CZ304424B6 - Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů - Google Patents

Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů Download PDF

Info

Publication number
CZ304424B6
CZ304424B6 CZ2003-2668A CZ20032668A CZ304424B6 CZ 304424 B6 CZ304424 B6 CZ 304424B6 CZ 20032668 A CZ20032668 A CZ 20032668A CZ 304424 B6 CZ304424 B6 CZ 304424B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
monoclonal antibody
human
antibody
light chain
mab
Prior art date
Application number
CZ2003-2668A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20032668A3 (cs
Inventor
De Acosta Del RĂ­o Cristina MarĂ­a Mateo
Valladares Josefa Lombardero
Navarro Lourdes Tatiana Roque
Requena Alejandro LĂłpez
Original Assignee
Centro De Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centro De Inmunologia Molecular filed Critical Centro De Inmunologia Molecular
Publication of CZ20032668A3 publication Critical patent/CZ20032668A3/cs
Publication of CZ304424B6 publication Critical patent/CZ304424B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001169—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/001171—Gangliosides, e.g. GM2, GD2 or GD3
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39566—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against immunoglobulins, e.g. anti-idiotypic antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3084—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated gangliosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4208—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig
    • C07K16/4241—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig
    • C07K16/4258—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig
    • C07K16/4266—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an idiotypic determinant on Ig against anti-human or anti-animal Ig against anti-receptor Ig against anti-tumor receptor Ig
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C12N5/0694—Cells of blood, e.g. leukemia cells, myeloma cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/686—Anti-idiotype
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57415—Specifically defined cancers of breast

Abstract

Řešení popisuje chimerní monoklonální protilátku odvozenou z myší antiidiotypové monoklonální protilátky 1E10, která rozpoznává myší MAb P3 a je produkována hybridomovou buněčnou linií s depozitním číslem ECACC 97112901. Tato chimerní monoklonální protilátka zahrnuje konstantní oblasti odvozené od lidských imunoglobulinů a specificky humanizované variabilní oblasti protilátky 1E10. Dále se popisují buněčné linie, které exprimují chimerní a humanizované protilátky, a farmaceutické kompozice obsahující tyto protilátky.

