JP4524074B2 - 低親和性Fcγレセプターを標的化する重合体の免疫グロブリン融合タンパク質 - Google Patents
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Description
本発明は、概して、免疫学の分野に関する。より具体的には、本発明は、免疫複合体、ならびに免疫グロブリンの複数のヒンジ領域およびCH2領域を含む組換えタンパク質の発現および使用に関する。
免疫複合体(IC)は、多様な生物学的活性を示し;そのいくつかは、疾患の一因となるが、別のものは疾患を回復させる。ICを含むIgGの組織表面上への沈着は、糸球体での例に関しては、抗体が媒介する自己免疫疾患の病態の一因であり得る。一方、ICは、免疫細胞上に発現されるFcレセプターへの結合を介するT細胞およびB細胞の活性化経路を有利に調節し得る。凝集IgG(aggregated IgG)(AIG)は、多くの特性および生物学的活性をICと共有している。この特性および生物学的活性の両方が、T細胞サプレッサ機能(Antelら、1981;Durandyら、1981)、サイトカイン合成、IgG選択、およびリンパ球増殖(Bergerら、1997;Wiesenhutterら、1984;Ptakら、2000)を調節する。
本発明は、変化する量のFcγRおよび/または補体結合ドメインを含む新規のポリペプチドを提供する。これらのポリペプチドは、他のFcγR結合モチーフ(IgG、Fcフラグメント、IgG融合タンパク質、ならびにそれらの複合体および/または凝集体を含む)にわたるいくつかの利点を提供する。これらの利点としては、以下が挙げられる:構成デザイン(construct design)およびタンパク質産物を変化させることによってFcγRとの相互作用を変化させる(hone)能力、および凝集IgG(AIG)を用いる場合のバッチ間の異質の性質および多数の改変とは対照的に、既知数のFcγR結合ドメインを含む正確に規定された構成物およびタンパク質産物を得る能力;AIGと比較しての効力の増加;ならびに単一の薬剤を用いて多くの細胞型(例えば、NK細胞、単球、およびB細胞)を標的化する能力。従って、本発明は、疾患の重症度を調節し得る、複数のFcγR結合部位および模倣の集合タンパク質を含むポリペプチドを設計することを可能にする。本発明に従う本明細書の技術を用いて、当業者は、小サイズの範囲およびコンホメーションを有する均質なタンパク質を作製し得る。また、一定の濃度範囲にわたる用量応答曲線の作成を容易にするような可溶性融合タンパク質を作製し得る。
本発明は、ポリペプチドをコードする領域を有する核酸のファミリー、およびFcγRとの相互作用に関して、凝集IgG(AIG)および免疫複合体の機能を模倣し得、かつ第二タンパク質ドメインを含むことおよびFcγRを発現する細胞にこのドメインを標的化することを可能にする、この核酸によってコードされるポリペプチドを記載する。本発明はまた、融合タンパク質の発現を指向するクローニングベクターのファミリーを記載し、ならびにFcγRとの相互作用に関して凝集IgG(AIG)および免疫複合体機能を模倣し得、かつ第二タンパク質ドメインを含むことおよびFcγRを発現する細胞にこのドメインを標的化することを可能にする融合タンパク質を記載する。ヒトIgG1のフレームワーク領域に融合された、ヒトIgG1のヒンジドメインおよびCH2ドメイン(HCH2)の少なくとも一部の直鎖状コピーを複数発現することにより、これらの特徴を有する組換えタンパク質が得られる。便利な制限部位は、さらなるアミノ末端ドメインの容易な導入を可能にする。得られる分子は、三部構成(tripartite)である。カルボキシル−IgG1フレームワークドメインは、安定性を提供し、そして二量化を可能にする;介在HCH2ポリマーは、増大したエフェクター機能(FcRを発現する細胞のサブセットに標的化することを含む)、増大したFcR連結能力および/または増大した補体成分結合能力を付与し、一方で、アミノ末端ドメインは、FcγRを発現する細胞に対してさらなるシグナルを送達し得る。
抗体は、共通の構造的特徴を有する大きなファミリーの糖タンパク質を含む。抗体は、文字Yに似た三次元構造を形成する4つのポリペプチドから構成される。代表的に、抗体は、2つの異なるポリペプチド(重鎖および軽鎖)から構成される。
組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、当該分野で周知である。例えば、Caponら,1989;Trauneckerら,1989;Chamowら,1996;Ashkenaziら,1997を参照のこと。代表的に、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、Igのヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域から構成されるカルボキシル末端に融合された、リガンド結合ドメインから構成されるアミノ末端を有する。最も普通に用いられるIgのクラスは、IgG1である。IgGのヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域は集合的に、IgGのFc領域と呼ばれる。ヒンジ領域は、Fc領域とリガンド結合ドメインとの間に可橈性リンカーを提供する。ヒンジ領域はまた、鎖間ジスルフィド結合の形成部位、すなわち、1つの抗体鎖を別の抗体鎖へと共有結合して、馴染みのある二量体構造を作製する部位である。ヒンジ領域(特に、ヒンジ近位領域として公知の、CH2ドメインに最も近い部分)は、分子認識、ならびにFcγレセプターおよび補体成分への結合に必要である。従って、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、Igに類似するが、可変領域およびCH1ドメインを欠き、これらは、リガンド結合ドメインによって置換されている。代表的に、組換え分子は、組換えDNA技術を用いてcDNAレベルで作製され、そして細胞培養において発現される。最も頻繁には、組換え免疫グロブリン融合タンパク質は、ジスルフィド結合したホモダイマーである。上記の代表的な融合タンパク質についてのバリエーションは、考慮すべきである。例えば、リガンド結合ドメインに加えて、多くの他の融合パートナー(例えば、リガンド、酵素およびペプチドエピトープ)は、アミノ末端に配置される。
免疫系は、内在的および適応性の免疫系として知られる2つのアーム(arm)に分けられ得る。この内在的な免疫系は、侵入する微生物または他の傷害に対する防御の第一線を提供する。内在的な免疫系防御に関与する細胞型としては、ナチュラルキラー(NK)細胞、天然の抗体産生を請け負うB細胞もよび単球/マクロファージが挙げられる。適応性の免疫系は、より精巧によくされ(hone)、免疫学的記憶を示し、そして第2のより特異的な防御線を提供する。適応性の免疫に関与する細胞型としては、T細胞、T細胞依存的抗体応答に関与するB細胞、およびまた単球/マクロファージが挙げられる。内在的な系と適応性の系との間の相互作用は、いくつかの環境下での強化、および他の環境下での拮抗作用を伴い、複合である。これらの相互作用のいくつかとしては、本発明が免疫複合体についての模倣物を提供する限り、本発明による免疫複合体によって、および伸長によって、発揮される制御が挙げられる。
NK細胞は、骨髄で生成される大きな顆粒性のリンパ球である。NK細胞は、NK細胞の異なる形態、およびNK細胞が発現するかまたは発現しないかのいずれかである表面マーカー分子によって認識され得る。NK細胞は、CD16+、CD56+およびCD3−である。NK細胞は、脾臓、血液および組織中に見出されるが、リンパ節には見出されない。NK細胞は、いくつかの腫瘍細胞、いくつかのウイルス感染細胞を殺傷する能力、およびサイトカイン(特にインターフェロンγおよび腫瘍壊死因子(TNF)(これらの両方が、ウイルス感染の最初の制御に寄与し、そしてこれらの両方が、適応性の免疫および自己免疫疾患に関与するT細胞およびB細胞にわたる調節効力(regulatory influence)を発揮する))を放出する能力を有する。本発明は、NK細胞を活性化して、NK細胞を増殖させ、そして漸増量のインターフェロンγおよびTNFを放出させる。NK細胞が発現するCD16表面マーカーは、本発明が結合するFcγRIIIaレセプターである。この結合が、NK細胞の活性化の原因となる。NK細胞自体は、少なくともいくつかの自己免疫プロセスにおける防護的役割を有する。なぜなら、これらの枯渇が、ヒトの主要な自己免疫疾患の1つである多発性硬化症についての動物モデルにおける実験的自己免疫脳脊髄炎の重篤度を増強するからである。従って、本発明によるNK細胞の活性化は、自己免疫プロセスのための改善された処置の見込みを提供する。
マクロファージは、単球に由来し、そしてこれらの機能の多くを共有する。このため、これら2つの細胞は、一緒にみなされる。単球は、骨髄内で成熟する。これらは、血液中に見出され、そして組織全体に見出される。これらは、内在的な防御および適応性の防御の両方において機能する。ウイルス感染の結果、これらは、インターフェロンγおよびTNFを産生するためにNK細胞を活性化するタンパク質であるIL−12を放出する。ウイルス性防御および腫瘍防御におけるIL−12の重要性は、上記で議論されている。単球は、抗原提示細胞として機能し、このためT細胞の活性化、よって適応性の免疫に重要である。同様に、これらは、活性化T細胞により放出される産物による食作用について活性化され、一旦活性化されると、侵入する生物、ならびに生物の侵入または自己免疫プロセスによって損傷される細胞および組織の両方を清澄化する。
