EA007958B1 - ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ - Google Patents
ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Download PDFInfo
- Publication number
- EA007958B1 EA007958B1 EA200300233A EA200300233A EA007958B1 EA 007958 B1 EA007958 B1 EA 007958B1 EA 200300233 A EA200300233 A EA 200300233A EA 200300233 A EA200300233 A EA 200300233A EA 007958 B1 EA007958 B1 EA 007958B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- gene
- human
- animal
- humanized
- segment
- Prior art date
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title claims abstract description 203
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 142
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 95
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 346
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 231
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims abstract description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 claims abstract description 20
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 177
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 110
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 98
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 95
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 70
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 38
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 claims description 34
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 32
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 27
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 26
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims description 20
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 18
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 10
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 8
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 claims description 4
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 101150074732 U gene Proteins 0.000 claims 11
- 101150004446 Cow gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 claims 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 abstract description 77
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 abstract description 77
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 31
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 abstract description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 14
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 13
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 6
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 6
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 89
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 49
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 35
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 35
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 35
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 29
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 28
- 101150117115 V gene Proteins 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 23
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 22
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 17
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 17
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 101710196256 Collagen adhesin Proteins 0.000 description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 14
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 14
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 14
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 14
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 14
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 13
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 11
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 10
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 10
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 9
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 8
- 239000002585 base Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 7
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 6
- 101100460719 Mus musculus Noto gene Proteins 0.000 description 6
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 101100187345 Xenopus laevis noto gene Proteins 0.000 description 6
- 101150051936 Y-3 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 5
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 5
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 238000009175 antibody therapy Methods 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 101150044072 cn gene Proteins 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 4
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 4
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 4
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 4
- 101150076615 ck gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 4
- 101150118163 h gene Proteins 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 4
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 208000008190 Agammaglobulinemia Diseases 0.000 description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 description 3
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 208000010667 Carcinoma of liver and intrahepatic biliary tract Diseases 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 206010073069 Hepatic cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010020983 Hypogammaglobulinaemia Diseases 0.000 description 3
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 235000013345 egg yolk Nutrition 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 201000002250 liver carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 3
- DVGKRPYUFRZAQW-UHFFFAOYSA-N 3 prime Natural products CC(=O)NC1OC(CC(O)C1C(O)C(O)CO)(OC2C(O)C(CO)OC(OC3C(O)C(O)C(O)OC3CO)C2O)C(=O)O DVGKRPYUFRZAQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 2
- 206010068051 Chimerism Diseases 0.000 description 2
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 2
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- 101000994700 Homo sapiens Casein kinase I isoform alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000777314 Homo sapiens Choline kinase alpha Proteins 0.000 description 2
- 101000777313 Homo sapiens Choline/ethanolamine kinase Proteins 0.000 description 2
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 2
- 101001138544 Homo sapiens UMP-CMP kinase Proteins 0.000 description 2
- BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N N(6),N(6)-dimethyladenine Chemical compound CN(C)C1=NC=NC2=C1N=CN2 BVIAOQMSVZHOJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 2
- COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N Thr-Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O COYHRQWNJDJCNA-NUJDXYNKSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 210000001172 blastoderm Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- -1 ethanol Chemical compound 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000005104 human peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 238000009097 single-agent therapy Methods 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 2'-(4-ethoxyphenyl)-5-(4-methylpiperazin-1-yl)-2,5'-bibenzimidazole Chemical compound C1=CC(OCC)=CC=C1C1=NC2=CC=C(C=3NC4=CC(=CC=C4N=3)N3CCN(C)CC3)C=C2N1 PRDFBSVERLRRMY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150020072 AN1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 101710197219 Alpha-toxin Proteins 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000003950 B-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010006654 Bleomycin Proteins 0.000 description 1
- 101100263837 Bovine ephemeral fever virus (strain BB7721) beta gene Proteins 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101150070959 CK1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150052200 CS gene Proteins 0.000 description 1
- 101100309447 Caenorhabditis elegans sad-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100426970 Caenorhabditis elegans ttr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 1
- 101100316840 Enterobacteria phage P4 Beta gene Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 101150072436 H1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001236294 Hebe Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101100113588 Homo sapiens CS gene Proteins 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 101100182721 Mus musculus Ly6e gene Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 102100034574 P protein Human genes 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 101710124951 Phospholipase C Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 108010015724 Prephenate Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 description 1
- 101150087998 Su-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 101150082045 U3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150066719 VH1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150100931 VI gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N acetylacetonate Chemical compound CC(=O)[CH-]C(C)=O CUJRVFIICFDLGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 239000002776 alpha toxin Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960001561 bleomycin Drugs 0.000 description 1
- OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O bleomycin A2 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC=C(N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCC[S+](C)C)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C OYVAGSVQBOHSSS-UAPAGMARSA-O 0.000 description 1
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 1
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 108091011142 collagen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000021124 collagen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091010988 fibronectin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 108700023876 human Y acceptor Proteins 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 238000002650 immunosuppressive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000002406 microsurgery Methods 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N sulfanyloxyethane Chemical compound CCOS FRGKKTITADJNOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0273—Cloned vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/082—Hepadnaviridae, e.g. hepatitis B virus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
- C07K16/1271—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Micrococcaceae (F), e.g. Staphylococcus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/20—Animal model comprising regulated expression system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/107—Rabbit
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/30—Bird
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Данное изобретение относится к гуманизированным антителам и препаратам антитела, полученным из трансгенных животных, отличных от человека. Животных, отличных от человека, получают генно-инженерным способом, так что они содержат один или более гуманизированных локусов иммуноглобулина, которые способны претерпевать реаранжировку генов и конверсию генов у трансгенных животных, отличных от человека, с получением разнообразных гуманизированных иммуноглобулинов. Данное изобретение, кроме того, относится к новым последовательностям, рекомбинантным векторам и трансгенным векторам, применимым для получения указанных трансгенных животных. Гуманизированные антитела согласно настоящему изобретению обладают минимальной иммуногенностью в организме человека и подходят для применения при терапевтическом лечении человека.
Description
Область изобретения
Данное изобретение относится к гуманизированным антителам, получаемым из трансгенных животных, отличных от человека. С помощью генетической инженерии создают животных, отличных от человека, так что они содержат один или более гуманизированных локусов иммуноглобулинов, которые у трансгенных животных, отличных от человека, способны подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, давая разнообразные гуманизированные иммуноглобулины. Данное изобретение, кроме того, относится к новым последовательностям, рекомбинантным векторам и трансгенным векторам, применимым для создания таких трансгенных животных.
Гуманизированные антитела согласно изобретению обладают минимальной иммуногенностью для человека и подходят для применения при терапевтическом лечении человека.
Предпосылка изобретения
Лечение инфекционных заболеваний, вызванных бактериями, грибами, вирусами и паразитами, в основном основано на химиотерапии. Однако появление организмов, устойчивых к лекарственным средствам, требует постоянной разработки новых антибиотиков. Лечение пациентов со злокачественными новообразованиями и раковыми опухолями также основано на химиотерапии. Однако многие из указанных способов лечения неэффективны, и смертность среди пациентов с такими заболеваниями высока. Как в случае инфекционных болезней, так и в случае рака необходимы усовершенствованные и новые способы лечения. Терапия резистентного к стероидам отторжения трансплантированных органов требует применения биологических реагентов (препаратов моноклональных или поликлональных антител), которые снимают протекающий аллоиммунный ответ у реципиента с трансплантатом. Основной проблемой в случае препаратов антител, полученных от животных, является присущая иммуноглобулинам нечеловеческой природы иммуногенность в организме пациента-человека. Чтобы уменьшить иммуногенность нечеловеческих антител, было предложено генетическое конструирование отдельных генов антител у животных. В частности, было показано, что в результате слияния экзонов вариабельных (V) областей животных с экзонами константных (С) областей человека можно получить ген химерного антитела. Однако указанный подход может только устранять иммуногенность, вызванную Ге-областью нечеловеческого антитела, тогда как остальные нечеловеческие ГаЬ-последовательности могут еще оставаться иммуногенными. При другом подходе гены иммуноглобулинов человека, как тяжелых, так и легких цепей иммуноглобулинов, вводили в геном мышей. Хотя указанный способ генетической инженерии в результате приводит к экспрессии полипептидов иммуноглобулинов человека в генетически сконструированных мышах, уровень экспрессии человеческих иммуноглобулинов низкий. Это может быть следствием видоспецифичных регуляторных элементов в локусах иммуноглобулинов, которые необходимы для эффективной экспрессии иммуноглобулинов. Как показано на трансфицированных линиях клеток регуляторные элементы, имеющиеся в генах иммуноглобулинов человека, могут функционировать у животных, отличных от человека, неправильно.
Описано несколько регуляторных элементов в генах иммуноглобулинов. Особенно важное значение имеют энхансеры, расположенные ниже (3') константных областей тяжелой цепи, и интронные энхансеры в генах легких цепей. Кроме того, в генах иммуноглобулинов могут присутствовать другие регуляторные элементы, которые еще предстоит идентифицировать. Исследования на мышах показали, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы молекул иммуноглобулинов играют важную роль в регуляции уровней экспрессии химерных антител мышь-человека в сыворотке мышей, гомозиготных по гену Су1 человека. Поэтому для экспрессии гетерологичных генов иммуноглобулинов у животных желательно заменить последовательности, которые содержат энхансерные элементы и экзоны, кодирующие трансмембранный (экзон М1) и цитоплазматический концевой участок (экзон М2), последовательностями, которые в норме встречаются у животных в сходных положениях.
Введение генов иммуноглобулина человека в геном мышей приводило к экспрессии разнообразного спектра антител человека у мышей, полученных генно-инженерным путем. Как у мышей, так и у человека разнообразие антител создается в результате реаранжировки генов. Указанный процесс приводит к созданию множества различных рекомбинантных сегментов ν(Ό)1, кодирующих большое количество молекул антител с разными антигенсвязывающими участками. Однако у других животных, подобных кроликам, свиньям, коровам и птицам, разнообразие антител создается во многом отличающимся механизмом, называемым конверсией генов. Например, хорошо установлено, что у кролика и курицы νΌΙреаранжировка очень ограничена (почти 90% иммуноглобулинов формируются с З'-проксимальным элементом νΗ1), и разнообразие антител создается в результате конверсии генов и гипермутирования. Напротив, конверсия генов мыши и человека происходит очень редко, если вообще происходит. Поэтому предполагается, что у животных, у которых разнообразие антител образуется за счет конверсии генов, способ генетической инженерии, основанный на реаранжировке генов, приведет у животных к низкому титру антител и ограниченному разнообразию антител. Таким образом, генетическая инженерия на крупных животных с целью получения неиммуногенных препаратов антител для лечения человека требует альтернативной стратегии генетической инженерии.
- 1 007958
Литература, имеющая отношение к изобретению
Обзор применения препаратов поликлональных антител для лечения отторжения трансплантата недавно опубликован N. ВоппеГоу-Вегагб е! а1., 1. Неаг! Ьипд Тгапзр1ап1 1996; 15 (5): 435-442; С. Со1Ьу е! а1., Апп. Рйагтасо1йег. 1996; 30 (10): 1164-1174; М.1. Иидап е1 а1., Апп. Нета1о1. 1997; 75 (1-2): 41-46. Применение терапии поликлональными антителами при аутоиммунных заболеваниях описано Сепбтотезк1, Во11 1з1. 81ето1ег Мбап 1997; 58 (4): 339-343; Ь.К. Каз1гикоГГ е1 а1., Сап. 1. №иго1. 8ск 1978; 5 (2): 175-178; 1.Е. \Уа1кег е1 а1., 1. №ито1. 8с1. 1976; 29 (2-4): 303-309. Истощение жировых клеток с использованием препаратов антител описано Ь. Эе С1егсс.| е1 а1., 1. Ашт. 8ск 1997; 75 (7): 1791-1797; 1.Т. \Упд1Ц е1 а1., ОЬез. Вез. 1995; 3 (3): 265-272.
Регуляторные элементы генов иммуноглобулинов описаны Вгаб1еу е1 а1. (1999), Ттапзспр1юпа1 епйапсегз апб 1Ие еуо1и1юп оГ 1Ие 1дН 1осиз; Ьаиз1ет, В. е1 а1., ЕтЬо 1. 12: 4615-23 (1993); Уо1дша е1 а1., 1. 1ттипо1. 165: 6400 (2000); Но1е е1 а1., 1. 1ттипо1. 146: 4377 (1991).
Увеличение разнообразия антител в результате конверсии генов у курицы и кролика описано ВиссЫш е1 а1., №1иге 326: 4 09-11 (1987); Кшдй! е1 а1., Абуапсез ш 1ттипо1оду 56: 179-218 (1994); Ьапдтап е1 а1., Вез. 1ттипо1. 144: 422-46 (1993). Создание мышей, экспрессирующих химерные антитела мышичеловека, описано Р1изсйке е1 а1., 1оитпа1 оГ 1ттипо1одюа1 Ме1йобз 215: 27-37 (1998). Создание мышей, экспрессирующих химерные антитела человека-мыши с мембранными и цитоплазматическими концевыми сегментами, полученными из антитела мыши, описано 2ои е1 а1., 8с1епсе 262: 1271-1274 (1993); 2ои е1 а1. Сигг. Вю1. 4: 1099-1103. Создание мышей, экспрессирующих полипептиды иммуноглобулинов человека, описано Вгиддетапп е1 а1. Сигг. Орш. Вю1есйпо1. 8 (4): 455-8 (1997); ЬопЬетд е1 а1. 1п1. Веу. 1ттипо1. 13 (1): 65-93 (1995); №иЬегдег е1 а1., №11иге 338: 350-2 (1989). Создание трансгенных мышей с использованием клона ВАС описано Уапд е1 а1., N1. Вю1есйпо1. 15: 859-65 (1997).
Создание трансгенных кроликов описано Рап, 1. е1 а1., Ра1йо1. 1п1. 49: 583-94 (1999); Вгет е1 а1., Мо1. Вергоб. Эеу. 44: 56-62 (1996). Клонирование кроликов на основе ядерного переноса описано 81юе е1 а1., Вю1оду оГ Вертобисбоп 39: 657-664 (1988). Кролики с ослабленной экспрессией иммуноглобулинов описаны МсСайпеу-Ргапс1з е1 а1., Мо1. 1ттипо1. 24: 357-64 (1987); А11едгисс1, е1 а1., Еиг. 1. 1ттипо1. 21: 411-7 (1991).
Получение трансгенной курицы описано Е1сйез е1 а1., Ме1йобз ш Мо1еси1аг Вю1оду 62: 433-450; Рат е1 а1., Се11з Т1ззиез Огдапз 1999; 165 (3-4): 212-9; 8апд, Н., «Тгапздешс сЫскепз-те1йобз апб ро1епйа1 аррйсабопз», Тгепбз Вю1есйпо1. 12: 415 (1994); и в \УО 200075300, «1п1тобисшд а пис1ею ас1б ш1о ап а\зап депоте, изеГи1 Гог йапзГесйпд асзап Ь1аз1обегта1 се11з Гог ргобисшд йапздешс асзап ашта1з \νίΐ1ι 1йе безиеб депез, Ьу б1гес11у т1тобистд 1йе пис1ею ас1б ш1о 1йе дегтша1 б1зс оГ 1йе едд».
Курица с агаммаглобулинемией описана Рготте1 е1 а1., 1. 1ттипо1. 105 (1): 1-6 (1970); Вепебю! е1 а1., Абу. Ехр. Меб. Вю1. 1977; 88 (2): 197-205.
Клонирование животных из клеток описано Т. ^акауаша е1 а1., №1Шге 1998; 394: 369-374; 1. В. С1ЬеШ е1 а1., 8с1епсе 280: 1256-1258 (1998); 1.В. С1ЬеШ е1 а1., №1ше Вю1есйпо1оду 1998; 16: 642-646; А. Е. 8с11шеке е1 а1., 8с1епсе 278: 2130-2133 (1997); К. Н. СатрЬе11 е1 а1., ХаИие 380: 64-66 (1996).
Получение антител из трансгенных животных описано в патентах США 5814318, 5545807 и 5570429. Примеры гомологичной рекомбинации для получения химерных хозяев-млекопитающих приведены в патенте США 5416260. Способ введения ДНК в эмбрион описан в патенте США 5567607. Поддержание и размножение эмбриональных стволовых клеток описано в патенте США 5453357.
Обзор механизмов, вовлеченных в формирование разнообразия спектра антител у свиней, овец и коров, приведен в Ви11ег, 1. Е. (1998), «1ттипод1оЬи1ш бйегзйу, В-се11 апб апНЬобу герейо1ге беуе1ортеп1 ш 1агде Гагт ашта1з», Веу. 8ск Тесй. 17: 43. Формирование разнообразия антител у овец описано в Веупаиб, С. А., С. Оагаа, ^. В. Нет, апб 1. С. \УеШ (1995), «Нуретти1а1юп депетайпд 1йе зйеер 1ттипод1оЬи1ш герейойе 1з ап апйдеп-тберепбеп! ргосезз», Се11 80: 115; и ИиГоиг, V., 8. Ма1шде, апб Р. Ν;ιιι. (1996), «Тйе зйеер 1д уапаЫе тедюп терейойе сопз1з1з оГ а зшд1е νΉ Гатбу», 1. 1шшцпо1. 156: 2163.
Сущность изобретения
Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным антителам (гуманизированным иммуноглобулинам), содержащим, по меньшей мере, часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека.
Гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных, отличных от человека, созданных генно-инженерным способом так, что они содержат один или более локусов гуманизированных 1д.
Предпочтительно гуманизированные антитела согласно данному изобретению получают из трансгенных животных, отличных от человека, у которых разнообразие антител главным образом образуется в результате конверсии и гипермутирования генов, например кролика, свиньи, курицы, овцы, коровы и лошади. Антитела можно получить посредством иммунизации трансгенных животных требуемым антигеном, таким как инфекционный агент (например, бактерии или вирусы) или их части или фрагменты.
Такие гуманизированные антитела обладают пониженной иммуногенностью у приматов, в частности у человека, по сравнению с негуманизированными антителами, полученными от животных, отличных от человека. Поэтому гуманизированные антитела согласно данному изобретению подходят для
- 2 007958 применения в терапевтическом лечении людей.
Другой вариант данного изобретения относится к препарату гуманизированных антител, которые могут быть моноклональными антителами или поликлональными антителами. Предпочтительные препараты антител согласно данному изобретению являются препаратами поликлональных антител, которые согласно данному изобретению обладают минимальной иммуногенностью по отношению к приматам, особенно человеку.
Предпочтительный препарат поликлональных антител состоит из гуманизированных молекул иммуноглобулина, имеющих, по меньшей мере, полипептидную последовательность константной области тяжелой цепи или легкой цепи, кодируемую сегментом гена константной области человека. Более предпочтительно вариабельные домены тяжелых цепей или легких цепей молекул иммуноглобулинов также кодируются сегментами генов человека.
В другом варианте данное изобретение относится к фармацевтическим композициям, которые включают препарат гуманизированных антител и фармацевтически приемлемый носитель.
Другой вариант данного изобретения относится к новым последовательностям из 5'- и 3'фланкирующих участков сегментов генов 1д животных, отличных от человека, предпочтительно животных, у которых формирование разнообразия антител, главным образом, основано на конверсии генов. В частности, данное изобретение относится к новым нуклеотидным последовательностям, расположенным ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих СХ у куриц, Су и Ск у кроликов, Су1, 2, 3 у коров и Су1, 2 у овец, а также новым последовательностям 5' Су кроликов.
В другом варианте данное изобретение относится к рекомбинантным векторам, пригодным для замены сегмента гена 1д животного, отличного от человека, соответствующим сегментом гена 1д человека. Указанные векторы включают сегмент гена 1д человека, который связан с фланкирующими последовательностями на 5'-конце и 3'-конце, при этом фланкирующие последовательности гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента гена 1д животного-мишени.
Предпочтительные рекомбинантные векторы представляют собой векторы, пригодные для замены константной области 1д животного. Например, представлены рекомбинантные векторы, пригодные для замены генов константных областей тяжелой цепи кролика. Предпочтительный вектор содержит в направлении 5'^3' нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕО ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, или часть 8Е0 ΙΌ N0: 12 или 8ЕЦ ΙΌ N0: 13, сегмент гена константной области тяжелой цепи человека, нуклеотидную последовательность, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 10 или часть 8ЕЦ ΙΌ N0: 10. Другой предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 51, и эта последовательность характеризуется тем, что содержит ген Су1 человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена константной области тяжелой цепи кролика.
Также представлены рекомбинантные векторы, пригодные для замены генов константной области легкой цепи кролика. Предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕЦ ΙΌ N0: 53, и эта последовательность характеризуется тем, что включает Ск человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3' -фланкирующих участков гена Ск1 легкой цепи кролика.
Представлены другие рекомбинантные векторы, которые пригодны для замены генов константных областей легкой цепи курицы. Предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в 8Е0 ΙΌ N0: 57, которая характеризуется тем, что включает в себя СХ2 человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5' и 3'-фланкирующих участков гена С λ легкой цепи курицы.
Другие представленные рекомбинантные векторы включают векторы, пригодные для замены элементов У-области Ι§ животного. Например, представлен рекомбинантный вектор, пригодный для замены элемента У-области тяжелой цепи кролика, и он содержит 8Е0 ΙΌ N0: 52. Представлен рекомбинантный вектор, пригодный для замены элемента У-области легкой цепи кролика, и он содержит 8Е0 ΙΌ N0: 54.
В еще одном варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям или векторам, содержащим по меньшей мере один гуманизированный локус Ιβ. т.е. локус Ιβ животного, отличного от человека, или часть локуса Ιβ животного, отличного от человека, где локус или часть локуса генетически модифицирована так, что содержит по меньшей мере один сегмент гена Ιβ человека. Такой гуманизированный локус Ιβ обладает способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов у животного, отличного от человека, тем самым, продуцируя разнообразный спектр гуманизированных иммуноглобулинов.
Один гуманизированный локус Ι§, представленный в изобретении, является гуманизированным локусом тяжелой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена У, один или более сегментов гена Ό, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в гуманизированном локусе тяжелой цепи размещены по отношению друг к другу в нереаранжированной или частично или полностью реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гума
- 3 007958 низированной тяжелой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно Са или Су. Более предпочтительный гуманизированный локус содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека наряду с участком константной области тяжелой цепи человека. Сегмент гена V человека помещен ниже нечеловеческих сегментов гена V.
Другой гуманизированный локус 1д представляет собой гуманизированный локус легкой цепи, который включает в себя один или более сегментов гена V, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в локусе гуманизированной легкой цепи расположены по отношению к друг другу либо в нереаранжированной, либо в реаранжированной конфигурации. Предпочтительный локус гуманизированной легкой цепи содержит сегмент гена константной области человека, предпочтительно СХ или Ск. Более предпочтительно, локус гуманизированной легкой цепи, кроме того, содержит множественные сегменты гена V и по меньшей мере один сегмент гена V человека. Сегмент гена V человека помещен ниже сегментов нечеловеческого гена V. Еще более предпочтительно локус гуманизированной легкой цепи включает в себя реаранжированный сегмент VI человека, помещенный ниже ряда генных сегментов УБ (например, 10-100) либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения.
Другой вариант данного изобретения относится к способам получения трансгенного вектора, содержащего гуманизированный локус 1д, посредством выделения локуса 1д или части локуса 1д животного, отличного от человека, и интеграции требуемого сегмента (ов) гена 1д человека в выделенный локус 1д животного или выделенную часть локуса 1д. Сегмент(ы) гена 1д человека интегрируют в выделенный локус 1д животного или выделенную часть локуса 1д с помощью лигирования или гомологичной рекомбинации таким образом, чтобы сохранить способность локуса подвергаться эффективной реаранжировке генов и конверсии генов у животного, отличного от человека. Интеграцию сегмента гена 1д человека посредством гомологичной рекомбинации можно выполнить с использованием рекомбинантных векторов согласно данному изобретению.
В другом варианте данное изобретение относится к способам получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные антитела. Трангенных животных можно создать путем введения трансгенного вектора, содержащего гуманизированный локус 1д или рекомбинантного вектора, содержащего сегмент гена 1д человека, в реципиентную клетку или клетки животного, и получения животного из генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток.
Также представлены трансгенные животные, содержащие один или более гуманизированных локусов 1д, и клетки, полученные от таких трансгенных животных (такие как В-клетки иммунизированного трансгенного животного). Трансгенные животные согласно данному изобретению способны к осуществлению реаранжировки генов и конверсии генов в трансгенном гуманизированном локусе 1д с получением разнообразного спектра гуманизированных молекул иммуноглобулина.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. 3'-Фланкирующие последовательности Су коровы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН3, и З'-праймер находится в М1. Последовательности клона 11, клона 3 и клона 5 указаны в 8ЕО ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 8Е0 ΙΌ N0: 5, соответственно.
Фиг. 2. 3'-Фланкирующие последовательности Су овцы. Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН3, и 3'-праймер находится в М2. Последовательности клона 11 и клона 1 указаны в 8Е0 ΙΌ N0: 8 и 8Е0 ΙΌ N0: 9, соответственно.
Фиг. 3. Новая 3'-фланкирующая последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 10) гена С-гамма кролика.
Фиг. 4. Новая нуклеотидная последовательность (8Е0 ΙΌ N0: 11) 3'-конца гена С-каппа-1 кролика.
Фиг. 5. Новые нуклеотидные последовательности (8Е0 ΙΌ N0: 12 апб 8Е0 ΙΌ N0: 13) 5'-конца гена С-гамма кролика. Последовательности между 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13 (пробел длиной примерно 1000 нуклеотидов) еще предстоит определить.
Фиг. 6. Сравнение последовательностей человека, мыши, кролика, овцы, коровы и верблюда в М1- и М2-участках 3'-конца гена С-гамма.
Фиг. 7а. Конструкция ДНК для замены Ск кролика на Ск человека. Фрагмент длиной 0,5 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую Ск человека, фланкирован последовательностями гена Ск1 кролика. «Верхняя» последовательность (5'Ск) составляет 2,8 т.п.н., «нижняя» последовательность (3'Ск) составляет 2,6 т.п.н. Вектор также содержит кассету 1ох-пео для позитивной селекции и кассету Ηκν-Тк для негативной селекции.
Фиг. 7Ь. Конструкция ДНК для замены Су кролика на Су1 человека. Фрагмент длиной 1,8 т.п.н., содержащий последовательность ДНК, кодирующую Су1 человека, фланкирован последовательностями гена Су кролика. «Верхняя» последовательность (5'Су) составляет 1,9 т.п.н., «нижняя» последовательность (3'Су) составляет 3,1 т.п.н. Вектор также содержит кассету 1ох-пео для позитивной селекции и кассету Ηκν-Тк для негативной селекции. Масштаб фигуры не выдержан.
Фиг. 8. Фрагмент ДНК (8Е0 ΙΌ N0: 51), содержащий сегмент гена Су1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из фланкирующих участков гена
- 4 007958
Су кролика. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена Су кролика, подчеркнуты.
Фиг. 9. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ГО N0: 52), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична ν-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательность ν-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов νΗ1 и 1 кролика, подчеркнуты.
Фиг. 10. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ГО N0: 53), содержащий сегмент гена Ск тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из гена легкой цепи иммуноглобулина кролика каппа-1. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков гена Ск кролика, подчеркнуты.
Фиг. 11. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ГО N0: 54), содержащий сегмент гена V, последовательность которого более чем на 80% идентична ν-элементам кролика, и кодирующий полипептидную последовательность ν-элемента человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и I кролика, подчеркнуты.
Фиг. 12. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ГО N0: 57), содержащий ген, кодирующий константную область легкой цепи иммуноглобулина человека С-лямбда-2, фланкированный 50 нуклеотидами (подчеркнуты), полученными из фланкирующих последовательностей гена С-лямбда курицы.
Фиг. 13. Модификация локуса легкой цепи курицы с использованием системы ЕТ. Геномный ВАСклон курицы с полноразмерным локусом легкой цепи модифицировали посредством гомологичной рекомбинации. На первой стадии СХ делегировали в результате инсерции кассеты для селекции, которую на второй стадии гомологичной рекомбинации заменяли на ген СХ человека.
