ES2257446T3 - Ensayo para detectar directamente un indicador de inflamacion en una muestra de fluido corporal. - Google Patents

Abstract

Un kit para detectar directamente al menos un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra, comprendiendo dicho kit i) un soporte sólido, y ii) una diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido, siendo dicha especie de reconocimiento capaz de detectar directamente al menos un indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y iii) un conjugado que comprende una molécula polimérica vehículo unida a a) al menos una primera y/o segunda especie de reconocimiento capaz de unir directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y b) al menos una especie de marcaje, y en el que el conjugado comprende A) una molécula polimérica vehículo que comprende una diversidad de al menos un grupo funcional reactivo, B) al menos un resto de conexión unido a al menos un grupo funcional reactivo, C) almenos una especie molecular seleccionada entre el grupo de especies moleculares compuesta por especies de reconocimiento y especies de marcaje, en el que cada una de las especies moleculares comprende al menos un grupo funcional que es reactivo con al menos un resto de conexión unido al reactivo, D) en el que el conjugado comprende al menos una especie molecular unida covalentemente a éste a través de un resto de conexión, iv) una zona de aplicación para aplicar la muestra que comprende el indicador de inflamación, comprendiendo dicha zona al menos un conjugado, siendo dicho conjugado móvil y estando dicha zona de aplicación en contacto líquido con v) una zona de detección para detectar la presencia, cantidad o concentración de dicho al menos un conjugado, comprendiendo además dicha zona la diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido.

Description

Ensayo para detectar directamente un indicador de inflamación en una muestra de fluido corporal.

Ámbito técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para la detección rápida de al menos un indicador de inflamación contenido en una muestra de fluido corporal. El procedimiento se usa para diagnosticar rápidamente una dolencia infecciosa y/o inflamatoria en un individuo.

El procedimiento comprende las etapas adicionales de detectar una diversidad de agentes infecciosos y/o de respuesta inflamatoria, preferiblemente citoquinas, y realizar un perfil de estos agentes. El perfil es una indicación adicional de la dolencia que se está diagnosticando.

El procedimiento además comprende una etapa de detección de al menos un agente de respuesta inflamatoria, tal como al menos un agente del sistema inmune, preferiblemente autoanticuerpos, y opcionalmente realizar un perfil de estos agentes. El agente puede ser la única y la primera indicación de la dolencia que se está diagnosticando o puede contribuir como una indicación adicional de la dolencia que se está diagnosticando.

Los procedimientos de la invención se realizan mediante la puesta en contacto de i) una muestra de fluido corporal que potencialmente contiene un agente de infección y/o de respuesta inflamatoria, incluyendo citoquinas y autoanticuerpos, con ii) una especie de reconocimiento que preferiblemente es detectable de forma cuantificable y capaz de reconocer específicamente un agente infeccioso predeterminado y/o un agente de respuesta a infección predeterminado. Se prefiere que el contacto tenga lugar esencialmente sin tratamiento previo de la muestra de fluido corporal.

La especie de reconocimiento preferiblemente comprende un anticuerpo capaz de ponerse en contacto con uno o ambos de un agente infeccioso y un agente de respuesta a infección. La especie de reconocimiento también puede comprender un marcador visible capaz de ser detectado cuando el complejo de la especie de reconocimiento con uno o ambos de un agente infeccioso y un agente de respuesta a infección esté en contacto con un área de prueba sólido en, por ejemplo, un dispositivo de flujo lateral.

Antecedentes de la invención

La patente de Estados Unidos Nº 5.587.285 describe un ensayo de detección de anticuerpos frente a VIH altamente sensible. El ensayo detecta la presencia de anticuerpos frente a VIH mediante el uso de un determinante antigénico de VIH no desnaturalizado que se une de forma inmunorreactiva a anticuerpos frente a VIH en una muestra biológica. El determinante antigénico de VIH no desnaturalizado ha proporcionado un medio para detectar anticuerpos frente a VIH en muestras de suero probadas como seronegativas para la presencia de anticuerpos de VIH dirigidos frente a antígenos VIH desnaturalizados.

La patente de Estados Unidos Nº 5.093.230 se refiere a un procedimiento de ensayo para detectar anticuerpos IgM frente a un retrovirus seleccionado entre el grupo compuesto por VIH-1, VIH-2, HTLV-I y HTLV-II. El procedimiento se realiza durante 70 minutos y comprende las etapas de i) poner en contacto papel de nitrocelulosa que contiene la proteína antigénica de retrovirus resuelta y transferida obtenida del lisado viral resuelto por gel de electroforesis con una muestra de ensayo e incubar en condiciones predeterminadas el papel de nitrocelulosa y la muestra de ensayo para permitir la unión de los anticuerpos presentes en la muestra con la proteína en el papel de nitrocelulosa, iii) poner en contacto el papel de nitrocelulosa incubado de la etapa i) con un antisuero anti-IgM conjugado con una enzima reactivo con dichos anticuerpos e incubar para permitir la unión del antisuero con dichos anticuerpos, iii) poner en contacto el papel de nitrocelulosa incubado de la etapa ii) con un sustrato enzimático específico para la enzima de la etapa ii) e incubar hasta producir color, iv) detener la reacción de producción de color de la etapa iii); y v) evaluar la cantidad de color producido como indicación de la presencia de anticuerpos en el lisado viral.

El documento EP 0267317 (PROFILE DIAGNOSTIC SCIENCES) describe un procedimiento para la detección de proteínas o virus diana en una muestra, las muestras se tratan para retirar componentes no deseados y, a continuación, se pone en contacto con un suporte en fase sólida extendida que se ha conjugado sobre el mismo con el anticuerpo antidiana (Ac v) para formar inmunocomplejos con antígenos característicos de las proteínas o virus que se van a detectar; la fase sólida extendida se separa de la muestra; la fase sólida extendida separada se pone en contacto con una fase sólida móvil compuesta por microesferas dispersas a las que se ha conjugado el Ac v para unir las microesferas a los inmunocomplejos; la fase sólida extendida se separa de la fase sólida móvil y se detecta la presencia de microesferas unidas a la fase sólida extendida, por lo que se detecta o determina la presencia de proteína o de virus en la muestra.

Se han detectado una diversidad de citoquinas en la técnica previa. La patente de Estados Unidos Nº 5.587.294 se refiere a un procedimiento para medir citoquinas endógenas en sangre. Las citoquinas se miden en presencia de sustancias que se unen a las citoquinas y originan procedimientos convencionales que dan resultados poco precisos. La invención también se aplica a una medición no invasiva de citoquinas en fluidos biológicos tales como saliva y secreciones nasales. En una realización, la invención se refiere a un procedimiento para controlar la terapia con citoquinas en un humano, en donde la citoquina es capaz de unirse a una molécula vehículo, a condición de que la molécula de citoquina no sea IL-1. El procedimiento comprende las etapas de i) obtener una muestra de fluido corporal humano que comprende potencialmente una citoquina, ii) formar una mezcla de ensayo combinando la muestra de la etapa i) con a) un anticuerpo capaz de unirse de forma específica a sustancialmente todas las citoquinas, en donde el anticuerpo está inmovilizado en un soporte en fase sólida, y b) un epítope de unión marcado de la citoquina, en donde el epítope de unión marcado compite con la citoquina por la unión al anticuerpo, iii) incubar la mezcla de ensayo para permitir que el anticuerpo inmovilizado se una específicamente con la citoquina o con el epítope de unión marcado, iv) lavar el epitope de unión marcado no unido del soporte en fase sólida, v) detectar el marcaje unido al soporte en fase sólida, vi) determinar la cantidad de la citoquina en la muestra. En una etapa adicional, la determinación de la cantidad de citoquina se compara con la cantidad de citoquina en la muestra con una determinación de la citoquina en una muestra de fluido corporal previa. Las citoquinas preferidas son interleuquina-2, interleuquina-6, interferón-\alpha, interferón-\gamma y factor de necrosis tumoral-\alpha.

Resumen de la invención

En un primer aspecto, se proporciona un procedimiento para detectar al menos un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra en una cantidad de menos de 100 nanogramos (100 x 10^{-9} gramos) por mililitro (10^{-3} litros). El procedimiento comprende las etapas de:

i) poner en contacto la muestra con un kit que comprende

a)

un soporte sólido, y

b)

una diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido, siendo dicha especie de reconocimiento capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

c)

un conjugado que comprende una molécula polimérica vehículo unido a i) al menos una primera y/o segunda especie dirigido capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el suporte sólido, y ii) al menos una especie de marcaje y

ii) detectar una especie de reconocimiento capaz de dirigirse al indicador de inflamación predeterminado.

donde la detección de la especie de reconocimiento es indicativo de la presencia del indicador de inflamación predeterminado en la muestra.

Por la expresión indicador o agente de inflamación se entiende un indicador de actividad inflamatoria y/o del sistema inmune siendo estos indicadores, por ejemplo, citoquinas y autoanticuerpos.

En un aspecto adicional se proporciona un procedimiento para diagnosticar una dolencia infecciosa en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

i) detectar un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra de fluido corporal según el procedimiento de la invención, y

ii) diagnosticar dicha dolencia infecciosa.

Aún en un aspecto adicional se proporciona un procedimiento para diagnosticar una dolencia inflamatoria en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

iii) detectar al menos un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra de fluido corporal según el procedimiento de la invención, y

iv) diagnosticar dicha dolencia inflamatoria.

Aún aspectos adicionales de la invención se refieren a un kit según la invención para su uso en i) un procedimiento para detectar un indicador de inflamación predeterminado, ii) un procedimiento para diagnosticar una dolencia infecciosa y/o inflamatoria en un individuo.

Dibujos

La Figura 1 muestra una representación esquemática de autoanticuerpos seleccionados detectables según la presente invención.

Descripción detallada de la invención

En una realización preferida la presente invención se refiere a un kit para detectar directamente un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra, comprendiendo dicho kit

i) un soporte sólido, y

ii) una diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido, siendo dicha especie de reconocimiento capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

iii) un conjugado que comprende una molécula polimérica vehículo unido al menos a

a)

una primera y/o segunda especie de reconocimiento que es capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

b)

al menos una especie de marcaje,

A)

donde la molécula polimérica vehículo comprende una diversidad de al menos un grupo funcional reactivo,

B)

al menos un resto de conexión unido a al menos un grupo reactivo funcional y

C)

al menos una especie molecular seleccionada entre el grupo de especies moleculares compuesto por especies de reconocimiento y especies de marcaje, en donde cada uno de las especies moleculares comprende al menos un grupo funcional que es reactivo con al menos un resto de conexión unido al reactivo y

D)

en donde el conjugado comprende al menos una especie molecular unida covalentemente a éste mediante un resto de conexión,

iv) una zona de aplicación para aplicar la muestra que comprende el indicador de inflamación, comprendiendo dicha zona al menos un conjugado, siendo dicho conjugado móvil y estando dicha zona de aplicación en contacto líquido con

v) una zona de detección para detectar la presencia, cantidad o concentración de dicho al menos un conjugado, comprendiendo adicionalmente dicha zona la diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido.

En una realización preferida, el kit es adecuado para detectar un indicador de inflamación presente en una muestra en una cantidad de menos de aproximadamente 100 nanogramos (100 x 10^{-9} gramos) por mililitro (10^{-3} litros).

La molécula polimérica vehículo preferiblemente comprende grupos funcionales reactivos en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 5.000 \mumoles por gramo de vehículo polimérico.

En otra realización, la molécula polimérica vehículo comprende, por ejemplo, una cadena de dextrano que según la invención comprende menos de aproximadamente 400 especies de marcaje, preferiblemente en forma de especies de marcaje visiblemente detectables o especies de marcaje detectable por fluorescencia, tal como menos de 380 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 360 especies de marcaje, tal como menos de 340 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 320 especies de marcaje, tal como menos de 300 especies de marcaje, por ejemplo menos de 280 especies de marcaje, tal como menos 260 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 240 especies de marcaje, tal como menos de 220 especies de marcaje, por ejemplo menos de 200 especies de marcaje, tal como menos de 180 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 160 especies marcaje, tal como menos de 140 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 120 especies de marcaje, tal como menos de 100 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 80 especies de marcaje, tal como menos de 70 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 60 especies de marcaje, tal como menos de 50 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 40 especies de marcaje, tales como menos de 30 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 25 especies de marcaje, tal como menos de 20 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 15 especies de marcaje, tal como menos de 12 especies de marcaje, por ejemplo menos de 10 especies de marcaje, tal como menos de 8 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 4 especies de marcaje, tal como menos de 3 especies de marcaje, por ejemplo, menos de 2 especies de marcaje.

El peso molecular de una cadena de dextrano polimérico preferiblemente es de aproximadamente 500.000 Da, pero también pueden usarse pesos moleculares de aproximadamente 100.000 Da a aproximadamente 900.000 Da.

En una realización, cada cadena de dextrano comprende aproximadamente 2.700 unidades de glucosa de las que el 20-22% se activan, preferiblemente con divinil sulfona, aunque también pueden usarse otros restos de conexión como se describe a continuación en detalle.

En una realización, aproximadamente la mitad de los aproximadamente 600 restos de conexión, preferiblemente, pero sin limitaciones, grupos divinil sulfona, por cadena de dextrano reaccionan con especies de reconocimiento y especies de marcaje según la invención y esto proporciona la cifra de menos de aproximadamente 400 especies de marcaje por cadena de dextrano. Sin embargo, está claro que más de aproximadamente la mitad de los 600 restos de conexión pueden reaccionar bien con una especie de marcaje y el número de especies de marcaje puede, por tanto, ser mayor de aproximadamente 400.

El número de especies de marcaje y de especies de reconocimiento en una única molécula polimérica vehículo según la invención influye en la cantidad mínima de indicadores de inflamación que pueden detectarse según la invención. En una realización, la cantidad mínima detectable de células es de menos de 100 nanogramos por mililitro de muestra, tal como menos de 95 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 90 nanogramos por mililitro, tal como menos de 85 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 70 nanogramos por mililitro, tal como menos de 75 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 70 nanogramos por mililitro, tal como menos de 65 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 60 nanogramos por mililitro, tal como menos de 55 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 50 nanogramos por mililitro, tal como menos de 45 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 40 nanogramos por mililitro, tal como menos de 35 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 30 nanogramos por mililitro, tal como menos de 25 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 20 nanogramos por mililitro, tal como menos de 15 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 10 nanogramos por mililitro, tal como menos de 5 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 1 nanogramo por mililitro, tal como menos de 0,5 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 0,1 nanogramo por mililitro, tal como menos de 0,05 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 0,01 nanogramos por mililitro, tal como menos de 0,005 nanogramos por mililitro, por ejemplo, menos de 0,001 nanogramo por mililitro de muestra.

El indicador de inflamación, que incluye una citoquina y/o un autoanticuerpo, presente en una muestra, tal como por ejemplo una muestra de fluido corporal, se detecta y se registra preferiblemente como un resultado diagnóstico positivo según un procedimiento de la invención en menos de aproximadamente 20 minutos, tal como menos de 15 minutos, por ejemplo, menos de 10 minutos, tal como menos de 8 minutos, por ejemplo, menos de 7 minutos, tal como menos de 6 minutos, por ejemplo, menos de 5 minutos, tal como menos de 4 minutos, por ejemplo, menos de 3 minutos, tal como menos de 2 minutos, por ejemplo, menos de 1 minuto, tal como menos de 45 segundos, por ejemplo, menos de 30 segundos, tal como menos de 15 segundos.