B細胞は、抗体を産生する。IgMクラスの抗体の最初の産生は、T細胞の影響に非依存的であるが、続くIgGおよび他のクラスの抗体へのスイッチは、T細胞の指揮下で生じる。T細胞非依存性抗体およびT細胞依存性抗体の両方が、自己免疫応答に関係し得る。B細胞は、FcγRIIbレセプター(CD32)を発現する。このFcγRIIbレセプターは、そのレセプターの細胞質テール内に位置される免疫レセプターチロシンベースのインヒビターモチーフ(ITIM)として知られる特定化されたシグナル伝達モチーフを介して媒介されるネガティブシグナルを送達する。ITIMモチーフは、FcγRIIbレセプターに独特な特徴であり、他のFcγレセプタークラスのいずれにも存在しない。このレセプターの連結は、ネガティブシグナル、よって、抗体産生についての阻害シグナルをB細胞に提供する。FcγRIIbレセプターは、IgG含有免疫複合体およびIgG凝集体を認識し、そしてこれらに応答する。従って、結果として、IgMクラスおよびIgGクラス両方の免疫グロブリン産生の阻害を有する本発明に対して応答することが予期される。
T細胞は、胸腺で成熟する小さなリンパ球であり、ここからTリンパ球は、リンパ器官に進む。T細胞は、CD4細胞およびCD8細胞として知られる、2つの主要なカテゴリーに分けられ得る。この2つのカテゴリーは、たとえ重複しても、異なる機能を有する。CD4細胞は、時折、遅延型過敏性としていわれる細胞性免疫の原因である。細胞性免疫は、多くの自己免疫疾患の病原性に関与する。CD4細胞は、細胞表面上に発現するT細胞レセプターによって抗原を認識する。抗原性ペプチドフラグメントは、抗原提示細胞(例えば、単球)の表面に発現されるMHCクラスII分子によって、CD4細胞に提示される。T細胞は、この提示によって活性化されるが、第2の活性化シグナルが抗原提示細胞によって提供される場合にのみである。活性化CD4細胞は、これらの生物学的効果の原因であるサイトカインを放出する。CD4細胞は、Th1細胞およびTh2細胞として知られる2つのサブクラスに分けられ得る。Th1細胞は、細胞性免疫の原因であるが、Th2細胞は、IgGおよび他のクラスの免疫グロブリンの、B細胞による産生を指向する。
Fcレセプターの3つのクラスが存在する(Gessnerら、1998;Raghavanら、1996)。FcγRI(CD64)は、モノマーのIgGを高い親和性で結合するのに対して、AIGおよびICは、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)(Fcに対する低親和性レセプター)に優先的に結合する。FcγRIIおよびFcγRIIIは、それらのリガンド結合ドメインの構造において密接に関連する。ヒトの3つの独立した遺伝子(FcγRIIA、FcγRIIB、およびFcγRIIC)において、これらの2個は、交互にスプライシングされた(FcgRIIをコードする)改変体を生じる。FcγRIIaが、活性化シグナルを送達するのに対して、FcγRIIbは、阻害シグナルを送達する。互いに異なるシグナルに関する機能的基盤は、レセプターの細胞質テイル内に局在するシグナル伝達モチーフから生じる。FcγRIIbの細胞質テイルに局在化する免疫レセプターチロシンベースインヒビターモチーフ(ITIM)が、ネガティブレセプターシグナル伝達に関して重要である。ITIMモチーフは、FcγRIIbレセプターの独特な特徴であり、他のいずれのFcγレセプタークラスにも存在しない。対照的に、活性化性の免疫レセプターチロシンベースアクチベーターモチーフ(すなわちITAM)は、FcγRIIaの細胞質テイルに局在化する。ITAMモチーフは、活性化シグナルを変換する。これらは、FcR γ鎖にもまた見出され、このγ鎖は、高親和性IgEレセプター(FcεRI)のγ鎖と同一である。FcγRIIaおよびFcγRIIbが、骨髄性細胞およびいくつかのT細胞サブセット上で広く発現される一方、FcγRIIaおよびFcγRIIbは、NK細胞には全く存在しない。
NK細胞は、ライゲーションによって、リンフォカインの発現および構成的に発現される低親和性IL−2レセプター(IL−2R(p75))のアップレギュレーションを生じる、ただ1つの型のFcγR(FcγRIIIa)を発現する(Anegonら、1988)。多量のIL−2に曝すだけで、リンフォカインの発現、増加したIL−2Rの発現、強化された細胞傷害性機能を生じるが、NK細胞によってほんの控えめな増殖応答を生じる(Naglerら、1990)。多量のIL−2ならびにFcγRIIIaライゲーションでの共刺激によって、IL−2単独で達成されるよりも大きなNK細胞活性化(brisker増殖を含む)を生じる(Harrisら、1989)。NK細胞の増殖性応答は、FcγR−リガンド相互作用に対する生物学的読み取りとして使用される。例えば、4つのHCH2ポリマー構築物を2.5μg/mLのPBMCで試験し、結果を抗CD16 mAbおよびAIGを用いて得られた結果と比較した。予期されるように、抗CD16 mAbおよびAIGは、IL−2の存在下で、増殖性応答を誘導した。HCH2ポリマー構築物によって推進される増殖性応答は、反復単位の数に関連し、CD8R0が、IL−2単独の7.5倍の誘導を付与したのに対して、CD8R4は、15倍の誘導を付与した。CD8R4は、最大レベルの活性化を誘導したが、CD8R3による誘導のレベルは、CD8R4のレベルにほぼ等しく、これらの間の差異は、統計的に有意ではなかった。両方の構築物は、FcγRを最適に作動するために必要なHCH2単位の数であるかまたはそれに近い数であり得る。CD8R4とAIGとの間の直接の比較によって、CD8R4が、AIGよりかなり強力である(CD8R4が、5μg/μLで18倍の誘導を生じるのに対して、125μg/μLのAIGが、類似するレベルの誘導を生じるために必要とされる)ことが示される。
NK細胞上のCD2レセプターを通したシグナル伝達はまた、ζ鎖を通しても生じ(Vivierら、1991;Moingeonら、1992)、そして、抗CD2抗体は、NK細胞の機能およびサプレッサー機構を研究するために、有効に使用されてきた。従って、CD2またはCD16を通したNK細胞の活性化によって、IFN−γおよびTNFαの分泌、ならびに増殖を含む、重複するエフェクターの機能が誘導される。CD2を通したNK細胞の活性化によって、CD8 T細胞上で作用するTGFβの分泌が誘導され、次いで、このCD8 T細胞は、B細胞によるIg分泌を阻害する(Grayら、1994;Ohtsukaら、1998)。活性化NK細胞による可溶性CD16(インビトロでのIg分泌の強力なインヒビター)の放出は、NK細胞の活性化による、Ig調節の潜在的な第2の機構を提供する。
(1.抗体の臨床的使用)
モノクローナル抗体(mAb)技術の出現によって、細胞機能に関連する特定の細胞表面抗原と反応する可能性のある治療薬を開発する基礎が提供された。この型の治療薬は、本発明の融合タンパク質に組み込まれ得る。
組換えモノクローナル抗体(mAb)を、Fc領域への1つ以上のHCH2単位の導入によって改変し、モノクローナル抗体内に適切な長さのHCH2ポリマーを作製し得ることが、本発明の実施形態である。この方法で改変されたモノクローナル抗体が、これらの標的特異性を保持する一方で、改善されたおよび/またはより選択的なエフェクター機能を獲得する。HCH2ポリマーは、Fc−FcRレセプター相互作用を大いに強化する。本発明のより特異的なHCH2ポリマーは、本治療的使用において、mAbのFc部位を使用して見られるものより、FcγRIIIaレセプターへの、大いに改善された結合およびそれの大いに強化された活性化を有する。FcRγIIIaとのmABの強化された相互作用が、悪性腫瘍の処置における治療的利点を有することが示されてきたように、本発明者らは、mAbのFc領域へのHCH2ポリマーの導入を用いた、現存するmAbの改変を考える。この改変を有するモノクローナル抗体は、FcγRIIIaレセプターとの強化された相互作用を有する。
モノクローナル抗体(MAb)を産出する方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製する方法と同じ手法で始める。簡単には、ヒトは、動物を免疫原で免疫することによって開始し、そしてこの免疫化動物から抗血清を回収し、ポリクローナル抗体を調製する。広い範囲の動物種が、抗血清の産出に使用され得る。代表的には、抗血清の産出に使用される動物は、ウサギ、マウス、ラット、ハムスターまたはモルモットである。ウサギの比較的大きい血量に起因して、ウサギは、ポリクローナル抗体の産出について好ましい選択である。
上記の使用に加えて、特許請求したペプチドは、種々のインビトロでの使用を有する。これらのいくつかが、以下に記載され;当業者は、他を理解する。
