JPS59162880A - プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の生産方法 - Google Patents
プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の生産方法Info
- Publication number
- JPS59162880A JPS59162880A JP3748283A JP3748283A JPS59162880A JP S59162880 A JPS59162880 A JP S59162880A JP 3748283 A JP3748283 A JP 3748283A JP 3748283 A JP3748283 A JP 3748283A JP S59162880 A JPS59162880 A JP S59162880A
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- Japan
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- plasminogen activator
- medium
- cells
- serum
- qgf
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はプラスミノーゲン・アクチベーター（以下ＰＡ
ということがある）を合成培地で生産せしめる方法に関
するものである。
ということがある）を合成培地で生産せしめる方法に関
するものである。
一般に、生体を構成する細胞は、生体の恒常性を維持す
る為に必要な生理的に意義のある物質を種々生産してい
る。この細胞の生産する生理活性物質には大きな期待が
寄せられており、既にヒドリン・ξ球細胞によるインタ
ーフェロン、ヒト胎児腎臓細胞によるウロキナーゼ、免
疫担当細胞による各種抗体や各種リンフ才力イン、各種
ホルモン等の工業的生産が実施或いは検討されている。
る為に必要な生理的に意義のある物質を種々生産してい
る。この細胞の生産する生理活性物質には大きな期待が
寄せられており、既にヒドリン・ξ球細胞によるインタ
ーフェロン、ヒト胎児腎臓細胞によるウロキナーゼ、免
疫担当細胞による各種抗体や各種リンフ才力イン、各種
ホルモン等の工業的生産が実施或いは検討されている。
これらの物質は動物細胞によって産生されるものである
ことから、それらの利用を目的として培地や培養方法に
関する技術の開発が急がれている。この技術は動物個体
の機能やその動態を、細胞のレベルで解明しようとする
方向からも古くから研究されているものではあるが、未
だに完全に成功しているとは言す難い。特に、細胞を増
殖・維持せしめる為の培地成分については、極めて多く
の問題点が未解決のまま残されてｂる。
ことから、それらの利用を目的として培地や培養方法に
関する技術の開発が急がれている。この技術は動物個体
の機能やその動態を、細胞のレベルで解明しようとする
方向からも古くから研究されているものではあるが、未
だに完全に成功しているとは言す難い。特に、細胞を増
殖・維持せしめる為の培地成分については、極めて多く
の問題点が未解決のまま残されてｂる。
また、一般的に、動物細胞の培養を行なうには、塩類、
糖類、アミノ酸類、ビタミン類等を含む基本的栄養素の
みでは不可能であって、それらに様様な生体試料を添加
する必要があるのが普通である。その生体試料としては
、胚抽出物、を髄液、羊水、リン・ξ液、乳、初乳、血
漿、血清等が知られているが、これらの中で血清が多く
の有利な点を持つことから、最も広く用いられている。
糖類、アミノ酸類、ビタミン類等を含む基本的栄養素の
みでは不可能であって、それらに様様な生体試料を添加
する必要があるのが普通である。その生体試料としては
、胚抽出物、を髄液、羊水、リン・ξ液、乳、初乳、血
漿、血清等が知られているが、これらの中で血清が多く
の有利な点を持つことから、最も広く用いられている。
そして血清中に存在する細胞を増殖・維持する有効物質
に関する探索研究も開始されて久しい。しかし、有効成
分の存在量が非常に微量であったり、有効成分が複合体
である為に分解によってその有効性が減じたり、有効成
分が複数成分の総合作用でめったすし、又、有効成分の
分離・検出方法に大変な困難を伴なうものであったりと
、数多くの問題を抱えている為、現在に至るも成功して
いない。
に関する探索研究も開始されて久しい。しかし、有効成
分の存在量が非常に微量であったり、有効成分が複合体