Description

Předložený vynález se týká oblasti biotechnologie, zejména nových rekombinantních protilátek získaných prostřednictvím genového inženýrství, konkrétně chimemích a humanizovaných protilátek získaných z myší monoklonální protilátky P3 (MAb P3) a její antiidiotypové myší monoklonální protilátky 1E10 (MAbai 1E10).
Konkrétněji se vynález týká protilátek, které se vážou na gangliosidy obsahující N-glykolylovanou kyselinu sialovou, ale nikoli s acetylovanými formami gangliosidů ani s neutrálními glykolipidy. Gangliosidy obsahující N-glykolylovanou kyselinu sialovou jsou antigeny hojně exprimované při rakovině prsu a melanomech. Na druhé straně se na experimentálních modelech prokázal protinádorový účinek MAbai 1E10.
Předložený vynález se také týká farmaceutických kompozic, které obsahují dříve popsané rekombinantní protilátky prospěšné při diagnóze a léčbě rakoviny, zejména rakoviny prsu a melanomů.
Dosavadní stav techniky
Gangliosidy jsou glykosfingolipidy, které obsahují kyselinu sialovou a jsou přítomné vplasmatické membráně buněk obratlovců (Stults a spol. (1989): Glycosphingolipids: structure, biological source and properties, Methods Enzymology, 179: 167-214}. O některých z těchto molekul se v literatuře referovalo jako o antigenech souvisejících s nádory nebo markéry nádoru (Hakomori a spol. (1991): Possible functions of tumor associated carbohydrate antigens. Curr. Opin. Immunol., 3: 646-653), a proto se použití protilátek proti gangliosidům popisovalo jako prospěšné při diagnóze a léčbě rakoviny (Hougton a spol. (1985): Mouše monoclonal antibody IgG3 antibody detecting GD3 ganglioside: to phase I trial in patients with malignant melanoma, PNAS USA, 82: 1242-1246; Zhang a spol. (1997): Selection of carbohydrate tumor antigens as targets for immune attack using immunohistochemistry. I. Focus on gangliosides, Int. J. Cancer, 73: 42-49).
Kyseliny sialové častěji exprimované u zvířat jsou A-acetyl (NeuAc) a A-glykolyl (NeuGc) (Corfield a spol. (1982): Occurrence of sialic acids, Cell. Biol. Monogr., 10: 5-50). Obecně se NeuGc neexprimuje v normálních lidských a kuřecích tkáních, ale všeobecně se vyskytuje u jiných obratlovců (Leeden a Yu, (1976): Chemistry and analysis of sialic acid. In: Biological Role of Sialic Acid. Rosemberg A. a Shengtrund C. L. (editoři). Plenům Press, New York, 148; Kawai a spol. (1991): Quantitative determination of A-glycolylneuraminic acid expression in human cancerous tissues and avian lymphoma cell lineš as a tumor associated sialic acid by gas chromatography-mass spectrometry, Cancer Research, 51: 1242-1246). Nicméně existují studie, které ukazují, že protilátky proti NeuGc rozpoznávají určité lidské nádory a nádorové buněčné linie (Higashi a spol. (1988): Detection of gangliosides as A-glycolylneuraminic acid specific tumor-associated Hanganutziu Deicher antigen in human retinoblastoma cells, Jpn. J. Cancer Res., 79: 952-956; Fukui a spol. (1989): Detection of glycoproteins as tumor associated Hanganutziu-Deicher antigen in human gastric cancer cell line, NUGC4, Biochem. Biophys. Res. Commun., 160: 1149-1154). Zvýšené koncentrace GM3 (NeuGc) gangliosidů byly nalezené v lidské rakovině prsu (Marquina a spol. (1996): Gangliosides expressed in human breast cancer, Cancer Research, 56: 5165-5171), tento výsledek činí použití této molekuly jako terče pro léčbu rakoviny přitažlivým.
Monoklonální protilátka (MAb) P3 produkovaná buněčnou linií uloženou pod přístupovým číslem ECACC 94113026 (Evropský patent EP 0 657 471 Bl) je myší monoklonální protilátka s IgM isotypem, která se získá, když se spojí myší splenocyty z myši BALB/c imunizované lipo- 1 CZ 304424 B6 somy obsahujícími GM3 (NeuGc) a tetanový toxoid s buněčnou linií P3-X63-Ag8.653; která je myším myelomem. Tato protilátka MAb P3 výrazně reaguje s gangliosidy obsahujícími Nglykolylovanou sialovou kyselinu, ale nereaguje s acetylovými formami gangliosidů ani s neutrálními glykolipidy. Pomocí imunocytochemických a imunohistochemických studií provedených s buněčnými liniemi a tkáněmi z benigních a neoplastických nádorů se prokázalo, že MAb P3 rozpoznává rakovinu prsu (Vázquez a spol. (1995): Generation of a murine monoclonal antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides that also recognizes sulfated glycolipids, Hybridoma, 14: 551-556) a melanom.
Monoklonální protilátka MAb P3 indukovala antiidiotypovou imunitní odpověď (Ab2) u myši BALB/c (syngenetický model), dokonce i bez adjuvans a proteinového nosiče, (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGc-containing ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). Úloha elektronegativních skupin, sialové kyseliny (pro gangliosidy) a SO3“ (pro sulfatidy - sulfogalaktosylceramidy), v rozpoznávacích vlastnostech této protilátky byla navržena pomocí imunochemických analýz (Mořeno a spol. (1998): Delineation of epitope recognized by an antibody specific for N-glycolylneuraminic acid-containing gangliosides, Glycobiology, 8: 695-705).
Antiidiotypová MAb 1E10 (MAbai 1E10) subtypu IgGl se získala z myši BALB/c imunizované s MAb P3 vázané na KLH (patent US 6 063 379, buněčná linie uložená pod přístupovým číslem ECACC 97112901). MAbai 1E10 rozpoznávala MAb P3 a nevázala jiné protilátky IgM proti gangliosidům. Kromě toho MAbai 1E10 inhibovala specifickou vazbu MAb P3 na GM3 (NeuGc) a na buněčnou linii MDA-MB-435 získanou z karcinomu prsních kanálků (pozitivních na vazbu MAb P3). MAbai 1E10 stimulovala silnou imunitní odpověď protilátek Ab3, když se imunizovaly myši ze syngenetických a alogenních modelů, přičemž tyto protilátky Ab3 nevykazovaly stejnou specifitu jako MAb P3, i když nesly idiotypy podobné těm, které nesla protilátka Abl (Vázquez a spol. (1998): Syngeneic anti-idiotypic monoclonal antibodies to an anti-NeuGccontaining ganglioside monoclonal antibody, Hybridoma, 17: 527-534). MAbai 1E10 stimulovala silný protinádorový účinek u syngenetické, jakož i alogenní myši. Růst buněčné linie karcinomu prsních žláz F3II se významně snížil opakovanou dávkou MAbai 1E10 vázanou na KLH ve Freundově adjuvancii, když se myš BALB/c vakcinovala. Po vakcinaci se také snížil počet spontánních plicních metastází. Intravenózní aplikace MAbai 1E10 naočkované myši C57BL/6, 10 až 14 dní po intravenózním naočkování melanomových buněk B16, způsobilo dramatické snížení počtu plicních metastází při srovnání s myší ošetřenou irelevantním IgG. Tyto výsledky naznačují, že se spouští více než jeden mechanismus protinádorového účinku (Vázquez a spol. (2000): Antitumor properties of an antiidiotypic monoclonal antibody in relation to V-glycolylcontaining gangliosides, Oncol. Rep., 7: 751-756).
I když se hybridomová technologie během 15 let rozvinula (Kohler a Milstein (1975): Continuos cultures of fused cells secreting antibody of predefined specifity, Nátuře, 256: 495—497), a kdy monoklonální protilátky jsou stále velice prospěšné při diagnózách, jakož i ve výzkumu, neprokázala se jejich terapeutická účinnost u lidí. Způsobuje to hlavně jejich krátký poločas života v krvi a to, že myší efektorové funkce selhávají pro lidský imunitní systém a také kvůli lidské imunitní odpovědi na myší protilátky (HAMA odpověď).
Převrat v eventuální užitečnosti MAb jinak způsobila technologie genového inženýrství, jelikož manipulací genů imunoglobulinů je možné získat modifikované protilátky se sníženou antigenicitou a rovněž zlepšit efektorové funkce pro léčbu nebo diagnózy určitých patologií. Způsoby snížení imunogenity imunoglobulinu mají zásadní cíl zmenšit rozdíly mezi myší protilátkou a lidským imunoglobulinem, aniž by se změnila specifita rozpoznávání antigenu (Morrison a Oi (1989): Genetically engineered antibody molecules, Adv. Immunol., 44: 65-92).
V poslední době bylo vyvinuto několik způsobů humanizace myších nebo krysích protilátek, a tím snížení xenogenní imunitní odpovědi proti cizím proteinům, když jsou vpíchnuté lidem. Jedním z prvních přístupů ke snížení antigenicity byly chimemí protilátky, ve kterých se variabil-2CZ 304424 B6 ní domény myšího proteinu vložily do konstantních domén lidských molekul, které vykazují stejnou specifítu, ale sníženou imunogenitu ve srovnání s jejich myšími protějšky, přičemž se zachovaly humánní efektorové funkce chimemích protilátek, (Morrison a spol. (1984): Chimeric human antibody molecules: Mouše antigen-binding domains with human constant region domains, PNAS USA, 81: 6851-6855). I když chimemí protilátky mají stejnou specifítu jako myší protějšky, běžně se pozorovala imunitní odpověď na hlodavci variabilní oblasti.
Při pokusu o další snížení imunogenity chimemích protilátek, se transplantovaly pouze oblasti determinující komplementaritu (CDR) z hlodavci monoklonální protilátky do oblastí lidských základních zbytků a tato hybridní variabilní oblast se exprimovala s lidskými konstantními oblastmi (Jones a spol. (1986): Replacing the complementary-determining regions in a human antibody with those from a mouše, Nátuře, 321: 522-524; Verhoeyen a spol. (1988): Reshaping human antibodies: grafting an antilysozyme activity, Science, 239: 1534-1536). Tento postup měl nicméně několik nedostatků: výsledná protilátka měla běžně sníženou afinitu a řada základních zbytků se musela pro obnovení vazby zpětně mutovat na odpovídající myší systémy (Rietchmann a spol. (1988): Reshaping human antibodies for therapy, Nátuře, 332: 323-327; Queen a spol. (1989): A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor, PNAS UAS, 86: 10029-10033; Tempest a spol. (1991): Reshaping a human monoclonal antibody to inhibit human respirátory syncytial virus infection in vivo, Biotechnology, 9: 266-272). Kromě toho se běžně pozorovalo, že imunogenita přetrvávala v protilátkách s transplantovanými CDR.