Фиг. 14. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ΙΌ N0: 58), содержащий сегмент гена VI. последовательность которого на 80% идентична сегментам гена V курицы, и кодирующий полипептид VI иммуноглобулина человека. Фланкирующие последовательности, полученные из фланкирующих участков генов V и I иммуноглобулина курицы, подчеркнуты.
Фиг. 15. Модифицированный локус легкой цепи курицы.
Подробное описание изобретения
Один вариант данного изобретения относится к гуманизированным иммуноглобулинам (антителам).
Под «гуманизированным антителом» или «гуманизированным иммуноглобулином» подразумевается молекула иммуноглобулина, имеющая по меньшей мере часть полипептидной последовательности иммуноглобулина человека (или полипептидной последовательности, кодируемой сегментом гена 1д человека). Молекулы гуманизированных иммуноглобулинов согласно данному изобретению можно выделить из трансгенных животных, отличных от человека, полученных генно-инженерным способом, так, что они продуцируют молекулы гуманизированных иммуноглобулинов. Такие гуманизированные молекулы иммуноглобулинов менее иммуногены по отношению к приматам, в частности к человеку, по сравнению с негуманизированными молекулами иммуноглобулинов, выделенными от животного, или выделенными из клеток, полученных от животного.
Термин «животные, отличные от человека» в используемом в данном описании смысле включает в себя, но не ограничен указанным, кроликов, свиней, птиц (например, куриц, индеек, уток, гусей и т.п.), овец, коз, коров и лошадей. Предпочтительными животными, отличными от человека, являются такие животные, у которых формирование разнообразия антител главным образом основано на конверсии генов и/или соматическом гипермутировании, например, кролик, свиньи, птицы (например, курица, индейка, утка, гусь и т.п.), овца, коза и корова. Особенно предпочтительными животными, отличными от человека, являются кролик и курица.
У таких животных, как человек и мышь, имеется множество копий сегментов гена V, Ό и 1 в локусе тяжелой цепи и множество копий сегментов гена V и I в локусе легкой цепи. Разнообразие антител у указанных животных главным образом формируется в результате реаранжировки генов, т.е. различных комбинаций сегментов гена с образованием реаранжированной вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи. Однако у других животных (например, у кролика, курицы, овцы, козы и коровы) реаранжировка генов не играет значительной роли в создании разнообразия антител. Например, у кролика только очень ограниченное количество сегментов гена V, чаще всего сегменты гена V на З'-конце V-области, используются в реаранжировке генов с образованием непрерывного участка ХТО. У курицы только один сегмент гена V (участок, прилежащий к Ό-области или «3'-проксимальный сегмент гена V»), один Ό-сегмент и один 1-сегмент используются при реаранжировке тяжелой цепи; и только один сегмент гена V (З'-проксимальный сегмент V) и один сегмент 1 используются при реаранжировке легкой цепи. Таким образом, у указанных животных существует небольшое разнообразие исходно реаранжированных последовательностей вариабельных областей, возникающих при формировании разнообразия воссоединением. Дальнейшее формирование разнообразия реаранжированных генов 1д достигается посредством конверсии генов, процесса, при котором короткие последовательности, полученные из расположенных выше сегментов гена V, заменяют короткие последовательности внутри сегмента гена
- 5 007958
V в реаранжированном гене 1д.
Термин «сегмент гена 1д» в используемом в данном описании смысле относится к участкам ДНК, кодирующим различные части молекулы 1д, которые присутствуют в зародышевой линии животных и человека, и которые сходятся вместе в В-клетках, образуя реаранжированные гены 1д. Таким образом, сегменты гена 1д в используемом в данном описании смысле включают в себя сегменты генов V, сегменты генов Ό, сегменты генов 1 и генные сегменты С-области.
Термин «сегмент гена 1д человека» в используемом в данном описании смысле включает в себя как последовательности сегмента гена 1д человека природного происхождения, так и вырожденные формы последовательностей сегмента гена 1д человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени идентичную полипептиду, кодируемому последовательностью сегмента гена 1д человека природного происхождения. «В значительной степени» означает, что степень идентичности аминокислотных последовательностей составляет по меньшей мере примерно 85-95%.
Предпочтительная молекула гуманизированного иммуноглобулина согласно данному изобретению содержит, по меньшей мере, часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно молекула иммуноглобулина содержит, по меньшей мере, часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека и, по меньшей мере, часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека.
В другом варианте данное изобретение относится к препарату гуманизированных антител.
Термин «препарат гуманизированных антител» означает продукт, представленный выделенным антителом, или продукт, представленный очищенным антителом, полученный из трансгенного животного, отличного от человека (например, из сыворотки, молока или яичного желтка животного) или из клеток, полученных из трансгенного животного, отличного от человека (например, В-клетки или клетки гибридомы).
Препарат гуманизированного антитела может быть препаратом поликлональных антител, который включает в себя спектр гуманизированных молекул иммуноглобулина. Препарат гуманизированных антител также может представлять собой препарат моноклонального антитела.
Хотя иммуногенность препарата гуманизированного моноклонального антитела по отношению к человеку также снижена по сравнению с препаратом негуманизированного моноклонального антитела, препараты гуманизированных поликлональных антител являются предпочтительными вариантами данного изобретения. Выяснено, что гуманизированные моноклональные антитела еще вызывают некоторую степень иммунного ответа (антиидиотипический ответ) у приматов (например, человека) при многократном введении в больших количествах вследствие уникального и нового идиотипа моноклонального антитела. Авторы данного изобретения однозначно показали, что общая иммуногенность поликлональных антител менее зависима от антиидиотипического ответа. Например, поликлональные антитела, полученные от животных, отличных от человека, в которых гуманизированы только элементы константной области (например, поликлональные антитела, имеющие константные области, кодируемые сегментами гена человека, и имеющие вариабельные домены, кодируемые эндогенными генами животного, отличного от человека) по существу не иммуногены у приматов.
Без намерения связать с какой-либо теорией авторы данного изобретения предположили, что сниженная иммуногенность такого препарата гуманизированных поликлональных антител является следствием того факта, что препарат содержит очень большое количество различных антител, с большим количеством разных идиотипов, которые в большой степени определяются новыми аминокислотными последовательностями в гипервариабельных областях (СЭВ) тяжелой и легкой цепи. Поэтому при введении такого препарата примату, такому как человек, введенное количество каждой отдельной молекулы иммуноглобулина в препарате может быть слишком мало, чтобы вызвать иммунный ответ против каждой молекулы иммуноглобулина. Таким образом, препарат гуманизированных поликлональных антител, который имеет много разных идиотипов и вариабельных областей, обладает минимальной иммуногенностью по отношению к реципиенту, даже если все антитела в препарате поликлональных антител направлены к одному и тому же антигену. Чтобы далее снизить какую-либо потенциальную остаточную иммуногенность, можно получить препарат гуманизированных поликлональных антител, который состоит из молекул иммуноглобулина, имеющих как вариабельные домены, так и константные области, кодируемые сегментами гена 1д человека.
В предпочтительном варианте данное изобретение относится к препарату антитела, который включает в себя гуманизированные молекулы иммуноглобулинов, имеющие по меньшей мере часть полипептидной последовательности константной области тяжелой или легкой цепи человека. Более предпочтительно, гуманизированные иммуноглобулины в препарате антител согласно данному изобретению дополнительно содержат по меньшей мере часть полипептидной последовательности вариабельного домена человека в дополнение по меньшей мере к части полипептидной последовательности константной области человека.
Предпочтительные препараты гуманизированных антител согласно данному изобретению состоят из гуманизированных антител, полученных от трансгенных животных, отличных от человека, разнообра
- 6 007958 зие антител которых, главным образом, формируется в результате конверсии генов, таких как кролик, птицы (например, курица, индейка, утка, гусь и т.п.), овца, коза и корова; предпочтительно кролик и курица.
После получения трансгенного животного, отличного от человека, способного продуцировать разнообразные гуманизированные молекулы иммуноглобулинов (как, кроме того, указано далее) гуманизированные иммуноглобулины и препараты гуманизированных антител против антигена легко можно получить посредством иммунизации животного антигеном. Для иммунизации трансгенного животногохозяина можно использовать множество антигенов. Такие антигены включают микроорганизм, например вирусы и одноклеточные организмы (такие как бактерии и грибы), живые, аттенуированные или мертвые, фрагменты микроорганизмов или антигенные молекулы, выделенные из микроорганизмов.
Предпочтительные бактериальные антигены для применения при иммунизации животного включают очищенные антигены 81арбу1ососсик аитеик, такие как капсульные полисахариды типа 5 и 8, рекомбинантные версии факторов вирулентности, таких как альфа-токсин, белки, связывающие адгезии, белки, связывающие коллаген, и белки, связывающие фибронектин. Предпочтительные бактериальные антигены также включают аттенуированный вариант 8. аитеик, Ркеиботопак аетидшока, Етегососсик, ЕтегоЬас1ег и К1еЬк1е11а риеитошае, или надосадок культуры клеток указанных бактерий. Другие бактериальные антигены, которые можно использовать для иммунизации, включают очищенный липополисахарид (ЛПС), капсульные антигены, капсульные полисахариды и/или рекомбинантные варианты белков наружной мембраны, белки, связывающие фибронектин, эндотоксин и экзотоксин Ркеиботопак аетидшока, Еп1етососсик, Еп1егоЬас1ег и К1еЬк1е11а риеитошае.
Предпочтительные антигены для создания антител против грибов включают аттенуированные варианты грибов или белков их наружной мембраны, и указанные грибы включают, но не ограничены указанным, Сапб1ба а1Ысаик, Сапб1ба рагаркйоык, Сапб1ба боркабк и СтурФсоссик пеоГогтапк.
Предпочтительные антигены для применения при иммунизации для того, чтобы получить антитела против вирусов, включают белки оболочки и аттенуированные варианты вирусов, которые включают, но не ограничены указанным, респираторно-синцитиальный вирус (К.8У) (в частности, Р-белок), вирус гепатита С (НСУ), вирус гепатита В (ИВУ), цитомегаловирус (СМУ), ЕВУ и Н8У.
Терапевтические антитела для лечения рака можно получить иммунизацией трансгенных животных выделенными клетками опухоли или линиями опухолевых клеток; ассоциированными с опухолями антигенами, которые включают, но не ограничены указанным, антиген Нег-2-пеи (антитела против которого применимы для лечения рака молочной железы); антигены СЭ20, СЭ22 и СЭ53 (антитела против которых применимы для лечения В-клеточных лимфом), (3) специфичный для простаты мембранный антиген (РМ8А) (антитела против которого применимы для лечения рака простаты) и молекула 17-1А (антитела против которой применимы для лечения рака толстой кишки).
Антигены можно вводить трансгенному животному-хозяину любым обычным способом с адъювантом или без него, и можно вводить согласно назначаемой схеме.
После иммунизации сыворотку или молоко иммунизированных трансгенных животных можно фракционировать для очистки поликлональных антител, специфичных по отношению к антигену до фармацевтической степени очистки. В случае трансгенных птиц антитела также можно получить фракционированием яичных желтков. Концентрированную очищенную иммуноглобулиновую фракцию можно получить хроматографией (аффинной, ионообменной, гель-фильтрацией и т.д.), избирательным осаждением солями, такими как сульфат аммония, органическими растворителями, такими как этанол, или полимерами, такими как полиэтиленгликоль.
Для получения моноклональных антител выделяют клетки селезенки от иммунизированного трансгенного животного и используют либо в слиянии клеток с трансформированными линиями клеток для получения гибридом, либо кДНК, кодирующую антитела, клонируют стандартными способами молекулярной биологии и экспрессируют в трансфецированных клетках. Методики получения моноклональных антител хорошо разработаны в данной области. См., например, Европейскую патентную заявку 0583980 А1 («Ме1йоб Рог Сеиетабид Мопос1опа1 АибЬоб1ек Ргот КаЬЬйк»), патент США 4977081 («81аЬ1е ВаЬЬйМоике НуЬпботак апб 8естебоп Ргобис1к ТбетеоГ»), \νϋ 97/16537 («81аЬ1е СЫскеп В-се11 Ыпе апб Мебюб оГ Ике ТбетеоГ») и ЕР 04 91057 В1 («НуЬпбота \νΐιΕ1ι Ргобисек Ау1ап 8ресШс 1ттипод1оЬи1ш С»), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки. Продукция моноклональных антител ш Х11го на основе клонированных молекул кДНК описана Аиблк-МбЬорГ е1 а1., «Ме1йобк Гог 1йе деиетабои оГ сЫскеп топос1опа1 апбЬобу ГтадтеШк Ьу рбаде б1кр1ау», 1. 1ттипо1. Мебюбк 242: 159 (2000) и Вибоп, Ό. В., «Рбаде б1кр1ау», 1ттипо1есНпо1оду 1: 87 (1995), описания которых включены в данную заявку в виде ссылки.
В следующем варианте данного изобретения очищенные моноклональные или поликлональные антитела смешивают с соответствующим фармацевтическим носителем, пригодным для введения приматам, в частности человеку, чтобы получить фармацевтические композиции. Фармацевтически приемлемыми носителями, которые можно использовать в данных фармацевтических композициях, могут быть любые и все растворители, дисперсионные среды, изотоничные агенты и т.п. За исключением случаев, когда любые обычные среды, агент, разбавитель или носитель вредят реципиенту или терапевтической
- 7 007958 эффективности находящихся в них антител, их применение в фармацевтических композициях согласно данному изобретению приемлемо. Носителем могут быть жидкие, полутвердые, например пасты, или твердые носители. Примеры носителей включают масла, воду, физиологические растворы, спирт, сахар, гель, липиды, липосомы, смолы, пористые основы, связывающие вещества, наполнители, покрытия, консерванты и тому подобное, или их комбинации.
Данное изобретение, кроме того, относится к новым нуклеотидным последовательностям и векторам, а также к применению последовательностей и векторов для получения трансгенного животного, отличного от человека, которое продуцирует гуманизированные иммуноглобулины.
В общем, генетическая инженерия животного, отличного от человека, заключается в интеграции одного или более сегментов гена 1д в геном животного, чтобы создать один или более гуманизированных локусов 1д. Следует заметить, что в зависимости от подхода, используемого в генетической модификации, сегмент гена 1д человека можно интегрировать в эндогенный локус 1д животного (например, в результате направленной инсерции) или в другой локус животного. Другими словами, гуманизированный локус 1д может находиться в положении хромосомы, в котором обычно находится эндогенный локус 1д животного, или в положении хромосомы, отличном от положения, в котором обычно находится эндогенный локус 1д животного. Независимо от хромосомного положения гуманизированный локус 1д согласно данному изобретению обладает способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов у животного, отличного от человека, тем самым, продуцируя разнообразный спектр гуманизированных молекул иммуноглобулинов. Локус 1д, обладающий способностью подвергаться реаранжировке генов и конверсии генов, в данном описании также называется «функциональным» локусом 1д, и антитела в случае разнообразия, создаваемого функциональным локусом 1д, также называются в данном описании «функциональными» антителами или «функциональным» спектром антител.
В одном варианте данное изобретение относится к новым последовательностям, применимым для создания гуманизированного локуса 1д и получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные молекулы иммуноглобулинов. В частности, данное изобретение относится к последовательностям из 5'- и З'-фланкирующих участков сегментов гена 1д животного, отличного от человека, предпочтительно животного, создание разнообразия антител которого, главным образом, основано на конверсии генов (например, кролика, свиньи, овцы, козы, коровы, птиц, таких как курица, индейка, утка, гусь и т. п.).
5'- и З'-Фланкирующие участки генов, кодирующих константную область, являются особенно важными, так как указанные последовательности содержат нетранслируемые регуляторные элементы (например, энхансеры), необходимые для высокой экспрессии 1д в сыворотке. З'-Фланкирующий участок генов, кодирующих константную область тяжелой цепи, также содержит экзоны, кодирующие мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы иммуноглобулина (Уо1дша с1 а1. 1. 1ттипо1. 165: 6400, 2000). Ранее было установлено, что мембранный и цитоплазматический концевой участок мембранной формы антител необходимы для достижения высокого уровня экспрессии антител в сыворотке мышей (Ζου с1 а1., 8с1епсе 262: 1271, 1993). Таким образом, идентификация фланкирующих последовательностей позволяет осуществлять замену экзонов и промежуточных интронов гена Су человеческим эквивалентом и сохранять эндогенные экзоны, кодирующие трансмембранную и цитоплазматическую концевую области, а также эндогенные некодирующие энхансерные последовательности.
В одном варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих Су кролика, Су1, 2, 3 коровы и Су1, 2 овцы. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают 8ЕО ΙΌ N0: 10 (3' Су кролика), 8ЕО ΙΌ N0: 3-5 (3' Су1, 2, 3 коровы) и 8ЕО ΙΌ N0: 8-9 (3' Су1, 2 овцы).
В другом варианте данное изобретение относится к 3'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, данное изобретение относится к нуклеотидным последовательностям ниже (3', 3-штрих) генов, кодирующих Ск у кроликов. Особенно предпочтительные нуклеотидные последовательности включают 8Е0 ΙΌ N0: 11 (3' Ск кролика).
В еще одном варианте данное изобретение относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей тяжелой цепи животных, отличных от человека. Более конкретно, представлены нуклеотидные последовательности выше (5', 5-штрих) гена Су кролика. Особенно предпочтительные последовательности включают 8Е0 ΙΌ N0: 12 и 8Е0 ΙΌ N0: 13.
Другой вариант данного изобретения относится к 5'-фланкирующим последовательностям константных областей легкой цепи животных, отличных от человека.
Данное изобретение относится к частям указанных выше новых фланкирующих последовательностей. «Часть» означает фрагмент фланкирующей нуклеотидной последовательности, способный опосредовать гомологичную рекомбинацию между сегментом гена Ιβ человека и сегментом гена Ιβ животногомишени. В общем, часть составляет по меньшей мере примерно 200 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере примерно 400 пар оснований в случае рекомбинации в таких клетках животных, как клет
- 8 007958 ки Е8 или фибробласты, и по меньшей мере 40 пар оснований, предпочтительно по меньшей мере 50 пар оснований в случае рекомбинации в Е. сой. Примеры частей указанных выше новых фланкирующих последовательностей включают 8ЕЦ ГО N0: 59-60, 61-62, 63-64, 65-66, 67-68 и 69-70 (представленные подчеркнутыми последовательностями на фиг. 8-12 и 14 соответственно).
В следующем аспекте данное изобретение относится к векторам, пригодным для замены сегмента гена 1д животного, отличного от человека, соответствующим сегментом гена 1д человека. Указанные векторы, также называемые в данном описании «рекомбинантными векторами», включают сегмент гена 1д человека, который связан с фланкирующими последовательностями на 5'-конце и З'-конце, при этом степень гомологии фланкирующих последовательностей с фланкирующими последовательностями сегмента гена 1д животного-мишени достаточна для опосредования гомологичной рекомбинации между сегментами гена человека и гена животного. Как правило, по меньшей мере примерно 200 оснований должны быть идентичными во фланкирующих областях в рекомбинантном векторе и фланкирующих областях гена-мишени для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в клетках животных, таких как клетки Е8 и фибробласты; и по меньшей мере примерно 40 оснований должны быть идентичными для достижения эффективной гомологичной рекомбинации в Е. сой.
Представлены рекомбинантные векторы, пригодные для замены генов константных областей тяжелой цепи иммуноглобулина животного, которые содержат от 5'- к З'-концу нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени, ген константной области тяжелой цепи человека (например, Су1 человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную З'-фланкирующему участку гена константной области тяжелой цепи животного-мишени.
Представлены предпочтительные рекомбинантные векторы для замены генов константных областей тяжелой цепи кролика. Один такой вектор содержит в направлении 5'^3', нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕЦ ГО N0: 12 или 8ЕЦ ГО N0: 13, или их часть, сегмент гена константной области тяжелой цепи человека, нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕЦ ГО N0: 10, или часть 8ЕЦ ГО N0: 10. Другой такой вектор содержит 8ЕЦ ГО N0: 51 (фиг. 8), которая характеризуется тем, что содержит ген Су1 человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'фланкирующих участков гена константной области тяжелой цепи кролика.
Также представлены рекомбинантные векторы, которые применимы для замены генов константных областей легкой цепи иммуноглобулина животного. Такие векторы содержат в направлении 5'^3' нуклеотидную последовательность, гомологичную 5'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени, ген константной области легкой цепи человека (например, Ск или Ολ человека) и нуклеотидную последовательность, гомологичную 3'-фланкирующему участку гена константной области легкой цепи мишени.
Предпочтительные векторы включают векторы для замены генов константных областей легкой цепи кролика. Предпочтительный вектор содержит нуклеотидную последовательность, указанную в 8ЕЦ ГО N0: 53, и указанная последовательность характеризуется тем, что содержит ген Ск человека, связанный с фланкирующими последовательностями из 5'- и 3'-фланкирующих участков гена Ск1 легкой цепи кролика.
Другие представленные рекомбинантные векторы включают векторы, применимые для замены элементов У-области 1д животного. Например, представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента У-области тяжелой цепи кролика, который содержит 8ЕЦ ГО N0: 52. Представлен рекомбинантный вектор, применимый для замены элемента У-области легкой цепи кролика, который содержит 8Е0 ГО N0: 54.
Рекомбинантные векторы согласно данному изобретению могут включать дополнительные последовательности, которые облегчают селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации. Например, маркерные гены, кодирующие устойчивость к неомицину, блеомицину, пуромицину и тому подобному, можно включить в рекомбинантные векторы, чтобы облегчить селекцию клеток, которые успешно претерпели событие рекомбинации.
В следующем аспекте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям или векторам, несущим один или более гуманизированных локусов 1д.
В одном варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус тяжелой цепи 1д, который включает один или более сегментов гена У, один или более сегментов гена Ό, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена представляет собой сегмент гена тяжелой цепи человека. Сегменты генов в таком гуманизированном локусе тяжелой цепи расположены по отношению друг к другу в нереаранжированной конфигурации (или «конфигурации гаметического типа») или в частично или полностью реаранжированной конфигурации. Гуманизированный локус тяжелой цепи обладает способностью подвергаться реаранжировке генов (если сегменты генов не полностью реаранжированы) и конверсии генов у животного, отличного от человека, продуцируя при этом разнообразный спектр тяжелых цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или «гуманизированных тяже
- 9 007958 лых цепей».
В предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи содержит, по меньшей мере, сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно Са или Су (включая любые подклассы Су1, 2, 3 и 4).
В другом более предпочтительном варианте гуманизированный локус тяжелой цепи трансгена содержит гуманизированную ν-область и гуманизированную С-область, т.е. ν-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена νΗ человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, Са или Су человека).
Предпочтительно гуманизированная ν-область содержит по меньшей мере примерно 10-100 сегментов гена V тяжелой цепи (или «νΗ»), по меньшей мере один из которых является сегментом гена νΗ человека. Согласно данному изобретению сегмент гена νΗ человека, включенный в трансген, обладает по меньшей мере примерно 75-85% гомологией с участками гена νΗ животного-хозяина, в частности, с участками гена νΗ животного, включенными в вышерасположенный участок трансгена. Как описано выше, участок νΗ человека охватывает последовательности сегмента гена νΗ человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена νΗ человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность в значительной степени (т.е. по меньшей мере, примерно на 85-95%) идентичную полипептиду ν-домена тяжелой цепи человека.
Предпочтительно сегмент(ы) гена νΗ человека помещают ниже нечеловеческих сегментов νΗ в трансгенном локусе.
Предпочтительно нечеловеческие сегменты гена νΗ в трансгене представляют собой сегменты гена νΗ из З'-УИ-области в локусе 1д животного-хозяина, включая З'-проксимальный νΗ1.
В другом варианте данное изобретение относится к трансгенным конструкциям, содержащим гуманизированный локус легкой цепи, способный претерпевать реаранжировку генов и конверсию генов у животного-хозяина, продуцируя при этом разнообразный спектр легких цепей, имеющих полипептидные последовательности человека, или «гуманизированных легких цепей».
Гуманизированный локус легкой цепи включает один или более сегментов гена ν, один или более сегментов гена 1 и один или более сегментов гена константной области, при этом по меньшей мере один сегмент гена является сегментом гена легкой цепи человека. Сегменты гена в гуманизированном локусе легкой цепи расположены друг относительно друга в нереаранжированной конфигурации (или «конфигурации гаметического типа») или в полностью реаранжированной конфигурации.
В предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи содержит, по меньшей мере, сегмент гена С-области, который является сегментом гена константной области человека, предпочтительно СХ или Ск.
В другом предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи трансгена содержит гуманизированную ν-область и гуманизированную С-область, например ν-область, имеющую по меньшей мере один ген УЪ человека и/или по меньшей мере один реаранжированный сегмент VI человека, и С-область, имеющую по меньшей мере один сегмент гена С человека (например, СХ или Ск).
Предпочтительно гуманизированная У-область включает по меньшей мере примерно 10-100 сегментов гена V легкой цепи (или «УЪ»), по меньшей мере один из которых является сегментом гена УЪ человека. Сегмент гена УЪ человека, включенный в трансген, проявляет по меньшей мере примерно 7585% гомологии с сегментами гена УЪ животного-хозяина, в частности сегментами гена УЪ животного, включенными в вышерасположенный участок трансгена. Соответственно сегмент УЪ человека охватывает последовательности сегмента гена УЪ человека природного происхождения, вырожденные формы последовательностей сегмента гена УЪ человека природного происхождения, а также синтетические последовательности, которые кодируют полипептидную последовательность, в значительной степени (т.е. по меньшей мере, примерно на 85-95%) идентичную полипептиду домена V легкой цепи человека.
Предпочтительно сегмент(ы) гена УЪ человека помещают ниже нечеловеческих сегментов УЪ в трансгенном локусе. Нечеловеческие сегменты гена УЪ в трансгенной конструкции выбраны из сегментов гена УЪ в З'-УЪ-области локуса легкой цепи животного-хозяина, включая З'-проксимальный УЪ1.
В еще одном предпочтительном варианте гуманизированный локус легкой цепи включает реаранжированный сегмент VI человека, помещенный ниже ряда (например, 10-100) сегментов гена УЪ либо нечеловеческого, либо человеческого происхождения.
Другой аспект данного изобретения относится к способам получения трансгенного вектора, содержащего гуманизированный локус 1д. Такие способы заключаются в выделении локуса 1д или его части от животного, отличного от человека, и встраивании требуемого сегмента(ов) гена 1д человека в выделенный локус 1д животного или выделенную часть локуса 1д животного. Сегмент(ы) гена 1д человека встраивают в выделенный локус 1д животного или его часть посредством лигирования или гомологичной рекомбинации таким образом, при котором сохраняется способность локуса претерпевать эффективную реаранжировку генов и конверсию генов у животного, отличного от человека.
Предпочтительно фрагменты ДНК, содержащие локус 1д, которые необходимо гуманизировать, вы
- 10 007958 деляют из животных, у которых разнообразие антител формируется в результате конверсии генов, например кролика или курицы. Такие большие фрагменты ДНК можно выделить посредством скрининга библиотеки на основе плазмид, космид, УАС или ВАС и тому подобных, полученных из геномной ДНК животного, отличного от человека. Полная С-область животного может находиться в одном плазмидном или космидном клоне, который затем подвергают гуманизации. Клоны УАС могут нести фрагменты ДНК длиной до 2 миллионов оснований, таким образом, полный локус тяжелой цепи животного или его большую часть можно выделить в одном клоне УАС или реконструировать так, чтобы он находился в одном клоне УАС. Клоны ВАС способны нести фрагменты ДНК меньших размеров (примерно 150-250 т.п.н.). Однако множество клонов ВАС, содержащих перекрывающиеся фрагменты локуса 1д, можно гуманизировать отдельно и затем вместе инъецировать в клетку животного-реципиента, при этом перекрывающиеся фрагменты рекомбинируют в клетке животного-реципиента с образованием непрерывного локуса 1д.
