでDNA49308と命名する)を構築した。DNA49308コンセンサス配列とIncyteESTクローン番号2777282との間に観察された相同性に基づき、IncyteESTクローン番号2777282を購入し、その挿入物を得て配列決定し、PRO788の全長DNA配列[ここで、UNQ430(DNA56405−1357)と命名される](配列番号:453)及びPRO788の誘導タンパク質配列を与えた。
クローンUNQ430(DNA56405−1357)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置84−86に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置459−461の停止コドンで終端する(Fig184)。予測されるポリペプチド前駆体は125アミノ酸長である(Fig185)。Fig185に示した全長PRO788タンパク質は、約13,115ダルトンの見積もり分子量及び約5.90のpIを有する。クローンUNQ430(DNA56405−1357)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
Fig185の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:454のおよそアミノ酸1−17に見られる。N−グリコシル化部位は配列番号:454のおよそアミノ酸46−49である。
【0504】
実施例75:ヒトPRO1008をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列をDNA49804と命名する。ジェネンテクが独自に開発したESTをコンセンサス構築に用い、ここでDNA16508(Fig188;配列番号:457)と命名する。DNA49804配列とMerckESTクローン番号AA143670との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号AA143670を購入し、その挿入物を得て配列決定した。ここで、この配列はFig186(配列番号:455)に示す。
配列決定は、PRO1008の全長DNA配列[ここで、UNQ492(DNA57530−1375)と命名される](配列番号:455)及びPRO1008の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ492(DNA57530−1375)の全核酸配列をFig186(配列番号:455)に示す。クローンUNQ492(DNA57530−1375)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置138−140に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置936−938の停止コドンで終端する(Fig186)。予測されるポリペプチド前駆体は266アミノ酸長である(Fig187)。Fig187に示した全長PRO1008タンパク質は、約28,672ダルトンの見積もり分子量及び約8.85のpIを有する。クローンUNQ492(DNA57530−1375)は1998年5月20日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1008ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がmdkk−1と有意な配列同一性及び/又は類似性を有し、それによりPRO1008がこのファミリーの新規なメンバーであり、ヘッド誘発活性を有することを示している。
配列番号:456のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:456のおよそアミノ酸1−23である。N−グリコシル化部位は配列番号:456のおよそアミノ酸256−259であり、真菌zn−(2)−cys(6)二核クラスタードメインは配列番号:456のおよそアミノ酸110−126である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0505】
実施例76:ヒトPRO1012をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA49313と命名される。DNA49313コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1012の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACTCCCCAGGCTGTTCACACTGCC−3’(配列番号:460)
逆方向PCRプライマー 5’−GATCAGCCAGCCAATACCAGCAGC−3’(配列番号:461)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49313コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGTGATGATAGAATGCTTTGCCGAATGAAAGGAGTCAACAGCTATCCC−3’
(配列番号:462)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1012遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1012の全長DNA配列[ここで、UNQ495(DNA56439−1376)と命名される](配列番号:458)及びPRO1012の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ495(DNA56439−1376)の全核酸配列をFig189A−B(配列番号:458)に示す。クローンUNQ495(DNA56439−1376)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置404−406に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2645−2647の停止コドンで終端する(Fig189A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は747アミノ酸長である(Fig190)。Fig190に示した全長PRO1012タンパク質は、約86,127ダルトンの見積もり分子量及び約7.46のpIを有する。クローンUNQ495(DNA56439−1376)は1998年5月14日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1012ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有し、それによりPRO1012が新規なジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号:459のアミノ酸配列の更なる分析により、チトクロムCファミリーヘム結合部位シグネーチャーは配列番号:459のおよそアミノ酸158−163である。Nt−DNAJドメインシグネーチャーは配列番号:459のおよそアミノ酸77−96である。N−グリコシル化部位は配列番号:459のおよそアミノ酸484−487である。ER標的配列は配列番号:459のおよそアミノ酸744−747である。開示したポリペプチド及び核酸は、これに換わる実施例において、必要に応じてこれらの部分有り又は無しで日常的に作成できると理解される。例えば、ER標的配列無しのPRO1012を生成するのが好ましい場合もある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0506】
実施例77:ヒトPRO1014をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、得られたコンセンサス配列をDNA49811と命名する。DNA49811配列とIncyteESTクローン番号2612207との間に観察された相同性に基づき、IncyteESTクローン番号2612207を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig191(配列番号:463)に示す。
配列決定は、PRO1014の全長DNA配列[ここで、UNQ497(DNA56409−1377)と命名される](配列番号:463)及びPRO1014の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ497(DNA56409−1377)の全核酸配列をFig191(配列番号:463)に示す。クローンUNQ497(DNA56409−1377)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置66−68に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置966−968の停止コドンで終端する(Fig191)。予測されるポリペプチド前駆体は300アミノ酸長である(Fig192)。Fig192に示した全長PRO1014タンパク質は、約33,655ダルトンの見積もり分子量及び約9.31のpIを有する。クローンUNQ497(DNA56409−1377)は1998年5月20日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1014ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がレダクターゼと有意な配列同一性を有し、それによりPRO1014がレダクターゼファミリーの新規なメンバーとなることを示している。
配列番号:464のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:464のおよそアミノ酸1−19である。cAMP及びcGMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:464のおよそアミノ酸30−33である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号:464のおよそアミノ酸165−202、37−49、112−122及び210−219である。これらのドメイン及び他のここに提供したアミノ酸の対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0507】
実施例78:ヒトPRO1017をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA53235と命名する。DNA53235配列とMerckESTクローン番号AA243086との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号AA243086を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig193(配列番号:465)に示した。DNA配列決定は、PRO1017の全長DNA配列[ここで、UNQ500(DNA56112−1379)と命名される](配列番号:456)及びPRO1017の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ500(DNA56112−1379)の全核酸配列をFig193(配列番号:465)に示す。クローンUNQ500(DNA56112−1379)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置128−130に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1370−1372の停止コドンで終端する(Fig193)。予測されるポリペプチド前駆体は414アミノ酸長である(Fig194)。Fig194に示した全長PRO1017タンパク質は、約48,414ダルトンの見積もり分子量及び約9.54のpIを有する。クローンUNQ500(DNA56112−1379)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1017ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がHNK−1、スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有し、それによりPRO1017が新規なスルホトランスフェラーゼとなりうることを示している。
配列番号:466のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:466のおよそアミノ酸1−31である。N−グリコシル化部位は配列番号:466のおよそアミノ酸134−137、209−212、280−283及び370−273である。TNFR/NGFRファミリーシステイン富化領域タンパク質は配列番号:466のおよそアミノ酸329−332である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0508】
実施例79:ヒトPRO474をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、得られたコンセンサス配列をDNA49818と命名する。DNA49818配列とMerckESTクローン番号H77889との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号H77889を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig195(配列番号:467)に示した。DNA配列決定は、PRO474の全長DNA配列[ここで、UNQ502(DNA56045−1380)と命名される](配列番号:467)及びPRO474の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ502(DNA56045−1380)の全核酸配列をFig195(配列番号:467)に示す。クローンUNQ502(DNA56045−1380)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置916−918の停止コドンで終端する(Fig195)。予測されるポリペプチド前駆体は270アミノ酸長である(Fig196)。Fig196に示した全長PRO474タンパク質は、約28,317ダルトンの見積もり分子量及び約6.0のpIを有する。クローンUNQ502(DNA56045−1380)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:468のアミノ酸配列の更なる分析により、N−グリコシル化部位は配列番号:468のおよそアミノ酸138−141である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号:468のおよそアミノ酸10−22、81−91、134−171及び176−185である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0509】
実施例80:ヒトPRO1031をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対して最初のコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA47332と命名する。DNA47332配列とMerckESTクローン番号W74558との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号W74558を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig197(配列番号:469)に示した。DNA配列決定は、PRO1031の全長DNA配列[ここで、UNQ516(DNA59294−1381)と命名される](配列番号:469)及びPRO1031の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ516(DNA59294−1381)の全核酸配列をFig197(配列番号:469)に示す。クローンUNQ516(DNA59294−1381)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置42−44に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置582−584の停止コドンで終端する(Fig197)。予測されるポリペプチド前駆体は180アミノ酸長である(Fig198)。Fig198に示した全長PRO1031タンパク質は、約20,437ダルトンの見積もり分子量及び約9.58のpIを有する。クローンUNQ516(DNA59294−1381)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1031ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが新規なサイトカインであることを示唆している。
配列番号:470のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:470のおよそアミノ酸1−20である。N−グリコシル化部位は配列番号:470のおよそアミノ酸75−78である。IL−17と配列同一性を持つ領域はおよそアミノ酸96−180である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0510】
実施例81:ヒトPRO938をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対して最初のコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA49798と命名する。DNA49798DNAコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO938の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTCCAGCCCATGACCGCCTCCAAC−3’(配列番号:473)逆方向PCRプライマー 5’−CTCTCCTCATCCACACCAGCAGCC−3’(配列番号:474)さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49798コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGATGCTGAAATTTTACGCCCCATGGTGTCCATCCTGCCAGC−3’(配列番号:475)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO938遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO938の全長DNA配列[ここで、UNQ475(DNA56433−1406)と命名される](配列番号:471)及びPRO938の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ475(DNA56433−1406)の全核酸配列をFig199(配列番号:471)に示す。クローンUNQ475(DNA56433−1406)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1181−1183の停止コドンで終端する(Fig199)。予測されるポリペプチド前駆体は349アミノ酸長である(Fig200)。Fig200に示した全長PRO938タンパク質は、約38,952ダルトンの見積もり分子量及び約4.34のpIを有する。Fig200(配列番号:472)に示す全長PRO938配列の分析により以下の特徴が明らかとなった:約アミノ酸1〜約アミノ酸22のシグナルペプチド、約アミノ酸191〜約アミノ酸211の膜貫通ドメイン、約アミノ酸46〜約アミノ酸49の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸56〜約アミノ酸72のジスルフィドイソメラーゼ相同領域、及び約アミノ酸173〜約アミノ酸187のフラボドキシンタンパク質と配列同一性を持つ領域。
クローンUNQ475(DNA56433−1406)は1998年5月12日にATCCに寄託され、ATCC登録番号209857が付与されている。
全長PRO938ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有し、それによりPRO938が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO938アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W03626, P_W03627, P_R70491, GARP_PLAFF, XLU85970_1, ACADISPROA_1, IE68_HSVSA, KSU520 64_1, U93872_83, P_R97866との間の有意な相同性を明らかにした。
【0511】
実施例82:ヒトPRO1082をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA38097と命名する。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1082の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTCCACAGACAGTCATCTCAGGAGCAG−3’
(配列番号:478)
正方向PCRプライマー 5’−ACAAGTGTCTTCCCAACCTG−3’(配列番号:479)
逆方向PCRプライマー 5’−ATCCTCCCAGAGCCATGGTACCTC−3’(配列番号:480)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38097コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAAGGATAGCTGTTGTTTCAGAGAAAGGATCGTGTGCTGCATCTCCTCCT−3’
(配列番号:481)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1082遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1082の全長DNA配列[ここで、UNQ539(DNA53912−1457)と命名される](配列番号:476)及びPRO1082の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ539(DNA53912−1457)の全核酸配列をFig201(配列番号:476)に示す。クローンUNQ539(DNA53912−1457)は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置160−162に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置763−765の停止コドンで終端する(Fig201)。予測されるポリペプチド前駆体は201アミノ酸長である(Fig202)。Fig202に示した全長PRO1082タンパク質は、約22,563ダルトンの見積もり分子量及び約4.87のpIを有する。クローンUNQ539(DNA53912−1457)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:477のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号:477のおよそアミノ酸45−65である。cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:477のおよそアミノ酸197−200である。N−ミリストイル化部位は配列番号:477のおよそアミノ酸35−40及び151−156である。LDLレセプターと配列同一性を持つ領域は配列番号:477のおよそアミノ酸34−67及び70−200である。これらのアミノ酸領域及び他に対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0512】
実施例83:ヒトPRO1083をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したアミラーゼスクリーニング技術を用いてcDNAを同定し、そのcDNAをここでDNA24256(Fig205;配列番号:484)と命名する。次いで、上記実施例1に記載したように、このcDNAを他のEST配列と比較して整列させてコンセンサスDNA配列を得て、それをDNA43422と命名する。DNA43422コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1083の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCATTGGAGCAGTGCTGGGTG−3’(配列番号:485)
逆方向PCRプライマー 5’−TGGAGGCCTAGATGCGGCTGGACG−3’(配列番号:486)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1083遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1083の全長DNA配列[ここで、UNQ540(DNA50921−1458)と命名される](配列番号:482)及びPRO1083の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ540(DNA50921−1458)の全核酸配列をFig203(配列番号:482)に示す。クローンUNQ540(DNA50921−1458)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置214−216に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2293−2295の停止コドンで終端する(Fig203)。予測されるポリペプチド前駆体は693アミノ酸長である(Fig204)。Fig204に示した全長PRO1083タンパク質は、約77,738ダルトンの見積もり分子量及び約8.87のpIを有する。クローンUNQ540(DNA50921−1458)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:483のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:483のおよそアミノ酸1−25である。膜貫通ドメインは配列番号:483のおよそアミノ酸382−398、402−420、445−468、473−491、519−537、568−590及び634−657である。微小体C−末端標的化シグナルは配列番号:483のおよそアミノ酸691−693である。cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:配列番号:483のおよそアミノ酸198−201及び370−373である。N−グリコシル化部位は配列番号:483のおよそアミノ酸39−42、148−151、171−174、234−237、303−306、324−227及び341−344である。G−プロテイン結合ファミリードメインは配列番号:483のおよそアミノ酸475−504である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0513】
実施例84:ヒトPRO200をコードするcDNAクローンの単離
VEGFとの相同性に基づいてIncyte Phamaceuticalsデータベースから同定された発現配列タグ(EST)に基づくプローブを、ヒト神経膠腫細胞系G61から誘導されたcDNAライブラリのスクリーニングに使用した。特に、Incyteクローン「INC1302516」は以下のプローブを生成するのに用いた:
(配列番号:489)ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG;
(配列番号:490)GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC;
(配列番号:491)CACCACAGCGTTTAACCAGG;及び
(配列番号:492)ACAACAGGCACAGTTCCCAC。
9つのポジティブを同定し特徴付けした。3つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させない1つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
【0514】
実施例85:PRO200の発現作成物
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム(ORF)をCMV−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ(FLAG, Kodak)及びヒスチジンタグ(His8)をORFと停止コドンの間に挿入した。VEGF−E−His8及びVEGF−E−FLAGを、Superfect(Qiagen)によりヒト胚腎臓293細胞に形質移入し、[35S]メチオニン及び[35C]システインで3時間パルス標識した。15倍濃縮無血清条件培地20マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動させたとき、両方のエピトープタグタンパク質を同時泳動させた(SDS−PAGE)。ヒトFc(IgG)配列の前でORFにクローニングすることによりVEGF−E−IgG発現プラスミドを作成した。
VEGF−E−IgGプラスミドを、Lipofectin(GibcoBRL)を用いて、10%ウシ胎児血清を添加したハンクのTNM−FH培地(JRH Biosciences)において成長させた105Sf9細胞にBaculogoldバキュロウイルスDNA(Pharmagen)で同時形質移入した。細胞を28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、次いで約10の感染多発性(MOI)でのSf9細胞感染による第1のウイルス増幅に使用した。細胞を3日間インキュベートし、次いで上清を回収し、1mlの上清の30μlのプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)への結合、続くSDS−PAGE分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第1の増幅の上清を、ESF−921培地(Expression Systems LLC)で約0.1のMOIで成長させたSf9細胞のスピナー培地500mlの感染に使用して。回収した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインAセファロース4ファストフロー(Pharmacia)カラムに結合させることにより精製した。
【0515】
実施例86:PRO200のノーザンブロット分析
複数の成人及び胎児組織及び腫瘍細胞系からヒトポリ(A)+RNAのブロットをClontech(Palo alto, CA)から得た。ハイブリッド形成は、全コード化領域を含む32P−標識プローブを用いて実施し、0.1xSSC、0.1%SDSで63℃において洗浄した。
VEGF−EmRNAは、胎児肺、腎臓、脳、肝臓及び成人心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓で検出可能であった。またVEGF−EmRNAは、A549肺腺癌及びHeLa頸部腺癌細胞系でも見られた。
【0516】
実施例87:PRO200についてのヒト胎児組織切片のインサイツハイブリッド形成
ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト胎児脳、肝臓、下肢、小腸、甲状腺、リンパ腺、胸腺、副腎、心臓、大動脈、及び皮膚を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20μg/ml)で37℃において15分間脱タンパクし、さらに、Lu LH及びGillett NA(Cell Vision 1: 169−176, 1994)に記載されているようにインサイツハイブリッド形成のために加工した。[α−33−P]UTP−標識アンチセンスリボプローブを98bpのPCR産物(プライマーGGCGGAATCCAACCTGAGTAG及びGCGGCTATCCTCCTGTGCTC、各々配列番号:493及び494)から生成した。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬し4週間露出した。
VEGF−EmRNA発現は成長プレート領域での局在化及び胎児筋細胞の包囲を含んでいた。
【0517】
実施例88:PRO200についての筋細胞肥大アッセイ
新生ハーランSDラット心室(妊娠23日)からの筋細胞を、96−ウェルプレートにおいて75000細胞/mlで2通りに配した。細胞を。2000、200、20、又は2ng/mlのVEGF−E−IgGで48時間処理した。筋細胞をクリスタルバイオレットで染色して形態を可視化し、3を無刺激及び7を完璧な肥大として3から7の評点付けをした。
2000ng/ml及び200ng/mlのVEGF−Eは肥大を生じ、5に評点付けされた。
【0518】
実施例89:PRO200についての細胞増殖アッセイ
マウス胚繊維芽細胞C3HlOT1/2細胞(ATCC)を、10%のウシ胎児血清(FCS)を含む50:50のハムF−12:低グルコースDMEM培地で成長させた。細胞を24−ウェルペレットにおいて1000、2000及び4000細胞/ウェルで2通りには配した。48時間後、細胞を2%FCSを含む培地に移し、200、800、又は2000ng/mlVEGF−Eと共に、又は成長因子を添加せずに72時間インキュベートした。
3種の細胞密度の全てにおいて、200ng/mlのVEGF−Eが存在すると、それが無い場合より約1.5倍多数の細胞が測定された。
【0519】
実施例90:PRO200についての内皮細胞生存アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を完全培地(Cell Systems)中に維持し、48−ウェルプレートに20,000細胞/ウェルで、無血清培地(Cell Systemからの基本培地、0.1%BSA含有)に3回蒔いた。細胞を、200又は400ng/mlのVEGF−E−IgG、100ng/mlのVEGF、20ng/mlの塩基性EGFと共に、又は無添加で5日間インキュベートした。
VEGF−Eでは、成長因子無添加に比較して2−3倍の多くが生存していた。VEGF及びEGFは正の対照に含まれる。
【0520】
実施例91:ヒトPRO285をコードするcDNAクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索して、ショウジョウバエTollタンパク質と相同性を示すEST(#2243209)を同定した。
ESTに基づいて、PCRプローブの対:
TAAAGACCCAGCTGTGACCG(配列番号:499)
ATCCATGAGCCTCTGATGGG (配列番号:500)、及び
プローブ:
ATTTATGTCTCGAGGAAAGGGACTGGTTACCAGGGCAGCCAGTTC(配列番号:501)を合成した。
cDNAライブラリを作成するためのmRNAはヒト胎盤組織から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CA(Fast Track 2)からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen, Inc.)に、Life Technoligies, Gaithersburg, MD(Super script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いてクローニングした。2本鎖cDNAを1000bpより大きなものにサイズ分類し、cDNAをBamHI/NotI切断ベクターにクローニングした。pCR2.1は市販のプラスミドであり、PCR断片の容易なクローニングのために設計され、選択のためのAmpR及びKanR遺伝子及び青−白選択のためのLacZ遺伝子を保有する。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO285遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAクローン全体を配列決定した。DNA40021−1154(PRO285をコードする)の全核酸配列をFig208(配列番号:495)に示す。クローンDNA40021−1154は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置61−63に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig208)。予測されるポリペプチド前駆体は1049アミノ酸長であり、アミノ酸位置1−29に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置837−860に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置132−153及び704−725にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンDNA40021−1154はATCCに寄託され(命名:DNA40021−1154)、ATCC寄託番号209389が付与された。
(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、全長配列は、ショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトTollタンパク質の相同体である:Toll(DNAX# HSU88540−1これはランダム配列した全長cDNA #HUMRSC786−1と同一である);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(DNAX# HSU88880−1)。
【0521】
実施例92:ヒトPRO286をコードするcDNAクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索して、ショウジョウバエTollタンパク質と相同性を示すEST(#694401)を同定した。
ESTに基づいて、PCRプローブの対(正及び逆方向):
GCCGAGACAAAAACGTTCTCC(配列番号:502)
CATCCATGTTCTCATCCATTAGCC(配列番号:503)、及び
プローブ:
TCGACAACCTCATGCAGAGCATCAACCAAAGCAAGAAAACAGTATT(配列番号:504)を合成した。
cDNAライブラリを作成するためのmRNAはヒト胎盤組織から単離した。このRNAは、ベクターpRK5DにおいてオリゴdTプライムしたcDNAライブラリを、Life Technoligies, Gaithersburg, MD(Super script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いて生成するのに使用した。pRK5は、XhoI/NotIcDNAクローニング部位の前にSfiI制限酵素部位に続くsp6転写開始部位を持つクローニングベクターである。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で約1000bpより大きなサイズ分類し、所定の方向でXhoI/NotI−切断pRKDにクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO286遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAクローン全体を配列決定した。DNA42663−1154(PRO286をコードする)の全核酸配列をFig210A−B(配列番号:497)に示す。クローンDNA42663−1154は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置57−59に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig211)。予測されるポリペプチド前駆体は1041アミノ酸長であり、アミノ酸位置1−26に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置826−848に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置130−151、206−227、662−684、669−690及び693−614にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンDNA42663−1154はATCCに寄託され(命名:DNA42663−1154)、ATCC寄託番号209386が付与された。
PRO286の全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、それがショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトTollタンパク質の相同体である:Toll1(DNAX# HSU88540−1これはランダム配列した全長cDNA #HUMRSC786−1と同一である);Toll2(DNAX# HSU88878−1);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(DNAX# HSU88880−1)。
【0522】
実施例93:PRO285及びPRO286についてのNF−κBアッセイ
NF−κB経路を通したTollタンパク質シグナルと同様に、それらの生物学的活性はNF−κBアッセイで試験できる。このアッセイにおいて、ジャーカット細胞は、製造者の指示に従ってリポフェクタミン試薬(Gibco BRL)を用いて一過的に形質移入される。NF−κB制御ルシフェラーゼ遺伝子を含むpB2XLucプラスミドの1μgを、PRO285又はPRO286をコードする挿入物有又は無のpSRαN発現ベクターと同時形質移入する。正の対照として、細胞をPMA(ホルボールミリスチルアセテート;20ng/ml)及びPHA(フィトヘマグルチニン;2μg/ml)で3から4時間処理した。細胞は、2から3日後に、Promegaからの試薬を用いたルシフェラーゼ活性の測定のために溶解させた。
【0523】
実施例94:ヒトPRO213−1、PRO1330及びPRO1449をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を作成した。このコンセンサス配列は、ここにDNA28735と命名される。DNA28735コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGAGCAGCAATATGCCAGCC−3’(配列番号:511)
逆方向PCRプライマー 5’− TTTTCCACTCCTGTCGGGTTGG−3’(配列番号:512)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA28735配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGACACTTGCCAGTCAGATGTGGATGAATGCAGTGCTAGGAGGG−3’(配列番号:513)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449PRO237の全長DNA配列[各々、DNA30943−1−1163−1(配列番号:505)、DNA64907−1163−1(配列番号:507)及びDNA64908−1163−1(配列番号:509)と命名される]を与えた。
各々DNA30943−1−1163−1(配列番号:505)、DNA64907−1163−1(配列番号:507)及びDNA64908−1163−1(配列番号:509)に対応する全核酸配列。DNA30943−1163、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1は、単一のオープンリーディングフレームを含み、各々ヌクレオチド位置336−338、488−490及び326−328に見かけの翻訳開始部位を持ち、そして各々ヌクレオチド位置1221−1223、1307−1309及び1145−1147の停止コドンで終端する(Fig212、214及び216)。予測されるポリペプチド前駆体は、各々295、273及び273アミノ酸長である(Fig213、215及び217)。DNA30943−1−1163−1、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1はATCCに寄託され、各々ATCC寄託番号209791、203242及び203243が付与された。
全長PRO213−1ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止−特異的遺伝子6タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO213アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSMHC3W5A_6及びB48089との間の有意な相同性を明らかにした。
全長PRO1330及びPRO1449ポリペプチドのアミノ酸配列の更なる分析は、notch4との有意な同一性を示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.130 SwissProt 35)は、PRO1330と以下のDayhoff配列、D86566_1及びNEL_HU MANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0524】
実施例95:ヒトPRO298をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたcDNAを、ここでDNA26832(Fig220;配列番号:516)と命名する。DNA26832の配列を発現配列タグ(EST)データベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発されたESTデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。タンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。
他のEST配列に対してphrapを用いてコンセンサスDNA配列を構築した。コンセンサス配列を同定し、次いでそれをBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて拡張し、コンセンサス配列を上記のEST配列の供給源を使用する限りできるだけ拡張した。拡張した構築体配列をDNA35861コンセンサス配列のDNA35861.Basedと命名する。1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO298の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向プライマーは一般に20から30ヌクレオチドの範囲であり、約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計されることが多い。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。或る場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAをAusubel等, Current Protocols i Molecular Biology, のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた対象とする遺伝子クローンの単離に使用した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブを合成した:
正方向PCRプライマー1 CAACGTGATTTCAAAGCTGGGCTC(配列番号:517)
正方向PCRプライマー2 GCCTCGTATCAAGAATTTCC(配列番号:518)
正方向PCRプライマー3 AGTGGAAGTCGACCTCCC(配列番号:519)
逆方向PCRプライマー1 CTCACCTGAAATCTCTCATAGCCC(配列番号:520)
ハイブリッド形成プローブ1 CGCAAAACCCATTTTGGGAGCAGGAATTCCAATCATGTCTGTGATGGTGG(配列番号:521)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO298遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB25)から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science , 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO298の全長DNA配列[ここで、UNQ261(DNA39975−1210)と命名される](配列番号:514)及びPRO298の誘導タンパク質配列を与えた(配列番号:515)。
UNQ261(DNA39975−1210)の全核酸配列をFig218(配列番号:514)に示す。クローンDNA39975−1210は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置375−377に見かけの翻訳開始部位を持つ。予測されるポリペプチド前駆体は364アミノ酸長である。タンパク質は、各々アミノ酸位置36−55(II型TM)、65−84、188−208及び229−245に4つの膜貫通ドメインを有する。推定N−結合グリコシル化部位はアミノ酸位置253で開始する。さらに、タンパク質中に以下の特徴が同定された:cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は位置8で開始する;N−ミリストイル化部位は位置173及び262で開始する;そしてZpドメインは位置45−60の間である。クローンDNA39975−1210はATCCに寄託され(1998年4月21日)、ATCC寄託番号209783が付与された。
【0525】
実施例96:ヒトPRO337をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたcDNAを、ここでDNA42301(Fig223;配列番号:524)と命名する。上記実施例1に記載した用にphrapを用いてDNA42301の配列をEST配列と比較し、ここでDNA28761と命名するコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO337遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織から単離した。
cDNAクローンは、その全体を配列決定した。DNA43316−1237の全核酸配列をFig221(配列番号:522)に示す。クローンDNA43316−1237は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig221;配列番号:552)。予測されるポリペプチド前駆体は344アミノ酸長である。クローンDNA43316−1237はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209487が付与された。
全長配列のBLAST−2及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO337はラットニューロトリミンとアミノ酸配列同一性(97%)を示す。
【0526】
実施例97:ヒトPRO403をコードするcDNAクローンの単離
導入:
ヒトトロンボポエチン(THPO)は、2つのドメインからなる352アミノ酸のグリコシル化ホルモンである。N−末端ドメインはエリスロポエチンと50%類似性を持ち、生物学的活性を負っている。C−末端領域は分泌に必要とされる。トロンボポエチン(THPO)についての遺伝子はヒト染色体3q27−q28にマッピングされ、そこでこの遺伝子の6つのエクソンはゲノムDNAの7キロベース塩基対をスピンさせる(Chang等, Genomics 26: 636−7 (1995); Foster等, Rroc. Natl. Acad. Csi. USA 91: 13023−7 (1994); Gurney等, Blood 85: 981−988 (1995))。THPOの直近に位置するTHPO相同体をコードする任意の遺伝子が存在するか否かを決定するため、この領域からのゲノムDNA断片を同定して配列決定した。THPO遺伝子座を含む3つのP1クローン及び1つのPACクローン(Genome Systems Inc., St. Louis. MO;カタログ番号P1−2535及びPAC−6539)が単離され、140kb領域をPCRベースのギャップ充填法と組み合わせた規則的ショットガン法(Chen等, Genomics 17: 651−656 (1993))を用いて配列決定した。分析によりこの領域がTHPOに極めて近く位置する4つの付加的遺伝子腫瘍壊死因子レセプター1関連タンパク質2(TRAP2)及び伸長開始因子ガンマ(elF40)、塩化物チャンネル2(CLCN2)及びRNAポリメラーゼIIサブユニットhRPB17を持つ遺伝子富化であることが明らかとなった。この領域のTHPO相同体は見られなかったが、4つの新規な遺伝子がコンピュータ補助遺伝子検出(GRAIL)により予測された(Xu等, Gen. Engin. 16: 241−253 (1994), CpG島の存在(Cross, S.及びBird, A., Curr. Opin. Genet. & Devel. 5: 109−314 (1995), 及び公知の遺伝子との相同性(WU−BLAST2.0(Altschul及びGish, Methods Enzymol. 266: 460−480 (1996)(http://blast.wustl.edu/blastREADME.html))による検出))。
方法:
P1及びPACクローン:
最初のヒトP1クローンはゲノムP1ライブラリ(Genome Systems Inc., St. Louis, MO; カタログ番号P1−2535)から単離され、THPO下のみ配列から設計されたPCRプライマーでスクリーニングされた。PCRプライマーは、このP1クローンから誘導された末端配列から設計され、次いでP1及びPACライブラリ(Genome Systems カタログ番号P1−2535びPAC−6539)のスクリーニングに用い、重複クローン(PAC1、pl.t及びp1.u)を同定した。PAC.zからの3’末端配列を、ヒトBACライブラリ(Genome Systems Inc., St. Louis, MO; カタログ番号: BDTW−4533A)のスクリーニングに使用するプライマーの同定に用いた。
規則的ショットガン法:
規則的ショットガン法(OSS)(Chen等, Genomics 17: 651−656 (1993))は、階層的方法での大きなゲノムDNAクローンのマッピング及び配列を含む。P1又はPACクローンを超音波処理し、断片をラムダベクター(λBluestar)にサブクローニングした(Novegen, Inc., Madison, WI: カタログ番号69242−3)。ラムダサブクローン挿入物は長範囲PCR(Barnes, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216−2220 (1994))により単離し、末端を配列決定した。ラムダ末端配列を重複させ、最初のクローンの部分的マップを作成した。重複末端配列を持つこれらのラムダクローンを同定し、インセットをプラスミドベクター(pUC18又はpUC19, Hoefer Pharmacia Biotech, Inc., San Francisco, CA, カタログ番号 27−4949−01及び27−4951−01)にサブクローニングし、プラスミドサブクローンの末端を配列決定し、組み立てて近接配列を生成した。この方向性を持った配列決定法は、必要な無駄を最小にし、対象とする領域をスキャンし集中するのを可能にする。
よりよいTHPO遺伝子座を同定し、ヘマトポエチンファミリーに関連する他の遺伝子を検索するために、5つのゲノムクローンを、ヒトP1及びPACライブラリのPCRスクリーニングによりこの領域から単離した(Genome System. Inc., カタログ番号: P1−2535及びPAC−6539)。
遺伝子断片のサイズは次に通り:P1.tは40kb;P1.gは70kb;P1.uは70kb;PAC.zは200kb;及びBAC.1は80kb。190kbゲノムDNA領域の約75%(140kb)を、規則的ショットガン法(OSS)(Chen等, Genomics 17: 651−56 (1993))を用いて配列決定し、自動整列器(Applied Biosystems. Perkin Elmer, Foster City, CA, カタログ番号903227)を用いてコンティグに構築した。これらのコンティグの予備的順序を手動分析で決定した。140kb領域に47のコンティグが存在した。コンティグの順序づけ及びギャップの充填のためのPCRベースの方法を採用した。以下に、ギャップの数及びサイズをまとめる。BAC.1に特有の50kbの配列を、10倍の冗長性を持つ全ショットガン法で配列決定した。
ギャップのサイズ 数
<50bp 13
50−150bp 7
150−300bp 7
300−1000bp 10
1000−5000bp 7
>5000bp 2(15,000bp)
【0527】
DNA配列決定:
ABI DYE−プライマーTM化学(PE Applied Biosystems, Foster City, CA;カタログ番号: 402112)を、ラムダ及びプラスミドサブクローンの末端配列決定に用いた。ABI DYE−プライマーTM化学(PE Applied Biosystems, Foster City, CA;カタログ番号: 403044)を、PCR産物のその対応するPCRプライマーでの配列決定に用いた。配列は、ABI377装置で収集した。1kbより大きなPCR産物について、歩行プライマーを用いた。自動整列器(PE Applied BioSystems, Foster City, CA )でのOSS法により生成されたコンティグの配列及びギャップ充填配列決定跡ファイルを、重複及び終端についてSequencher(商品名)(Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI)に入力した。全ショットガン法により生成された配列は、PhredおよびPhrapを用いて構築し、Consed(http://chimera.biotech. washington.edu/uwgc/projects.htm)およびGFP(Genome Reconstruction Manager for Phrap), version 1.2(http://stork.cellb.bcm.tmc.edu/gfp/)を用いて編集した。
PCR−ベースギャップ充填法:
各コンティグの配列決定された5’及び3’末端に基づいてプライマーを設計し、反復及び低品質配列領域を避けた。全てのプライマーを50−70%のG/C量を持つ19−24量体であるように設計した。オリゴを合成し、標準的な方法によりゲル精製した。
コンティグの配向と順序は未知であったので、プライマーの順列を増幅反応において使用した。二つのPCRキットを使用した:第1に、およそ10分の伸展時間でのXL PCRキット(Perkin Elmer, Norwalk, CT; カタログ番号:N8080205);第2に、XL PCRキットで汚れた又は複数の生成物が観察された場合にはTaqポリメラーゼPCRキット(Qiagen Inc., Valencia, CA;カタログ番号:201223)を高緊縮性条件下で使用した。それぞれの成功した反応からの主要なPCR産物は0.9%の低溶融アガロースゲルから抽出し配列決定前にGeneclean DNA Purificationキットで精製した。
分析:
コード領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した:第1に、反復配列をRepeatMasker(A.F.A. Smit & P. Green, http://ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.html)でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してFastA方式でDNA配列スクリーニングし、マスクしたクエリー配列に戻した。マスクされていないリピートは、配列をGenBankデータベースとWUBLAST(Altschu, S.及びGish, W., Methods Enzymol. 266: 460−480(1996))を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をWUBLAST2.0アルゴリズムを用いて比較することにより既知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びcDNA配列を各々、さもないと大きく異なる配列間の局所的同一性の領域を見つけるためにNeedleman−Wunch(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443−453 (1970))アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。該方法は、該領域の5つの既知の遺伝子、THPO、TRAP2、elF4g、CLCN2及びhRPB17の全てのエクソンの検出をもたらした(表8)。
分析:
コード化領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した:第1に、反復配列をRepeatm Master(A.F.A. Smit & P.Green, http://ftp.genome.washington.edu/RM/details.html)でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してFastA方式でDNA配列スクリーニングし、マスクしたクウィアリー(quiery)配列に戻した。マスクしていないリピートは、配列をGenBankデータベースとWOBLAST2.0[Altschu, S.及びGish, W., Methods Enzymol. 266: 460−480 (1996); http://blast.wustl.edu/blastREADME.html]を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をWUBLAST2.0アルゴリズムを用いて比較することにより公知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びcDNA配列各々を、配列間の局所的同一性の領域を見つけるためのニードルマン−バンチ(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443−453 (1970))アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。この方法は、この領域の5つの公知の遺伝子、THPO、TRAP2、elF4g、CLCN2及びhRPB18の全てのエクソンの検出をもたらした(下記参照)。
公知の遺伝子 マップ位置
真核生物翻訳開始因子4ガンマ 3q27−qter
トロンボポエチン 3q26−q27
塩化物チャンネル2 3q26−qter
TNFレセプター関連タンパク質2 未だマッピングされていない
RNAポリメラーゼIIサブユニットhRPB17 未だマッピングされていない
最後に、新規な転写単位を多数の方法を用いて予測した。CpG島(S. Cross及びBird, A., Curr. Opin. Gene. Dev. 5: 109−314 (1995))島をプロモーター同定に使用し、GC−富化、6−又は8−mer回文構造配列を認識する酵素によって切断される部位のクラスターとして同定した(NotI、NarI、BssHII、XhoI)。CpG島は通常、遺伝子のプロモーター領域を付随している。短いゲノム領域(10−20kb)のGenBankに対するWUBLAST2.0分析は、ESTに一致することを示した。個々のEST配列(或いは可能ならば、それらの配列クロマトグラムファイル)を検索し、シーケンサーで構築して理論的cDNA配列を与えた(DNA36443)。新規のエクソンを予測するためにGRAIL2(ApoCom Inc., Knoxville, TN, DEC アルファに対するコマンドラインバージョン)を用いた。この領域の5つの公知の遺伝子は、GLAILアルゴリズムの成功のための内部コントロールとして与えた。
【0528】
単離:
部分的エンドセリン変換酵素−2(ECE−2)cDNAクローンを、ゲノム配列の予測されるECE−2エクソンを最初にシリコ(silico)でスプライシングして推定配列を生成することにより単離した(DNA36443)。オリゴヌクレオチドプローブ: GAAGCAGTGCAGCCAGCAGTAGAGAGGCACCTGCTAAGA(配列番号:530)を設計し、ヒト胎児小腸ライブラリ(LIB110)のスクリーニングに使用し、内部PCRプライマー(36443f1)(ECE2.f: ACGCAGCTGGAGCTGGTCTTAGCA)(配列番号:531)及び(36443r1)(ECE2.r)(GGTACTGGACCCCTAGGGCCACAA)(配列番号:532)を用いて配列決定前にプローブにハイブリッド形成するクローンを確認した。1つのポジティブクローンが得られたが、このcDNA(DNA49830)は、適当にスプライシングされたエクソン1から6、次いでイントロン6配列を含む部分的にスプライシングされた転写物を表示した。オリゴdTプライマー、イントロン6に存在するAlu成分内でのポリA−伸展までアニーリングした。更なるECE−2cDNA断片(DNA49831)は、ヒト胎児腎臓ライブラリ(LIB227)から、推定cDNA配列から設計したプライマー[36443f3: CCTCCCAGCCGAGACCAGTGG(配列番号:533)及び36443r2: GGTCCTATAAGGGCCAAGACC (配列番号:534)]でのPCRによって得た。このPCR産物をエクソン13からエクソン18の3’ 非翻訳領域まで拡張した。
全長エンドセリン変換酵素2(ECE2)cDNAクローン(DNA55800−1263)をオリゴ−dT−プライムヒト胎児脳ライブラリから単離した。ヒト胎児脳組織からのRNA(妊娠20週、#283005)(SRC175)をグアニジンチオシアネートにより単離し、5μgを二本鎖cDNAの生成に使用し、それをベクターpRK5Eにクローニングした。3’−プライマー(pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT)(配列番号:535)及び5’−リンカー(pCGGACGCGTGGGTCGA)(配列番号:536)をXhoI及びNotI部位に導入するために設計した。ライブラリを、部分的ヒトECE−2cDNA配列(DNA49830及びDNA49831)から設計したPCRプライマー[36443pcrf1: CGGCCGTGATGGCTGGTGACG(配列番号:537)及び36443r3: GGCAGACTCCTTCCTATGGG(配列番号:538)]でスクリーニングした。PCR産物をベクターpCR2.1−TOPO(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号K4500−01)にクローニングし、上記したようなDYE−ターミネーター化学で配列決定した。
【0529】
実施例98:PRO403のノーザンブロット及びインサイツRNAハイブリッド形成分析
ヒト組織におけるPRO403mRNAの発現をノーザンブロット分析により試験した。ヒト胎児及び成人組織から誘導したヒトポリA+RNAブロット(Clontech, Palo Alto, CA; Cat. Nos. 7760−1, 7756−1及び7755−1)を、全長PRO403cDNAに基づくプローブからの[32P−α]dATP標識cDNA断片にハイブリッド形成させた。ブロットをプローブとともにハイブリッド形成バッファー(5X SSPE; 2X デンハード液; 100mg/mLの変性剪断サケ精子DNA; 50%のホルムアミド; 2%のSDS)中、42℃で18時間インキュベートし、高緊縮性(0.1X SSC; 0.1% SDS, 50℃)まで洗浄してオートラジオグラフ分析した。終夜露出の後にブロットをホスホイメージャ分析(Fuji)により展開した。
PRO403mRNA転写物を検出した。発現パターンの分析は、成人脳(小脳、被殻、側頭葉及び中頭葉で最大、及び大脳皮質、後頭葉及び前頭葉でより低い)、脊髄、肺及び膵臓において3.3kbと予測される転写物の最も強いシグナル、胎児脳及び腎臓における4.5kb転写物の高いレベルを示した。
【0530】
実施例99:ハイブリッド形成プローブとしてのPROポリペプチドコード化核酸の使用
以下の方法は、PROをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する対象とするPROポリペプチドのコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種DNA類(PROポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして又はそれからプローブを調製する塩基として用いられる。
いずれかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識PROポリペプチドコード化核酸誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDSの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列PROポリペプチドをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【0531】
実施例100:大腸菌におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のPROポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
所望のPROポリペプチドをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、特定のPROポリペプチドコード領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化PROポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製できる。
PRO181、PRO195、PRO200、PRO237、PRO540、PRO322、PRO1017、PRO938、PRO162、PRO1114、PRO827及びPRO1008は、以下の手法を用いて、大腸菌においてポリHisタグ形態で発現させた。PROポリペプチドをコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでPCR増幅された、ポリ−Hisタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中、30℃で振盪しながら3−5のO.D.600に達するまで成長させた。ついで培地をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中に50−100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20−30時間成長させた。試料を取り出してSDS−PAGEにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
【0532】
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni−NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールデlイング溶液を4℃で12−36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたPROタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHEPES、pH6.8に調製した。
【0533】
実施例101:哺乳動物細胞におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるPROポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてpRK5(1989年3月15日発行のEP 307,247参照)を用いた。場合によっては、PROコード化DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、Sambrook等, 上掲に記載されたような結合方法を用いてPROポリペプチドDNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5−PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μgのpRK5−PROポリペプチドDNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μlの1mMトリス−HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30分間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地(のみ)又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【0534】
これに換わる技術において、PROポリペプチドは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5−PROポリペプチドDNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたPROポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、PROポリペプチドをCHO細胞で発現させることができる。pRK5−PROポリペプチドは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグPROポリペプチドは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PROポリペプチドはpRK5ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−hisタグPROポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−hisタグPROポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【0535】
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び/又はポリ−Hisタグ形態のコード化配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現された。PCR増幅に続いて、対応するDNAを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5’ 及び3’ に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774−1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)約一千万のCHO細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3x107細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加)中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた1−2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートした。さらに2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2x106細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とpHを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)の30mLとした。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷された。
【0536】
ポリ−Hisタグ作成物について、タンパク質はNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりN−末端アミノ酸配列決定した。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0537】
実施例102:酵母菌でのPROポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROポリペプチドの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。所望のPROポリペプチドをコードするDNA、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROポリペプチドをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、酵母菌アルファ因子分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PROポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0538】
実施例103:バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROポリペプチドの組換え発現を記載する。
所望のPROポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Navogen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PROポリペプチド又はPROポリペプチドの所定部分(膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など)が、5’ 及び3’ 領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’ プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4から5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O’Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
次に、発現されたポリ−hisタグPROポリペプチドは、例えばNi2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175−179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes、pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄する。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したNi2+−NTAでのウェスタンブロットで分析する。溶離したHis10−タグPROポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROポリペプチドの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【0539】
PRO195、PRO526、PRO540、PRO846、PRO362、PRO363、PRO700、PRO707、PRO322、PRO719、PRO1083、PRO868、PRO866、PRO768、PRO788、PRO938、PRO827、及びPRO1031は、バキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞で成功裏に発現された。発現は、実際には0.5−2Lスケールで実施したが、より大きな(例えば8L)での調製に容易にスケールアップできる。タンパク質は、対応するタンパク質の可溶化形態及び/又はポリ−Hisタグ形態のコード化配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現された。
バキュロウイルス感染Sf9細胞での発現のために、PCR増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター(IgG融合物に対するpb.PH.IgG及びポリHisタグに対するPH.His.c)にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルスDNA(Pharmingen)を105スポドプテラグルヒペルダ(Spodoptera frugiperda)(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)にリポフェクチン(Gibco BRL)を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.cは、市販のバキュロウイルス発現ベクターpV1393(Pharmingen)の修飾物であり、His又はFcタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のFBS(Hyclone)を添加したHinkのTNM−FM培地で成長させた。細胞は、28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%FBSを添加したHinkのTNM−FH培地におけるSf9細胞感染による約10の感染効率(MOI)での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を28℃で3日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi−NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定した。
第1の増幅上清をESF−92培地(Expression System LLC)で成長させたSf9細胞のスピナー培地(500ml)の約0.1のMOIでの感染に使用した。細胞は28℃で3日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びSDS−PAGEを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地(0.5〜3L)を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Hisタグ作成物については、タンパク質作成物をNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲル(PEG)電気泳動で試験し、エドマン(Edman)分解によりN−末端アミノ酸配列決定した。
PRO181、PRO195、PRO200、PRO320、PRO237、PRO273、PRO285、PRO337、PRO526、PRO540、PRO846、PRO362、PRO363、PRO617、PRO322、PRO1083、PRO868、768、PRO792、PRO788、PRO162、PRO1114、PRO827、PRO1075、及びPRO1031はバキュロウイルス感染Hi5昆虫細胞において成功裏に発現された。発現は、実際には0.5−2Lスケールで実施したが、より大きな(例えば8L)での調製に容易にスケールアップできる。
【0540】
バキュロウイルス感染Hi5細胞における発現について、PROポリペプチドコード化DNAは、Pfu(Stratagene)等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流(5’−)に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ−Hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域等)を含む。種々のプラスミドを用いることができ、pVL1393(Novagen)等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。簡単には、PROポリペプチド又はPROポリペプチドの所望の部分(膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など)を、5’ 及び3’ 領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅する。5’ プライマーは隣接する(選択された)制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、pVL1393の誘導体はヒトIgG(pb.PH.IgG)のFc領域又はNAME配列の8ヒスチジン(pb.PH.His)タグ下流(3’−)を含むことができる。
Hi5細胞は、27℃、CO2無し、ペン/ストレプト無しの条件下で50%の集密度まで成長させた。150mmプレート各々について、30μgのPROポリペプチドを含むpIEベースベクターを1mlのEx−細胞培地(媒質:Ex−細胞401+1/100のL−Glu JRH Bioscience #14401−78P(注:この媒質は軽感受性))と混合し、別の管において、100μlのセルフェクチン(CellFECTIN(Gibco BRL #10362−010)(ボルテックスで混合))を1mlのEx−細胞培地と混合する。2つの溶液を混合し、室温で15分間インキュベーションした。8mlのEx−細胞培地を2mlのDNA/セルフェクチン混合物に添加し、Ex−細胞培地で1回洗浄したHi5細胞上に層形成さる。次いでプレートを暗中室温でインキュベートする。次いでDNA/セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をEx−細胞で1回戦乗して過剰のセルフェクチンを除去する。30mlの新鮮なEx−細胞培地を添加し、細胞を28℃で3日間インキュベートする。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベクターでのPROポリペプチドの発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi−NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定できる。
形質移入細胞からの条件培地(0.5〜3L)を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収する。ポリ−Hisタグ作成物については、タンパク質作成物をNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加する。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給する。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵する。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷する。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離する。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。PROポリペプチドの均一性はSDSポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0541】
実施例104:PROポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例は、PROポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PROポリペプチド、PROポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムで注入したPROポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗−PROポリペプチド抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、PROポリペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PROポリペプチドに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗−PROポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【0542】
実施例105:キメラPROポリペプチド
PROポリペプチドは、タンパク質精製を促進するための一又は複数の付加的ポリペプチドドメインを持つキメラタンパク質として発現させてもよい。このような精製促進ドメインは、これらに限られないが、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレート形成ペプチド、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインAドメイン、及びFLAGS(商品名)伸展/親和性精製系(Immunex Corp., Seattle, Wash.)で利用されるドメインを含む。精製ドメイン及びPROポリペプチド配列の間に因子XA又はエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego Calif.)等の切断可能なリンカー配列を含むことは、PROポリペプチドをコードするDNAの発現促進に有用であろう。
【0543】
実施例106:特異的抗体を用いたPROポリペプチドの精製
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロPROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレPROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗−PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr−活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地中に油様な量で分泌される。
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PROポリペプチドが回収される。
【0544】
実施例107:薬剤スクリーニング
本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような刺権威用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に位置しても、細胞内に局在化していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法は、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験する事もできる。
即ち本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、フリーのPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、フリー又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に発行されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPROポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPROポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体が、PROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PROポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【0545】
実施例108:合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例は、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19−21 (1991))。
1つの方法において、PROポリペプチド、又はPRO−インヒビター複合体の三次元構造が、x線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には2つの方法の組み合わせにより決定する。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は行こうなインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796−7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742−746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその決せよう構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体(抗−ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−idsは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のPROポリペプチドがX線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【0546】
実施例109:血管内皮成長因子(VEGF)刺激の内皮細胞成長の増殖を阻害するPROポリペプチドの能力(アッセイ9)
VEGFに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のPROポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳類の内皮細胞の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害する等の恩恵となる。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮(ACE)細胞(一次培地から、最大12−14継代)を96−ウェルの100マイクロタイタープレートに500細胞/ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースDMEM、10%のウシ血清、2mMのグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン/フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む:(1)ACE細胞を添加しないもの;(2)ACE細胞単独;(3)ACE細胞プラス5ng/mlのFGF;(4)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGF;(5)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス1ng/mlのTGF−ベータ;及び(6)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス5ng/mlのLIF。ついで、試験用試料であるポリ−hisタグPROポリペプチド(100マイクロタイター容量中)をウェル(それぞれ1%、0.1%及び0.001%に希釈)の添加した。細胞を37℃/5%のCO2で6−7日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を1xPBSで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロタイター、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%のトリトンX−100、10mMのp−ニトロフェニルホスフェート)を各ウェルに添加した。37℃で2時間インキュベートした後、10マイクロタイターの1NのNaOHの添加で反応を停止した。光学密度(OD)をマイクロプレートリーダーで405nmにおいて測定した。
PROポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するVEGF(3ng/ml)刺激増殖のパーセント阻害(OD405nmにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定)として算出した。TGF−ベータはVEGF刺激ACE細胞増殖を70−90%阻止するので、1ng/mlで活性参照として使用した。結果は、PROポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値(相対阻害度)は刺激なし細胞に対するPROポリペプチドによるVEGF刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで1ng/ml濃度でのTGF−βが、VEGF刺激細胞増殖を70−90%阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、PROポリペプチドが内皮細胞成長のVEGF刺激を30%又はそれ以上(相対阻害度30%又はそれ以上)を阻害したときにポジティブと考える。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった:PRO200、PRO322及びPRO320。
【0547】
実施例110:網膜ニューロン生存(アッセイ52)
この実施例は種々のPROポリペプチドが網膜ニューロン細胞の生存の促進において有効性を有することを示し、それ故に、例えば網膜色素変性症、AMD等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠7日のSDラット胎児(混合集団:グリア及び網膜ニューロン型)をCO2麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮から切除し、他の眼組織をCa2+、Mg2+無しのPBS中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を37℃で7−10分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、N2を添加し、特異的な試験PROポリペプチド有り又は無しのDMEM/F12中、96−ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%CO2の水飽和雰囲気下、37℃で成長させた。培地中で2−3日後に細胞をカルセインAMで染色し、次いで4%のパラホルムアルデヒドで固定し、全細胞カウントの測定のためにDAPIで染色した。全細胞(蛍光)は、CCDカメラ及びMacIntosh用NIH画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
種々の濃度のPROポリペプチドの効果は、培地中2−3日でのカルセインAMポジティブ細胞の合計数を、培地中2−3日のDAPI標識細胞の合計数で除することにより計算した。30%を越える生存をポジティブと考える。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイで0.01%−1.0%の範囲のポリペプチド濃度の使用でポジティブであった:PRO200、PRO322、PRO540、PRO846及びPRO617。
【0548】
実施例111:杆状体光受容体細胞の生存(アッセイ56)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが杆状体光受容体細胞の生存/増殖を高めるように作用し、よって、例えば色素性網膜炎、AMD等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠7日のSprague Dawleyラット胎児(混合集団:グリア及び網膜ニューロン細胞型)をCO2麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮及び他の眼組織から切除し、ついでCa2+、Mg2+無しのPBS中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を37℃で7−10分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、N2を添加したDMEM/F12中、96−ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%CO2の水飽和雰囲気下、37℃で成長させた。培地中で2−3日後に細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでセルトラッカーグリーンCMFDA染色した。Rho 4D2(腹水又はIgG1:100)、可視色素ロドプシンに対するモノクローナル抗体を、間接的免疫蛍光法による杆状体光受容体の検出に使用した。結果は%生存:培地中2−3日のカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数を、培地中2−3日でのカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数で除するものとして計算する。全細胞(蛍光)は、CCDカメラ及びMacIntosh用NIH画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO322、PRO540、PRO846及びPRO617。
【0549】
実施例112:軟骨からのプロテオグリカン放出を刺激するPROポリペプチドの能力(アッセイ97)
PROポリペプチドが軟骨組織からプロテオグリカンの放出を刺激する能力を以下のようにして試験した。
4−6月齢のブタの手指節関節を無菌で切除し、関節軟骨を下の骨を注意深く避けたフリーハンドスライスによって取り除いた。軟骨を細かく切り刻み、0.1%BSA及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清(SF)培地(DME/F12 1:1)中、95%空気、5%CO2雰囲気においてバルクで24時間培養した。3回洗浄した後、約100mgの関節軟骨をミクロニクス(micronics)管に分け、上記SF培地中でさらに24時間インキュベートした。次いで、PRO241ポリペプチドの1%を、単独あるいは公知の軟骨組織からのプロテオグリカン放出刺激剤であるインターロイキン−1αの18ng/mlとともに添加した。次いで上清を回収し、1,9−ジメチル−メチレンブルー(DMB)比色アッセイ(FarndaleおよびButtle, Biochem. Biophys. Acta 883: 173−177 (1985))を用いてプロテオグリカンの量を検定した。このアッセイにおけるポジティブな結果は、試験ポリペプチドが、例えば、運動関連関節問題である関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療での使用が見出されることを示す。
上記のアッセイで種々のPROポリペプチドを試験したとき、このポリペプチドは、根本的におよびインターロイキン−1αでの刺激後および処理後24および72時間に軟骨組織からのプロテオグリカン放出を刺激する顕著な能力を示し、従って、PROポリペプチドは軟骨組織からのプロテオグリカンの放出刺激に有用であるをこと示している。このように、PROポリペプチドは運動関連関節問題である関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療に有用である。このアッセイでポジティブであったポリペプチドは:PRO200。
【0550】
実施例113:インビトロ抗増殖性アッセイ(アッセイ161)
種々のPROポリペプチドの抗増殖活性を、本質的にSkehan等, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107−1112 (1990)に記載されたスルホローダミンB(SRB)染料結合アッセイを用いる国立癌研究所(NCI)の実験的、疾患指向的インビトロ抗癌薬発見アッセイにおいて測定した。このアッセイで用いた60の腫瘍細胞系(「NCIパネル」)、並びにそれらの維持およびインビトロ培養の条件は、Monks等, J. Natl. Cancer Inst. 83: 757−766 (1991)に記載されている。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する試験化合物の細胞毒性及び/又は細胞分裂停止活性を最初に評価することである(Monks等, 上掲; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10): 1−12[1989])。
約60のヒト腫瘍細胞系からの細胞をトリプシン/EDTA(Gibco)で回収し、1回洗浄し、IMEM中に再懸濁し、それらの生存を測定した。細胞懸濁物をピペット(100μL容量)で別の96−ウェルマイクロタイタープレートに添加した。6日インキュベーションの細胞密度は2日インキュベーションより小さく過剰成長は防止された。播種後、安定化のために37℃で24時間プレインキュベーションした。目的とする試験濃度の2倍希釈をゼロ時に100μlのアリコートにマイクロタイタープレートウェルに添加した(1:2希釈)。試験化合物を2分の5log希釈(1000〜100,000倍)で評価した。インキュベーションは5%CO2雰囲気および100%湿度で2日および6日実施した。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞を10%トリクロロ酢酸の0.1mlで40℃において固定した。プレートを脱イオン水で5回洗浄し、乾燥させ、1%酢酸に溶解した0.4%スルホローダミンB染料(Sigma)の0.1mlで30分間染色し、1%酢酸で4回洗浄して非結合染料を除去し、乾燥させ、染色物を10mMトリス塩基[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン], pH10.5の0.1mlで5分間抽出した。スルホローダミンBの492nmにおける吸収(OD)を、コンピュータ接続96−ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は、一又は複数の濃度で少なくとも50%の成長阻害を示すときにポジティブと考える。このアッセイにおいてポジティブを示したPROポリペプチドは、表7に示されており、略語は以下の通りである:
NSCL=非小細胞肺癌腫
CNS=中枢神経系
【0551】
これらのアッセイの結果には、PROポリペプチドが多くの異なる細胞系の新生物成長の阻害に有用であり、治療的に使用できることが示されている。PROポリペプチドに対する抗体は、これらの有用なポリペプチドのアフィニティ精製に有用である。PROポリペプチドをコードする核酸はこれらのポリペプチドの組換え調製に有用である。
【0552】
実施例114:腫瘍の遺伝子増幅
この実施例は、種々のPROポリペプチドをコードする遺伝子が或る種のヒト癌のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、PROポリペプチドが結腸、肺及び他の癌等の或る種の癌において治療的介入の有用な標的であることを示している。治療薬はPROポリペプチドコード化遺伝子のアンタゴニスト、例えばマウス−ヒトキメラ、PROポリペプチドに対するヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムDNAである。DNAは、定量的、例えば蛍光定量的に正確である。ネガティブ対照として、DNAを10の正常健常個体からDNAを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した(示さず)。5’ ヌクレアーゼアッセイ(例えばTaqMan(商品名))及び実時間定量的PCR(例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(商品名)(Perkin Elmer, applied Biosystems Division, Foster City, CA))を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果は、PROポリペプチドがスクリーニングした肺及び結腸癌において過剰発現されたか否かの決定に用いた。原発性肺癌は、表8に示してあるように、個々の腫瘍の型及び段階から得た。表8の原発性腫瘍の命名に用いた省略形の説明及び本実施例を通して言及されている原発性腫瘍と細胞株は、下記に示されている。
TaqMan(商品名)の結果はデルタCT単位で報告した。1単位は1PCRサイクル又は正常に対して約2倍の増幅に相当し、2単位は4倍、3単位は8倍等々に相当する。定量化はプライマー及びPROポリペプチドコード化遺伝子から誘導したTaqMan(商品名)蛍光を用いて得た。最も独特の核酸配列を含むと思われ、スプライシングされたイントロンを最も持たないと思われるPROポリペプチドの領域、例えば3’ −非翻訳領域がプライマー誘導に好ましい。PROポリペプチドの遺伝子増幅分析に使用されたプライマー及びプローブ(正、逆及びプローブ)のための配列は、以下の通りであった:
【0553】
PRO853(DNA48227−1350)
48227.tm.f1
5’−GGCACTTCATGGTCCTTGAAA−3’ (配列番号:539)
48227.tm.p1
5’−CGGATGTGTGTGAGGCCATGCC−3’(配列番号:540)
48227.tm.r1
5’−GAAAGTAACCACGGAGGTCAAGAT−3’(配列番号:541)
PRO1017(DNA56112−1379):
56112.tm.f1
5’−CCTCCTCCGAGACTGAAAGCT−3’(配列番号:542)
56112.tm.p1
5’−TCGCGTTGCTTTTTCTCGCGTG−3’(配列番号:543)
56112.tm.r1
5’−GCGTGCGTCAGGTTCCA−3’(配列番号:544)
PRO213−1(DNA30943−1163−1):
30943.tm.f3:
5’−CGTTCGTGCAGCGTGTGTA−3’(配列番号:545)
30943.tm.p3:
5’−CTTCCTCACCACCTGCGACGGG−3’(配列番号:546)
30943.tm.r3:
5’−GGTAGGCGGTCCTATAGATGGTT−3’(配列番号:547)
30943.tm.f1:
5’−AGATGTGGATGAATGCAGTGCTA−3’(配列番号:548)
30943.tm.p1:
5’−ATCAACACCGCCGGCAGTTACTGG−3’(配列番号:549)
30943.tm.r1:
5’−ACAGAGTGTACCGTCTGCAGACA−3’(配列番号:550)
30943.3trn−5:
5’−AGCCTCCTGGTGCACTCCT−3’(配列番号:551)
30943.3trn−probe:
5’−CGACTCCCTGAGCGAGCAGATTTCC−3’(配列番号:552)
30943.3trn−3:
5’−GCTGGGCAGTCACGAGTCTT−3’(配列番号:553)
PRO237(DNA34353−1428):
34353.tm.f:
5’−AATCCTCCATCTCAGATCTTCCAG−3’(配列番号:554)
34353.tm.p:
5’−CCTCAGCGGTAACAGCCGGCC−3’(配列番号:555)
34353.tm.r:
5’−TGGGCCAAGGGCTGC−3’(配列番号:556)
PRO324(DNA36343−1310):
36343.tmf1:
5’−TGGTGGATAACCAACAAGATGG−3’(配列番号:557)
36343.tmp1:
5’−GAGTCTGCATCCACACCACTCTTAAAGTTCTCAA−3’ (配列番号:558)
36343.tmr1:
5’−CAGGTGCTCTTTTCAGTCATGTTT−3’(配列番号:559)
PRO351(DNA40571−1315):
40571.tm.f1:
5’−TGGCCATTCTCAGGACAAGAG−3’(配列番号:560)
40571.tm.p1:
5’−CAGTAATGCCATTTGCCTGCCTGCAT−3’(配列番号:561)
40571.tm.r1:
5’−TGCCTGGAATCACATGACA−3’ (配列番号:562)
PRO362(DNA45416−1251):
45416.tm.f1:
5’−TGTGGCACAGACCCAATCCT−3’ (配列番号:563)
45416.tm.p1:
5’−GACCCTGAAGGCCTCCGGCCT−3’(配列番号:564)
45416.tm.r1:
5’−GAGAGAGGGAAGGCAGCTATGTC−3’(配列番号:565)
PRO615(DNA48304−1323):
48304.tm.f1:
5’−CAGCCCCTCTCTTTCACCTGT−3’(配列番号:566)
48304.tm.p1:
5’−CCATCCTGTGCAGCTGACACACAGC−3’(配列番号:567)
48304.tm.r1:
5’−GCCAGGCTATGAGGCTCCTT−3’ (配列番号:568)
PRO531(DNA48314−1320):
48314.tm.f1:
5’−TTCAAGTTCCTGAAGCCGATTAT−3’(配列番号:569)
48814.tm.p1:
5’−CCAACTTCCCTCCCCAGTGCCCT−3’(配列番号:570)
48814.tm.r1:
5’−TTGGGGAAGGTAGAATTTCCTTGTAT−3’(配列番号:571)
PRO618(DNA49152−1324):
49152.tm.f1:
5’−CCCTTCTGCCTCCCAATTCT−3’(配列番号:572)
49152.tm.p1:
5’−TCTCCTCCGTCCCCTTCCTCCACT−3’(配列番号:573)
49152.tm.r1:
5’−TGAGCCACTGCCTTGCATTA−3’(配列番号:574)
PRO772(DNA49645−1347):
49645.tm.f2:
5’−TCTGCAGACGCGATGGATAA−3’ (配列番号:575)
49645.tm.p2:
5’−CCGAAAATAAAACATCGCCCCTTCTTCTGC−3’ (配列番号:576)
49645.tm.r2:
5’−CACGTGGCCTTTCACACTGA−3’(配列番号:577)
49645.tm.f1:
5’−ACTTGTGACAGCAGTATGCTGTCTT−3’ (配列番号:578)
49645.tm.p1:
5’−AAGCTTCTGTTCAATCCCAGCGGTCC−3’(配列番号:579)
49645.tm.r1:
5’−ATGCACAGGTTTTTCTGGTAA−3’(配列番号:580)
PRO703(DNA50913−1287):
50913.tm.f1:
5’−GCAGGAAACCTTCGAATCTGAG−3’(配列番号:581)
50913.tm.p1:
5’−ACACCTGAGGCACCTGAGAGAGGAACTCT−3’ (配列番号:582)
50913.tm.r1:
5’−GACAGCCCAGTACACCTGCAA−3’(配列番号:583)
PRO792(DNA56352−1358):
56352.tm.f1:
5’−GACGGCTGGATCTGTGAGAAA−3’(配列番号:584)
56352.tm.p1:
5’−CACAACTGCTGACCCCGCCCA−3’(配列番号:585)
56352.tm.r1.
5’−CCAGGATACGACATGCTGCAA−3’(配列番号:586)
PRO474(DNA56045−1380):
56045.tm.f1:
5’−AAACTCCAACCTGTATCAGATGCA−3’(配列番号:587)
56045.tm.p1:
5’−CCCCCAAGCCCTTAGACTCTAAGCCC−3’ (配列番号:588)
56045.tm.r1:
5’−GACCCGGCACCTTGCTAAC−3’ (配列番号:589)
PRO274(DNA39987−1184):
39987.tm.f:
5’−GGACGGTCAGTCAGGATGACA−3’ (配列番号:590)
39987.tm.p:
5’−TTCGGCATCATCATCTCTTCCCTCTCCC−3’ (配列番号:591)
39987.tm.r:
5’−ACAAAAAAAAGGGAACAAAATACGA−3’(配列番号:592)
PRO381(DNA44194−1317):
44194.tm.f:
5’−CTTTGAATAGAAGACTTCTGGACAATTT−3’ (配列番号:593)
44194.tm.p:
5’−TTGCAACTGGGAATATACCACGACATGAGA−3’ (配列番号:594)
44194.tm.r:
5’−TAGGGTGCTAATTTGTGCTATAACCT−3’ (配列番号:595)
44194.tm.f2:
5’−GGCTCTGAGTCTCTGCTTGA−3’(配列番号:596)
44194.tm.p2:
5’−TCCAACAACCATTTTCCTCTGGTCC−3’(配列番号:597)
44194.tm.r2:
5’−AAGCAGTAGCCATTAACAAGTCA−3’ (配列番号:598)
PRO717(DNA50988−1326):
50988.tm.f3:
5’−CAAGCGTCCAGGTTTATTGA−3’(配列番号:599)
50988.tm.r3:
5’−GACTACAAGGCGCTCAGCTA−3’(配列番号:600)
50988.tm.p3:
5’−CCGGCTGGGTCTCACTCCTCC−3’(配列番号:601)
PRO1330及びPRO1449(各々、DNA64907−1163及びDNA64908−1163):
30943.tm.f3:
5’−CGTTCGTGCAGCGTGTGTA−3’(配列番号:602)
30943.tm.p3:
5’−CTTCCTCACCACCTGCGACGGG−3’(配列番号:603)
30943.tm.r3:
5’−GGTAGGCGGTCCTATAGATGGTT−3’(配列番号:604)
30943.tm.f1:
5’−AGATGTGGATGAATGCAGTGCTA−3’(配列番号:605)
30943.tm.p1:
5’−ATCAACACCGCCGGCAGTTACTGG−3’(配列番号:606)
30943.tm.r1:
5’−ACAGAGTGTACCGTCTGCAGACA−3’(配列番号:607)
30943.3trn−5:
5’−AGCCTCCTGGTGCACTCCT−3’(配列番号:608)
30943.3trn−probe:
5’−CGACTCCCTGAGCGAGCAGATTTCC−3’(配列番号:609)
30943.3trn−3:
5’−GCTGGGCAGTCACGAGTCTT−3’(配列番号:610)
【0554】
5’ ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光PCRベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのTaqDNAポリメラーゼ酵素の5’ エキソヌクレアーゼ活性を使用する。PCR反応に典型的な単位複製配列の生成に2つのオリゴヌクレオチドプライマー(正[.f]及び逆[.r])を使用した。第3のオリゴヌクレオチド、又はプローブ(.p)は、2つのPCRプライマーの間に位置する核酸配列を検出するために設計された。プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。2つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素によりテンプレート依存的方式で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第2のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子について標識され、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
5’ ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などの実時間定量的PCR装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合装置(CCD)カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96−ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは光ファイバーケーブルで96ウェルに集められ、CCDで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
5’ ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はCt又は境界サイクルで表現される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。癌DNAの結果と正常ヒトDNAの結果を比較する場合、Ct値は核酸試料における特定の標的配列の種発コピー相対数の定量的尺度として使用しされる。
表8は、本発明のPROポリペプチド化合物のスクリーニングに用いられた種々の原発腫瘍のT段階及びN段階を示す。
【0555】
【0556】
DNA調製:
DNAは培養した細胞系、一次腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解:
細胞を洗浄し、チップ当たり7.5x108の濃度でトリプシン化し、4℃で5分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで1/2容量のPBS再遠心で洗浄した。ペレットを3回洗浄し、懸濁細胞を回収して2xPBSで洗浄した。次いで細胞を10mLのPBSに懸濁させた。バッファーC1を4℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を6.25mlの冷ddH2Oで最終濃度20mg/mlまで希釈して4℃で平衡化させた。10mLのG2バッファーを、QuiagenRNAseAストック(100mg/ml)を200μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーC1(10mL、4℃)及びddH2O(40mL、4℃)を、次いで10mLの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で10分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで4℃において2500rpmで15分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mLのバッファーC1(4℃)及び6mLのddH2Oに懸濁し、1秒後に4℃において2500rpmで15分間遠心分離した。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり200μlを用いて再懸濁した。G2バッファー(10ml)を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを30秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ(200μl上記のように調製)を添加し、50℃で60分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0557】
固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解:
腫瘍試料を秤量し50mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり250mgの組織未満に制限した(1チップ/調製)。プロテアーゼ溶液を6.25mlの冷ddH2O中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して4℃で貯蔵した。DNAseAを最終濃度200mg/mlまで希釈することによりG2バッファー(20ml)を調製した(100mg/mlのストックから)。エアロゾルの吸入を避けるために層流Tフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を19mlのG2バッファー中で60秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々2LのddH2Oで2x30秒間、次いでG2バッファー(50ml)でスピンさせることによりポリトロンを透明化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ(上記の用に調製、1.0ml)を添加し、次いでボルテックスして50℃で3時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0558】
ヒト血液調製及び溶解:
健常なボランティアから標準的な感染薬プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり10mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを6.25mlの冷ddH2O中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して4℃で貯蔵した。DNAseAを100mg/mlのストックから最終濃度200mg/mlまで希釈することによりG2バッファー(20ml)を調製した。血液(10ml)を50mlのコニカル管に配し、10mlのC1バッファー及び30mlのddH2O(ともに4℃で平衡化したもの)を添加し、反転させて混合して氷上に10分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、4℃において2500rpmで15分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を2mlのC1バッファー(4℃)及び6mlのddH2O(4℃)中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に200μlチップを用いて懸濁させた。G2バッファー(10ml)を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで30秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加(200μl)し、50℃で60分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0559】
透明化溶解物の精製:
(1)ゲノムDNAの単離:
ゲノムDNAを10mlのQBTバッファーで平衡化した(最大チップ調製当たり1試料)。QF溶離バッファーを50℃で平衡化した。試料を30秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを2x15mlのQCバッファーで洗浄した。DNAを、30mlのシラン化したオートクレーブ30mlCortex管に15mlのQFバッファー(50℃)で溶離した。イソプロパノール(10.5ml)を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、DNAが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、SS−34ロータで4℃において15,000rpmで10分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、10mlの70%エタノール(4℃)を添加した。試料を、SS−34ロータで4℃において10,000rpmで10分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚の各面に置き、37℃で10分間乾燥させたが、使用の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを1.0mlのTE(pH8.5)に溶解し、50℃に1−2時間置いた。試料を4℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでDNA溶液を、ツベルクリンシリンジ上に26ゲージの針を具備する1.5ml管に移した。DNAを剪断するために移行を5x繰り返した。次いで試料を50℃に1−2時間置いた。
【0560】
(2)ゲノムDNAの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製:
各管のDNAレベルを1:20希釈(5μlDNA+95μlddH2O)での標準的なA260、A280スペクトルにより、Beckman DU640分光光度計の0.1ml石英キュベットを用いて定量した。A260/A280比率は1.8−1.9の範囲であった。次いで各DNA試料をTE(pH8.5)中に約200ng/mlまで希釈した。最初の材料が高濃度(約700ng/μl)である場合、材料を50℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料(20−600ng/ml)に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光DNA定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約15分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液(#H33258、10μl、使用の12時間以内に調製)を100mlの1xTNEバッファーに希釈した。2mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。pGEM3Zf(+)(2μl、ロット#360851026)を2mlの蛍光計溶液に添加して200単位で校正した。次いで、さらに2μlのpGEM3Zf(+)DNAを試験し、400+/−10単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも3回読んだ。3試料が互いに10%以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をddH2O中に10ng/μlまで希釈するのに用いた。これは、1回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、500−1000アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、Taqman(商品名)プライマー及びプローブで3回試験し、B−アクチン及びGAPDHともに正常なヒトDNAを持ちテンプレート対照を持たない単一のプレート上にある。希釈した試料を用いたが、試験DNAから減算した正常ヒトDNAのCT値は+/−1CTであった。希釈した、ロット定性化したゲノムDNAを、1.0mlアリコートで−80℃において保存した。続いて遺伝し増幅アッセイに使用するアリコートは、4℃で保存した。各1mlのアリコートは、8−9プレート又は64試験に十分である。
【0561】
遺伝子増幅アッセイ:
本発明のPROポリペプチド化合物を以下の原発腫瘍でスクリーニングし、1.0以上の得られたΔCt値を表9に報告する。
【0562】
【0563】
要約
上記に記載した種々のDNAの増幅が種々の腫瘍において生じるため、種々DNAの増幅は腫瘍の形成及び/又は成長と関連しているようである。結果として、これらポリペプチドを標的としたアンタゴニスト(例えば抗体)は、癌治療において有用であると期待される。
【0564】
実施例115:内皮細胞におけるc−fosの誘導(アッセイ34)
このアッセイはPROポリペプチドが内皮細胞においてc−fosを誘導する能力を示すか否を決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば創傷治癒やそれに類似のものを含む血管新生が有益な症状や疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストのように)。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性の腫瘍の治療上の処置にとって有用であると期待される。
成長培地(50%のハムのF12w/oGHT:低グルコース、及びグリシンなしの50%DMEM:NaHCO3、1%グルタミン、10mMのHEPES、10%のFBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を1x104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl/ウェルの試験試料と対照(ポジティブ対照=成長培地;ネガティブ対照=プロテイン32バッファー=10mMのHEPES、140mMのNaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%CO2中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、DNAキットプロトコール(Chiron Diagnostics, cat.#6005−037)の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬/バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なTM溶菌バッファー及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをTM溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。bDNA条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μlの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各b−DNAウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのプローブを伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各b−DNAウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むbDNAウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
【0565】
次の日に、bDNAキットプロトコールの第2の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により適用された情報に基づいて計算した。ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物(Amplifier Concentrate)(20fm/μl)を作成することにより50μlのアンプリファイアー作用液を調製した。ついで、プレートをインキュベーターから取り除いて10分間冷却した。標識プローブ作用液を、ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈で標識濃縮物(40pmoles/μl)を作成することにより調製した。10分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質に3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Aで2回、洗浄剤Dで3回洗浄した。50μlのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、RLUを適当な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。ネガティブ対照(上述のプロテイン32/HEPESバッファー)値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位(RLU)によって示された。結果を下記の表8に示し、ネガティブ対照値に対して少なくとも2倍の値を示す試料はポジティブと考えた。ネガティブ対照=1.00%希釈で1.00RLU。ポジティブ対照=1.00%希釈で8.39RLU。
このアッセイでは、以下の試験PROポリペプチドが陽性であった:PRO938、PRO200、PRO865、PRO788、及びPRO1013。
【0566】
実施例116:ラット卵形嚢支持細胞の増殖(アッセイ54)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが、聴覚性有毛細胞前駆体である内耳支持細胞に対して潜在的にマイトジェンとして作用し、それ故に聴毛細胞の再生の誘導及び哺乳類の聴力損失の治療に有用であることを示している。
本アッセイは、次のように行われる。ラットUEC−4卵形嚢内皮細胞を、33℃における200μlの血清含有培地中、3000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに分ける。一晩の後、37℃において培地を無血清培地に変える。そしてPROポリペプチドの種々の希釈(又はコントロール無し)を培地へ添加し、細胞を24時間インキュベートする。24時間のインキュベーションの後、3H−チミジン(1μCi/ウェル)を添加し、細胞を更に24時間インキュベートする。次いで培地を洗浄して取り込まれていない放射能標識を取り除き、細胞は回収し、Cpm/ウェルを測定した コントロール培地と比較して、PROポリペプチド処理培地の中で、少なくとも30%又はそれより高いCpmをこのアッセイでのポジティブと考える。
以下の試験PROポリペプチドがこのアッセイで陽性であった:PRO337、PRO363及びPRO1012。
【0567】
実施例117:初期ラット脂肪細胞によるグルコース又はFFA取り込みに影響を与えるPROポリペプチドの検出(アッセイ94)
このアッセイは、PROポリペプチドが脂肪細胞によるグルコース又はFFA取りみに影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む脂肪細胞によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるPROポリペプチドは初期ラット脂肪細胞へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。4及び16時間目に、グリセロール、グルコース及びFFA取り込みのアッセイのための試料が取られる。16時間のイキュベーション後、イシュリンを培地へ加え、4時間のインキュベートをおこなう。この時、試料が取られて、グリセロール、グルコース及びFAAの取り込みが測定される。PROポリペプチドが無くインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロールとして使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果は陽性と記録される。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの刺激剤として陽性と評価された:PRO181、PRO200、PRO337、PRO362、PRO363、PRO731、PRO534、PRO1114及びPRO075。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの阻害剤として陽性であった:PRO195、PRO322、PRO862、PRO868、PRO865、及びPRO162。
【0568】
実施例118:骨格筋のグルコース又はFFA取り込みに影響を与えるポリペプチドの検出(アッセイ106)
このアッセイは、PROポリペプチドが骨格筋のグルコース又はFFA取り込に影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む骨格筋によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるPROポリペプチドは初期ラット分化型骨格筋へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。ついで、PROポリペプチド及び+/−インシュリンを含む新鮮な培地がウェルに加えられる。その後、試料培地は、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを測定するために監視される。イシュリンは、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを刺激し、PROポリペプチドを含まないインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロール及びスコーリング制限として使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果は陽性と記録される。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの刺激剤又は阻害剤として陽性であった:PRO181、PRO200、PRO1083、PRO865、PRO162、PRO1008及びPRO1330。
【0569】
実施例119:心臓新生児肥大の刺激(アッセイ1)
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、種々の心臓機能不全疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x104/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12+4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加する。試験PROポリペプチド又は成長培地のみ(負の対照)(20μl/ウェル)を含む試験試料を1日目にウェルに直接添加する。ついで、PGF(20μl/ウェル)を10−6Mの最終濃度まで2日目に添加する。ついで、細胞を4日目に染色し、5日目に視覚的にスコアをつけ、負の対照と比較してサイズの増加がない細胞をスコアが0.0とし、負の対照と比較してサイズが小から中程度増加している細胞を1.0とし、負の対照と比較してサイズが大きく増加している細胞を2.0のスコアとする。このアッセイの陽性は、スコアが1.0又はそれ以上である。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO195、PRO200、PRO526及びPRO792。
【0570】
実施例120:F2aにより誘導された心臓新生児肥大の促進(アッセイ37) このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、種々の心臓機能不全疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x104/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12 +4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加する。試験PROポリペプチド(20μl/ウェル)を含有する試験試料を1日目にウェルに直接添加する。次いで2日後にPGF(20μl/ウェル)を最終濃度10−6Mで添加する。次いで細胞を4日目に染色し、5日目にスコアをつける。視覚的スコアは細胞サイズに基づき、ネガティブ対照に比較してサイズの増加を示さない細胞を0.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの小から中程度の増加を示す細胞を1.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの大きな増加を示す細胞を2.0とスコア付けする。1.0又はそれ以上のスコアをポジティブと考える。
アッセイ反応にCa濃度が重要であるためPBSは含有しない。プレートはDMEM/F12 +4%FCS(200μl/ウェル)でコートした。アッセイ媒体は以下を含む:DMEM/F12(2.44gmの重炭酸塩を含む)、10μg/mlのトランスフェリン、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのアプロチニン、2mmol/Lのグルタミン、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン。マンニトール(4%)を含むタンパク質バッファーは1/10(0.4%)及び1/100(0.04%)ではポジティブシグナル(スコア3.5)を与えたが、1/1000(0.004%)では与えなかった。従って、マンニトールを含む試験試料バッファーは実行しなかった。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO195。【0571】
実施例121:モルモット血管漏洩(アッセイ32及び51)
このアッセイは本発明のPROポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば肥大した局所免疫系細胞浸潤から恩恵を受ける状態を含む肥大血管透過性
によって益を受ける状態の治療上の処置にとって有用であると期待される。
350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(70−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける。PRO302ポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ16−24の注射部位があった。ついで1mlのエバンスブルー染料(PBS中1%)を心臓内注射する。化合物に対する皮膚血管透過性応答(すなわち、注射部位の斑点)について、試験動物の投与1及び6時間後に注射部位からの青色の漏出の直径(mm)を測定することで視覚によりスコアをつける。注射部位の青さのmm直径を観察し、血管漏出の重症度と共に記録する。少なくとも5mmの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは陽性であると考えられ、血管漏出又は透過性を誘導する能力を示している。7mmの直径より大きな応答は、条件付けられた培地試料に対して陽性であると考えられる。0.1μg/100μlのヒトVEGFが正の対照として使用され、15−23mm直径の応答を誘導した。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO200。
【0572】
実施例122:皮膚血管透過性アッセイ(アッセイ64)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが免疫系を刺激し、哺乳類の注射の部位での単核球、好酸球及びPMN浸潤を誘導することによる炎症を誘導することを示す。免疫応答を刺激する化合物は、免疫応答が有益である場合には治療的に有用である。この皮膚血管透過性アッセイは,以下のようにおこなわれる。350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(70−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける(IM)。本発明の精製ポリペプチド又は条件付試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ10−30、好ましくは16−24の注射部位を有する可能性がある。ついで1μlのエバンスブルー染料(1%の緩衝化された生理的食塩水)を心臓内注射する。そして、注射部位の斑点を注射後1及び6時間後に測定する(mm直径)。動物は、注射から6時間後に犠牲となった。各々の皮膚注射部位は、生検されてホルマリンで固定される。そして、この皮膚は、組織病理学的評価のために調整される。各々の部位は、皮膚への炎症細胞湿潤のために評価される。可視的な炎症細胞湿潤の部位は、陽性とスコアされる。炎症細胞は、好中球、好酸球、単核球又はリンパ性である可能性がある。少なくとも、注射部位の最小血管周囲湿潤物は陽性とスコアされ、注射の部位の湿潤物でないものは、陰性とスコアされる。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO200、PRO362及びPRO1031。
【0573】
実施例123:皮質性ニューロンでのc−fosの誘導(アッセイ83)
このアッセイは、PROポリペプチドが皮質性ニューロンでのc−fosを誘導する能力を示すかどうかを測定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、神経系疾患の治療上の処置及びニューロン増殖が有益である損傷にとって有用であると期待される。
皮質性ニューロンは、分離されて96ウェルプレートの1ウェル当たり10,000細胞で成長培地にプレートされる。2細胞分裂の後、細胞は30分間に渡り、PROポリペプチド処理されるか、何も処理されない(負の対照)。次に、細胞は5分間に渡り冷メタノールで固定化され、リン酸化CREBを標的とする抗体によって染色される。そして、mRNAレベルが化学発光を使用して算定される。このアッセイにおける陽性は、負の対照と比較してc−fosのメッセージが少なくとも2倍の増加となった全ての因子である。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200。
【0574】
実施例124:マウス腎メサンギウム細胞増殖アッセイ(アッセイ92)
このアッセイ37は、本発明のあるペプチドが、哺乳類の腎メサンギウム細胞の増殖を誘導するように作用し、それ故にバーガー病又はシェーンライン−ヘノーホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎又はクローン病に関連する他の腎障害のようなメサンギウム細胞の機能低下と関連する腎疾患の治療に有用である。このアッセイは以下のようにおこなわれる。1日目、マウス腎メサンギウム細胞を、96ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95%ウシ胎児血清、5%14mM HEPES補充)にプレートし、一晩生育させる。2日目には、PROポリペプチドを無血清培地で二つの濃度(1%及び5%)に希釈し、細胞へ添加する。対照試料は無血清培地である。4日目には、20μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を2時間に渡り継続させる。そして、吸光度を490nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも15%上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO363、PRO731、PRO534、PRO866及びPRO1031。
【0575】
実施例125:周皮細胞c−fos誘導(アッセイ93)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞におけるc−fosの発現を誘発するように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞結合腫瘍の治療的処置に有用であると予期されるアンタゴニストを生じせしめることを示す。特に1日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得、5mlの培地以外をフラスコから取り出す。2日目に周皮細胞をトリプシン化し、洗浄し、スピンさせ、ついで96ウェルプレートに蒔く。7日目に培地を取り出し、周皮細胞を100μlのPROポリペプチドテスト用試料及び対照体(正の対照体=DEM+5%血清+/−500ng/mlのPDGF;負の対照体=プロテイン32)で処理する。複製を平均し、SD/CVを決定する。蛍光ルミネセンス単位(RLU)照度計リーディングバース頻度により示されたプロテイン32値を越える折り畳み増加(バッファー対照)をヒストグラム上にプロットし、上記のプロテイン32値を2倍越えると、アッセイについてポジティブであると考えられる。ASYマトリックス:成長培地=低グルコースDMEM=20%FBS+1xペンストレップ(pen strep)+1Xフンギゾン(fungizone)。アッセイ用培地=低グルコースDMEM+5%FBS。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO200。
【0576】
実施例126:軟骨細胞再分化アッセイ(アッセイ110)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導し、それ故に例えば、スポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれる。ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、単離された細胞を、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF−12へ25,000細胞/cm2の割合で接種する。培地は、3日ごとに換えられ、そして細胞を血清を含まない100μlの同じ培地へ5,000細胞/ウェルとなるよう96ウェルプレートへ接種し、100μlの試験PROポリペプチド、5nMスタウロスポリン(正の対照)又は培地のみ(負の対照)を添加して最終容量を200μl/ウェルとする。5日間のインキュベーション後、各ウェルの写真を撮り、軟骨細胞の分化段階を測定する。軟骨細胞の再分化が負の対照よりも正の対照へ似ている場合には、アッセイにおいて陽性の結果が生じたとした。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO220、PRO285、PRO337、PRO526、PRO362、PRO363、PRO531、PRO1083、PRO862、PRO733、PRO1017、PRO792、PRO788、PRO1008、PRO1075、PRO725、及びPRO1031。
【0577】
実施例127:赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビン誘発(アッセイ107)
このアッセイは、成人のヘモグロビンから赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビンへの切替を誘発する、PROポリペプチドの能力をスクリーニングするのに有用である。このアッセイにおいて試験する分子がポジティブであると、種々のサラセミア等の、多様な哺乳類ヘモグロビン関連疾患を治療的に処置するのに有用であることが期待される。このアッセイは以下のようにして行われる。赤芽球細胞を標準的成長培地において、96ウェルフォーマットに1000細胞/ウェルで蒔く。0.2%又は2%の濃度でPROポリペプチドを成長培地に添加し、細胞を37℃で5日間インキュベートする。正の対照体として、細胞を100μMのヘミンで処理し、負の対照体として、細胞を処理しない。5日後、細胞溶解物を調製し、ガンマグロブリンの発現について分析する(胎児用マーカー)。このアッセイにおいてポジティブとは、ガンマグロブリンレベルが負の対照体の少なくとも2倍であることである。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO237、PRO381、PRO362、PRO724、PRO866、PRO1114、PRO725及びPRO1071。
【0578】
実施例128:膵臓β細胞前駆体の増殖の誘導(アッセイ117)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の増殖を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化PCR(RT−PCR、real time quatitative PCR)によって測定する:評価されるマーカーは、Pdx1と呼ばれる転写因子である。
膵臓は、E14胚(CD1マウス)から解剖された。そして、膵臓はF12/DMEM中のコラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)で37℃、40−60分で消化された(コラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113)。次に、消化物を等量の5%BSAによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第1日目、細胞を12ウェルの組織培養プレート(PBS中の20μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された)へ接種する。1−2の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第2日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、2mlの最小培地を添加する。第4日目には、培地を取り除き、細胞よりRNAを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写PCR(real time quantitative RT−PRC)によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640は、以下のもの加えたRPMI1640である:
グループA1:1000
グループB1:1000組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml)1:2000(べーリンガーマンハイム#981532)
ウシ下垂体抽出物(BPE)60μg/ml
ゲンタマイシン100ng/ml
グループA:(10ml PBS中)
トランスフェリン、100mg(シグマ T2252)
上皮細胞成長因子、100μg(BRL 100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマ T5516)
エタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ E0135)
ホスホエタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ P0503)
セレニウム、4μlの10−1Mの100μl(Aesar #12574)
グループC:(10ml 100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−3M(シグマ #H0135)
プロジェステロン、1x10−3M(シグマ P0503)
フォルスコリン、20mMの500μl(カルバイオケム #344270)
最小培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びBPE(15μg/ml)。
限定培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO237及びPRO731。
【0579】
実施例129:混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける刺激性活性(アッセイ24)
この実施例は、本発明のあるペプチドが、刺激されたT−リンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益な 場合、治療的に有益に有用である。治療剤は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形をとり、例えば、ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。このアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版に記載されている。
さらに具体的には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)に3x106細胞/mlに再懸濁させる。刺激物PBMCは細胞を光にさらす(約300ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物:
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4−IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0 mC/ウェル;Amersham)を適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトM(Lympholyte M)(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000 rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
対照体に対する増加が陽性であると考えられ、好ましくは180%以上又は180%と同等の増加が好ましい。しかしながら、対照体より大きい全ての値は、試験用タンパク質について刺激効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273、PRO526、PRO381、PRO719、PRO866、及びPRO1031。
【0580】
実施例130:混合リンパ球反応(MLR)における阻害活性アッセイ(アッセイ67)
この実施例は、本発明の一又は複数のポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい治療において有用である。
このアッセイの基本的プロトコールは、Immunology, unit3.12;J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のCurrent Protocolsに記載されている。
さらに、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)に3x106細胞/mlに再懸濁させる。刺激物PBMCは細胞を光にさらす(約300ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物:
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4−IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)を適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトM(Lympholyte M)(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
任意に以下の対照体が減少することは、阻害用化合物についてのポジティブな結果であると考えられ、80%未満の減少が好ましい。しかしながら、任意の値が対照体未満であるなら、試験用タンパク質について阻害効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273、PRO526、PRO381、PRO701、PRO363、PRO531、PRO1083、PRO865、PRO788、及びPRO1114。
【0581】
実施例131:繊維芽細胞(BHK−21)の増殖(アッセイ98)
このアッセイは、本発明のあるPROポリペプチドが、培養において哺乳類の繊維芽細胞の増殖の誘導し、それ故に哺乳類のシステムにおいて有用な成長因子として機能することを示す。BHK−21繊維芽細胞を標準成長培地へ、全容量100μlで2500細胞/ウェルでプレートした。そして、全容量200μlで1μg/mlのヘパリンの存在下のウェルへPROポリペプチド、β−FGF(正の対照)又は無含有(負の対照)を添加する。ついで、細胞を37℃で6−7日間インキュベートする。インキュベーシュン後、培地を取り除き、細胞をPBSで洗浄した後に酸性ホスファターゼ基質混合物(100μl/ウェル)を加える。そして,細胞を37℃で2時間インキュベートする。次に、1ウェルにつき10μlの1N NaOHを添加し、酸性ホスファターゼ反応を止める。そして、プレートをOD 450nmで測定する。このアッセイの陽性は、少なくとも負の対照より50%上の酸性ホスファターゼ活性である。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273及びPRO731。
【0582】
実施例132:
内皮細胞アポトーシスの誘導(ELISA)(アッセイ109)
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力を、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中で96ウェルフォーマットを使用して、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。使用した96ウェルプレートはFalconにより製造された(番号3072)。96ウェルのコーティングは、PBS溶液中の0.2%ゼラチン100μlで>30分間ゼラチン化を起こすことにより調製した。ゼラチン混合物を全部吸引した後、10%血清含有培地中で最終濃度2x104細胞/mlの最終濃度−ウェル当たり100μl容量でプレーティングした。対象とするPROポリペプチドを含有する試験試料を添加する前に細胞を24時間成長させた。
全てのウェルに、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中100μlを添加した。PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%の希釈で三つ組で添加した。細胞の無いウェルをブランクとして使用し、細胞だけのウェルをネガティブ対照として使用した。ポジティブ対照として、3x原液のスタウロスポリンの50μlの1:3の連続希釈物を使用した。ELISAに先立って、細胞を24から35時間インキュベートした。
ELISAを、Boehringer マニュアル[Boehringer, 細胞死検出ELISA plus, カタログ番号1920685]に従ってアポトーシス調製溶液のレベルを決定するのに使用した。試料調製:96ウェルプレートを1krpmで10分間スピン沈降させ(200g)、高速反転により上清を除去し、プレートをペーパータオル上に上下逆に置いて残りの液体を除去した。各ウェルに、100μlの1X溶菌バッファーを添加して振盪させずに30分間室温でインキュベートした。プレートを1krpmで10分間スピン沈降させ、20μlの溶菌液(細胞質画分)をストレプトアビジン被覆MTPに移した。80μlの免疫試薬混合物を各ウェルで20μl溶菌液に加えた。MTPを粘着性ホイルでカバーし、それを軌道振盪機(200 rpm)に配することにより2時間室温でインキュベートした。2時間後、上清を吸引により除去し、ウェル当たり250μlの1Xインキュべーションバッファーで3回ウェルをリンスした(吸引で除去した)。各ウェルに基質溶液を添加し(100μl)、軌道振盪機で室温において250 rpmで、光度測定分析に十分な発色がされるまでインキュベートした(約10−20分後)。参照波長492nmとして405nmでプレートを読むのに96ウェルリーダーを用いた。PIN32(対照バッファー)について得られたレベルを100%に設定した。レベル>130%の試料をアポトーシス誘導についてのポジティブと考えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO8446。
【0583】
実施例133: 内皮細胞アポトーシスの誘導(ELISA)(アッセイ73)
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力をヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。
細胞を96ウェルマイクロたーたープレート(Amersham Life Science, cytostar−Tシンチレーティングマイクロプレート、無菌、組織培地処理、個々にラッピング)で10%の血清(CSG−媒体、Cell Systems)中、ウェル当たり2x104細胞の密度で全容量100μlでプレーティングした。2日目に、PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%希釈の3段階で添加した。細胞無しのウェルをブランクとして用い、細胞のみのウェルをネガティブ対照として用いた。ポジティブ対照としてスタウロスポリンの3xストックの1:3連続希釈50μlを用いた。PROポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、カルシウム及びリン脂質結合タンパク質のメンバーであるアネキシンV(AnnexinV)の検出のために96ウェルをプロセッシングしてアポトーシスを検出することにより決定した。
0.2mlのアネキシンV−ビオチンのストック溶液(100μg/ml)を、4.6mlの2 x Ca2+結合バッファー及び2.5%BSA中に希釈した(1:25希釈)。50μlの希釈アネキシンV−ビオチン液を、1.0μg/mlの最終濃度になるまで各ウェル(対照を除く)に添加した。試料を35S−ストレプトアビジンの直接添加の前にアネキシン−ビオチンと共に10−15分間インキュベートした。35S−ストレプトアビジンは2 x Ca2+結合バッファー、2.5%BSA中に希釈し、最終濃度が3 x 104cpm/ウェルになるまで全てのウェルに添加した。次いでプレートを密封し、1000 rpmで15分間遠心分離し、2時間の間、軌道シェイカー上に配した。分析は1450Microbeta Trilux (Wallac)で実施した。バックグラウンドを越えるパーセントがネガティブ対照を越える毎分当たりのカウントのパーセント量を表す。バックグラウンドを越えるパーセントが30%以上のものがポジティブであると考えられる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO719。
【0584】
実施例134:ヒト静脈内皮細胞Caフラックスアッセイ(アッセイ68)
このアッセイは、PROポリペプチドがヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)におけるカルシウムフラックスを刺激する能力を示すか否かを決定するために設計されている。Ca流入(influx)は、ある種のリガンドがそのレセプターに結合する際の良好に実証された反応である。このCa流入アッセイにおいてポジティブ反応をもたらす試験化合物は、特定のレセプターに結合してヒト内皮細胞における生物学的シグナル伝達経路を活性化すると言える。これは究極的に、例えば細胞分裂、細胞増殖の阻害、内皮管形成、細胞泳動、アポトーシスを誘導しうる。
成長培地(50:50グリシン無し、1%グルタミン、10mMのHepes、10%FBS、10 ng/mlのbFGF)中のヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を、96ウェルのmicrotiter View Plate−96(Packard Instrument Company Part #6005182)マイクロタイタープレートに2x104細胞/ウェルの細胞密度でプレーティングした。プレーティングの次の日、細胞をバッファー(HBSS+10mMのHepes)で3回洗浄し、100μl/ウェルを残した。次いで100μl/ウェルの8μMのFluo−3(2x)を添加した。細胞を37℃/5%CO2において1.5時間インキュベートした。インキュべーションの後、細胞をバッファー(上記)で3x洗浄し、100μl/ウェルを残した。PROポリペプチドの試験試料は、異なる96ウェルプレート上で、バッファー中5x濃度で調製した。ポジティブ対照は50μMイオノマイシン(5x)に相当し;ネガティブ対照はプロテイン32に相当する。細胞プレート及び試料プレートをFLIPR(Molecular Devices)マシンで走らせた。FLIPRマシンは25μlの試験試料を細胞に添加し、2秒ごとに1分間、次いで3秒ごとに3分間読み取りを行った。
曲線のベースラインから最大値まで上昇する蛍光変化(Δ変化)を計算し、複製を平均化した。蛍光増加の速度を監視し、1000より大きなΔ変化及び60秒以内の上昇を有する試料のみをポジティブと考えた。下記の表9において、結果はポジティブ対照に対して表現した。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO771。
【0585】
実施例135:内皮細胞でのc−fosの誘導(アッセイ34)
このアッセイはPROポリペプチドが内皮細胞においてc−fosを誘導する能力を示すか否を決定するために設計されている。この試験において陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストがそうあろうように)。このアッセイにおいて陽性と試験されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置において有用であると期待される。
成長培地(50%のハムのF12w/oGHT:低グルコース、及びグリシンなしの50%DMEM:NaHCO3、1%グルタミン、10mMのHEPES、10%のFBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を1x104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl/ウェルの試験試料と対照(ポジティブ対照=成長培地;ネガティブ対照=プロテイン32 buffer=10mMのHEPES、140mMのNaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%CO2中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、DNAキットプロトコール(Chiron Diagnostics, cat.#6005−037)の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬/バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なTM溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをTM溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。bDNA条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μlの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各b−DNAウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのプローブを伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各b−DNAウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むbDNAウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
【0586】
次の日に、bDNAキットプロトコールの第2の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により提供された情報に基づいて計算した。ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物(Amplifier Concentrate)(20 fm/μl)を作成することによりアンプリファイアー作用液を調製した。ハイブリダイゼーション混合物をプレートから取り除かれ、洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlのアンプリファイアー作用液を各ウェルへ添加し、ウェルを53℃で30分間インキュベートした。ついで、プレートをインキュベーターから取り除いて10分間冷却した。標識プローブ作用液を、ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈で標識濃縮物(40 pmoles/μl)を作成することにより調製した。10分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質に3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Aで2回、洗浄剤Dで3回洗浄した。50μlのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、RLUを適当な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。負の対照(上述のプロテイン32/HEPESバッファー)値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位(RLU)によって示された。結果は、負のバッファー対照の値に対して少なくとも2倍の値を示す試料は陽性と考えた。
負の対照=1.00%希釈で1.00RLU。正の対照=1.00%希釈で8.39RLU。
【0587】
実施例136:膵臓β細胞前駆体分化の誘導(アッセイ89)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の分化を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化PCR(RTQ−PCR、real time quatitative PCR)によって測定される:評価されるマーカーは、インシュリンである。
膵臓は、E14胚(CD1マウス)から解剖される。そして、膵臓はF12/DMEM中のコラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)で37℃、40−60分で消化される(コラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113)。次に、消化物を等量の5%BSAによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第1日目、細胞を12ウェルの組織培養プレート(PBS中の20μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された)へ接種する。1−2の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第2日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、2mlの最小培地を添加する。第4日目には、培地を取り除き、細胞よりRNAを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写PCR(real time quantitative RT−PRC)によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640(Gibco)は、以下のものを加えたRPMI1640:
グループA1:1000
グループB1:1000
組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml)1:2000(べーリンガーマンハイム#981532)
ウシ下垂体抽出物(BPE)60μg/ml
ゲンタマイシン100 ng/ml
グループA:(10 mlPBS中)
トランスフェリン、100 mg(シグマ T2252)
上皮細胞成長因子、100μg(BRL 100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマ T5516)
エタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ E0135)
ホスホエタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ P0503)
セレニウム、4μlの10−1Mの100μl(Aesar #12574)
グループC:(10 ml 100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−3M(シグマ #H0135)
プロジェステロン、1 x 10−3M(シグマ P0503)
フォルスコリン、20 mMの500μl(カルバイオケム #344270)
最小培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びBPE(15μg/ml)。
限定培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100 ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO162。
【0588】
実施例137:内皮細胞増殖の刺激(アッセイ8)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞(ACE)成長を刺激する能力を示すか否かを測定する用に設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストがそうあろうように)。このアッセイにおいて陽性と試験されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であると期待される。
ウシ副腎皮質毛細管内皮(ACE)細胞(初代培養からのもの、最大12−14継代)を96ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞/ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10%子ウシ血清、2mMグルタミン、及び1xペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む:(1)ACE細胞無添加;(2)ACE細胞のみ;(3)ACE細胞+VEGF(5 ng/ml);及び(4)ACE細胞+FGF(5 ng/ml)。次いで、対照及び試験試料(100マイクロリットル容量)をウェルに添加した(各々、1%、0.1%及び0.01%希釈)。細胞培地を37℃/5%CO2で6−7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をPBSで1x洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロリットル、0.1M酢酸ナトリウム, pH5.5,0.1% トリトンX−100、10mMのリン酸p−ニトロフェニル)を殻ウェルに添加した。37℃で2時間のインキュベーション後に、10マイクロリットルの1NのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度(OD)を405nmでマイクロタイタープレートで測定した。
PROポリペプチドの活性は、(1)細胞のみのバックグラウンドに対する、及び(2)VEGFによる最大刺激に対する(酸ホスファターゼ活性、OD405nmで測定した)増殖増加の倍数として計算した。最大刺激についての活性参照としてVEGF(3−10ng/ml)及びFGF(1−5ng/ml)を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドを越えて>50%である場合に「陽性」と考えた。VEGF(5 ng/ml)対照は1%希釈において1.24倍の刺激を与え;FGB(5 ng/ml)対照は1%希釈において1.46倍の刺激を与えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO1075。
【0589】
実施例138:マウスMesengial細胞阻害アッセイ(アッセイ114)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養においてマウスMesengial細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定すように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば嚢胞性腎形成不全、多発性嚢胞腎疾患、又はMesengial細胞の異常増殖に関連する他の腎疾患、腎腫瘍、及びそれに類似のものなどのMesengial細胞増殖の阻害が有益である症状や疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。
1日目、マウスMesengial細胞を、96ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95%ウシ胎児血清、5%14mM HEPES補充)にプレートし、一晩生育させた。2日目には、PROポリペプチドを無血清培地で二つの異なった濃度(1%及び0.1%)に希釈し、細胞へ添加した。対照試料はPROポリペプチドが無添加の成長培地である。48時間に渡り細胞をインキュベーションした後、20μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を2時間に渡り継続させた。そして、吸光度を490 nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも10%上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO697。
【0590】
実施例139:軟骨細胞増殖アッセイ(アッセイ111)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養において軟骨細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。
ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離した。そして、単離された細胞を25,000細胞/cm2の割合で、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF−12へ接種する。培地は3日ごとに換えられ、細胞は25,000細胞/cm2となるように5日ごとに再接種された。12日目に、細胞を5,000細胞/ウェルの割合の血清を含まない100μlの同じ培地の96ウェルプレートへ接種し、無血清培地(負の対照)、スタウロスポリン(最終濃度5nM;正の対照)又は試験PROポリペプチドを添加して200μl/ウェルの最終容量とした。37℃の5日間の後、20μlのアラマーブルー(Alamar blue)を各ウェルへ添加し、プレートをさらに3時間、37℃でインキュベートした。そして、各ウェルの蛍光を測定した(Ex:530 nm;Em:590 nm)。バックグラウンドを得るために、200μlの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定した。このアッセイの陽性の結果は、PROポリペプチド処理試料の蛍光が負の対照のそれよりも正の対照のそれのような場合において得られる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO181、PRO200及びPRO322。
【0591】
実施例140:ラットDRGニューロン生存阻害アッセイ
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養においてニューロン細胞生存を阻害する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば神経芽細胞腫、神経膠腫、グリア芽細胞腫、及び類似の症状を含む所望されない神経細胞増殖に関連する神経障害性症状の治療的処置に対して有用であると期待される。
E14ラット胎児の背側神経節から新たに単離された神経細胞の異種性集団をF12完全培地で希釈し、50μlのF12完全培地を含みポリオルニチンで前処理されたプレートに5000細胞/ウェルで配する。そして、50μl付加的アッセイ培地を伴う試験PROポリペプチド(50μl、1濃度)を、生存阻害活性の試験の為に添加する。全体で100μlの更なる培地に添加した。負の対照は、100μlの完全培地のみで処理される。3日間のインキュベーシュンの後、細胞をCMFDAで染色し、1時間の4%パラホルムアルデヒド処理の後に固定した。ついで、細胞は、NIHイメージ分析によって数量化された。本アッセイの陽性は、処理ウェル中の細胞数が未処理対照(コントロール)ウェルの0.5より低い場合である。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO195及びPRO701。