である為に分解によってその有効性が減じたり、有効成
分が複数成分の総合作用でめったすし、又、有効成分の
分離・検出方法に大変な困難を伴なうものであったりと
、数多くの問題を抱えている為、現在に至るも成功して
いない。
そこで血清の代替として、各種ホルモンが注目されるよ
うになり、新たなる展開がなされている。
うになり、新たなる展開がなされている。
そして、イーグル基礎培地（Ｅａｇｌ’ｅ’ｓ Ｍｉｎ
ｉｍｕｍＢｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ） 、ＲＰ
Ｍ Ｉ −１６４０培地、Ｈａｍ Ｆ −’ １２培地
、ダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｉａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）等
の基礎培地に、ポリはプチド、ステロイドなど、種々の
ホルモン類を添加することにより、動物細胞は血清が存
在していなくても生育することが明らかになつだ。これ
らの研究の成果をもとにして、各種細胞の培養に関する
試みが活発になされており、今や、殆んどの細胞を培養
できるまでになっている。
ｉｍｕｍＢｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ） 、ＲＰ
Ｍ Ｉ −１６４０培地、Ｈａｍ Ｆ −’ １２培地
、ダルベツコ変法イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｆｉａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）等
の基礎培地に、ポリはプチド、ステロイドなど、種々の
ホルモン類を添加することにより、動物細胞は血清が存
在していなくても生育することが明らかになつだ。これ
らの研究の成果をもとにして、各種細胞の培養に関する
試みが活発になされており、今や、殆んどの細胞を培養
できるまでになっている。
しかしながら細胞によっては、互いに生理的な特性が異
なることから、当然、増殖に必要な因子も各々異なって
くることがある。これまでに知られている細胞増殖因子
としては、インシュリン、グルカゴン、ソマトトロピン
、神経増殖促進因子（ＮＧＦ）、表皮細胞増殖促進因子
（ＥＧＦ”）、ハイドロコーチシン、トランスフェリン
、フロスタグランジン（ＰＧ）、トリヨードサイロニン
、テストステロン、乳、アルブミン等がある。
なることから、当然、増殖に必要な因子も各々異なって
くることがある。これまでに知られている細胞増殖因子
としては、インシュリン、グルカゴン、ソマトトロピン
、神経増殖促進因子（ＮＧＦ）、表皮細胞増殖促進因子
（ＥＧＦ”）、ハイドロコーチシン、トランスフェリン
、フロスタグランジン（ＰＧ）、トリヨードサイロニン
、テストステロン、乳、アルブミン等がある。
以上のような無血清完全合成培地は、血清添加に伴なう
様々な短所、即ち、その高価なこと、ロット間の原因の
わからない差やマイコプラズマやウィルスによる汚染の
可能性があ答ので使用前に検定をしておく必要のあるこ
と、又、血清が極めて多種多様の成分を含んでいる為に
、細胞の産出する物質の精製が容易でないこと、等を排
除することができる。その上、動物細胞そのものの生理
や機能を研究１−でゆく際に、血清という、成分不明の
物質を用いる必要がないことは大きな利点となる。
様々な短所、即ち、その高価なこと、ロット間の原因の
わからない差やマイコプラズマやウィルスによる汚染の
可能性があ答ので使用前に検定をしておく必要のあるこ
と、又、血清が極めて多種多様の成分を含んでいる為に
、細胞の産出する物質の精製が容易でないこと、等を排
除することができる。その上、動物細胞そのものの生理
や機能を研究１−でゆく際に、血清という、成分不明の
物質を用いる必要がないことは大きな利点となる。
一方、本発明で目的とするＰＡはプラスミノーゲンを活
性化してプラス・・ミンにする酵素として知られている
。そして、プラスミンは血栓の原因となるフィブリンを
溶解する酵素であるために、いまや、ＰＡの大量生産が
強く要望されるに至っているのである。
性化してプラス・・ミンにする酵素として知られている
。そして、プラスミンは血栓の原因となるフィブリンを
溶解する酵素であるために、いまや、ＰＡの大量生産が
強く要望されるに至っているのである。
しかし、２人の生産は細胞によって行なわれるために生
産性は高くなく、それに加えて血清培地によって生産さ
れているために、培地が高価なものになったり、また、