Сегменты гена 1д человека можно интегрировать в локус 1д в векторе (например, клоне ВАС) множеством способов, включая лигирование фрагментов ДНК или инсерцию фрагментов ДНК с помощью гомологичной рекомбинации. Интеграцию сегментов гена 1д человека осуществляют таким образом, чтобы сегмент гена 1д человека функционально связать с последовательностью животного-хозяина в трансгене, чтобы получить функциональный гуманизированный локус 1д, т.е. локус 1д, способный к реаранжировке генов и конверсии генов, которые приводят к продукции разнообразного спектра гуманизированных антител.
Предпочтительно сегменты гена 1д человека интегрируют в локус 1д гомологичной рекомбинацией. Гомологичную рекомбинацию можно выполнить в бактериях, дрожжевых и других клетках с высокой частотой событий гомологичной рекомбинации. Например, дрожжевую клетку трансформируют УАС, содержащей локус 1д животного или его большую часть. Затем такую дрожжевую клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который описан выше, который несет сегмент гена 1д человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и З'-фланкирующей последовательностью. 5'и 3'-Фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента гена 1д животного в УАС. В результате гомологичной рекомбинации сегмент гена 1д животного в УАС заменяют сегментом гена 1д человека. Альтернативно, бактериальную клетку, такую как Е. сой, трансформируют ВАС, содержащей локус 1д животного или его большую часть. Такую бактериальную клетку дополнительно трансформируют рекомбинантным вектором, который несет сегмент гена 1д человека, связанный с 5'-фланкирующей последовательностью и 3'фланкирующей последовательностью. 5'- и 3'-Фланкирующие последовательности в рекомбинантном векторе опосредуют гомологичную рекомбинацию и обмен между сегментом гена 1д человека в рекомбинантном векторе и сегментом гена 1д животного в ВАС. Гуманизированные УАС и ВАС легко можно выделить из клеток и использовать для получения трансгенных животных.
В следующем аспекте данное изобретение относится к способам получения трансгенных животных, способных продуцировать гуманизированные иммуноглобулины.
Согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, получают введением в реципиентную клетку или клетки животного одного или более трансгенных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут гуманизированный локус 1д, и получением животного из генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток.
Предпочтительно реципиентные клетки являются клетками животных, отличных от человека, которые образуют разнообразие антител посредством конверсии генов и гипермутирования, например птиц (таких как курица), кроликов, коров и тому подобных. У таких животных для продуцирования иммуноглобулинов предпочтительно используется З'-проксимальный сегмент гена V.
Интеграция сегмента гена V человека в локус 1д в трансгенном векторе либо путем замены 3'проксимального сегмента гена V животного, либо путем помещения в непосредственной близости к 3'проксимальному сегменту гена V, приводит к экспрессии полипептидных последовательностей Vобласти человека в большинстве иммуноглобулинов. Альтернативно реаранжированный сегмент У(Э)1 человека можно встроить в локус 1 иммуноглобулинового локуса в трансгенном векторе.
Трансгенные векторы, содержащие гуманизированный локус 1д, вводят в реципиентную клетку или клетки, и затем они интегрируют в геном реципиентной клетки или клеток в результате случайной интеграции или направленной интеграции.
В случае случайной интеграции трансгенный вектор, содержащий гуманизированный локус 1д, можно ввести в реципиентную клетку животного стандартным трансгенным способом. Например, трансгенный вектор можно непосредственно инъецировать в пронуклеус оплодотворенного ооцита. Трансгенный вектор также можно вводить совместной инкубацией спермы с трансгенным вектором до оплодотворения ооцита. Из оплодотворенных ооцитов могут развиваться трансгенные животные. Другой способ введения трансгенного вектора состоит в трансфекции эмбриональных стволовых клеток и затем инъецировании генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в развивающиеся эмбрионы. Альтернативно трансгенный вектор («голый» или в комбинации с облегчающими введение реагентами) можно непосредственно инъецировать в развивающийся эмбрион. В конечном счете, химер
- 11 007958 ных трансгенных животных получают из эмбрионов, которые содержат трансген гуманизированного 1д, интегрированный в геном, по меньшей мере, нескольких соматических клеток трансгенного животного.
В предпочтительном варианте трансген, содержащий гуманизированный локус 1д, случайным образом интегрируют в геном реципиентных клеток (таких как оплодотворенный ооцит или развивающиеся эмбрионы), полученных из линий животных с нарушенной экспрессией эндогенных генов иммуноглобулина. Применение таких линий животных обеспечивает преимущественную экспрессию молекул иммуноглобулина из гуманизированного трансгенного локуса 1д. Примеры таких животных включают линии кроликов А11С1а и ВакНеа, а также линию куриц агаммаглобулинемией. Альтернативно трангенных животных с гуманизированными трансгенами или локусами иммуноглобулинов можно скрестить с линиями животных с нарушенной экспрессией эндогенных иммуноглобулинов. Можно получить потомство, гомозиготное по нарушенному эндогенному локусу 1д и гуманизированному трансгенному локусу 1д.
В случае направленной интеграции трансгенный вектор можно ввести в соответствующие реципиентные клетки животного, такие как эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Затем клетки, в которых трансген был интегрирован в геном животного и заменил соответствующий эндогенный локус 1д посредством гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Затем отобранные клетки можно слить с единичными клетками с удаленным ядром для ядерного переноса, например, ооцитами или эмбриональными стволовыми клетками, клетками, которые являются полипотентными и способны формировать функциональный организм новорожденного. Слияние выполняют согласно традиционным способам, которые хорошо разработаны. См., например, С1ЬеШ е! а1., 8с1еисе (1998) 280: 1256. Удаление ядер ооцитов и ядерный перенос также можно выполнять посредством микрохирургии с использованием инъекционных пипеток. (См., например, \Уакауата е! а1., Ыа1иге (1998) 394: 369). Затем полученные в результате яйцеклетки культивируют в соответствующей среде и переносят синхронизированным реципиентам для получения трансгенных животных. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, затем развивающиеся в химерных животных.
Кроме того, согласно данному изобретению трансгенное животное, способное продуцировать гуманизированные иммуноглобулины, также можно получить введением в реципиентную клетку или клетки одного или более рекомбинантных векторов, описанных в данной заявке выше, которые несут сегмент гена 1д человека, связанный с 5'- и 3'-фланкирующими последовательностями, которые гомологичны фланкирующим последовательностям сегмента эндогенного гена 1д, отбором клеток, в которых сегмент эндогенного гена 1д заменен сегментом гена 1д человека в результате гомологичной рекомбинации, и получением животного из отобранной генетически модифицированной реципиентной клетки или клеток.
Подобно случаю с направленной инсерцией трансгенного вектора клетки, подходящие для применения реципиентных клеток в указанном способе, включают эмбриональные стволовые клетки или уже дифференцированные соматические клетки. Рекомбинантный вектор, несущий сегмент гена 1д человека, можно вводить в такие реципиентные клетки любыми подходящими способами, например трансфекцией. Затем клетки, в которых сегмент гена 1д человека заменил соответствующий сегмент эндогенного гена 1д в результате гомологичной рекомбинации, можно отобрать стандартными способами. Указанные генетически модифицированные клетки могут служить в качестве клеток-доноров ядер в процессе ядерного переноса при клонировании трансгенного животного. Альтернативно, отобранные генетически модифицированные эмбриональные стволовые клетки можно инъецировать в развивающиеся эмбрионы, которые затем могут развиться в химерных животных.
Трансгенные животные, получаемые любым из указанных выше способов, составляют другой вариант данного изобретения. Трансгенные животные имеют по меньшей мере один, т.е. один или более, гуманизированных локусов 1д в геноме, из которых продуцируется функциональный спектр гуманизированных антител.
В предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным кроликам, имеющим один или более гуманизированных локусов 1д в геноме. Трансгенные кролики согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов 1д и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител.
В другом предпочтительном варианте данное изобретение относится к трансгенным курицам, имеющим один или более гуманизированных локусов 1д в геноме. Трансгенные курицы согласно данному изобретению способны к реаранжировке и конверсии генов гуманизированных локусов 1д и экспрессии функционального спектра гуманизированных антител.
Клетки, полученные из трансгенных животных согласно данному изобретению, такие как В-клетки или линии клеток, полученные из трансгенного животного, иммунизированного против антигена, также являются частью данного изобретения.
В следующем аспекте данное изобретение относится к способам лечения заболевания примата, в частности, человека, посредством введения композиции очищенного гуманизированного антитела, предпочтительно композиции гуманизированных поликлональных антител, необходимой для лечения указанного заболевания.
Композиции гуманизированных поликлональных антител, используемые для введения, в общем,
- 12 007958 характеризуются тем, что они содержат популяцию поликлональных антител, имеющую концентрации иммуноглобулинов от 0,1 до 100 мг/мл, более обычно от 1 до 10 мг/мл. Композиция антител может содержать иммуноглобулины разных изотипов. Альтернативно композиция антител может содержать антитела только одного изотипа или ряда выбранных изотипов.
В большинстве случаев композиция антител состоит из немодифицированных иммуноглобулинов, т.е. гуманизированных антител, полученных от животного без дополнительной модификации, например, химическими веществами или ферментами. Альтернативно фракцию иммуноглобулинов можно подвергнуть такой обработке, как ферментативное расщепление (например, пепсином, папаином, плазмином, гликозидазами, нуклеазами, и.т.д.), нагревание, и т.д., и/или далее фракционировать.
Композиции антител, как правило, вводят в сосудистую систему, для удобства внутривенно путем инъекции или инфузии через катетер, имплантированный в соответствующую вену. Композицию антител вводят с соответствующей скоростью, как правило, в пределах примерно от 10 мин до 24 ч, более обычно примерно от 30 мин до 6 ч, в соответствии со скоростью, при которой пациент может воспринимать жидкость. Введение эффективной дозы можно осуществлять путем однократной инфузии или серии инфузий. Многократные инфузии можно вводить раз в день, раз в неделю, раз в месяц или раз каждые три месяца, в зависимости от периода полужизни препарата антител и клинических показаний. В случае применений на эпителиальных поверхностях композиции антител наносят на поверхность, которую необходимо обработать, в количестве, достаточном для обеспечения планируемого конечного результата, и при необходимости нанесение можно повторять.
Композиции антител можно использовать для связывания и нейтрализации антигенных единиц в тканях организма человека, которые вызывают заболевание или которые вызывают нежелательные или аномальные иммунные ответы. «Антигенная единица» в данном описании является определением, которое охватывает любые растворимые или связанные с клеточной поверхностью молекулы, включая белки, а также клетки или организмы, вызывающие инфекционные заболевания, или агенты, которые, по меньшей мере, способны связывать антитело и предпочтительно также способны стимулировать иммунный ответ.
Введение композиции антител против инфекционного агента в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией приводит к удалению инфекционных частиц. Однократное введение антител снижает количество инфекционных частиц, как правило, от 10 до 100 раз, более обычно более чем в 1000 раз. Подобным образом, терапия антителами у пациентов со злокачественным заболеванием, используемая в виде монотерапии или в комбинации с химиотерапией, снижает количество злокачественных клеток, как правило, от 10 до 100 раз или более, чем в 1000 раз. Терапию можно повторять в течение длительного периода времени, чтобы обеспечить полное удаление инфекционных частиц, злокачественных клеток и т.д. В некоторых случаях терапия препаратами антител будет продолжаться в течение длительных периодов времени в отсутствие регистрируемых количеств инфекционных частиц или нежелательных клеток. Подобным образом, применение терапии антителами для модулирования иммунных ответов может заключаться в однократном или многократном введениях терапевтических антител. Терапия может продолжаться в течение длительных периодов в отсутствие каких-либо симптомов заболевания.
Лечение субъекта можно применять вместе с химиотерапией в дозах, достаточных для ингибирования инфекционного заболевания или злокачественных новообразований. Для пациентов с аутоиммунным заболеванием или реципиентов трансплантатов терапию антителами можно применять вместе с иммуносупрессирующей терапией в дозах, достаточных для подавления иммунных реакций.
Далее изобретение иллюстрируется следующими примерами, но не ограничено ими.
Пример 1. Новые последовательности З'-конца гена Су коров, овец и кроликов
Геномную ДНК выделяли из крови симментальской коровы с использованием набора для выделения ДНК из крови ΟΙΛαιηρ (ΟΙΑΟΕΝ). Геномный З'-участок гена Су коровы (т.е. З'-фланкирующую последовательность гена Су коровы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры:
5'-праймер: 5'сдсаадсйССТАСАСОТОТОТООТОАТОЗ' (8ЕО ΙΌ N0:1);
З'-праймер: 5'сдсаадсйАА6АТ66^6АТ66Т86ТССАЗ' (8ЕО ΙΌ N0: 2) (универсальный вырожденный код: ^=(А/Т), 8=(О/С)).
Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами, взята из экзона З Су, и часть, указанная строчными буквами, представляет концевой сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ. Часть З'-праймера, указанная заглавными буквами, представляла собой вырожденную последовательность, сконструированную в соответствии с опубликованными последовательностями экзона М1 человека и экзона М1 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ΗίηάΙΙΙ. ПЦР-фрагмент длиной 1,З т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы ЕXΡΑN^ (Воске). Фрагмент очищали в геле, расщепляли ΗίηάΙΙΙ и клонировали в клонирующем векторе В1ие5спр1. Полученные в результате клоны разделялись на три популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, получаемых с помощью ВашШ, ЕсоШ и ХкоГ Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 1 (8ЕО ΙΌ N0: З-5).
- 1З 007958
Геномную ДНК выделяли из крови мериносовых овец, используя набор для выделения ДНК из крови ΟΙΛαιηρ ^ΙΛΟΕ^. Геномный 3'-участок гена Су овцы (т.е. 3'-фланкирующую последовательность гена Су овцы) амплифицировали ПЦР, используя в качестве матрицы выделенную геномную ДНК и следующие праймеры:
5'-праймер: 5'сдсдда1ссССТАС6С6Т6Т6Т66Т6АТ63' (8 ЕС) ГО N0: 6) 3'-праймер:
5'сдсдда1ссЛсСбЛ66Л6ЛЛ6ЛТССЛСТТ3' (8ЕЦ ΙΌ N0: 7) Часть 5'-праймера, указанная заглавными буквами, взята из экзона 3 Су, и часть, указанная строчными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ВатНЕ Часть 3'-праймера, указанную заглавными буквами, конструировали в соответствии с опубликованными последовательностями экзона М2 человека и экзона М2 мыши, а часть, указанная прописными буквами, представляла собой концевой сайт рестрикции ВатНЕ ПЦР-фрагмент длиной 2,9 т.п.н. получали, используя ПЦР-систему на основе длинной матрицы ЕХРАМЭ (Косйе). Фрагмент очищали в геле, расщепляли ВатН и клонировали в клонирующем векторе В1иекспр1. Полученные в результате клоны разделялись на две популяции, которые отличаются друг от друга картиной фрагментов рестрикции, полученных с помощью ΗίηάΙΙΙ, ЕсоШ и ΧΙιοΙ. Один клон из каждой популяции секвенировали, и последовательности показаны на фиг. 2 (8ЕЦ ГО N0: 8-9).
ЕсоКб-фрагмент длиной 10 т.п.н., содержащий ген Су и его фланкирующие последовательности кролика аллотипа А2, субклонировали из геномного космидного клона (сок 8.3 от Кшдй! е) а1., 1. бттипок (1985) 1245-50, «0гдап1/а11оп апб ро1утогрЫкт о£ гаЬЬй 1ттипод1оЬи1т Неауу скат депек»). Нуклеотидные 5'- и 3'-последовательности Су определяли, используя стандартные способы, последовательности указаны на фиг. 3 и 5, 8ЕЦ ГО N0: 10, 12, 13, соответственно.
3'-Последовательности С-каппа 1 кролика определяли из ЕсоКб/ВатНКсубклона Убк2Ск в р8У2пео. Нуклеотидная последовательность представлена на фиг. 4, 8ЕЦ ΙΌ N0: 11.
Аминокислотные последовательности, кодируемые экзонами М1 и М2 коровы, овцы и кролика рассчитывали на основе указанной выше 3'-фланкирующей последовательности. Указанные аминокислотные последовательности сопоставляли с опубликованными последовательностями М1 и М2 верблюда, человека и мыши, как показано на фиг. 6.
Пример 2. Вектор для замены участка эндогенного гена Су кролика сегментом Су1 человека
Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по а2 кролика. Последовательность ДНК, расположенную выше Су кролика (т.е. 5'-фланкирующую последовательность Су кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры:
5' 1ааба!дсддссдсСТТСА6С6Т6ААССАС6СССТС 3' (8ЕС) ГО N0: 39) с 5'-ЫоЧ-сайтом и
5' 6ТС6АС6ССССТС6АТ6САСТСССА6А6 3' (8ЕС) ГО N0: 40).
Последовательность ДНК, расположенную ниже Су кролика (т.е. 3'-фланкирующую последовательность Су кролика) амплифицируют со следующими праймерами:
5' дд1ассСТСТСССТСССССАС6СС6СА6С 3' (8ЕС) ГО N0: 41) с 5'-Крп1-сайтом и
5' а1а1с1садаЛСТСССТСТСССТССТСТАСТАСАССС 3' (8ЕС) ГО N0: 42) с 5'-ХМ-сайтом.
Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий Су1 человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров:
5' 6ТС6ЛСЛСТ66ЛС6СТ6ЛЛССТС6С66 3' (8ЕС) ГО N0: 43) и
5' 66ТАСС66666СТТ6СС66СС6ТС6САС 3' (8ЕС) ГО N0: 44).
Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе В1иекспр1. Затем кассету 1ох пео встраивают в сайт 8аП, а кассету Нку-1к - в сайт Х1юЕ Схематичный чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7а.
Пример 3. Вектор для замены сегмента эндогенного гена Ск кролика сегментом Ск человека
Геномную ДНК выделяют из кроличьих зародышевых фибробластов гомозиготного по Ь5 кролика. Последовательность ДНК выше Ск1 (т.е. 5'-фланкирующую последовательность Ск1 кролика) амплифицируют ПЦР, используя следующие праймеры:
5' дсддссдсТ66С6Л66Л6ЛССЛЛ6СТ66Л6ЛТСЛЛЛС6 3' (8ЕС) ГО N0: 45) с 5'-Ыо1б-сайтом
5' 6ТС6ЛС6СЛ6СССЛЛЛ6СТ6ТТ6СЛЛТ6666СЛ6С6 3' (8ЕС) ГО N0: 46).
Последовательность ДНК ниже Ск1 кролика (т.е. 5'-фланкирующую последовательность Ск1 кролика) амплифицируют со следующими праймерами:
5' аΐаΐддΐасс6С6Л6ЛС6ССТ6ССЛ666СЛСС6СС 3' (8ЕС) ГО N0: 47) с 5' -Крпб-сайтом
5' 66ЛТССС6Л6СТТТЛТ666СЛ666Т66666 3' (8ЕС) ГО N0: 48).
Геномную ДНК человека выделяют из лимфоцитов периферической крови человека. Фрагмент ДНК, кодирующий Ск человека, амплифицируют с использованием следующих праймеров:
5' ЛТЛТ6ТС6ЛССТ666ЛТЛЛ6СЛТ6СТ6ТТТТСТ6ТСТ6ТССС 3' (8ЕС) ГО N0: 49)
5' СТЛ66ТЛССЛ6СЛ66Т66666СЛСТТСТССС 3' (8ЕС) ГО N0: 50).
Фрагменты расщепляют ферментами рестрикции и клонируют в векторе В1иекспр1. Затем кассету 1ох пео встраивают в сайт 8аП, а кассету Нку-1к - в сайт Х1юЕ Схематический чертеж конечной конструкции показан на фиг. 7Ь.
- 14 007958
Пример 4. Замена сегментов эндогенных генов Су и Ск в фибробластах зародыша кролика соответствующими сегментами гена человека
Клетки, фибробласты зародыша кролика, получают стандартными способами. После одного пассажа фибробласты трансфицируют 5 мкг линеаризованного с помощью N011 вектора, направленного к мишени, как показано на фиг. 5а для Су или на фиг. 5Ь для Ск, и высевают в 96-луночные планшеты (2х103 клеток/лунку). После позитивной селекции с использованием 600 мкг/мл 0418 и негативной селекции с использованием 200 нМ МАИ, реплики устойчивых колоний переносят на два 96-луночных планшета для анализа ДНК и криоконсервирования, соответственно. Проводят ПЦР и/или Саузерн-блот-анализ, чтобы идентифицировать клетки с сегментом гена Су1 человека, интегрированным в геном. Клетки, имеющие интегрированный ген Су1 человека, используют для клонирования кроликов, как описано в примере 5.
Пример 5. Клонирование кроликов
Взрослых кроликов ЭШсЕ Ве11оп подвергают суперовуляции посредством подкожной инъекции фолликулостимулирующего гормона (Ε8Η) каждые 12 ч (0,3 мг х 2 и 0,4 мг х 4). Овуляцию индуцируют внутривенным введением 0,5 мг лютеинизирующего гормона (ЬН) через 12 ч после последней инъекции Е8Н. Ооциты извлекают промывкой яйцеводов через 17 ч после инъекции ЬН. Из ооцитов механически удаляют ядра через 16-19 ч после созревания. Удаление хромосом оценивают с использованием красителя бисбензимида (Н0ЕСН8Т 33342, 8щта, 81. Ьош8, МО) в ультрафиолетовом свете. Ооциты, из которых удалены ядра, сливают с активно делящимися фибробластами, используя один электрический импульс 180 В/см в течение 15 мкс (Е1сс1госс11 Машри1а1ог 200, Оепейошск, 8ап Ωίοβο, СА). Через 3-5 ч ооциты химически активируют кальциевым ионофором (6 мкМ) в течение 4 мин (№ 407952, Са1Ьюсйет, 8ап П1едо, СА) и 2 мМ 6-диметиламинопурином (ΌΜΑΡ, 81дта) в среде СВ2 (специализированная среда, Ьауа1ей, N1) с 3 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (не содержащего жирных кислот, 8щта) в течение 3 ч. После активации эмбрионы пять раз промывают в среде для культивирования эмбрионов хомячка (НЕСМ)-Нерек и затем культивируют в среде СВ2, содержащей 3 мг/мл БСА, не содержащего жирных кислот, в течение 2-48 ч при 37,8°С и 5% СО2 в воздухе. Затем эмбрионы переносят синхронизированным реципиентам. Потомство анализируют с помощью ПЦР в отношении сегмента трансгена.
Пример 6. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи кролика с сегментом гена Су1 человека и сегментом гена УН, кодирующим полипептидную последовательность УН-домена человека
Секвенировали верхние и нижние участки (т.е. 5'-фланкирующие и 3'-фланкирующие участки) гена Су тяжелой цепи кролика от кролика с аллотипом а2. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ΙΌ N0: 51) создают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5'^3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена Су кролика, ген Су1 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена Су кролика (фиг. 8).
Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа а2, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к Су кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи кролика. Ген Су кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном Су1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой, используя фрагмент ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 51 и систему рЕТ. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена Су кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена Су1 человека.
Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены тяжелой цепи кролика и встроенный ген Су1 человека далее модифицируют заменой 3'-проксимального сегмента \Н1 синтетическим сегментом гена \Н (фиг. 9). Указанный синтетический сегмент гена \Н (8ЕЦ ΙΌ N0: 52) получают, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды, и участок включает в себя 5'-фланкирующую последовательность, 3'фланкирующую последовательность и последовательность, кодирующую полипептид, почти идентичный полипептидной последовательности вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Ниапд апб 8ю11аг (1. 1ттипо1. 151: 5290-5300, 1993). Кодирующую последовательность синтетического сегмента гена \Н конструируют на основе опубликованной последовательности гена \ΉΙ кролика (а2, Κηί^Ηΐ апб Вескег, Се11 60: 963-970, 1990), и последовательность идентична сегментам гена \Н кролика более чем на 80%. 5'- и 3'-Фланкирующие последовательности в синтетическом сегменте \Н получают из выше- и нижерасположенных участков гена \Н1 кролика аллотипа а2. Синтетический ген \Н 8Е0 ΙΌ N0: 52 используют для замены гена АН1 кролика в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ или гебеву. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные методики.
Пример 7. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса легкой цепи кролика с сегментом гена Ск человека и сегментом гена VI, кодирующим полипептидную последовательность домена человека
Секвенировали выше и нижерасположенные участки (т.е. 5'-фланкирующие и 3'-фланкирующие участки) гена Ск1 легкой цепи кролика от кролика с аллотипом Ь5. Фрагмент ДНК (8ЕЦ ΙΌ N0: 53) соз
- 15 007958 дают посредством ПЦР с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5'^3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена Ск1 кролика, ген Ск1 человека и последовательность, полученную из З'-фланкирующего участка гена Ск1 кролика (фиг. 10) .
Геномную ВАС-библиотеку, полученную из кролика аллотипа Ь5, создают стандартными способами и проводят скрининг с использованием зондов, специфичных по отношению к Ск1 кролика. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена легкой цепи кролика. Ген Ск1 кролика в указанном ВАС-клоне заменяют геном Ск1 человека в фрагменте ДНК 8ЕЦ ΙΌ N0: 53 посредством гомологичной рекомбинации в Е. со11 с использованием системы рЕТ или Γβάεβγ. Указанную замену осуществляют в две последовательные стадии рекомбинации: сначала сегмент гена Ск1 кролика заменяют маркерным геном; затем маркерный ген заменяют сегментом гена Ск1 человека.
Модифицированный ВАС-клон, содержащий гены легкой цепи кролика и встроенный ген Ск1 человека, далее модифицируют встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК VI в 1-область локуса легкой цепи кролика. Реаранжированный фрагмент ДНК VI кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный РгЩсН е! а1. (В1ооб 82 (10): 3103-3112, 1993) и ЕаиШег-Кгекке е! а1. (Еиг. 1 1ттипо1. 22 (4), 1023-1029, 1992)) (фиг. 7). Нуклеотидную последовательность реаранжированного участка VI конструируют, чтобы максимально увеличить гомологию последовательностей на уровне нуклеотидов с последовательностью V-каппа кролика, опубликованной ЫеЬегтап е! а1. (1. 1ттипо1. 133 (5), 2753-2756, 1984). Указанная реаранжированная последовательность ДНК VI более чем на 80% идентична известным генам кролика. Используя перекрывающиеся олигонуклеотиды в ПЦР, реаранжированный фрагмент ДНК VI связывают с 5'- и 3'-фланкирующей последовательностью, получая фрагмент ДНК 8ЕЦ ΙΌ N0: 54 (фиг. 11). 5'-Фланкирующую последовательность получают из 5'-конца V кролика, 3'-фланкирующую последовательность получают из 3'-конца 12 кролика. Затем фрагмент ДНК ЗЕЦ ΙΌ N0: 54 встраивают в локус легкой цепи кролика посредством гомологичной рекомбинации в Е. со11, используя систему рЕТ или κάεβγ. Встраивание осуществляют таким образом, что область легкой цепи кролика, содержащую сегмент гена Υκ1 кролика, участки Л и 12 кролика и последовательности между ними заменяют реаранжированным фрагментом ДНК VI. И в этом случае указанное встраивание осуществляют заменой участка V-! кролика маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК VI. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные методики.
Пример 8. Трансгенные кролики, экспрессирующие трансген легкой и/или тяжелой цепи гуманизированного иммуноглобулина
Трансгенных кроликов получают, как описано Еап е! а1. (Ра11ю1. Ιηΐ. 49: 583-594, 1999). Коротко, самок кроликов подвергают суперовуляции, используя стандартные способы, и спаривают с самцами кроликов. Зиготы в стадии пронуклеуса собирают из яйцевода и помещают в соответствующую среду, такую как фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки. Экзогенную ДНК (например, гуманизированный ВАС-клон, описанный в примере 4 и/или 5, который был линеаризован перед инъекцией) микроинъецируют в мужской пронуклеус с помощью пары манипуляторов. Выжившие, судя по морфологическим признакам, зиготы переносят в яйцеводы псевдобеременных кроликов. Псевдобеременность индуцируют инъекцией хорионического гонадотропина человека (11СС). Примерно 0,1-1% инъецированных зигот развиваются в живых трансгенных кроликах. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом с использованием зонда, специфичного для трансгена.