Los parámetros de calidad estadística preferidos para la presente invención cuando el ensayo es capaz de detectar una cantidad de indicadores, como se especifica anteriormente dentro de un periodo de tiempo predeterminado pueden resumirse como sigue:

Sensibilidad: al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%.

Especificidad: al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%.

Valor predictivo positivo: al menos el 80%, tal como al menos el 85%, tal como al menos el 90%.

Valor predictivo negativo: al menos el 80%, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 99,5%.

Los valores predictivos positivo y negativo están muy relacionados con la prevalencia de la enfermedad en la población que se va a ensayar. En el presente contexto se prefiere que los cálculos estadísticos estén basados en un tipo de población realista para el uso del ensayo. De este modo, los cálculos estadísticos no se basan sólo en una población conocida por haber adquirido la enfermedad, sino también en individuos que pueden aparecer como negativos para la enfermedad. Debido a la validez y sensibilidad del kit según la presente invención, el kit es especialmente adecuado para el ensayo de poblaciones que tienen una prevalencia de la dolencia que se está ensayando de menos del 100%, tal como menos del 90%, tal como menos del 80%, más preferiblemente menos del 70%, incluso más preferiblemente menos del 60%, tal como aproximadamente el 50%.

En otra realización, la presente invención proporciona un procedimiento para detectar indicadores de inflamación en una muestra, en donde dicha muestra, tratada opcionalmente para retirar componentes no deseados, se pone en contacto con una fase sólida extendida que tiene conjugada sobre ella una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, dirigido frente al indicador de inflamación. La puesta en contacto da lugar, en caso de usar un anticuerpo, a la formación de inmunocomplejos con antígenos característicos de los indicadores de inflamación a la que se van a dirigir.

La fase sólida extendida se separa de la muestra; dicha fase sólida extendida separada se pone en contacto con una fase sólida móvil que comprende una molécula polimérica vehículo según la invención que tiene conjugado a ella una especie de reconocimiento predeterminada tal como un anticuerpo. El anticuerpo da lugar a la unión de dichas moléculas poliméricas vehículo según la invención a dichos inmunocomplejos, posteriormente, la fase sólida extendida se separa de dicha fase sólida móvil; y se detecta la presencia de moléculas poliméricas vehículo según la invención, unidas a dicha fase sólida extendida, por lo que se detecta o determina la presencia de indicadores de inflamación en dicha muestra.

También, la invención proporciona un kit para la detección de un indicador de inflamación que comprende como componentes individuales: (a) una fase sólida extendida que tiene conjugada sobre ella una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo capaz de formar inmunocomplejos con antígenos característicos de los indicadores de inflamación que se van a detectar, y (b) una fase sólida móvil compuesta por moléculas poliméricas vehículo dispersas según la invención que tiene conjugado a ella dicha especie de reconocimiento, o una especie de reconocimiento diferente, preferiblemente un anticuerpo, característica de los indicadores de inflamación que se van a detectar.

En una realización, una muestra que puede comprender un indicador de inflamación de los tipos que se detectan está expuesta a un componente en fase sólida extendido que está recubierto al menos en una localización con una especie de reconocimiento que formará complejos con los antígenos de los indicadores de inflamación que se van a detectar.

En una realización, la fase sólida extendida está separada de la muestra, tal como lavando la muestra de la fase sólida extendida y a continuación, la fase sólida extendida separada se pone en contacto con una fase sólida móvil de moléculas poliméricas vehículo dispersas según la invención que comprende la misma o diferente especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo. Si se han formado inmunocomplejos de los antígenos de los indicadores de inflamación que se van a detectar (indicadores de inflamación "diana") en la fase sólida extendida, las moléculas poliméricas vehículo según la invención, se unirán a estos complejos.

Las moléculas poliméricas vehículo no unidas según la invención se retiran a continuación de la fase sólida móvil, tal como lavando, y la fase sólida extendida se examina para determinar la presencia de moléculas poliméricas vehículo según la invención, unidas a la fase sólida extendida. En algunos casos, estas pueden detectarse visualmente, por ejemplo, cuando las moléculas poliméricas vehículo según la invención se han teñido o coloreado inicialmente. Puede emplearse el examen microscópico. El uso de trazadores o marcadores para las moléculas poliméricas vehículo según la invención permite el uso de otros procedimientos de detección como se describe a continuación en este documento con más detalle.

Por este medio, la presencia o ausencia de moléculas poliméricas vehículo unido según la invención permite la detección de la presencia o ausencia de los indicadores de inflamación diana, y una evaluación de la cantidad de moléculas poliméricas vehículo unidas según la invención permite la determinación de la cantidad de indicadores de inflamación en la muestra, por ejemplo, mediante comparación con resultados convencionales para el ensayo de muestras conocidas.

La fase sólida extendida usada en la presente invención puede emplearse en una diversidad de formas o estructuras. La fase sólida tiene una localización donde una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, puede unirse o asociarse y la formación de esta fase sólida con dicha especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, permite poner en contacto una muestra y otros materiales usados en el procedimiento de la invención. Las muestras preferidas son muestras de fluido corporal como se describe con más detalle a continuación en este documento.

La fase sólida extendida se forma mejor de manera que permita una manipulación simple para que se ponga en contacto fácilmente con la muestra y otros reactivos. Con este fin, la fase sólida extendida puede formar al menos parte de una tira reactiva, jeringa, tubo o recipiente.

La muestra y otros reactivos pueden aspirarse y expulsarse de una jeringa, hacer que fluyan a través de un tubo o depositarse en un recipiente, tal como un recipiente con forma de tubo de ensayo. En estos dispositivos, la fase sólida extendida puede formar el total del dispositivo o parte de éste, donde, en el caso de una jeringa, tubo o recipiente, la parte formada por la fase sólida extendida se expondrá al menos en el interior del dispositivo para permitir la puesta en contacto con la muestra y los reactivos. La especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, preferiblemente está concentrada en una localización de la fase extendida, para exponerse a la muestra.

Una forma más preferida de la fase sólida extendida es una tira reactiva. En esta tira reactiva, adicionalmente se prefiere que la fase sólida extendida incluyera al menos un extremo, y que la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, conjugada en la fase sólida extendida se concentre en el extremo de la tira reactiva. No obstante, la fase sólida extendida puede comprender la tira reactiva completa, con la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, concentrada en un extremo o en más de una localización.

La tira reactiva puede estar formada completamente a partir de la fase sólida extendida, en uno de cuyos extremos se ha conjugado un recubrimiento de especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo. En otra realización la tira reactiva tiene una fase sólida extendida uno de cuyos extremos se adhiere a una porción del cuerpo. Un recubrimiento de una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, se conjuga a la fase sólida extendida. Aún en otra realización, la fase sólida extendida por completo forma un recipiente tubular en el que puede situarse una muestra. Los recubrimientos de especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, se localizan cerca de la base de recipiente y se concentran en una o más localizaciones.

La fase sólida extendida se compone de cualquier material al cual puede unirse de forma eficaz la especie de reconocimiento deseada, preferiblemente un anticuerpo. Para la unión covalente con la proteína anticuerpo, puede elegirse el material en fase sólida para que contenga una superficie carboxilo funcional, con el uso de una carbodiimida soluble en agua como reactivo de conjugación. Un material preferido es la resina acrílica, que tiene una superficie carboxilada que permite la unión de la especie de reconocimiento deseada, preferiblemente un anticuerpo, mediante conjugación. Para materiales con grupos amino superficiales, pueden prepararse reactivos carboxilo intermedios mediante la reacción con anhídrido succínico. También puede prepararse una diversidad de soportes inorgánicos, generalmente vidrio, mediante la conjugación covalente con la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo. Se hace referencia, por ejemplo, a "Enzymology, A Series of Textbooks and Monographs", vol. 1, capítulo 1, 1975, cuya descripción se incorpora a este documento como referencia.

Los materiales de la fase sólida extendida capaz de unirse a la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, se seleccionan entre materiales que no causan interferencias serias con las etapas del ensayo.

La presencia de aglutinantes no específicos en una muestra de tejido, especialmente los conjugados a inmunoglobulinas, pueden dar lugar a errores al causar la unión de moléculas poliméricas vehículo móviles según la invención a la fase sólida extendida, incluso en ausencia de Ag específico. Los lavados repetidos durante el ensayo podrían reducir la unión no específica, pero es necesaria retirar los aglutinantes no específicos para evitar esta unión no deseada. Una simple superficie de látex de poliestireno, por ejemplo, puede eliminar de forma pasiva alguno de los aglutinantes, mientras que una superficie recubierta de IgG proporciona una mejor afinidad.

Para la conveniencia de la siguiente descripción, la fase sólida extendida se referirá como la tira reactiva preferida, aunque pueden usarse otras formas como se explicó anteriormente en este documento.

Los anticuerpos monoclonales dirigidos frente a los indicadores de inflamación pueden proporcionar una unión regular y reproducible. Con un suministro apropiado de anticuerpo específico, el presente inmunoensayo de unión directa, en contraposición con el inmunoensayo de unión competitiva puesto en práctica en el radioinmunoensayo, puede ser un procedimiento fiable y muy rápido ya que el tiempo de incubación para un equilibrio cinético, necesario en el ensayo de unión competitivo, no se requiere en este momento.

De acuerdo con el procedimiento de la presente invención, la especie anticuerpo de reconocimiento, bien de la fracción Ig normal de los antisueros o de los anticuerpos monoclonales, se conjuga respectivamente con una tira reactiva de fase sólida así como con una fase sólida móvil, o las denominadas moléculas poliméricas vehículo "monodispersas" según la invención.

Las funciones de la tira reactiva son el manejo y la separación de los antígenos unidos de los libres, mientras que las de las moléculas poliméricas vehículo móvil según la presente invención, son la detección de los inmunocomplejos formados. Las técnicas de conjugación entre la proteína anticuerpo y diversos materiales en fase sólida están bien desarrollados (véase, por ejemplo, W. J. Dreyer, patente de EE.UU. Nº 3.853.987 mencionada anteriormente).

En una realización del procedimiento de la presente invención descrito anteriormente, el inmunocomplejo resultante es un "sándwich" multicapa que comprende:

Tira reactiva + especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, + antígeno + especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, + molécula polimérica vehículo que comprende una especie de marcaje.

Sin embargo, la cantidad de anticuerpo requerida para la unión covalente puede ser inferior a un millar de veces la de la adsorción pasiva a un plástico tal como cloruro de polivinilo y los aspectos económicos del uso de esta cantidad de especie de reconocimiento altamente específica, preferiblemente un anticuerpo, pueden ser prohibitivos.

Una forma alternativa de unión que retiene cierta potencia de la unión covalente así como la especificidad de la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, es unir la especie de reconocimiento y la fase sólida con un primer anticuerpo, un anticuerpo antiespecie dirigido frente a la porción Fc del anticuerpo diana. Esta porción Fc se ilustra, por ejemplo, en "Immunology" (1981), The Upjohn Company, Kalamazoo, Mich.

Es decir, un primer anticuerpo barato puede unirse inicialmente de forma covalente a la fase sólida y el primer anticuerpo unido atrae la porción Fc específica de especie de un anticuerpo de reconocimiento, dejando el epítope funcional del anticuerpo de reconocimiento sin alterar con respecto a un antígeno de un indicador de inflamación. Unido con este primer anticuerpo antiespecie, el inmunoensayo de la presente invención provoca el siguiente "sándwich" de conjugación en el caso de detección de una especie:

Tira reactiva + anticuerpo antiespecie + anticuerpo de reconocimiento + antígeno + anticuerpo de reconocimiento + anticuerpo antiespecie + molécula polimérica vehículo que comprende una especie de marcaje.

En el ensayo de unión directa de la presente invención, las uniones entre la tira reactiva y la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, así como las uniones entre las moléculas poliméricas vehículo según la invención y la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, se preparan por adelantado, y se retirar o desactivan los elementos de la aglutinación no específica en la muestra de fluido para el pretratamiento previo al ensayo de unión directa como se menciona anteriormente.

El procedimiento de ensayo según una realización de la invención se simplifica por tanto, en las siguientes etapas:

(1) Insertar la tira reactiva en una muestra opcionalmente pretratada en forma de una muestra de fluido corporal.

(2) Incubar la tira reactiva y la muestra.

(3) Lavar la tira reactiva.

(4) Insertar la tira reactiva en una dispersión de moléculas poliméricas vehículo que comprende al menos una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, y al menos una especie de marcaje, a menos que las moléculas poliméricas vehículo no se haya añadido previamente a la muestra.

(5) Opcionalmente, lavar la preparación obtenida en (3).

(6) Detectar las moléculas poliméricas vehículo según la invención en la tira reactiva mediante la detección de la especie de reconocimiento o de la especie de marcaje.

Para que pueda usarse una cantidad mínima de agentes de análisis químico por vía húmeda, la presente detección de moléculas poliméricas vehículo unidas según la presente invención a una tira reactiva se hace de forma independiente de la química inmune. Mediante concentración de la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, en un extremo de la tira reactiva, las moléculas poliméricas vehículo unidas según la invención se concentran en una localización, lo que simplifica la detección.

Las moléculas poliméricas vehículo según la invención pueden incluir cualquier compuesto colorante o fluorescente para la observación visual directa, o tener elementos metálicos o de óxido de hierro mezclados o incluidos dentro para proporcionar señales de rayos X, de fluorescencia o electromagnéticas. También puede diseñarse una amplificación enzimática en las moléculas poliméricas vehículo según la invención.

En una realización, el procedimiento presente emplea un ensayo de unión directa en lugar de un ensayo de unión competitiva donde un equilibrio dinámico necesita una incubación prolongada. El procedimiento descrito puede, por supuesto, emplearse también en un ensayo de unión competitiva de proteínas. Los papeles de los analitos inmunes, anticuerpo y antígeno, pueden también intercambiarse, haciendo uso todavía de la fase sólida inmovilizada para la amplificación de señal. Es bien conocida la unión del anticuerpo o de diversas moléculas de antígenos al material de la fase sólida, en adsorción pasiva así como en unión covalente.

En el inmunoensayo de la presente invención, la característica del antígeno para un indicador de inflamación, que opcionalmente aparece en multiplicidad alta, se usa como un enlace para conectar las fases sólida móvil e inmovilizada. Obviamente, esta conexión también puede servir para otros antígenos diversos con múltiples sitios de unión al anticuerpo. En caso de ciertos antígenos sin sitios de unión repetitivos que no pueden conectar específicamente con más de un anticuerpo monoclonal, también puede usarse en su lugar anticuerpos polivalentes.

El procedimiento de la invención también puede diseñarse para analizar diversos analitos en un único procedimiento donde cada analito está representado por un par especial de patrones de unión correspondientes que incluyen anticuerpos, antígenos y la misma o diferente molécula polimérica vehículo que comprende una o más especies de reconocimiento.

La detección de tipos diferentes de indicadores de inflamación puede hacerse de acuerdo con la invención conjugando una diversidad de especies de reconocimiento diferentes, preferiblemente un anticuerpo, de proteínas capaces de formar complejos con los antígenos correspondientes de indicadores de inflamación diferentes a la fase sólida extendida y a la fase sólida móvil. La observación visual u otra detección de cualquier microesfera unida tras el ensayo indica que uno o más de los diferentes indicadores de inflamación está presente en la muestra, y este ensayo, si es positivo, puede ir seguido de ensayos para indicadores de inflamación individuales diferentes a los que se ensayaron simultáneamente.