ＦＡの精製がきわめて困難になるなどの欠点があった。
産性は高くなく、それに加えて血清培地によって生産さ
れているために、培地が高価なものになったり、また、
ＦＡの精製がきわめて困難になるなどの欠点があった。
本発明者らは、ＦＡを合成培地で生産できるようになれ
ば、これら問題点が一羊に解決されるところから研究を
行ったところ、トランスフェリン、エタノールアミン及
び亜セレン酸を添加した合成培地によってＰＡが生産さ
れることを確認することができた。更に、本発明におい
てはトランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸
及び増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培地を用い
ればＰＡが高収率に、かつ、長期にわたって生産される
ことも確認された。
ば、これら問題点が一羊に解決されるところから研究を
行ったところ、トランスフェリン、エタノールアミン及
び亜セレン酸を添加した合成培地によってＰＡが生産さ
れることを確認することができた。更に、本発明におい
てはトランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸
及び増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培地を用い
ればＰＡが高収率に、かつ、長期にわたって生産される
ことも確認された。
本発明は、プラスミノーゲン・アンチベーター生産性細
胞をトランスフェリン、エタノールアミン及び亜セレン
酸を添加した合成培地で培養することを特徴とするプラ
スミノーゲン・アクチベーターの生産方法である。また
、本発明は、プラスミノーゲン・アンチベーター生産性
細胞をトランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン
酸及ヒ増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培地で培
養することを特徴とするプラスミノーゲン・アクチベー
ターの生産方法である。
胞をトランスフェリン、エタノールアミン及び亜セレン
酸を添加した合成培地で培養することを特徴とするプラ
スミノーゲン・アクチベーターの生産方法である。また
、本発明は、プラスミノーゲン・アンチベーター生産性
細胞をトランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン
酸及ヒ増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培地で培
養することを特徴とするプラスミノーゲン・アクチベー
ターの生産方法である。
本発明の特色は、まず、ＰＡ生産性細胞を用いてＰＡを
生産する際に、トランスフェリン、エタノールアミン及
び亜セレン酸を添加した合成培地を使用する点にある。
生産する際に、トランスフェリン、エタノールアミン及
び亜セレン酸を添加した合成培地を使用する点にある。
これによって無血清完全合成培地によってＰＡを生産さ
せることに成功したものであって、ＰＡの精製が容易と
なシ、ＰＡの大量生産ができるようになるなどその効果
はきわめて犬である。
せることに成功したものであって、ＰＡの精製が容易と
なシ、ＰＡの大量生産ができるようになるなどその効果
はきわめて犬である。
本発明の次の特色は、２人生産性細胞を用いてＦＡを生
産する際に、トランスフェリン、エタノールアミン、亜
セレン酸及び増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培
地を使用する点にある。無血清完全合成培地によってＰ
Ａを高収率に、かつ連続的に長期間生産させることに成
功したものであって、ＰＡの大量連続生産ができるよう
になるなどその効果はきわめて大である。
産する際に、トランスフェリン、エタノールアミン、亜
セレン酸及び増殖促進因子（ＱＧＦ）を添加した合成培
地を使用する点にある。無血清完全合成培地によってＰ
Ａを高収率に、かつ連続的に長期間生産させることに成
功したものであって、ＰＡの大量連続生産ができるよう
になるなどその効果はきわめて大である。
本発明に用いる細胞はＰＡ釜生産する細胞であればいか
なる細胞でもよりが、すぐれたＰＡ持続生産細胞として
例えば細胞株ＱＧ−９０をあけることができる。
なる細胞でもよりが、すぐれたＰＡ持続生産細胞として
例えば細胞株ＱＧ−９０をあけることができる。
また、使用する基本培地としては、例えば几ＰＭＩ−１
６４０（ＧＩＢＣＯ社裏）があけられる。