кДНК получают с использованием РНК, выделенной из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенного кролика. Используют праймеры, специфичные по отношению к трансгену человека (участку гена СН человека или синтетическому участку гуманизированного гена УН), для получения на основе кДНК амплифицированных продуктов. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том, что трансген реаранжируется в трансгенном животном, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорных последовательностей вышерасположенных генов V свидетельствует о том, что трансген, введенный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов.
Наличие антител, содержащих 1дС человека и/или антигенные детерминанты легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных кроликов-родоначальников определяют с использованием анализа ЕЫ8А.
Пример 9. Получение гуманизированных антител из трансгенных кроликов, имеющих генетический фон линии кроликов А11с1а и/или ВаШеа
У кроликов линии А1ю1а отсутствует сегмент гена УН1, и поэтому у них нарушена экспрессия тяжелой цепи 1д. Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы тяжелой цепи на генетическом фоне линии кроликов А11с1а, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов АНаа в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов А1ю1а, которых скрещивали с самцами кроликов АНаа в приведенном
- 16 007958 выше примере 8. Также получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу Ι§ А11С1а, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену тяжелой цепи. Сыворотку проверяют в ЕЫ8А на наличие гуманизированной тяжелой цепи (например, константной области тяжелой цепи человека). Концентрация антител с гуманизированными тяжелыми цепями Ιβ у указанных гомозиготных животных А11С1а значительно выше, например примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация, которая продуцируется с трансгена, интегрированного в геном кроликов дикого типа (не относящихся к А11С1а).
Линия Вакйеа не экспрессирует легкую цепь к1, а вместо этого экспрессирует исключительно легкие цепи к2 и λ. Получают трансгенных кроликов-родоначальников, способных экспрессировать гуманизированные молекулы легкой цепи на генетическом фоне линии кроликов Вакйеа, например, используя эмбриональные фибробласты, полученные от кроликов Вакйеа в указанных выше примерах 4-5, или, используя зиготы от самок кроликов Вакйеа, которых скрещивали с самцами кроликов Вакйеа в приведенном выше примере 8. Получают трансгенных животных, которые являются гомозиготными по фенотипу легкой цепи Вакйеа, а также гомозиготными по гуманизированному трансгену легкой цепи. Сыворотку проверяют в ЕЫ8А на наличие гуманизированной легкой цепи. Концентрация гуманизированной легкой цепи у гомозиготных животных Вакйеа значительно выше, примерно в 10-100 раз выше, чем концентрация гуманизированной легкой цепи у трансгенного кролика с генетическим фоном дикого типа (не относящегося к Вакйеа). Трансгенных кроликов-родоначальников скрещивают друг с другом, чтобы получить трансгенных кроликов со следующими особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи, (3) гомозиготных по локусу тяжелой цепи А11С1а и (4) гомозиготных по локусу легкой цепи Вакйеа.
Пример 10. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего модифицированный локус легкой цепи курицы, имеющий сегмент гена С-лямбда-2 человека и сегмент гена VI, кодирующий домен МЬ человека
Проводили скрининг геномной ВАС-библиотеки, полученной от кустарниковой дикой курицы, с помощью радиоактивно меченых зондов, специфичных по отношению к С-лямбда легкой цепи курицы и курицы (сегмент гена V на самом 5'-конце локуса легкой цепи). Идентифицировали ВАС-клон, содержащий полный локус легкой цепи лямбда. Ген СХ курицы в данном ВАС-клоне заменяют геном СХ2 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. сой, используя систему рЕТ (Ζΐιηΐ'ΐβ е1 а1., №11. Вю1есйпо1. 18 (12): 1314-7, 2000), следующим образом.
Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Тп5. 5'-Праймер (5' са1асасадсса1аса1асдсд1д1ддссдс1с1дсс1с1с1сидсаддТАТССАСАССААСС 6ААСС0 3', 8ЕО ΙΌ N0: 55) конструировали так, чтобы он включал в себя 50 п.н. на 5'-конце (строчные буквы), полученных из 5'фланкирующего участка гена С λ легкой цепи курицы. 3'-Праймер (5' а1саддд1дасссс1асдйасас1сс1д1сассааддад1дддадддас ТСА6АА6ААСТС6ТСАА6АА6 3', 8ЕО ΙΌ N0: 56) конструировали так, чтобы он включал примерно 50 п.н. на конце (строчные буквы), полученных из 3'-фланкирующего участка гена СХ легкой цепи курицы.
Второй фрагмент ДНК (8ЕО ΙΌ N0: 57) синтезировали с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, при этом фрагмент ДНК содержит в направлении 5№3' последовательность, полученную из 5'-фланкирующего участка гена С-лямбда легкой цепи курицы, гена С-лямбда-2 человека и последовательность, полученную из 3'-фланкирующего участка гена С-лямбда курицы (фиг. 12).
Клетки Е. сой ВАС-клона легкой цепи курицы трансформировали рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции гесЕ и гесТ под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, трансформировали первым фрагментом ДНК, описанным выше, и затем проводили селекцию в среде, содержащей канамицин. Идентифицировали клоны, устойчивые к канамицину и замену участка СХ курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждали расщеплением ферментом рестрикции.
На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, трансформировали вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводили скрининг трансформированных клеток по признаку отсутствия устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном СХ2 человека. Обмен подтверждали расщеплением ферментами рестрикции и/или секвенированием.
Методика ЕТ-клонирования суммирована на фиг. 13.
ВАС-клон, содержащий локус легкой цепи курицы и встроенный сегмент гена С-лямбда-2 человека дополнительно модифицировали встраиванием реаранжированного фрагмента ДНК VI.
Реаранжированный фрагмент ДНК VI кодирует полипептид вариабельного домена иммуноглобулина человека, описанный Кате1аш е1 а1. (Л. Вюсйет. 93 (2), 421-429, 1983) как №0-64 V-I-обласτи цепи лямбда Ιβ (Р01702) (фиг. 14). Нуклеотидная последовательность реаранжированного фрагмента VI конструировали так, чтобы достичь максимальной гомологии последовательностей на уровне нуклеотидов с последовательностью V-ламбда-2 курицы, опубликованной МсСогтаск е1 а1. (Се11 56, 785-791, 1989).
- 17 007958
Полученная реаранжированная последовательность ДНК VI более чем на 80% идентична известным генам V легкой цепи курицы. Реаранжированный фрагмент ДНК VI связывали с 5'-фланкирующей последовательностью и З'-фланкирующей последовательностью, получая в результате фрагмент ДНК 8ЕО ΙΌ N0: 58 (фиг. 14). 5'-Фланкирующую последовательность получали из 5'-конца ν-лямбда-! курицы и 3'фланкирующую последовательность получали из З'-конца 1 курицы. Фрагмент ДНК 8Е0 ΙΌ N0: 58 затем встраивали в локус легкой цепи курицы в Е. со11, используя систему рЕТ, как показано на фиг. 15. Встраивание осуществляли таким образом, чтобы участок локуса легкой цепи курицы от 5'-конца сегмента гена ν-лямбда-! курицы до З'-конца области 1 курицы заменить реаранжированным синтетическим фрагментом ДНК VI. И в этом случае указанное встраивание осуществляли заменой ν-1-области курицы маркерным геном с последующей заменой маркерного гена реаранжированным фрагментом ДНК VI. Модифицированная область локуса легкой цепи курицы показана на фиг. 15. Модифицированный ВАС-клон амплифицировали и очищали, используя стандартные способы.
Пример 11. Конструирование фрагмента ДНК, содержащего часть локуса тяжелой цепи курицы с сегментом гена Су1 человека и сегментом гена УН, кодирующим полипептидную последовательность домена УН человека
Геномную ВАС-библиотеку кустарниковой дикой курицы получали стандартными способами и подвергали скринингу с помощью зондов, специфичных по отношению к Су курицы. Идентифицируют ВАС-клон, содержащий сегменты гена тяжелой цепи курицы. Секвенируют выше- и нижерасположенные участки (т.е. 5'- и З'-фланкирующие участки) гена Су тяжелой цепи. Ген Су курицы в данном ВАСклоне заменяют геном Су1 человека посредством гомологичной рекомбинации в Е. со11, используя систему рЕТ, следующим образом.
Создают первый фрагмент ДНК, содержащий кассету для селекции канамицином, посредством ПЦР с использованием праймеров, специфичных по отношению к гену Тп5. 5'- и З'-Праймеры конструируют так, чтобы они включали около 50 п.н. на конце, полученных из 5'- и З'-фланкирующих участков гена Су тяжелой цепи курицы.
Второй фрагмент ДНК создают посредством ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды, при этом указанный второй фрагмент ДНК содержит в направлении 5№З' последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из 5'-фланкирующего участка гена Су курицы, ген Су1 человека и последовательность длиной примерно 50 п.н., полученную из З'-фланкирующего участка гена Су курицы.
Клетки Е. со11 ВАС-клона Су курицы трансформируют рекомбинантной плазмидой, экспрессирующей функции гесЕ и гесТ под контролем индуцируемого промотора. Затем клетки, трансформированные рекомбинантной плазмидой, далее трансформируют первым фрагментом ДНК и проводят селекцию в среде, содержащей канамицин. Идентифицируют клоны, устойчивые к канамицину, и замену сегмента СУ курицы кассетой для селекции канамицином посредством гомологичной рекомбинации подтверждают расщеплением ферментом рестрикции.
На второй стадии гомологичной рекомбинации клетки, позитивные в отношении кассеты для селекции канамицином, теперь трансформируют вторым фрагментом ДНК, описанным выше. Проводят скрининг трансформированных клеток по признаку потери устойчивости к канамицину в качестве показателя замены кассеты для селекции канамицином геном Су1 человека. Обмен подтверждают расщеплением ферментом рестрикции и/или секвенированием.
ВАС-клон, содержащий встроенный ген Су1 человека, далее модифицируют заменой З'проксимального сегмента УН1 (т.е. З'-проксимального гена УШ в V-области) синтетическим сегментом гена 7^ Указанный синтетический сегмент гена ΥΉ конструируют на основе опубликованной последовательности гена \Ή1 курицы (Агака^а е1 а1., ЕМВ0 1. 15 (10): 2540-2546, 1996). Синтетический сегмент гена более чем на 80% идентичен сегментам гена МН курицы и кодирует аминокислотную последовательность, которая идентична аминокислотной последовательности полипептида вариабельного домена тяжелой цепи иммуноглобулина человека, описанной Маййуззепз апй ВаЬЬйзз (в 81е1пЬегд СМ апй Ье1коуЙ8 I, (ейз). ТНе 1ттипе 8уз1еш: 1З2-1З8, 8. Кагдег, ΝΥ 1981). Указанный синтетический сегмент 7^ содержащий 5'- и З'-фланкирующие последовательности, синтезируют ПЦР, используя перекрывающиеся олигонуклеотиды. 5'- и З'-Фланкирующие последовательности получают из выше- и нижерасположенных участков гена VΉ1 курицы. Полученный синтетический сегмент ΫΉ используют для замены гена VН1 курицы в ВАС-клоне посредством гомологичной рекомбинации с использованием системы рЕТ. Модифицированный ВАС-клон амплифицируют и очищают, используя стандартные способы.
Пример 12. Трансгенная курица, экспрессирующая трансгены гуманизированной легкой и/или тяжелой цепи иммуноглобулина
Трансгенную курицу получают, используя способы, которые описаны Е(сНе8 е1 а1., Ме!йойз ίη Мо1еси1аг Вю1оду 62: 4ЗЗ-450; Раш е( а1., Се11з Т1ззиез Огдапз 1999; 165 (З-4): 212-9; 8апд, Ή., «Тгапздешс сИскепз-шеЛойз апй ро!еп(1а1 аррйсайопз», Тгепйз Вю(ес1шо1. 12: 415 (1994); и в \У0 200075З00, «1п(гойисшд а пис1ею асД 1п1о ап ау1ап депоше, изеГи1 Гог 1гапзГес11пд ау1ап Ь1а8(ойегша1 се11з Гог ргойисшд йапздешс ау1ап ашша1з \νί(1ι (Не йемгей депез, Ьу йиесйу шйойисшд (Не пис1ею асД ш(о (Не дегшша1 Й1зс оГ Ле едд».
- 18 007958
Вкратце, модифицированные ВАС-клоны переводят в линейную форму и смешивают с реагентом для трансфекции, чтобы стимулировать захват ДНК клетками. Инъецируют композиции в эмбрион курицы в многоклеточной стадии в непосредственной близости к зародышевому диску. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. После вылупления химерных куриц идентифицируют с помощью ПЦР и Саузерн-блот-анализа с использованием специфичных для трансгена последовательностей. Интеграцию трансгена в геном подтверждают Саузерн-блот-анализом, используя специфичный для трансгена зонд. Животных, трансгенных по тяжелой и легкой цепям, скрещивают друг с другом, получая трансгенных куриц, экспрессирующих антитела, имеющие гуманизированные тяжелые и легкий цепи.
кДНК получают, используя РНК, выделенную из В-клеток (крови, селезенки и/или лимфатических узлов) трансгенных куриц. Используют праймеры, специфичные для трансгена (например, для сегментов гена СН человека и/или синтетических участков гуманизированного гена УН), чтобы получить амплифицированные продукты кДНК. Исследование амплифицированных продуктов свидетельствует о том, что трансген реаранжирован у трансгенного животного, и реаранжированный трансген транскрибируется у животного. Амплифицированные продукты секвенируют, и наличие донорских последовательностей из вышерасположенных областей генов У свидетельствует о том, что трансген, введенный в зародышевую линию животного, подвергается конверсии генов.
Наличие антител, содержащих антигенные детерминанты ЦС человека и/или легкой цепи каппа человека, в сыворотке трансгенных куриц определяют с использованием анализа ЕЫ8Л.
Пример 13. Получение функциональных гуманизированных антител у трансгенной курицы с агаммаглобулинемическим фенотипом
Получают трансгенных куриц со следующими характерными особенностями: (1) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной легкой цепи, (2) имеющих по меньшей мере один трансген гуманизированной тяжелой цепи и (3) гомозиготных по фенотипу агаммаглобулинемии. Указанные животные продуцируют антитела в кровь и яйца, и антитела можно очистить из любого источника. Как правило, концентрации антител в яйцах составляют примерно от 5 до 50% от концентрации антител в крови. Животных, которые содержат высокие уровни гуманизированных антител в яйцах, можно отобрать и скрестить для получения потомства. Альтернативно можно получить трансгенных животных, которые специфично секретируют гуманизированные антитела в яйца.
Пример 14. Создание трансгенных куриц, экспрессирующих гуманизированный иммуноглобулин
Эмбриональные стволовые клетки куриц выделяют и культивируют, как описано Рат е1 а1. (Эеге1ортеп! 122, 2339-2348; 1996). Эмбрионы куриц получают из яиц сразу же после их откладки. Полностью извлекают бластодерм с помощью осторожного отсасывания, эмбрионы подвергают медленной механической диссоциации и клетки высевают в полную среду Е8А на инактивированные питающие клетки 8Т0. Среда Е8А состоит из среды МЕМ, содержащей 10% ЕС8, 2% сыворотки курицы, 1% бычьего сывороточного альбумина, 10 нг/мл овальбумина, 1 мМ пируват натрия, 1% заменимых аминокислот, 1 мкМ каждого из нуклеотидов аденозина, гуанозина, цитидина, уридина, тимидина, 0,16 мМ (3меркаптоэтанола, полную среду Е8А дополняют 10 нг/мл БЕСЕ, 20 нг/мл й-ЮЕ-1, 1% об./об. 8СЕ птиц и 1% об./об. й-ЫЕ, 1% об./об. Ь-ГЬ-11. Культуры клеток инкубируют при 37°С в 7,5 СО2 и при 90% влажности. Через 48 ч к культуре добавляют свежие бластодермальные клетки в половине исходного объема полной среды Е8А. После дополнительной инкубации в течение трех дней культуральную среду частично (50%) заменяют свежей полной средой Е8А и после этого каждый день полностью. Для сбора клеток культуры промывают РВ8 и инкубируют в растворе проназы (0,025% мас./об.). Диссоциированные клетки трансфицируют различными линеаризованными трансгенными конструкциями, содержащими гуманизированный локус Ц. Трансфицированные клетки инкубируют с питающими клетками 8Т0 (как описано выше) в присутствии антибиотиков для селекции. Клетки переносят на свежие питающие клетки дважды в неделю. Выделяют устойчивые к антибиотикам клетки и с помощью ПЦР подтверждают интеграцию фрагментов гуманизированного гена Ц в случайный сайт или в соответствующие локусы генов иммуноглобулинов курицы.
Затем генетически модифицированные клетки инъецируют в реципиентные эмбрионы. В качестве реципиентных эмбрионов свежеотложенные яйца облучают (6 Гр - кобальтовый источник). От 100 до 200 генетически модифицированных клеток инъецируют в подзародышевую полость, используя микропипетку. Отверстие в яичной скорлупе закрывают и яйца инкубируют. Соматический химеризм вылупившихся куриц оценивают с помощью ПЦР. Химеризм зародышевой линии оценивают скрещиванием соматических химер.
Пример 15. Иммунизация трансгенных животных
Полученных генно-инженерным способом куриц иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (НВкАд) (5 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0,14 и 28 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8А (ИНИС, Эептагк) покрывают 1 мкг/мл НВкАд в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (НЕМ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в РВ8/1% КЕМ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают РВ8/0,05% твин 20 и связанный Ц выявляют, используя антитело козы про
- 19 007958 тив 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с ΗΒ§Α§. При разведении 1:250 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых ΗΒ§Λ§ лунках, составляет ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с ΗΒ§Λ§. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,З. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1§С курицы-ΗΚΡ. Это свидетельствует о том, что полученные генноинженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против ΗΒδΆ§.
Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно очищенным поверхностным антигеном гепатита В (ΗΒ§Λ§) (10 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 и 14 день. На 28 день у животных берут кровь из уха и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8Л (ΝυΝί.'. Эептагк) покрывают 1 мкг/мл ΗΒ§Λ§ в ΡΒ8 в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΓΜ) в ΡΒ8 (З00 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в ΡΒ8/1% ΝΓΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты З раза промывают ΡΒ8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена.
Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид орто-фенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1 М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированных кроликов. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с ΗΒ§Λ§. При разведении 1:100 оптическая плотность, измеренная в непокрытых и покрытых ΗΒ§Λ§ лунках, составляет ниже 0,4. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит частично человеческие антитела, реагирующие с ΗΒ§Λ§. При разведении сыворотки 1:100 измеренная оптическая плотность составляет 2,8. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,2 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1§С кролика-ΗΚΡ. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против ΗΒ§Λ§.
Пример 16. Опосредованная комплиментом цитотоксичность инфицированной вирусом линии клеток с использованием гуманизированных антител
Линию клеток карциномы печени человека, экспрессирующую ΗΒ§Λ§, метят 0,1 мкюри 51Сг в 100 мкл ΡΒδ в течение 1 ч при З7°С. Две тысячи клеток, меченых 51Сг, инкубируют с сывороткой полученных генно-инженерным способом кроликов или куриц, экспрессирующих гуманизированные иммуноглобулины против ЧЬ^Ад. Через 2 ч при З7° определяют высвобождение 51 Сг в надосадок, измеряя радиоактивность с использованием сцинтилляционного счетчика. Для определения максимального высвобождения добавляют 1% тритон Х100. Степень лизиса клеток рассчитывают следующим образом: % лизиса = имп/мин экспериментальное ± имп/мин спонтанное/имп/мин суммарное ± имп/мин спонтанное. Инкубация меченых клеток с сывороткой (разведенной 1:З0) неиммунизированных кроликов не приводит к лизису клеток (< 10%). Однако инкубация клеток с сывороткой иммунизированных кроликов вызывает 80% лизис. Инактивация комплемента в сыворотке тепловой обработкой (56°С в течение З0 мин) делает сыворотку иммунизированных кроликов неактивной. Полученные результаты свидетельствуют о том, что гуманизированные антитела, продуцируемые полученными генно-инженерным способом кроликами, связываются с ΗΒ8Ад-позитивными клетками и вызывают зависимый от комплемента лизис.
Пример 17. Иммунизация трансгенных животных против 8!арйу1ососси5 аигеик
Полученные генно-инженерным способом курицы иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина 8!арйу1ососси5 аигеик (100 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0,14 и 28 день. На З5 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8А (ΝυΝ^ Эепшагк) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в ΡΒδ в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ΝΡΜ) в ΡΒδ (З00 мкл/лунку). Сыворотку курицы разбавляют в ΡΒδ/1% ΝΕΜ и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты З раза промывают ΡΒδ/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид ортофенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированной курицы. Сыворотка неиммунизированных куриц не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизирован
- 20 007958 ных куриц содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1§С курицы-НКР. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом курицы после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина 81арй. аигеиз.
Полученных генно-инженерным способом кроликов иммунизируют внутримышечно рекомбинантным фрагментом белка коллагенового адгезина 81арйу1ососсиз аигеиз (100 мкг в неполном адъюванте Фрейнда) в 0 день и 14 день. На 35 день у животных берут кровь и получают сыворотку. Планшеты для ЕЫ8Л (^^, Эептагк) покрывают 2 мкг/мл белка коллагенового адгезина в РВ8 в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем доступные места связывания блокируют инкубацией с 1% обезжиренным сухим молоком (ЫЕМ) в РВ8 (300 мкл/лунку). Сыворотку кролика разбавляют в РВ8/1% №М и добавляют к покрытым лункам. После инкубации в течение 1 ч планшеты 3 раза промывают РВ8/0,05% твин 20 и связанный 1д выявляют, используя антитело козы против 1д человека, конъюгированное с пероксидазой хрена. Конъюгированное антитело козы регистрируют, используя дигидрохлорид ортофенилендиамина (81дта) в концентрации 1 мг/мл. Колориметрическую реакцию останавливают добавлением 1М раствора НС1 и оптическую плотность измеряют при 490 нм. В качестве контроля используют сыворотку неиммунизированного кролика. Сыворотка неиммунизированных кроликов не реагирует с белком коллагенового адгезина. При разведении 1:250 значение оптической плотности, измеренное в непокрытых и покрытых белком коллагенового адгезина лунках, ниже 0,2. Напротив, сыворотка иммунизированных кроликов содержит гуманизированные антитела, реагирующие с коллагеновым адгезином. При разведении сыворотки 1:250 измеренная оптическая плотность составляет 2,3. При дальнейшем разведении сыворотки измеряемая оптическая плотность снижается до 0,1 (при разведении в 25600 раз). Не выявляются антитела, реагирующие с конъюгатом антитело козы против 1§С кролика-НКР. Это свидетельствует о том, что полученные генно-инженерным способом кролики после иммунизации продуцируют гуманизированные антитела против коллагенового адгезина 81ар11. аигеиз.
Пример 18. Защита от инфекции 81ар11у1ососсиз аигеиз в мышиной модели
Нативных мышей пассивно иммунизируют в/б в -1 день 16 мг иммуноглобулиновой фракции, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина 8. аигеиз (из примера 17) или иммуноглобулиновой фракцией неиммунизированных животных. В 0 день мышам в/в вводят 4х107 КОЕ 8. аигеиз на мышь и регистрируют смертность в течение следующих 7 дней. Коэффициент смертности в контрольных группах составляет 80 и 10% в группе, обработанной иммуноглобулиновой фракцией, содержащей антитела, специфичные по отношению к белку коллагенового адгезина 8. аигеиз. Результаты свидетельствуют о том, что антитела против коллагенового адгезина могут защищать мышей от летального заражения 8. аигеиз.
Пример 19. Антиген-специфичные гибридомы, полученные от трансгенных животных
Трансгенных животных иммунизируют антигеном (например, КЬН, эритроцитами человека или эритроцитами овцы). Клетки селезенки извлекают в разных временных точках после иммунизации и сливают с линиями клеток миеломы, полученными от кролика и курицы, соответственно. После слияния клетки высевают в 96-луночные планшеты и надосадки тестируют по наличию гуманизированных антител. Чтобы показать, что антитела содержат последовательности иммуноглобулина человека, гибридомы красят флуоресцентно мечеными антителами, реагирующими с тяжелой и легкой цепью иммуноглобулинов человека. Проводят ограниченное разведение, чтобы очистить гибридомы до моноклональности.
Пример 20. Оценка иммуногенности
Собирают образцы сыворотки от пяти макак-крабоедов в 0 день. Затем вводят очищенный препарат частично человеческих поликлональных антител (5 мг/кг) пяти макакам-крабоедам путем внутривенного введения. Введение повторяют шесть раз с двухнедельными интервалами. За обезьянами ведут тщательное наблюдение в отношении побочных эффектов (например, анафилактический шок, отражающийся повышением температуры тела). Через семь месяцев из образцов крови собирают сыворотку. Аффинные смолы, содержащие очищенный 1§С человека или частично очищенный 1§С человека, получают стандартным способом, используя СНВг-активированную сефарозу. Образцы сыворотки обезьян (3 мл) добавляют к 1дС-аффинной смоле (4 мл), содержащей 10 мг человеческого или частично человеческого 1дС. Затем колонки промывают РВ8. Связанный иммуноглобулин обезьян элюируют с колонки 0,1М глицином/НС1, рН 2,5 и 2 раза диализуют против РВ8. Содержание белка в элюированных фракциях определяют с использованием анализа ВСА, используя в качестве стандарта 1дС человека. Суммарное количество белка в указанных фракциях свидетельствует о том, что терапия частично человеческим 1§С не приводит к значительному гуморальному ответу у обработанных животных.
Пример 21. Лечение животных с использованием гуманизированных антител
Гуманизированные поликлональные иммуноглобулины очищают из сыворотки полученных генноинженерным способом кроликов или из яичного желтка полученных генно-инженерным способом куриц осаждением сульфатом аммония и ионообменной хроматографией. Мышам 8СГО инъецируют один миллион клеток карциномы печени человека, экспрессирующих НВзАд. Затем внутрибрюшинно один раз в
- 21 007958 день инъецируют 25 мкг иммуноглобулина. Животные, обработанные антителами, выделенными из сыворотки неиммунизированного кролика, погибают примерно через 60 дней. Полученный результат сходен с результатом для необработанных реципиентов клеток карциномы печени. Напротив, мыши, обработанные антителами, выделенными из сыворотки иммунизированного кролика, живут более 150 дней. Это свидетельствует о том, что антитела человека, продуцируемые полученными генно-инженерным способом кроликами, способны удалять клетки карциномы человека из организма мышей 8СГО.
Список последовательностей <110> Νίτη уап ЗсЬооЬеп, ей а1.