En otra realización, los diferentes indicadores de inflamación pueden detectarse simultánea e individualmente. Para este ensayo, la especie de reconocimiento diferente, preferiblemente un anticuerpo, correspondiente a los antígenos de una diversidad de tipos diferentes de indicadores de inflamación se conjugan con microesferas que están correspondientemente marcadas con diferentes elementos metálicos.

Cuando más de un tipo de microesferas marcadas de forma diferente se unen a la fase sólida extendida en el ensayo de la invención, pueden separarse y detectarse simultáneamente. En este sentido, la presencia de los correspondientes tipos individuales de indicadores de inflamación en la muestra se detecta simultánea e independientemente. Esto es especialmente relevante cuando los perfiles determinantes de los indicadores de inflamación, tales como perfiles de citoquinas o perfiles de autoanticuerpos.

La fase sólida extendida y las microesferas dispersas que se conjugan con especies de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, preparado como se describe anteriormente como componentes individuales útiles para el procedimiento de ensayo de la invención, puede proporcionarse en forma de un kit para la detección del indicador de inflamación que comprende estos componentes. Pueden proporcionarse kits diferentes, que difieren en la especie de reconoci-
miento, preferiblemente un anticuerpo, recubrimientos y, por tanto, en el indicador de inflamación que se va a detectar.

Este kit puede incluir adicionalmente como componente individual, una fase sólida de látex para retirar las aglutinaciones no específicas de una muestra antes del ensayo. El látex preferido para este fin es poliestireno recubierto con gamma inmunoglobulina.

Los componentes de fase sólida extendida y fase sólida móvil del kit de la invención pueden proporcionarse con una especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, unida a un anticuerpo antiespecie como se describe anteriormente. También como se describe anteriormente, el componente de la microesfera puede estar marcado, y la fase sólida extendida puede tomar forma de parte o toda una tira reactiva, jeringa, tubo o recipiente, recubierto con la especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, en al menos una localización, como se describe.

Además, el componente de la fase sólida extendida puede proporcionarse con una diversidad de diferentes especies de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, capaces de formar complejos con antígenos correspondientes de tipos diferentes de indicadores de inflamación. Cuando se proporciona de este modo, puede proporcionarse el componente de fase sólida móvil individual que tenga la misma diversidad de especie de reconocimiento, preferiblemente un anticuerpo, conjugado con cada una de las moléculas poliméricas vehículo de éste, o puede proporcionarse una mezcla de tipos diferentes de moléculas poliméricas vehículo, teniendo cada tipo conjugado a él una especie de reconocimiento diferente, preferiblemente un anticuerpo, de dicha diversidad; o en una variación adicional, el componente de la fase sólida móvil puede proporcionarse en forma de lotes individuales de moléculas poliméricas vehículo teniendo cada lote conjugado a él una especie de reconocimiento diferente, preferiblemente un anticuerpo, de dicha pluralidad.

Aunque se prefiere usar una molécula polimérica vehículo que comprenda una especie de reconocimiento y una especie de marcaje como se describe anteriormente en este documento, la invención también puede ponerse en práctica usando partículas esféricas incluyendo microesferas que comprenden una especie de reconocimiento y, opcionalmente, también una especie de marcaje. En particular, estas microesferas pueden usarse en conexión con un microsistema que comprende el kit según la invención.

El kit según la invención también puede aplicarse a un microsistema, tal como un sistema de microflujo descrito en el documento WO 98/10267, un sistema tal como el comercializado por Torsana Biosensor A/S, Dinamarca.

El principio detrás de la tecnología de un sistema de microflujo es que controlando la tasa de flujo de al menos dos corrientes conductoras, una corriente de muestra puede situarse con exactitud en una superficie diana.

Controlando las tasas de flujo entre las corrientes conductoras y la corriente de muestra, la corriente de muestra puede concentrarse en una anchura de pocos mm. La corriente de muestra lleva a las moléculas a interaccionar con la superficie.

Los carriles inmovilizados del sistema interaccionan con las corrientes líquidas que contienen muestras desconocidas en la dimensión-y.

Se crean miles de puntos de intersección únicos donde puede darse la reacción.

El hecho de que no se den turbulencias en corrientes fluidas muy estrechas da lugar a que la difusión sea el único fenómeno que perturba el centro de la corriente de muestra. En efecto, la tecnología permite la situación precisa de una corriente líquida en una superficie plana. De ese modo es posible colocar el material con una precisión de pocos mm.

El sistema microfluídico permite el control de corrientes muy estrechas del líquido que lleva el material (ADN, proteínas, células) para que interaccione con la superficie del segmento.

El sistema de microflujo permite la inmovilización de corrientes de reactivo, en el contexto presente las corrientes de conjugado que comprenden el vehículo polimérico y posterior ensayo con una o varias muestras que crean una onda con miles de puntos de intersección donde tienen lugar y se detectan reacciones químicas. El proceso completo se realiza en un sistema fluídico cerrado que proporciona la flexibilidad en términos de muestra (y aplicación de reactivo, elección de inmovilización), detección química y composición de la matriz.

En particular, cuando se usa el kit para ensayar una variedad de indicadores de inflamación y/o indicadores de inflamación, tales como para proporcionar perfiles de indicadores de inflamación o un perfil de autoanticuerpos, la invención adecuadamente incluye el uso del kit en un microsistema.

Además de los microsistemas, el kit según la invención también puede formar parte de un macrosistema convencional tal como, por ejemplo, un dispositivo de flujo lateral. Los ejemplos de estos dispositivos se enumeran a continuación en este documento.

La patente de Estados Unidos Nº 5.610.077 (Unilever) describe un procedimiento para realizar un ensayo de unión específico. Por lo tanto, se proporciona un procedimiento según la invención para realizar un ensayo de unión específico que comprende las etapas de hacer reaccionar (a) una muestra de ensayo que comprende un indicador de inflamación con (b) un patrón específico de unión para el indicador de inflamación que se está ensayando, que incluye una molécula polimérica vehículo según la invención, inmovilizada en un soporte sólido, y (c) un patrón específico de unión para el indicador de inflamación que se está ensayando, que incluye una molécula polimérica vehículo según la invención, que está conjugada con un marcador detectable, para formar de este modo un complejo de tipo sándwich mediante la reacción entre cualquier cantidad presente del indicador de inflamación que se está ensayando con los reactivos (b) y (c), e inmovilizando el marcador al soporte mediante el indicador de inflamación que se está ensayando, detectándose o ensayándose el marcador como un índice de la cantidad del indicador de inflamación que se están ensayando presente en la muestra (a), la mejora que comprende el uso de los reactivos (b) y (c) juntos para la reacción con la muestra (a) y evitar la interferencia competitiva entre las reacciones de unión del indicador de inflamación que se está ensayando y los reactivos (b) y (c) usando como reactivos (b) y (c), anticuerpos monoclonales cada uno con especificidad sin interferencia estrecha y diferente, estando inmovilizado el reactivo de unión (b) en la superficie de un cuerpo desplazador que ocupa la mayoría del volumen de un pocillo o cubeta que contiene un líquido acuoso en el que tiene lugar la reacción de unión específica.

La especificidad estrecha requerida del anticuerpo es una capacidad para unirse de forma específica con el indicador de inflamación en ensayo pero sin prevenir la reacción de unión entre el indicador de inflamación en ensayo y su otro par específico de unión. El conjugado entre anticuerpo y la enzima u otro marcador, y/o el anticuerpo (si lo hay) que se conjuga con la superficie sólida, puede comprender un anticuerpo monoclonal u otro anticuerpo de especificidad suficientemente estrecha para asegurar que la reacción o reacciones de ensayo deseadas no dificulte la competición entre el conjugado y el inmunoabsorbente en sus reacciones con cualquier cantidad presente del indicador de inflamación que se está ensayando en la muestra de ensayo. También puede obtenerse un anticuerpo de especificidad suficientemente estrecha en las inmunoglobulinas (policlonales) de antisueros obtenidos frente a fragmentos moleculares químicos o físicos discretos de la materia de ensayo, por ejemplo, anticuerpos frente a fragmentos Fc (o frente a fragmentos peptídicos menores) de las inmunoglobulinas que se están ensayando o frente a subunidades o péptidos de los antígenos proteicos que se están ensayando. El objetivo en cada caso es asegurar una libertad sustancial de la interferencia que puede surgir especialmente, por ejemplo, cuando se realizan inmunoensayos de configuraciones de ensayo de tipo "sándwich" o "antiglobulina".

En una configuración de ensayo de tipo "sándwich", el antígeno ensayado puede adsorberse específicamente a un primer anticuerpo unido a una superficie sólida y un segundo anticuerpo que lleva un marcador enzimático u otro (por ejemplo, fluorescente o radiactivo) se une específicamente al antígeno adsorbido en ensayo. El marcador unido específicamente de este modo se usa para medir y determinar el antígeno en ensayo, por ejemplo, mediante medición directa, tal como radiometría o fluorímetría, o la exposición del marcador enzimático al sustrato seguido de la medida del producto. De este modo, en ensayos de tipo sándwich preferidos, los dos anticuerpos usados pueden tener especificidad sin interferencia diferente con respecto al mismo antígeno en ensayo.

En una configuración de ensayo de "antiglobulina", algunas veces también denominada configuración de ensayo de tipo "sándwich", la posición es análoga: el material de ensayo es en sí mismo una inmunoglobulina; el material unido a una superficie sólida es su correspondiente antígeno o hapteno; y el material que lleva el marcador es una antiglobulina que se corresponde con la especie y tipo de inmunoglobulina del anticuerpo en ensayo. En ensayos de antiglobulina preferidos, la antiglobulina puede tener una especificidad suficientemente estrecha como para no interferir en la posterior adsorción de su correspondiente globina al antígeno insolubilizado.

Si los anticuerpos de antisueros ordinarios obtenidos frente a antígenos sin modificar (anticuerpos policlonales) se usan en ensayos de tipo sándwich o antiglobulina, hay un riesgo muy probable de que si se mezclan todos los ingredientes en una única etapa, habrá interferencias entre las dos reacciones de adsorción específica. Cuando estos ensayos se realizan según la presente invención, usando aparatos como los descritos en este documento, estas interferencias pueden evitarse usando anticuerpos de especificidad estrecha como se describe, o bien asegurando que la unión del material de ensayo a la superficie sólida tenga lugar antes de exponer el material de ensayo al otro agente de unión (conjugado con el marcador) si hay un riesgo de que la unión a este otro agente pudiera prevenir la adsorción posterior a la superficie sólida. Esta secuencia puede asegurarse fijando la liberación lenta del otro agente de unión (conjugado con el marcador).

Ejemplos particulares de especificidades de ensayo adecuadas, especificidades de anticuerpo y formas de liberación lenta del reactivo conjugado (c) se describen, por ejemplo, a continuación.

También se ha encontrado que mientras se realizan estos ensayos de unión específica, puede obtenerse una mejora importante de las cinéticas de reacción si el líquido de reacción que contiene los ingredientes (a), (b) y (c) está contenido en un pocillo o cubeta en el que la mayoría del volumen está ocupado por un cuerpo desplazador. (Se conoce el uso de inserciones de diversas formas a modo de vara o bola en relación con otros tipos de inmunoensayos, como se describe en las memorias descriptivas G.B. Nº 1.414.479 y 1.485.729).

El cuerpo desplazador puede, por ejemplo, tener forma sustancialmente complementaria y ligeramente menor que la cubeta o pocillo, de modo que la fase líquida que contiene uno de los reactivos de unión específica está aproximadamente en forma de una concha que ocupa el espacio entre el desplazador y la cubeta o pocillo. El desplazador puede ser holgado y no estar montado de forma fija, por ejemplo, relativamente móvil con respecto a la cubeta o pocillo, de modo que por el movimiento relativo entre el desplazador y el pocillo, el líquido entre ambos puede moverse o tener un movimiento de agitación.

Por ejemplo, un pocillo redondo puede tener un desplazador redondo en éste con un diámetro externo ligeramente menor que el diámetro del pocillo. La presencia del desplazador puede reducir el espacio disponible para el líquido en el pocillo en un factor de, por ejemplo, 2-10, por ejemplo de 3-8, en comparación con los volúmenes en base a niveles de líquido similares en el pocillo, por ejemplo, cuando se rellena hasta su nivel de trabajo normal o su capacidad máxima. Por ejemplo, un pocillo de microvaloración diseñado para tener 300 microlitros de líquido dentro durante un ensayo normal, puede usarse con un desplazador que deja espacio para 30-150 microlitro de líquido, por ejemplo, 50-100 microlitro.

El uso de pocillos o cubetas junto con desplazadores, como se describe en este documento, puede mejorar la eficacia de la etapas de reacción del ensayo ya que, en primer lugar, permite el uso de reactivos más concentrados sin aumento del peso del reactivo o descenso en el tamaño de los pocillos de microvaloración, en comparación con las condiciones normales encontradas en pocillos de microvaloración de un tamaño determinado; y en segundo lugar, aumenta el área de la superficie sensible disponible para la reacción con un volumen de reactivo líquido dado, de modo que pueden alcanzarse cinéticas de adsorción comparativamente más rápidas sin tener que aumentar la densidad de reactivo específico en la superficie sensible o encontrar problemas de agrupamiento.

Preferiblemente, en ciertas realizaciones de la invención puede presentarse un conjunto de cuerpos desplazadores, por ejemplo, como parte integral de una tapa que puede ajustarse sobre una placa de microvaloración, por ejemplo, una placa convencional de 12 por 8 pocillos. El conjunto puede ser suficientemente grande como para ajustarse a todos los pocillos de una placa o a un subgrupo de la misma, por ejemplo, una fila. Las dimensiones de los desplazadores y el volumen de líquido que se va a añadir al pocillo pueden elegirse en relación con el pocillo de la forma descrita anteriormente, y preferiblemente de modo que el líquido que se va a ensayar esté en contacto sustancialmente con la mayor parte y, preferiblemente, el total de la superficie interna del pocillo.

El par de unión específica inmovilizado (el reactivo (b)) para el indicador de inflamación que se está ensayando, puede estar inmovilizado en la pared del pocillo o cubeta en donde tiene lugar la reacción de ensayo. De forma alternativa, según un aspecto de la invención independientemente capaz de proporcionar la ventaja y la conveniencia de su uso, un desplazador líquido, por ejemplo en forma de una varilla, gancho o botón, para sumergir en una reacción de ensayo líquido, puede tener una superficie inmunoabsorbente. Esto permite que la porción de los materiales de ensayo que es necesario que se lleven de un reactivo al siguiente, y las manipulaciones asociadas se realicen más fácilmente que cuando la superficie sensible es parte de un pocillo hueco. Una forma alternativa a este cuerpo desplazador líquido es un penacho de fibras o láminas de material adecuado, o cuerpo equivalente con un área de superficie grande. Una forma alternativa adicional es un botón o un gancho relativamente hueco y proporciones proyectadas de su superficie, por ejemplo, con surcos y bordes asociados, por ejemplo, surcos anulares. Esta disposición puede dar robustez, aumentar el área de superficie sensible y mejorar la reactividad.

El equipo de ensayo según realizaciones relacionadas de la invención pueden comprender, de este modo, un conjunto de cuerpos desplazadores líquidos sensibles de una o más de estas formas, unidos a una barra, enlace o tapa manejable y para su uso en combinación con un conjunto o conjuntos complementarios de pocillos que contienen cualquiera de los materiales restantes usados en el ensayo. Los diversos cuerpos desplazadores del conjunto pueden tener la misma o diferente sensibilidad de modo que uno o una variedad de diferentes tipos de ensayo pueden realizarse simultáneamente. Si se desea, los cuerpos desplazadores pueden montarse de forma reversible o intercambiable en la barra, enlace o tapa de manejo de modo que los conjuntos de especificidad deseada pueden construirse a voluntad a partir de una solución madre común para realizar gran número de ensayos según un patrón deseado.