６４０（ＧＩＢＣＯ社裏）があけられる。
基本培地に添加されるトランスフェリン、エタノールア
ミン及び亜セレン酸は三者同時に添加されてはじめてＰ
Ａ生産性細服が増殖し、ＰＡを生産するようになるもの
であって、そのうちの一つづつではＰＡの生産はできな
くなる。基本培地に添加されるものは、これら三者以外
にも、抗生物質やグルタミン等があり、これらは適宜添
加される１、 また、基本培地に上記三者と同時に増殖促進因子（ＱＧ
Ｆ’）（以下ＱＧＦと示す）が添加されると、基本培地
におけるＰＡ生産は高収率となり、かつ連続的に長期間
継続することができ、ＦＡの大量生産を可能とするもの
である。
ミン及び亜セレン酸は三者同時に添加されてはじめてＰ
Ａ生産性細服が増殖し、ＰＡを生産するようになるもの
であって、そのうちの一つづつではＰＡの生産はできな
くなる。基本培地に添加されるものは、これら三者以外
にも、抗生物質やグルタミン等があり、これらは適宜添
加される１、 また、基本培地に上記三者と同時に増殖促進因子（ＱＧ
Ｆ’）（以下ＱＧＦと示す）が添加されると、基本培地
におけるＰＡ生産は高収率となり、かつ連続的に長期間
継続することができ、ＦＡの大量生産を可能とするもの
である。
ＱＧＦはすでに研究されているものであるが、本発明に
用いられたＱＧＦは次のようにして調整された。
用いられたＱＧＦは次のようにして調整された。
即ち、屠殺直後の成牛より放血された新鮮な血液を直ち
に４℃に冷却して遠心分離し、血清を得た。この血清に
酢酸を加え、析出した沈澱物を遠心分離で除き、上清を
セファデックスＧ’−２００を用いてゲル濾過した（１
フラクション５−）。
に４℃に冷却して遠心分離し、血清を得た。この血清に
酢酸を加え、析出した沈澱物を遠心分離で除き、上清を
セファデックスＧ’−２００を用いてゲル濾過した（１
フラクション５−）。
この結果、第７図に示すような波長２８０ｎｍにおける
吸光度のピークが２つ認められた。これらのピークのう
ち、後方のピークの部分に増殖促進活性が認められ、こ
のフラクションを採取し、ＱＧＦとした。そのＱＧＦは
ゲル濾過においては単一ピークであり、蛋白質を主成分
とする分子量が５〜７万（ＳＤＳゲル電気泳動法による
）の物質であった。
吸光度のピークが２つ認められた。これらのピークのう
ち、後方のピークの部分に増殖促進活性が認められ、こ
のフラクションを採取し、ＱＧＦとした。そのＱＧＦは
ゲル濾過においては単一ピークであり、蛋白質を主成分
とする分子量が５〜７万（ＳＤＳゲル電気泳動法による
）の物質であった。
各添加成分の適当濃度は第６図〜第６図の各添加量と培
養曲線とから明らかにされる。
養曲線とから明らかにされる。
培養温度は特に規定されるものではないが、約３０〜４
０℃が適し、特に３７℃前後が好ましい。
０℃が適し、特に３７℃前後が好ましい。
培養はＣＯ２存在下、静置条件でも可能である。
□ 培養は回分式でもよいが、細胞が十分生育すれば
、培地を連続的に交換して、ＰＡを連続的に生産させる
ことができる。
、培地を連続的に交換して、ＰＡを連続的に生産させる
ことができる。
得られた培養液は、無血清培地を使用しているために、
ＦＡに類似した夾雑物をほとんど含んでおらず、ゲル濾
過等周知の精製手法によって容易にＰＡを単離すること
ができるものである。
ＦＡに類似した夾雑物をほとんど含んでおらず、ゲル濾
過等周知の精製手法によって容易にＰＡを単離すること
ができるものである。
次に本発明の実施例を示す。
実施例
培地組成を１１当たり、
ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ社製） ＩＯ，９０
９ｆ硫酸カナマイシン（ベーリンガーマンハイム社製）
６０■ Ｎ−２−ヒドロキシエチルヒハラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸 １．１９
２５’メイロン（炭酸水素ナトリウム７％Ｗ／Ｖ水溶液
：大塚製薬＠製） １５−ＱＧＦ
Ｑ〜または１７５〜トランス
フエリン（シグマ社製）’ ｉｒｒｒｇエタ
ノールアミン ４．６〜亜セレ
ン酸 １６μ２としたものを濾
過滅菌して、直径３５ｍｍのプラスチック・シャーレ（
コースタ−社製）に２ｍｌづつ分注した。
９ｆ硫酸カナマイシン（ベーリンガーマンハイム社製）
６０■ Ｎ−２−ヒドロキシエチルヒハラジン−Ｎ′−２−エタ
ンスルホン酸 １．１９
２５’メイロン（炭酸水素ナトリウム７％Ｗ／Ｖ水溶液
：大塚製薬＠製） １５−ＱＧＦ
Ｑ〜または１７５〜トランス
フエリン（シグマ社製）’ ｉｒｒｒｇエタ