<120> Получение гуманизированных антител в трансгенных животных <130> 14750 <140> ТО 01/24348 <141> 2001-08-03 <1б0> 58 <170> Патент, версия 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 1
X ♦“ X лЬ *> х « λ/ύΙ· л·· гтггй 1·/V ЭО у ч— к- ь-ν— к. ьу ь <210> 2 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 2 сасаадсЬДа адаЬддугдаЪ ддезд-Дсса 29 <210> 3 <211> 1714 <212> ДНК <213> корова <400> 3 ссЬасасдЬд ЪдЪддЬдаСд сасдааасЬЬ ЪасддааЬса сЬасааадад аадЬссассЬ 60 сдаддЬсЬсс дддСаааЬда дссЬсдсдсс дсСдаСсДад ЬддасдЬДсс сЬсаЕссасс 120 сассссДссс сссассссдд дсЬссаддСс садссадддс дсссЬадссс сДсссЬдЬдЬ 180 дсаЬЬссЪсс Ьдддссдссд ЬдааЬааадс асссаддссд сссЬдддасс сЪдсаасдсЬ 240 дЬдсЬддБЬс ЬЪЪссдаддс ададсссЬдд Ьддссдссад дссЬдсдддд дЬдддсЪдад 300 ссдасСсЬдд дссасСЬСдД СсадсаЬсДд БдддддадсС дассссасСс сдддссадас 360 асасадЬдад Ддддсссадс аддссассЬд ддддсЬдссс ааддссасад аддддсЬСдд 420 ссададдсас адсЬссасдд ЬссссЬссад ссассассдд сСдддссддс сДсЬддасад 480 даассдддда адсссссдад асссЬсаддд аДЬдаддссс ааДдсДЬссс дссЪссдсЬс 540 садсссасдс ЬдЬддддсад ддссасаСсс ГХдПссссад дссссЬдЪсс ТХдддЬдЬсс 600 ададЪссЪЪд ЬдЬссасЬсЕ дддссЬдссЬ ддадссасдс аСддссаддд ддЬддсссЬд 660 сСЬсасссЬс аддсЬсссаа ддЬсаддссЬ сдсссЬсссЬ сддссаддад дсСсХдсссд 720 дсГсЬсссЬд сссадддсса ддссСдСдсд сссаДдддда ддЬсаЬсссЬ дЬдссСдааа 780 ддддЬссадд ссдададссс ЬдааСдЬсса дддсадддас сСадсДдсЬс ссДдЪддаса 840 сддадсссад адссасадас аасаадсссс адссссдсас дсасасдада садсссдсас 900
- 22 007958 ссадссЬссЬ ссасасдсас ЬсаддЬдеас аЬдсдсасаС дадсасасЬС сассссдСса 960 сасссасаса ссеасасаса сЬсаддесйс дсасссдддд асссаСдддд сдассссасд 1020 ддсссадасс ададсЬдддС. сЬСдЬдадсс сЬсссСдЪдд асассадсЬд ддссссассс 1080 Ъссадсдссс аЬдддсЬдсГ. садсддсссЬ СХсссасасС. дассасасСд ассаддСсад 1140 асаРссдсьс сСЬдссСссс сьдддасасс сасдссссСс ссЪадсаддс едадаЬсссс 1200 ссЬсадсссс СсдСссСддс адссРсассс сСсдддсаса дсассссЕса ддсссддЬдс 1260 ЬдЬсадсссЬ сссЬссссдд дддсадддсс саддаасдЬд сдсксЬдсСд асссЬсссад 1320 сЬссаддссС ддсссссадд дсададдадд ссаддаасрд адссСсЪдСс сЬдЬддддад 1380 дСадддЪсад ддРсссадсЬ садддсасад сСсаддаЬдд дадсаддасс ссасаддсса 1440 ддсссадаРа дсадссаддд сЬддаддддЬ БддддсЬддд дсЪдддсссс ададасЬдас 1500 сЪсаддРдас сссЬдссИдд сссаРдддда даСсасдсса ссСЬсссссс асссададдд 1560 адсссЕдссс сассссадСд асссСдссса дсссЬссдЬд ддсадасаса дсасЬдасса 1620 ссссРсссСд СдсадасЬСд сЬдсСддадд аддадаЬсРд Ьдсддасдас сЬддаЪдддд 1680 адсЬддасдд дсСсЬддасс ассаЪсЬсса ЬсЬР 1714 <210> 4 <211> 1704 <212 > ДНК <213> корова <400> 4 ссРасасдЪд ЬдЕддЬдаЬд сасдаддссс ЬдсасааСса сЬасасдсад аадРссассС 60 сЬаадЪсЪдс дддЪаааСда дссЬсасдЪс ссрдсассад саадсссЬса сссадсссас 120 ссрссссддд сСссаадСсс адссаддасд сссСадсссс ЬсссСдСдСд саССссСссС 180 дддссдссдЬ дааЪааадса сссаддссас ссЕдддассс Ьдсаасдсрд СдсСддСРсР 240 еессдаддса дадсссрдде ддссдссадд ссЬдсадддд ЬдддсСдадс сдасрсрддд 300 ссасЬЬСдСЪ садсаСсСдС дддддадсСд ассссдсЬсс дддссадаса сасадСдадС 360 дддЬссадса ддссассСдд дддсЬдсссд аддссасдда ддддсЬЬддс сададдсдЕа 420 ссЪссасддс ссссьссадс сассассЬдс Сдддссддсс РсЪддасадд аассддддаа 480 дсссссдада сссЬсаддда ЪЬдаддссса аедсЬЬсссд ссЬсЬдсЪсс адсссасдсЬ 540 дЬддддсадд дссасаъсср СдЬссссадд ссссСдСссс ЬдддЬдссса дадРссЬЬде 600 дЬссасЪсЕд ддссРдссЪд дадссасдсд Ъддссддддд аСддсссЬдс ЪссасссЬса 660 ддсСсссаад десаддссЪс дсссСсссЬс адссаддадд сЪсРдсссдд сесЬсссЕдс 720 ссадддссад дссРдйдсдс ссаСддддад дЬсаЬсссРд Ьдссйдааад ддсРссаддс 780 сдддадсссЬ дааСдСссад ддсадддасс ЬадсСдсЬсс сИдсадасас ддадсссада 840 дссасадаса асаадсссса дссссдсасд сасасаадас адсссдсасс садссСссЪс 900 сасасдсасЬ. саддЬдСдса СссдсасаЪд адсасасЬСс ассссдЬсас асссасасдс 960 сЬасасасас ЬсаддЬсСсд сасСсдддда сссаСддддЬ дассссасад дсссадассс 1020 ададсЬдддЬ сЬЬдЬдадсс сЬсссЬдЪдд асассадсЬд дРссссассс Ьссадсдссс 1080 аРдддсРдсЬ садЬддссск ЬЬсссасасЪ дассасасЪд ассаддЬсад асаЬссдЪЪс 1140 сССдссессс седдддсасс сасдссссСс ссЬадсаддс сдадаСсссс ссСсадсссс 1200 СсдРссСддс асссЪсассс сьсаддсаса дддасасадс ссддсдсйдС сЪдсссйссс 1260 Ьсссрддддд садддсссад дсСсасаЪдс ЬсСдсЬдасс сСсссддсРс саддссЬддс 1320 ссссадддса даддаддсса ддаасЬдадс сьсъдьссрд дддддаддСд дддСсадддс 1380 сссадсЪсад ддсасадсРс аддаЬдддаа саддасасса саддссаддс ссадасадЬд 1440 дссадддсрд даддддЕддд дЪсЕддддсЬ ддддсссада дасЪдассЕс аддЪдаЬссс 1500 Сдсссадссс аРддддддаС ссЬдссассЬ Сссссссасс сададддадс ссЬдссссда 1560 ддсссРдаЪд аЪдссассса дссссссдЬд ддсадасаса дсасЬдасса ссссСсссСд 1620 СдсадассПд сЬдсЬддадд аддадаЪсйд Ьдсддасдсс саддасдддд адсЬддасдд 1680 дсЬсЬддасд ассаЪсасса ЪсРЬ 1704 <210> 5 <211> 1704 <212> ДНК <213> корова <400> 5 ссЕасасдЬд ЬдСддЬдаЬд сасдаддссс ЬдсасааЬса сЕасасдсад аадСссассЬ 60 сСаадЬсСдс дддЬаааЬда дссСсасдСс ссЬдсассад саадсссЬса сссадсссас 120
- 23 007958 ссессссддд сессаддссс адссаддасд сссЕадсссс СсссСдедсд сассссСссЕ 180 дддссдссдь даасааадса сссаддссдс ссДдддассс Ддсаасдссд СдсСддССсс 240 СЕссдаддса дадсссЬддИ ддссдссадд ссЬдсддддд ЬдддсСдадс сдасСсСддд 300 ссасЬЬЬдСЬ садсаЕсСдД дддддадсЬд ассссасСсс дддссадаса сасадСдадС 360 дддЬссадса ддссасс^дд дддсйдссса аддссасада ддддсСХддс сададдсаса 420 дсЕссасддЬ ссссСссадс сассасскдс Ддддссддсс ЪсСддасадд аассддддаа 480 дсссссдада сссесаддда СПдаддссса аИдсСЕсссд ссЕсДдсьсс адсссасдсй 540 дСддддсадд дссасаСссЬ сдЕссссадд ссссСдйссй ЬдддкдСсса дадессДЕдС 600 дкссасЕскд ддсскдссЬд дадссасдса Еддссадддд дЪддсссЬдс СЕсасссЕса 660 ддсЬсссаад дЬеаддссСс дсссссссСс ддссаддадд сРсЬдсссдд сЬсЬсссЬдс 720 ссадддссад дссЬдСдсдс ссаЕддддад дЕсаДсссЕд ДдссСдааад дддпссаддс 780 сдададсссе дааДдСссад ддсадддасс ЪадсЬдсесс сДдЕддасас ддадсссада 840 дссасадаса асаадсссса дссссдсасд сасасдадас адсссасасс ссдссСссЕс 900 сасасдсаск саддСдЕдса ЕссдсасаЕд адсасасЪЕс ассссаЕсас асссасасдс 960 сЕасасасас ЪсаддЕсЬсд сасЪсдддда сссаСддддр дассссасад дсссадассс 1020 ададсСдддС сЬСдрдадсс сСсссСдСдд асассадсСд дЬссссассс Ьссадсдссс 1080 дРдддсДдсЪ садсддСссе ЬЬсссасасР дассасасСд ассаддСсад асаЬссдССс 1140 сСЪдсскссс скддддсасс саЬдсссскс сскадсаддс ЬдадаЕсссс ссксадсссс 1200 ЬсдЕссЬддс асссЪсассс сЪсаддааса дддасасадс ссддЬдскдС сЬдсссЬссс 1260 ЪсссСддддд садддсссад дсЬсасаЬдс ЬсСдсСдасс сСсссадсЬс саддссДддс 1320 ссссадддса даддаддсса ддаасДдадс сЬсСдДссСд дддддаддСд дддЬсадддс 1380 сссадсъсад ддсасадсЬс аддаСдддад саддасасса саддссаддс ссадасадед 1440 дссадддсЬд даддддсддд дСспддддсД дддссссада даасдасссс аддсдаСссс 1500 Ьдсссадссс аСддддддаЕ ссЬдссассЪ Ьссссссасс сададддадс ссЬдссссда 1560 ддсссСдаЬд аедссассса дссссссдСд ддсадасаса дсасСдасса ссссесссСд 1620 ЬдсадассСд сьдсЪддадд аддадаДсЬд Ъдсддасдсс саддасдддд адсЕддасдд 1680 дсЬсЬддасс ассаЬсасса ЬсЬЬ 1704 <210> б <211> 29 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> б сдсддаЕссс сеасдсдСдЕ дСддЕдаДд 29 <210> 7 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 7 сдсддаДсса ссдаддадаа дасссасес 29 <210> 8 <211> 2842 <212> ДНК <213> овца <400> 8 ссЪасдсдЕд ЪдЬддЬдаЕд сасдаддсСс Сасасаасса сЪасасасад аадРсдаЕсС 60 сЕаадссЕсс дддЪаааСда дссасаЕдсс сссдсассад саадсссСса сссадсссдс 120
- 24 007958 ссСссссддд сЪссаддЬсс адссаддасд сссЬадсссс ссссСдЪдГд саедссСссе 180 дддссдссаЪ дааСааадса сссаддссдс ссСдддассс СдсаасдсСд ЬдсЕСдССсе 240 Ебссдаддса дадссседде дассдссадд ссИдсддддд дГдддсГдад сссасесЬдд 300 дссдсЕЬддЬ ЕсадсаЕсЕд ЬдддддсдсЕ дассссГсЬс сдддссадас асасадЬдад 360 СдддЕссддс адддсассСд ддддседссс даддссЕсдд аддддсЕИдд ссададдсдс 420 адсЕЕсасдд сссссЬссад ссассасаЪЕ сЕдддссада сЪсСдддсад даасддддда 480 адсссссдас ассЕсаддда ЕЕдаддссса асдсЕСсссд ссЪсЕдсЕсс адсссасдсе 540 даддддсадд дссдсддссС СдСссссадд сссс^дЪЕсс Гдддедссса дадЪссдеде 600 дессасГсед ддссСдссСд дадссадасе ддсссадддд даддсссСдс С^сасссСса 660 ддсесссдад десаддсаЕс аГссЕсдбсд дссадЕадсб сбдссЬддсб сСсЬсСдссс 720 ддддссаадс сбдсдЕдссс аЕддддадде сдСссседГд ссСдаааадд дсссаддсЬд 780 ддадсссСда асдЪссаддд садддассЬа дсЕдсСсссе ддддасасЪд адсссададс 840 сссадасасс аадссссадс сссдсасдса сасдадасад сссасассса дсдСссСсса 900 сасдсасСса ддсдЬссасс сдсасасаад саЬдсЕЪсас ссссдСсаса сасссасаЪд 960 сседсасаса сСсаддесСс асдсЪссддд асссаеддад ПдаСсссасд ддсссадасс 1020 сададсСддд ЪсСсаЪдадс ссСсссСдСд дасассадсС ддСссссаСС сСссадсдсс 1080 с££дддс£дс Ъсадбддссс глхсссасас Ьдассасасс. дассаддбса дасабссббс 1140 сйсдссСссс сСддддсасс сасдссссЬс ссьсдсаддс Ьдадассссс ссЪсадсссс 1200 ЕсдСссСддс асссесассс сЕсдддсаса дддасасадс ссддсасЪде сГдсссСссс 1260 СсЪсддддас ададсссадд сасдедЬдсЬ сЬдсЬдадсс есссддсесс аддссСддсс 1320 сссадддсад аддаддссад дааЬСдадсс СсПдИссСдс ддддаддСдд ддЬсадддсс 1380 ссадсгсадд дсасадсЬса ддаЬдддадс аддассссас аддссаддсс садасадйдд 1440 ссадддсСдд ддсЕддддсС ддддсссада дасСдассЬс аддЕдасссс Сдсссддссс 1500 аЬдддддаЪс асассдссаС сссссссдсс дсададддад сссСдссссд аадссссдаЪ 1560 ддссссдссс адссссссдс дддсадасас адсасидасс сссссссссд ЬдсадаЬссд 1620 сСдсЬддадд аддададсЬд Сдсддасдсс саддасдддд адсСддасдд дсеседдасд 1680 асеаЬсЬсса ЪсСЬсаГсас дсссЬЕссЕд сЬсадсдЬсС дсСасадсдс сассдСдасс 1740 сесССсаадд ГдддддСсса ссссдссддд сссСсдддсс сссЬсСсСдС. ссссадддсс 1800 сссдсададЕ сссЬсссСдс сссЬсаседе сссссссЬде сссесесПдЬ сссСсЬсСдЬ 1860 сссСсЬсЬде сссЕсГсСдС ссдпесаьее ЬсссЬЬсасс дЬаадсЬЕда дасадаСЬдд 1920 ддесаьъеса дадддсдЬсС. даададСсСс Ьдедссдсас дссЬсссЬЪс аСдЬсадЕдд 1980 ддадаассса дсаадддЬдд адСдсЬддде дадааапдад дсССдсддсд сСсасдадса 2040 дСдаСддддс асСдседсСс ссСдадассС дсдсддасас сдСЪЬЪссаС сдсаддадаа 2100 дсдддсаадд даааасдссс ГсЕСддЪсЕс СсЬЬдадЪаа аЬдЬсдсдЬЪ ГЬддЬсаЬса 2160 дСсссСсссс садЬдаддсЬ ададдадЬСХ асеесесссЬ сСсдаеддЬс аддЬсаддас 2220 сдСсаСадас ЕссддаСсас сегссЕдЕаа аСдсиедсГС ССЪдедСдса дададсссде 2280 СЬСадсЕсдд дддСссСсад сЪсасСдадс Ссдсддддса ддддкдддсС сдддсЕддсд 2340 ссдссГдЕГс дддадсдсаЬ сйссадсаЬд сЕдСсдсаса дсЪГсдСХдс Саасаадасс 2400 дсПСадесйс дСддСГадас саассСдсЬС ЬсСсдадЕаа ССдССааССС асаддадССЬ 2460 ссСдСаесСЕ ЕсаасСЕаСа аСссссСадС садаСаасЬс ьееааСсасс ЪаССсСдссс 2520 сЬГсаГССЬс ЬсссЕаСсда ЬсЬсадсаас ссаЬсасЬдс ссСсасЬдЪс сГЕааасЕдЬ 2580 сссЪЬаасЬд ассадасЬдЬ сссЬсадСдЪ ссссСсадад ссассЬсссС аЪсассСсас 2640 СдЬсссЬсес сдссссСссс СдссссСсСс СдГсссГссс Сдссссессс сдЬссссСсЪ 2700 сСдесссСсЬ сЪдссссСса сСдсСссЬсе сЬдсассСса сСдсСссЬса сСдсссЪддд 2760 ддаддсссдс аГсдаддСдЬ сЬсСдсЪсас сссдЬссссс ассссдСасс ссссдссадд 2820 СдаадЬддаЬ сЬСсЬссСсд дс. 2842 <210> 9 <211> 2840 <212 > днк <213 > овца <400> 9 ссЬасдсдЬд ЬдеддЕдаГд сасдаддсСс Сдсасаасса сЕасасасад аадСсддЕсЬ60 сЕаадссСсс дддСаааСда дссасасдсс сссдсассад саадсссЬса сссадсссдс120 ссГссссддд сС.ссаддЬсс адссаддасд сссГадсссс сссседсд^д саЬдссГссЕ180 дддссдссаС дааСааадса сссаддссдс ссГдддассс СдсадсдсЬд ЬдсЬддСЪсС240
ЕЕссдаддса дадсссГддЪ дагсдссадд ссбдсддддд дсдддсЬдад сссасссСдд300 дссдсЕСддЬ ГсадсаГсСд ГдддддсдсС дассссСсЬс сдддссадас асасадСдад360
ЬдддЬссддс адддсассЬд ддддсЬдссс даддссГсдд аддддсГЬдд ссададдсдс420
- 25 007958 адсбссасдд сссссЬссад ссассасаеь сЬдддссада сбскдддсад даасддддда480 адсссссдас ассСсаддда СХдаддссса асдссъсссд ссссбдсГсс адсссасдсб540 даддддсадд дссдсддссе ЬдЪссссадд ссссъдеъсс СдддСдссса дадессдЬдЬ600 дЬссасЬс-Ьд ддссСдссЬд дадссадасЬ ддсссадддд даддссседс ЬСсасссЬса660 ддсЬсссдад дЬсаддсаЪс аСссСсдЬсд дссадСадсЪ сЬдссСддсЬ сСсъсЪдссс720 ддддссаадс сЪдкдедссс аЬддддаддЬ сдбсссЬдед ссЬдаааадд дсссаддсЬд780 ддадсссСда асдЬссаддд садддассСа дсСдсСсссЬ ддддасасСд адсссададс840 сссадасасс аадссссадс сссдсасдса сасдадасад сссасассса дсдьссСсса 900 сасссасбса ддсдсссасс сдсасасаад сабдсЬЬсас ссссдЕсаса сасссасаЬд 960 ссСдсасаса сесаддСсЬс асдсСссддд асссаСддад (хдаесссасд ддсссадасс 1020 сададсСддд СсЬсаСдадс ссЬсссЬдЪд дасассадсЬ ддЬссссаЬс сессадсдсс 1080 сЬЬддасЕдс СсадСддссс ЬССсссасас СдассасасЬ дассаддСса дасаСссЬ+с 1140 сЬсдссЬссс сСддддсасс сасдссссес ссЫхдсаддс Ьдадассссс ссСсадсссс 1200 СсдЪссЬддс асссЪсассс с^сдддсаса дддасасадс ссддсасСде сЬдсссессс 1260 СсЬсддддас ададсссадд сасдЪдСдсС с^дсЬдадсс ссссддсСсс аддссСддсс 1320 сссадддсад аддаддссад дааЬСдадсс СсЬдессрдс ддддаддЬдд дд-Ьсадддсс 1380 ссадсйсадд дсасадсЕса ддаРдддадс аддассссас аддссаддсс садасадЬдд 1440 ссадддсйдд ддскддддсй ддддсссада дасйдассбс аддйдасссс Ьдсссддссс 1500 аЬдддддаЬс асассдссаЬ сссссссдсс дсададддад сссЪдссссд аадссссдаЪ 1560 ддссссдссс адссссссдС дддсадасас адсасСдасс ссссЬсссСд ЬдсадаесЬд 1620 сьдсиддадд аддададссд сдсддасдсе саддасдддд адссддасдд дсСссддасд 1680 асСаСсСсса СсчъсаЬсас дсСсЬСссСд сСсадсдСсС дсЬасадСдс сассдедасс 1740 сСсЪ-Ьсаадд Сдддддссса сссСдседдд сссСсдддсс сссЪсС.с1:дЪ ссссадддЬс 1800 сссдсададЪ сссЪсссСдс сссСсасЪдй сссЬсссСдС сссЬсРсСдЬ сссЪсЬсЪдЬ 1860 сссСсСсЪдС сссЬсСссдС ссдсС.са£.1:е есссеесасс дЬаадсПСда дасадаЬЬдд1920 ддЬсаЬЬЬса дадддсдЬсЬ даададЪсЬс ЬдЬдссдсас дссРсссЬЪс аЬдСсадЬдд1980 ддадааЬЪса дсаадддСдд адЬдсЬдддЪ дадаааЪдад дсЬЬдсддсд сЬсасдадса2040 дсдаьддддс асСдсСдссс сссдадассс дсдсддасас сдССССссаЬ сдсаддадаа2100 дсдддсаадд даааасдссс ЬсЬСддЬсес есЪЬдадЬаа аСдПсдсдЪС ЪЬддЪсаеса2160 дЬсссЪсссс сад1:даддсЪ ададдадЬИС. асЬСсЬсссЬ сЬсдаЬддСс аддСсаддас2220
СдСсаСадас сссддаЪсас сССссСдЬаа аСдсССдсСС СССдСдСдса дадссЬдЬСС2280
СадсСсдддд дСссСсадск сассдадсЬс дсддддсадд ддСдддсСсд ддсСддсдсс2340 дсссдЬЬсдд дадсддсаСс сссадсЪдсС. дЪсдсасадс СЬсдЬЬдсСа асаадассдс2400 ехадесЬсде ддЬЬадасса ассЪдсЪЬСс ЪсдадЪааЫ: дсхааСЪеас аддадееесс2460 сдЬаСССЬЬс аасЬсаЬааЬ ссссСадСса даЬаасСсСЬ СааСсассСа ССсСдссссС2520
ЪсаЬЬЬЬсЪс ссЬаНсдаЪс ьсадсаассс аЬсасЬдссс ЬсасЪдЬссй ЬааасСд^сс2580 сЬЬаасЬдас садасСдСсс сСсадЬдЪсс ссЬсададЬс ассЬсссЬаС сассЪсасСд2640
СсссЬсСсСд ссссесСсСд ссссЬсСсСд СсссСсЬсЬд ЬсссСссссд СссссЬсЬсЬ2700 дПсссЬсСсЬ дссссСсасе дсЬссСсЬсЬ дсассСсасС дсЬссЬсасС. дсссЪддддд2760 аддсссдсаЬ сдаддЬдСсЬ сЪдсЬсассс сдесссссас сссдЬссссс ссдссаддед2820 аадЪддаЬсЬ ЬсСссЬсддС2840 <210> 10 <211> 3120 <212> ДНК <213> кролик <400> 10 сЪссссссса сдссдсадсЪ дЪдсассссд сасасаааЬа аадсасссад сесЬдсссед60 ададдсЬдСс седаеЪсссС ссааддсада ддсСЬссасП сдддссддас адддьсдддс120 дддсдссдЪд ддсСсСдсЬд Ьддссадсад ссадаасддС саасадЬддд асаддддсад180 асссасадса саддддссЬд ссаадаасЬд ддсьсадссд дадСдсСдЬд дсаддЬсссс240 ссССдсадсе адсасдСдЬд едсСдддсад дсададдссс ссаддддадд адсасасадс300
ЬассассСсЬ дсаададссЬ ддссЬддсдс ссаддЪссса дЬссасаддд СдьдЬадЪас360 асададссьс аЬсЬЬассас адаЬдЬаддд асадасссас сасдссссед сассссассс420 адссСсдссс сССдьдддас садддсЬасс асЬссасЬсс сссдсссада дсадсадаад480 саддЪддсаС ссСсадсада дддасадСсЬ сассссЬсса сддсасСдад сссбдассса540 бсааасаадс сссЬссЬдсЬ дсасадсасс СдбдЬдсаса Ьсасасасас асасасасас600 асасЬдаддс сЬдассссаЬ сааасаадсс ссЬссСдсЬд сасадсассС дЬдЬдсасаЬ660 сасасасаса сасасасаса сасЬдаддсс ЬдассссаСс сЬдсссЬссЬ дсЪдсаЬддс720
- 26 007958 асс^дЬдСдс асаСсасаса сасаЬдсаса сасасасаса сасасасЬда дсссЬдассс 780 саксседссс ессъдсСдса кддсассСдС дкдсасаеса сасасасаса сасасасаса 840 сасасасЬда дсссЬдассс саСссЬдссс Ьсс^дсЬдса ЪддсассСдС дсасасаСса 900 сааасасдсс едссСсаЬас асСддсасСс адааддддсс ссСдЬасасд саЪасасаСд 960 сасасассСЬ дасасаСддд сссссЬасас асдсаСсаса сасаспсаЬд сасасСссес 1020 асасаСддсс сЬссСдсаса еасаьедсас асасаСдЪдс асадасс^са сааедддссс 1080 сЪдсасасас аЬЬдЬасаса сдсаЬдЬдса сасасЬЬсас асаЬдддссс ссЪдсасаЬд 1140 саесдсасас асадасасас асаСдСдсаЛ йссЬсасаса еСддддссЪЬ дсаадддаЬд 1200 сссЬдсасас асаъсдсаса едсЬсасаСд Ьдсасасасс ссасасС-дда дссЕСдсаЬа 1260 дддсссссед Сасасасасс аСдсаЬасас асасассСса сасааддддс ссссЪасаСа 1320 сдсаааасас асасасасас аСдсасасас сСсаЬасасд ддсссссСас асасаСсаса 1380 сасасасаса сасасасд^а ЬдсаЬдссЬс асасасадас сЬЬдсааддд дссссседса 1440 саЬдсаСсаа асаса^аЬдс асаЬдссеса сасасасддС ссссСасаса сасЬдсасас 1500 дсасасаЪдБ дСасаедсСС сасасасСдд ддсскьдсае ддддСссссГ дсасадсаС.а 1560 дсасссадад ссасдссадд Ъдсседддса саСддасасе ддрдсасаса садсасссаа 1620 дсссадсПсС сссасссаад дддсассадс ассссссасС сасдадсасс седааССссС 1680 дсЬссссаса адсдаасдЬд сасссЪассЬ сЬссадасдЬ сссееессЪд СддссасЪсс 1740 саЬаддбаСе ддсдадассс ЕсссЬЬдасс сЬЬдддсскд дЬсасссадд ддасаддада 1800 дддссаадСС дддссасаде ассасьдссс адсаддддед аддсаадсад адддкдддСс 1860 Сдрдаддсдъ сьддссадсс дЪдсСддддс ссаддьдддд адсадсЬддд еддседаддъ 1920 ддсЬЬссЬЬд саддеддььд дддддадсед дссссасаад едссаседсс садсасСдСс 1980 садедсеесс сссЪдаассС сссддссасс саСссссадс Ьдсадссдса дадддадЬдс 2040 сссЬсддссе ссЬсддсаад асдсасдсьд асЬдссссес сссаСссада дсЬдсадсСд 2100 дасдададсе дЬдссдаддс ссаддасддд дадсЬддасд ддсЪдСддас сассаСсасс 2160 ассЬСсаЬсЬ сссСсССссС дсесадсдед Ьдсеасадсд ссасадесас ссСссЬсаад 2220 дСдддСдсЬд сасссддсас дддСдддсСд ддддссаддд дсдддддссд ддддссаддс 2280 ссСссссасс ссдсдссдсс дсСдседсад дедаадЬдда 1:с1:ЬсСсдес сдЬддСддад 234 0 скдааасаса ссаЪсдсгсс сдасЬасадд аасаЬдаЪсд ддсадддддс сеаддсссСЪ 2400 сдСЬсЬсаса дссъдссьсс сЬддссадса ддадсссссд ссСссдссСс ддассссаСд 2460 дсЪсЬсЬдсЪ сЬддссдсЬс сддассссЬс сдссЬсддда даадсдсдса дсЪдаЪдссЬ 2520 дссддссссь ссасдсадса дЪдсддасад сасдсаЬсРд ЪсдЬссассс ддсаддассс 2580 сасссадддс садссседас сдссадссЬс сЬддасЪсад ддсЬссЬсЪд адааааддсс 2640 сасеедССдд Сссссссадс ссасасссад дсадссСссд дедддСдсЬС сссСддассс 2700 садссСдадд ссСаСдсССд сесСсссдьд дсРсЬСасРс ададдсссдЪ дсЬддасСсс 2760 сасссасадд дасадСдссс СдсСссаасс сесаседсас СдддддЬсае ддддссассС 2820 ЪсЬдЪдсадд ддессьддск. ссааддадаа сасЬсдаадд дссЬдсЕЬдд ссассЪддса 2880 ссасдддадс сссдсЪдддЬ адсЬЬддсад ддасссседа дЬададдкдд дЬдсасссад 2940 ссадааадсс едсЬддаЪдд асаддадссе ддсдСссддд ссссаддсад дсадасасдд 3000 сЬХсаеддас аддададдсс ааддаасаъс адсааадада дасадседдд ссдддсдЬес 3060 садссадасс саСссСдсад сссадсаСсд дссссдСдеа сгасадсадд дасадссадС 3120 <210> 11 <211> 2587 <212> ДНК <213> кролик <400> 11 дсдадасдсс Сдссадддса ссдссадЬда сссЬдаддсс садссесдсс дсесссСссс 60 сЬсадЬддас ссаСЬсссас сасад^ссес садссссЪсс ссьсссддсс сЬсасссссе.120 ссСЛддсСЕе аассседсда аСдССддСда даЬддаЪдаа ПааадЬдаа1: сЪесдсасЪе180 дедасе^сСс СсЪдсЬСсее саСЪСааСдд ЪЬаССасЬса БддИесссса дЪЬдссскаа240 адесассдсс аССЬсаСссС. ссаЪсссасс сЬдсссЬдсЬ дЪссЪссддд адасассасЬ300 сссЪдааасс сасаддсссс СдЬсЬЬсаса ссдссдассс сдассасасд СдаддддсЬБ360 дсССсдСдСс ЬсасЪссссс саесдадссс сададессСс сееСадСдСС сЬСасадЬса420 саСасадЬСа СасадЬИСда дСсааЬссаа ссБдсссБдс сааСХСссса ааасааадаС.480 еьссадааСа ааасадсСаЬ даадааадЬс аЪСЬаЬддаа дса^дакаСа саасаасааа540 асааедсааа саассСаасЪ дааЬаадсад адддаааСдС Ьсадасасас ЬаСддддсье600 дддсБЪсаСд дадПаЪСаса ссЬЬсакСас аксеьсааас ЕЬдЬасЬаад дадсСссЬаС:660 аЬЬасаадда ССаЬасСада дсасСЫсса ЬдассСааСЪ ааЬГсЬсаЫ: асасЬдСдад720 дееаааадса ССадЬЬаааа ЬаЬСдддсад дсСсссЬаЕа дссаасадеь дСХсаЬа-еЪс780