Una ventaja de estas disposiciones es que varios cuerpos desplazadores pueden estar sensibilizados en el mismo cuerpo de reactivo líquido, evitando condiciones fluctuantes de concentración, etc., resultado de las alícuotas de dosificación en los pocillos.

Los cuerpos desplazadores pueden, en esta realización, ser de cualquier material adecuado para la preparación de un inmunoabsorbente mediante unión covalente o adsorción: por ejemplo, poliestireno, nailon o acetato de celulosa. (No importa la naturaleza de la superficie del desplazador siempre que sea inerte, cuando la sensibilización tiene que darse en la superficie del pocillo antes que en a superficie del desplazador). La unión de los anticuerpos, antígenos, etc., a los cuerpos desplazadores pueden llevarse a cabo mediante procedimientos de unión conocidos en sí mismos, por ejemplo, hidrólisis ácida parcial de la superficie del nailon, sustitución de la superficie amina expuesta con glutaraldehído y conjugación del material que se va a unir, por ejemplo anticuerpo o antígeno, a grupos aldehído inmovilizados. Procedimientos adecuados entre una amplia diversidad se dan por ejemplo en Inman y Hornby (1972) Biochem. J. 129, 255; Campbell, Hornby y Morris (1975) Biochim. Biophys. Acta 384, 307; Mattiasson y Nilsson (1977) F.E.B.S. Letters 78, 251 y en las memorias descriptivas de las patentes G.B. Nº 1.470.955 y 1.485.122).

Puede verse que la invención también proporciona un kit de materiales de ensayo para realizar un ensayo de unión a proteínas específico, que comprende (i) un patrón de unión inmovilizado específico de un indicador de inflamación que se está ensayando, que incluye una molécula polimérica vehículo según la invención, llevada en un soporte sólido, y (ii) un patrón de unión específico conjugado a un marcador para el indicador de inflamación que se está ensayando, que incluye una molécula polimérica vehículo según la invención que puede añadirse a una líquido de reacción que se pone en contacto con el reactivo inmovilizado (i) como una forma de liberación lenta o en cualquier otra forma siempre que los patrones de unión específica de los reactivos (i) y (ii) incluyan un anticuerpo de especificidad estrecha, de modo que los reactivos (i) y (ii) no interfieran con cualquier de las otras reacciones de unión con el indicador de inflamación que se está ensayando. Opcionalmente, el kit también puede comprender materiales para la estimación posterior de la cantidad de marcador inmovilizado durante el ensayo.

El reactivo (i) puede estar inmovilizado en un cuerpo desplazador para un pocillo de reacción o en la pared de un pocillo de reacción, como se describe anteriormente. Una forma de liberación lenta del reactivo (ii) puede ser, por ejemplo, una sacarosa o azúcar equivalente en una superficie complementaria del desplazador o de la pared del pocillo, también como se describe anteriormente. El anticuerpo de especificidad estrecha puede seleccionarse, por ejemplo, entre anticuerpos monoclonales de la manera ya descrita.

La patente de Estados Unidos Nº 5.501.949 (Murex) se refiere a un procedimiento para la detección o cuantificación de un analito en una solución. Por lo tanto, la presente invención en una realización se refiere a un procedimiento que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto la solución con partículas insolubles o una molécula polimérica vehículo según la invención, que tiene unida a ella un componente específico de unión para el analito, de modo que forme una suspensión que comprenda un primer complejo en el que el primer complejo comprende el analito, el componente de unión y la partícula insoluble;

(b) aplicar la suspensión al menos a una porción de una membrana semipermeable que tiene intersticios de dimensiones relacionadas con las partículas insolubles o las moléculas poliméricas vehículo según la invención y que tiene un espesor tal que las partículas insolubles o las moléculas poliméricas vehículo según la invención, quedan retenidas por todo el espesor de la membrana semipermeable, definiendo la porción de membrana semipermeable que retiene las partículas o moléculas poliméricas vehículos una zona de ensayo;

(c) poner en contacto la membrana semipermeable que contiene la zona de ensayo con un componente de marcaje, preferiblemente comprendido en una partícula o en una molécula polimérica vehículo según la invención y que forma parte de la misma, siendo dicha partícula o molécula polimérica vehículo capaz de unirse específicamente al primer complejo formando, de este modo, un segundo complejo, en el que el segundo complejo comprende el primer complejo que incluye el componente de marcaje, en el que la membrana semipermeable permite la eliminación de la zona de ensayo del componente del marcaje que no se une al primer complejo; y

(d) medir la señal producida por el componente de marcaje del segundo complejo, como indicador de la presencia o cantidad del analito presente en la solución.

La patente de Estados Unidos Nº 5.155.021 (EASTMAN KODAK) describe un kit de diagnóstico útil para la determinación de un herpes virus simple. Por lo tanto, la presente invención en una realización se refiere a un kit de diagnóstico que comprende:

i) partículas poliméricas que están sustancialmente libres de materiales químicos o biológicos, que tienen un diámetro medio de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 10 micrómetros, y que tienen un área superficial de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 600 m^{2}/g de partículas, cuyas partículas son capaces de tener un antígeno indicador de inflamación directamente unido a ellas,

ii) un dispositivo de ensayo desechable que comprende una membrana microporosa que tiene un tamaño medio de poro de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 \mum, y

iii) anticuerpos que se unen a un indicador de inflamación según la invención.

Los anticuerpos pueden estar marcados con una enzima o puede no estar marcados, en cuyo caso el kit adicionalmente comprende anticuerpos marcados que se unen a dicho indicador de inflamación. El dispositivo de ensayo comprende tres pocillos de ensayo, teniendo cada pocillo una membrana microporosa preparada a partir de una poliamida montada en estos. Las partículas poliméricas se suministran en la membrana microporosa de dicho dispositivo de ensayo (las partículas se suministran en una suspensión acuosa).

La membrana microporosa puede ser cualquier membrana adecuada, por ejemplo seleccionada entre los siguientes filtros disponibles en el mercado

Whatman GF/D

Whatman F147-11

Whatman GF/AVA

Whatman 147-02

Whatman GF/DFA

Whatman F147-09

Whatman F075-17*

Millipore Rapid Q24*

Millipore Rapid Q27

Ahlstrom A142.

Adicionalmente, puede proporcionarse un filtro absorbente para absorber el líquido de la suspensión acuosa. Los filtros absorbentes son por ejemplo:

Whatman D28

Whatman 1.5WF*

Whatman 3MM CHR

Ejemplos adicionales de dispositivos de ensayo y de procedimientos de diagnóstico relacionados con la invención incluyen, pero sin limitación:

Un dispositivo de ensayo que preferiblemente comprende:

i) una zona para aplicar una muestra de fluido corporal que comprende un indicador de infección y/o inflamación, comprendiendo dicha zona al menos una especie indicadora móvil capaz de unirse a dicho indicador, estando en contacto líquido dicha zona de aplicación con

ii) una zona para detectar la presencia, cantidad o concentración de dicha al menos una especie indicadora unida a dicho indicador, comprendiendo dicha zona además una especie de unión para inmovilizar en dicha zona de detección al menos una cantidad sustancial de dicho indicador comprendido en dicha muestra de fluido corporal, y opcionalmente

iii) una zona de control positivo que genera un control positivo para confirmar la transferencia de al menos parte de dicha muestra de fluido corporal de dicha zona de aplicación a dicha zona de detección.

La al menos una especie indicadora comprendida en el área de aplicación de la muestra, preferiblemente comprende un anticuerpo que comprende al menos una etiqueta, enlazador o marcador que hace posible al menos detectar la presencia de dicho marcador, y también preferiblemente hace posible detectar de forma cuantificable dicho anticuerpo y/o dicha especie indicadora unida a dicho indicador.

La especie de unión de la zona de detección preferiblemente también es un anticuerpo, pero este anticuerpo puede no comprender ninguna etiqueta, marcador o señal. De este modo, es posible inmovilizar en la zona de detección una cantidad de una especie indicadora detectable y cuantificable que refleje con exactitud la cantidad de marcador presente en la muestra de fluido corporal. La al menos una etiqueta, señal o marcador usado permite preferiblemente tanto la detección visual, mediante la generación de, por ejemplo, radiación electromagnética o un color visible, como la cuantificación de, por ejemplo, la radiación electromagnética emitida.

Debería entenderse que la especie indicadora móvil comprende una especie indicadora capaz de moverse en, por ejemplo, una superficie sólida o semisólida, por ejemplo, cuando es aplicado a un dispositivo de flujo lateral.

En una realización de este aspecto de la invención se proporciona un dispositivo de ensayo para detectar un indicador de infección y/o de inflamación presente en una muestra de fluido corporal, comprendiendo dicho dispositivo:

i) una cubierta agujereada que tiene una apertura para la aplicación de una muestra de fluido corporal y una apertura para observación del resultado de ensayo,

ii) un componente receptor de la muestra de fluido corporal poroso en dicha cubierta agujereada para recibir dicha muestra de fluido corporal aplicada a dicha apertura de aplicación de la muestra,

iii) una tira de ensayo que comprende un vehículo poroso seco, tal como nitrocelulosa, en dicha cubierta y que se extiende a partir de dicho componente de recepción de la muestra de fluido corporal poroso y a través de dicho apertura de observación del resultado del ensayo, teniendo dicho vehículo poroso seco una zona de resultado del ensayo observable a través de dicha apertura de observación.

iv) al menos uno de dicho componente receptor de la muestra de fluido corporal poroso y dicha tira de ensayo contenida por encima de dicha zona de resultado del ensayo, contiene una especie indicadora capaz de unirse de forma específica dicho indicador para formar un primer complejo,

v) dicha especie indicadora que comprende al menos un marcador particulado, tal como una solución de colorante, una solución metálica o una partícula de látex coloreada, y opcionalmente también al menos un marcador detectable por fluorescencia, liberándose dicho marcador de forma móvil mediante dicha muestra de fluido corporal,donde la movilidad de dicho marcador dentro de dicha tira de ensayo se facilita mediante el recubrimiento de al menos una porción de dicha tira de ensayo por encima de dicho zona de resultado de ensayo con un material que comprende un polisacárido, o secando dicho marcador en una porción de dicha tira de ensayo por encima de dicha zona de ensayo en presencia de un material que comprende un polisacárido, en una cantidad eficaz para reducir la interacción entre dicha tira de ensayo y dicho marcador, y

donde dicho vehículo poroso seco contiene en dicha zona de resultado del ensayo un medio para unir dicho primer complejo, comprendiendo dicho medio de unión un medio de unión específico inmovilizado en dicha zona de resultado del ensayo, y

donde la migración de dicha muestra de fluido corporal desde dicho componente de recepción de la muestra porosa transportando por capilaridad y a través de dicho vehículo poroso dicho primer complejo a dicha zona de resultado del ensayo de dicho vehículo poroso seco en donde dicho medio de unión une dicho primer complejo para formar de este modo un segundo complejo, y

vi) determinar la presencia, cantidad o concentración de dicho segundo complejo que es observable a través de dicha apertura de observación del resultado del ensayo.

En otra realización, se proporciona un dispositivo de ensayo para detectar un indicador de infección y/o inflamación en una muestra de fluido corporal, comprendiendo dicho dispositivo un soporte sólido que incluye al menos una especie indicadora detectable en un área de ensayo del soporte sólido, siendo capaz dicha al menos una especie indicadora detectable de unir dicho marcador, comprendiendo, además, dicha especie indicadora un liposoma o una microcápsula que comprende un compuesto colorante particulado visible y opcionalmente también un marcador detectable por fluorescencia.

Aún en otra realización se proporciona un dispositivo de ensayo que comprende

i) un área de aplicación de muestra que comprende una cantidad predeterminada de una especie indicadora que comprende un anticuerpo capaz de unir dicho indicador depositado en el mismo, estando dicho área en comunicación fluida con

ii) una zona de reacción que comprende una especie indicadora móvil que comprende un anticuerpo capaz de unir dicho indicador, comprendiendo además dicha especie indicadora al menos una partícula visualmente detectable y/o al menos una partícula detectable por fluorescencia, y

iii) una zona de detección que comprende una especie indicadora que comprende un anticuerpo capaz de unir dicho indicador, en la que, cuando dicha muestra de fluido corporal que comprende dicho indicador se aplica a dicha área de aplicación de la muestra, una cantidad umbral del indicador se une a dicho anticuerpo y, de este modo, se previene la unión del anticuerpo que está presente en la zona de reacción, y

donde el indicador que permanece sin unir en dicha muestra de fluido corporal pasa del área de aplicación de la muestra a dicha zona de reacción, donde se une a dicha especie indicadora móvil que comprende i) un anticuerpo capaz de unir dicho indicador y ii) al menos una partícula visiblemente detectable y/o al menos una partícula detectable por fluorescencia, y

donde el indicador unido a la especie indicadora móvil se pone en contacto con la zona de detección, donde el indicador se une a dicha especie indicadora que comprende dicho anticuerpo capaz de unir dicho indicador y donde dicha unión de dicho indicador tiene como resultado la inmovilización de dicha especie indicadora móvil que comprende además i) un anticuerpo capaz de unir dicho indicador y ii) al menos una partícula visualmente detectable y/o al menos una partícula detectable por fluorescencia.

La presente invención emplea especies de reconocimiento, especies de marcaje y, más en general, especies moleculares. La expresión "especie molecular" en el contexto de la presente invención se usa para indicar, por ejemplo: moléculas o especies iónicas que sirven como etiquetas o marcadores (tales como enzimas o especies fluorescentes o luminiscentes); o moléculas que sirven como especie de reconocimiento, es decir, moléculas que son capaces de unir selectiva o específicamente una o más moléculas, restos, receptores o epítopes diana (siendo ejemplos de estas especies de reconocimiento, haptenos o conjugados de haptenos, antígenos, anticuerpos, secuencias nucleotídicas y hormonas). En una realización en particular, la invención se refiere al uso simultánea o secuencialmente de ambas o una cualquiera de una primera especie de reconocimiento y una segunda especie de reconocimiento, que incluyen anticuerpos policlonales y monoclonales que pueden ser, respectivamente, i) idénticos o no idénticos y ii) específicos para el mismo o diferente epítope de determinantes antigénicos característicos para un indicador de inflamación según la invención.

La especie molecular según la invención se tiene que encontrar entre numerosos tipos diferentes de sustancias, por ejemplo: proteínas, tales como ferritina, ficoeritrinas, ficocianinas o ficobilinas; enzimas, tales como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasas, galactosidasas o ureasas; toxinas; fármacos; colorantes; sustancias fluorescentes, luminiscentes, fosforescentes u otras sustancias emisoras de luz; sustancias quelantes de metales, tales como ácido iminodiacético, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) o desferrioxamina B; sustancias marcadas con un isótopo radioactivo; o sustancias marcadas con un átomo
pesado.