ノールアミン ４．６〜亜セレ
ン酸 １６μ２としたものを濾
過滅菌して、直径３５ｍｍのプラスチック・シャーレ（
コースタ−社製）に２ｍｌづつ分注した。
これにヒト由来のＦＡ生産細胞株ＱＧ−９０を４Ｘ１０
’セル／シヤーレになるように播いて、５％Ｖ ／ Ｖ
ＣＯｔ、３７℃の条件下で静置培養した。
’セル／シヤーレになるように播いて、５％Ｖ ／ Ｖ
ＣＯｔ、３７℃の条件下で静置培養した。
第１図にはＱＧＦをｏｍｙ７を添加した培地と、ＱＧＦ
を１７５■／を添加した培地とにおいて細胞株ＱＧ−９
０を培養した時の増殖の比較を行った結果を示した。図
から明らかなように、’ＱＧＦを添加した場合に得られ
る細胞数の方が多いのが分る。
を１７５■／を添加した培地とにおいて細胞株ＱＧ−９
０を培養した時の増殖の比較を行った結果を示した。図
から明らかなように、’ＱＧＦを添加した場合に得られ
る細胞数の方が多いのが分る。
次に第２図に、ＱＧＦ１７５〜／を添加した培地を用い
細胞接種後、培地交換（矢印）を繰返すことにより１６
〜１５日目まで増殖は継続し、定常状態（約２ｘ１ｏ’
セル／シヤーレ）が少なくとも６〜７日間続くことを示
した。（Ｘ）また、２人の産生は定常状態に多くな９２
〜ｌ０ＩＵ／ｌ／（ウロキナーゼ換算）のＦＡを見出し
、これを示した。 （Ｙ）
細胞接種後、培地交換（矢印）を繰返すことにより１６
〜１５日目まで増殖は継続し、定常状態（約２ｘ１ｏ’
セル／シヤーレ）が少なくとも６〜７日間続くことを示
した。（Ｘ）また、２人の産生は定常状態に多くな９２
〜ｌ０ＩＵ／ｌ／（ウロキナーゼ換算）のＦＡを見出し
、これを示した。 （Ｙ）
第１図は、ＱＧ Ｆ’を添加した場合と添加しない場合
の比較増殖図で、第２図はＱＧＦ’を添加した培地によ
る増殖及びＰＡ活性の変化を示す図で、第６図は、トラ
ンスフェリンの最適濃度を示す図で、第４図はエタノー
ルアミンの最適濃度を示す図で、第５図は亜セレン酸の
最適濃度を示す図で、第６図はＱＧＦの最適濃度を示す
図で、第７図はＱＧＦのゲル濾過による・ξターンを示
す図である。 第 １ 図 第 ６ 図 第 ４ 図 第５図 １．６５２ａ１１６ （ｌｌ！ｖｔ）第 ６ 図 ０ ３５ ７０ ４０５ １４０ １７５２１０（
□）
の比較増殖図で、第２図はＱＧＦ’を添加した培地によ
る増殖及びＰＡ活性の変化を示す図で、第６図は、トラ
ンスフェリンの最適濃度を示す図で、第４図はエタノー
ルアミンの最適濃度を示す図で、第５図は亜セレン酸の
最適濃度を示す図で、第６図はＱＧＦの最適濃度を示す
図で、第７図はＱＧＦのゲル濾過による・ξターンを示
す図である。 第 １ 図 第 ６ 図 第 ４ 図 第５図 １．６５２ａ１１６ （ｌｌ！ｖｔ）第 ６ 図 ０ ３５ ７０ ４０５ １４０ １７５２１０（
□）
Claims (2)
- （１） プラスミノーゲン・アクチ（−ター生産性細
胞をトランスフェリン、エタノールアミン及び亜セレン
酸を添加した合成培地で培養することを特徴とするプラ
スミノーゲン・アクチベーターの生産方法、１ - （２） プラスミノーゲン・アンチベーター生産性細
胞をトランスフェリン、エタノールアミン、亜セレン酸
及び増殖促進因子（Ｑ Ｇ Ｆ）を添加した合成培地で
培養することを特徴とするプラスミノーゲン・アクチベ
ーターの生産方法０
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3748283A JPS59162880A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3748283A JPS59162880A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS59162880A true JPS59162880A (ja) | 1984-09-13 |
Family
ID=12498736
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3748283A Pending JPS59162880A (ja) | 1983-03-09 | 1983-03-09 | プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS59162880A (ja) |
-
1983
- 1983-03-09 JP JP3748283A patent/JPS59162880A/ja active Pending
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