Mateo a spolupracovníci (patent US 5 712 120) popsali způsob snížení imunogenity myších protilátek. Podle tohoto způsobu se modifikace omezují na variabilní domény a konkrétně na myší oblasti základní struktury (FR) chimemích protilátek. Kromě toho se záměny provádějí pouze v těch oblastech FR, které mají amfípatické sekvence, a proto jsou možnými epitopy rozpoznatelnými T buňkami. Způsob zahrnuje uvážlivou záměnu několika málo zbytků aminokyselin lokalizovaných v potenciálních imunogenních epitopech za odpovídající zbytky z lidské sekvence s nejvyšší homologií, musí se však uchovat aminokyseliny, které jsou hlavně odpovědné za kanonické struktury a také zbytky v bezprostředním sousedství oblastí CDR nebo ve Vemierově zóně.
Výsledná protilátka si uchovává svoji specifítu vazby antigenů a je méně imunogenní než buď její myší, nebo chimemí předchůdce (Mateo a spol. (2000): Removal of T cell epitopes from genetically engineered antibodies: Production of modified immunoglobulins with reduced immunogenicity, Hybridoma, 19: 463-471), což jsou vlastnosti, které zvyšují jejich terapeutickou užitečnost. Použitím tohoto nového způsobu se musí provést pouze několik málo mutací a samozřejmě méně genových manipulací.
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu jsou rekombinantní protilátky získané technologií genového inženýrství. Konkrétně je předmětem vynálezu chimemí monoklonální protilátka odvozená z myší anti-idiotypové monoklonální protilátky 1E10, kde tato myší protilátka 1E10 rozpoznává myší MAb P3 a je produkována hybridomovou buněčnou linií s depozitním číslem ECACC 97112901, a kde tato chimemí monoklonální protilátka zahrnuje
a. konstantní oblast těžkého řetězce obsahující sekvenci aminokyselin gama-1 řetězce a konstantní oblast lehkého řetězce obsahující sekvenci aminokyselin kapa řetězce, obě odvozené z lidských imunoglobulinů,
b. hypervariabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců obsahující následující sekvence:
-3 CZ 304424 B6
TĚŽKÝ ŘETĚZEC CDR1: SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3: EDYYDNSYYFDY
LEHKÝ ŘETĚZEC
CDR1: RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT
c. úseky základní struktury (FR) těžkých a lehkých řetězců obsahující následující sekvence:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
FR 1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV
LEHKÝ ŘETĚZEC
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK, a
d. pro další humanizaci a zachování vazebných vlastností k antigenu zahrnuje variabilní oblast protilátky přinejmenším jednu z následujících substitucí:
LEHKÝ ŘETĚZEC pozice 7 ve FR1: Thr za Ser pozice 8 ve FR1: Thr za Pro pozice 15 ve FR1: Leu za Val
TĚŽKÝ ŘETĚZEC pozice 5 ve FR1: Gin za Val pozice 5 ve FR2: Arg za Ala pozice 7 ve FR2: Glu za Gly pozice 21 ve FR3: Thr za Arg
V dalším aspektu jsou předmětem předloženého vynálezu buněčné linie, které exprimují popsané chimemí a humanizované protilátky. Předmětem předloženého vynálezu jsou navíc farmaceutické kompozice obsahující popsané protilátky.
-4CZ 304424 B6
Výhodně jsou předmětem vynálezu farmaceutické kompozice pro léčbu nádorů prsu, plic, trávicí soustavy, urogenitálního systému, melanomů, sarkomů a neuroektodermatických nádorů, jejich metastází a relapsů obsahující popsané protilátky a vhodnou pomocnou látku.
Dalším předmětem reprezentace předloženého vynálezu je možnost použít farmaceutické kompozice pro lokalizaci a diagnózy nádorů, prsu, plic, trávicí soustavy, urogenitálního systému, melanomů, sarkomů a neuroektodermatických nádorů, jejich metastází a relapsů in vivo.
Syntéza cDNA a amplifikace genu pomocí PCR (řetězové polymerasové reakce) variabilních oblastí MAb P3 a MAbai 1E10.
Cytoplasmatická RNA se extrahovala z asi 106 buněk hybridomu P3 (myší IgM MAb, která rozpoznává GM3 N-glykolovaný gangliosid) nebo 1E10 (protilátka antiidiotypu proti P3). RNA se extrahovala s použitím reagencie TRIZOL (GIBCO BRL, Grand Island, NY), podle instrukcí výrobce.
Reakce syntézy cDNA se provedla smíšením 5 pg RNA, 25 pmolů VH (komplementární ke konstantní oblasti myší IgM pro VH P3 a ke konstantní oblasti myší IgGl pro VH 1E10) nebo VK (komplementární ke konstantní myší kapa oblasti pro obě protilátky), 2,5mM každého dNTP, 50mM Tris-HCl pH 7,5, 75mM KC1, lOmM DTT, 8mM MgCl2 a 15 jednotek inhibitoru RNA polymerasy v 50 pL reakční směsi. Deset minut se směs zahřívala na 70 °C a pomalu se ochladila na 37 °C. Potom se přidalo 100 jednotek enzymu ML V reversní transkriptasy a inkubace pokračovala při 42 °C jednu hodinu.
Variabilní oblasti VK a VH cDNA se amplifikovaly pomocí PCR. Krátce, 5 pL cDNA VH nebo VK se smíchalo s 25 pmoly specifických příměrů, 2,5mM každé dNTP, 5 pL složek 10X pufru Taq DNA polymerasy a 1 jednotkou tohoto enzymu. Vzorky se podrobily 25 teplotním cyklům při 94 °C, 30 sekund; při 50 °C 30 sekund; při 72 °C, 1 minutu a poslední inkubaci při 72 °C po dobu 5 minut.
Klonování a sekvenování amplifikované cDNA.
PCR produkty VH a VK (z P3 a z 1E10) se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Promega, USA). Výsledné klony se sekvenovaly pomocí dideoxy způsobu s použitím T7 DNA polymerasy (T7 sekvenovací souprava, Pharmacia, Švédsko).
Konstrukce chimemích genů.
Geny VH a VK se vystřihly z TA vektorů enzymatickou digescí a klonovaly se do odpovídajících expresních vektorů (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaction, J. Immunol. Meth., 152: 89104).
Geny VH se vystřihly z TA vektoru pomocí enzymatické digesce s EcoRV a Nhel a klonovaly se do expresního vektoru (PAH 4604), který zahrnoval variabilní region lidské IgGl a geny resistentní k histidinolu. Výsledné konstrukce byly P3VH-PAH4604 a 1E10VH-PAH4604. Geny VK se vystřihly z TA vektoru pomocí enzymatické digesce s EcoRV a Sáli a klonovaly se do expresního vektoru (PAG4622). Tento vektor obsahoval geny resistence k mykofenolové kyselině a lidskou kapa konstantní oblast. Výsledné konstrukce byly P3VK-PAG4622 a 1E10VK-PAG4622.
-5 CZ 304424 B6
Exprese chimemích protilátek získaných z MAb P3 a MAbid 1E10.
Buňky NS-0 se podrobily elektroporaci s 10 pg P3VK-PAG4622 nebo 1E10VK-PAG4622, klony exprimující lidské kapa lehké řetězce se transfektovaly s 10 pg P3VH-PAH4604 nebo 1E10VH-PAH4604.
DNA se linearizovaly digescí s enzymem Pvul, precipitovaly ethanolem a rozpustily v 50 pL PBS. Odstředěním se sklidilo přibližně 107 buněk a resuspendovaly se v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po desetiminutovém ponechání v ledu byly buňky vystaveny impulzu 200 Voltů a 960 pF a ponechaly se na ledu dalších deset minut. Buňky se distribuovaly na 96 jamkovou destičku s D'MEM F12 s 10% fetálním telecím sérem. Po dvou až čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL mykofenolové kyseliny nebo ÍOmM histidinolem). Transfektované klony byly po 14 dnech viditelné pouhým okem.
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících transfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se smočily kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem tlumený roztok obsahující 0,05 % Tweenu 20) se na jednu hodinu při 37 °C přidalo do každé mikrotitrační jamky zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty. Jamky se promyly s PBS-T a přidala se kozí protilátka proti lidskému kapa lehkému řetězci konjugovaná s křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) konjugovaný s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo 77-nitrofenyl-fosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Konstrukce humanizovaných protilátek P3hu a lElOhu pomocí humanizace epitopů T buněk. Predikce epitopů T buněk.
Sekvence variabilních oblastí P3 a 1E10 se analyzovaly algoritmem AMPHI (Margalit a spol. (1987): Prediction of immunodominant helper T cell antigenic sites from the primary sequence, J. Immunol., 138: 2213-2229). Vyhledávaly se spirálovité amfipatické segmenty se sedmi nebo jedenácti zbytky aminokyselin, které byly spojené s T imunogenitou. Program SOHHA také předpovídal spirálovité hydrofobní segmenty. (Elliot a spol. (1987): An hypothesis on the binding of an amphipathic, alpha helical sequence in li to the desotope of class II antigen, J. Immunol., 138: 2949-2952). Oba programy předpovídají, které segmenty ze sekvencí variabilní oblasti protilátky P3 a 1E10 by mohly být prezentovány T pomocným buňkám v kontextu molekul MHC třídy II.
Analýza homologie s lidskými imunoglobuliny.
Sekvence aminokyselin myších variabilních oblastí se porovnaly se sekvencemi imunoglobulinů v databázích GeneBank a EMBL (přístupných na internetu). Pro každou protilátku se stanovily lidské variabilní oblasti s nejvyšší homologií. Pro vyhledávání homologie sekvencí se použil software PC-TWO HIBIO PROSIS 06-00.
Analýza snížení imunogenity.
Cílem způsobuje snížení imunogenity zmírněním nebo humanizováním potenciálních imunogenních T epitopů s minimálními změnami. Způsob zahrnuje uvážlivé nahrazení několika málo zbytků aminokyselin umístěných v spirálovitých amfipatických segmentech. Aminokyseliny, které hlavně odpovídají za kanonické struktury a také zbytky v bezprostředním sousedství sekvencí CDR nebo ve Vemierově zóně, se musí zachovat.
-6CZ 304424 B6
Sekvence myší variabilní oblasti se podle tohoto způsobu porovnaly s lidskými sekvencemi s nejvyšší homologií a identifikovaly se rozličné zbytky aminokyselin v každé pozici mezi myší MAb a lidskou sekvencí s nejvyšší homologií, přičemž se braly do úvahy pouze zbytky ve FR (Kabat a spol. (1991), Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), a předtím definované zbytky se nahradily těmi zbytky, které se nacházejí v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Nahrazení se provedlo řízenými technikami mutageneze.
Zbytky zapojené do třírozměrné struktury vazebného místa se nemutovaly; mohly by ovlivnit rozpoznání antigenů. Další informace o vlivu náhrad v terciární struktuře lze získat molekulárním modelováním vazebného místa antigenů.
Musí se pamatovat na přítomnost zbytků prolinu ve spirálovitém amfipatickém segmentu a na skutečnost, že určité myší zbytky se neobjeví ve stejné pozici v lidské sekvenci s nejvyšší homologií, ale jsou hojné v dalších lidských imunoglobulinech. Z tohoto důvodu neexistuje jedinečný soubor myších aminokyselin, který by se vyměnil v systémech. Je možné získat rozličné verze modifikované protilátky s rozličným počtem náhrad. Mutace se prováděly překrývajícími se reakcemi PCR.
Klonování a exprese humanizovaných protilátek P3hu a lElOhu.
Genové konstrukce odpovídající P3hu a lEÍOhu se klonovaly expresními vektory způsobem popsaným pro chimemí protilátky. Výsledné konstrukce byly P3VKhu-PAG4622 nebo lE10VKhu-PAG4622 a P3VHhu-PAH4604 a lE10VHhu-PAH4604. Tyto konstrukce se transfektovaly do buněk NS-0 podle dříve popsaného protokolu pro chimemí protilátky.
Čištění rekombinantních protilátek.
Rekombinantní protilátky se čistily s použitím afinitní chromatografie s proteinem A (Pharmacia, Upssala, Švédsko).
Biologická aktivita.
Biologická aktivita rekombinantních protilátek se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELIS A.
Pro rekombinantní MAb P3 se mikrotitrační destička potáhla GM3(NeuGc) gangliosidem v methanolu. Po jednohodinovém sušení se nespecifické vazby blokovaly 1% hovězím sérovým albuminem (BSA) v Tris-HCl pufru inkubací po dobu jedné hodiny při 37 °C. Jamky se promyly PBS a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb P3. Jamky se promyly Tris-HCl a přidala se kozí antilidská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Nakonec se jamky promyly a přidal se substrátový pufr obsahující p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřily absorbance při 405 nebo 492 nm.
Pro rekombinantní MAbai 1E10 byla zkouška ELIS A podobná, s výjimkou, že se jamky potáhly MAb P3 a promývání se provádělo v PBS s 0,05 % Tweenu 20.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: VHP3 DNA a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDRjsou vyznačeny čárami.
-7CZ 304424 B6
Obr. 2: VKP3 a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 3: VHP3 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněna tučně.
Obr. 4: VKP3 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněna tučně.
Obr. 5: Specifická vazba chimemí MAb P3 kGM3 (NeuGc). Rozličné koncentrace MAb P3 aMAb TI (negativní kontrola) se testovaly pomocí ELIS A. Mikrotitrační destičky se potáhly gangliosidy GM3(NeuGc) a GM3(NeuAc) (negativní kontrola) v methanolu a měřila se specifická vazba. (Značení bodů: ♦ - GM3-P3, - chimemí GM3(NeuGc)-P3, A - chimemí GM3(NeuGc)-Tl, · - chimemí GM3-T1).
Obr. 6: VH1E10 DNA a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 7: VK1E10 a dedukované sekvence aminokyselin. Sekvence jsou seřazeny podle Kabatova číslování (Kabat a spol. (1991): Sequences of proteins of immunological interest, páté vydání, National Institute of Health), příslušné sekvence CDR jsou vyznačeny čárami.
Obr. 8: VH1E10 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 9: VK1E10 se přidaly k lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Amfipatické segmenty jsou podtrženy a sekvence CDR jsou zvýrazněny tučně.
Obr. 10: Specifická vazba myší MAb P3 chimemí MAb 1 El0. Rozličné koncentrace MAb 1E10 a MAb C5 (negativní kontrola) se testovaly pomocí ELISA. Mikrotitrační destičky se potáhly MAb P3 a MAb A3 (negativní kontrola) a měřila se specifická vazba. (Značení bodů: ♦ chimemí MAb P3-1E10, - chimemí MAB A3-1E10, ▲ - chimemí MAb P3-C5, x - chimemí MAb A3-C5).
Příklady provedení vynálezu
V následujících příkladech se všechny použité enzymy, jakož i reagencie a materiály získaly z komerčních zdrojů, pokud se neuvádí něco jiného.
Příklad 1: Získání chimemí MAb P3.
syntéza cDNA se provedla reakcí s enzymem reversní transkriptasou, když se vycházelo z RNA z hybridomu, který produkuje MAb P3, jak se popsalo výše. Sekvence specifických primerů použitých v této reakci byly:
-8CZ 304424 B6
Pro VH:
5' AGGTCTAGAA (CT) CTCCACACACAGG (AG) (AG) CCAGTGGATAGAC 3 '
Pro VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG 3' cDNA VHP3 a cDNA VKP3 se amplifíkovaly pomocí PCR s použitím Taq Polymerasy a specifických primerů. Restrikční místa zahrnutá v primerech byly ECORV/NHEI pro VH a
ECORV/SALI pro VK. Použité příměrové sekvence byly následující:
Pro VH:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3' Primer 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGCAGAGACAGTGACCAGAGT 3'
Pro VK:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGGAG (TA) CACA(GT) (TA) CTCAGGTCTTT (GA) T 3 ' Primer 2 (Ck) :
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
PCR produkty se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Invitrogen). Dvanáct nezáio vislých klonů se sekvenovalo dideoxy způsobem s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Vyhledávací analýzou homologie se stanovila sekvenční skupina s nejvyšší homologií pro VHP3 a VKP3.
Sekvence VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) mají vysokou homologií s odpovídajícími skupinami IB a V podle Kabatovy klasifikace.
Po digesci s restrikčními enzymy ECORV a NHEI pro VHP3 a ECORV a SÁLI pro VKP3 se klonovaly v expresních vektorech, které se dříve digestovaly se stejnými enzymy, PAH4604 pro VH a PAG4622 pro VK. Tyto expresní vektory vhodné pro expresi imunoglobulinů v savčích buňkách byly darem od Sheria Morrison (UCLA, Kalifornie, USA). Vektor PAH 4604 zahrnoval lidskou konstantní oblast IgGl a PAG 4622 lidskou variabilní oblast (Coloma a spol. (1992):
Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaktion, J. Immunol. Meth., 152: 89-104). Výsledné konstrukty byly P3VHPAH4604 a P3VK-PAG4622.
Buňky NA-0 se transfekovaly s 10 pg P3VK-PAG4622, klon exprimující lehký řetězec se trans25 fekoval s 10 pg P3VH-PAH4604, v obou případech se DNA před transfekcí linearizovala Pvul, precipitovala ethanolem a rozpustila v 50 pL PBS.
Přibližně 107 buněk se sklidilo centrifugací a resuspendovalo se v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po uložení na deset minut na led byly buňky vysta30 vény pulzu 200 V a 960 pF a ponechaly se v ledu dalších deset minut. Buňky se rozdělily do 96 jamek destičky s D'MEM F12 s 10% fetálním telecím sérem. Po dvou nebo čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolové nebo lOmM histidinolem). Transfektované klony byly viditelné po čtrnácti dnech pouhým okem.
-9CZ 304424 B6
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících transfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se potáhly kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem tlumený roztok obsahující 0,05 % Tweenu 20) se do každé mikrotitrační jamky při 37 °C na jednu hodinu přidalo zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty. Jamky se promyly PBST a přidala se kozí protilátka proti lidskému kapa lehkému řetězci konjugovaná s křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) konjugovaný s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při laboratorní teplotě. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo /7-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Příklad 2: Získání rozličných verzí humanizované protilátky P3.
Sekvence myších VHP3 a VKP3 (obr. 1 a 2) se porovnaly s lidskými sekvencemi. Na obr. 3 a 4 jsou ukázané lidské sekvence s nej vyšší homologii. Spirálovité amfipatické oblasti nebo potenciální T buněčné epitopy se vyhledávaly v sekvencích myší P3 variabilní oblasti a ve shodě se způsobem uvážlivé strategie se stanovily náhrady aminokyselin, aby se narušily nebo humanizovaly potenciální T buněčné epitopy v myších sekvencích.
Analýza VHP3 poskytla (obr. 3) dva amfipatické segmenty, první zahrnoval CDR1, FR2 a několik zbytků CDR2, druhý zahrnoval konec FR3 a CDR3. Hlavní rozdíly myších sekvencí ve srovnání s lidskými sekvencemi s nejvyšší homologii byly nalezeny v sekvencích CDR nebo zbytcích zapojených do třírozměrné struktury vazebného místa. Z tohoto důvodu bylo rozhodnuto nenahrazovat žádnou aminokyselinu v myším VHP3.
Analýza VKP3 poskytla také dva amfipatické segmenty (obr. 4), první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR2 a několik zbytků FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 8,9, 10, 11 a 13 za zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nejvyšší homologii. Aminokyseliny His, Lys, Phe, Met a Thr se nahradily aminokyselinami Pro, Ser, Ser, Leu a Ala. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid Insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., \T. 5404) s použitím primerů 1, 2, 3, 4, sekvence kterých jsou následující:
Primer 1:
5' ATGACCCAGTCTCCTTCTTCTCTTTCCGCGTCAGTAGGAGAC 3'
Primer 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Primer 3:
5' gtctcctactgacgcggaaagagaagaagGagactgggtcat 3'
Primer 4:
' GGGGATATCCACCATGGAG (TA) CACA (GT) (TA) CTCAGGTCTTT (GA) T 3'