Muchas especies moleculares serán capaces de servir como especie de marcaje en conjugados según la invención. Inmediatamente a continuación se enumeran ejemplos adicionales de especies de marcaje.

i) Sustancias fluorescentes seleccionadas a partir de, por ejemplo, fluoresceína (adecuadamente como isotiocianato de fluoresceína, FITC), fluoresceinamina, 1-naftol, 2-naftol, eosina, eritrosina, morina, o-fenilendiamina, rodamina y ácido 8-anilino-1-naftalensulfónico.

ii) Pueden seleccionarse isótopos radioactivos de relevancia, por ejemplo, entre isótopos de hidrógenos (es decir, tritio, ^{3}H), carbono (tal como ^{14}C), fósforo (tal como ^{32}P), azufre (tal como ^{35}S), yodo (tal como ^{131}I), bismuto (tal como ^{212}Bi), itrio (tal como ^{90}Y), tecnecio (tal como ^{99}Tc), paladio (tal como ^{109}Pd) y samario (tal como ^{153}Sm).

iii) Pueden seleccionarse átomos pesados de relevancia, por ejemplo, entre Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, In, Ag, Au, Hg, I, Bi, Y, La, Ce, Eu y Gd. El oro (Au) puede usarse en combinación con plata (Ag) como reactivo de potenciación y el Au es un átomo pesado particularmente útil en muchos casos.

La especie molecular también puede estar en forma de especie de reconocimiento capaz de unirse selectivamente a, o reaccionar selectivamente con, una molécula complementaria o una región estructural complementaria de un material de origen biológico. Ejemplos de especies de reconocimiento relevantes son, por ejemplo: antígenos; haptenos; anticuerpos monoclonales o policlonales; sondas génicas; oligonucleótidos o polinucleótidos naturales o sintéticos; ciertos monosacáridos, oligosacáridos o polisacáridos naturales o sintéticos; lectinas; avidina o estreptavidina; biotina; factores de crecimiento; hormonas; moléculas receptoras; proteína A o proteína G. Para ejemplos de anticuerpos apropiados, se hace referencia a los ejemplos experimentales dados en este documento. Ejemplos de hormonas relevantes se pueden seleccionar a partir de hormonas esteroideas (por ejemplo, estrógeno, progesterona o cortisona), hormonas aminoacídicas (por ejemplo, tiroxina) y hormonas peptídicas y proteicas (por ejemplo, vasopresina, bombesina, gastrina o insulina).

En una realización, la presente invención puede emplear procedimientos convencionales de detección inmunohistoquímica o citoquímica para la detección del indicador de inflamación predeterminado, o cualquier modificación adecuada de estos procedimientos. Por lo tanto, la invención puede emplear cualquier ensayo que tenga como resultado el reconocimiento de un determinante antigénico mediado por una reacción inmunoquímica del determinante antigénico con un denominado anticuerpo primario específico capaz de reaccionar exclusivamente con el determinante antigénico diana en forma de un indicador de inflamación predeterminado.

El anticuerpo primario está marcado preferiblemente con un marcador apropiado capaz de generar, directa o indirectamente, una señal detectable. El marcador es preferiblemente una enzima, un isótopo, un grupo fluorescente o un metal pesado como el oro.

En otra realización, la invención emplea la detección del anticuerpo primario mediante una reacción inmunoquímica con los denominados anticuerpos secundarios específicos capaces de reaccionar con los anticuerpos primarios. En este caso, los anticuerpos secundarios están marcados preferiblemente con un marcador apropiado, tal como una enzima, un isótopo, un grupo fluorescente o un metal pesado como el oro.

Aún en otra realización, la presente invención emplea un denominado anticuerpo enlazador como medio de detección del indicador de inflamación predeterminado. Esta realización aprovecha que la reacción inmunoquímica entre el determinante antigénico diana en forma del indicador de inflamación predeterminado y del anticuerpo primario está mediada por otra reacción inmunoquímica que implica al anticuerpo enlazador específico capaz de reaccionar simultáneamente tanto con el cuerpo primario como con otro anticuerpo al cual se han unido enzimas a través de una reacción inmunoquímica, o a través de unión covalente o similar.

Aún en otra realización según la presente invención, la reacción inmunoquímica entre un determinante antigénico diana en forma de indicador de inflamación predeterminado y el anticuerpo primario o, alternativamente, entre el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario, se detecta por medio de una unión de pares de moléculas complementarias distintas de antígenos y anticuerpos. Se prefiere un par complementario, tal como por ejemplo, biotina y estreptavidina. En esta realización, un miembro del par complementario se une al anticuerpo primario o secundario, y el otro miembro de la pareja complementaria se pone en contacto con cualquier marcador adecuado, tal como por ejemplo, una enzima, un isótopo, un grupo fluorescente o un metal pesado como el oro.

Una muestra que contiene potencialmente un indicador de inflamación predeterminado que se va a detectar se pone en contacto preferiblemente con una molécula polimérica vehículo que comprende un anticuerpo primario marcado o sin marcar capaz de detectar dicho indicador de inflamación. El anticuerpo se une inmunoquímicamente al indicador de inflamación predeterminado contenido en la muestra. A continuación, el indicador de inflamación se une a un soporte sólido que contiene el mismo u otro anticuerpo primario marcado o sin marcar capaz de detectar dicho indicador de inflamación. Cuando se usa un dispositivo de flujo lateral, el anticuerpo marcado unido al indicador de inflamación predeterminado se detecta mediante la reacción con reactivos apropiados, dependiendo de la elección del sistema de detección.

La muestra que contiene el indicador de inflamación predeterminado que se va a detectar, y opcionalmente también cuantificar, en una realización de la invención se somete a al menos una de las reacciones de detección descritas a continuación. La elección de la reacción de detección depende de la especie de reconocimiento en cuestión, así como de la especie de marcaje que se ha decidido usar.

Cuando se usa un marcador enzimático como especie de marcaje, el indicador de inflamación unido a un soporte sólido como se describe anteriormente en este documento, se trata con un sustrato, preferiblemente un reactivo que desarrolle color. La enzima reacciona con el sustrato y esto, en definitiva, conduce a la formación de un depósito insoluble coloreado en y alrededor de la localización de la enzima. La formación de una reacción de color es una indicación positiva de la presencia del indicador de inflamación en la muestra.

Cuando se usa un metal pesado como marcador, tal como el oro, la muestra se trata preferiblemente con un denominado potenciador en forma de reactivo que contiene, por ejemplo, plata o un indicador de contraste similar. El metal plata precipita preferiblemente como un depósito negro en y alrededor de la localización del oro. Cuando se usa un marcador fluorescente, normalmente no es necesario un reactivo de revelado.

Puede ser deseable introducir al menos una etapa de lavado después de lo cual algunos de los constituyentes de la muestra se colorean preferiblemente por la reacción con un colorante adecuado que da lugar contraste deseable al color proporcionado por la especie de marcaje en cuestión. Después de una etapa final de lavado opcional, preferiblemente se recubre la muestra con un reactivo transparente para asegurar un registro permanente para el examen.

La detección de la especie de marcaje en cuestión preferiblemente indica tanto la localización como la cantidad del determinante antigénico diana en forma del indicador de inflamación predeterminado. La detección se puede realizar por inspección visual, mediante examen por microscopía óptica en el caso de marcadores enzimáticos, mediante examen por microscopía óptica o electrónica en el caso de marcadores de metales pesados, mediante examen por microscopía de fluorescencia, usando luz irradiada de una longitud de onda adecuada en el caso de marcadores fluorescentes y mediante autorradiografía en el caso de un marcador isotópico. Es preferible la detección de la presencia del indicador de inflamación (y preferiblemente también la cantidad del indicador) mediante la inspección visual de la muestra.

En una realización especialmente preferida, la detección visual se basa en un punto límite sobre el cual un color indica la presencia del indicador de inflamación sobre una cierta cantidad mínima (punto límite), y por debajo de cuyo punto límite otro color indica que el indicador de inflamación está presente en una cantidad inferior a la indicada por el punto límite. Cuando se usan marcadores fluorescentes, las cantidades detectadas de indicador de inflamación se correlacionan directamente con la fluorescencia medida por una unidad de detección.

Para la detección del indicador de inflamación predeterminado según la presente invención, son especialmente preferidos los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzima (ELISA) en los que el indicador de inflamación se detecta directamente, inicialmente mediante detección por una especie de reconocimiento en forma de antígeno, hapteno o anticuerpo, y posteriormente por medio de una enzima que está ligada, esto es unida covalentemente o conjugada, bien (cuando se tiene que determinar un antígeno o un hapteno) a un anticuerpo que es específico para el antígeno o hapteno en cuestión, o bien (cuando se tiene que determinar un anticuerpo) a un anticuerpo que es específico para el anticuerpo en cuestión.

En una realización preferida, el indicador de inflamación predeterminado que se va a detectar se une o inmoviliza poniendo en contacto inmunoquímicamente el indicador con un anticuerpo denominado de "captura" unido por ejemplo, mediante adsorción no covalente a la superficie de un material apropiado tal como un soporte sólido. Ejemplos de dichos materiales de soporte sólido son polímeros, tales como por ejemplo nitrocelulosa o poliestireno, opcionalmente en forma de varilla, tira de ensayo, perla o placa de microvaloración.

Membranas de nitrocelulosa disponibles en el mercado son, por ejemplo

Millipore Hi-Flow Plus HF07504

Millipore Hi-Flow Plus HF09004

Millipore Hi-Flow Plus HF12004

Millipore Hi-Flow Plus HF13504

Millipore Hi-Flow Plus HF18004

Sartorius Unisart CN40

Sartorius Unisart CN90

Sartorius Unisart CN200*

Se permite que un anticuerpo específico adecuado ligado a una enzima se una al indicador de inflamación inmovilizado para ser detectado directamente. La cantidad de anticuerpo específico unido, es decir, un parámetro que se correlaciona con el indicador inmovilizado, se determina añadiendo una sustancia capaz de actuar como sustrato para la enzima unida. La catálisis enzimática del sustrato tiene como resultado el desarrollo de una señal detectable, tal como por ejemplo un color característico o una fuente de radiación electromagnética. La intensidad de la radiación emitida puede medirse, por ejemplo, mediante espectrofotometría, mediante colorimetría o mediante comparación. La intensidad determinada de la radiación emitida se correlaciona (y preferiblemente, es proporcional) con la cantidad de indicador de inflamación predeterminado detectado. Ejemplos de enzimas preferidas para el uso en ensayos de este tipo son, por ejemplo, peroxidasas, tales como la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasas, galactosidasas y ureasas.

Los ensayos inmunoquímicos de tipo análogo al ELISA, pero que emplean otros medios de detección, también son adecuados para detectar directamente un indicador de inflamación según la presente invención. Típicamente, estos ensayos se basan en el uso de anticuerpos específicos a los que se unen covalentemente especies de marcaje fluorescente o luminiscente. Los ensayos denominados de "fluorescencia de resolución temporal" son especialmente preferidos y típicamente emplean un marcador de ión europio o un quelante de europio, incluso aunque otras ciertas especies de lantánidos o quelantes de lantánidos pueden emplearse también. A diferencia de muchas especies tradicionales de marcaje fluorescente, la vida de la fluorescencia del quelato lantánido está generalmente en el intervalo de 100-1000 microsegundos. En comparación, la fluoresceína tiene una vida de fluorescencia de sólo aproximadamente 100 nanosegundos o menos. Haciendo uso de una fuente de luz pulsada y un fluorímetro con control de tiempo, se puede medir la fluorescencia de los compuestos de quelato de lantánido en una ventana de tiempo de aproximadamente 200-600 microsegundos después de cada excitación. Una ventaja principal de esta técnica es la reducción de las señales de fondo que pueden surgir de la fluorescencia de vida más corta de otras sustancias presentes en la muestra de análisis o en el sistema de medición.

Ensayos adicionales que emplean técnicas de detección inmunoquímica capaces de ser aprovechadas en la presente invención pertenecen al grupo de los procedimientos de "inmunotransferencia", tales como por ejemplo, procedimientos de "transferencia de puntos" y "inmunotransferencia de proteínas". En el procedimiento de inmunotransferencia de proteínas, que se emplea típicamente para el análisis e identificación de polipéptidos o proteínas antigénicos, el indicador de inflamación predeterminado de interés preferiblemente se transfiere o se fija a un soporte sólido o a una hoja de membrana, tal como por ejemplo, una hoja de nitrocelulosa o un papel químicamente tratado al cual es capaz de unirse el indicador de inflamación. La unión puede estar mediada por una especie de reconocimiento, tal como por ejemplo, un anticuerpo unido al soporte. Se añade inicialmente una especie de reconocimiento apropiada en forma de anticuerpo específico y seguido después por un segundo anticuerpo marcado dirigido frente al primer anticuerpo. Se puede añadir proteína A marcada como alternativa a la adición del segundo anticuerpo marcado. Preferiblemente, el marcador es un radioisótopo, un colorante fluorescente, una enzima o un metal pesado, tal como oro o un coloide del mismo. La presencia y localización del indicador de inflamación se detecta de forma apropiada como se describe anteriormente en este documento.

"Resto de conexión" como se usa en este documento indica cualquier especie química capaz de formar un conjugado mediante la unión a una especie molecular y una molécula polimérica vehículo. Según una realización de la invención, se prefieren especialmente el establecimiento, en la molécula polimérica vehículo, de restos reactivos unidos covalentemente derivadas de divinil sulfona, y el establecimiento de enlaces covalentes entre, por un lado, estos restos, y, por otro lado, especies moleculares como se define en este documento.

Ejemplos adicionales de restos de conexión, o grupos funcionales reactivos, son especies químicas que comprenden como grupo reactivo compuestos tales como por ejemplo, 4-fluoro-3-nitrofenil azida, acil azidas tales como benzoil azida y p-metilbenzoil azida, formiatos de azido, tales como etil azidoformiato, fenil azidoformiato, sulfonil azidas, tales como benzenosulfonil azida, fosforil azidas, tales como difenil fosforil azida y dietil fosforil azida, compuestos diazo, tales como diazoacetofenona y 1-trifluorometil-1-diazo-2-pentanona, diazoacetatos, tales como t-butil diazoacetato y fenil diazoacetato, beta-ceto-alfa-diazoacetatos, tales como t-butil alfa diazoacetoacetato, compuestos azo alifáticos, tales como azobisisobutironitrilo, diazirinas, tales como 3-trifluorometil-3-fenildiazirina, cetenas (-CH=C=O), tales como cetena y difenilcetena, cetonas fotoactivables, tales como benzofenona y acetofenona, compuestos peroxi, tales como peróxido de di-t-butilo, peróxido de diciclohexilo, peróxidos de diacilo, tales como peróxido de dibenzoilo y peróxido de diacetilo, y peroxiésteres, tales como peroxibenzoato de etilo.

En caso de que el grupo reactivo funcional sea un grupo vinilo, la reactividad del grupo vinilo en una especie química, tal como por ejemplo divinil sulfona, necesitará generalmente que la funcionalidad reactiva en el vehículo polimérico, es decir, el grupo con el cual un grupo vinilo de, por ejemplo, divinil sulfona reaccionará para formar un enlace covalente, será una función nucleófila.

Vehículos poliméricos adecuados serán entonces, por ejemplo, vehículos poliméricos con grupos funcionales tales como:

i) O^{-} (por ejemplo, grupos hidroxi-fenólicos desprotonados, tales como grupos hidroxi aromáticos desprotonados en restos de tirosina de polipéptidos o proteínas),

ii) S^{-} (por ejemplo, grupos tiol desprotonados en anillos aromáticos o grupos alifáticos, tales como grupos tiol desprotonados en restos de cisteína de polipéptidos o proteínas),

iii) OH (por ejemplo, grupos hidroxi alifáticos en anillos de azúcar, tales como glucosa u otros anillos de monosacáridos en oligosacáridos o polisacáridos; o grupos hidroxi alcohólicos en polioles, tales como polietilenglicoles; o grupos hidroxi en ciertos restos de aminoácidos de polipéptidos o proteínas, tales como restos de serina o treonina),

iv) SH (por ejemplo, grupos tiol en restos de cisteína de polipéptidos o proteínas), grupos amino primarios (por ejemplo, en restos de lisina u ornitina de polipéptidos o proteínas; o en anillos de azúcar amino sustituidos en ciertos polisacáridos o derivados de los mismos, tal como quitosano) o grupos amino secundarios (por ejemplo, en restos de histidina de polipéptidos o proteínas).

Por lo tanto, el grupo funcional en cuestión de la especie molecular en el contexto de la invención normalmente tendrá también una función nucleófila, tal como una función nucleófila de uno de los tipos descritos anteriormente.

En una realización, la presente invención se refiere a un kit que comprende un conjugado que comprende una molécula polimérica vehículo a la cual están unidas covalentemente una o más especies moleculares, cada una a través de un resto de conexión en forma de un grupo de enlace.

Un tipo de grupo de enlace preferido deriva de divinil sulfona. En este caso, la unión de cada uno de los grupos de enlace a la molécula polimérica vehículo se genera mediante un enlace covalente formado entre uno de los dos grupos vinilo de la molécula de divinil sulfona y una funcionalidad reactiva en la molécula vehículo, y la unión de una especie molecular al grupo de enlace a través de un enlace covalente formado entre el otro grupo vinilo que se origina a partir de la molécula de divinil sulfona y un grupo funcional en la especie molecular.

En conjugados especialmente interesantes del último tipo según la invención, la molécula polimérica vehículo además se ha unido covalentemente a estos uno o más restos derivados de divinil sulfona, cada uno de cuyos restos está unido a través de un enlace covalente formado entre uno o los dos grupos vinilo de una molécula de divinil sulfona y una funcionalidad reactiva en la molécula polimérica vehículo, teniendo al menos uno de dichos restos en su estado unido el restante grupo vinilo libre y capaz de reaccionar con una especie molecular adicional que tiene un grupo funcional que es reactivo con el grupo vinilo libre.

La especie molecular unida a un conjugado según la invención se puede dividir en, por ejemplo, especies moleculares que tienen pesos moleculares de aproximadamente 2.000 o por debajo, y especies moleculares que tienen pesos moleculares de aproximadamente 2.000 o por encima. En el primer caso, la molécula polimérica vehículo del conjugado puede tener desde 1 a aproximadamente 10.000 especies moleculares unidas covalentemente a ésta, por ejemplo desde aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 especies moleculares, tales como desde aproximadamente 20 a aproximadamente 500 especies moleculares unidas covalentemente a ésta. En el último caso, es decir, para especies moleculares de peso molecular de aproximadamente 2.000 o por encima, la molécula polimérica vehículo del conjugado puede tener desde 1 a aproximadamente 1000 especies moleculares unidas covalentemente a ésta, por ejemplo, desde 1 a aproximadamente 500 especies moleculares, tales como desde 1 a aproximadamente 100, desde 2 a aproximadamente 50 o desde 10 a aproximadamente 50 especies moleculares unidas covalentemente a ésta.

La "molécula polimérica vehículo" según la invención es cualquier polímero capaz de unir una especie molecular o capaz de modificación con el propósito de unirse a una especie molecular. Las moléculas poliméricas vehículo y los conjugados que contienen dichas moléculas poliméricas vehículo según la invención se pueden elegir entre una amplia diversidad de polímeros, que incluyen:

i) polisacáridos naturales y sintéticos, así como derivados de los mismos, por ejemplo dextranos y derivados de dextrano, almidones y derivados de almidón, derivados de celulosa, amilosa y pectina, así como ciertas gomas naturales y derivados de las mismas, tal como goma arábiga y sales de ácido algínico;

ii) homopoliaminoácido u homopoliaminoácidos que tienen funcionalidades reactivas adecuadas, tales como polilisinas, polihistidinas o poliornitinas;

iii) polipéptidos y proteínas naturales o sintéticos, tales como albúmina bovina y otras albúminas de mamíferos; y

iv) polímeros sintéticos que tienen grupos funcionales nucleófilos, tales como alcoholes de polivinilo, alcohol de polialilo, polietilenglicoles y poliacrilatos sustituidos.

Un grupo de moléculas poliméricas vehículo preferido para los fines de la invención son polisacáridos y derivados de los mismos, por ejemplo: dextranos, carboximetil dextranos, hidroxietil e hidroxipropil almidones, glucógeno, derivados de agarosa e hidroxietil e hidroxipropil celulosas.

Se ha demostrado que los dextranos son un grupo de polímeros especialmente adecuados en conexión con la presente invención y los dextranos actualmente representan uno de los grupos de polímeros más preferidos.

Los conjugados según la presente invención preferiblemente no tienen carga neta, ya que la presencia de una carga neta positiva o negativa puede conducir, inter alia, a la unión inespecífica no deseable de los conjugados a sustancias y/o materiales distintos de los de interés. En muchos casos esta condición, a menos que se introduzcan especies moleculares cargadas, se cumplirá simplemente asegurando que el propio vehículo polimérico no posee carga neta. En una realización adicional de la invención, la molécula polimérica vehículo de un reactivo o conjugado de la invención es, en su estado libre, sustancialmente lineal y sustancialmente sin carga a un pH en el intervalo de aproximadamente 4 a aproximadamente 10. Este intervalo de pH es de relevancia práctica para la inmensa mayoría de procedimientos inmunoquímicos, procedimientos de hibridación y otras aplicaciones, en particular, de conjugados de la invención. Entre los diversos polímeros que cumplen este criterio están, por ejemplo, numerosos polisacáridos y derivados de polisacáridos, por ejemplo, dextranos e hidroxietil e hidroxipropil celulosas.

Dependiendo del uso al cual se va a destinar un reactivo o conjugado de la invención, los conjugados de la invención pueden estar basados en moléculas poliméricas vehículo que tengan pesos moleculares que oscilen desde muy bajos a muy altos. En una realización adicional de la invención la molécula polimérica vehículo puede tener un pico de peso molecular en el intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 40.000.000.

El pico de pesos moleculares que son de considerable interés están en el intervalo de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 80.000, y en el intervalo de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 2.000.000. Un pico de peso molecular de especial interés, en particular en el caso de dextranos como vehículos poliméricos, es un pico de peso molecular de aproximadamente 500.000.

La expresión "pico de peso molecular" (también denominado "pico de peso molecular promedio") según se emplea en este documento indica el peso molecular de mayor abundancia, es decir, aquel peso molecular (entre una distribución de pesos moleculares) que posee el mayor número de moléculas en una muestra o lote del polímero determinado. Es muy normal caracterizar numerosos tipos de polímeros de esta forma, debido a la dificultad (especialmente para los pesos moleculares más altos) para obtener o preparar fracciones de polímero de una distribución de pesos moleculares muy estrecha. En el caso de numerosos polímeros disponibles en el mercado que son de interés en el contexto de la invención, por ejemplo dextranos, el fabricante o distribuidor será capaz de proporcionar datos fiables del pico de peso molecular (determinado, por ejemplo, mediante cromatografía de filtración en gel) que puedan proporcionar una base para la selección de una fracción de polímero adecuada para la preparación de un tipo particular de reactivo o conjugado.

Los valores del pico de peso molecular citados en este documento se refieren al pico de peso molecular del polímero libre en cuestión y no tiene en cuenta, por ejemplo, la posible formación de unidades entrecruzadas de polímero, por ejemplo, como resultado del entrecruzamiento de dos o más moléculas de polímero mediante la reacción, por ejemplo, con divinil sulfona durante un procedimiento según la invención para la preparación de un reactivo o conjugado de la invención; dichas unidades entrecruzadas tendrán, como promedio, pesos moleculares más altos que las moléculas libres individuales de polímero a partir de las cuales se forman.

Los conjugados según la presente invención pueden adaptarse para cumplir un intervalo muy amplio de requisitos con respecto al pico de peso molecular del polímero y del contenido de grupos vinilo reactivos libres. Un aspecto adicional de la invención se refiere a conjugados que comprenden una molécula polimérica vehículo que tiene un pico de peso molecular de aproximadamente 500.000 o aproximadamente 2.000.000 o que tiene un pico de peso molecular en uno cualquiera de los siguientes intervalos: De aproximadamente 1.000 a aproximadamente 20.000; de aproximadamente 20.000 a aproximadamente 80.000; de aproximadamente 80.000 a aproximadamente 500.000; de aproximadamente 500.000 a aproximadamente 5.000.000 y de aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 40.000.000.

Las moléculas poliméricas vehículo preferiblemente tienen un contenido de grupos vinilo reactivos libres en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 \mumoles de grupos vinilo por gramo de vehículo polimérico, como en cualquiera de los siguientes subintervalos (expresados en \mumoles de grupos de vinilo por gramo de vehículo polimérico): De aproximadamente 1 a aproximadamente 50; de aproximadamente 50 a aproximadamente 300; de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 y de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000.

En una realización adicional de la presente invención se proporciona un kit que comprende un conjugado que comprende un vehículo polimérico que tiene

i) un pico de peso molecular de aproximadamente 500.000 ó aproximadamente 2.000.000, o que tiene un pico de peso molecular en uno cualquiera de los siguientes intervalos: De aproximadamente 1.000 a aproximadamente 20.000; aproximadamente 20.000 a aproximadamente 80.000; aproximadamente 80.000 a aproximadamente 500.000; aproxi-
madamente 500.000 a aproximadamente 5.000.000 o aproximadamente 5.000.000 a aproximadamente 40.000.000 y

ii) un contenido total de especies moleculares y, cuando sea relevante, grupos vinilo libres en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 \mumoles de a) especies moleculares y, cuando sea relevante, b) grupos vinilo por gramo de vehículo polimérico, tal como en cualquiera de los siguientes subintervalos (expresados en \mumoles de especie molecular más, cuando sea relevante, \mumoles de grupos vinilo por gramo de vehículo polimérico): De aproximadamente 1 a aproximadamente 50; de aproximadamente 50 a aproximadamente 300; de aproximadamente 300 a aproximadamente 1.000 o de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 5.000.

Las muestras según la presente invención son adecuadamente fluido de la conjuntiva, secreción nasal, secreción faríngea, esputo, lavado bucal, lavado bronquial, secreción cervical y vaginal, orina, sangre, heces, sinovio, líquido cefalorraquídeo, ascitis, vesículas, exudado de lesiones y torundas de, por ejemplo, úlceras o conjuntiva.

Los indicadores de inflamación que incluyen mediadores inflamatorios según la invención se seleccionan, pero no de forma limitante, entre el grupo formado por citoquinas y autoanticuerpos, que incluye citoquinas pertenecientes a sistemas inflamatorios, tales como por ejemplo, el sistema de IL-1; que incluye IL-1\alpha e IL-1\beta, IL-1ra y autoanticuerpos frente a IL-1\alpha, sIL1-RI y sIL1-RII, el sistema de TNF\alpha; que incluye, pero no de forma limitante, los antagonistas de TNF\alpha, sTNFR p55 y p75, e IL-6 y autoanticuerpos frente a IL-6, citoquinas que pertenecen a sistemas inmunorreguladores, tales como mediadores relacionados con el equilibrio Th1/Th2; IL-12, sIL-4R, citoquinas Th1: TNF\beta (LT), IFN\gamma, citoquinas Th2: IL-4, IL-10, y mediadores adicionales tales como por ejemplo IL-2, RANTES, IL-8, sIL-2R, IL-18, IFN\alpha y proteína catiónica del eosinófilo.

Las citoquinas enumeradas a continuación representan un grupo preferido de indicadores de inflamación según la presente invención.

Citoquina	Producida, por ejemplo, por	Efectos más importantes
IL-1\alpha/IL-1\beta	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células NK, células T y B, granulocitos neutrófilos, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos, células sinoviales, células de músculo liso, células mesangiales\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células T, B y NK, células endoteliales, osteoclastos y células de médula ósea. Numerosos efectos sobre células inflamatorias, media en la fiebre\end{minipage}
IL-1ra IL-1ra	Monocitos, macrófagos	\begin{minipage}[t]{63mm}Antagoniza los efectos de IL-1\alpha/\betab a nivel del receptor\end{minipage}
IcIL-1ra	Granulocitos neutrófilos, queratinocitos	\begin{minipage}[t]{63mm} se está utilizando en un ensayo base en pacientes con sepsis, artritis crónica\end{minipage}
IL-2	Células Th1	Potencia el crecimiento de células T, B y NK
IL-3	Células Th2, queratinocitos, mastocitos	Estimula granulocitos basófilos
IL-4	\begin{minipage}[t]{63mm} Células Th2, granulocitos basófilos y mastocitos, monocitos/macrófagos, células B\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Potencia el crecimiento de células T y B. Suprime las funciones de macrófagos. Induce el cambio de isotipo en células B (producción de IgE e IgG4)\end{minipage}
IL-5	Células Th2, mastocitos	Estimula granulocitos eosinófilos
IL-6	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células Th2, fibroblastos, células endoteliales, ciertas células cancerosas\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Como IL-1 con ciertas excepciones. El activador más importante de la producción de proteínas de fase aguda de hepatocitos. Factor de crecimiento para células de mieloma\end{minipage}
IL-7	\begin{minipage}[t]{63mm} Células del estroma en médula ósea, células de hígado fetal, células del epitelio intestinal\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Crecimiento y maduración de células pre-T y pre-B. Coactiva células T y NK\end{minipage}
IL-8	\alpha-quimioquina	\alpha-quimioquina
IL-9	Células Th2	\begin{minipage}[t]{63mm} Factor de crecimiento para mastocitos (con IL-3), células T, megacariocitos, preeritrocitos (con eritropoyetina). Coactiva mastocitos, células T y células B (producción de IgE)\end{minipage}
IL-10	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células Th0, células Th2, células B (especialmente infectadas con EBV), mastocitos, queratinocitos, células epidérmicas\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Coactiva ciertas subpoblaciones de células T y B y mastocitos. Suprime células Th1 (producción de IFN\gamma) y ciertas funciones de monocitos/macrófagos y células NK\end{minipage}
IL-11	\begin{minipage}[t]{63mm} Fibroblastos, células del estroma en médula ósea, células de pulmón fetal, trofoblastos\end{minipage}	Como IL-6

(Continuación)

Citoquina	Producida, por ejemplo, por	Efectos más importantes
IL-12	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células B, células dendríticas, células de Langerhans, queratinocitos, granulocitos neutrófilos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células Th1 (producción de IFN\gamma) y células NK\end{minipage}
IL-13	Células T	\begin{minipage}[t]{63mm} Estimula el crecimiento de células B (induce IgE, IL-13 IgG4)\end{minipage}
IL-14	Células T	\begin{minipage}[t]{63mm} Coactiva células B(proliferación/diferencia- ción), pero inhibe la secreción de Ig\end{minipage}
IL-15	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, ciertas células T, fibroblastos, células endoteliales y epiteliales, miocitos, células del estroma en médula ósea, células de la placenta\end{minipage}	Como IL-2
IL-16	Células T, granulocitos eosinófilos	\begin{minipage}[t]{63mm} Quimiotáctico para células T CD4. Activa células T CD4 y monocitos\end{minipage}
IL-17	Células Th	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células T, fibroblastos (expresión de ICAM-1). Induce IL-6 e IL-8\end{minipage}
IL-18	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células de Kupffer, osteoblastos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm}Activa células Th1 y NK (producción de IFN\gamma)\end{minipage}
LIF	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células T, células del estroma en médula ósea, fibroblastos, astrocitos\end{minipage}	Como IL-6
PDGF	\begin{minipage}[t]{63mm} Trombocitos, monocitos, macrófagos, células endoteliales, células de músculo liso, fibroblastos, neuronas\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células de músculo liso vascular, células endoteliales y epiteliales, células gliales, condriocitos, fibroblastos, neutrófilos y monocitos. Quimiotáctico para las células mencionadas anteriormente\end{minipage}
NGF	\begin{minipage}[t]{63mm} Macrófagos, astrositos, células nerviosas, células de músculo liso, fibroblastos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células B, granulocitos basófilos y neuronas simpáticas y sensoras\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{22mm}TGF\beta (varias formas)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Megacariocitos, trombocitos, monocitos, macrófagos, células T, células endoteliales, fibroblastos, osteoblastos, condriocitos, células de músculo liso\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células B (induce IgA), osteoblastos, fibroblastos y otras células. Inhibe el crecimiento de células endoteliales y epiteliales, osteoclastos, células T y NK\end{minipage}
TNF	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, incluido macrófagos titulares, células Th1 y Tc, células B, células NK, neutrófilos, queratinocitos, células de músculo liso\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa células T, B y NK, granulocitos neutrófilos y eosinófilos, células endoteliales, osteoclastos. Citotóxico para células transformadas e infectadas por virus. Media en la fiebre\end{minipage}
LT\alpha/LT\beta	Células Th1, (células B)	Como TNF
FasL	Células Th1 y Tc, células NK	\begin{minipage}[t]{63mm} Citotóxico para células infectadas con virus, incluido células infectadas por VIH\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{25mm}IFN\alpha (>16 subtipos)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Leucocitos infectados por virus, células T y B, monocitos, macrófagos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Actividad antiviral. Efectos antiproliferativos y antitumorales. Activa macrófagos, células NK y B\end{minipage}
IFN\beta	\begin{minipage}[t]{63mm} Muchos tipos de células infectadas por virus, fibroblastos\end{minipage}	Actividad antiviral Activa células NK

(Continuación)

Citoquina	Producida, por ejemplo, por	Efectos más importantes
IFN\gamma	\begin{minipage}[t]{63mm} Células Th1 y Tc, células endoteliales, células del músculo liso\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa fibroblastos, monocitos/macrófagos, células T, B y NK (induce IgG). Induce MHC II (muchos tipos celulares). Suprime el crecimiento celular en general\end{minipage}
SCF	\begin{minipage}[t]{63mm} Células del estroma en médula ósea, células endoteliales, fibroblastos, células de Sertoli\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa y diferencia células troncales de médula, mastocitos\end{minipage}
GM-CSF	\begin{minipage}[t]{63mm} Células Th2, fibroblastos, células endoteliales, macrófagos, mastocitos, granulocitos neutrófilos, granulocitos eosinófilos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Activa y diferencia precursores de células T, monocitos, granulocitos neutrófilos\end{minipage}
G-CSF	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales, células T, granulocitos neutrófilos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm}Activa y diferencia precursores de granulocitos neutrófilos\end{minipage}
M-CSF	\begin{minipage}[t]{63mm}Monocitos, macrófagos, fibroblastos, células endoteliales\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm}Activa y diferencia precursores de monocitos\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{25mm}\alpha\text{-}quimioquinas (CXC)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células T, células endoteliales, otras varias células\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Quimiotácticas para granulocitos neutrófilos, células T, granulocitos basófilos, queratinocitos\end{minipage}
\begin{minipage}[t]{25mm}\beta\text{-}quimioquinas (CC)\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Monocitos, macrófagos, células T y B, trombocitos, células endoteliales, células de músculo liso, mastocitos, fibroblastos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Quimiotácticas para monocitos/macrófagos, células NK, granulocitos eosinófilos y basófilos. Inhiben la infección de monocitos/macrófagos CD4-positivos con VIH (que usa receptores de \beta\text{-}quimioquinas como coactivadores para la infección)\end{minipage}
Linfotactina	Células T	Quimiotáctico para células T
\begin{minipage}[t]{25mm}VIP/PACAP y otros neuropéptidos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Células nerviosas (por ejemplo, en timo, bazo y ganglios linfáticos), células T y B, eosinófilos, mastocitos, neutrófilos\end{minipage}	\begin{minipage}[t]{63mm} Inmunosupresor por la inhibición de la producción de IL-2 e IL-4. Inmunoestimulación indirecta por la inhibición de IL-10\end{minipage}

\vskip1.000000\baselineskip

Abreviaturas y definiciones

CC:

\beta-quimioquinas (por ejemplo, proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1, proteína quimiotáctica de monocitos (MCP)-1 -4, expresado y secretado por células T normales y regulado por la activación (RANTES)

CXC:

\alpha-quimioquinas (por ejemplo, IL-8)

CSF:

factor estimulante de colonias

FasL:

ligando de Fas

G-CSF:

CSF de granulocitos

GM-CSF:

CSF de granulocitos-macrófagos

icIL-1ra:

IL-1ra intracelular

IFN:

interferón

IL:

interleuquina

LT:

linfotoxina

M-CSF:

CSF de macrófagos

MHC:

complejo principal de histocompatibilidad

NGF:

factor de crecimiento neuronal

Células NK:

células asesinas naturales

PACAP:

péptido activador de la adenilil ciclasa de la pituitaria

SCF:

factor de células madre

TGF:

factor de crecimiento transformante

TNF:

factor de necrosis tumoral

VIP:

péptido intestinal vasoactivo

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En particular, la presente invención se puede usar para proporcionar un perfil de citoquinas, es decir, una medida de al menos dos citoquinas, tales como por ejemplo, al menos cuatro citoquinas, por el cual la presencia y concentración relativa de cada citoquina puede ser indicativo de una enfermedad o del pronóstico de una enfermedad.

Además, los indicadores de inflamación pueden incluir indicadores del sistema inmune, tales como autoanticuerpos. Mediante la presente invención es posible detectar y cuantificar autoanticuerpos relacionados con enfermedades inmunes o dolencias relacionadas con enfermedades inmunes.

En una realización preferida los autoanticuerpos se seleccionan, pero no de forma limitante, entre los autoanticuerpos mencionados a continuación en relación a la enfermedad para la que se diagnostica.

\vskip1.000000\baselineskip

Diagnóstico provisional		Prueba recomendada para autoanticuerpo
Enfermedad de Addison	1:	anti-adrenocortical
Síndrome renopulmonar agudo	1:	paquete renopulmonar
Síndrome antifosfolípido	1:	análisis de ANA, anti-cardiolipina IgG e IgM, anti-beta2-GPI.
	2:	anti-ADNcd.
	3:	valoración de ANA, anti-ENA, análisis de IB, anti-SSA/SSB
Enfermedad celiaca	1:	EMA, anti-gliadina, anti-reticulina.
Colitis ulcerosa	1:	ANCA IIF.
Fibrosis quística	1:	BPI-ANCA.
Diabetes mellitus	1:	anti-GAD-65, ICA.
Fiebre reumática	1:	anti-sarcolema.
Alveolitis fibrosante	1:	análisis de ANA.
	2:	anti-ENA, anti-Jo-1, anti-Scl-70.
	3:	valoración de ANA, análisis de IB
Glomerulonefritis (RPGN)	1:	ANCA IIF, anti-MBG.
	2:	MPO-ANCA, Pr3-ANCA.
	3:	análisis de ANA, anti-ADNcd, anti-entactina, IgA-FN.

(Continuación)

Diagnóstico provisional		Prueba recomendada para autoanticuerpo
Síndrome de Goodpasture	1:	anti-MBG.
	2:	MPO-ANCA.
Púrpura hipergammaglobulinémica	1:	análisis de ANA.
	2:	valoración de ANA, anti-SSA/SSB, IgM-RF.
	3:	análisis de IB.
Hiper/hipotireosis	1:	anti-TPO, anti-TG.
	2:	PCA.
Nefritis por IgA	1:	IgA-FN.
Vasculitis relacionada con infección	1:	BPI-ANCA.
Artritis reumatoide juvenil*	1:	análisis de ANA, ANCA IIF.
	2:	IgM-RF.
	3:	valoración de ANA, análisis de IB
Hepatitis activa crónica	1:	SMA, anti-LKM.
	2:	análisis de ANA.
	3:	valoración de ANA, ANCA IIF, anti-ADNcd, AMA, IgM-RF.
LE relacionado con medicamentos*	1:	ANCA IIF.
	2:	Análisis de ANA, anti-histona, EL-ANCA, MPO-ANCA.
	3:	valoración de ANA, anti-ADNcd, análisis de IB, Pr3-ANCA.
Poliangitis microscópica/síndrome de	1:	ANCA IIF.
Churg-Strauss	2:	MPO-ANCA, Pr3-ANCA.
Enfermedad mixta del tejido conectivo*	1:	análisis de ANA.
	2:	valoración de ANA, anti-ENA, IgM-RF.
	3:	análisis de IB.
Enfermedad de Crohn	1:	ASCA
Miastenia gravis	1:	TVMA.
Anemia perniciosa	1:	PCA.
Polidermatomiositis*	1:	análisis de ANA.
	2:	anti-ENA, anti-Jo-1, paquete miositis.
Cirrosis biliar primaria	1:	análisis de ANA, AMA.
	2:	anti-PDH.
	3:	valoración de ANA, SMA, análisis de IB

(Continuación)

Diagnóstico provisional		Prueba recomendada para autoanticuerpo
Colangitis esclerosante primaria	1:	ANCA IIF.
Síndrome de Raynaud primario	1:	análisis de ANA.
	2:	anti-ENA.
	3:	valoración de ANA, análisis de IB, anti-Scl-70.
Vasculitis inducida por propiltiouracilo	1:	ANCA IIF.
	2:	EL-ANCA, MPO-ANCA.
Artritis reumatoide*	1:	anti-queratina, IgM-RF, ANCA IIF.
	2:	análisis de ANA, IgA-RF.
	3:	valoración de ANA, anti-histona, análisis de IB, anti-SSA/SSB.
Vasculitis reumatoide	1:	ANCA IIF.
	2:	LF-ANCA.
Síndrome de Sjögren*	1:	análisis de ANA.
	2:	valoración de ANA, anti-SSA/SSB,
		IgA-RF, IgM-RF.
	3:	AMA, análisis de IB.
Esclerodermia*	1:	análisis de ANA.
	2:	valoración de ANA, anti-ENA, anti-Scl-70.
	3:	anti-histona, análisis de IB, anti-SSA/SSB, anti-ARN.
Lupus eritematoso sistémico*	1:	análisis de ANA.
	2:	valoración de ANA, anti-cardiolipina, anti-ADNcd, anti-ENA,
		anti-rRNP.
	3:	anti-histona, análisis de IB, AMA, anti-SSA/SSB, IgM-RF.
Nefritis tubulointersticial	1:	anti-MBT.
Sospecha de enfermedad del tejido	1:	valoración de ANA, ANCA IIF, anti-cardiolipina, IgM-RF.
conectivo
	2:	anti-Jo-1, AMA, anti-SSA/SSB.
	3:	valoración de ANA, anti-ENA, análisis de IB, anti-Scl-70, anti-
		TPO, MPO-ANCA, Pr3-ANCA.
Granulomatosis de Wegener	1:	ANCA IIF.
	2:	MPO-ANCA, Pr3-ANCA.

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Numeración relacionada con la elección de prioridad

La detección de autoanticuerpos puede usarse para diagnosticar una dolencia relacionada con el sistema inmune, tal como una enfermedad autoinmune, o como una indicación del riesgo de adquirir una enfermedad autoinmune. La correlación entre autoanticuerpos seleccionados y enfermedades se enumera de forma esquemática en la Figura 1. No debe considerarse que la lista limite la invención a los autoanticuerpos y enfermedades indicados.

En una realización de la presente invención los indicadores de inflamación son partículas infecciosas proteináceas, tales como priones. El término prión incluye proteínas PrP-Sc. Las proteínas PrP-Sc son glucoproteínas insolubles resistentes a proteasas que resultan de la modificación postraduccional de las sialoglicoproteínas PrP-C normales de mamífero. Tanto PrP-Sc como PrP-C están codificadas por un gen PrP.

Las partículas infecciosas proteináceas dentro del alcance de la presente invención pueden ser indicativas de un grupo heterogéneo de trastornos neurodegenerativos fatales, denominados frecuentemente encefalomielitis espongiformes transmisibles (TSE). Las TSE se caracterizan por el depósito de proteínas priones, la forma infecciosa de las proteínas PrP-C, en el sistema nervioso central de los individuos afectados.

Las encefalomielitis espongiformes transmisibles dentro del significado de la presente invención incluyen, pero no de forma limitante, prurito lumbar en ovejas y cabras, encefalopatía espongiforme bovina (EEB) en el ganado, enfermedad debilitante crónica (CWD) en el ciervo mula y en el alce, encefalopatía transmisible del visón (TME) en el visón, encefalopatía espongiforme felina (EEF) en gatos, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD) en humanos, síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS) en humanos, insomnio familiar fatal (IFF) en humanos o Kuru en humanos.

La detección de encefalopatías espongiformes transmisibles puede hacerse en muestras derivadas de una diversidad de animales que incluye humanos, ganado, visón, gatos, cabra, ciervo mula, alce y oveja. Estas muestras pueden ser muestras de tejido, tales como muestras de cerebro o del sistema nervioso central o muestras de fluido corporal.

Los expertos en la materia conocen anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente PrP-Sc de diversas especies. Por ejemplo, el documento US 6165784 describe anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a un epítope conservado en las proteínas PrP-Sc de oveja, ganado, ciervo mula y alce.

Además, el kit según la invención puede ser adecuado para la detección de autoanticuerpos en combinación con citoquinas relevantes.

De este modo, mediante la presente invención es posible detectar cualitativa y cuantitativamente indicadores de inflamación, y proporcionar perfiles de los indicadores de inflamación, como herramienta para diagnosticar rápidamente una amplia diversidad de enfermedades y dolencias.

El procedimiento de diagnóstico según la invención en una realización, incluye el uso de datos cualitativos y cuantitativos obtenidos mediante la detección de indicadores de inflamación. Dichos datos y procedimientos proporcionan perfiles de los indicadores de inflamación como herramienta para diagnosticar y/o identificar rápidamente individuos que sufren, pero no de forma limitante, de una dolencia infecciosa seleccionada entre el grupo compuesto por: actinomicosis, infecciones por adenovirus, ántrax, disentería bacteriana, botulismo, brucelosis (enfermedad de Bang), causada por ejemplo, por B. melitensis y B. suis, candidiasis, celulitis, chancroide, cólera, coccidioidomicosis, afebril aguda, conjuntivitis, cistitis, dermatofitosis, endocarditis bacteriana, epiglotitis, erisipela, erisipeloide, gastroenteritis, herpes genital, glándulas, gonorrea, hepatitis viral, histoplasmosis, impétigo, malaria, mononucleosis, gripe, enfermedad del legionario, leptospirosis, enfermedad de Lyme, melioidosis, meningitis, nocardiosis por Nocardia asteroides, uretritis no gonocócica, pinta, enfermedad pulmonar neumocócica, poliomielitis, infección pulmonar primaria, enterocolitis pseudomembranosa, sepsis puerperal asociada a antibióticos, rabia, fiebre recurrente, fiebre reumatoide, fiebre manchada de las Montañas Rocosas, rubéola, sarampión, síndrome estafilocócico de la piel escaldada, faringitis estreptocócica (infección de garganta), sífilis, tétano, síndrome del choque tóxico, toxoplasmosis, tuberculosis, tularemia, fiebre tifoidea, tifus, vaginitis, varicela, verrugas, tos ferina, frambesia (bubas) y fiebre
amarilla.

También, el procedimiento de diagnóstico puede ser capaz de identificar individuos que sufren de una dolencia seleccionada entre el grupo compuesto por enfermedades inmunes, enfermedades autoinmunes y otras enfermedades y síndromes inflamatorios, véase, por ejemplo, la Figura 1.

Ejemplo 1 Tira reactiva para detectar una citoquina en una muestra

Se ha desarrollado una tira reactiva para detectar una citoquina en una muestra que puede detectar claramente la citoquina, por la aparición de una clara señal detectable visualmente, tal como una mancha roja en un ensayo de flujo lateral funcional.

El antígeno que se tiene que analizar es una citoquina (IFNx) disponible en el mercado.

Como la especie de reconocimiento, se usó un anticuerpo monoclonal dirigido frente al IFNx unido a una superficie sólida en la tira reactiva, el denominado anticuerpo de captura.

La especie indicadora además comprendía moléculas poliméricas vehículo de polidextrano, que eran de aproximadamente 500.000 Da, a las que estaban unido covalentemente el grupo reactivo divinil sulfona. Además, la especie indicadora comprendía como marcador moléculas de rodamina, que estaban unidas también a través de los grupos de divinil sulfona.

Para analizar la especie indicadora se empleó una prueba de flujo lateral en 2 capas, siguiendo el principio explicado en la Figura 1. La Figura 1 ilustra una tira reactiva esquemática, para el uso en un ensayo para el análisis de células con IFNx en una muestra. La tira reactiva comprende una zona de aplicación para la muestra que comprende la especie indicadora. El término conjugado se refiere a una especie indicadora. Además, la tira reactiva comprende una zona en donde está unido el anticuerpo de captura y una segunda zona en donde está unido el anticuerpo control. La tira reactiva está hecha de nitrocelulosa (Sartorius Unisart CN200), y de una membrana microporosa de Whatman FO 75-17 o de Millipore Rapid Q24, y un filtro absorbente (Whatman 1, 5 NF).

Como anticuerpo de captura se usó un anticuerpo secundario con especificidad frente al anticuerpo diana comprendido en la especie indicadora. Esta prueba lateral dio una mancha roja positiva, que demostró que 1) el anticuerpo diana estaba unido al vehículo polidextrano; 2) el vehículo polidextrano tenía buenas características de flujo. Además, ninguno de ellos dio lugar a fondo o unión inespecífica.

La prueba se desarrolló de modo que apareciera una mancha roja cuando la prueba era positiva. Esta mancha se produce por acumulación de rodamina unida a la especie indicadora. El resultado positivo en la prueba se define como muestras que tienen INFx. Se obtuvo un resultado negativo, que se visualizó por la ausencia de cambio de color (no aparece la mancha roja), cuando no se usó sustancialmente INFx.

La prueba es una prueba de 1 etapa, donde la muestra se aplica directamente a la tira reactiva después de lo cual aparece el resultado de la prueba. Cuando la prueba se realiza como una prueba de 1 etapa aparece la primera reacción de color en la prueba de flujo rápidamente como en 1-3 minutos. La prueba acaba tras aproximadamente 5 minutos.

También se unió a la superficie sólida de la tira reactiva en la zona control un anticuerpo control que une la especie indicadora independientemente del antígeno en la orina. Cada vez aparece una mancha roja control en la prueba, independientemente de que se use una orina negativa o positiva, como indicador de si la prueba se realizó correctamente. El color rojo de esta mancha control también se produjo por la acumulación de rodamina unida a la especie indicadora.

Además, se ha desarrollado una tira reactiva para que aparezca una línea roja de prueba atravesando la membrana en vez de una mancha roja, tanto para observar el resultado de la prueba como para el control (Figura 2). A menudo se observa que la intensidad de color se incrementa en una línea de prueba comparada con una mancha de prueba.

Ejemplo 2 Tira reactiva competitiva

En este ejemplo se produjo una tira reactiva similar a la tira reactiva descrita en el Ejemplo 1 como una tira reactiva competitiva por la que una señal positiva se muestra como ausencia de color, mientras que una señal negativa se muestra como un cambio de color.

La cantidad de especie indicadora se valoró a modo de una mancha roja (acumulación visible de rodamina) que sólo aparecía en las muestras negativas.

Claims (56)

1. Un kit para detectar directamente al menos un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra, comprendiendo dicho kit

i) un soporte sólido, y

ii) una diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido, siendo dicha especie de reconocimiento capaz de detectar directamente al menos un indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

iii) un conjugado que comprende

una molécula polimérica vehículo unida a

a)

al menos una primera y/o segunda especie de reconocimiento capaz de unir directamente dicho indicador de inflamación predeterminado cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

b)

al menos una especie de marcaje, y

en el que el conjugado comprende

A)

una molécula polimérica vehículo que comprende una diversidad de al menos un grupo funcional reactivo,

B)

al menos un resto de conexión unido a al menos un grupo funcional reactivo,

C)

al menos una especie molecular seleccionada entre el grupo de especies moleculares compuesta por especies de reconocimiento y especies de marcaje, en el que cada una de las especies moleculares comprende al menos un grupo funcional que es reactivo con al menos un resto de conexión unido al reactivo,

D)

en el que el conjugado comprende al menos una especie molecular unida covalentemente a éste a través de un resto de conexión,

iv) una zona de aplicación para aplicar la muestra que comprende el indicador de inflamación, comprendiendo dicha zona al menos un conjugado, siendo dicho conjugado móvil y estando dicha zona de aplicación en contacto líquido con

v) una zona de detección para detectar la presencia, cantidad o concentración de dicho al menos un conjugado, comprendiendo además dicha zona la diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido.

2. El kit según la reivindicación 1, en el que el kit es un dispositivo de microflujo o un dispositivo de flujo lateral.

3. El kit según las reivindicaciones 1 y 2, en el que el kit comprende una superficie sólida o semisólida y dicho conjugado móvil es capaz de moverse en dicha superficie sólida o semisólida.

4. El kit según la reivindicación 1, en el que el indicador de inflamación está presente en la muestra en una cantidad de menos de aproximadamente 100 nanogramos (100 x 10^{-9} gramos) por mililitro (10^{-3} litros).

5. El kit según la reivindicación 2, en el que la molécula polimérica vehículo comprende grupos funcionales reactivos en una cantidad de aproximadamente 5 a aproximadamente 5.000 \mumoles por gramo de vehículo polimérico.

6. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un indicador de inflamación predeterminado es una citoquina.

7. El kit según la reivindicación 6, en el que al menos un indicador de inflamación predeterminado es al menos dos citoquinas.

8. El kit según la reivindicación 7, siendo dicho kit capaz de detectar un perfil de citoquinas.

9. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por agonistas del sistema de IL-1, preferiblemente IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-1ra, autoanticuerpos frente a IL-1\alpha, sIL1-RI y sIL1-RII.

\newpage

10. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por antagonistas del sistema de TNF\alpha, preferiblemente sTNFR p55 y p75.

11. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-6 y autoanticuerpos frente a IL-6.

12. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-12, sIL-4R, TNF\beta (LT), INF\gamma, IL-4 e IL-10.

13. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-2, RANTES, IL-8, sIL-2R, IL-18, IFN\alpha y proteína catiónica del eosinófilo.

14. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que al menos un indicador de inflamación predeterminado es un autoanticuerpo.

15. El kit según la reivindicación 6, en el que al menos un indicador de inflamación predeterminado es al menos dos autoanticuerpos.

16. El kit según la reivindicación 7, siendo dicho kit capaz de detectar un perfil de autoanticuerpos.

17. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dicho kit capaz de detectar una combinación de citoquina (o citoquinas) y autoanticuerpo (o autoanticuerpos).

18. El kit según la reivindicación 17, siendo dicho kit capaz de detectar una combinación de al menos dos citoquinas y al menos un autoanticuerpo.

19. El kit según la reivindicación 18, siendo dicho kit capaz de detectar una combinación de al menos cuatro citoquinas y al menos un autoanticuerpo.

20. El kit según la reivindicación 19, siendo dicho kit capaz de detectar una combinación de al menos una citoquina y al menos dos autoanticuerpos.

21. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que dicho indicador de inflamación es PrP-Sc.

22. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la especie de reconocimiento se selecciona entre el grupo de especies compuesto por antígenos; haptenos; anticuerpos monoclonales y policlonales; sondas génicas; oligonucleótidos y polinucleótidos naturales y sintéticos; monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos naturales y sintéticos; lectinas; avidina y estreptavidina; biotina; factores de crecimiento; hormonas; moléculas receptoras; proteína A y proteína G.

23. El kit según la reivindicación 22, en el que la especie de reconocimiento se selecciona entre anticuerpos monoclonales y policlonales.

24. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la especie de marcaje se selecciona entre el grupo de especies compuesto por proteínas; enzimas; toxinas; fármacos; colorantes; sustancias fluorescentes, luminiscentes, fosforescentes y otras sustancias emisoras de luz; sustancias celulares quelantes de metales; sustancias marcadas con un isótopo radioactivo y sustancias marcadas con un átomo pesado.

25. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la especie de marcaje se selecciona entre el grupo de especies compuesto por ferritina, ficoeritrinas, ficocianinas, ficobilinas, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasas, galactosidasas, ureasas, ácido iminodiacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético y desferrioxamina B.

26. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la primera y segunda especie de reconocimiento son idénticas.

27. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1-26, en el que la primera y segunda especie de reconocimiento no son idénticas.

28. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo de polímeros compuesto por polisacáridos naturales y sintéticos; homopoliaminoácidos; polipéptidos y proteínas naturales y sintéticos y polímeros sintéticos que tiene grupos funcionales nucleófilos.

29. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo de polímeros compuesto por alcoholes de polivinilo, alcoholes de polialilo, polietilenglicoles y poliacrilatos sustituidos.

\newpage

30. El kit según cualquiera de las reivindicaciones 1-27, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo compuesto por dextranos, carboximetil dextranos, almidones, hidroxietil almidones, hidroxipropil almidones, glucógeno, derivados de agarosa, derivados de celulosa y gomas naturales.

31. El kit según la reivindicación 30, en el que el vehículo polimérico es un dextrano.

32. El kit según la reivindicación 31, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo compuesto por hidroxietil celulosas e hidroxipropil celulosas.

33. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, siendo dicho kit una tira reactiva.

34. El kit según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, estando dicho kit adaptado para un microsistema.

35. Un procedimiento para detectar al menos un indicador de inflamación predeterminado, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

i) poner en contacto la muestra con un kit que comprende

a)

un soporte sólido, y

b)

una diversidad de una primera especie de reconocimiento unida al soporte sólido, siendo dicha especie de reconocimiento capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el soporte sólido, y

c)

un conjugado que comprende una molécula polimérica vehículo unido a i) al menos una primera y/o segunda especie de reconocimiento capaz de detectar directamente dicho indicador de inflamación cuando está presente en una muestra que se pone en contacto con el suporte sólido, y ii) al menos una especie de marcaje, y

ii) detectar una especie de reconocimiento capaz de dirigirse al indicador de inflamación predeterminado.

en donde la detección de la especie de reconocimiento es indicativa de la presencia del indicador de inflamación predeterminado en la muestra.

36. El procedimiento según la reivindicación 35, en el que la muestra es una muestra de fluido corporal.

37. El procedimiento según la reivindicación 35 ó 36, en el que el kit es un dispositivo de microflujo o un dispositivo de flujo lateral.

38. El procedimiento según la reivindicación 35, en el que el indicador de inflamación está presente en la muestra en una cantidad de menos de aproximadamente 100 nanogramos (100 x 10^{-9} gramos) por mililitro (10^{-3} litros).

39. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-38, en el que la molécula polimérica vehículo comprende i) una diversidad de al menos un grupo funcional reactivo, ii) al menos un resto de conexión unido a al menos un grupo funcional reactivo, y iii) al menos una especie molecular seleccionada entre el grupo de especies moleculares compuesto por especies de reconocimiento y especies de marcaje, en el que cada una de las especies moleculares comprende al menos un grupo funcional que es reactivo con al menos un resto de conexión unido al reactivo, y en el que el conjugado comprende al menos una especie molecular unida covalentemente a éste a través de un resto de conexión.

40. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-39, en el que la especie de reconocimiento se selecciona entre el grupo de especies compuesto por antígenos; haptenos; anticuerpos monoclonales y policlonales; sondas génicas; oligonucleótidos y polinucleótidos naturales y sintéticos; monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos naturales y sintéticos; lectinas; avidina y estreptavidina; biotina; factores de crecimiento; hormonas; moléculas receptoras; proteína A y proteína G.

41. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-40, en el que la especie de marcaje se selecciona entre el grupo de especies compuesto por proteínas; enzimas; toxinas; fármacos; colorantes; sustancias fluorescentes, luminiscentes, fosforescentes y otras sustancias emisoras de luz; sustancias quelantes de metales; sustancias marcadas con un isótopo radioactivo y sustancias marcadas con un átomo pesado.

42. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-41, en el que la especie de marcaje se selecciona entre el grupo de especies compuesto por ferritina, ficoeritrinas, ficocianinas, ficobilinas, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasas, galactosidasas, ureasas, ácido iminodiacético, ácido etilendiaminotetraacético, ácido dietilentriaminopentaacético y desferrioxamina B.

43. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-42, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo de polímeros compuesto por polisacáridos naturales y sintéticos; homopoliaminoácidos; polipéptidos y proteínas naturales y sintéticos y polímeros sintéticos que tiene grupos funcionales nucleófilos.

44. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-43, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo de polímeros compuesto por alcoholes de polivinilo, alcoholes de polialilo, polietilenglicoles y poliacrilatos sustituidos.

45. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-44, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo compuesto por dextranos, carboximetil dextranos, almidones, hidroxietil almidones, hidroxipropil almidones, glucógeno, derivados de agarosa, derivados de celulosa y gomas naturales.

46. El procedimiento según la reivindicación 36, en el que el vehículo polimérico es un dextrano.

47. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35-46, en el que el vehículo polimérico se selecciona entre el grupo compuesto por hidroxietil celulosas e hidroxipropil celulosas.

48. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 47, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por agonistas del sistema de IL-1, preferiblemente IL-1\alpha, IL-1\beta, IL-1ra, autoanticuerpos frente a IL-1\alpha, sIL1-RI y sIL1-RII.

49. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 48, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por antagonistas del sistema de TNF\alpha, preferiblemente sTNFR p55 y p75.

50. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 48, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-6 y autoanticuerpos frente a IL-6.

51. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 48, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-12, sIL-4R, TNF\beta (LT), INF\gamma, IL-4 e IL-10.

52. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 48, en el que el indicador de inflamación predeterminado se selecciona entre el grupo compuesto por IL-2, RANTES, IL-8, sIL-2R, IL-18, IFN\alpha y proteína catiónica del eosinófilo.

53. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 47, en el que el indicador de inflamación predeterminado es un autoanticuerpo.

54. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones precedentes 35-53, en el que se obtiene un perfil de indicadores de inflamación.

55. Un procedimiento para diagnosticar una dolencia infecciosa y/o inflamatoria en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

i) detectar un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra de fluido corporal según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 54, y

ii) diagnosticar dicha dolencia infecciosa y/o inflamatoria.

56. Un procedimiento para diagnosticar una dolencia infecciosa y/o inflamatoria en un individuo, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de

i) detectar un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra de fluido corporal según la reivindicación 37,

ii) detectar un indicador de inflamación predeterminado presente en una muestra de fluido corporal según cualquiera de las reivindicaciones 35 a 54, y

iii) diagnosticar dicha dolencia infecciosa.