所望の因子の量を正確に定量する免疫学的検定の成功は、特定の様式において因子を捕捉する工程、特定の様式において因子を検出する工程、または両方のいずれかに大部分基づく。本発明者らは、本発明の融合タンパク質が、Fcレセプターの特異的な検出、またはFcレセプターの捕捉における有用であり得ることを予測する。Fcレセプターへの本発明の融合タンパク質の結合は、これらのレセプターの特異的な捕捉または検出におけるその使用を可能にする。本発明の融合タンパク質は、適切な表面上に固定化され得、そしてFcレセプターを捕捉するために使用され得る。続いて、捕捉されたFcレセプターは、他の因子(例えば、レセプターの非競合部位に対する抗体)を用いて検出され得る。あるいは、融合タンパク質は、適切な表面上で非特異的、または特異的のいずれかで捕捉される、Fcレセプターを検出するために使用され得る。免疫学的検定手順を改変することによって、本発明の融合タンパク質は、種々の様式でCD16およびCD32の検出のために利用され得る。
蛍光活性化細胞分類;フローサイトメトリーまたはフローマイクロフルオロメトリーは、抗原の存在について個々の細胞をスキャンするための手段を提供する。この方法は、液体培地中の標識細胞の励起放射を活性化および検出し得る計測装置を用いる。
本発明の融合タンパク質はまた、免疫組織化学による研究のために調製された新鮮な凍結組織ブロック、およびホルマリン固定組織ブロック、パラフィン包埋組織ブロックまたは他の固定組織ブロックと組み合わせて使用され得る。
本発明の融合タンパク質は、免疫沈降によるCD16およびCD32の単離のために特に有用である。免疫沈降は、複合混合物由来の標的抗原成分の分離を含み、そして微少量のタンパク質を区別または単離するために使用される。膜タンパク質の単離のために、細胞は、洗浄ミセル中に溶解されなければならない。他の因子(例えば、胆汁酸塩)は、酸性のpHまたは二価カチオンの存在下で沈殿するので、非イオン性の塩が好ましい。
自己免疫疾患は、免疫系が体組織成分に対する攻撃を増加するプロセスである。この攻撃は、Bリンパ球によって生成される抗組織成分抗体によってか、またはT細胞、NK細胞、および単球/マクロファージによって媒介される細胞媒介性組織破壊性プロセスによって媒介され得る。いくつかの自己免疫疾患において、いくつかの組織損傷機構は、並行してか、または経時的に作用し得る。本発明の融合タンパク質は、自己免疫疾患の処置に使用され得る。これらは、免疫性を変化するため、および治療剤が有効である患者の送達部位に治療剤を送達するために使用され得る。
複数の器官系が、SLEに関し、そして疾病の発現が多様である。非びらん性関節炎および一般の非変形性関節炎ならびに日光過敏性発疹は、75%を超える場合において累積的に生じるが、漿膜炎、中枢神経系(CNS)併発、および腎性の併発が、約50%の場合において生じる。リンパ球減少症は、大半の選択されていない場合において生じ、そしてほぼ不変的に活性疾患に存在する。溶血性貧血および血小板減少症は、約50%の場合において存在する。SLEは、体における任意の器官を含み得る。一般に罹患する器官としては、皮膚、腎臓、漿膜、間接、心臓およびCNSが挙げられる。病理学的に、免疫複合体は、腎臓の糸球体中に蓄えられ、そして免疫グロブリンが、皮膚表皮接合部で皮膚に累積することは規則である。SLEは、多数の自己抗体の変化する特異性によって特徴付けられ、ここで、抗核抗体(ANA)は、ネイティブな2本鎖DNAに対する抗体および変性された1本鎖DNAに対する抗体として大半が不変的に存在する。このような抗体は、診断において有用である。フィブリノイドは、血管内に累積し、そして漿膜表面上は、別の病理学的特徴である。
この疾患は、CNSミエリンの破壊、およびミエリンが鞘で覆う軸索の破壊によって特徴付けられる。この疾病は、最も一般的には、CNSの白質における組織破壊の病巣発作(これは、ニューロン機能の損失を引き起こす)から、および、ある発作が、別の進行的に蓄積している障害に付随する場合、発症する。しばらくして、大半の多発性硬化症の患者は、発作の頻度の減少を経験するが、この減少は、この疾病の自然な過程における、神経障害のゆっくりではあるが容赦ない悪化へのシフトにより達成される。再発−緩和の経過から進行性の経過への転換は、最終的には、80%よりも多くの多発性硬化症の罹患者において起こる。
ギヤン−バレー症候群(GBS)は、末梢神経の運動機能が、僅かに検出可能なほどの衰弱から換気支持体を必要とする全運動性麻痺の範囲にわたる可変的な程度まで失われる、自己免疫ニューロパシーの一群の亜急性開始を含む。西洋におけるGBS症候群の最も一般的な形態は、たいていの場合、通常は呼吸性か胃腸性である感染疾病を伴う。末梢神経は、神経線維を鞘で覆うミエリンを攻撃し、そしてそれを破壊するT細胞およびマクロファージにより浸潤される。ミエリンの欠損は、神経インパルス伝導を妨害し、そして、これは、衰弱、極端な場合は、麻痺を引き起こす。このプロセスは、通常は自己制限されており、そして、ミエリンの欠損は、続いて、可変的な程度までの機能の回復により修復される。GBS症候群の処置は、不完全である。いくつかの利点は、免疫グロブリンの血漿交換または静脈内注射から得られるが、病的状態はかなり残り、そして、より良い処置が必要である。本発明は、GBS症候群の改良された治療のための見通しを提供する。
この自己免疫疾患において、血小板は、個々自身の血小板膜上に存在する抗原に対して指向される自己抗体により、破壊される。この疾患は、急性プロセスとして、または慢性プロセスとして存在し得る。急性プロセスは、主に、性別にかかわらず、幼児に罹患する。慢性プロセスは、通常は、30代〜50代の成体に罹患し、そして、3:1で女性の優勢を示す。血小板数が、10,000未満に落ちた場合に観察される、一般的な臨床特性としては、点状出血、紫斑、歯肉出血、鼻出血および月経過多が挙げられる。血小板およびその前駆物の表面上に発現される糖タンパク質に対して指向される自己抗体は、大多数の患者で明白である。IgGが結合した表面を有する血小板は、大部分が、マクロファージ上で発現されるFcγRIIIaレセプターへのIgGの結合を介して、損傷された血小板を認識する食細胞性マクロファージによって、脾臓中で取り除かれる。血小板減少の消散は、FcγRIIIaレセプターに対して指向されるモノクローナル抗体の注射後に報告されている(Clarksonら、1986)。NK細胞活性は、自己免疫血小板減少性紫斑病において減少されると報告される(Sempleら、1991)。本発明は、FcγRIIIaレセプターに結合し、そして、NK細胞を活性化し、従って、この自己免疫疾患のより有効な処置の見通しを提供する。ATPのための現在許容された処置としては、グルココルチコイド、および静脈内免疫グロブリンが挙げられ、これらが疾患を制御することに失敗した場合(残念なことに、たいていの場合であるが)、免疫抑制剤および細胞傷害剤が、それらの危険にもかかわらず、投与され得なければならない場合がある。
本発明者らは、静脈内免疫グロブリンが以前に使用されていた任意の疾患において、本発明の融合タンパク質の治療的使用を企図する。静脈内免疫グロブリンは、ATPの処置のためのFDA認可を有する。この薬剤は、二重盲検対照臨床試験に基づいて、ギヤン−バレー症候群、重症筋無力症および皮膚筋炎の処置において有効であることが証明されている。静脈内免疫グロブリンは、30よりも多い免疫学的疾患において有益であることが報告されている。これらの疾患における有益な薬効についての機構は、現在のところ未知であるが、静脈内免疫グロブリンの様々な免疫調節特性によって媒介され得る(Asgharら、1996;Dwyerら、1992;Gehaら、1996;Yuら、1999)。免疫グロブリンが処置のために使用されているいくつかの疾患を、表1中に示す(http://www.bioscience.org/2000/v5/e/asghar/fulltext.htm)。
改変および/または変化が、本発明のポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質の構造においてなされ得るが、類似または改良された特徴を有する取得された分子(例えば、生物学的機能等価物)もまた本発明に含まれる。
生物学的機能等価物は、異なる配列を含むが同時に「野生型」または標準的タンパク質をコードする能力を保持するように操作されているポリヌクレオチドを含み得る。これは、同一のアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重性(すなわち、複数のコドンの存在)のもとで達成され得る。一例において、当業者は、ポリヌクレオチドに制限酵素認識配列を導入するが、タンパク質をコードするそのポリヌクレオチドの能力を妨げないことを所望し得る。
議論は、アミノ酸変化から生じる機能的に等価なポリペプチドに焦点を合わせているが、これらの変化は、コードするDNAの改変により及ぼされ得ることが理解され;遺伝暗号が縮重されること、および、2つ以上のコドンが、同じアミノ酸をコードし得るということもまた考慮される。アミノ酸およびそれらのコドンについての表を、このような実施形態での使用のため、ならびに、例えば、プローブおよびプライマーなどの設計での使用のために、以下に提示する。
本発明は、多くの局面において、適当なポリヌクレオチドの転写および翻訳を介するin cytoでのペプチドおよびポリペプチドの合成に、依存する。これらのペプチドおよびポリペプチドとしては、20個の「天然の」アミノ酸およびそれらの翻訳後修飾物が挙げられる。しかし、インビトロのペプチド合成は、修飾アミノ酸および/または普通でないアミノ酸の使用を可能にする。例示的な(しかし、これらに限定されない)、修飾アミノ酸および/または普通でないアミノ酸の表は、本明細書中の以下に提供される。