Body mutace se verifikovaly sekvenováním. Výsledný konstrukt byl P3VK.hu a klonoval se do expresního vektoru PAG 4662. Výsledný konstrukt byl P3VKhu-PAH4622. Pro expresi humanizované protilátky P3 se buňky NS-0 transfektovaly s P3VH-PAH4604 a P3VKhu-PAH4622.
Protilátka P3hu se transfektovala podle stejného postupu elektroporace a detekce, jak se popisuje výše pro chimemí protilátky.
-10CZ 304424 B6
Příklad 3: Biologická aktivita chimemí MAb P3.
Biologická aktivita chimemí PAb P3 se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELISA.
Pro rekombinantní MAb P3 se mikrotitrační destička potáhla gangliosidem GM3 (NeuGc) v methanolu. Po jednohodinovém sušení při 37 °C se nespecifické vazby blokovaly 1% hovězím sérovým albuminem (BSA) v Tris-HCl pufru inkubací po dobu jedné hodiny při 37 °C. Jamky se promyly PBS a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb P3. Jamky se promyly Tris-HCl a přidala se kozí anti-lidská protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Nakonec se jamky promyly s Tris-HCl a přidal se substrátový pufr obsahující p-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřila absorbance při 405 nm.
Jako negativní kontrola se použila chimemí MAb TI. Specifickou vazbu chimemí MAb P3 na antigen ukazuje obr. 5.
Příklad 4: Získání chimemí MAb 1E10.
Syntéza cDNA se provedla reakcí s enzymem reversní transkriptasou, když se vycházelo z RNA zhybridomu, který produkuje MAb 1E10, jak se popsalo výše. Sekvence specifických primerů použitých v této reakci byly:
Pro VH:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Pro VK:
5' GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGGA 3' cDNA VH1E10 a cDNA VK1E10 se amplifikovaly pomocí PCR s použitím Taq Pol a specifických primerů.
Pro VH:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3' Primer 2 (CH1):
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Pro VK:
Primer 1 (signální peptid):
5' GGGGTTAACCACCATGAGG (GT) CCCC (AT) GCTCAG (CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3 ' Primer 2 (Ck):
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT) GTCCC 3'
PCR produkty se klonovaly do TA vektoru (TA klonovací souprava, Invitrogen). Dvanáct nezávislých klonů se sekvenovalo (obr. 7 a 8) dideoxy způsobem s použitím T7 DNA Pol (Pharmacia). Vyhledávací analýzou homologie se stanovila sekvenční skupina s nejvyšší homologií pro
-11 CZ 304424 B6
VH1E10 a VK1E10. Sekvence VH1E10 a VK1E10 mají vysokou homologií s odpovídajícími různorodými skupinami a V podle Kabatovy klasifikace.
Po digesci s restrikčními enzymy ECORV a NHEI pro VH1E10 a s HincII a SÁLI pro VK1E10 se klonovaly v expresních vektorech po dřívější digesci se stejnými enzymy, PAH4604 pro VH a PAG4622 pro VK. Tyto expresní vektory vhodné pro expresi imunoglobulinů v savčích buňkách byly darem od Sherie Morrison (UCLA, Kalifornie, USA). Vektor PAH 4604 zahrnoval lidskou konstantní oblast IgGl a PAG 4622 lidskou variabilní oblast (Coloma a spol. (1992): Novel vectors for the expression of antibody molecules using variable regions generated by polymerase chain reaktion, .1 Immunol. Meth., 152: 89-104). Výsledné konstrukty byly 1E10VH-PAH4604 a 1E10VK-PAG4622.
Buňky NA-0 se transfektovaly s 10 pg 1E10VK-PAG4622, klon exprimující lehký řetězec se transfektoval s 10 pg 1E10VH-PAH4604, v obou případech se před transfekcí DNA linearizovala Pvul, precipitovala ethanolem a rozpustila v 50 pL PBS.
Přibližně 107 buněk se sklidilo centrifugací a resuspendovalo v 0,5 mL PBS společně s digestovanou DNA v kyvetě pro elektroporaci. Po uložení na deset minut na led se buňky vystavily pulzu 200 V a 960 pF a ponechaly se v ledu dalších deset minut. Buňky se rozdělily do 96 jamek destičky s D'MEM F12 s 10% fetálním telecím sérem. Po dvou nebo čtyřech dnech se přidalo selektivní médium (D'MEM F12 s 0,45 pg/mL kyseliny mykofenolové nebo lOmM histidinolem). Transfektované klony byly viditelné po čtrnácti dnech pouhým okem.
Přítomnost lidské protilátky v médiu jamek obsahujících transfektované klony se měřila pomocí ELISA. Jamky mikrotitrační destičky se potáhly kozími protilátkami proti lidskému kapa lehkému řetězci (pro klony produkující lidský kapa řetězec) nebo protilátkami proti lidskému IgG (specifický pro gama řetězec) (pro klony produkující kompletní protilátku). Po promytí s PBST (slaný fosfátem tlumený roztok obsahující 0,05 % Tween 20) se do každé mikrotitrační jamky při 37 °C na jednu hodinu přidalo zředěné kultivační médium z jamek obsahujících transfektanty. Jamky se promyly PBST a přidala se kozí protilátka proti lidskému kapa lehkému řetězci konjugovaná s křenovou peroxidasou nebo kozí anti-lidský IgG (specifický pro gama řetězec) konjugovaný s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při laboratorní teplotě. Jamky se promyly PBS-T a přidal se substrátový pufr obsahující o-fenylendiamin nebo /7-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se měřila absorbance při 492 nebo 405 nm.
Příklad 5: Získání rozličných verzí humanizované protilátky 1E10.
Sekvence myší VH1E10 a VK1E10 (obr. 6 a 7) se porovnaly s lidskými sekvencemi. Lidské sekvence s nejvyšší homologií ukazují obr. 8 a 9. Spirálovité amfípatické oblasti nebo potenciální T buněčné epitopy se vyhledávaly v sekvencích myší 1E10 variabilní oblasti a ve shodě se způsobbem uvážlivé strategie se stanovily náhrady aminokyselin, aby se narušily nebo humanizovaly potenciální T buněčné epitopy v myších sekvencích.
Analýza VH1E10 poskytla (obr. 8) tři amfípatické segmenty, první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval FR2 a třetí zahrnoval FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 5, 40, 42 a 87 (83 podle Kabatova číslování) zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nevyšší homologií. Aminokyseliny Gin, Arg, Glu a Thr se nahradily aminokyselinami Val, Ala, Gly a Arg. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím rozličných sad primerů.
Primery pro mutaci v pozici 5 těžkého řetězce byly 1, 2, 3 a 4, sekvence, kterých jsou následující:
- 12CZ 304424 B6
Primer 1:
5' CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCT 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' AGCTCCAGACTGCACCAGCTGAACCTG 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA)AT (CG) CTCTT 3' Po ověření pomocí sekvence bodu mutace v pozici 5, se zavedly mutace v pozicích 40 a 42.
Primer pro mutace v pozicích 40 a 42 těžkého řetězce:
Primer 1:
5' TGGGTGAGGCAGGCGCCTGGGCAGGGACTTGAG 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' CTCAAGTCCCTGCCCAGGCGCCTGCCTCACCCA 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3'
Po ověření pomocí sekvence bodu mutace v pozicích 40 a 42, se zavedla mutace v pozici 87 (83 ío podle Kabatova číslování).
Primer pro mutace v pozici 87 (83 podle Kabatova číslování) těžkého řetězce:
5' CTCAGCAGGCTGCGGTCTGAGGACTCT 3'
Primer 2:
5' GGGGCTAGCTGAGGAGACTGTGAGAGTGGT 3'
Primer 3:
5' AGAGTCCTCAGACCGCAGCCTGCTGAG 3'
Primer 4:
5' GGGGATATCCACCATGG (AG) ATG (CG) AGCTG (TG) GT (CA) AT (CG) CTCTT 3 '
Další náhrady se neprovedly, protože zbytky byly zapojeny v třírozměrné struktuře vazebného místa.
Body mutace se verifikovaly sekvenováním. Výsledný konstrukt byl lElOVHhu a klonoval se 20 v PAH4604 expresním vektoru. Výsledný konstrukt byl 1E10VH-PAH4604.
Analýza pro VK1E10 poskytla také tři amfipatické segmenty (obr. 9), první zahrnoval FR1, druhý zahrnoval CDR1 a třetí zahrnoval FR3. Bylo rozhodnuto nahradit zbytky v pozicích 7, 8
- 13 CZ 304424 B6 a 15 zbytky ve stejných pozicích v lidské sekvenci s nejvyšší homologií. Aminokyseliny Thr, Thr a Leu se nahradily aminokyselinami Ser, Pro a Val. Nahrazení se provedlo překryvnou PCR (Kammann a spol. (1989): Rapid insertional mutagenesis of DNA by polymerase chain reaction (PCR), Nucleic Acids Res., 17: 5404) s použitím primerů 1, 2, 3 a 4, kterých sekvence jsou následující:
Primery pro mutace v pozicích 7, 8 a 15 lehkého řetězce:
Primer 1:
5' CAGATGACACAGTCTCCTTCCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTC 3 ' Primer 2:
5' AGCGTCGACTTACGTTT(TG)ATTTCCA(GA)CTT(GT)GTCCC 3'
Primer 3:
5' GACTCTGTCTCCCACAGAGGCAGACAGGGAGGAAGGAGACTGTGTCATCTG 3 '
Primer 4:
5' GGGGTTAACCACCATGAGG(GT)CCCC(AT)GCTCAG(CT)T(CT)CT(TG)GG(GA) 3'
Body mutací se ověřily sekvenováním. Výsledný konstrukt byl lElOVKhu a klonoval se v expresním vektoru PAG 4622. Výsledný konstrukt byl lE10VKhu-PAG4662.
Pro expresi humanizované protilátky 1E10 se buňky NS-0 transfektovaly lE10VHhu-PAH4604 a lE10VKhu-PAG4662.
Protilátka lElOhu se transfektovala stejným postupem elektroporace a detekce, jak byl výše popsán pro chimemí protilátky.
Příklad 6: Biologická aktivita chimemí MAb 1E10.
Biologická aktivita chimemí MAb 1E10 se testovala měřením specifické vazby na antigen pomocí ELISA.
Pro rekombinantní MAb 1E10 se mikrotitrační destička potáhla MAb P3. Po promytí sPBST (roztok solného fosfátového pufru obsahující 0,05 % Tweenu 20) se nespecifické vazby blokovaly 1% hovězím sérovým albuminem (BSA) vPBST inkubací po dobu jedné hodiny při 37 °C. Jamky se promyly a jednu hodinu inkubovaly při 37 °C s vyčištěnou rekombinantní MAb 1E10. Jamky se promyly PĚST a přidala se antilidská kozí protilátka konjugovaná s alkalickou fosfatasou a jednu hodinu se inkubovaly při 37 °C. Nakonec se jamky promyly PBST a přidal se substrátový pufr obsahující /5-nitrofenylfosfát. Po půl hodině se změřily odpovídající absorbance při 405 nm.
Jako negativní kontrola se použila chimemí MAb C5. Specifickou vazbu chimemí MAb 1E10 na MAb P3 ukazuje obr. 10.

Claims (5)

1. Chimemí monoklonální protilátka odvozená z myší anti-idiotypové monoklonální protilátky 1E10, kde tato myší protilátka 1E10 rozpoznává myší MAb P3 a je produkována hybridomovou buněčnou linií s depozitním číslem ECACC 97112901, a kde tato chimemí monoklonální protilátka zahrnuje
a) konstantní oblast těžkého řetězce obsahující sekvenci aminokyselin gama-1 řetězce a konstantní oblast lehkého řetězce obsahující sekvenci aminokyselin kapa řetězce, obě odvozené z lidských imunoglobulinů,
b) hypervariabilní oblasti těžkých a lehkých řetězců obsahující následující sekvence:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC CDR1: SYDIN
CDR2: WIFPGDGSTKYNEKFKG CDR3: EDYYDNSYYFDY
LEHKÝ ŘETĚZEC
CDR1: RASQDISNYLN CDR2: YTSRLHSG CDR3: QQGNTLPWT
c) úseky základní struktury (FR) těžkých a lehkých řetězců obsahující následující sekvence:
TĚŽKÝ ŘETĚZEC
FR1: QVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASGYTFT FR2: WVRQRPEQGLEWIG
FR3: KATLTTDKSSSTAYMQLSRLTSEDSAVYFCAR FR4: WGQGTTLTV
LEHKÝ ŘETĚZEC
FR1: DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISC FR2: WYQQKPDGTVKLLIY FR3: VPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFC FR4: FGGGTKLESK, a
d) pro další humanizaci a zachování vazebných vlastností k antigenů zahrnuje variabilní oblast protilátky přinejmenším jednu z následujících substitucí:
- 15CZ 304424 B6
LEHKÝ ŘETĚZEC pozice 7 ve FR1: Thr za Ser pozice 8 ve FR1: Thr za Pro pozice 15 ve FR1: Leu za Val
TĚŽKÝ ŘETĚZEC pozice 5 ve FR1: Gin za Val pozice 5 ve FR2: Arg za Ala pozice 7 ve FR2: Glu za Gly pozice 21 ve FR3: Thr za Arg
2. Buněčná linie, která produkuje chimemí monoklonální protilátku podle nároku 1.
5
3. Farmaceutická kompozice pro použití při léčbě maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů, vyznačující se tím, že obsahuje chimemí monoklonální protilátku podle nároku 1.
4. Farmaceutická kompozice pro použití při lokalizaci a identifikaci maligních nádorů prsu io a melanomů, jejich metastází a relapsů „in vivo“, vyznačující se tím, že obsahuje chimemí monoklonální protilátku podle nároku 1.
5. Použití chimemí monoklonální protilátky podle nároku 1 pro výrobu léku pro léčbu maligních nádorů prsu a melanomů, jejich metastází a relapsů.
CZ2003-2668A 2001-04-06 2002-04-08 Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů CZ304424B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2001008420010084A CU23007A1 (es) 2001-04-06 2001-04-06 Combinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiencombinaciones inmunoterapéuticas para el tratamiento de tumores que sobre-expresan gangliósidos to de tumores que sobre-expresan gangliósidos

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20032668A3 CZ20032668A3 (cs) 2004-07-14
CZ304424B6 true CZ304424B6 (cs) 2014-04-30

Family

ID=40291118

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032641A CZ296276B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutické kombinace pro lécbu nádoru, nadmerne exprimujících gangliosidy
CZ2003-2668A CZ304424B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Rekombinantní protilátky související s gangliosidy a jejich použití při diagnóze a léčbě nádorů

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20032641A CZ296276B6 (cs) 2001-04-06 2002-04-08 Imunoterapeutické kombinace pro lécbu nádoru, nadmerne exprimujících gangliosidy

Country Status (37)

Country Link
US (3) US20050069535A1 (cs)
EP (3) EP1411064B1 (cs)
JP (2) JP2004528033A (cs)
KR (3) KR100863509B1 (cs)
CN (3) CN100349920C (cs)
AR (2) AR033123A1 (cs)
AT (3) ATE378356T1 (cs)
AU (3) AU2002308348B2 (cs)
BG (2) BG66293B1 (cs)
BR (3) BR0208675A (cs)
CA (2) CA2443372C (cs)
CU (1) CU23007A1 (cs)
CZ (2) CZ296276B6 (cs)
DE (2) DE60228561D1 (cs)
DK (2) DK1411064T3 (cs)
EA (2) EA006936B1 (cs)
EC (2) ECSP034787A (cs)
ES (2) ES2312610T3 (cs)
HK (3) HK1066818A1 (cs)
HR (2) HRP20030806B1 (cs)
HU (2) HU228106B1 (cs)
IL (2) IL158246A0 (cs)
IS (2) IS2701B (cs)
MX (2) MXPA03008739A (cs)
MY (3) MY157372A (cs)
NO (2) NO331533B1 (cs)
NZ (2) NZ528599A (cs)
PE (1) PE20020972A1 (cs)
PL (2) PL208109B1 (cs)
PT (2) PT1411064E (cs)
SG (1) SG161737A1 (cs)
SI (2) SI1411064T1 (cs)
SK (2) SK287783B6 (cs)
UA (3) UA75393C2 (cs)
UY (2) UY27242A1 (cs)
WO (2) WO2002081661A2 (cs)
ZA (2) ZA200307585B (cs)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7297336B2 (en) * 2003-09-12 2007-11-20 Baxter International Inc. Factor IXa specific antibodies displaying factor VIIIa like activity
DK1853305T3 (en) * 2005-02-04 2014-12-01 Survac Aps Survivin-peptide vaccine
FI20055398A0 (fi) * 2005-07-08 2005-07-08 Suomen Punainen Risti Veripalv Menetelmä solupopulaatioiden evaluoimiseksi
NZ566245A (en) * 2005-08-11 2012-04-27 Matossian Rogers Arpi Tcr-v-beta related peptides for treatment and diagnosis of autoimmune disease
CN103450359B (zh) 2005-08-19 2018-07-24 惠氏有限责任公司 抗gdf-8的拮抗剂抗体以及在als和其他gdf-8-相关病症治疗中的用途
ITFI20060163A1 (it) * 2006-06-29 2006-09-28 Menarini Internat Operations Luxembourg Sa Composizione farmaceutica contenente un anticorpo monoclonale anti idiotipico anti-ca-125 ed alluminio
TWI434855B (zh) * 2006-11-21 2014-04-21 Hoffmann La Roche 結合物及其在免疫分析中作為參考標準之用途
WO2009104649A1 (ja) * 2008-02-22 2009-08-27 片山化学工業株式会社 合成糖脂質含有リポソーム
EP2166085A1 (en) 2008-07-16 2010-03-24 Suomen Punainen Risti Veripalvelu Divalent modified cells
TWI516501B (zh) 2008-09-12 2016-01-11 禮納特神經系統科學公司 Ｐｃｓｋ９拮抗劑類
JP6061469B2 (ja) 2009-03-10 2017-01-25 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗ｂｃｍａ抗体
CN102471380B (zh) 2009-04-01 2015-01-14 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗FcRH5抗体和免疫偶联物及使用方法
CU23736A1 (es) * 2009-05-04 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos que reconocen sulfatidos y proteoglicanos sulfatados y su uso
CA2780713A1 (en) * 2009-09-03 2011-03-10 Vancouver Biotech Ltd. Monoclonal antibodies against gonadotropin-releasing hormone receptor
US9469685B2 (en) * 2011-01-10 2016-10-18 Emory University Antibodies directed against influenza
CU24070B1 (es) * 2011-12-27 2015-01-29 Ct De Inmunología Molecular Composiciones farmacéuticas para el tratamiento de tumores que expresan regf y gangliósidos n-glicolilados gm3 (neugcgm3)
EP2641916A1 (en) * 2012-03-23 2013-09-25 Centre National de la Recherche Scientifique (C.N.R.S) Novel antibodies anti-sPLA2-IIA and uses thereof
EP2861617A1 (en) 2012-06-15 2015-04-22 Pfizer Inc. Improved antagonist antibodies against gdf-8 and uses therefor
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
PL3192812T3 (pl) 2013-12-17 2020-10-19 Genentech, Inc. Przeciwciała anty-CD3 i sposoby ich zastosowania
AU2015243246B2 (en) * 2014-04-10 2018-09-06 Obi Pharma Inc. Antibodies, pharmaceutical compositions and uses thereof
TWI715587B (zh) 2015-05-28 2021-01-11 美商安可美德藥物股份有限公司 Ｔｉｇｉｔ結合劑和彼之用途
IL256079B2 (en) 2015-06-16 2024-01-01 Genentech Inc Human antibodies with improved affinity to FCRH5 - and methods of use
WO2018017864A2 (en) * 2016-07-20 2018-01-25 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Pvrig-binding agents and uses thereof
MX2019006072A (es) 2016-11-30 2019-08-14 Oncomed Pharm Inc Metodos para tratamiento de cancer que comprenden agentes de enlace al inmunoreceptor de celulas t con dominios ige itim (tigit).
CU20170173A7 (es) * 2017-12-27 2019-11-04 Ct Inmunologia Molecular Nano-partículas que contienen el gangliósido gm3 como inmunomoduladoras

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657471A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-14 Centro de Inmunologia Molecular Anti ganglioside monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumours
EP0699755A2 (en) * 1994-06-30 1996-03-06 Centro de Inmunologia Molecular Method for obtaining modified immunoglobulins with reduced immunogenicity of murine antibody variable domains, compositions containing them
CA2308142A1 (en) * 1997-10-21 1999-04-29 Ana Maria Vazquez Lopez Anti-idiotype monoclonal antibodies, their use in active immunotherapy of malignant tumors and compositions containing them

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2754206B2 (ja) * 1987-11-17 1998-05-20 メクト株式会社 α２→３結合を認識するモノクローナル抗体
US6051225A (en) * 1988-10-19 2000-04-18 The Dow Chemical Company Family of high affinity, modified antibodies for cancer treatment
ES2144440T3 (es) * 1992-08-18 2000-06-16 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpos monoclonales que reconocen el receptor del factor de crecimiento epidermico, celulas y metodos para su produccion y compuestos que los contienen.
JPH07101999A (ja) * 1993-10-06 1995-04-18 Hagiwara Yoshihide 抗癌ヒトモノクローナル抗体に対する抗イデイオタイプ抗体のアミノ酸配列およびそれをコードするｄｎａ塩基配列
US6063379A (en) * 1993-12-09 2000-05-16 Centro De Inmunologia Molecular Anti-idiotypic monoclonal antibodies and compositions including the anti-idiotypic monoclonal antibodies
CU22420A1 (es) * 1993-12-29 1996-01-31 Centro Inmunologia Molecular Composicion vacunal para el desarrollo de una respuesta contra gangliosidos n glicolilados y su uso para el tratamiento del cancer
US6149921A (en) * 1993-12-29 2000-11-21 Centro De Inmunologia Molecular Vaccine compositions for eliciting an immune response against N-acetylated gangliosides and their use for cancer treatment
CU22731A1 (es) * 1998-02-05 2002-02-28 Centro Inmunologia Molecular Anticuerpo monoclonal que reconoce el oligosacárido ácido siálico n´glicolilado-galactosa-glucosa (ngcneu-gal-glu) en tumores malignos y composiciones farmacéuticas que los contienen
US7442776B2 (en) * 1999-10-08 2008-10-28 Young David S F Cancerous disease modifying antibodies

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0657471A1 (en) * 1993-12-09 1995-06-14 Centro de Inmunologia Molecular Anti ganglioside monoclonal antibodies and their use in the specific active immunotherapy of malignant tumours
EP0699755A2 (en) * 1994-06-30 1996-03-06 Centro de Inmunologia Molecular Method for obtaining modified immunoglobulins with reduced immunogenicity of murine antibody variable domains, compositions containing them
CA2308142A1 (en) * 1997-10-21 1999-04-29 Ana Maria Vazquez Lopez Anti-idiotype monoclonal antibodies, their use in active immunotherapy of malignant tumors and compositions containing them

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Vázquez AM et al. Antitumor properties of an anti-idiotypic monoclonal antibody in relation to N-glycolyl-containing gangliosides. Oncology Reports, 2000, 7(4),751-756. *

Also Published As

Publication number Publication date
NO20034436D0 (no) 2003-10-03
PL208109B1 (pl) 2011-03-31
PL371770A1 (en) 2005-06-27
SI1384726T1 (sl) 2009-04-30
CN100349920C (zh) 2007-11-21
HU228105B1 (en) 2012-11-28
NO20034437D0 (no) 2003-10-03
US8758753B2 (en) 2014-06-24
KR100919617B1 (ko) 2009-09-29
NZ528598A (en) 2005-03-24
HRP20030805A2 (en) 2005-08-31
KR20030092048A (ko) 2003-12-03
ECSP034788A (es) 2004-01-28
EA006310B1 (ru) 2005-10-27
CN101054417B (zh) 2012-07-11
UA86768C2 (ru) 2009-05-25
ES2312610T3 (es) 2009-03-01
JP2004528033A (ja) 2004-09-16
IS6965A (is) 2003-09-23
HUP0401695A2 (en) 2006-08-28
EP1798243B1 (en) 2010-08-11
IL158246A (en) 2010-05-31
CA2441845A1 (en) 2002-10-17
US20100297008A1 (en) 2010-11-25
HK1109160A1 (en) 2008-05-30
JP4366080B2 (ja) 2009-11-18
UA75393C2 (en) 2006-04-17
DK1411064T3 (da) 2008-03-25
BR0208676A (pt) 2008-04-08
PL371937A1 (en) 2005-07-11
SK287914B6 (sk) 2012-03-02
CU23007A1 (es) 2004-12-17
KR20080080680A (ko) 2008-09-04
CA2441845C (en) 2011-06-07
DE60223547T2 (de) 2008-09-18
PE20020972A1 (es) 2003-01-02
US20050069535A1 (en) 2005-03-31
ZA200307585B (en) 2004-09-16
ZA200307679B (en) 2005-03-30
HK1070080A1 (en) 2005-06-10
PT1411064E (pt) 2008-02-12
HUP0401355A2 (hu) 2004-10-28
UY27243A1 (es) 2002-09-30
CN1319991C (zh) 2007-06-06
US20040253233A1 (en) 2004-12-16
CA2443372C (en) 2013-05-28
BR0208676B1 (pt) 2017-11-14
ES2296986T3 (es) 2008-05-01
CZ20032668A3 (cs) 2004-07-14
EP1411064A2 (en) 2004-04-21
EP1384726A2 (en) 2004-01-28
NO20034437L (no) 2003-12-02
MY157372A (en) 2016-06-15
IS2701B (is) 2010-11-15
ATE406386T1 (de) 2008-09-15
BG108228A (bg) 2005-04-30
AR033122A1 (es) 2003-12-03
EA006936B1 (ru) 2006-06-30
IS6964A (is) 2003-09-23
BG66304B1 (bg) 2013-03-29
BG108227A (bg) 2005-04-30
KR20030087053A (ko) 2003-11-12
UY27242A1 (es) 2002-07-31
MXPA03008739A (es) 2003-12-11
CZ296276B6 (cs) 2006-02-15
HK1066818A1 (cs) 2005-04-01
CZ20032641A3 (cs) 2004-07-14
EP1798243A2 (en) 2007-06-20
NZ528599A (en) 2005-03-24
IL158246A0 (en) 2004-05-12
PT1384726E (pt) 2008-12-05
SK287783B6 (sk) 2011-09-05
DK1384726T3 (da) 2008-12-15
CN101054417A (zh) 2007-10-17
DE60228561D1 (de) 2008-10-09
MY145703A (en) 2012-03-30
AU2002308347B2 (en) 2006-09-14
MY137078A (en) 2008-12-31
HRP20030805B1 (en) 2011-11-30
SG161737A1 (en) 2010-06-29
BR0208675A (pt) 2004-08-03
ATE378356T1 (de) 2007-11-15
SI1411064T1 (sl) 2008-04-30
BRPI0208675B1 (pt) 2018-03-13
WO2002081661A2 (es) 2002-10-17
NO20034436L (no) 2003-12-02
WO2002081661A3 (es) 2003-01-03
NO331533B1 (no) 2012-01-23
EP1411064B1 (en) 2007-11-14
SK12262003A3 (sk) 2004-08-03
UA76745C2 (uk) 2006-09-15
JP2004525953A (ja) 2004-08-26
CN1535282A (zh) 2004-10-06
AU2002308348B2 (en) 2007-11-22
EA200301098A1 (ru) 2004-04-29
WO2002081496A3 (es) 2004-02-19
HUP0401355A3 (en) 2012-05-29
ECSP034787A (es) 2004-01-28
BG66293B1 (en) 2013-02-28
CN1507452A (zh) 2004-06-23
DE60223547D1 (de) 2007-12-27
HU228106B1 (en) 2012-11-28
AU2007231687B2 (en) 2010-09-30
HRP20030806B1 (en) 2011-11-30
EP1384726B1 (en) 2008-08-27
KR100946168B1 (ko) 2010-03-11
HUP0401695A3 (en) 2012-05-29
WO2002081496A2 (es) 2002-10-17
AU2007231687A1 (en) 2007-11-22
HRP20030806A2 (en) 2005-08-31
SK12162003A3 (sk) 2004-05-04
AR033123A1 (es) 2003-12-03
KR100863509B1 (ko) 2008-10-15
MXPA03008738A (es) 2003-12-11
ATE477279T1 (de) 2010-08-15
EA200301097A1 (ru) 2004-02-26
EP1798243A3 (en) 2007-10-17
CA2443372A1 (en) 2002-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8758753B2 (en) Ganglioside associated recombinant antibodies and the use thereof in the treatment of tumors
EP1623997B1 (en) Recombinant antibodies and fragments recognising ganglioside n-glycolyl-gm3 and use thereof in the diagnosis and treatment of tumours
JP5631733B2 (ja) 抗ＥｐＣＡＭ抗体およびその使用
WO2021052307A1 (zh) 一种抗b7-h3抗体及其应用
JP2022539344A (ja) 抗ｃｅａ抗体及びその応用
EP3778632A1 (en) Anti-human lag-3 monoclonal antibody and use thereof
CN111662385B (zh) 全人源抗人gpc3单克隆抗体及其用途
CN115838424A (zh) 靶向tigit的单克隆抗体

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20180408