- 27 007958 саеаасссаа ссаесассЬа ддгдасЬсад ддСсссСдсс сассаадаас ССЬддсаада 840 аЬдСЬсадад сааскЬссъе еакаааадЬс асадСадааЬ дддсЕдБЬаа ЬЬддсаЬаЬд дааЬЬаасаа асЬасаасЬа ЬсссЬааСаа асаадаассс ааасасаааа дасасасПдП ЬадЬЪааааа ЬСдааЬЬада ааЬЬдадаЬд аддсддЬдсс сддсддддда садааадьдд сасСдеддЬд ЬдЪдсСасЬс ЬдааааЬдЬа СЪаЬасЬсса аадЪаадЬЬс ЬсаТааасаЪ ассаададда аЬдадСааса даЬсааддсс аасссСдЬсС дсссаасьсс дсСсесСРда дссаЬдсада асадддадЬа ддасаСдсЬа аассаддадс асссаЬасаЪ адааасадда ададаЬЬаас ссьдССсадЪ аОЪдЪдаЕсс сасасададс ассдЬссссс (ХсСаСдЬдс ссдсссадсд ьдсаспсасЬ садсассссь Сааскааасс адсЬСсссЬс сЬСсадСдас ссЕссЬеЬЬс адЬдсаддад ссЕддадааа ЬсаОЬЬЬдЬд Паадддаааа ЬаСасСсаас ЬаададаадП ааЬСсаЪдсд ааддьсдадс адСдСЬадЬс ассдСЬадаа аЬаадаадда ьссепдааса ПдЬСсЬСсад ЬСаЬсаСсСЬ сЬсасаЬдда ЬЪсЬадассЬ дСдссдадаа дайдаддсЪд СсссЪасЬдЬ ддСдЪдсЬас ССадсасЬаЬ дааЬаЬаЬаЬ аСаЬаЬСаСа саЬЬдсаБдЬ. ЪдадаЬадЬа аЬсЬасЪЬЬд адасаааПСП саЬаддЪЪЬа СддСЬЬЬесс аасааеьааь ссаСССааад ЬддадааЪдд РЬаадассад аЬдЬСдсЬсЬ СддсСПсСдд дссаСсСдад дадСааасад СддаСддаад дддаЬсс аааааЬЬдда адЬаасЬсаа аЬдСсЬасса 900 есеасаЬаЬЬ адааЬдсСдС ЬЬааСааада 960 саЬаддЬдас СсаСааасаЬ даЬдЫхаадс 1020 дПаЪдСЬЬСс аПссаЬадда адСПсаааас 1080 аадьепасСс ПЬддсСдддд дСдЬддадЬд 1140 срдседддде сееддЪдаьд сгсСадЬссЬ 1200 ЬПдадсасас ааССаддССЬ Ъдсдсььсса 1260 ЪдссЪЬасас ддддЬсЬаса даЪаададад 1320 асасадс-Сдд ЬаддсаПддд ссЬдддаЪса 13 80 дсссСасасП аьесПШхсса дсасГддааЬ 1440 ссЬсссЬадд дСсЪссессЬ СЬасссассЬ 1500 Ъддаааадас саЬсадсааЬ ддаасааддд 1560 саЬдСаддаа адаЬЬдПддд аддадддсЬд 1620 ссассдсесС дСдсссссьь аьседсхсас 1680 СЬсдссЬдсс сСсПдааада ддЬдсадаад 1740 ИСддааСсса дкИЬЬссЬсс ЬсЬаспсссс 1800 СдЬдаеЬСдЬ дССаССаЬаа аЬСЬсссаса 1860 адЬсаЬаасЬ ддЪаааасЬд сЬдСдаааас 1920 ассадссЬЬд ЬаЬаЬасЪаа дадаЬссада 1980 дЬадсЬсааЬ ЬЬдасЬадЬЬ ссЬддЬЬсас 2040 СсадСсссаа аСдаССдаас ССддааЬЬаа 2100 сддсЬдссас псдСдсЬс^а дадсЬсЬддд 2160 аддпсеааса асасассадд еессдаадас 2220 ССссааПааа ССЬаасаСас ъессеасЬСС 2280 даЬаЬаСХЬд дСЬааассаа асЬаСХсСса 2340 асааЫХааЬ сааааЬаСаа асаЬадСсса 2400 сссаадЬдЬБ ЬдддссссЬд сЕасссаС+С 2460 сЬЬеЪдсЬЬд дсЬсадссс!: ддссаЬРдса 2520 асаьсесссс ссасссСдсс саСааадсСс 2580 2587 <210> 12 <211? 1205 <212> ДНК <213? КрОЛИК <220>
<221? неопределенные <222> (997) <223> η в положении 997 не определен <220>
<221> неопределенные <222> (1127) <223> η в положении 1127 не определен <400? 12 гЪЬг'ястг’гтЬя яалгдпаггг Ьлсг’ог^ггасг ^г^глгпгаг сгаг*а лЬ Г'Г'пп СП ———з — — — - — — — -з — з ————33—3——-ссЬсассЬдд ааддЪдсасЬ дасЪдаадас асСдсааддд дЬдададсаЬ ЬЪсЬсаддаа120 ададсссСда дСС.Ьадаадд ссадададса дадддсЪдад ддсЬдссЬСд сдспдсаасс180 саЬддаааса саддсПЬадс адаЬдЬЬсаа дсЬссдддад ПссасасЬдд дЕдадддсад240 дсдЬссадсс ЬдасаЬддсс сссасадасЬ сдсссасадд Ьдасдссада Сдаддасддс.300 сааддаьсдд дддаЬссСас аЬдсссаддд дсассаадас адссаддада дсассададд360 ссасаадада ддссЬдддас адЬсЕсссЬд сьдасаьсса дадсссаддс сссасЬЬддс420 ададсСддсС дадаасасдЬ сСсЬдсддПд даадсЕдссс сдЬссРдддЬ дЪЬдсПсддс480 дддсСаадсс дасСдасдсд дддсдддсса ддссаЬсддс сссасддссС дсадсЬЬссС540 ссссадссса ддссасдЬдд дсЬссГ.ддсЪ даасПддссд сСсдсЬдадс ЪсПсассссс600 ссасссадса дсаддссддд сддЕдсЬдсс аЪдадсЬсса ЬЬсссассас асаадсдаса660 дсссдддсад сдссссаддс ссасддддсд ЬЬЬдсСдЬдс ддсСсдсасЬ сдсСдсСсад720
- 28 007958 ддссадсдса дддЕдсадса дддасЕсасс аасссдсссс дасЕсддсЕд дсасдЕЕЕас 780 ЕддаддссЕс ЕдадссЕдас сдЕддсадЕд дддсссдадс аддсЕссадд сЕдсссссЕд 840 сасссЕдддс ЕЕдссдсЕсс дддассссЕд дЕдддсассЕ ЕсссадаЕдЕ дсЕсссассд 900 ЕдссЕссЕЕд дддсЕсЕддд сЕсаЕадсдд ЕсасЕсЕссд ссЕЕсЕсЕсс ЕсссадсссЕ 960 ЕЕссЕдссЕс ссеаьддссс саЕсЕадсЕс ЕдсссепСсЕ ададссЕсЕа ссЕддаадда 1020 аЕсЕдсЕдЕЕ ддассаадас ассасссдса дсасаддЕдд дсдссЕЕдса сЕдЕдсЕадд 1080 сссЕссссдс асадаааадд дсссЕаддсЕ сЕддаддсЕд сЕдсЕдпсЕс ЕддддсЕддс 1140 аЕсдддсдса сссЕдсассс ЕдсасссЕда ддааасЕсад дссЕдсссдс ЕссаддссЕд 1200 ЕсссЕ 1205 <210> 13 <211> 668 <212> ДНК.
<213> кролик <400> 13 даадсЕЕЕас ЕЕдЕЕддддд сдддсаддЕс ЕаадддассЕ дссаддЕдЕд ддддсЕдддс60
ЕЕдасЕсадс аддадссЕЕс Еадааддааа дсЕсЕддада аддЕдддддс ададддсддд120 аааддссЕдЕ даддаддсдд дЕддЕдддса дддссасЕдд даадддаддд сЕдддддЕда180 сасЕсаддЕЕ ддсасЕдддд аддассЕдад даддсаддЕд ссаддсасад адсЕдаассЕ240 дддсадддса ддддсаддЕа асаадаадда ЕЕсЕссЕЕдд адссЕддЕсс адддЕддЕсс300 адддсддЕсс адддссЕддд дЕЕЕдсаадс ЕдддсЕдЕда садддссЕсЕ сЕссссаддд360 дсаадсадса аадссЕдддс асададссса аадсссссас асададаадс Ессссадддс420 адддсседса дддсЕЕдддд дассЕЕсЕЕд дадсаддсад аддасададд саЕдадаЕса480 дссЕсссада ддсЕддааЕд аЕаддЕссад саддаддддс ссасаЕдддс ЕсЕддЕЕадс540 аддадаааас адсссссадд ЕссссаЕддс сассасдсас сдасЕдсЕдд ЕдаадсЕЕЕд600 ддЕддсадас дададссаса ЕддсадсЕдс ЕссЕдЕсасЕ сЕсЕдддадЕ дсаЕсдаддд660 дсдЕсдас668 <210> 14 <211> 45 <212> белок <213> верблюд <400> 14
| С1и 1 | Рго Ьеи | Ьеи | С1и 5 | С1и С1и Зег Суя | А1а 10 | 61и | А1а | <31п | Зег О1у 15 | С1и | |||||
| Ьеи | Аар | О1у | Ьеи | Тгр | ТЫ | ТЬг | Не | Зег | 11е | РЬе | 11е | ТЫ | Ьеи | РЬе | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Ьеи | Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз | |||
| 35 | 40 | 45 |
<210? 15 <211? 44 <212? белок <213> Ното вархепз <400? 15
| С1и | Ьеи | С1п | Ьеи | С1и | С1и | Зег | Суз | А1а | <31и | А1а | С1п | Азр | С1у | С1и | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЫ | 11е | ТЫ | 11е | РЬе | 11е | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | РЬе | РЬе | Ьуз |
- 29 007958 <210> 16 <211э 44 <212> белок <213> Ното зархепз <400> 16
| С1и Ьеи С1п Ьеи 1 | (31и С1и Зег Суз А1а С1и А1а С1п Азр С1у 61и | Ьеи | ||||||||||||
| 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | 11е | Ьеи | Не | ТЬг Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | РЬе | РЬе | Ьуз |
40 <210> 17 <211> 44 <212> белок <213> Ното зархепз
| <400> 17 С1и Ьеи С1п 1 | Ьеи | С1и С1и Зег Суз А1а С1и А1а С1п | Азр | С1у | <31и 15 | Ьеи | |||||||||
| 5 | 10 | ||||||||||||||
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр | ТЫ | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | 11е | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | РЬе | РЬе | Ьуз |
40 <210> 18 <211> 44 <212> белок <213> мышь <400> 18
| С1у Ьеи С1п Ьеи Азр С1и ТЬг Суз А1а С1и А1а <31п Азр С1у <31и Ьеи | |||||||||||||||
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | 31 у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | А1а | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
40 <210> 19 <211> 44 <212> белок <213> мышь <400> 19
С1у Ьеи Азр Ьеи Азр Азр Уа1 Суз А1а С1и А1а С1п Азр С1у О1и Ьеи
10 15
Азр С1у Ьеи Тгр ТЬг ТЬг Не ТЬг Не РЬе 11е Зег Ьеи РЬе Ьеи Ьеи 20 25 30
Зег Уа1 Суз Туг Зег А1а Зег Уа1 ТЬг Ьеи РЬе Ьуз
40 <210> 20 <211> 45 <212> белок <213> мышь <400> 20
| Рго 1 | <31у | Ьеи | С1п | Ьеи 5 | Азр | С1и | ТЬг | Суз | А1а 10 | О1и | А1а | С1п | Азр | С1у 15 | С1и |
| Ьеи | Азр | С1у | Ьеи 20 | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг 25 | Не | РЬе | Не | Зег | Ьеи 30 | РЬе | Ьеи |
| Ьеи | Зег | Уа1 35 | Суз | Туг | Зег | А1а | А1а 40 | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз 45 |
<210> 21 <211> 44 <212> белок <213> мышь <400> 21
| С1и 1 | Ьеи | <31 и | Ьеи | Азп 5 | О1и | ТЬг | Суз | А1а | 01и 10 | А1а | С1п | Азр | С1у | <31 и 15 | Ьеи |
| Азр | 01у | Ьеи | Тгр 20 | ТЬг | ТЬг | 11е | ТЬг | Не 25 | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе 30 | Ьеи | Ьеи |
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Зег | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
40 <210> 22 <211> 44 <212> белок <213> МЫШЬ <400> 22
| С1и 1 | Ьеи | С1и | Ьеи | Азп 5 | С1у | ТЬг | Суз | А1а | <31и 10 | А1а | <31п | Азр | В1у | <31и 15 | Ьеи |
| Азр | С1у | Ьеи | Тгр 20 | ТЬг | ТЬг | Не | ТЬг | Не 25 | РЬе | Не | Зег | Ьеи | РЬе 30 | Ьеи | Ьеи |
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | Зег | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
40 <210> 23 <211> 44 <212> белок <213> овца <400> 23
| Ьеи | Ьеи | Ьеи | 01и | 01 и | О1и | Зег | Суз | А1а | Азр | А1а | <31п | Азр | С1у | О1и | Ьеи |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Азр | <31у | Ьеи | Тгр | ТЬг | ТЬг | Не | Зег | 11е | РЬе | Не | ТЬг | Рго | РЬе | Ьеи | Ьеи |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Зег | Уа1 | Суз | Туг | Зег | А1а | ТЬг | Уа1 | ТЬг | Ьеи | РЬе | Ьуз |
40 <210> 24 <211> 44 <212> белок <213> овца <400> 24
Ьеи Ьеи Ьеи С1и 61и С1и 5ег Суз А1а Азр А1а 61п Азр <31у С1и Ьеи 15 1015
Азр С1у Ьеи Тгр ТЬг ТЬг Не Зег 11е РЬе Х1е ТЬг Ьеи РЬе Ьеи Ьеи
2530
Зег Ца1 Суз Туг Зег А1а ТЬг νβΐ ТЬг Ьеи РЬе Ьуз
| 35 | |
| <210> | 25 |
| <211> | 19 |
| <212> | белок |
| <213> | корова |
| <400> | 25 |
Ьеи Ьеи Ьеи С1и 01 и О1и 11е Суз А1а Азр Азр Ьеи Азр С1у С1и Ьеи 15 1015
Азр О1у Ьеи <210> 26 <211> 19 <212> белок <213> корова <400> 26
Ьеи Ьеи Ьеи О1и О1и С1и Не Суз А1а Азр А1а С1п Азр С1у С1и Ьеи 15 10 15
Азр О1у Ьеи <210> 27 <211> 43 <212> белок <213 > кролик <400> 27
Ьеи С1п Ьеи Азр С1и Зег Суз А1а 01и А1а 01л Азр С1у С1и Ьеи Азр
- 32 007958
1015
О1у Ьеи Тгр ТЬг ТЬг 11е ТЬг Не РЬе 11е Зег Ьеи РЬе Ьеи Ьеи Зег
2530
Уа1 Суз Туг Зег А1а ТЬг Уа1 ТЬг Ьеи РЬе Ьуз
3540 <210> 28 <211> 27 <212> белок <213> верблюд <400> 28
| Уа1 Ьуз Тгр | 11е РЬе | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | С1и | Ьеи | Ьуз Агд | ТЬг | Не |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| Рго Азр Туг | Агд Азп | МеЬ | Не | С1у | С1п | Е1у | Зег | |||
| 20 | 25 | |||||||||
| <210> 29 <211> 27 <212> белок | ||||||||||
| <213> Ното зар1епз | ||||||||||
| <400> 29 Уа1 Ьуз Тгр | 11е РЬе | Зег | Зег | Уа1 | Уа1 | Азр | Ьеи | Ьуз <31 п | ТЬг | Не |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| Рго Азр Туг | Агд Азп | МеС | 11е | О1у | <31п | б!у | А1а |
25 <210> 30 <211> 27 <212> белок <213> Ното зархепз
| <400> 30 | |||
| Уа1 Ьуз Тгр 11е | РЬе Зег Зег Уа1 | Уа1 Азр Ьеи Ьуз | <31п ТЬг 11е |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
Рго Азр Туг Агд Азп МеС 11е 61у 61п С1у А1а
25 <210> 31 <211> 27 <212> белок <213> Ното зархепэ <400> 31
Рго
| <210> | 32 |
| <211> | 27 |
| <212> | белок |
| <213> | мышь |
| <400> | 32 |
| Уа1 Ьуз Тгр |
| <210> | 33 |
| <21Х> | 27 |
| <212> | белок |
| <213> | МЫШЬ |
| <400> | 33 |
| Уа1 Ьуз Тгр |
| <210> | 35 |
| <211> | 27 |
| <212> | белок |
| <213> | мышь |
| <400> | 35 |
| Уа1 Ьуз Тгр |
| <210> <211> <212> <213> | 36 27 белок мышь |
| <400> 36 Уа1 Ьуз Тгр 1 |
З4 007958
Рго Азр Туг Агд Азп МеС Не 51у 31п С1у А1а
25 <210> 37 <211> 27 <212> белок <213> кролик <400> 37
Йа1 Ьуз Тгр 11е РЬе Зег Зег Уа1 Уа1 (31и Ьеи Ьуз Н1з ТПг 11е А1а
5 10 · 15
Рго Азр Туг Агд Азп МеЕ Мее С1у С1п С1у А1а
25 <210> 38 <211> 8 <212> белок <213> овца <400> 38
Уа1 Ьуз Тгр Х1е РНе Зег Зег Уа1
5 <210> 33 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 39 сдсаадсССс сЪасасдЬде деддедаЪд 29 <210> 40 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> описание искусственной последовательности: праймер <400> 40 десдасдссс сСсдаедсас Ссссадад 28 <210> 41 <211> 29 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 41 ддСасссЕсЕ ссссссссса сдссдсадс 29
- З5 007958 <210> 42 <211> 37 <212> днк <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: праймер <400> 42 аЬаЬсСсада асПддсПдСс ссЬдсЬдПад Сасасдд 37 <210> 43 <211> 27 <212> ДНК <213* Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 43 дСсдасасСд дасдсСдаас сЬсдсдд 27 <210> 44 <211> 28 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 44 ддСассдддд дсЬЬдссддс сдесдсас 28 <210> 45 <211> 38 <212> ДНК ' <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 45 дсддссдсЪд дсдаддадас саадсЬддад айсааасд 38 <210> 46 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 46 дЕсдасдсад сссааадсЕд ЬЬдсааЪддд дсадсд зб
- 36 007958 <210> 47 <211> 35 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 47 аДаеддДасс дсдадасдсс Ьдссадддса ссдсс 35 <210> 48 <211> 30 <212> дНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223* Описание искусственной последовательности: праймер <400> 48 ддаЬсссдад сЪССаЬдддс адддЬддддд 30 <210> 49 <211> 42 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 49 ’ аеаСдссдас сЬдддаДаад саедсъдссе ЬсЪдескдСс сс 42 <210> 50 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 50 сЪаддЬасса дсаддЬдддд дсасЕЪсЕсс с 31 <210> 51 <211> 1719 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: сегмент гена Су1 тяжелой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный нуклеотидами, полученными из тяжелой цепи кролика .
<400> 51
- З7 007958
ЕдассЕассЕ асссЕдссаа ддЕсаддддЕ ссЕссааддс аадддаЕсас аЕддсассас 60 сЕсЕсЕЕдса дссЕссасса адддсссаЕс ддЕсЕЕсссс сЕддсасссЕ ссЕссаадад 120 сассЕсЕддд ддсасадсдд сссЕдддсЕд ссЕддЕсаад дасЕасЕЕсс ссдаассддЕ 180 дасддЕдЕсд ЕддаасЕсад дсдсссЕдас садсддсдЕд сасассЕЕсс сддсЕдЕссЕ 240 асадЕссЕса ддасЕсЕасЕ сссЕсадсад сдЕддЕдасс дЕдсссЕсса дсадсЕЕддд 300 сасссадасс ЕасаЕсЕдса асдЕдааЕса саадсссадс аасассаадд Еддасаадаа 3 60 адЕЕддЕдад аддссадсас адддадддад ддкдЕсЕдсЕ ддаадссадд сЕсадсдсЕс 420 сЕдссЕддас дсаЕсссддс ЕаЕдсадссс садЕссаддд садсааддса ддссссдСсЕ 480 дссЕсЕЕсас ссддаддссЕ сЕдсссдссс сасЕсаЕдсЕ садддададд дЕсЕЕсЕддс 540 ЕЕЕЕЕсссса ддсЕсЕдддс аддсасаддс ЕаддЕдсссс Еаасссаддс ссЕдсасаса 600 ааддддсадд ЕдсЕдддсЕс адассЕдсса ададссаЕаЕ ссдддаддас ссЕдссссЕд ббо ассЕаадссс ассссааадд ссааасЕсЕс сасЕсссЕса асЕсддасас сЕЕсЕсЕссЕ 720 сссадаЕЕсс адЕаасЕссс ааЕсЕЕсЕсЕ сЕдсададсс саааЕсЕЕдЕ дасаааасЕс 780 асасаЕдссс ассдЕдссса ддЕаадссад сссаддссЕс дсссЕссадс Есааддсддд 840 асаддЕдссс ЕададЕадсс ЕдсаЕссадд дасаддсссс адссдддЕдс ЕдасасдЕсс Э00 ассЕссаЕсЕ сЕЕссЕсадс ассЕдаасЕс сЕддддддас сдЕсадЕСЕЕ ссЕсЕЕсссс .960 ссаааассса аддасасссЕ саЕдаЕсЕсс сддассссЕд аддЕсасаЕд сдЕддЕддЕд 1020 дасдЕдадсс асдаадассс ЕдаддЕсаад ЕЕсаасЕддЕ асдЕддасдд сдЕддаддЕд 1080 саЬаайдсса адасааадсс дсдддаддад садЕасааса дсасдЕассд ЕдЕддЕсадс 1140 дЕссЕсассд ЕссЕдсасса ддасЕддсЕд ааЕддсаадд адЕасаадЕд сааддЕсЕсс 1200 аасааадссс Есссадсссс саЕсдадааа ассаЕсЕсса аадссааадд ЕдддасссдЕ 1260 ддддЕдсдад ддссасаЕдд асададдссд дсЕсддссса сссЕсЕдссс ЕдададЕдас 1320 сдсЕдЕасса ассЕсЕдЕсс сЕасадддса дссссдадаа ссасаддЕдЕ асасссЕдсс 138 0 сссаЕсссдд даЕдадсЕда ссаадаасса ддЕсадссЕд ассЕдссЕдд ЕсаааддсЕЕ 1440 сЕаЕсссадс дасаЕсдссд ЕддадЕддда дадсааЕддд садссддада асаасЕасаа 1500 дассасдссЕ сссдЕдсЕдд асЕссдасдд сЕссЕЕсЕЕс сЕсЕасадса адсЕсассдЕ 1560 ддасаададс аддЕддсадс аддддаасдЕ сЕЕсЕсаЕдс ЕссдЕдаЕдс аЕдаддсЕсЕ 1620 дсасаассас Еасасдсада ададссЕсЕс ссЕдЕсЕссд ддЕаааЕдад сдсЕдЕдссд 1680 дсдадсЕдсс ссЕсЕсссЕс ссссссасдс сдсадсЕдЕ 1719 <210> 52 <211> 390 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: сегмент гена УН, кодирующий полипептидную последовательность элемента УН человека, с фланкирующими последовательностями, полученными из последовательностей ДНК иммуноглобулина кролика.
<400> 52
ЕдадЕдасад ЕдСссЕдасс аЕдЕсдЕсЕд ЕдЕЕЕдсадд ЕдЕссадЕдЕ даддЕдсадс60
ЕдЕЕддадЕс сдддддаддЕ сЕсдЕссадс саддддддас ссЕдадасЕс ассЕдсдсад120
ЕсЕсЕддаЕЕ сассЕЕсадЕ адсЕаЕдсаа ЕдадсЕдддС ссдссаддсс ссадддаадд180 ддсЕддааЕд ддЕсддадсс аЪЕадЕддка дЕддЕадсас аЕасЕасдсд дасадсдЕда240 ааддссдаЕЕ сассаЕсЕсс ададасаасЕ ссаадаасас дсЕдЕаЕсЕд саааЕдааса300 дЕсЕдададс сдаддасасд дссдссЕаЕЕ асЕдЕдсдаа адасасадЕд аддддсссЕс 360 аддсЕдадсс садасасааа ссЕсссЕдса390 <210> 53 <211> 445' <212> дНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: последовательность, содержащая сегмент гена Ск легкой цепи иммуноглобулина человека, фланкированный 50 нуклеотидами, полученными из гена каппа-1 легкой цепи иммуноглобулина кролика.
- 38 007958 <400> 53 саЬссасаСд дсасссаддд дадаСдСсса сСддЬассСа адссЪсдсса ЪссСдСССдс 60 ССсссссссс аддаасСдсд дсЬдсассаС ссдСсССсаС сССсссдсса СсСдаСдадс 120 адссдаааЕс сддаасбдсс СсЕдсхдЕдС дсссдссдаа саасссссаб сссадададд 180 ссааадСаса дСддааддсд даСаасдссс СссааСсддд ЕаасСсссад дададСдСса 240 сададсадда садсааддас адсасссаса дссСсадсад сасссСдасд седадсааад 300 садасСасда дааасасааа дСсСасдссС дсдаадссас ссаСсадддс сСдадсссдс 360 ссдссасааа дадсССсаас аддддададС дССададсда дасдссСдсс адддсассдс 420 садсдасссС даддсссадс сСсдс 445 <210> 54 .