上記の生物学的な機能的等価物に加え、本発明者らはまた、構造的に類似する化合物を定式化して本発明のペプチドまたはポリペプチドの重要な部分を模倣し得ることを企図する。このような化合物(ペプチド模倣物(peptidomimetic)と名付けられ得る)は、本発明のペプチドとして同様の様式で使用され得、そしてそのため、また機能的等価物でもある。
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのタンパク質性分子(例えば、複数のHCH2領域を有する融合タンパク質)を含む、新規の組成物に関する。本明細書中で使用される場合、「タンパク質性分子」、「タンパク質性組成物」、「タンパク質性化合物」、「タンパク質性鎖」または「タンパク質性物質」は一般的に、約200アミノ酸よりも多いタンパク質、もしくは遺伝子から翻訳される全長の内在性配列;約100アミノ酸より多いポリペプチド;および/または約3〜約100アミノ酸のペプチドをいうが、それらに限定されない。上記の全ての「タンパク質性」という語は、本明細書中で互換可能に使用され得る。
(I.作用機構と適用)
自己免疫疾患はしばしば、T細胞媒介成分およびB細胞媒介成分の両方を含み、それらの成分は、お互いに依存的にかまたは非依存的に、同時にかまたは連続的に作用し得、その結果、組織または細胞の寛解、および1つ以上の生体機能の消失によりしばしば特徴付けられる、宿主損傷性の疾患を生じる。Fcレセプターおよび補体カスケードのタンパク質は、しばしば自己免疫応答の生成、進行中の免疫応答の調節、および免疫応答のエフェクター期(すなわち、組織もしくは細胞の崩壊または組織もしくは細胞の損傷へと導く機構)と密接に関係する。本発明の融合タンパク質は、Fcレセプターおよび/または補体を結合する融合タンパク質の能力により、1つ以上のFcレセプターおよび/または補体の領域に対する融合タンパク質の影響により、疾患の結果を影響し得る。
本発明の別の実施形態において、HCH2ポリマー融合タンパク質は、細胞を特異的に標的化するように構築され得る。1つの実施形態において、本発明の融合タンパク質は、腫瘍細胞、この腫瘍を構成する悪性細胞、または癌細胞を標的化するように構築され得る。腫瘍細胞、癌細胞、すなわち、腫瘍を構成する悪性細胞は、この腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに対する結合が可能な領域を有する、リガンドまたは二重特異性リガンドを使用して標的化され得る。特異的な実施形態において、本発明の融合タンパク質は、Fab’フラグメントあるいは遺伝的または化学的手段によってポリマーと共有結合したFab’フラグメントを使用して、直接的にこの標的細胞に結合する。本発明の別の局面は、HCH2融合タンパク質を使用して、トキシン送達のために腫瘍細胞を含む送達部位を標的化することを含む。トキシンは、この腫瘍細胞を殺傷する。本発明の別の局面は、治療剤送達のために腫瘍細胞を含む送達部位を標的化する、HCH2融合タンパク質を使用することを含む。同様に、本発明のHCH2融合タンパク質が、細菌性病原体、原生動物性病原体、真菌性病原体、マイコプラズマ性病原体、リケッチア性病原体、およびウイルス性病原体による感染から引き起こされる病理状態の処置を求めて、この標的細胞を標的化するために使用され得る。
多くの、所謂、「腫瘍抗原」は、本発明の併用局面に関連した標的として使用され得る任意の1つの抗原であると記載されてきた。多くの例示的な固形腫瘍関連抗原が、本明細書中において、以下に列挙される。このような抗原に対する抗体の調製および使用は、当業者にとって周知であり、そして、例示的な抗体としては、以下が挙げられる:婦人科的な腫瘍部位由来:
腫瘍抗原標的を認識する直接的手段は、特定の抗原について結合親和性を有する抗体の使用を介する。固形腫瘍抗原に対して指向される大規模な数の抗体が公知である。特定の有用な抗腫瘍抗体は、上記に列挙される。しかし、当業者にとって瞬時に理解されるように、これらの列挙された抗体のうちの特定のものは、治療に有用な、適切な生化学的特性を有し得ず、または、十分に腫瘍特異性であり得ない。例は、細胞質抗原を認識するMUC8−22である。このような抗体は、一般的に、モデル系またはスクリーニングアッセイのような調査目的の実施形態においてのみ有用である。
抗体の使用に加え、他のリガンドは、腫瘍細胞抗原に結合することによって、HCH2融合タンパク質を腫瘍部位に指向するために使用され得る。過剰発現されるレセプター(例えば、エストロゲンレセプター、EGFレセプター)または変異レセプターである腫瘍抗原のために、これらに対応するリガンドは、標的化薬剤として使用され得る。
本発明の別の実施形態において、本発明のポリマーは、抗原に連結される。本明細書中で使用される場合、用語「抗原」は、(米国特許第5922845号,13頁において定義されるように)任意の天然免疫原性物質または合成免疫原性物質、免疫原性物質のフラグメントまたは一部分、ペプチドエピトープ、またはハプテンを意味する。1つの実施形態において、本発明のポリマーは、抗原を細胞に標的化して、これらの細胞による抗原の内在化および提示のプロセスを増強し、最終的に免疫応答を刺激するように使用される。別の実施形態において、本発明のポリマーは、この抗原に直接的に特異的に結合するか、または、この抗原に結合するエピトープに特異的に結合する(例えば、抗原また抗原に結合したエピトープを認識し、そして、内在化、プロセシング、および提示のために抗原提示細胞(APC)に対して、この結合した抗原を標的化する、遺伝的な手段または化学的手段によってこのポリマーと共有結合したクローン化されたFab’フラグメント)。別の実施形態において、この抗原は、本発明のポリマーに結合し、そして、同時に、抗原提示細胞の表面レセプターに結合する。好ましい実施形態において、この抗原は、遺伝的手段または化学的手段によって本発明のポリマーと共有結合する。
従来のワクチンは、免疫応答を発生させるために投与される、殺傷されたか、また、弱毒化された、病原性生物またはそれらの産物からなる。従来のアプローチの欠点としては、望まない有害な免疫応答、潜在的に感染性である病原体でのワクチン接種、および乏しい免疫応答が挙げられる。代表的には、これらのワクチンは、効果的な抗体応答を誘発する強力なアジュバントの同時投与を必要とする。ワクチンは、防御免疫を与える可能性が最もあるこれらの抗原性決定因子を送達することによってより効果的に作製され得る。ペプチドに基づくワクチンを開発する為の初期の試みは、APCによる抗原の非効率的な提示に部分的に起因して、乏しい免疫応答を生じた。
免疫寛容は、免疫系の他の応答はインタクトなままでの、特定の抗原に対する病原性免疫応答の欠如を含む、免疫応答の選択的欠如によって特徴付けられる。特定の抗原に対するT細胞非応答性の誘導および維持は、1)クローン除去;2)アネルギー;および3)抑制として広く要約され得るいくつかの機構によって達成され得る。クローン除去は、ネガティブ選択のプロセスであり、これによって、自己抗原に対する高い親和性を有するT細胞が、胸腺において除去される。除去は、プログラム細胞死(アポトーシス)によって達成される。胸腺におけるこのネガティブ選択プロセスは、「中心寛容」として知られる。アネルギーは、増殖およびサイトカイン応答がなくなっていることによって特徴付けられる免疫不活化状態を示す。これは、以前に所定の抗原に対して応答し、そして抗原での再刺激の際に非応答性状態を生じる細胞において誘導される。この機構は、胸腺を出て末梢区画に存在する成熟T細胞に対して作用するので、この形態の寛容は、「末梢寛容」と称される。アネルギーは、任意の多数の分子事象によって誘導され、そして永続的である必要はない:これは、特定のサイトカインによって逆転され得る。3つの共通のアネルギー誘導機構は、同時刺激シグナルなしのT細胞レセプター(TCR)刺激、同時刺激の存在下でさえの準最適TCR刺激、およびIL−10のオートクライン阻害作用である。T細胞機能の抑制は、T細胞寛容が達成され得る第三の機構である。抑制は、調節T細胞がその近位にある抗原特異的T細胞に対する「非特異的」抑制効果を発揮するように誘導される場合に、生じる。この微小環境効果はまた、「バイスタンダー抑制」とも称される。
特定の適用について、治療的因子または薬理学的因子は、HCH2融合タンパク質、特に新生物細胞を殺傷するか、または新生物細胞の増殖もしくは細胞分裂を抑制する能力を有する細胞傷害性因子またはさもなければ抗細胞性因子に結合されることが想定される。一般に、本発明の1局面は、特定の領域を標的化するように構築され、そして標的化細胞に対して活性な形態で送達されるHCH2融合タンパク質に結合体化され得る任意の薬理学的因子の使用を意図する。例示的な抗細胞性因子としては、化学療法剤、放射性同位体および細胞毒素が挙げられる。化学療法剤の場合、ホルモン(例えば、ステロイド)のような因子、代謝拮抗物質(例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサートまたはアミノプテリン);アントラサイクリン;マイトマイシンC;ビンカアルカロイド;デメコルチン;エトポシド;ミトラマイシン;または抗腫瘍アルキル化剤(例えば、クロラムブシルまたはメルファラン)が、特に好ましい。他の実施形態は、サイトカイン、増殖因子、細菌性内毒素または細菌性内毒素のリピドA部分のような因子を含み得る。
一般に、免疫毒素の調製は、当該分野で周知であるが(例えば、米国特許第4,340,535号およびEP 44167(これらは両方とも、本明細書中で参考として援用される)を参照のこと)、本発明者らは、免疫毒素の調製およびその後の臨床的投与のための精製の両方において、特定の利点が、特定の好ましい技術の適用によって達成され得ることを理解している。
本発明のさらなる免疫毒素の局面の最も治療的な適用は、腫瘍細胞への毒素部分の標的化を含むことが意図される。このことは、ほとんどの毒素が、他の潜在的な因子と比較して、細胞殺傷効果を送達する能力がずっと高いことに起因する。しかし、標的抗原が標的化因子/毒素化合物(例えば、免疫毒素)による効果的な中毒と一致する経路によって内在化されないような場合、化学療法剤(例えば、抗腫瘍薬物、他のサイトカイン、代謝拮抗物質、アルキル化剤、ホルモン)を標的化することが所望される場合など、場合による。非標的化因子結合体化対応物を超えるこれらの因子の利点は、標的化因子(例えば、HCH2ポリマー融合タンパク質)によって得られるさらなる選択性である。因子の例として、例えば、ステロイド、シトシンアラビノシド、メトトレキサート、アミノプテリン、アントラサイクリン、マイトマイシンC、ビンカアルカロイド、デメコルチン、エトポシド、ミトラマイシンなどに言及し得る。もちろん、このリストは、組織への特異的送達のために、標的化因子(例えば、抗体または抗体融合タンパク質)に薬学的因子を結合させるための技術が十分確立されているので、単に例示である(例えば、GhoseおよびBlair、1987を参照のこと)。
二重特異的抗体(BsAb)の使用は、本発明の融合タンパク質、ならびに疾患を処置する方法および送達部位を標的化するための方法において意図される。一般に、BsAbの調製はまた、Glennieら(1987)によって例示されるように、当該分野で周知である。
本発明の融合タンパク質と他の治療剤との組み合わせが、変化する免疫、炎症または新生物を含む種々の疾患の臨床処置における使用に対して意図される。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア中に溶解または分散された、有効量の1つ以上の融合タンパク質、治療剤またはさらなる薬剤を含む。本発明の水性組成物は、薬学的に受容可能なキャリアまたは水性媒体中に溶解または分散された、有効量の融合タンパク質を含む。句「薬学的に受容可能なまたは薬理学的に受容可能な」とは、動物(または、適切な場合、ヒト)に投与された場合に、有害な反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生成しない、分子実体および組成物をいう。
本明細書中に記載される全ての組成物は、キット中に含まれ得る。非限定的な例として、免疫グロブリン融合タンパク質、免疫グロブリン融合タンパク質をコードする核酸、および/またはさらなる薬剤が、キット中に含まれ得る。従ってこのキットは、適切な容器手段中に、本発明の融合タンパク質、融合タンパク質をコードする核酸、および/またはさらなる薬剤を含み得る。本発明者らは、キット中に含まれ得る別の成分を想定する。これら成分としては、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体と連結されたペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような免疫検出剤、プロテインAまたはプロテインGが連結されたビーズのような免疫沈降試薬、磁気ビーズのような免疫細胞精製試薬、発現ベクターを取り扱うことを目的とするクローニング試薬、タンパク質発現の目的のための原核細胞株および真核細胞株を含む、タンパク質発現試薬、が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために挙げられる。以下の本実施例において開示される技術が、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、これら技術が本発明の実践のために好ましいモデルを構築することを考慮され得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を参考して、多くの変更が、開示される特定の実施例において成され得、そしてこれらの変更が、依然として本発明の精神および範囲から逸脱すること無く、同様の結果または類似の結果を達成することを理解するべきである。
H−CH2−CH3から構成される、ヒトIgG1のフレームワーク領域を、細胞株ARH−77由来の総RNAから単離し、そしてRT−PCR、ヒンジ領域の直ぐ5’にHindIII部位を導入したプライマーFRM−5p−H3、終止コドンの直ぐ3’側にSalI部位を導入した2番目のプライマーFRM−3p−Salを使用して、サブクローニングした(表5)。クローンpFRM−HSを、DNA配列決定により特徴付けを行い、そしてさらなる構築物の組立のために使用した。この工程およびIgG1のクローニングに関連する後の工程のためのプライマーを、手引きとしてヒトIgG1定常領域の遺伝子(登録番号 Z17370)由来の配列データを使用して、設計した。
PCR増幅のために使用されるプライマーの配列
FcのFcγR結合領域(ヒンジドメインおよびHCH2ドメイン(HCH2)からなる)を、分離した単量体ユニットとして単離した。HCH2単量体ユニット内のヒンジ領域を、PCR変異誘発を使用して改変して、Fcユニット間の鎖間(inter−chain)ジスルフィド架橋を生成する3つのシステインをセリンに変更した。このFcγR結合ドメインを、5’プライマーHinge1(表5)(これは、3つのヒンジのシステインコドン中に単一ヌクレオチド変更を導入し、その結果これらの変更がセリン残基への変更をもたらす)を使用して、増幅した。この5’プライマーはまた、ヒンジ領域の直ぐ5’側にEcoRI部位を導入した。3’プライマーCH2NH3(表5)は、CH2ドメインの増幅を導き、そしてHindIII部位から6ヌクレオチドのスペーサーにより分けられた、3’NruI部位をインフレーム(in−frame)に導入した。このPCR産物をEcoRIおよびHindIIIで消化して、そしてベクターpBSKS+の中にクローニングした。この構築物(5’EcoRI−HCH2−NruI−HindIII 3’からなる)を、制限酵素部位の配列を示すために「ENH」と名付けて、そしてポリマー構築物のための出発ユニットとして提供した。クローンpENH18を、DNA配列決定法により特徴付けて、そしてその後のクローニング工程において使用した。
HCH2ユニットからなるポリマーを、図1に提示されるスキームを使用して組み立てた。HCH2ポリマーを、1つの出発ユニット(ENH)、複数の伸長ユニット(SNH)の連続的な添加により構築して、そして1つのキャッピングユニット(SH3)を添加することにより終結させた。クローンpENH18をNruIおよびHindIIIで消化して、その結果5’平滑末端および3’突出末端を生じた。次いで、SNHインサートを上記のように消化し、そして直線化したベクターの中にライゲーションして、pENH18出発ユニットの3’末端に、HCH2繰り返しユニットのインフレームなインサートを生じた。このインサートはまた、次回の伸長において使用される、元の配列の制限酵素部位(NruI−スペーサー−HindIII)を再生した。この伸長過程は、NruIおよびHindIIIの消化、その後、上記のように次のSNHインサートとのライゲーションの工程を用いて、継続した。この、消化および挿入のサイクルを、直鎖のポリマーを生成するために必要とされるまで繰り返した。ポリマー構築の最終ラウンドにおいて、「キャッピング」ユニット(SH3インサート)を、SNHインサートの代りにポリマーの中にライゲーションした。このことは、内部のクローニング部位の消失を生じた。この結果は、フレームワークの発現ベクター中にHCH2ユニットの段階的な挿入であった。HCH2挿入の方向性を、互換性のない側方の制限酵素部位の使用により維持した。HCH2ユニット間の連結は、5’NruIの半分の部位の、3’SmaIの半分の部位との融合から構成され、その結果、タンパク質ドメインの間にインフレームなGly−Serスペーサーを生じた。完了したポリマー構築物を、EcoRI部位およびHindIII部位でpBSKS+クローニングベクターから遊離させて、そして同様に消化したpFRM−HSの中へとクローニングし、その結果、HCH2ポリマーのIgG1フレームワーク領域へのインフレームな連結を生じた。
ヒトCD8αの分泌シグナルおよび細胞外ドメインの最初の119残基を、PFUポリメラーゼ(Stratagene)、CD8α cDNA、および隣接の5’XhoI部位および3’EcoRI部位を導入するプライマー(表5)を使用して、増幅した。プライマーは、手引きとしてヒトCD8α cDNA(登録番号 M12824)由来の配列データを使用して設計した。PCR生成物を、XhoIおよびEcoRIで消化して、そして同様に消化されたpBlueBac4.5バキュロウイルス輸送ベクター(Invitrogen)の中へとクローニングした。生じた構築物pCD8Bacを、後のクローニング工程のためのホストとして使用した。
トランスフェクション用に定められたプラスミドDNAを、QiagenプラスミドDNA単離カラム(Qiagen plasmid DNA isolation columns)(Quiagen)を使用して精製した。ペレット化したDNAを70%エタノールで繰り返し洗浄して、風乾させて、そして滅菌TE緩衝液に再懸濁した。Sf9昆虫細胞(ATCC)を、100u/mLのペニシリンおよび100μg/mLのストレプトマイシン(Gibco)を含むExCell420培地(JRH Biosciences)中で増殖させた。トランスフェクションの1日前に、10%のSf9調整済み培地で補充したExCell420培地中で、2×106細胞を60mm培養ディッシュ上にプレートした。
より多量のタンパク質を発現させるために、250mL培養物を、スピナーフラスコおよび/またはシェーカーフラスコにおいて開始した。培養物を、100μg/mLのG418、0.1%のプルロニック(pluronic)F−68および抗生物質を補充したExCell420中で増殖させた。培養物上清を遠心分離して、細胞残渣を除去した。PMSF(Sigma)およびPepstatinA(Sigma)をそれぞれ最終濃度1mMおよび1μMまで添加した。
ベクターの有用性を実証するために、ヒトCD8αの細胞外ドメインを、HCH2ポリマー融合タンパク質として発現した。ヒトCD8αの分泌シグナルおよび最初の119残基をHCH2ポリマーのアミノ末端の中にクローニングした。この発現構築物をpIE1−4ベクター(Novagen)中にインサートした。このベクターは、Sf9細胞中で構築的に活性なバキュロウイルスie1遺伝子プロモーター(Jarvisら、1996)の制御の下に融合構築物を置く。トランスフェクトされた昆虫細胞の使用は、ウイルスに感染した細胞において達成されるよりも、より効率的なプロセッシングおよび分泌に起因して、グリコシル化された分泌タンパク質の改善された発現を生じ得る(McCarrollら、1997;Pfeiferら、1998)。
HCH2ユニットの数、潜在的にN−連結されるグリコシル化部位、予想される分子量、およびN−連結されるグリコシル化の、IgG1−Fcフレームワークと融合されたCD8−HCH2ポリマーの見かけの分子量に対する寄与。
構造的整合性および抗原性含量を試験するために、組換えタンパク質をSDS−PAGEゲル上で解離させて、そしてウエスタンブロットにより分析した。タンパク質を7%のSDS−PAGEゲル上に電気泳動され(Laemmliら、1970)、そしてニトロセルロース膜(MSI)に転写された。膜を、トリス緩衝化生理食塩水pH7.4(TBS)中の5%脱脂乳中で、一晩ブロックした。Fcドメインの分析のために、総量50ngの組換えタンパク質または0.5μgのコントロールタンパク質(ヒトIgGおよびBSA)を、ゲル上に装填した。この膜を、TBS中の0.1%の脱脂乳および0.1%の正常ヤギ血清からなる結合緩衝液中で、1:10000希釈で使用される、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識されたヤギ抗ヒトFcポリクローナル抗体(Caltag)で、2時間インキュベーションした。このブロットをTBS−tweenで洗浄して、そして製造業者の指示書に従ってECL−plus化学発光試薬(Amersham)を使用して検出を実施した。
予期された1つの困難性は、オリゴマー化の間にネイティブヒンジ領域と競合する変異HCH2単位の能力であった。このことは、かなりの量のモノマー生成を潜在的に生じ得た。このタンパク質を、還元条件下および非還元条件下でSDS−PAGEゲル上で分析して、そのHCH2ポリマーが抗体様共有結合オリゴマーを形成するか否かを決定した。すべての場合において、その組換えタンパク質はダイマーを形成し、そのダイマーは、2−メルカプトエタノールにより還元し得た。このことは、IgG様オリゴマー化が生じたことを示す。しかし、CD8R0およびCD8R4の両方が、検出可能なレベルのモノマーを生じた。このことが、分泌後のジスルフィド結合還元から生じたのかまたはオリゴマー化の失敗から生じたのかは、未解決のままである。しかし、CD8R0調製物中のモノマーの存在は、競合的機構に対する反証である。
以前、HCH2ポリマーが、ヒトCD8αの細胞外ドメインとの融合物として発現された。どの効果がHCH2ポリマーに起因しそしてどの効果がアミノ末端融合パートナーに起因するのかを識別するために、HCH2ポリマーに融合したHSAのドメインIを用いて、融合タンパク質を構築した。その後、CD8α−HCH2ポリマーの生物学的活性を、HSA−HCH2ポリマーのものと比較した。これらの実験はまた、その発現系の一般的有用性を示すためにもまた役立つ。HSAのドメインIの分泌シグナルおよび最初の197残基を、RT−PCR、細胞株HEP G2(ATCC HB−8065)由来の全RNA、および隣接する5’ XhoI部位および3’ EcoRI部位を導入するプライマーを使用して、増幅した。プライマーは、HSA cDNAからの配列データ(アクセッション番号V00494)を指針として使用して設計した。そのPCR産物を、XhoIおよびEcoRIで消化し、そして同様に消化したpFRM−HCH2ベクター中にクローニングした。このpFRM−HCH2ベクターは、種々の数のHCH2反復を含むHCH2ポリマーとインフレームに融合されたN末端タンパク質ドメインの発現を指向する。このベクター骨格は、pIE1−4昆虫細胞発現ベクター(Novagen)に由来し、このベクター骨格は、バキュロウイルスie1遺伝子プロモーターの制御下に融合タンパク質構築物を配置する。
6人の健常ドナーの末梢血単核細胞(PBMC)を、Ficoll−Paque勾配(Pharmacia Biotech Inc)上のヘパリン化血液から単離し、そしてAIM V規定無血清培地(Gibco BRL)において懸濁した。組換えタンパク質ストックを、まずRPMI 1640中に調製した(濃度≧1mg/ml)。組換えタンパク質ストックを、図面に示される所望の最終濃度を達成するまで、AIM V培地(Fisher Scientific)中で希釈した。IgG凝集物を調製するために、4mgのヒトIgG(Organen Teknika Corp.)を、2mlの生理食塩水中に溶解し、そして57℃にて1時間インキュベートした。得た熱凝集IgG(AIG)を、図面に示される所望の最終濃度までAIM V培地中で希釈した。rIL−2(Pharmingen)を、最終濃度1ng/mlで添加した。抗CD16 mAb 3G8(Caltag Laboratories)でPBMCを刺激するために、重炭酸緩衝液(pH8.4)中の50μlのmAb 3G8(10μg/mlまたはその希釈物)を、96ウェル平底組織培養プレート(Corning Costar)の各ウェル中に、室温で3時間重層した。その後、そのウェルを生理食塩水で徹底的に洗浄し、吸引し、その直後に細胞培養のために使用した。PBMCを、96ウェル平底プレート中に最終濃度2×106細胞/ml(0.200ml/ウェル最終体積)または48ウェル平底プレート中に最終濃度2×106細胞/ml(1ml/ウェル最終体積)でプレーティングした。サイトカイン誘導のために、細胞を、5%大気CO2中で37℃にて加湿インキュベーター中で48時間インキュベートし、そして上清を採集し、そして2100rpmで10分間遠心分離して、細胞および細胞破片をペレットにした。無細胞上清を、サイトカイン含量についてアッセイするまで−80℃にて凍結した。増殖アッセイのために、細胞を、5%大気CO2中で37℃にて加湿インキュベーター中で72時間インキュベートした。培養の最後の5時間の間、ウェルを、1μCiの[メチル−3H]チミジン(Amersham Corp)でパルスした。PhD細胞採集器(Cambridge Technologies)を使用して、細胞を採集した。Beckman Scintillation Counter LS 5000TD(Beckman Instruments)を使用して、放射能を測定した。
IFN−γおよびTNF−αを検出するために、サンドイッチELISAを使用した。IFN−γを検出するために、マウス抗ヒト抗体クローンNIB42を、捕捉抗体として使用し、そして抗体クローン4S.B3を、検出抗体として使用した(両方とも、Pharmingen Corporationから得た)。TNF−αを検出するために、マウス抗ヒト抗体クローンMAb1を、捕捉抗体として使用し、そして抗体クローンMAb11を、検出抗体として使用した(両方とも、Pharmingen Corporationから得た)。ELISAプレート(Costar Corporation,Cambridge,MA)を、炭酸緩衝液(0.5M、pH8.5)中0.75μg/mlの捕捉抗体を0.1mg/ウェルで、コーティングした。プレートを、室温(RT)で一晩インキュベートした。ダルベッコリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)中の2%結晶化BSAを0.100ml、各ウェルに室温でさらに3〜6時間添加した。プレートをDPBSで徹底的に洗浄し、そして組換えIFN−γもしくはTNFα(標準物質として)(Pharmingen Corp.)または細胞上清を、添加した。組換えIFN−γまたはTNFαを、10ng/ml〜0.15ng/mlに1:3連続希釈した。細胞上清を、50%希釈物および10%希釈物にてアッセイした。;プレートを、4℃で一晩インキュベートし、ウェルを洗浄し、そしてDPBS中の0.2% BSA中0.75μg/mlのビオチン化結合抗体0.200mlを室温で2時間重層した。ウェルを洗浄し、そしてビオチンと反応性のヤギポリクローナル親和性精製IgG(1% DPBS中1:400)(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)0.200mlを室温で1時間重層した。ウェルを洗浄し、そしてクエン酸緩衝液(0.1M、pH4.5)中のオルトフェニレンジアミン(4mg/ml)0.200mlを、各ウェルに添加した。プレートを、Thermomax Microplateリーダー(Molecular Devices,Corp.,Menlo Park,CA)上で読み取った。
可能なHCH2ポリマー−FcγRIII相互作用を評価するために、HCH2ポリマーを、PBMC単離物中のNK細胞を活性化する能力について評価した。NK細胞は、低親和性IL−2レセプターと、FcγRIII(CD16)との両方を発現する(Naglerら、1990)。高レベルIL−2(1ng/mL)で刺激した場合、NK細胞は、CD16連結物に対する増殖応答を開始する。誘発されるこの応答を、FcγRと係合するIC分子、AIG分子および組換え分子の適合性の試験として使用した。2つの異なるHCH2ポリマー構築物の組を、PBMCを活性化する能力について試験した。1組は、CD8αの細胞外ドメインを発現し(CD8R0、CD8R2、CD8R3、およびCD8R4と呼んだ)、もう一組は、HSAのドメイン1を発現した(HSAR0、HSAR2、HSAR3およびHSAR4と呼んだ)。
(組換えHCH2ポリマーおよびIL−2によるPBMCの同時刺激からの増殖応答)
HCH2ポリマータンパク質によるPBMC活性化は、HCH2領域反復の数と相関し、このことは、HCH2ポリマータンパク質中のHCH2の数に対するFcγレセプターによる高レベルの感受性を示す(図5)。PBMCを、IL−2の存在下で、種々の数のHCH2ドメインを含む、種々の濃度の異なるHCH2ポリマータンパク質に曝した(図5)。結果:各HCH2ポリマータンパク質について、用量依存性応答が観察される。PBMCは、より数の多い反復HCH2単位を含むHCH2ポリマータンパク質に対して、良好に応答する。従って、HCH2ポリマータンパク質は、Igに対するレセプター反応性の微妙な差異を識別するために使用され得る。図5の凡例に示されるように、IL−2の非存在下でのHCH2ポリマータンパク質に対する増殖応答は、培地単独において見出される増殖応答と近かった。従って、PBMCが増殖するように活性化させるHCH2ポリマータンパク質の能力は、固定抗CD16 Abを用いて観察されたのと同様に、IL−2による同時刺激に依存する。示されるデータは、4人の異なるドナー由来のPBMCを使用して得た平均を示す。
異なるタンパク質由来のドメインとともに反復HCH2単位を用いて構築されたHCH2ポリマータンパク質の生物学的機能を直接比較するために、HSAのドメイン1を発現するHCH2ポリマータンパク質(HSAR0およびHSAR4)がPBMCを活性化させる能力を、CD8αの細胞外ドメインを発現するHCH2ポリマータンパク質(CH8R0およびCD8R4)の能力と比較した。HSAR0、HSAR4、CD8R0およびCD8R4を、実施例8に記載されるようにPBMCを活性化させるために、IL−2(1ng/ml)とともに濃度5μg/mlで使用した。結果:表8に示されるように、HSAR0、HSAR4、CD8R0およびCD8R4はすべて、IL−2の存在下でPBMCが増殖するように活性化させる。増殖応答の増加が、共発現されるタンパク質ドメインに関わらず、より多くの数のHCH2反復単位を含む構築物と用いて着目される。従って、異なる型のタンパク質由来のドメインを共発現しなおそのHCH2反復単位の生物学的活性化特性を保持する、HCH2ポリマータンパク質が、種々の数のHCH2反復単位を用いて構築され得る。
(組換えHCH2ポリマーおよびIL−2によるPBMCの同時刺激からの増殖応答)
HCH2ポリマータンパク質は、天然のIgG1リガンドおよび抗CD16 mAbと同様の様式で、PBMCがサイトカインを分泌するように活性化させる(表9)。PBMCを、IL−2単独でか、またはIL−2+固定抗CD16抗体3G8(10μg/ml)、IL−2+凝集IgG(40μg/ml)もしくはIL−2+HSAR4(40μg/ml)を用いて活性化した(表9)。PBMCによるIFNγ生成およびTNFα生成の両方が、抗CD16 Ab、AIG、およびHSAR4の存在下で、IL−2単独と比較して増加する。
(IL−2単独でか、または固定抗CD16 mAb、凝集IgG、もしくはHSAR4で刺激された、PBMCからのサイトカイン分泌)
特定の治療適用のために、HCH2ポリマーへの補体の結合は、望ましくなく潜在的に有害な副作用を引き起こし得る。さらに、このHCH2ポリマーへの補体結合は、特定の研究における結果を混乱し得る。昆虫細胞は、変化した糖質部分を有するタンパク質を発現することが公知である。これらの変化は、これらのタンパク質への補体因子C1qの結合を弱め得る。この理由のために、昆虫細胞株SF9において発現されるHCH2ポリマーへのC1qの結合を、調査した。昆虫細胞において発現されるヒトIgGまたはHCH2ポリマーへのC1qの結合を試験するアッセイを、行った。種々の濃度のヒトC1qを、96ウェルELISAプレートのウェル上に前もって固定した、ヒトIgGまたはHCH2ポリマーであるHSAR0およびHSAR4のいずれかに、結合させた。C1q結合の程度を、ヤギ抗ヒトC1qポリクローナル抗体を使用して検出した。その結果(図6に図示される)は、昆虫細胞発現系から単離されたHCH2ポリマーが、ネイティブIgGよりも弱くC1qと係合することを示す。
EAEを、6〜7週齢のSJL/Jマウスにおいて誘導した。各マウスに、合計0.1mlのアジュバントを、背中の3つの部位にわたって分布するように投与した。注射は、側腹部の上および肩の肩甲骨の間の、剃毛した皮膚領域中に皮内送達した。免疫のためのアジュバントを調製するために、ミエリンプロテオリピドタンパク質ペプチド139〜151(Peptides International,Louisville,KY)を、1.5μg/mlでPBS中に溶解し、そして等容量の完全フロイントアジュバント(Difco Laboratories,Detroit,MI)で乳化した。0.1mlの生理食塩水中の200ngの百日咳毒素(List Biological Labs Inc.,Campbell、CA)を、免疫1日後および3日後の各マウスの尾静脈中に注射した。疾患の重篤度に対するその構築物の効果を決定するために、マウスに、生理食塩水単独(150μl総容積)をか、またはHSAR0を含む生理食塩水(50μg HSAR0/150μl生理食塩水)をか、またはHSAR4を含む生理食塩水(50μg HSAR4/150μl生理食塩水)を、腹腔内注射した。マウスに、これらの構築物または生理食塩水コントロールを、免疫3日前、免疫1日後、および免疫3日後に注射した。臨床疾患を、重篤度が増加する以下の0〜5のスケール上に段階分けした:0(異常なし);1(弛緩性の尾);2(軽度の後肢衰弱を伴う弛緩性の尾);2.5(完全には麻痺していない中程度の後肢の衰弱);3(後肢の全体的麻痺);4(前肢の衰弱または麻痺を伴う、後肢の麻痺);5(瀕死)。瀕死状態になったマウスを、安楽死させた。
以下の参考文献は、それらが本明細書中に示される例示的手順または他の詳細を補充する例示的手順または他の詳細を提供する程度に、本明細書中で参考として援用される。
Claims (64)
- 以下:
ヒト抗体またはヒト化抗体のFab領域、CD8α、HSAあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域;および
IgGの少なくともHCH2領域の少なくとも3コピーを含む第二領域であって、該HCH2領域が少なくともアミノ酸残基216〜340を含む、第二領域;
を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、FcγRを発現する細胞を標的化し、FcγRに結合し、そして/または補体成分に結合する、ポリペプチド。 - 前記HCH2領域が、ヒトIgG1由来のHCH2領域である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、単鎖、2量体、または3量体である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、凝集IgGおよび免疫複合体と、FcγRとの機能的相互作用を模倣するために適応する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 哺乳動物免疫グロブリンのアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記アミノ酸配列が、免疫グロブリンの少なくとも2つの配列を含む、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記哺乳動物免疫グロブリンが、ヒト、げっ歯類、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコまたはブタの免疫グロブリンである、請求項6に記載のポリペプチド。
- 前記哺乳動物免疫グロブリンが、マウス免疫グロブリンである、請求項8に記載のポリペプチド。
- 前記哺乳動物免疫グロブリンが、ヒト免疫グロブリンである、請求項8に記載のポリペプチド。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgEまたはIgMのアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
- IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgEおよびIgMからなる群に由来する少なくとも2つの配列を含むアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のポリペプチド。
- FcγR、FcαR、FcεR、FcμR、FcδRまたはFcRnの1つ以上を発現する細胞を標的化するために適応する、請求項10に記載のポリペプチド。
- FcγR、FcαR、FcεR、FcμR、FcδRまたはFcRnの群に由来する少なくとも2つに結合するために適応するようにさらに定義された、請求項12に記載のポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、免疫欠損障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、炎症性ニューロパシー、慢性関節リウマチ、狼瘡および/または喘息を処置するために適応される、ポリペプチド。
- 請求項1に記載のポリペプチドであって、該ポリペプチドが、アポトーシス、壊死または溶解を促進させるか、あるいは、新生物細胞および/もしくはウイルス感染細胞の細胞分裂を減少させるために適応される、ポリペプチド。
- 補体結合を変更するために適応される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 水溶液中に溶解性である、請求項1に記載のポリペプチド。
- NK細胞、単球、マクロファージ、T細胞またはB細胞を標的化し得る、請求項1に記載のポリペプチド。
- ワクチンとしての使用のために適用される、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二領域が、前記ポリペプチドの凝集する傾向を変更させるアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二領域が、前記ポリペプチドの補体への結合を増強させるか、または選択的に低減させるアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記第二領域が変更されたヒンジ領域を含む、請求項1に記載のポリペプチドであって、該変更されたヒンジ領域は、FcγRおよび/または補体結合を保存し、かつ分子間ジスルフィド結合形成を防ぐ、ポリペプチド。
- 前記第二領域が、前記ポリペプチドのFcγRサブタイプへの結合を増強させるか、または選択的に低減させるアミノ酸置換を含む、請求項1に記載のポリペプチド。
- 26kDaと1500kDaとの間である、請求項1に記載のポリペプチド。
- 45kDaと600kDaとの間である、請求項25に記載のポリペプチド。
- 抗体配列およびIgGの少なくともHCH2領域の少なくとも3コピーを含み、該HCH2領域が少なくともアミノ酸残基216〜340を含む、ポリペプチド。
- ポリペプチドをコードする核酸であって、該ポリペプチドは、以下:
ヒト抗体またはヒト化抗体のFab領域、CD8α、HSAあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域;および
IgGの少なくともHCH2領域の少なくとも3コピーを含む第二領域であって、該HCH2領域が、少なくともアミノ酸残基216〜340を含む、第二領域;
を含むポリペプチドであって、ここで、該ポリペプチドは、FcγRを発現する細胞を標的化し、FcγRに結合し、そして/または補体成分に結合する、ポリペプチド、
をコードする、核酸。 - 前記HCH2領域が、ヒトIgG1由来のHCH2領域である、請求項28に記載の核酸。
- 免疫グロブリンフレームワーク領域をコードする領域をさらに含む、請求項28に記載の核酸。
- 前記第一および第二領域が、タンパク質ドメインおよび/またはリンカー基によって作動可能に連結される、請求項28に記載の核酸。
- 前記第一領域が、細胞表面マーカーに対する結合部位を含む、請求項28に記載の核酸。
- 前記細胞表面マーカーが抗原である、請求項32に記載の核酸。
- 前記Fab配列が、適切な条件下で、腫瘍関連抗原に結合し得る、請求項28に記載の方法。
- 前記Fab配列が、ヒト抗体またはヒト化抗体に由来する、請求項28に記載の核酸。
- 前記Fab配列が、2つの別個の抗原または細胞表面マーカーに結合する、請求項28に記載の核酸。
- 前記結合部位が、細胞レセプター、レセプターリガンドまたは接着分子の結合部位を含む、請求項32に記載の核酸。
- 前記ポリペプチドが免疫グロブリン融合タンパク質としてさらに定義される、請求項28に記載の核酸。
- 免疫グロブリンHCH2のヒンジ領域およびCH2領域の少なくとも3コピーを含む前記領域が、組換えタンパク質として発現可能である、請求項38に記載の核酸。
- クローニングベクターとしてさらに定義される、請求項28に記載の核酸。
- ヒト抗体またはヒト化抗体のFab領域、CD8α、HSAあるいは輸送タンパク質由来の配列の少なくとも一部を含む第一領域およびIgGの少なくともHCH2領域の少なくとも3コピーを含む第二領域を含むポリペプチドを含む、組成物であって、ここで、該ポリペプチドは、FcγRを発現する細胞を標的化し、FcγRに結合し、そして/または補体成分に結合し、該HCH2領域は少なくともアミノ酸残基216〜340を含み、該組成物は、少なくとも1つの細胞に投与されるのに適している、組成物。
- 前記ポリペプチドが、免疫グロブリンフレームワーク領域をさらに含む、請求項41に記載の組成物。
- 前記組成物が哺乳動物を治療するためのものである、請求項41に記載される組成物。
- 前記組成物が、経口、経鼻、または注射を介して投与されるのに適している、請求項43に記載の組成物。
- 前記組成物が、静脈内、腹腔内、筋肉内または皮下の注射を介して投与されるのに適している、請求項44に記載の組成物。
- 前記組成物が、0.75mg/kg体重で投与されるのに適している、請求項43に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項43に記載の組成物。
- 請求項43に記載の組成物であって、ここで、前記哺乳動物は、免疫欠損障害、皮膚筋炎−多発筋炎、感染症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎、前立腺炎、炎症性疾患、自己免疫疾患、アレルギー疾患、中枢神経系の変性疾患、炎症性ニューロパシー、慢性関節リウマチ、狼瘡および/または喘息を有する、組成物。
- 前記組成物が炎症性疾患を処置するためのものである、請求項48に記載の組成物。
- 前記炎症性疾患が、多発性硬化症、クローン病、潰瘍性大腸結腸炎、狼瘡、慢性関節リウマチ、ブドウ膜網膜炎、アレルギー性鼻炎、アルツハイマー病、ALS、脊髄損傷、免疫欠損障害、皮膚筋炎、多発筋炎、感染症、喘息、エリテマトーデス、重症筋無力症、自己免疫性甲状腺炎、間質性膀胱炎または前立腺炎である、請求項49に記載の組成物。
- 前記組成物が、哺乳動物において免疫性を変更させるためのものである、請求項43に記載の組成物。
- 前記組成物が、新生物細胞を殺傷するためのものである、請求項41に記載の組成物。
- 前記新生物細胞が癌腫細胞である、請求項52に記載の組成物。
- 前記組成物の投与が、補体依存的細胞傷害を生じる、請求項52に記載の組成物。
- 前記新生物細胞が、哺乳動物に含まれる、請求項52に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項55に記載の組成物。
- 前記組成物が、ウイルス感染細胞を殺傷するためのものである、請求項41に記載の組成物。
- 前記組成物の投与が、補体依存的細胞傷害性を生じる、請求項57に記載の組成物。
- 前記ウイルス感染細胞が、哺乳動物に含まれる、請求項57に記載の組成物。
- 前記哺乳動物が、ヒトまたはげっ歯類である、請求項59に記載の組成物。
- 免疫学的産物を調製する方法であって、該方法は、以下の工程:
リガンド結合ドメインを含む第一領域、およびIgGの少なくともHCH2領域の少なくとも3コピーを含む第二領域を含む、抗原およびポリペプチドの量で、非ヒト哺乳動物を免疫する工程であって、該第一領域は抗体の一部または全体を含み、該HCH2領域は少なくともアミノ酸残基216〜340を含む、工程;ならびに
該非ヒト哺乳動物において、免疫学的産物を産生させる工程であって、該産物が、T細胞、T細胞によって産生される産物、B細胞、またはB細胞によって産生される抗体である、工程、
を包含する、方法。 - 前記免疫学的産物が、前記哺乳動物から得られる、請求項61に記載の方法。
- 前記第一領域が、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア属、マイコプラズマ、細菌、原生動物寄生虫または後生動物寄生虫への結合に適応する、請求項61に記載の方法。
- 前記第一領域が、腫瘍、ウイルス、真菌、リケッチア属、マイコプラズマ、細菌、原生動物寄生虫または後生動物寄生虫に由来する、タンパク質または非タンパク質分子に結合体化されている、請求項61に記載の方法。
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