【0592】
実施例141:組織発現分布
オリゴヌクレオチドプローブを、定量PCR増幅反応の使用において、付随する図に示すPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列から構築した。オリゴヌクレオチドプローブを、標準的PCR反応に関連したテンプレートの3’ 末端から、約200−600塩基対の増幅された断片が付与されるように選択した。オリゴヌクレオチドプローブを、異なるヒト成人及び/又は胎児の組織源から単離されたcDNAライブラリーを用いた標準的な定量PCR増幅反応に使用し、試験した種々の組織におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現レベルを定量的測定を得るためにアガロースゲル電気泳動により分析した。種々の異なるヒト組織型におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現パターンの知識は、転移腫瘍等の一次組織源を決定するために、他の組織特異的マーカーを用いて又は用いない組織分類分けに有用な診断用マーカーが提供される。これらのアッセイは、以下の結果を提供する。
【0593】
実施例 142:インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定mRNA合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169−176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、PCR生成33P−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。[33P]UTP−標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
【0594】
33P−リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P−UTPを含む管に以下の成分を添加した:
2.0μlの5x転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 10μ; 10mMのGTP, CTP&ATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRnasin
1.0μlのDNAテンプレート(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS, T7=S,通常)
管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon−50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBiofluor IIで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1−3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−17℃冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0595】
33P−ハイブリッド形成
A.凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250 mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10 mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
B.パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10 mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
C.プレハイブリッド化
スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
D.ハイブリッド形成
スライド当たり1.0x106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
E.洗浄:
洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf = 4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250 ml RNaseバッファー中10 mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2x10分間、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20x SSC+16 mlのEDTA、Vf=4L)。
F.オリゴヌクレオチド
ここに開示した種々のDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に用いたオリゴヌクレオチドは、ここに開示したヌクレオチド配列から派生したもので、一般的に約40から50ヌクレオチドの長さである。
【0596】
G.結果
ここに開示した種々のDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析の結果は、以下の通りである。
(1)DNA29101−1122(PRO200)
胎児:
軟骨原基の縁(例えば外縁周辺)における発育中の下肢骨、発育中の腱、血管平価通勤及び細胞包含発育中の骨格筋筋細胞及び筋管における下肢発現。発現は、骨端の成長板でも観察された。発達中のリンパ節の周縁洞におけるリンパ節発現。胸腺皮質の被膜下領域における胸腺発現、おそらく、被膜下内皮細胞又はこの領域で見られる増殖中の二重ネガティブ胸腺のいずれか。脾臓はネガティブである。平滑筋における気管発現。皮質ニューロンにおける脳(小脳皮質)病巣発現。脊髄はネガティブ。平滑筋における小腸発現。甲状腺−甲状腺内皮を越える一般化発現。副腎はネガティブ。管板細胞における肝臓発現。壁平滑筋における胃発現。鱗状内皮の基底層における胎児皮膚発現。栄養膜絨毛の胃腸細胞における膵臓発現。動脈及び静脈の壁における索発現。
コメント:発現パターンは、PRO200が細胞分化/増殖に含まれていることを示唆している。
高発現は以下の付加的部位で観察された:チンパンジー卵巣−成熟小胞の顆粒膜細胞、低強度シグナルが包膜細胞で観察された。チンパンジー上皮小体−主細胞全体の高発現。ヒト胎児精巣−発育中の細管を囲む間質細胞全体に中程度の発現。ヒト胎児肺−発育中の気管支の軟骨細胞全体の高発現、及び分岐している気管支内皮における低レベル発現。腎臓細胞、胃腸及び結腸肉腫では特定の発現は観察されなかった。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢。試験した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃腸肉腫、結腸、結腸肉腫及び骨盤肉腫を含む。アセトミノフェン(acetominophe)は肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
(2)DNA30867−1335(PRO218)
胎児小腸、胎児胸腺、チンパンジー胃腸内皮を含む多数の内皮全体に低レベルの発現。発現は、幹細胞癌の悪性細胞全体にも見られた。胎児脳、皮質全体の発現。分布は明らかな機能を示唆していない。試験したヒト胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢を含む。試験した成人組織は、腎臓(正常及び末期)、膀胱、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、結腸、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性不全)、心臓、腎臓の明細胞癌、胃腸腺癌、結腸直腸癌を含む。試験した非ヒト霊長類組織は以下を含む:チンパンジー組織:唾液腺、胃、甲状腺、腹甲状腺、舌、胸腺、卵巣、リンパ節、末梢神経。アカゲザル組織:大脳皮質、海馬、小脳、陰茎。
(3)DNA40021−1154(PRO285)
低レベル発現が、骨盤及びマウス胎児肝臓の造血細胞で観察された。ヒト胎児、成人又はチンパンジーリンパ節のいずれにも発現は検出されず、ヒト胎児又はヒト成人脾臓で発現は検出されなかった。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、脳梗塞(ヒト)、大脳(ヒト)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、結腸、結腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトミノフェンは肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
【0597】
(4)DNA39523−1192(PRO273)
マウス胚皮膚の内皮全体並びにヒト胎児皮膚の基底内皮及び上皮全体の発現。チンパンジー舌の鱗状粘膜の基底内皮ペッグ(pegs)もポジティブであった。胎児腎臓の発育中の糸球体、成人腎臓細管、及び末期腎臓疾患の「甲状腺化」内皮の細胞のサブセット全体の発現、腎細胞癌、おそらく内皮細胞全体の低発現。胎児肺の間質細胞全体の低レベル発現。胃腸腺の先端部分における間質細胞全体の発現。胎児小腸絨毛の固有層、正常結腸粘膜、及び結腸癌における間質細胞全体の高発現。肉腫のヒラン化(hylanized)支質における良性結合組織細胞全体の強い発現。胎盤絨毛及び脾赤髄における支質細胞全体の発現。脳においては、皮質ニューロン全体の発現。発育中の骨を囲む結合組織及び胎児の神経鞘細胞全体。試験した胎児組織(E12−E16)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、前立腺、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトミノフェンは肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
サル大脳皮質の外層(I及びII)における多数の細胞に発現が存在した。より深い皮質層の細胞の小さなサブセットも、このケモカイン相同体のmRNAを発現した。海馬の分子層内の散乱細胞及び歯状回の内部辺縁の境界はケモカイン相同体mRNAを含んでいた。大脳皮質内では発現は検出されなかった。ケモカイン相同体発現は、ケモカイン相同体が正常に発現される領域において細胞死が起こった梗塞脳では観察されなかった。このプローブは、大脳皮質の外層のニューロンのサブセットのマーカーとして提供され、ニューロン移動障害を明らかにできる。異常なニューロン移動は、幾つかの発作性疾患及び精神分裂病の原因となりうる。このmRNAの分布のよりよい理解を促進するために、我々は、このプローブがマウス脳組織と交差ハイブリッド形成するか否かを試験した。
また、生後(P)10日及び成熟マウス脳内にイントリギューイング(intriguing)及び特定のハイブリッド形成を示した。P10マウスの1つの矢状切断において、海馬の分子層及び歯状回の内辺縁に散乱した強いシグナルが観察された。プレ鉤状回における細胞は中程度に標識され;シグナルは強い帯中を、後部板状皮質の外層を通って後頭皮質まで伸び、そこでシグナルはバックグラウンドレベルの低下する。ポジティブニューロンの小セットがP10運動皮質の深い領域で検出された。P10皮質の外層内のニューロンはバックグラウンドを越えるシグナルを示さなかった。中程度のハイブリッド形成シグナルも下丘で検出された。成熟マウス脳におけるケモカイン相同体シグナルは、異なるレベルの3つの冠状断面で評価した。強いシグナルは隔壁及び橋核の散乱ニューロン及び三叉神経の運動根で検出された;中程度のシグナルは海馬の分子層及び後部板状皮質の外層に見られた。
【0598】
(5)DNA39979−1213(PRO296)
胎児及び成人組織での広範な発現。種々の胎児及び成人内皮、骨格及び心筋、発達中の(網膜を含む)及び成人CNS、甲状腺内皮、胎盤絨毛、硬変の肝細胞及びアセトアミノフェン誘発毒素で発現した。発達中の骨格系の軟骨細胞において高度に発現された。全発現パターンは、完全に重複していないが(糸球体で発現せず、CNSでより広く発現する)、VEGFに非類似ではない。従って、新脈管形成における可能な役割が考えられるべきである。試験したヒト胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、大血管、胃、小腸、脾臓、胸腺、前立腺、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、精巣、及び下肢。試験したヒト成人組織:腎臓(正常及び末期)、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、眼(網膜を含む)、膀胱、肝臓(正常、硬変、急性不全)。試験した非ヒト霊長類組織:チンパンジー組織:副腎。アカゲザル組織:大王皮質、海馬、小脳。
(6)DNA52594−1270(PRO868)
胎児脊髄神経節、脊髄、発達中の腸ニューロン、皮質性ニューロンにおけるニューロン細胞全体の発現。成人組織では、顕著な発現が観察された唯一の部位は正常成人前立腺であり;それは前立腺細胞表面レセプター標的抗原を表示しうる。成人組織における発現をさらに特徴付ける研究は適正であったと思われる。脂肪肉腫においても低レベル発現が観察された。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、肝細胞癌、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢。アセトアミノフェンは、肝臓障害及び肝硬変を誘発した。試験したアカゲザル組織:大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳。試験したチンパンジー組織:甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃腸粘膜及び唾液腺。ヒト乳癌及び正常乳房組織におけるWIG−1(WISP−1), WIG−2(WISP−2)及びWIG−5(WISP−3)の発現、肺癌におけるWig−2及び結腸癌におけるWig−5。
【0599】
(7)DNA64907−1163(PRO1330)
ヒト胎児組織において、胎児脳を除く試験した全ての組織で、動脈、静脈、毛細血管及び洞様毛細血管内皮全体に強い特異的発現が存在した。正常成人組織では、発現は低いか無かったが、発現が現れた場合には脈管構造に確認された。成人組織における最も高い発現は、アカゲザル脳の白質内を走る血管の領域であり−このパターンの意義は明確ではない。腫瘍脈管構造を含む多くの炎症性及び障害性組織の脈管構造で向上した発現が観察された。これらの組織の幾つかでは、発現が血管内皮のみに確認されるか否かは不明であった。試験した15の肺腫瘍では、悪性内皮全体に発現は見られなかったが、血管発現は腫瘍及び隣接肺組織の多くで観察された。中程度の明らかに非特異的なバックグラウンドは、このプローブで、ヒアリン化コラーゲン及び組織壊死の部位で見られた。しかし、センスコントロール無しでは、これら全てのシグナルが非特異的であることを完全に確かめるのは不可能である。また、非特異的と考えられる幾つかのシグナルは、チンパンジー胃粘膜全体、ヒト成人膀胱の移行細胞内皮及び胎児網膜で見られた。
(8)DNA49624−1279(PRO545)
ADAMファミリー分子であるADAM 12(DNA49624−1279)の発現は、正常ヒト胚、肺腫瘍、正常結腸及び結腸癌で観察された。
(9)DNA59294−1381(PRO1031)
このIL17相同体の発現は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。このパネルは、Tリンパ球作用を媒介(刺激性又は阻害性)する新規なタンパク質の免疫媒介疾患における発現パターンを特異的に評価するために設計した。このタンパク質は、Ig−融合タンパク質として発現された場合は、ヒト混合リンパ球反応(MLR)において用量依存的に免疫刺激性であり;2つの異なる濃度(1.0%及び0.1%の560 nMストック)で用いられたとき、ベースライン刺激指数より285%及び147%という増加を生じる。要旨:発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及びヒト胎児の平滑筋に制限された。ヒト成人における発現は、結腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。ヒト成人骨格筋は評価しなかった。胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散発現があった。腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。発現したヒト成人組織:結腸、慢性炎症性腸疾患を持つ5検体において平滑筋(筋層)で低レベルの拡散発現があった。胆嚢:胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。発現したヒト胎児組織:骨格筋において中程度の拡散発現及び平滑筋において弱から低レベル発現があった;胎児心臓又は肝臓、脾臓、CNS、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現は無かった。発現の無いヒト組織:慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎(5患者)の肺、末梢神経、心臓、胎盤、肝臓(疾患多重ブロック)、脳(大脳及び小脳)、扁桃(反応性過形成)、末梢リンパ節、胸腺。
【0600】
(10)DNA45416−1251(PRO362)
この新規なタンパク質の発現は、種々のヒト及び非ヒト霊長類組織で評価し、高度に制限されていることが見出された。発現は、肺の肺胞マクロファージ及び肝臓洞様毛細血管のクップファー細胞にのみ存在した。これらの細胞での発現は、これら識別可能な細胞集団が活性化されたときに有意に増加した。組織マクロファージのこれら2つの亜集団は異なる器官に局在化し、それらは類似の生物学的機能を有する。これら両方の型の食細胞は、病原、老化細胞及びタンパク質を含む血流又は気道からの物質を除去するフィルターとして作用し、ともに広範な重要なプロ炎症サイトカインを分泌することができる。炎症性肺(7患者サンプル)では、発現は反応性肺胞マクロファージ細胞集団において顕著であり、肺胞内に1個又は凝集体で存在する大きくて青白く、しばしば空胞を持つ細胞によって定まり、正常で非反応性マクロファージ(正常サイズの単一の散乱細胞)においては弱からネガティブであった。肺胞マクロファージでの発現は、これらの細胞が数及びサイズともに増大(活性化)したとき、炎症の間に増加した。これらの組織の間質炎症及び気管支周辺リンパ細胞過形成の領域に組織球が存在するにも関わらず、発現は肺胞マクロファージに制限されていた。多くの炎症性肺も幾分の炎症抑制を有し;発現は神経向性の顆粒球に存在しなかった。肝臓においては、急性中心小葉性壊死(アセトアミノフェン毒性)又はかなり顕著な門脈周囲の炎症を持つ肝臓において反応性/活性化クップファー細胞に強い発現があった。しかしながら、正常肝臓又は穏和から中程度の小葉過形成/肥大のみを持つ肝臓におけるクップファー細胞では発現が無かった。即ち、肺と同様に、活性化/反応性細胞において発現の増加があった。炎症性腸疾患、過形成/反応性扁桃又は正常リンパ節に存在する組織球/マクロファージにおいて、この分子の発現は無かった。全てが組織球炎症又は常在性マクロファージ集団を含むこれらの組織で発現が無いことは、肺胞マクロファージ及び肝臓クップファー細胞として定義される独特のマクロファージサブセット集団に制限された発現を強く支持する。脾臓又は骨髄は、評価できなかった。検出可能な発現を示さなかった評価したヒト組織は以下を含む:炎症性腸疾患(中程度から重症の7患者サンプル)、反応性過形成を持つ扁桃、末梢リンパ節、乾癬皮膚(穏和から中程度の疾患を持つ2患者サンプル)、心臓、末梢神経。検出可能な発現を示さなかった評価したチンパンジー組織は以下を含む:舌、胃、胸腺。
(11)DNA52196−1348(PRO733)
多数の組織及び多数の細胞型における一般化された低レベルのシグナル。内皮細胞発現が観察されたが、それは、胎児、正常又は疾患組織において主要な特徴ではなかった。ヒト組織:胎児肝臓(主に肝細胞)全体、肺、皮膚、副腎及び心臓における中程度の発現。胎児脾臓、小腸、脳及び眼はネガティブ。成人正常腎臓、膀胱内皮、肺、副腎、膵臓、皮膚−全てネガティブ。ヒト成人肝臓(正常及び疾患)、末期腎臓疾患の腎臓細管、脂肪組織、肉腫、結腸、腎細胞癌、肝細胞癌、鱗状細胞癌。非ヒト霊長類組織:チンパンジー唾液腺、脈管、胃、舌、末梢神経、胸腺、リンパ節、甲状腺及び腹甲状腺。アカゲザル脊髄はネガティブ、皮質及び海馬ニューロンはポジティブ。
【0601】
実施例143:ヒトPRO4993をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に関連したコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列は、ここにおいてDNA85042と命名された。ある場合、DNA85042コンセンサス配列は、BLASTの繰り返しサイクル及びphrapを上記で論じられたEST配列の起源を使用し可能な限りそのDNAの中間体コンセンサス配列を延長するために使用して延長された中間体コンセンサスDNA配列より派生する。DNA85042に基づいて、オリゴヌクレオチドが:1)PCRによって対象となる配列を含んでいたcDNAライブラリーを同定する、そして2)PRO4993のための全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために合成された。
PCRプライマー(正及び逆)が合成された:
正方向のPCRプライマー 5’−AGATGTGAAGGTGCAGGTGTGCCG−3’
(配列番号:619)
逆方向のPCRプライマー 5’−GAACATCAGCGCTCCCGGTAATTCC−3’
(配列番号:620)
さらには、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスDNA85042配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ
5’−CCAGCCTTTGAATGGTACAAAGGAGAGAGAAGAAGCTCTTCAATGGCC−3’
(配列番号:621)
cDNAライブラリーの構築のためのRNAがヒト胎児脳組織から単離された。
上記に記載したような単離されたクローンのDNAシーケンシングは、全長PRO4993ポリペプチド(ここにおいてはDNA94832−2659[Figure 229、配列番号611]と命名)のための全長DNA配列及び派生したPRO4993ポリペプチドのためのタンパク質配列を与える。
上記の同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置305−307の明白な翻訳開始点及びヌクレオチド位置1361−1363の終止シグナル(Figure 229,配列番号611)を含んだ。予想されたポリペプチド前駆体は352アミノ酸長で、およそ38,429ダルトンの計算された分子量及びおよそ6.84の見積もりpIを有する。Figure230(配列番号:612)に示されている全長PRO4993の分析は、重要なポリペプチドドメインへ与えられた位置が上記に記載されているようにおおよそであるFigure230に示されている種々の重要なポリペプチドドメインの存在を明示する。DNA94832−2659クローンは1999年6月15日にATCCへ寄託され、ATCC寄託番号no.240−PTAが与えられた。
Figure230(配列番号:612)に示された全長配列のALIGN−2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析は、PRO49993アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:P_W05152;LAMP_HUMAN;P_W05157;P_W05155;I56551;OPCM_RAT;AMAL_DROME;DMU78177_1;I37246;及びNCA_1HUMANとの間の配列の相同性を明示した。
【0602】
実施例144:ヒトPRO1559、PRO725及びPRO739をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、他のEST配列に関連したコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列とIncyteESTクローンNo.4242090に含まれるEST配列との間に観察された相同性に基づいて、IncyteESTクローンNo.4242090を取得し、その挿入断片を得て配列を決定した。挿入断片配列が、ここにおいてPRO1559(Figure232;配列番号:614)と命名された全長タンパク質をコードすることが発見された。挿入断片(DNA68886)のDNA配列は、Figure231(配列番号:613)に示されている。
上記の実施例2に記載のアミラーゼスクリーンで単離されたcDNA配列は、ここにおいてDNA43301と命名された。そして、DNA43301は、公共のESTデーターベース(例えばGenBank)及び自社のEST DNAデーターベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA)を含んだ現存の相同性を同定するための種々の発現配列tag(EST)データーベースと比較された。相同性の検索は、コンピュータープログラムBLAST又はBLAST2(Altshul等.,Methods in Enzymology 266:460−480(1996))を使用しておこなわれた。既知のタンパク質をコードしない70(又はある場合は90)又はそれ以上のBLASTスコアとなったこれらの比較は、プログラム「pharp」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)によってコンセンサスDNA配列へと集められ組み立てられた。それから得られたコンセンサス配列は、ここにおいてDNA45458と命名された。DNA45458コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブが作られ、上記の実施例2のパラグラフ1に示されているように調製されたヒト胎児脳(LIB153)ライブラリーの選別に使用された。クローニングベクターはpRK5B(pRK5Dは、pRK5Dの前駆体でSfiI部位を含まない;Holmes等.,Science,253:1278−1280(1991)を参照のこと)で、切り出されたcDNAのサイズは2800bpより小さい。
PCRプライマー(正及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(45458.fl)5’−CCAAACTCACCCAGTGAGTGTGAGC−3’
(配列番号:619)
逆方向PCRプライマー(45458.rl)5’−TGGGAAATCAGGAATGGTGTTCTCC−3’
(配列番号:620)
さらには、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスDNA45458配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ(45458.p1)
5’−CTTGTTTTCACCATTGGGCTAACTTTGCTGCTAGGAGTTCAAGCCATGCC−3’
(配列番号:621)
【0603】
全長クローンの起源の為の幾つかのライブラリーを選別するために、ライブラリーからのDNAを上記で同定したPCRプライマー対によるPCR増幅によって選別した。そして、陽性のライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマーの一つをを使用するPRO725をコードするクローンの単離に使用した。
全長クローンは、明白な翻訳開始位置をヌクレオチド161−163に持ち、ヌクレオチド位置455−457に見出される終止コドンで終了する単一のオープンリーデングフレームを含むと同定された(Figure233;配列番号:615)。予想されるポリペプチド前駆体は98アミノ酸長で、おおよそ11,081ダルトンの計算された分子量とおおよそ6.68の見積もりpIを有する。Figure234(配列番号:616)に示された全長PRO725配列の解析は、以下のことを明示した:約アミノ酸1から約アミノ酸20の単一ペプチド、約アミノ酸72から約アミノ酸75の潜在的N−グリコシル化部位、及び約アミノ酸63から約アミノ酸70のチロシンキナーゼリン酸化部位。クローンDNA52758−1399は、1998年4月14日にATCCへ寄託され、ATCC寄託番号no.209773を与えられた。
全長PRO725のアミノ酸配列の解析は、PRO725があらゆる既知のタンパク質に対して有意な配列相同性を有しないことを示唆する。しかし、Dayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)は、PRO725アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:POL_
BLVAU、PSSP_RAT、CELC36C5_7、AF019234_1、I48862、P_R12498、P_P10125、P_R26861、A64527及びP_W20495との間のある程度の相同性を明示した。
Figure235(配列番号:617)に示され、そして天然PRO739ポリペプチ(Figure236;配列番号618)をコードするDNA52756がGenBankから得られた。
【0604】
実施例145:受容体/リガンド相互作用の同定
このアッセイでは、受容体/リガンド相互作用の同定を目的として、種々のPROポリペプチドは潜在的受容体分子のパネルとの結合する能力が試験される。既知の受容体へのリガンド、既知のリガンドへの受容体又は新規の受容体/リガンド対の同定は、例えば受容体又はリガンドを発現することが知られている細胞をの生物活性分子(リガンド又は受容体へ連結している)の標的にすること、組成物がリガンド又は受容体を発現することが推定される細胞を含む場合にリガンド又は受容体をを含むと推測される組成物の中にリガンド又は受容体の存在を検出する為に受容体又はリガンドを試薬として使用すること、受容体又はリガンドを発現或いはこれらへ反応することが知られた細胞の生育又はその他の生物学的或いは免疫学的活性を調節すること、受容体又はリガンドを発現する細胞の免疫応答或いはこれら細胞への免疫応答を調節すること、受容体又はリガンドを発現する細胞の生育又は生物学的或いは免疫学的活性を調節する受容体又はリガンドに対して向けられたアゴニスト、アンタゴニスト及び/又は抗体の調製を可能すること、及び普通の熟練した技術者には容易に理解できる多様な他の指示を含む種々の指示にとって有用である。
このアッセイは、以下のようにしておこなわれた。受容体のリガンドと推測される本発明のPROポリペプチドを、ヒトIgG(イムノアドヘシン(immunoadhesin))のFcドメインを含む融合タンパク質として発現する。受容体−リガンド結合は、イムノアドヘシンポリペプチドと候補PROポリペプチド受容体を発現する細胞(例えばCos細胞)との相互作用及び結合イムノアドヘシンをFc融合ドメインを対象とする蛍光試薬による視覚化、そして顕微鏡での検定を可能にすることによって検出される。候補受容体を発現している細胞は、同時に、受容体分子として機能するPROポリペプチドをコードするcDNA発現ベクターのライブラリーの明確な一組の過度的な形質導入によって生成される。次に、細胞を、受容体結合の可能性について試験されたPROポリペプチドイムノアドヘシンの存在下で1時間インキュベートする。そして、細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定する。次に、細胞をPROポリペプチドイムノアドヘシンのFc部分を対象とした蛍光共役抗体とともにインキュベートする(例えばFITC共役ヤギ抗−ヒト−Fc抗体)。そして、再び細胞を洗浄し、顕微鏡によって検査する。陽性の相互作用は、特定のPROポリペプチド受容体又は受容体プールをコードしているcDNAによって形質移入された細胞の蛍光ラベリングの存在、及び他のcDNA又はcDNAのプールによって形質移入されている同じように調製された細胞の同じような蛍光ラベリングの不在によって判断される。限定されたcDNA発現ベクターのプールがPROポリペプチドイムノアドヘシンとの相互作用の為に陽性と判断された場合、プールを構成する個々のcDNA種は、PROポリペプチドイムノアドヘシンと相互作用することができる受容体をコードする特定のcDNAを決定するために個々(プールは「壊れている」)に試験される。
【0605】
このアッセイのその他の実施態様では、エピトープ−タッグ潜在性リガンドPROポリペプチド(例えば8ヒスチジン「His」タッグ)は、ヒトIgG(イムノアドヘシン)のFcドメインとの融合物として発現される潜在性レセプターPROポリペプチドのパネルと相互作用することが可能とされる。エピトープタッグPROポリペプチドとの1時間の共同インキュベーションの後、候補受容体は、各々プロテインAビーズによって免疫沈降されてビーズは洗浄される。潜在的リガンド相互作用は、免疫沈降複合物とエピトープタッグを対象とした抗体のウエスタンブッロト解析によって決定される。相互作用は、エピトープタッグタンパク質の期待される分子量のバンドが候補受容体とともにウエスタンブロット解析において観察されるが、潜在的受容体のパネルの他のメンバーとともに生じることが観察されない場合、相互作用は生じると判断される。
これらのアッセイを使用して、ここにおいて以下の受容体/リガンド相互作用が同定された:PRO337がPRO4993に結合、PRO1559がPRO725に結合、PRO1559がPRO700に結合、及びPRO1559がPRO739に結合。
【0606】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,12301 パークラウンドライブ、ロックビル、MD、USA(ATCC)に寄託した:
【0607】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886O G638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図の簡単な説明】
【Fig1】配列番号:1が、ここにおいて「UNQ187」及び/又は「DNA30943−1163」と命名されたクローンである、天然配列PRO213cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:1)を示す。
【Fig2】Fig1に示されている配列番号:1のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。
【Fig3】配列番号:6が、ここにおいて「UNQ241」及び/又は「DNA39987−1184」と命名されたクローンである、天然配列PRO274cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:6)を示す。
【Fig4】Fig3に示されている配列番号:6のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:7)を示す。
【Fig5】DNA17873(配列番号:8)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig6】DNA36157(配列番号:9)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig7】DNA28929(配列番号:10)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig8】配列番号:18が、ここにおいて「UNQ263」及び/又は「DNA46025−1189」と命名されたクローンである、天然配列PRO300cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:18)を示す。
【Fig9】Fig8に示されている配列番号:18のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:19)を示す。
【Fig10】配列番号:27が、ここにおいて「UNQ247」及び/又は「DNA23318−1211」と命名されたクローンである、天然配列PRO284cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:27)を示す。
【Fig11】Fig10に示されている配列番号:27のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:28)を示す。
【Fig12】DNA12982(配列番号:29)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig13】DNA15886(配列番号:30)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig14】配列番号:35が、ここにおいて「UNQ260」及び/又は「DNA39979−1213」と命名されたクローンである、天然配列PRO296cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:35)を示す。
【Fig15】Fig14に示されている配列番号:35のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:36)を示す。
【Fig16】DNA23020(配列番号:37)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig17】DNA21971(配列番号:38)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig18】DNA29037(配列番号:39)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig19】配列番号:44が、ここにおいて「UNQ291」及び/又は「DNA40594−1233」と命名されたクローンである、天然配列PRO329cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:44)を示す。
【Fig20】Fig19に示されている配列番号:44のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:45)を示す。
【Fig21】配列番号:51が、ここにおいて「UNQ317」及び/又は「DNA45416−1251」と命名されたクローンである、天然配列PRO362cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:51)を示す。
【Fig22】Fig21に示されている配列番号:51のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:52)を示す。
【Fig23】配列番号:58が、ここにおいて「UNQ318」及び/又は「DNA45419−1252」と命名されたクローンである、天然配列PRO363cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:58)を示す。
【Fig24】Fig23に示されている配列番号:58のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:59)を示す。
【Fig25】配列番号:63が、ここにおいて「UNQ437」及び/又は「DNA52594−1270」と命名されたクローンである、天然配列PRO868cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:63)を示す。
【Fig26】Fig25に示されている配列番号:63のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:64)を示す。
【Fig27】配列番号:68が、ここにおいて「UNQ323」及び/又は「DNA45234−1277」と命名されたクローンである、天然配列PRO382cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:68)を示す。
【Fig28】Fig27に示されている配列番号:68のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:69)を示す。
【Fig29】、配列番号:73が、ここにおいて「UNQ346」及び/又は「DNA49624−1279」と命名されたクローンである、天然配列PRO545cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:73)を示す。
【Fig30】Fig29に示されている配列番号:73のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:74)を示す。
【Fig31】DNA13217(配列番号:75)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig32】配列番号:84が、ここにおいて「UNQ353」及び/又は「DNA48309−1280」と命名されたクローンである、天然配列PRO617cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:84)を示す。
【Fig33】Fig32に示されている配列番号:84のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:85)を示す。
【Fig34】、配列番号:89が、ここにおいて「UNQ364」及び/又は「DNA46776−1284」と命名されたクローンである、天然配列PRO700cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:89)を示す。
【Fig35】Fig34に示されている配列番号:89のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:90)を示す。
【Fig36】配列番号:96が、ここにおいて「UNQ366」及び/又は「DNA50980−1286」と命名されたクローンである、天然配列PRO702cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:96)を示す。
【Fig37】Fig36に示されている配列番号:96のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:97)を示す。
【Fig38】配列番号:101が、ここにおいて「UNQ367」及び/又は「DNA50913−1287」と命名されたクローンである、天然配列PRO703cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:101)を示す。
【Fig39】Fig38に示されている配列番号:101のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:102)を示す。
【Fig40】配列番号:108が、ここにおいて「UNQ369」及び/又は「DNA50914−1289」と命名されたクローンである、天然配列PRO705cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:108)を示す。
【Fig41】Fig40に示されている配列番号:108のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:109)を示す。
【Fig42A−B】配列番号:113が、ここにおいて「UNQ372」及び/又は「DNA48296−1292」と命名されたクローンである、天然配列PRO708cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:113)を示す。
【Fig43】Fig42A−Bに示されている配列番号:113のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:114)を示す。
【Fig44】、配列番号:118が、ここにおいて「UNQ281」及び/又は「DNA32284−1307」と命名されたクローンである、天然配列PRO320cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:118)を示す。
【Fig45】Fig44に示されている配列番号:118のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:119)を示す。
【Fig46】配列番号:123が、ここにおいて「UNQ285」及び/又は「DNA36343−1310」と命名されたクローンである、天然配列PRO324cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:123)を示す。
【Fig47】Fig46に示されている配列番号:123のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:124)を示す。
【Fig48】配列番号:131が、ここにおいて「UNQ308」及び/又は「DNA40571−1315」と命名されたクローンである、天然配列PRO351cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:131)を示す。
【Fig49】Fig48に示されている配列番号:131のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:132)を示す。
【Fig50】配列番号:136が、ここにおいて「UNQ309」及び/又は「DNA41386−1316」と命名されたクローンである、天然配列PRO352cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:136)を示す。
【Fig51】Fig50に示されている配列番号:136のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:137)を示す。
【Fig52】配列番号:144が、ここにおいて「UNQ322」及び/又は「DNA44194−1317」と命名されたクローンである、天然配列PRO381cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:144)を示す。
【Fig53】Fig52に示されている配列番号:144のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:145)を示す。
【Fig54】配列番号:149が、ここにおいて「UNQ326」及び/又は「DNA45415−1318」と命名されたクローンである、天然配列PRO386cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:149)を示す。
【Fig55】Fig54に示されている配列番号:149のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:150)を示す。
【Fig56】DNA23350(配列番号:151)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig57】DNA23536(配列番号:152)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig58】配列番号:156が、ここにおいて「UNQ341」及び/又は「DNA44189−1322」と命名されたクローンである、天然配列PRO540cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:156)を示す。
【Fig59】Fig58に示されている配列番号:156のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:157)を示す。
【Fig60】配列番号:161が、ここにおいて「UNQ352」及び/又は「DNA48304−1323」と命名されたクローンである、天然配列PRO615cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:161)を示す。
【Fig61】Fig60に示されている配列番号:161のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:162)を示す。
【Fig62】配列番号:168が、ここにおいて「UNQ354」及び/又は「DNA49152−1324」と命名されたクローンである、天然配列PRO618cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:168)を示す。
【Fig63】Fig62に示されている配列番号:168のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:169)を示す。
【Fig64】DNA35597(配列番号:170)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig65】配列番号:177が、ここにおいて「UNQ387」及び/又は「DNA49646−1327」と命名されたクローンである、天然配列PRO719cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:177)を示す。
【Fig66】Fig65に示されている配列番号:177のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:178)を示す。
【Fig67】配列番号:182が、ここにおいて「UNQ389」及び/又は「DNA49631−1328」と命名されたクローンである、天然配列PRO724cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:182)を示す。
【Fig68】Fig67に示されている配列番号:182のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:183)を示す。
【Fig69】配列番号:189が、ここにおいて「UNQ410」及び/又は「DNA49645−1347」と命名されたクローンである、天然配列PRO772cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:189)を示す。
【Fig70】Fig69に示されている配列番号:189のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:190)を示す。
【Fig71】DNA43509(配列番号:191)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig72】配列番号:195が、ここにおいて「UNQ418」及び/又は「DNA45493−1349」と命名されたクローンである、天然配列PRO852cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:195)を示す。
【Fig73】Fig72に示されている配列番号:195のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:196)を示す。
【Fig74】配列番号:205が、ここにおいて「UNQ419」及び/又は「DNA48227−1350」と命名されたクローンである、天然配列PRO853cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:205)を示す。
【Fig75】Fig74に示されている配列番号:205のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:206)を示す。
【Fig76】配列番号:210が、ここにおいて「UNQ421」及び/又は「DNA41404−1352」と命名されたクローンである、天然配列PRO860cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:210)を示す。
【Fig77】Fig76に示されている配列番号:210のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:211)を示す。
【Fig78】配列番号:215が、ここにおいて「UNQ422」及び/又は「DNA44196−1353」と命名されたクローンである、天然配列PRO846cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:215)を示す。
【Fig79】Fig78に示されている配列番号:215のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:216)を示す。
【Fig80】配列番号:220が、ここにおいて「UNQ424」及び/又は「DNA52187−1354」と命名されたクローンである、天然配列PRO862cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:220)を示す。
【Fig81】Fig80に示されている配列番号:220のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:221)を示す。
【Fig82】配列番号:225が、ここにおいて「UNQ426」及び/又は「DNA48328−1355」と命名されたクローンである、天然配列PRO864cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:225)を示す。
【Fig83】Fig82に示されている配列番号:225のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:226)を示す。
【Fig84】配列番号:230が、ここにおいて「UNQ431」及び/又は「DNA56352−1358」と命名されたクローンである、天然配列PRO792cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:230)を示す。
【Fig85】Fig84に示されている配列番号:230のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:231)を示す。
【Fig86】配列番号:235が、ここにおいて「UNQ435」及び/又は「DNA53971−1359」と命名されたクローンである、天然配列PRO866cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:235)を示す。
【Fig87】Fig86に示されている配列番号:235のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:236)を示す。
【Fig88】配列番号:244が、ここにおいて「UNQ438」及び/又は「DNA50919−1361」と命名されたクローンである、天然配列PRO871cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:244)を示す。
【Fig89】Fig88に示されている配列番号:244のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:245)を示す。
【Fig90】配列番号:253が、ここにおいて「UNQ440」及び/又は「DNA44179−1362」と命名されたクローンである、天然配列PRO873cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:253)を示す。
【Fig91】Fig90に示されている配列番号:253のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:254)を示す。
【Fig92】配列番号:258が、ここにおいて「UNQ477」及び/又は「DNA54002−1367」と命名されたクローンである、天然配列PRO940cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:258)を示す。
【Fig93】Fig92に示されている配列番号:258のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:259)を示す。
【Fig94】配列番号:263が、ここにおいて「UNQ478」及び/又は「DNA53906−1368」と命名されたクローンである、天然配列PRO941cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:263)を示す。
【Fig95】Fig94に示されている配列番号:263のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:264)を示す。
【Fig96】DNA6415(配列番号:265)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig97】配列番号:269が、ここにおいて「UNQ481」及び/又は「DNA52185−1370」と命名されたクローンである、天然配列PRO944cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:269)を示す。
【Fig98】Fig97に示されている配列番号:269のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:270)を示す。
【Fig99】DNA14007(配列番号:271)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig100】DNA12773(配列番号:272)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig101】DNA12746(配列番号:273)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig102】DNA12834(配列番号:274)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig103】DNA12846(配列番号:275)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig104】DNA13104(配列番号:276)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig105】DNA13259(配列番号:277)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig106】DNA13959(配列番号:278)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig107】DNA13961(配列番号:279)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig108】配列番号:283が、ここにおいて「UNQ484」及び/又は「DNA53977−1371」と命名されたクローンである、天然配列PRO983cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:283)を示す。
【Fig109】Fig108に示されている配列番号:283のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:284)を示す。
【Fig110】DNA17130(配列番号:285)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig111】DNA23466(配列番号:286)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig112】DNA26818(配列番号:287)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig113】DNA37618(配列番号:288)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig114】DNA41732(配列番号:289)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig115】DNA45980(配列番号:290)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig116】DNA46372(配列番号:291)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig117】配列番号:295が、ここにおいて「UNQ522」及び/又は「DNA57253−1382」と命名されたクローンである、天然配列PRO1057cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:295)を示す。
【Fig118】Fig117に示されている配列番号:295のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:296)を示す。
【Fig119】ここにおいて、配列番号:300が「UNQ528」及び/又は「DNA58847−1383」と命名されたクローンである、天然配列PRO1071cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:300)を示す。
【Fig120】Fig119に示されている配列番号:300のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:301)を示す。
【Fig121】配列番号:302が、ここにおいて「UNQ529」及び/又は「DNA58747−1384」と命名されたクローンである、天然配列PRO1072cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:302)を示す。
【Fig122】Fig121に示されている配列番号:302のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:303)を示す。
【Fig123】DNA40210(配列番号:304)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig124】配列番号:308が、ここにおいて「UNQ532」及び/又は「DNA57689−1385」と命名されたクローンである、天然配列PRO1075cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:308)を示す。
【Fig125】Fig124に示されている配列番号:308のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:309)を示す。
【Fig126】DNA13059(配列番号:310)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig127】DNA19463(配列番号:311)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig128】配列番号:321が、ここにおいて「UNQ155」及び/又は「DNA23330−1390」と命名されたクローンである、天然配列PRO181cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:321)を示す。
【Fig129】Fig128に示されている配列番号:321のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:322)を示す。
【Fig130】DNA13242(配列番号:323)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig131】配列番号:329が、ここにおいて「UNQ169」及び/又は「DNA26847−1395」と命名されたクローンである、天然配列PRO195cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:329)を示す。
【Fig132】Fig131に示されている配列番号:329のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:330)を示す。
【Fig133】DNA15062(配列番号:331)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig134】DNA13199(配列番号:332)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig135】配列番号:336が、ここにおいて「UNQ434」及び/又は「DNA53974−1401」と命名されたクローンである、天然配列PRO865cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:336)を示す。
【Fig136】Fig135に示されている配列番号:336のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:337)を示す。
【Fig137】DNA37642(配列番号:338)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig138】配列番号:345が、ここにおいて「UNQ468」及び/又は「DNA57039−1402」と命名されたクローンである、天然配列PRO827cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:345)を示す。
【Fig139】Fig138に示されている配列番号:345のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:346)を示す。
【Fig140】DNA47751(配列番号:347)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig141】配列番号:351が、ここにおいて「UNQ557」及び/又は「DNA57033−1403」と命名されたクローンである、天然配列PRO1114cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:351)を示す。
【Fig142】Fig141に示されている配列番号:351のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:352)を示す。
【Fig143】DNA48466(配列番号:353)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig144】配列番号:357が、ここにおいて「UNQ211」及び/又は「DNA34353−1428」と命名されたクローンである、天然配列PRO237cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:357)を示す。
【Fig145】Fig144に示されている配列番号:357のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:358)を示す。
【Fig146】配列番号:362が、ここにおいて「UNQ342」及び/又は「DNA45417−1432」と命名されたクローンである、天然配列PRO357cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:362)を示す。
【Fig147】Fig146に示されている配列番号:362のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:363)を示す。
【Fig148】配列番号:369が、ここにおいて「UNQ240」及び/又は「DNA39523−1192」と命名されたクローンである、天然配列PRO273cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:369)を示す。
【Fig149】Fig148に示されている配列番号:369のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:370)を示す。
【Fig150】配列番号:374が、ここにおいて「UNQ365」及び/又は「DNA44205−1285」と命名されたクローンである、天然配列PRO701cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:374)を示す。
【Fig151】Fig150に示されている配列番号:374のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:375)を示す。
【Fig152】配列番号:379が、ここにおいて「UNQ368」及び/又は「DNA50911−1288」と命名されたクローンである、天然配列PRO704cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:379)を示す。
【Fig153】Fig152に示されている配列番号:379のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:380)を示す。
【Fig154】配列番号:384が、ここにおいて「UNQ370」及び/又は「DNA48329−1290」と命名されたクローンである、天然配列PRO706cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:384)を示す。
【Fig155】Fig154に示されている配列番号:384のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:385)を示す。
【Fig156】配列番号:389が、ここにおいて「UNQ371」及び/又は「DNA48306−1291」と命名されたクローンである、天然配列PRO707cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:389)を示す。
【Fig157】Fig156に示されている配列番号:389のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:390)を示す。
【Fig158】配列番号:394が、ここにおいて「UNQ283」及び/又は「DNA48336−1309」と命名されたクローンである、天然配列PRO322cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:394)を示す。
【Fig159】Fig158に示されている配列番号:394のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:395)を示す。
【Fig160】配列番号:399が、ここにおいて「UNQ330」及び/又は「DNA44184−1319」と命名されたクローンである、天然配列PRO526cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:399)を示す。
【Fig161】Fig160に示されている配列番号:399のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:400)を示す。
【Fig162】配列番号:404が、ここにおいて「UNQ332」及び/又は「DNA48314−1320」と命名されたクローンである、天然配列PRO531cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:404)を示す。
【Fig163】Fig162に示されている配列番号:404のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:405)を示す。
【Fig164】配列番号:409が、ここにおいて「UNQ335」及び/又は「DNA48333−1321」と命名されたクローンである、天然配列PRO534cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:409)を示す。
【Fig165】Fig164に示されている配列番号:409のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:410)を示す。
【Fig166】配列番号:414が、ここにおいて「UNQ361」及び/又は「DNA50920−1325」と命名されたクローンである、天然配列PRO697cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:414)を示す。
【Fig167】Fig166に示されている配列番号:414のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:415)を示す。
【Fig168】配列番号:419が、ここにおいて「UNQ385」及び/又は「DNA50988−1326」と命名されたクローンである、天然配列PRO717cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:419)を示す。
【Fig169】Fig168に示されている配列番号:419のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:420)を示す。
【Fig170】配列番号:424が、ここにおいて「UNQ395」及び/又は「DNA48331−1329」と命名されたクローンである、天然配列PRO731cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:424)を示す。
【Fig171】Fig170に示されている配列番号:424のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:425)を示す。
【Fig172】配列番号:429が、ここにおいて「UNQ192」及び/又は「DNA30867−1335」と命名されたクローンである、天然配列PRO218cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:429)を示す。
【Fig173】Fig172に示されている配列番号:429のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:430)を示す。
【Fig174】DNA14472(配列番号:431)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig175】DNA15846(配列番号:432)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig176】配列番号:436が、ここにおいて「UNQ406」及び/又は「DNA55737−1345」と命名されたクローンである、天然配列PRO768cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:436)を示す。
【Fig177】Fig176に示されている配列番号:436のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:437)を示す。
【Fig178】配列番号:441が、ここにおいて「UNQ409」及び/又は「DNA49829−1346」と命名されたクローンである、天然配列PRO771cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:441)を示す。
【Fig179】Fig178に示されている配列番号:441のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:442)を示す。
【Fig180】配列番号:446が、ここにおいて「UNQ411」及び/又は「DNA52196−1348」と命名されたクローンである、天然配列PRO733cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:446)を示す。
【Fig181】Fig180に示されている配列番号:446のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:447)を示す。
【Fig182】配列番号:451が、ここにおいて「UNQ429」及び/又は「DNA56965−1356」と命名されたクローンである、天然配列PRO162cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:451)を示す。
【Fig183】Fig182に示されている配列番号:451のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:452)を示す。
【Fig184】配列番号:453が、ここにおいて「UNQ430」及び/又は「DNA56405−1357」と命名されたクローンである、天然配列PRO788cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:453)を示す。
【Fig185】Fig184に示されている配列番号:453のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:454)を示す。
【Fig186】配列番号:455が、ここにおいて「UNQ492」及び/又は「DNA57530−1375」と命名されたクローンである、天然配列PRO1008cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:455)を示す。
【Fig187】Fig186に示されている配列番号:455のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:456)を示す。
【Fig188】DNA16508(配列番号:457)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig189】配列番号:458が、ここにおいて「UNQ495」及び/又は「DNA56439−1376」と命名されたクローンである、天然配列PRO1012cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:458)を示す。
【Fig190】Fig189に示されている配列番号:458のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:459)を示す。
【Fig191】配列番号:463が、ここにおいて「UNQ497」及び/又は「DNA56409−1377」と命名されたクローンである、天然配列PRO1014cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:463)を示す。
【Fig192】Fig191に示されている配列番号:463のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:464)を示す。
【Fig193】配列番号:465が、ここにおいて「UNQ500」及び/又は「DNA56112−1379」と命名されたクローンである、天然配列PRO1017cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:465)を示す。
【Fig194】Fig193に示されている配列番号:465のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:466)を示す。
【Fig195】配列番号:467が、ここにおいて「UNQ502」及び/又は「DNA56045−1380」と命名されたクローンである、天然配列PRO474cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:467)を示す。
【Fig196】Fig195に示されている配列番号:467のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:468)を示す。
【Fig197】配列番号:469が、ここにおいて「UNQ516」及び/又は「DNA59294−1381」と命名されたクローンである、天然配列PRO1031cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:469)を示す。
【Fig198】Fig197に示されている配列番号:469のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:470)を示す。
【Fig199】配列番号:471が、ここにおいて「UNQ475」及び/又は「DNA56433−1406」と命名されたクローンである、天然配列PRO938cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:471)を示す。
【Fig200】Fig199に示されている配列番号:471のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:472)を示す。
【Fig201】配列番号:476が、ここにおいて「UNQ539」及び/又は「DNA53912−1457」と命名されたクローンである、天然配列PRO1082cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:476)を示す。
【Fig202】Fig201に示されている配列番号:476のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:477)を示す。
【Fig203】配列番号:482が、ここにおいて「UNQ540」及び/又は「DNA50921−1458」と命名されたクローンである、天然配列PRO1083cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:482)を示す。
【Fig204】Fig203に示されている配列番号:482のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:483)を示す。
【Fig205】DNA24256(配列番号:484)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig206】配列番号:487が、ここにおいて「UNQ174」及び/又は「DNA29101−1122」と命名されたクローンである、天然配列PRO200cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:487)を示す。
【Fig207】Fig206に示されている配列番号:487のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:488)を示す。
【Fig208】配列番号:495が、ここにおいて「DNA40021−1154」と命名されたクローンである、天然配列PRO285cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:495)を示す。
【Fig209】Fig208に示されている配列番号:495のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:496)を示す。
【Fig210】配列番号:497が、ここにおいて「DNA42663−1154」と命名されたクローンである、天然配列PRO286cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:497)を示す。
【Fig211】Fig210に示されている配列番号:497のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:498)を示す。
【Fig212】配列番号:505が、ここにおいて「DNA30943−1−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO213−1cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:505)を示す。
【Fig213】Fig212に示されている配列番号:505のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:506)を示す。
【Fig214】配列番号:507が、ここにおいて「DNA64907−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO1330cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:507)を示す。
【Fig215】Fig214に示されている配列番号:507のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:508)を示す。
【Fig216】配列番号:509が、ここにおいて「DNA64908−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO1449cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:509)を示す。
【Fig217】Fig216に示されている配列番号:509のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:510)を示す。
【Fig218】配列番号:514が、ここにおいて「UNQ261」及び/又は「DNA39975−1210」と命名されたクローンである、天然配列PRO298cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:514)を示す。
【Fig219】Fig218に示されている配列番号:514のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:515)を示す。
【Fig220】DNA26832(配列番号:516)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig221】配列番号:522が、ここにおいて「DNA43316−1237」と命名されたクローンである、天然配列PRO337cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:522)を示す。
【Fig222】Fig221に示されている配列番号:522のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:523)を示す。
【Fig223】DNA42301(配列番号:524)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig224】配列番号:525が、ここにおいて「DNA55800−1263」と命名されたクローンである、天然配列PRO403cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:525)を示す。
【Fig225】Fig224に示されている配列番号:525のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:526)を示す。
【Fig226】DNA34415(配列番号:527)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig227】DNA49830(配列番号:528)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig228】DNA49831(配列番号:529)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig229】配列番号:611が、ここにおいて「DNA94832−2659」と命名されたクローンである、天然配列PRO4993cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:611)を示す。
【Fig230】Fig229に示されている配列番号:611のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:612)を示す。
【Fig231】配列番号:613が、ここにおいて「DNA68886」と命名されたクローンである、天然配列PRO1559cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:613)を示す。
【Fig232】Fig231に示されている配列番号:613のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:614)を示す。
【Fig233】配列番号:615が、ここにおいて「DNA52758−1399」と命名されたクローンである、天然配列PRO725cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:615)を示す。
【Fig234】Fig233に示されている配列番号:615のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:616)を示す。
【Fig235】配列番号:617が、ここにおいて「DNA52756」と命名されたクローンである、天然配列PRO739cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:617)を示す。
【Fig236】Fig235に示されている配列番号:617のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:618)を示す。
(発明の分野)
本発明は、一般的に、新規なDNAの同定及び単離、及び該DNAによりコードされる新規なポリペプチドの組換え生産に関する。
【0002】
(発明の背景)
細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取る情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル分子は、通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境におけるその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターを含む、様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び種々の他のサイトカインのような、現在入手可能な大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。新規な未変性分泌タンパク質を同定する努力が産業界及び学術界の両方によってなされている。多くの努力が新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci. 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照されたい]。
【0003】
膜結合タンパク質及びレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を担っている。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化又は他の細胞との相互作用は、典型的には他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報に支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞の増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は、様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるプロテインチロシンキナーゼはまた成長因子レセプターとしても作用する。具体例には、繊維芽細胞増殖因子及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断薬を含む、様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド間相互作用を阻止する治療薬として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド間相互作用の可能性のあるペプチド又は小分子インヒビターをスクリーニングするために使用することもできる。新規な未変性レセプタータンパク質を同定するための努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために、哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
ここで我々は、新規の分泌及び膜貫通ポリペプチド、及びこれらポリペプチドをコードする新規な核酸の同定及び特徴づけを記述する。
【0004】
1.PRO213
ヒト成長停止−特異的遺伝子6(Human growth arrest−specific gene 6)(gas6)は、様々な異なる組織で発現され、血清欠乏期間中に高度に発現されて成長誘導中にネガティブに調節されることが報告されているタンパク質をコードする。Manfioletti等, Mol. Cell. Biol. 13(8):4976−4985(1993)及びStitt等, Cell 80:661−670(1995)を参照されたい。Manfioletti等(1993),前掲は、gas6プロテインが、ビタミンK依存性タンパク質ファミリーのメンバーであることを示唆しており、ここで後者のタンパク質ファミリーメンバー(例えば、プロテインS、プロテインC及びX因子が含まれる)は全て血液凝固経路において調節の役割を担っている。よって、gas6は、成長調節に関連したプロテアーゼカスケードの調節又は血液凝固カスケードにおいてある役割を担っていることが示唆される。
gas6プロテインの生理学的な重要性が分かったため、gas6に相同な新規で未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によりなされている。これらの努力の多くは、新規の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にgas6と相同性を有するもののコード配列を同定するために、哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このようなスクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照されたい]。ここで我々は、gsa6ポリペプチドに対する相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【0005】
2.PRO274
文献においてG−プロテイン共役レセプター(G−protein coupled receptors)とも呼ばれている7−膜貫通(「7TM」)タンパク質又はレセプターは、リガンドの認識と、それらリガンド内に含まれる情報の細胞の機構への続くシグナル伝達のために設計された特殊化されたタンパク質である。細胞表面レセプターの主たる目的は、各細胞が遭遇する様々な細胞外刺激から適切なリガンドを識別し、ついで細胞内シグナルをつくり出すエフェクター系を活性化させ、それによって細胞プロセスを制御することである。[Dohlman, H., Ann. Rev. Biochem., 60:653(1991)]。認識ドメインにリガンドを結合させ、細胞内ドメインに情報をアロステリックに伝達する7TMレセプターの能力は、7TMタンパク質の特殊化された特徴である。[Kenakin, T., Pharmacol. Rev., 48:413(1996)]。7TMレセプター又はG−プロテイン関連レセプターをコードする遺伝子ファミリーは、これらに限定されるものではないが、C5a、インターロイキン8及び関連したケモカインを含む多数のリガンドを認識するレセプターをコードする。この分野における研究では、細胞表面の異なるシグナルが細胞活性化の共通の経路に送られることが示唆されている。[Gerard, C.,及びGerard, N., Curr. Op. Immunol., 6:140(1994)、Gerard, C.及びGerard, N., Ann. Rev. Immunol., 12:775(1994)]。7TM又はG−プロテイン共役レセプターのスーパーファミリーには、光子、イオン及びとりわけアミノ酸のような様々なメッセージを認識可能な数百のメンバーが含まれる[Schwartz, T.W.ら, H., Trends in Pharmacol. Sci., 17(6):213(1996)]。[Dohlman, H., Ann. Rev. Biochem., 60:653(1991)]。[Schwartz, T.W.ら, H., Eur. J. Pharm. Sci., 2:85(1994)]。ここで我々は、7膜貫通セグメントレセプタータンパク質及びFn54タンパク質に対して相同性を有する新規のポリペプチド(ここではPRO274と命名)の同定について記載する。
【0006】
3.PRO300
Diff33プロテインはマウスの精巣腫瘍において過剰発現される。現在、その役割は不明であるが、癌においてある役割を担っていると思われる。癌の生理の理解の医学的な重要性が分かっているので、癌に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力が現在なされている。ここで我々は、ここではPRO300と命名したDiff33に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定について記載する。
【0007】
4.PRO284
新規な膜貫通ポリペプチドを同定し特徴づけるための努力が現在なされている。ここで我々は、PRO284と命名した新規の膜貫通ポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0008】
5.PRO296
癌細胞は、しばしは、対応する正常な細胞型では発現されないか、対応する正常な細胞型におけるものとは異なるレベルで発現される数多くのタンパク質を発現する。これらタンパク質の多くは、正常な細胞から癌細胞への形質転換の誘発、又は癌表現型の維持に関与している。このように、癌細胞で発現されるタンパク質を同定し特徴づけることにはかなりの関心がある。ここで我々は、ここでPRO296と命名した肉腫増幅タンパク質SASに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0009】
6.PRO329
免疫グロブリン分子は、多くの重要な哺乳類の生理的プロセスにおいて役割を担っている。免疫グロブリン分子の構造は広範囲に研究されており、無傷の免疫グロブリンは、その一つが免疫グロブリン分子の定常領域又はFc領域である異なるドメインを有していることが十分に実証されている。免疫グロブリンのFcドメインは、抗原の認識と結合に直接には関与してはいないが、その各抗原と複合化されていまいとも複合されていようとも、免疫グロブリン分子の、血清中を循環しているか細胞表面にあるFcレセプターに結合する能力を媒介する。免疫グロブリンのFcレセプター分子への結合能力は、例えば望まれない外来粒子に対する免疫反応をなさせることを含む様々な重要な活性を生じる。このように、新規なFcレセプタータンパク質とそのサブユニットの同定にはかなりの関心がある。ここで我々は、ここにPRO329と命名した、高親和性免疫グロブリンFcレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについて記載する。
【0010】
7.PRO362
結腸直腸ガン腫は、西側諸国、特に米国において高い発症率を有する悪性新生物疾患である。この種の腫瘍はしばしばリンパ又は導管チャンネルを通して転移し、米国において年間約62000人を死に至らしめる。
モノクローナル抗体A33(mAbA33)は、結腸直腸癌腫に羅患した患者において広範な前臨床分析及び局在化研究を受けたマウス免疫グロブリンである(Welt等, J. Clin. Oncol. 8:1894−1906(1990)及びWelt等, J. Clin. Oncol. 12:1561−1571(1994))。mAbA33は、正常な結腸細胞及び結腸ガン細胞の内部及びその表面で見出される抗原に結合することが分かった。結腸粘膜から派生した癌腫において、A33抗原は、95%を越えるケースで均一に発現している。しかし、A33抗原は、他の広範囲の正常な組織では検出されておらず、すなわちその発現は、むしろ器官特異的であると思われる。従って、A33抗原は結腸直腸ガンの誘発において重要な役割を担っていると思われる。
腫瘍細胞の形成及び/又は増殖におけるA33抗原の明らかな重要性が分かったため、A33抗原の相同体の同定にはかなりの関心がある。この点で、我々は、ここでPRO362と命名した、A33抗原に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけをここに記載する。
【0011】
8.PRO363
細胞表面タンパク質HCARは、アデノウイルスのサブグループC及びコクサッキーウイルスのサクグループBに対するレセプターとして作用する膜結合タンパク質である。よって、HCARは細胞へのウイルス感染を媒介する手段を提供するものであり、細胞表面上にHCARレセプターが存在すると、ウイルス粒子に対する結合部位が提供され、それによってウイルス感染が促進される。
膜結合タンパク質、特にウイルスに対する細胞表面レセプターを提供するものの生理学的重要性に鑑みて、新規で未変性の膜結合レセプタータンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の双方により現在なされている。これらの多くの努力は、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでPRO363と命名した、A33及びガン胎児抗原を含む様々な腫瘍抗原及び細胞表面タンパク質HCARに対して相同性を有する新規な膜結合ポリペプチドポリペプチドをここに記載するもので、このポリペプチドは新規な細胞表面ウイルスレセプター又は腫瘍抗原でありうる。
【0012】
9.PRO868
哺乳動物における細胞数のコントロールは、細胞増殖と細胞死の間のバランスにより部分的に決定されると考えられている。しばしば壊死性細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、ある種の外傷又は細胞傷害の結果生じる細胞死の病理的形態として特徴づけられる。これに対して、通常は規則的又はコントロールされた状態で進行する細胞死の他の「生理的」形態がある。細胞死のこの規則的又はコントロールされた形態は、しばしば「アポトーシス」と称される[例えば、Barr等, Bio/Technology, 12:487−493(1994);Steller等, Science, 267:1445−1449(1995)を参照]。アポトーシス性細胞死は、免疫系におけるクローン選択と胚の発達を含む多くの生理的プロセスにおいて自然に生じる[Itoh等, Cell, 66:233−243(1991)]。アポトーシス性細胞死のレベルの減少は、ガン、狼瘡、疱疹ウイスル感染を含む種々の病理的条件に関連している[Thompson, Science, 267:1456−1462(1995)]。アポトーシス性細胞死のレベルの増加は、エイズ、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、色素性網膜炎、小脳変性、無形成性貧血、心筋梗塞、脳卒中、再灌流傷害、及び毒素誘発性肝疾患を含む様々な他の病理状態に関連している[Thompson, 上掲を参照されたい]。
典型的には、アポトーシス性細胞死には、細胞内における一又は複数の特徴的な形態学的及び生化学的変化、例えば細胞質の凝結、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体DNAの分解又はミトコンドリア機能の喪失が伴う。様々な外因的及び内因的シグナルが、このような形態学的及び生化学的な細胞変化を惹起又は誘発すると考えられている[Raff, Nature, 356:397−400(1992);Steller, 上掲;Sachsら, Blood, 82:15(1993)]。例えば、ホルモンの刺激、例えば未成熟胸腺細胞に対する糖質コルチコイドホルモン、並びにある種の成長因子の退薬により惹起され得る[Watanabe−Fukunaga等, Nature, 356:314−317(1992)]。また、幾つかの同定された発ガン遺伝子、例えばmyc、rel、及びE1A、及び腫瘍サプレッサー、例えばp53が、アポトーシスを誘発する際にある役割を有していることも報告されている。ある種の化学療法薬及びある種の放射線も同様にアポトーシス誘発活性を有していることも見出されている[Thompson, 上掲]。
【0013】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子−α(「TNF−α」)、腫瘍壊死因子−β(「TNF−β」又は「リンホトキシン−α」)、リンホトキシン−β(「LT−β」)、CD30リガンド、CD27リガンド、CD40リガンド、OX−40リガンド、4−1BBリガンド、Apo−1リガンド(Fasリガンド又はCD95リガンドとも称される)、及びApo−2リガンド(トレイル(TRAIL)とも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「TNF」)ファミリーのメンバーとして同定された[例えば、Gruss及びDower, Blood, 85:3378−3404(1995);Pitti等, J. Biol. Chem., 271:12687−12690(1996);Wiley等, Immunity, 3:673−682(1995);Browningら, Cell, 72:847−856(1993);Armitage等, Nature, 357:80−82(1992)、1997年1月16日に公開されたWO97/01633;1997年7月17日に公開されたWO97/25428]。これらの分子のなかでも、TNF−α、TNF−β、CD30リガンド、4−1BBリガンド、Apo−1リガンド、及びApo−2リガンド(TRAIL)は、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。TNF−αとTNF−βの両方とも、感受性腫瘍細胞におけるアポトーシス性死を誘発することが報告されている[Schmid等, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881(1986);Dealtry等, Eur. J. Immunol., 17:689(1987)]。Zheng等は、TNF−αがCD8ポジティブT細胞のポスト刺激性アポトーシスに関与していることを報告している[Zheng等, Nature, 377:348−351(1995)]。他の研究者は、CD30リガンドが胸腺における自己反応性T細胞の欠失に関与していることを報告している[Amakawa等, プログラム細胞死に関するコールドスプリングハーバー研究所のシンポジウム、要約集、第10巻、(1995)]。
マウスのFas/Apo−1レセプター又はリガンド遺伝子(それぞれ1pr及びgldと呼ばれる)における変異は幾つかの自己免疫疾患に関連しており、Apo−1リガンドが末梢の自己反応性リンパ球のクローン除去を調節する役割を担っていることを示している[Krammer等, Curr. Op. Immunol., 6:279−289(1994);Nagata等, Science, 267:1449−1456(1995)]。また、Apo−1リガンドは、CD4ポジティブTリンパ球及びBリンパ球においてポスト刺激性アポトーシスを誘発することが報告されており、それらの機能がもはや必要でなくなった際の活性化リンパ球の除去に関与している[Krammer等, 上掲;Nagata等, 上掲]。Apo−1レセプターと特異的に結合するアゴニストのマウスモノクローナル抗体は、TNF−αに匹敵するか類似する細胞死滅活性を示すことが報告されている[Yonehara等, J. Exp. Med., 169:1747−1756(1989)]。
【0014】
このようなTNFファミリーのサイトカインが介在する種々の細胞反応誘導は、特異的な細胞レセプターに結合することにより開始されると考えられている。約55−kDa(TNFR1)と75−kDa(TNFR2)の2つの異なるTNFレセプターが同定されており[Hohman等, J. Biol. Chem., 264:14927−14934(1989);Brockhaus等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87:3127−3131(1990);1991年3月20日に公開されたEP417563]、双方のレセプター型に対応するヒト及びマウスcDNAが単離され、特徴づけされている[Loetscher等, Cell, 61:351(1990);Schall等, Cell, 61:361(1990);Smith等, Science, 248:1019−1023(1990);Lewis等, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:2830−2834(1991);Goodwin等, Mol. Cell. Biol., 11:3020−3026(1991)]。広範な多型性が、双方のTNFレセプター遺伝子に関連している[例えば、Takao等, Immunogenetics, 37:199−203(1993)を参照]。双方のTNFRは細胞外、膜貫通及び細胞内領域を含む細胞表面のレセプターの典型的な構造を共有する。双方のレセプターの細胞外部分はまた可溶性TNF結合タンパク質として天然に見出される[Nophar, Y等, EMBO J., 9:3269(1990);及びKohno, T等, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:8331(1990)]。更に最近になって、組換え体可溶性TNFレセプターのクローニングがヘイル(Hale)等[J. Cell. Biochem. 増補15F, 1991, p.113(P424)]により報告されている。
1型又は2型のTNFR(TNFR1及びTNFR2)の細胞外部分は、NH2末端から出発して、1〜4とされる4つのシステインに富んだドメイン(CRD)の反復アミノ酸配列パターンを含む。各CRDは約40のアミノ酸長のものであり、良好に保存された位置に4〜6のシステイン残基を含んでいる[Schall等, 上掲;Loetscher等, 上掲;Smith等, 上掲;Nophar等, 上掲;Kohno等, 上掲]。TNFR1において、4つのCRDのおおよその境界は次の通りである:CRD1−14から約53までのアミノ酸;CRD2−約54から約97までのアミノ酸;CRD3−約98から約138までのアミノ酸;CRD4−約139から約167までのアミノ酸。TNFR2において、CRD1は、17〜約54までのアミノ酸を、CRD2は約55から約97までのアミノ酸を;CRD3は約98から約140までのアミノ酸を;CRD4は約141から約179までのアミノ酸を含む[Banner等, Cell, 73:431−435(1993)]。また、リガンド結合におけるCRDの可能な役割は前掲のBanner等により記載されている。
【0015】
CRDの類似の反復パターンが、p75神経成長因子レセプター(NGFR)[Johnson等, Cell, 47:545(1986);Radeke等, Nature, 325:593(1987)]、B細胞抗原CD40[Stamenkovic等, EMBO J., 8:1403(1989)]、T細胞抗原OX40[Mallet等, EMBO J., 9:1063(1990)]及びFas抗原[Yonehara等, 上掲、及びItoh等, Cell, 66:233−243(1991)]を含むいくつかの他の細胞表面タンパク質に存在している。また、CRDはショープ(Shope)及び粘液腫ポックスウィルスの可溶型TNFR(sTNFR)様のT2タンパク質にも見出されている[Upton等, Virology, 160:20−29(1987);Smith等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 176:335(1991);Upton等, Virology, 184:370(1991)]。これらの配列の最適なアラインメントは、システイン残基の位置が良好に保存されていることを示している。これらレセプターは、しばしば集合的に、TNF/NGFレセプタースーパーファミリーのメンバーと称される。p75NGFRに関する最近の研究では、このドメインにおけるCRD1の欠失[Welcher, A.A.等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:159−163(1991)]又は5−アミノ酸の挿入[Yan. H及びChao, M.V., J. Biol. Chem., 266:12099−12104(1991)]は、NGF結合には殆ど又は全く影響を持たないことが示されている[Yan. H及びChao, M.V., 上掲]。p75NGFRはNGF結合に関与せず、そのCRD4と膜貫通領域の間に約60のアミノ酸のプロリンに富んだ伸展を含む[Peetre, C等, Eur. J. Hematol.、41:414−419(1988);Seckinger, P等, J. Biol. Chem., 264:11966−11973(1989);Yan. H及びChao, M.V., 上掲]。同様のプロリンに富んだ領域はTNFR2に見出されているが、TNFR1にはない。
リンフォトキシン−αを除き、今日までに同定されているTNFファミリーのリガンドは、II型の膜貫通タンパク質であり、そのC−末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているTNFレセプター(TNFR)ファミリーのレセプター類はI型の膜貫通タンパク質である。しかしながら、TNFリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ECD」)において見出されている。TNF−α、Apo−1リガンド及びCD40リガンドを含むTNFファミリーサイトカインの幾つかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され;それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、TNFレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインのインヒビターとして機能し得る可溶性レセプターのECDを放出する。
【0016】
最近、TNFRファミリーの他のメンバーが同定されている。このようなTNFRファミリーの新規に同定されたメンバーには、CAR1、HVEM及びオステオプロテグリン(osteoprotegerin:OPG)[Brojatsch等, Cell, 87:845−855(1996);Montgomery等, Cell, 87:427−436(1996);Marsters等, J. Biol. Chem., 272:14029−14032(1997);Simonet等, Cell, 89:309−319(1997)]が含まれる。他の既知のTNFR様分子と異なり、Simonet等, 上掲,は、OPGは疎水性の膜貫通−スパンニング配列を含んでいないと報告している。
更に、「グルココルチコイド−誘発性腫瘍壊死因子レセプターファミリー−関連遺伝子」に対して「GITR」と呼ばれるレセプターである、TNF/NGFレセプターファミリーの新規なメンバーがマウスにおいて同定されている[Nocentini等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:6216−6221(1997)]。マウスGITRレセプターは、正常なマウスの胸腺、脾臓及びリンパ節からのTリンパ球中に発現される228のアミノ酸からなるI型膜貫通タンパク質である。マウスGITRレセプターの発現は、抗CD3抗体、ConA又はホルボール−12−ミリスタート−13−アセタートで活性化されたTリンパ球において誘発される。マウスGITRレセプターはT細胞レセプター−媒介性細胞死に関連していると著者は推測している。
Marsters等,Curr. Biol., 6:750(1996)において、研究者は、細胞外のシステインに富んだ反復につおいてTNFRファミリーに対して類似性を示し、細胞質死亡ドメイン配列を含む点でTNFR1及びCD95に似ており、Apo−3と称される、ヒトのポリペプチドの全長天然配列を開示している[Marsters等,Curr. Biol., 6:1669(1996)]。他の研究者には、Apo−3はDR3、wsl−1及びTRAMPとも称されている[Chinnaiyan等, Science, 274:990(1996);Kitson等, Nature, 384:372(1996);Bodmer等, Immunity, 6:79(1997)]。
【0017】
Pan等は、「DR4」と称される他のTNFレセプターファミリーのメンバーを開示している[Pan等, Science, 276:111−113(1997)]。DR4は細胞自殺器を活動させる細胞質死亡ドメインを含むと報告されている。Pan等は、DR4がApo−2リガンド又はTRAILとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridan等, Science, 277:818−821(1997)及びPan等, Science, 277:815−818(1997)には、Apo−2リガンド(TRAIL)に対するレセプターであると考えられている他の分子が記載されている。その分子はDR5と称されている(またApo−2とも称されている)。同様に、DR4、DR5は細胞質死亡ドメインを含み、アポトーシスをシグンル伝達しうることが報告されている。
Sheridan等, 上掲,において、DcR1(又はApo−2DcR)と呼ばれるレセプターは、Apo−2リガンド(TRAIL)に対する可能なデコイレセプター(decoy receptor)であるとして開示されている。Sheridan等は、DcR1がApo−2リガンドの機能をインビトロで阻害可能であると報告している。また、TRIDと称されるデコイレセプターの開示については、Pan等, 上掲,が参照される。
サイトカインのTNFファミリー及びそれらのレセプターのレビューについては、Gruss及びDower, 上掲を参照されたい。
現在理解されているように、細胞死プログラムは、少なくとも3つの重要な要素−活性化因子、インヒビター及びエフェクターを含む;線虫(C. elegans)において、これらの成分はそれぞれ3つの遺伝子、Ced−4、Ced−9及びCed−3によりコード化されている[Steller, Science, 267:1445(1995);Chinnaiyan等, Science, 275:1122−1126(1997);Wang等, Cell, 90:1−20(1997)]。TNFRファミリーのメンバーの2つ、TNFR1及びFas/Apol(CD95)は、アポトーシス性細胞死を活性化しうる[Chinnaiyan及びDixit, Current Biology, 6:555−562(1996);Fraser及びEvan, Cell, 85:781−784(1996)]。また、TNFR1は、転写因子、NF−κBの活性化を媒介することも知られている[Tartaglia等, Cell, 74:845−853(1993);Hsu等, Cell, 84:299−308(1996)]。ある程度のECD相同性に加えて、これら2つのレセプターは、死亡ドメインとして知られているオリゴマー形成界面の細胞内ドメイン(ICD)での相同性を共有する[Tartaglia, 上掲;Nagata, Cell, 88:355(1997)]。また、死亡ドメインはアポトーシスを調節する幾つかの後生動物タンパク質、すなわちショウジョウバエタンパク質、リーパー(Reaper)、及びFADD/MORT1、TRADD及びRIPと称される哺乳動物タンパク質中においても見出されている[Cleaveland及びIhle, Cell, 81:479−482(1995)]。
【0018】
リガンド結合及びレセプターのクラスター形成の際に、TNFR1とCD95は死亡誘発性シグナル伝達複合体にFADDを補充するものと考えられている。言われるところによれば、CD95はFADDに直接結合する一方、TNFR1はTRADDを介して間接的にFADDに結合する[Chinnaiyan等, Cell, 81:505−512(1995);Boldin等, J. Biol. Chem., 270:387−391(1995);Hsu等, 上掲;Chinnaiyan等, J. Biol. Chem., 271:4961−4965(1996)]。FADDは、Ced−3−関連プロテアーゼ、MACHα/FLICE(カスパーゼ8)を、死亡シグナル伝達複合体に補充するアダプターとなることが報告されている[Boldin等, Cell, 85:803−815(1996);Mizio等, Cell, 85:817−827(1996)]。MACHα/FLICEは、細胞死プログラムの幾つかの重要な側面を実施し得る、インターロイキン−1β変換酵素(ICE)及びCPP32/Yamaを含むアポトーシス性プロテアーゼのカスケードを引き起こすトリガーであると思われる[Fraser及びEvan, 上掲]。
プログラム細胞死が、線虫の細胞死遺伝子、ced−3、及び哺乳動物のIL−1−変換酵素、ICEに関連したシステインプロテアーゼファミリーのメンバーの活性に関与していることが最近開示された。ICE及びCPP32/Yamaプロテアーゼの活性は、牛痘ウイルス遺伝子、crmAの産物により阻害されうる[Ray等, Cell, 69:597−604(1992);Tewari等, Cell, 81:801−809(1995)]。最近の研究では、CrmAがTNFR1−及びCD95−誘発細胞死を阻害しうることが示されている[Enari等, Nature, 375:78−81(1995);Tewari等, J. Biol. Chem., 270:3255−3260(1995)]。
Tewari等により最近レビューされているように、TNFR1、TNFR2及びCD40は、転写因子、NF−κBの活性化により、炎症誘発性及び同時刺激性サイトカイン、サイトカインレセプター、及び細胞接着分子の発現を変調する[Tewari等, Curr. Op. Genet. Develop., 6:39−44(1996)]。NF−κBは、そのサブユニットが保存Rel領域を含む二量体転写因子のファミリーの原型である[Verma等, Genes Develop., 9:2723−2735(1996);Baldwin, Ann. Rev. Immunol., 14:649−681(1996)]。その潜伏形態において、NF−κBはIκBーインヒビターファミリーのメンバーと複合化しており;所定の刺激に反応してIκBの不活性化の際に、放出されたNF−κBが、特異的DNA配列と結合する核に転座して遺伝子転写を活性化する。
【0019】
10.PRO382
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々のセリン含有タンパク質に対して特異的な活性を示すセリンプロテアーゼを含む、種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方により現在なされている。これらの努力の多くは、新規な膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5536637号を参照]。我々は、ここでPRO382と命名した、セリンプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0020】
11.PRO545
メルトリン(meltrin)がメンバーである、ADAM[ディスインテグリン(Disintegrin)及びメタロプロテアーゼ]タンパク質ファミリーは、細胞の相互作用及び細胞反応の変調において重要な役割を有しうる。[例えば、Gilpin等, J. Biol. Chem., 273(1):157−166(1998)]。ADAMタンパク質は発ガンに関与していた。メルトリン−α(ADAM12)は細胞融合に必要であると報告されている筋芽細胞遺伝子産物である。[Harris等, J. Cell. Biochem., 67(1):136−142(1997)、Yagami−Hiromasa等, Nature, 377:652−656(1995)]。メルトリンはディスインテグリン及びメタロプロテアーゼを含有し、インテグリン−結合ディスインテグリンドメインを通じて、発達に関与している細胞接着現象に関連しているが、亜鉛依存性メタロプロテアーゼドメインを通して抗接着機能も有している。[Alfandari等, Devel. Biol., 182(2):314−330(1997)]。発ガン及び他の疾患のメカニズムにおける細胞接着及び細胞応答の変調の医学的な重要性が分かっているので、現在、細胞接着及び細胞応答の変調に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここではPRO545と命名した、メルトリンに対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0021】
12.PRO617
CD24は、好中球、単球及びある種のリンパ球、例えばBリンパ球を含む、哺乳類の免疫系の種々の異なる細胞の細胞表面に結合しているタンパク質である。CD24は、血小板結合性表面糖タンパクP−セレクチン(また、顆粒膜プロテイン−140すなちGMP−140)に対するリガンドであることが分かっており、該糖タンパク質は血小板及び内皮細胞の両方で構成的に合成され、その細胞が活性化すると血小板表面に現れる。このように、P−セレクチンは、活性化した血小板及び内皮細胞の、P−セレクチン分子に対する一又は複数のリガンド、特にCD24を発現する免疫系の種々の細胞へのカルシウム依存的接着を媒介する。このメカニズムにより、それらが最も必要とされている位置、例えば損傷部位に、免疫系細胞を補充することができる。よって、免疫系細胞の細胞表面抗原に対する相同性を示す新規のポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。ここで我々は、CD24タンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規のポリペプチドはここではPRO617と命名される。
【0022】
13.PRO700
タンパクジスルフィドイソメラーゼ(PDI)は、タンパク質の折り畳み中の異性化及びジスルフィド形成を触媒する酵素である。チオレドキシンに相同な2つのドメイン内に存在する2つの触媒部位を有するもので、その一方はN末端近傍にあり、他方はC末端近傍にある。[例えば、Gilbert HF, J. Biol. Chem., 47:29399−29402(1997)、Mayfield KJ, Science, 278:1954−1957(1997)及びPuig等, J. Biol. Chem., 52:32988−32994(1997)を参照]。PDIは原核細胞で生産されるタンパク質における天然型のジスルフィド結合の形成に有用である。(米国特許第5700659号及び同5700678号も参照のこと)。
よって、PDI及びそれに関連する分子は、特にジスルフィド結合の形成を触媒する能力のために興味がある。更に、これらの分子は、酸化還元反応及び関連プロセスの研究において、一般的に関心を持たれている。更に、PDI及び関連分子は、Darby等, Biochemistry 34, 11725−11735(1995)に記載されている。我々は、ここでPRO700ポリペプチドと命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0023】
14.PRO702
コングルチニンは、当初は脊椎動物のレクチンタンパク質として記載され、4つの特徴あるドメイン、(1)N末端システイン−リッチドメイン、(2)コラーゲン様ドメイン、(3)ネックドメイン及び(4)炭水化物認識ドメイン(CRD)を有するC型レクチンのファミリーに属すウシ血清タンパク質である。最近の報告では、ウシコングルチニンはそのレクチン特性のために、インフルエンザA型ウイルスによる血球凝集を阻害可能であることが実証されている(Eda等, Biochem. J. 316:43−48(1996))。また、コングルチニン等のレクチンは、補体媒介メカニズムであるために、免疫グロブリン非依存性防御分子(defense molecules)として機能しうることが示唆されている。よって、コングルチニンはインビトロにおける免疫複合体の精製、及びインビボにおける患者の血漿からの循環免疫複合体の除去に有用であることが示されている(Lim等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 218:260−266(1996))。我々は、ここでPRO702と命名した、コングルチニンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0024】
15.PRO703
超長鎖アシル−CoA合成酵素(「VLCAS」)は、長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送において活性な長鎖脂肪酸輸送タンパク質である。[例えば、Uchida等, J. Biochem(Tokyo) 119(3):565−571(1996)及びUchiyama等, J. Biol. Chem 271(48):30360−30365(1996)]。脂肪酸の輸送メカニズムの生物学的な重要性が分かったために、現在、脂肪酸輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO703と命名した、VLCASに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0025】
16.PRO705
グリピカン(glypican)は、その細胞表面局在化とヘパリン硫酸鎖の所有により、多くのヘパリン結合成長因子、細胞接着分子及び細胞外マトリックス成分に対する細胞の応答性を調節することができるグルコシルホスファチジルイノシトール(GPI)−アンカープロテオグリカンのファミリーである。一つのグリピカンタンパク質における変異がヒト出生欠損症候群の原因であり、これはグリピカンが発育において重要な役割を担っていることを示唆している(Litwack等, Dev. Dyn. 211:72−87(1998))。また、グリピカンは様々な細胞外マトリックスと相互作用しうるため、創傷治癒においても重要な役割を担っている(McGrath等, Pathol. 183:251−252(1997))。更に、グリピカンはニューロン及び神経膠腫細胞中で発現するため、神経系の細胞生存及び細胞分割の調節においても重要な役割を担っている(Liang等, J. Cell. Biol. 139:851−864(1997))。よって、グリピカンがプロテオグリカンの極めて重要なファミリーであることは明らかである。従って、グリピカンファミリーのメンバーに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO705と命名した、K−グリピカンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0026】
17.PRO708
アリールスルファターゼは、アリールスルファターゼA(ASA)、アリールスルファターゼB(ASB)及びアリールスルファターゼC(ASC)を含む、多くの異なるイソ型で存在し、種々の異なる芳香族スルファートを加水分解するように機能する酵素である。アリールスルファターゼは、種々の異なる動物組織及び微生物源から単離され、その構造及び機能は広範囲に研究されている(例えば、Nichol及びRoy, J.Biochem. 55:643−651(1964))。ASA欠乏は、異染性ロイコジストロフィー(MLD)に関連していることが報告されている(Giles等, Prenat. Diagn. 7(4):245−252(1987)及びHerska等, Am. J. Med. Genet. 26(3):629−635(1987))。更に、他のグループはアリールスルファターゼが免疫系のナチュラルキラー細胞において高レベルで見出されていることを報告しており、NK細胞媒介性細胞溶解における、これらの酵素の可能な役割を仮定している(例えば、Zucker−Franklin等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80(22):6977−6981(1983))。アリールスルファターゼ酵素の明らかな生理学的な重要性が分かっているため、新規なアリールスルファートに相同なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、アリールスルファターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載し、この新規なポリペプチドはここではPRO708ポリペプチドと命名される。
【0027】
18.PRO320
フィブリン(fibulin)−1は、基底膜及び結合組織弾性繊維及び血漿タンパク質の、システインに富む、カルシウム結合性細胞外マトリックス(ECM)成分であり、選択的スプライシングにより得られるA〜Dの4つのイソ型を有する。フィブリン−1はアミノ末端アナフィラトキシン様分子に9つの表皮成長因子(EGF)様分子が続き、選択的スプライシングに応じて4つの可能なカルボキシル末端を有するモジュラー糖タンパク質である。フィブリン−2は、フィブロネクチン又はフィブリリンを含むミクロフィブリルと密に結合して頻繁に見出される新規な細胞外マトリックスタンパク質である。それらのRNA先駆物質を選択的にスプライシングするプロセスにより、C末端領域が異なる多様な形態のフィブリン−1が存在する。[例えば、Tran等, Matrix Biol 15(7):479−493(1997)]。
患者から取り出された悪性細胞株及び無胸腺マウスにおいて形成された腫瘍から確立した16細胞株のノーザン及びウエスタンブロット分析により、フィブリン−1Dの低発現性が、腫瘍の形成及び浸潤においてある役割を担っていることを示している[Qing等, Oncogene, 18:2159−2168(1997)]。卵巣ガン細胞は腹腔を自由に浸潤する能力により特徴づけられている。エストラジオールはエストロゲンレセプター(ER)−ポジティブ卵巣ガン細胞の増殖、並びにフィブリン−1の発現を刺激することが実証されている。MDA−MB231乳ガン細胞株の運動性に対するフィブリン−1の効果についての研究により、MDA−MB231細胞の走触性遊走の阻害が示され、著者は、フィブリン−1がインビトロにおけるガン細胞の運動性を阻害しえ、よって腫瘍の浸潤を阻害する可能性を有していると結論付けた。[Hayashido等, Int J Cancer 75(4):654−658(1998)]。
よって、フィブリン及びその関連分子は、特にガンを予防する用途において関心を持たれている。更にこれらの分子は、一般的に結合組織及び付着分子及び関連するメカニズムの研究において関心が持たれている。フィブリン及びその関連分子は、Adams等, J. Mol. Biol., 272(2):226−36(1997);Kielty及びShuttleworth, Microsc. Res. Tech., 38(4):413−27(1997);及びChild. J. Card. Surg. 12(2Supp.):131−5(1997)に更に記載されている。
我々は、ここでPRO320ポリペプチドと命名した、フィブリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0028】
19.PRO324
オキシドレダクターゼは、反応に入る水分子と共に、一方の分子が酸化され、他方の分子が還元されるように化合物の2分子が相互作用する反応を触媒する酵素である。哺乳類生物において非常に重要な生理学的役割を担っている多くの異なる種類のオキシドレダクターゼ酵素がある。最も重要なオキシドレダクターゼには、例えばリアーゼ、ラクターゼ、コレステロールオキシダーゼ等が含まれる。これらの酵素は、消化、シグナル伝達及びイオン的ホメオスタシスの維持等のような必須のプロセスにおいてある役割を担っている。このように、オキシドレダクターゼ酵素には、哺乳類生物における種々の必須の用途が見出されているため、新規なオキシドレダクターゼ酵素の相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO324と命名した、オキシドレダクターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0029】
20.PRO351
プロスタシン(prostasin)はヒト精液から精製されるヒトセリンプロテアーゼである。免疫組織化学的局在化により、プロスタシンは上皮細胞及び前立腺の導管に存在することが明らかにされている。プロスタシンのcDNAはクローニングされ、特徴づけられている。サザンブロット分析と、続く逆転写ポリメラーゼ連鎖反応では、プロスタシンmRNAが前立腺、肝臓、唾液腺、腎臓、肺、膵臓、結腸、気管支、腎近位尿細管細胞、及び前立腺癌腫LNCaP細胞で発現していることが示されている。プロスタシンmRNAの細胞局在化はインシトゥーのハイブリッド形成組織化学により、ヒトの前立腺の上皮細胞内において同定された。[例えば、Yu等, J. Biol. Chem. (1994) 269(29):18843−18848、及びYu等, J. Biol. Chem. (1994) 270(22):13483−13489を参照]。
よって、プロスタシン及びその関連分子は、前立腺に関与する医学的症状の研究、診断及び治療において特に関心がもたれている。プロスタシン及び関連分子は、Yu等, Genomics (1996) 32(3):334−340にも更に記載されている。我々は、ここでPRO351ポリペプチドと命名した、プロスタシンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0030】
21.PRO352
ブチロフィリン(butyrophilin)は、哺乳類の乳の脂肪球膜に結合した全タンパク質の40%以上を構成している乳糖タンパク質である。ブチロフィリンmRNAの発現は、妊娠終期での乳脂肪の生成の開始と相関しており、乳汁分泌期を通して維持されていることが示されている。ブチロフィリンはウシ、マウス及びヒトにおいて同定されており(Taylor等, Biochim. Biophys. Acta 1306:1−4(1996)、Ishii等, Biochim. Biophys. Acta 1245:285−292(1995)、Mather等, J. Dairy Sci. 76:3832−3850(1993)及びBanghart等, J. Biol. Chem. 273:4171−4179(1998)を参照)、脂肪グロブリン膜内に取り込まれるI型膜貫通タンパク質である。ブチロフィリンは、キサンチンデヒドロゲナーゼ/オキシダーゼ及び授乳の間の尖端表面からの乳脂肪小球の発芽と放出において機能する他のタンパク質との複合体の集合体に対する主要な足場としての役割を果たしうることが示唆されている(Banghart等, 上掲)。
ブチロフィリンは、哺乳類の乳生成において明らかに重要な役割を担っているので、新規なブチロフィリン相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO352と命名した、ブチロフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0031】
22.PRO381
イムノフィリンはサイクロスポリンA、FK506及びラパマイシン等の免疫抑制剤に対するレセプターとして機能するタンパク質ファミリーである。イムノフィリンには、2つの別個のクラス、すなわち(1)FK506及びラパマイシンに結合するFK506−結合タンパク質(FKBP)と、(2)サイクロスポリンAに結合するサイクロフィリンとして生じる。FK506−結合タンパク質に関しては、FK506/FKBP複合体は、セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ2B(カルシニュリン)の活性を阻害する機能を有し、よって免疫抑制活性をもたらすと報告されている。また、FKBPイムノフィリンは哺乳類の神経系で見出されており、免疫抑制をなすプロセスとは独立したメカニズムを通しての中枢神経系における軸索再生に関与していると報告されている(Gold, 上掲)。よって、FKBPイムノフィリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO381と命名した、FKBPイムノフィリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0032】
23.PRO386
哺乳類の細胞膜は種々の細胞及び組織の構造的完全性及び活性に関する非常に重要な機能を果たす。膜の生理において特に関心があるのは、種々の生理学的、薬理学的及び細胞プロセスを直接制御するように作用する膜貫通イオンチャンネルの研究である。カルシウム(Ca)、ナトリウム(Na)及びカリウム(K)チャンネルを含む数多くのイオンチャンネルが同定されており、各々が詳細に分析されて、脊椎動物及び昆虫の細胞の生理学的プロセスにおけるその役割が決定されている。
細胞膜随伴イオンチャンネルの一タイプであるナトリウムチャンネルは、イオン的ホメオスタシスを維持し、並びに細胞内及び細胞外シグナルを伝達する細胞の能力において極めて重要な役割を担っている。脳ニューロンの電位作動型ナトリウムチャンネルは、孔形成αユニットの、より小さいβ−1及びβ−2サブユニットとの複合体であることが示されている(Isom等, Cell 83:433−442(1995))。細胞ホメオスタシス及び他の重要な生理学的機能におけるナトリウムチャンネルの明らかな重要性が分かっているので、ナトリウムチャンネルサブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO386と命名した、ラットのナトリウムチャンネルのβ−2サブユニットに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0033】
24.PRO540
ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼとしても知られているレシチン−コレステロールアシルトランスフェラーゼ(「LCAT」)は、特にコレステロールの代謝プロセスにおける、高密度リポタンパク質の血管内代謝のキー酵素である。[例えば、Brousseau等, J. Lipid Res., 38(12):2537−2547(1997)、Hill等, Biochem. J., 294:879−884(1993)、及びDrayna等, Nature 327(6123):632−634(1987)]。脂質代謝の医学的な重要性が分かっているため、現在、脂質輸送に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO540と命名した、LCATに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0034】
25.PRO615
シナプトギリン(synaptogyrin)は神経系に均一に分布しているシナプス小胞タンパク質である。シナプトギリンをコードするcDNAはクローニングされ、配列決定されており、その配列により、4つの膜スパンニングドメインを有する25,900Dの分子量のタンパク質であると考えられている。シナプトギリンは、血漿膜まで及び血漿膜からの膜輸送に関連している。Stenius等, J. Cell. Biol. 131(6−2):1801−1809(1995)。加えて、セルギリン(cellugyrin)と称される新規のシナプトギリンの新規なイソ型は、シナプトギリンと配列同一性を示す。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。セルギリンはテストした全ての組織に遍在し、脳組織で最もレベルが低かったが、これに対しシナプトギリンタンパク質は脳でのみ検出可能である。ラットの組織において、セルギリンとシナプトギリンは鏡像パターンの形で発現される。シナプス小胞タンパク質であるシナプトギリンは、偏在性タンパク質であるセルギリンが特殊化したものでありえ、2つのタンパク質は構造的類似性を共有しているが、局在化が異なる。この知見は、シナプス小胞を、ジェネリックな輸送オルガネラの単純化及び特殊化形態としての新しい概念を支持する[Janz等, J. Biol. Chem. 273(5):2851−2857(1998)]。ノルウェーラット、ラッタスノルベジカス(Rattus norvegicus)から得られたセルギリンの配列は、受託番号AF039085として1997年12月23日にジェンバンクデータベースに寄託されている。また、Janz等, J. Biol. Chem. 273(1998)、印刷中を参照されたい。
シナプス伝達の医学的な重要性が分かっているため、現在、シナプス小胞の形態の単純化又は特殊化したジェネリックな輸送オルガネラの一部でありうる、新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO615と命名した、シナプトギリンに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0035】
26.PRO618
エンテロペプチターゼは、トリプシノーゲンから酸性プロペプチドを特異的に開裂させて活性トリプシンを産出させる、腸内の消化カスケードにおけるキー酵素である。この開裂により、多くの膵臓チモーゲンの活性化に至るタンパク分解反応のカスケードが始まる。
例えば、Matsushima等, J. Biol. Chem. 269(31):19976−19982(1994)、Kitamoto等, Proc. Natl. Acad. Sci., 91(16):7588−7592(1994)を参照。エンテロキナーゼ(エンテロペプチターゼ)は、消化、凝固及び繊維素溶解に関連する哺乳類のセリンプロテアーゼに関連している。La Vallie等, J. Biol. Chem., 268(31):23311−23317(1993)。
消化プロセスの医学的な重要性が分かっているため、現在、消化、凝固及び繊維素溶解に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO618と命名された、エンテロペプチターゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0036】
27. PRO719
リポタンパクリパーゼは、循環する血漿リポタンパク質中に存在するリン脂質とトリグリセリドの加水分解を媒介するキー酵素である(Dugi等, J. Biol. Chem., 270:25396−25401(1995))。更に、リポタンパクリパーゼは細胞内へのリポタンパク質の取り込みを媒介することが知られており、ここでリポタンパク質の細胞への取り込みは、細胞表面のプロテオグリカン及び低密度リポタンパク質(LDL)レセプター関連タンパク質にリポタンパクリパーゼが結合することから開始される(Krapp等, J. Lipid Res. 36:2362−2373(1995))。よって、リポタンパクリパーゼがリポタンパク質及びコレステロール代謝において極めて重要な役割を担っていることは明らかである。よって、リポタンパクリパーゼと、配列相同性及び/又は生物学的活性を共有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO719と命名された、リポタンパク質リパーゼHに対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0037】
28.PRO724
低密度リポタンパク質(LDL)レセプターは、そのリガンド、アポリポタンパク質(apo)B−100及びapoEに対する高親和結合性により、リポタンパク質粒子の細胞への取り込みを媒介する、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を担っている膜結合タンパク質である。LDLレセプターのリガンド結合ドメインは、約40のアミノ酸からなる7つのシステインリッチの反復部を含み、各反復部は、3つの反復内ジスルフィド結合を形成する6つのシステインを含んでいる。これらの独特の構造的特徴により、LDLレセプターにはapoB−100及びapoEと特異的に相互作用する能力が付与され、これにより細胞膜を通過してこれらのリポタンパク質を輸送すること、及びそれらの成分を代謝することが可能になる。LDLレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片には、その特異的なリポタンパク質リガンドと相互作用する能力が保持されていることが示されている(Simmons等, J. Biol. Chem. 272:25531−25536(1997))。よって、LDLレセプターがコレステロール代謝に係る重要な生理学的活性に密接に関与していることは明らかである。このように、新規なLDLレセプターに相同なタンパク質を同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO724と命名した、ヒトLDLレセプタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0038】
29.PRO772
ヒト遺伝子A4の発現は結腸上皮で多く、インビボにおける結腸上皮細胞の分化で転写的に活性化される(Oliva等, Arch. Biochem. Biophys. 302:183−192(1993)及びOliva等, Am. J. Physiol. 272:C957−C965(1997))。A4cDNAは約17キロダルトンの大きさのポリペプチドであると予想される読み取り枠を含んでいる。A4タンパク質のヒドロパシー分析により、4つの推定膜スパンニングのαヘリックスが明らかになった。A4タンパク質が発現している細胞の免疫細胞化学的研究によれば、発現は小胞体に局在化していた。A4タンパク質の4つの膜スパンニングドメイン及び生物物理学的特徴によれば、それは、その幾つかが多量体化してイオンチャンネルを形成する、プロテオリピドと呼ばれる完全な膜タンパク質のファミリーに属することが示唆される。事実、予備的証拠においても、A4がそれ自身で多量体化し、イオンチャンネルの性質を獲得することが示唆されている(Oliva等, Am. J. Physiol. 272:C957−C965(1997))。細胞ホメオスタシスの維持におけるイオンチャンネルの重要性が分かっているため、既知及び推定のイオンチャンネルに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することにはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO772と命名した、推定イオンチャンネルタンパク質、A4に対する相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0039】
30.PRO852
プロテアーゼは哺乳類又は非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。 種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は多くの異なる生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規で未変性のプロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するための哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照]。我々は、ここでPRO852ポリペプチドと命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0040】
31.PRO853
細胞のレドックス状態は細胞の運命の重要な決定因子であることが、ある研究において報告されている。更に反応性酸素種は、組織壊死、器官機能不全、アテローム性動脈硬化、不妊症、出生欠損症、時期尚早の加齢、変異及び悪性腫瘍を含む炎症性疾患の原因となる細胞毒性であると報告されている。よって、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧の制御及び予防を含む、悪性腫瘍の発達に関与している多くの理由から重要である。反応性酸素種の水への転化を触媒する、レダクターゼ等の酸化防止酵素のレベルはガン細胞において低いことが示されている。特に、悪性の前立腺上皮はこのような酸化防止酵素の発現を低下させた[Baker等, Prostate 32(4):229−233(1997)]。この点において、レダクターゼには興味がある。加えて、転写因子、NF−κB及びAP−1は酸化還元状態により調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化及び糖尿病の合併症の病因に関与すると考えられる種々の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。さらに、この主題事項について記載した出版物には、Engman等, Anticancer Res. (Greece), 17:4599−4605(1997)、Kelsey等, Br. J. Cancer, 76(7):852−4(1997);FriedrichとWeiss. J. Theor. Biol., 187(4):529−40(1997)及びPieulle等, J. Bacteriol., 179(18):5684−92(1997)が含まれる。インビボにおけるレドックス反応の生理学的な重要性が分かっているため、レドックス反応に関与している新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO853と命名した、レダクターゼに対して配列類似性を有する新規な前立腺特異的ポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0041】
32.PRO860
ニューロファシン(neurofascin)は神経系接着分子の細胞接着分子(「CAM」)ファミリーのL1サブグループのメンバーであり、細胞凝集に関連している。細胞−細胞認識と細胞接触のパターニングは、神経系における経細胞複合体又は幅広い種類の可逆的なアセンブリを媒介する上で重要な役割を有している。ニューロファスシンに結合するアンキリンを変調することにより、細胞の相互作用が調節される。例えば、Tuvia, Proc. Natl. Acad. Sci., 94(24) 12957−12962(1997)を参照。ニューロファスシンは胚発達中の神経突起の伸長に関与する免疫グロブリンスーパーファミリーのL1サブグループのメンバーとして記載され、種々の発育段階で数多くのイソ型が検出されている。また、Hassel等, J. Biol. Chem., 272(45) 28742−28749(1997)、Grumet, Cell. Tissue. Res. 290(2) 423−428(1997)、Garver等, J. Cell. Biol., 137:703−714(1997)、及びLambert等, J. Neurosci., 17:7025−7−36(1997)を参照。
インビボにおける神経系の発達及び細胞接着分子の生理学的な重要性が分かっているため、現在、神経系の細胞相互作用の調節に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO860と命名した、ニューロファシンに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0042】
33.PRO846
CMRF35モノクローナル抗体は、リンパ球細胞株、末梢血液T及びBリンパ球の一部、好中球、単球の表面に存在し、CMRF35と命名された、細胞膜抗原を同定するために使用されていた。CMRF35cDNAは免疫グロブリン(Ig)遺伝子スーパーファミリーの新規で完全な膜糖タンパク質のメンバーをコードする。該分子は、(a)ポリマーIgA及びIgMに対するFcレセプターに顕著に似通った単一の細胞外Ig可変ドメイン、(b)かなりO−グルコシル化されていると考えられている、プロリン、セリン及びスレオニン残基を多量に含有する膜近位ドメイン、(c)グルタミン酸とプロリン残基を含有する珍しい膜貫通アンカー、及び(d)短い細胞質の尾部を含む。CMRF35タンパク質をコードした転写物は、免疫細胞化学の染色結果で確認されているように、初期の単球細胞株、末梢血液T細胞、あるBリンパ芽球状細胞株で検出されている。Jackson等, Eur. J. Immunol. 22(5):1157−1163(1992)。CMRF−35分子は、造血細胞で差次的に発現しており、抗原の発現は、分裂促進剤及びサイトカインによる刺激に、顕著な影響を受けることが示された。例えば、Clark等, Exp. Hematol. 25(8):759(1997)、Daish等, Immunol. 79(1):55−63(1993)、及びClark等, Tissue Antigens 48:461(1996)を参照。
免疫系及び種々の免疫系細胞に付随する抗原の生理学的な重要性が分かっているため、現在、免疫系の種々の細胞で発現する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO846と命名した、CMRF35に対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0043】
34.PRO862
リゾチームは、乳、涙及び唾液を含む分泌液及び幾つかのヒトの組織に幅広く分布しているタンパク質である。それは、N−アセチルグルコサミン間の結合を加水分解することが証明されている。毒性酸素フリーラジカルの生成及び走化性のインヒビターであることが証明されており、また石灰化プロセスにおいてある役割を有している。このように、リゾチームに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がある。我々は、リゾチームに対して配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0044】
35.PRO864
Wnt−4は腎臓管形成(kidney tubulogenesis)に必要で、またこれに関連している分泌糖タンパク質である。Wnt−4活性が欠乏したマウスは、前管細胞(pretubular cell)の集合体を形成できないが;間充織及び尿管発達の他の面に影響を及ぼさない。よって、Wnt−4はネフロン発達の根底にある上皮トランジションに対する間充織の誘発物質として作用するものと思われる。Stark等, Nature;372(6507):679−683(1994)。加えて、Wnt遺伝子ファミリーのメンバーは、細胞間シグナル伝達分子として作用可能で、発達中の脳において差次的に発現する、システインリッチの分泌タンパク質をコードする。Wnt遺伝子、例えばWnt−1は中脳細胞の運命の特定化に必須であることが知られている。Yoshioka等, Biochem. Biophys. Res. Commun. 203(3):1581−1588(1994)。Wntファミリーの分泌因子の幾つかのメンバーは、乳房細胞増殖及び分化の制御因子として強く関連している。Shimizu等, Cell Growth Differ. 8(12) 1349−1358。Wnt−4は妊娠初期において通常発現している。よって、Wnt−4は妊娠中に上皮を分岐させる局部シグナルでありうる。Edwards PA, Biochem Soc Symp. 63:21−34(1998)。また、Lipschutz JH, Am. J. Kidney Dis. 31(3):383−397(1998)を参照。我々は、ここでPRO864と命名した、Wnt−4に対する配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0045】
36.PRO792
少なくとも2つの細胞誘導シグナルが、B細胞で変換する免疫グロブリンアイソタイプの誘発に必要であることが示されている。第1のシグナルは可溶性リンフォカイン、インターロイキン(IL)−4又はIL−13の何れかで、生殖細胞イプシロン転写発現を誘発するものにより付与されるが、これ単独では免疫グロブリンE(IgE)の分泌を引き起こすには不十分である。第2のシグナルはB細胞と活性化T細胞、好塩基球とマスト細胞との物理的相互作用により提供され、CD40/CD40リガンド対合がIgE合成の媒介において重要であることが示されている。更に、IgE合成に関与する表面接着分子の多くの対の中でもCD23/CD21対がIgE生成において重要な役割を担っていると思われる。CD23は、IgE生成を増加又は減少させる因子により、正又は負に調節されるタンパク質である。CD23に対する抗体はインビトロにおいてIL−4誘発性ヒトIgE生成を阻害し、アイソタイプを選択する形で、ラットモデルにおける抗原特異性IgE応答を阻害することが示されている(Bonnefoy等, Eur. Respir. J. Suppl. 22:63S−66S(1996))。CD23はB細胞においてCD21と相互作用し、優先的にIgE生成を推進する。CD23タンパク質が哺乳類IgE応答の誘発において極めて重要な役割を担っているため、CD23に対して相同性を有する新規のポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO792と命名した、CD23に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0046】
37. PRO866
ミンジン(mindin)及びスポンジン(spondin)タンパク質は、互いに構造的に関連した分泌タンパク質であり、種々の生物で同定されている。例えば、Higashijima等, Dev Biol. 192:211−227(1997)はゼブラフィッシュの胚軸のフロアプレート細胞(floor plate cell)におけるスポンジン及びミンジンの発現の特定を報告しており、これによってミンジンとスポンジンタンパク質が、胚の発達において重要な役割を担っていることが示唆される。この同じグループはミンジンとスポンデジタンパク質が基底層に対して高親和性を有する細胞外マトリックスタンパク質として機能することを報告している(同上)。また。F−スポンジンは神経接着及び神経突起伸長を促進する分泌タンパク質であり(Klar等, Cell 69:95−110(1992))、またM−スポンディンはショウジョウバエの筋付着部位に局在化する細胞外マトリックスタンパク質である(Umemiya等, Dev Biol. 186:165−176(1997)ことも報告されている。よって、ミンジンとスポンジンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO866と命名した、ミンジン2及びミンジン1に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0047】
38.PRO871
サイクロフィリンはサイクロスポリンAに結合し、ペプチジル−プロリル−シス−トランスイソメラーゼ活性を有するタンパク質のファミリーである(Sherry等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:1758−1763(1998))。加えて、サイクロフィリンは活性化細胞により分泌され、おそらくは細胞表面のサイクロフィリンレセプターを通過するシグナル伝達により、サイトカイン様の形で作用する。宿主細胞誘導性サイクロフィリンAはHIV−1ビリオン中に取り込まれることが示されており、この取り込みはウイルス感染に必須であることも示されている。よって、一又は複数のサイクロフィリンがHIV−1感染に直接関連している可能性がある。サイクロフィリンタンパク質の明らかな重要性が分かったため、一又は複数のサイクロフィリンタンパク質に対して配列相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。我々は、ここでPRO871と命名した、サイクロフィリン様タンパク質CyP−60に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0048】
39.PRO873
酵素タンパク質は食物の消化、巨大分子の生合成、化学エネルギーの利用及び放出の制御、及び生命維持に必要な他のプロセスに関与する化学反応において重要な役割を担っている。また、酵素は種々の病気及び疾患に抗するという、重要な役割を担っていることも示されている。例えば、肝臓のカルボキシルエステラーゼは、ガンのプロドラッグに対するヒト腫瘍細胞の感作を助成することが報告されている。Danks等は、Rh30ヒト横紋筋肉腫細胞においてカルボキシルエステラーゼをコードするcDNAが安定して発現していると、CPT−11ガンプロドラッグに対する細胞の敏感度が8.1倍増加すると報告している。Cancer Res. (1998)58(1):20−22。著者は、このプロドラッグ/酵素複合体を、ガンシクロビル/単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼと5−フルオロシトシン/シトシンデアミナーゼの組合せを用いた研究下で現在なされているアプローチに類似した形で治療用に利用可能であると提案している。van Pelt等は、55kDのヒト肝臓カルボキシルエステラーゼが、培養中の主要なヒト肝細胞へのプラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)マラリアスポロゾイトの侵入を阻害することを示している。J Hepatol (1997)27(4):688−698。
また、カルボキシルエステラーゼは、薬剤、農薬及び他の生体異物の解毒に重要であることが見出されている。精製されたヒト肝臓カルボキシルエステラーゼは、コカインやヘロインを含む、種々の薬剤の代謝に関与していることが示されている。Prindelらは、コカイン及びヘロインの加水分解を触媒し、ヒト組織におけるこれらの薬剤の分解において重要な役割を担っている、広い基質特異性のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼのクローニング及び精製について記載している。J. Biol. Chem. (1997)6:272(23):14769−14775。Brzenzinskiらはカルボキシルエステラーゼにより代謝される環境エステル又は薬剤の同定に使用される分光光度競合阻害アッセイについて記載している。Drug Metab Dispos(1997)25(9):1089−1096。
カルボキシルエステラーゼによりなされる重要な生理学的役割に鑑みて、新規な未変性カルボキシルエステラーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。我々は、ここでPRO873と命名した、カルボキシルエステラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0049】
40.PRO940
CD33は、シアル酸タイプと末端近くの糖へのその結合の両方に対して異なる特異性を有するシアル酸依存性結合を媒介可能なタンパク質のシアロアドヘシン(sialoadhesin)ファミリーのメンバーである細胞表面タンパク質である。CD33は初期の脊髄及び幾つかの単球細胞系において特異的に発現しており、例えば急性非リンパ球性白血病(ANLL)を含む、種々の脊髄腫瘍と強く関連していることが示されてる。このように、CD33はタンパク質の高レベル発現に関連したガンの治療を潜在的な目的として提案されている。よって、CD33に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定にはかなりの関心がもたれている。事実、CD33相同体の一つ(CD33Lと命名)が既に同定され、記載されている(Takei等, Cytogenet. Cell Genet. 78:295−300(1997))。我々は、ここでPRO940と命名した、CD33に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。ここで記載された新規なポリペプチドは、デイホフ(Dayhoff)データベース(35.45版、Swiss Prot35)においてHSU71382 1及びHSU71383 1と称されるヒトOB結合性タンパク質に対して有意な相同性を示す。
【0050】
41.PRO941
カドヘリンは大きなファミリーの膜貫通タンパク質である。カドヘリンには、事実上、多細胞生物の全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介するように機能するカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーが含まれる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が同定され、特徴づけられている。幾つかの例外はあるが、カドヘリンの機能の中でも、カドヘリンが細胞凝集に関与しており、細胞−細胞接着部位に付随していることが知られている。最近、全てのカドヘリンが、細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられているカドヘリン特異的モチーフの多重反復を分かち持つが、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多様な構造、及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関連していることが報告されている。Suzuki, J. Cell. Biochem., 61(4):531−542(1996)。カドヘリンはさらに、Tanihara等, J. Cell Sci., 107(6):1697−1704(1994)、Aberle等, J. Cell. Biochem., 61(4):514−523(1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26(1994)にも記載されている。我々は、ここでPRO941と命名した、カドヘリンタンパク質に対して相同性を有する他の新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0051】
42.PRO944
クロストリジウム・パーフリンゲンス(Clostridium perfringens)エンテロトキシン(CPE)はC,パーフリンゲンスA型の食中毒の徴候の原因である毒性因子であると考えられており、また他のヒト及び獣医学的病気に関連している可能性もある(McClane, Toxicon. 34:1335−1343(1996))。CPEはクロストリジウム・パーフリンゲンスエンテロトキシンレセプター(CPE−R)と称される約50kDの細胞表面レセプタータンパク質に結合し、細胞表面上に約90,000kDの複合体を形成することにより、その有害な細胞機能を実行していく。CPE−Rタンパク質をコードするcDNAはヒト及びマウスの両方において同定され、特徴づけられている(Katahira等, J. Cell. Biol. 136:1239−1247(1997)及びKatahira等, J. Biol. Chem. 272:26652−26658(1997))。CPE毒素は哺乳類宿主の種々の病気の原因であることが報告されており、これらの病気はCPE−RにCPE毒素が結合することにより始まるので、新規なCPE−R相同体の同定にはかなりの関心がある。我々は、ここでPRO944と命名した、CPE−Rに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定及び特徴づけについてここに記載する。
【0052】
43.PRO983
膜結合タンパク質には細胞表面膜結合タンパク質だけでなく、細胞内小胞体の表面で見出されるタンパク質も含まれる。これらの小胞体は細胞血漿膜と分泌小胞体の融合であるエキソサイトーシスに関与し、2つの主たる機能を有する。一つは、細胞内空間への小胞体内容物の放出であり、第2は血漿膜自体への、新しいタンパク質及び脂質の取り込みである。エキソサイトーシスは構成的であるか調節されうる。全ての真核細胞は、形成後に分泌小胞体が直ちに融合されることで特徴づけられる構成的エキソサイトーシスを示す。これに対し、調節エキソサイトーシスは、小胞体結合膜タンパク質による適切なシグナルを受取次第、血漿膜と融合する分泌小胞体が蓄積する。通常、このシグナルは、サイトゾル中の遊離のCa2+濃度が増加することである。しかしなから、Ca2+と無関係である調節エキソサイトーシスが報告されている(例えば、Fujita−Yoshigaki等, J. Biol. Chem. (1996)31:271(22):13130−13134を参照)。調節エキソサイトーシスは、ニューロン(シナプス小胞体から神経伝達物質を放出)、副腎クロム親和性細胞(アドレナリン分泌)、膵腺房細胞(消化酵素分泌)、膵臓β細胞(インシュリン分泌)、マスト細胞(ヒスタミン分泌)、乳房細胞(乳タンパク質分泌)、精液(酵素分泌)、卵細胞(受精包膜の生成)及び含脂肪細胞(血漿膜へのグルコース輸送体の挿入)を含む多くの特殊化細胞にとって重要なものである。
エキソサイトーシスに関連した疾患が知られている。例えばマスト細胞から放出される炎症媒介物により、喘息を含む種々の疾患に至る。同様に、チェディアック−東症候群(CHS)は、好中球、単球及びリンパ球が巨大な細胞質顆粒を含有する、珍しい常染色体劣性病である。従って、エキソサイトーシスに関与するタンパク質には最大の関心があり、新規な小胞体結合タンパク質を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方においてなされている。例えば、Skehel等は、神経伝達物質のエキソサイトーシスに必要な、VAP−33と呼称される、アメフラシの33キロダルトンの膜タンパク質を同定した。Science(1995) 15:269(5230):1580−1583、及びNeuropharmacology (1995)34(11):1379−1385。多くの努力は、新規な小胞体結合膜タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。本発明の目的は、ここでPRO983と命名した、小胞体結合タンパク質、VAP−33に対して相同性を有するタンパク質を提供することである。
【0053】
44.PRO1057
プロテアーゼは哺乳類及び非哺乳類生物における多くの非常に重要な生物学的プロセスに関与している酵素タンパク質である。種々の異なる哺乳類及び非哺乳類生物からの数多くの異なるプロテアーゼ酵素が同定され、特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は生物学的プロセス、例えばタンパク質の消化、活性化、不活性化、又はペプチドホルモン活性度の変調、及びタンパク質及び酵素の物理学的特性の改変において、重要な役割を担っている。
プロテアーゼ酵素が担っている重要な生理学的役割に鑑みて、現在、新規な未変性プロテアーゼ相同体を同定するための努力が、産業界及び学術界の両方でなされている。これらの努力の多くは、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類の組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc. Natl. Acad. Sci., 93;7108−7113(1996);米国特許第5,536,637号を参照]。我々は、ここでPRO1057と命名した、種々のプロテアーゼ酵素に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定についてここに記載する。
【0054】
45.PRO1071
トロンボスポジン−1は、トロンビン刺激に応答して血小板α顆粒から放出され、発達しかつ修復している組織における細胞外マトリックスの一過性成分でもある三量体高分子量糖タンパク質である(Adams, Int.J.Biochem.Cell Biol. 29:861−865 (1997)及びQian等, Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 212:199−207 (1996))。種々の因子がトロンボスポジンの発現を調節し、タンパク質が細胞外と細胞内の双方の経路により分解する。トロンボスポジン−1は細胞接着分子として機能し、また細胞移行、細胞増殖、神経突起成長及び血管形成誘導を変調する。このように、トロンボスポジンに対して相同性を持つ新規なポリペプチドを同定することには相当の重要性がある。我々は、ここでPRO1071と命名した、トロンボスポジンと相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0055】
46.PRO1072
細胞のレドックス状態は細胞運命の重要な決定要因であるという研究が報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要であり、悪性腫瘍の発達に関与している。反応性酸素種の水への転化を触媒するレダクターゼのような抗酸化酵素のレベルは、ガン細胞では低いことが分かっている。特に、悪性前立腺上皮はそのような抗酸化酵素の発現を低下させた[Baker等, Prostate 32(4):229−233 (1997)]。この点に関して、レダクターゼが興味深い。また、転写因子、NF−κB及びAP−1は、レドックス状態によって調節され、エイズ、ガン、アテローム性動脈硬化症及び糖尿病合併症の原因に関与していると思われる非常に多種の遺伝子の発現に影響を及ぼすことが知られている。この主題事項を更に記述している刊行物には、Engman等, Anticancer Res. (Greece), 17:4599−4605 (1997), Kelsey等, Br.J.Cancer, 76(7):852−854 (1997); Friedrich及びWeiss, J.Theor.Biol., 187(4):529−40 (1997)及びPieulle等, J.Bacteriol., 179(18):5684−92 (1997)が含まれる。インビボでのレドックス反応の生理学的重要性が分かったので、現在はレドックス反応に関与する新規な未変性タンパク質を同定するための努力がなされている。我々は、ここでPRO1072と命名した、レダクターゼ酵素と配列類似性を有する新規なポリペプチドの同定をここに記載する。
【0056】
47.PRO1075
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。
ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組み換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに照準が合わされている。スクリーニング法と技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等,Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。我々は、ここでPRO1075と命名した、タンパクジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをここに記載する。
【0057】
48.PRO181
ショウジョウバエでは、極性卵房の背側−腹側極性が、卵母細胞の背側−腹側隅への卵母細胞核とグルケン(gurken)RNAの局在化に依存する。グルケンタンパク質は卵母細胞を取り囲んでいる卵胞体細胞に発現されるショウジョウバエEGFレセプター(トーピード(torpedo)/DER)に対するリガンドとしておそらく作用する(Roth等,Cell 81:967−978 (1995))。コルニコン(cornichon)、グルケン及びトーピードはまた後卵胞細胞の運命を確立し卵房の背側−腹側極性を特定する早期のシグナル伝達事象においても機能する。これらの遺伝子の何れか又は全てにおける突然変異により、腹側と後側の決定基バイコイド(bicoid)とオスカー(oskar)の適切な局在化と、卵母細胞の非対象な位置決めに対して必要とされる正しく極性化された微小管細胞骨格の形成が妨げられる。従って、コルニコン遺伝子産物が早期の発達において重要な役割を担っていることは明らかである。我々は、ここでPRO181と命名した、コルニコンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0058】
49.PRO195
新規な膜貫通タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでPRO195と命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0059】
50.PRO865
新規な分泌タンパク質を同定し特徴づけるための努力が現在なされている。我々は、ここでPRO865と命名した、新規な分泌ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0060】
51.PRO827
VLA−2は、マウスとヒトを含む多くの哺乳類生物において同定され特徴づけられた細胞表面インテグリンタンパク質である。VLA−2は、エコーウィルス−1(EV−1)によってVLA−2発現細胞の感染を媒介するEV−1に対する細胞の表面上のレセプターであることが分かった(Zhang等, Virology 235(2):293−301 (1997)及びBergelson等, Science 255:1718−1720 (1992))。VLA−2はまたインビトロ血管形成の間の内皮とのコラーゲンの相互作用を媒介することも分かった(Jackson等, Cell Biol.Int. 18(9):859−867 (1994))。VLA−2と様々な度合いのアミノ酸配列相同性を分かち持つ様々な他のインテグリンタンパク質が様々な哺乳類生物において同定され特徴づけられた。これらのインテグリンは様々な異なった生理学的機能において重要な役割を果たしていることが報告された。それ故に、一又は複数のインテグリンタンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定することには顕著な興味がある。我々は、ここでPRO827と命名した、VLA−2インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0061】
52. PRO1114
多くの重要なサイトカインタンパク質が同定され特徴づけられ、特異的細胞表面レセプター複合体を介してシグナル伝達をなうことが示された。例えば、クラスIIサイトカインレセプターファミリー(CRF2)はインターフェロンレセプター、インターロイキン−10レセプター及び組織因子CRFB4を含む(Spencer等,J.Exp.Med. 187:571−578 (1998) 及びKotenko等, EMBO J. 16:5894−5903 (1997))。従って、様々なサイトカインタンパク質が示す多数の生物学的活性は標的細胞の表面上のサイトカインレセプタータンパク質の存在に全面的に依存する。それ故に、一又は複数のサイトカインレセプターファミリーに対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることに顕著な興味がある。我々は、ここでPRO1117と命名した、サイトカインレセプターファミリー−4タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
インターフェロン(IFNs)は脊椎動物において生じる多くのファミリーの分泌タンパク質を包含する。インターフェロンはその抗ウィルス活性によって本来は命名されたが、増大する証拠は細胞増殖と分化におけるIFNsの重要な役割を裏付けている(Jaramillo等, Cancer Investigation 13(3):327−338 (1995))。IFNsは正常なものと形質転換した表現型の双方を持つ広範な細胞の成長を阻害する能力を有する負の成長因子のクラスに属する。IFN療法はカポジ肉腫、慢性骨髄性白血病、非ホジキンリンパ腫、及びヘアリー細胞白血病のようなヒトの悪性腫瘍の治療並びにB型肝炎のような感染症の治療に役立つことが分かった(Gamliel等, Scanning Microscopy 2(1):485−492 (1988), Einhorn等, Med.Oncol. & Tumor Pharmacother. 10:25−29 (1993), Ringenberg等, Missouri Medicine 85(1):21−26 (1988), Saracco等, Journal of Gastroenterology and Hepatology 10:668−673 (1995), Gonzalez−Mateos等, Hepato−Gastroenterology 42:893−899 (1995)及びMalaguarnera等, Pharmacotherapy 17(5):998−1005 (1997))。
【0062】
インターフェロンはその一次配列に基づいて二つの主要なグループに分類することができる。I型インターフェロン、IFN−α及びIFN−βは、IFN−α遺伝子ファミリーからなるイントロンのない遺伝子のスーパーファミリーと共通の祖先遺伝子から生じたと思われる単一のIFN−β遺伝子によりコードされている。I型インターフェロンは殆どの細胞型により生産されうる。II型IFN、又はIFN−γは、リンパ球(T細胞及びナチュラルキラー細胞)に限定され、非特異的T細胞アクチベータ又は特異的抗原によりインビボで刺激される。
I型及びII型IFNsの双方が類似の抗ウィルス及び抗増殖効果をつくりだすけれども、それらは別個の細胞表面レセプターに作用し、結合は一般に種特異的である(Langer等, Immunol. Today 9:393−400 (1988))。IFN−α及びIFN−βの両方とも同一の高親和性型Iレセプターに競合的に結合する一方、IFN−γは別のII型レセプターに結合する。IFNタンパク質の効果が細胞表面インターフェロンレセプターへの結合を介して媒介されることは明らかであるが、細胞表面上のIFNレセプターの存在と数は、IFNへの細胞の感度を一般には反映しない。このように、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけは極めて興味深い。
我々は、ここで「PRO1114インターフェロンレセプター」と命名した、新規なインターフェロンレセプタータンパク質の同定と特徴づけをここに記載する。従って、本発明のPRO1114ポリペプチドは新規な細胞表面インターフェロンレセプターを表す。
【0063】
53. PRO237
カルボニックアンヒドラーゼは、二酸化炭素と水から(及びそれらへの)炭酸の合成(及び脱水)を触媒することにより哺乳類の血液系における二酸化炭素の輸送と放出を助ける酵素タンパク質である。従って、カルボニックアンヒドラーゼの作用は哺乳類における様々な重要な生理的反応に対して不可欠である。このように、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけは顕著な興味がある。我々は、ここでPRO237と命名した、カルボニックアンヒドラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0064】
54. PRO541
数多くのトリプシンインヒビタータンパク質が同定され特徴づけされている(例えばYamakawa等, Biochim.Biophys.Acta 1395:202−208 (1998)及びMizuki等, Mammalian Genome 3:274−280 (1992)を参照されたい)。トリプシンインヒビタータンパク質は、様々な異なった生理学的及び生物学的経路において重要な役割を果たしており、特にタンパク質の分解、消化等々の調節のようなプロセスに関与している。このような酵素タンパク質により果たされる重要な役割が分かると、既知のトリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドを同定し特徴づけることには顕著な興味がある。我々は、ここでPRO541と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質に対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0065】
55. PRO273
白血球は単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球を含み、免疫応答に重要な役割を果たしている。これら細胞はT及び/又はBリンパ球により開始される機構において重要であり、他の炎症性細胞を補充し活性化させ組織破壊に寄与するある範囲のサイトカインを分泌する。
従って、白血球がその適切な目的地まで移動し他の細胞と相互作用する調節プロセスの研究は重要である。現在、白血球は血管壁の内皮細胞に沿って転がることにより損傷を受けたあるいは炎症を起こした組織まで移動すると考えられている。この移動は、セレクチンとそのリガンドの間の一過性の相互作用により媒介される。この血液から漏出と管外遊出工程は、またインテグリンとそのリガンドにより媒介される、より安定した白血球−内皮細胞相互作用を促進する細胞活性化を含む。
ケモカインは構造的に関連したポリペプチドサイトカインの大きなファミリーである。これらの分子は白血球の動きを刺激し、異なった炎症状況における白血球の情報交換を説明する。ケモシネシスは内皮細胞上で特定の接着分子の発現を媒介し、それらが特定の細胞型を活性化する化学誘因物質をつくりだす。また、ケモカインは特定の細胞型の増殖を刺激し活性化を調節する。これらの活動の双方において、ケモカインは高度の標的細胞特異性を証明する。
ケモカインファミリーは、二つのアミノ末端システイン残基がが直ぐに隣接しているか(C−C)、1つのアミノ酸によって分離しているか(C−X−C)に従って二つのサブファミリーに分割される。C−X−Cファミリーのケモカインは一般に好中球と線維芽細胞を活性化させる一方、C−Cケモカインは単球/マクロファージ、好塩基球、好酸球及びTリンパ球を含むより広範なグループ標的細胞に作用する。両方のサブファミリーの既知のケモカインは、Thomson A. (1994) The Cytokine Handbook, 2nd Ed. Academic Press, N.Y.においてレビューされているように、多くの多様な細胞型により合成される。ケモカインはまたSchall TJ (1994) Cehmotactic Cytokines: Targets for Therapeutic Development. International Business Communications, Southborough Mass. pp180−270;及びPaul WE (1993) Fundamental Immunology, 3rd Ed. Raven Press, N.Y. pp822−826においてレビューされている。
【0066】
C−X−Cサブファミリーの既知のケモカインには、マクロファージ炎症タンパクα及びβ(MIP−1及びMIP−2)、インターロイキン−8(IL−8)、及び成長調節タンパク質(GRO−α及びβ)が含まれる。
MIP−2はとして最初はリポ多糖類(LPS)での刺激時にマウスマクロファージ細胞株RAW264.7により分泌される6kDaのヘパリン結合タンパク質として同定された。MIP−2はケモカインのC−X−C(又はCXC)サブファミリーのメンバーである。マウスMIP−2はヒト好中球に対して化学走化性であり、マウスの足の裏に注射した場合、局所的好中球浸潤を誘発する。ラットMIP−2はマウスMIP−2に対して86%のアミノ酸相同性を示し、ラット好中球に対して化学走化性であるが、ラット肺胞マクロファージ又はヒト末梢血好酸球又はリンパ球の遊走を刺激しない。また、MIP−2はラット肺胞内皮細胞の増殖を刺激するが線維芽細胞の増殖は刺激しないことが分かっている。
炎症を生じた又は羅患した組織における異常の診断に対する現在の技術は、臨床的徴候の観察又はホルモン、ポリペプチド又は様々な代謝物に対する体の組織又は流体の血清学的な検査に主に依存している。問題はこれらの診断法にある。第1に、患者は疾患の初期段階では臨床的徴候を表さないであろう。第2に、血清学的試験は浸潤性疾患と遺伝的シンドローム間を必ずしも区別しない。従って、発現されたケモカインの同定は、新規な診断法、効果的な治療法の開発、及び分病原性の理解の助けとしてに重要である。
今日まで、ケモカインは少なくとも次の症状:乾癬、炎症性腸疾患、腎疾患、関節炎、免疫媒介脱毛症、脳卒中、脳炎、MS、肝炎、及びその他に関与していた。また、非ELR含有ケモカインは血管形成誘導の阻害に関与しており、よって、これらのケモカインが腫瘍血管新生及び腫瘍形成においてある役割を有していることを示している。
従って、サイトカイン誘導好中球化学誘引物質、MIP−1、MIP−2、及びその他の関連タンパク質と配列同一性及び類似性を有するポリペプチド及びこれをコードする核酸を同定することが本発明の目的である。
【0067】
56.PRO701
βニューレキシン及びニューロリギンはニューロン細胞表面上に示される原形質膜タンパク質である。ニューロロゴン1は、Ichtchenko等,Cell,81(3):435−443 (1995)に記載されているように、シナプス原形質膜に濃縮されており、βニューレキシンに対するスプライス部位特異的リガンドとして作用する。ニューロリギンの細胞外配列はアセチルコリンエステラーゼに相同の触媒的に不活性なエステラーゼ領域からなる。ニューロリギン2及び3はニューロリギン1に構造と配列が類似している。全てのニューロリギンは切断シグナルペプチドに大きなエステラーゼ相同領域、高度に保存された単一の膜貫通領域、及び短い細胞質領域が続く特徴を持つN末端疎水性配列を含む。3種のニューロリギンは同一の位置で選択的スプライシングを受け、脳においてのみ高レベルで発現される。βニューレキシンに対する3種のニューロリギンの密着結合はスプライス部位4に挿入断片を欠くβニューレキシンに対してのみ観察される。従って、ニューロリギンは、ニューロン間の認識プロセスを媒介する点でオーバーラップする機能を有する異なったアイソフォームを持つ脳特異的タンパク質の多重遺伝子族を構成する。Ichtchenko等, J.Biol.Chem., 271(5):2676−2682 (1996)を参照されたい。更に、ニューレキシンとニューロリギンは、βニューレキシンの選択的スプライシングによって調節されるCa2+依存性反応において接着分子として機能することが報告されている。Nguyen及びSudhof, J.Biol.Chem., 272(41):26032−26039 (1997)を参照されたい。
上述のことが分かると、膜結合タンパク質は興味深い。より一般的には、膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持に重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例には線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0068】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合レセプタータンパク質、特にニューロリギン1、2及び3と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力の結果はここに提供される。
【0069】
57. PRO704
VIP36はゴルジ体と細胞表面に局在化し、糖タンパク質、糖脂質、又は双方の情報交換に関与しているかも知れない動物分泌経路中のマメ科植物レクチン相同体のファミリーに属している。VIP36は、スフィンゴ糖脂質及び/又はグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーの糖残基に結合し、細胞質蛋白分離機及び糖脂質ラフトの細胞外/管腔面間の関連性を提供するかもしれない。更にVIP36に関して、細胞質膜とゴルジの間をサイクルするその能力を付与するすると更に内部移行コンセンサス配列に一致するシグナルがそのC末端にあると信じられている。Fiedler等, EMBO J., 13(7):1729−1740 (1994); Fiedler及びSimons, J.Cell Sci., 109(1):271−276 (1996); Itin等, MBO J., 14(10):2250−2256 (1995)を参照されたい。VIP36はヒトGP36bタンパク質と同じかこれに非常に密接に関連していると信じられている。VIP36及び/又はGP36bは興味深い。
更に一般的には、小胞、細胞質、細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質において、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0070】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の小胞、細胞質、分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にVIP36と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0071】
58. PRO706
酸性ホスファターゼタンパク質は、酸性pH条件下で末端リン酸基を脱リン酸化する分泌タンパク質である。酸性ホスファターゼはRHGXRXPアミノ酸配列を含み、これは機構的に重要であると予想されている。酸性ホスファターゼはヒトの疾患の診断と治療において重要な機能を有しうる。例えば、前立腺酸性ホスファターゼは前立腺組織およっび前立腺ガンに独特に発現される分泌タンパク質である。前立腺酸性ホスファターゼのレベルは、Lankford等, Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 38(2):327−333 (1997)に記載されているように、放射線療法で治療された前立腺ガン患者における局所的及び生化学的制御に対する潜在的な予後因子である。研究によれば、前立腺酸性ホスファターゼに対する細胞免疫応答が破壊的自己免疫前立腺炎を媒介し、前立腺酸性ホスファターゼの異種型が前立腺ガンの免疫療法に有用であることが示唆されている。Fong等, J.Immunol. 169(7):3113−3117 (1997)を参照されたい。精液前立腺酸性ホスファターゼレベルは、35を越えた個人において非常に低い精子レベル(精子過小症)と有意に相関している。Singh等, Singapore Med.J. 37(6):598−599 (1996)を参照。従って、前立腺酸性ホスファターゼは様々なヒトの疾患に関与しており、これらの疾患の診断と治療において重要な機能を有している。一連のアミノベンジルリン酸化合物は、Beers等, Bioorg.Med.Chem. 4(10):1693−1701 (1996)に記載されているように、前立腺酸性ホスファターゼの非常に有力なインヒビターである。
更に一般的には、細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性タンパク質、特に前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と配列同一性を有するもの、及びある場合には胎性心臓に見出されるDNAと同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0072】
59.PRO707
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。更に、カドヘリンスーパーファミリーの幾つかのメンバーは一般に伝達を含む細胞−細胞相互作用プロセスに関与している。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。
更に一般的には、膜結合タンパク質を含む、全ての新規なタンパク質は興味深い。膜結合タンパク質とレセプターは多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にカドヘリンと同一性を有する膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0073】
60.PRO322
プロテアーゼは、哺乳類及び非哺乳類生物における多数の非常に重要な生物学的プロセスに関与する酵素タンパク質である。様々なセリン含有タンパク質に対して特異的活性を示すセリンプロテアーゼを含む、様々な異なった哺乳類及び非哺乳類生物からの無数の異なったプロテアーゼ酵素が同定されかつ特徴づけられている。哺乳類のプロテアーゼ酵素は、例えばタンパク質消化、ペプチドホルモン活性の活性化、不活性化、又は変調、及びタンパク質と酵素の物理的性質の変更のような生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。
ニューロプシンは、mRNAが中枢神経系に発現される新規なセリンプロテアーゼである。マウスニューロプシンはクローニングされ、海馬可塑性に慣用することが研究から分かっている。ニューロプシンはまた細胞外マトリックスの改変と細胞遊走に付随していることが示されている。一般的には、Chen等, Neurosci., 7(2):5088−5097 (1995)及びChen等, J.Histochem.Cytochem., 46:313−320 (1998)を参照されたい。
新規な未変性の膜結合又は分泌タンパク質、特にニューロプシン、セリンプロテアーゼ、ニューロシン及びトリプシノーゲンと相同性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0074】
61.PRO526
タンパク質−タンパク質相互作用はレセプター及び抗原複合体及びシグナル伝達機構に関連するものを含む。タンパク質−タンパク質相互作用の基となる構造的及び機能的機構についてよく知られているように、タンパク質−タンパク質相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用の特定の結果を調節するように更に容易に操作することができる。従って、タンパク質−タンパク質相互作用の基となる機構は科学及び医学界にとって興味深い。
ロイシンリッチ反復を含む全てのタンパク質はタンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている。ロイシンリッチ反復は多様な機能を持つ多くのタンパク質と細胞位置に存在する短い配列モチーフである。リボ核酸インヒビタータンパク質の結晶構造から、ロイシンリッチ反復はβ−α構造単位に対応することが明らかになった。これらの単位は、一面が溶媒に暴露された平行なβシートを形成するように配置され、タンパク質は珍しい非球状の形状を獲得する。これらの二つの特徴はロイシンリッチ反復を含むタンパク質のタンパク質結合機能の原因であることが示されている。Kobe及びDeisenhofer, Trends Biochem.Sci., 19(10):415−421 (Oct.1994)を参照されたい。
個体発生の間にコラーゲン原線維を配向し指令する組織オーガナイザーとなり、創傷治癒、組織修復、及び腫瘍ストローマ形成のような病理プロセスに関与するロイシンリッチプロテオグリカンについて研究が報告されている。Iozzo,R.V., Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol., 32(2):141−174 (1997)。創傷治癒、組織修復におけるロイシンリッチタンパク質の関与を示す研究は、De La Salle, C.等, Vouv.Rev.Fr.Hematol. (Germany),37(4):215−222 (1995)であり、出血疾患ベルナール−スーリエ症候群に伴う複合体におけるロイシンリッチモチーフの突然変異を報告しており、Chlemetson,K.J., Thromb.Haemost. (Germany),74(1):111−116 (July 1995)は、血小板がロイシンリッチ反復を有していることを報告しており、La Jolla Cancer Research FoundationのRuoslahti, E.I.等の国際公開第9110727−Aは、トランスフォーミング成長因子βに結合するデコリンがガンの治療、創傷治癒及び瘢痕化に関与していることを報告している。結合組織、皮膚及び骨のような組織の再成長に関連する創傷治癒及び付随する治療法において;ヒトと動物における体成長を促進することで;及び他の成長関連プロセスを刺激する点で有用であることにおいて、この群のタンパク質に機能が関連しているのはインスリン様成長因子(IGF)である。IGFの酸不安定サブユニット(ALS)はまたIGFの半減期を増大させインビボのIGF複合体の一部である点で興味深い。ALSはLeong及びBaxter, Mol.Endocrinol., 6(6):870−876 (1992); Baxter, J.Biol.Chem., 264(20):11843−11848 (1989);及びKhosravi等, J.Clin.Endocrinol.Metab., 82(12):3944−3951 (1997)に更に記載されている。
【0075】
ロイシンリッチ反復を有することが報告されている他のタンパク質は、アルツハイマー病のような神経変性疾患、パーキンソン病のような神経損傷の治療において、及びガンの診断に対して有用であることが報告されているSLITタンパク質である。エール大学のArtavanistsakonas,S.及びRothberg,J.M.の国際公開第9210518−A1を参照。また興味深いのはLIG−1、すなわちマウス脳のグリア細胞中に特異的に発現され、ロイシンリッチ反復及び免疫グロブリン様ドメインを有する膜糖タンパク質である。Suzuki等,J.Biol.Chem.(U.S.),271(37):22522 (1996)。ロイシンリッチ反復を有するタンパク質の生物学的機能を報告している他の研究には:Tayar,N.等, Mol.Cell Endocrinol., (Ireland), 125(1−2):65−70 (Dec.1996)(ゴナドトロピンレセプター関連);Miura,Y.等,Nippon Rinsho (Japan), 54(7):1784−1789 (July 1996)(アポトーシス関連);Harris,P.C.等, J.Am.Soc.Nephrol., 6(4):1125−1133 (Oct.1995)(腎疾患関連)が含まれる。
タンパク質−タンパク質相互作用をよりよく理解するためにロイシンリッチ反復を有する新規なタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。特に興味深いものは、ALSのようなロイシンリッチ反復を有する既知のタンパク質と同一性又は類似性を有するタンパク質である。多くの努力が、ロイシンリッチ反復を有する新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0076】
62.PRO531
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)、Aberle等, J.Cell Biochem., 61(4):514−523 (1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Sano等,EMBO J., 12(6):2249−2256 (1993)を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン3(Pcdh3又はpc3とも称される)が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とPcdh3の更なる特徴についてはSago等, Genomics, 29(3):631−640 (1995)を参照されたい。
【0077】
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、特に3及び4と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【0078】
63.PRO534
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47:28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);及びDesilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、また興味深いものは、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターである。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0079】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってから、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素の重要性と多くの異なった応用、例えば組換え的に産生されたタンパク質の正しいリフォールディングの収量を増大させる際の、その潜在的な用途が分かったので、現在は産業界と学術研究機関の双方により、タンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性を有する新規で未変性のタンパク質を同定するための努力がなされている。これらの努力の多くは、新規なジスルフィドイソメラーゼ相同体に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチド及びこれをコードする核酸をここに記載する。
【0080】
64.PRO697
分泌フリズルド(frizzled)関連タンパク質(sFRPs)は膜貫通レセプターのフリズルド(frizzled)ファミリーである。sFRPsはおよそ30kDaの大きさで、それぞれ推定シグナル配列、フリズルド(frizzled)様システインリッチドメイン及び保存された親水性カルボキシ末端ドメインを含む。sFRPsはWntシグナル伝達を変調するように機能し、又はある種のレセプターに対するリガンドとして機能することが報告されている。Rattner等, PNAS USA, 94(7):2859−2863 (1997)。従って、sFRPs及びsFRPsと配列同一性及び/又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
興味深い他の分泌タンパク質は分泌アポトーシス関連タンパク質(SARPs)のファミリーの任意のメンバーである。SARPsの発現はβカテニンの細胞内レベルを変え、SARPsがWnt−フィルズルド(frizzled)タンパク質シグナル伝達経路に緩衝することを示唆している。Melkonyan等,PNAS USA, 94(25):13636−13641 (1997)。従って、SARPs及びSARPsと配列同一性及び/又は類似性を有するタンパク質は興味深い。
sFRPs及びSARPsに加えて、多くの細胞外タンパク質は興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にsFRP−2とSARP−1と配列同一性及び/又は類似性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0081】
65.PRO717
新規な膜貫通レセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【0082】
66.PRO731
カドヘリンは膜貫通タンパク質の大きなファミリーである。カドヘリンは、多細胞生物の実質的に全ての固体組織において細胞−細胞接着を媒介する機能をするカルシウム依存性糖タンパク質のファミリーからなる。少なくともカドヘリン1−13並びにB、E、EP、M、N、P及びR型が特徴づけられている。カドヘリンについて知られている機能のなかで、ある例外をもって、カドヘリンは細胞凝集に関与し、細胞−細胞接着部位に付随する。最近になって、全てのカドヘリンが細胞外ドメインの折り畳みに対応すると考えられるカドヘリン特異的モチーフ複数の反復を分かち持つ一方、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーは多岐にわたる構造及びおそらくは機能を有していることが報告されている。特に、カドヘリンスーパーファミリーのメンバーはシグナル伝達に関与していることが報告されている。Suzuki, J.Cell Biochem., 61(4):531−542 (1996)を参照されたい。カドヘリンは更にTanihara等, J.Cell Sci., 107(6):1697−1704 (1994)、Aberle等, J.Cell Biochem., 61(4):514−523 (1996)及びTanihara等, Cell Adhes. Commun., 2(1):15−26 (1994)に記載されている。
プロトカドヘリンは脳内に高度に発現されるカドヘリンスーパーファミリーのメンバーである。ある研究では、プロトカドヘリンは細胞接着活性を示した。Sano等,EMBO J., 12(6):2249−2256 (1993)を参照されたい。しかしながら、研究では、ある種のプロトカドヘリン、例えばプロトカドヘリン3(Pcdh3又はpc3とも称される)が強いカルシウム依存性凝集活性を示さないことも示されている。この研究とPcdh3の更なる特徴についてはSago等, Genomics, 29(3):631−640 (1995)を参照されたい。
従って、カドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーは興味深い。より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが興味深い。このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0083】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性の膜結合タンパク質、特にプロトカドヘリン、とりわけ4、68、43、42、3及び5と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な膜結合タンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。ここに提供するものはかかる努力の結果である。
【0084】
67.PRO218
新規な未変性の膜結合タンパク質、特に膜調節タンパク質と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
【0085】
68.PRO768
インテグリンは細胞接着を促進する細胞表面糖タンパク質レセプターのスーパーファミリーからなる。各細胞はその細胞接着能力を形成する数多くのレセプターを有している。インテグリンは細胞と他の細胞又はマトリックス成分との間の広範な相互作用に関与する。インテグリンは免疫系細胞の移動と機能の調節において特に重要である。血小板IIb/IIIAインテグリン複合体は血小板凝集の調節において特に重要である。インテグリンファミリーのメンバーであるインテグリンβ−6は、上皮細胞上に発現され上皮炎症を変調する。他のインテグリンである白血球随伴抗原−1(LFA−1)は免疫応答の間のリンパ球の接着において重要である。
特に重要なものは、Song等, J.Cell Biol., 117(3):643−657 (1992)に記載されているように筋形成の間に発生的に調節されるインテグリンα鎖であるH36−α7である。ラミニン結合α7β1インテグリンの発現パターンは骨格、心及び平滑筋において発生的に調節される。Ziober等, Mol.Biol.Cell, 8(9):1723−1734 (1997)。α7−X1/X2インテグリンの発現は、細胞特異的な形でレセプターアフィニティ状態を調節し、筋肉の発達と修復の間のインテグリン依存性事象を変調しうる新規な機構であることが報告されている。上掲。ラミニンがα7インテグリンレセプターを介して骨格筋芽細胞の歩行運動を促進することが更に報告されている。特に、α7β1レセプターは限られた数のラミニンアイソフォームに対する筋芽細胞の接性着と運動性を促進し、再生と分化の間における筋原先駆体補充において重要であることが報告されている。Yao等, J.Cell Sci., 109(13):3139−3150 (1996)。インテグリンα7のスプライシングされた変異体もまたLeung等, Biochem.Biophys.Res.Commun., 243(1):317−325 (1998)及びFornaroとLanguino, Matrix Biol., 16(4):185−193 (1997)に記載されている。更に、インテグリンα7が無いと、ある形の筋ジストロフィーを引き起こすことが報告されている。従って、インテグリン、特にインテグリン7と関連分子に関するものは興味深い。
【0086】
インテグリンに対する興味に加えて、より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、このようなタンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるために興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力、特にインテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドを同定するために注がれたものをここに記載する。
【0087】
69.PRO771
テスチカン(testican)は、限定されるものではないが神経筋組織、脳及び生殖組織を含む数多くの組織において発現される多領域精巣プロテオグリカンである。テスチカンは、細胞形、接着、遊走及び増殖のような細胞社会的挙動の修飾因子に似ている。[Bonnet,F.等,J.Biol.Chem., 271(8):4373 (1996), Perin,J.P.等,EXS (Switzerland), 70:191 (1994), Alliel,P.M.等,Eur.J.Biochem., 214(1):346 (1993), Charbonnier,F.等, C.R.Seances Soc.Biol.Fil. (France), 191(1):127 (1997)]。とりわけ、テスチカンはニューロンプロセスに関係し、結合組織の成長に関連しているので、テスチカンと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質が興味深い。細胞外タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果、特にテスチカンと同一性及び/又は類似性を有する分子を同定するために注がれたものは興味深い。
【0088】
70.PRO733
T1/ST2は、細胞シグナル伝達に関与していると信じられている、I型インターロイキン−1レセプターに相同なレセプター様分子である。T1/ST2レセプター及び/又は推定リガンドは更に、Gayle等, J.Biol.Chem., 271(10):5784−5789 (1996), Kumar等, J.Biol.Chem., 270(46):27905−27913 (1995)及びMitcham等, J.Biol.Chem., 271(10):5777−5783 (1996)に記載されている。これらのタンパク質及びそれに関連するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターは、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
産業界と学術研究機関の双方により、新規な未変性のレセプタータンパク質を同定するための努力がなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質に対するコード配列を同定するための哺乳動物組み換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。このような努力の結果をここに提供する。
【0089】
71.PRO162
膵臓随伴タンパク質(PAP)は急性膵炎の間に膵臓から過剰発現される分泌タンパク質である。血清PAP濃度は急性膵炎の患者において異常に高いことが分かっている。Pezzilli等, Am.J.Gastroenterol., 92(10):1887−1890 (1997)。
PAPは膵臓炎症のために膵臓により合成され、膵臓の損傷に対する良好な血清マーカーであることが示されている。また、血清PAPレベルはクレアチニンクリアランス測定値と強く相関していると思われる。膵臓−腎臓移植の患者では、PAPは膵臓移植片拒絶の有用な生物学的かつ組織学的マーカーであることが証明されている。Van der Pijl等, Transplantation, 63(7):995−1003 (1997)。更に、PAPは、嚢胞性線維症について新生児をスクリーニングする際に有用であることが分かっている。実際、PAPは現在の免疫反応性トリプシス(trypsis)検査法よりも良好な特異性をもって嚢胞性線維症を判別する。Iovanna等, C.R.Acad.Aci.III, 317(6):561−564。
PAPのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0090】
72. PRO788
抗悪性腫瘍尿タンパク(ANUP)は、マウス又はハムスター由来の幾つかの正常な二倍体細胞株又は腫瘍細胞の増殖に影響を及ぼさないでヒトの腫瘍細胞株に対して抗増殖活性を示すヒトの尿の画分中に存在する主要なタンパク質として同定された。Sloane等,Biochem.J., 234(2):355−362 (1986)。
ANUPはヒトの顆粒球に見出される独特のサイトカインである。N末端アミノ酸配列は独特であることが分かっている。4位と7位にCysを持つ最初の9残基に対応する合成ペプチドは、インビトロの抗腫瘍剤であることが見出されている。RidgeとSloane, Cytokine, 8(1):1−5 (1996)。
ANUPのような分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。
【0091】
73.PRO1008
Dickkopf−1(dkk−1)は分泌タンパク質のファミリーのメンバーであり、頭部誘導において機能する。Dkk−1は両生類胎仔におけるシュペーマン形成体の誘導物質である。Glinka等, Nature, 391(6665):357−362 (1998)。Dkk−1はWntシグナル伝達の有力なアンタゴニストであり、dkk遺伝子が分泌Wntインヒビターのファミリーをコードしていることを示唆している。従って、dkk−1ファミリーメンバーと関連分子は興味深い。
より一般的には、全ての細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たすので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にdkk−1に関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein.,等Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。dkk−1に関連した分子を同定するためのかかる努力の結果をここに提供する。
【0092】
74.PRO1012
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47:28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);及びDesilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定は、これらが多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうるので、興味深い。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、通常は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0093】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
特に興味深いものは、小胞体(ER)保持シグナルを有する細胞タンパク質である。これらのタンパク質は細胞に保持され、タンパク質生産において小胞体と密接に機能する。かかるタンパク質は過去に記載されている。すなわち、ShorroshとDixon, Plant J., 2(1):51−58 (1992)を参照されたい。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にER保持シグナルを有する細胞タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力、特にタンパクジスルフィドイソメラーゼに対して配列同一性及び類似性を有する、新規なポリペプチドとこれをコードする核酸の同定の結果がここに提供される。
【0094】
75.PRO1014
酸素フリーラジカルと酸化防止剤は脳虚血及び再灌流後における中枢神経系に重要な役割を果たしていると思われる。更に、虚血及び再灌流に関連した心臓損傷がフリーラジカルの作用によって引き起こされることが報告されている。また、細胞のレドックス状態は細胞運命の中心的な決定要因であることが研究により報告されている。更に、反応性酸素種が、細胞毒性であり、組織壊死、臓器不全、アテローム性動脈硬化症、不妊症、出生欠損、早老、突然変異、悪性腫瘍を含む、炎症性疾患を引き起こすことが報告されている。しかして、酸化と還元の制御は、脳卒中、心臓発作、酸化ストレス、高血圧症の制御と防止を含む多くの理由から重要である。この点において、レダクターゼ、特にオキシドレダクターゼは興味深い。この主題事項を更に記述している刊行物には、Kelsey等, Br.J.Cancer, 76(7):852−854 (1997); FriedrichとWeiss, J.Theor.Biol., 187(4):529−40 (1997)及びPieulle等, J.Bacteriol., 179(18):5684−92 (1997)が含まれる。
特にレダクターゼに加えて、新規なポリペプチドは一般に興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。新規な未変性の分泌タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。このような努力、特にレダクターゼに対して配列同一性を有するポリペプチド、及びこれをコードする核酸を同定するものの結果がここに提供される。
【0095】
76.PRO1017
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。スルホトランスフェラーゼは、硫酸ドナーからアクセプター基質へ硫酸塩を転移させる酵素、特に末端グルクロン酸を含むものである。HNK−1カルボヒドラーゼエピトープは幾つかの神経接着糖タンパク及び糖脂質上に発現され、細胞相互作用に関与している。グルクロニルトランスフェラーゼ及びスルホトランスフェラーゼは、構造の残りが複合糖質においてしばしば生じるので、このエピトープの生合成におけるキーの酵素と考えられる。HNK−1スルホトランスフェラーゼは更にBakker,H.等,J.Biol.Chem., 272(47):29942−29946 (1997)に記載されている。
HNK−1スルホトランスフェラーゼ及びそれに関連する新規なタンパク質に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0096】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特にHNK−1と配列同一性を有するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0097】
77.PRO474
酵素タンパク質は食物の消化に関連する化学反応、巨大分子の生合成、化学エネルギーの徐放と利用、及び生命を維持するために必要な他のプロセスにおいて重要な役割を果たしている。グルコースデヒドロゲナーゼは、グルコースのグルコン酸への酸化において機能して代謝的に有用なエネルギーを産生する。PQQ関連グルコースデヒドロゲナーゼの異なった生物における調節はNeijssel等, Antonie Van Leeuwenhoek, 56(1):51−61 (1989)において概説されている。グルコースデヒドロゲナーゼは、エネルギーストレスの条件下において最大に合成されるので、補助エネルギー発生機構として機能している。グルコースデヒドロゲナーゼに関連した分子に加えて、全ての新規なタンパク質が興味深い。細胞外及び膜結合タンパク質は多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、普通は膜結合レセプタータンパク質における、細胞外環境のその作用部位に到達する。
【0098】
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。実際、血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンは、レセプター−リガンド相互作用を阻止する治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質はまた関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的ペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに対して使用することもできる。そのような膜結合タンパク質と細胞レセプターには、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホフファターゼ、細胞−細胞相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子が含まれる。細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
新規な未変性の分泌及び膜結合レセプタータンパク質、特に細胞タンパク質及びデヒドロゲナーゼ又はオキシドレダクターゼに関連するものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌及び膜結合レセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0099】
78.PRO1031
サイトカインインターロイキン17(IL−17)は上皮、内皮、及び線維芽細胞を刺激し、IL−6、IL−8のようなサイトカイン、及び顆粒球コロニー刺激因子、並びにプロスタグランジンE2を分泌することが報告されている。更に、IL−17の存在下で培養したとき線維芽細胞が好中球へのCD34+優先成熟の増殖を維持しうることが示されている。しかして、IL−17はT細胞依存性炎症反応の初期イニシエーター及び/又は免疫系を造血へ橋渡しするサイトカインネットワークの要素を構成していることが示唆されている。Yao等, J.Immunol., 155(12):5483−5486 (1995); Fossiez等, J.Exp.Med., 183(6):2593−2603 (1996); Kennedy等, J.Interferon Cytokine Res., 16(8):611−617 (1996)を参照されたい。従って、IL−1に関連したタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての新規なポリペプチドが興味深い。細胞外タンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たす。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は通常は細胞分泌経路を通過して、細胞外環境のその作用部位に到達する。
分泌タンパク質は、製薬、診断、バイオセンサー及びバイオリアクターのような用途を含む様々な産業上の利用性を有している。血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及び様々な他のサイトカインのような、現在入手できる大抵のタンパク質薬物は分泌タンパク質である。そのレセプターは、膜結合タンパク質であるが、治療又は診断薬剤としてまた可能性を有している。
新規な未変性の分泌タンパク質、特にIL−17に関連したものを同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規な分泌タンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。スクリーニング方法及び技術の例は文献に記載されている[例えば、Klein等, Proc.Natl.Acad.Sci., 93:7108−7113 (1996);米国特許第5,536,637号を参照されたい]。かかる努力の結果がここに提供される。
【0100】
79.PRO938
タンパクジスルフィドイソメラーゼは、正しいジスルフィド結合の形成の確立を通してタンパク質の正しいリフォールディングの促進に関与する酵素タンパク質である。タンパクジスルフィドイソメラーゼは当初は還元された変性RNA分解酵素の再生を触媒するその能力に基づいて同定された(Goldberger等, J.Biol.Chem. 239:1406−1410 (1964)及びEpstein等, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28:439−449 (1963))。タンパクジスルフィドイソメラーゼは、そのC末端に−KDEL又は−HDELアミノ酸配列を介して小胞体に保持されている小胞体の常在性酵素であることが示されている。タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと関連するタンパク質は、更にLaboissiere等, J.Biol.Chem., 270(47):28006−28009 (1995); Jeenes等, Gene, 193(2):151−156 (1997); Koivunen等, Genomics, 42(3):397−404 (1997);Desilva等, DNA Cell Biol., 15(1):9−16 (1996);Freedman等 Trends in Biochem. Sci. 19:331−336 (1994); Bulleid, N.J. Advances in Prot. Chem. 44:125−50 (1993);及びNoiva, R., Prot. Exp. and Purification 5:1−13(1994)に記載されている。これらの研究はタンパク質ジスルフィド関連タンパク質の同定の重要性を示している。
より一般的には、全ての新規な膜結合タンパク質とレセプターの同定がまた興味深い。かかるタンパク質は、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。
【0101】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
膜結合タンパク質の重要性が分かってからは、新規な膜結合タンパク質を同定する努力がなされている。更に、ジスルフィド結合形成酵素と多くの異なった用途、例えば組換え的に生産されたタンパク質の正しいリホールディングの収量を増大させる際におけるその潜在的な使用の重要性が分かってからは、タンパクジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規な未変性のタンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ相同体のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。
我々はここにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼに対して相同性を有する新規なポリペプチドの同定と特徴づけを記載する。
【0102】
80.PRO1082
低密度リポタンパク質(LDL)レセプターは、コレステロールホメオスタシスにおいて重要な役割を果たす膜結合タンパク質であり、そのリガンド、アポリポタンパク質(アポ)B−100及びアポEに対する高親和性結合によるリポタンパク質の細胞取り込みを媒介する。LDLレセプターのリガンド結合ドメインはおよそ40のアミノ酸のシステインリッチの反復を7つ含み、各反復は6つのシステインを含み、これが3つの反復内ジスルフィド結合を形成する。これらの独特な構造上の特徴がLDLレセプターに、アポB−100及びアポEと特異的に相互作用するその能力を付与し、これらのリポタンパク質粒子の細胞膜を越えての輸送とその成分に対する代謝が可能になる。LDLレセプターの細胞外ドメインを含む可溶性断片は、その特異的リポタンパク質リガンドと相互作用する能力を維持していることが分かっている(Simmons等, J.Biol.Chem. 272:25531−25536 (1997))。LDLレセプターはJavitt, FASEB J., 9(13):1378−1381 (1995)及びHerzとWillnow, Ann.Ny Acad.Sci., 737:14−19 (1994)に更に記載されている。従って、LDLレセプターと配列同一性を有するタンパク質は興味深い。
より一般的には、全ての膜結合タンパク質とレセプターが、多細胞生物の形成、分化及び維持において重要な役割を果たしうる。多くの個々の細胞の運命、例えば増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、典型的には、他の細胞及び/又は直接の環境から受け取られる情報により支配される。この情報は、しばしば分泌ポリペプチド(例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞障害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン)により伝達され、これが、次に多様な細胞レセプター又は膜結合タンパク質により受け取られ解釈される。このような膜結合タンパク質及び細胞レセプターは、これらに限定されるものではないが、サイトカインレセプター、レセプターキナーゼ、レセプターホスファターゼ、細胞−細胞間相互作用に関与するレセプター、及びセレクチン及びインテグリンのような細胞接着分子を含む。例えば、細胞増殖及び分化を調節するシグナルの伝達は様々な細胞タンパク質のリン酸化により部分的に調節される。そのプロセスを触媒する酵素であるチロシンキナーゼは、成長因子レセプターとしても作用しうる。例としては線維芽細胞成長因子レセプター及び神経成長因子レセプターが含まれる。特に興味深いものはII型膜貫通ドメインを有する膜結合タンパク質である。
【0103】
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
従って、新規な未変性のタンパク質、特にII型膜貫通結合タンパク質を含む膜結合タンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0104】
81.PRO1083
特に興味深いものは7の膜貫通(7TM)レセプタースーパーファミリーに属する膜結合タンパク質である。これらのレセプターの例にはイオンレセプターのようなGプロテイン共役レセプターが含まれる。7TMレセプタースーパーファミリーのメンバーの他の例は、Osterhoff等, DNA Cell Biol., 16(4):379−389 (1997)に記載されている。
膜結合タンパク質及びレセプター分子は、製薬及び診断剤としてのものを含む様々な産業上の利用性を有している。例えば、レセプターイムノアドヘシンはレセプター−リガンド相互作用をブロックする治療剤として使用することができる。膜結合タンパク質は、関連するレセプター/リガンド相互作用の潜在的なペプチド又は小分子インヒビターのスクリーニングに使用することもできる。
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。かかる努力の結果がここに提供される。
【0105】
82.PRO200
細胞の生存、増殖及び/又は分化に関与するポリペプチドは興味深い。細胞の生存、増殖及び/又は分化に関与していることが知られているポリペプチドには、VEGF及び骨形成タンパク質ファミリーのメンバーが含まれる。従って、VEGF又は骨形成タンパク質ファミリーの何れかに関連している新規なポリペプチドが興味深い。
ヘパリン結合内皮細胞成長因子、VEGFは、数年以上前にウシ下垂体濾胞性又は濾胞星状細胞により馴化された培地から同定され精製された。Ferrara等, Biophys.Res.Comm. 161,851 (1989)を参照されたい。VEGFは、顆粒細胞の形態学的によく特徴づけされた集団である濾胞性又は濾胞星状細胞(FC)において生産される天然に生じる化合物である。FCは分泌細胞間に細胞質突起を送る星状細胞である。
VEGFは、選択的RNAスプライシングから生じる多重ホモ二量体型(モノマー当たり121、165、189及び206のアミノ酸)として様々な組織において発現される。VEGF121はヘパリンに結合しない可溶性分裂促進因子である;VEGFの長い型は連続的により高い親和性をもってヘパリンに結合する。VEGFのヘパリン結合型は、プラスミンによりカルボキシ末端で切断でき、VEGFの拡散性型を放出する。プラスミン切断後に同定されたカルボキシ末端ペプチドのアミノ酸配列はArg110−Ala111である。アミノ末端「コア」タンパク質である、ホモ二量体として単離されるVEGF(1−110)は、FMS様チロシンキナーゼ(FLT−1)、キナーゼドメイン領域(KDR)及び胎児肝臓キナーゼ(FLK)レセプターの可溶型及び中和モノクローナル抗体(4.6.1及び2E3)に無傷のVEGF165ホモ二量体と比較して類似した親和性で結合する。
【0106】
説明されるように、VEGFは、それぞれKDRとFLT−1レセプターへの結合の原因である二つのドメインを含む。これらのレセプターは内皮(血管)細胞上にのみ存在する。外傷等のために細胞に酸素が欠乏すると、VEGF生産がそのような細胞において増加し、ついで細胞が、最終的には生物学的効果をシグナルするために各レセプターに結合する。その後シグナルが血管透過性を増大させ、細胞が分割され拡大されて新しい血管経路を形成する−血管形成と新血管形成。
しかして、VEGFは、過剰な組織成長のない状態で血管内皮細胞への選択性作用が重要である状態、例えば糖尿病性潰瘍及び皮下創傷のような損傷から生じる血管損傷を治療するのに対して有用である。血管(動脈及び静脈)内皮細胞成長因子であるので、VEGFは損傷を受けた細胞を修復し(血管形成と呼ばれるプロセス)、新しい血管の形成を刺激する(新血管形成と呼ばれるプロセス)。
VEGFにはまた心筋梗塞後の脈管構造の修復の用途、並びに演繹される他の用途が見出される。この点について、特にガン細胞における新血管形成と血管形成のようなプロセスを和らげるためにVEGFのインヒビターが時々望ましい。
【0107】
骨形成タンパク質ファミリーに関しては、このファミリーのメンバーが軟骨の分化及び血管新生と予備成形ヒドロキシアパタイトにおける骨誘導の促進に関与していると報告されている。Zou等, Genes Dev. (U.S.), 11(17):2191 (1997); Levine等, Ann.Plast.Surg., 39(2):158 (1997)。多くの関連した骨形成タンパク質が同定されており、全てが骨形成タンパク質(BMP)ファミリーのメンバーである。骨形成未変性及び変異体タンパク質、それをコードする核酸、レセプターを含む関連化合物、宿主細胞及び用途が、少なくとも米国特許第5,670,338号、同第5,454,419号、同第5,661,007号、同第5,637,480号、同第5,631,142号、同第5,166,058号、同第5,620,867号、同第5,543,394号、同第4,877,864号、同第5,013,649号、同第55,106,748号及び同第5,399,677号に更に記載されている。特に興味深いものは、基質沈着の調節において重要な役割を果たすプロコラーゲンC−プロテイナーゼである骨形成タンパク質1と相同性を有するタンパク質である。
本発明は、VEGF及びBMPファミリーに関連する新規なポリペプチド、特に細胞の生存、増殖及び/又は分化にある役割を果たすポリペプチドを同定することを意図した研究に基づいて断定されたものである。新規なポリペプチドはそれらが相同性を有する既知のポリペプチドと同じ生物活性を有することは期待されていないが、既知のポリペプチドの生物活性を、新規のポリペプチドの相対的生物活性を決定するために使用することができる。特に、ここに記載する新規なポリペプチドは、細胞の生存、増殖又は分化を誘導するポリペプチドの能力を決定することを意図したアッセイに使用することができる。順に、これらのアッセイの結果は従って診断及び治療目的に使用することができる。このような研究の結果が本発明の主題である。
【0108】
83.PRO285及びPRO286
胚性背側−腹側パターンの確立において中心的な役割を果たしている母性効果遺伝子であるショウジョウバエのToll遺伝子のクローニングは、Hashimoto等, Cell 52, 269−279 (1988)によって報告されている。ショウジョウバエToll遺伝子は、803アミノ酸の細胞質外ドメインと269アミノ酸の細胞質ドメインを持つ複合膜タンパク質をコードする。細胞質外ドメインは潜在的な膜貫通セグメントを有し、多くの膜貫通タンパク質に見出される構造モチーフであるロイシンリッチセグメントの多重コピーを含む。Tollタンパク質はショウジョウバエの胚において背側−腹側パターンを調節し、そのリガンドSpatzleへの結合の際に転写因子Dorsalを活性化する(MorisatoとAnderson, Cell 76,677−688 (1994))。成体ショウジョウバエにおいては、Toll/Dorsalシグナル伝達経路は抗真菌免疫応答に関与する(Lenaitre等, Cell 86,973−983 (1996))。
ショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体は、Medzhitov等, Nature 388,394−397 (1997)により記載されている。このヒトTollは、丁度ショウジョウバエTollのように、非LRR領域による分離された21の直列型反復ロイシンリッチモチーフ(ロイシンリッチ領域−LRR)からなる細胞外ドメインと、ヒトインターロイキン−1(IL−1)レセプターの細胞質ドメインに相同な細胞質ドメインとを持つI型膜貫通タンパク質である。ヒト株化細胞内に形質移入されたヒトTollの構成的に活性な変異体は、NF−κBの活性化及び炎症性サイトカインIL−1、IL−6及びIL−8に対するNF−κB調節性遺伝子の発現、並びに未変性T細胞の活性化に必要とされる、同時刺激性分子B7.1の発現を誘導しうることが示された。Tollは脊椎動物において免疫系の非クローンレセプターとして機能し、これが脊椎動物における生得的及び順応免疫応答の双方を活性化するためのシグナルを誘導することができることが示唆されている。上掲のMedzhitov等により報告されたヒトToll遺伝子は脾臓及び末梢血白血球(PBL)に最も強く発現されており、著者は、他の組織におけるその発現はマクロファージ及び樹枝状細胞の存在により、そこでは感染に対する初期警告系として作用しうることを示唆している。公のジェンバンクデータベースは次のToll配列:ランダム配列全長cDNA #HUMRSC786−1と同一であるToll1(DNAX# HSU88540−1);Toll2(DNAX# HSU88878−1);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(上掲のMedzhitov等により報告されたDNA配列と同一であるDNAX# HSU88880−1)を含んでいる。部分Toll配列(Toll5)はDNAX# HSU88881−1としてジェンバンクから入手できる。
更に、Toll様レセプター(huTLRs1−5)と命名されたショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体が最近クローニングされ、ショウジョウバエの対応物の組織分布構造を写していることが示された(Rock等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 95,588−593 [1998])。あるヒトTLRの構成的に活性な変異体(Tollタンパク質相同体−Medzhitov等,上掲;TLR4−Rock等,上掲)の過剰発現はNF−κBの活性化及び炎症性サイトカイン及び同時刺激性分子の誘導に至る。Medzhitov等,上掲。
【0109】
84.PRO213−1、PRO1330及びPRO1449
癌は、増殖して腫瘍集団を形成する、正常な組織から誘導された異常な、あるいは新生物の細胞の数の増加、これらの新生物腫瘍細胞による隣接組織の浸襲、及び血液又はリンパ系を介して局所リンパ節まで及び遠い部位まで(転移)最終的に広がる悪性細胞の産生により特徴づけられる。癌の状態では細胞は正常な細胞が成長しない条件下で増殖する。癌は広範な形で現れ、異なった度合いの浸襲性及び病原力により特徴づけられる。
遺伝子発現の変化は全ての癌の共通の特徴である制御されていない細胞増殖及び脱分化に密接に関連している。ある種のよく研究されている腫瘍のゲノムは、悪性腫瘍細胞増殖を通常は防止するように機能する、癌抑制遺伝子と通常呼ばれる劣性遺伝子の発現の減少、及び/又は悪性腫瘍の増殖を促進するように作用する発癌遺伝子のようなある種の優性遺伝子の過剰発現を示すことが見出されている。これらの遺伝子変化の各々は、凝集して完全な新生物表現型を表す幾つかの形質を移入する原因であると思われる(Hunter, Cell 64,1129 [1991]; Bishop, Cell, 235−248 [1991])。
癌細胞における遺伝子(例えば発ガン遺伝子)過剰発現のよく知られた機構は遺伝子増幅である。これは、特定の遺伝子の先祖細胞多重コピーの染色体がつくられるプロセスである。該プロセスは、染色体中に戻される複製セグメントの組換えが続く、遺伝子を構成する染色体領域の予定外の複製を含む(Alitalo等, Adv.Cancer Res. 47,235−281 [1986])。遺伝子の過剰発現は遺伝子増幅と平行する、すなわち作製されたコピーの数に比例する。
【0110】
成長因子及び成長因子レセプターをコードするプロトオンコジーンは、乳ガンを含む様々なヒトの悪性腫瘍の病因に重要な役割を果たしていることが確認されている。例えば、上皮成長因子レセプター(EGFR)に関連した185kdの膜貫通糖タンパク質レセプター(p185HER2;HER2)をコードするヒトErbB2遺伝子(her2としても知られるerbB2、又はc−erbB−2)が、ヒトの乳ガンの約25%〜30%において過剰発現することが見出されている(Slamon等, Science 235:177−182 [1987]; Slamon等, Science 244:707−712 [1989])。
プロトオンコジーンの遺伝子増幅は典型的には癌の更に悪性の形態に関与する事象であり、臨床結果のプレディクターとして作用しうることが報告されている(Schwab等, Genes Chromosomes Cancer 1, 181−193 [1990]; Alitalo等, 上掲)。従って、erbB2過剰発現は、特に腋窩リンパ節を関与させる原疾患を持つ患者において、不十分な予後のプレディクターと一般に見なされており(Slamon等,[1987]及び[1989],上掲;Ravdin及びChamness, Gene 159:19−27[1995];及びHynes及びStern, Biochem Biophys Acta 1198:165−184 [1994])、CMF(シクロホスファミド、メトトレキサート、及びフルオロウラシル)及びアントラサイクリンを含む化学療法及びホルモン療法に対する感応性及び/又は耐性に関連している(Baselga , Oncology 11 (3 Suppl 1): 43−48 [1997])。しかし、erbB2過剰発現が不十分な予後に関連しているにも拘わらず、タキサンでの治療に臨床的に応答するHER2陽性患者の可能性はHER2陰性患者のものの3倍を越えていた(上掲)。組換えヒト化抗ErbB2(抗HER2)モノクローナル抗体(rhuMAbHER2又はハーセプチン7δと称される、マウス抗ErbB2抗体4D5のヒト化バージョン)は、それまでに広範な抗ガン治療を受けたErbB2を過剰発現する転移性乳ガンの患者において臨床的に活性であった(Baselga等, J.Clin.Oncol. 14:737−744 [1996])。
タンパク質ノッチ(Notch)とその相同体は、様々な発達プロセスにおいて細胞運命を決定する際に重要な調節レセプターである。タンパク質ノッチ−4は、int−3発癌遺伝子としても知られ、マウスの乳腺腫瘍ウィルス(MMVS)中において頻繁な標的として元々は同定された。ノッチ−4は幹細胞の分化能に影響し上皮細胞における新生物増殖に導く導入遺伝子であると信じられている。Shirayoshi等, Genes Cells 2(3):213−224 (1997)。胚形成の間、ノッチ−4の発現は、のような背側大動脈、セグメント間血管、卵黄嚢血管、頭部血管、心臓、鰓弓の血管、及び神経叢毛細血管のような組織を形成する血管の上皮細胞に検出された。これらの組織におけるノッチ−4発現はまた、血管形成と新血管形成の主要な調節遺伝子であるflk−1に付随していた。ノッチ−4は内皮幹細胞の分化中にインビトロでアップレギュレートされる。ノッチ−4の内皮細胞特異的発現パターン、並びにノッチに対するその構造類似性は、ノッチ−4がノッチの内皮細胞特異的相同体であり、血管形成と新血管形成においてある役割を果たしていることを示唆している。
【0111】
85.PRO298
新規な未変性のレセプタータンパク質を同定する努力が産業界と学術界の双方によってなされている。多くの努力が、新規なレセプタータンパク質のコード配列を同定するために哺乳類組換えDNAライブラリーのスクリーニングに注がれている。我々は、ここでPRO298ポリペプチドと命名した、新規な膜貫通ポリペプチドの同定と特徴づけをここに記載する。
【0112】
86.PRO337
高等脊椎動物におけるニューロンの発達は、途中の別個の細胞環境を成功裡にそのシナプス標的まで航路決定しなければならないプロセスにより特徴づけられる。結果は神経回路の機能的に正確な形成である。精度は、成長円錐経路の発見と標的認識を調節し、後者の洗練とニューロン活性を必要とする現象によるそのような突出の再構築が続く機構から得られるものと信じられている。Goodman及びShatz, Cell/Neuron [Suppl.] 72(10):77−98 (1993)。更に、異なったニューロンが生化学的に区別される神経線維を伸長し、細胞−細胞、細胞−マトリックス、及び走化性相互作用によって提供される特異的案内キューに依存して、その適切なシナプス標的に到達することが明らかである。Goodman等、上掲。
ニューロン細胞表面の多様性がつくり出される一つの特定の手段は、細胞接着分子(CAMs)と称される細胞表面タンパク質の差次的な発現を通してである。ニューロン的に発現されたCAMsは、放射状グリア細胞に沿ったニューロンの遊走を含む、広範な発達プロセスに関与し、神経突起伸長に対して許容できる又は反発性の基質を提供し、また突出経路における軸索の選択的束状化を促進することに関与している。Jessel, Neuron 1:3−13 (1998); Edelman及びCrossin, Annu.Rev.Biochem. 60:155−190 (1991)。成長円錐膜上に存在するCAMsと対向する細胞膜上又は細胞外マトリックス中の分子との間の相互作用は、適切な突出経路に沿って神経線維の成長を方向付ける特異的案内キューを提供すると考えられている。そのような相互作用の結果、神経突起成長を調節する成長円錐内において様々な第2のメッセンジャー系の活性化が生じると思われる。Doherty及びWalsh, Curr.Opin.Neurobiol. 2:595−601 (1992)。
高等脊椎動物において、大抵の神経CAMsはタンパク質の3つの主要な構造ファミリー:インテグリン、カドヘリン、及び免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー(IgSF)のメンバーであることが見出されている。Jessel,上掲;Takeichi, Annu.Rev.Biochem. 59:237−252 (1990); Reichardt及びTomaselli, Annu.Rev.Neurosci. 14:531−570 (1991)。IgSF(又はIg−CAMs)の細胞接着分子は特に、発達の間の神経細胞相互作用及び神経線維成長にしばしば関与しているタンパク質の大きなファミリーを構成している。Salzer及びColman, Dev.Neurosci. 11:377−390 (1989); Bruemmendorf及びRathjen, J.Neurochem. 61:1207−1219 (1993)。しかし、哺乳類Ig−CAMsの大半はあまりに広範に発現されているので航路決定又はシナプス標的を特定できないように思われ、まだ同定されていない他のCAMsがニューロンのこれらの更に選択的な相互作用において役割を果たしていることが示唆される。
【0113】
既知の神経Ig−CAMsの多くはグリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカーを介して原形質膜に結合していることが見出されている。また、多くの研究によれば、GPIアンカータンパク質が特異的経路におけるニューロンの成長の間、特異的案内キューの提供に関与している。バッタの神経系の研究では、細胞の表面からGPI−アンカータンパク質を選択的に除去するホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)での胎仔の治療の結果、開拓している成長円錐のサブセットの間での誤案内及び偽りの航路決定、並びに初期ニューロンのサブセットの阻害遊走パターンが生じる。Chang等, Devel. 114:507−519 (1992)。網膜線維の視蓋への突出は、部分的に33kDaのGPIアンカータンパク質に依存しているように思われるが、このタンパク質の正確な性質は未知である。Stahl等, Neuron 5:735−743 (1990)。
様々なGPIアンカータンパク質の発現は、後根神経節の一次ラットニューロン、頸部神経節の交感ニューロン、上頸神経節の交感ニューロン、及び小脳顆粒ニューロンの異なった集団のなかで特徴づけられている。Rosen等, J.Cell Biol. 117:617−627 (1992)。これらの異なったタイプのニューロンによる全膜タンパク質の発現の類似パターンとは対照に、顕著な差異がこれらのニューロン間でGPIアンカータンパク質の発現において観察された。最近、ニューロトリミン(neurotrimin)として知られている65kDaのタンパク質バンドが発見され、一次ニューロンにより差次的に発現され(Rosen等,上掲)、神経系に制限され、CNSにおいて最も豊富で最も初期に発現されたGPIアンカー種であることが分かった。Struyk等, J.Neuroscience 15(3):2141−2156 (1995)。ニューロトリミンの発見は更に、現在IgLONと名付けられ、それぞれが有意なアミノ酸同一性を分かち持つIg様ドメインを含んでいるIgSFメンバーのファミリーの同定に至った。Struyk等,上掲;Pimenta等,Gene 170(2):189−95 (1996)。
IgLONサブファミリーの更なるメンバーは、オピエート結合細胞接着分子(OBCAM)、Schofield等, EMBO J. 8:489−495 (1989);辺縁随伴膜タンパク質(LAMP)、Pimenta等,上掲;CEPU−1;GP55、Wilson等, J.Cell Sci. 109:3129−3138 (1996); Eur.J.Neurosci. 9(2):334−41 (1997);及びAvGp50、Hancox等,Brain Res.Mol.Brain Res. 44(2):273−85 (1997)を含む。
【0114】
ニューロトリミンの発現は広範であると思われる一方、幾つかの神経回路の発達に相関していると思われる。例えば、E18とP10の間で、前脳内でのニューロチミンmRNAの発現が、発達中の視床、皮質サブプレート、及び皮質のニューロン、特にラミナV及びVI(II、II及びIVでのあまり強くない発現とラミナIでの最小の発現を伴って)において高レベルに維持される。皮質サブプレートニューロンは、皮質内のその最終のシナプス標的までの途中の内に伸びる視床求心性神経に対する初期の一時的な足場を提供する。Allendoerfer及びShatz, Annu.Rev.Neurosci. 17:185−218 (1994)。逆に、サブプレートニューロンは、層Vからの皮質ニューロンがVIを選択して視床内に成長し、層Vからのニューロンが小丘、脳橋、及び脊髄においてその標的を選択するのに必要とされることが示唆されている(McConnell等, J.Neurosci. 14:1892−1907 (1994))。これらの突出の多くにおけるニューロトリミンの高レベルの発現はそれがその発達に関与していることを示唆している。
後脳において、ニューロトリミンメッセージ発現の高レベルは、脳橋核内中に、及び小脳のプルキニエ細胞及び内部顆粒細胞によって観察された。脳橋核はV層の皮質脳橋線維を含む様々なソースから求心性線維の入力を受け取り、顆粒細胞への苔状線維を介しての求心性線維の入力の主要ソースであり、該顆粒細胞は次にプルキニエ細胞への平行線維を介しての求心性線維の入力の主たるソースである。[Palay及びChan−Palay, The cerebellar cortex: cytology and organization. New York: Springer (1974)]。これらニューロトリミンニューロンの高レベルの発現はこれらの回路の確率における強力な関与を示唆している。
ニューロトリミンはまた初期の出生後線条体において段階的な発現パターンを示す。ニューロトリミンの発現の増加はラットの背外側線条体上に横たわって見出される一方、より低いハイブリダイゼーション強さが腹側正中線条体上に横たわって見られる。Struyk等,上掲。より高いニューロトリミンハイブリダイゼーション強さのこの領域は細胞構造的に区別しうる領域に対応せず、むしろ、対側性感覚運動皮質のVI層からの求心性入力の一次領域に対応する(Gerfen, Nature 311:461−464 (1984); Donoghue及びHerkenham, Brain Res. 365:397−403 (1986))。対照的に、腹側正中線条体は鼻周囲及び連合野からその大部分の求心性入力を受け取る。LAMP発現の相補的段階的パターンは線条体において、腹側正中領域において最も高い発現と背外側的に最も低い発現を伴って観察されている。Levitt, Science 223:299−301 (1985); Chesselet等, Neuroscience 40:725−733 (1991)。
【0115】
87.PRO403
シングルパス膜貫通タンパク質としても知られているII型膜貫通タンパク質は細胞質に留まるN末端部分を有する一方、C末端部分は細胞外ドメインに暴露されている。
エンドセリンは、イソペプチド及びその遺伝子(エンドセリン−1、−2及び−3)の存在と構造、遺伝子発現の調節、細胞内プロセシング、特異的エンドセリン変換酵素(ECE)、レセプターサブタイプ(ET−A及びET−B)、レセプター活性化に続く細胞内シグナル伝達等々を含む、その薬理学的、生化学的及び分子生物学的特徴を更に良好に理解するために多くの活動が注がれている血管収縮薬ペプチドのファミリーである。
ペプチドのエンドセリン(ET)ファミリーは、多くのヒトの疾患状態において病態生理学的な重要性を有する有力な血管、心臓及び腎臓作用を有している。ET−1は不活性な212アミノ酸プレプロペプチドとして発現される。プレプロペプチドは最初はArg52−Cys53及びArg92−Ala93で切断され、ついでカルボキシ末端Lys91及びArg92はタンパク質から切り取ってプロペプチドビッグET−1を産生する。
エンドセリンは、エンドセリン変換酵素(ECE)である亜鉛メタロプロテアーゼにより触媒される独特のプロセシング事象により不活性な中間体であるビッグエンドセリンから生産される。ECEは最近クローニングされ、その構造は触媒ドメインと数多くのN−グリコシル化部位を含む長い細胞外C末端と短い細胞内N末端を持つシングルパス膜貫通タンパク質であることが分かった。ECEsはTrp73とVal74の間でエンドセリンプロペプチドを切断して活性なペプチドETを生産し、これが循環ホルモンよりもむしろ局所ホルモンとして機能するように思われる(Rubanyi,G.M.及びPolokoff,M.A., Pharmacological Reviews 46:325−415 (1994))。従って、ECE活性はエンドセリン生産の調節の有力な部位であり、エンドセリン系における治療的介入に対する可能な標的である。ECE活性を遮断することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグET−1の生理学的に活性な形態への転換を阻害して、ET−1の生産を停止することができる。
エンドセリンは、1)循環器病(血管痙攣、高血圧、心筋虚血症;再灌流損傷及び急性心筋梗塞、脳卒中(脳虚血)、鬱血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管肥厚);2)腎疾患(急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変);3)肺疾患(気管支喘息、肺性高血圧);4)胃腸障害(胃潰瘍、炎症性腸疾患);5)生殖疾患(早発分娩、月経困難症、子癇前症)及び6)発癌を含む多くの疾患状態の病態生理学における役割を担っている。Rubanyi & Polokoff,上掲。
【0116】
(発明の概要)
1.PRO213
出願人は、本出願において「PRO213」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO213ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig2(配列番号:2)のアミノ酸残基1〜295を持つPRO213をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO213ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO213ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig2(配列番号:2)の残基1〜295を含んでなるアミノ酸を含む。
【0117】
2.PRO274
出願人は、本出願において「PRO274」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO274ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig4(配列番号:7)のアミノ酸残基1〜492を持つPRO274をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO274をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209786として1998年4月21日に寄託されたDNA39987−1184ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO274ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO274ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig4(配列番号:7)の残基1〜492を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はPRO274ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO274ポリペプチドは、ATCC209786として1998年4月21日に寄託されたDNA39987−1184ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:8(ここでDNA17873と命名)、配列番号:9(ここでDNA36157と命名)及び配列番号:10(ここでDNA28929と命名)(それぞれFig5−7を参照されたい)のヌクレオチド配列を含んでなる3種の発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0118】
3.PRO300
出願人は、本出願において「PRO300」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO300ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig9(配列番号:19)のアミノ酸残基1〜457を持つPRO300をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO300をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209788として1998年4月21日に寄託されたDNA40625−1189ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO300ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO300ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig9(配列番号19)の残基1〜457を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様はPRO300ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO300ポリペプチドは、ATCC209788として1998年4月21日に寄託されたDNA40625−1189ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0119】
4.PRO284
出願人は、本出願において「PRO284」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO284ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸残基1〜285を持つPRO284をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸残基約25〜285又はFig11(配列番号:28)の1からもしくは約25からX(ここで、XはFig11(配列番号:28)の71〜80の任意のアミノ酸である)を持つPRO284をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO284をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209787として1998年4月21日に寄託されたDNA23318−1211ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO284ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO284ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig11(配列番号:28)の残基1〜285を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig11(配列番号:28)のアミノ酸約25〜285又はFig11(配列番号:28)の1からもしくは約25からX(ここで、XはFig11(配列番号:28)の71〜80の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO284ポリペプチドに関している。場合によっては、PRO284ポリペプチドは、ATCC209787として1998年4月21日に寄託されたDNA23318−1211ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号29のヌクレオチド配列を含んでなるDNA12982とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号30のヌクレオチド配列を含んでなるDNA15886とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0120】
5. PRO296
出願人は、本出願において「PRO296」と命名した、肉腫増幅タンパク質SASと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO296ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸残基1〜204を持つPRO296をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸残基約35〜204又はFig15(配列番号:36)のアミノ酸1からもしくは約35からX(ここで、XはFig15(配列番号:36)の42〜51の任意のアミノ酸である)を持つPRO296をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO296をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209789として1998年4月21日に寄託されたDNA39979−1213ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO296ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO296ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig15(配列番号:36)の残基1〜204を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig15(配列番号:36)のアミノ酸約35〜204又はFig15(配列番号:36)の1からもしくは約35からX(ここで、XはFig15(配列番号:36)の42〜51の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO296ポリペプチドに関している。場合によっては、PRO296ポリペプチドは、ATCC209789として1998年4月21日に寄託されたDNA39979−1213ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:37のヌクレオチド配列を含んでなるDNA23020とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:38のヌクレオチド配列を含んでなるDNA21971とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:39のヌクレオチド配列を含んでなるDNA29037とここで命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0121】
6. PRO329
出願人は、本出願において「PRO329」と命名した、高親和性免疫グロブリンFcレセプターと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO329ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig20(配列番号:45)のアミノ酸残基1〜359を持つPRO329をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO329をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209617として1998年2月5日に寄託されたDNA40594−1233ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO329ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO329ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig20(配列番号:45)の残基1〜359を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO329ポリペプチドは、ATCC209617として1998年2月5日に寄託されたDNA40594−1233ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0122】
7.PRO362
出願人は、本出願において「PRO362」と命名した、A33抗原及びHCAR膜結合タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig22(配列番号:52)のアミノ酸残基1〜321を持つPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図22(配列番号52)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸271〜280の任意のアミノ酸である)を持つPRO362ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO362をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209620として1998年2月5日に寄託されたDNA45416−1251ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO362ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO362ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig22(配列番号:52)の残基1〜321を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig22(配列番号:52)に示されるアミノ酸配列のアミノ酸1〜X(ここで、Xはアミノ酸271〜280の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO362ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO362ポリペプチドは、ATCC209620として1998年2月5日に寄託されたDNA45416−1251ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0123】
8.PRO363
出願人は、本出願において「PRO363」と命名した、細胞表面レセプタータンパク質HCARと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO363ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig24(配列番号:59)のアミノ酸残基1〜373を持つPRO363ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、図24(配列番号59)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸216〜アミノ酸225の任意のアミノ酸である)を持つPRO363細胞外ドメインポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO363をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209616として1998年2月5日に寄託されたDNA45419−1252ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO363ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO363ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig24(配列番号:59)の残基1〜373を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO363ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関しており、該細胞外ドメインは、24(配列番号59)に示される配列のアミノ酸1〜X(ここで、Xはアミノ酸216〜225の任意のアミノ酸である)を含みうる。場合によっては、PRO363ポリペプチドは、ATCC209616として1998年2月5日に寄託されたDNA45419−1252ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0124】
9.PRO868
出願人は、本出願において「PRO868」と命名した、腫瘍壊死因子レセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜655を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸343〜352の任意のアミノ酸である)を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。更に他の側面では、単離された核酸は、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基X〜655(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸371〜380の任意のアミノ酸である)を持つPRO868ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO868をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209679として1998年3月17日に寄託されたDNA52594−1270ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO868ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO868ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig26(配列番号:64)の残基1〜655を含んでなるアミノ酸を含む。他の側面では、単離されたPRO868ポリペプチドは、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸343〜352の任意のアミノ酸である)を含みうる。更に他の側面では、PRO868ポリペプチドは、Fig26(配列番号:64)のアミノ酸残基X〜655(ここで、XはFig26(配列番号:64)に示された配列のアミノ酸371〜380の任意のアミノ酸である)を含みうる。場合によっては、PRO868ポリペプチドは、ATCC209679として1998年3月17日に寄託されたDNA52594−1270ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0125】
10.PRO382
出願人は、本出願において「PRO382」と命名した、セリンプロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO382ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig28(配列番号:69)のアミノ酸残基1〜453を持つPRO382ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO382をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209654として1998年3月5日に寄託されたDNA45234−1277ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO382ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO382ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig28(配列番号:69)の残基1〜453を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、シグナルペプチドを持つか持たない、PRO382ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO382ポリペプチドは、ATCC209654として1998年3月5日に寄託されたDNA45234−1277ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0126】
11.PRO545
出願人は、本出願において「PRO545」と命名した、メルトリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO545ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig30(配列番号:74)のアミノ酸残基1〜735を持つPRO545ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO545をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209655として1998年3月5日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO545ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO545ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig30(配列番号:74)の残基1〜735を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO545ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関している。場合によっては、PRO545ポリペプチドは、ATCC209655として1998年3月5日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号:75(Fig31)のヌクレオチド配列を含んでなる、ここでDNA13217と命名した発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0127】
12.PRO617
出願人は、本出願において「PRO617」と命名した、CD24と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO617ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig33(配列番号:85)のアミノ酸残基1〜67を持つPRO617ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO617をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209656として1998年3月5日に寄託されたDNA48309−1280ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO617ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO617ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig33(配列番号:85)の残基1〜67を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO617ポリペプチドは、ATCC209656として1998年3月5日に寄託されたDNA48309−1280ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0128】
13.PRO700
出願人は、本出願において「PRO700」と命名した、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig35(配列番号:90)のアミノ酸残基1〜432を持つPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig35(配列番号:90)の約34〜432のアミノ酸残基を持つPRO700ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO700をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209721として1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO700ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO700ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig35(配列番号:90)の残基1〜432を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はFig35(配列番号:90)の約34〜432の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離PRO700ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO700ポリペプチドは、ATCC209721として1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0129】
14.PRO702
出願人は、本出願において「PRO702」と命名した、コングルチニンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基1〜277を持つPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基26〜277を持つPRO702ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO702をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209717として1998年3月31日に寄託されたDNA50980−1286ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO702ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO702ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig37(配列番号:97)の残基1〜277を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig37(配列番号:97)のアミノ酸残基26〜277を含んでなる単離されたPRO702ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO702ポリペプチドは、ATCC209717として1998年3月31日に寄託されたDNA50980−1286ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0130】
15. PRO703
出願人は、本出願において「PRO703」と命名した、VLCASと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig39(配列番号:102)のアミノ酸残基1〜730を持つPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig39(配列番号:102)の約43〜730のアミノ酸残基を持つPRO703ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO703をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209716として1998年3月31日に寄託されたDNA50913−1287ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO703ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO703ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig39(配列番号:102)の残基1〜730を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明はFig39(配列番号:102)の約43〜730の残基を含んでなるアミノ酸を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO703ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO703ポリペプチドは、ATCC209716として1998年3月31日に寄託されたDNA50913−1287ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0131】
16.PRO705
出願人は、本出願において「PRO705」と命名した、K−グリピカンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig41(配列番号:109)のアミノ酸残基1〜555を持つPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig41(配列番号:109)の約24〜555のアミノ酸残基を持つPRO705ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO705をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209722として1998年3月31日に寄託されたDNA50914−1289ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO705ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO705ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig41(配列番号:109)の残基1〜555を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Fig41(配列番号:109)の約24〜555のアミノ酸残基を含んでなる単離されたPRO705ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO705ポリペプチドは、ATCC209722として1998年3月31日に寄託されたDNA50914−1289ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0132】
17. PRO708
出願人は、本出願において「PRO708」と命名した、アリールスルファターゼと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO708ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig43(配列番号:114)のアミノ酸残基1〜515を持つPRO708ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO708をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209668として1998年3月31日に寄託されたDNA48296−1292ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO708ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO708ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig43(配列番号:114)の残基1〜515を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Fig43(配列番号:114)に示すアミノ酸配列の残基38〜515を含んでなるPRO708ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO708ポリペプチドは、ATCC209668として1998年3月11日に寄託されたDNA48296−1292ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0133】
18. PRO320
出願人は、本出願において「PRO320」と命名した、フィブリンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO320ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig45(配列番号:119)のアミノ酸残基1〜338を持つPRO320ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO320をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209670として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO320ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO320ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig45(配列番号:119)の残基1〜338を含んでなるアミノ酸を含む。場合によっては、PRO320ポリペプチドは、ATCC209670として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0134】
19.PRO324
出願人は、本出願において「PRO324」と命名した、オキシドレダクターゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig47(配列番号:124)のアミノ酸残基1〜289を持つPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig47(配列番号:124)のアミノ酸残基1又は約32からX(ここで、Xは131〜140の任意のアミノ酸である)を持つPRO324ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO324をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209718として1998年3月30日に寄託されたDNA36343−1310ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO324ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO324ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig47(配列番号:124)の残基1〜289を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまたFig47(配列番号:124)の残基1又は約32からX(ここで、Xは約131〜140の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO324ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO324ポリペプチドは、ATCC209718として1998年3月30日に寄託されたDNA36343−1310ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0135】
20.PRO351
出願人は、本出願において「PRO351」と命名した、プロスタシン(prostasin)と配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig49(配列番号:132)のアミノ酸残基1〜571を持つPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig49(配列番号:132)の約16〜571のアミノ酸残基を持つPRO351ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO351をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209784として1998年4月21日に寄託されたDNA40571−1315ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO351ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO351ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig49(配列番号:132)の残基1〜571を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、Fig49(配列番号:132)の約16〜571の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO351ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO351ポリペプチドは、ATCC209784として1998年4月21日に寄託されたDNA40571−1315ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0136】
21.PRO352
出願人は、本出願において「PRO352」と命名した、ブチロフィリンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig51(配列番号:137)のアミノ酸残基1〜316を持つPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig51(配列番号:137)の約29〜316のアミノ酸残基、又はFig51の1あるいは約29からX(ここで、Xは246〜255の任意のアミノ酸である)を持つPRO352ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO352をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209703として1998年3月26日に寄託されたDNA41386−1316ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO352ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO352ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig51(配列番号:137)の残基1〜316を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig51(配列番号:137)の残基約29〜316及びFig51(配列番号:137)の1又は約29からX(ここで、Xは246〜255の任意のアミノ酸である)を含んでなる単離されたPRO352ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO352ポリペプチドは、ATCC209703として1998年3月26日に寄託されたDNA41386−1316ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0137】
22.PRO381
出願人は、本出願において「PRO381」と命名した、イムノフィリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig53(配列番号:145)のアミノ酸残基1〜211を持つPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig53(配列番号:145)の約21〜211のアミノ酸残基を持つPRO381ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO381をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209808として1998年4月28日に寄託されたDNA44194−1317ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO381ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO381ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig53(配列番号:145)の残基1〜211を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様は、Fig53(配列番号:145)の約21〜211のアミノ酸残基を含んでなるPRO381ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO381ポリペプチドは、ATCC209808として1998年4月28日に寄託されたDNA44194−1317ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0138】
23.PRO386
出願人は、本出願において「PRO386」と命名した、ナトリウムチャネルのβ−2サブユニットと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸残基1〜215を持つPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸残基約21〜215又は1もしくは約21からX(ここで、XはFig55(配列番号:150)の156〜165の任意のアミノ酸である)を持つPRO386ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO386をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209810として1998年4月28日に寄託されたDNA45415−1318ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO386ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO386ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig55(配列番号:150)の残基1〜215を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の他の実施態様は、Fig55(配列番号:150)のアミノ酸約21〜215及びFig55(配列番号:150)の1もしくは約21からX(ここで、XはFig55(配列番号:150)の156〜165の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO386ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO386ポリペプチドは、ATCC209810として1998年4月28日に寄託されたDNA45415−1318ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、配列番号151のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供し、これはDNA23350とここで命名したESTに対応する。
他の実施態様では、本発明は、配列番号152のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供し、これはDNA23536とここで命名したESTに対応する。
【0139】
24.PRO540
出願人は、本出願において「PRO540」と命名した、LCATと配列類似性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig59(配列番号:157)のアミノ酸残基1〜412を持つPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig59(配列番号:157)の約29〜412のアミノ酸残基を持つPRO540ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO540をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209699として1998年3月26日に寄託されたDNA44189−1322ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO540ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO540ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig59(配列番号:157)の残基1〜412を含んでなるアミノ酸を含む。本発明はまた単離されたPRO540ポリペプチドを提供し、これは一実施態様では、Fig59(配列番号:157)の約29〜412の残基を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO540ポリペプチドは、ATCC209699として1998年3月26日に寄託されたDNA44189−1322ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0140】
25.PRO615
出願人は、本出願において「PRO615」と命名した、シナプトジリン(synaptogyrin)と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基1〜224を持つPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基約X〜224(ここで、Xは157〜166の任意のアミノ酸である)を持つPRO615ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO615をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209811として1998年4月28日に寄託されたDNA48304−1323ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO615ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO615ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig61(配列番号:162)の残基1〜224を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig61(配列番号:162)のアミノ酸残基X〜224(ここで、XはFig61(配列番号:162)の157〜166の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO615ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO615ポリペプチドは、ATCC209811として1998年4月28日に寄託されたDNA48304−1323ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0141】
26.PRO618
出願人は、本出願において「PRO618」と命名した、エンテロペプチダーゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO618ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig63(配列番号:169)のアミノ酸残基1〜802を持つPRO618ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig63(配列番号:169)のアミノ酸残基X〜802(ここで、XはFig63(配列番号:169)の63〜72の任意のアミノ酸である)を持つPRO618ポリペプチドの単離された細胞外ドメインをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO618をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209813として1998年4月28日に寄託されたDNA49152−1324ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO618ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO618ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig63(配列番号:169)の残基1〜802を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、アミノ酸X〜802(ここで、XはFig63(配列番号:169)の63〜72の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO618ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO618ポリペプチドは、ATCC209813として1998年4月28日に寄託されたDNA49152−1324ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA35597と命名された、配列番号170のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する(Fig64を参照されたい)。
【0142】
27.PRO719
出願人は、本出願において「PRO719」と命名した、リポタンパク質リパーゼHと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig66(配列番号:178)のアミノ酸残基1〜354を持つPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig66(配列番号178)のアミノ酸残基約17〜354を持つPRO719ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO719をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209705として1998年3月26日に寄託されたDNA49646−1327ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO719ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO719ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig66(配列番号:178)の残基1〜354を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig66(配列番号:178)の約17〜354の残基を含んでなる単離されたPRO719ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO719ポリペプチドは、ATCC209705として1998年3月26日に寄託されたDNA49646−1327ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0143】
28.PRO724
出願人は、本出願において「PRO724」と命名した、LDLレセプターと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig68(配列番号:183)のアミノ酸残基1〜713を持つPRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig68(配列番号:183)のアミノ酸残基1〜X(ここで、Xはアミノ酸437〜446の任意のアミノ酸である)を持つ可溶性PRO724ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。上記の二種のポリペプチドはシグナルペプチドを含んでいても含んでいなくともよい。単離された核酸配列は、PRO724をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209806として1998年4月28日に寄託されたDNA49631−1328ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO724ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO724ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig68(配列番号:183)の残基1〜713を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、単離された可溶性PRO724ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された可溶性PRO724ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では、Fig68(配列番号:183)の残基1〜X(ここで、Xは図68(配列番号183)に示される配列の437〜446の任意のアミノ酸である)を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO724ポリペプチドは、ATCC209806として1998年4月28日に寄託されたDNA49631−1328ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0144】
29.PRO772
出願人は、本出願において「PRO772」と命名した、A4プロテインと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸残基1〜152を持つPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig70(配列番号:190)の21〜30の任意のアミノ酸である)を持つPRO772ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO772をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209809として1998年4月28日に寄託されたDNA49645−1347ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO772ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO772ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様では図70(配列番号:190)の残基1〜152を含んでなるアミノ酸を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig70(配列番号:190)のアミノ酸1〜X(ここで、XはFig70(配列番号:190)の21〜30の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO772ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO772ポリペプチドは、ATCC209809として1998年4月28日に寄託されたDNA49645−1347ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA43509と命名された、配列番号:191のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する(Fig71)。
【0145】
30.PRO852
出願人は、本出願において「PRO852」と命名した、様々なプロテアーゼ酵素と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸残基1〜518を持つPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸残基約21〜518又はFig73(配列番号:196)の1あるいは約21からX(ここで、XはFig73(配列番号:196)のアミノ酸461〜アミノ酸470の任意のアミノ酸である)を持つPRO852ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO852をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209805として1998年4月28日に寄託されたDNA45493−1349ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO852ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO852ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig73(配列番号:196)の残基1〜518を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、PRO852は、Fig73(配列番号:196)のアミノ酸約21〜アミノ酸518あるいはFig73(配列番号:196)のアミノ酸1又は約21からX(ここで、XはFig73(配列番号:196)のアミノ酸461〜アミノ酸470の任意のアミノ酸である)を含んでなる。場合によっては、PRO852ポリペプチドは、ATCC209805として1998年4月28日に寄託されたDNA45493−1349ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0146】
31.PRO853
出願人は、本出願において「PRO853」と命名した、レダクターゼと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig75(配列番号:206)のアミノ酸残基1〜377を持つPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig75(配列番号:206)のアミノ酸残基約17〜377を持つPRO853ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO853をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209812として1998年4月28日に寄託されたDNA48227−1350ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO853ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO853ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig75(配列番号:206)の残基1〜377を含んでなるアミノ酸を含む。他の実施態様では、本発明は、本発明は、Fig75(配列番号:206)の残基約17〜377を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナルペプチドを欠いた単離されたPRO853ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO853ポリペプチドは、ATCC209812として1998年4月28日に寄託されたDNA48227−1350ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0147】
32.PRO860
出願人は、本出願において「PRO860」と命名した、ニューロファシン(neurofascin)と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig77(配列番号:211)のアミノ酸残基1〜985を持つPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig77(配列番号:211)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig77(配列番号:211)のアミノ酸443〜452の任意のアミノ酸である)を持つPRO860ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO860をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209844として1998年5月6日に寄託されたDNA41404−1352ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO860ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO860ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig77(配列番号:211)の残基1〜985を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig77(配列番号:211)の残基1〜X(ここで、XはFig77(配列番号:211)の443〜452の任意のアミノ酸残基である)を含んでなるアミノ酸配列を含む単離されたPRO860ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO860ポリペプチドは、ATCC209844として1998年5月6日に寄託されたDNA41404−1352ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0148】
33.PRO846
出願人は、本出願において「PRO846」と命名した、CMRF35と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig79(配列番号:216)のアミノ酸残基1〜332を持つPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig79(配列番号:216)のアミノ酸残基約18〜332又は配列番号:216の1あるいは約18からX(ここで、XはFig79(配列番号:216)の243〜252の任意のアミノ酸である)を持つPRO846ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO846をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209847として1998年5月6日に寄託されたDNA44196−1353ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO846ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO846ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig79(配列番号:216)の残基1〜332を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig79(配列番号:216)の残基約18〜332を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO846ポリペプチドを提供する。本発明の更なる実施態様は、Fig79(配列番号:216)の1又は約18からX(ここで、XはFig79(配列番号:216)の243〜252の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO846に関する。場合によっては、PRO846ポリペプチドは、ATCC209847として1998年5月6日に寄託されたDNA44196−1353ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0149】
34.PRO862
出願人は、本出願において「PRO862」と命名した、リゾチームと配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig81(配列番号:221)のアミノ酸残基1〜146を持つPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig81(配列番号:221)のアミノ酸残基約19〜146を持つPRO862ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO862をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209845として1998年5月6日に寄託されたDNA52187−1354ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO862ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO862ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig81(配列番号:221)の残基1〜146を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig81(配列番号:221)の残基約19〜146を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO862ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO862ポリペプチドは、ATCC209845として1998年5月6日に寄託されたDNA52187−1354ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0150】
35.PRO864
出願人は、本出願において「PRO864」と命名した、Wnt−4と配列類似性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig83(配列番号:226)のアミノ酸残基1〜351を持つPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig83(配列番号:226)のアミノ酸残基約23〜351を持つPRO864ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO864をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209843として1998年5月6日に寄託されたDNA48328−1355ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO864ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO864ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig83(配列番号:226)の残基1〜351を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、本発明は、Fig83(配列番号:226)の残基約23〜351を含んでなるアミノ酸配列を含む、シグナル配列を欠いた単離されたPRO864ポリペプチドを提供する。場合によっては、PRO864ポリペプチドは、ATCC209843として1998年5月6日に寄託されたDNA48328−1355ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0151】
36.PRO792
出願人は、本出願において「PRO792」と命名した、CD23と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸残基1〜293を持つPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸残基X〜293(ここで、XはFig85(配列番号:231)の50〜59の任意のアミノ酸である)を持つPRO792ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO792をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209846として1998年5月6日に寄託されたDNA56352−1358ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO792ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO792ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig85(配列番号:231)の残基1〜293を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig85(配列番号:231)のアミノ酸X〜293(ここで、XはFig85(配列番号:231)の50〜59の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO792ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO792ポリペプチドは、ATCC209846として1998年5月6日に寄託されたDNA56352−1358ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0152】
37.PRO866
出願人は、本出願において「PRO866」と命名した、ミンジン(mindin)及びスポンジン(spondin)タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸残基1〜331を持つPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸残基約27〜229を持つPRO866ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO866をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209750として1998年4月7日に寄託されたDNA53971−1359ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO866ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO866ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig87(配列番号:236)の残基1〜331を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Fig87(配列番号:236)のアミノ酸約27〜331を含んでなるPRO866ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO866ポリペプチドは、ATCC209750として1998年4月7日に寄託されたDNA53971−1359ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0153】
38.PRO871
出願人は、本出願において「PRO871」と命名した、CyP−60と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸残基1〜472を持つPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸残基約22〜472を持つPRO871ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO871をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209848として1998年5月6日に寄託されたDNA50919−1361ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO871ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO871ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig89(配列番号:245)の残基1〜472を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig89(配列番号:245)のアミノ酸約22〜472を含んでなるPRO871ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO871ポリペプチドは、ATCC209848として1998年5月6日に寄託されたDNA50919−1361ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0154】
39.PRO873
出願人は、本出願において「PRO873」と命名した、カルボキシエステラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸残基1〜545を持つPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸残基約30〜545を持つPRO873ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO873をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209851として1998年5月6日に寄託されたDNA44179−1362ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO873ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO873ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig91(配列番号:254)の残基1〜545を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig91(配列番号:254)のアミノ酸約30〜545を含んでなるPRO873ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO873ポリペプチドは、ATCC209851として1998年5月6日に寄託されたDNA44179−1362ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0155】
40.PRO940
出願人は、本出願において「PRO940」と命名した、CD33及びOB結合プロテイン−2と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸残基1〜544を持つPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸残基約16〜544あるいはFig93(配列番号:259)の1又は約16からX(ここで、XはFig93(配列番号:259)の394〜403の任意のアミノ酸である)を持つPRO940ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO940をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209754として1998年4月7日に寄託されたDNA54002−1367ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO940ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO940ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig93(配列番号:259)の残基1〜544を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の他の実施態様は、Fig93(配列番号:259)のアミノ酸約16〜544あるいはFig93(配列番号:259)の1又は約16からX(ここで、XはFig93(配列番号:259)の394〜403の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO940ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO940ポリペプチドは、ATCC209754として1998年4月7日に寄託されたDNA54002−1367ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0156】
41.PRO941
出願人は、本出願において「PRO941」と命名した、カドヘリンタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸残基1〜772を持つPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸残基約22〜772あるいはFig95(配列番号:264)の1又は約22からX(ここで、XはFig95(配列番号:264)の592〜601の任意のアミノ酸である)を持つPRO941ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO941をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209747として1998年4月7日に寄託されたDNA53906−1368ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO941ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO941ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig95(配列番号:264)の残基1〜772を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig95(配列番号:264)のアミノ酸約21〜772あるいはFig95(配列番号:264)の1又は約22からX(ここで、XはFig95(配列番号:264)の592〜601の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO941ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO941ポリペプチドは、ATCC209747として1998年4月7日に寄託されたDNA53906−1368ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA6415と命名された、Fig96(配列番号:265)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0157】
42.PRO944
出願人は、本出願において「PRO944」と命名した、ウェルシュ菌エンテロトキシンレセプター(CPE−R)と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸残基1〜211を持つPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸残基約22〜229あるいはFig98(配列番号:270)の1又は約22からX(ここで、XはFig98(配列番号:270)の77〜80の任意のアミノ酸である)を持つPRO944ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO944をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209861として1998年5月14日に寄託されたDNA52185−1370ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO944ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO944ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig98(配列番号:270)の残基1〜211を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig98(配列番号:270)のアミノ酸約22〜211あるいは図98(配列番号270)の1又は約22からX(ここで、XはFig98(配列番号:270)の77〜86の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO944ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO944ポリペプチドは、ATCC209861として1998年5月14日に寄託されたDNA52185−1370ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA14007と命名された、Fig99(配列番号:271)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12733と命名された、Fig100(配列番号:272)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12746と命名された、Fig101(配列番号:273)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12834と命名された、Fig102(配列番号:274)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA12846と命名された、Fig103(配列番号:275)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13104と命名された、Fig104(配列番号:276)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13259と命名された、Fig105(配列番号:277)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13959と命名された、Fig106(配列番号:278)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13961と命名された、Fig107(配列番号:279)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0158】
43.PRO983
出願人は、本出願において「PRO983」と命名した、小胞関連タンパク質VAP−33と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸残基1〜243を持つPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸残基1〜X(ここで、XはFig109(配列番号:284)の219〜228の任意のアミノ酸である)を持つPRO983ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO983をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209862として1998年5月14日に寄託されたDNA53977−1371ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO983ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO983ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig109(配列番号:284)の残基1〜243を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig109(配列番号:284)のアミノ酸1〜X(ここで、XはFig109(配列番号:284)の219〜228の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO983ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO983ポリペプチドは、ATCC209862として1998年5月14日に寄託されたDNA53977−1371ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA17130と命名された、Fig110(配列番号:285)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA23466と命名された、Fig111(配列番号:286)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA26818と命名された、Fig112(配列番号:287)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA37618と命名された、Fig113(配列番号:288)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA41732と命名された、Fig114(配列番号:289)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA45980と命名された、Fig115(配列番号:290)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA46372と命名された、Fig116(配列番号:291)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0159】
44.PRO1057
出願人は、本出願において「PRO1057」と命名した、プロテアーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸残基1〜413を持つPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸残基約17〜413を持つPRO1057ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1057をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209867として1998年5月14日に寄託されたDNA57253−1382ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1057ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1057ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig118(配列番号:296)の残基1〜413を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig118(配列番号:296)のアミノ酸約17〜413を含んでなるPRO1057ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1057ポリペプチドは、ATCC209867として1998年5月14日に寄託されたDNA57253−1382ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0160】
45.PRO1071
出願人は、本出願において「PRO1071」と命名した、トロンボスポンジンと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸残基1〜525を持つPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸残基約26〜525を持つPRO1071ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1071をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209879として1998年5月20日に寄託されたDNA58847−1383ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1071ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1071ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig120(配列番号:301)の残基1〜525を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig120(配列番号:301)のアミノ酸約26〜525を含んでなるPRO1071ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1071ポリペプチドは、ATCC209879として1998年5月20日に寄託されたDNA58847−1383ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0161】
46.PRO1072
出願人は、本出願において「PRO1072」と命名した、レダクターゼタンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸残基1〜336を持つPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸残基約22〜336を持つPRO1072ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1072をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209868として1998年5月14日に寄託されたDNA58747−1384ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1072ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1072ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig122(配列番号:303)の残基1〜336を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig122(配列番号:303)のアミノ酸約22〜336を含んでなるPRO1072ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1072ポリペプチドは、ATCC209868として1998年5月14日に寄託されたDNA58747−1384ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA40210と命名された、Fig123(配列番号:304)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0162】
47.PRO1075
出願人は、本出願において「PRO1075」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸残基1〜406を持つPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸残基約30〜406を持つPRO1075ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1075をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209869として1998年5月14日に寄託されたDNA57689−1385ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1075ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1075ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig125(配列番号:309)の残基1〜406を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig125(配列番号:309)のアミノ酸約30〜406を含んでなるPRO1075ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1075ポリペプチドは、ATCC209869として1998年5月14日に寄託されたDNA57689−1385ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13059と命名された、Fig126(配列番号:310)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA19463と命名された、Fig127(配列番号:311)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0163】
48.PRO181
出願人は、本出願において「PRO181」と命名した、コルニコン(cornichon)タンパク質と相同性を持つ新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸残基1〜144を持つPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸残基約21〜144又はFig129(配列番号:322)のアミノ酸1もしくは約21からX(ここで、XはFig129(配列番号:322)の52〜61の任意のアミノ酸である)を持つPRO181ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO181をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209775として1998年4月14日に寄託されたDNA23330−1390ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO181ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO181ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig129(配列番号:322)の残基1〜144を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig129(配列番号:322)のアミノ酸約21〜144あるいはFig129(配列番号:322)のアミノ酸1又は約21からX(ここで、XはFig129(配列番号:322)の52〜61の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO181ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO181ポリペプチドは、ATCC209775として1998年4月14日に寄託されたDNA23330−1390ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13242と命名された、Fig130(配列番号:323)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0164】
49.PRO195
出願人は、本出願において「PRO195」と命名した新規な膜貫通ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸残基1〜323を持つPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸残基約32〜323又はFig132(配列番号:330)のアミノ酸1もしくは約32からX(ここで、XはFig132(配列番号:330)の236〜245の任意のアミノ酸である)を持つPRO195ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO195をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209772として1998年4月14日に寄託されたDNA26847−1395ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO195ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO195ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig132(配列番号:330)の残基1〜323を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig132(配列番号:330)のアミノ酸約32〜323あるいはFig132(配列番号:330)のアミノ酸1又は約32からX(ここで、XはFig132(配列番号:330)の236〜245の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO195ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO195ポリペプチドは、ATCC209772として1998年4月14日に寄託されたDNA26847−1395ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA15062と命名された、Fig133(配列番号:331)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA13199と命名された、Fig134(配列番号:332)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0165】
50.PRO865
出願人は、本出願において「PRO865」と命名した新規な分泌ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸残基1〜468を持つPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸残基約24〜229を持つPRO865ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO865をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209774として1998年4月14日に寄託されたDNA53974−1401ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO865ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO865ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig136(配列番号:337)の残基1〜468を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig136(配列番号:337)のアミノ酸約24〜468を含んでなるPRO865ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO865ポリペプチドは、ATCC209774として1998年4月14日に寄託されたDNA53974−1401ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA37642と命名された、Fig137(配列番号:338)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0166】
51.PRO827
出願人は、本出願において「PRO827」と命名した、インテグリンタンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸残基1〜124を持つPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸残基約23〜124を持つPRO827ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO827をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209777として1998年4月14日に寄託されたDNA57039−1402ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO827ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO827ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig139(配列番号:346)の残基1〜124を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig139(配列番号:346)のアミノ酸約23〜124を含んでなるPRO827ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO827ポリペプチドは、ATCC209777として1998年4月14日に寄託されたDNA57039−1402ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0167】
52.PRO1114
出願人は、本出願において「PRO1114」と命名した、サイトカインレセプターファミリー−4タンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1〜311を持つPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基約30〜311又はFig142(配列番号:352)のアミノ酸1もしくは約30からX(ここで、XはFig142(配列番号:352)の225〜234の任意のアミノ酸である)を持つPRO1114ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1114をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209905として1998年5月27日に寄託されたDNA57033−1403ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1114ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1114ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig142(配列番号:352)の残基1〜311を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸約30〜311あるいはFig142(配列番号:352)のアミノ酸1又は約30からX(ここで、XはFig142(配列番号:352)の225〜234の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO1114ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO1114ポリペプチドは、ATCC209905として1998年5月27日に寄託されたDNA57033−1403ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA48466と命名された、Fig143(配列番号:353)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0168】
本出願において「PRO1114インターフェロンレセプター」と命名した新規なインターフェロンレセプターポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA57033−1403)が同定された。
一実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
一側面では、単離された核酸は、(a)Fig142(配列番号:352)の約1又は約30から約311までのアミノ酸残基の配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる。
他の側面では、本発明は、Fig141(配列番号:351)のヌクレオチド約250又は約337と約1182の間で核酸の補体にハイブリダイズするDNAを含んでなるPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしている単離された核酸分子に関する。好ましくは、ハイブリダイゼーションはストリンジェントなハイブリダイゼーション及び洗浄条件下で起こる。
更なる側面では、本発明は、(a)ATCC寄託番号209905(DNA57033−1403)のヒトタンパク質cDNAによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子又は(b)(a)の核酸分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離核酸分子に関する。好適な実施態様では、核酸はATCC寄託番号209905(DNA57033−1403)のヒトタンパク質cDNAによりコードされた同じ成熟ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる。
なお更なる側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNAの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
更なる側面では、本発明は、少なくとも10のヌクレオチドを有し、被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有していれば、被験DNA分子を単離することにより生産される単離核酸分子に関する。
ある特定の側面では、本発明は、N末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを伴うか伴わない、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードしているDNAを含んでなる単離核酸分子、及びその可溶性、すなわち膜貫通ドメイン欠失又は不活性化変異体、又はそのようなコード核酸分子に相補的なものを提供する。シグナルペプチドはFig142(配列番号:352)の配列において約1のアミノ酸位置から約29のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された。膜貫通ドメインはPRO1114インターフェロンレセプターアミノ酸配列において約230のアミノ酸位置から約255のアミノ酸位置まで伸展していると試験的に特定された(Fig142、配列番号:352)。
他の側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNAの補体を含んでなる単離核酸分子に関する。
【0169】
他の実施態様は、ハイブリダイゼーションプローブとしての用途が見出されるPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドコード配列の断片に関する。そのような核酸断片は約20〜約80ヌクレオチド長、好ましくは約20〜約60ヌクレオチド長、より好ましくは約20〜約50ヌクレオチド長、最も好ましくは約20〜約40ヌクレオチド長のものであり、図141(配列番号351)し示されたヌクレオチド配列から引き出される。
他の実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターをコードするDNAを含んでなるベクター又はその変異体を提供する。ベクターは上において特定した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母である。PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを製造する方法が更に提供され、これは、PRO1114インターフェロンレセプターの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養からPRO1114インターフェロンレセプターを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は上記において特定した単離核酸配列の任意のものによってコードされた単離PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
ある特定の側面では、本発明は、ある実施態様では、Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311までを含んでなるアミノ酸配列を含む、単離された未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを提供する。
他の側面では、本発明は、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311の配列に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
更なる側面では、本発明は、Fig142(配列番号:352)の残基1又は約30から約311のアミノ酸配列と比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311を含んでなる、単離されたPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド、又は抗PRO1114インターフェロンレセプター抗体に対して結合部位を提供するのに十分なその断片に関する。好ましくは、PRO1114インターフェロン断片は未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【0170】
また更なる側面では、本発明は、(i)被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig142(配列番号:352)のアミノ酸残基1又は約30から約311までの配列を有するPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有していれば、(ii)被験DNA分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、(iii)細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合したPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドが含まれる。
他の実施態様では、本発明はPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明は未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO1114インターフェロンレセプター抗体である。
更なる実施態様では、本発明は、未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドを候補分子と接触させ、該ポリペプチドにより媒介される生物活性をモニターすることにより、未変性のPRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド、又は上記において記載したアゴニスト又はアンタゴニストを、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて含有する組成物に関する。
【0171】
53.PRO237
出願人は、本出願において「PRO237」と命名した、炭酸脱水酵素と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸残基1〜328を持つPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸残基約24〜328又はFig145(配列番号:358)のアミノ酸1もしくは約24からX(ここで、XはFig145(配列番号:358)の172〜181の任意のアミノ酸である)を持つPRO237ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO237をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209855として1998年5月12日に寄託されたDNA34353−1428ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO237ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO237ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig145(配列番号:358)の残基1〜328を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig145(配列番号:358)のアミノ酸約24〜328あるいはFig145(配列番号:358)のアミノ酸1又は約24からX(ここで、XはFig145(配列番号:358)の172〜181の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO237ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO237ポリペプチドは、ATCC209855として1998年5月12日に寄託されたDNA34353−1428ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0172】
54.PRO541
出願人は、本出願において「PRO541」と命名した、トリプシンインヒビタータンパク質と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸残基1〜500を持つPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸残基約21〜500を持つPRO541ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO541をコードするヌクレオチド配列を含むATCC209910として1998年5月27日に寄託されたDNA45417−1432ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO541ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO541ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig147(配列番号:363)の残基1〜500を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig147(配列番号:363)のアミノ酸約21〜500を含んでなるPRO541ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO541ポリペプチドは、ATCC209910として1998年5月27日に寄託されたDNA45417−1432ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0173】
55.PRO273
出願人は、本出願において「PRO273」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO273ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig149(配列番号:370)のアミノ酸残基1〜111を持つPRO273ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO273ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO273ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig149(配列番号:370)の残基1〜111を含んでなるアミノ酸配列を含む。
【0174】
56.PRO701
出願人は、本出願において「PRO701」と命名した、ニューロリジン(neuroligin)1、2、及び3と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO701ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig151(配列番号:375)のアミノ酸残基1〜816を持つPRO701ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO701をコードするヌクレオチド配列を含む1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO701ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO701ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig151(配列番号:375)の残基1〜816を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO701ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO701ポリペプチドは、1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0175】
57.PRO704
出願人は、本出願において「PRO704」と命名した、VIP36と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO704ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig153(配列番号:380)のアミノ酸残基1〜348を持つPRO704ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO704をコードするヌクレオチド配列を含む、DNA50911−1288としてATCCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO704ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO704ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig153(配列番号:380)の残基1〜348を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO704ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO704ポリペプチドは、DNA50911−1288としてATCCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0176】
58.PRO706
出願人は、本出願において「PRO706」と命名した、前立腺酸性ホスファターゼ及びリソソーム酸性ホスファターゼ前駆体と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO706ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig155(配列番号:385)のアミノ酸残基1〜480を持つPRO706ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO706をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48329−1290としてATCCに1998年4月21日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO706ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO706ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig155(配列番号:385)の残基1〜480を含んでなるか、Fig155(配列番号:385)の残基19〜480を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO706ポリペプチドは、DNA48329−1290としてATCCに1998年4月21日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0177】
59.PRO707
出願人は、本出願において「PRO707」と命名した、カドヘリン、特にカドヘリンFIB3と相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO707ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig157(配列番号:390)のアミノ酸残基1〜916を持つPRO707ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO707をコードするヌクレオチド配列を含むATCCにDNA48306−1291として1998年5月27日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO707ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO707ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig157(配列番号:390)の残基1〜916を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO707ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO707ポリペプチドは、ATCCにDNA48306−1291として1998年5月27日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0178】
60.PRO322
出願人は、本出願において「PRO322」と命名した、ニューロプシンと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO322ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig159(配列番号:395)のアミノ酸残基1又は24から260を持つPRO322ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO322をコードするヌクレオチド配列を含むATCC番号209669として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO322ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO322ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig159(配列番号:395)の残基1又は24から260を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO322ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO322ポリペプチドは、ATCC番号209669として1998年3月11日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0179】
61.PRO526
出願人は、本出願において「PRO526」と命名した、ALSと相同性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO526ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig161(配列番号:400)のアミノ酸残基1〜473を持つPRO526ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO526をコードするヌクレオチド配列を含むDNA44184−1319としてATCCに1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO526ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO526ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig161(配列番号:400)の残基1〜473を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO526ポリペプチドはDNA44184−1319としてATCCに1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0180】
62.PRO531
出願人は、本出願において「PRO531」と命名した、プロトカドヘリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO531ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig163(配列番号:405)のアミノ酸残基1〜789を持つPRO531ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO531をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48314−1320として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO531ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO531ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig163(配列番号:405)の残基1〜789を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO531ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO531ポリペプチドは、DNA48314−1320として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0181】
63.PRO534
出願人は、本出願において「PRO534」と命名した、ジスルフィドイソメラーゼ(ここではしばしばプロテインジスルフィドイソメラーゼと呼ぶ)と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO534ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig165(配列番号:410)のアミノ酸残基1〜360を持つPRO534ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO534をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48333−1321として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO534ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO534ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig165(配列番号:410)の残基1〜360を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO534ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO534ポリペプチドは、DNA48333−1321として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0182】
64.PRO697
出願人は、本出願において「PRO697」と命名した、sFRPsと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO697ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig167(配列番号:415)のアミノ酸残基1〜295を持つPRO697ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO697をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50920−1325として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO697ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO697ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig167(配列番号:415)の残基1〜295を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO697ポリペプチドは、DNA50920−1325として1998年3月26日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0183】
65.PRO717
出願人は、本出願において「PRO717」と命名した新規な12膜貫通ポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO717ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig169(配列番号:420)のアミノ酸残基1〜560を持つPRO717ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO717をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50988−1326としてATTCに1998年4月28日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO717ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO717ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig169(配列番号:420)の残基1〜560を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO717ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO717ポリペプチドは、DNA50988−1326として1998年4月28日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0184】
66.PRO731
出願人は、本出願において「PRO731」と命名した、プロトカドヘリン4と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO731ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig171(配列番号:425)のアミノ酸残基1〜1184を持つPRO731ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO731をコードするヌクレオチド配列を含むDNA48331−1329としてATTCに1998年3月31日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO731ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO731ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig171(配列番号:425)の残基1〜1184を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO731ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO731ポリペプチドは、DNA48331−1329として1998年3月31日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0185】
67.PRO218
出願人は、本出願において「PRO218」と命名した、膜調節タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO218ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig173(配列番号:430)のアミノ酸残基1〜455を持つPRO218ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO218をコードするヌクレオチド配列を含むDNA30867−1335としてATTCに1998年4月28日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO218ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO218ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig173(配列番号:430)の残基1〜455を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO218ポリペプチドは、DNA30867−1335として1998年4月28日にATTCに寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA14472と命名された、Fig174(配列番号:431)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA15846と命名された、Fig175(配列番号:432)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0186】
68.PRO768
出願人は、本出願において「PRO768」と命名した、インテグリンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO768ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig177(配列番号:437)のアミノ酸残基1〜1141を持つPRO768ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO768をコードするヌクレオチド配列を含むDNA55737−1345として1998年4月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO768ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO768ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig177(配列番号:437)の残基1〜1141を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO768ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO768ポリペプチドは、DNA55737−1345として1998年4月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0187】
69.PRO771
出願人は、本出願において「PRO771」と命名した、テスチカンと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO771ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig179(配列番号:442)のアミノ酸残基1〜436を持つPRO771ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO771をコードするヌクレオチド配列を含むDNA49829−1346としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO771ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO771ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig179(配列番号:442)の残基1〜436を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO771ポリペプチドは、DNA49829−1346としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0188】
70.PRO733
出願人は、本出願において「PRO733」と命名した、T1/ST2レセプター結合タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO733ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig181(配列番号:447)のアミノ酸残基1〜229を持つPRO733ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO733をコードするヌクレオチド配列を含むDNA52196−1348としてATTCに1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO733ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO733ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig181(配列番号:447)の残基1〜229を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO733ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO733ポリペプチドは、DNA52196−1348として1998年4月7日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0189】
71.PRO162
出願人は、本出願において「PRO162」と命名した、膵炎随伴タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO162ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig183(配列番号:452)のアミノ酸残基1〜175を持つPRO162ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO162をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56965−1356としてATTCに1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO162ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO162ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig183(配列番号:452)の残基1〜175を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO162ポリペプチドは、DNA56965−1356として1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0190】
72.PRO788
出願人は、本出願において「PRO788」と命名した、抗悪性腫瘍尿タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO788ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig185(配列番号:454)のアミノ酸残基1〜125を持つPRO788ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO788をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56405−1357としてATTCに1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO788ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO788ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig185(配列番号:454)の残基1〜125を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、PRO788ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO788ポリペプチドは、DNA56405−1357として1998年5月6日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0191】
73.PRO1008
出願人は、本出願において「PRO1008」と命名した、dickkopf−1(dkk−1)と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1008ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig187(配列番号:456)のアミノ酸残基1〜266を持つPRO1008ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1008をコードするヌクレオチド配列を含むDNA57530−1375としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1008ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1008ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig187(配列番号:456)の残基1〜266を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1008ポリペプチドは、DNA57530−1375として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA16508と命名された、Fig188(配列番号:457)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0192】
74.PRO1012
出願人は、本出願において「PRO1012」と命名した、ジスルフィドイソメレアーゼ及びホスホリパーゼCと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1012ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig190(配列番号:459)のアミノ酸残基1〜747を持つPRO1012ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1012をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56439−1376としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1012ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1012ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig190(配列番号:459)の残基1〜747を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1012ポリペプチドは、DNA56439−1376として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0193】
75.PRO1014
出願人は、本出願において「PRO1014」と命名した、レダクターゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1014ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig192(配列番号:464)のアミノ酸残基1〜300を持つPRO1014ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1014をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56409−1377としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1014ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1014ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig192(配列番号:464)の残基1〜300を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1014ポリペプチドは、DNA56409−1377として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0194】
76.PRO1017
出願人は、本出願において「PRO1017」と命名した、HNK−1スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1017ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig194(配列番号:466)のアミノ酸残基1〜414を持つPRO1017ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1017をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56112−1379としてATTCに1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1017ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1017ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig194(配列番号:466)の残基1〜414を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1017ポリペプチドは、DNA56112−1379として1998年5月20日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0195】
77.PRO474
出願人は、本出願において「PRO474」と命名した、デヒドロゲナーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO474ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig196(配列番号:468)のアミノ酸残基1〜270を持つPRO474ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO474をコードするヌクレオチド配列を含むDNA56045−1380としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO474ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO474ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig196(配列番号:468)の残基1〜270を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO474ポリペプチドは、DNA56045−1380として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0196】
78.PRO1031
出願人は、本出願において「PRO1031」と命名した、IL−17と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1031ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig198(配列番号:470)のアミノ酸残基1〜180を持つPRO1031ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1031をコードするヌクレオチド配列を含むDNA59294−1381としてATTCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1031ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1031ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig198(配列番号:470)の残基1〜180を含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO1031ポリペプチドは、DNA59294−1381として1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0197】
79.PRO938
出願人は、本出願において「PRO938」と命名した、プロテインジスルフィドイソメラーゼと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸残基1〜349を持つPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、単離された核酸は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸残基約23〜349又はFig200(配列番号:472)のアミノ酸1もしくは約23からX(ここで、XはFig200(配列番号:472)の186〜195の任意のアミノ酸である)を持つPRO938ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO938をコードするヌクレオチド配列を含むATCC受託番号209857として1998年5月12日に寄託されたDNA56433−1406ベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO938ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO938ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig200(配列番号:472)の残基1〜349を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、Fig200(配列番号:472)のアミノ酸約23〜349あるいはFig200(配列番号:472)のアミノ酸1又は約23からX(ここで、XはFig200(配列番号:472)の186〜195の任意のアミノ酸である)を含んでなるPRO938ポリペプチドに関する。場合によっては、PRO938ポリペプチドは、ATCC受託番号209857として1998年5月12日に寄託されたDNA56433−1406ベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0198】
80.PRO1082
出願人は、本出願において「PRO1082」と命名した、レクチン様酸化LDLレセプターと配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1082ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig202(配列番号:477)のアミノ酸残基1〜201を持つPRO1082ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1082をコードするヌクレオチド配列を含むDNA53912−1457としてATCCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1082ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1082ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig202(配列番号:477)の残基1〜201を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様は、細胞外ドメインを除く、PRO1082ポリペプチドの単離されたドメインに関する。場合によっては、PRO1082ポリペプチドは、DNA53912−1457としてATCCに1998年5月14日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
【0199】
81.PRO1083
出願人は、本出願において「PRO1083」と命名した、7TMレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質1、及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質と配列同一性を有する新規なポリペプチドをコードするcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明はPRO1083ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig204(配列番号:483)のアミノ酸残基1〜693を持つPRO1083ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、PRO1083をコードするヌクレオチド配列を含むDNA50921−1458としてATCCに1998年5月12日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO1083ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO1083ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig204(配列番号:483)の残基1〜693を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明の更なる実施態様はPRO1083ポリペプチドの単離された細胞外ドメインに関する。場合によっては、PRO1083ポリペプチドは、DNA50921−1458としてATCCに1998年5月12日に寄託されたベクターのcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の実施態様では、本発明は、ここにDNA24256と命名された、Fig205(配列番号:484)のヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0200】
82.PRO200
上記において一般的に記載した本発明の目的は、ここでPRO200とも命名した新規なポリペプチドであるVEGF−E(配列番号:488)、及びそれをコードする核、配列番号:487、残基259〜1293の提供による少なくとも部分的には達成される。
一実施態様では、本発明はVEGF−EポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig207(配列番号:488)のアミノ酸残基1〜345を持つVEGF−EポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の実施態様では、VEGF−E核酸が単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
他の実施態様では、本発明は単離されたVEGF−Eポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列VEGF−Eポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig207(配列番号:488)の残基1〜345を含んでなるアミノ酸配列を含む。他の実施態様では、VEGF−Eポリペプチドが単一又は多重の欠失、置換、挿入、切り詰め又はその組み合わせを有する変異体が提供される。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合してここに記載したVEGF−Eポリペプチドを治療的に有効量含有する、細胞の増殖、生存及び/又は分化が望まれる適応症を治療するために有用な組成物に関する。
本発明は、VEGF−Eと同じ生物活性を有する修飾VEGF−Eポリペプチド及び修飾変異体のようなVEGF−Eの関連する実施態様、及びこれらを含有する製薬組成物を更に含む。VEGF−Eのインヒビターもまた提供される。
【0201】
83.PRO285及びPRO286
出願人は、本出願においてPRO285(DNA40021−1154によりコード)及びPRO286(DNA42663−1154によりコード)と命名した、新規なヒトTollポリペプチドをコードする二種の新規なcDNAクローンを同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig209(配列番号:496)のアミノ酸残基27〜839を有するPRO285ポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(b)Fig211(配列番号:498)のアミノ酸残基27〜825を有するPRO286ポリペプチドをコードしているDNA分子、又は(c)(a)もしくは(b)のDNA分子の補体に対して、少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig209(配列番号:496)のアミノ酸1〜839の配列を含んでなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するか;Fig211(配列番号:498)のアミノ酸1〜1041の配列を含んでなるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドと少なくとも約90%、好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含んでなる。
特定の実施態様では、本発明は、N末端シグナル配列を持つか持たず、各全長配列の膜貫通領域を持つか持たない、未変性又は変異体PRO285及びPRO286ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、Fig209(配列番号:496)のアミノ酸残基1〜1049及びFig211(配列番号:498)のアミノ酸残基1〜1041を持つ成熟全長未変性PRO285又はPRO286ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的である。他の側面では、本発明は、N末端シグナル配列を持たない未変性PRO285又はPRO286をコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸に相補的である単離された核酸分子に関する。更に他の実施態様では、本発明は全長未変性PRO285又はPRO286タンパク質の膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型をコードする核酸に関する。
他の実施態様では、単離された核酸分子は、ATCC番号209389として1997年10月17日に寄託されたクローン(DNA40021−1154);又はATCC番号209386として1997年10月17日に寄託されたクローン(DNA42663−1154)を含んでなる。
更に他の実施態様では、本発明はPRO285又はPRO286をコードするDNAを含んでなるベクター、又はその変異体を提供する。しかして、ベクターは、上述した単離核酸分子の任意のものを含みうる。
【0202】
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO285及びPRO286ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO285及びPRO286ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig209及び211(配列番号:496及び498)の残基1〜1049及び1〜1041を含んでなるアミノ酸配列を含む。本発明はまた上に記載した単離核酸分子の任意のものによりコードされるPRO285及びPRO286の変異体も提供する。特定の変異体には、これらに限定されるものではないが、各N末端シグナル配列を欠くか及び/又はその各膜貫通及び/又は細胞質ドメインが欠失もしくは不活性化された全長未変性配列PRO285及びPRO286ポリペプチドの欠失(切り詰め)変異体が含まれる。
本発明はまた二重特異性を持つ抗体、例えば一を越えるTollペプチドに結合する二重特異的抗体を特に含む。
更に他の実施態様では、本発明は未変性PRO285及びPRO286ポリペプチドのアゴニストもしくはアンタゴニストに関する。特定の実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗PRO285又は抗PRO286抗体である。
更なる実施態様では、本発明は未変性のPRO285及びPRO286ポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定するスクリーニング検定法に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と組み合わせて、PRO285又はPRO286ポリペプチド、又は上述したアゴニスト又はアンタゴニストを含有してなる組成物に関する。
本発明はまたPRO285又はPRO286ポリペプチドのアンタゴニストの有効量を患者に投与することを含んでなる感染性ショックを治療する方法に関する。特定の実施態様では、アンタゴニストは未変性PRO285又はPRO286ポリペプチドを特異的に結合する阻止抗体である。
【0203】
84.PRO213−1、PRO1330及びPRO1449
本発明は、ヒトを含む哺乳類における腫瘍性細胞成長及び増殖の診断と治療のための組成物と方法に関する。本発明は腫瘍細胞のゲノムにおいて増幅される遺伝子の同定に基づく。そのような遺伝子増幅には遺伝子産物の過剰発現が付随し腫瘍形成に寄与すると予想される。従って、増幅された遺伝子によりコードされるタンパク質は、ある種のガンの診断及び/又は治療(予防を含む)に対する有用な標的であると信じられ、腫瘍治療の予後のプレディクターとして作用しうる。
一実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸分子は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273を有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。単離された核酸配列は、1998年4月21日に寄託されたDNA30943−1163(ATTC209791)、1998年9月9日に寄託されたDNA64907−1163−1(ATTC203242)及び/又は1998年9月9日に寄託されたDNA64908−1163−1(ATTC203243)と命名されたベクターのcDNA挿入断片を含みうる。
他の実施態様では、本発明は、(a)Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273をそれぞれ有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する単離された核酸分子を含んでなる。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig213(配列番号:506)の残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273をそれぞれ含んでなるアミノ酸配列を含む。場合によっては、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドは、DNA30943−1163(ATTC209791)、DNA64907−1163−1(ATTC203242)又はDNA64908−1163−1(ATTC203243)のcDNA挿入断片によりコードされるポリペプチドを発現させることにより得られるか得られうる。
他の側面では、本発明は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273に少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明は、Fig213(配列番号:506)のアミノ酸残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273又はFig217(配列番号:510)の20〜273を含んでなる、単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチド、又は抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体を提供するのに十分なその断片を提供する。好ましくは、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449断片は未変性のPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの定性的生物活性を保持する。
【0204】
更なる側面では、本発明は、Fig213(配列番号:506)の残基1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273のアミノ酸配列とそれぞれ比較したとき、少なくとも約80%のポジティブ、好ましくは少なくとも約85%のポジティブ、より好ましくは少なくとも約90%のポジティブ、最も好ましくは少なくとも約95%のポジティブのスコアを示すアミノ酸配列を含んでなる、単離されたPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに関する。
また更なる側面では、本発明は、(i)被験DNA分子をストリンジェントな条件下で、(a)Fig213(配列番号:506)の1〜295、Fig215(配列番号:508)の20〜273及びFig217(配列番号:510)の20〜273のアミノ酸残基を有するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをそれぞれコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と、ハイブリダイズさせ、被験DNA分子が(a)又は(b)に対して少なくとも約80%の配列同一性を有していれば、(ii)被験DNA分子を含んでなる宿主細胞をポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、(iii)細胞培養からポリペプチドを回収することにより生産されるポリペプチドを提供する。
一実施態様では、本発明はPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに結合する単離された抗体に関する。一側面では、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを過剰発現する細胞の死を誘導する。他の側面では、抗体はモノクローナル抗体であり、これは好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)酸基を有する。抗体は標識されても固体支持体上に固定化されてもよい。更なる側面では、抗体は抗体断片、単鎖抗体、又は抗イディオタイプ抗体である。
他の実施態様では、本発明は、製薬的に許容可能な担体と混合して、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドに結合する抗体を含有する組成物に関する。一側面では、組成物は治療的に有効量の抗体を含有する。他の側面では、組成物は更に活性成分を含有し、この成分は例えば更なる抗体又は細胞毒性もしくは化学療法剤でありうる。好ましくは組成物は無菌である。
更なる実施態様では、本発明は抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体をコードする核酸、及びそのような核酸を含んでなるベクター及び宿主細胞に関する。
本発明は更にPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの機能又は活性の一又は複数を阻害するPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドのアンタゴニスト及びアゴニストに関する。
更なる実施態様では、本発明はPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードする核酸分子の補体にハイブリダイズする単離された核酸分子に関する。核酸分子は好ましくはDNAであり、ハイブリダイゼーションは好ましくはストリンジェントな条件下で生じる。そのような核酸分子は、ここで同定された増幅遺伝子のアンチセンス分子として作用し、これにより、各増幅遺伝子の変調における用途、あるいは増幅反応におけるアンチセンスプライマーとしての用途が見出される。更に、そのような配列はリボザイム及び/又は三重らせん体配列の一部として使用でき、これにより、増幅遺伝子の調節に使用されうる。
他の実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを含む疑いのある細胞を抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体に暴露し、細胞への抗体の結合性を測定することを含んでなる、ポリペプチドPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの有無を測定する方法に関する。
更に他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料と(b)同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料中で、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードする遺伝子の発現のレベルを検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関し、ここで、被験試料の高い発現レベルが、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。
【0205】
他の実施態様では、本発明は、(a)哺乳動物から得られた組織細胞の被験試料に抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体を接触させ、(b)被験試料中における抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体とPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの間の複合体の生成を検出することを含んでなる、哺乳動物における腫瘍の診断方法に関する。検出は定量的とも定性的ともしえ、同じ細胞型の既知の正常な組織細胞の対照試料における複合体の生成をモニターして比較しながらなされる。被験試料中に生成された多量の複合体が、被験組織細胞が得られた哺乳動物中に腫瘍が存在することを示す。抗体は好ましくは検出可能な標識を担持する。複合体生成は、光学顕微鏡、フローサイトメトリー、蛍光定量法、あるいは他の当該分野で知られている方法によりモニターすることができる。被験試料は通常は腫瘍細成長又は増殖(例えば癌細胞)を有する疑いのある個人から得られる。
他の実施態様では、本発明は、抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体と担体(例えばバッファー)を適当な包装中に含んでなるガン診断キットに関する。好ましくはキットはPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを検出するために抗体を使用するための指示を含む。
更なる他の実施態様では、本発明は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドを過剰発現する細胞を、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害する有効量の薬剤に暴露することを含んでなる、腫瘍細胞の増殖を阻止する方法に関する。該薬剤は好ましくは抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体、小さい無機及び有機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス又はリボザイム分子、あるいは三重らせん体分子である。特定の側面では、該薬剤、例えば抗PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449抗体は細胞死を誘導する。更なる側面では、腫瘍細胞は放射線治療及び/又は細胞毒性又は化学療法剤に更に暴露される。
更なる実施態様において、本発明は、
a) 容器;
b) 容器上のラベル;及び
c) 容器内に含まれる活性剤を含有する組成物を含んでなる、製造物品に関し、ここで組成物は、腫瘍細胞の増殖を阻止するのに有効であり、容器上のラベルには、組成物がPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの過剰発現により特徴づけられる症状を治療するために使用でき、組成物中の活性剤は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害する薬剤であることが示される。好適な側面では、活性剤は、抗PRO213−1、抗PRO1330及び/又は抗PRO1449抗体である。
また更なる実施態様では、本発明は、候補化合物をPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドと、これら二つの化合物が相互作用するのに十分な条件と時間の間接触させることを含んでなる、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの発現及び/又は活性を阻害可能な化合物を同定する方法を提供する。特定の側面では、候補化合物かPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドの何れかが固体支持体上に固定化される。他の側面では、非固定化成分が検出可能な標識を担持する。
【0206】
85.PRO298
出願人は新規なポリペプチドをコードするcDNAを同定した。DNAは本出願において「PRO298」と称される、新規な多膜貫通タンパク質をコードする「DNA39975−1210」と命名した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig219(配列番号:515)のアミノ酸1〜364の配列を含んでなるPRO298をコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子を提供する。一側面では、単離された核酸は、図219(配列番号515)のアミノ酸残基1〜364を持つPRO298ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。
更なる実施態様では、本発明は、(a)ATCC寄託番号209783(DNA39975−1210)のヒトタンパク質cDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体と少なくとも80%の配列同一性を有するDNAを含んでなる単離された核酸分子に関する。
また更なる実施態様では、本発明は、ATCC寄託番号209783(DNA39975−1210)のヒトタンパク質cDNAによりコードされる同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子を含んでなる核酸に関する。
他の実施態様では、本発明は単離されたPRO298ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO298ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig219(配列番号:515)の残基1〜364を含んでなるアミノ酸配列を含む。
多の実施態様では、本発明はFig220(配列番号:516)のヌクレオチド配列を含んでなるDNA26832と命名された、発現された配列タグ(EST)を提供する。
【0207】
86.PRO337
出願人は、本出願において「PRO337」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA43316−1237)を同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig222(配列番号:523)のアミノ酸1〜344の配列を含んでなるPRO337ポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約85%、より好ましくは約90%、最も好ましくは約95%である。一側面では、単離された核酸は、図222(配列番号523)のアミノ酸残基1〜344を持つポリペプチドと少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%(96、97、98及び99%を含む)の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、免疫グロブリン及び主要組織適合性ドメイン(図222、配列番号523のアミノ酸113〜130)内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig222(配列番号:523)のアミノ酸残基約1〜344を持つニューロトリミンポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ATCC209487でATTCに寄託されたクローンDNA43316−1237の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ATCC209487で寄託されたクローンDNA43316−1237のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたPRO337ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO337ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig222(配列番号:523)の残基1〜344を含んでなるアミノ酸配列を含む。未変性シグナル配列を持つか持たず(Fig222(配列番号:523)のアミノ酸1〜約28)、開始メチオニンを持つか持たない未変性PRO337ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ATCC209487で寄託された核酸によりコードされるPRO337ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はDNA42301(配列番号:524)としてFig223において同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)及び他の配列断片を提供する。
【0208】
87.PRO403
出願人は、本出願において「PRO403」と命名した新規なポリペプチドをコードするcDNAクローン(DNA55800−1263)を同定した。
一実施態様では、本発明は、(a)Fig225(配列番号:526)のアミノ酸1〜736の配列を含んでなるPRO403ポリペプチドをコードするDNA、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%の配列同一性を有する単離された核酸分子を提供する。配列同一性は、好ましくは約85%、より好ましくは約90%、最も好ましくは約95%である。一側面では、単離された核酸は、図225(配列番号526)のアミノ酸残基1〜736を持つポリペプチドと少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の配列同一性を有する。好ましくは、配列同一性の最も高い度合いは、(1)推定上のNグリコシル化部位(アミノ酸残基132、136、177、237、282、349、505、598及び606);(2)Kell血液型タンパク質ファミリー(アミノ酸残基65、70、88及び96)及び推定上の亜鉛結合モチーフ(アミノ酸残基570−579)が保存されたCys残基内で生じる。
更なる実施態様では、単離された核酸分子は、Fig225(配列番号:526)のアミノ酸残基約1〜736を持つPRO403ポリペプチドをコードするDNAを含んでなるか、そのようなコード核酸配列に相補的であり、少なくとも中程度の条件下、場合によっては高度にストリンジェントな条件下でそれに安定して結合する。他の側面では、本発明は、受託番号ATCC209680でATTCに寄託されたクローンDNA55800−1263の全長タンパク質の核酸、あるいは受託番号ATCC209680で寄託されたクローンDNA55800−1263のコード配列を提供する。
更に他の実施態様では、本発明は単離されたPRO403ポリペプチドを提供する。特に、本発明は単離された未変性配列PRO403ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは一実施態様ではFig225(配列番号:526)の残基1〜736を含んでなるアミノ酸配列を含む。開始メチオニンを持つか持たない未変性PRO403ポリペプチドが特に含まれる。あるいは、本発明は、受託番号ATCC209680で寄託された核酸によりコードされるPRO403ポリペプチドを提供する。
更に他の実施態様では、本発明はここにDNA34415(Fig226A−B;配列番号:527);DNA49830(Fig227;配列番号:528)及びDNA49831(Fig228;配列番号:529)として同定されたヌクレオチド配列を含んでなる発現された配列タグ(EST)及び他の配列断片を提供する。
【0209】
88.更なる実施態様
本発明の他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含んでなるベクターを提供する。そのようなベクターを含んでなる宿主細胞もまた提供される。例を挙げると、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又は酵母である。上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを製造する方法が更に提供され、これは、所望のポリペプチドの発現に適した条件下で宿主細胞を培養し、細胞培養から所望のポリペプチドを回収することを含んでなる。
他の実施態様では、本発明は、異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものを含んでなるキメラ分子を提供する。そのようなキメラ分子の例としては、免疫グロブリンのFc領域又はエピトープタグ配列に融合した上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものが含まれる。
他の実施態様では、本発明は上述したあるいは後記するポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体である。
また他の実施態様では、本発明はゲノム及びcDNAヌクレオチド配列を単離するのに有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、これらプローブは上述したあるいは後記するヌクレオチド配列の任意のものから取り出されうる。
【0210】
他の実施態様では、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一側面においては、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されている全長アミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン,又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
他の側面においては、単離された核酸分子は、(a)ここに開示されている全長PROポリペプチドcDNAのコード化配列を含んでなるDNA分子、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くPROポリペプチドのコード化配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメインのコード化配列、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片のコード化配列、或いは(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる。
【0211】
さらなる側面においては、本発明は、(a)ここに開示されているATCCへ寄託されている全てのヒトタンパク質cDNAによってコードされているのと同じ成熟ポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の補体に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子に関する。
その他の側面において、本発明は、PROポリペプチドの膜貫通タンパク質がここにおいて開示されていて、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性化となっているPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、或いはそのようなヌクレオチド配列に対して相補的なを含んでなる単離された核酸分子を提供する。
【0212】
その他の実施態様では、例えば、抗−PRO抗体の結合部位を含むポリペプチドを選択的にコードするPROポリペプチドのコード化断片のためのハイブリダイゼーションプローブ、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドプローブとしての使用を見出すことができるPROポリペプチドコード化配列の断片、又はその補体について向けられている。そのような核酸断片は、文脈において「約」という語句が引用されているヌクレオチド配列の長さのプラス又はマイナス10%を意味していて、通常少なくとも約20ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約30ヌクレオチド長、さらに好ましくは少なくとも約40ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約50ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約60ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約70ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約80ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約90ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約100ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約110ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約120ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約130ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約140ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約150ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約160ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約170ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約180ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約190ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約200ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約250ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約300ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約350ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約400ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約450ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約500ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約600ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約700ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約800ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約900ヌクレオチド長、なおさらに好ましくは少なくとも約1000ヌクレオチド長である。PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列の新規の断片は、任意の良く知られた配列アライメントプログラムを使用し、PROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列と他の既知のヌクレオチド配列を整列させ、どのPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列断片が新規であるのかを決定することによる日常的方法によって決定が可能であることは注目される。全てのそのようなPROポリペプチドコード化配列はが、本出願において検討される。さらに、検討されるのは、これらヌクレオチド配列断片によってコードされているPROポリペプチド、好ましくは抗−PRO抗体の結合部位を含むこれらPROポリペプチド断片である。
【0213】
その他の実施態様では、本発明は、上文において特定された全ての単離された核酸配列によってコードされている単離されたPROポリペプチドを提供する。
ある側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有する全長PROポリペプチド、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されたATCCへ寄託された全てのヒトタンパク質cDNAによってコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも約80%配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約82%配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも83%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも84%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも85%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも86%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも87%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも88%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも89%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも90%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも91%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも92%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも93%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも94%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも95%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも96%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも97%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも98%の配列同一性、なおさらに好ましくは少なくとも99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
【0214】
さらなる側面においては、本発明は、ここに開示されている全長アミノ酸配列を有するPROポリペプチドのアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示されているシグナルペプチドを伴う又は伴わない膜貫通PROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示されている全長アミノ酸配列の全ての特異的に定義された断片と比較して、少なくとも約80%の陽性(ポジティブ)、好ましくは少なくとも約81%の陽性(ポジティブ)、さらに好ましくは少なくとも約82%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも83%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも84%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも85%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも86%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも87%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも88%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも89%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも90%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも91%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも92%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも93%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも94%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも95%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも96%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも97%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも98%の陽性(ポジティブ)、なおさらに好ましくは少なくとも99%の陽性(ポジティブ)のスコアのアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
特別な側面においては、本発明は、N−末端シグナル配列及び/又は開始メチオニンを含まず、前記に記載したようなアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされている単離されたPROポリペプチドを提供する。PROポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びPROポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたPROポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
【0215】
その他の側面においては、本発明は、膜貫通ドメイン欠損又は膜貫通ドメイン不活性の単離されたPROポリペプチドを提供する。PROポリペプチドの発現に適した条件下にある適切なコード化核酸分子を含むベクターを含んでなる宿主細胞の培養、及びPROポリペプチドを培養細胞から回収することを含む工程である、単離されたPROポリペプチドを生産する工程が同じくここに開示されている。
さらなるその他の実施態様においては、ここにおいて開示される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様においては、アゴニスト又はアンタゴニストは、抗−PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様においては、PROポリペプチドを候補化合物と接触せしめ、そして前記PROポリペプチドによって仲介される生物活性を監視することを含むPROポリペプチドに対するアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関する。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
さらにさらなる実施態様においては、本発明は、PROポリペプチド、又はここに開示されるPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、抗−PRO抗体を含んでなる製造品で容器との組合せに関する。選択的には、容器は、製薬的に許容しうるものである。
本発明のその他の実施態様は、PROポリペプチドの使用、又はPROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト或いは抗−PRO抗体に対して反応性のある条件の治療に有効な薬剤の調製のための前文に記載したようなPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗−PRO抗体を対象としている。
【0216】
(好適な実施態様の詳細な説明)
I.定義
ここで使用される際の「PROポリペプチド」及び「PRO」という用語は、直後に数値符号がある場合に種々のポリペプチドを指し、完全な符号(例えば、PRO/数字)は、ここに記載する特定のポリペプチド配列を意味する。ここで使用される「PRO/数字ポリペプチド」及び「PRO/数字」は、天然配列ポリペプチド及び変異体(ここで更に詳細に定義する)を含む。ここの記載されるPROポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源といった種々の供給源から単離してもよく、組換え又は合成方法によって調製してもよい。
「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示されている天然配列PROポリペプチドは、関連する図に示されている全長アミノ酸配列を含有する成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び終止コドンは、太い書体及び下線で図中に示さている。しかし、関連する図に開示されているPROポリペプチドがメチオニン残基で開始すると図のアミノ酸位置1において示されている一方で、図のアミノ酸位置1より上流又は下流のいずれかに位置する他のメチオニン残基が、PROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いられることが考えられるし可能である。
【0217】
PROポリペプチド「細胞外ドメイン」又は「ECD」は、膜貫通及び細胞質ドメインを実質的に有しないPROポリペプチドの形態を意味する。通常、PROポリペプチドECDは、それらの膜貫通及び/又は細胞質ドメインを1%未満、好ましくはそのようなドメインを0.5%未満しか持たない。本発明のPROポリペプチドについて同定された任意の膜貫通ドメインは、疎水性ドメインのその型を同定するために当該分野において日常的に使用される基準に従い同定されることが理解されるであろう。膜貫通ドメインの厳密な境界は変わり得るが、最初に同定されたドメインのいずれかの末端から約5アミノ酸を越えない可能性が高い。従って、PROポリペプチド細胞外ドメインは、場合によっては、実施例又明細書おいてに同定された膜貫通ドメインのいずれかの末端から約5を越えないアミノ酸を含みうるし、付着のシグナルペプチドを有する又は有しないそのようなポリペプチド及びそれらをコードする核酸は、本発明において考慮される。
ここに開示する種々のPROポリペプチドの「シグナルペプチド」の適切な位置は、本明細書と添付の図面に示される。しかし、注記するように、シグナルペプチドのC−末端境界は変化しうるが、ここで最初に定義したようにシグナルペプチドC−末端境界のいずれかの側で約5アミノ酸未満である可能性が最も高く、シグナルペプチドのC−末端境界は、そのような型のアミノ酸配列成分を同定するのに日常的に使用される基準に従って同定しうる(例えば、Nielsen等, Prot. Eng. 10: 1−6 (1997)及びvon Heinje等, Nucl. Acids. Res. 14: 4683−4690 (1986))。さらに、幾つかの場合には、分泌ポリペプチドからのシグナルペプチドの切断は完全に均一ではなく、一以上の分泌種をもたらすことも認められる。シグナルペプチドがここに定義されるシグナルペプチドのC−末端境界の何れかの側の約5アミノ酸未満内で切断されるこれらの成熟ポリペプチド、及びそれらをコードするポリヌクレオチドは、本発明で考慮される。
【0218】
「PROポリペプチド変異体」とは、上記又は下記に定義されるように、ここに開示される全長天然配列PROポリペプチド、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性を有する活性PROポリペプチドを意味する。このようなPROポリペプチド変異体には、例えば、全長天然アミノ酸配列のN−又はC−末端において一又は複数のアミノ酸残基が付加、もしくは欠失されたPROポリペプチドが含まれる。通常、PROポリペプチド変異体は、ここに開示される全長天然アミノ酸配列、ここに開示されたシグナルペプチドを欠く全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示されたPROの細胞外ドメイン又はここに開示された全長PROポリペプチドの他の断片と、少なくとも約80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは少なくとも約81%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%のアミノ酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%のアミノ酸配列同一性を有している。通常は、PRO変異体ポリペプチドは、少なくとも約10アミノ酸長、より多くは少なくとも約20アミノ酸長、より多くは少なくとも約30アミノ酸長、より多くは少なくとも約40アミノ酸長、より多くは少なくとも約50アミノ酸長、より多くは少なくとも約60アミノ酸長、より多くは少なくとも約70アミノ酸長、より多くは少なくとも約80アミノ酸長、より多くは少なくとも約90アミノ酸長、より多くは少なくとも約100アミノ酸長、より多くは少なくとも約150アミノ酸長、より多くは少なくとも約200アミノ酸長、より多くは少なくとも約300アミノ酸長、又はそれ以上である。
【0219】
ここに定義されるPROポリペプチドに対してここで同定されている「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、PROポリペプチドのアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラムALIGN−2を使用することによって得られ。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0220】
アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、「PRO」が対象となる仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を表し、「比較タンパク質」が対象となる「比較」タンパク質が比較されているアミノ酸配列を表し、そして「X」、「Y」及び「Z」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表2及び3は、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
【0221】
特に断らない限りは、ここでの全ての%アミノ酸配列同一性値は上記のようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%アミノ酸配列同一性値は、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%アミノ酸配列同一性値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU−BLAST−2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
【0222】
また、%アミノ酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
アミノ酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いれれる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
【0223】
「PRO変異体ポリヌクレオチド」又は「PRO変異体核酸配列」とは、下記に定義されるように、活性PROポリペプチドをコードする核酸分子であり、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチド配列の他の任意の断片をコードする核酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。通常は、PRO変異体ポリペプチドヌクレオチドは、ここに開示する全長天然配列PROポリペプチド配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠いた全長天然配列PROポリペプチド配列、シグナルペプチド有無のここに開示するPROポリペプチドの細胞外ドメイン、又はここに開示する全長PROポリペプチドの他の任意の断片をコードする核酸配列と、少なくとも約80%の核酸配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%の核酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%の核酸配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%の核酸配列同一性を有している。変異体は、天然ヌクレオチド配列を含まない。
通常は、PRO変異体ポリヌクレオチドは、少なくとも約30ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約60ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約90ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約120ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約150ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約180ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約210ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約240ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約270ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約300ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約450ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約600ヌクレオチド長、より多くは少なくとも約900ヌクレオチド長、又はそれ以上である。
【0224】
ここで同定されるPROコード化核酸配列に対する「パーセント(%)核酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、PRO配列のヌクレオチドと同一である候補配列中のヌクレオチドのパーセントとして定義される。パーセント核酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の知る範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、ALIGN−2プログラム用の完全なソースコードが下記の表1に提供されている配列比較プログラALIGN−2を使用することによって得られ。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、下記の表1に示したソースコードは米国著作権事務所,Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2はジェネンテク社、South San Francisco, Californiaから好適に入手可能であり、下記の表1に提供されたソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。
【0225】
核酸配列比較にALIGN−2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN−2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。
核酸配列Cの長さがアミノ酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、「PRO−DNA」が対象となる仮説的PROコード化核酸配列を表し、「比較DNA」が対象となる「PRO−DNA」核酸分子が比較されている核酸配列を表し、そして「N」、「L」及び「V」の各々が異なった仮説的アミノ酸残基を表し、表4及び5が「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO−DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
【0226】
特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は、直上のパラグラフに示したようにALIGN−2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性値は、WU−BLAST−2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて決定してもよい。さらに、殆どのWU−BLAST−2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。WU−BLAST−2が用いられた場合、%核酸配列同一性値は、(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列と、対象とする比較核酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子が比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU−BLAST−2によって決定した一致する同一核酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%の核酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、核酸配列Aが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
【0227】
また、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI−BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389−3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI−BLAST2配列比較プログラムは、http://www.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI−BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe−値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
核酸配列比較にNCBI−BLAST2が用いれれる状況では、与えられた核酸配列Cの、与えられた核酸配列Dとの、又はそれに対する%核酸配列同一性(あるいは、与えられた核酸配列Dと、又はそれに対して或る程度の%核酸配列同一性を持つ又は含む与えられた核酸配列Cと言うこともできる)は次のように計算される:
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI−BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアの核酸残基の数であり、ZはDの全核酸残基数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
他の実施態様では、PRO変異体ポリペプチドヌクレオチドは、活性PROポリペプチドをコードし、好ましくは緊縮性ハイブリッド形成及び洗浄条件下で、ここに開示する全長PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列にハイブリッド形成する核酸分子である。PRO変異体ポリペプチドは、PRO変異体ポリヌクレオチドにコードされるものであってもよい。
【0228】
「陽性(ポジティブ)」という用語は、上記のように実施された配列比較の中で、比較された配列において同一ではないが類似の特性を有している残基(例えば、保存的置換の結果として、下記の表6参照)を含む。ここでの目的のために、陽性の%値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、PROポリペプチド配列が比較されるアミノ酸配列)との間の、WU−BLAST−2のBLOSUM62マトリクス内でポジティブな値を記録したアミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドのアミノ酸残基の総数で除した商によって決定される。
特に断らない限り、陽性の%値は、直上のパラグラフに記載したようにして計算される。WU−BLAST−2コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、ALIGN−2及びNCBI−BLAST2について上記したように実施されるアミノ酸配列同一性には、同一のみならず類似した特性をもつ配列におけるアミノ酸残基を含む。対象とするアミノ酸残基に対して陽性とされたアミノ酸残基は、対象とするアミノ酸残基と同一であるか、又は対象とするアミノ酸残基の好ましい置換(下記の表6に定義)であるものである。
ALIGN−2又はNCBI−BLAST2を用いたアミノ酸配列比較では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する陽性の%値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN−2又はNCBI−BLAST2のA及びBのアラインメントによって陽性であるとされたスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと等しくない場合、AのBに対する%陽性は、BのAに対する%陽性とは異なることが理解されるであろう。
【0229】
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び/又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、PROポリペプチドの自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも1つの精製工程により調製される。
「単離された」PROポリペプチドコード化核酸は、同定され、PROポリペプチドをコードする核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、天然の細胞中に存在するPROポリペプチドコード化核酸分子とは区別される。しかし、単離されたPROポリペプチドコード化核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチドを通常発現する細胞に含まれるPROポリペプチド核酸分子を含む。
【0230】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なDNA配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【0231】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、例えば、単一の抗−PROポリペプチドモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和抗体を含む)、多エピトープ特異性を持つ抗−PRO抗体組成物、一本鎖抗−PRO抗体、及び抗−PRO抗体の断片を包含している(下記参照)。ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能性のある突然変異を除いて同一である集団から得られる抗体を称する。
ハイブリッド形成反応の「緊縮性」は、当業者によって容易に決定され、一般的にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、プローブが長くなると適切なアニーリングのための温度が高くなり、プローブが短くなると温度は低くなる。ハイブリッド形成は、一般的に、相補的鎖がその融点に近いがそれより低い環境に存在する場合における変性DNAの再アニールする能力に依存する。プローブとハイブリッド形成可能な配列との間の所望の相同性の程度が高くなると、使用できる相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は、反応条件をより緊縮性にするが、低い温度は緊縮性を低下させる。さらに、緊縮性は塩濃度に逆比例する。ハイブリッド形成反応の緊縮性の更なる詳細及び説明は、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)を参照のこと。
【0232】
ここで定義される「緊縮性条件」又は「高度の緊縮性条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高緊縮性洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度の緊縮性条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載されているように同定され、上記の緊縮性より低い洗浄溶液及びハイブリッド形成条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度の緊縮性条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mLの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
【0233】
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したPROポリペプチド、又はそれらのドメイン配列を含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープ、又は幾つかの他の試薬によって同定できるエピトープを提供するに十分な数の残基を有しているが、その長さは対象とするPROポリペプチドの活性を阻害しないよう充分に短い。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも6のアミノ酸残基、通常は約8〜約50のアミノ酸残基(好ましくは約10〜約20の残基)を有する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG−1、IgG−2、IgG−3又はIgG−4サブタイプ、IgA(IgA−1及びIgA−2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
【0234】
ここで意図している「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROの形態を意味し、「生物学的」活性とは、天然又は天然発生PROによって生ずる(阻害性又は刺激性の)生物学的機能であって、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を除くものを意味し、「免疫学的」活性とは、天然又は天然発生PROが有する抗原性エピトープに対して抗体を生成する能力を意味する。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を阻止、阻害、又は中和する任意の分子を指す。同様に「アゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、ここに開示した天然PROポリペプチドの生物学的活性を模倣する任意の分子を指す。好適なアゴニスト又はアンタゴニスト分子は特に、アゴニスト又はアンタゴニスト抗体又は抗体断片、天然PROポリペプチドの断片又はアミノ酸配列変異体、ペプチド、有機小分子、などを含む。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストの同定方法は、PROポリペプチドを候補アンタゴニスト又はアゴニストと接触させ、PROポリペプチドに通常付随する一又は複数の生物学的活性の変化を測定することを含みうる。
【0235】
ここで使用される「治療」とは、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法の両方を意味し、患者は標的とする病理学的状態又はしっかんを防止又は低下(減少)させられる。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに疾患に罹りやすいもの又は疾患が防止されているものを含む。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持することを意味する。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の対象のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を意味する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数の治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
【0236】
ここで用いられる「担体」は、製薬的に許容されうる担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、用いられる用量及び濃度でそれらに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。生理学的に許容されうる担体は、水性pH緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容されうる担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸塩のバッファー;アスコルビン酸を含む酸化防止剤;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;疎水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン;グルコース、マンノース又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;マンニトール又は祖ルビトール等の糖アルコール;ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又は非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN(商品名)、ポリエチレングリコール(PEG)、及びPLURONICS(商品名)を含む。
【0237】
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくは無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Fab、Fab’、F(ab’)2、及びFv断片;ダイアボディ(disbodies);直鎖状抗体(Zapata等, Protein Eng. 8(10): 1057−1062 [1995]);一本鎖抗体分子;及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Fc」断片と命名される。ペプシン処理はF(ab’)2断片を生じ、それは2つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。この領域は、密接に非共有結合した1本の重鎖と1本の軽鎖の可変領域の二量体からなる。この配置において各ドメインの3つのCDRが相互作用してVH−VLに量体の表面に抗原結合部位を決定する。正しくは、6つのCDRsが抗体にたいする抗原結合特異性を持つ。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原に特異的な3つのCDRのみを含んでなるFvの半分)でさえ、結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。
またFab断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)も含む。Fab断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖CH1ドメインのカルボキシ末端に幾つかの残基が付加されていることによりFab断片と相違する。ここで、Fab’−SHは、定常ドメインのシステイン残基が遊離のチオール基を持つFab’を表す。F(ab’)2抗体断片は、最初はFab’断片の対として生成され、それらの間にヒンジシステインを有する。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【0238】
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる二つの明らかに異なる型の一方に分類される。
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンは異なるクラスに分類できる。免疫グロブリンの五つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらの幾つかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、
IgG4、IgA及びIgA2に分類される。
「一本鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含む抗体断片を含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、FvポリペプチドはVH及びVLドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはsFVが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。scFvの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer−Verlag, New York, pp. 269−315 (1994)のPluckthunを参照のこと。
用語「ダイアボディ(diabodies)」は、二つの抗原結合部位を持つ小型の抗体断片を指し、その断片は同じポリペプチド鎖(VH−VL)内で軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を含む。同じ鎖の二つのドメイン間に対形成するには短すぎるリンカーを用いることにより、ドメインは強制的に他の鎖の相補的ドメインと対形成して二つの抗原結合部位を生成する。ダイアボディは、例えば、EP 404,097; WO 93/11161; 及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により十分に記載されている。
【0239】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリ法(Lowry method)で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS−PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
「標識」なる語は、ここで用いられる場合、抗体に直接又は間接的に抱合して「標識」抗体を生成する検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識は、それ自身検出可能でもよく(例えば、放射性標識又は蛍光標識)、又は酵素標識の場合、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変換を触媒してもよい。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに意図する固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び/又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(PROポリペプチド又はその抗体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「小分子」とは、ここで、約500ダルトン未満の分子量を持つと定義される。
【0240】
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子−E」又は「VEGF−E」は、Fig207のヒトアミノ酸配列を含むここに記載する哺乳動物成長因子、VEGF及び骨形成タンパク質1と相同性を持つ、及びVEGFの生物学的活性に必要なことが示されたVEGFの全システイン残基の完全変換を含む配列を意味する。VEGF−E発現は、ヒト胎児骨、胸腺、及び胃腸管における発現を含む。天然VEGF−Eの生物学的活性は、その任意の類似物又は変異体に共有され、それは、臍静脈内皮細胞の選択的成長及び/又は生存を促進でき、多能性繊維芽細胞の分化を誘発し、ヒト内皮細胞系における初期遺伝子c−fosを誘発し、心臓細胞において筋細胞肥大を生ずる、又は対応する天然VEGF−Eの少なくとも1つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。ここで、ヒトVEGF−Eは、種に渡っての保存を示すラット及びマウスに対して活性である。さらに、ここのVEGF−Eは、成長板領域で発現され、胎児筋細胞を包含することが示された。
ここで用いられる場合の「血管内皮細胞成長因子」又は「VEGF」は、米国特許第5,332,671号に定義されている哺乳動物成長因子を意味する。天然VEGFの生物学的活性は、それらの類似物又は変異体によって共有され、それらは血管内皮細胞の選択的成長促進できるが、ウシ角膜内皮細胞、レンズ内皮細胞、副腎皮質細胞、BHK−21繊維芽、又はケラチノサイトはせず、又は対応する天然VEGFの少なくとも1つのエピトープに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性である免疫エピトープを有する。
【0241】
用語「VEGF−Eポリペプチド」及び「VEGF−E」は、ここで用いる場合、天然配列VEGF−Eポリペプチド及びVEGF−Eポリペプチド変異体(ここで更に定義する)を含む。VEGF−Eポリペプチドは、ヒト組織型等の種々の供給源から、又は他の供給源から単離しても、組換え又は合成方法により調製してもよい。
VEGF−Eの阻害剤は、VEGF−Eの発現又は活性を減じる或いは阻害するものを含み、そしてアンチセンス分子を含む。
略語「KDR」は、VEGF分子のキナーゼドメイン領域に相当する。VEGF−Eは、このドメインにおいてVEGFとの相同性を有しない。
略語「FLT−1」は、対応するFLT−1受容体と結合することが知られているFMS様チロシンキナーゼ結合ドメインに相当する。
「Tollレセプター2」、「TLR2」及び「huTLR2」は交換可能に用いられ、Rock等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 588−593 (1998)により「huTLR2」と命名されたヒトTollレセプターを意味する。
【0242】
「リポ多糖」又は「LPS」は、ここで「エンドトキシン」の同義語として用いられる。リポ多糖(LPS)は、グラム陰性菌、例えば大腸菌の外膜の特徴的成分である。それらは多糖部分と脂質Aと呼ばれる脂肪部分とからなる。一細菌種から他に変化する多糖は、O−特異的鎖(3〜8糖の繰り返し単位から構成される)及び2部コアからなる。脂質Aは実際に、リン酸及び種々の数の脂肪酸で修飾された2つのグルコサミン糖を常に含む。さらなる情報については、例えば、Rietschel及びBrade, Scientific American August 1992, 54−62を参照のこと。
「敗血性ショック」は、ここでは最も広い意味で用いられ、Bone, Ann. Intern Med. 114, 332−333 (1991)に記載された全ての定義を含む。特に、敗血性ショックは、感染に対する全身性反応で始まる、敗血症と呼ばれる症候群である。この症候群は低血圧及び器官不全をもたらし、それは敗血性ショックと呼ばれる。敗血性ショックは、グラム陽性生物及び真菌、並びにエンドトキシン含有グラム陰性生物によって開始されうる。従って、この定義は「エンドトキシンショック」に限定されない。
「遺伝子増幅」及び「遺伝子複製」なる語句は交換可能に用いられ、遺伝子又は遺伝子断片の複数のコピーが特定の細胞又は細胞系で生成されるプロセスを意味する。複製された領域(増幅されたDNAの伸展)は、しばしば「単位複製配列」と呼ばれる。通常は、生成されるメッセンジャーRNA(mRNA)の量、即ち遺伝子発現レベルも、発現された特定遺伝子の作成されたコピー数に比例して増加する。
【0243】
ここで用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性に関わらず、全ての腫瘍形成細胞成長及び増殖、及び全ての前癌性及び癌性細胞及び組織を意味する。「癌」及び「癌性」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病が含まれる。このような癌のより特定の例には、乳癌、前立腺癌、大腸癌、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、結腸直腸癌、子宮体癌、唾液腺癌、腎臓癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌及び様々な種類の頭部及び頸部の癌が含まれる。
ここで用いられる「細胞毒性薬」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び/又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、I131、I125、Y90及びRe186)、化学治療薬、及び細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【0244】
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アドリアマイシン、エピルビシン、5−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara−C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール、Bristol−Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア、Rhone−Poulenc Rorer, Antony, France)、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
「成長阻害薬」は、ここで用いられる場合、インビトロ又はインビボで、細胞、特にここに定義される遺伝子を過剰発現している癌細胞の成長を阻害する化合物又は組成物を意味する。即ち、成長阻害薬は、S相においてそのような遺伝子を過剰発現している細胞の割合を有意に減少させるものである。成長阻害薬の例は、細胞周期の進行を(S相以外の位置で)阻止する薬剤、例えば、G1停止及びM相停止を誘発する薬剤を含む。古典的なM相ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポII阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。G1停止させるこれらの薬剤は、S相停止にも波及し、例えば、DNAアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニソン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、5−フルオロウラシル及びAra−Cである。さらなる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael,編集, Chapter 1, Murakamiによる表題「Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs」(WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出される。
「ドキソルビシン」は、アントラサイクリン抗生物質である。
【0245】
用語「サイトカイン」は、一の細胞集団により放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質のための一般的用語である。このようなサイトカインの例は、リンカイン、モノカイン、及び伝統的ポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、N−メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン;甲状腺ホルモン;チロキシン;インシュリン;プロインシュリン;リラキシン;プロリラキシン;等である。ここで用いられるように、用語サイトカインは天然供給源から又は組換え細胞培地からのタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的等価物を含む。
【0246】
【0247】
【0248】
【0249】
【0250】
【0251】
【0252】
【0253】
【0254】
【0255】
【0256】
【0257】
【0258】
【0259】
【0260】
【0261】
【0262】
【0263】
【0264】
【0265】
【0266】
【0267】
II. 本発明の組成物と方法
A.全長PROポリペプチド
本発明は、本出願でPROポリペプチドと呼ばれるポリペプチドをコードする新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に下記の実施例でさらに詳細に説明するように、種々のPROポリペプチドをコードするcDNAが同定され単離された。別々の発現ラウンドで生成されたタンパク質には異なるPRO番号が与えられるが、UNQ番号は全ての与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり、変わることはないことを記しておく。しかしながら、単純化のために、本明細書において、ここに開示した全長天然核酸分子にコードされるタンパク質並びに上記のPROの定義に含まれるさらなる天然相同体及び変異体は、それらの起源又は調製形式に関わらず、「PRO/番号」で呼称する。
下記の実施例に開示するように、種々のcDNAクローンがATCCに寄託されている。これらのクローンの正確なヌクレオチド配列は、この分野で日常的な方法を用いて寄託されたクローンを配列決定することにより容易に決定することができる。予測されるアミノ酸配列は、ヌクレオチド配列から常套的技量を用いて決定できる。ここに記載したPROポリペプチド及びコード化核酸について、本出願人は、現時点で入手可能な配列情報と最も良く一致するリーディングフレームであると考えられるものを同定した。
【0268】
1.全長PRO213ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO213と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO213ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO213ポリペプチドの一部がヒト腫瘍停止特異的6(gas6)タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO213ポリペプチドがgas6タンパク質と同一又は類似の活性を有すると考えられている。
2.全長PRO274ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO274と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO274ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO274ポリペプチドの種々の部分が7膜貫通セグメントレセプター及びFn54タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO274ポリペプチドが7膜貫通セグメントレセプター及び/又はFn54タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0269】
3.全長PRO300ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO300と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO300ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO300ポリペプチドの種々の部分がヒトDiff33タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO300ポリペプチドがDiff33ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
4.全長PRO284ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO284と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO284ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。本出願人の現在の知識では、UNQ247(DNA23318−1211)核酸配列が新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【0270】
5.全長PRO296ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO296と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO296ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO296ポリペプチドが肉腫増幅SASタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO296ポリペプチドが新たに同定されたSASタンパク質相同体であると考えられている。
6.全長PRO329ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO329と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO329ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO329ポリペプチドが高親和性免疫グロブリンFcレセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO329ポリペプチドが新たに同定されたFcレセプター相同体であると考えられている。
【0271】
7.全長PRO362ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO362と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO362ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO362ポリペプチドがA33抗原タンパク質並びにHCARタンパク質及びNrCAM関連細胞接着分子と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO362ポリペプチドが新たなA33抗原及びHCARタンパク質相同体であると考えられている。
8.全長PRO363ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO363と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO363ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO363ポリペプチドが細胞表面タンパク質HCARと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO363ポリペプチドが新たなHCAR相同体であると考えられている。
【0272】
9.全長PRO868ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO868と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO868ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO868ポリペプチドが腫瘍壊死因子レセプターと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO868ポリペプチドがタンパク質の腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
10.全長PRO382ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO382と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO382ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、天然PRO382ポリペプチドが種々のセリンプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。また本出願人は、PRO382ポリペプチドをコードするDNAが種々のセリンプロテアーゼタンパク質をコードする核酸と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO382ポリペプチドが新たに同定されたセリンプロテアーゼ質相同体であると考えられている。
【0273】
11.全長PRO545ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO545と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO545ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO545ポリペプチドが、ヒトメタロプロテイナーゼ(「P_W01825」)、マウスメルトリンアルファ(「S60257」)、メタロプロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−アルファ(「GEN13695」)、ADAM13−アフリカツメガエル(「XLU66003_1」)、マウスメルトリンベータ(「S60258」)、ウサギメタロトロテアーゼ−ディスインテグリンメルトリン−ベータ(「GEN13696」)、ヒトメルトリンS(「AF023477_1」)、ヒトメルトリン前駆体(「AF023476_1」)、ヒトADAM21(「AF029900_1」)、及びヒトADAM20(「AF029899_1」)と命名され同定された配列と有意な類似性を有していることを見出し、それによりPRO545は新規なメルトリンタンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO545ポリペプチドがメルトリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、メタロプロテアーゼ及びディスインテグリンドメインを有するメルトリンタンパク質に典型的な細胞接着を有すると考えられている。
12.全長PRO617ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO617と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO617ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO617ポリペプチドがCD24タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また本出願人は、PRO617ポリペプチドをコードするDNAがCD24タンパク質をコードするDNAと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO617ポリペプチドが新たに同定されたCD24相同体であると考えられている。
【0274】
13.全長PRO700ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO700と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO700ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO700ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO700ポリペプチドの種々の部分が種々のジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有している事を示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO700アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;タンパク質イソメラーゼ活性を持つポリペプチド、(「P_P80664」)と命名、ヒトPDI、(「P_R51696」)と命名、ヒトPDI、(「P_R25297」)と命名、可能なタンパク質イソメラーゼer−60前駆体、(「ER60_SCHMA」)と命名、タンパク質イソメラーゼ前駆体−ショウジョウバエ、(「PDI_DROME」)と命名、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ−回旋糸状虫、(「OVU12440_1」)と命名、ヒトタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質5、(「HSU79278_1」)、及びタンパク質イソメラーゼ前駆体/プロリル4−ヒドロキシ、(「PDI_HUMAN」)と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO700が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO700ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なジスルフィド結合の形成を触媒する能力を有していると考えられている。
【0275】
14.全長PRO702ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO702と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO702ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO702ポリペプチドがコングルチニン(conglutinin)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO702ポリペプチドが新たに同定されたコングルチニン相同体であると考えられている。
【0276】
15.全長PRO703ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO703と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO703ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO703ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO703ポリペプチドの種々の部分がVLCASタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO703が新規なVLSACタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO703アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;超長鎖アシル−CoAに対するヒトmRNA、(「D88308」)、超長鎖アシル−CoAシンセターゼに対するラットmRNA、(「D85100」)、マウス脂肪酸輸送タンパク質、(「MMU15976」)、ヒト超長鎖アシル−CoAシンターゼ、(「D88308_1」)、マウス超長鎖アシル−CoAシンターゼ、(「AF033031_1」)、超長鎖アシル−CoAシンターゼ−Rattus、(「D85100_1」)、ラット長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FATP_RAT」)、マウス長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FATP_MOUSE」)、可能な長鎖脂肪酸輸送タンパク質、(「FAT1_YEAST」)、及び脂肪酸輸送タンパク質、(「CHY15839_2」)、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO703が新規なVLCASであることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO703ポリペプチドがVLCASファミリーの新たに同定されたメンバーであり、VLCASファミリーに典型的な長鎖及び超長鎖脂肪酸の細胞輸送を促進する能力を有していると考えられている。
【0277】
16.全長PRO705ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO705と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO705ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO705ポリペプチドがK−グリピカン(glypican)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO705ポリペプチドがプロテオグリカンタンパク質のグリピカンファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
17.全長PRO708ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO708と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO708ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO708ポリペプチドがアリールスルファターゼタンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO708ポリペプチドが新たに同定されたアリールスルファターゼ相同体であると考えられている。
【0278】
18.全長PRO320ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO320と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO320ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO320ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO320ポリペプチドの種々の部分がフィブリンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO320アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;ヒトフィブリン−2前駆体、「FBL2_HUMAN」と命名、ヒトフィブリン−1アイソフォーム前駆体、「FBLA_HUMAN」と命名、ZK783.1−線虫、「CELZK783_1」と命名、ヒト−notch2、「HSU77493_1」と命名、NeI部分前駆体−rattus norvegicus、「NEL_RAT」と命名、マウス細胞表面タンパク質、「D32210_1」と命名、マウス(断片)NotchBタンパク質、「A49175」と命名、C50H2.3a−線虫、「CEC50H2_3」と命名、MEC−9L−線虫、「CEU33933_1」と命名、及びマウスnotch4、「10MMMHC29N7_2」と命名、との間の有意な配列類似性を実証し、それによりPRO320が新規なフィブリン又はフィブリン様タンパク質であることを示している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO320ポリペプチドがフィブリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、フィブリンファミリーに典型的な生物学的活性を有していると考えられている。
【0279】
19.全長PRO324ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO324と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO324ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO324ポリペプチドがオキシドレダクターゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO324ポリペプチドが新たに同定されたオキシドレダクターゼ相同体であると考えられている。
【0280】
20.全長PRO351ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO351と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO351ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO351ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO351ポリペプチドの種々の部分がプロシタシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO351アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AC003965_1」、「CELC07G1_7」、「GEN12917」、「HEPS_HUMAN」、「GEN14584」、「MCT6_MOUSE」、「HSU75329_1」、「PLMN_ERIEU」、「TRYB_HUMAN」及び「P_W22987」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO351ポリペプチドがプロスタシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロスタシンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【0281】
21.全長PRO352ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO352と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO352ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO352ポリペプチドがブチロフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO352ポリペプチドが新たに同定されたブチロフィリン相同体であると考えられている。
22.全長PRO381ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO381と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO381ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO381ポリペプチドがイムノフィリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO381ポリペプチドが新たに同定されたFKBPイムノフィリン相同体であると考えられている。
【0282】
23.全長PRO386ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO386と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO386ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO386ポリペプチドがナトリウムチャンネルタンパク質のベータ−2サブユニットと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO386ポリペプチドが哺乳動物細胞で発現されたナトリウムチャンネルのベータ−2サブユニットの相同体であると考えられている。
【0283】
24.全長PRO540ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO540と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO540ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO540ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO540ポリペプチドの種々の部分がLCATタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO540が新規なLCATタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO540アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;ホスファチジルコリン−ステロールアシルトランスフェラーゼ、「LCAT_HUMAN」と命名、マクロテトロリド耐性タンパク質−ストレプトミセス、「JH0655」と命名、T細胞レセプターデルタ鎖前駆体「C30583」と命名、アカゲザルkringle2、「P_W07551」と命名、RAGE−1ORF5、「HSU46191_3」と命名、ヒトIgカッパ鎖VKIII−JK3、「HSU07466_1」と命名、及びアルストロメリアインドラ逆転写酵素、「ALI223606_1」と命名、との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO540ポリペプチドがLCATタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、LCATファミリーに典型的な脂質輸送能力を有していると考えられている。
【0284】
25.全長PRO615ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO615と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO615ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO615ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO615ポリペプチドの種々の部分がヒトシナプトギリン(synaptogyrin)タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO615アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AF039085_1」、「RNU39549_1」、「CELT08A9_8」、「FSU62028_1」、「S73645」、「Y348_MYCPN」、「AC000103_5」、「」、「RT12_LEITA」及び「EBVLMP218_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO615ポリペプチドがシナプトギリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、シナプトギリンファミリーに典型的な特性及び活性を有していると考えられている。
【0285】
26.全長PRO618ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO618と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO618ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO618ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO618ポリペプチドの種々の部分がエンテロペプチダーゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO618が新規なエンテロペプチダーゼであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO618アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_W22987」、「KAL_HUMAN」、「AC003965_1」、「GEN12917」、「ENTK_HUMAN」、「FA11_HUMAN」、「HSU75329_1」、「P_W22986」、及び「PLMN_HORSE」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO618ポリペプチドがエンテロペプチダーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、エンテロペプチダーゼファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【0286】
27.全長PRO719ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO719と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO719ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO719ポリペプチドがリポタンパク質リパーゼHタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO719ポリペプチドが新たに同定されたリポタンパク質リパーゼH相同体であると考えられている。
28.全長PRO724ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO724と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO724ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO724ポリペプチドが低密度リポタンパク質(LDL)レセプタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO724ポリペプチドが新たに同定されたLDLレセプターH相同体であると考えられている。
【0287】
29.全長PRO772ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO772と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO772ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO772ポリペプチドがヒトA4タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO772ポリペプチドが新たに同定されたA4タンパク質相同体であると考えられている。
30.全長PRO852ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO852と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO852ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO852ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO852ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ酵素相同体であると考えられている。
【0288】
31.全長PRO853ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO853と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO853ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO853ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO853ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO853が新規なレダクターゼであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO853アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_W03198」、「CEC15H11_6」、「MTV030_12」、「P_W15759」、「S42651」、「ATAC00234314」、「MTV022_13」、「SCU43704_1」、「CELE04F6_7」及び「ALFA_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO853ポリペプチドがレダクターゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、レダクターゼファミリーに典型的な抗酸化酵素活性を有していると考えられている。
【0289】
32.全長PRO860ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO860と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO860ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO860ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO860ポリペプチドの種々の部分がニューロファシンタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO860が新規なニューロファシンであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO860アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「AF040990_1」、「AF041053_1」、「CELZK377_2」、「RNU81035_1」、「D86983_1」、「S26180」、「MMBIG2A_1」、「S46216」、及び「RNU68726_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO860ポリペプチドがニューロファシンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロファシンファミリーに典型的な細胞接着特性を有していると考えられている。
【0290】
33.全長PRO846ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO846と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO846ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO846ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO846ポリペプチドの種々の部分がCMRF35タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO846が新規なCMRF35タンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO846アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「CM35_HUMAN」、「AF035963_1」、「PIGR_RABIT」、「AF043724_1」、「RNU89744_1」、「A52091_1」、「S48841」、「ELK06A9_3」、及び「AF049588_1」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO846ポリペプチドがCMRF35タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、CMRF35タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【0291】
34.全長PRO862ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO862と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO862ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO862ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO862ポリペプチドの種々の部分がリソザイムタンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO862が新規なリソザイムタンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO862アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「P_P90343」及び「LYC_HUMAN」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO862ポリペプチドがリソザイムファミリーの新たに同定されたメンバーであり、リソザイムファミリーに典型的な触媒活性を有していると考えられている。
【0292】
35.全長PRO864ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO864と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO864ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いた全長PRO864ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO864ポリペプチドの種々の部分がWnt−4タンパク質と有意な配列類似性を持つことを示唆し、それによりPRO864が新規なWnt−4タンパク質であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 33.45 SwissProt 35)の分析は、PRO864アミノ酸配列と以下のDayhoff配列;「WNT4_MOUSE」、「WNT3_MOUSE」、「WN5A_HUMAN」、「WN7B_MOUSE」、「WN3A_MOUSE」、「XLU66288_1」、「WN13_HUMAN」、「WN5B_ORYLA」、「WNT2_MOUSE」、及び「WN7A_MOUSE」との間の有意な配列類似性を実証している。従って、現在では、本出願で開示されるPRO864ポリペプチドがWnt−4タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Wnt−4タンパク質ファミリーに典型的な特性を有していると考えられている。
【0293】
36.全長PRO792ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO792と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO792ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO792ポリペプチドがCD23タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO792ポリペプチドが新たに同定されたCD23相同体であると考えられている。
37.全長PRO866ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO866と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO866ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO866ポリペプチドが種々のミンジン及びスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO866ポリペプチドが新たに同定されたミンジン/スポンジン相同体であると考えられている。
【0294】
38.全長PRO871ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO871と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO871ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO871ポリペプチドがCyp−60タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO871ポリペプチドがCyp−60タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【0295】
39.全長PRO873ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO873と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO873ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO873ポリペプチドがヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO873ポリペプチドがカルボキシエステラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カルボキシルエステラーゼファミリーに典型的な触媒活性を有すると考えられている。
40.全長PRO940ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO940と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO940ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO940ポリペプチドがCD33及びOB結合タンパク質−2と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO940ポリペプチドが新たなCD33及び/又はOB結合タンパク質−2相同体であると考えられている。
【0296】
41.全長PRO941ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO941と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO941ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO941ポリペプチドが一又は複数のカドヘリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO941ポリペプチドが新たに同定されたカドヘリン相同体であると考えられている。
42.全長PRO944ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO944と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO944ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO944ポリペプチドがCPE−R細胞表面タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO944ポリペプチドが新たに同定されたCPE−R相同体であると考えられている。
【0297】
43.全長PRO983ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO983と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO983ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO983ポリペプチドが小胞関連タンパク質VAP−33と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO983ポリペプチドが小胞関連膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、小胞関連膜タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
44.全長PRO1057ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1057と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1057ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1057ポリペプチドが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1057ポリペプチドが新たに同定されたプロテアーゼ相同体であると考えられている。
【0298】
45.全長PRO1071ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1071と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1071ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1071ポリペプチドがトロンボスポンジンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1071ポリペプチドが新たに同定されたトロンボスポンジン相同体であると考えられている。
46.全長PRO1072ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1072と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1072ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1072ポリペプチドが種々のレダクターゼタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1072ポリペプチドがレダクターゼタンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0299】
47.全長PRO1075ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1075と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1075ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1075ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1075ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
【0300】
48.全長PRO181ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO181と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO181ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO181ポリペプチドがコルニコン(cornichon)タンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO181ポリペプチドが新たに同定されたコルニコン相同体であると考えられている。
49.全長PRO195ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO195と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO195ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO195コード化クローンがヒト胎児胎盤ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、UNQ169(DNA26847−1395)核酸配列は新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
【0301】
50.全長PRO865ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO865と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO865ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO865コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから、分泌されたタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。PRO865コード化クローンは分泌されたタンパク質をコードする。本出願人の知識では、UNQ434(DNA53974−1401)核酸配列は新規な因子をコードし;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と配列同一性を持たないことが明らかとなった。
51.全長PRO827ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO827と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO827ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO827ポリペプチドがVLA−2及び種々の他のインテグリンタンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO827ポリペプチドが新たなインテグリンタンパク質又はそのスプライシング変異体であると考えられている。
【0302】
52.全長PRO1114ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1114と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1114ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1114ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1114ポリペプチドがタンパク質のサイトカインレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであり、そのファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
本発明は、本出願においてPRO1114インターフェロンレセプター(UNQ557)と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるPRO番号で与えられたが、UNQ番号は任意の与えられたDNA及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではDNA57033−1403にコードされるタンパク質並びにPRO1114インターフェロンレセプターの上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「PRO1114インターフェロンレセプター」と呼ぶ。
WU−BLAST配列アラインメントプログラムを用いて、全長天然配列PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチド(Fig142及び配列番号:352に示す)が、他の公知のインターフェロンレセプターと配列同一性を有することが見出された。従って、現在では、PRO1114インターフェロンレセプターが他のインターフェロンレセプターに典型的な活性を有すると考えられている。
【0303】
53.全長PRO237ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO237と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO237ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO237ポリペプチドが脱炭酸酵素と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO237ポリペプチドが新たに同定された脱炭酸酵素相同体であると考えられている。
54.全長PRO541ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO541と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO541ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO541ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO541ポリペプチドがトリプシンインヒビタータンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられている。
【0304】
55.全長PRO273ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO273と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO273ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO273ポリペプチドが種々のケモカインと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO273ポリペプチドがケモカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ケモカインファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。
56.全長PRO701ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO701と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO701ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO701ポリペプチドがニューロリジン(neuroligin)1、2及び3及びカルボキシエステラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼを含むエステラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO701ポリペプチドがニューロリジンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ニューロリジンに典型的なようにニューロン間の認識プロセスの媒介及び/又は機能に接着因子として含まれると考えられている。
【0305】
57.全長PRO704ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO704と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO704ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO704ポリペプチドがVIP36及びGP36bと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO704ポリペプチドが小胞複合膜タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な糖への結合及び原形質膜とゴルジの間をサイクルする能力を有すると考えられている。
58.全長PRO706ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO706と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO706ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO706ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体及びヒトリソソーム酸ホスファターゼ前駆体と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO706ポリペプチドがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、酸ホスファターゼファミリーに典型的なホスファターゼを有すると考えられている。
【0306】
59.全長PRO707ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO707と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO707ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO707273ポリペプチドの種々の部分がカドヘリン、特に繊維芽細胞に見られるカドヘリンFIB3と有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO707ポリペプチドがカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、カドヘリンファミリーに典型的な細胞相互作用シグナル伝達を有すると考えられている。
60.全長PRO322ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO322と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO322ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO322ポリペプチドの種々の部分がヒトニューロプシン(neuropsin)、セリンプロテアーゼ、ニューロシン(neurosin)及びトリプシノーゲンと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO322ポリペプチドがセリンプロテアーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な活性を有すると考えられている。また、PRO322は海馬可塑性に含まれ、細胞外マトリクス変性及び細胞泳動を伴うとも考えられている。
【0307】
61.全長PRO526ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO526と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO526ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO526ポリペプチドの種々の部分がインシュリン様成長因子複合体(ALS)の酸安定性サブユニット、並びにカルボキシペプチダーゼ、SLIT、及び血小板糖タンパク質Vと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO526ポリペプチドがロイシン−リピートリッチスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なタンパク質−タンパク質相互作用能力を有すると考えられている。
62.全長PRO531ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO531と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO531ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO531ポリペプチドの種々の部分がカドヘリンスーパーファミリー、特にプロトカドヘリン3と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO531ポリペプチドがカドヘリンスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、プロトカドヘリンであると考えられている。PRO531は細胞外カドヘリンモチーフを持つ膜貫通タンパク質である。PRO531は細胞−細胞活性、特に細胞シグナル伝達に含まれると考えられる。
【0308】
63.全長PRO534ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO534と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO534ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO534ポリペプチドの種々の部分が推定ジスルフィドイソメラーゼerp38前駆体及びチオレドキシンc−3と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO534ポリペプチドがジスルフィドイソメラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な中間又は不正な折りたたみパターンの認識及び解読をする能力を有すると考えられている。
64.全長PRO697ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO697と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO697ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO697ポリペプチドの種々の部分がsFRP−2、sFRP−1及びSARP−1、−2及び−3と有意な同一性又は類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO697ポリペプチドがsFRPファミリーの新たに同定されたメンバーであり、Wntシグナル経路に関連する活性を有すると考えられている。
【0309】
65.全長PRO717ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO717と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO717ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。本出願人の知識では、UNQ385(DNA50988−1326)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のヒトタンパク質と有意な配列同一性を持たないことが明らかとなった。
66.全長PRO731ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO731と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO731ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO731ポリペプチドの種々の部分がプロトカドヘリン4、68、43、42、3及び5と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO731ポリペプチドがプロトカドヘリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞−細胞凝集又はシグナル伝達活性又はシグナル伝達関与を有すると考えられている。
【0310】
67.全長PRO218ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO218と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO218ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO218コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから単離された。本出願人の知識では、UNQ192(DNA30867−1335)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、公知のタンパク質と有意な配列同一性がないことが明らかとなった。膜調節タンパク質と幾分の配列同一性が見られ、PRO218が膜調節器として機能しうることを示している。
68.全長PRO768ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO768と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO768ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO768ポリペプチドの種々の部分がインテグリン7及び6を含むインテグリンと有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO768ポリペプチドがインテグリンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、インテグリイン7の相同体又はスプライシング変異体のいずれかであり、筋細胞及び細胞外マトリクス間の細胞接着及び連絡に含まれると考えられている。
【0311】
69.全長PRO771ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO771と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO771ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO771ポリペプチドの種々の部分がテスチカン(testican)と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO771ポリペプチドがテスチカンファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な細胞シグナル伝達、結合、又は接着特性を有すると考えられている。
70.全長PRO733ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO733と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO733ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO733ポリペプチドの種々の部分がT1/STレセプター結合タンパク質と有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO733ポリペプチドがインターロイキン様ファミリー結合タンパク質の新たに同定されたメンバーであり、サイトカインであり、そして細胞シグナル伝達に含まれる。PRO733はApoAIV相同体であると思われる。
【0312】
71.全長PRO162ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO162と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO162ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO162ポリペプチドの種々の部分がヒト膵炎関連タンパク質(PAP)と顕著な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、PRO162ポリペプチドをコードするDNAがウシlithostathine前駆体及びウシ膵臓繊維状タンパク質(PAP)と有意な相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO162ポリペプチドが膵炎関連タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、膵炎関連タンパク質ファミリーに典型的な活性を有すると考えられる。
72.全長PRO788ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO788と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO788ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO788ポリペプチドの種々の部分が抗悪性腫瘍尿タンパク質と有意な相同性を有していることを見出した。また、本出願人は、PRO788ポリペプチドをコードするDNAがヒトE48抗原、ヒトコンポーネントBタンパク質、及びヒト前立腺幹細胞抗原と有意な相同性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO788ポリペプチドが抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、抗悪性腫瘍尿タンパク質ファミリーに典型的な抗悪性腫瘍活性を有すると考えられる。
【0313】
73.全長PRO1008ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1008と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1008ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1008ポリペプチドの種々の部分がマウスdkk−1(mdkk−1)と有意な配列同一性及び類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1008ポリペプチドがdkk−1ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な頭部誘発活性を有すると考えられる。
74.全長PRO1012ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1012と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1012ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1012ポリペプチドの種々の部分がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1012ポリペプチドがER保有タンパク質ファミリーの新たに同定されたメンバーであり、ジスルフィドイソメラーゼファミリーに典型的なポリペプチドのプロセシング、生成及び/又は折りたたみに関連する活性を有すると考えられる。
【0314】
75.全長PRO1014ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1014と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1014ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1014ポリペプチドの種々の部分がレダクターゼ及びデヒドロゲナーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1014ポリペプチドがレダクターゼスーパーファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的な還元能力を有すると考えられる。
76.全長PRO1017ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1017と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1017ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1017ポリペプチドの種々の部分がHNK−1スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1017ポリペプチドがHNK−1スルホトランスフェラーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、このファミリーに典型的なHNK−1炭水化物エピトープの合成に含まれると考えられる。
【0315】
77.全長PRO474ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO474と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO474ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO474ポリペプチドの種々の部分がデヒドロゲナーゼ、グルコースデヒドロゲナーゼおよびオキシドレダクターゼと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO474ポリペプチドがデヒドロゲナーゼファミリーの新たに同定されたメンバーであり、グルコースの酸化に含まれると考えられる。
78.全長PRO1031ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1031と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1031ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1031ポリペプチドの種々の部分がIL−17及びCTLA−8と配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1031ポリペプチドがサイトカインファミリーの新たに同定されたメンバーであり、よって炎症及び/又は免疫系に含まれると考えられる。
【0316】
79.全長PRO938ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO938と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO938ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO938ポリペプチドがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な類似性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO937ポリペプチドがチオレドキシンファミリータンパク質の新たに同定されたメンバーであり、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに典型的な活性を有すると考えられる。
80.全長PRO1082ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1082と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1082ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO1082ポリペプチドの種々の部分がデータベースに「AB010710_1」として現れるレクチン様酸化LDLレセプターと配列同一性を有していることを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO1082ポリペプチドがLDLレセプターファミリーの新たに同定されたメンバーであると考えられる。
【0317】
81.全長PRO1083ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO1083と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO1083ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。PRO1083コード化クローンがヒト胎児腎臓ライブラリから分泌されるタンパク質をコードする核酸配列を選択する捕捉技術を用いて単離された。本出願人の知識では、UNQ540(DNA50921−1458)核酸配列は新規な因子をコードする;BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、7TMレセプター、ラトロフィリン関連タンパク質1及びマクロファージ制限細胞表面糖タンパク質との幾分の配列同一性が見られた。Fig204に示すキナーゼリン酸化部位及びG−結合レセプタードメインは、PRO1083が7TMレセプタースーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
82.全長PRO200ポリペプチド
本発明は、本出願においてVEGF−Eと称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、VEGF−EポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、VEGF−EポリペプチドがVEGF及び骨形成タンパク質1と有意な相同性を有していることを見出した。特に、VEGF−EのcDNA配列はVEGFと24%のアミノ酸類似性を示し、構造的保存を有している。さらに、VEGF−EはVEGFに存在しないN−末端半分を含み骨形成タンパク質1と28%の相同性を有する。
【0318】
83.全長PRO285及びPRO286ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO285及びPRO286と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定及び単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO285及びPRO286ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、PRO285及びPRO286がGenBamkデータベースのDNA配列HSU88540_1、HSU88878_1、HSU88879_1、HSU88880_1、及びHSU88881_1と高度な相同性を有していることを見出した。
従って、現在では、本出願で開示されるPRO285及び286タンパク質がショウジョウバエタンパク質Tollの新たに同定されたヒト相同体メンバーであり、獲得免疫において重要な役割を果たすであろうと考えられている。より詳細には、PRO285及びPRO286は、炎症、敗血性ショック、及び病原に対する反応に含まれ、免疫反応によって増悪する様々な医学的状態、例えば糖尿病、ALS、癌、慢性関節リウマチ、及び潰瘍などにおいて役割を果たす可能性がある。PRO285及びPRO286の病原パターン認識レセプターとしての役割は、微生物に存在する保存された分子構造の存在の感知は、本出願に開示するデータにより更に支持され、公知のヒトToll様レセプター、TLR2がLPSシグナル伝達の直接的メディエータであることを示している。
【0319】
84.全長PRO213−1、PRO1330及びPRO1449ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に、以下の実施例で更に詳細に開示するように、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。別の発現ラウンドで生成されたタンパク質が異なるPRO番号で与えられたが、UNQ番号は任意の与えられたDNA及びコードされるタンパク質に特有であり、変化しないであろう。しかしながら、単純にするために、本明細書ではDNA30943−1163−1、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1にコードされるタンパク質並びにPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449の上記の定義に含まれる全てのさらなる相同体及び変異体を、それらの起源又は調製方式に関わらず「PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449」と呼ぶ。
85.全長PRO298ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO298と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。(PRO298はFig218、配列番号:514に示した核酸にコードされ、Fig219、配列番号:515に示すアミノ酸配列を有するタンパク質の任意の命名であることを記しておく。さらに、同じアミノ酸配列を持ち異なる発現ラウンドで発現されるタンパク質は異なる「PRO」番号で与えられる。)
特に、本出願人は、以下の実施例で更に詳細に記載されるPRO298をコードするcDNAを同定し単離した。BLASTX2.0aMP−WashUコンピュータプログラム、スコアリングパラメータT=12、S=68、S2=36、マトリクス:BLOSUM62を用い、本出願人は、ここに特に記載するPRO298タンパク質が、GenBankデータベースに見られる以下の配列:S59392(可能な膜タンパク質YLR246w−酵母);S58154(仮説タンパク質SPAC2F7.10−酵母);CELF33D11_9(F33D11.9b−線虫);YO41_CAEEL(仮説68.7kdタンパク質zk57.1);CEAC3_5(AC3.4−線虫);S52691(可能な膜タンパク質YDR126w−酵母);ATT12H17_14(タンパク質−シロイヌナズナ);S55963(可能な膜タンパク質YNL326c−酵母);CELC43H6_2(C43H6.7−線虫);TMO18A10_14(A_TMO18A10.8−シロイヌナズナ)と限られた配列同一性(27−38%)を示すことを見出した。
【0320】
86.全長PRO337ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO337と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO337ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST、BLAST−2及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列PRO337が、ラットニューロトリミンと97%の配列同一性、チキンCEPUと85%の配列同一性、チキンG55と73%の配列同一性、ヒトLAMPと59%の相同性、及びヒトOPCAMと84%の相同性を有することを見出した。従って、現在では、本出願で開示されるPRO337が免疫グロブリンスーパーファミリーのIgLONサブファミリーの新たに同定されたメンバーであり、神経突起成長及び分化可能特性を有すると考えられる。
87.全長PRO403ポリペプチド
本発明は、本出願においてPRO403と称されるポリペプチドをコードする、新規に同定され単離された核酸配列を提供する。特に本出願人は、以下の実施例で更に詳細に開示するような、PRO403ポリペプチドをコードするcDNAを同定し単離した。BLAST、BLAST−2及びFastA配列アラインメントプログラムを用いて、本出願人は、全長天然配列PRO403がウシECE−2と94%の同一性及びヒトECE−1と64%の同一性を有していることを見出した。従って、現在では、PRO403がECEタンパク質ファミリーの新規なメンバーであり、活性エンドセリンを生成する能力を有すると考えられている。
【0321】
B.PROポリペプチド変異体
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PROポリペプチドDNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、あるいは所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることを理解するであろう。
天然全長配列PRO又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROと比較してPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列によって示される活性について試験することにより決定される。
【0322】
PROポリペプチド断片がここに提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較した際に、N−末端又はC−末端で切断されてもよく、又は内部残基を欠いていてもよい。或る種の断片は、PROポリペプチドの所望の生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
PRO断片は、多くの従来技術の任意のものによって調製してよい。所望のペプチド断片は化学合成してもよい。代替的方法は、酵素的消化、例えば特定のアミノ酸残基によって決定される部位のタンパク質を切断することが知られた酵素でタンパク質を処理することにより、あるいは適当な制限酵素でDNAを消化して所望の断片を単離することによるPRO断片の生成を含む。さらに他の好適な技術は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、所望のポリペプチド断片をコードするDNA断片を単離し増幅することを含む。DNA断片の所望の末端を決定するオリゴヌクレオチドは、PCRの5’ 及び3’ プライマーで用いられる。好ましくは、PROポリペプチド断片は、ここに開示した天然PROポリペプチドと少なくとも1つの生物学的及び/又は免疫学的活性を共有する。
特別の実施態様では、対象とする保存的置換を、好ましい置換を先頭にして表1に示す。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表1に例示的置換と名前を付けた又は以下にアミノ酸分類でさらに記載するように、より置換的な変化が導入され生成物がスクリーニングされる。
【0323】
【0324】
PROポリペプチドの機能及び免疫学的同一性の置換的修飾は、(a)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、(b)標的部位の電荷又は疎水性、又は(c)側鎖の嵩を維持しながら、それらの効果において実質的に異なる置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる:
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャンニング、及びPCR突然変異誘発[Carter等, Nucl. Acids Res., 13: 4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10: 6487 (1987)]、カセット突然変異誘発[Wells等, Gene, 34: 315 (1985)]、制限的選択突然変異誘発[Wells等, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317: 415 (1986)]等のこの分野で知られた方法を用いてなすことができ、又は他の知られた技術をクローニングしたDNAに実施してPRO変異体DNAを作成することもできる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cuningham及びWells, Science, 244: 1081−1085 (1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
【0325】
C.PROの修飾
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN又はC末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗−PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1−ビス(ジアゾアセチル)−2−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4−アジドサリチル酸、3,3’−ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス−N−マレイミド−1,8−オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル−3−[(p−アジドフェニル)−ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79−86 (1983)]、N末端アミンのアセチル化、及び任意のC末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【0326】
本発明の範囲内に含まれるPROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、ポリペプチドの天然グリコシル化パターンの変更を含む。「天然グリコシル化パターンの変更」とは、ここで意図されるのは、天然配列PROに見られる1又は複数の炭水化物部分の欠失(存在するグリコシル化部位の除去又は化学的及び/又は酵素的手段によるグリコシル化の削除のいずれかによる)、及び/又は天然配列PROに存在しない1又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。さらに、この文節は、存在する種々の炭水化物部分の性質及び特性の変化を含む、天然タンパク質のグリコシル化における定性的変化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、1又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PRO(O−結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
【0327】
PROポリペプチド上に炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、グリコシドのポリペプチドへの化学的又は酵素的結合による。このような方法は、この技術分野において、例えば、1987年9月11日に発行されたWO 87/05330、及びAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259−306 (1981)に記載されている。
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
本発明のPROの共有結合的修飾の他の型は、PROポリぺプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
【0328】
また、本発明のPROポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に融合したPROポリペプチドを含むキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly−his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly−his−gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159−2165 (1988)];c−mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610−3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547−553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204−1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192−194 (1992)];α−チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163−15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz−Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393−6397 (1990)]を含む。
それに換わる実施態様では、キメラ分子はPROの免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えてPROポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
【0329】
D.PROの調製
以下の説明は、主として、PRO核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PRO配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい[例えば、Stewart等, Solid−Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149−2154 (1963)参照]。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROを生産してもよい。
【0330】
1.PROをコードするDNAの単離
PROをコードするDNAは、PROmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPRODNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPRO−コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動化核酸合成)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである[Sambrook等,上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)]。
【0331】
下記の実施例には、cDNAライブラリーのスクリーニング技術を記載している。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さで、疑陽性が最小化されるよう充分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリ内のDNAとのハイブリッド形成時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、32P標識されたATPのような放射線標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用が含まれる。中程度の厳密性及び高度の厳密性を含むハイブリッド形成条件は、上掲のSambrook等に与えられている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、この分野で知られた、そしてここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。
【0332】
2.宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したPRO生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編(IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
原核生物細胞形質移入及び真核生物細胞形質移入の方法、例えば、CaCl2、CaPO4、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315 (1983)及び1989年6月29日公開のWO 89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456−457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が好ましい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527−537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348−352 (1988)を参照のこと。
【0333】
ここに記載のベクターにDNAをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母菌、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えば大腸菌のような腸内細菌科を含む。種々の大腸菌株が公衆に利用可能であり、例えば、大腸菌K12株MM294(ATCC31,446);大腸菌X1776(ATCC31,537);大腸菌株W3110(ATCC27,325)及びK5772(ATCC53,635)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌、例えば、E. coli、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えば、ネズミチフス菌、セラチア、例えば、セラチアマルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバシリスブチリス(B. subtilis)及びバシリリチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日発行のDD 266,710に記載されたバシリリチェニフォルミス41P)、シュードモナス、例えば緑膿筋及びストレプトマイセスなどの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株W3110は、組換えDNA生産発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株W3110は、細胞に外来のタンパク質をコードする遺伝子における遺伝子変異をするように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型tonAを有する大腸菌W3110株1A2;完全な遺伝子型tonA ptr3を有する大腸菌W3110株9E4;完全な遺伝子型tonA prt3 phoA E15 (argF−lac)169 degP ompTkanrを有する大腸菌W3110株27C7(ATCC 55,244);完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (algF−lac)169 degP ompT rbs7ilvG kanrを有する大腸菌W3110株37D6;非カナマイシン耐性degP欠失変異を持つ37D6株である大腸菌W3110株40B4;及び1990年8月7日発行の米国特許第4,946,783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばPCR又は他の核酸ポリメラーゼポリメラーゼ反応が好ましい。
【0334】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、PROポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセスプロンブ(Schizosaccharomyces prombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985年5月2日発行のEP 139,383);クルベロミセスホスツ(Kluveromyces hosts)(米国特許第4,943,529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968−975 (1991))、例えばケーラクチス(K. lactis)(MW98−8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol. 737 [1983])、ケーフラギリス(K. fragilis)(ATCC 12,424)、ケーブルガリクス(K. bulgaricus)(ATCC 16,045)、ケーウィケラミイ(K. wickeramii)(ATCC 24,178)、ケーワルチイ(K. waltii)(ATCC 56,500)、ケードロソフィラルム(K. drosophilarum)(ATCC 36,906; Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、ケーテモトレランス(K. themotolerans)及びケーマルキシアナス(K. marxianus);ヤロウィア(yarrowia)(EP 402,226);ピッチャパストリス(Pichia pastoris)(EP 183,070; Sheekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265−278 [1988]);カンジダ;トリコデルマレーシア(reesia)(EP 244,234);アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259−5263 [1979]);シュワニオマイセス(schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス(occidentalis)(1990年10月31日発行のEP 394,538);及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日発行のWO 91/00357);及びコウジ菌、例えば偽巣性コウジ菌(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284−289 [1983]; Tilburn等, Gene, 26: 205−221 [1983]; Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470−1474 [1984])及びクロカビ(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475−479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピチア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されるメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【0335】
グリコシル化PROの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株(COS−7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/−DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243−251 (1980))ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞(Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞(MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
【0336】
3.複製可能なベクターの選択及び使用
PROをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN−末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPRO−コード化DNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダアルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【0337】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドpBR322に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、2μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(SV40、ポリオーマ、アデノウイルス、VSV又はBPV)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選べるマーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD−アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
【0338】
哺乳動物細胞に適切な選べるマーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PRO−コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である[Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)]。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4−1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する[Jones, Genetics, 85:12 (1977)]。
発現及びクローニングベクターは、通常、PRO−コード化核酸配列に作用可能に結合し、mRNA合成を制御するプロモーターを含む。種々の可能な宿主細胞により認識される好適なプロモーターが知られている。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターはβ−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系[Cahng等, Nature, 275:615 (1978); Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)]、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776]、及びハイブリッドプロモーター、例えばtacプロモーター[deBoer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21−25 (1983)]を含む。細菌系で使用するプロモータもまたPROをコードするDNAと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(S.D.)配列を有する。
【0339】
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3−ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−リン酸イソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
【0340】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのPRO転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開のUK 2,211,504)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス2)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、B型肝炎ウィルス及びサルウィルス40(SV40)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及び熱衝撃プロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
【0341】
より高等の真核生物による所望のPROをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROコード化配列の5’ 又は3’ 位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’ 位に位置する。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’ 、時には3’ の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620−625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40−46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
【0342】
4.遺伝子増幅/発現の検出
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201−5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリッド形成法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA−タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRODNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【0343】
5.ポリペプチドの精製
PROの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン−X100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS−PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG−75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer−Verlag, New York (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
【0344】
E.PROの用途
PROをコードする核酸配列(又はそれらの補体)は、ハイブリッド形成プローブとしての使用を含む分子生物学の分野において、染色体及び遺伝子マッピングにおいて、及びアンチセンスRNA及びDNAの生成において種々の用途を有している。また、PRO核酸も、ここに記載される組換え技術によるPROポリペプチドの調製に有用であろう。
全長天然配列PRO遺伝子又はその一部は、全長PROcDNAの単離又はここに開示したPRO配列に対して所望の配列同一性を持つ更に他の遺伝子(例えば、PROの天然発生変異体又は他の種からのPROをコードするもの)の単離のためのcDNAライブラリ用のハイブリッド形成プローブとして使用できる。場合によっては、プローブの長さは約20〜約50塩基である。ハイブリッド形成プローブは、少なくとも部分的に全長天然ヌクレオチド配列の新規な領域から誘導してもよく、それらの領域は、過度の実験をすることなく、天然配列PROのプロモーター、エンハンサー成分及びイントロンを含むゲノム配列から誘導され得る。例えば、スクリーニング法は、PROポリペプチド遺伝子のコード化領域を周知のDNA配列を用いて単離して約40塩基の選択されたプローブを合成することを含む。ハイブリッド形成プローブは、32P又は35S等の放射性ヌクレオチド、又はアビディン/ビオチン結合系を介してプローブに結合したアルカリフォスファターゼ等の酵素標識を含む種々の標識で標識されうる。本発明のPROポリペプチド遺伝子に相補的な配列を有する標識されたプローブは、ヒトcDNA、ゲノムDNA又はmRNAのライブラリーをスクリーニングし、そのライブラリーの何れのメンバーがプローブにハイブッド形成するかを決定するのに使用できる。ハイブリッド形成技術は、以下の実施例において更に詳細に記載する。
【0345】
本出願で開示する任意のESTはプローブと同様に、ここに記載した方法で用いることができる。
PRO核酸の他の有用な断片は、標的PROmRNA(センス)又はPRODNA(アンチセンス)配列に結合できる一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを含む、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、本発明によると、PRODNAのコード化領域の断片を含む。このような断片は、一般的には少なくとも約14ヌクレオチド、好ましくは約14から30ヌクレオチドを含む。与えられたタンパク質をコードするcDNA配列に基づく、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを制御する可能性は、例えば、Stein及びCohen(CancerRes. 48: 2659: 1988)及び van der Krol等(BioTechniques 6: 958, 1988)に記載されている。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への結合は二重鎖の形成をもたらし、それは、二重鎖の分解の促進、転写又は翻訳の期外停止を含む幾つかの方法の一つ、又は他の方法により、標的配列の転写又は翻訳を阻止する。よって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、PROタンパク質の発現を阻止するのに用いられる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、修飾糖−ホスホジエステル骨格(又は他の糖結合、WO 91/06629に記載のもの等)を有するオリゴヌクレオチドをさらに含み、そのような糖結合は内因性ヌクレアーゼ耐性である。そのような耐性糖結合を持つオリゴヌクレオチドは、インビボで安定であるが(即ち、酵素分解に耐えうるが)、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性は保持している。
【0346】
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例は、WO 90/10048に記載されているもののような、有機部分、及びオリゴヌクレオチドの標的核酸配列への親和性を向上させる他の部分、例えばポリ−(L−リジン)に共有結合したオリゴヌクレオチドを含む。さらにまた、エリプチシン等の挿入剤、アルキル化剤又は金属作体をセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに結合させ、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を改変してもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、CaPO4−媒介DNA形質移入、エレクトロポレーションを含む任意の遺伝子転換方法により、又はエプスタイン−バーウイルスなどの遺伝子転換ベクターを用いることにより、標的核酸配列を含む細胞に導入される。好ましい方法では、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、適切なレトロウイルスベクターに挿入される。標的核酸配列を含む細胞は、インビボ又はエキソビボで組換えレトロウイルスベクターに接触させる。好適なレトロウイルスベクターは、これらに限られないが、マウスレトロウイルスM−MuLVから誘導されるもの、N2(M−MuLVから誘導されたレトロウイルス)、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと命名されたダブルコピーベクター(WO 90/13641参照)を含む。
【0347】
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 91/04753に記載されているように、リガンド結合分子との複合体の形成により標的配列を含む細胞に導入してもよい。適切なリガンド結合分子は、これらに限られないが、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドを含む。好ましくは、リガンド結合分子の複合体形成は、リガンド結合分子がその対応する分子又はレセプターに結合する、あるいはセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合体の細胞への侵入を阻止する能力を実質的に阻害しない。
あるいは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 90/10448に記載されたように、オリゴヌクレオチド−脂質複合体の形成により標的核酸配列を含む細胞に導入してもよい。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質複合体は、好ましくは内因性リパーゼにより細胞内で分解される。
アンチセンスRNA又はDNA分子は一般に少なくとも約5塩基長、約10塩基長、約15塩基長、約20塩基長、約25塩基長、約30塩基長、約35塩基長、約40塩基長、約45塩基長、約50塩基長、約55塩基長、約60塩基長、約65塩基長、約70塩基長、約75塩基長、約80塩基長、約85塩基長、約90塩基長、約95塩基長、約100塩基長、あるいはそれ以上である。
【0348】
また、プローブは、PCR技術に用いて、密接に関連したPROコード化配列の同定のための配列のプールを作成することができる。
また、PROをコードするヌクレオチド配列は、そのPROをコードする遺伝子のマッピングのため、及び遺伝子疾患を持つ個体の遺伝子分析のためのハイブリッド形成プローブの作成にも用いることができる。ここに提供されるヌクレオチド配列は、インサイツハイブリッド形成、既知の染色体マーカーに対する結合分析、及びライブラリーでのハイブリッド形成スクリーニング等の周知の技術を用いて、染色体及び染色体の特定領域にマッピングすることができる。
PROのコード化配列が他のタンパク質に結合するタンパク質をコードする場合(例えば、PROがレセプターである場合)、PROは、そのリガンドを同定するアッセイに用いることができる。このような方法により、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤を同定することができる。このような結合性相互作用に含まれるタンパク質も、ペプチド又は小分子阻害剤又は結合性相互作用のアゴニストのスクリーニングに用いることができる。また、レセプターPROは関連するリガンドの単離にも使用できる。スクリーニングアッセイは、天然PRO又はPROのレセプターの生物学的活性に似たリード化合物の発見のために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリーの高スループットスクリーニングにも用いられ、小分子候補薬剤の同定に特に適したものとする。考慮される小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、この分野で良く知られ特徴付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生物学的スクリーニングアッセイ、免疫検定及び細胞ベースのアッセイを含む種々の型式で実施される。
【0349】
また、PRO又はその任意の修飾型をコードする核酸は、トランスジェニック動物又は「ノックアウト」動物を産生するのにも使用でき、これらは治療的に有用な試薬の開発やスクリーニングに有用である。トランスジェニック動物(例えばマウス又はラット)とは、出生前、例えば胚段階で、その動物又はその動物の祖先に導入された導入遺伝子を含む細胞を有する動物である。導入遺伝子とは、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれたDNAである。一実施形態では、PROをコードするcDNAは、確立された技術によりPROをコードするゲノムDNAをクローン化するために使用することができ、ゲノム配列を、PROをコードするDNAを発現する細胞を有するトランスジェニック動物を産生するために使用することができる。トランスジェニック動物、特にマウス又はラット等の特定の動物を産生する方法は当該分野において常套的になっており、例えば米国特許第4,736,866号や第4,870,009号に記述されている。典型的には、特定の細胞を組織特異的エンハンサーでのPRO導入遺伝子の導入の標的にする。胚段階で動物の生殖系列に導入されたPROコード化導入遺伝子のコピーを含むトランスジェニック動物はPROをコードするDNAの増大した発現の影響を調べるために使用できる。このような動物は、例えばその過剰発現を伴う病理学的状態に対して保護をもたらすと思われる試薬のテスター動物として使用できる。本発明のこの態様においては、動物を試薬で治療し、導入遺伝子を有する未治療の動物に比べ病理学的状態の発症率が低ければ、病理学的状態に対する治療的処置の可能性が示される。
【0350】
あるいは、PROの非ヒト相同体は、動物の胚性細胞に導入されたPROをコードする変更ゲノムDNAと、PROをコードする内在性遺伝子との間の相同的組換えによって、PROをコードする欠陥又は変更遺伝子を有するPRO「ノックアウト」動物を作成するために使用できる。例えば、PROをコードするcDNAは、確立された技術に従い、PROをコードするゲノムDNAのクローニングに使用できる。PROをコードするゲノムDNAの一部を欠失したり、組み込みを監視するために使用する選択可能なマーカーをコードする遺伝子等の他の遺伝子で置換することができる。典型的には、ベクターは無変化のフランキングDNA(5’ と3’ 末端の両方)を数キロベース含む[例えば、相同的組換えベクターについてはThomas及びCapecchi, Cell, 51:503(1987)を参照のこと]。ベクターは胚性幹細胞に(例えばエレクトロポレーションによって)導入し、導入されたDNAが内在性DNAと相同的に組換えられた細胞が選択される[例えば、Li等, Cell, 69:915(1992)参照]。選択された細胞は次に動物(例えばマウス又はラット)の胚盤胞内に注入されて集合キメラを形成する[例えば、Bradley, Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, ed. (IRL, Oxford, 1987), pp. 113−152参照]。その後、キメラ性胚を適切な偽妊娠の雌性乳母に移植し、期間をおいて「ノックアウト」動物をつくり出す。胚細胞に相同的に組換えられたDNAを有する子孫は標準的な技術により同定され、それらを利用して動物の全細胞が相同的に組換えられたDNAを含む動物を繁殖させることができる。ノックアウト動物は、PROポリペプチドが不在であることによるある種の病理的状態及びその病理的状態の進行に対する防御能力によって特徴付けられる。
【0351】
また、PROポリペプチドをコードする核酸は遺伝子治療にも使用できる。遺伝子治療用途においては、例えば欠陥遺伝子を置換するため、治療的有効量の遺伝子産物のインビボ合成を達成するために遺伝子が導入される。「遺伝子治療」とは、1回の処理により継続的効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はmRNAの1回又は繰り返し投与を含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、ある種の遺伝子のインビボ発現を阻止する治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを、細胞膜による制限された取り込みに起因する低い細胞内濃度にもかかわらず、それが阻害剤として作用する細胞中に移入できることは既に示されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4143−4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、それらの負に荷電したリン酸ジエステル基を非荷電基で置換することによって取り込みを促進するように修飾してもよい。
生存可能な細胞に核酸を導入するための種々の技術が存在する。これらの技術は、核酸が培養細胞にインビトロで、あるいは意図する宿主の細胞においてインビボで移入されるかに応じて変わる。核酸を哺乳動物細胞にインビトロで移入するのに適した方法は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などを含む。現在好ましいインビボ遺伝子移入技術は、ウイルス(典型的にはレトロウイルス)ベクターでの形質移入及びウイルス被覆タンパク質−リポソーム媒介形質移入である(Dzau等, Trends, in Biotechnology 11, 205−210(1993))。幾つかの状況では、核酸供給源を、細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンド等の標的細胞を標的化する薬剤とともに提供するのが望ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクルにおいて内部移行を受けるタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし細胞内半減期を向上させるタンパク質が、標的化及び/又は取り込みの促進のために用いられる。レセプター媒介エンドサイトーシスは、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429−4432 (1987); 及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410−3414 (1990)によって記述されている。遺伝子作成及び遺伝子治療のプロトコールの概説については、Anderson等, Science 256, 808−813 (1992)を参照のこと。
【0352】
ここに記載したPROポリペプチドは、タンパク質電気泳動目的の分子量マーカーとして用いてもよいし、単離された核酸配列は、これらのマーカーの組み換え発現に使用しもよい。
ここに記載したPROポリペプチド又はその断片をコードする核酸分子は染色体同定に有用である。この点において、実際の配列に基づく染色体マーキング試薬は殆ど利用可能ではないため、新規な染色体マーカーの同定の必要性が存在している。本発明の各PRO核酸分子は染色体マーカーとして使用できる。
また本発明のPROポリペプチド及び核酸分子は組織タイピングに使用でき、本発明のPROポリペプチドは一方の組織で他方に比較して異なる発現をする。PRO核酸分子は、PCR、ノーザン分析、サザン分析及びウェスタン分析のプローブ生成のための用途が見出されるであろう。
ここに記載したPROポリペプチドは治療薬として用いてもよい。本発明のPROポリペプチドは、製薬的に有用な組成物を調製するのに知られた方法に従って製剤され、それにより、このPRO生成物は製薬的に許容される担体媒体と混合される。治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製度を有する活性成分とを混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osol, Ed., [1980])、調製され保管される。許容される担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液;アスコルビン酸を含む抗酸化剤;低分子量(残基数10個未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性重合体;グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、EDTA等のキレート剤、マンニトール又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン;及び/又はTWEEN(商品名)、PLURONICS(商品名)又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【0353】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
ここで、本発明の製薬組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針で貫通可能なストッパーを持つ静脈内バッグ又はバイアル内に配される。
投与経路は周知の方法、例えば、静脈内、腹膜内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内又は病巣内経路での注射又は注入、局所投与、又は徐放系による。
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬物濃度は、意図する特定の用途に応じて変化する。適切な用量又は投与経路の決定は、通常の内科医の技量の範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量の決定についての信頼できるガイダンスを提供する。有効量の種間スケーリングは、Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi等, 編, Pergamon Press, New York 1989, pp. 42−96のMordenti, J. 及びChappell, W. 「The use of interspecies scaling in toxicokinetics」に記載された原理に従って実施できる。
【0354】
PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり1日に約10ng/kgから100mg/kgまで、好ましくは約1μg/kg/日から10mg/kg/日である。特定の用量及び輸送方法の指針は文献に与えられている;例えば、米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、又は第5,225,212号参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一つの器官又な組織を標的とする投与には他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することは必要であることが予想される。
PROポリペプチドの投与を必要とする任意の疾患又は疾病の治療に適した放出特性を持つ製剤でPROポリペプチドの持続放出が望まれる場合、PROポリペプチドのマイクロカプセル化が考えられる。持続放出のための組換えタンパク質のマイクロカプセル化は、ヒト成長ホルモン(rhGH)、インターフェロン−(rhIFN−)、インターロイキン−2、及びMNrgp120で成功裏に実施されている。Johnson等, Nat. Med., 2: 795−799 (1996); Yasuda, Biomed. Ther., 27: 1221−1223 (1993); Hora等, Bio/Technology, 8: 755−758 (1990); Cleland, 「Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polyactide Polyglycolide Microsphere Systems」Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell 及び Newman編, (Plenum Press: New York, 1995), p. 439−462; WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399; 及び米国特許第5,564,010号。
【0355】
これらのタンパク質の持続放出製剤は、ポリ−乳酸−コグリコール酸(PLGA)ポリマーを用い、その生体適合性及び広範囲の生分解特性に基づいて開発された。PLGAの分解生成物である乳酸及びグリコール酸は、ヒト身体内で即座にクリアされる。さらに、このポリマーの分解性は、分子量及び組成に依存して数ヶ月から数年まで調節できる。Lewis, 「Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer」: M. Chasin及び R. Langer (編), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), pp. 1−41。
本発明は、PROポリペプチドに類似する(アゴニスト)又はPROポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドの他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
該アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイで、この分野で知られたものを含む種々の方式で実施される。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
【0356】
結合アッセイにおいて、相互作用は結合であり、形成された複合体は単離されるか、又は反応混合物中で検出される。特別な実施態様では、ここに同定された遺伝子にコードされるPROポリペプチド又は候補薬が、共有又は非共有結合により固相、例えばミクロタイタープレートに固定化される。非共有結合は、一般的に固体表面をポリペプチドの溶液で被覆し乾燥させることにより達成される。あるいは、固定化されるPROポリペプチドに特異的な固定化抗体、例えばモノクローナル抗体を、それを固体表面に固着させるために用いることができる。アッセイは、固定化成分、例えば固着成分を含む被覆表面に、検出可能な標識で標識されていてもよい非固定化成分を添加することにより実施される。反応が完了したとき、未反応成分を例えば洗浄により除去し、固体表面に固着した複合体を検出する。最初の非固定化成分が検出可能な標識を有している場合、表面に固定化された標識の検出は複合体形成が起こったことを示す。最初の非固定化成分が標識を持たない場合は、複合体形成は、例えば、固定化された複合体に特異的に結合する標識抗体によって検出できる。
【0357】
候補化合物が相互作用するがここに同定した遺伝子にコードされる特定のPROポリペプチに結合しない場合、そのポリペプチドとの相互作用は、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するために良く知られた方法によってアッセイすることができる。そのようなアッセイは、架橋、同時免疫沈降、及び勾配又はクロマトグラフィカラムを通す同時精製などの伝統的な手法を含む。さらに、タンパク質−タンパク質相互作用は、Fields及び共同研究者等[Fiels及びSong, Nature(London) 340, 245−246 (1989); Chien等, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 88, 9578−9582 (1991)]に記載された酵母菌ベースの遺伝子系を用いることにより、Chevray及びNathans[Proc.Natl. Acad. Sci. USA 89, 5789−5793 (1991)]に開示されている酵母菌ベースの系を用いて監視することができる。酵母菌GAL4などの多くの転写活性化剤は、2つの物理的に別個のモジュラードメインからなり、一方はDNA結合ドメインとして作用し、他方は転写活性化ドメインとして機能する。以前の文献に記載された酵母菌発現系(一般に「2−ハイブリッド系」と呼ばれる)は、この特性の長所を利用して、2つのハイブリッドタンパク質を用い、一方では標的タンパク質がGAL4のDNA結合ドメインに融合し、他方では、候補となる活性化タンパク質が活性化ドメインに融合している。GAL1−lacZリポーター遺伝子のGAL4活性化プロモーターの制御下での発現は、タンパク質−タンパク質相互作用を介したGAL4活性の再構成に依存する。相互作用するポリペプチドを含むコロニーは、β−ガラクトシダーゼに対する色素生産性物質で検出される。2−ハイブリッド技術を用いた2つの特定なタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を同定するための完全なキット(MATCHMAKER(商品名))は、Clontechから商業的に入手可能である。この系は、特定のタンパク質相互作用に含まれるタンパク質ドメインのマッピング、並びにこの相互作用にとって重要なアミノ酸残基の特定にも拡張することができる。
【0358】
ここで同定されたPROポリペプチドをコードする遺伝子と細胞内又は細胞外成分との相互作用を阻害する化合物は、次のように試験できる:通常は反応混合物は、遺伝子産物と細胞外又は細胞内成分を、それら2つの生成物が相互作用及び結合する条件下及び時間で含むように調製される。候補化合物が結合を阻害する能力を試験するために、反応は試験化合物の不存在及び存在下で実施される。さらに、プラシーボを第3の反応混合物に添加してポジティブ対照を提供してもよい。混合物中に存在する試験化合物と細胞内又は細胞外成分との結合(複合体形成)は上記のように監視される。試験化合物を含有する反応混合物ではなく対照反応における複合体の形成は、試験化合物が試験化合物とその結合パートナーとの相互作用を阻害することを示す。
アンタゴニストを検定するために、PROポリペプチドを特定の活性についてスクリーニングする化合物とともに添加してよく、PROポリペプチド存在下での対象とする活性を阻害する化合物の能力が化合物がPROポリペプチドのアンタゴニストであることを示す。あるいは、アンタゴニストは、PROポリペプチド及び膜結合PROポリペプチドレセプター又は組換えレセプターを持つ潜在的アンタゴニストを、競合的阻害アッセイに適した条件下で結合させることにより検出してもよい。PROポリペプチドは、放射活性等で標識でき、レセプターに結合したPROポリペプチドの数を潜在的アンタゴニストの有効性を決定するのに使用できる。レセプターをコードする遺伝子は、当業者に知られた多くの方法、例えばリガンドパンニング及びFACSソートにより同定できる。Coligan等, Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)。好ましくは、発現クローニングが用いられ、ポリアデニル化RNAがPROポリペプチドに反応性の細胞から調製され、このRNAから生成されたcDNAライブラリがプールに分配され、COS細胞又はPROポリペプチド反応性でない他の細胞の形質移入に使用される。スライドガラスで成長させた形質移入細胞を標識したPROポリペプチドに暴露する。PROポリペプチドは、ヨウ素化又は部位特異的タンパク質キナーゼの認識部位の包含を含む種々の手段で標識できる。固定及びインキュベーションの後、スライドにオートラジオグラフィ分析を施す。ポジティブプールを同定し、相互作用サブプール化及び再スクリーニング工程を用いてサブプールを調製して再形質移入し、結果的に推定レセプターをコードする単一のクローンを生成する。
【0359】
レセプター同定の代替的方法として、標識下PROポリペプチドをレセプター分子を発現する細胞膜又は抽出調製物に光親和性結合させることができる。架橋材料はPAGEに溶解させ、X線フィルムに暴露する。レセプターを含む標識複合体を励起し、ペプチド断片に分離し、タンパク質マイクロ配列決定を施すことができる。マイクロ配列決定から得たアミノ酸配列は、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するcDNAライブラリをスクリーニングする分解性オリゴヌクレオチドプローブの組の設計に用いられる。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリペプチド−及びモノクローナル抗体及び抗体断片、一本鎖抗体、抗−イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが効果を与えず、従ってPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。
他の潜在的なPROポリペプチドアンタゴニストは、アンチセンス技術を用いて調製されたアンチセンスRNA又はDNA作成物であり、例えば、アンチセンスRNA又はDNAは、標的mRNAにハイブリッド形成してタンパク質翻訳を妨害することによりmRNAの翻訳を直接阻止するように作用する。アンチセンス技術は、トリプルへリックス形成又はアンチセンスDNA又はRNAを通して遺伝子発現を制御するのに使用でき、それらの方法はともに、ポリペプチドヌクレオチドのDNA又はRNAへの結合に基づく。例えば、ここでの成熟PROポリペプチドをコードするポリペプチドヌクレオチド配列の5’コード化部分は、約10から40塩基対長のアンチセンスRNAオリゴヌクレオチドの設計に使用される。DNAオリゴヌクレオチドは、転写に含まれる遺伝子の領域に相補的であるように設計され(トリプルへリックス−Lee等, Nucl, Acid Res., 6: 3073 (1979); Cooney等, Science, 241: 456 (1988); Dervan等, Science, 251: 1360 (1991)参照)、それによりPROポリペプチドの転写及び生成を防止する。アンチセンスRNAオリゴヌクレオチドはインビボでmRNAにハイブリッド形成してmRNA分子のPROポリペプチドへの翻訳を阻止する(アンチセンス−Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (SRS Press: Boca Raton, FL, 1988))。上記のオリゴヌクレオチドは、細胞に輸送され、アンチセンスRNA又はDNAをインビボで発現させて、PROポリペプチドの生産を阻害することもできる。アンチセンスDNAが用いられる場合、翻訳開始部位、例えば標的遺伝子ヌクレオチド配列の−10から+10位置の間から誘導されるオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【0360】
潜在的アンタゴニストは、PROポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPROポリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリッド形成、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469−471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日公開)を参照。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、PCT公報、番号WO 97/33551, 上掲を参照。
これらの小分子は、上記で検討したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
【0361】
PRO213ポリペプチド及びその一部は、成長誘発カスケード及び/又は血液凝集カスケードを調節する能力を持ち、インビボ及びインビトロでそのような目的のために用いることができる。当業者はPRO213ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド274及びその一部は、7TMタンパク質及びFn54に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規な7TMタンパク質及びFn54様分子の同定は多数のヒト疾患に関連し、それはリガンドの認識及びそれに続くリガンドに含まれる細胞プロセスの制御のための情報のシグナル伝達を含む。即ち、新たな7TMタンパク質及びFn54様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO274などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
PROポリペプチド300及びその一部は、Diff33に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なDiff33様分子の同定は癌の生理学などの多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなDiff33様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO300などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0362】
本発明のPRO296ポリペプチドは、肉腫増幅SASタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO296ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO329ポリペプチドは、免疫グロブリンFcレセプタータンパク質又はそのサブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO329ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO362ポリペプチドは、A33抗原タンパク質、HCARタンパク質又はNrCAM関連細胞接着分子に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。
【0363】
本発明のPRO363ポリペプチドは、細胞表面HCARタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO363ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。特に、PROポリペプチドから誘導される細胞外ドメインは、ウイルス感染の影響を低下させるためにインビボで治療的に使用できる。
本発明のPRO868ポリペプチドは、腫瘍壊死因子タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO868ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO382ポリペプチドは、セリンプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO382ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0364】
PROポリペプチド545及びその一部は、メルトリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。細胞接着に関連する新規な分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。メルトリンタンパク質が多くの疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなメルトリンタンパク質及びメルトリン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO545などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO617ポリペプチドは、CD24タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO617ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド700及びその一部は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。ジスルフィド結合の形成及びタンパク質折りたたみが多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たすので、新たなタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ及びタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO700などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0365】
本発明のPRO702ポリペプチドは、コングルチニンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO702ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。コングルチニン活性を持つPRO702ポリペプチドは、インフルエンザウイルスによる赤血球凝集活性を阻害することができ及び及び/又は補体媒介機構の結果として免疫グロブリン非依存性防御分子として機能すると予測される。
本発明のPRO703ポリペプチドは、VLCASタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO703ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド703及びその一部は、VLCASに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なVLCASタンパク質及び関連分子の同定は多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなVLCASタンパク質及びVLCASタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO703などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0366】
本発明のPRO705ポリペプチドは、K−グリピカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO705ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO708ポリペプチドは、アリールスルファターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO708ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO320ポリペプチドは、フィブリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO320ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド320及びその一部は、フィブリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なフィブリンタンパク質及び関連分子の同定は、癌などの多数のヒト疾患又は結合組織、接着分子及び関連機構を含むものに関連する。即ち、新たなフィブリンタンパク質及びフィブリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO320などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0367】
本発明のPRO324ポリペプチドは、オキシドレダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO324ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO351ポリペプチドは、プロスタシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO351ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド351及びその一部は、プロスタシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なプロスタシンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなプロスタシンタンパク質及びプロスタシンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO351などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0368】
本発明のPRO352ポリペプチドは、ブチロフィリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO352ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO381ポリペプチドは、FKPBイムノフィリンタンパク質の一又は複数に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方、例えば、免疫抑制活性の促進及び/又は軸索再生に用いられる。当業者は本発明のPRO381ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO386ポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されるナトリウムチャンネルのベータ−2サブユニットに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO386ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0369】
本発明のPRO540ポリペプチドは、LCATタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO540ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO615ポリペプチドは、シナプトギリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO615ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド615及びその一部は、シナプトギリンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なシナプトギリンタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなシナプトギリンタンパク質及びシナプトギリンタンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO615などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0370】
本発明のPRO618ポリペプチドは、エンテロペプチダーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO618ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド618及びその一部は、エンテロペプチダーゼに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なエンテロペプチダーゼタンパク質及び関連分子の同定は、多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなエンテロペプチダーゼタンパク質及びエンテロペプチダーゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO618などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO719ポリペプチドは、リポタンパク質リパーゼHタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO719ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0371】
本発明のPRO724ポリペプチドは、ヒトLDLレセプタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO724ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO772ポリペプチドは、ヒトA4タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO772ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO852ポリペプチドは、或る種のプロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO852ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0372】
本発明のPRO853ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO853ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド853及びその一部は、レダクターゼタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。酸素フリーラジカル及び酸化防止剤が多数の疾患プロセスにおいて重要な役割を果たすことがわかったので、新規なレダクターゼタンパク質及びレダクターゼ様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO853などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO860ポリペプチドは、ニューロファシンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO860ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド860及びその一部は、ニューロファシンに相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なニューロファシンタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなニューロファシンタンパク質及びニューロファシン様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO860などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0373】
本発明のPRO846ポリペプチドは、CMRF35タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO846ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド846及びその一部は、CMRF35タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なCMRF35タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなCMRF35タンパク質及びCMRF35タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO846などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO862ポリペプチドは、リソザイムタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO862ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド862及びその一部は、リソザイムタンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なリソザイムタンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなリソザイムタンパク質及びリソザイム様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO862などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
【0374】
本発明のPRO864ポリペプチドは、Wnt−4タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO864ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PROポリペプチド864及びその一部は、Wnt−4タンパク質に相同性を持ち、インビボ治療用途並びに種々の他の応用に有用である。新規なWnt−4タンパク質及び関連分子の同定は、細胞接着を含む多数のヒト疾患に関連する。即ち、新たなWnt−4タンパク質及びWnt−4タンパク質様分子の同定は、それらのタンパク質が種々の異なるヒト疾患の潜在的治療をもたらしうることにおいて特に重要である。このようなポリペプチドは、生物工学的及び医学的研究において並びに種々の工業的応用においても重要な役割を果たす。結果として、PRO860などの新規な分子には、特に科学的及び医学的興味がある。
本発明のPRO792ポリペプチドは、CD23タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO792ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0375】
本発明のPRO866ポリペプチドは、ミンジン及び/又はスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO866ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のPRO871ポリペプチドは、サイクロフィリンタンパク質ファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO871ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO873ポリペプチドは、カルボキシルエステラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。例えば、それらはプロドラッグと組み合わされ、プロドラッグをその活性形態に変換するのに用いられる(Danks等, 上掲参照)。それらは、パラサイト感染の阻害に用いてもよい(van Pelt等, 上掲参照)。本発明のPRO873ポリペプチドをそれら又は他の用途に用いる方法は、当業者には容易に理解されるであろう。
【0376】
本発明のPRO940ポリペプチドは、CD33タンパク質及び/又はOB結合タンパク質−2に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO940ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO941ポリペプチドは、カドヘリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO941ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO944ポリペプチドは、CPE−Rタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO944ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。ウェルシュ菌エンテロトキシン(CPE)に結合する機能を持つ本発明のPRO944ポリペプチドは、CPEエンドトキシンによる感染の有効な治療に用途が見出される。
【0377】
本発明のPRO983ポリペプチドは、小胞関連膜タンパク質、VAP−33に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO983ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1057ポリペプチドは、プロテアーゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1057ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1071ポリペプチドは、トロンボスポンジンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1071ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0378】
本発明のPRO1072ポリペプチドは、レダクターゼタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1072ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1075ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1075ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
本発明のPRO181ポリペプチドは、コルニコンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO181ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0379】
本発明のPRO827ポリペプチドは、種々のインテグリンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO827ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1114ポリペプチドは、タンパク質のサイトカインレセプターファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1114ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
上記に加えて、PRO1114インターフェロンレセプターポリペプチドは、インビボ及びインビトロの両方で、インターフェロンリガンドへの結合能力が望まれる用途で用いられる。このような応用はこの分野の技術常識である。
本発明のPRO237ポリペプチドは、脱炭酸酵素タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO237ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
【0380】
本発明のPRO541ポリペプチドは、トリプシンインヒビタータンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO541ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO273ポリペプチドは、他のケモカインが競合的アッセイの実施に用いられるアッセイにおいて用いることができる。結果はしかるべく用いることができる。
本発明のPRO701ポリペプチドは、ニューロリジンファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO701ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO701は、ニューロンでのアッセイに用いることができ、それに対する活性をニューロリジン1、2及び3と比較することができる。結果はしかるべく適用できる。
【0381】
本発明のPRO704ポリペプチドは、小胞複合膜タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO704ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO704は、それが同一性を有するポリペプチドでアッセイでき、相対的活性を決定できる。結果はしかるべく適用できる。PRO704はエンドサイトーシス活性を測定するための活性についてタグ又は測定でき、それによりエンドサイトーシスに影響する薬剤をスクリーニングできる。
本発明のPRO706ポリペプチドは、内因性前立腺酸ホスファターゼ前駆体に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO706ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO706は、ヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ホスファターゼでのアッセイに使用でき、それらに対する活性をヒト前立腺酸ホスファターゼ又はヒトリソソーム産ヒスファターゼと比較する。結果はしかるべく適用できる。
【0382】
本発明のPRO707ポリペプチドは、カドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO707ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO707は、他のカドヘリン、特にカドヘリンFIB3に対するその活性を決定するアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO322ポリペプチドは、ニューロプシンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO322ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO322は、ニューロピリン、トリプシノーゲン、セリンプロテアーゼ及びニューロシンに対するその活性を決定するアッセイに使用でき、結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO526ポリペプチドは、タンパク質−タンパク質結合タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO526ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO526がそれに結合するか及びその結合により半減期が向上するかを決定する複合体を形成することが知られた成長因子及び他のタンパク質でアッセイを実施できる。結果はしかるべく用いられる。
【0383】
本発明のPRO531ポリペプチドは、プロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO531ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO531は、それらの相対的活性を決定するために、プロトカドヘリン3及び他のプロトカドヘリンに対するアッセイに用いることができる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO534ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO534ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO534は、相対的活性を決定するためにタンパク質ジスルフィドイソメラーゼでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO697ポリペプチドは、sFRPファミリーに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO697ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO697は、相対的活性を決定するためにsFRP及びSARPでのアッセイに使用できる。結果はしかるべく適用できる。
【0384】
本発明のPRO731ポリペプチドは、任意のプロトカドヘリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO731ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO731は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO768ポリペプチドは、インテグリンに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO768ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO768は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO771ポリペプチドは、テスチカンタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO771ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO771は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0385】
本発明のPRO733ポリペプチドは、T1/ST2レセプターに結合するタンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO733ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO733は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO162ポリペプチドは、膵臓関連タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO162ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO162は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO788ポリペプチドは、抗悪性腫瘍尿タンパク質に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO788ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO788は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0386】
本発明のPRO1008ポリペプチドは、dkk−1に関連する生物学的活性を有しインビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1008ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1008は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1012ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1012ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知ってる。
PRO1012は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1014ポリペプチドは、レダクターゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1014ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1014は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。PRO1014の阻害剤が特に好ましい。結果はしかるべく適用できる。
【0387】
本発明のPRO1017ポリペプチドは、スルホトランスフェラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1017ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1017は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO474ポリペプチドは、デヒドロゲナーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO474ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO474は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
本発明のPRO1031ポリペプチドは、IL−17に関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1031ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1031は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。
【0388】
本発明のPRO938ポリペプチドは、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO938ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
本発明のPRO1082ポリペプチドは、LDLレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1082ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
PRO1082は、それらが同一性を有するポリペプチドでの、相対的活性を決定するためのアッセイに用いられる。結果はしかるべく適用できる。またPRO1082は、レセプターを変調させる候補薬剤を同定するアッセイに使用できる。
本発明のPRO1083ポリペプチドは、7TMレセプターに関連する生物学的活性を有し、インビボ治療用途及びインビトロの両方に用いられる。当業者は本発明のPRO1083ポリペプチドをそのような用途に用いる方法を良く知っている。
特にPRO1083は、PRO1083を制御又は変調させる、即ちレセプターに影響を与える候補薬剤を決定するアッセイに使用できる。
【0389】
ここで、VEGF−E分子は、細胞の生存、増殖及び/又は分化に関連する多くの治療的用途を有する。このような用途は、VEGF−Eがヒト臍静脈内皮細胞の生存を増大させる能力が示されたという観点から、臍静脈内皮細胞の治療を含む。治療は、静脈が損傷を受けた場合、又は例えば臍静脈の生存を促進するための人工的手段が用いられた状況、例えば、人工的マトリクスに基づいて又は人工的な環境においてにおいてそれが弱体化、疾患となっている状況で必要とされる。VEGF−Eの選択的分裂促進特性に基づいて向上されうる他の生理学的状態もここに含まれる。また、用途は、VEGF−Eが繊維芽細胞の増殖及び筋細胞肥大を誘発する能力が示されたという観点から、繊維芽細胞及び筋細胞の治療も含む。特に、VEGF−Eは創傷治癒、組織成長及び筋生成及び再生に使用できる。
上記した徴候のために、VEGF−E分子を製剤し、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、VEGF−Eの送達部位、投与方法、及び実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する形式で投与される。即ち、ここでの目的について、VEGF−Eの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び/又は分化を促進するのに十分な量である。
【0390】
天然VEGFに対して生じた抗体と免疫学的交差反応性であるVEGF−Eアミノ酸変異体配列及び誘導体は、標準として、又は標識された場合には競合試薬としてについてのVEGF−Eについてのイムノアッセイに有用である。
VEGF−Eは、適当な純度を持つVEGF−Eを任意の生理学的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤と混合することにより貯蔵又は投与のために調製される。このような材料は、用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性である。VEGF−Eが水溶性である場合、それはクエン酸塩又は他の有機酸塩などのバッファー中に、好ましくは約7から8のpHで製剤される。VEGF−Eが水に一部しか溶解しない場合、それを0.04−0.05%(w/v)の量のTween、Pluronics又はPEG等の非イオン性界面活性剤、例えばTween80とともに製剤して溶解性を向上させ、マイクロエマルションとして調製してもよい。
場合によっては、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸;低分子量(約10残基未満)ポリペプチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、又はアルギニン;セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;及びマンニトール又はソルビトール等の糖といった他の成分を添加してもよい。
【0391】
治療投与に用いられるVEGF−Eは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌濾過膜(例えば、0.2ミクロン膜)を通すことにより容易に達成される。VEGF−Eは通常は凍結乾燥形態又は熱的及び酸化的変性に対して安定性が高い場合には水溶液中に貯蔵される。VEGF−E製剤のpHは典型的には約6から8であるが、より高い又は低いpH値が適している場合もある。上記した或る種の賦形剤、担体又は安定化剤を用いることによりVEGF−Eの塩が形成されることは理解されるであろう。
VEGF−Eが非経口で用いられる場合、VEGF−Eを含有する治療用組成物は一般的に無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備するバイアルに配される。
一般に、疾患が許すならば、VEGF−Eを部位特異的輸送のために製剤し投与すべきである。これは、創傷及び腫瘍の場合に便利である。
また、持続放出製剤を調製することもでき、マイクロカプセル粒子及びインプラント可能な物品の形成も含む。持続放出VEGF−E組成物を調製するために、VEGF−Eは好ましくは生分解性マトリクス又はマイクロカプセルに導入される。この目的に適した材料はポリアクチドであるが、ポリ−(a−ヒドロキシカルボン酸)のポリマー、例えばポリ−D−(−)−3−ヒドロキシブチル酸(EP 133,988A)を用いることもできる。他の生分解性ポリマーは、ポリ(ラクトン)、ポリ(オルトエステル)、又はポリ(オルトカーボネート)を含む。ここで最初に考慮するのは、担体自身又はその分解生成物が標的組織に非毒性であり、状態を悪化させないことである。これは、標的とする疾患の動物モデル、もしそのようなモデルが入手不能ならば正常な動物における日常的なスクリーニングによって決定できる。多数の科学出版物がそのような動物モデルを記録している。
【0392】
持続性放出組成物については、米国特許第3,773,919号、EP 58,481A、米国特許第3,887,699号、EP 158,277A、カナダ国特許番号1176565、U. Sidman等, Biopolymers 22, 547 (1983)、及びR. Langer等, Chem. Tech. 12, 98[1982]を参照のこと。
局所適用する場合、VEGF−Eは好適には他の成分、例えば担体及び/又はアジュバントと組み合わされる。そのような他の成分の性質には、それらの意図している投与について製薬的に許容可能かつ有効であり、組成物の活性成分の活性を低下させないこと以外に制限はない。適当な媒体の例には、軟膏、クリーム、ゲル、又は懸濁液を含み、精製コラーゲンを含んでも含まなくてもよい。また、組成物は経皮パッチ、プラスター、及びバンドに、好ましくは液体又は半液体形態で含浸させてもよい。
【0393】
ゲル製剤を得るために、液体組成物に製剤したVEGF−Eを、有効量の水溶性多糖類又はポリエチレングリコールなどの合成ポリマーと混合して、局所投与するのに適した粘度のゲルを形成してもよい。用いられる多糖類は、例えば、セルロース誘導体、例えばアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース、及びヒドロキシアルキルセルロースを含むエーテル化セルロース誘導体、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロース;デンプン及び分別デンプン;寒天;アルギン酸及びアルギン酸塩;アラビアゴム;プルラン;アガロース;カラゲナン;デキストラン;デキストリン;フルクタン;インシュリン;マンナン;キシラン;アラビナン;キトサン;グリコーゲン;グルカン;及び合成バイオポリマー;並びにゴム、例えばキサンタンゴム;グアールゴム;イナゴマメゴム;アラビアゴム;トラガカントゴム;及びカラヤゴム;及びこれらの誘導体及び混合物である。ここで好ましいゲル化剤は、生物学系に不活性で、非毒性で、調製が単純で、なおかつ緩すぎず粘りすぎず、そしてそこに保持されるVEGF−Eを不安定化させないものである。
好ましくは、多糖類はエーテル化セルロース誘導体、より好ましくは良好に定義され、精製され、米国特許に記載されたものであり、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのメチルセルロース及びヒドロキシアルキルセルロース誘導体である。ここで最も好ましいのはメチルセルロースである。
ゲル化に有用なポリエチレングリコールは、典型的には適切な粘度を得るための低及び高分子量ポリエチレングリコールの混合物である。例えば、分子量400−600のポリエチレングリコールと分子量1500のものとの混合物は、ペーストを得るのに適した比率で混合した場合にこの目的に有効となるであろう。
【0394】
多糖類及びポリエチレングリコールに適用される「水溶性」という用語は、コロイド溶液及び分散物も含むことを意味する。一般に、セルロース誘導体の溶解性はエーテル基の置換の程度によって決まり、ここで有用な安定化誘導体は、そのようなエーテル基をセルロース鎖の無水グルコース単位当たりに誘導体を水溶性とするのに十分な量有していなければならない。無水グルコース単位当たりに少なくとも0.35のエーテル基というエーテル置換度が一般的には十分である。さらに、セルロース誘導体はアルカリ金属塩、例えばLi、Na、K、又はCs塩の形態であってもよい。
ゲルにメチルセルロースが用いられる場合、好ましくはゲルの約2−5%、より好ましくは約3%を含み、VEGFはゲル1ml当たりに約300−1000mgの量で存在する。
【0395】
用いられる投与量は上記の要因に依存する。一般的な提案として、VEGF−Eは、組織において約0.1ng/ccより大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのVEGF−Eレベルを確立することのできる投与量で製剤され標的部位又は組織に輸送される。この細胞内濃度は、もし可能ならば、連続的吸入、持続放出、局所適用、又は経験的に決められる頻度での注射により維持されるべきである。
ここで、VEGF−E治療を、細胞増殖、生存、分化及び再生の促進において、VEGF−Eを含む任意の成長因子の活性を向上させるための他の新規な又は従来からの治療薬(例えば、VEGF、aFGF、bFGF、PDGF、IGF、NGF、タンパク同化ステロイド、EGF又はTGF−a等の成長因子)と組み合わせるのも範囲内である。これらの協働治療薬は、それ自体が本発明の組成物に含まれる必要はないが、それらの薬剤がタンパク質性であるのが便利である。そのような混合物は、VEGF−Eが単独で用いられるのと同様の方式及び同様の目的で適切に投与される。VEGF−Eのそれら二次的成長因子に対する有用なモル比は、典型的には1:0.1−10であり、およそ等モル量が好ましい。
【0396】
本発明の化合物は、製薬的に有用な組成物を調製するための周知の方法に従って処方でき、それによりPROポリペプチドが製薬的に許容可能な担体媒体との混合物に混合される。好適な担体媒体及びその処方は、他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含むが、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., Osol等編集に記載されており、その開示は参考としてここに取り入れる。ここで、VEGF−Eは、心臓血管疾患又は状態に罹った患者に非経口で投与してもよく、又は血流への有効形態での輸送を確実にする他の方法によってもよい。
本発明の実施に用いられるVEGF−Eの臨床投与に特に良く適した組成物は、例えば、無菌の水溶液、又は凍結乾燥タンパク質のような無菌の水和可能な粉末を含む。一般的に好ましいのは、製剤中に適量の、一般的には製剤を等張にするのに十分な量の製薬的に許容可能な塩をさらに含むことである。また、アルギニン塩基、及びリン酸などのpH調節剤は、典型的には適当なpH、一般的には5.5から7.5に維持するのに十分な量が含まれる。さらに、水性製剤の有効期間又は安定性を向上させるために、グリセロールなどの薬剤を更に含有するのも望ましい。このようにして、種々のt−PA製剤が非経口投与、特に静脈内投与に適したものとされる。
【0397】
本発明の製薬組成物の用量及び望ましい薬剤濃度は、特に意図される用途に応じて変化する。例えば、静脈深部の血栓症又は末梢血管疾患の治療においては、「ボーラス」投与が典型的には好ましく、それに続く投与は、およそ一定な血液レベル、好ましくは約3μg/mlのオーダーに維持するように与えられる。
しかしながら、吸入能力は一般に利用できない救急医療ケア設備に関連する用途では、横たわる疾患(例えば塞栓症、亀裂骨折)の一般的な緊急性のために、幾分多めの初期投与量、例えば静脈内ボーラスを与えるのが一般的に望ましい。
ここの化合物について述べた種々の徴候のために、VEGF−E分子は、治療すべき特定の疾患、個々の患者の状態、輸送部位、投与方法、及び対応する分野の実務者に知られた他の要因を考慮して良好な医学的実務に合致する方式で製剤され投与される。即ち、ここでの目的について、VEGF−Eの「治療的有効量」は、治療される状態の悪化を防止、抑制するか、その状態を軽減又は回復させるのに有効な量、特に、治療されるインビボでの細胞の生存、増殖及び/又は分化を促進するのに十分な量である。一般的に、治療すべき治療的徴候の対象である組織において約0.1ng/cm3より大きく、有効だが過度に毒性ではない最大用量までのVEGF−Eレベルを確立することのできる投与量が採用される。組織内投与は、ここの化合物の或る種の治療的徴候のための選択肢であると考えられる。
【0398】
本発明のヒトTollタンパク質も、Toll媒介シグナル伝達に含まれる他のタンパク質又は分子を同定するアッセイに使用できる。例えば、PRO285及びPRO286は、ヒトTollレセプターの未だ知られていない天然リガンド、又はヒトTollレセプターを介する活性化及び/又はシグナル伝達に(直接又は間接的に)参加する他の因子、例えば潜在的Tollレセプター関連キナーゼなどを同定するのに有用である。さらに、レセプター/リガンド結合性相互作用の阻害剤(インヒビター)も同定できる。そのような結合性相互作用に含まれるタンパク質は、結合性相互作用のペプチド又は小分子インヒビター又はアゴニストのスクリーニングにも使用できる。
スクリーニングアッセイは、天然Tollポリペプチド又は天然Tollポリペプチドのリガンドの生物学的活性に類似するリード化合物を見出すのに設計することができる。そのようなスクリーニングアッセイは、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能であり、小分子薬剤候補の同定のために特に適したものにする。考えられる小分子は、合成有機又は無機化合物を含む。アッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ及び細胞ベースのアッセイを含む種々の形式で実施され、それらはこの分野で良く特徴付けされている。
【0399】
インビトロアッセイは、Tollレセプターポリペプチドを含む成分の混合物を用いるが、それは他のペプチド又はポリペプチド、例えば検出又は固着などのためのタグとの融合生成物の一部であってもよい。アッセイ混合物は、(結合アッセイのために)天然細胞内又は細胞外Toll結合標的(例えば、Tollリガンド、又はTollレセプターを介して活性化及び/又はシグナル伝達することが知られた他の分子)をさらに含有してよい。天然結合標的を用いてもよいが、そのような結合標的の一部(例えばペプチド)が、主題のTollタンパク質に対してアッセイで便利に測定可能な結合親和性及び結合活性を与える限り、その一部を用いるのが好ましい場合が多い。また、アッセイ混合物は、候補の薬理学的薬剤も含有する。候補薬剤は多くの化学的分類を含み、典型的には有機化合物、好ましくは小型有機化合物であり、合成又は天然化合物のライブラリを含む広範な供給源から得られるものに渡る。種々の他の試薬、例えば、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、洗浄剤、プロテアーゼインヒビター、ヌクレアーゼインヒビター、抗微生物薬等も含有してよい。
インビトロ結合アッセイにおいて、得られた混合物は、候補分子の存在を別にすれば、Tollタンパク質が細胞結合標的、一部又は類似物に、参照結合親和性で特異的に結合する条件下でインキュベートする。混合物成分は、必要な結合を与える任意の順序で添加でき、インキュベーションは最適の結合を促進する温度で実施する。インキュベーション時間は、同様に最適な結合のために選択するが、迅速な高スループットスクリーニングを促進するために最短とする。
【0400】
インキュベーションの後、Tollタンパク質と一又は複数の結合標的との間の薬剤を介する結合が任意の便利な技術により検出される。細胞無しの結合型アッセイのために、分離工程は結合した成分を結合していない成分から分離するのにしばしば用いられる。分離は、沈殿(例えばTCA沈殿、免疫沈降など)、固定化(例えば、固体基体上)等、次いで洗浄、例えば、膜濾過(例えばWhatman’s P−18イオン交換紙、Polyfiltronic’s 疎水性GFC膜など)、ゲルクロマトグラフィー(例えば、ゲル濾過、親和性など)によってなされる。Toll依存性転写アッセイでは、結合はToll依存性リポーターの発言における変化により検出される。
検出は任意の従来法でなされる。細胞無し結合アッセイでは、成分の一つが通常は標識を含むか結合している。標識は、放射活性、蛍光、光学又は電子密度としての直接検出、又はエピトープタグ、酵素などの間接的検出を与える。標識及び他のアッセイ成分の性質に応じて、例えば光学又は電子密度、放射線放出、非放射性エネルギー移動等を通して、又は間接的に検出される抗体抱合などで、種々の標識検出方法が用いられる。
また、ここに開示したTollポリペプチドをコードする核酸は、遺伝子治療に用いてもよい。遺伝子治療用途においては、遺伝子が細胞に導入され、例えば欠陥遺伝子を置換するために、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」とは、1回の治療で長期間の効果が達成される従来の遺伝子治療と、治療的に有効なDNA又はRNAを1回又は繰り返し投与することを含む遺伝子治療薬の投与の両方を含む。アンチセンスRNA及びDNAは、或る種の遺伝子のインビボ発現を阻止するための治療薬として用いることができる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞内に導入でき、それらの細胞膜による取り込みが少ないために生ずる細胞内低濃度にもかかわらず、そこでインヒビターとして作用することが既に示されている。(Zamnecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 4143−4146 [1986])。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電したホスホジエステルを非荷電基に置換することにより、それらの取り込みを促進するような修飾をすることができる。
【0401】
核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAE−デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などの使用を含む。現在好ましいインビボ遺伝子導入技術は、ウィルス(典型的にはレトロウィルス)ベクター及びウィスル被覆リポソーム媒介形質移入を含む(Dzau等, Trends in in Biotechnology 11, 205−210 [1993])。幾つかの状況では、核酸供給源を標的細胞をターゲティングする試薬、例えば細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体又は標的細胞、即ち標的細胞上のレセプターのリガンドなどとともに提供するのが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質が、ターゲティング及び/又は取り込みの促進のために用いられ、例えば、特定の細胞型向性のキャプシドタンパク質又はその断片、サイクリングにおいて内部移行を受けるタンパク質の抗体、及び細胞内局在化をターゲティングし細胞内半減期を向上させるタンパク質である。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem., 262:4429−4432 (1987);及びWagner等, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 3410−3414 (1990)に記載されている。現在知られている遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 256:808−813 (1992)を参照のこと。
ここにTollタンパク質に関連して列挙した種々の用途は、天然Tollレセプターの少なくとも1つの生物学的活性が類似している天然Tollレセプターのアゴニストにも利用可能である。
【0402】
ニューロトリミン並びに免疫グロブリンスーパーファミリーのIgLONサブファミリーの他のメンバーは、神経パターニング、分化、成熟及び成長に影響を与えることが同定された。その結果、PRO337というヒトニューロトリミン相同体ポリペプチドは、神経不全を特徴とする疾患において有用性を持つ。例えば、筋萎縮性側索硬化症(ルー・ゲーリグ病)、ベル麻痺、及び棘筋萎縮又は麻痺を含む種々の状態を含む運動神経疾患である。本発明のNGF変異体製剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、てんかん、多発性硬化症、ハンティングトン舞踏病、ダウン症、感音難聴、及びメニエール病などのヒト神経変性疾患の治療に使用できる。さらにPRO337ポリペプチドは、特に上記の疾患に伴うもののような痴呆又は障害において学習を促進するための認識促進剤として使用できる。
さらに、PRO337ポリペプチドは神経障害、特に末梢神経障害の治療に用いられる。「末梢神経障害」は、末梢神経系に影響を与える疾患を指し、運動、感覚、運動感覚、又は自律神経の1つ又は複数の機能障害として現れることが多い。末梢神経障害によって現れる広範な形態は、各々が同様に多くの原因の一つによる。例えば、末梢神経障害は、遺伝子的に獲得され、全身性疾患によりもたらされ、又は毒性薬により誘発されることもある。例としては、これらに限られないが、糖尿病性末梢神経障害、遠位感覚運動神経障害、又は胃腸管の運動低下又は膀胱のアトニーなどの自律神経障害を含む。全身性疾患に伴う神経障害の例は、ポスト−ポリオ症候群又はAIDS関連神経障害を含み;遺伝性神経障害は、シャルコー‐マリー‐ツース病、レフサム病、無β‐リポ蛋白血症、タンジアー病、クラッベ病、異染性白質萎縮症、ファブリー病、及びドゥジュリーヌ‐ソッタ症候群を含み;毒性薬に誘発される神経障害の例は、ビンクリスチン、シスプラチン、メトトレキセート、又は3’−アジド−3’−でオキシチミジンなどの化学治療薬での処理により生じるものを含む。同様に、ニューロトリミンアンタゴニストは、過剰なニューロン活性を特徴とする疾患において有用性を持つと予想される。
【0403】
エンドセリンは、不活性な中間体、ビッグエンドセリンから、亜鉛メタロプロテアーゼ、エンドセリン変換酵素(ECE)によって触媒される独特なプロセシング事象によって生成される。ECEは細菌クローニングされ、その構造が単一経路の膜貫通タンパク質であり、短い細胞内Nー末端及び長い細胞外C−末端を持ち、それが触媒ドメインと多数のN−グリコシル化部位を含むことが示された。ECEはTrp73及びVal74の間のエンドセリンプロペプチドを切断し、活性なペプチドであるETを生成し、それは循環ホルモンではなく局所的に作用することがわかった(Rubanyi, G.M. & Polokoff, M.A., Pharmachological Review 46: 325−415 (1994))。即ち、ECE活性はエンドセリン生成の調節の潜在的部位であり、エンドセリン系における治療的介入の可能な標的である。ECE活性を阻止することにより、相対的に不活性な前駆体ビッグET−1の生理学的に活性な形態への変換を阻止することにより、ET−1の生成を停止することができる。
【0404】
ECE−2は、アミノ酸レベルでウシECE−2と64%同一である。ECE−2はECE−1(63%同一、80%保存)、、エンドペプチダーゼ24.11及びKell血液グループタンパク質と密接に関連している。ウシECE−2は、トランス−ゴルジネットワークに局在化したII型膜結合メタロプロテイナーゼであり、そこで内因性ビッグエンドセリン−1を活性エンドセリンに変換する細胞内酵素として作用する(Emoto, N. 及び Yanangisawa, M., J. Biol. Chem. 270: 15262−15268 (1995))。ウシECE−2mRNAの発現は、脳の一部、大脳皮質、小脳及び副腎髄質で最も高い。それは、子宮筋層(mymetrium)、精巣、卵巣、及び内皮細胞で低レベルで発現される。ウシECE−2及びECE−1はともに、基質としてET−2又はET−3よりもET−1に対して活性である、Emoto及びYanangisawa, 上掲。
ヒトECE−2は736アミノ酸長で、31残基アミノ末端尾部、23残基膜貫通へリックス、及び682カルボキシ末端ドメインを持つ。それはウシECE−2に94%同一であり、ヒトECE−1に64%同一である。予想される膜貫通ドメインは、ヒト及びウシECE−2タンパク質間及びヒトECE−1及びヒトECE−2間で高度に保存され、これは推定N−結合グリコシル化部位と同様であり、Cys残基は中性エンドペプチダーゼ24.11及びKell血液グループタンパク質及び推定亜鉛結合部位に保存されている。配列は、NEP−ECE−Kellファミリーの他の膜と同様に、ヒトECE−2はII型膜貫通亜鉛結合メタロプロテイナーゼをコードし、それは、ウシECE−2について知られているものから外挿することにより、細胞内生産されたビッグET−1を持つ分泌経路内に局在化した細胞内酵素であるが、分泌小胞にとどまることを示唆している。EmotoおよびYnangisawa, 上掲。
【0405】
ECE−2の発現パターンは、ECE−1で観察されたものとは異なる。mRNAレベルのノーザンブロット分析は、成人脳(小脳、被殻、髄質および側頭葉で最も高く、大脳皮質、後頭葉、および前頭葉で低い)、脊髄、肺および膵臓での3.3kb転写物の低レベル発現、および胎児脳および腎臓における高レベル4.5kbを示した。2つの転写物サイズは、おそらくウシECE−2(Emoto及びYanangisawa, 上掲)及びECE−1(Xu等, Cell 78: 473−485 (1994))で観察されたような代替的ポリアデニル化部位の使用を表している。cDNAライブラリに対するPCRは、胎児脳、胎児腎臓、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓、胎児肺及び成人膵臓は、全て陰性であった。
ペプチドのエンドセリン(ET)ファミリーは、潜在的な血管、心臓及び腎臓活性を有し、それは多くのヒト疾患状態において病理生理学的に重要である。ET−1は不活性212アミノ酸プレペプチドとして発現される。プレペプチドは、最初にArg52−Cys53及びArg92−Ala93において切断され、次いでカルボキシ末端Lys91及びArg92がタンパク質から削除されてプロペプチドビッグET−−1を生成する。ECEは、次いでTrp73及びVal74の間で切断され、活性なペプチドETを生じ、それは循環ホルモンではなく局所で機能することがわかった(Rubany及びPolokoff, Pharma. R. 46: 325−415 (1994))。
エンドセリンは、1)心臓血管疾患(血管痙攣、高血圧、心筋虚血;再灌流障害及び急性心筋梗塞、発作(大脳虚血)、うっ血性心不全、ショック、アテローム性動脈硬化症、血管狭窄);2)腎臓疾患(急性及び慢性腎不全、糸球体腎炎、肝硬変);3)肺疾患(気管支喘息、肺高血圧症);4)胃腸疾患(胃潰瘍、炎症性腸疾患);5)生殖疾患(早産、月経困難症、子癇前症);及び6)発癌を含む多くの疾患の病理生理において役割を果たす。Rubany及びPolokoff, 上掲。
【0406】
疾患は、1)ET生産の増加;2)ETの反応性向上;及び/又は3)ETレセプター、アンタゴニスト、抗体又はECEインヒビターの有効性を試験することにより、それに対するETの衝撃について評価することができる。従前の基準に対する応答は、ETが、クモ膜下出血、高血圧(劇症/合併症)、急性腎不全及びうっ血性心臓疾患に続く大脳血管痙攣において役割を果たすと思われることを示唆している。ET生産又は活性のインヒビターは、冠状血管痙攣、急性心筋梗塞、及びアテローム性動脈硬化症のモデルで使用されていないが、それらは、上昇したETレベル及びETに対する向上した反応性を有している。ショック及び肺性の高血圧も、上昇したETレベルを示す(Rubany及びPolokoff, 上掲)。これらの状態におけるECEの阻害は治療的価値があると思われる。
ECE−2の発現パターンは、ECE−1で観察されたものとは異なる。ノーザンブロット分析によると、ECE−2は、成人脳、肺および膵臓では低レベルで、胎児脳および腎臓では高レベルで観察された(Fig8)。PCRは、さらなる組織:胎児肺、胎児小腸、及び成人精巣における低レベルの発現を示した。胎児肝臓は陰性であった。類似の発現パターンはウシECE−2について報告されている(Emoto及びYanangisawa, 上掲)。それは脳組織(大脳皮質、小脳及び側頭葉)、子宮筋層及び精巣で発現され、卵巣では低レベルで、他の多くの組織では極めて低レベルである。ウシECE−1(Xu等, 上掲)は、より広く多く発現される。それは、殆どの器官の血管内皮細胞及び幾つかの実質細胞で観察される。脳での発現では、ECE−2mRNAはECE−1より低レベルで存在した。本出願人は、ECE−2が、クモ膜下出血及び発作に続く大脳血管痙攣などの疾患の治療的介入のための特に良好な標的であると信じる。
また、ここに開示された分子の使用は、下記に開示及び記載されている陽性機能アッセイヒットに基づいてよい。
【0407】
F.抗−PROポリペプチド抗体
本発明は、さらに抗−PROポリペプチド抗体を提供するものである。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ抱合体抗体が含まれる。
1.ポリクローナル抗体
抗−PROポリペプチド抗体はポリクローナル抗体を含む。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に抱合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は、これらに限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL−TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
【0408】
2.モノクローナル抗体
あるいは、抗−PROポリペプチド抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する[Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59−103]。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【0409】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、HAT培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやメリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている[Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51−63]。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
【0410】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを制限希釈工程によりサブクローニングし、標準的な方法で成長させることができる[Goding, 上掲]。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地及びRPMI−1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として成長させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【0411】
また、モノクローナル抗体は、組換えDNA法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするDNAは、常套的な方法を用いて(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなDNAの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、DNAは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、DNAは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより[米国特許第4,816,567号;Morrison等, 上掲]、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の1つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、キメラ性二価抗体を生成する。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
【0412】
3.ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗−PROポリペプチド抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab’、F(ab’)2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(CDR)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323−329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593−596 (1992)]。
【0413】
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522−525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323−327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534−1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
また、ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリー[Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1992);Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]を含むこの分野で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Cole等及びBoerner等の方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる[Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBoerner等, J. Immunol., 147(1):86−95(1991) ]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することができる。負荷の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察される。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;同第5,661,016号、及び次の科学文献:Marks等, Bio/Technology 10, 779−783 (1992); Lonberg等, Nature 368 856−859 (1994); Morrison, Nature 368, 812−13 (1994); Fishwild等, Nature Biotechnology 14, 845−51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65−93 (1995)に記載されている。
【0414】
4.二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合において、結合特異性の一方はPRO211、PRO228、PRO538、PRO172、又はPRO182に対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく(Milstein及びCuello, Nature, 305:537−539 (1983))。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655−3656 (1991)に開示されている。
【0415】
所望の結合特異性(抗体−抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合体をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
WO96/27011に記載された他のアプローチによれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのCH3ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第1抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又はより小さいサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(アラニン又はトレオニン)と置き換えることにより第2の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【0416】
二重特異性抗体は、全長抗体又は抗体断片(例えば、F(ab’)2二重特異性抗体)として調製できる。抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してF(ab’)2断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたFab’断片はついでチオニトロベンゾアート(TNB)誘導体に転換される。Fab’−TNB誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりFab’−チオールに再転換し、他のFab’−TNB誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。生成された二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。
大腸菌からFab’断片を直接回収し、化学的に結合して二重特異性抗体を形成してもよい。Shalaby等, J. Exp. Med., 175: 217−225 (1992)は、完全にヒト化された二重特異性抗体F(ab’)2分子の製造を記述している。各Fab’断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学結合させて二重特異性抗体を形成する。このように形成された二重特異性抗体は、ErbB2レセプターを過剰発現している細胞及び正常なヒトT細胞に結合でき、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の溶解活性をトリガーする。
【0417】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産された。Kostelny等, J. Immunol., 148(5):1547−1553 (1992)。Fos及びJunタンパク質からのロイシンジッパーペプチドが遺伝子融合により二つの異なった抗体のFab’部分に結合された。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444−6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の2つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(VL)に重鎖可変ドメイン(VH)を結合してなる。従って、一つの断片のVH及びVLドメインは他の断片の相補的VL及びVHドメインと強制的に対形成させられ、2つの抗原結合部位を形成する。一本鎖Fv(sFv)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方法もまた報告されている。Gruber等, J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照されたい。
【0418】
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
例示的二重特異性抗体は、ここで与えられるPROポリペプチド上の2つの異なるエピトープに結合しうる。あるいは、抗−PROポリペプチドアームは、T細胞レセプター分子(例えばCD2、CD3、CD28又はB7)等の白血球上のトリガー分子、又はFcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)及びFcγRIII(CD16)等のIgGのFcレセプター(FcγR)に結合するアームに結合し、細胞防御メカニズムを特定のPROポリペプチド発現細胞に集中するようにしてもよい。二重特異性抗体は、細胞毒性薬を特定のPROポリペプチドを発現する細胞に局在化させるのに使用してもよい。これらの抗体は、PRO−結合アーム及び細胞毒性薬又はキレート化剤、例えばEOTUBE、DPTA、DOTA、又はTETAに結合するアームを有する。他の対象とする二重特異性抗体は、PROポリペプチドに結合し、さらに組織因子(TF)に結合する。
【0419】
5.ヘテロ抱合体抗体
ヘテロ抱合体抗体もまた本発明の範囲内である。ヘテロ抱合抗体は2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため[米国特許第4,676,980号]及びHIV感染の治療のために[WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089]提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
【0420】
6.エフェクター機能の設計
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えばガンの治療における抗体の効能を増強することが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入して、この領域における鎖間ジスルイド結合を形成させる。このようにして産生されたホモダイマー抗体は改善されたインターナリゼーション能力及び/又は増加した補体媒介細胞死滅及び抗体依存性細胞障害活性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176:1191−1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918−2922 (1992)を参照されたい。抗腫瘍活性が高められたホモダイマー抗体は、Wolff等, Cancer Research 53:2560−2565(1993)に記載されているようなヘテロ二官能性架橋剤を使用して調製することもできる。あるいは二重Fc領域を有し、よって増強された補体溶解及びADCC能を有しうる抗体を設計することができる。Stevensonら, Anti−cancer Drug Design 3:219−230 (1989)を参照。
【0421】
7.免疫複合体
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性抱合)に抱合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、コレラ毒素、ボツリヌス毒素、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ−サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP−S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性抱合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
【0422】
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N−スクシンイミジル−3−(2−ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス−アジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6−ジイソシアネート等)、及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン−14−標識1−イソチオシアナトベンジル−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に抱合されてもよく、抗体−レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に抱合された「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。
【0423】
8.免疫リポソーム
また、ここに開示するタンパク質、抗体などは免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG−誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG−PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズのフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab’断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286−288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【0424】
9.抗体の製薬組成物
ここで同定されるPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PROポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889−7893 (1993)を参照。ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington’s Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
【0425】
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなけらばならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2−ヒドロキシエチル−メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L−グルタミン酸及びγ−エチル−L−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−(D)−3−ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
【0426】
G.抗−PRO抗体の用途
本発明の抗−PRO抗体は様々な有用性を有している。例えば、抗−PRO抗体は、PROの診断アッセイ、例えばその特定細胞、組織、又は血清での発現の検出に用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ[Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc. (1987) pp. 147−158]等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、3H、14C、32P、35S又は125I等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等 Nature, 144:945 (1962);David等, Biochemistry, 13: 1014 (1974);Pain等, J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ;及びNygren, J. Histochem. and Cytochem., 30:407 (1982)に記載された方法が含まれる。
また、抗−PRO抗体は組換え細胞培養又は天然供給源からのPROのアフィニティー精製にも有用である。この方法においては、PROに対する抗体を、当該分野でよく知られている方法を使用して、セファデックス樹脂や濾紙のような適当な支持体に固定化する。次に、固定化された抗体を、精製するPROを含む試料と接触させた後、固定化された抗体に結合したPRO以外の試料中の物質を実質的に全て除去する適当な溶媒で支持体を洗浄する。最後に、PROを抗体から脱離させる他の適当な溶媒で支持体を洗浄する。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。
本明細書で引用した全ての特許及び参考文献の全体を、出典明示によりここに取り込む。【0427】
(実施例)
実施例で言及されている全ての市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランドである。
【0428】
実施例1:新規なポリペプチド及びそれをコードするcDNAを同定するための細胞外ドメイン相同性スクリーニング
Swiss−Prot公的データベースからの約950の公知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(必要ならな、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び独自に開発したデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムWU−BLAST−2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の6フレーム翻訳との比較として実施した。公知のタンパク質をコードせず、Blastスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列に構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(全てではない)WU−BLAST−2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
上記のように得られたコンセンサス配列に基づいて、次いでオリゴヌクレオチドを合成し、PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及びPROポリペプチドの全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして用いるために使用した。正方向(.f)及び逆方向(.r)PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるために設計される。プローブ(.p)配列は、典型的に40−55bp長である。或る場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きいときに付加的なオリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, のように、PCRプライマー対でのPCRによりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、次いで、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いて対象とする遺伝子をコードするクローンの単離するのに使用した。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適切なサイズに分類し、そして適切なクローニングベクター(pRKB又はpRK5D等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
【0429】
実施例2:アミラーゼスクリーニングによるcDNAクローンの単離
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを対象とするヒト組織からInvitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターpRK5DにおけるオリゴdTプライムしたcDNAの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAは1000bpを越えるサイズ分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dを、sp6転写開始部位、それに続くSfiI制限酵素部位、さらにXhiI/NotIcDNAクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
2.ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5’ 末端を優先的に表現するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上記の)一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST−AMY.0におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid system)からの試薬及びプロ値コールを用いたランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500−1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST−AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いでアルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレーム単位で融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
【0430】
3.形質転換及び検出
上記2パラグラフに記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔た。次いで、SOC培地(Life Technplogies、1ml)を添加し、この混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む20標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl−勾配を用いてDNAを単離した。精製DNAは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56−5A(ATCC−90785)であった。この株は以下の遺伝子型:MATアルファー、ura3−52、leu2−3、leu2−112、his3−11、his3−15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び/又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p、SSA1p−4p)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
形質転換は、Gietz等, Nucl. Acid. Res., 20: 1425 (1992)に概略が記されたプロトコールに基づいて実施された。形質転換細胞は、次いで寒天からYEPD複合培地ブロス(100ml)に播種し、30℃で終夜成長させた。YEPDブロスは、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)に記載されているように調製した。終夜培地は、次いで新鮮なYEPDブロス(500ml)中におよそ2x106細胞/ml(約OD600=0.1)に希釈し、1x107細胞/ml(約OD600=0.4−0.5)まで再成長させた。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで5分間のSorval GS3 ローターのGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして50mlのファルコン管内で、Beckman GS−6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE(10ml, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのLi2OOCCH3)で続けて洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精子DNA(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換DNA(1μg, vol.< 10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl, 40%のポリエチレングリコール−4000, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLiOOCCH3, pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5−10秒間遠心分離し、デカント及びTE(500μl, 10mMのトリス−HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地に拡げた。
あるいは、複数の少量反応ではなく、形質転換を1回の大規模反応で実施したが、しやくの量はしかるべくスケールアップした。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208−210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD−Ura)であった。形質転換体は30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176−179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red−120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD−Ura寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した(最終濃度50−100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD−Ura寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
【0431】
4.PCR増幅によるDNAの単離
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、96ウェルプレートにおいて無菌水(30μl)に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート(5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μlの10mM dNTP(Perkin Elmer−Cetus); 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるPCR反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド1の配列は:
5’− TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT −3’
(配列番号:324)
逆方向オリゴヌクレオチド2の配列は:
5’− CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT−3’
(配列番号:325)
次いで、PCRは以下の通り実施した:
下線を施した領域は、各々ADHプロモーター領域及びアミラーゼ領域にアニーリングされ、挿入物が存在しない場合はベクターpSST−AMY.0からの307bp領域を増幅する。典型的には、これらのオリゴヌクレオチドの5’ 末端の最初の18ヌクレオチドは、配列プライマーのアニーリング部位を含んでいた。即ち、空のベクターからのPCR反応の全生成物は343bpであった。しかしながら、シグナル配列融合cDNAは、かなり長いヌクレオチド配列をもたらした。
PCRに続いて、反応のアリコート(5μl)を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス−ボレーと−EDTA(TBE)緩衝系を用いたアガローススゲル電気泳動により試験した。400bpより大きな単一で強いPCR産物をもたらすクローンを、96Qiaquick PCR 清浄化カラム(Quagen Inc., Charsworth, CA)での精製の後にDNA配列によりさらに分析した。
【0432】
実施例3:ヒトPRO213をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA28735と命名される。DNA28735コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO213の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
一組のPCRプライマー(正及び逆方向)が合成された:
正方向PCRプライマー 5’−TGGAGCAGCAATATGCCAGCC−3’(配列番号:3)
逆方向PCRプライマー 5’−TTTTCCACTCCTGTCGGGTTGG−3’(配列番号:4)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つDNA28735配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGACACTTGCCAGTCAGATGTGGATGAATGCAGTGCTAGGAGGG−3’(配列番号:5)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO213遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO213の全長DNA配列[ここで、UNQ187(DNA30943−1163)と命名される](配列番号:1)及びPRO213の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ187(DNA30943−1163)の全核酸配列をFig1(配列番号:1)に示す。クローンUNQ187(DNA30943−1163)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置336−338に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1221−1223の停止コドンで終端する(Fig1)。予測されるポリペプチド前駆体は295アミノ酸長である(Fig2)。クローンUNQ187(DNA30943−1163)はATCCに寄託されている。
全長PRO213ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止特異的遺伝子6タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO213アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSMHC3W5A_6及びB48089 との間の有意な相同性を明らかにした。
【0433】
実施例4:ヒトPRO274をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36469と命名される。DNA36469コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO274の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。ジェネンテクが所有するESTをコンセンサスす構築に用いた。ESTはFig5−7に示し、ここで各々DNA17873、DNA36157及びDNA28929と命名する。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(36469.f1) 5’−CTGATCCGGTTCTTGGTGCCCCTG−3’
(配列番号:11)
正方向PCRプライマー2(36469.f2) 5’−GCTCTGTCACTCACGCTC−3’
(配列番号:12)
正方向PCRプライマー3(36469.f3) 5’−TCATCTCTTCCCTCTCCC−3’
(配列番号:13)
正方向PCRプライマー4(36469.f4) 5’−CCTTCCGCCACGGAGTTC−3’
(配列番号:14)
逆方向PCRプライマー1(36469.r1) 5’−GGCAAAGTCCACTCCGATGATGTC−3’
(配列番号:15)
逆方向PCRプライマー2(36469.r2) 5’−GCCTGCTGTGGTCACAGGTCTCCG−3’
(配列番号:16)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36469配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(36469.p1)
5’−TCGGGGAGCAGGCCTTGAACCGGGGCATTGCTGCTGTCAAGGAGG−3’(配列番号:17)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO274遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO274の全長DNA配列[ここで、UNQ241(DNA39987−1184)と命名される](配列番号:1)及びPRO274の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ241(DNA39987−1184)の全核酸配列をFig3(配列番号:6)に示す。クローンUNQ241(DNA39987−1184)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置83−85に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1559−1561の停止コドンで終端する(Fig3)。予測されるポリペプチド前駆体は492アミノ酸長であり(Fig4)、約54,241ダルトンの見積もられた分子量及び約8.21の見積もられたpIを持つ。クローンUNQ241(DNA39987−1184)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209786が付与されている。
全長PRO274ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがFn54タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO274アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、MMFN54S2_1, MMFN54S1_1, CELF48C1_8, CEF38B7_6, PRP3_RAT, INL3_PIG, MTCY07A7_13, YNAX_KLEAE, A47234, 及びHME2_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0434】
実施例5:ヒトPRO300をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35930と命名される。DNA35930コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO300の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35930f1) 5’−GCCGCCTCATCTTCACGTTCTTCC−3’
(配列番号:20)
正方向PCRプライマー2(35930.f2) 5’−TCATCCAGCTGGTGCTGCTC−3’
(配列番号:21)
正方向PCRプライマー3(35930.f3) 5’−CTTCTTCCACTTCTGCCTGG−3’
(配列番号:22)
正方向PCRプライマー4(35930.f4) 5’−CCTGGGCAAAAATGCAAC−3’
(配列番号:23)
逆方向PCRプライマー1(35930.r1) 5’−CAGGAATGTAGAAGGCACCCACGG−3’
(配列番号:24)
逆方向PCRプライマー2(35930.r2) 5’−TGGCACAGATCTTCACCCACACGG−3’
(配列番号:25)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35930配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35930.p1)
5’−TGTCCATCATTATGCTGAGCCCGGGCGTGGAGAGTCAGCTCTACAAGCTG−3’
(配列番号:26)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO300遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO300の全長DNA配列[ここで、UNQ263(DNA40625−1189)と命名される](配列番号:18)及びPRO300の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ263(DNA40625−1189)の全核酸配列をFig8(配列番号:18に示す。クローンUNQ263(DNA40625−1189)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置45−47に見かけの翻訳開始部位そしてヌクレオチド位置1416−1418の停止コドンで終端する(Fig8)。予測されるポリペプチド前駆体は457アミノ酸長である(Fig9)。クローンUNQ263(DNA40625−1189)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209788が付与されている。
全長PRO300ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がDiff33タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO300アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU49188_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0435】
実施例6:ヒトPRO284をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて2つのcDNA配列が単離され、これらを、ここにDNA12982(Fig12参照;ヒト胎盤由来)及びDNA15886(Fig13参照;ヒト唾液腺由来)と命名する。DNA12982及びDNA15886配列は、次いでクラスター形成して整列させ、ここにDNA18832と命名するコンセンサス核酸配列を生じさせた。
DNA18832コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)をスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(18832.est.f) 5’−TCGTACAGTTACGCTCTCCC−3’
(配列番号:31)
正方向PCRプライマー2(18832.f) 5’−CTTGAGGAGCGTCAGAAGCG−3’
(配列番号:32)
逆方向PCRプライマー(18832.r) 5’−ATAACGAATGAAGCCTCGTG−3’
(配列番号:33)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つDNA18832配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(18832.p)
5’−GCTAATATCTGTAAGACGGCAGCTACAGCAGGCATCATTG−3’(配列番号:34)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO284遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1022−1024の停止コドンで終端する(Fig10;配列番号:27)。予測されるポリペプチド前駆体は285アミノ酸長であり、約32,190の計算された分子量及び約9.03の見積もられたpIを有する。Fig11(配列番号:28)に示した全長PRO284の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸24のシグナルペプチド、約アミノ酸76〜約アミノ酸96及び約アミノ酸171〜約アミノ酸195の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸153〜約156の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ247(DNA23318−1211)は1998年4月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209787が付与されている。
全長PRO284ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO284アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、JQ0124,CELE04A4_5, AB006451_1, AF030162_1, IM23_YEAST, S71194, NIA_CUCMA, IM17_YEAST, I50479及びHUMZFHP_1との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0436】
実施例7:ヒトPRO296をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列は、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、肉腫関連タンパク質SASをコードする核酸配列と配列同一性を有することがわかった。このcDNA配列を、ここにDNA23020(Fig16参照)と命名する。DNA23020配列は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発したデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA35858と命名する。構築において2つの独自に開発したジェネンテクESTを用い、これらのEST配列を、ここでDNA21971(Fig17;配列番号:38)及びDNA29037(Fig18;配列番号:39)と命名する。
DNA35858コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ(LIB228)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−128(1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35858.f1) 5’−ACCCACGTCTGCGTTGCTGCC−3’
(配列番号:40)
正方向PCRプライマー2(35858.f2) 5’−GAGAATATGCTGGAGAGG−3’
(配列番号:41)
逆方向PCRプライマー(35858.r1) 5’−AGGAATGCACTAGGATTCGCGCGG−3’
(配列番号:42)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35858配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35858.p1)
5’−GGCCCCAAAGGCAAGGACAAAGCAGCTGTCAGGGAACCTCCGCCG−3’(配列番号:43)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO296遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置786−788の停止コドンで終端する(Fig14;配列番号:35)。予測されるポリペプチド前駆体は204アミノ酸長であり、約22,147の計算された分子量及び約8.37の見積もられたpIを有する。Fig15(配列番号:36)に示した全長PRO296の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸34のシグナルペプチド、約アミノ酸47〜約アミノ酸63、約アミノ酸72〜約アミノ酸95及び約アミノ酸162〜約アミノ酸182の膜貫通ドメイン。クローンUNQ260(DNA39979−1213)は1998年4月21日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209789が付与されている。
全長PRO296ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが肉腫−増幅SASタンパク質と有意な配列類似性を持ち、それによりPRO2296が新規なSAS類似物となりうることを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO296アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、I58391, GEN11061, SSC2B04_1, HSU81031_2, CD63_RAT, CD63_MOUSE, CD63_HUMAN, AF022813_1, CD63_RABIT及びCO02_HUMANとの間に有意な相同性があることを明らかにした。
【0437】
実施例8:ヒトPRO329をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35612と命名される。DNA35612コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO329の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(35612f1) 5’−TGGGCTGTGTCCTCATGG−3’
(配列番号:46)
正方向PCRプライマー2(35612.f2) 5’−TTTCCAGCGCCAATTCTC−3’
(配列番号:47)
逆方向PCRプライマー1(35612.r1) 5’−AGTTCTTGGACTGTGATAGCCAC−3’
(配列番号:48)
逆方向PCRプライマー2(35612.r2) 5’−AAACTTGGTTGTCCTCAGTGGCTG−3’
(配列番号:49)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35612配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(35612.p1)
5’−GTGAGGGACCTGTCTGCACTGAGGAGAGCAGCTGCCACACGGAGG−3’(配列番号:50)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO329遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB6)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO329の全長DNA配列[ここで、UNQ291(DNA40594−1233)と命名される](配列番号:44)及びPRO329の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ291(DNA40594−1233)の全核酸配列をFig19(配列番号:44)に示す。クローンUNQ291(DNA40594−1233)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置9−11に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1086−1088の停止コドンで終端する(Fig19)。予測されるポリペプチド前駆体は359アミノ酸長である(Fig20)。Fig20に示した全長PRO329タンパク質は、約38,899の分子量及び約5.21のpIを有する。クローンUNQ291(DNA40594−1233)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209617が付与されている。
全長PRO329ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが高親和性免疫グロブリンFcレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO329アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、FCG1_HUMAN, FCG0_HUMAN, P_R91439, P_R22549, P_R91438, P_W00859, P_R20811, P_R25550, HUMCD6406_1及びFCG1_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0438】
実施例9:ヒトPRO362をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42257と命名される。DNA42257コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO362の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1(42257.f1) 5’−TATCCCTCCAATTGAGCACCCTGG−3’
(配列番号:53)
正方向PCRプライマー2(42257.f2) 5’−GTCGGAAGACATCCCAACAAG−3’
(配列番号:54)
逆方向PCRプライマー1(42257.r1) 5’−CTTCACAATGTCGCTGTGCTGCTC−3’
(配列番号:55)
逆方向PCRプライマー2(42257.r2) 5’−AGCCAAATCCAGCAGCTGGCTTAC−3’
(配列番号:56)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42257配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(42257.p1)
5’−TGGATGACCGGAGCCACTACACGTGTGAAGTCACCTGGCAGACTCCTGAT−3’(配列番号:57)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO362遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO362の全長DNA配列[ここで、UNQ317(DNA45416−1251)と命名される](配列番号:51)及びPRO362の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ317(DNA45416−1251)の全核酸配列をFig21(配列番号:51)に示す。クローンUNQ317(DNA45416−1251)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置119−121に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1082−1084の停止コドンで終端する(Fig21)。予測されるポリペプチド前駆体は321アミノ酸長である(Fig22)。Fig2に示した全長PRO362タンパク質は、約35,544の分子量及び約8.51のpIを有する。Fig22に示すように、全長PRO362ポリペプチドの分析は、およそアミノ酸149からおよそアミノ酸152におけるグリコサミノグリカン結合部位及び約アミノ酸276〜約アミノ酸306の膜貫通ドメインの存在を明らかにした。クローンUNQ317(DNA45416−1251)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209620が付与されている。
全長PRO362ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがA33抗原タンパク質及びHCARタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)はPRO362アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB002341_1, HSU55258_1, HSC7NRCAM_1, RNU81037_1, A33_HUMAN, P_W14158, NMNCAMRI_1, HSTITINN2_1, S71824_1及びHSU63041_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0439】
実施例10:ヒトPRO363をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42828と命名される。DNA42828コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO363の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(42828.f1) 5’−CCAGTGCACAGCAGGCAACGAAGC−3’
(配列番号:60)
逆方向PCRプライマー(42828.r1) 5’−ACTAGGCTGTATGCCTGGGTGGGC−3’
(配列番号:61)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42828配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(42828.p1)
5’−GTATGTACAAAGCATCGGCATGGTTGCAGGAGCAGTGACAGGC−3’(配列番号:62)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO363遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO363の全長DNA配列[ここで、UNQ318(DNA45419−1252)と命名される](配列番号:58)及びPRO363の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ318(DNA45419−1252)の全核酸配列をFig23(配列番号:58)に示す。クローンUNQ318(DNA45419−1252)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置190−192に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1309−1311の停止コドンで終端する(Fig23)。予測されるポリペプチド前駆体は373アミノ酸長である(Fig24)。Fig24に示した全長PRO363タンパク質は、約41.281の分子量及び約8.33のpIを有する。Fig24(配列番号:59)に示したアミノ酸配列のアミノ酸221〜254に膜貫通ドメインが存在する。またPRO363ポリペプチドは、約アミノ酸15〜56及び約アミノ酸87〜116に少なくとも2つのミエリンP0タンパク質ドメインを有する。クローンUNQ318(DNA45419−1252)は、1998年2月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209616が付与されている。
全長PRO363ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが細胞表面タンパク質HCARと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO363が新規なHCAR相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO363アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HS46KDA_1, HSU90716_1, MMCARH_1, MMCARHOM_1, A33_HUMAN, P_W14146, P_W14158, A42632,及びB42632との間の有意な相同性を明らかにした。
【0440】
実施例11:ヒトPRO868をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38133と命名される。DNA38133コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO868の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(38133.f1) 5’−GTAGCAGTGCACATGGGGTGTTGG−3’
(配列番号:65)
逆方向PCRプライマー(38133.r1) 5’−ACCGCACATCCTCAGTCTCTGTCC−3’
(配列番号:66)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38133配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(38133.p1)
5’−ACGATGATCGCGGGCTCCCTTCTCCTGCTTGGATTCCTTAGCACCACCAC−3’
(配列番号:67)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO868遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO868の全長DNA配列[ここで、UNQ437(DNA52594−1270)と命名される](配列番号:63)及びPRO868の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ437(DNA52594−1270)の全核酸配列をFig25(配列番号:63)に示す。クローンUNQ437(DNA52594−1270)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置325−327に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2290−2292の停止コドンで終端する(Fig25)。予測されるポリペプチド前駆体は655アミノ酸長である(Fig26)。Fig26に示した全長PRO868タンパク質は、約71,845の分子量及び約8.22のpIを有する。全長PRO868ポリペプチド配列の分析は、Fig26(配列番号:3)に示した配列の約アミノ酸66〜約アミノ酸78及び約アミノ酸123〜約アミノ酸134の保存されたシステイン含有ドメイン、約アミノ酸85〜薬アミノ酸110のTNFR死亡ドメイン、約アミノ酸159〜約アミノ酸175のFASA_マウス死亡ドメイン及び約アミノ酸347〜約アミノ酸375の膜貫通ドメインの存在を示している。クローンUNQ437(DNA52594−1270)は、1998年3月17日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209679が付与されている。
全長PRO868ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが腫瘍壊死因子レセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO868が腫瘍壊死因子ファミリーの新規なメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO868アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、RNU94330_1, P_R99933, P_R99945, P_R99950, HSU94332_1, CD40_HUMAN, S63368_1, TNR2_HUMAN, MVU87844_1及びCVU87837_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0441】
実施例12:ヒトPRO382をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30892と命名される。DNA30892コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO382の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGACATCGCCCTTATGAAGCTGGC−3’(配列番号:70)
逆方向PCRプライマー 5’−TACACGTCCCTGTGGTTGCAGATC−3’(配列番号:71)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30892配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGTTCAATGCAGAAATGATCCAGCCTGTGTGCCTGCCCAACTCTGAAGAG−3’(配列番号:72)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO382遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO382の全長DNA配列[ここで、UNQ323(DNA45234−1277)と命名される](配列番号:68)及びPRO382の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ323(DNA45234−1277)の全核酸配列をFig27(配列番号:68)に示す。クローンUNQ323(DNA45234−1277)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置126−128に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1485−1487の停止コドンで終端する(Fig27)。予測されるポリペプチド前駆体は453アミノ酸長である(Fig28)。Fig28に示した全長PRO382タンパク質は、約49,334の分子量及び約6.32のpIを有する。Fig28(配列番号:69)に示した全長PRO382ポリペプチド配列の分析は、約アミノ酸240〜約アミノ酸284の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸1〜約アミノ酸20の推定シグナルペプチド、約アミノ酸386〜約アミノ酸419の推定アップルドメイン、約アミノ酸394〜約アミノ酸406の推定クリングル(Krngle)ドメイン及び約アミノ酸253〜約アミノ酸258のヒスチジン含有プロテアーゼ活性部位の存在を示している。クローンUNQ323(DNA45234−1277)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209654が付与されている。
全長PRO382ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがセリンプロテアーゼタンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO382が新規なセリンプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO382アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU75329_1, ENTK_MOUSE, HEPS_HUMAN, AF030065_1, HEPS_RAT, PLMN_PIG, P_R89430, P_R89435, PLMN_HORSE, PLMN_BOVIN及びP_R83959との間の有意な相同性を明らかにした。
【0442】
実施例13:ヒトPRO545をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44706と命名される。ジェネンテクが独自に開発したESTをコンセンサス構築に用い、ここにDNA13217(Fig31;配列番号:75)と命名する。DNA44706コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO545の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GTCTCAGCACGTGTTCTGGTCTCAGGG−3’
(配列番号:76)
正方向PCRプライマー2 5’−CATGAGCATGTGCACGGC−3’ (配列番号:77)
正方向PCRプライマー3 5’−TACCTGCACGATGGGCAC−3’ (配列番号:78)
正方向PCRプライマー4 5’−CACTGGGCACCTCCCTTC−3’ (配列番号:79)
逆方向PCRプライマー1 5’−CTCCAGGCTGGTCTCCAAGTCCTTCC−3’
(配列番号:80)
逆方向PCRプライマー2 5’−TCCCTGTTGGACTCTGCAGCTTCC−3’(配列番号:81)
逆方向PCRプライマー3 5’−CTTCGCTGGGAAGAGTTTG−3’(配列番号:82)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44706配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGCAACCAACAGATACAAACTCTTCCCAGCGAAGAAGCTGAAAAGCGTC−3’(配列番号:83)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO545遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎盤組織(LIB90)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO545の全長DNA配列[ここで、UNQ346(DNA49624−1279)と命名される](配列番号:73)及びPRO545の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ346(DNA49624−1279)の全核酸配列をFig29(配列番号:73)に示す。クローンUNQ346(DNA49624−1279)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置311−313に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2516−2518の停止コドンで終端する(Fig29)。予測されるポリペプチド前駆体は753アミノ酸長である(Fig30)。Fig30に示した全長PRO545タンパク質は、約80,177ダルトンの見積もり分子量及び約7.08のpIを有する。PRO545アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸1−28に相当するシグナルペプチド、およそアミノ酸111−114、アミノ酸146−149、アミノ酸348−351、アミノ酸449−452、及びアミノ酸648−651に相当する5つの潜在的N−−グリコシル化部位、及びおよそアミノ酸344−353の中性亜鉛メタロペプチダーゼ、亜鉛結合領域シグネーチャー配列を含む。クローンUNQ346(DNA49624−1279)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209655が付与されている。
【0443】
実施例14:ヒトPRO617をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42798と命名される。DNA42798配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO617の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACGGGCACACTGGATCCCAAATG−3’(配列番号:86)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTAGAGATGTAGAAGGGCAAGCAAGACC−3’
(配列番号:87)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42798配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCTCCCTACCCGTGCAGGTTTCTTCATTTGTTCCTTTAACCAGTATGCCG−3’(配列番号:88)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO617遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO617の全長DNA配列[ここで、UNQ353(DNA48309−1280)と命名される](配列番号:1)及びPRO617の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ353(DNA48309−1280)の全核酸配列をFig32(配列番号:84)に示す。クローンUNQ353(DNA48309−1280)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置723−725に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置924−926の停止コドンで終端する(Fig32)。予測されるポリペプチド前駆体は67アミノ酸長である(Fig33)。Fig33に示した全長PRO617タンパク質は、約6,981ダルトンの分子量及び約7.47のpIを有する。また、PRO617アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸15〜約アミノ酸27の推定シグナルペプチド及び約アミノ酸41〜約アミノ酸43の推定タンパク質キナーゼCリン酸化部位の存在を明示している。クローンUNQ353(DNA48309−1280)は、1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209656が付与されている。
全長PRO617ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD24タンパク質と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO617が新規なCD24相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO617アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CD24_HUMAN, CD24_MOUSE, S15785, CD24_RAT, VGE BPG4, MSE5_HUMAN, HSMHC3W36A_2, MLU15184_8, P R85075, SEPL_HUMAN及びMTCY63_13との間の有意な相同性を明らかにした。
【0444】
実施例15:ヒトPRO700をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30837と命名される。DNA30837配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO700の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−ATGTTCTTCGCGCCCTGGTG−3’(配列番号:91)
正方向PCRプライマー2 5’−CCAAGCCAACACACTCTACAG−3’(配列番号:92)
逆方向PCRプライマー1 5’−AAGTGGTCGCCTTGTGCAACGTGC−3’(配列番号:93)
逆方向PCRプライマー2 5’−GGTCAAAGGGGATATATCGCCAC−3’(配列番号:94)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30837配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCATGGAAGATGCCAAAGTCTATGTGGCTAAAGTGGACTGCACGGCCCA−3’(配列番号:95)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO700遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO700の全長DNA配列[ここで、UNQ364(DNA46776−1284)と命名される](配列番号:89)及びPRO700の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ364(DNA46776−1284)の全核酸配列をFig34(配列番号:89)に示す。クローンUNQ364(DNA46776−1284)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置33−35に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1329−1331の停止コドンで終端する(Fig34)。予測されるポリペプチド前駆体は432アミノ酸長である(Fig35)。Fig35に示した全長PRO700タンパク質は、約47,629ダルトンの見積もり分子量及び約5.90のpIを有する。PRO700のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸1〜33に相当するシグナルペプチド、アミノ酸約82−99、210−255及び345−360に相当するジスルフィドイソメラーゼに相同な領域、アミノ酸約143−151に相当するチロシンキナーゼリン酸化部位、アミノ酸約429−432に相当する小胞体標的化配列を含む。クローンUNQ364(DNA46776−1284)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209721が付与されている。
【0445】
実施例16:ヒトPRO702をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36623と命名される。DNA36623コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO702の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(36623.f1) 5’−CGCTGACTATGTTGCCAAGAGTGG−3’
(配列番号:98)
逆方向PCRプライマー(36623.r1) 5’−GATGATGGAGGCTCCATACCTCAG−3’
(配列番号:99)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36623配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(36623.p1)
5’−GTGTTCATTGGCGTGAATGACCTTGAAAGGGAGGGACAGTACATGTTCAC−3’
(配列番号:100)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO702遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO702の全長DNA配列[ここで、UNQ366(DNA50980−1286)と命名される](配列番号:96)及びPRO702の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ366(DNA50980−1286)の全核酸配列をFig36(配列番号:96)に示す。クローンUNQ366(DNA50980−1286)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置22−24に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置853−855の停止コドンで終端する(Fig36)。予測されるポリペプチド前駆体は277アミノ酸長である(Fig37)。Fig37に示した全長PRO702タンパク質は、約30,645ダルトンの見積もり分子量及び約7.47のpIを有する。また、PRO702アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸25の推定シグナルペプチド、約アミノ酸230〜約アミノ酸233及び約アミノ酸258〜約アミノ酸261の潜在的N−グリコシル化部位、及び約アミノ酸248〜約アミノ酸270のC型レクチンドメインシグネーチャー配列の存在を明示している。クローンUNQ366(DNA50980−1286)は、1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209717が付与されている。
全長PRO702ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコングルチニンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO702が新規なコングルチニン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO702アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S32436, P_R75642, P_W18780, P_W18781, A53330, AC002528_1, HSPPA2IC0_1, CA21_HUMAN, CA14_HUMAN及びA61262との間の有意な相同性を明らかにした。
【0446】
実施例17:ヒトPRO703をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43047と命名される。DNA43047コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO703の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GAGAGCCATGGGGCTCCACCTG−3’(配列番号:103)
逆方向PCRプライマー1 5’−GGAGAATGTGGCCACAAC−3’(配列番号:104)
逆方向PCRプライマー2 5’−GCCCTGGCACAGTGACTCCATAGACG−3’
(配列番号:105)
逆方向PCRプライマー3 5’−ATCCACTTCAGCGGACAC−3’(配列番号:106)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAGTGCCAGGATACCTCTCTTCCCCCCAGAGCATAACAGACACG−3’(配列番号:107)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO703遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO703の全長DNA配列[ここで、UNQ367(DNA50913−1287)と命名される](配列番号:101)及びPRO703の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ367(DNA50913−1287)の全核酸配列をFig38(配列番号:101)に示す。クローンUNQ367(DNA50913−1287)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置115−117に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2305−2307の停止コドンで終端する(Fig38)。予測されるポリペプチド前駆体は730アミノ酸長である(Fig39)。Fig39に示した全長PRO703タンパク質は、約78,644ダルトンの見積もり分子量及び約7.65のpIを有する。PRO703アミノ酸配列の重要な領域は、シグナル配列、cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位、CUBドメインタンパク質モチーフ、N−グリコシル化部位及び推定AMP−結合ドメインシグネーチャーを含む。クローンUNQ367(DNA50913−1287)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209716が付与されている。
【0447】
実施例18:ヒトPRO705をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43437と命名される。DNA43437コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO705の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AAGCGTGACAGCGGGCACGTC−3’(配列番号:110)
逆方向PCRプライマー 5’−TGCACAGTCTCTGCAGTGCCCAGG−3’(配列番号:111)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43437配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ(43437.p1)
5’−GAATGCTGGAACGGGCACAGCAAAGCCAGATACTTGCCTG−3’(配列番号:112)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO705遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO705の全長DNA配列[ここで、UNQ369(DNA50914−1289)と命名される](配列番号:108)及びPRO705の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ369(DNA50914−1289)の全核酸配列をFig40(配列番号:108)に示す。クローンUNQ369(DNA50914−1289)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置556−568に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2231−2233の停止コドンで終端する(Fig40)。予測されるポリペプチド前駆体は555アミノ酸長である(Fig41)。Fig41に示した全長PRO705タンパク質は、約62,736ダルトンの見積もり分子量及び約5.36のpIを有する。Fig41に示した全長PRO705配列の分析は、以下のものの存在を明示した:約アミノ酸1〜約アミノ酸23に対応するシグナルペプチド、約アミノ酸418〜約アミノ酸436の真核生物DNAトポイソメラーゼI活性部位、及び約アミノ酸237〜約アミノ酸279、約アミノ酸421〜約アミノ酸458、約アミノ酸53〜約アミノ酸74、約アミノ酸466〜約アミノ酸504、約アミノ酸308〜約アミノ酸355、約アミノ酸104〜約アミノ酸156、及び約アミノ酸379〜約アミノ酸410の種々のグリピカンタンパク質に相同な種々の領域。クローンUNQ369(DNA50914−1289)は、1998年3月31日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209722が付与されている。
全長PRO705ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがK−グリピカンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO705が新規なグリピカンタンパク質のメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO705アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、GPCK_MOUSE, GLYP_CHICK, GLYP_RAT, GLYP_HUMAN, GPC2_RAT, GPC5_HUMAN, GPC3_HUMAN, GPC3_RAT, P_R30168及びCEC03H12_2との間の有意な相同性を明らかにした。
【0448】
実施例19:ヒトPRO708をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34024と命名される。DNA34024コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO708の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCAACCCAACTGTTTACCTCTGG−3’(配列番号:115)
逆方向PCRプライマー 5’−CTCTCTGAGTGTACATCTGTGTGG−3’(配列番号:116)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34024配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCACCCTACCTCAGAAACTGAAGGAGGTTGGNTATTCAACGCATATGGTCGG−3’
(配列番号:117)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO708遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO708の全長DNA配列[ここで、UNQ372(DNA48296−1292)と命名される](配列番号:113)及びPRO708の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ372(DNA48296−1292)の全核酸配列をFig42A−B(配列番号:113)に示す。クローンUNQ372(DNA48296−1292)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置891−893に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2436−2438の停止コドンで終端する(Fig42A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は515アミノ酸長である(Fig43)。Fig43に示した全長PRO708タンパク質は、約56,885ダルトンの見積もり分子量及び約6.49のpIを有する。Fig43に示した全長PRO708アミノ酸配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸37の推定シグナルペプチド、約アミノ酸120〜約アミノ酸132及び約アミノ酸168〜約アミノ酸177の推定スルファターゼシグネーチャー配列、約アミノ酸163〜約アミノ酸169の推定チロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸157〜約アミノ酸160、約アミノ酸306〜約アミノ酸309、及び約アミノ酸318〜約アミノ酸321の推定N−グリコシル化部位の存在を実証している。クローンUNQ372(DNA48296−1292)は、1998年3月11日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209668が付与されている。
全長PRO708ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがアリールスルファターゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO708が新規なアリールスルファターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO708アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、ARSB_HUMAN, CELC54D2_2, G02857, STS_HUMAN, I37186, I37187, GEN12648, CELD1014_7, GA6S_HUMAN及びSPHM_HUMANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0449】
実施例20:ヒトPRO320をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA28739と命名される。DNA28739コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO320の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTCAGTGGCCACATGCTCATG−3’(配列番号:120)
逆方向PCRプライマー 5’−GGCTGCACGTATGGCTATCCATAG−3’(配列番号:121)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA28739配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GATAAACTGTCAGTACAGCTGTGAAGACACAGAAGAAGGGCCACAGTGCC−3’(配列番号:122)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO320遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB25)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO320の全長DNA配列[ここで、UNQ281(DNA32284−1307)と命名される](配列番号:118)及びPRO320の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ281(DNA32284−1307)の全核酸配列をFig44(配列番号:118)に示す。クローンUNQ281(DNA32284−1307)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置135−137に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1149−1151の停止コドンで終端する(Fig44)。予測されるポリペプチド前駆体は338アミノ酸長である(Fig45)。Fig45に示した全長PRO320タンパク質は、約37,143ダルトンの見積もり分子量及び約8.92のpIを有する。PRO320アミノ酸配列の重要な領域は、アミノ酸1−21に相当するシグナルペプチド、アミノ酸80−91に相当するEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャー、各々アミノ酸103−124、230−151及び185−206に相当する3つのカルシウム結合EGF様ドメインを含む。クローンUNQ281(DNA32284−1307)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209670が付与されている。
【0450】
実施例21:ヒトPRO324をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34347と命名される。DNA34347コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO324の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GCAATGAACTGGGAGCTGC−3’ (配列番号:125)
正方向PCRプライマー2 5’−CTGTGAATAGCATCCTGGG−3’ (配列番号:126)
正方向PCRプライマー3 5’−CTTTTCAAGCCACTGGAGGG−3’(配列番号:127)
逆方向PCRプライマー1 5’−CTGTAGACATCCAAGCTGGTATCC−3’
(配列番号:128)
逆方向PCRプライマー2 5’−AAGAGTCTGCATCCACACCACTC−3’(配列番号:129)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34347配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ACCTGACGCTACTATGGGCCGAGTGGCAGGGACGACGCCCAGAATG−3’(配列番号:130)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO324遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB6)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO324の全長DNA配列[ここで、UNQ285(DNA36343−1310)と命名される](配列番号:123)及びPRO324の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ285(DNA36343−1310)の全核酸配列をFig46(配列番号:123)に示す。クローンUNQ285(DNA36343−1310)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置144−146に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1011−1013の停止コドンで終端する(Fig46)。予測されるポリペプチド前駆体は289アミノ酸長である(Fig47)。Fig47に示した全長PRO324タンパク質は、約32,268ダルトンの見積もり分子量及び約9.21のpIを有する。Fig47(配列番号:124)に示した全長PRO324アミノ酸配列の分析は以下のものの存在を実証している:約アミノ酸1〜約アミノ酸31のシグナルペプチド、約アミノ酸136〜約アミノ酸157の膜貫通ドメイン、約アミノ酸106又は約アミノ酸107〜約アミノ酸113のチロシンキナーゼリン酸化部位、約アミノ酸80〜約アミノ酸90、約アミノ酸131〜約アミノ酸168、約アミノ酸1〜約アミノ酸13、及び約アミノ酸176〜約アミノ酸185の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼ領域に相同な領域。クローンUNQ285(DNA36343−1310)は、1998年3月30日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209718が付与されている。
全長PRO324ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがオキシドレダクターゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO324が新規なオキシドレダクターゼ相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO324アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、B61209, A69965, YQJQ_BACSU, D69930, S76124, FABG_ECOLI, C70023, S77280, FABG_VIBHA,及びMTV013_6との間の有意な相同性を明らかにした。
【0451】
実施例22:ヒトPRO351をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35950と命名される。DNA35950コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO351の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTGTGCTGTGCCTCGAGCCTGAC−3’(配列番号:133)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGGGCAGCAGTTAGCACCGCCTC−3’(配列番号:134)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35950配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGCTGGCATCATCAGCTTTGCATCAAGCTGTGCCCAGGAGGACGC−3’(配列番号:135)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO351遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB230)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO351の全長DNA配列[ここで、UNQ308(DNA40571−1315)と命名される](配列番号:131)及びPRO351の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ308(DNA40571−1315)の全核酸配列をFig48(配列番号:131)に示す。クローンUNQ308(DNA40571−1315)は、2つのオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置189−191に見かけの翻訳開始部位を持ち、第2のオープンリーディングフレームはヌクレオチド470で開始され、2つのオープンリーディングフレームは、各々ヌクレオチド位置363−365及び2009−2011の停止コドンで終端する(Fig48)。予測されるポリペプチド前駆体は571アミノ酸長である(Fig49)。PRO351のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、トリプシンファミリーのセリンプロテアーゼと配列類似性を持つ領域、2つのN−グリコシル化部位、及びクリングルドメインを含む。クローンUNQ308(DNA40571−1315)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209784が付与されている。
【0452】
実施例23:ヒトPRO352をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36950と命名される。DNA36950コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO352の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CTGGCACAGCTCAACCTCATCTGG−3’
(配列番号:138)
正方向PCRプライマー2 5’−GCTGTCTGTCTGTCTCATTG−3’(配列番号:139)
正方向PCRプライマー3 5’−GGACACAGTATACTGACCAC−3’(配列番号:140)
逆方向PCRプライマー1 5’−TGCGAACCAGGCAGCTGTAAGTGC−3’
(配列番号:141)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGGAAGAAGAGGGTGGTGATGTGG−3’
(配列番号:142)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36950配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCTGACAGACACCAAACAGCTGGTGCACAGTTTCACCGAAGGC−3’ (配列番号:143)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO352遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO352の全長DNA配列[ここで、UNQ309(DNA41386−1316)と命名される](配列番号:136)及びPRO352の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ309(DNA41386−1316)の全核酸配列をFig50(配列番号:136)に示す。クローンUNQ309(DNA41386−1316)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置152−154に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1100−1102の停止コドンで終端する(Fig50)。予測されるポリペプチド前駆体は316アミノ酸長である(Fig51)。Fig2に示した全長PRO352タンパク質は、約4.62の見積もられたpIを有する。全長PRO352配列の分析は、約アミノ酸1〜約アミノ酸28のシグナルペプチド、約アミノ酸251〜約アミノ酸270の膜貫通ドメイン、約アミノ酸91〜約アミノ酸94、約104〜約アミノ酸107、約アミノ酸189〜約アミノ酸192及びアミノ酸215〜約アミノ酸218のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸217〜約アミノ酸234の免疫グロブリン及びMHCに相同性を有する領域の存在を実証している。クローンUNQ309(DNA41386−1316)は、1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209703が付与されている。
全長PRO352ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがブチロフィリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO352が新規なブチロフィリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO352アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、BUTY_HUMAN, HSB73_1, GGCD80_1, I46690, A33_HUMAN, P_R67988, CD86_MOUSE, P_R71360, B39371, 及びD50558_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0453】
実施例24:ヒトPRO381をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39651と命名される。DNA39651コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO381の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTTCCTTGCTTCAGCAACATGAGGC−3’
(配列番号:146)
逆方向PCRプライマー 5’−GCCCAGAGCAGGAGGAATGATGAGC−3’(配列番号:147)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39651配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGAACGCGGTCTTGACTCTGTTCGTCACTTCTTTGATTGGGGCTTTG−3’(配列番号:148)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO381遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO381の全長DNA配列[ここで、UNQ322(DNA44194−1317)と命名される](配列番号:144)及びPRO381の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ322(DNA44194−1317)の全核酸配列をFig52(配列番号:144)に示す。クローンUNQ322(DNA44194−1317)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置174−176に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置807−809の停止コドンで終端する(Fig52)。予測されるポリペプチド前駆体は211アミノ酸長である(Fig53)。Fig53に示した全長PRO381タンパク質は、約24,172ダルトンの見積もり分子量及び約5.99のpIを有する。Fig53(配列番号:145)に示した全長PRO381ポリペプチドの分析は、以下のものの存在を実証した:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸176〜約アミノ酸179の潜在的N−グリコシル化部位、膜貫通ドメイン、約アミノ酸143〜約アミノ酸146、約156〜約アミノ酸159、約アミノ酸178〜約アミノ酸181及びアミノ酸200〜約アミノ酸203の潜在的カゼインキナーゼIIリン酸化部位、約アミノ酸78〜約アミノ酸114及び約アミノ酸118〜約アミノ酸131のFKBP−型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ部位、約アミノ酸191〜約アミノ酸203、約アミノ酸184〜約アミノ酸203及び約アミノ酸140〜約アミノ酸159のEF−腕カルシウム結合ドメイン、及び約アミノ酸183〜約アミノ酸203のS−100/ICaBP型カルシウム結合ドメイン。クローンUNQ322(DNA44194−1317)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209808が付与されている。
全長PRO381ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがFKBP免疫グロブリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO381が新規なFKBP免疫グロブリン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO381アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF40252_1, I49669, P_R93551, S71238, CEL05C8_1, CEU27353_1, MIP_TRYCR, CEZC455_3, FKB4_HUMAN及びI40718との間の有意な相同性を明らかにした。
【0454】
実施例25:ヒトPRO386をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40674と命名される。2つのジェネンテクが独自に開発したEST配列をコンセンサス構築に使用し、これらEST配列は、ここにDNA23350(Fig56;配列番号:151)及びDNA23536(Fig57;配列番号:152)と命名する。DNA40674コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO386の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACGGAGCATGGAGGTCCACAGTAC−3’(配列番号:153)
逆方向PCRプライマー 5’−GCACGTTTCTCAGCATCACCGAC−3’(配列番号:154)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40674配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGCCTGCCCTGCACCTTCAACTCCTGCTACACAGTGAACCACAAACAGTT−3’
(配列番号:155)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO386遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO386の全長DNA配列[ここで、UNQ326(DNA45415−1318)と命名される](配列番号:149)及びPRO386の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ326(DNA45415−1318)の全核酸配列をFig54(配列番号:149)に示す。クローンUNQ326(DNA45415−1318)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置146−148に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置791−793の停止コドンで終端する(Fig54)。予測されるポリペプチド前駆体は215アミノ酸長である(Fig55)。Fig55に示した全長PRO386タンパク質は、約24,326の見積もり分子量及び約6.32のpIを有する。Fig55(配列番号:150)に示した全長PRO386配列の分析は、以下のものの存在を実証した:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸161〜約アミノ酸179の膜貫通ドメイン、約アミノ酸83〜約アミノ酸127の免疫グロブリン様折りたたみ、及び約42〜約アミノ酸45、約アミノ酸66〜約アミノ酸69及びアミノ酸74〜約アミノ酸77の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ326(DNA45415−1318)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209810が付与されている。
全長PRO386ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがナトリウムチャンネルベータ−2サブユニットと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO386がその新規な相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO386アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、A57843, MYP0_HUMAN, GEN14531, JC4024, HS46KDA_1, HSU90716_1, D8996_2, MUSIGLVD_1, DMU42768_1, 及びS19247との間の有意な相同性を明らかにした。
【0455】
実施例26:ヒトPRO540をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39631と命名される。DNA39631コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO540の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTGGGGCTACACACGGGGTGAGG−3’(配列番号:158)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTGCCGCTGCAGAAAGTAGAGCG−3’(配列番号:159)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCCCAAATGAAAACGGGCCCTACTTCCTGGCCCTCCGCGAGATG−3’(配列番号:160)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO540遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO540の全長DNA配列[ここで、UNQ341(DNA44189−1322)と命名される](配列番号:156)及びPRO540の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ341(DNA44189−1322)の全核酸配列をFig58(配列番号:156)に示す。クローンUNQ341(DNA44189−1322)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置21−23に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1257−1259の停止コドンで終端する(Fig58)。予測されるポリペプチド前駆体は412アミノ酸長である(Fig59)。Fig59に示した全長PRO540タンパク質は、約46,658ダルトンの見積もり分子量及び約6.65のpIを有する。PRO540のアミノ酸配列の重要な領域は、シグナルペプチド、潜在的N−グリコシル化部位、潜在的脂肪基質結合部位、リパーゼ及びセリンタンパク質に典型的な配列、及びベータ伝達ファミリーTrp−Aspリピートを含む。クローンUNQ341(DNA44189−1322)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209699が付与されている。
【0456】
実施例27:ヒトPRO615をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42240と命名される。DNA42240コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO615の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGTCTTCGCCTTGATCGTGTTCT−3’(配列番号:163)
正方向PCRプライマー 5’−GTGTACTGAGCGGCGGTTAG−3’ (配列番号:164)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGAAGGTGATGGCTGCCCTCAC−3’ (配列番号:165)
逆方向PCRプライマー 5’−CCAGGAGGCTCATGGGAAAGTCC−3’ (配列番号:166)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42240配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCACGAGTCTAAGCAGATGTACTGCGTGTTCAACCGCAACGAGGATGCCT−3’
(配列番号:167)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO615遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO615の全長DNA配列[ここで、UNQ352(DNA48304−1323)と命名される](配列番号:161)及びPRO615の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ352(DNA48304−1323)の全核酸配列をFig60(配列番号:161)に示す。クローンUNQ352(DNA48304−1323)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置51−53に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置723−725の停止コドンで終端する(Fig60)。予測されるポリペプチド前駆体は224アミノ酸長である(Fig61)。Fig61に示した全長PRO615タンパク質は、約24,810ダルトンの見積もり分子量及び約4.75のpIを有する。PRO615のアミノ酸配列の重量な領域は、約アミノ酸24−43に相当するII型膜貫通ドメイン、各々約アミノ酸74−90,108−126及び145−161に相当する他の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸97−100に相当する潜在的N−グリコシル化部位を含む。クローンUNQ352(DNA48304−1323)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209811が付与されている。
【0457】
実施例28:ヒトPRO618をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30900と命名される。DNA30900コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO618の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TAACAGCTGCCCACTGCTTCCAGG−3’(配列番号:171)
逆方向PCRプライマー 5’−TAATCCAGCAGTGCAGGCCGGG−3’(配列番号:172)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30900配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATGGCCTCCACGGTGCTGTGGACCGTGTTCCTGGGCAAGGTGTGGCAGAA−3’
(配列番号:173)
上記のライブラリのスクリーニングは、ここでDNA35597(配列番号:170)と命名される部分的cDNAクローンを生じた。この配列のBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いた発現は、ここでDNA43335と命名される核酸配列を生じた。次いで、DNA43335コンセンサス配列に基づいて以下のプライマーを調製した。
正方向PCRプライマー 5’−TGCCTATGCACTGAGGAGGCAGAAG−3’(配列番号:174)
逆方向PCRプライマー 5’−AGGCAGGGACACAGAGTCCATTCAC−3’(配列番号:175)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43335配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGTATGATTTGCCGTGCACCCAGGGCCAGTGGACGATCCAGAACAGGAGG−3’
(配列番号:176)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO618遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO618の全長DNA配列[ここで、UNQ354(DNA49152−1324)と命名される](配列番号:168)及びPRO618の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ354(DNA49152−1324)の全核酸配列をFig62(配列番号:168)に示す。クローンUNQ354(DNA49152−1324)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置73−75に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2479−2481の停止コドンで終端する(Fig62)。予測されるポリペプチド前駆体は802アミノ酸長である(Fig63)。Fig63に示した全長PRO618タンパク質は、約88,846ダルトンの見積もり分子量及び約6.41のpIを有する。PRO618のアミノ酸配列の重量な領域は、II型膜貫通ドメイン、プロテアーゼに典型的な配列、トリプシンファミリー、ヒスチジン活性部位、複数のN−グリコシル化部位、2つのクリングルドメインに典型的な配列、2つのカリクレイン軽鎖に類似する配列を持つ領域、及び低密度リポタンパク質レセプターに類似する配列を持つ領域を含む。クローンUNQ354(DNA49152−1324)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209813が付与されている。
【0458】
実施例29:ヒトPRO719をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44851と命名される。DNA44851コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO719の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTGAGCATGAGCGAGCCGTCCAC−3’(配列番号:179)
逆方向PCRプライマー 5’−GCTATTACAACGGTTCTTGCGGCAGC−3’
(配列番号:180)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44851配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTGACTCTCTGGTGAATCAGGACAAGCCGAGTTTTGCCTTCCAG−3’(配列番号:181)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO719遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎盤組織(LIB90)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO719の全長DNA配列[ここで、UNQ387(DNA49646−1327)と命名される](配列番号:177)及びPRO719の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ387(DNA49646−1327)の全核酸配列をFig65(配列番号:177)に示す。クローンUNQ387(DNA49646−1327)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置223−225に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1285−1287の停止コドンで終端する(Fig65)。予測されるポリペプチド前駆体は354アミノ酸長である(Fig66)。Fig66に示した全長PRO719タンパク質は、約39,362ダルトンの見積もり分子量及び約8.35のpIを有する。全長PRO719配列の分析は、Fig66(配列番号:178)に示したように約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸163〜約アミノ酸172のリパーゼ関連セリン含有活性部位、及び約アミノ酸80〜約アミノ酸83及び約アミノ酸136〜約アミノ酸139の2つの潜在的N−グリコシル化部位の存在を明らかにした。クローンUNQ387(DNA49646−1327)は、1998年3月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209705が付与されている。
全長PRO719ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがリポタンパク質リパーゼHタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO719が新規なリポタンパク質リパーゼ相同体となりうることが示されている。より詳細にはDayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO719アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、LIPL_HUMAN, LIPH_HUMAN, D83548_1, A24059_1, P_R30740, D88666_1, A43357, A46696, B43357及びA49488との間の有意な相同性を明らかにした。
【0459】
実施例30:ヒトPRO724をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35603と命名される。DNA35603コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO724の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−GGCTGTCACTGTGGAGACAC−3’(配列番号:184)
正方向PCRプライマー2 5’−GCAAGGTCATTACAGCTG−3’(配列番号:185)
逆方向PCRプライマー1 5’−AGAACATAGGAGCAGTCCCACTC−3’(配列番号:186)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGCCTGCTGCTGCACAATCTCAG−3’(配列番号:187)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35603配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGCTATTGCTTGCCTTGGGACAGACCCTGTGGCTTAGGCTCTGGC−3’(配列番号:188)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO724遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO724の全長DNA配列[ここで、UNQ389(DNA49631−1328)と命名される](配列番号:182)及びPRO724の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ389(DNA49631−1328)の全核酸配列をFig67(配列番号:182)に示す。クローンUNQ389(DNA49631−1328)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置546−548に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2685−2687の停止コドンで終端する(Fig67)。予測されるポリペプチド前駆体は713アミノ酸長である(Fig68)。Fig68に示した全長PRO724タンパク質は、約76,193ダルトンの見積もり分子量及び約5.42のpIを有する。Fig68(配列番号:183)に示した全長PRO724配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸442〜約アミノ酸462の膜貫通ドメイン、約アミノ酸152〜約アミノ酸171、約アミノ酸331〜約アミノ酸350、約アミノ酸374〜約アミノ酸393及び約アミノ酸441〜約アミノ酸430のLDLレセプタークラスAドメイン領域。クローンUNQ389(DNA49631−1328)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209806が付与されている。
全長PRO724ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトLDLレセプタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO724が新規なLDLレセプター相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO724アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_R48547, MMAM2R_1, LRP2_RAT, P_R60517, P_R47861, P_R0553, A44513_1, A30363, P_R74692, 及びLMLIPOPHO_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0460】
実施例31:ヒトPRO772をコードするcDNAクローンの単離
実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて1つのcDNA配列が単離され、このcDNA配列を、ここにDNA43509(Fig71参照)と命名する。DNA43509配列に基づいてオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎児肺ライブラリ(LIB25)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
DNA43509配列に基づいてPCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CGTTTTGCAGAACCTACTCAGGCAG−3’(配列番号:192)
逆方向PCRプライマー 5’−CCTCCACCAACTGTCAATGTTGTGG−3’(配列番号:193)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43509配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AAAGTGCTGCTGCTGGGTCTGCAGACGCGATGGATAACGT−3’(配列番号:194)
上記のプライマー及びライブラリを用いて全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置131−133に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置587−589に見られる停止コドンで終端する(Fig69;配列番号:189)。予測されるポリペプチド前駆体は152アミノ酸長であり、約17,170ダルトンの計算上の分子量及び約9.62の見積もられたpIを有する。Fig70(配列番号:190)に示した全長PRO772配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸26〜約アミノ酸42の潜在的II型膜貫通ドメイン、約アミノ酸44〜約アミノ酸65、約アミノ酸81〜約アミノ酸101及び約アミノ酸109〜約アミノ酸129の他の膜貫通ドメイン、約アミノ酸78〜約アミノ酸99及び約アミノ酸85〜約アミノ酸106のロイシンジッパーパターン配列。クローンUNQ410(DNA49645−1347)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209809が付与されている。
全長PRO772ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒトA4タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO772が新規なA4タンパク質相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO772アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSU93305_1, A4P_HUMAN, CELB0454_2, VPU_JSRV, CELC12D_2, OCCM_AGT1, LBPHIG1E_50, YIGK_ECOLI, S76245及びP_R59807との間の有意な相同性を明らかにした。
【0461】
実施例32:ヒトPRO852をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34364と命名される。DNA34364コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO852の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CGCAGAAGCTACAGATTCTCG−3’(配列番号:197)
正方向PCRプライマー2 5’−GGAAATTGGAGGCCAAAGC−3’(配列番号:198)
正方向PCRプライマー3 5’−GGATGTAGCCAGCAACTGTG−3’(配列番号:199)
正方向PCRプライマー4 5’−GCCTTGGCTCGTTCTCTTC−3’(配列番号:200)
正方向PCRプライマー5 5’−GGTCCTGTGCCTGGATGG−3’(配列番号:201)
逆方向PCRプライマー1 5’−GACAAGACTACCTCCGTTGGTC−3’(配列番号:202)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGATGCACAGTTCAGCACCTGTTG−3’
(配列番号:203)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34364配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGCTCCAAGGGCTTTGACGTCACAGTGAAGTACACACAAGGAAGCTG−3’(配列番号:204)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO852遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO852の全長DNA配列[ここで、UNQ418(DNA45493−1349)と命名される](配列番号:195)及びPRO852の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ418(DNA45493−1349)の全核酸配列をFig72(配列番号:195)に示す。クローンUNQ418(DNA45493−1349)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置94−96に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置16748−1650の停止コドンで終端する(Fig72)。予測されるポリペプチド前駆体は518アミノ酸長である(Fig73)。Fig73に示した全長PRO852タンパク質は、約56,180ダルトンの見積もり分子量及び約5.08のpIを有する。Fig73(配列番号:196)に示した全長PRO852配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸466〜約アミノ酸494の膜貫通ドメイン、約アミノ酸170〜約アミノ酸173及び約アミノ酸366〜約アミノ酸369のN−グリコシル化部位、約アミノ酸10〜約アミノ酸31及び約アミノ酸197〜約アミノ酸218のロイシンジッパー配列パターンブロック、及び約アミノ酸109〜約アミノ酸118、約アミノ酸252〜約アミノ酸261及び約アミノ酸298〜約アミノ酸310の真核生物及びウイルスアスパラギン酸プロテアーゼに相同な配列を有するアミノ酸のブロック。クローンUNQ418(DNA45493−1349)は、1998年4月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209805が付与されている。
全長PRO852ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO852が新規なプロテアーゼタンパク質又はその相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO852アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、PEPC_HUMAN, S66516, S66517, PEPE_CHICK, CATD_HUMAN, P_R74207, CARP_YEAST, PEP2_RABIT, CATE_HUMAN及びRENI_MOUSEとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0462】
実施例33:ヒトPRO853をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43050と命名される。DNA43050コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO853の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTCATGGCCTTGGACTTGGCCAG−3’(配列番号:207)
逆方向PCRプライマー 5’−ACGCCAGTGGCCTCAAGCTGGTTG−3’(配列番号:208)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43050配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTTTCTGAGCTCTGAGCCACGGTTGGACATCCTCATCCACAATGC−3’(配列番号:209)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO853遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO853の全長DNA配列[ここで、UNQ419(DNA48227−1350)と命名される](配列番号:205)及びPRO853の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ419(DNA48227−1350)の全核酸配列をFig74(配列番号:205)に示す。クローンUNQ419(DNA48227−1350)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置128−130に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1259−1261の停止コドンで終端する(Fig74)。予測されるポリペプチド前駆体は377アミノ酸長である(Fig75)。Fig75に示した全長PRO853タンパク質は、約40,849ダルトンの見積もり分子量及び約7.98のpIを有する。PRO852配列のアミノ酸配列の重要な領域は、配列番号:206の約アミノ酸1〜約アミノ酸16に相当するシグナルペプチド、配列番号:206の約アミノ酸46〜約アミノ酸49に相当するグリコサミノグリカン結合部位、配列番号206の約アミノ酸37〜約アミノ酸49及び約114〜約124に各々相当する2つの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリーに典型的な配列を含む。クローンUNQ419(DNA48227−1350)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209812が付与されている。
【0463】
実施例34:ヒトPRO860をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38137と命名される。DNA38137コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO860の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GAAGGGACCTACATGTGTGTGGCC−3’(配列番号:212)
逆方向PCRプライマー 5’−ACTGACCTTCCAGCTGAGCCACAC−3’(配列番号:213)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40654配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGGACTACACGGAGCCTGTGGAGCTTCTGGCTGTGCGAATTCAGCTGGAA−3’
(配列番号:214)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO852遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO860の全長DNA配列[ここで、UNQ421(DNA41404−1352)と命名される](配列番号:210)及びPRO860の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ421(DNA41404−1352)の全核酸配列をFig76A−B(配列番号:210)に示す。クローンUNQ421(DNA41404−1352)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置58−60に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3013−3015の停止コドンで終端する(Fig76A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は985アミノ酸長である(Fig77)。Fig77に示した全長PRO860タンパク質は、約105,336ダルトンの見積もり分子量及び約6.55のpIを有する。PRO860のアミノ酸配列の重要な領域は、約アミノ酸448−467に相当する膜貫通ドメイン、約アミノ酸1−447に相当する細胞外ドメイン、幾つかのN−グリコシル化部位、多数のN−ミリストイル化部位およびホスホチロシン相互作用ドメインタンパク質に典型的な配列を含む。クローンUNQ421(DN A41404−1352)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209844が付与されている。
【0464】
実施例35:ヒトPRO846をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39949と命名される。DNA39949コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO846の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG−3’(配列番号:217)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG−3’(配列番号:218)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39949配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC−3’(配列番号:219)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO846遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO846の全長DNA配列[ここで、UNQ422(DNA44196−1353)と命名される](配列番号:215)及びPRO846の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ422(DNA44196−1353)の全核酸配列をFig78(配列番号:215)に示す。クローンUNQ422(DNA44195−1353)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置25−27に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1021−1023の停止コドンで終端する(Fig78)。予測されるポリペプチド前駆体は332アミノ酸長である(Fig79)。Fig79に示した全長PRO846タンパク質は、約36,143ダルトンの見積もり分子量及び約5.89のpIを有する。PRO846のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig79に示したように、シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、N−グリコシル化部位、フィブリノーゲンベータ及びガンマ鎖C末端ドメインに典型的な配列、及びIg様V型ドメインに典型的な配列を含む。クローンUNQ422(DNA44196−1353)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209847が付与されている。
【0465】
実施例36:ヒトPRO862をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47370と命名される。DNA47370コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO862の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGGATCATGTTGTTGGCCCTGGTC−3’(配列番号:222)
逆方向PCRプライマー 5’−GCAAGGCAGACCCAGTCAGCCAG−3’(配列番号:223)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47370配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTGCCTGCTACCCTCCAAGTGAGGCCAAGCTCTACGGTCGTTGTG−3’(配列番号:225)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO862遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト膵臓組織(LIB55)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO862の全長DNA配列[ここで、UNQ424(DNA52187−1354)と命名される](配列番号:220)及びPRO862の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ424(DNA52187−1354)の全核酸配列をFig80(配列番号:220)に示す。クローンUNQ424(DNA52187−1354)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置410−412に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置848−850の停止コドンで終端する(Fig80)。予測されるポリペプチド前駆体は146アミノ酸長である(Fig81)。Fig81に示した全長PRO862タンパク質は、約16,430ダルトンの分子量及び約5.05のpIを有する。PRO862のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig81に示したように、シグナルペプチド、N−ミリストイル化部位、及びアルファ−ラクトアルブミン/リソザイムCタンパク質の領域と類似性を持つ配列を含む。クローンUNQ424(DNA52187−1354)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209845が付与されている。
【0466】
実施例37:ヒトPRO864をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40666と命名される。DNA40666コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO864の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
正方向及び逆方向のプライマーを合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCTGCAGCTGCAAATTCCACTGG−3’(配列番号:227)
逆方向PCRプライマー 5’−TGGTGGGAGACTGTTTAAATTATCGGCC−3’
(配列番号:228)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40666配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TGCTTCGTCAAGTGCCGGCAGTGCCAGCGGCTCGTGGAGTT−3’(配列番号:229)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO864遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO864の全長DNA配列[ここで、UNQ426(DNA48328−1355)と命名される](配列番号:225)及びPRO864の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ426(DNA48328−1355)の全核酸配列をFig82(配列番号:225)に示す。クローンUNQ426(DNA48328−1355)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置37−39に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1090−10920の停止コドンで終端する(Fig82)。予測されるポリペプチド前駆体は351アミノ酸長である(Fig83)。Fig83に示した全長PRO864タンパク質は、約39,052ダルトンの分子量及び約8.97のpIを有する。PRO864のアミノ酸配列の重要な領域は、Fig83に示したように、シグナルペプチド、N−グリコシル化部位、Wntファミリーシグネーチャー配列、Wnt−1ファミリータンパク質に相同な配列領域を含む。クローンUNQ426(DNA48328−1355)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209843が付与されている。
【0467】
実施例38:ヒトPRO792をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA38106と命名される。DNA38106コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO792の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCGAGAACTGTGTCATGATGCTGC−3’(配列番号:232)
逆方向PCRプライマー 5’−GTTTCTGAGACTCAGCAGCGGTGG−3’(配列番号:233)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38106配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CACCGTGTGACAGCGAGAAGGACGGCTGGATCTGTGAGAAAAGGCACAAC−3’
(配列番号:234)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO792遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO792の全長DNA配列[ここで、UNQ431(DNA56352−1358)と命名される](配列番号:230)及びPRO792の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ431(DNA56352−1358)の全核酸配列をFig84(配列番号:230)に示す。クローンUNQ431(DNA56352−1358)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置67−69に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置946−948の停止コドンで終端する(Fig84)。予測されるポリペプチド前駆体は293アミノ酸長である(Fig85)。Fig85に示した全長PRO792タンパク質は、約32,562ダルトンの見積もり分子量及び約6.53のpIを有する。Fig85(配列番号:231)に示した全長PRO792配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸31〜約アミノ酸54のII型膜貫通ドメイン、約アミノ酸73〜約アミノ酸76及び約アミノ酸159〜約アミノ酸162の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸102〜約アミノ酸123のロイシンジッパーアミノ酸配列パターン、約アミノ酸18〜約アミノ酸23、約アミノ酸133〜約アミノ酸138及び約アミノ酸242〜約アミノ酸247のN−ミリストル化部位、及び約アミノ酸264〜約アミノ酸287のC型レクチンドメインシグネーチャーブロック。クローンUNQ431(DNA56352−1358)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209846が付与されている。
全長PRO792ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD23タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO792が新規なCD23相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO792アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S34198, A07100_1, A05303_1, P_R41689, P_P82839, A10871_1, P_R12796, P_R47199, A46274及びP_R32188との間の有意な相同性を明らかにした。
【0468】
実施例39:ヒトPRO866をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA44708と命名される。DNA44708コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO866の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−CAGCACTGCCAGGGGAAGAGGG−3’(配列番号:237)
正方向PCRプライマー2 5’−CAGGACTCGCTACGTCCG−3’(配列番号:238)
正方向PCRプライマー3 5’−CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCC−3’
(配列番号:239)
逆方向PCRプライマー1 5’−GCAGTTATCAGGGACGCACTCAGCC−3’
(配列番号:240)
逆方向PCRプライマー2 5’−CCAGCGAGAGGCAGATAG−3’(配列番号:241)
逆方向PCRプライマー3 5’−CGGTCACCGTGTCCTGCGGGATG−3’(配列番号:242)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA44708配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCCCCTTCTCCTCCTTTCTCCCACGTCCTATCTGCCTCTC−3’(配列番号:243)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO866遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO866の全長DNA配列[ここで、UNQ435(DNA53971−1359)と命名される](配列番号:235)及びPRO866の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ435(DNA53971−1359)の全核酸配列をFig86(配列番号:235)に示す。クローンUNQ435(DNA53971−1359)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1268−1270の停止コドンで終端する(Fig86)。予測されるポリペプチド前駆体は331アミノ酸長である(Fig87)。Fig87に示した全長PRO866タンパク質は、約35,844ダルトンの見積もり分子量及び約5.45のpIを有する。Fig87(配列番号:236)に示した全長PRO866配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸26のシグナルペプチド。クローンUNQ435(DNA53971−1359)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209750が付与されている。
全長PRO866ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがミンジン(mindin)/スポンジン(spondin)ファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO866が新規なミンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO866アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB006085_1, AB006084_1, AB006086_1, AF01267_1, CWU42213_1, AC004160_1, CPMICRP_1, S49108, A48569及びI46687との間の有意な相同性を明らかにした。
【0469】
実施例40:ヒトPRO871をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40324と命名される。DNA40324コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO871の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−TGCGGAGATCCTACTGGCACAGGG−3’
(配列番号:246)
正方向PCRプライマー2 5’−CGAGTTAGTCAGAGCATG−3’(配列番号:247)
正方向PCRプライマー3 5’−CAGATGGTGCTGTTGCCG−3’(配列番号:248)
逆方向PCRプライマー1 5’−CAACTGGAACAGGAACTGAGATGTGGATC−3’
(配列番号:249)
逆方向PCRプライマー2 5’−CTGGTTCAGCAGTGCAAGGGTCTG−3’
(配列番号:250)
逆方向PCRプライマー3 5’−CCTCTCCGATTAAAACGC−3’(配列番号:251)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40324配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAGAGGACTGGTTGCCATGGCAAATGCTGGTTCTCATGATAATGG−3’(配列番号:252)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO871遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO871の全長DNA配列[ここで、UNQ438(DNA50919−1361)と命名される](配列番号:244)及びPRO871の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ438(DNA50919−1361)の全核酸配列をFig88(配列番号:244)に示す。クローンUNQ438(DNA50919−1361)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置191−193に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1607−1609の停止コドンで終端する(Fig88)。予測されるポリペプチド前駆体は472アミノ酸長である(Fig89)。Fig89に示した全長PRO871タンパク質は、約53,847ダルトンの見積もり分子量及び約5.75のpIを有する。Fig89(配列番号:245)に示した全長PRO871配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸109〜約アミノ酸112及び約アミノ酸201〜約アミノ酸204の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸49〜約アミノ酸66のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼシグネーチャー配列、及び、約アミノ酸96〜約アミノ酸140、約アミノ酸49〜約アミノ酸89及び約アミノ酸22〜約アミノ酸51のサイクロフィリン型ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼに相同な領域。クローンUNQ438(DNA50919−1361)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209848が付与されている。
全長PRO871ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のサイクロフィリンファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO871が新規なサイクロフィリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO871アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、SPBC16H5_5, S64705, YAL5_SCHPO, CYP4 CAEEL, CELC34D4_7, CYPA_CAEEL, HUMORF006_1, CYPI_MYCTU, AF043642_1及びHSSRCYP_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0470】
実施例41:ヒトPRO873をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39621と命名される。DNA39621コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO873の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGGTGCCTGCAGGAGTCCTGGGG−3’(配列番号:255)
逆方向PCRプライマー 5’−CCACCTCAGGAAGCCGAAGATGCC−3’(配列番号:256)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39621配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAACGGTACAAGTGGCTGCGCTTCAGCGAGGACTGTCTGTACCTG−3’(配列番号:257)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO873遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO873の全長DNA配列[ここで、UNQ440(DNA44179−1362)と命名される](配列番号:253)及びPRO873の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ440(DNA44179−1362)の全核酸配列をFig90(配列番号:253)に示す。クローンUNQ440(DNA44179−1362)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置139−141に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1774−1776の停止コドンで終端する(Fig90)。予測されるポリペプチド前駆体は545アミノ酸長である(Fig91)。Fig91に示した全長PRO873タンパク質は、約58,934ダルトンの見積もり分子量及び約9.45のpIを有する。Fig91(配列番号:254)に示した全長PRO873配列の分析は、以下の特徴の存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド;約アミノ酸312〜約アミノ酸327のカルボキシルエステラーゼB型セリン活性部位;約アミノ酸218〜約アミノ酸228のカルボキシエステラーゼB型シグネーチャー2モチーフ;及び各々約アミノ酸318〜約アミノ酸321、約アミノ酸380〜約アミノ酸383及び約アミノ酸465〜約アミノ酸468の3つのN−グリコシル化部位。クローンUNQ440(DNA44179−1362)は、1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209851が付与されている。
全長PRO873ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のヒト肝臓カルボキシルエステラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO873が新規なカルボキシルエステラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO873アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:ES10_RAT, GEN12405, AB10633_1, EST4_RAT, A48809, SASB_ANAPL, RNU41662_1, RNU22952_1, BAL_RAT, GEN13522との間の有意な相同性を明らかにした。
【0471】
実施例42:ヒトPRO940をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47442と命名される。DNA47442コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO940の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAAAGCCTGCGCCTGGTCTGTG−3’(配列番号:260)
逆方向PCRプライマー 5’−TTCTGGAGCCCAGAGGGTGCTGAG−3’(配列番号:262)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47442配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGAGCTGCCACCCATTCAAATGGAGCACGAAGGAGAGTTCACCTG−3’(配列番号:263)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO940遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO940の全長DNA配列[ここで、UNQ477(DNA54002−1367)と命名される](配列番号:258)及びPRO940の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ477(DNA54002−1367)の全核酸配列をFig92(配列番号:258)に示す。クローンUNQ477(DNA54002−1367)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置46−48に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1678−1680の停止コドンで終端する(Fig92)。予測されるポリペプチド前駆体は544アミノ酸長である(Fig93)。Fig93に示した全長PRO940タンパク質は、約60,268ダルトンの見積もり分子量及び約9.53のpIを有する。Fig93(配列番号:259)に示した全長PRO940配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸15のシグナルペプチド、約アミノ酸100〜約アミノ酸103、約アミノ酸297〜約アミノ酸300及び約アミノ酸306〜約アミノ酸309のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸365〜約アミノ酸371の免疫グロブリン及び主要組織適合性複合体シグネーチャー配列ブロック。クローンUNQ477(DNA54002−1367)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209754が付与されている。
全長PRO940ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCD33及びOB結合タンパク質−2と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO940アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CD33_HUMAN, HSU71382_1, HSU71383_1, D86359_1, PGBM_HUMAN, MAGS_MOUSE, D86983_1, C22B_HUMAN, P_W01002及びHVU24116_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0472】
実施例43:ヒトPRO941をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA35941と命名される。ジェネンテクが独自に開発したEST配列を構築に使用し、それはここにDNA6415(Fig96;配列番号:265)と命名する。DNA35941コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO941の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTTGACTGTCTCTGAATCTGCACCC−3’(配列番号:266)
逆方向PCRプライマー 5’−AAGTGGTGGAAGCCTCCAGTGTGG−3’(配列番号:267)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA35941配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCACTACGGTATTAGAGCAAAAGTTAAAAACCATCATGGTTCCTGGAGCAGC−3’
(配列番号:268)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO941遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO941の全長DNA配列[ここで、UNQ478(DNA53906−1368)と命名される](配列番号:263)及びPRO941の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ478(DNA53906−1368)の全核酸配列をFig94(配列番号:263)に示す。クローンUNQ478(DNA53906−1368)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置37−39に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2353−2355の停止コドンで終端する(Fig94)。予測されるポリペプチド前駆体は772アミノ酸長である(Fig95)。Fig95に示した全長PRO941タンパク質は、約87,002ダルトンの見積もり分子量及び約4.64のpIを有する。Fig95(配列番号:264)に示した全長PRO941配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸57〜約アミノ酸60、約アミノ酸74〜約アミノ酸77、約アミノ酸419〜約アミノ酸422、約アミノ酸437〜約アミノ酸440、約アミノ酸508〜約アミノ酸511、約アミノ酸515〜約アミノ酸518、約アミノ酸516〜約アミノ酸519及び約アミノ酸534〜約アミノ酸537の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸136〜約アミノ酸146及び約アミノ酸244〜約アミノ酸254のカドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列。クローンUNQ478(DNA53906−1368)は、1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209747が付与されている。
全長PRO941ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがカドヘリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO941が新規なカドヘリンタンパク質ファミリーメンバーとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO941アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、I50180, CADA_CHICK, I50178, GEN12782, CADC_HUMAN, P_W25637, A38992, P R49731, D38992及びG02678との間の有意な相同性を明らかにした。
【0473】
実施例44:ヒトPRO944をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47374と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のEST配列を構築に使用し、それはFig99−107に示した。DNA47374コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO944の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CGAGCGAGTCATGGCCAACGC−3’(配列番号:280)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGTCACACGTAGTCTTTCCCGCTGG−3’
(配列番号:281)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47374配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTGCAGCTGTTGGGCTTCATTCTCGCCTTCCTGGGATGGATCG−3’(配列番号:282)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO944遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO944の全長DNA配列[ここで、UNQ481(DNA52185−1370)と命名される](配列番号:269)及びPRO944の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ481(DNA52185−1370)の全核酸配列をFig97(配列番号:269)に示す。クローンUNQ481(DNA52185−1370)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置219−221に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置852−854の停止コドンで終端する(Fig97)。予測されるポリペプチド前駆体は211アミノ酸長である(Fig98)。Fig98に示した全長PRO944タンパク質は、約22,744ダルトンの見積もり分子量及び約8.51のpIを有する。Fig98(配列番号:270)に示した全長PRO944配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸82〜約アミノ酸102、約アミノ酸118〜約アミノ酸142及び約アミノ酸161〜約アミノ酸187の膜貫通ドメイン、約アミノ酸72〜約アミノ酸75のN−グリコシル化部位、約アミノ酸70〜約アミノ酸111のタンパク質のPMP−22/EMP/MP20ファミリーに相同性を持つ配列ブロック、及び約アミノ酸119〜約アミノ酸133のABC−2型膜貫通系複合膜タンパク質。クローンUNQ481(DNA5218 5−1370)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209861が付与されている。
全長PRO944ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがCPE−Rタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO944が新規なCPE−R相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO944アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB000713_1, AB000 714_1, AF035814_1, AF000959_1, HSU89916_1, EMP2_HUMAN, JC5732, CELF53B3_6, PM22_MOUSE及びCGU49797_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0474】
実施例45:ヒトPRO983をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA47473と命名される。ジェネンテクが独自に開発した種々のEST配列を構築に使用し、それらのEST配列はFig110−116に示した。DNA47473コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO983の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCACCACCGTAGGTACTTGTGTGAGGC−3’
(配列番号:292)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCACCAGAGCCAAGAGCCGGG−3’(配列番号:293)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47473配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CAGCGGAATCATCGATGCAGGGGCCTCAATTAATGTATCTGTGATGTTAC−3’
(配列番号:294)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO983遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄(LIB256)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO983の全長DNA配列[ここで、UNQ484(DNA53977−1371)と命名される](配列番号:283)及びPRO983の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ484(DNA53977−1371)の全核酸配列をFig108(配列番号:283)に示す。クローンUNQ484(DNA53977−1371)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置234−236に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置963−965の停止コドンで終端する(Fig108)。予測されるポリペプチド前駆体は243アミノ酸長である(Fig109)。Fig109に示した全長PRO983タンパク質は、約27,228ダルトンの見積もり分子量及び約7.43のpIを有する。Fig109(配列番号:284)に示した全長PRO983配列の分析は以下の特徴の存在を明示している:約アミノ酸224〜約アミノ酸239の推定膜貫通ドメイン、約アミノ酸68〜約アミノ酸71の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸59〜約アミノ酸64、約アミノ酸64〜約アミノ酸69及び約アミノ酸235〜約アミノ酸240の3つの潜在的N−ミリストイル化部位。クローンUNQ484(DNA53977−1371)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209862が付与されている。
全長PRO983ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞関連タンパク質、VAP−33と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO983が新規な小胞関連膜タンパク質となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO983アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、VP33_APLCA, CELF33D11_12, CELF42G2_2, S50623, YDFC_SCHPO, CELF54H5_2, CELZC196_8, CEF57A10_3, MSP3_GLORO, CEC15H11_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0475】
実施例46:ヒトPRO1057をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA49808と命名される。DNA49808コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1057の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GCATCTGCAGGAGAGAGCGAAGGG−3’(配列番号:297)
逆方向PCRプライマー 5’−CATCGTTCCCGTGAATCCAGAGGC−3’(配列番号:298)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49808配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GAAGGGAGGCCTTCCTTTCAGTGGACCCGGGTCAAGAATACCCAC−3’(配列番号:299)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1057遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1057の全長DNA配列[ここで、UNQ522(DNA57253−1382)と命名される](配列番号:295)及びPRO1057の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ522(DNA57253−1382)の全核酸配列をFig117(配列番号:295)に示す。クローンUNQ522(DNA57253−1382)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置275−277に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1514−1516の停止コドンで終端する(Fig117)。予測されるポリペプチド前駆体は413アミノ酸長である(Fig118)。Fig118に示した全長PRO1057タンパク質は、約47,070ダルトンの見積もり分子量及び約9.92のpIを有する。Fig118(配列番号:296)に示した全長PRO1057配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド、約アミノ酸90〜約アミノ酸93、約アミノ酸110〜約アミノ酸113及び約アミノ酸193〜約アミノ酸196の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸236〜約アミノ酸239のグリコサミノグリカン結合部位、及び約アミノ酸165〜約アミノ酸170のセリンプロテアーゼヒスチジン含有活性部位。クローンUNQ522(DNA57253−1382)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209867が付与されている。
全長PRO1057ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のプロテアーゼタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1057が新規なプロテアーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1057アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、TRYE_DROER, P_R14159, A69660, EBN1_EBV, S65494, GEN12688, A51084_1, P_R99571, A57514及びAF003200_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0476】
実施例47:ヒトPRO1071をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA53035と命名される。DNA53035コンセンサス配列に基づいて、コンセンサス配列が、概観したところ全長タンパク質をコードすることがわかったクローンであるIncyteのESTクローン番号2872569と有意な配列同一性を有していることが同定された。そのようにして、IncyteのESTクローン番号2872569を購入し、その挿入物を得て配列決定し、正しい配列を確認した。この配列を、ここにUNQ528又はDNA58847−1383と命名する。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1071の全長DNA配列[ここで、UNQ528(DNA58847−1383)と命名される](配列番号:300)及びPRO1071の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ528(DNA58847−1383)の全核酸配列をFig119(配列番号:300)に示す。クローンUNQ528(DNA58847−1383)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置133−135に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1708−1710の停止コドンで終端する(Fig119)。予測されるポリペプチド前駆体は525アミノ酸長である(Fig120)。Fig120に示した全長PRO1071タンパク質は、約58,416ダルトンの見積もり分子量及び約6.62のpIを有する。Fig120(配列番号:301)に示した全長PRO1071配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸25のシグナルペプチド、約アミノ酸251〜約アミノ酸254の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸385〜約アミノ酸399のトロンボスポンジン−1相同ブロック、約アミノ酸385〜約アミノ酸399、約アミノ酸445〜約アミノ酸459及び約アミノ酸42〜約アミノ酸56のウィリブランズ(Willibrands)因子C型相同ブロック。クローンUNQ528(DNA58847−1383)は、1998年5月20日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209879が付与されている。
全長PRO10717ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが種々のトロンボスポンジンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1071が新規なトロンボスポンジン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1071アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AB002364_1, D67076_1, BTPCINPGN_1, CET13H10_1, CEF25H8_5, CEF53B6_2, CEC26C6_6, HSSEMG_1, CET21B6_4及びBTY08561_1との間の有意な相同性を明らかにした。
【0477】
実施例48:ヒトPRO1072をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA53125と命名される。DNA53125コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1072の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCAGGAAATGCTCCAGGAAGAGCC−3’(配列番号:305)
逆方向PCRプライマー 5’−GCCCATGACACCAAATTGAAGAGTGG−3’
(配列番号:306)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA53125配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AACGCAGGGATCTTCCAGTGCCCTTACATGAAGACTGAAGATGGG−3’(配列番号:307)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1072遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1072の全長DNA配列[ここで、UNQ529(DNA58747−1384)と命名される](配列番号:302)及びPRO1072の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ529(DNA58747−1384)の全核酸配列をFig121(配列番号:302)に示す。クローンUNQ529(DNA58747−1384)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置65−67に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1073−1075の停止コドンで終端する(Fig121)。予測されるポリペプチド前駆体は336アミノ酸長である(Fig122)。Fig122に示した全長PRO1072タンパク質は、約36,865ダルトンの見積もり分子量及び約9.15のpIを有する。Fig122(配列番号:303)に示した全長PRO1072配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸21のシグナルペプチド、約アミノ酸134〜約アミノ酸144、約アミノ酸44〜約アミノ酸56及び約アミノ酸239〜約アミノ酸248の短鎖アルコールデヒドロゲナーゼタンパク質相同ブロック、及び約アミノ酸212〜約アミノ酸215及び約アミノ酸239〜約アミノ酸242の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ529(DNA58747−1384)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209868が付与されている。
全長PRO1072ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質のレダクターゼファミリーと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1072が新規なレダクターゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1072アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W03198, P_W15759, P_R60800, MTV037_3, CEC15H11_6, ATAC00234314, MTV022_13, SCU43704_1, OXIR_STRAT及びCELC01G8_3との間の有意な相同性を明らかにした。
【0478】
実施例49:ヒトPRO1075をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA34363と命名される。DNA34363配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1075の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGAGAGGCCTCTCTGGAAGTTG−3’(配列番号:312)
正方向PCRプライマー 5’−GTCAGCGATCAGTGAAAGC−3’ (配列番号:313)
正方向PCRプライマー 5’−CCAGAATGAAGTAGCTCGGC−3’ (配列番号:314)
正方向PCRプライマー 5’−CCGACTCAAAATGCATTGTC−3’ (配列番号:315)
正方向PCRプライマー 5’−CATTTGGCAGGAATTGTCC−3’ (配列番号:316)
正方向PCRプライマー 5’−GGTGCTATAGGCCAAGGG−3’ (配列番号:317)
逆方向PCRプライマー 5’−CTGTATCTCTGGGCTATGTCAGAG−3’ (配列番号:318)
逆方向PCRプライマー 5’−CTACATATAATGGCACATGTCAGCC−3’(配列番号:319)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA34363配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGTCTTCCTATCCTTACCCGACCTCAGATGCTCCCTTCTGCTCCTG−3’(配列番号:320)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1075遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト皮膚腫瘍組織(LIB324)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1075の全長DNA配列[ここで、UNQ532(DNA57689−1385)と命名される](配列番号:308)及びPRO1075の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ532(DNA57689−1385)の全核酸配列をFig124(配列番号:308)に示す。クローンUNQ532(DNA57689−1385)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置137−139に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1355−1357の停止コドンで終端する(Fig124)。予測されるポリペプチド前駆体は406アミノ酸長である(Fig125)。Fig125に示した全長PRO1075タンパク質は、約46,927ダルトンの見積もり分子量及び約5.21のpIを有する。Fig125(配列番号:309)に示した全長PRO1075配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド、約アミノ酸403〜約アミノ酸406の小胞標的化配列、約アミノ酸203〜約アミノ酸211のチロシンキナーゼリン酸化部位、及び約アミノ酸50〜約アミノ酸66のタンパク質のチオレドキシンファミリーに相同性を持つ配列ブロック。クローンUNQ532(DNA57689−1385)は、1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209869が付与されている。
全長PRO1075ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO1075が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO1075アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、CELC30H7_2, CELC06A6_3, CELF42G8_3, S57942, ER72_CAEEL, CELC07A12_3, CEH06O01_4及びP_R51696との間の有意な相同性を明らかにした。
【0479】
実施例50:ヒトPRO181をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、コルニコン(cornichon)タンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA13242(Fig130;配列番号:323)と命名する。相同性に基づいて、DNA13242分子の配列からオリゴヌクレオチドプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは次のものを含む:
正方向PCRプライマー 5’−GTGCAGCAGAGTGGCTTACA−3’(配列番号:326)
逆方向PCRプライマー 5’−ACTGGACCAATTCTTCTGTG−3’(配列番号:327)
ハイブリッド形成プローブ
5’−GATATTCTAGCATATTGTCAGAAGGAAGGATGGTGCAAATTAGCT−3’(配列番号:328)
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置14−16に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置446−448に見られる停止コドンで終端する(Fig128;配列番号:321)。予測されるポリペプチド前駆体は144アミノ酸長であり、約16,699ダルトンの計算上の分子量及び約5.6の見積もられたpIを有する。Fig129(配列番号:322)に示した全長PRO181配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸11〜約アミノ酸31の推定II型膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸57〜約アミノ酸77及び約アミノ酸123〜約アミノ酸143の他の膜貫通ドメイン。クローンUNQ155(DNA23330−139 0)は、1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209775が付与されている。
全長PRO181ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがコルニコンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO181が新規なコルニコン相同体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO181アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF022811_1, CET09 E8_3, S64058, YGF4_TEAST, YB60_YEAST, EBU89455_1, SIU36383及びPH1371との間の有意な相同性を明らかにした。
【0480】
実施例51:ヒトPRO195をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいてcDNA配列を単離し、ここでDNA13199(Fig134;配列番号:332)と命名した。DNA13199配列は、次いで、公的ESTデータベース(例えば、GenBank)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap. docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA22778と命名する。
DNA22778配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991))、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACAAGCTGAGCTGCTGTGACAG−3’(配列番号:333)
逆方向PCRプライマー 5’−TGATTCTGGCAACCAAGATGGC−3’(配列番号:334)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA22778配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATGGCCTTGGCCGGAGGTTCGGGGACCGCTTCGGCTGAAG−3’(配列番号:335)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO195遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置70−72に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1039−1041の停止コドンで終端する(Fig132;配列番号:330)。予測されるポリペプチド前駆体は323アミノ酸長であり、約36,223の計算された分子量及び約5.06の見積もられたpIを有する。Fig132(配列番号:330)に示した全長PRO195の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸31のシグナルペプチド、約アミノ酸241〜約アミノ酸260の膜貫通ドメイン、及び約アミノ酸90〜約アミノ酸93の潜在的N−グリコシル化部位。クローンUNQ169(DNA26847−1395)は1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209772が付与されている。
全長PRO195ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO195アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_P91380, AF035118_1, HUMTROPCS_1, NOUD_SALTY及びE70002との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0481】
実施例52:ヒトPRO865をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列を、ここにDNA37642(Fig137;配列番号:338)と命名する。DNA37642配列は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発したデータベース(LIFESEQ<SUP>TM</SUP>、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現されたタグ配列(EST)データベースと比較し、それらの間に存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。得られたコンセンサス配列を、ここでDNA48615と命名する。
DNA48615コンセンサス配列に基づいてプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ(LIB227)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー1 5’−AAGCTGCCGGAGCTGCAATG−3’ (配列番号:339)
正方向PCRプライマー2 5’−TTGCTTCTTAATCCTGAGCGC−3’(配列番号:340)
正方向PCRプライマー3 5’−AAAGGAGGACTTTCGACTGC−3’ (配列番号:341)
逆方向PCRプライマー1 5’−AGAGATTCATCCACTGCTCCAAGTCG−3’
(配列番号:342)
逆方向PCRプライマー2 5’−TGTCCAGAAACAGGCACATATCAGC−3’
(配列番号:343)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA48615配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGACAGCGGCACAGAGGTGCTTCTGCCAGGTTAGTGGTTACTTGGATGAT−3’(配列番号:344)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO865遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンが同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1577−1579の停止コドンで終端する(Fig135;配列番号:336)。予測されるポリペプチド前駆体は468アミノ酸長であり、約54,393の計算された分子量及び約5.63の見積もられたpIを有する。Fig136(配列番号:337)に示した全長PRO865の分析は、以下のものの存在を明らかにした:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド、約アミノ酸280〜約アミノ酸283及び約アミノ酸384〜約アミノ酸387の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸94〜約アミノ酸97の潜在的アミド化部位、約アミノ酸20〜約アミノ酸23及び約アミノ酸223〜約アミノ酸226のグリコサミノグリカン結合部位、約アミノ酸216〜約アミノ酸222のアミノトランスフェラーゼクラスVピリドキシルホスフェートアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸338〜約アミノ酸343のインターロイキン−7に見られるものと類似するアミノ酸配列ブロック。クローンUNQ434(DNA53974−1401)は1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209774が付与されている。
全長PRO865ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが任意の公知のタンパク質と有意な配列類似性を持たないことを示唆している。しかしながら、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析はPRO865アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、YMN0_YEAST, ATFCA4_43, S44168, P_W14549及びRABTCRG4_1との間に或る程度の相同性があることを明らかにした。
【0482】
実施例53:ヒトPRO827をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、種々のインテグリンタンパク質をコードする核酸配列に対して配列相同性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA47751(Fig140;配列番号:347)と命名する。配列相同性に基づいて、DNA47751分子の配列からプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎児色素上皮ライブラリ(LIB113)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGGGACAGAGGCCAGAGGACTTC−3’ (配列番号:348)
逆方向PCRプライマー 5’−CAGGTGCATATTCACAGCAGGATG−3’(配列番号:349)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA47751配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGAACTCCCCTTCGTCACTCACCTGTTCTTGCCCCTGGTGTTCCT−3’(配列番号:350)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO827遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置506−508に見られる停止コドンで終端する(Fig138;配列番号:345)。予測されるポリペプチド前駆体は124アミノ酸長であり、約13,352ダルトンの計算上の分子量及び約5.99の見積もられたpIを有する。Fig139(配列番号:346)に示した全長PRO827配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸22のシグナルペプチド、約アミノ酸70〜約アミノ酸72の細胞接着配列、約アミノ酸98〜約アミノ酸101のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸67〜約アミノ酸81のインテグリンアルファ鎖タンパク質相同配列。クローンUNQ468(DNA57039−1402)は、1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209777が付与されている。
全長PRO827ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがVLA−2インテグリンタンパク質及び他の種々のインテグリンタンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO827が新規なインテグリン又はそのスプライシング変異体となりうることが示されている。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO827アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、S44142, ITA2_ HUMAN, ITA1_RAT, ITA1_HUMAN, ITA4_HUMAN, ITA9_HUMAN, AF03108_1, ITAM_MOUSE, ITA8_CHICK及びITA6_CHICKとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0483】
実施例54:ヒトPRO1114をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列が、WU−BLAST配列アラインメントコンピュータプログラムにより、他の公知のインターフェロンレセプターと或る程度の配列同一性を有していることが見出された。このcDNA配列を、ここにDNA48466(Fig143;配列番号:352)と命名する。配列相同性に基づいて、DNA48466分子の配列からプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト乳癌ライブラリー(LIB135)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)、cDNAサイズ切断は2800bp未満であった。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り:
正方向PCRプライマー 5’−AGGCTTCGCTGCGACTAGACCTC−3’ (配列番号:354)
逆方向PCRプライマー 5’−CCAGGTCGGGTAAGGATGGTTGAG−3’(配列番号:355)
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTTCTACGCATTGATTCCATGTTTGCTCACAGATGAAGTGGCCATTCTGC−3’
(配列番号:356)
全長クローンを同定し、それは、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置250−252に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1183−1185に見られる停止コドンで終端する(Fig141;配列番号:351)。予測されるポリペプチド前駆体は311アミノ酸長であり、約35,076ダルトンの計算上の分子量及び約5.04の見積もられたpIを有する。Fig142(配列番号:352)に示した全長PRO1114配列の分析は、以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド、約アミノ酸230〜約アミノ酸255の膜貫通ドメイン、約アミノ酸40〜約アミノ酸43及び約アミノ酸134〜約アミノ酸137の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸92〜約アミノ酸119の組織因子タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸232〜約アミノ酸262のインテグリンアルファ鎖タンパク質に相同性を持つアミノ酸配列ブロック。クローンUNQ557(DNA57033−1403)は、1998年5月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209905が付与されている。
Fig142(配列番号:352)に示した全長配列の、WU−BLAST2配列アラインメント分析を用いた、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)の分析は、PRO1114インターフェロンレセプターアミノ酸配列と以下のDayhoff配列:G01418, INR1_MOUSE, P_R71035, INGS_HUMAN, A26595_1, A26593_1, I56215及びTF_HUMANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0484】
実施例55:ヒトPRO237をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA30905と命名される。DNA30905コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO237の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TCTGCTGAGGTGCAGCTCATTCAC−3’(配列番号:359)
逆方向PCRプライマー 5’−GAGGCTCTGGAAGATCTGAGATGG−3’(配列番号:360)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA30905配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCTCTTTGTCAACGTTGCCAGTACCTCTAACCCATTCCTCAGTCGCCTC−3’
(配列番号:361)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1075遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO237の全長DNA配列[ここで、UNQ211(DNA34353−1428)と命名される](配列番号:357)及びPRO237の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ211(DNA34353−1428)の全核酸配列をFig144(配列番号:357)に示す。クローンUNQ211(DNA34353−1428)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置586−588に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1570−1572の停止コドンで終端する(Fig144)。予測されるポリペプチド前駆体は328アミノ酸長である(Fig145)。Fig145に示した全長PRO237タンパク質は、約36,238ダルトンの見積もり分子量及び約9.90のpIを有する。Fig145(配列番号:358)に示した全長PRO237配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド、約アミノ酸177〜約アミノ酸199の膜貫通ドメイン、約アミノ酸118〜約アミノ酸121、約アミノ酸170〜約アミノ酸173及び約アミノ酸260〜約アミノ酸263のN−グリコシル化部位、及び約アミノ酸222〜約アミノ酸270、約アミノ酸128〜約アミノ酸164及び約アミノ酸45〜約アミノ酸92の真核生物型炭酸脱水酵素配列相同性ブロック。クローンUNQ211(DNA34353−1428)は、1998年5月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209855が付与されている。
全長PRO237ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが炭酸脱水酵素タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO237アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、AF0550106_1, OACALP_1, CELD1022_8, CAH2_HUMAN, 1CAC, CAH5_HUMAN, CAHP_HUMAN, CAH3_HUMAN, CAH1_HUMAN及び2CABとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0485】
実施例56:ヒトPRO541をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42259と命名される。DNA42259コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO541の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGACAGAATTTGGGAGCACACTGG−3’ (配列番号:364)
正方向PCRプライマー 5’−CCAAGAGTATACTGTCCTCG−3’ (配列番号:365)
逆方向PCRプライマー 5’−AGCACAGATTTTCTCTACAGCCCCC−3’(配列番号:366)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCACTCCAGCATGTACTGCTGC−3’ (配列番号:367)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42259配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCATTCAGGTGTTCTGGCCCTGTATGTACACATTATACACAGGTCGTGTG−3’(配列番号:368)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO541遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO541の全長DNA配列[ここで、UNQ342(DNA45417−1432)と命名される](配列番号:362)及びPRO541の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ342(DNA45417−1432)の全核酸配列をFig146(配列番号:362)に示す。クローンUNQ342(DNA45417−1432)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置469−471に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1969−1971の停止コドンで終端する(Fig146)。予測されるポリペプチド前駆体は500アミノ酸長である(Fig147)。Fig147に示した全長PRO541タンパク質は、約56,888ダルトンの見積もり分子量及び約8.53のpIを有する。Fig147(配列番号:363)に示した全長PRO541配列の分析は以下のものの存在を明示している:約アミノ酸1〜約アミノ酸20のシグナルペプチド、約アミノ酸165〜約アミノ酸186、約アミノ酸196〜約アミノ酸218、約アミノ酸134〜約アミノ酸146、約アミノ酸96〜約アミノ酸108及び約アミノ酸58〜約アミノ酸77の細胞外タンパク質SCP/Tpx−1/PR−1/Sc7に相同性を持つアミノ酸配列ブロック、及び約アミノ酸28〜約アミノ酸31のN−グリコシル化部位。クローンUNQ342(DNA45417−1432)は、1998年5月27日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209910が付与されている。
全長PRO541ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがトリプシンインヒビタータンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、それによりPRO541が新規なトリプシンインヒビターとなりうることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO541アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、D45027_1, AB009609_1, JC5308, CRS3_HORSE, TPX1_HUMAN, HELO_HELHO, GEN14351, A28112_1, CET05A10_1及びP_W11485との間の有意な相同性を明らかにした。
【0486】
実施例57:ヒトPRO273をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA36465と命名される。DNA36464コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO273の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCGCCCTCCCCATGTCCCTG−3’ (配列番号:371)
逆方向PCRプライマー 5’−TCCCAACTGGTTTGGAGTTTTCCC−3’(配列番号:372)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA36465配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTCCGGTCAGCATGAGGCTCCTGGCGGCCGCTGCTCCTGCTGCTG−3’(配列番号:373)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO273遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO273の全長DNA配列[ここで、UNQ240(DNA39523−1192)と命名される](配列番号:369)及びPRO273の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ240(DNA39523−1192)の全核酸配列をFig148(配列番号:369)に示す。クローンUNQ240(DNA39423−1192)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置167−169に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置500−502の停止コドンで終端する(Fig148)。予測されるポリペプチド前駆体は111アミノ酸長である(Fig149)。クローンUNQ240(DNA39423−1192)はATCCに寄託されている。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。さらに、ここに提供された配列及び全遺伝子コードの知識が与えられれば、任意の与えられたアミノ酸についての対応するヌクレオチドは日常的に同定でき、その逆も可能である。
全長PRO273ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒトマクロファージ炎症タンパク質−2、サイトカイン誘発性ニューロフィル化学誘引物質2、及びニューロフィル化学誘引因子2−ベータと配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO273が新規なケモカインであることを示している。
後で更に議論するように、cDNAはバキュロウイルスベクターにサブクローニングされ、C−末端タグIgG融合タンパク質として発現される。得られたタンパク質のN−末端配列は、77アミノ酸の成熟ポリペプチドを生成するシグナル配列切断部位を決定する。成熟配列は、他のヒトCXCケモカインと31−40%の同一性を示し、4つの正準システイン残基を含むがELRモチーフを欠く。ノーザン分析は、少なくとも小腸、結腸、脾臓、リンパ節及び腎臓での発現を示した。これも後で詳細に記載するインサイツハイブリッド形成によると、mRNAは、腸絨毛の固有層及び尿細管に局在化している。
【0487】
実施例58:ヒトPRO701をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39848と命名される。DNA39848コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO701の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCAAGCTACGGAAACGTCATCGTG−3’(配列番号:376)
逆方向PCRプライマー 5’−AACCCCCGAGCCAAAAGATGGTCAC−3’(配列番号:377)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39848配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTACCGGTGACCAGGCAGCAAAAGGCAACTATGGGCTCCTGGATCAG−3’(配列番号:378)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO701遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO701の全長DNA配列[ここで、UNQ365(DNA44205−1285)と命名される](配列番号:374)及びPRO701の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ365(DNA44205−1285)の全核酸配列をFig150(配列番号:374)に示す。クローンUNQ365(DNA44205−1285)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置50−52に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2498−3000の停止コドンで終端する(Fig150)。予測されるポリペプチド前駆体は816アミノ酸長である(Fig151)。Fig151に示した全長PRO701タンパク質は、約91,794ダルトンの見積もり分子量及び約5.88のpIを有し、NX(S/T)は4であった。クローンUNQ365(DNA44205− 1285)は、1998年3月31日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
さらに、Fig151に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸25に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置83、511、716及び803に潜在的N−グリコシル化部位が存在する。カルボキシルエステラーゼB型シグネーチャー2配列は、およそ残基125〜135である。カルボキシルエステラーゼB型に相同な領域は、およそ残基54−74、197−212及び221−261である。潜在的な膜貫通領域は、およそアミノ酸671〜およそ700に相当する。対応する核酸は、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
全長PRO701ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがクマネズミ属ノルベギカス(norvigicus)からのニューロリジン(neuroligin)と有意な配列類似性を有することを示唆し、PRO701が新規なヒトニューロリジンであることを示している。
【0488】
実施例59:ヒトPRO704をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43033と命名される。DNA43033コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO704の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTTGGGTCGTGGCAGCAGTGG−3’(配列番号:381)
逆方向PCRプライマー 5’−CACTCTCCAGGCTGCATGCTCAGG−3’(配列番号:382)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43033配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTCAAACGTTCGAGTACTTGAAACGGGAGCACTCGCTGTCGAAGC−3’(配列番号:383)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO704遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO704の全長DNA配列[ここで、UNQ368(DNA50911−1288)と命名される](配列番号:379)及びPRO704の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ368(DNA50911−1288)の全核酸配列をFig152(配列番号:379)に示す。クローンUNQ368(DNA50911−1288)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置8−10に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1052−1054の停止コドンで終端する(Fig152)。予測されるポリペプチド前駆体は348アミノ酸長である(Fig153)。Fig153に示した全長PRO704タンパク質は、約39,711ダルトンの見積もり分子量及び約8.7のpIを有する。クローンUNQ368(DNA50911−1288)は、1998年3月31日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供した配列は現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
全長PRO704ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが小胞複合膜タンパク質36と有意な配列相同性を有することを示唆し、PRO704が新規な小胞複合膜タンパク質となりうることを示している。
配列番号:380のさらなる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:380のおよそアミノ酸1−39である。膜貫通ドメインは、配列番号:380のアミノ酸310−335である。潜在的N−グリコシル化部位は、配列番号:380のおよそアミノ酸180−183である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列が与えられれば日常的に決定できる。
【0489】
実施例60:ヒトPRO706をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA40669と命名される。DNA40669コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO706の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCAAGCAGCTTAGAGCTCCAGACC−3’(配列番号:386)
逆方向PCRプライマー 5’−TTCCCTATGCTCTGTATTGGCATGG−3’(配列番号:387)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA40669配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GCCACTTCTGCCACAATGTCAGCTTTCCCTGTACCAGAAATGGCTGTGTT−3’
(配列番号:388)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO706遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO706の全長DNA配列[ここで、UNQ370(DNA48329−1290)と命名される](配列番号:384)及びPRO706の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ370(DNA48329−1290)の全核酸配列をFig154(配列番号:384)に示す。クローンUNQ370(DNA48329−1290)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置279−281に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1719−1721の停止コドンで終端する(Fig154)。予測されるポリペプチド前駆体は480アミノ酸長である(Fig155)。Fig155に示した全長PRO706タンパク質は、約55,239ダルトンの見積もり分子量及び約9.30のpIを有する。クローンUNQ370(DNA48329−1290)は、1998年4月21日にATCCに寄託された。
さらに、Fig155に示したアミノ酸配列について、およそアミノ酸19に潜在的シグナルペプチド切断部位が存在する。アミノ酸位置305及び354に潜在的N−グリコシル化部位が存在する。潜在的チロシンキナーゼリン酸化部位は、およそアミノ酸333に存在する。ヒスチジン酸ホスファターゼと相同な領域は、およそ残基87−102である。対応する核酸領域は提供された配列が与えられれば日常的に決定できる、即ち、コドンは与えられた特定の名称のアミノ酸から決定できる。
全長PRO706ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがヒト前立腺酸ホスファターゼ前駆体と有意な配列相同性を有することを示唆し、それによりPRO706が新規なヒト前立腺酸ホスファターゼとなりうることを示している。
【0490】
実施例61:ヒトPRO707をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42775と命名される。DNA42775に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO707の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TCCGTCTCTGTGAACCGCCCCAC−3’ (配列番号:391)
逆方向PCRプライマー 5’−CTCGGGCGCATTGTCGTTCTGGTC−3’(配列番号:392)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42775配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCGACTGTGAAAGAGAACGCCCCAGATCCACTTGTTCCCC−3’(配列番号:393)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO707遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO707の全長DNA配列[ここで、UNQ371(DNA48306−1291)と命名される](配列番号:389)及びPRO707の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ371(DNA48306−1291)の全核酸配列をFig156(配列番号:389)に示す。クローンUNQ371(DNA48306−1291)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、配列番号:389のヌクレオチド位置371−373に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3119−3121の停止コドンで終端する。予測されるポリペプチド前駆体は916アミノ酸長である(Fig157)。Fig157に示した全長PRO707タンパク質は、約100,204ダルトンの見積もり分子量及び約4.92のpIを有する。クローンUNQ371(DNA48306−1291)は、1998年5月27日にATCCに寄託された。クローンUNQ371はPRO707をコードし、そして、ここの配列は、些細な誤差を生ずるかもしれない現在の配列技術に基づいた単なる代表例であると理解される。
アミノ酸配列の分析に関して、シグナル配列は配列番号:390のおよそ1〜30に現れる。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャー配列は、配列番号:390のおよそアミノ酸121−131、230−240、335−345、440−450及び550−560である。チロシンキナーゼリン酸化部位は、配列番号:390のおよそアミノ酸124−132及び580−586である。潜在的膜貫通ドメインは、およそアミノ酸682−715±5である。核酸位置は、命名されたアミノ酸の対応するコドンを参照して誘導できる。
全長PRO707ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ヒト繊維芽細胞で発現されるカドヘリンFIB3タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO707が新規なカドヘリンとなりうることを示している。
【0491】
実施例62:ヒトPRO322をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA48336と命名される。DNA48336コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO322の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCCTACAGAATAAAGATGGCCC−3’(配列番号:396)
逆方向PCRプライマー 5’−GGTGCAATGATCTGCCAGGCTGAT−3’(配列番号:397)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA48336コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGAAATACCTGTGGTTCAGTCCATCCCAAACCCCTGCTACAACAGCAG−3’
(配列番号:398)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO322遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO322の全長DNA配列[ここで、UNQ283(DNA48336−1309)と命名される](配列番号:394)及びPRO322の誘導タンパク質配列を与えた。UNQ283(DNA48336−1309)は実際にPRO322をコードし、配列番号:394はこの分野で知られた配列技術に基づく配列の代表例であると理解される。
UNQ283(DNA48336−1309)の全核酸配列をFig158(配列番号:394)に示す。クローンUNQ283(DNA48336−1309)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置166−168に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置946−948の停止コドンで終端する(Fig158)。予測されるポリペプチド前駆体は260アミノ酸長である(Fig159)。Fig159に示した全長PRO322タンパク質は、約28,028ダルトンの見積もり分子量及び約7.87のpIを有する。クローンUNQ283(DNA48336−1309)はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209669が付与されている。
Fig159のアミノ酸配列に関して、潜在的N−グリコシル化部位は配列番号:395のアミノ酸110である。セリンプロテアーゼ、チロシンファミリー及びヒスチジン活性部位は、配列番号:395のアミノ酸69〜74に同定され、コンセンサス配列は配列番号:395のアミノ酸207〜217に同定される。クリングルドメインタンパク質モチーフは、配列番号:395のアミノ酸205〜217に同定される。推定シグナルペプチドは、およそアミノ酸1−23でコードされる。
全長PRO322ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ニューロプシン及び他のセリンプロテアーゼと有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO322が新規なセリンプロテアーゼ関連ニューロプシンとなりうることを示している。
【0492】
実施例63:ヒトPRO526をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA39626と命名される。DNA39626コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO526の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGCTGCCCTGCAGTACCTCTACC−3’(配列番号:401)
逆方向PCRプライマー 5’−CCCTGCAGGTCATTGGCAGCTAGG−3’(配列番号:402)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA39626コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−AGGCACTGCCTGATGACACCTTCCGCGACCTGGGCAACCTCACAC−3’(配列番号:403)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO526遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB228)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO526の全長DNA配列[ここで、UNQ330(DNA44184−1319)と命名される](配列番号:399)及びPRO526の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ330(DNA44184−1319)の全核酸配列をFig160(配列番号:399)に示す。クローンUNQ330(DNA44184−1319)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置514−516に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1933−1935の停止コドンで終端する(Fig160)。予測されるポリペプチド前駆体は473アミノ酸長である(Fig161)。Fig161に示した全長PRO526タンパク質は、約50,708ダルトンの見積もり分子量及び約9.28のpIを有する。クローンUNQ330(DNA44184−1319)は1998年3月26日にATCCに寄託された。このクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO526ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、ALS、SLIT、カルボキシペプチダーゼ及び血小板糖タンパク質Vを含むロイシンリピート豊富なタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO526がタンパク質−タンパク質相互作用に含まれる新規なタンパク質であることを示している。
配列番号:400の更なる分析により、シグナルペプチドはおよそアミノ酸1−26にある。ロイシンジッパーパターンはおよそアミノ酸135−156にある。グリコサミノグリカン結合部位は、およそアミノ酸436−439にある。N−グリコシル化部位は、およそアミノ酸82−85、179−182、237−240及び423−426にある。フォンウィルブランド因子(VWF)型Cドメインは、およそアミノ酸411−425に見られる。当業者は、ここに提供した配列に基づいて、これらのアミノ酸に対応するヌクレオチドを理解できる。
【0493】
実施例64:ヒトPRO531をコードするcDNAクローンの単離
ECDデータベースを検索し、プロトカドヘリン3と相同性を示す発現配列タグ(EST)をLIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAから同定した。この配列に基づいて、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として検索を実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/ phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。
他のEST配列に対してphrapを用いてコンセンサス配列を構築した。得られたコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO531の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CTGAGAACGCGCCTGAAACTGTG−3’(配列番号:406)
逆方向PCRプライマー 5’−AGCGTTGTCATTGACATCGGCG−3’ (配列番号:407)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TTAGTTGCTCCATTCAGGAGGATCTACCCTTCCTCCTGAAATCCGCGGAA−3’
(配列番号:408)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でのPCR増幅でスクリーニングした。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO531遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織(LIB153)から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, Caからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278−1280 (1991)参照にこと)に、独特のXol及びNotI部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO531の全長DNA配列[ここで、UNQ332(DNA48314−1320)と命名される](配列番号:404)及びPRO531の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ332(DNA48314−1320)の全代表的核酸配列をFig162(配列番号:404)に示す。実際の配列は、ATCCにDNA48314−1320として寄託されたクローン内にあると理解される。クローンUNQ332(DNA48314−1320)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置171−173に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2565−2567の停止コドンで終端する(Fig162)。予測されるポリペプチド前駆体は789アミノ酸長である(Fig163)。Fig163に示した全長PRO531タンパク質は、約87,552ダルトンの見積もり分子量及び約4.84のpIを有する。クローンUNQ332(DNA48314−1320)は1998年3月26日にATCCに寄託された。
全長PRO531ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、プロトカドヘリン3と有意な相同性を有することを示唆している。さらに、PRO531は他のプロトカドヘリンと同様に脳に見出され、それによりPRO531がカドヘリンスーパーファミリーの新規なメンバーであることを示している。
配列番号:405の更なる分析により、カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは、配列番号:405のおよそアミノ酸122−132、231−241、336−346、439−449及び549−559に見られる。ATP/GTP結合部位モチーフ(P−ループ)は、配列番号:405のおよそアミノ酸285−292に見られる。N−グリコシル化部位は、配列番号:405のおよそアミノ酸567−570、786−790、418−421及び336−339に見られる。シグナルペプチドは配列番号:405のおよそアミノ酸1−26、膜貫通ドメインはおよそアミノ酸685−712にある。
【0494】
実施例65:ヒトPRO534をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43038と命名される。DNA43048コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO534の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CACAGAGCCAGAAGTGGCGGAATC−3’(配列番号:411)
逆方向PCRプライマー 5’−CCACATGTTCCTGCTCTTGTCCTGG−3’(配列番号:412)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43038配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CGGTAGTGACTGTACTCTAGTCCTGTTTTACACCCCGTGGTGCCG−3’(配列番号:413)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO534遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB26)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO534の全長DNA配列[ここで、UNQ335(DNA48333−1321)と命名される](配列番号:409)及びPRO534の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ335(DNA48333−1321)の全核酸配列をFig164(配列番号:409)に示す。クローンUNQ335(DNA48333−1321)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置87−89に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1167−1169の停止コドンで終端する(Fig164)。予測されるポリペプチド前駆体は360アミノ酸長である(Fig165)。Fig165に示した全長PRO534タンパク質は、約39,885ダルトンの見積もり分子量及び約4.79のpIを有する。クローンUNQ335(DNA48333−1321)は1998年3月26日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO534ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO534が新規なジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。
PRO534のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:410のおよそアミノ酸1−25である。膜貫通ドメインは配列番号:410のおよそアミノ酸321−340である。ジスルフィドイソメラーゼ対応領域は配列番号:410のおよそアミノ酸212−302である。チオレドキシンドメインは配列番号:410のおよそ亜物酸211−227である。N−グリコシル化部位は、配列番号:410の165−168、181−184、187−190、194−197、206−209、278−281及び293−296にある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。PRO534は、他のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと同様にER保持ペプチドではなく膜貫通ドメインを有する。さらに、PRO534は5プライム末端にイントロンを有してもよい。
【0495】
実施例66:ヒトPRO697をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43052と命名される。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO697の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCTGGCTCGCTGCTGCTGCTC−3’ (配列番号:416)
逆方向PCRプライマー 5’−CCTCACAGGTGCACTGCAAGCTGTC−3’(配列番号:417)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43052配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CTCTTCCTCTTTGGCCAGCCCGACTTCTCCTACAAGCGCAGAATTGC−3’(配列番号:418)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO697遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO697の全長DNA配列[ここで、UNQ361(DNA50920−1325)と命名される](配列番号:414)及びPRO697の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ361(DNA50920−1325)の全核酸配列をFig166(配列番号:414)に示す。クローンUNQ361(DNA50920−1325)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置44−46に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置929−931の停止コドンで終端する(Fig166)。予測されるポリペプチド前駆体は295アミノ酸長である(Fig167)。Fig167に示した全長PRO697タンパク質は、約33,518ダルトンの見積もり分子量及び約7.74のpIを有する。クローンUNQ361(DNA50920−1325)は1998年3月26日にATCCに寄託された。寄託されたクローンは実際の配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づく代表例であると理解される。
全長PRO697ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、sFRPsと有意な配列同一性を有することを示唆し、それによりPRO697が新規なsFRPファミリーメンバーとなりうることを示している。
PRO697のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:415のおよそアミノ酸1−20である。縮れた(frizzled)N−末端と同一性を持つシステイン富化ドメインは配列番号:415のおよそアミノ酸6−153である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0496】
実施例67:ヒトPRO717をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA42829と命名される。DNA42829コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO717の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AGCTTCTCAGCCCTCCTGGAGCAG−3’(配列番号:421)
逆方向PCRプライマー 5’−CGGGTCAATAAACCTGGACGCTTGG−3’(配列番号:422)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42829配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TATGTGGACCGGACCAAGCACTTCACTGAGGCCACCAAGATTG−3’(配列番号:423)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO717遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肝臓組織(LIB229)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO717の全長DNA配列[ここで、UNQ385(DNA50988−1326)と命名される](配列番号:419)及びPRO717の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ385(DNA50988−1326)の全核酸配列をFig168(配列番号:419)に示す。クローンUNQ385(DNA50988−1326)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置17−19に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1697−1699の停止コドンで終端する(Fig168)。予測されるポリペプチド前駆体は560アミノ酸長である(Fig169)。Fig169に示した全長PRO717タンパク質は、約58,427ダルトンの見積もり分子量及び約6.86のpIを有する。クローンUNQ385(DNA50988−1326)は1998年4月28日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は現在の配列技術に基づいていると理解される。
全長PRO717ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO717が新規な12膜貫通レセプターとなりうることを示している。DNA50988の逆補体鎖は、ヒト調節性ミオシン軽鎖と同一的に適合する伸展を有する。
配列番号:420のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号:420のおよそアミノ酸30−50、61−79、98−112、126−146、169−182、201−215、248−268、280−300、318−337、341−357、375−387、及び420−441である。N−グリコシル化部位は配列番号:420のおよそアミノ酸40−43及び43−46である。グリコサミノグリカン結合部位は配列番号:420のおよそアミノ酸468−471である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0497】
実施例68:ヒトPRO731をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)データベースの検索にデータベースを使用した。ここで用いたESTデータベースは、独自に開発されたEST DNAデータベース、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CAである。Incyteクローン2581326を、ここでDNA42801と命名する。DNA42801配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO731の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTAAGCACATGCCTCCAGAGGTGC−3’(配列番号:426)
逆方向PCRプライマー 5’−GTGACGTGGATGCTTGGGATGTTG−3’(配列番号:427)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA42801配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−TGGACACCTTCAGTATTGATGCCAAGACAGGCCAGGTCATTCTGCGTCGA−3’
(配列番号:428)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO731遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等,Science, 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXol及びNotI部位でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO731の全長DNA配列[ここで、UNQ395(DNA48331−1329)と命名される](配列番号:424)及びPRO731の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ395(DNA48331−1329)の全核酸配列をFig170A−B(配列番号:424)に示す。クローンUNQ395(DNA48331−1329)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置329−331に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3881−3883の停止コドンで終端する(Fig170A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は1184アミノ酸長である(Fig171)。Fig171に示した全長PRO731タンパク質は、約129,022ダルトンの見積もり分子量及び約5.2のpIを有する。クローンUNQ395(DNA48331−1329)は1998年3月31日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO731ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部が、多数のプロトカドヘリンファミリーと有意な同一性及び類似性を有することを示唆し、それによりPRO731が新規なプロトカドヘリンとなりうることを示している。
配列番号:425のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:425のおよそアミノ酸1−13である。膜貫通ドメインは配列番号:425のおよそアミノ酸719−739である。配列番号:425のN−グリコシル化部位は次の通りである:415−418、582−586、659−662、662−665及び857−860。カドヘリン細胞外繰り返しドメインシグネーチャーは(配列番号:425の)およそアミノ酸123−133、232−242、340−350、448−458及び553−563である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0498】
実施例69:ヒトPRO218をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA17411と命名される。2つの独自に開発したジェネンテクEST配列をコンセンサス構築に使用し、それらをFig174及び175に示した。DNA17411コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO218の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−AAGTGGAGCCGGAGCCTTCC−3’(配列番号:433)
逆方向PCRプライマー 5’−TCGTTGTTTATGCAGTAGTCGG−3’(配列番号:434)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA17411配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−ATTGTTTAAAGACTATGAGATACGTCAGTATGTTGTACAGG−3’(配列番号:435)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO218遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB28)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO218の全長DNA配列[ここで、UNQ192(DNA30867−1335)と命名される](配列番号:429)及びPRO218の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ192(DNA30867−1335)の全核酸配列をFig172(配列番号:429)に示す。クローンUNQ192(DNA30867−1335)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置150−152に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1515−1517の停止コドンで終端する(Fig172)。予測されるポリペプチド前駆体は455アミノ酸長である(Fig173)。Fig173に示した全長PRO218タンパク質は、約52,917ダルトンの見積もり分子量及び約9.5のpIを有する。クローンUNQ192(DNA30867−1335)は1998年4月28日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO218ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、PRO218が新規な膜貫通タンパク質となりうることを示している。
配列番号:430のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:430のおよそアミノ酸1〜23である。膜貫通ドメインは潜在的に配列番号:430のおよそアミノ酸37−55、81−102、150−168、288−311、338−356、375−398及び425−444である。N−グリコシル化部位は配列番号:430のおよそアミノ酸67、180及び243にある。真核生物コバラミン(cobalamin)結合タンパク質は配列番号:430のおよそアミノ酸151−160である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0499】
実施例70:ヒトPRO768をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43448と命名される。DNA43448コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO768の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCTGACACCGCAGTGCTCTTCAG−3’(配列番号:438)
逆方向PCRプライマー 5’−GCTGCTGGGGACTGCAATGTAGCT−3’(配列番号:439)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43448配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CATCCTCCATGTCTCCCATGAGGTCTCTATTGCTCCACGAAGCATC−3’(配列番号:440)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO768遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO768の全長DNA配列[ここで、UNQ406(DNA55737−1345)と命名される](配列番号:436)及びPRO768の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ406(DNA55737−1345)の全核酸配列をFig176A−B(配列番号:436)に示す。クローンUNQ406(DNA55737−1345)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置20−22に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置3443−3445の停止コドンで終端する(Fig176A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は1141アミノ酸長である(Fig177)。Fig177に示した全長PRO768タンパク質は、約124,671ダルトンの見積もり分子量及び約5.82のpIを有する。クローンUNQ406(DNA55737−1345)は1998年4月6日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO768ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がインテグリン7と有意な配列同一性及び類似性を有することを示唆している。
配列番号:437のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:437のおよそアミノ酸1−33である。膜貫通ドメインは配列番号:437のアミノ酸1039−1064にある。N−グリコシル化部位は配列番号:437のアミノ酸:86−89、746−749、949−952、985−988、及び1005−1008にある。インテグリンアルファ鎖タンパク質ドメインは配列番号:437のおよそアミノ酸:1064−1071、384−409、1041−1071、317−346、443−465、385−407、215−224、634−647、85−99、322−346、470−479、442−466、379−408及び1031−1047である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0500】
実施例71:ヒトPRO771をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA43330と命名される。DNA43330配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO771の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CAGCAATATTCAGAAGCGGCAAGGG−3’(配列番号:443)
逆方向PCRプライマー 5’−CATCATGGTCATCACCACCATCATCATC−3’
(配列番号:444)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA43330コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTTACTACAAGCCAACACAATGTCATGGCAGTGTTGGACAGTGCTGG−3’ (配列番号:445)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO771遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB28)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO771の全長DNA配列[ここで、UNQ409(DNA49829−1346)と命名される](配列番号:441)及びPRO771の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ409(DNA49829−1346)の全核酸配列をFig178(配列番号:441)に示す。クローンUNQ409(DNA49829−1346)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1442−1444の停止コドンで終端する(Fig178)。予測されるポリペプチド前駆体は436アミノ酸長である(Fig179)。Fig179に示した全長PRO771タンパク質は、約49,429ダルトンの見積もり分子量及び約4.8のpIを有する。クローンUNQ409(DNA49829−1346)は1998年4月7日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO771ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がテスチカ(testican)タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、それによりPRO771が新規なテスチカン相同体となりうることを示している。
配列番号:442のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、ロイシンジッパーパターン、N−ミリストイル化部位、及びチログロブリン(thyroglobulin)1型リピートもFig179に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0501】
実施例72:ヒトPRO733をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA45600と命名される。DNA45600コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO733の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−CCCAGCAGGGATGGGCGACAAGA−3’(配列番号:448)
逆方向PCRプライマー 5’−GTCTTCCAGTTTCATATCCAATA−3’(配列番号:449)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA45600コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAGAAGGAGCACGGGGAAGGGCAGCCAGATCTTGTCGCCCAT−3’(配列番号:450)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO733遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO733の全長DNA配列[ここで、UNQ411(DNA52196−1348)と命名される](配列番号:446)及びPRO733の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ411(DNA52196−1348)の全核酸配列をFig180A−B(配列番号:446)に示す。クローンUNQ411(DNA52196−1348)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置793−795の停止コドンで終端する(Fig180A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は229アミノ酸長である(Fig181)。Fig181に示した全長PRO733タンパク質は、約26,017ダルトンの見積もり分子量及び約4.73のpIを有する。クローンUNQ411(DNA52196−1348)は1998年4月7日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO733ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がT1/ST2レセプター結合タンパク質前駆体と有意な配列同一性及び類似性を有し、従って細胞シグナル伝達において類似の機能を有することを示唆している。それがサイトカインである場合、炎症及び癌の治療に有用であろう。
配列番号:447のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチド、膜貫通ドメイン、N−ミリストイル化部位、及びチロシンキナーゼ部位もFig181に示した。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0502】
実施例73:ヒトPRO162をコードするcDNAクローンの単離
発現配列タグ(EST)DNAデータベースを検索し、ヒト膵炎関連タンパク質と相同性を示すEST AA397543を同定した。EST AA397543コール(cole)を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig182(配列番号:451)に示した。
PRO162の全核酸配列をFig182(配列番号:451)に示す。このクローンのDNA配列は、PRO162の全長DNA配列[ここで、UNQ429(DNA56965−1356)と命名される](配列番号:451)及びPRO162の誘導タンパク質配列を与えた。クローンUNQ429(DNA56965−1356)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置86−88に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置611−613の停止コドンで終端する(Fig182)。予測されるポリペプチド前駆体は175アミノ酸長である(Fig183)。Fig183に示した全長PRO162タンパク質は、約19,330ダルトンの見積もり分子量及び約7.25のpIを有する。クローンUNQ429(DNA56965−1356)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO162ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト膵炎関連タンパク質と有意な相同性する事を示唆し、それによりPRO162が新規な膵炎関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号:452のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:452のおよそアミノ酸1−26である。C型レクチンドメインシグネーチャーは配列番号:452のおよそアミノ酸146−171である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0503】
実施例74:ヒトPRO788をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列(ここでDNA49308と命名する)を構築した。DNA49308コンセンサス配列とIncyteESTクローン番号2777282との間に観察された相同性に基づき、IncyteESTクローン番号2777282を購入し、その挿入物を得て配列決定し、PRO788の全長DNA配列[ここで、UNQ430(DNA56405−1357)と命名される](配列番号:453)及びPRO788の誘導タンパク質配列を与えた。
クローンUNQ430(DNA56405−1357)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置84−86に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置459−461の停止コドンで終端する(Fig184)。予測されるポリペプチド前駆体は125アミノ酸長である(Fig185)。Fig185に示した全長PRO788タンパク質は、約13,115ダルトンの見積もり分子量及び約5.90のpIを有する。クローンUNQ430(DNA56405−1357)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
Fig185の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:454のおよそアミノ酸1−17に見られる。N−グリコシル化部位は配列番号:454のおよそアミノ酸46−49である。
【0504】
実施例75:ヒトPRO1008をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列をDNA49804と命名する。ジェネンテクが独自に開発したESTをコンセンサス構築に用い、ここでDNA16508(Fig188;配列番号:457)と命名する。DNA49804配列とMerckESTクローン番号AA143670との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号AA143670を購入し、その挿入物を得て配列決定した。ここで、この配列はFig186(配列番号:455)に示す。
配列決定は、PRO1008の全長DNA配列[ここで、UNQ492(DNA57530−1375)と命名される](配列番号:455)及びPRO1008の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ492(DNA57530−1375)の全核酸配列をFig186(配列番号:455)に示す。クローンUNQ492(DNA57530−1375)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置138−140に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置936−938の停止コドンで終端する(Fig186)。予測されるポリペプチド前駆体は266アミノ酸長である(Fig187)。Fig187に示した全長PRO1008タンパク質は、約28,672ダルトンの見積もり分子量及び約8.85のpIを有する。クローンUNQ492(DNA57530−1375)は1998年5月20日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1008ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がmdkk−1と有意な配列同一性及び/又は類似性を有し、それによりPRO1008がこのファミリーの新規なメンバーであり、ヘッド誘発活性を有することを示している。
配列番号:456のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:456のおよそアミノ酸1−23である。N−グリコシル化部位は配列番号:456のおよそアミノ酸256−259であり、真菌zn−(2)−cys(6)二核クラスタードメインは配列番号:456のおよそアミノ酸110−126である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0505】
実施例76:ヒトPRO1012をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したように種々のEST配列に対してコンセンサス配列が得られ、得られたコンセンサス配列は、ここにDNA49313と命名される。DNA49313コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1012の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−ACTCCCCAGGCTGTTCACACTGCC−3’(配列番号:460)
逆方向PCRプライマー 5’−GATCAGCCAGCCAATACCAGCAGC−3’(配列番号:461)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49313コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGTGATGATAGAATGCTTTGCCGAATGAAAGGAGTCAACAGCTATCCC−3’
(配列番号:462)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1012遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1012の全長DNA配列[ここで、UNQ495(DNA56439−1376)と命名される](配列番号:458)及びPRO1012の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ495(DNA56439−1376)の全核酸配列をFig189A−B(配列番号:458)に示す。クローンUNQ495(DNA56439−1376)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置404−406に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2645−2647の停止コドンで終端する(Fig189A−B)。予測されるポリペプチド前駆体は747アミノ酸長である(Fig190)。Fig190に示した全長PRO1012タンパク質は、約86,127ダルトンの見積もり分子量及び約7.46のpIを有する。クローンUNQ495(DNA56439−1376)は1998年5月14日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1012ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がジスルフィドイソメラーゼと有意な配列同一性を有し、それによりPRO1012が新規なジスルフィドイソメラーゼ関連タンパク質となりうることを示している。
配列番号:459のアミノ酸配列の更なる分析により、チトクロムCファミリーヘム結合部位シグネーチャーは配列番号:459のおよそアミノ酸158−163である。Nt−DNAJドメインシグネーチャーは配列番号:459のおよそアミノ酸77−96である。N−グリコシル化部位は配列番号:459のおよそアミノ酸484−487である。ER標的配列は配列番号:459のおよそアミノ酸744−747である。開示したポリペプチド及び核酸は、これに換わる実施例において、必要に応じてこれらの部分有り又は無しで日常的に作成できると理解される。例えば、ER標的配列無しのPRO1012を生成するのが好ましい場合もある。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0506】
実施例77:ヒトPRO1014をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、得られたコンセンサス配列をDNA49811と命名する。DNA49811配列とIncyteESTクローン番号2612207との間に観察された相同性に基づき、IncyteESTクローン番号2612207を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig191(配列番号:463)に示す。
配列決定は、PRO1014の全長DNA配列[ここで、UNQ497(DNA56409−1377)と命名される](配列番号:463)及びPRO1014の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ497(DNA56409−1377)の全核酸配列をFig191(配列番号:463)に示す。クローンUNQ497(DNA56409−1377)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置66−68に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置966−968の停止コドンで終端する(Fig191)。予測されるポリペプチド前駆体は300アミノ酸長である(Fig192)。Fig192に示した全長PRO1014タンパク質は、約33,655ダルトンの見積もり分子量及び約9.31のpIを有する。クローンUNQ497(DNA56409−1377)は1998年5月20日にATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1014ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がレダクターゼと有意な配列同一性を有し、それによりPRO1014がレダクターゼファミリーの新規なメンバーとなることを示している。
配列番号:464のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:464のおよそアミノ酸1−19である。cAMP及びcGMP依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:464のおよそアミノ酸30−33である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号:464のおよそアミノ酸165−202、37−49、112−122及び210−219である。これらのドメイン及び他のここに提供したアミノ酸の対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0507】
実施例78:ヒトPRO1017をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA53235と命名する。DNA53235配列とMerckESTクローン番号AA243086との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号AA243086を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig193(配列番号:465)に示した。DNA配列決定は、PRO1017の全長DNA配列[ここで、UNQ500(DNA56112−1379)と命名される](配列番号:456)及びPRO1017の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ500(DNA56112−1379)の全核酸配列をFig193(配列番号:465)に示す。クローンUNQ500(DNA56112−1379)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置128−130に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1370−1372の停止コドンで終端する(Fig193)。予測されるポリペプチド前駆体は414アミノ酸長である(Fig194)。Fig194に示した全長PRO1017タンパク質は、約48,414ダルトンの見積もり分子量及び約9.54のpIを有する。クローンUNQ500(DNA56112−1379)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1017ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がHNK−1、スルホトランスフェラーゼと配列同一性を有し、それによりPRO1017が新規なスルホトランスフェラーゼとなりうることを示している。
配列番号:466のアミノ酸配列の更なる分析により、シグナルペプチドは配列番号:466のおよそアミノ酸1−31である。N−グリコシル化部位は配列番号:466のおよそアミノ酸134−137、209−212、280−283及び370−273である。TNFR/NGFRファミリーシステイン富化領域タンパク質は配列番号:466のおよそアミノ酸329−332である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0508】
実施例79:ヒトPRO474をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、得られたコンセンサス配列をDNA49818と命名する。DNA49818配列とMerckESTクローン番号H77889との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号H77889を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig195(配列番号:467)に示した。DNA配列決定は、PRO474の全長DNA配列[ここで、UNQ502(DNA56045−1380)と命名される](配列番号:467)及びPRO474の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ502(DNA56045−1380)の全核酸配列をFig195(配列番号:467)に示す。クローンUNQ502(DNA56045−1380)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置106−108に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置916−918の停止コドンで終端する(Fig195)。予測されるポリペプチド前駆体は270アミノ酸長である(Fig196)。Fig196に示した全長PRO474タンパク質は、約28,317ダルトンの見積もり分子量及び約6.0のpIを有する。クローンUNQ502(DNA56045−1380)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:468のアミノ酸配列の更なる分析により、N−グリコシル化部位は配列番号:468のおよそアミノ酸138−141である。短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリータンパク質は配列番号:468のおよそアミノ酸10−22、81−91、134−171及び176−185である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0509】
実施例80:ヒトPRO1031をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対して最初のコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA47332と命名する。DNA47332配列とMerckESTクローン番号W74558との間に観察された相同性に基づき、MerckESTクローン番号W74558を購入し、その挿入物を得て配列決定し、得られた配列をFig197(配列番号:469)に示した。DNA配列決定は、PRO1031の全長DNA配列[ここで、UNQ516(DNA59294−1381)と命名される](配列番号:469)及びPRO1031の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ516(DNA59294−1381)の全核酸配列をFig197(配列番号:469)に示す。クローンUNQ516(DNA59294−1381)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置42−44に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置582−584の停止コドンで終端する(Fig197)。予測されるポリペプチド前駆体は180アミノ酸長である(Fig198)。Fig198に示した全長PRO1031タンパク質は、約20,437ダルトンの見積もり分子量及び約9.58のpIを有する。クローンUNQ516(DNA59294−1381)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
全長PRO1031ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それが新規なサイトカインであることを示唆している。
配列番号:470のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:470のおよそアミノ酸1−20である。N−グリコシル化部位は配列番号:470のおよそアミノ酸75−78である。IL−17と配列同一性を持つ領域はおよそアミノ酸96−180である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0510】
実施例81:ヒトPRO938をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対して最初のコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA49798と命名する。DNA49798DNAコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO938の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTCCAGCCCATGACCGCCTCCAAC−3’(配列番号:473)逆方向PCRプライマー 5’−CTCTCCTCATCCACACCAGCAGCC−3’(配列番号:474)さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA49798コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GTGGATGCTGAAATTTTACGCCCCATGGTGTCCATCCTGCCAGC−3’(配列番号:475)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO938遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO938の全長DNA配列[ここで、UNQ475(DNA56433−1406)と命名される](配列番号:471)及びPRO938の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ475(DNA56433−1406)の全核酸配列をFig199(配列番号:471)に示す。クローンUNQ475(DNA56433−1406)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置1181−1183の停止コドンで終端する(Fig199)。予測されるポリペプチド前駆体は349アミノ酸長である(Fig200)。Fig200に示した全長PRO938タンパク質は、約38,952ダルトンの見積もり分子量及び約4.34のpIを有する。Fig200(配列番号:472)に示す全長PRO938配列の分析により以下の特徴が明らかとなった:約アミノ酸1〜約アミノ酸22のシグナルペプチド、約アミノ酸191〜約アミノ酸211の膜貫通ドメイン、約アミノ酸46〜約アミノ酸49の潜在的N−グリコシル化部位、約アミノ酸56〜約アミノ酸72のジスルフィドイソメラーゼ相同領域、及び約アミノ酸173〜約アミノ酸187のフラボドキシンタンパク質と配列同一性を持つ領域。
クローンUNQ475(DNA56433−1406)は1998年5月12日にATCCに寄託され、ATCC登録番号209857が付与されている。
全長PRO938ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、それがタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有し、それによりPRO938が新規なタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとなりうることを示している。Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO938アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、P_W03626, P_W03627, P_R70491, GARP_PLAFF, XLU85970_1, ACADISPROA_1, IE68_HSVSA, KSU520 64_1, U93872_83, P_R97866との間の有意な相同性を明らかにした。
【0511】
実施例82:ヒトPRO1082をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築し、このコンセンサス配列をDNA38097と命名する。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1082の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GTCCACAGACAGTCATCTCAGGAGCAG−3’
(配列番号:478)
正方向PCRプライマー 5’−ACAAGTGTCTTCCCAACCTG−3’(配列番号:479)
逆方向PCRプライマー 5’−ATCCTCCCAGAGCCATGGTACCTC−3’(配列番号:480)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA38097コンセンサス配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−CCAAGGATAGCTGTTGTTTCAGAGAAAGGATCGTGTGCTGCATCTCCTCCT−3’
(配列番号:481)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1082遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1082の全長DNA配列[ここで、UNQ539(DNA53912−1457)と命名される](配列番号:476)及びPRO1082の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ539(DNA53912−1457)の全核酸配列をFig201(配列番号:476)に示す。クローンUNQ539(DNA53912−1457)は、単一のオープンリーディングフレームリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置160−162に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置763−765の停止コドンで終端する(Fig201)。予測されるポリペプチド前駆体は201アミノ酸長である(Fig202)。Fig202に示した全長PRO1082タンパク質は、約22,563ダルトンの見積もり分子量及び約4.87のpIを有する。クローンUNQ539(DNA53912−1457)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:477のアミノ酸配列の更なる分析により、膜貫通ドメインは配列番号:477のおよそアミノ酸45−65である。cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:477のおよそアミノ酸197−200である。N−ミリストイル化部位は配列番号:477のおよそアミノ酸35−40及び151−156である。LDLレセプターと配列同一性を持つ領域は配列番号:477のおよそアミノ酸34−67及び70−200である。これらのアミノ酸領域及び他に対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0512】
実施例83:ヒトPRO1083をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したアミラーゼスクリーニング技術を用いてcDNAを同定し、そのcDNAをここでDNA24256(Fig205;配列番号:484)と命名する。次いで、上記実施例1に記載したように、このcDNAを他のEST配列と比較して整列させてコンセンサスDNA配列を得て、それをDNA43422と命名する。DNA43422コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1083の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−GGCATTGGAGCAGTGCTGGGTG−3’(配列番号:485)
逆方向PCRプライマー 5’−TGGAGGCCTAGATGCGGCTGGACG−3’(配列番号:486)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1083遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児腎臓組織(LIB227)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO1083の全長DNA配列[ここで、UNQ540(DNA50921−1458)と命名される](配列番号:482)及びPRO1083の誘導タンパク質配列を与えた。
UNQ540(DNA50921−1458)の全核酸配列をFig203(配列番号:482)に示す。クローンUNQ540(DNA50921−1458)は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置214−216に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置2293−2295の停止コドンで終端する(Fig203)。予測されるポリペプチド前駆体は693アミノ酸長である(Fig204)。Fig204に示した全長PRO1083タンパク質は、約77,738ダルトンの見積もり分子量及び約8.87のpIを有する。クローンUNQ540(DNA50921−1458)はATCCに寄託された。配列に関して、寄託されたクローンは正しい配列を含み、ここに提供される配列は周知の配列技術に基づくと理解される。
配列番号:483のアミノ酸配列の更なる分析により、推定シグナルペプチドは配列番号:483のおよそアミノ酸1−25である。膜貫通ドメインは配列番号:483のおよそアミノ酸382−398、402−420、445−468、473−491、519−537、568−590及び634−657である。微小体C−末端標的化シグナルは配列番号:483のおよそアミノ酸691−693である。cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は配列番号:配列番号:483のおよそアミノ酸198−201及び370−373である。N−グリコシル化部位は配列番号:483のおよそアミノ酸39−42、148−151、171−174、234−237、303−306、324−227及び341−344である。G−プロテイン結合ファミリードメインは配列番号:483のおよそアミノ酸475−504である。対応するヌクレオチドは、ここに提供した配列から日常的に決定できる。
【0513】
実施例84:ヒトPRO200をコードするcDNAクローンの単離
VEGFとの相同性に基づいてIncyte Phamaceuticalsデータベースから同定された発現配列タグ(EST)に基づくプローブを、ヒト神経膠腫細胞系G61から誘導されたcDNAライブラリのスクリーニングに使用した。特に、Incyteクローン「INC1302516」は以下のプローブを生成するのに用いた:
(配列番号:489)ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG;
(配列番号:490)GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC;
(配列番号:491)CACCACAGCGTTTAACCAGG;及び
(配列番号:492)ACAACAGGCACAGTTCCCAC。
9つのポジティブを同定し特徴付けした。3つのクローンが全コード化領域を含み、配列で一致した。胎児肺ライブラリから部分的クローンも同定し、コードされるアミノ酸を変化させない1つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
【0514】
実施例85:PRO200の発現作成物
哺乳動物タンパク質発現のために、全オープンリーディングフレーム(ORF)をCMV−ベース発現ベクターにクローニングした。エピトープタグ(FLAG, Kodak)及びヒスチジンタグ(His8)をORFと停止コドンの間に挿入した。VEGF−E−His8及びVEGF−E−FLAGを、Superfect(Qiagen)によりヒト胚腎臓293細胞に形質移入し、[35S]メチオニン及び[35C]システインで3時間パルス標識した。15倍濃縮無血清条件培地20マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウムバッファー中においてポリアクリルアミドゲル(Novex)上で電気泳動させたとき、両方のエピトープタグタンパク質を同時泳動させた(SDS−PAGE)。ヒトFc(IgG)配列の前でORFにクローニングすることによりVEGF−E−IgG発現プラスミドを作成した。
VEGF−E−IgGプラスミドを、Lipofectin(GibcoBRL)を用いて、10%ウシ胎児血清を添加したハンクのTNM−FH培地(JRH Biosciences)において成長させた105Sf9細胞にBaculogoldバキュロウイルスDNA(Pharmagen)で同時形質移入した。細胞を28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、次いで約10の感染多発性(MOI)でのSf9細胞感染による第1のウイルス増幅に使用した。細胞を3日間インキュベートし、次いで上清を回収し、1mlの上清の30μlのプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)への結合、続くSDS−PAGE分析により組換えプラスミドの発現を決定した。第1の増幅の上清を、ESF−921培地(Expression Systems LLC)で約0.1のMOIで成長させたSf9細胞のスピナー培地500mlの感染に使用して。回収した上清を無菌濾過した以外は細胞を上記のように処理した。特定のタンパク質を、プロテインAセファロース4ファストフロー(Pharmacia)カラムに結合させることにより精製した。
【0515】
実施例86:PRO200のノーザンブロット分析
複数の成人及び胎児組織及び腫瘍細胞系からヒトポリ(A)+RNAのブロットをClontech(Palo alto, CA)から得た。ハイブリッド形成は、全コード化領域を含む32P−標識プローブを用いて実施し、0.1xSSC、0.1%SDSで63℃において洗浄した。
VEGF−EmRNAは、胎児肺、腎臓、脳、肝臓及び成人心臓、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓で検出可能であった。またVEGF−EmRNAは、A549肺腺癌及びHeLa頸部腺癌細胞系でも見られた。
【0516】
実施例87:PRO200についてのヒト胎児組織切片のインサイツハイブリッド形成
ホルマリン固定、パラフィン包埋したヒト胎児脳、肝臓、下肢、小腸、甲状腺、リンパ腺、胸腺、副腎、心臓、大動脈、及び皮膚を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20μg/ml)で37℃において15分間脱タンパクし、さらに、Lu LH及びGillett NA(Cell Vision 1: 169−176, 1994)に記載されているようにインサイツハイブリッド形成のために加工した。[α−33−P]UTP−標識アンチセンスリボプローブを98bpのPCR産物(プライマーGGCGGAATCCAACCTGAGTAG及びGCGGCTATCCTCCTGTGCTC、各々配列番号:493及び494)から生成した。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬し4週間露出した。
VEGF−EmRNA発現は成長プレート領域での局在化及び胎児筋細胞の包囲を含んでいた。
【0517】
実施例88:PRO200についての筋細胞肥大アッセイ
新生ハーランSDラット心室(妊娠23日)からの筋細胞を、96−ウェルプレートにおいて75000細胞/mlで2通りに配した。細胞を。2000、200、20、又は2ng/mlのVEGF−E−IgGで48時間処理した。筋細胞をクリスタルバイオレットで染色して形態を可視化し、3を無刺激及び7を完璧な肥大として3から7の評点付けをした。
2000ng/ml及び200ng/mlのVEGF−Eは肥大を生じ、5に評点付けされた。
【0518】
実施例89:PRO200についての細胞増殖アッセイ
マウス胚繊維芽細胞C3HlOT1/2細胞(ATCC)を、10%のウシ胎児血清(FCS)を含む50:50のハムF−12:低グルコースDMEM培地で成長させた。細胞を24−ウェルペレットにおいて1000、2000及び4000細胞/ウェルで2通りには配した。48時間後、細胞を2%FCSを含む培地に移し、200、800、又は2000ng/mlVEGF−Eと共に、又は成長因子を添加せずに72時間インキュベートした。
3種の細胞密度の全てにおいて、200ng/mlのVEGF−Eが存在すると、それが無い場合より約1.5倍多数の細胞が測定された。
【0519】
実施例90:PRO200についての内皮細胞生存アッセイ
ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を完全培地(Cell Systems)中に維持し、48−ウェルプレートに20,000細胞/ウェルで、無血清培地(Cell Systemからの基本培地、0.1%BSA含有)に3回蒔いた。細胞を、200又は400ng/mlのVEGF−E−IgG、100ng/mlのVEGF、20ng/mlの塩基性EGFと共に、又は無添加で5日間インキュベートした。
VEGF−Eでは、成長因子無添加に比較して2−3倍の多くが生存していた。VEGF及びEGFは正の対照に含まれる。
【0520】
実施例91:ヒトPRO285をコードするcDNAクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索して、ショウジョウバエTollタンパク質と相同性を示すEST(#2243209)を同定した。
ESTに基づいて、PCRプローブの対:
TAAAGACCCAGCTGTGACCG(配列番号:499)
ATCCATGAGCCTCTGATGGG (配列番号:500)、及び
プローブ:
ATTTATGTCTCGAGGAAAGGGACTGGTTACCAGGGCAGCCAGTTC(配列番号:501)を合成した。
cDNAライブラリを作成するためのmRNAはヒト胎盤組織から単離した。cDNAクローンを単離するのに用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CA(Fast Track 2)からのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、所定の方向で適当なクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen, Inc.)に、Life Technoligies, Gaithersburg, MD(Super script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いてクローニングした。2本鎖cDNAを1000bpより大きなものにサイズ分類し、cDNAをBamHI/NotI切断ベクターにクローニングした。pCR2.1は市販のプラスミドであり、PCR断片の容易なクローニングのために設計され、選択のためのAmpR及びKanR遺伝子及び青−白選択のためのLacZ遺伝子を保有する。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO285遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAクローン全体を配列決定した。DNA40021−1154(PRO285をコードする)の全核酸配列をFig208(配列番号:495)に示す。クローンDNA40021−1154は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置61−63に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig208)。予測されるポリペプチド前駆体は1049アミノ酸長であり、アミノ酸位置1−29に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置837−860に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置132−153及び704−725にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンDNA40021−1154はATCCに寄託され(命名:DNA40021−1154)、ATCC寄託番号209389が付与された。
(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、全長配列は、ショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトTollタンパク質の相同体である:Toll(DNAX# HSU88540−1これはランダム配列した全長cDNA #HUMRSC786−1と同一である);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(DNAX# HSU88880−1)。
【0521】
実施例92:ヒトPRO286をコードするcDNAクローンの単離
独自に開発された発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索して、ショウジョウバエTollタンパク質と相同性を示すEST(#694401)を同定した。
ESTに基づいて、PCRプローブの対(正及び逆方向):
GCCGAGACAAAAACGTTCTCC(配列番号:502)
CATCCATGTTCTCATCCATTAGCC(配列番号:503)、及び
プローブ:
TCGACAACCTCATGCAGAGCATCAACCAAAGCAAGAAAACAGTATT(配列番号:504)を合成した。
cDNAライブラリを作成するためのmRNAはヒト胎盤組織から単離した。このRNAは、ベクターpRK5DにおいてオリゴdTプライムしたcDNAライブラリを、Life Technoligies, Gaithersburg, MD(Super script Plasmid system)からの試薬及びプロトコールを用いて生成するのに使用した。pRK5は、XhoI/NotIcDNAクローニング部位の前にSfiI制限酵素部位に続くsp6転写開始部位を持つクローニングベクターである。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で約1000bpより大きなサイズ分類し、所定の方向でXhoI/NotI−切断pRKDにクローニングした。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO286遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAクローン全体を配列決定した。DNA42663−1154(PRO286をコードする)の全核酸配列をFig210A−B(配列番号:497)に示す。クローンDNA42663−1154は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置57−59に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig211)。予測されるポリペプチド前駆体は1041アミノ酸長であり、アミノ酸位置1−26に推定シグナルペプチド、アミノ酸位置826−848に推定膜貫通ドメイン、及び各々アミノ酸位置130−151、206−227、662−684、669−690及び693−614にロイシンジッパーパターンを有する。表示した境界はおよそのものであり、表示した領域の正確な境界は数アミノ酸異なる可能性があることを注記しておく。クローンDNA42663−1154はATCCに寄託され(命名:DNA42663−1154)、ATCC寄託番号209386が付与された。
PRO286の全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、それがショウジョウバエTollタンパク質のヒト相同体であり、以下のヒトTollタンパク質の相同体である:Toll1(DNAX# HSU88540−1これはランダム配列した全長cDNA #HUMRSC786−1と同一である);Toll2(DNAX# HSU88878−1);Toll3(DNAX# HSU88879−1);及びToll4(DNAX# HSU88880−1)。
【0522】
実施例93:PRO285及びPRO286についてのNF−κBアッセイ
NF−κB経路を通したTollタンパク質シグナルと同様に、それらの生物学的活性はNF−κBアッセイで試験できる。このアッセイにおいて、ジャーカット細胞は、製造者の指示に従ってリポフェクタミン試薬(Gibco BRL)を用いて一過的に形質移入される。NF−κB制御ルシフェラーゼ遺伝子を含むpB2XLucプラスミドの1μgを、PRO285又はPRO286をコードする挿入物有又は無のpSRαN発現ベクターと同時形質移入する。正の対照として、細胞をPMA(ホルボールミリスチルアセテート;20ng/ml)及びPHA(フィトヘマグルチニン;2μg/ml)で3から4時間処理した。細胞は、2から3日後に、Promegaからの試薬を用いたルシフェラーゼ活性の測定のために溶解させた。
【0523】
実施例94:ヒトPRO213−1、PRO1330及びPRO1449をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例1に記載したようにphrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を作成した。このコンセンサス配列は、ここにDNA28735と命名される。DNA28735コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー 5’−TGGAGCAGCAATATGCCAGCC−3’(配列番号:511)
逆方向PCRプライマー 5’− TTTTCCACTCCTGTCGGGTTGG−3’(配列番号:512)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリッド形成プローブは、以下の核酸配列を持つコンセンサスDNA28735配列から作成した。
ハイブリッド形成プローブ
5’−GGTGACACTTGCCAGTCAGATGTGGATGAATGCAGTGCTAGGAGGG−3’(配列番号:513)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO213−1、PRO1330及び/又はPRO1449PRO237の全長DNA配列[各々、DNA30943−1−1163−1(配列番号:505)、DNA64907−1163−1(配列番号:507)及びDNA64908−1163−1(配列番号:509)と命名される]を与えた。
各々DNA30943−1−1163−1(配列番号:505)、DNA64907−1163−1(配列番号:507)及びDNA64908−1163−1(配列番号:509)に対応する全核酸配列。DNA30943−1163、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1は、単一のオープンリーディングフレームを含み、各々ヌクレオチド位置336−338、488−490及び326−328に見かけの翻訳開始部位を持ち、そして各々ヌクレオチド位置1221−1223、1307−1309及び1145−1147の停止コドンで終端する(Fig212、214及び216)。予測されるポリペプチド前駆体は、各々295、273及び273アミノ酸長である(Fig213、215及び217)。DNA30943−1−1163−1、DNA64907−1163−1及びDNA64908−1163−1はATCCに寄託され、各々ATCC寄託番号209791、203242及び203243が付与された。
全長PRO213−1ポリペプチドのアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト成長静止−特異的遺伝子6タンパク質と有意な相同性を有することを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.45 SwissProt 35)は、PRO213アミノ酸配列と以下のDayhoff配列、HSMHC3W5A_6及びB48089との間の有意な相同性を明らかにした。
全長PRO1330及びPRO1449ポリペプチドのアミノ酸配列の更なる分析は、notch4との有意な同一性を示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(version 35.130 SwissProt 35)は、PRO1330と以下のDayhoff配列、D86566_1及びNEL_HU MANとの間の有意な相同性を明らかにした。
【0524】
実施例95:ヒトPRO298をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたcDNAを、ここでDNA26832(Fig220;配列番号:516)と命名する。DNA26832の配列を発現配列タグ(EST)データベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、GenBank)及び独自に開発されたESTデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460−480 (1996))を用いて実施した。タンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA; http://bozeman.mbt.washington.edu/phrap.docs/phrap.html)でクラスター形成してコンセンサスDNA配列を構築した。
他のEST配列に対してphrapを用いてコンセンサスDNA配列を構築した。コンセンサス配列を同定し、次いでそれをBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて拡張し、コンセンサス配列を上記のEST配列の供給源を使用する限りできるだけ拡張した。拡張した構築体配列をDNA35861コンセンサス配列のDNA35861.Basedと命名する。1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO298の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向プライマーは一般に20から30ヌクレオチドの範囲であり、約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計されることが多い。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。或る場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きいとき付加的オリゴヌクレオチドが合成される。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAをAusubel等, Current Protocols i Molecular Biology, のように、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた対象とする遺伝子クローンの単離に使用した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)及びハイブリッド形成プローブを合成した:
正方向PCRプライマー1 CAACGTGATTTCAAAGCTGGGCTC(配列番号:517)
正方向PCRプライマー2 GCCTCGTATCAAGAATTTCC(配列番号:518)
正方向PCRプライマー3 AGTGGAAGTCGACCTCCC(配列番号:519)
逆方向PCRプライマー1 CTCACCTGAAATCTCTCATAGCCC(配列番号:520)
ハイブリッド形成プローブ1 CGCAAAACCCATTTTGGGAGCAGGAATTCCAATCATGTCTGTGATGGTGG(配列番号:521)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO298遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児肺組織(LIB25)から単離した。cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法により作成した。cDNAをNotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science , 253: 1278−1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
上記のように単離したクローンのDNA配列は、PRO298の全長DNA配列[ここで、UNQ261(DNA39975−1210)と命名される](配列番号:514)及びPRO298の誘導タンパク質配列を与えた(配列番号:515)。
UNQ261(DNA39975−1210)の全核酸配列をFig218(配列番号:514)に示す。クローンDNA39975−1210は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置375−377に見かけの翻訳開始部位を持つ。予測されるポリペプチド前駆体は364アミノ酸長である。タンパク質は、各々アミノ酸位置36−55(II型TM)、65−84、188−208及び229−245に4つの膜貫通ドメインを有する。推定N−結合グリコシル化部位はアミノ酸位置253で開始する。さらに、タンパク質中に以下の特徴が同定された:cAMP−及びcGMP−依存性タンパク質キナーゼリン酸化部位は位置8で開始する;N−ミリストイル化部位は位置173及び262で開始する;そしてZpドメインは位置45−60の間である。クローンDNA39975−1210はATCCに寄託され(1998年4月21日)、ATCC寄託番号209783が付与された。
【0525】
実施例96:ヒトPRO337をコードするcDNAクローンの単離
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングで単離されたcDNAを、ここでDNA42301(Fig223;配列番号:524)と命名する。上記実施例1に記載した用にphrapを用いてDNA42301の配列をEST配列と比較し、ここでDNA28761と命名するコンセンサス配列を同定した。このコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO337遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAは、ヒト胎児脳組織から単離した。
cDNAクローンは、その全体を配列決定した。DNA43316−1237の全核酸配列をFig221(配列番号:522)に示す。クローンDNA43316−1237は、単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位を持つ(Fig221;配列番号:552)。予測されるポリペプチド前駆体は344アミノ酸長である。クローンDNA43316−1237はATCCに寄託され、ATCC寄託番号209487が付与された。
全長配列のBLAST−2及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO337はラットニューロトリミンとアミノ酸配列同一性(97%)を示す。
【0526】
実施例97:ヒトPRO403をコードするcDNAクローンの単離
導入:
ヒトトロンボポエチン(THPO)は、2つのドメインからなる352アミノ酸のグリコシル化ホルモンである。N−末端ドメインはエリスロポエチンと50%類似性を持ち、生物学的活性を負っている。C−末端領域は分泌に必要とされる。トロンボポエチン(THPO)についての遺伝子はヒト染色体3q27−q28にマッピングされ、そこでこの遺伝子の6つのエクソンはゲノムDNAの7キロベース塩基対をスピンさせる(Chang等, Genomics 26: 636−7 (1995); Foster等, Rroc. Natl. Acad. Csi. USA 91: 13023−7 (1994); Gurney等, Blood 85: 981−988 (1995))。THPOの直近に位置するTHPO相同体をコードする任意の遺伝子が存在するか否かを決定するため、この領域からのゲノムDNA断片を同定して配列決定した。THPO遺伝子座を含む3つのP1クローン及び1つのPACクローン(Genome Systems Inc., St. Louis. MO;カタログ番号P1−2535及びPAC−6539)が単離され、140kb領域をPCRベースのギャップ充填法と組み合わせた規則的ショットガン法(Chen等, Genomics 17: 651−656 (1993))を用いて配列決定した。分析によりこの領域がTHPOに極めて近く位置する4つの付加的遺伝子腫瘍壊死因子レセプター1関連タンパク質2(TRAP2)及び伸長開始因子ガンマ(elF40)、塩化物チャンネル2(CLCN2)及びRNAポリメラーゼIIサブユニットhRPB17を持つ遺伝子富化であることが明らかとなった。この領域のTHPO相同体は見られなかったが、4つの新規な遺伝子がコンピュータ補助遺伝子検出(GRAIL)により予測された(Xu等, Gen. Engin. 16: 241−253 (1994), CpG島の存在(Cross, S.及びBird, A., Curr. Opin. Genet. & Devel. 5: 109−314 (1995), 及び公知の遺伝子との相同性(WU−BLAST2.0(Altschul及びGish, Methods Enzymol. 266: 460−480 (1996)(http://blast.wustl.edu/blastREADME.html))による検出))。
方法:
P1及びPACクローン:
最初のヒトP1クローンはゲノムP1ライブラリ(Genome Systems Inc., St. Louis, MO; カタログ番号P1−2535)から単離され、THPO下のみ配列から設計されたPCRプライマーでスクリーニングされた。PCRプライマーは、このP1クローンから誘導された末端配列から設計され、次いでP1及びPACライブラリ(Genome Systems カタログ番号P1−2535びPAC−6539)のスクリーニングに用い、重複クローン(PAC1、pl.t及びp1.u)を同定した。PAC.zからの3’末端配列を、ヒトBACライブラリ(Genome Systems Inc., St. Louis, MO; カタログ番号: BDTW−4533A)のスクリーニングに使用するプライマーの同定に用いた。
規則的ショットガン法:
規則的ショットガン法(OSS)(Chen等, Genomics 17: 651−656 (1993))は、階層的方法での大きなゲノムDNAクローンのマッピング及び配列を含む。P1又はPACクローンを超音波処理し、断片をラムダベクター(λBluestar)にサブクローニングした(Novegen, Inc., Madison, WI: カタログ番号69242−3)。ラムダサブクローン挿入物は長範囲PCR(Barnes, W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2216−2220 (1994))により単離し、末端を配列決定した。ラムダ末端配列を重複させ、最初のクローンの部分的マップを作成した。重複末端配列を持つこれらのラムダクローンを同定し、インセットをプラスミドベクター(pUC18又はpUC19, Hoefer Pharmacia Biotech, Inc., San Francisco, CA, カタログ番号 27−4949−01及び27−4951−01)にサブクローニングし、プラスミドサブクローンの末端を配列決定し、組み立てて近接配列を生成した。この方向性を持った配列決定法は、必要な無駄を最小にし、対象とする領域をスキャンし集中するのを可能にする。
よりよいTHPO遺伝子座を同定し、ヘマトポエチンファミリーに関連する他の遺伝子を検索するために、5つのゲノムクローンを、ヒトP1及びPACライブラリのPCRスクリーニングによりこの領域から単離した(Genome System. Inc., カタログ番号: P1−2535及びPAC−6539)。
遺伝子断片のサイズは次に通り:P1.tは40kb;P1.gは70kb;P1.uは70kb;PAC.zは200kb;及びBAC.1は80kb。190kbゲノムDNA領域の約75%(140kb)を、規則的ショットガン法(OSS)(Chen等, Genomics 17: 651−56 (1993))を用いて配列決定し、自動整列器(Applied Biosystems. Perkin Elmer, Foster City, CA, カタログ番号903227)を用いてコンティグに構築した。これらのコンティグの予備的順序を手動分析で決定した。140kb領域に47のコンティグが存在した。コンティグの順序づけ及びギャップの充填のためのPCRベースの方法を採用した。以下に、ギャップの数及びサイズをまとめる。BAC.1に特有の50kbの配列を、10倍の冗長性を持つ全ショットガン法で配列決定した。
ギャップのサイズ 数
<50bp 13
50−150bp 7
150−300bp 7
300−1000bp 10
1000−5000bp 7
>5000bp 2(15,000bp)
【0527】
DNA配列決定:
ABI DYE−プライマーTM化学(PE Applied Biosystems, Foster City, CA;カタログ番号: 402112)を、ラムダ及びプラスミドサブクローンの末端配列決定に用いた。ABI DYE−プライマーTM化学(PE Applied Biosystems, Foster City, CA;カタログ番号: 403044)を、PCR産物のその対応するPCRプライマーでの配列決定に用いた。配列は、ABI377装置で収集した。1kbより大きなPCR産物について、歩行プライマーを用いた。自動整列器(PE Applied BioSystems, Foster City, CA )でのOSS法により生成されたコンティグの配列及びギャップ充填配列決定跡ファイルを、重複及び終端についてSequencher(商品名)(Gene Codes Corp., Ann Arbor, MI)に入力した。全ショットガン法により生成された配列は、PhredおよびPhrapを用いて構築し、Consed(http://chimera.biotech. washington.edu/uwgc/projects.htm)およびGFP(Genome Reconstruction Manager for Phrap), version 1.2(http://stork.cellb.bcm.tmc.edu/gfp/)を用いて編集した。
PCR−ベースギャップ充填法:
各コンティグの配列決定された5’及び3’末端に基づいてプライマーを設計し、反復及び低品質配列領域を避けた。全てのプライマーを50−70%のG/C量を持つ19−24量体であるように設計した。オリゴを合成し、標準的な方法によりゲル精製した。
コンティグの配向と順序は未知であったので、プライマーの順列を増幅反応において使用した。二つのPCRキットを使用した:第1に、およそ10分の伸展時間でのXL PCRキット(Perkin Elmer, Norwalk, CT; カタログ番号:N8080205);第2に、XL PCRキットで汚れた又は複数の生成物が観察された場合にはTaqポリメラーゼPCRキット(Qiagen Inc., Valencia, CA;カタログ番号:201223)を高緊縮性条件下で使用した。それぞれの成功した反応からの主要なPCR産物は0.9%の低溶融アガロースゲルから抽出し配列決定前にGeneclean DNA Purificationキットで精製した。
分析:
コード領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した:第1に、反復配列をRepeatMasker(A.F.A. Smit & P. Green, http://ftp.genome.washington.edu/RM/RM_details.html)でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してFastA方式でDNA配列スクリーニングし、マスクしたクエリー配列に戻した。マスクされていないリピートは、配列をGenBankデータベースとWUBLAST(Altschu, S.及びGish, W., Methods Enzymol. 266: 460−480(1996))を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をWUBLAST2.0アルゴリズムを用いて比較することにより既知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びcDNA配列を各々、さもないと大きく異なる配列間の局所的同一性の領域を見つけるためにNeedleman−Wunch(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443−453 (1970))アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。該方法は、該領域の5つの既知の遺伝子、THPO、TRAP2、elF4g、CLCN2及びhRPB17の全てのエクソンの検出をもたらした(表8)。
分析:
コード化領域の同定及び特徴付けは以下のように実施した:第1に、反復配列をRepeatm Master(A.F.A. Smit & P.Green, http://ftp.genome.washington.edu/RM/details.html)でマスクし、それを反復成分のライブラリに対してFastA方式でDNA配列スクリーニングし、マスクしたクウィアリー(quiery)配列に戻した。マスクしていないリピートは、配列をGenBankデータベースとWOBLAST2.0[Altschu, S.及びGish, W., Methods Enzymol. 266: 460−480 (1996); http://blast.wustl.edu/blastREADME.html]を用いて比較することにより同定し、手動でマスクした。
次に、ジェネンテクのタンパク質データベースに対してゲノム領域をWUBLAST2.0アルゴリズムを用いて比較することにより公知の遺伝子を明らかにし、各遺伝子についてゲノム及びcDNA配列各々を、配列間の局所的同一性の領域を見つけるためのニードルマン−バンチ(Needleman及びWunsch, J. Mol. Biol. 48: 443−453 (1970))アルゴリズムを用いて整列させることにより注釈をつけた。この方法は、この領域の5つの公知の遺伝子、THPO、TRAP2、elF4g、CLCN2及びhRPB18の全てのエクソンの検出をもたらした(下記参照)。
公知の遺伝子 マップ位置
真核生物翻訳開始因子4ガンマ 3q27−qter
トロンボポエチン 3q26−q27
塩化物チャンネル2 3q26−qter
TNFレセプター関連タンパク質2 未だマッピングされていない
RNAポリメラーゼIIサブユニットhRPB17 未だマッピングされていない
最後に、新規な転写単位を多数の方法を用いて予測した。CpG島(S. Cross及びBird, A., Curr. Opin. Gene. Dev. 5: 109−314 (1995))島をプロモーター同定に使用し、GC−富化、6−又は8−mer回文構造配列を認識する酵素によって切断される部位のクラスターとして同定した(NotI、NarI、BssHII、XhoI)。CpG島は通常、遺伝子のプロモーター領域を付随している。短いゲノム領域(10−20kb)のGenBankに対するWUBLAST2.0分析は、ESTに一致することを示した。個々のEST配列(或いは可能ならば、それらの配列クロマトグラムファイル)を検索し、シーケンサーで構築して理論的cDNA配列を与えた(DNA36443)。新規のエクソンを予測するためにGRAIL2(ApoCom Inc., Knoxville, TN, DEC アルファに対するコマンドラインバージョン)を用いた。この領域の5つの公知の遺伝子は、GLAILアルゴリズムの成功のための内部コントロールとして与えた。
【0528】
単離:
部分的エンドセリン変換酵素−2(ECE−2)cDNAクローンを、ゲノム配列の予測されるECE−2エクソンを最初にシリコ(silico)でスプライシングして推定配列を生成することにより単離した(DNA36443)。オリゴヌクレオチドプローブ: GAAGCAGTGCAGCCAGCAGTAGAGAGGCACCTGCTAAGA(配列番号:530)を設計し、ヒト胎児小腸ライブラリ(LIB110)のスクリーニングに使用し、内部PCRプライマー(36443f1)(ECE2.f: ACGCAGCTGGAGCTGGTCTTAGCA)(配列番号:531)及び(36443r1)(ECE2.r)(GGTACTGGACCCCTAGGGCCACAA)(配列番号:532)を用いて配列決定前にプローブにハイブリッド形成するクローンを確認した。1つのポジティブクローンが得られたが、このcDNA(DNA49830)は、適当にスプライシングされたエクソン1から6、次いでイントロン6配列を含む部分的にスプライシングされた転写物を表示した。オリゴdTプライマー、イントロン6に存在するAlu成分内でのポリA−伸展までアニーリングした。更なるECE−2cDNA断片(DNA49831)は、ヒト胎児腎臓ライブラリ(LIB227)から、推定cDNA配列から設計したプライマー[36443f3: CCTCCCAGCCGAGACCAGTGG(配列番号:533)及び36443r2: GGTCCTATAAGGGCCAAGACC (配列番号:534)]でのPCRによって得た。このPCR産物をエクソン13からエクソン18の3’ 非翻訳領域まで拡張した。
全長エンドセリン変換酵素2(ECE2)cDNAクローン(DNA55800−1263)をオリゴ−dT−プライムヒト胎児脳ライブラリから単離した。ヒト胎児脳組織からのRNA(妊娠20週、#283005)(SRC175)をグアニジンチオシアネートにより単離し、5μgを二本鎖cDNAの生成に使用し、それをベクターpRK5Eにクローニングした。3’−プライマー(pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTT)(配列番号:535)及び5’−リンカー(pCGGACGCGTGGGTCGA)(配列番号:536)をXhoI及びNotI部位に導入するために設計した。ライブラリを、部分的ヒトECE−2cDNA配列(DNA49830及びDNA49831)から設計したPCRプライマー[36443pcrf1: CGGCCGTGATGGCTGGTGACG(配列番号:537)及び36443r3: GGCAGACTCCTTCCTATGGG(配列番号:538)]でスクリーニングした。PCR産物をベクターpCR2.1−TOPO(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, カタログ番号K4500−01)にクローニングし、上記したようなDYE−ターミネーター化学で配列決定した。
【0529】
実施例98:PRO403のノーザンブロット及びインサイツRNAハイブリッド形成分析
ヒト組織におけるPRO403mRNAの発現をノーザンブロット分析により試験した。ヒト胎児及び成人組織から誘導したヒトポリA+RNAブロット(Clontech, Palo Alto, CA; Cat. Nos. 7760−1, 7756−1及び7755−1)を、全長PRO403cDNAに基づくプローブからの[32P−α]dATP標識cDNA断片にハイブリッド形成させた。ブロットをプローブとともにハイブリッド形成バッファー(5X SSPE; 2X デンハード液; 100mg/mLの変性剪断サケ精子DNA; 50%のホルムアミド; 2%のSDS)中、42℃で18時間インキュベートし、高緊縮性(0.1X SSC; 0.1% SDS, 50℃)まで洗浄してオートラジオグラフ分析した。終夜露出の後にブロットをホスホイメージャ分析(Fuji)により展開した。
PRO403mRNA転写物を検出した。発現パターンの分析は、成人脳(小脳、被殻、側頭葉及び中頭葉で最大、及び大脳皮質、後頭葉及び前頭葉でより低い)、脊髄、肺及び膵臓において3.3kbと予測される転写物の最も強いシグナル、胎児脳及び腎臓における4.5kb転写物の高いレベルを示した。
【0530】
実施例99:ハイブリッド形成プローブとしてのPROポリペプチドコード化核酸の使用
以下の方法は、PROをコードする核酸配列のハイブリッド形成プローブとしての使用を記載する。
ここに開示する対象とするPROポリペプチドのコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリにおける同種DNA類(PROポリペプチドの天然発生変異体をコードするものなど)のスクリーニングのためのプローブとして又はそれからプローブを調製する塩基として用いられる。
いずれかのライブラリDNAを含むフィルターのハイブリッド形成及び洗浄は、以下の高い緊縮条件で実施した。放射性標識PROポリペプチドコード化核酸誘導プローブのフィルターへのハイブリッド形成は、50%ホルムアミド、5xSSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で、42℃において20時間行った。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDSの水溶液中、42℃で行った。
次いで、全長天然配列PROポリペプチドをコードするDNAと所望の配列同一性を有するDNAは、この分野で知られた標準的な方法を用いて同定できる。
【0531】
実施例100:大腸菌におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、大腸菌における組み換え発現による所望のPROポリペプチドの非グリコシル化形態の調製を例示する。
所望のPROポリペプチドをコードするDNA配列は、選択されたPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され、脱リン酸される。PCR増幅した配列は、次いで、ベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、polyhisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、polyhis配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、特定のPROポリペプチドコード領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、Sambrook等, 上掲に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列分析で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を採集して遠心分離できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、可溶化PROポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製できる。
PRO181、PRO195、PRO200、PRO237、PRO540、PRO322、PRO1017、PRO938、PRO162、PRO1114、PRO827及びPRO1008は、以下の手法を用いて、大腸菌においてポリHisタグ形態で発現させた。PROポリペプチドをコードするDNAを選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位、及び効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレートカラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼでのタンパク質分解的除去を与える他の有用な配列を含む。次いでPCR増幅された、ポリ−Hisタグ配列を発現ベクターに結合させ、それを株52(W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts) cllpP(lacIq))に基づく大腸菌宿主の形質転換に使用した。形質転換体は、最初に50mg/mlのカルベニシリンを含有するLB中、30℃で振盪しながら3−5のO.D.600に達するまで成長させた。ついで培地をCRAP培地(3.57gの(NH4)2SO4、0.71gのクエン酸ナトリウム・2H2O、1.07gのKCl、5.36gのDifco酵母抽出物、500mL水中の5.36gのShefield hycase SF、並びに110mMのMPOS、pH7.3、0.55%(w/v)のグルコース及び7mMのMgSO4の混合で調製)中に50−100倍希釈し、30℃で振盪させながら約20−30時間成長させた。試料を取り出してSDS−PAGEにより発現を確認し、バルク培地を遠心分離して細胞のペレットとした。細胞細胞ペレットを精製及び再折りたたみまで凍結させた。
【0532】
0.5から1Lの発酵(6−10gペレット)からの大腸菌ペーストを、7Mのグアニジン、20mMのトリス、pH8バッファー中で10容量(w/v)で再懸濁させた。固体硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを添加して最終濃度を各々0.1M及び0.02Mとし、溶液を4℃で終夜撹拌した。この工程により、亜硫酸によりブロックされたシステイン残基を持つ変性タンパク質がもたらされた。溶液をBeckman Ultracentrifuge中で40,000rpmで30分間濃縮した。上清を金属キレートカラムバッファー(6Mのグアニジン、20mMのトリス、pH7.4)の3−5容量で希釈し、0.22ミクロンフィルターを通して濾過して透明化した。透明化抽出物を、金属キレートカラムバッファーで平衡化させた5mlのQiagen Ni−NTA金属キレートカラムに負荷した。カラムを50mMのイミダゾール(Calbiochem, Utrol grade)を含む添加バッファー、pH7.4で洗浄した。タンパク質を250mMのイミダゾールを含有するバッファーで溶離した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、4℃で保存した。タンパク質濃度は、そのアミノ酸配列に基づいて計算した吸光係数を用いて280nmにおけるその吸収により見積もった。
試料を、20mMのトリス、pH8.6、0.3MのNaCl、2.5Mの尿素、5mMのシステイン、20mMのグリシン及び1mMのEDTAからなる新たに調製した再折りたたみバッファー中に徐々に希釈することによりタンパク質を再折りたたみさせた。リフォールディング容量は、最終的なタンパク質濃度が50〜100マイクログラム/mlとなるように選択した。リフォールデlイング溶液を4℃で12−36時間ゆっくり撹拌した。リフォールディング反応はTFAを採取濃度0.4%(約3のpH)で添加することにより停止させた。タンパク質をさらに精製する前に、溶液を0.22ミクロンフィルターを通して濾過し、アセトニトリルを最終濃度2−10%で添加した。再折りたたみされたタンパク質を、Poros R1/H逆相カラムで、0.1%TFAの移動バッファーと10〜80%のアセトニトリル勾配での溶離を用いてクロマトグラフにかけた。A280吸収を持つ画分のアリコートをSDSポリアクリルアミドゲルで分析し、相同な再折りたたみされたタンパク質を含有する画分をプールした。一般的に、殆どのタンパク質の正しく再折りたたみされた種は、これらの種が最もコンパクトであり、その疎水性内面が逆相樹脂との相互作用から遮蔽されているので、アセトニトリルの最低濃度で溶離される。凝集した種は通常、より高いアセトニトリル濃度で溶離される。タンパク質の誤って折りたたまれた形態を所望の形態から除くのに加えて、逆相工程は試料からエンドトキシンも除去する。
所望の折りたたまれたPROタンパク質を含有する画分をプールし、溶液に向けた窒素の弱い気流を用いてアセトニトリルを除去した。タンパク質を、透析又は調製バッファーで平衡化したG25 Superfine(Pharmacia)樹脂でのゲル濾過及び滅菌濾過により、0.14Mの塩化ナトリウム及び4%のマンニトールを含む20mMのHEPES、pH6.8に調製した。
【0533】
実施例101:哺乳動物細胞におけるPROポリペプチドの発現
この実施例は、哺乳動物細胞における組み換え発現によるPROポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてpRK5(1989年3月15日発行のEP 307,247参照)を用いた。場合によっては、PROコード化DNAを選択した制限酵素を持つpRK5に結合させ、Sambrook等, 上掲に記載されたような結合方法を用いてPROポリペプチドDNAを挿入させる。得られたベクターは、pRK5−PROと呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分及び/又は抗生物質を添加したDMEMなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μgのpRK5−PROポリペプチドDNAを約1μgのVA RNA遺伝子コード化DNA[Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))]と混合し、500μlの1mMトリス−HCl、0.1mMEDTA、0.227MCaCl2に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMHEPES(pH7.35)、280mMのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30分間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地(のみ)又は200μCi/ml35S−システイン及び200μCi/ml35S−メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムにさらした。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
【0534】
これに換わる技術において、PROポリペプチドは、Somparyac等, Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981)に記載されたデキストラン硫酸法を用いて293細胞に一過的に導入される。293細胞は、スピナーフラスコ内で最大密度まで成長させ、700μgのpRK5−PROポリペプチドDNAを添加する。細胞は、まずスピナーフラスコから遠心分離によって濃縮し、PBSで洗浄した。DNA−デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で4時間インキュベートした。細胞を20%グリセロールで90秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、5μg/mlウシインシュリン及び0.1μg/mlウシトランスフェリンを含むスピナーフラスコに再度導入した。約4日後に、条件培地を遠心分離して濾過し、細胞及び細胞片を除去した。次いで発現されたPROポリペプチドを含む試料を濃縮し、透析及び/又はカラムクロマトグラフィー等の選択した方法によって精製した。
他の実施態様では、PROポリペプチドをCHO細胞で発現させることができる。pRK5−PROポリペプチドは、CaPO4又はDEAE−デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(のみ)又は35S−メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法にとって精製することができる。
また、エピトープタグPROポリペプチドは、宿主CHO細胞において発現させてもよい。PROポリペプチドはpRK5ベクターからサブクローニングした。サブクローン挿入物は、次いで、PCRを施してバキュロウイルス発現ベクター中のポリ−hisタグ等の選択されたエピトープタグを持つ枠に融合できる。ポリ−hisタグPROポリペプチド挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。発現されたポリ−hisタグPROポリペプチドを含む培養培地は、次いで濃縮し、Ni2+−キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。
【0535】
CHO細胞における安定な発現は以下の方法を用いて実施された。タンパク質は、それは対応するタンパク質の可溶化形態及び/又はポリ−Hisタグ形態のコード化配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH2ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現された。PCR増幅に続いて、対応するDNAを、Ausubel等, Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.26, John Wiley and Sons (1997)に記載されたような標準的技術を用いてCHO発現ベクターにサブクローニングした。CHO発現ベクターは、対象とするDNAの5’ 及び3’ に適合する制限部位を有し、cDNAの便利なシャトル化ができるように作成される。ベクターは、Lucas等, Nucl. Acids res. 24: 9, 1774−1779 (1996)に記載されたようにCHO細胞での発現を用い、対象とするcDNA及びジヒドロフォレートレダクターゼ(DHFR)の発現の制御にSV40初期プロモーター/エンハンサーを用いる。DHFR発現は、形質移入に続くプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。
所望のプラスミドDNAの12マイクログラムを、市販の形質移入試薬Superfect(登録商標)(Quiagen), Dosper(登録商標)及びFugene(登録商標)(Boehringer Mannheim)約一千万のCHO細胞に導入した。細胞は、上掲のLucas等に記載されているように成長させた。約3x107細胞を、下記のような更なる成長及び生産のためにアンプル中で凍結させた。
プラスミドDNAを含むアンプルを水槽に配して解凍し、ボルテックスにより混合した。内容物を10mLの媒質を含む遠心管にピペットして、1000rpmで5分間遠心分離した。上清を吸引して細胞を10mLの選択培地(0.2μm濾過PS20、5%の0.2μm透析濾過ウシ胎児血清を添加)中に懸濁させた。次いで細胞を90mLの選択培地を含む100mlスピナーに分けた1−2日後、細胞を150mLの選択培地を満たした250mLスピナーに移し、37℃でインキュベートした。さらに2−3日後、250mL、500mL及び2000mLのスピナーを3x105細胞/mLで播種した。細胞培地を遠心分離により新鮮培地に交換し、生産培地に再懸濁させた。任意の適切なCHO培地を用いてもよいが、実際には1992米国特許第5,122,469号に記載された生産培地を使用した。3Lの生産スピナーを1.2x106細胞/mLで播種した。0日目に、細胞数とpHを測定した。1日目に、スピナーをサンプルし、濾過空気での散布を実施した。2日目に、スピナーをサンプルし、温度を33℃に変え、500g/Lのグルコース及び0.6mLの10%消泡剤(例えば35%ポリジメチルシロキサンエマルション、Dow Corning 365 Medical Grade Emulsion)の30mLとした。生産を通して、pHは7.2近傍に調節し維持した。10日後、又は生存率が70%を下回るまで、細胞培地を遠心分離で回収して0.22μmフィルターを通して濾過した。濾過物は、4℃で貯蔵するか、即座に精製用カラムに負荷された。
【0536】
ポリ−Hisタグ作成物について、タンパク質はNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製の前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
イムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275μlの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲルで試験し、エドマン(Edman)分解によりN−末端アミノ酸配列決定した。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0537】
実施例102:酵母菌でのPROポリペプチドの発現
以下の方法は、酵母菌中でのPROポリペプチドの組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。所望のPROポリペプチドをコードするDNA、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROポリペプチドの細胞内発現を指示する。分泌のために、PROポリペプチドをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーターをコードするDNA、酵母菌アルファ因子分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PROポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0538】
実施例103:バキュロウイルス感染昆虫細胞でのPROポリペプチドの発現
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中におけるPROポリペプチドの組換え発現を記載する。
所望のPROポリペプチドを、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ−hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Navogen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PROポリペプチド又はPROポリペプチドの所定部分(膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など)が、5’ 及び3’ 領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅される。5’ プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生産物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGold(商品名)ウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO−BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4から5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O’Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施する。
次に、発現されたポリ−hisタグPROポリペプチドは、例えばNi2+−キレートアフィニティクロマトグラフィーにより次のように精製される。抽出は、Rupert等, Nature, 362:175−179 (1993)に記載されているように、ウイルス感染した組み換えSf9細胞から調製した。簡単には、Sf9細胞を洗浄し、超音波処理用バッファー(25mLのHepes、pH7.9;12.5mMのMgCl2;0.1mM EDTA;10%グリセロール;0.1%のNP−40;0.4MのKCl)中に再懸濁し、氷上で2回20秒間超音波処理した。超音波処理物を遠心分離で透明化し、上清を負荷バッファー(50mMリン酸塩、300mMのNaCl、10%グリセロール、pH7.8)で50倍希釈し、0.45μmフィルターで濾過した。Ni2+−NTAアガロースカラム(Qiagenから市販)を5mLの総容積で調製し、25mLの水で洗浄し、25mLの負荷バッファーで平衡させる。濾過した細胞抽出物は、毎分0.5mLでカラムに負荷する。カラムを、分画回収が始まる点であるA280のベースラインまで負荷バッファーで洗浄する。次に、カラムを、結合タンパク質を非特異的に溶離する二次洗浄バッファー(50mMリン酸塩;300mMのNaCl、10%グリセロール、pH6.0)で洗浄する。A280のベースラインに再度到達した後、カラムを二次洗浄バッファー中で0から500mMイミダゾール勾配で展開した。1mLの分画を回収し、SDS−PAGE及び銀染色又はアルカリホスファターゼ(Qiagen)に複合したNi2+−NTAでのウェスタンブロットで分析する。溶離したHis10−タグPROポリペプチドを含む画分をプールして負荷バッファーで透析する。
あるいは、IgGタグ(又はFcタグ)PROポリペプチドの精製は、例えば、プロテインA又はプロテインGカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技術を用いて実施できる。
【0539】
PRO195、PRO526、PRO540、PRO846、PRO362、PRO363、PRO700、PRO707、PRO322、PRO719、PRO1083、PRO868、PRO866、PRO768、PRO788、PRO938、PRO827、及びPRO1031は、バキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞で成功裏に発現された。発現は、実際には0.5−2Lスケールで実施したが、より大きな(例えば8L)での調製に容易にスケールアップできる。タンパク質は、対応するタンパク質の可溶化形態及び/又はポリ−Hisタグ形態のコード化配列(例えば、細胞外ドメイン)がIgG1のヒンジ、CH2及びCH3ドメインを含む定常領域配列に融合したIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現された。
バキュロウイルス感染Sf9細胞での発現のために、PCR増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター(IgG融合物に対するpb.PH.IgG及びポリHisタグに対するPH.His.c)にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルスDNA(Pharmingen)を105スポドプテラグルヒペルダ(Spodoptera frugiperda)(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)にリポフェクチン(Gibco BRL)を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.cは、市販のバキュロウイルス発現ベクターpV1393(Pharmingen)の修飾物であり、His又はFcタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のFBS(Hyclone)を添加したHinkのTNM−FM培地で成長させた。細胞は、28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%FBSを添加したHinkのTNM−FH培地におけるSf9細胞感染による約10の感染効率(MOI)での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を28℃で3日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi−NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定した。
第1の増幅上清をESF−92培地(Expression System LLC)で成長させたSf9細胞のスピナー培地(500ml)の約0.1のMOIでの感染に使用した。細胞は28℃で3日間インキュベートした。上清を回収して濾過した。バッチ結合及びSDS−PAGEを、スピナー培地の発現が確認されるまで、必要に応じて繰り返した。
形質移入細胞からの条件培地(0.5〜3L)を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ−Hisタグ作成物については、タンパク質作成物をNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。均一性はSDSポリアクリルアミドゲル(PEG)電気泳動で試験し、エドマン(Edman)分解によりN−末端アミノ酸配列決定した。
PRO181、PRO195、PRO200、PRO320、PRO237、PRO273、PRO285、PRO337、PRO526、PRO540、PRO846、PRO362、PRO363、PRO617、PRO322、PRO1083、PRO868、768、PRO792、PRO788、PRO162、PRO1114、PRO827、PRO1075、及びPRO1031はバキュロウイルス感染Hi5昆虫細胞において成功裏に発現された。発現は、実際には0.5−2Lスケールで実施したが、より大きな(例えば8L)での調製に容易にスケールアップできる。
【0540】
バキュロウイルス感染Hi5細胞における発現について、PROポリペプチドコード化DNAは、Pfu(Stratagene)等の適当な系で増幅されても、又はバキュロウイルス発現ベクターの含まれるエピトープタグの上流(5’−)に融合させてもよい。このようなエピトープタグは、ポリ−Hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域等)を含む。種々のプラスミドを用いることができ、pVL1393(Novagen)等の市販のプラスミドから誘導されたプラスミドを含む。簡単には、PROポリペプチド又はPROポリペプチドの所望の部分(膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列など)を、5’ 及び3’ 領域に相補的なプライマーでのPCRにより増幅する。5’ プライマーは隣接する(選択された)制限酵素部位を導入してもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化して発現ベクターにサブクローニングされる。例えば、pVL1393の誘導体はヒトIgG(pb.PH.IgG)のFc領域又はNAME配列の8ヒスチジン(pb.PH.His)タグ下流(3’−)を含むことができる。
Hi5細胞は、27℃、CO2無し、ペン/ストレプト無しの条件下で50%の集密度まで成長させた。150mmプレート各々について、30μgのPROポリペプチドを含むpIEベースベクターを1mlのEx−細胞培地(媒質:Ex−細胞401+1/100のL−Glu JRH Bioscience #14401−78P(注:この媒質は軽感受性))と混合し、別の管において、100μlのセルフェクチン(CellFECTIN(Gibco BRL #10362−010)(ボルテックスで混合))を1mlのEx−細胞培地と混合する。2つの溶液を混合し、室温で15分間インキュベーションした。8mlのEx−細胞培地を2mlのDNA/セルフェクチン混合物に添加し、Ex−細胞培地で1回洗浄したHi5細胞上に層形成さる。次いでプレートを暗中室温でインキュベートする。次いでDNA/セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をEx−細胞で1回戦乗して過剰のセルフェクチンを除去する。30mlの新鮮なEx−細胞培地を添加し、細胞を28℃で3日間インキュベートする。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベクターでのPROポリペプチドの発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi−NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL−4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定できる。
形質移入細胞からの条件培地(0.5〜3L)を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収する。ポリ−Hisタグ作成物については、タンパク質作成物をNi−NTAカラム(Qiagen)を用いて精製する。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加する。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi−NTAカラムに4−5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給する。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離する。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵する。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製する。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷する。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離する。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化する。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ−Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩する。PROポリペプチドの均一性はSDSポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるN−末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
ここにおいて開示された多くのPROポリペプチドが、上記に示したように成功裏に発現された。
【0541】
実施例104:PROポリペプチドに結合する抗体の調製
この実施例は、PROポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、Goding,上掲に記載されている。用いられ得る免疫原は、精製PROポリペプチド、PROポリペプチドを含む融合タンパク質、細胞表面に組換えPROポリペプチドを発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1−100マイクログラムで注入したPROポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗−PROポリペプチド抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血からの血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「陽性」な動物に、PROポリペプチド静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺し、脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫株化細胞に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン)培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PROポリペプチドに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体を分泌する「陽性」ハイブリドーマ細胞の決定は、技術常識の範囲内である。
陽性ハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗−PROポリペプチドモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
【0542】
実施例105:キメラPROポリペプチド
PROポリペプチドは、タンパク質精製を促進するための一又は複数の付加的ポリペプチドドメインを持つキメラタンパク質として発現させてもよい。このような精製促進ドメインは、これらに限られないが、固定化金属での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール等の金属キレート形成ペプチド、固定化免疫グロブリンでの精製を可能にするプロテインAドメイン、及びFLAGS(商品名)伸展/親和性精製系(Immunex Corp., Seattle, Wash.)で利用されるドメインを含む。精製ドメイン及びPROポリペプチド配列の間に因子XA又はエンテロキナーゼ(Invitrogen, San Diego Calif.)等の切断可能なリンカー配列を含むことは、PROポリペプチドをコードするDNAの発現促進に有用であろう。
【0543】
実施例106:特異的抗体を用いたPROポリペプチドの精製
天然又は組換えPROポリペプチドは、この分野の種々の標準的なタンパク質精製方法によって精製できる。例えば、プロPROポリペプチド、成熟ポリペプチド、又はプレPROポリペプチドは、対象とするPROポリペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性クロマトグラフィーによって精製される。一般に、免疫親和性カラムは抗−PROポリペプチド抗体を活性化クロマトグラフィー樹脂に共有結合させて作成される。
ポリクローナル免疫グロブリンは、硫酸アンモニウムでの沈殿又は固定化プロテインA(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.)での精製のいずれかにより免疫血清から調製される。同様に、モノクローナル抗体は、硫酸アンモニウム沈殿又は固定化プロテインAでのクロマトグラフィーによりマウス腹水液から調製される。部分的に精製された免疫グロブリンは、CnBr−活性化セファロース(商品名)(Pharmacia LKB Biotechnology)等のクロマトグラフィー樹脂に共有結合される。抗体が樹脂に結合され、樹脂がブロックされ、誘導体樹脂は製造者の指示に従って洗浄される。
このような免疫親和性カラムは、可溶化形態のPROポリペプチドを含有する細胞からの画分を調製することによるPROポリペプチドの精製において利用される。この調製物は、洗浄剤の添加又はこの分野で公知の方法により微分遠心分離を介して得られる全細胞又は細胞成分画分の可溶化により誘導される。あるいは、シグナル配列を含む可溶化PROポリペプチドは、細胞が成長する培地中に油様な量で分泌される。
可溶化PROポリペプチド含有調製物は、免疫親和性カラムを通され、カラムはPROポリペプチドの好ましい吸着をさせる条件下(例えば、洗浄剤存在下の高イオン強度バッファー)で洗浄される。次いで、カラムは、抗体/PROポリペプチド結合を分解する条件下(例えば、約2−3といった低pH、高濃度の尿素又はチオシアン酸イオン等のカオトロープ)で溶離され、PROポリペプチドが回収される。
【0544】
実施例107:薬剤スクリーニング
本発明は、PROポリペプチド又はその結合断片を種々の薬剤スクリーニング技術において使用することによる化合物のスクリーニングに特に有用である。そのような刺権威用いられるPROポリペプチド又は断片は、溶液中の自由状態でも、固体支持体に固定されても、細胞表面に位置しても、細胞内に局在化していてもよい。薬剤スクリーニングの1つの方法は、PROポリペプチド又は断片を発現する組換え核酸で安定に形質移入される真核生物又は原核生物宿主細胞を利用する。薬剤は、そのような形質移入細胞に対して、競合的結合アッセイにおいてスクリーニングされる。そのような細胞は、生存可能又は固定化形態のいずれかにおいて、標準的な結合アッセイに使用できる。例えば、PROポリペプチド又は断片と試験される試薬の間での複合体形成を測定してよい。あるいは、試験する試薬によって生ずるPROポリペプチドとその標的細胞との間の複合体形成における減少を試験する事もできる。
即ち本発明は、PROポリペプチド関連疾患又は障害に影響を与えうる薬剤又は任意の他の試薬のスクリーニング方法を提供する。これらの方法は、その試薬をPROポリペプチド又は断片に接触させ、(i)試薬とPROポリペプチド又は断片との間の複合体の存在について、又は(ii)PROポリペプチド又は断片と細胞との間の複合体の存在について検定することを含む。これらの競合結合アッセイでは、PROポリペプチド又は断片が典型的には標識される。適切なインキュベーションの後、フリーのPROポリペプチド又は断片を結合形態のものから分離し、フリー又は未複合の標識の量が、特定の試薬がPROポリペプチドに結合する又はPROポリペプチド/細胞複合体を阻害する能力の尺度となる。
薬剤スクリーニングのための他の技術は、ポリペプチドに対して適当な結合親和性を持つ化合物についての高スループットスクリーニングを提供し、1984年9月13日に発行されたWO 84/03564に詳細に記載されている。簡単に述べれば、多数の異なる小型ペプチド試験化合物が、プラスチックピン等の固体支持体又は幾つかの他の表面上で合成される。PROポリペプチドに適用すると、ペプチド試験化合物はPROポリペプチドと反応して洗浄される。結合したPROポリペプチドはこの分野で良く知られた方法により検出される。精製したPROポリペプチドは、上記の薬剤スクリーニング技術に使用するためにプレート上に直接被覆することもできる。さらに、非中和抗体は、ペプチドを捕捉し、それを固体支持体上に固定化するのに使用できる。
また、本発明は、PROポリペプチドに結合可能な中和抗体が、PROポリペプチド又はその断片について試験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも考慮する。この方法において、抗体は、PROポリペプチドで、一又は複数の抗原決定基を持つ任意のペプチドの存在を検出するのに使用できる。
【0545】
実施例108:合理的薬剤設計
合理的薬剤設計の目的は、対象とする生物学的活性ポリペプチド(例えば、PROポリペプチド)又はそれらが相互作用する小分子、例えばアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターの構造的類似物を製造することである。これらの例は、PROポリペプチドのより活性で安定な形態又はインビボでPROポリペプチドに機能を促進又は阻害する薬剤の創作に使用できる(参考、Hodgson, Bio/Technology, 9: 19−21 (1991))。
1つの方法において、PROポリペプチド、又はPRO−インヒビター複合体の三次元構造が、x線結晶学により、コンピュータモデル化により、最も典型的には2つの方法の組み合わせにより決定する。分子の構造を解明し活性部位を決定するためには、PROポリペプチドの形状及び電荷の両方が確認されなければならない。数は少ないが、PROポリペプチドの構造に関する有用な情報が相同タンパク質の構造に基づいたモデル化によって得られることもある。両方の場合において、関連する構造情報は、類似PROポリペプチド様分子の設計又は行こうなインヒビターの同定に使用される。合理的な薬剤設計の有用な例は、Braxton及びWells, Biochemistry, 31: 7796−7801 (1992)に示されているような向上した活性又は安定性を持つ分子、又はAthauda等, J. Biochem., 113: 742−746 (1993)に示されているような天然ペプチドのインヒビター、アゴニスト、又はアンタゴニストとして作用する分子を含む。
また、上記のような機能アッセイによって選択された標的特異的な抗体を単離しその決せよう構造を解明することもできる。この方法は、原理的には、それに続く薬剤設計が基礎をおくことのできるファーマコア(pharmacore)を生成する。機能的な薬理学的に活性な抗体に対する抗−イディオタイプ抗体(抗−ids)を生成することにより、タンパク質結晶学をバイパスすることができる。鏡像の鏡像として、抗−idsの結合部位は最初のレセプターの類似物であると予測できる。抗−idsは、次いで、化学的又は生物学的に製造したペプチドのバンクからペプチドを同定及び単離するのに使用できる。単離されたペプチドは、ファーマコアとして機能するであろう。
本発明により、十分な量のPROポリペプチドがX線結晶学などの分析実験を実施するために入手可能である。さらに、ここに提供したPROポリペプチドアミノ酸配列の知識は、X線結晶学に換える、又はそれに加えるコンピュータモデル化技術で用いられる知識を提供する。
【0546】
実施例109:血管内皮成長因子(VEGF)刺激の内皮細胞成長の増殖を阻害するPROポリペプチドの能力(アッセイ9)
VEGFに刺激された内皮細胞の増殖を阻害する種々のPROポリペプチドの能力を試験した。このアッセイにおいてポリペプチド試験がポジティブであると哺乳類の内皮細胞の阻害に有用であり、このような効果は、例えば腫瘍成長の阻害する等の恩恵となる。
特に、ウシ副腎皮質性毛細管内皮(ACE)細胞(一次培地から、最大12−14継代)を96−ウェルの100マイクロタイタープレートに500細胞/ウェルで蒔いた。アッセイ用培地は、低グルコースDMEM、10%のウシ血清、2mMのグルタミン、1xペニシリン/ストレプトマイシン/フンギゾンを含有する。対照ウェルは次のものを含む:(1)ACE細胞を添加しないもの;(2)ACE細胞単独;(3)ACE細胞プラス5ng/mlのFGF;(4)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGF;(5)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス1ng/mlのTGF−ベータ;及び(6)ACE細胞プラス3ng/mlのVEGFプラス5ng/mlのLIF。ついで、試験用試料であるポリ−hisタグPROポリペプチド(100マイクロタイター容量中)をウェル(それぞれ1%、0.1%及び0.001%に希釈)の添加した。細胞を37℃/5%のCO2で6−7日インキュベートした。インキュベート後、ウェルの培地を吸引し、細胞を1xPBSで洗浄した。酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロタイター、0.1Mの酢酸ナトリウム、pH5.5、0.1%のトリトンX−100、10mMのp−ニトロフェニルホスフェート)を各ウェルに添加した。37℃で2時間インキュベートした後、10マイクロタイターの1NのNaOHの添加で反応を停止した。光学密度(OD)をマイクロプレートリーダーで405nmにおいて測定した。
PROポリペプチドの活性を、刺激無しの細胞に対するVEGF(3ng/ml)刺激増殖のパーセント阻害(OD405nmにおける酸ホスファターゼ活性を測定することにより決定)として算出した。TGF−ベータはVEGF刺激ACE細胞増殖を70−90%阻止するので、1ng/mlで活性参照として使用した。結果は、PROポリペプチドの癌治療、特に腫瘍新脈管形成の阻害における有用性を示している。数値(相対阻害度)は刺激なし細胞に対するPROポリペプチドによるVEGF刺激増殖のパーセント阻害を算出し、ついで1ng/ml濃度でのTGF−βが、VEGF刺激細胞増殖を70−90%阻止することが知られていることで得られたパーセント阻害をパーセンテージに除することで決定される。結果は、PROポリペプチドが内皮細胞成長のVEGF刺激を30%又はそれ以上(相対阻害度30%又はそれ以上)を阻害したときにポジティブと考える。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイにおいてポジティブであった:PRO200、PRO322及びPRO320。
【0547】
実施例110:網膜ニューロン生存(アッセイ52)
この実施例は種々のPROポリペプチドが網膜ニューロン細胞の生存の促進において有効性を有することを示し、それ故に、例えば網膜色素変性症、AMD等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠7日のSDラット胎児(混合集団:グリア及び網膜ニューロン型)をCO2麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮から切除し、他の眼組織をCa2+、Mg2+無しのPBS中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を37℃で7−10分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、N2を添加し、特異的な試験PROポリペプチド有り又は無しのDMEM/F12中、96−ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%CO2の水飽和雰囲気下、37℃で成長させた。培地中で2−3日後に細胞をカルセインAMで染色し、次いで4%のパラホルムアルデヒドで固定し、全細胞カウントの測定のためにDAPIで染色した。全細胞(蛍光)は、CCDカメラ及びMacIntosh用NIH画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
種々の濃度のPROポリペプチドの効果は、培地中2−3日でのカルセインAMポジティブ細胞の合計数を、培地中2−3日のDAPI標識細胞の合計数で除することにより計算した。30%を越える生存をポジティブと考える。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイで0.01%−1.0%の範囲のポリペプチド濃度の使用でポジティブであった:PRO200、PRO322、PRO540、PRO846及びPRO617。
【0548】
実施例111:杆状体光受容体細胞の生存(アッセイ56)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが杆状体光受容体細胞の生存/増殖を高めるように作用し、よって、例えば色素性網膜炎、AMD等による哺乳類の視力喪失の治療を含む網膜疾患又は損傷の治療的処置に有用であることを示す。
妊娠7日のSprague Dawleyラット胎児(混合集団:グリア及び網膜ニューロン細胞型)をCO2麻酔に続いて断頭により屠殺し、無菌条件下で眼を取り出した。神経網膜を色素上皮及び他の眼組織から切除し、ついでCa2+、Mg2+無しのPBS中の0.25%トリプシンを用いて単細胞懸濁物中に解離させた。網膜を37℃で7−10分間インキュベートし、その後1mlのダイズトリプシンインヒビターを添加することによりトリプシンを不活性化した。細胞を、N2を添加したDMEM/F12中、96−ウェルプレートにウェル当たり100,000細胞で蒔いた。全ての実験について、細胞は5%CO2の水飽和雰囲気下、37℃で成長させた。培地中で2−3日後に細胞を4%のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでセルトラッカーグリーンCMFDA染色した。Rho 4D2(腹水又はIgG1:100)、可視色素ロドプシンに対するモノクローナル抗体を、間接的免疫蛍光法による杆状体光受容体の検出に使用した。結果は%生存:培地中2−3日のカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数を、培地中2−3日でのカルセイン−ロドプシンポジティブ細胞の全数で除するものとして計算する。全細胞(蛍光)は、CCDカメラ及びMacIntosh用NIH画像ソフトウェアを用いて20X対物倍率で定量化した。ウェルの視野は無作為に選択した。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO322、PRO540、PRO846及びPRO617。
【0549】
実施例112:軟骨からのプロテオグリカン放出を刺激するPROポリペプチドの能力(アッセイ97)
PROポリペプチドが軟骨組織からプロテオグリカンの放出を刺激する能力を以下のようにして試験した。
4−6月齢のブタの手指節関節を無菌で切除し、関節軟骨を下の骨を注意深く避けたフリーハンドスライスによって取り除いた。軟骨を細かく切り刻み、0.1%BSA及び100U/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを添加した無血清(SF)培地(DME/F12 1:1)中、95%空気、5%CO2雰囲気においてバルクで24時間培養した。3回洗浄した後、約100mgの関節軟骨をミクロニクス(micronics)管に分け、上記SF培地中でさらに24時間インキュベートした。次いで、PRO241ポリペプチドの1%を、単独あるいは公知の軟骨組織からのプロテオグリカン放出刺激剤であるインターロイキン−1αの18ng/mlとともに添加した。次いで上清を回収し、1,9−ジメチル−メチレンブルー(DMB)比色アッセイ(FarndaleおよびButtle, Biochem. Biophys. Acta 883: 173−177 (1985))を用いてプロテオグリカンの量を検定した。このアッセイにおけるポジティブな結果は、試験ポリペプチドが、例えば、運動関連関節問題である関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療での使用が見出されることを示す。
上記のアッセイで種々のPROポリペプチドを試験したとき、このポリペプチドは、根本的におよびインターロイキン−1αでの刺激後および処理後24および72時間に軟骨組織からのプロテオグリカン放出を刺激する顕著な能力を示し、従って、PROポリペプチドは軟骨組織からのプロテオグリカンの放出刺激に有用であるをこと示している。このように、PROポリペプチドは運動関連関節問題である関節軟骨障害、変形性関節症又は慢性関節リウマチの治療に有用である。このアッセイでポジティブであったポリペプチドは:PRO200。
【0550】
実施例113:インビトロ抗増殖性アッセイ(アッセイ161)
種々のPROポリペプチドの抗増殖活性を、本質的にSkehan等, J. Natl. Cancer Inst. 82: 1107−1112 (1990)に記載されたスルホローダミンB(SRB)染料結合アッセイを用いる国立癌研究所(NCI)の実験的、疾患指向的インビトロ抗癌薬発見アッセイにおいて測定した。このアッセイで用いた60の腫瘍細胞系(「NCIパネル」)、並びにそれらの維持およびインビトロ培養の条件は、Monks等, J. Natl. Cancer Inst. 83: 757−766 (1991)に記載されている。このスクリーニングの目的は、異なる型の腫瘍に対する試験化合物の細胞毒性及び/又は細胞分裂停止活性を最初に評価することである(Monks等, 上掲; Boyd, Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update 3(10): 1−12[1989])。
約60のヒト腫瘍細胞系からの細胞をトリプシン/EDTA(Gibco)で回収し、1回洗浄し、IMEM中に再懸濁し、それらの生存を測定した。細胞懸濁物をピペット(100μL容量)で別の96−ウェルマイクロタイタープレートに添加した。6日インキュベーションの細胞密度は2日インキュベーションより小さく過剰成長は防止された。播種後、安定化のために37℃で24時間プレインキュベーションした。目的とする試験濃度の2倍希釈をゼロ時に100μlのアリコートにマイクロタイタープレートウェルに添加した(1:2希釈)。試験化合物を2分の5log希釈(1000〜100,000倍)で評価した。インキュベーションは5%CO2雰囲気および100%湿度で2日および6日実施した。
インキュベーション後、培地を除去し、細胞を10%トリクロロ酢酸の0.1mlで40℃において固定した。プレートを脱イオン水で5回洗浄し、乾燥させ、1%酢酸に溶解した0.4%スルホローダミンB染料(Sigma)の0.1mlで30分間染色し、1%酢酸で4回洗浄して非結合染料を除去し、乾燥させ、染色物を10mMトリス塩基[トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン], pH10.5の0.1mlで5分間抽出した。スルホローダミンBの492nmにおける吸収(OD)を、コンピュータ接続96−ウェルマイクロタイタープレートリーダーを使用して測定した。
試験試料は、一又は複数の濃度で少なくとも50%の成長阻害を示すときにポジティブと考える。このアッセイにおいてポジティブを示したPROポリペプチドは、表7に示されており、略語は以下の通りである:
NSCL=非小細胞肺癌腫
CNS=中枢神経系
【0551】
これらのアッセイの結果には、PROポリペプチドが多くの異なる細胞系の新生物成長の阻害に有用であり、治療的に使用できることが示されている。PROポリペプチドに対する抗体は、これらの有用なポリペプチドのアフィニティ精製に有用である。PROポリペプチドをコードする核酸はこれらのポリペプチドの組換え調製に有用である。
【0552】
実施例114:腫瘍の遺伝子増幅
この実施例は、種々のPROポリペプチドをコードする遺伝子が或る種のヒト癌のゲノムで増幅されることを示す。増幅は遺伝子産物の過剰発現を伴い、PROポリペプチドが結腸、肺及び他の癌等の或る種の癌において治療的介入の有用な標的であることを示している。治療薬はPROポリペプチドコード化遺伝子のアンタゴニスト、例えばマウス−ヒトキメラ、PROポリペプチドに対するヒト化又はヒト抗体の形態をとりうる。
スクリーニングの出発物質は種々の癌から単離したゲノムDNAである。DNAは、定量的、例えば蛍光定量的に正確である。ネガティブ対照として、DNAを10の正常健常個体からDNAを単離し、それをプールして健常個体における遺伝子コピーのアッセイ対照として使用した(示さず)。5’ ヌクレアーゼアッセイ(例えばTaqMan(商品名))及び実時間定量的PCR(例えば、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System(商品名)(Perkin Elmer, applied Biosystems Division, Foster City, CA))を、或る種の癌で潜在的に増幅される遺伝子の発見に使用した。結果は、PROポリペプチドがスクリーニングした肺及び結腸癌において過剰発現されたか否かの決定に用いた。原発性肺癌は、表8に示してあるように、個々の腫瘍の型及び段階から得た。表8の原発性腫瘍の命名に用いた省略形の説明及び本実施例を通して言及されている原発性腫瘍と細胞株は、下記に示されている。
TaqMan(商品名)の結果はデルタCT単位で報告した。1単位は1PCRサイクル又は正常に対して約2倍の増幅に相当し、2単位は4倍、3単位は8倍等々に相当する。定量化はプライマー及びPROポリペプチドコード化遺伝子から誘導したTaqMan(商品名)蛍光を用いて得た。最も独特の核酸配列を含むと思われ、スプライシングされたイントロンを最も持たないと思われるPROポリペプチドの領域、例えば3’ −非翻訳領域がプライマー誘導に好ましい。PROポリペプチドの遺伝子増幅分析に使用されたプライマー及びプローブ(正、逆及びプローブ)のための配列は、以下の通りであった:
【0553】
PRO853(DNA48227−1350)
48227.tm.f1
5’−GGCACTTCATGGTCCTTGAAA−3’ (配列番号:539)
48227.tm.p1
5’−CGGATGTGTGTGAGGCCATGCC−3’(配列番号:540)
48227.tm.r1
5’−GAAAGTAACCACGGAGGTCAAGAT−3’(配列番号:541)
PRO1017(DNA56112−1379):
56112.tm.f1
5’−CCTCCTCCGAGACTGAAAGCT−3’(配列番号:542)
56112.tm.p1
5’−TCGCGTTGCTTTTTCTCGCGTG−3’(配列番号:543)
56112.tm.r1
5’−GCGTGCGTCAGGTTCCA−3’(配列番号:544)
PRO213−1(DNA30943−1163−1):
30943.tm.f3:
5’−CGTTCGTGCAGCGTGTGTA−3’(配列番号:545)
30943.tm.p3:
5’−CTTCCTCACCACCTGCGACGGG−3’(配列番号:546)
30943.tm.r3:
5’−GGTAGGCGGTCCTATAGATGGTT−3’(配列番号:547)
30943.tm.f1:
5’−AGATGTGGATGAATGCAGTGCTA−3’(配列番号:548)
30943.tm.p1:
5’−ATCAACACCGCCGGCAGTTACTGG−3’(配列番号:549)
30943.tm.r1:
5’−ACAGAGTGTACCGTCTGCAGACA−3’(配列番号:550)
30943.3trn−5:
5’−AGCCTCCTGGTGCACTCCT−3’(配列番号:551)
30943.3trn−probe:
5’−CGACTCCCTGAGCGAGCAGATTTCC−3’(配列番号:552)
30943.3trn−3:
5’−GCTGGGCAGTCACGAGTCTT−3’(配列番号:553)
PRO237(DNA34353−1428):
34353.tm.f:
5’−AATCCTCCATCTCAGATCTTCCAG−3’(配列番号:554)
34353.tm.p:
5’−CCTCAGCGGTAACAGCCGGCC−3’(配列番号:555)
34353.tm.r:
5’−TGGGCCAAGGGCTGC−3’(配列番号:556)
PRO324(DNA36343−1310):
36343.tmf1:
5’−TGGTGGATAACCAACAAGATGG−3’(配列番号:557)
36343.tmp1:
5’−GAGTCTGCATCCACACCACTCTTAAAGTTCTCAA−3’ (配列番号:558)
36343.tmr1:
5’−CAGGTGCTCTTTTCAGTCATGTTT−3’(配列番号:559)
PRO351(DNA40571−1315):
40571.tm.f1:
5’−TGGCCATTCTCAGGACAAGAG−3’(配列番号:560)
40571.tm.p1:
5’−CAGTAATGCCATTTGCCTGCCTGCAT−3’(配列番号:561)
40571.tm.r1:
5’−TGCCTGGAATCACATGACA−3’ (配列番号:562)
PRO362(DNA45416−1251):
45416.tm.f1:
5’−TGTGGCACAGACCCAATCCT−3’ (配列番号:563)
45416.tm.p1:
5’−GACCCTGAAGGCCTCCGGCCT−3’(配列番号:564)
45416.tm.r1:
5’−GAGAGAGGGAAGGCAGCTATGTC−3’(配列番号:565)
PRO615(DNA48304−1323):
48304.tm.f1:
5’−CAGCCCCTCTCTTTCACCTGT−3’(配列番号:566)
48304.tm.p1:
5’−CCATCCTGTGCAGCTGACACACAGC−3’(配列番号:567)
48304.tm.r1:
5’−GCCAGGCTATGAGGCTCCTT−3’ (配列番号:568)
PRO531(DNA48314−1320):
48314.tm.f1:
5’−TTCAAGTTCCTGAAGCCGATTAT−3’(配列番号:569)
48814.tm.p1:
5’−CCAACTTCCCTCCCCAGTGCCCT−3’(配列番号:570)
48814.tm.r1:
5’−TTGGGGAAGGTAGAATTTCCTTGTAT−3’(配列番号:571)
PRO618(DNA49152−1324):
49152.tm.f1:
5’−CCCTTCTGCCTCCCAATTCT−3’(配列番号:572)
49152.tm.p1:
5’−TCTCCTCCGTCCCCTTCCTCCACT−3’(配列番号:573)
49152.tm.r1:
5’−TGAGCCACTGCCTTGCATTA−3’(配列番号:574)
PRO772(DNA49645−1347):
49645.tm.f2:
5’−TCTGCAGACGCGATGGATAA−3’ (配列番号:575)
49645.tm.p2:
5’−CCGAAAATAAAACATCGCCCCTTCTTCTGC−3’ (配列番号:576)
49645.tm.r2:
5’−CACGTGGCCTTTCACACTGA−3’(配列番号:577)
49645.tm.f1:
5’−ACTTGTGACAGCAGTATGCTGTCTT−3’ (配列番号:578)
49645.tm.p1:
5’−AAGCTTCTGTTCAATCCCAGCGGTCC−3’(配列番号:579)
49645.tm.r1:
5’−ATGCACAGGTTTTTCTGGTAA−3’(配列番号:580)
PRO703(DNA50913−1287):
50913.tm.f1:
5’−GCAGGAAACCTTCGAATCTGAG−3’(配列番号:581)
50913.tm.p1:
5’−ACACCTGAGGCACCTGAGAGAGGAACTCT−3’ (配列番号:582)
50913.tm.r1:
5’−GACAGCCCAGTACACCTGCAA−3’(配列番号:583)
PRO792(DNA56352−1358):
56352.tm.f1:
5’−GACGGCTGGATCTGTGAGAAA−3’(配列番号:584)
56352.tm.p1:
5’−CACAACTGCTGACCCCGCCCA−3’(配列番号:585)
56352.tm.r1.
5’−CCAGGATACGACATGCTGCAA−3’(配列番号:586)
PRO474(DNA56045−1380):
56045.tm.f1:
5’−AAACTCCAACCTGTATCAGATGCA−3’(配列番号:587)
56045.tm.p1:
5’−CCCCCAAGCCCTTAGACTCTAAGCCC−3’ (配列番号:588)
56045.tm.r1:
5’−GACCCGGCACCTTGCTAAC−3’ (配列番号:589)
PRO274(DNA39987−1184):
39987.tm.f:
5’−GGACGGTCAGTCAGGATGACA−3’ (配列番号:590)
39987.tm.p:
5’−TTCGGCATCATCATCTCTTCCCTCTCCC−3’ (配列番号:591)
39987.tm.r:
5’−ACAAAAAAAAGGGAACAAAATACGA−3’(配列番号:592)
PRO381(DNA44194−1317):
44194.tm.f:
5’−CTTTGAATAGAAGACTTCTGGACAATTT−3’ (配列番号:593)
44194.tm.p:
5’−TTGCAACTGGGAATATACCACGACATGAGA−3’ (配列番号:594)
44194.tm.r:
5’−TAGGGTGCTAATTTGTGCTATAACCT−3’ (配列番号:595)
44194.tm.f2:
5’−GGCTCTGAGTCTCTGCTTGA−3’(配列番号:596)
44194.tm.p2:
5’−TCCAACAACCATTTTCCTCTGGTCC−3’(配列番号:597)
44194.tm.r2:
5’−AAGCAGTAGCCATTAACAAGTCA−3’ (配列番号:598)
PRO717(DNA50988−1326):
50988.tm.f3:
5’−CAAGCGTCCAGGTTTATTGA−3’(配列番号:599)
50988.tm.r3:
5’−GACTACAAGGCGCTCAGCTA−3’(配列番号:600)
50988.tm.p3:
5’−CCGGCTGGGTCTCACTCCTCC−3’(配列番号:601)
PRO1330及びPRO1449(各々、DNA64907−1163及びDNA64908−1163):
30943.tm.f3:
5’−CGTTCGTGCAGCGTGTGTA−3’(配列番号:602)
30943.tm.p3:
5’−CTTCCTCACCACCTGCGACGGG−3’(配列番号:603)
30943.tm.r3:
5’−GGTAGGCGGTCCTATAGATGGTT−3’(配列番号:604)
30943.tm.f1:
5’−AGATGTGGATGAATGCAGTGCTA−3’(配列番号:605)
30943.tm.p1:
5’−ATCAACACCGCCGGCAGTTACTGG−3’(配列番号:606)
30943.tm.r1:
5’−ACAGAGTGTACCGTCTGCAGACA−3’(配列番号:607)
30943.3trn−5:
5’−AGCCTCCTGGTGCACTCCT−3’(配列番号:608)
30943.3trn−probe:
5’−CGACTCCCTGAGCGAGCAGATTTCC−3’(配列番号:609)
30943.3trn−3:
5’−GCTGGGCAGTCACGAGTCTT−3’(配列番号:610)
【0554】
5’ ヌクレアーゼアッセイ反応は蛍光PCRベースの技術であり、実時間での増幅監視のためのTaqDNAポリメラーゼ酵素の5’ エキソヌクレアーゼ活性を使用する。PCR反応に典型的な単位複製配列の生成に2つのオリゴヌクレオチドプライマー(正[.f]及び逆[.r])を使用した。第3のオリゴヌクレオチド、又はプローブ(.p)は、2つのPCRプライマーの間に位置する核酸配列を検出するために設計された。プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素により非伸展性であり、レポーター蛍光染料及び消光剤蛍光染料で標識される。2つの染料がプローブ上に接近して位置する場合、レポーター染料からのレーザー誘導発光は消光染料によって消光される。増幅反応の間、プローブはTaqDNAポリメラーゼ酵素によりテンプレート依存的方式で切断される。得られたプローブ断片は溶液中に解離し、放出されたレポーター染料からのシグナルは第2のフルオロホアからの消光効果を受けない。レポーター染料の一分子は、新たに合成された各分子について標識され、非消光レポーター染料の検出がデータの定量的解釈の基礎を提供する。
5’ ヌクレアーゼ法は、ABI Prism 7700TM配列検出などの実時間定量的PCR装置で実施される。系は温度サイクル器、レーザー、電荷結合装置(CCD)カメラ及びコンピュータからなる。系は温度サイクル器上で96−ウェルでの試料を増幅させる。増幅中に、レーザー誘導蛍光シグナルは光ファイバーケーブルで96ウェルに集められ、CCDで検出される。系は装置の実行及びデータの分析のためのソフトウェアを含む。
5’ ヌクレアーゼアッセイデータは、最初はCt又は境界サイクルで表現される。これは、レポーターシグナルが蛍光のバックグラウンドを越えて蓄積されるサイクルとして定義される。癌DNAの結果と正常ヒトDNAの結果を比較する場合、Ct値は核酸試料における特定の標的配列の種発コピー相対数の定量的尺度として使用しされる。
表8は、本発明のPROポリペプチド化合物のスクリーニングに用いられた種々の原発腫瘍のT段階及びN段階を示す。
【0555】
【0556】
DNA調製:
DNAは培養した細胞系、一次腫瘍、正常ヒト血液から調製した。単離は、全てQuiagenからの、精製キット、バッファーセット及びプロテアーゼを用い、製造者の指示と下記に従って実施した。
細胞培養溶解:
細胞を洗浄し、チップ当たり7.5x108の濃度でトリプシン化し、4℃で5分間1000rpmで遠心分離してペレット化し、次いで1/2容量のPBS再遠心で洗浄した。ペレットを3回洗浄し、懸濁細胞を回収して2xPBSで洗浄した。次いで細胞を10mLのPBSに懸濁させた。バッファーC1を4℃で平衡化させた。Quiagenプロテアーゼ#19155を6.25mlの冷ddH2Oで最終濃度20mg/mlまで希釈して4℃で平衡化させた。10mLのG2バッファーを、QuiagenRNAseAストック(100mg/ml)を200μg/mlの最終濃度まで希釈して調製した。
バッファーC1(10mL、4℃)及びddH2O(40mL、4℃)を、次いで10mLの細胞懸濁物に添加し、反転させて混合し、氷上で10分間インキュベートした。細胞核をBeckmanスイングバケットロータで4℃において2500rpmで15分間遠心分離することによりペレット化した。上清を捨て、核をボルテックスしながら2mLのバッファーC1(4℃)及び6mLのddH2Oに懸濁し、1秒後に4℃において2500rpmで15分間遠心分離した。次いで核を残りのバッファー中にチップ当たり200μlを用いて再懸濁した。G2バッファー(10ml)を懸濁した核に添加しながら緩いボルテックスを適用した。バッファー添加が完了したら、強いボルテックスを30秒間適用した。Quiagenプロテアーゼ(200μl上記のように調製)を添加し、50℃で60分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0557】
固体ヒト腫瘍試料の調製及び溶解:
腫瘍試料を秤量し50mlのコニカル管に配して氷上に保持した。加工は調製当たり250mgの組織未満に制限した(1チップ/調製)。プロテアーゼ溶液を6.25mlの冷ddH2O中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して4℃で貯蔵した。DNAseAを最終濃度200mg/mlまで希釈することによりG2バッファー(20ml)を調製した(100mg/mlのストックから)。エアロゾルの吸入を避けるために層流Tフード内でポリトロンの大きなチップを用いて、腫瘍組織を19mlのG2バッファー中で60秒間均一化し、室温に保持した。試料間で、各々2LのddH2Oで2x30秒間、次いでG2バッファー(50ml)でスピンさせることによりポリトロンを透明化した。組織がジェネレータチップ上に存在する場合は、装置を分解して清浄化した。
Quiagenプロテアーゼ(上記の用に調製、1.0ml)を添加し、次いでボルテックスして50℃で3時間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0558】
ヒト血液調製及び溶解:
健常なボランティアから標準的な感染薬プロトコールを用いて血液を採りだし、チップ当たり10mlの試料にクエン酸化した。Quiagenプロテアーゼを6.25mlの冷ddH2O中に最終濃度20mg/mlまで希釈することにより新たに調製して4℃で貯蔵した。DNAseAを100mg/mlのストックから最終濃度200mg/mlまで希釈することによりG2バッファー(20ml)を調製した。血液(10ml)を50mlのコニカル管に配し、10mlのC1バッファー及び30mlのddH2O(ともに4℃で平衡化したもの)を添加し、反転させて混合して氷上に10分間保持した。Beckmanスイングバケットローターで、4℃において2500rpmで15分間核をペレット化し、上清を捨てた。ボルテックスしながら、核を2mlのC1バッファー(4℃)及び6mlのddH2O(4℃)中に懸濁させた。ボルテックスはペレットが白くなるまで繰り返した。次いで核を残りのバッファー中に200μlチップを用いて懸濁させた。G2バッファー(10ml)を懸濁核に添加しながら緩くボルテックスし、次いで30秒間強くボルテックスした。Quiagenプロテアーゼを添加(200μl)し、50℃で60分間インキュベートした。インキュベーション及び遠心分離を、溶解物が透明になるまで繰り返した(例えば、さらに30−60分間インキュベートし、4℃で10分間3000xgでペレット化する)。
【0559】
透明化溶解物の精製:
(1)ゲノムDNAの単離:
ゲノムDNAを10mlのQBTバッファーで平衡化した(最大チップ調製当たり1試料)。QF溶離バッファーを50℃で平衡化した。試料を30秒間ボルテックスし、次いで平衡化チップに負荷して重力により排液した。チップを2x15mlのQCバッファーで洗浄した。DNAを、30mlのシラン化したオートクレーブ30mlCortex管に15mlのQFバッファー(50℃)で溶離した。イソプロパノール(10.5ml)を各試料に添加し、管をパラフィンで被覆し、DNAが沈殿するまで繰り返し反転させて混合した。試料を、SS−34ロータで4℃において15,000rpmで10分間遠心分離してペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨て、10mlの70%エタノール(4℃)を添加した。試料を、SS−34ロータで4℃において10,000rpmで10分間遠心分離して再度ペレット化した。ペレット位置をマークして上清を捨てた。次いで管を乾燥棚の各面に置き、37℃で10分間乾燥させたが、使用の過剰乾燥には注意した。
乾燥後、ペレットを1.0mlのTE(pH8.5)に溶解し、50℃に1−2時間置いた。試料を4℃に終夜保持して溶解を続けた。次いでDNA溶液を、ツベルクリンシリンジ上に26ゲージの針を具備する1.5ml管に移した。DNAを剪断するために移行を5x繰り返した。次いで試料を50℃に1−2時間置いた。
【0560】
(2)ゲノムDNAの定量及び遺伝子増幅アッセイのための調製:
各管のDNAレベルを1:20希釈(5μlDNA+95μlddH2O)での標準的なA260、A280スペクトルにより、Beckman DU640分光光度計の0.1ml石英キュベットを用いて定量した。A260/A280比率は1.8−1.9の範囲であった。次いで各DNA試料をTE(pH8.5)中に約200ng/mlまで希釈した。最初の材料が高濃度(約700ng/μl)である場合、材料を50℃に再懸濁するまで数時間置いた。
次いで、希釈した材料(20−600ng/ml)に対して、製造者の指示を以下のように改変して蛍光DNA定量を実施した。これは、Hoeffer DyNA Quant 200蛍光計を約15分間暖めて実施した。Hoechst染料作業溶液(#H33258、10μl、使用の12時間以内に調製)を100mlの1xTNEバッファーに希釈した。2mlキュベットを蛍光計溶液で満たし、機械に配し、機械をゼロ調節した。pGEM3Zf(+)(2μl、ロット#360851026)を2mlの蛍光計溶液に添加して200単位で校正した。次いで、さらに2μlのpGEM3Zf(+)DNAを試験し、400+/−10単位で読みを確認した。次いで各試料を少なくとも3回読んだ。3試料が互いに10%以内であることが見られたとき、それらの平均をとり、この値を定量化値として用いた。
次いで、蛍光測定で決定した濃度を、各試料をddH2O中に10ng/μlまで希釈するのに用いた。これは、1回のTaqManプレートアッセイについて全てのテンプレート試料について同時に行い、500−1000アッセイを実施するのに十分な材料で行った。試料は、Taqman(商品名)プライマー及びプローブで3回試験し、B−アクチン及びGAPDHともに正常なヒトDNAを持ちテンプレート対照を持たない単一のプレート上にある。希釈した試料を用いたが、試験DNAから減算した正常ヒトDNAのCT値は+/−1CTであった。希釈した、ロット定性化したゲノムDNAを、1.0mlアリコートで−80℃において保存した。続いて遺伝し増幅アッセイに使用するアリコートは、4℃で保存した。各1mlのアリコートは、8−9プレート又は64試験に十分である。
【0561】
遺伝子増幅アッセイ:
本発明のPROポリペプチド化合物を以下の原発腫瘍でスクリーニングし、1.0以上の得られたΔCt値を表9に報告する。
【0562】
【0563】
要約
上記に記載した種々のDNAの増幅が種々の腫瘍において生じるため、種々DNAの増幅は腫瘍の形成及び/又は成長と関連しているようである。結果として、これらポリペプチドを標的としたアンタゴニスト(例えば抗体)は、癌治療において有用であると期待される。
【0564】
実施例115:内皮細胞におけるc−fosの誘導(アッセイ34)
このアッセイはPROポリペプチドが内皮細胞においてc−fosを誘導する能力を示すか否を決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば創傷治癒やそれに類似のものを含む血管新生が有益な症状や疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストのように)。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性の腫瘍の治療上の処置にとって有用であると期待される。
成長培地(50%のハムのF12w/oGHT:低グルコース、及びグリシンなしの50%DMEM:NaHCO3、1%グルタミン、10mMのHEPES、10%のFBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を1x104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl/ウェルの試験試料と対照(ポジティブ対照=成長培地;ネガティブ対照=プロテイン32バッファー=10mMのHEPES、140mMのNaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%CO2中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、DNAキットプロトコール(Chiron Diagnostics, cat.#6005−037)の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬/バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なTM溶菌バッファー及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをTM溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。bDNA条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μlの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各b−DNAウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのプローブを伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各b−DNAウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むbDNAウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
【0565】
次の日に、bDNAキットプロトコールの第2の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により適用された情報に基づいて計算した。ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物(Amplifier Concentrate)(20fm/μl)を作成することにより50μlのアンプリファイアー作用液を調製した。ついで、プレートをインキュベーターから取り除いて10分間冷却した。標識プローブ作用液を、ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈で標識濃縮物(40pmoles/μl)を作成することにより調製した。10分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質に3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Aで2回、洗浄剤Dで3回洗浄した。50μlのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、RLUを適当な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。ネガティブ対照(上述のプロテイン32/HEPESバッファー)値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位(RLU)によって示された。結果を下記の表8に示し、ネガティブ対照値に対して少なくとも2倍の値を示す試料はポジティブと考えた。ネガティブ対照=1.00%希釈で1.00RLU。ポジティブ対照=1.00%希釈で8.39RLU。
このアッセイでは、以下の試験PROポリペプチドが陽性であった:PRO938、PRO200、PRO865、PRO788、及びPRO1013。
【0566】
実施例116:ラット卵形嚢支持細胞の増殖(アッセイ54)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが、聴覚性有毛細胞前駆体である内耳支持細胞に対して潜在的にマイトジェンとして作用し、それ故に聴毛細胞の再生の誘導及び哺乳類の聴力損失の治療に有用であることを示している。
本アッセイは、次のように行われる。ラットUEC−4卵形嚢内皮細胞を、33℃における200μlの血清含有培地中、3000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに分ける。一晩の後、37℃において培地を無血清培地に変える。そしてPROポリペプチドの種々の希釈(又はコントロール無し)を培地へ添加し、細胞を24時間インキュベートする。24時間のインキュベーションの後、3H−チミジン(1μCi/ウェル)を添加し、細胞を更に24時間インキュベートする。次いで培地を洗浄して取り込まれていない放射能標識を取り除き、細胞は回収し、Cpm/ウェルを測定した コントロール培地と比較して、PROポリペプチド処理培地の中で、少なくとも30%又はそれより高いCpmをこのアッセイでのポジティブと考える。
以下の試験PROポリペプチドがこのアッセイで陽性であった:PRO337、PRO363及びPRO1012。
【0567】
実施例117:初期ラット脂肪細胞によるグルコース又はFFA取り込みに影響を与えるPROポリペプチドの検出(アッセイ94)
このアッセイは、PROポリペプチドが脂肪細胞によるグルコース又はFFA取りみに影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば肥満、糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む脂肪細胞によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるPROポリペプチドは初期ラット脂肪細胞へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。4及び16時間目に、グリセロール、グルコース及びFFA取り込みのアッセイのための試料が取られる。16時間のイキュベーション後、イシュリンを培地へ加え、4時間のインキュベートをおこなう。この時、試料が取られて、グリセロール、グルコース及びFAAの取り込みが測定される。PROポリペプチドが無くインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロールとして使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果は陽性と記録される。
以下のPROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの刺激剤として陽性と評価された:PRO181、PRO200、PRO337、PRO362、PRO363、PRO731、PRO534、PRO1114及びPRO075。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの阻害剤として陽性であった:PRO195、PRO322、PRO862、PRO868、PRO865、及びPRO162。
【0568】
実施例118:骨格筋のグルコース又はFFA取り込みに影響を与えるポリペプチドの検出(アッセイ106)
このアッセイは、PROポリペプチドが骨格筋のグルコース又はFFA取り込に影響を及ぼす能力を示すかどうかを決定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば糖尿病又は高或いは低インシュリン血症を含む骨格筋によるグルコース取り込みの刺激又は阻害である疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
96ウェルフォーマットにおいて、アッセイされるPROポリペプチドは初期ラット分化型骨格筋へ加えられ、そして一晩インキュベートされる。ついで、PROポリペプチド及び+/−インシュリンを含む新鮮な培地がウェルに加えられる。その後、試料培地は、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを測定するために監視される。イシュリンは、骨格筋によるグルコース又はFFA取り込みを刺激し、PROポリペプチドを含まないインシュリンを含む培地を、陽性の基準コントロール及びスコーリング制限として使用する。試験されるPROポリペプチドがグルコース又はFFA取り込みを刺激或いは阻害した場合、インシュリンのコントロールより1.5倍より高い又は0.5倍より低いと、結果は陽性と記録される。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいてグルコース及び/又はFAAの取り込みの刺激剤又は阻害剤として陽性であった:PRO181、PRO200、PRO1083、PRO865、PRO162、PRO1008及びPRO1330。
【0569】
実施例119:心臓新生児肥大の刺激(アッセイ1)
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、種々の心臓機能不全疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x104/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12+4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加する。試験PROポリペプチド又は成長培地のみ(負の対照)(20μl/ウェル)を含む試験試料を1日目にウェルに直接添加する。ついで、PGF(20μl/ウェル)を10−6Mの最終濃度まで2日目に添加する。ついで、細胞を4日目に染色し、5日目に視覚的にスコアをつけ、負の対照と比較してサイズの増加がない細胞をスコアが0.0とし、負の対照と比較してサイズが小から中程度増加している細胞を1.0とし、負の対照と比較してサイズが大きく増加している細胞を2.0のスコアとする。このアッセイの陽性は、スコアが1.0又はそれ以上である。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO195、PRO200、PRO526及びPRO792。
【0570】
実施例120:F2aにより誘導された心臓新生児肥大の促進(アッセイ37) このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、種々の心臓機能不全疾患の治療上の処置にとって有用であると期待される。
1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x104/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12 +4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加する。試験PROポリペプチド(20μl/ウェル)を含有する試験試料を1日目にウェルに直接添加する。次いで2日後にPGF(20μl/ウェル)を最終濃度10−6Mで添加する。次いで細胞を4日目に染色し、5日目にスコアをつける。視覚的スコアは細胞サイズに基づき、ネガティブ対照に比較してサイズの増加を示さない細胞を0.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの小から中程度の増加を示す細胞を1.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの大きな増加を示す細胞を2.0とスコア付けする。1.0又はそれ以上のスコアをポジティブと考える。
アッセイ反応にCa濃度が重要であるためPBSは含有しない。プレートはDMEM/F12 +4%FCS(200μl/ウェル)でコートした。アッセイ媒体は以下を含む:DMEM/F12(2.44gmの重炭酸塩を含む)、10μg/mlのトランスフェリン、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのアプロチニン、2mmol/Lのグルタミン、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン。マンニトール(4%)を含むタンパク質バッファーは1/10(0.4%)及び1/100(0.04%)ではポジティブシグナル(スコア3.5)を与えたが、1/1000(0.004%)では与えなかった。従って、マンニトールを含む試験試料バッファーは実行しなかった。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO195。【0571】
実施例121:モルモット血管漏洩(アッセイ32及び51)
このアッセイは本発明のPROポリペプチドが血管透過性を誘導する能力を示すかどうかを決定するためのものである。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、例えば肥大した局所免疫系細胞浸潤から恩恵を受ける状態を含む肥大血管透過性
によって益を受ける状態の治療上の処置にとって有用であると期待される。
350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(70−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける。PRO302ポリペプチド又は試験ポリペプチドを含まない生理緩衝液を含む試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ16−24の注射部位があった。ついで1mlのエバンスブルー染料(PBS中1%)を心臓内注射する。化合物に対する皮膚血管透過性応答(すなわち、注射部位の斑点)について、試験動物の投与1及び6時間後に注射部位からの青色の漏出の直径(mm)を測定することで視覚によりスコアをつける。注射部位の青さのmm直径を観察し、血管漏出の重症度と共に記録する。少なくとも5mmの直径の斑点は、精製タンパク質を試験する場合はアッセイでは陽性であると考えられ、血管漏出又は透過性を誘導する能力を示している。7mmの直径より大きな応答は、条件付けられた培地試料に対して陽性であると考えられる。0.1μg/100μlのヒトVEGFが正の対照として使用され、15−23mm直径の応答を誘導した。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO200。
【0572】
実施例122:皮膚血管透過性アッセイ(アッセイ64)
このアッセイは、本発明のあるポリペプチドが免疫系を刺激し、哺乳類の注射の部位での単核球、好酸球及びPMN浸潤を誘導することによる炎症を誘導することを示す。免疫応答を刺激する化合物は、免疫応答が有益である場合には治療的に有用である。この皮膚血管透過性アッセイは,以下のようにおこなわれる。350g又はそれ以上の無毛モルモットにケタミン(70−80mg/kg)と5mg/kgのキシラジンを筋肉内投与して麻酔をかける(IM)。本発明の精製ポリペプチド又は条件付試験試料を、注射部位当たり100μlで試験動物の背の皮膚に皮内注射する。動物当たりおよそ10−30、好ましくは16−24の注射部位を有する可能性がある。ついで1μlのエバンスブルー染料(1%の緩衝化された生理的食塩水)を心臓内注射する。そして、注射部位の斑点を注射後1及び6時間後に測定する(mm直径)。動物は、注射から6時間後に犠牲となった。各々の皮膚注射部位は、生検されてホルマリンで固定される。そして、この皮膚は、組織病理学的評価のために調整される。各々の部位は、皮膚への炎症細胞湿潤のために評価される。可視的な炎症細胞湿潤の部位は、陽性とスコアされる。炎症細胞は、好中球、好酸球、単核球又はリンパ性である可能性がある。少なくとも、注射部位の最小血管周囲湿潤物は陽性とスコアされ、注射の部位の湿潤物でないものは、陰性とスコアされる。
以下の試験PROポリペプチドが、このアッセイにおいて陽性であった:PRO200、PRO362及びPRO1031。
【0573】
実施例123:皮質性ニューロンでのc−fosの誘導(アッセイ83)
このアッセイは、PROポリペプチドが皮質性ニューロンでのc−fosを誘導する能力を示すかどうかを測定するために設計されている。このアッセイにおいて陽性と評価されたPROポリペプチドは、神経系疾患の治療上の処置及びニューロン増殖が有益である損傷にとって有用であると期待される。
皮質性ニューロンは、分離されて96ウェルプレートの1ウェル当たり10,000細胞で成長培地にプレートされる。2細胞分裂の後、細胞は30分間に渡り、PROポリペプチド処理されるか、何も処理されない(負の対照)。次に、細胞は5分間に渡り冷メタノールで固定化され、リン酸化CREBを標的とする抗体によって染色される。そして、mRNAレベルが化学発光を使用して算定される。このアッセイにおける陽性は、負の対照と比較してc−fosのメッセージが少なくとも2倍の増加となった全ての因子である。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200。
【0574】
実施例124:マウス腎メサンギウム細胞増殖アッセイ(アッセイ92)
このアッセイ37は、本発明のあるペプチドが、哺乳類の腎メサンギウム細胞の増殖を誘導するように作用し、それ故にバーガー病又はシェーンライン−ヘノーホ紫斑病、セリアック病、疱疹状皮膚炎又はクローン病に関連する他の腎障害のようなメサンギウム細胞の機能低下と関連する腎疾患の治療に有用である。このアッセイは以下のようにおこなわれる。1日目、マウス腎メサンギウム細胞を、96ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95%ウシ胎児血清、5%14mM HEPES補充)にプレートし、一晩生育させる。2日目には、PROポリペプチドを無血清培地で二つの濃度(1%及び5%)に希釈し、細胞へ添加する。対照試料は無血清培地である。4日目には、20μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を2時間に渡り継続させる。そして、吸光度を490nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも15%上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO363、PRO731、PRO534、PRO866及びPRO1031。
【0575】
実施例125:周皮細胞c−fos誘導(アッセイ93)
このアッセイは、本発明の所定のポリペプチドが周皮細胞におけるc−fosの発現を誘発するように作用し、よって特定の種類の周皮細胞結合腫瘍の診断用マーカーとして有用であるばかりでなく、周皮細胞結合腫瘍の治療的処置に有用であると予期されるアンタゴニストを生じせしめることを示す。特に1日目に、周皮細胞をVEC Technologiesから得、5mlの培地以外をフラスコから取り出す。2日目に周皮細胞をトリプシン化し、洗浄し、スピンさせ、ついで96ウェルプレートに蒔く。7日目に培地を取り出し、周皮細胞を100μlのPROポリペプチドテスト用試料及び対照体(正の対照体=DEM+5%血清+/−500ng/mlのPDGF;負の対照体=プロテイン32)で処理する。複製を平均し、SD/CVを決定する。蛍光ルミネセンス単位(RLU)照度計リーディングバース頻度により示されたプロテイン32値を越える折り畳み増加(バッファー対照)をヒストグラム上にプロットし、上記のプロテイン32値を2倍越えると、アッセイについてポジティブであると考えられる。ASYマトリックス:成長培地=低グルコースDMEM=20%FBS+1xペンストレップ(pen strep)+1Xフンギゾン(fungizone)。アッセイ用培地=低グルコースDMEM+5%FBS。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO200。
【0576】
実施例126:軟骨細胞再分化アッセイ(アッセイ110)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが軟骨細胞の再分化を誘導し、それ故に例えば、スポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれる。ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離する。そして、単離された細胞を、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF−12へ25,000細胞/cm2の割合で接種する。培地は、3日ごとに換えられ、そして細胞を血清を含まない100μlの同じ培地へ5,000細胞/ウェルとなるよう96ウェルプレートへ接種し、100μlの試験PROポリペプチド、5nMスタウロスポリン(正の対照)又は培地のみ(負の対照)を添加して最終容量を200μl/ウェルとする。5日間のインキュベーション後、各ウェルの写真を撮り、軟骨細胞の分化段階を測定する。軟骨細胞の再分化が負の対照よりも正の対照へ似ている場合には、アッセイにおいて陽性の結果が生じたとした。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO220、PRO285、PRO337、PRO526、PRO362、PRO363、PRO531、PRO1083、PRO862、PRO733、PRO1017、PRO792、PRO788、PRO1008、PRO1075、PRO725、及びPRO1031。
【0577】
実施例127:赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビン誘発(アッセイ107)
このアッセイは、成人のヘモグロビンから赤芽球細胞系における胎児ヘモグロビンへの切替を誘発する、PROポリペプチドの能力をスクリーニングするのに有用である。このアッセイにおいて試験する分子がポジティブであると、種々のサラセミア等の、多様な哺乳類ヘモグロビン関連疾患を治療的に処置するのに有用であることが期待される。このアッセイは以下のようにして行われる。赤芽球細胞を標準的成長培地において、96ウェルフォーマットに1000細胞/ウェルで蒔く。0.2%又は2%の濃度でPROポリペプチドを成長培地に添加し、細胞を37℃で5日間インキュベートする。正の対照体として、細胞を100μMのヘミンで処理し、負の対照体として、細胞を処理しない。5日後、細胞溶解物を調製し、ガンマグロブリンの発現について分析する(胎児用マーカー)。このアッセイにおいてポジティブとは、ガンマグロブリンレベルが負の対照体の少なくとも2倍であることである。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO237、PRO381、PRO362、PRO724、PRO866、PRO1114、PRO725及びPRO1071。
【0578】
実施例128:膵臓β細胞前駆体の増殖の誘導(アッセイ117)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の増殖を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化PCR(RT−PCR、real time quatitative PCR)によって測定する:評価されるマーカーは、Pdx1と呼ばれる転写因子である。
膵臓は、E14胚(CD1マウス)から解剖された。そして、膵臓はF12/DMEM中のコラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)で37℃、40−60分で消化された(コラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113)。次に、消化物を等量の5%BSAによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第1日目、細胞を12ウェルの組織培養プレート(PBS中の20μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された)へ接種する。1−2の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第2日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、2mlの最小培地を添加する。第4日目には、培地を取り除き、細胞よりRNAを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写PCR(real time quantitative RT−PRC)によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640は、以下のもの加えたRPMI1640である:
グループA1:1000
グループB1:1000組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml)1:2000(べーリンガーマンハイム#981532)
ウシ下垂体抽出物(BPE)60μg/ml
ゲンタマイシン100ng/ml
グループA:(10ml PBS中)
トランスフェリン、100mg(シグマ T2252)
上皮細胞成長因子、100μg(BRL 100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマ T5516)
エタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ E0135)
ホスホエタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ P0503)
セレニウム、4μlの10−1Mの100μl(Aesar #12574)
グループC:(10ml 100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−3M(シグマ #H0135)
プロジェステロン、1x10−3M(シグマ P0503)
フォルスコリン、20mMの500μl(カルバイオケム #344270)
最小培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びBPE(15μg/ml)。
限定培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO237及びPRO731。
【0579】
実施例129:混合リンパ球反応(MLR)アッセイにおける刺激性活性(アッセイ24)
この実施例は、本発明のあるペプチドが、刺激されたT−リンパ球の増殖の刺激剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を刺激する化合物は、免疫応答の増強が有益な 場合、治療的に有益に有用である。治療剤は、本発明のポリペプチドのアンタゴニストの形をとり、例えば、ポリペプチドに対するマウス−ヒトキメラ、ヒト化又はヒト抗体である。このアッセイの基本的プロトコールは、Current Protocols in Immunology, unit3.12;J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版に記載されている。
さらに具体的には、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)に3x106細胞/mlに再懸濁させる。刺激物PBMCは細胞を光にさらす(約300ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物:
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4−IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0 mC/ウェル;Amersham)を適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルバート)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトM(Lympholyte M)(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000 rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
対照体に対する増加が陽性であると考えられ、好ましくは180%以上又は180%と同等の増加が好ましい。しかしながら、対照体より大きい全ての値は、試験用タンパク質について刺激効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273、PRO526、PRO381、PRO719、PRO866、及びPRO1031。
【0580】
実施例130:混合リンパ球反応(MLR)における阻害活性アッセイ(アッセイ67)
この実施例は、本発明の一又は複数のポリペプチドが刺激されたTリンパ球の増殖阻害剤として活性であることを示す。リンパ球の増殖を阻害する化合物は、免疫反応の抑制が好ましい治療において有用である。
このアッセイの基本的プロトコールは、Immunology, unit3.12;J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober編, 国立衛生研究所, John Wiley & Sons, Incから出版のCurrent Protocolsに記載されている。
さらに、このアッセイの一変形例では、末梢血液単核細胞(PBMC)を個々の哺乳類、例えばヒトのボランティアからロイコフェレーシスにより単離する(一人のドナーには刺激物PBMCを供給し、他のドナーにはレスポンダーPBMCを供給する)。所望するならば、単離後に、細胞をウシ胎児血清及びDMSO中で凍結する。凍結細胞をアッセイ用培地(37℃、5%CO2)で一晩解凍し、ついで洗浄し、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)に3x106細胞/mlに再懸濁させる。刺激物PBMCは細胞を光にさらす(約300ラド)ことにより調製される。
このアッセイは混合物:
100:1の1%又は0.1%に希釈された試験料試料、
50:1の光にさらされた刺激物細胞、及び
50:1のレスポンダーPBMC細胞、
を三重ウェルに蒔くことにより調製される。100マイクロタイターの細胞培養培地又は100マイクロタイターのCD4−IgGを対照体として使用する。ついで、ウェルを37℃、5%CO2で4日間インキュベートする。5日目、各ウェルにトリチウム化チミジン(1.0mC/ウェル;Amersham)を適用する。6時間後、細胞を3回洗浄し、ついで標識の取込を評価する。
このアッセイの他の変形例では、PBMCをBalb/cマウス及びC57B6マウスの脾臓から単離する。細胞を、アッセイ用培地(RPMI;10%ウシ胎児血清、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタミン、1%HEPES、1%非必須アミノ酸、1%ピルビン酸塩)において新たに回収された脾臓から顕微鏡検査用に細かく切断し、リンパライトM(Lympholyte M)(Organon Teknika)上にこれらの細胞をオーバーレイすることによりPMBCを単離し、2000rpmで20分間遠心分離し、集め、アッセイ用培地における単核細胞層を洗浄し、アッセイ用培地に1x107細胞/mlになるように細胞を再懸濁させる。ついで、このアッセイは上記のように行われる。
任意に以下の対照体が減少することは、阻害用化合物についてのポジティブな結果であると考えられ、80%未満の減少が好ましい。しかしながら、任意の値が対照体未満であるなら、試験用タンパク質について阻害効果を示す。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273、PRO526、PRO381、PRO701、PRO363、PRO531、PRO1083、PRO865、PRO788、及びPRO1114。
【0581】
実施例131:繊維芽細胞(BHK−21)の増殖(アッセイ98)
このアッセイは、本発明のあるPROポリペプチドが、培養において哺乳類の繊維芽細胞の増殖の誘導し、それ故に哺乳類のシステムにおいて有用な成長因子として機能することを示す。BHK−21繊維芽細胞を標準成長培地へ、全容量100μlで2500細胞/ウェルでプレートした。そして、全容量200μlで1μg/mlのヘパリンの存在下のウェルへPROポリペプチド、β−FGF(正の対照)又は無含有(負の対照)を添加する。ついで、細胞を37℃で6−7日間インキュベートする。インキュベーシュン後、培地を取り除き、細胞をPBSで洗浄した後に酸性ホスファターゼ基質混合物(100μl/ウェル)を加える。そして,細胞を37℃で2時間インキュベートする。次に、1ウェルにつき10μlの1N NaOHを添加し、酸性ホスファターゼ反応を止める。そして、プレートをOD 450nmで測定する。このアッセイの陽性は、少なくとも負の対照より50%上の酸性ホスファターゼ活性である。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO273及びPRO731。
【0582】
実施例132:
内皮細胞アポトーシスの誘導(ELISA)(アッセイ109)
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力を、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中で96ウェルフォーマットを使用して、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。使用した96ウェルプレートはFalconにより製造された(番号3072)。96ウェルのコーティングは、PBS溶液中の0.2%ゼラチン100μlで>30分間ゼラチン化を起こすことにより調製した。ゼラチン混合物を全部吸引した後、10%血清含有培地中で最終濃度2x104細胞/mlの最終濃度−ウェル当たり100μl容量でプレーティングした。対象とするPROポリペプチドを含有する試験試料を添加する前に細胞を24時間成長させた。
全てのウェルに、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中100μlを添加した。PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%の希釈で三つ組で添加した。細胞の無いウェルをブランクとして使用し、細胞だけのウェルをネガティブ対照として使用した。ポジティブ対照として、3x原液のスタウロスポリンの50μlの1:3の連続希釈物を使用した。ELISAに先立って、細胞を24から35時間インキュベートした。
ELISAを、Boehringer マニュアル[Boehringer, 細胞死検出ELISA plus, カタログ番号1920685]に従ってアポトーシス調製溶液のレベルを決定するのに使用した。試料調製:96ウェルプレートを1krpmで10分間スピン沈降させ(200g)、高速反転により上清を除去し、プレートをペーパータオル上に上下逆に置いて残りの液体を除去した。各ウェルに、100μlの1X溶菌バッファーを添加して振盪させずに30分間室温でインキュベートした。プレートを1krpmで10分間スピン沈降させ、20μlの溶菌液(細胞質画分)をストレプトアビジン被覆MTPに移した。80μlの免疫試薬混合物を各ウェルで20μl溶菌液に加えた。MTPを粘着性ホイルでカバーし、それを軌道振盪機(200 rpm)に配することにより2時間室温でインキュベートした。2時間後、上清を吸引により除去し、ウェル当たり250μlの1Xインキュべーションバッファーで3回ウェルをリンスした(吸引で除去した)。各ウェルに基質溶液を添加し(100μl)、軌道振盪機で室温において250 rpmで、光度測定分析に十分な発色がされるまでインキュベートした(約10−20分後)。参照波長492nmとして405nmでプレートを読むのに96ウェルリーダーを用いた。PIN32(対照バッファー)について得られたレベルを100%に設定した。レベル>130%の試料をアポトーシス誘導についてのポジティブと考えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO8446。
【0583】
実施例133: 内皮細胞アポトーシスの誘導(ELISA)(アッセイ73)
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力をヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。
細胞を96ウェルマイクロたーたープレート(Amersham Life Science, cytostar−Tシンチレーティングマイクロプレート、無菌、組織培地処理、個々にラッピング)で10%の血清(CSG−媒体、Cell Systems)中、ウェル当たり2x104細胞の密度で全容量100μlでプレーティングした。2日目に、PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%希釈の3段階で添加した。細胞無しのウェルをブランクとして用い、細胞のみのウェルをネガティブ対照として用いた。ポジティブ対照としてスタウロスポリンの3xストックの1:3連続希釈50μlを用いた。PROポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、カルシウム及びリン脂質結合タンパク質のメンバーであるアネキシンV(AnnexinV)の検出のために96ウェルをプロセッシングしてアポトーシスを検出することにより決定した。
0.2mlのアネキシンV−ビオチンのストック溶液(100μg/ml)を、4.6mlの2 x Ca2+結合バッファー及び2.5%BSA中に希釈した(1:25希釈)。50μlの希釈アネキシンV−ビオチン液を、1.0μg/mlの最終濃度になるまで各ウェル(対照を除く)に添加した。試料を35S−ストレプトアビジンの直接添加の前にアネキシン−ビオチンと共に10−15分間インキュベートした。35S−ストレプトアビジンは2 x Ca2+結合バッファー、2.5%BSA中に希釈し、最終濃度が3 x 104cpm/ウェルになるまで全てのウェルに添加した。次いでプレートを密封し、1000 rpmで15分間遠心分離し、2時間の間、軌道シェイカー上に配した。分析は1450Microbeta Trilux (Wallac)で実施した。バックグラウンドを越えるパーセントがネガティブ対照を越える毎分当たりのカウントのパーセント量を表す。バックグラウンドを越えるパーセントが30%以上のものがポジティブであると考えられる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO719。
【0584】
実施例134:ヒト静脈内皮細胞Caフラックスアッセイ(アッセイ68)
このアッセイは、PROポリペプチドがヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)におけるカルシウムフラックスを刺激する能力を示すか否かを決定するために設計されている。Ca流入(influx)は、ある種のリガンドがそのレセプターに結合する際の良好に実証された反応である。このCa流入アッセイにおいてポジティブ反応をもたらす試験化合物は、特定のレセプターに結合してヒト内皮細胞における生物学的シグナル伝達経路を活性化すると言える。これは究極的に、例えば細胞分裂、細胞増殖の阻害、内皮管形成、細胞泳動、アポトーシスを誘導しうる。
成長培地(50:50グリシン無し、1%グルタミン、10mMのHepes、10%FBS、10 ng/mlのbFGF)中のヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を、96ウェルのmicrotiter View Plate−96(Packard Instrument Company Part #6005182)マイクロタイタープレートに2x104細胞/ウェルの細胞密度でプレーティングした。プレーティングの次の日、細胞をバッファー(HBSS+10mMのHepes)で3回洗浄し、100μl/ウェルを残した。次いで100μl/ウェルの8μMのFluo−3(2x)を添加した。細胞を37℃/5%CO2において1.5時間インキュベートした。インキュべーションの後、細胞をバッファー(上記)で3x洗浄し、100μl/ウェルを残した。PROポリペプチドの試験試料は、異なる96ウェルプレート上で、バッファー中5x濃度で調製した。ポジティブ対照は50μMイオノマイシン(5x)に相当し;ネガティブ対照はプロテイン32に相当する。細胞プレート及び試料プレートをFLIPR(Molecular Devices)マシンで走らせた。FLIPRマシンは25μlの試験試料を細胞に添加し、2秒ごとに1分間、次いで3秒ごとに3分間読み取りを行った。
曲線のベースラインから最大値まで上昇する蛍光変化(Δ変化)を計算し、複製を平均化した。蛍光増加の速度を監視し、1000より大きなΔ変化及び60秒以内の上昇を有する試料のみをポジティブと考えた。下記の表9において、結果はポジティブ対照に対して表現した。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO771。
【0585】
実施例135:内皮細胞でのc−fosの誘導(アッセイ34)
このアッセイはPROポリペプチドが内皮細胞においてc−fosを誘導する能力を示すか否を決定するために設計されている。この試験において陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストがそうあろうように)。このアッセイにおいて陽性と試験されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置において有用であると期待される。
成長培地(50%のハムのF12w/oGHT:低グルコース、及びグリシンなしの50%DMEM:NaHCO3、1%グルタミン、10mMのHEPES、10%のFBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を1x104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl/ウェルの試験試料と対照(ポジティブ対照=成長培地;ネガティブ対照=プロテイン32 buffer=10mMのHEPES、140mMのNaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%CO2中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、DNAキットプロトコール(Chiron Diagnostics, cat.#6005−037)の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬/バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なTM溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをTM溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリッド形成バッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。bDNA条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μlの捕獲ハイブリッド形成バッファーを必要な各b−DNAウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのプローブを伴う溶菌ハイブリッド形成バッファーを各b−DNAウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリッド形成バッファーを含むbDNAウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
【0586】
次の日に、bDNAキットプロトコールの第2の部分に従った。すなわち、プレートをインキュベーターから取り除き、ベンチに配置して10分間冷却した。必要な添加の容積は製造者により提供された情報に基づいて計算した。ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈のアンプリファイアー濃縮物(Amplifier Concentrate)(20 fm/μl)を作成することによりアンプリファイアー作用液を調製した。ハイブリダイゼーション混合物をプレートから取り除かれ、洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlのアンプリファイアー作用液を各ウェルへ添加し、ウェルを53℃で30分間インキュベートした。ついで、プレートをインキュベーターから取り除いて10分間冷却した。標識プローブ作用液を、ALハイブリッド形成バッファー中に1:100の希釈で標識濃縮物(40 pmoles/μl)を作成することにより調製した。10分の冷却期間後、アンプリファイアーハイブリッド形成混合物を除去し、プレートを洗浄剤Aで2回洗浄した。50μlの標識プローブ作用液を各ウェルに添加し、ウェルを53℃で15分間インキュベートした。10分間の冷却後、基質を室温まで温めた。アッセイに必要な各モルの基質に3μlの基質エンハンサーを添加して、プレートを10分間冷却し、標識ハイブリッド形成混合物を取り除き、プレートを洗浄剤Aで2回、洗浄剤Dで3回洗浄した。50μlのエンハンサーを伴う基質溶液を各ウェルに添加した。プレートを37℃で30分間インキュベートし、RLUを適当な照度計で読みとった。
複製を平均化し変動係数を決定した。負の対照(上述のプロテイン32/HEPESバッファー)値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位(RLU)によって示された。結果は、負のバッファー対照の値に対して少なくとも2倍の値を示す試料は陽性と考えた。
負の対照=1.00%希釈で1.00RLU。正の対照=1.00%希釈で8.39RLU。
【0587】
実施例136:膵臓β細胞前駆体分化の誘導(アッセイ89)
このアッセイは、本発明のあるペプチドが膵臓β細胞前駆体の分化を誘導し、それ故に糖尿病を含む哺乳類における種々のインシュリン欠乏状態の治療に有用であると期待されることを示す。このアッセイは、以下のようにおこなわれた。このアッセイは、マウス胎児膵臓細胞の一次培養を使用し、一次計測は、β細胞前駆体又は成熟β細胞のいずれかを示すマーカーの発現の変化である。マーカー発現は、実時間数量化PCR(RTQ−PCR、real time quatitative PCR)によって測定される:評価されるマーカーは、インシュリンである。
膵臓は、E14胚(CD1マウス)から解剖される。そして、膵臓はF12/DMEM中のコラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)で37℃、40−60分で消化される(コラゲナーゼ/デスパーゼ(dispase)、1.37mg/ml、べーリンガーマンハイム、#1097113)。次に、消化物を等量の5%BSAによって中和し、細胞を、一度、RPMI1640で洗浄する。第1日目、細胞を12ウェルの組織培養プレート(PBS中の20μl/mlのラミニン、べーリンガーマンハイム、#124317によって,前被覆された)へ接種する。1−2の胚からの膵臓の細胞を一つのウェルに分布させる。この一次培養の為の培地は、14F/1640である。第2日目には、培地を取り除き、RPMI/1640によって付着細胞を洗浄する。試験されるタンパク質に加えて、2mlの最小培地を添加する。第4日目には、培地を取り除き、細胞よりRNAを調製し、マーカー発現を実数時間数量化逆転写PCR(real time quantitative RT−PRC)によって分析する。タンパク質は、関連するβ細胞マーカーの発現が未処理対照に比較して増加した場合、このアッセイにおいて活性があるものと考える。
14F/1640(Gibco)は、以下のものを加えたRPMI1640:
グループA1:1000
グループB1:1000
組み換えヒトインシュリン10μg/ml
アプロチニン(50μg/ml)1:2000(べーリンガーマンハイム#981532)
ウシ下垂体抽出物(BPE)60μg/ml
ゲンタマイシン100 ng/ml
グループA:(10 mlPBS中)
トランスフェリン、100 mg(シグマ T2252)
上皮細胞成長因子、100μg(BRL 100004)
トリヨードチロニン、5x10−6Mの10μl(シグマ T5516)
エタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ E0135)
ホスホエタノールアミン、10−1Mの100μl(シグマ P0503)
セレニウム、4μlの10−1Mの100μl(Aesar #12574)
グループC:(10 ml 100%エタノール中)
ヒドロコルチゾン、5x10−3M(シグマ #H0135)
プロジェステロン、1 x 10−3M(シグマ P0503)
フォルスコリン、20 mMの500μl(カルバイオケム #344270)
最小培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100ng/ml)、アプロチニン(50μg/ml)及びBPE(15μg/ml)。
限定培地:
RPMI1640プラストランスフェリン(10μg/ml)、インシュリン(1μg/ml)、ゲンタマイシン(100 ng/ml)及びアプロチニン(50μg/ml)。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO162。
【0588】
実施例137:内皮細胞増殖の刺激(アッセイ8)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞(ACE)成長を刺激する能力を示すか否かを測定する用に設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば創傷治癒、及びこれに類似のものを含み、血管新生が有益である症状や疾患の治療的処置において有用であると期待される(これらPROポリペプチドのアゴニストがそうあろうように)。このアッセイにおいて陽性と試験されたPROポリペプチドのアンタゴニストは、癌性腫瘍の治療的処置に対して有用であると期待される。
ウシ副腎皮質毛細管内皮(ACE)細胞(初代培養からのもの、最大12−14継代)を96ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞/ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10%子ウシ血清、2mMグルタミン、及び1xペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む:(1)ACE細胞無添加;(2)ACE細胞のみ;(3)ACE細胞+VEGF(5 ng/ml);及び(4)ACE細胞+FGF(5 ng/ml)。次いで、対照及び試験試料(100マイクロリットル容量)をウェルに添加した(各々、1%、0.1%及び0.01%希釈)。細胞培地を37℃/5%CO2で6−7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をPBSで1x洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロリットル、0.1M酢酸ナトリウム, pH5.5,0.1% トリトンX−100、10mMのリン酸p−ニトロフェニル)を殻ウェルに添加した。37℃で2時間のインキュベーション後に、10マイクロリットルの1NのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度(OD)を405nmでマイクロタイタープレートで測定した。
PROポリペプチドの活性は、(1)細胞のみのバックグラウンドに対する、及び(2)VEGFによる最大刺激に対する(酸ホスファターゼ活性、OD405nmで測定した)増殖増加の倍数として計算した。最大刺激についての活性参照としてVEGF(3−10ng/ml)及びFGF(1−5ng/ml)を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドを越えて>50%である場合に「陽性」と考えた。VEGF(5 ng/ml)対照は1%希釈において1.24倍の刺激を与え;FGB(5 ng/ml)対照は1%希釈において1.46倍の刺激を与えた。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO1075。
【0589】
実施例138:マウスMesengial細胞阻害アッセイ(アッセイ114)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養においてマウスMesengial細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定すように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば嚢胞性腎形成不全、多発性嚢胞腎疾患、又はMesengial細胞の異常増殖に関連する他の腎疾患、腎腫瘍、及びそれに類似のものなどのMesengial細胞増殖の阻害が有益である症状や疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。
1日目、マウスMesengial細胞を、96ウェルプレート上の成長培地(ダルベッコの改変イーグル培地及びハムF12培地の3:1混合、95%ウシ胎児血清、5%14mM HEPES補充)にプレートし、一晩生育させた。2日目には、PROポリペプチドを無血清培地で二つの異なった濃度(1%及び0.1%)に希釈し、細胞へ添加した。対照試料はPROポリペプチドが無添加の成長培地である。48時間に渡り細胞をインキュベーションした後、20μlのCell Titer 96 Aqueous one solution reagent(Progema)を各々のウェルへ添加し、比光分析反応を2時間に渡り継続させた。そして、吸光度を490 nmで測定した。このアッセイにおける陽性は、少なくとも対照試料の示度よりも10%上の吸光度示度を与える全てのものである。
以下の試験ポリペプチドが、このアッセイでポジティブであった:PRO200、PRO697。
【0590】
実施例139:軟骨細胞増殖アッセイ(アッセイ111)
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養において軟骨細胞の増殖を阻害する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えばスポーツ傷害及び関節炎などの種々の骨及び/又は軟骨組織疾患の治療的処置に対して有用であると期待される。
ブタ軟骨細胞を、4−6ヶ月の年長雌ブタの中手指節関節の関節軟骨より一晩に渡るコラゲナーゼ消化によって単離した。そして、単離された細胞を25,000細胞/cm2の割合で、10%FBS及び4μg/mlゲンタマイシンを含むハムF−12へ接種する。培地は3日ごとに換えられ、細胞は25,000細胞/cm2となるように5日ごとに再接種された。12日目に、細胞を5,000細胞/ウェルの割合の血清を含まない100μlの同じ培地の96ウェルプレートへ接種し、無血清培地(負の対照)、スタウロスポリン(最終濃度5nM;正の対照)又は試験PROポリペプチドを添加して200μl/ウェルの最終容量とした。37℃の5日間の後、20μlのアラマーブルー(Alamar blue)を各ウェルへ添加し、プレートをさらに3時間、37℃でインキュベートした。そして、各ウェルの蛍光を測定した(Ex:530 nm;Em:590 nm)。バックグラウンドを得るために、200μlの無血清培地を含むプレートの蛍光を測定した。このアッセイの陽性の結果は、PROポリペプチド処理試料の蛍光が負の対照のそれよりも正の対照のそれのような場合において得られる。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO181、PRO200及びPRO322。
【0591】
実施例140:ラットDRGニューロン生存阻害アッセイ
このアッセイは、本発明のPROポリペプチドが培養においてニューロン細胞生存を阻害する能力を示すか否かを測定するように設計されている。このアッセイにおいて陽性と試験されたポリペプチドは、例えば神経芽細胞腫、神経膠腫、グリア芽細胞腫、及び類似の症状を含む所望されない神経細胞増殖に関連する神経障害性症状の治療的処置に対して有用であると期待される。
E14ラット胎児の背側神経節から新たに単離された神経細胞の異種性集団をF12完全培地で希釈し、50μlのF12完全培地を含みポリオルニチンで前処理されたプレートに5000細胞/ウェルで配する。そして、50μl付加的アッセイ培地を伴う試験PROポリペプチド(50μl、1濃度)を、生存阻害活性の試験の為に添加する。全体で100μlの更なる培地に添加した。負の対照は、100μlの完全培地のみで処理される。3日間のインキュベーシュンの後、細胞をCMFDAで染色し、1時間の4%パラホルムアルデヒド処理の後に固定した。ついで、細胞は、NIHイメージ分析によって数量化された。本アッセイの陽性は、処理ウェル中の細胞数が未処理対照(コントロール)ウェルの0.5より低い場合である。
以下の試験ポリペプチドがこのアッセイでポジティブであった:PRO195及びPRO701。
【0592】
実施例141:組織発現分布
オリゴヌクレオチドプローブを、定量PCR増幅反応の使用において、付随する図に示すPROポリペプチドコード化ヌクレオチド配列から構築した。オリゴヌクレオチドプローブを、標準的PCR反応に関連したテンプレートの3’ 末端から、約200−600塩基対の増幅された断片が付与されるように選択した。オリゴヌクレオチドプローブを、異なるヒト成人及び/又は胎児の組織源から単離されたcDNAライブラリーを用いた標準的な定量PCR増幅反応に使用し、試験した種々の組織におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現レベルを定量的測定を得るためにアガロースゲル電気泳動により分析した。種々の異なるヒト組織型におけるPROポリペプチドコード化核酸の発現パターンの知識は、転移腫瘍等の一次組織源を決定するために、他の組織特異的マーカーを用いて又は用いない組織分類分けに有用な診断用マーカーが提供される。これらのアッセイは、以下の結果を提供する。
【0593】
実施例 142:インサイツハイブリダイゼーション
インサイツハイブリッド形成は、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び局在化のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定及び局在化、特定mRNA合成及び染色体マッピングにおける追跡に有用である。
インサイツハイブリッド形成は、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169−176 (1994)のプロトコールの最適な変形に従って、PCR生成33P−標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリッド形成する。[33P]UTP−標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリッド形成する。スライドをKodak NTB2核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
【0594】
33P−リボプローブ合成
6.0μl(125mCi)の33P−UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P−UTPを含む管に以下の成分を添加した:
2.0μlの5x転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 10μ; 10mMのGTP, CTP&ATP+10μlのH2O)
1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRnasin
1.0μlのDNAテンプレート(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS, T7=S,通常)
管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon−50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBiofluor IIで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1−3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180−250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−17℃冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
【0595】
33P−ハイブリッド形成
A.凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250 mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10 mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
B.パラフィン包埋切片の前処理
スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10 mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
C.プレハイブリッド化
スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリッド形成バッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1−4時間インキュベートした。
D.ハイブリッド形成
スライド当たり1.0x106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリッド形成バッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
E.洗浄:
洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf = 4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250 ml RNaseバッファー中10 mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2x10分間、EDTAで室温において洗浄した。緊縮性洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20x SSC+16 mlのEDTA、Vf=4L)。
F.オリゴヌクレオチド
ここに開示した種々のDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析に用いたオリゴヌクレオチドは、ここに開示したヌクレオチド配列から派生したもので、一般的に約40から50ヌクレオチドの長さである。
【0596】
G.結果
ここに開示した種々のDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析の結果は、以下の通りである。
(1)DNA29101−1122(PRO200)
胎児:
軟骨原基の縁(例えば外縁周辺)における発育中の下肢骨、発育中の腱、血管平価通勤及び細胞包含発育中の骨格筋筋細胞及び筋管における下肢発現。発現は、骨端の成長板でも観察された。発達中のリンパ節の周縁洞におけるリンパ節発現。胸腺皮質の被膜下領域における胸腺発現、おそらく、被膜下内皮細胞又はこの領域で見られる増殖中の二重ネガティブ胸腺のいずれか。脾臓はネガティブである。平滑筋における気管発現。皮質ニューロンにおける脳(小脳皮質)病巣発現。脊髄はネガティブ。平滑筋における小腸発現。甲状腺−甲状腺内皮を越える一般化発現。副腎はネガティブ。管板細胞における肝臓発現。壁平滑筋における胃発現。鱗状内皮の基底層における胎児皮膚発現。栄養膜絨毛の胃腸細胞における膵臓発現。動脈及び静脈の壁における索発現。
コメント:発現パターンは、PRO200が細胞分化/増殖に含まれていることを示唆している。
高発現は以下の付加的部位で観察された:チンパンジー卵巣−成熟小胞の顆粒膜細胞、低強度シグナルが包膜細胞で観察された。チンパンジー上皮小体−主細胞全体の高発現。ヒト胎児精巣−発育中の細管を囲む間質細胞全体に中程度の発現。ヒト胎児肺−発育中の気管支の軟骨細胞全体の高発現、及び分岐している気管支内皮における低レベル発現。腎臓細胞、胃腸及び結腸肉腫では特定の発現は観察されなかった。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、及び下肢。試験した成人組織は:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃腸肉腫、結腸、結腸肉腫及び骨盤肉腫を含む。アセトミノフェン(acetominophe)は肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
(2)DNA30867−1335(PRO218)
胎児小腸、胎児胸腺、チンパンジー胃腸内皮を含む多数の内皮全体に低レベルの発現。発現は、幹細胞癌の悪性細胞全体にも見られた。胎児脳、皮質全体の発現。分布は明らかな機能を示唆していない。試験したヒト胎児組織(E12−E16週)は:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢を含む。試験した成人組織は、腎臓(正常及び末期)、膀胱、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、結腸、膀胱、肝臓(正常、肝硬変、急性不全)、心臓、腎臓の明細胞癌、胃腸腺癌、結腸直腸癌を含む。試験した非ヒト霊長類組織は以下を含む:チンパンジー組織:唾液腺、胃、甲状腺、腹甲状腺、舌、胸腺、卵巣、リンパ節、末梢神経。アカゲザル組織:大脳皮質、海馬、小脳、陰茎。
(3)DNA40021−1154(PRO285)
低レベル発現が、骨盤及びマウス胎児肝臓の造血細胞で観察された。ヒト胎児、成人又はチンパンジーリンパ節のいずれにも発現は検出されず、ヒト胎児又はヒト成人脾臓で発現は検出されなかった。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、脳梗塞(ヒト)、大脳(ヒト)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、結腸、結腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトミノフェンは肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
【0597】
(4)DNA39523−1192(PRO273)
マウス胚皮膚の内皮全体並びにヒト胎児皮膚の基底内皮及び上皮全体の発現。チンパンジー舌の鱗状粘膜の基底内皮ペッグ(pegs)もポジティブであった。胎児腎臓の発育中の糸球体、成人腎臓細管、及び末期腎臓疾患の「甲状腺化」内皮の細胞のサブセット全体の発現、腎細胞癌、おそらく内皮細胞全体の低発現。胎児肺の間質細胞全体の低レベル発現。胃腸腺の先端部分における間質細胞全体の発現。胎児小腸絨毛の固有層、正常結腸粘膜、及び結腸癌における間質細胞全体の高発現。肉腫のヒラン化(hylanized)支質における良性結合組織細胞全体の強い発現。胎盤絨毛及び脾赤髄における支質細胞全体の発現。脳においては、皮質ニューロン全体の発現。発育中の骨を囲む結合組織及び胎児の神経鞘細胞全体。試験した胎児組織(E12−E16)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、リンパ節、前立腺、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫。アセトミノフェンは肝臓障害及び肝硬変を誘発した。
サル大脳皮質の外層(I及びII)における多数の細胞に発現が存在した。より深い皮質層の細胞の小さなサブセットも、このケモカイン相同体のmRNAを発現した。海馬の分子層内の散乱細胞及び歯状回の内部辺縁の境界はケモカイン相同体mRNAを含んでいた。大脳皮質内では発現は検出されなかった。ケモカイン相同体発現は、ケモカイン相同体が正常に発現される領域において細胞死が起こった梗塞脳では観察されなかった。このプローブは、大脳皮質の外層のニューロンのサブセットのマーカーとして提供され、ニューロン移動障害を明らかにできる。異常なニューロン移動は、幾つかの発作性疾患及び精神分裂病の原因となりうる。このmRNAの分布のよりよい理解を促進するために、我々は、このプローブがマウス脳組織と交差ハイブリッド形成するか否かを試験した。
また、生後(P)10日及び成熟マウス脳内にイントリギューイング(intriguing)及び特定のハイブリッド形成を示した。P10マウスの1つの矢状切断において、海馬の分子層及び歯状回の内辺縁に散乱した強いシグナルが観察された。プレ鉤状回における細胞は中程度に標識され;シグナルは強い帯中を、後部板状皮質の外層を通って後頭皮質まで伸び、そこでシグナルはバックグラウンドレベルの低下する。ポジティブニューロンの小セットがP10運動皮質の深い領域で検出された。P10皮質の外層内のニューロンはバックグラウンドを越えるシグナルを示さなかった。中程度のハイブリッド形成シグナルも下丘で検出された。成熟マウス脳におけるケモカイン相同体シグナルは、異なるレベルの3つの冠状断面で評価した。強いシグナルは隔壁及び橋核の散乱ニューロン及び三叉神経の運動根で検出された;中程度のシグナルは海馬の分子層及び後部板状皮質の外層に見られた。
【0598】
(5)DNA39979−1213(PRO296)
胎児及び成人組織での広範な発現。種々の胎児及び成人内皮、骨格及び心筋、発達中の(網膜を含む)及び成人CNS、甲状腺内皮、胎盤絨毛、硬変の肝細胞及びアセトアミノフェン誘発毒素で発現した。発達中の骨格系の軟骨細胞において高度に発現された。全発現パターンは、完全に重複していないが(糸球体で発現せず、CNSでより広く発現する)、VEGFに非類似ではない。従って、新脈管形成における可能な役割が考えられるべきである。試験したヒト胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、大血管、胃、小腸、脾臓、胸腺、前立腺、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤、精巣、及び下肢。試験したヒト成人組織:腎臓(正常及び末期)、副腎、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、眼(網膜を含む)、膀胱、肝臓(正常、硬変、急性不全)。試験した非ヒト霊長類組織:チンパンジー組織:副腎。アカゲザル組織:大王皮質、海馬、小脳。
(6)DNA52594−1270(PRO868)
胎児脊髄神経節、脊髄、発達中の腸ニューロン、皮質性ニューロンにおけるニューロン細胞全体の発現。成人組織では、顕著な発現が観察された唯一の部位は正常成人前立腺であり;それは前立腺細胞表面レセプター標的抗原を表示しうる。成人組織における発現をさらに特徴付ける研究は適正であったと思われる。脂肪肉腫においても低レベル発現が観察された。試験した胎児組織(E12−E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織:肝臓、腎臓、副腎、心筋層、大動脈、脾臓、肺、皮膚、軟骨肉腫、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、肝細胞癌、前立腺、膀胱粘膜及び胆嚢。アセトアミノフェンは、肝臓障害及び肝硬変を誘発した。試験したアカゲザル組織:大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳。試験したチンパンジー組織:甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎、胃腸粘膜及び唾液腺。ヒト乳癌及び正常乳房組織におけるWIG−1(WISP−1), WIG−2(WISP−2)及びWIG−5(WISP−3)の発現、肺癌におけるWig−2及び結腸癌におけるWig−5。
【0599】
(7)DNA64907−1163(PRO1330)
ヒト胎児組織において、胎児脳を除く試験した全ての組織で、動脈、静脈、毛細血管及び洞様毛細血管内皮全体に強い特異的発現が存在した。正常成人組織では、発現は低いか無かったが、発現が現れた場合には脈管構造に確認された。成人組織における最も高い発現は、アカゲザル脳の白質内を走る血管の領域であり−このパターンの意義は明確ではない。腫瘍脈管構造を含む多くの炎症性及び障害性組織の脈管構造で向上した発現が観察された。これらの組織の幾つかでは、発現が血管内皮のみに確認されるか否かは不明であった。試験した15の肺腫瘍では、悪性内皮全体に発現は見られなかったが、血管発現は腫瘍及び隣接肺組織の多くで観察された。中程度の明らかに非特異的なバックグラウンドは、このプローブで、ヒアリン化コラーゲン及び組織壊死の部位で見られた。しかし、センスコントロール無しでは、これら全てのシグナルが非特異的であることを完全に確かめるのは不可能である。また、非特異的と考えられる幾つかのシグナルは、チンパンジー胃粘膜全体、ヒト成人膀胱の移行細胞内皮及び胎児網膜で見られた。
(8)DNA49624−1279(PRO545)
ADAMファミリー分子であるADAM 12(DNA49624−1279)の発現は、正常ヒト胚、肺腫瘍、正常結腸及び結腸癌で観察された。
(9)DNA59294−1381(PRO1031)
このIL17相同体の発現は、正常成人及び胎児組織及び炎症、主に慢性リンパ球炎症を持つ組織からなるパネルで評価した。このパネルは、Tリンパ球作用を媒介(刺激性又は阻害性)する新規なタンパク質の免疫媒介疾患における発現パターンを特異的に評価するために設計した。このタンパク質は、Ig−融合タンパク質として発現された場合は、ヒト混合リンパ球反応(MLR)において用量依存的に免疫刺激性であり;2つの異なる濃度(1.0%及び0.1%の560 nMストック)で用いられたとき、ベースライン刺激指数より285%及び147%という増加を生じる。要旨:発現は、筋肉、成人の或る種の型の平滑筋及びヒト胎児の平滑筋に制限された。ヒト成人における発現は、結腸及び胆嚢を含む管器官の平滑筋において評価された。血管及び気管支の平滑筋では発現されなかった。ヒト成人骨格筋は評価しなかった。胎児組織において、骨格筋、体幹骨格及び肢における中程度から高度の拡散発現があった。腸壁の平滑筋では弱い発現があったが、心筋では発現されなかった。発現したヒト成人組織:結腸、慢性炎症性腸疾患を持つ5検体において平滑筋(筋層)で低レベルの拡散発現があった。胆嚢:胆嚢の平滑筋で弱から低レベルの発現があった。発現したヒト胎児組織:骨格筋において中程度の拡散発現及び平滑筋において弱から低レベル発現があった;胎児心臓又は肝臓、脾臓、CNS、腎臓、腸、肺を含む他の任意の器官では発現は無かった。発現の無いヒト組織:慢性肉芽腫炎症及び慢性気管支炎(5患者)の肺、末梢神経、心臓、胎盤、肝臓(疾患多重ブロック)、脳(大脳及び小脳)、扁桃(反応性過形成)、末梢リンパ節、胸腺。
【0600】
(10)DNA45416−1251(PRO362)
この新規なタンパク質の発現は、種々のヒト及び非ヒト霊長類組織で評価し、高度に制限されていることが見出された。発現は、肺の肺胞マクロファージ及び肝臓洞様毛細血管のクップファー細胞にのみ存在した。これらの細胞での発現は、これら識別可能な細胞集団が活性化されたときに有意に増加した。組織マクロファージのこれら2つの亜集団は異なる器官に局在化し、それらは類似の生物学的機能を有する。これら両方の型の食細胞は、病原、老化細胞及びタンパク質を含む血流又は気道からの物質を除去するフィルターとして作用し、ともに広範な重要なプロ炎症サイトカインを分泌することができる。炎症性肺(7患者サンプル)では、発現は反応性肺胞マクロファージ細胞集団において顕著であり、肺胞内に1個又は凝集体で存在する大きくて青白く、しばしば空胞を持つ細胞によって定まり、正常で非反応性マクロファージ(正常サイズの単一の散乱細胞)においては弱からネガティブであった。肺胞マクロファージでの発現は、これらの細胞が数及びサイズともに増大(活性化)したとき、炎症の間に増加した。これらの組織の間質炎症及び気管支周辺リンパ細胞過形成の領域に組織球が存在するにも関わらず、発現は肺胞マクロファージに制限されていた。多くの炎症性肺も幾分の炎症抑制を有し;発現は神経向性の顆粒球に存在しなかった。肝臓においては、急性中心小葉性壊死(アセトアミノフェン毒性)又はかなり顕著な門脈周囲の炎症を持つ肝臓において反応性/活性化クップファー細胞に強い発現があった。しかしながら、正常肝臓又は穏和から中程度の小葉過形成/肥大のみを持つ肝臓におけるクップファー細胞では発現が無かった。即ち、肺と同様に、活性化/反応性細胞において発現の増加があった。炎症性腸疾患、過形成/反応性扁桃又は正常リンパ節に存在する組織球/マクロファージにおいて、この分子の発現は無かった。全てが組織球炎症又は常在性マクロファージ集団を含むこれらの組織で発現が無いことは、肺胞マクロファージ及び肝臓クップファー細胞として定義される独特のマクロファージサブセット集団に制限された発現を強く支持する。脾臓又は骨髄は、評価できなかった。検出可能な発現を示さなかった評価したヒト組織は以下を含む:炎症性腸疾患(中程度から重症の7患者サンプル)、反応性過形成を持つ扁桃、末梢リンパ節、乾癬皮膚(穏和から中程度の疾患を持つ2患者サンプル)、心臓、末梢神経。検出可能な発現を示さなかった評価したチンパンジー組織は以下を含む:舌、胃、胸腺。
(11)DNA52196−1348(PRO733)
多数の組織及び多数の細胞型における一般化された低レベルのシグナル。内皮細胞発現が観察されたが、それは、胎児、正常又は疾患組織において主要な特徴ではなかった。ヒト組織:胎児肝臓(主に肝細胞)全体、肺、皮膚、副腎及び心臓における中程度の発現。胎児脾臓、小腸、脳及び眼はネガティブ。成人正常腎臓、膀胱内皮、肺、副腎、膵臓、皮膚−全てネガティブ。ヒト成人肝臓(正常及び疾患)、末期腎臓疾患の腎臓細管、脂肪組織、肉腫、結腸、腎細胞癌、肝細胞癌、鱗状細胞癌。非ヒト霊長類組織:チンパンジー唾液腺、脈管、胃、舌、末梢神経、胸腺、リンパ節、甲状腺及び腹甲状腺。アカゲザル脊髄はネガティブ、皮質及び海馬ニューロンはポジティブ。
【0601】
実施例143:ヒトPRO4993をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に関連したコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列は、ここにおいてDNA85042と命名された。ある場合、DNA85042コンセンサス配列は、BLASTの繰り返しサイクル及びphrapを上記で論じられたEST配列の起源を使用し可能な限りそのDNAの中間体コンセンサス配列を延長するために使用して延長された中間体コンセンサスDNA配列より派生する。DNA85042に基づいて、オリゴヌクレオチドが:1)PCRによって対象となる配列を含んでいたcDNAライブラリーを同定する、そして2)PRO4993のための全長コード化配列のクローンを単離するためのプローブとしての使用のために合成された。
PCRプライマー(正及び逆)が合成された:
正方向のPCRプライマー 5’−AGATGTGAAGGTGCAGGTGTGCCG−3’
(配列番号:619)
逆方向のPCRプライマー 5’−GAACATCAGCGCTCCCGGTAATTCC−3’
(配列番号:620)
さらには、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスDNA85042配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ
5’−CCAGCCTTTGAATGGTACAAAGGAGAGAGAAGAAGCTCTTCAATGGCC−3’
(配列番号:621)
cDNAライブラリーの構築のためのRNAがヒト胎児脳組織から単離された。
上記に記載したような単離されたクローンのDNAシーケンシングは、全長PRO4993ポリペプチド(ここにおいてはDNA94832−2659[Figure 229、配列番号611]と命名)のための全長DNA配列及び派生したPRO4993ポリペプチドのためのタンパク質配列を与える。
上記の同定された全長クローンは、ヌクレオチド位置305−307の明白な翻訳開始点及びヌクレオチド位置1361−1363の終止シグナル(Figure 229,配列番号611)を含んだ。予想されたポリペプチド前駆体は352アミノ酸長で、およそ38,429ダルトンの計算された分子量及びおよそ6.84の見積もりpIを有する。Figure230(配列番号:612)に示されている全長PRO4993の分析は、重要なポリペプチドドメインへ与えられた位置が上記に記載されているようにおおよそであるFigure230に示されている種々の重要なポリペプチドドメインの存在を明示する。DNA94832−2659クローンは1999年6月15日にATCCへ寄託され、ATCC寄託番号no.240−PTAが与えられた。
Figure230(配列番号:612)に示された全長配列のALIGN−2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析は、PRO49993アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:P_W05152;LAMP_HUMAN;P_W05157;P_W05155;I56551;OPCM_RAT;AMAL_DROME;DMU78177_1;I37246;及びNCA_1HUMANとの間の配列の相同性を明示した。
【0602】
実施例144:ヒトPRO1559、PRO725及びPRO739をコードするcDNAクローンの単離
実施例1に記載したように、他のEST配列に関連したコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列とIncyteESTクローンNo.4242090に含まれるEST配列との間に観察された相同性に基づいて、IncyteESTクローンNo.4242090を取得し、その挿入断片を得て配列を決定した。挿入断片配列が、ここにおいてPRO1559(Figure232;配列番号:614)と命名された全長タンパク質をコードすることが発見された。挿入断片(DNA68886)のDNA配列は、Figure231(配列番号:613)に示されている。
上記の実施例2に記載のアミラーゼスクリーンで単離されたcDNA配列は、ここにおいてDNA43301と命名された。そして、DNA43301は、公共のESTデーターベース(例えばGenBank)及び自社のEST DNAデーターベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto、CA)を含んだ現存の相同性を同定するための種々の発現配列tag(EST)データーベースと比較された。相同性の検索は、コンピュータープログラムBLAST又はBLAST2(Altshul等.,Methods in Enzymology 266:460−480(1996))を使用しておこなわれた。既知のタンパク質をコードしない70(又はある場合は90)又はそれ以上のBLASTスコアとなったこれらの比較は、プログラム「pharp」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)によってコンセンサスDNA配列へと集められ組み立てられた。それから得られたコンセンサス配列は、ここにおいてDNA45458と命名された。DNA45458コンセンサス配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブが作られ、上記の実施例2のパラグラフ1に示されているように調製されたヒト胎児脳(LIB153)ライブラリーの選別に使用された。クローニングベクターはpRK5B(pRK5Dは、pRK5Dの前駆体でSfiI部位を含まない;Holmes等.,Science,253:1278−1280(1991)を参照のこと)で、切り出されたcDNAのサイズは2800bpより小さい。
PCRプライマー(正及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(45458.fl)5’−CCAAACTCACCCAGTGAGTGTGAGC−3’
(配列番号:619)
逆方向PCRプライマー(45458.rl)5’−TGGGAAATCAGGAATGGTGTTCTCC−3’
(配列番号:620)
さらには、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを、以下のヌクレオチド配列を有するコンセンサスDNA45458配列から構築した。
ハイブリダイゼーションプローブ(45458.p1)
5’−CTTGTTTTCACCATTGGGCTAACTTTGCTGCTAGGAGTTCAAGCCATGCC−3’
(配列番号:621)
【0603】
全長クローンの起源の為の幾つかのライブラリーを選別するために、ライブラリーからのDNAを上記で同定したPCRプライマー対によるPCR増幅によって選別した。そして、陽性のライブラリーを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマーの一つをを使用するPRO725をコードするクローンの単離に使用した。
全長クローンは、明白な翻訳開始位置をヌクレオチド161−163に持ち、ヌクレオチド位置455−457に見出される終止コドンで終了する単一のオープンリーデングフレームを含むと同定された(Figure233;配列番号:615)。予想されるポリペプチド前駆体は98アミノ酸長で、おおよそ11,081ダルトンの計算された分子量とおおよそ6.68の見積もりpIを有する。Figure234(配列番号:616)に示された全長PRO725配列の解析は、以下のことを明示した:約アミノ酸1から約アミノ酸20の単一ペプチド、約アミノ酸72から約アミノ酸75の潜在的N−グリコシル化部位、及び約アミノ酸63から約アミノ酸70のチロシンキナーゼリン酸化部位。クローンDNA52758−1399は、1998年4月14日にATCCへ寄託され、ATCC寄託番号no.209773を与えられた。
全長PRO725のアミノ酸配列の解析は、PRO725があらゆる既知のタンパク質に対して有意な配列相同性を有しないことを示唆する。しかし、Dayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)は、PRO725アミノ酸配列と以下のDayhoff配列:POL_
BLVAU、PSSP_RAT、CELC36C5_7、AF019234_1、I48862、P_R12498、P_P10125、P_R26861、A64527及びP_W20495との間のある程度の相同性を明示した。
Figure235(配列番号:617)に示され、そして天然PRO739ポリペプチ(Figure236;配列番号618)をコードするDNA52756がGenBankから得られた。
【0604】
実施例145:受容体/リガンド相互作用の同定
このアッセイでは、受容体/リガンド相互作用の同定を目的として、種々のPROポリペプチドは潜在的受容体分子のパネルとの結合する能力が試験される。既知の受容体へのリガンド、既知のリガンドへの受容体又は新規の受容体/リガンド対の同定は、例えば受容体又はリガンドを発現することが知られている細胞をの生物活性分子(リガンド又は受容体へ連結している)の標的にすること、組成物がリガンド又は受容体を発現することが推定される細胞を含む場合にリガンド又は受容体をを含むと推測される組成物の中にリガンド又は受容体の存在を検出する為に受容体又はリガンドを試薬として使用すること、受容体又はリガンドを発現或いはこれらへ反応することが知られた細胞の生育又はその他の生物学的或いは免疫学的活性を調節すること、受容体又はリガンドを発現する細胞の免疫応答或いはこれら細胞への免疫応答を調節すること、受容体又はリガンドを発現する細胞の生育又は生物学的或いは免疫学的活性を調節する受容体又はリガンドに対して向けられたアゴニスト、アンタゴニスト及び/又は抗体の調製を可能すること、及び普通の熟練した技術者には容易に理解できる多様な他の指示を含む種々の指示にとって有用である。
このアッセイは、以下のようにしておこなわれた。受容体のリガンドと推測される本発明のPROポリペプチドを、ヒトIgG(イムノアドヘシン(immunoadhesin))のFcドメインを含む融合タンパク質として発現する。受容体−リガンド結合は、イムノアドヘシンポリペプチドと候補PROポリペプチド受容体を発現する細胞(例えばCos細胞)との相互作用及び結合イムノアドヘシンをFc融合ドメインを対象とする蛍光試薬による視覚化、そして顕微鏡での検定を可能にすることによって検出される。候補受容体を発現している細胞は、同時に、受容体分子として機能するPROポリペプチドをコードするcDNA発現ベクターのライブラリーの明確な一組の過度的な形質導入によって生成される。次に、細胞を、受容体結合の可能性について試験されたPROポリペプチドイムノアドヘシンの存在下で1時間インキュベートする。そして、細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定する。次に、細胞をPROポリペプチドイムノアドヘシンのFc部分を対象とした蛍光共役抗体とともにインキュベートする(例えばFITC共役ヤギ抗−ヒト−Fc抗体)。そして、再び細胞を洗浄し、顕微鏡によって検査する。陽性の相互作用は、特定のPROポリペプチド受容体又は受容体プールをコードしているcDNAによって形質移入された細胞の蛍光ラベリングの存在、及び他のcDNA又はcDNAのプールによって形質移入されている同じように調製された細胞の同じような蛍光ラベリングの不在によって判断される。限定されたcDNA発現ベクターのプールがPROポリペプチドイムノアドヘシンとの相互作用の為に陽性と判断された場合、プールを構成する個々のcDNA種は、PROポリペプチドイムノアドヘシンと相互作用することができる受容体をコードする特定のcDNAを決定するために個々(プールは「壊れている」)に試験される。
【0605】
このアッセイのその他の実施態様では、エピトープ−タッグ潜在性リガンドPROポリペプチド(例えば8ヒスチジン「His」タッグ)は、ヒトIgG(イムノアドヘシン)のFcドメインとの融合物として発現される潜在性レセプターPROポリペプチドのパネルと相互作用することが可能とされる。エピトープタッグPROポリペプチドとの1時間の共同インキュベーションの後、候補受容体は、各々プロテインAビーズによって免疫沈降されてビーズは洗浄される。潜在的リガンド相互作用は、免疫沈降複合物とエピトープタッグを対象とした抗体のウエスタンブッロト解析によって決定される。相互作用は、エピトープタッグタンパク質の期待される分子量のバンドが候補受容体とともにウエスタンブロット解析において観察されるが、潜在的受容体のパネルの他のメンバーとともに生じることが観察されない場合、相互作用は生じると判断される。
これらのアッセイを使用して、ここにおいて以下の受容体/リガンド相互作用が同定された:PRO337がPRO4993に結合、PRO1559がPRO725に結合、PRO1559がPRO700に結合、及びPRO1559がPRO739に結合。
【0606】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,12301 パークラウンドライブ、ロックビル、MD、USA(ATCC)に寄託した:
【0607】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から30年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテク社とATCCとの間の合意に従い、ATCCから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886O G638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許庁長官が決定した者に子孫を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した材料が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと即座に取り替えることに同意する。寄託材料の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
【図の簡単な説明】
【Fig1】配列番号:1が、ここにおいて「UNQ187」及び/又は「DNA30943−1163」と命名されたクローンである、天然配列PRO213cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:1)を示す。
【Fig2】Fig1に示されている配列番号:1のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。
【Fig3】配列番号:6が、ここにおいて「UNQ241」及び/又は「DNA39987−1184」と命名されたクローンである、天然配列PRO274cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:6)を示す。
【Fig4】Fig3に示されている配列番号:6のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:7)を示す。
【Fig5】DNA17873(配列番号:8)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig6】DNA36157(配列番号:9)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig7】DNA28929(配列番号:10)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig8】配列番号:18が、ここにおいて「UNQ263」及び/又は「DNA46025−1189」と命名されたクローンである、天然配列PRO300cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:18)を示す。
【Fig9】Fig8に示されている配列番号:18のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:19)を示す。
【Fig10】配列番号:27が、ここにおいて「UNQ247」及び/又は「DNA23318−1211」と命名されたクローンである、天然配列PRO284cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:27)を示す。
【Fig11】Fig10に示されている配列番号:27のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:28)を示す。
【Fig12】DNA12982(配列番号:29)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig13】DNA15886(配列番号:30)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig14】配列番号:35が、ここにおいて「UNQ260」及び/又は「DNA39979−1213」と命名されたクローンである、天然配列PRO296cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:35)を示す。
【Fig15】Fig14に示されている配列番号:35のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:36)を示す。
【Fig16】DNA23020(配列番号:37)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig17】DNA21971(配列番号:38)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig18】DNA29037(配列番号:39)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig19】配列番号:44が、ここにおいて「UNQ291」及び/又は「DNA40594−1233」と命名されたクローンである、天然配列PRO329cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:44)を示す。
【Fig20】Fig19に示されている配列番号:44のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:45)を示す。
【Fig21】配列番号:51が、ここにおいて「UNQ317」及び/又は「DNA45416−1251」と命名されたクローンである、天然配列PRO362cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:51)を示す。
【Fig22】Fig21に示されている配列番号:51のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:52)を示す。
【Fig23】配列番号:58が、ここにおいて「UNQ318」及び/又は「DNA45419−1252」と命名されたクローンである、天然配列PRO363cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:58)を示す。
【Fig24】Fig23に示されている配列番号:58のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:59)を示す。
【Fig25】配列番号:63が、ここにおいて「UNQ437」及び/又は「DNA52594−1270」と命名されたクローンである、天然配列PRO868cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:63)を示す。
【Fig26】Fig25に示されている配列番号:63のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:64)を示す。
【Fig27】配列番号:68が、ここにおいて「UNQ323」及び/又は「DNA45234−1277」と命名されたクローンである、天然配列PRO382cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:68)を示す。
【Fig28】Fig27に示されている配列番号:68のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:69)を示す。
【Fig29】、配列番号:73が、ここにおいて「UNQ346」及び/又は「DNA49624−1279」と命名されたクローンである、天然配列PRO545cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:73)を示す。
【Fig30】Fig29に示されている配列番号:73のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:74)を示す。
【Fig31】DNA13217(配列番号:75)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig32】配列番号:84が、ここにおいて「UNQ353」及び/又は「DNA48309−1280」と命名されたクローンである、天然配列PRO617cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:84)を示す。
【Fig33】Fig32に示されている配列番号:84のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:85)を示す。
【Fig34】、配列番号:89が、ここにおいて「UNQ364」及び/又は「DNA46776−1284」と命名されたクローンである、天然配列PRO700cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:89)を示す。
【Fig35】Fig34に示されている配列番号:89のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:90)を示す。
【Fig36】配列番号:96が、ここにおいて「UNQ366」及び/又は「DNA50980−1286」と命名されたクローンである、天然配列PRO702cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:96)を示す。
【Fig37】Fig36に示されている配列番号:96のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:97)を示す。
【Fig38】配列番号:101が、ここにおいて「UNQ367」及び/又は「DNA50913−1287」と命名されたクローンである、天然配列PRO703cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:101)を示す。
【Fig39】Fig38に示されている配列番号:101のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:102)を示す。
【Fig40】配列番号:108が、ここにおいて「UNQ369」及び/又は「DNA50914−1289」と命名されたクローンである、天然配列PRO705cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:108)を示す。
【Fig41】Fig40に示されている配列番号:108のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:109)を示す。
【Fig42A−B】配列番号:113が、ここにおいて「UNQ372」及び/又は「DNA48296−1292」と命名されたクローンである、天然配列PRO708cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:113)を示す。
【Fig43】Fig42A−Bに示されている配列番号:113のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:114)を示す。
【Fig44】、配列番号:118が、ここにおいて「UNQ281」及び/又は「DNA32284−1307」と命名されたクローンである、天然配列PRO320cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:118)を示す。
【Fig45】Fig44に示されている配列番号:118のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:119)を示す。
【Fig46】配列番号:123が、ここにおいて「UNQ285」及び/又は「DNA36343−1310」と命名されたクローンである、天然配列PRO324cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:123)を示す。
【Fig47】Fig46に示されている配列番号:123のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:124)を示す。
【Fig48】配列番号:131が、ここにおいて「UNQ308」及び/又は「DNA40571−1315」と命名されたクローンである、天然配列PRO351cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:131)を示す。
【Fig49】Fig48に示されている配列番号:131のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:132)を示す。
【Fig50】配列番号:136が、ここにおいて「UNQ309」及び/又は「DNA41386−1316」と命名されたクローンである、天然配列PRO352cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:136)を示す。
【Fig51】Fig50に示されている配列番号:136のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:137)を示す。
【Fig52】配列番号:144が、ここにおいて「UNQ322」及び/又は「DNA44194−1317」と命名されたクローンである、天然配列PRO381cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:144)を示す。
【Fig53】Fig52に示されている配列番号:144のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:145)を示す。
【Fig54】配列番号:149が、ここにおいて「UNQ326」及び/又は「DNA45415−1318」と命名されたクローンである、天然配列PRO386cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:149)を示す。
【Fig55】Fig54に示されている配列番号:149のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:150)を示す。
【Fig56】DNA23350(配列番号:151)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig57】DNA23536(配列番号:152)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig58】配列番号:156が、ここにおいて「UNQ341」及び/又は「DNA44189−1322」と命名されたクローンである、天然配列PRO540cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:156)を示す。
【Fig59】Fig58に示されている配列番号:156のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:157)を示す。
【Fig60】配列番号:161が、ここにおいて「UNQ352」及び/又は「DNA48304−1323」と命名されたクローンである、天然配列PRO615cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:161)を示す。
【Fig61】Fig60に示されている配列番号:161のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:162)を示す。
【Fig62】配列番号:168が、ここにおいて「UNQ354」及び/又は「DNA49152−1324」と命名されたクローンである、天然配列PRO618cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:168)を示す。
【Fig63】Fig62に示されている配列番号:168のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:169)を示す。
【Fig64】DNA35597(配列番号:170)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig65】配列番号:177が、ここにおいて「UNQ387」及び/又は「DNA49646−1327」と命名されたクローンである、天然配列PRO719cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:177)を示す。
【Fig66】Fig65に示されている配列番号:177のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:178)を示す。
【Fig67】配列番号:182が、ここにおいて「UNQ389」及び/又は「DNA49631−1328」と命名されたクローンである、天然配列PRO724cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:182)を示す。
【Fig68】Fig67に示されている配列番号:182のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:183)を示す。
【Fig69】配列番号:189が、ここにおいて「UNQ410」及び/又は「DNA49645−1347」と命名されたクローンである、天然配列PRO772cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:189)を示す。
【Fig70】Fig69に示されている配列番号:189のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:190)を示す。
【Fig71】DNA43509(配列番号:191)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig72】配列番号:195が、ここにおいて「UNQ418」及び/又は「DNA45493−1349」と命名されたクローンである、天然配列PRO852cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:195)を示す。
【Fig73】Fig72に示されている配列番号:195のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:196)を示す。
【Fig74】配列番号:205が、ここにおいて「UNQ419」及び/又は「DNA48227−1350」と命名されたクローンである、天然配列PRO853cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:205)を示す。
【Fig75】Fig74に示されている配列番号:205のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:206)を示す。
【Fig76】配列番号:210が、ここにおいて「UNQ421」及び/又は「DNA41404−1352」と命名されたクローンである、天然配列PRO860cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:210)を示す。
【Fig77】Fig76に示されている配列番号:210のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:211)を示す。
【Fig78】配列番号:215が、ここにおいて「UNQ422」及び/又は「DNA44196−1353」と命名されたクローンである、天然配列PRO846cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:215)を示す。
【Fig79】Fig78に示されている配列番号:215のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:216)を示す。
【Fig80】配列番号:220が、ここにおいて「UNQ424」及び/又は「DNA52187−1354」と命名されたクローンである、天然配列PRO862cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:220)を示す。
【Fig81】Fig80に示されている配列番号:220のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:221)を示す。
【Fig82】配列番号:225が、ここにおいて「UNQ426」及び/又は「DNA48328−1355」と命名されたクローンである、天然配列PRO864cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:225)を示す。
【Fig83】Fig82に示されている配列番号:225のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:226)を示す。
【Fig84】配列番号:230が、ここにおいて「UNQ431」及び/又は「DNA56352−1358」と命名されたクローンである、天然配列PRO792cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:230)を示す。
【Fig85】Fig84に示されている配列番号:230のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:231)を示す。
【Fig86】配列番号:235が、ここにおいて「UNQ435」及び/又は「DNA53971−1359」と命名されたクローンである、天然配列PRO866cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:235)を示す。
【Fig87】Fig86に示されている配列番号:235のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:236)を示す。
【Fig88】配列番号:244が、ここにおいて「UNQ438」及び/又は「DNA50919−1361」と命名されたクローンである、天然配列PRO871cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:244)を示す。
【Fig89】Fig88に示されている配列番号:244のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:245)を示す。
【Fig90】配列番号:253が、ここにおいて「UNQ440」及び/又は「DNA44179−1362」と命名されたクローンである、天然配列PRO873cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:253)を示す。
【Fig91】Fig90に示されている配列番号:253のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:254)を示す。
【Fig92】配列番号:258が、ここにおいて「UNQ477」及び/又は「DNA54002−1367」と命名されたクローンである、天然配列PRO940cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:258)を示す。
【Fig93】Fig92に示されている配列番号:258のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:259)を示す。
【Fig94】配列番号:263が、ここにおいて「UNQ478」及び/又は「DNA53906−1368」と命名されたクローンである、天然配列PRO941cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:263)を示す。
【Fig95】Fig94に示されている配列番号:263のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:264)を示す。
【Fig96】DNA6415(配列番号:265)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig97】配列番号:269が、ここにおいて「UNQ481」及び/又は「DNA52185−1370」と命名されたクローンである、天然配列PRO944cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:269)を示す。
【Fig98】Fig97に示されている配列番号:269のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:270)を示す。
【Fig99】DNA14007(配列番号:271)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig100】DNA12773(配列番号:272)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig101】DNA12746(配列番号:273)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig102】DNA12834(配列番号:274)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig103】DNA12846(配列番号:275)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig104】DNA13104(配列番号:276)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig105】DNA13259(配列番号:277)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig106】DNA13959(配列番号:278)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig107】DNA13961(配列番号:279)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig108】配列番号:283が、ここにおいて「UNQ484」及び/又は「DNA53977−1371」と命名されたクローンである、天然配列PRO983cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:283)を示す。
【Fig109】Fig108に示されている配列番号:283のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:284)を示す。
【Fig110】DNA17130(配列番号:285)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig111】DNA23466(配列番号:286)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig112】DNA26818(配列番号:287)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig113】DNA37618(配列番号:288)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig114】DNA41732(配列番号:289)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig115】DNA45980(配列番号:290)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig116】DNA46372(配列番号:291)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig117】配列番号:295が、ここにおいて「UNQ522」及び/又は「DNA57253−1382」と命名されたクローンである、天然配列PRO1057cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:295)を示す。
【Fig118】Fig117に示されている配列番号:295のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:296)を示す。
【Fig119】ここにおいて、配列番号:300が「UNQ528」及び/又は「DNA58847−1383」と命名されたクローンである、天然配列PRO1071cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:300)を示す。
【Fig120】Fig119に示されている配列番号:300のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:301)を示す。
【Fig121】配列番号:302が、ここにおいて「UNQ529」及び/又は「DNA58747−1384」と命名されたクローンである、天然配列PRO1072cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:302)を示す。
【Fig122】Fig121に示されている配列番号:302のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:303)を示す。
【Fig123】DNA40210(配列番号:304)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig124】配列番号:308が、ここにおいて「UNQ532」及び/又は「DNA57689−1385」と命名されたクローンである、天然配列PRO1075cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:308)を示す。
【Fig125】Fig124に示されている配列番号:308のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:309)を示す。
【Fig126】DNA13059(配列番号:310)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig127】DNA19463(配列番号:311)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig128】配列番号:321が、ここにおいて「UNQ155」及び/又は「DNA23330−1390」と命名されたクローンである、天然配列PRO181cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:321)を示す。
【Fig129】Fig128に示されている配列番号:321のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:322)を示す。
【Fig130】DNA13242(配列番号:323)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig131】配列番号:329が、ここにおいて「UNQ169」及び/又は「DNA26847−1395」と命名されたクローンである、天然配列PRO195cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:329)を示す。
【Fig132】Fig131に示されている配列番号:329のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:330)を示す。
【Fig133】DNA15062(配列番号:331)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig134】DNA13199(配列番号:332)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig135】配列番号:336が、ここにおいて「UNQ434」及び/又は「DNA53974−1401」と命名されたクローンである、天然配列PRO865cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:336)を示す。
【Fig136】Fig135に示されている配列番号:336のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:337)を示す。
【Fig137】DNA37642(配列番号:338)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig138】配列番号:345が、ここにおいて「UNQ468」及び/又は「DNA57039−1402」と命名されたクローンである、天然配列PRO827cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:345)を示す。
【Fig139】Fig138に示されている配列番号:345のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:346)を示す。
【Fig140】DNA47751(配列番号:347)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig141】配列番号:351が、ここにおいて「UNQ557」及び/又は「DNA57033−1403」と命名されたクローンである、天然配列PRO1114cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:351)を示す。
【Fig142】Fig141に示されている配列番号:351のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:352)を示す。
【Fig143】DNA48466(配列番号:353)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig144】配列番号:357が、ここにおいて「UNQ211」及び/又は「DNA34353−1428」と命名されたクローンである、天然配列PRO237cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:357)を示す。
【Fig145】Fig144に示されている配列番号:357のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:358)を示す。
【Fig146】配列番号:362が、ここにおいて「UNQ342」及び/又は「DNA45417−1432」と命名されたクローンである、天然配列PRO357cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:362)を示す。
【Fig147】Fig146に示されている配列番号:362のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:363)を示す。
【Fig148】配列番号:369が、ここにおいて「UNQ240」及び/又は「DNA39523−1192」と命名されたクローンである、天然配列PRO273cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:369)を示す。
【Fig149】Fig148に示されている配列番号:369のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:370)を示す。
【Fig150】配列番号:374が、ここにおいて「UNQ365」及び/又は「DNA44205−1285」と命名されたクローンである、天然配列PRO701cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:374)を示す。
【Fig151】Fig150に示されている配列番号:374のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:375)を示す。
【Fig152】配列番号:379が、ここにおいて「UNQ368」及び/又は「DNA50911−1288」と命名されたクローンである、天然配列PRO704cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:379)を示す。
【Fig153】Fig152に示されている配列番号:379のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:380)を示す。
【Fig154】配列番号:384が、ここにおいて「UNQ370」及び/又は「DNA48329−1290」と命名されたクローンである、天然配列PRO706cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:384)を示す。
【Fig155】Fig154に示されている配列番号:384のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:385)を示す。
【Fig156】配列番号:389が、ここにおいて「UNQ371」及び/又は「DNA48306−1291」と命名されたクローンである、天然配列PRO707cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:389)を示す。
【Fig157】Fig156に示されている配列番号:389のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:390)を示す。
【Fig158】配列番号:394が、ここにおいて「UNQ283」及び/又は「DNA48336−1309」と命名されたクローンである、天然配列PRO322cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:394)を示す。
【Fig159】Fig158に示されている配列番号:394のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:395)を示す。
【Fig160】配列番号:399が、ここにおいて「UNQ330」及び/又は「DNA44184−1319」と命名されたクローンである、天然配列PRO526cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:399)を示す。
【Fig161】Fig160に示されている配列番号:399のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:400)を示す。
【Fig162】配列番号:404が、ここにおいて「UNQ332」及び/又は「DNA48314−1320」と命名されたクローンである、天然配列PRO531cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:404)を示す。
【Fig163】Fig162に示されている配列番号:404のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:405)を示す。
【Fig164】配列番号:409が、ここにおいて「UNQ335」及び/又は「DNA48333−1321」と命名されたクローンである、天然配列PRO534cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:409)を示す。
【Fig165】Fig164に示されている配列番号:409のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:410)を示す。
【Fig166】配列番号:414が、ここにおいて「UNQ361」及び/又は「DNA50920−1325」と命名されたクローンである、天然配列PRO697cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:414)を示す。
【Fig167】Fig166に示されている配列番号:414のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:415)を示す。
【Fig168】配列番号:419が、ここにおいて「UNQ385」及び/又は「DNA50988−1326」と命名されたクローンである、天然配列PRO717cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:419)を示す。
【Fig169】Fig168に示されている配列番号:419のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:420)を示す。
【Fig170】配列番号:424が、ここにおいて「UNQ395」及び/又は「DNA48331−1329」と命名されたクローンである、天然配列PRO731cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:424)を示す。
【Fig171】Fig170に示されている配列番号:424のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:425)を示す。
【Fig172】配列番号:429が、ここにおいて「UNQ192」及び/又は「DNA30867−1335」と命名されたクローンである、天然配列PRO218cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:429)を示す。
【Fig173】Fig172に示されている配列番号:429のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:430)を示す。
【Fig174】DNA14472(配列番号:431)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig175】DNA15846(配列番号:432)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig176】配列番号:436が、ここにおいて「UNQ406」及び/又は「DNA55737−1345」と命名されたクローンである、天然配列PRO768cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:436)を示す。
【Fig177】Fig176に示されている配列番号:436のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:437)を示す。
【Fig178】配列番号:441が、ここにおいて「UNQ409」及び/又は「DNA49829−1346」と命名されたクローンである、天然配列PRO771cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:441)を示す。
【Fig179】Fig178に示されている配列番号:441のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:442)を示す。
【Fig180】配列番号:446が、ここにおいて「UNQ411」及び/又は「DNA52196−1348」と命名されたクローンである、天然配列PRO733cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:446)を示す。
【Fig181】Fig180に示されている配列番号:446のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:447)を示す。
【Fig182】配列番号:451が、ここにおいて「UNQ429」及び/又は「DNA56965−1356」と命名されたクローンである、天然配列PRO162cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:451)を示す。
【Fig183】Fig182に示されている配列番号:451のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:452)を示す。
【Fig184】配列番号:453が、ここにおいて「UNQ430」及び/又は「DNA56405−1357」と命名されたクローンである、天然配列PRO788cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:453)を示す。
【Fig185】Fig184に示されている配列番号:453のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:454)を示す。
【Fig186】配列番号:455が、ここにおいて「UNQ492」及び/又は「DNA57530−1375」と命名されたクローンである、天然配列PRO1008cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:455)を示す。
【Fig187】Fig186に示されている配列番号:455のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:456)を示す。
【Fig188】DNA16508(配列番号:457)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig189】配列番号:458が、ここにおいて「UNQ495」及び/又は「DNA56439−1376」と命名されたクローンである、天然配列PRO1012cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:458)を示す。
【Fig190】Fig189に示されている配列番号:458のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:459)を示す。
【Fig191】配列番号:463が、ここにおいて「UNQ497」及び/又は「DNA56409−1377」と命名されたクローンである、天然配列PRO1014cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:463)を示す。
【Fig192】Fig191に示されている配列番号:463のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:464)を示す。
【Fig193】配列番号:465が、ここにおいて「UNQ500」及び/又は「DNA56112−1379」と命名されたクローンである、天然配列PRO1017cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:465)を示す。
【Fig194】Fig193に示されている配列番号:465のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:466)を示す。
【Fig195】配列番号:467が、ここにおいて「UNQ502」及び/又は「DNA56045−1380」と命名されたクローンである、天然配列PRO474cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:467)を示す。
【Fig196】Fig195に示されている配列番号:467のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:468)を示す。
【Fig197】配列番号:469が、ここにおいて「UNQ516」及び/又は「DNA59294−1381」と命名されたクローンである、天然配列PRO1031cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:469)を示す。
【Fig198】Fig197に示されている配列番号:469のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:470)を示す。
【Fig199】配列番号:471が、ここにおいて「UNQ475」及び/又は「DNA56433−1406」と命名されたクローンである、天然配列PRO938cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:471)を示す。
【Fig200】Fig199に示されている配列番号:471のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:472)を示す。
【Fig201】配列番号:476が、ここにおいて「UNQ539」及び/又は「DNA53912−1457」と命名されたクローンである、天然配列PRO1082cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:476)を示す。
【Fig202】Fig201に示されている配列番号:476のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:477)を示す。
【Fig203】配列番号:482が、ここにおいて「UNQ540」及び/又は「DNA50921−1458」と命名されたクローンである、天然配列PRO1083cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:482)を示す。
【Fig204】Fig203に示されている配列番号:482のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:483)を示す。
【Fig205】DNA24256(配列番号:484)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig206】配列番号:487が、ここにおいて「UNQ174」及び/又は「DNA29101−1122」と命名されたクローンである、天然配列PRO200cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:487)を示す。
【Fig207】Fig206に示されている配列番号:487のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:488)を示す。
【Fig208】配列番号:495が、ここにおいて「DNA40021−1154」と命名されたクローンである、天然配列PRO285cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:495)を示す。
【Fig209】Fig208に示されている配列番号:495のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:496)を示す。
【Fig210】配列番号:497が、ここにおいて「DNA42663−1154」と命名されたクローンである、天然配列PRO286cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:497)を示す。
【Fig211】Fig210に示されている配列番号:497のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:498)を示す。
【Fig212】配列番号:505が、ここにおいて「DNA30943−1−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO213−1cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:505)を示す。
【Fig213】Fig212に示されている配列番号:505のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:506)を示す。
【Fig214】配列番号:507が、ここにおいて「DNA64907−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO1330cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:507)を示す。
【Fig215】Fig214に示されている配列番号:507のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:508)を示す。
【Fig216】配列番号:509が、ここにおいて「DNA64908−1163−1」と命名されたクローンである、天然配列PRO1449cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:509)を示す。
【Fig217】Fig216に示されている配列番号:509のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:510)を示す。
【Fig218】配列番号:514が、ここにおいて「UNQ261」及び/又は「DNA39975−1210」と命名されたクローンである、天然配列PRO298cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:514)を示す。
【Fig219】Fig218に示されている配列番号:514のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:515)を示す。
【Fig220】DNA26832(配列番号:516)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig221】配列番号:522が、ここにおいて「DNA43316−1237」と命名されたクローンである、天然配列PRO337cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:522)を示す。
【Fig222】Fig221に示されている配列番号:522のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:523)を示す。
【Fig223】DNA42301(配列番号:524)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig224】配列番号:525が、ここにおいて「DNA55800−1263」と命名されたクローンである、天然配列PRO403cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:525)を示す。
【Fig225】Fig224に示されている配列番号:525のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:526)を示す。
【Fig226】DNA34415(配列番号:527)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig227】DNA49830(配列番号:528)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig228】DNA49831(配列番号:529)と、ここにおいて命名されたESTヌクレオチドを示す。
【Fig229】配列番号:611が、ここにおいて「DNA94832−2659」と命名されたクローンである、天然配列PRO4993cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:611)を示す。
【Fig230】Fig229に示されている配列番号:611のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:612)を示す。
【Fig231】配列番号:613が、ここにおいて「DNA68886」と命名されたクローンである、天然配列PRO1559cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:613)を示す。
【Fig232】Fig231に示されている配列番号:613のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:614)を示す。
【Fig233】配列番号:615が、ここにおいて「DNA52758−1399」と命名されたクローンである、天然配列PRO725cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:615)を示す。
【Fig234】Fig233に示されている配列番号:615のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:616)を示す。
【Fig235】配列番号:617が、ここにおいて「DNA52756」と命名されたクローンである、天然配列PRO739cDNAのヌクレオチド配列(配列番号:617)を示す。
【Fig236】Fig235に示されている配列番号:617のコード化配列から派生したアミノ酸配列(配列番号:618)を示す。
Claims (57)
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)及びFig236(配列番号:618)に示されているアミノ酸配列からなるグループから選択されたアミノ酸配列をコードする核酸配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:6)、Fig8(配列番号:18)、Fig10(配列番号:27)、Fig14(配列番号:35)、Fig19(配列番号:44)、Fig21(配列番号:51)、Fig23(配列番号:58)、Fig25(配列番号:63)、Fig27(配列番号:68)、Fig29(配列番号:73)、Fig32(配列番号:84)、Fig34(配列番号:89)、Fig36(配列番号:96)、Fig38(配列番号:101)、Fig40(配列番号:108)、Fig42(配列番号:113)、Fig44(配列番号:118)、Fig46(配列番号:123)、Fig48(配列番号:131)、Fig50(配列番号:136)、Fig52(配列番号:144)、Fig54(配列番号:149)、Fig58(配列番号:156)、Fig60(配列番号:161)、Fig62(配列番号:168)、Fig65(配列番号:177)、Fig67(配列番号:182)、Fig69(配列番号:189)、Fig72(配列番号:195)、Fig74(配列番号:205)、Fig76(配列番号:210)、Fig78(配列番号:215)、Fig80(配列番号:220)、Fig82(配列番号:225)、Fig84(配列番号:230)、Fig86(配列番号:235)、Fig88(配列番号:244)、Fig90(配列番号:253)、Fig92(配列番号:258)、Fig94(配列番号:263)、Fig97(配列番号:269)、Fig108(配列番号:283)、Fig117(配列番号:295)、Fig119(配列番号:300)、Fig121(配列番号:302)、Fig124(配列番号:308)、Fig128(配列番号:321)、Fig131(配列番号:329)、Fig135(配列番号:336)、Fig138(配列番号:345)、Fig141(配列番号:351)、Fig144(配列番号:357)、Fig146(配列番号:362)、Fig148(配列番号:369)、Fig150(配列番号:374)、Fig152(配列番号:379)、Fig154(配列番号:384)、Fig156(配列番号:389)、Fig158(配列番号:394)、Fig160(配列番号:399)、Fig162(配列番号:404)、Fig164(配列番号:409)、Fig166(配列番号:414)、Fig168(配列番号:419)、Fig170(配列番号:424)、Fig172(配列番号:429)、Fig176(配列番号:436)、Fig178(配列番号:441)、Fig180(配列番号:446)、Fig182(配列番号:451)、Fig184(配列番号:453)、Fig186(配列番号:455)、Fig189(配列番号:458)、Fig191(配列番号:463)、Fig193(配列番号:465)、Fig195(配列番号:467)、Fig197(配列番号:469)、Fig199(配列番号:471)、Fig201(配列番号:476)、Fig203(配列番号:482)、Fig206(配列番号:487)、Fig208(配列番号:495)、Fig210(配列番号:497)、Fig212(配列番号:505)、Fig214(配列番号:507)、Fig216(配列番号:509)、Fig218(配列番号:514)、Fig221(配列番号:522)、Fig224(配列番号:525)、Fig229(配列番号:611)、Fig231(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:613)、Fig233(配列番号:615)及びFig235(配列番号:617)に示されている核酸配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- Fig1(配列番号:1)、Fig3(配列番号:6)、Fig8(配列番号:18)、Fig10(配列番号:27)、Fig14(配列番号:35)、Fig19(配列番号:44)、Fig21(配列番号:51)、Fig23(配列番号:58)、Fig25(配列番号:63)、Fig27(配列番号:68)、Fig29(配列番号:73)、Fig32(配列番号:84)、Fig34(配列番号:89)、Fig36(配列番号:96)、Fig38(配列番号:101)、Fig40(配列番号:108)、Fig42(配列番号:113)、Fig44(配列番号:118)、Fig46(配列番号:123)、Fig48(配列番号:131)、Fig50(配列番号:136)、Fig52(配列番号:144)、Fig54(配列番号:149)、Fig58(配列番号:156)、Fig60(配列番号:161)、Fig62(配列番号:168)、Fig65(配列番号:177)、Fig67(配列番号:182)、Fig69(配列番号:189)、Fig72(配列番号:195)、Fig74(配列番号:205)、Fig76(配列番号:210)、Fig78(配列番号:215)、Fig80(配列番号:220)、Fig82(配列番号:225)、Fig84(配列番号:230)、Fig86(配列番号:235)、Fig88(配列番号:244)、Fig90(配列番号:253)、Fig92(配列番号:258)、Fig94(配列番号:263)、Fig97(配列番号:269)、Fig108(配列番号:283)、Fig117(配列番号:295)、Fig119(配列番号:300)、Fig121(配列番号:302)、Fig124(配列番号:308)、Fig128(配列番号:321)、Fig131(配列番号:329)、Fig135(配列番号:336)、Fig138(配列番号:345)、Fig141(配列番号:351)、Fig144(配列番号:357)、Fig146(配列番号:362)、Fig148(配列番号:369)、Fig150(配列番号:374)、Fig152(配列番号:379)、Fig154(配列番号:384)、Fig156(配列番号:389)、Fig158(配列番号:394)、Fig160(配列番号:399)、Fig162(配列番号:404)、Fig164(配列番号:409)、Fig166(配列番号:414)、Fig168(配列番号:419)、Fig170(配列番号:424)、Fig172(配列番号:429)、Fig176(配列番号:436)、Fig178(配列番号:441)、Fig180(配列番号:446)、Fig182(配列番号:451)、Fig184(配列番号:453)、Fig186(配列番号:455)、Fig189(配列番号:458)、Fig191(配列番号:463)、Fig193(配列番号:465)、Fig195(配列番号:467)、Fig197(配列番号:469)、Fig199(配列番号:471)、Fig201(配列番号:476)、Fig203(配列番号:482)、Fig206(配列番号:487)、Fig208(配列番号:495)、Fig210(配列番号:497)、Fig212(配列番号:505)、Fig214(配列番号:507)、Fig216(配列番号:509)、Fig218(配列番号:514)、Fig221(配列番号:522)、Fig224(配列番号:525)、Fig229(配列番号:611)、Fig231(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:613、Fig233(配列番号:615)及びFig235(配列番号:617)に示されている核酸配列の全長コード化配列からなる群から選択されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。
- ATCC受託番号ATCC209791、ATCC209786、ATCC209788、ATCC209787、
ATCC209789、ATCC209617、ATCC209620、ATCC209616、ATCC209679、ATCC209654、ATCC209655、ATCC209656、ATCC209721、ATCC209717、ATCC209716、ATCC209722、ATCC209668、ATCC209670、ATCC209718、ATCC209784、ATCC209703、ATCC209808、ATCC209810、ATCC209699、ATCC209811、ATCC209813、ATCC209705、ATCC209806、ATCC209809、ATCC209805、ATCC209812、ATCC209844、ATCC209847、ATCC209845、ATCC209843、ATCC209846、ATCC209750、ATCC209848、ATCC209851、ATCC209754、ATCC209747、ATCC209861、ATCC209862、ATCC209867、ATCC209879、ATCC209868、ATCC209869、ATCC209775、ATCC209772、ATCC209774、ATCC209777、ATCC209905、ATCC209855、ATCC209910、ATCC209424、ATCC209720、ATCC209714、ATCC209785、ATCC209911、ATCC209669、ATCC209704、ATCC209702、ATCC209701、ATCC209700、ATCC209814、ATCC209715、ATCC209807、ATCC209753、ATCC209749、ATCC209748、ATCC209842、ATCC209849、ATCC209880、ATCC209864、ATCC209882、ATCC209883、ATCC209865、ATCC209866、ATCC209857、ATCC209870、ATCC209859、ATCC209653、ATCC209389、ATCC209386、ATCC203242、ATCC203243、ATCC209783、ATCC209487、ATCC209680、240−PTA、又はATCC209773で寄託したDNAの全長コード化配列と少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - 請求項1から4の何れか一つの核酸を含んでなるベクター。
- ベクターで形質転換された宿主細胞によって認識されるコントロール配列と作用可能に連結した請求項5のベクター。
- 請求項5のベクターを含んでなる宿主細胞。
- 前記細胞がCHO細胞である請求項7の宿主細胞。
- 前記細胞が大腸菌である請求項7の宿主細胞。
- 前記細胞が酵母細胞である請求項7の宿主細胞。
- 前記PROポリペプチドの発現に適した条件下での請求項7の宿主細胞の培養、細胞培養から前記PROポリペプチドを回収することを含んでなるPROポリペプチドの製造方法。
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)及びFig236(配列番号:618)に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。
- Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)及びFig236(配列番号:618)に示されているアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列と比較し、少なくとも80%のポジティブのスコアを有する単離されたポリペプチド。
- ATCC受託番号ATCC209791、ATCC209786、ATCC209788、ATCC209787、
ATCC209789、ATCC209617、ATCC209620、ATCC209616、ATCC209679、ATCC209654、ATCC209655、ATCC209656、ATCC209721、ATCC209717、ATCC209716、ATCC209722、ATCC209668、ATCC209670、ATCC209718、ATCC209784、ATCC209703、ATCC209808、ATCC209810、ATCC209699、ATCC209811、ATCC209813、ATCC209705、ATCC209806、ATCC209809、ATCC209805、ATCC209812、ATCC209844、ATCC209847、ATCC209845、ATCC209843、ATCC209846、ATCC209750、ATCC209848、ATCC209851、ATCC209754、ATCC209747、ATCC209861、ATCC209862、ATCC209867、ATCC209879、ATCC209868、ATCC209869、ATCC209775、ATCC209772、ATCC209774、ATCC209777、ATCC209905、ATCC209855、ATCC209910、ATCC209424、ATCC209720、ATCC209714、ATCC209785、ATCC209911、ATCC209669、ATCC209704、ATCC209702、ATCC209701、ATCC209700、ATCC209814、ATCC209715、ATCC209807、ATCC209753、ATCC209749、ATCC209748、ATCC209842、ATCC209849、ATCC209880、ATCC209864、ATCC209882、ATCC209883、ATCC209865、ATCC209866、ATCC209857、ATCC209870、ATCC209859、ATCC209653、ATCC209389、ATCC209386、ATCC203242、ATCC203243、ATCC209783、ATCC209487、ATCC209680、240−PTA、又はATCC209773で寄託したDNAの全長コード化配列にコードされているアミノ酸配列に対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。 - 異種アミノ酸配列と融合した請求項12から14の何れか一項に記載のポリペプチドを含んでなるキメラ分子。
- 前記異種アミノ酸配列がエピトープタグ配列である請求項15のキメラ分子。
- 前記異種アミノ酸配列がイムノグロブリンのFc領域である請求項15のキメラ分子。
- 請求項12から14の何れか一項に記載のポリペプチドへ特異的に結合する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体、ヒト化抗体又は一本鎖抗体である請求項18の抗体。
- (a)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列で、その結合シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列;
(b)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドの細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列で、その結合シグナルペプチドを伴うヌクレオチド配列;又は
(c)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドをコードする核酸配列で、その結合シグナルペプチドを欠くヌクレオチド配列に対して、少なくとも80%の核酸配列同一性を有する単離された核酸。 - (a)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドで、その結合シグナルペプチドを欠くポリペプチド;
(b)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドの細胞外ドメインで、その結合シグナルペプチドを伴うポリペプチドの細胞外ドメイン;又は
(c)Fig2(配列番号:2)、Fig4(配列番号:7)、Fig9(配列番号:19)、Fig11(配列番号:28)、Fig15(配列番号:36)、Fig20(配列番号:45)、Fig22(配列番号:52)、Fig24(配列番号:59)、Fig26(配列番号:64)、Fig28(配列番号:69)、Fig30(配列番号:74)、Fig33(配列番号:85)、Fig35(配列番号:90)、Fig37(配列番号:97)、Fig39(配列番号:102)、Fig41(配列番号:109)、Fig43(配列番号:114)、Fig45(配列番号:119)、Fig47(配列番号:124)、Fig49(配列番号:132)、Fig51(配列番号:137)、Fig53(配列番号:145)、Fig55(配列番号:150)、Fig59(配列番号:157)、Fig61(配列番号:162)、Fig63(配列番号:169)、Fig66(配列番号:178)、Fig68(配列番号:183)、Fig70(配列番号:190)、Fig73(配列番号:196)、Fig75(配列番号:206)、Fig77(配列番号:211)、Fig79(配列番号:216)、Fig81(配列番号:221)、Fig83(配列番号:226)、Fig85(配列番号:231)、Fig87(配列番号:236)、Fig89(配列番号:245)、Fig91(配列番号:254)、Fig93(配列番号:259)、Fig95(配列番号:264)、Fig98(配列番号:270)、Fig109(配列番号:284)、Fig118(配列番号:296)、Fig120(配列番号:301)、Fig122(配列番号:303)、Fig125(配列番号:309)、Fig129(配列番号:322)、Fig132(配列番号:330)、Fig136(配列番号:337)、Fig139(配列番号:346)、Fig142(配列番号:352)、Fig145(配列番号:358)、Fig147(配列番号:363)、Fig149(配列番号:370)、Fig151(配列番号:375)、Fig153(配列番号:380)、Fig155(配列番号:385)、Fig157(配列番号:390)、Fig159(配列番号:395)、Fig161(配列番号:400)、Fig163(配列番号:405)、Fig165(配列番号:410)、Fig167(配列番号:415)、Fig169(配列番号:420)、Fig171(配列番号:425)、Fig173(配列番号:430)、Fig177(配列番号:437)、Fig179(配列番号:442)、Fig181(配列番号:447)、Fig183(配列番号:452)、Fig185(配列番号:454)、Fig187(配列番号:456)、Fig190(配列番号:459)、Fig192(配列番号:464)、Fig194(配列番号:466)、Fig196(配列番号:468)、Fig198(配列番号:470)、Fig200(配列番号:472)、Fig202(配列番号:477)、Fig204(配列番号:483)、Fig207(配列番号:488)、Fig209(配列番号:496)、Fig211(配列番号:498)、Fig213(配列番号:506)、Fig215(配列番号:508)、Fig217(配列番号:510)、Fig219(配列番号:515)、Fig222(配列番号:523)、Fig225(配列番号:526)、Fig225(配列番号:526)、Fig230(配列番号:612)、Fig232(配列番号:614)、Fig234(配列番号:616)又はFig236(配列番号:618)に示されているポリペプチドの細胞外ドメインで、その結合シグナルペプチドを欠くポリペプチドの細胞外ドメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有する単離されたポリペプチド。。 - PRO4993ポリペプチドを含有すると推測される試料よりPRO4993ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をPRO337ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のPRO4993/PRO337ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のPRO4993ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO4993ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項22に記載の方法。
- 前記PRO337ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項22に記載の方法。
- 前記PRO337ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項22に記載の方法。
- PRO337ポリペプチドを含有すると推測される試料よりPRO337ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をPRO4993ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のPRO4993/PRO337ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のPRO337ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO337ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項26に記載の方法。
- 前記PRO4993ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項26に記載の方法。
- 前記PRO4993ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項26に記載の方法。
- PRO1559ポリペプチドを含有すると推測される試料よりPRO1559ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をPRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のPRO1559/PRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のPRO1559ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO1559ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記PRO725、PRO700、PRO739ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項30に記載の方法。
- 前記PRO725、PRO700、PRO739ポリペプチドが固体支持体へ付着している、請求項30に記載の方法。
- PRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドを含有すると推測される試料よりPRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドを検出する方法において、前記試料をPRO1559ポリペプチドと接触せしめ、前記試料中のPRO1559/PRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチド抱合体の形成を測定することを含んでなり、前記抱合体の形成が前記試料中のPRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドの存在を示す方法。
- 前記試料が前記PRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドを発現すると推測される細胞を含んでなる、請求項30に記載の方法。
- 前記PRO1559ポリペプチドが検出可能なラベルによって標識されている、請求項34に記載の方法。
- 前記PRO1559ポリペプチドが固体支持体へ付着している、求項34に記載の方法。
- 生物活性分子をPRO337ポリペプチドを発現する細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO4993ポリペプチドと接触せしめ、前記PRO337とPRO4993ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項38に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項38に記載の方法。
- 生物活性分子をPRO4993ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO337ポリペプチドと接触せしめ、前記PRO4993とPRO337ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項41に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項38に記載の方法。
- 生物活性分子をPRO1559ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO725、PRO700,又はPRO739ポリペプチドと接触せしめ、前記PRO1559とPRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項44に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項44に記載の方法。
- 生物活性分子をPRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチドを発現している細胞へ関連させる方法において、前記細胞を前記生物活性分子と結合しているPRO1559ポリペプチドと接触せしめ、前記PRO1559とPRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチドが互いに結合することを可能にすることを含んでなり、これにより前記生物活性分子を前記細胞へ関連させる方法。
- 前記生物活性分子が毒素、放射線同位元素又は抗体である、請求項47に記載の方法。
- 前記生物活性分子が前記細胞の死を生じせしめる、請求項47に記載の方法。
- PRO337ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とPRO4993又は抗−PRO337抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記PRO4993ポリペプチド又は抗−337抗体が前記PRO337ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項50に記載の方法。
- PRO4993ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とPRO337又は抗−PRO4993抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記PRO337ポリペプチド又は抗−4993抗体が前記PRO4993ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項52に記載の方法。
- PRO1559ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とPRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチド又は抗−PRO1559抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記PRO725,PRO700又はPRO739ポリペプチド又は前記抗−PRO1559抗体が前記PRO1559ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項54に記載の方法。
- PRO725、PRO700、又はPRO739ポリペプチドを発現している細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法において、前記細胞とPRO1559ポリペプチド、又は抗−PRO725、抗−PRO700又は抗−PRO739抗体を接触せしめることを含んでなり、これにより前記PRO1559ポリペプチド,又は前記抗−PRO725、抗−PRO700又は抗−PRO739抗体が前記PRO725、PRO700又はPRO739ポリペプチドと結合し、前記細胞の少なくとも一つの生物活性を調節する方法。
- 前記細胞が死滅せしめられる、請求項54に記載の方法。
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