<211> 632 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: сегмент гена Ук, кодирующий полипептидную последовательность элемента Ук человека, фланкированный последовательностями, полученными из ДНК иммуноглобулина кролика.
<400> 54 ддсаддсСдс Ссссасссса Сдсаддаддс адСассаддс аддасссадс аСддасаСда60 дддСсссСдс ЬсадсСсссд ддасСссСдс сдсСсСддсС сссаддСаад дадддаааса120 асаааааССС СаССсадсса дсдсадссас СааСдссСдд сасССсадда ааССсССсСС180 адаасаССас СааСсаСдСд даСаСдСдСС СЕСаСдССсс саасаСсада СассадаСдс240
Сасасссада сдасссадСс СссаСссСсс сСдссСдсаи сСдсдддада сададСсасс300 аСсасССдсс дадссадСса дддсаССадс ааССасСХад ссСддСаСса дсадааасса360 дддааддеСс ссаадсСссС даСССаСдсС дсасссасСС сдсаассСдд ддСсссаСсд420 сддССсадСд дсадСддаСс СдддасадаС ССсасСсССа ссаСсадсад ссСдсадссС480 даадаСдССд ссассСасса сСдСсаааад СасаасадСд ссссСссасС СССсддсдда540 дддассаадд СддадаСсаа асдСаадСдс асСССссСаа СдССссСсас сдСССсСдсс600
СдаСССдССС дсСССССсса ССССССсдсС ас632 <210> 55 <211> 70 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 55 саСасасадс саСаса.Сасд сдСдСддссд сСсСдссСсС сСсССдсадд СаСддасадс 60 аадсдаассд 70 <210> 56 <211> 71 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > Описание искусственной последовательности: праймер <400> 56 аСсадддСда ссссСасдСЕ асасСссСдС сассааддад Ьдддадддас Ссадаадаас 60
- 39 007958 (;сдСсаадаа д 71 <210> 57 <211> 419 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: ген, кодирующий константную область легкой цепи иммуноглобулина человека С-лямбда-2, фланкированный нуклеотидами, полученными из гена легкой цепи курицы.
<400> 57 сабасасадс сабасабасд сдбдбддссд сСседссСсС сбсббдсадд Ссадсссаад 60 дсбдсссссС ссдСсасбсС дббсссдссс СссбсСдадд адсССсаадс саасааддсс 120 асасСддбдЬ дСсбсаЬаад СдасССсбас ссдддадссд СдасадСддс ССддааадса 180 дабадсадсс ссдСсааддс дддадбддад ассассасас ссЪссаааса аадсаасаас 240 аадЬасдсдд ссадсадсСа ЬсСдадссбд асдссбдадс адЬддаадСс ссасадаадс 300 ЪасадсЪдсс адд+сасдса. Сдаадддадс ассдСддада адасадЬддс сссбасадаа 360 сдсисаСадс адссссасСд дддаидсаас дСдаддасад СддСсССсса сСссССсСд 419 <210> 58 <211> 416 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Описание искусственной последовательности: сегмент гена Уб, кодирующий полипептид Уб иммуноглобулина человека, с фланкирующими последовательностями, полученными из ДНК иммуноглобулина курицы.
<400> 58
ЪЬдссдЬЬЬЬ сЪссссбсбс ЪссЬсЬсссЬ сбссаддЬЬс ссбддбдсад ЬсадТдсЬда60 сбсадссдсс сЬсддбдбса дсадссссдд дасаадаадб сасдабсСсс ЬдсбссдддС.120 сбадбадсаа сасбддсдас ааббссдбсб сьбддсасса дсадсбдссб ддсасбдссс180 сбаадсПЪсЬ дабсЬаЬдаб аасаасаада дасссбсддд саТсссЬдас сдаЬбсбссд240 дЬСссааабс сддсассбса дссасабЬад дсабсасбдд дсбссааасс ддсдасдадд300 сбдасйабба сбдЬдддасб бдддасадса дссЪбСсбдб «хддьаьдббб дддддсдддазбо сасдсдбдас сдбссбаддб дадбсдсбда ссбсдСсбсд дбсЪЬбсббс ссссаЕ416
Claims (32)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Трансгенный вектор, содержащий гуманизированный локус 1д, полученный из локуса 1д или части локуса 1д животного, отличного от человека, у которого разнообразие антител, главным образом, создается посредством конверсии генов, где регуляторные последовательности указанного гуманизированного локуса 1д идентичны регуляторным последовательностям локуса 1д животного, отличного от человека, у которого разнообразие антител главным образом создается посредством конверсии генов, причем указанный гуманизированный локус 1д содержит два или более сегмента гена 1д, включая множественные сегменты вариабельного гена (V) и множественные сегменты вариабельного гена (1), где по меньшей мере один из указанных сегментов гена является сегментом гена человека, интегрированным в указанный локус 1д или часть локуса 1д указанного животного, отличного от человека, фланкированным и отделенным некодирующими последовательностями из генома указанного животного, отличного от человека, и указанные сегменты гена расположены друг относительно друга в нереаранжированной, частично реаранжированной или полностью реаранжированной конфигурации, причем указанный гуманизированный локус 1д способен претерпевать конверсию генов и продуцировать спектр гуманизированных иммуноглобулинов с геном У-области у указанного животного, отличного от человека.
- 2. Трансгенный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанным животным, отличным от человека, является кролик, свинья, курица, овца или корова.
- 3. Трансгенный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный гуманизированный локус 1д является локусом тяжелой цепи и содержит по меньшей мере два сегмента гена У человека, по меньшей мере один сегмент гена Ό, по меньшей мере два сегмента гена 1 и по меньшей мере один сегмент гена константной области.
- 4. Трансгенный вектор по п.3, отличающийся тем, что указанный сегмент гена константной области является сегментом гена константной области тяжелой цепи человека.- 40 007958
- 5. Трансгенный вектор по п.4, отличающийся тем, что указанный сегмент гена константной области тяжелой цепи человека представляет собой Сд.
- 6. Трансгенный вектор по п.3, содержащий приблизительно 10-100 сегментов гена У и по меньшей мере один сегмент гена У человека, где указанный сегмент гена У человека помещен ниже указанных 10100 сегментов гена У.
- 7. Трансгенный вектор по п.6, отличающийся тем, что указанные сегменты гена У выбраны из сегментов гена У на 3'-конце У-области указанного животного, отличного от человека, и сегментов гена У человека.
- 8. Трансгенный вектор по п.1, отличающийся тем, что указанный гуманизированный локус Ιβ является локусом легкой цепи и содержит по меньшей мере два сегмента гена У, по меньшей мере два сегмента гена 1 и по меньшей мере один сегмент гена константной области.
- 9. Трансгенный вектор по п.8, отличающийся тем, что указанный сегмент гена константной области является сегментом гена константной области легкой цепи человека.
- 10. Трансгенный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный сегмент гена константной области легкой цепи человека представляет собой СХ или Ск.
- 11. Трансгенный вектор по п.8, содержащий приблизительно 10-100 сегментов гена У и по меньшей мере один сегмент гена У человека, где указанный сегмент гена У человека помещен ниже указанных 10100 сегментов гена У.
- 12. Трансгенный вектор по п.11, отличающийся тем, что указанные сегменты гена У выбраны из сегментов гена У на 3'-конце У-области животного, отличного от человека, и сегментов гена У человека.
- 13. Трансгенный вектор по п.9, отличающийся тем, что указанный сегмент гена У человека помещен непосредственно на 5'-конце сегмента гена 1 в реаранжированной конфигурации.
- 14. Способ получения трансгенного вектора по п.1, предусматривающий (ί) получение фрагмента ДНК, содержащего локус Ιβ или его часть от животного, отличного от человека, содержащий по меньшей мере один сегмент гена У, по меньшей мере один сегмент гена 1 и по меньшей мере один сегмент гена константной области и регуляторные последовательности; и (ίί) интеграцию по меньшей мере одного сегмента гена Ιβ человека в указанный фрагмент ДНК, полученный на стадии (ί), с получением гуманизированного локуса Ιβ, в клетке, не являющейся клеткой указанного животного-реципиента, где указанный сегмент гена Ιβ человека функционально фланкирован некодирующими последовательностями из указанного животного, отличного от человека, чтобы обеспечить реаранжировку генов и конверсию генов указанного гуманизированного локуса Ιβ и продуцирование функционального спектра гуманизированных антител с аминокислотными последовательностями Уобласти, кодируемыми более чем одним сегментом гена У-области, у указанного животного-реципиента, отличного от человека.
- 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что интеграцию указанного сегмента гена Ιβ человека осуществляют путем гомологической рекомбинации, путем замены сегмента гена Ιβ в указанном локусе Ιβ или указанной его части.
- 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что гомологичную рекомбинацию осуществляют в бактериальной клетке, дрожжевой клетке или клетке животного, отличного от человека.
- 17. Способ по п.15, отличающийся тем, что сегмент гена Ιβ человека включают в рекомбинантный вектор и связывают с 5'-нуклеотидной последовательностью и 3'-нуклеотидной последовательностью, которые гомологичны 5'- и 3'-фланкирующим последовательностям указанного сегмента гена Ιβ животного, отличного от человека.
- 18. Трансгенное животное, отличное от человека, содержащее трансгенный вектор по п.1.
- 19. Трансгенное животное по п.18, отличающееся тем, что указанное животное выбрано из кролика, свиньи, курицы, овцы или коровы.
- 20. В-клетка, полученная из трансгенного животного по п.18.
- 21. Способ получения трансгенного животного по п.18, предусматривающий:(ί) введение трансгенного вектора по любому из пп.3-7 в реципиентную клетку животного с интегрированием гуманизированного локуса тяжелой цепи в геном указанной реципиентной клетки и (ίί) получение животного из реципиентной клетки, содержащей гуманизированный локус тяжелой цепи, интегрированный в геном, продуцирующего функциональный спектр гуманизированных тяжелых цепей Ιβ.
- 22. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанным животным является кролик, а указанной реципиентной клеткой является клетка раннего эмбриона.
- 23. Способ по п.22, отличающийся тем, что у указанного кролика нарушена экспрессия эндогенных молекул Ιβ.
- 24. Способ по п.21, отличающийся тем, что указанным животным является курица, а указанной реципиентной клеткой является оплодотворенная яйцеклетка.
- 25. Способ по п.24, отличающийся тем, что у указанной курицы нарушена экспрессия эндогенных молекул Ιβ.
- 26. Способ получения трансгенного животного по п.18, предусматривающий:- 41 007958 (ΐ) введение трансгенного вектора по любому из пп.8-13 в реципиентную клетку животного с интегрированием гуманизированного локуса легкой цепи в геном указанного животного, отличного от человека и (ίί) получение животного из реципиентной клетки, содержащей гуманизированный локус легкой цепи, интегрированный в геном, продуцирующего функциональный спектр гуманизированных легких цепей Ιβ.
- 27. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанным животным является кролик, а указанной реципиентной клеткой является клетка раннего эмбриона.
- 28. Способ по п.27, отличающийся тем, что у указанного кролика нарушена экспрессия эндогенных молекул Ιβ.
- 29. Способ по п.26, отличающийся тем, что указанным животным является курица, а указанной реципиентной клеткой является оплодотворенная яйцеклетка.
- 30. Способ по п.29, отличающийся тем, что у указанной курицы нарушена экспрессия эндогенных молекул Ιβ.
- 31. Способ получения трансгенного животного по п.18, предусматривающий:(ί) введение трансгенного вектора по любому из пп.15-19 и трансгенного вектора по любому из пп.20-25 в реципиентную клетку животного с интегрированием гуманизированных локусов Ιβ в геном указанного животного, отличного от человека; и (ίί) получение животного из реципиентной клетки, содержащей гуманизированные локусы Ιβ, интегрированные в геном, продуцирующего функциональный спектр гуманизированных антител.
- 32. Способ получения потомства трансгенного животного по п.18, предусматривающий:(ί) получение трансгенного животного, отличного от человека, способного продуцировать функциональный спектр гуманизированных тяжелых цепей, в соответствии со способом по пп.21-25;(ίί) получение трансгенного животного, отличного от человека, способного продуцировать функциональный спектр гуманизированных легких цепей, в соответствии со способом по пп.26-30;(ΐϊϊ) скрещивание трансгенного животного, полученного на стадии (1), с трансгенным животным, полученным на стадии (ίι); и (ίν) отбор потомства, которое продуцирует как гуманизированные тяжелые цепи, так и гуманизированные легкие цепи, с получением трансгенного животного, способного продуцировать функциональный спектр гуманизированных антител.Фиг. 1(а)-(б). Новые нуклеотидные последовательности 3'-конца гена С-гамма коровы (3'фланкирующие последовательности Су коровы). Праймеры показаны в заштрихованных прямоугольниках. 5'-праймер находится в СН3, а 3'-праймер - в М1. Последовательности клона 11, клона 3 и клона 5 указаны в 8ЕО ΙΌ N0: 3, 8Е0 ΙΌ N0: 4 и 8Е0 ΙΌ N0: 5, соответственно.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US22287200P | 2000-08-03 | 2000-08-03 | |
| US27615601P | 2001-03-15 | 2001-03-15 | |
| PCT/US2001/024348 WO2002012437A2 (en) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | Production of humanized antibodies in transgenic animals |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200300233A1 EA200300233A1 (ru) | 2004-02-26 |
| EA007958B1 true EA007958B1 (ru) | 2007-02-27 |
Family
ID=26917236
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200601715A EA013564B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция |
| EA200300233A EA007958B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200601715A EA013564B1 (ru) | 2000-08-03 | 2001-08-03 | Гуманизированный иммуноглобулин и содержащая его фармацевтическая композиция |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7129084B2 (ru) |
| EP (2) | EP2044839A3 (ru) |
| CN (1) | CN1468250A (ru) |
| AP (1) | AP2003002756A0 (ru) |
| AU (2) | AU2001284703B2 (ru) |
| CA (2) | CA2422155A1 (ru) |
| EA (2) | EA013564B1 (ru) |
| IL (2) | IL154751A0 (ru) |
| MX (1) | MXPA03001915A (ru) |
| NO (1) | NO20031054L (ru) |
| NZ (1) | NZ524523A (ru) |
| WO (1) | WO2002012437A2 (ru) |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2631797C2 (ru) * | 2012-05-08 | 2017-09-26 | Эдэптив Байотекнолоджиз Корпорейшн | Композиции и способы измерения и калибровки систематической ошибки амплификации в мультиплексных пцр-реакциях |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US10077473B2 (en) | 2013-07-01 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags |
| US10077478B2 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| US10323276B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-06-18 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| RU2696202C1 (ru) * | 2008-06-25 | 2019-07-31 | ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи | Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела |
| US10392663B2 (en) | 2014-10-29 | 2019-08-27 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from a large number of samples |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| US11041202B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-06-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
Families Citing this family (148)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050144655A1 (en) | 2000-10-31 | 2005-06-30 | Economides Aris N. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| US6596541B2 (en) | 2000-10-31 | 2003-07-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of modifying eukaryotic cells |
| GB0110029D0 (en) | 2001-04-24 | 2001-06-13 | Grosveld Frank | Transgenic animal |
| GB0115256D0 (en) | 2001-06-21 | 2001-08-15 | Babraham Inst | Mouse light chain locus |
| US7323618B2 (en) | 2002-02-01 | 2008-01-29 | Origen Therapeutics, Inc. | Tissue specific expression of exogenous proteins in transgenic chickens |
| US20060191026A1 (en) | 2005-02-18 | 2006-08-24 | Origen Therapeutics, Inc. | Tissue specific expression of antibodies in chickens |
| US7145057B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-12-05 | Origen Therapeutics, Inc. | Chimeric bird from embryonic stem cells |
| US20100311954A1 (en) * | 2002-03-01 | 2010-12-09 | Xencor, Inc. | Optimized Proteins that Target Ep-CAM |
| US20050246782A1 (en) * | 2002-03-22 | 2005-11-03 | Origen Therapeutics | Transgenic aves producing human polyclonal antibodies |
| US7357928B2 (en) | 2002-04-08 | 2008-04-15 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
| US7541150B2 (en) | 2002-04-08 | 2009-06-02 | University Of Louisville Research Foundation, Inc | Method for the diagnosis and prognosis of malignant diseases |
| AU2003243651B2 (en) * | 2002-06-17 | 2008-10-16 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework |
| US20040172667A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-09-02 | Cooper Richard K. | Administration of transposon-based vectors to reproductive organs |
| US7527966B2 (en) * | 2002-06-26 | 2009-05-05 | Transgenrx, Inc. | Gene regulation in transgenic animals using a transposon-based vector |
| MXPA05004022A (es) | 2002-10-17 | 2005-10-05 | Genmab As | Anticuerpos monoclonales humanos contra cd20. |
| AU2015205832A1 (en) * | 2002-10-17 | 2015-08-13 | Genmab A/S | Human Monoclonal Antibodies Against CD20 |
| AU2003290689A1 (en) | 2002-11-08 | 2004-06-03 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Transgenic ungulates having reduced prion protein activity and uses thereof |
| DE10254601A1 (de) | 2002-11-22 | 2004-06-03 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
| WO2004072115A2 (en) * | 2003-02-05 | 2004-08-26 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies |
| MXPA06000562A (es) | 2003-07-15 | 2006-03-30 | Therapeutic Human Polyclonals | Loci de inmunoglobulina humanizada. |
| WO2005019463A1 (en) * | 2003-08-11 | 2005-03-03 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Improved transgenesis with humanized immunoglobulin loci |
| EP1533617A1 (en) * | 2003-11-19 | 2005-05-25 | RMF Dictagene S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment and diagnosis of cancer |
| US7642341B2 (en) | 2003-12-18 | 2010-01-05 | Merck Serono S.A. | Angiogenesis inhibiting molecules, their selection, production and their use in the treatment of cancer |
| US8071364B2 (en) | 2003-12-24 | 2011-12-06 | Transgenrx, Inc. | Gene therapy using transposon-based vectors |
| US20060174364A1 (en) * | 2004-03-01 | 2006-08-03 | Avigenics, Inc. | Artificial chromosomes and transchromosomic avians |
| US20060123504A1 (en) * | 2004-12-07 | 2006-06-08 | Avigenics, Inc. | Methods of producing polyclonal antibodies |
| JP5128935B2 (ja) | 2004-03-31 | 2013-01-23 | ジェネンテック， インコーポレイテッド | ヒト化抗ＴＧＦ−β抗体 |
| WO2005103081A2 (en) | 2004-04-20 | 2005-11-03 | Genmab A/S | Human monoclonal antibodies against cd20 |
| US7420099B2 (en) | 2004-04-22 | 2008-09-02 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Transgenic animals and uses thereof |
| DE102004024617A1 (de) | 2004-05-18 | 2005-12-29 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung |
| CA2570086A1 (en) * | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Merial Limited | Medium and methods for culturing of avian primordial germ cells |
| JP2008512987A (ja) | 2004-07-22 | 2008-05-01 | エラスムス・ユニヴァーシティ・メディカル・センター・ロッテルダム | 結合分子 |
| CN101084317A (zh) * | 2004-10-22 | 2007-12-05 | 人类多克隆治疗公司 | 对内源免疫球蛋白表达的抑制 |
| JP2008538912A (ja) * | 2005-04-29 | 2008-11-13 | イナート・ファルマ | 遺伝子導入動物および組換え抗体の製造方法 |
| US7557190B2 (en) | 2005-07-08 | 2009-07-07 | Xencor, Inc. | Optimized proteins that target Ep-CAM |
| CN103710371B (zh) * | 2005-08-03 | 2017-03-01 | 人类多克隆治疗股份有限公司 | 表达人源化免疫球蛋白的转基因动物中b细胞凋亡的抑制 |
| EP1762575A1 (en) | 2005-09-12 | 2007-03-14 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Identification of tumor-associated antigens for diagnosis and therapy |
| EP1790664A1 (en) | 2005-11-24 | 2007-05-30 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer |
| KR101481843B1 (ko) * | 2006-01-25 | 2015-01-12 | 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담 | 형질전환 동물 내에서의 중쇄만의 항체의 생성 |
| GB0618345D0 (en) * | 2006-09-18 | 2006-10-25 | Univ Erasmus | Binding molecules |
| KR101443752B1 (ko) | 2006-03-10 | 2014-09-26 | 와이어쓰 엘엘씨 | 항-５ｔ４ 항체 및 이의 용도 |
| WO2007109747A2 (en) * | 2006-03-21 | 2007-09-27 | Wyeth | Methods and compositions for antagonism of rage |
| CN101484471B (zh) | 2006-06-30 | 2013-11-06 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 抗-nkg2a抗体及其用途 |
| WO2008003319A1 (en) | 2006-07-04 | 2008-01-10 | Genmab A/S | Cd20 binding molecules for the treatment of copd |
| SG173385A1 (en) | 2006-07-14 | 2011-08-29 | Ac Immune S A Ch | Humanized antibody against amyloid beta |
| JP5087625B2 (ja) | 2006-09-01 | 2012-12-05 | セラピューティック・ヒューマン・ポリクローナルズ・インコーポレーテッド | 非ヒトトランスジェニック動物におけるヒトまたはヒト化免疫グロブリンの発現強化 |
| US20090053210A1 (en) | 2006-09-01 | 2009-02-26 | Roland Buelow | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals |
| US8007797B2 (en) * | 2006-09-28 | 2011-08-30 | Merck Serono S.A. | Junctional adhesion molecule-C (JAM-C) binding compounds and methods of their use |
| HU0700534D0 (en) | 2006-11-24 | 2007-10-29 | Mezoegazdasagi Biotechnologiai | Transgenic animal with enhanced immune response and method for the preparation thereof |
| EP1970384A1 (en) | 2007-03-14 | 2008-09-17 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| EP1997832A1 (en) | 2007-05-29 | 2008-12-03 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer |
| AU2008255350B2 (en) * | 2007-05-31 | 2014-07-10 | Genmab A/S | Transgenic animals producing monovalent human antibodies and antibodies obtainable from these animals |
| AU2008259939B2 (en) | 2007-06-01 | 2014-03-13 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Compositions and methods for inhibiting endogenous immunoglobulin genes and producing transgenic human idiotype antibodies |
| EP2183381A1 (en) * | 2007-06-01 | 2010-05-12 | Buelow Research Enterprises Llc | Compositions and methods for producing antibodies having human idiotypes in transgenic birds |
| US8613923B2 (en) * | 2007-06-12 | 2013-12-24 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| US8048420B2 (en) | 2007-06-12 | 2011-11-01 | Ac Immune S.A. | Monoclonal antibody |
| CL2008001742A1 (es) | 2007-06-12 | 2008-11-21 | Ac Immune Sa | Anticuerpo monoclonal que reconoce un epitope conformacional y se une a peptidos amiloides solubles polimericos y peptidos amiloides oligomericos; polinucleotido que lo codifica; composicion que lo comprende; y su uso para tratar enfermedades asociados a proteinas amiloides. |
| US20100138946A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-06-03 | Origen Therapeutics | Transgenic chickens with an inactivated endogenous gene locus |
| AU2008311367B2 (en) | 2007-10-05 | 2014-11-13 | Ac Immune S.A. | Use of anti-amyloid beta antibody in ocular diseases |
| BRPI0908508A2 (pt) | 2008-01-24 | 2016-03-22 | Novo Nordisk As | anticorpo monoclonal nkg2a anti-humano humanizado |
| US8012714B2 (en) | 2008-04-14 | 2011-09-06 | Innovative Targeting Solutions, Inc. | Sequence diversity generation in immunoglobulins |
| EP2166021A1 (en) * | 2008-09-16 | 2010-03-24 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| US9150880B2 (en) * | 2008-09-25 | 2015-10-06 | Proteovec Holding, L.L.C. | Vectors for production of antibodies |
| WO2010036979A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of interferon |
| WO2010036978A2 (en) * | 2008-09-25 | 2010-04-01 | Transgenrx, Inc. | Novel vectors for production of growth hormone |
| LT2346994T (lt) | 2008-09-30 | 2022-03-10 | Ablexis, Llc | Knock-in pelė, skirta chimerinių antikūnų gamybai |
| RU2011129459A (ru) * | 2008-12-18 | 2013-01-27 | Эрасмус Юниверсити Медикал Сентр Роттердам | Трансгенные животные (не человек), экспрессирующие гуманизированные антитела, и их применение |
| FI2398902T3 (fi) | 2009-02-20 | 2023-11-28 | Astellas Pharma Inc | Menetelmiä ja koostumuksia syövän diagnoosia ja hoitoa varten |
| GB0903325D0 (en) | 2009-02-26 | 2009-04-08 | Univ Aberdeen | Antibody molecules |
| WO2010118360A1 (en) * | 2009-04-09 | 2010-10-14 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Production of proteins using transposon-based vectors |
| EP2464220A4 (en) | 2009-08-13 | 2014-05-07 | Crystal Bioscience Inc | Transgenic animal for the production of antibodies with minimal complementarity-determining regions |
| EP2322555A1 (en) | 2009-11-11 | 2011-05-18 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Antibodies specific for claudin 6 (CLDN6) |
| KR102126964B1 (ko) | 2009-11-11 | 2020-06-25 | 가니메드 파마슈티칼스 게엠베하 | 클라우딘 6 특이적 항체 |
| CN102770529B (zh) | 2009-11-17 | 2018-06-05 | Musc研究发展基金会 | 针对人核仁素的人单克隆抗体 |
| KR101553244B1 (ko) | 2009-12-10 | 2015-09-15 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 중쇄 항체를 만드는 마우스 |
| US8865462B2 (en) * | 2010-01-20 | 2014-10-21 | Crystal Bioscience Inc. | Sustained culture of avian gonocytes |
| US20130045492A1 (en) | 2010-02-08 | 2013-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods For Making Fully Human Bispecific Antibodies Using A Common Light Chain |
| US9796788B2 (en) | 2010-02-08 | 2017-10-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Mice expressing a limited immunoglobulin light chain repertoire |
| RU2724663C2 (ru) | 2010-02-08 | 2020-06-25 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Мышь с общей легкой цепью |
| EP2371864A1 (en) | 2010-03-23 | 2011-10-05 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Monoclonal antibodies for treatment of cancer |
| US9580491B2 (en) | 2010-03-31 | 2017-02-28 | Ablexis, Llc | Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies |
| EP2404936A1 (en) | 2010-07-06 | 2012-01-11 | Ganymed Pharmaceuticals AG | Cancer therapy using CLDN6 target-directed antibodies in vivo |
| US10662256B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-05-26 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| CA2806233C (en) | 2010-07-26 | 2021-12-07 | Trianni, Inc. | Transgenic animals and methods of use |
| US10793829B2 (en) | 2010-07-26 | 2020-10-06 | Trianni, Inc. | Transgenic mammals and methods of use thereof |
| CN103179981B (zh) | 2010-07-30 | 2017-02-08 | Ac免疫有限公司 | 安全和功能性的人源化抗β‑淀粉样蛋白抗体 |
| NZ606824A (en) | 2010-08-02 | 2015-05-29 | Regeneron Pharma | Mice that make binding proteins comprising vl domains |
| GB201016864D0 (en) | 2010-10-06 | 2010-11-17 | Univ Aston | Therapeutic methods |
| US9528124B2 (en) | 2013-08-27 | 2016-12-27 | Recombinetics, Inc. | Efficient non-meiotic allele introgression |
| US10920242B2 (en) | 2011-02-25 | 2021-02-16 | Recombinetics, Inc. | Non-meiotic allele introgression |
| DK3026064T3 (en) | 2011-05-13 | 2019-01-14 | Ganymed Pharmaceuticals Gmbh | ANTIBODIES FOR TREATMENT OF CANCER EXPRESSING CLAUDIN 6 |
| ES2572915T3 (es) | 2011-06-02 | 2016-06-03 | The University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Nanopartículas conjugadas a un agente antinucleolina |
| CA2835231A1 (en) | 2011-06-10 | 2012-12-13 | Corimmun Gmbh | Binding compounds to human .beta.1-adrenoreceptor (.beta.1-ar) and their use in the measurement of auto-anti-.beta.1-ar antibodies |
| MY172718A (en) | 2011-08-05 | 2019-12-11 | Regeneron Pharma | Humanized universal light chain mice |
| JP2014533930A (ja) * | 2011-09-19 | 2014-12-18 | カイマブ・リミテッド | 免疫グロブリン遺伝子多様性の操作およびマルチ抗体治療薬 |
| SG10202010120XA (en) | 2011-10-17 | 2020-11-27 | Regeneron Pharma | Restricted immunoglobulin heavy chain mice |
| WO2013104798A1 (en) | 2012-01-12 | 2013-07-18 | Cemm - Center For Molecular Medicine Of The Austrian Academy Of Sciences | Modulators of immune responses |
| PL2809150T3 (pl) * | 2012-02-01 | 2020-04-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanizowane myszy wykazujące ekspresję łańcuchów ciężkich zawierających domeny VL |
| CN104379601B (zh) | 2012-02-03 | 2021-04-09 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 双特异性抗体分子和抗原-转染的t-细胞以及它们在医药中的用途 |
| WO2013167153A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Ganymed Pharmaceuticals Ag | Antibodies useful in cancer diagnosis |
| KR102436654B1 (ko) | 2012-06-12 | 2022-08-26 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 제한된 면역글로불린 중쇄 유전자좌를 가지는 인간화된 비-인간 동물 |
| LT2840892T (lt) | 2013-02-20 | 2018-07-25 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Nežmogaus tipo gyvūnai su modifikuotomis imunoglobulino sunkiųjų grandinių sekomis |
| US10993420B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-05-04 | Erasmus University Medical Center | Production of heavy chain only antibodies in transgenic mammals |
| WO2015014376A1 (en) | 2013-07-31 | 2015-02-05 | Biontech Ag | Diagnosis and therapy of cancer involving cancer stem cells |
| WO2015025054A1 (en) | 2013-08-22 | 2015-02-26 | Medizinische Universität Wien | Dye-specific antibodies for prestained molecular weight markers and methods producing the same |
| EP3978526A1 (en) | 2013-09-05 | 2022-04-06 | AB2 Bio SA | Il-18 binding protein (il-18bp) in inflammatory diseases |
| CN105636982B (zh) * | 2013-09-16 | 2020-06-23 | 健康与环境慕尼黑德国研究中心赫姆霍茨中心（有限责任公司） | 用于治疗hbv感染和相关病症的结合免疫效应细胞表面抗原和hbv抗原的双或多特异性多肽 |
| AU2015231025A1 (en) | 2014-03-21 | 2016-09-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vl antigen binding proteins exhibiting distinct binding characteristics |
| KR102601491B1 (ko) | 2014-03-21 | 2023-11-13 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물 |
| HUE057708T2 (hu) * | 2014-05-02 | 2022-05-28 | Chiome Bioscience Inc | Sejtek humán antitestek elõállítására |
| SG11201610320RA (en) * | 2014-06-26 | 2017-01-27 | Heidelberg Immunotherapeutics Gmbh | Topical application for an anti-hsv antibody |
| EP3191136A1 (en) | 2014-09-08 | 2017-07-19 | Michaela Arndt | Construct for the delivery of a molecule into the cytoplasm of a cell |
| US20170269092A1 (en) | 2014-12-02 | 2017-09-21 | Cemm - Forschungszentrum Fuer Molekulare Medizin Gmbh | Anti-mutant calreticulin antibodies and their use in the diagnosis and therapy of myeloid malignancies |
| JP6987638B2 (ja) | 2015-02-17 | 2022-01-05 | エックスフォー・ファーマシューティカルズ（オーストリア）ゲーエムべーハー | クレブシエラ・ニューモニエのガラクタンベースのｏ抗原をターゲティングする抗体 |
| JP6959869B2 (ja) | 2015-02-23 | 2021-11-05 | シーガル セラピューティクス エスアーエス | 非天然セマフォリン３およびそれらの医学的使用 |
| US10882905B2 (en) | 2015-03-05 | 2021-01-05 | Ab2 Bio Sa | IL-18 binding protein (IL-18BP) and antibodies in inflammatory diseases |
| CN107438622A (zh) | 2015-03-19 | 2017-12-05 | 瑞泽恩制药公司 | 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物 |
| US10857237B2 (en) | 2015-05-05 | 2020-12-08 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Anti-nucleolin agent-conjugated nanoparticles as radio-sensitizers and MRI and/or X-ray contrast agents |
| SG10202006332PA (en) * | 2015-10-29 | 2020-08-28 | Hoffmann La Roche | Transgenic rabbit with common light chain |
| US10813346B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-10-27 | Trianni, Inc. | Enhanced immunoglobulin diversity |
| DK3411476T3 (da) | 2016-02-04 | 2024-07-15 | Trianni Inc | Forøget produktion af immunoglobuliner |
| EP3216458A1 (en) | 2016-03-07 | 2017-09-13 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Modified vascular endothelial growth factor a (vegf-a) and its medical use |
| AU2017300040A1 (en) | 2016-07-22 | 2019-01-24 | Deutsches Zentrum Für Neurodegenerative Erkrankungen E.V. (Dzne) | TREM2 cleavage modulators and uses thereof |
| CA3036983A1 (en) | 2016-11-21 | 2018-05-24 | Cureab Gmbh | Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates |
| WO2018136823A1 (en) * | 2017-01-19 | 2018-07-26 | Open Monoclonal Technology, Inc. | Human antibodies from transgenic rodents with multiple heavy chain immunoglobulin loci |
| JP7430636B2 (ja) * | 2017-12-05 | 2024-02-13 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 操作された免疫グロブリンラムダ軽鎖を有する非ヒト動物及びその使用 |
| EP3731865A1 (en) | 2017-12-29 | 2020-11-04 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for improving vegf-receptor blocking selectivity of an anti-vegf antibody |
| SG11202006348VA (en) | 2018-01-05 | 2020-07-29 | Ac Immune Sa | Misfolded tdp-43 binding molecules |
| CA3091646A1 (en) | 2018-02-14 | 2019-08-22 | Abba Therapeutics Ag | Anti-human pd-l2 antibodies |
| EP3768079A4 (en) * | 2018-03-21 | 2021-12-08 | Crystal Bioscience Inc. | TRANSGENIC CHICKEN WHICH PRODUCES HUMAN ANTIBODIES |
| CA3125380A1 (en) | 2019-02-18 | 2020-08-27 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animals with humanized immunoglobulin locus |
| WO2020234473A1 (en) | 2019-05-23 | 2020-11-26 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof |
| CN114531878A (zh) | 2019-06-27 | 2022-05-24 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 新颖icos抗体及包含它们的肿瘤靶向抗原结合分子 |
| AR119382A1 (es) | 2019-07-12 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos de pre-direccionamiento y métodos de uso |
| AR119393A1 (es) | 2019-07-15 | 2021-12-15 | Hoffmann La Roche | Anticuerpos que se unen a nkg2d |
| US20230295281A1 (en) | 2020-04-10 | 2023-09-21 | Vanudis GmbH | Natural antibodies in prophylaxis and therapy |
| EP4158034A4 (en) | 2020-06-02 | 2024-07-03 | Biocytogen Pharmaceuticals Beijing Co Ltd | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS HAVING A LIGHT-CHAIN IMMUNOGLOBULIN LOCUS |
| JP2023537761A (ja) | 2020-08-14 | 2023-09-05 | エイシー イミューン ソシエテ アノニム | ヒト化抗ｔｄｐ－４３結合分子およびその使用 |
| WO2022043517A2 (en) | 2020-08-27 | 2022-03-03 | Cureab Gmbh | Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation |
| CA3192306A1 (en) | 2020-10-20 | 2022-04-28 | Burkhard Ludewig | Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to gremlin-1 and uses thereof |
| CA3203328A1 (en) | 2020-12-29 | 2022-07-07 | Dimitrios TSIANTOULAS | Anti-april antibodies and uses thereof |
| MX2024005876A (es) | 2021-11-16 | 2024-05-29 | Ac Immune Sa | Moleculas novedosas para terapias y diagnostico. |
| CR20240246A (es) | 2021-12-20 | 2024-07-19 | F Hoffmann La Roche Ag | Anticuerpos agonistas anti-ltbr y anticuerpos biespecificos que los comprenden |
| TW202342519A (zh) | 2022-02-16 | 2023-11-01 | 瑞士商Ａｃ 免疫有限公司 | 人源化抗ｔｄｐ－４３結合分子及其用途 |
| WO2023166081A1 (en) | 2022-03-02 | 2023-09-07 | Heidelberg Immunotherapeutics Gmbh | Vaccine comprising an antibody or an fc-containing fusion protein comprising an fc part of an antibody |
| WO2023194565A1 (en) | 2022-04-08 | 2023-10-12 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules |
| AU2023258146A1 (en) | 2022-04-20 | 2024-09-05 | Kantonsspital St. Gallen | Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof |
| WO2024184494A1 (en) | 2023-03-08 | 2024-09-12 | Ac Immune Sa | Anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
Family Cites Families (87)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5567607A (en) | 1981-10-28 | 1996-10-22 | Incell | Method of producing transgenic animals |
| US4994384A (en) * | 1986-12-31 | 1991-02-19 | W. R. Grace & Co.-Conn. | Multiplying bovine embryos |
| US4977081A (en) | 1987-05-04 | 1990-12-11 | Adi Diagnostics, Inc. | Stable rabbit-mouse hybridomas and secretion products thereof |
| GB8714426D0 (en) * | 1987-06-19 | 1987-07-22 | Agricultural & Food Res | Culture technique |
| US5204244A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-20 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5202238A (en) * | 1987-10-27 | 1993-04-13 | Oncogen | Production of chimeric antibodies by homologous recombination |
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| US5166065A (en) * | 1988-08-04 | 1992-11-24 | Amrad Corporation Limited | In vitro propagation of embryonic stem cells |
| US5162215A (en) * | 1988-09-22 | 1992-11-10 | Amgen Inc. | Method of gene transfer into chickens and other avian species |
| GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
| US5574205A (en) * | 1989-07-25 | 1996-11-12 | Cell Genesys | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
| EP0437576B1 (en) | 1989-07-25 | 2002-07-03 | Cell Genesys, Inc. | Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts |
| EP0747485B1 (en) * | 1989-11-06 | 1998-12-02 | Cell Genesys, Inc. | Production of proteins using homologous recombination |
| US5633076A (en) * | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
| JP3068180B2 (ja) * | 1990-01-12 | 2000-07-24 | アブジェニックス インコーポレイテッド | 異種抗体の生成 |
| DE4000939A1 (de) | 1990-01-15 | 1991-07-18 | Brem Gottfried Prof Dr Dr | Verfahren zur antikoerpergewinnung |
| GB2245589A (en) | 1990-05-25 | 1992-01-08 | Medical Res Council | Culture medium for mammalian embryos |
| US5614396A (en) * | 1990-06-14 | 1997-03-25 | Baylor College Of Medicine | Methods for the genetic modification of endogenous genes in animal cells by homologous recombination |
| EP0651787A1 (en) * | 1990-07-09 | 1995-05-10 | Amrad Corporation Limited | Enhanced implantation, development and maintenance of embryos using leukaemia inhibitory factor |
| AU8212291A (en) | 1990-07-10 | 1992-02-04 | Nkk Corporation | Hybridoma which produces avian specific immunoglobulin g |
| CA2043088A1 (en) | 1990-07-26 | 1992-01-27 | Michelle M. Sims | Method of cloning mammalian embryos |
| US5874299A (en) | 1990-08-29 | 1999-02-23 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5877397A (en) * | 1990-08-29 | 1999-03-02 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| US5661016A (en) * | 1990-08-29 | 1997-08-26 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes |
| US5814318A (en) | 1990-08-29 | 1998-09-29 | Genpharm International Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| ATE158021T1 (de) * | 1990-08-29 | 1997-09-15 | Genpharm Int | Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper |
| US5633425A (en) * | 1990-08-29 | 1997-05-27 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies |
| US5789650A (en) * | 1990-08-29 | 1998-08-04 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| ATE352612T1 (de) * | 1990-08-29 | 2007-02-15 | Pharming Intellectual Pty Bv | Homologe rekombination in säugetier-zellen |
| US5545806A (en) * | 1990-08-29 | 1996-08-13 | Genpharm International, Inc. | Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5625126A (en) * | 1990-08-29 | 1997-04-29 | Genpharm International, Inc. | Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies |
| US5258307A (en) * | 1990-09-17 | 1993-11-02 | Merck & Co., Inc. | Single stage avian embryo culture process |
| AU2515992A (en) * | 1991-08-20 | 1993-03-16 | Genpharm International, Inc. | Gene targeting in animal cells using isogenic dna constructs |
| JP2961986B2 (ja) | 1991-08-22 | 1999-10-12 | 東亞合成株式会社 | ポリクローナル抗体の分離精製方法 |
| WO1993016177A1 (en) * | 1992-02-11 | 1993-08-19 | Cell Genesys, Inc. | Homogenotization of gene-targeting events |
| US5340740A (en) * | 1992-05-15 | 1994-08-23 | North Carolina State University | Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process |
| EP0583980A1 (en) | 1992-08-20 | 1994-02-23 | Eli Lilly And Company | Method for generating monoclonal antibodies from rabbits |
| WO1994007997A1 (en) | 1992-10-06 | 1994-04-14 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Long-term proliferation of primordial germ cells |
| US5453357A (en) | 1992-10-08 | 1995-09-26 | Vanderbilt University | Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same |
| WO1994014294A1 (en) | 1992-12-08 | 1994-06-23 | Linaeum Corporation | Audio transducer with flexible foam enclosure |
| US5480772A (en) * | 1993-02-03 | 1996-01-02 | Brandeis University | In vitro activation of a nucleus |
| US5496720A (en) * | 1993-02-10 | 1996-03-05 | Susko-Parrish; Joan L. | Parthenogenic oocyte activation |
| AU5290793A (en) | 1993-09-22 | 1995-04-10 | Ohio University | Mammalian cloning by embryonic stem cell (esc) nuclear transplantation and esc |
| GB2282139A (en) | 1993-09-24 | 1995-03-29 | Univ Reading | Introducing DNA into the germ line of birds |
| WO1995010599A1 (en) | 1993-10-15 | 1995-04-20 | The University Of Melbourne | Embryonic stem cell-like cells |
| GB9324007D0 (en) | 1993-11-22 | 1994-01-12 | Pharmaceutical Proteins Ltd | Pre-implantation screening |
| DE69432901T2 (de) | 1993-12-23 | 2004-05-27 | Merck & Co., Inc. | Expressionssystem von antikörpern bei homologischer rekombinierung in murinezellen |
| GB9401380D0 (en) | 1994-01-25 | 1994-03-23 | Pharmaceutical Proteins Ltd | Embryonic cell isolation |
| JP4267689B2 (ja) | 1994-08-24 | 2009-05-27 | 明治乳業株式会社 | 鳥類由来の細胞の培養方法および該培養方法によって得られた細胞系 |
| GB9417831D0 (en) | 1994-09-05 | 1994-10-26 | Biotech & Biolog Scien Res | Biological manipulation |
| FR2726003B1 (fr) | 1994-10-21 | 2002-10-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Milieu de culture de cellules embryonnaires totipotentes aviaires, procede de culture de ces cellules, et cellules embryonnaires totipotentes aviaires |
| FR2728584A1 (fr) * | 1994-12-22 | 1996-06-28 | Centre Nat Rech Scient | Procede de transfert de gene dans des cellules activees a partir d'un etat de repos |
| US6130364A (en) | 1995-03-29 | 2000-10-10 | Abgenix, Inc. | Production of antibodies using Cre-mediated site-specific recombination |
| WO1996033266A1 (en) * | 1995-04-21 | 1996-10-24 | Cell Genesys, Inc. | Generation of large genomic dna deletions |
| US5952222A (en) * | 1995-08-04 | 1999-09-14 | The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas | Functional enucleation of bovine oocytes |
| GB9517780D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| GB2331751B (en) | 1995-08-31 | 2000-01-19 | Roslin Inst | Quiescent cell populations for nuclear transfer |
| GB9517779D0 (en) | 1995-08-31 | 1995-11-01 | Roslin Inst Edinburgh | Biological manipulation |
| AU7326796A (en) | 1995-10-30 | 1997-05-22 | Spectral Diagnostics Inc. | Stable chicken b-cell line and method of use thereof |
| US5721118A (en) * | 1995-10-31 | 1998-02-24 | The Regents Of The University Of California, San Diego | Mammalian artificial chromosomes and methods of using same |
| US5771429A (en) * | 1995-10-31 | 1998-06-23 | Ricoh Company, Ltd. | Developing device capable of automatic toner content control |
| JP3799426B2 (ja) | 1995-11-20 | 2006-07-19 | 株式会社東京大学Ｔｌｏ | トランスジェニック動物の作成方法 |
| US6737248B2 (en) * | 1996-01-05 | 2004-05-18 | Human Genome Sciences, Inc. | Staphylococcus aureus polynucleotides and sequences |
| US5994619A (en) * | 1996-04-01 | 1999-11-30 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Production of chimeric bovine or porcine animals using cultured inner cell mass cells |
| US5905042A (en) | 1996-04-01 | 1999-05-18 | University Of Massachusetts, A Public Institution Of Higher Education Of The Commonwealth Of Massachusetts, As Represented By Its Amherst Campus | Cultured inner cell mass cell lines derived from bovine or porcine embryos |
| NZ334016A (en) | 1996-08-19 | 2000-08-25 | Univ Massachusetts | Embryonic stem cell lines produced by cross species nuclear transplantation |
| US6271436B1 (en) | 1996-10-11 | 2001-08-07 | The Texas A & M University System | Cells and methods for the generation of transgenic pigs |
| KR20080059467A (ko) * | 1996-12-03 | 2008-06-27 | 아브게닉스, 인크. | 복수의 ｖｈ 및 ｖｋ 부위를 함유하는 사람 면역글로불린유전자좌를 갖는 형질전환된 포유류 및 이로부터 생성된항체 |
| WO1998029532A1 (en) | 1997-01-02 | 1998-07-09 | Monash University | A method of oocyte enucleation and production of reconstituted embryos |
| US6235969B1 (en) | 1997-01-10 | 2001-05-22 | University Of Massachusetts | Cloning pigs using donor nuclei from non-quiescent differentiated cells |
| US5945577A (en) * | 1997-01-10 | 1999-08-31 | University Of Massachusetts As Represented By Its Amherst Campus | Cloning using donor nuclei from proliferating somatic cells |
| US5731367A (en) * | 1997-02-04 | 1998-03-24 | Bayer Corporation | Injection molded parts having improved surface gloss |
| GB9703550D0 (en) | 1997-02-20 | 1997-04-09 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Cell mediated transgenesis |
| US6011197A (en) * | 1997-03-06 | 2000-01-04 | Infigen, Inc. | Method of cloning bovines using reprogrammed non-embryonic bovine cells |
| US5830698A (en) * | 1997-03-14 | 1998-11-03 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same |
| US6080912A (en) | 1997-03-20 | 2000-06-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Methods for creating transgenic animals |
| WO1998057538A1 (en) | 1997-06-18 | 1998-12-23 | The Curators Of The University Of Missouri | Complete activation of mammalian oocytes |
| CN101003800A (zh) | 1997-07-03 | 2007-07-25 | 马萨诸塞大学 | 使用来自无血清饥饿的分化细胞的供体细胞核进行克隆 |
| JP2003517261A (ja) | 1997-08-04 | 2003-05-27 | ユニバシティ オブ マサチューセッツ、ア パブリック インスチチユーション オブ ハイアー エデュケイション オブ ザ コモンウエルス オブ マサチューセッツ、アズ リプリゼンテッド バイ イッツ アマースト キャンパス | Ｐｇｃの長期間培養によるトリの胚生殖（ｅｇ）細胞系の産生、クローン形成およびキメラ形成へのその利用 |
| WO1999010505A2 (en) | 1997-08-22 | 1999-03-04 | University Of Guelph | Production of proteins in eggs |
| WO1999021415A1 (en) | 1997-10-28 | 1999-05-06 | Stem Cell Sciences Pty. Ltd. | Nuclear transfer for production of transgenic animal embryo |
| US6331659B1 (en) | 1998-01-21 | 2001-12-18 | University Of Hawaii | Cumulus cells as nuclear donors |
| WO1999040213A1 (en) | 1998-02-09 | 1999-08-12 | Tranxenogen, Incorporated | Genetic manipulation of spermatogonia |
| DK1151010T3 (da) * | 1999-02-05 | 2006-01-09 | Therapeutic Human Polyclonals | Humane polyklonale antistoffer fra antigene ikke-humane dyr |
| WO2000075300A2 (en) | 1999-06-04 | 2000-12-14 | Tranxenogen, Inc. | Methods for manipulating the avian genome |
| AU7491800A (en) * | 1999-09-15 | 2001-04-17 | Therapeutic Human Polyclonals, Inc. | Immunotherapy with substantially human polyclonal antibody preparations purifiedfrom genetically engineered birds |
| US20020028488A1 (en) * | 2000-06-19 | 2002-03-07 | Sujay Singh | Transgenic avian species for making human and chimeric antibodies |
-
2001
- 2001-08-03 AU AU2001284703A patent/AU2001284703B2/en not_active Ceased
- 2001-08-03 US US09/921,819 patent/US7129084B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-08-03 EP EP08016460A patent/EP2044839A3/en not_active Withdrawn
- 2001-08-03 CA CA002422155A patent/CA2422155A1/en not_active Abandoned
- 2001-08-03 AU AU8470301A patent/AU8470301A/xx active Pending
- 2001-08-03 CN CNA018167233A patent/CN1468250A/zh active Pending
- 2001-08-03 EP EP01963780A patent/EP1311530A4/en not_active Withdrawn
- 2001-08-03 MX MXPA03001915A patent/MXPA03001915A/es active IP Right Grant
- 2001-08-03 EA EA200601715A patent/EA013564B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-03 IL IL15475101A patent/IL154751A0/xx unknown
- 2001-08-03 WO PCT/US2001/024348 patent/WO2002012437A2/en active IP Right Grant
- 2001-08-03 EA EA200300233A patent/EA007958B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-08-03 NZ NZ524523A patent/NZ524523A/en unknown
- 2001-08-03 CA CA002634294A patent/CA2634294A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-03-04 AP APAP/P/2003/002756A patent/AP2003002756A0/en unknown
- 2003-03-05 IL IL154751A patent/IL154751A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-03-07 NO NO20031054A patent/NO20031054L/no unknown
-
2006
- 2006-10-20 US US11/584,187 patent/US20070092505A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6075181A (en) * | 1990-01-12 | 2000-06-13 | Abgenix, Inc. | Human antibodies derived from immunized xenomice |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| DUVOISIN et al.: Characterization of four constant region genes of rabbit immunoglobulin-lambda chains. J. Immunol. June 1986. Vol. 136. No. 11. pages 4297-4302, see whole document * |
| HAYZER et al.: cDNA cloues encoding immunoglobulin gamma chains from rabbit expressing the pheuotype c7. Eur. J. Immunol. 1990, vol. 20, pages 2707-2712, see whole document * |
| HEIDMANN et al.: Molecular clouing of rabbit gamma heavy chain mRNA. Nuc. Acids. Res. 1982, vol. 10, No. 5, pages 1535-1545 * |
| MAGE et al.: Evolutionary conservation of splice sites in sterile C mu trasucripts and of immunoglobulin heavy chain (igh) euhaneer regions seqenuces. Mol. Immunol. 1989. Vol. 26. No. 10,. pages 1007-1010, see whole document * |
| SEHGAL et al.: Generation of the primary antibody repertoire in rabbits:expression of a diverse set of Igk-V genes may compensate for limited combinatorial diversity of the heavy chain locus. Immunogen. 1999. Vol. 50. pages 31-42, see whole document * |
Cited By (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2696202C1 (ru) * | 2008-06-25 | 2019-07-31 | ИЭсБиЭйТЕК, ЭН АЛЬКОН БАЙОМЕДИКАЛ РИСЕРЧ ЮНИТ ЭлЭлСи | Гуманизация антител кролика с использованием универсального каркаса антитела |
| US10323276B2 (en) | 2009-01-15 | 2019-06-18 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| US10077478B2 (en) | 2012-03-05 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| US10894977B2 (en) | 2012-05-08 | 2021-01-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Compositions and methods for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions |
| RU2631797C2 (ru) * | 2012-05-08 | 2017-09-26 | Эдэптив Байотекнолоджиз Корпорейшн | Композиции и способы измерения и калибровки систематической ошибки амплификации в мультиплексных пцр-реакциях |
| US10214770B2 (en) | 2012-05-08 | 2019-02-26 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Compositions and method for measuring and calibrating amplification bias in multiplexed PCR reactions |
| US10150996B2 (en) | 2012-10-19 | 2018-12-11 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| US10077473B2 (en) | 2013-07-01 | 2018-09-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags |
| US10526650B2 (en) | 2013-07-01 | 2020-01-07 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method for genotyping clonotype profiles using sequence tags |
| US10435745B2 (en) | 2014-04-01 | 2019-10-08 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific T-cells |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US11261490B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-03-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining antigen-specific T-cells |
| US10392663B2 (en) | 2014-10-29 | 2019-08-27 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Highly-multiplexed simultaneous detection of nucleic acids encoding paired adaptive immune receptor heterodimers from a large number of samples |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| US11041202B2 (en) | 2015-04-01 | 2021-06-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Method of identifying human compatible T cell receptors specific for an antigenic target |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL154751A (en) | 2009-11-18 |
| EP2044839A2 (en) | 2009-04-08 |
| EP2044839A3 (en) | 2009-07-01 |
| NO20031054L (no) | 2003-04-02 |
| EP1311530A2 (en) | 2003-05-21 |
| EA200601715A1 (ru) | 2007-02-27 |
| MXPA03001915A (es) | 2004-09-10 |
| CN1468250A (zh) | 2004-01-14 |
| AP2003002756A0 (en) | 2003-02-03 |
| EA013564B1 (ru) | 2010-06-30 |
| EA200300233A1 (ru) | 2004-02-26 |
| US20070092505A1 (en) | 2007-04-26 |
| CA2634294A1 (en) | 2002-02-14 |
| NO20031054D0 (no) | 2003-03-07 |
| NZ524523A (en) | 2006-02-24 |
| IL154751A0 (en) | 2003-10-31 |
| US7129084B2 (en) | 2006-10-31 |
| EP1311530A4 (en) | 2004-10-06 |
| WO2002012437A2 (en) | 2002-02-14 |
| AU2001284703B2 (en) | 2007-03-22 |
| WO2002012437A3 (en) | 2002-05-30 |
| AU8470301A (en) | 2002-02-18 |
| CA2422155A1 (en) | 2002-02-14 |
| US20030017534A1 (en) | 2003-01-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA007958B1 (ru) | ТРАНСГЕННЫЙ ВЕКТОР, СОДЕРЖАЩИЙ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ ЛОКУС Ig, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ | |
| US11230697B2 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| JP6705650B2 (ja) | ヒトイディオタイプを有するげっ歯類抗体をコードするポリヌクレオチド及びそれを含む動物 | |
| AU2001284703A1 (en) | Production of humanized antibodies in transgenic animals | |
| JP6073550B2 (ja) | 遺伝子操作した動物から得られるヒトポリクローナル抗体 | |
| ES2473596T3 (es) | Loci de inmunoglobulina humanizada | |
| EP1690934A2 (en) | Generation of xenogeneic antibodies | |
| CN110662421B (zh) | 来自具有多个重链免疫球蛋白基因座的转基因啮齿类动物的人抗体 | |
| US10370641B2 (en) | Enhanced expression of human or humanized immunoglobulin in non-human transgenic animals | |
| US20040158880A1 (en) | Suppression of endogenous immunoglobulin expression in transgenic non-human animals expressing humanized or human antibodies | |
| ZA200301723B (en) | Production of humanized antibodies in transgenic animals. | |
| EP1604997A1 (en) | Human polyclonal antibodies from transgenic nonhuman animals | |
| NZ749259B2 (en) | Polynucleotides encoding rodent antibodies with human idiotypes and animals comprising same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC1A | Registration of transfer to a eurasian application by force of assignment | ||
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |