MXPA00008511A - Medio y metodo para la propagacion y multiplicacion viral - Google Patents

Abstract

La invención tiene que ver con un medio para la propagación viral sobre células cultivadas, caracterizado en que estálibre de proteína humana o animal y comprende proteínas y glicoproteínas extraídas de papa o pepino que tienen un potencial mitogénico y cuyo peso molecular varía entre 1000 y 200,000 daltons y/o hidrolizados de extracto de plantas.

Description

MEDIO Y MÉTODO PARA LA PROPAGACIÓN Y MULTIPLICACIÓN VIRAL DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un medio y a un método para la propagación y multiplicación viral sobre células en cultivo, en particular para producir vacunas. La producción de vacunas virales, ya sea que estén simplemente atenuadas, inactivadas, subunidades o la recombinación, involucra la producción a gran escala de virus . Esta producción puede llevarse a cabo, dependiendo de la naturaleza del virus, sobre diversos soportes los cuales permiten la replicación del virus; asi, por ejemplo, para la mayoría de las vacunas anti-influenza disponibles comercialmente en la actualidad, la proliferación de virus se lleva a cabo en huevos de gallina embrionados, mientras que para algunas vacunas contra la encefalitis Japonesa, esta etapa se lleva a cabo en cerebros de ratones. Sin embargo, el uso de tales soportes plantea muchos problemas: disponibilidad, reproducibilidad, pero especialmente seguridad debido a las posibles contaminaciones con virus, microplasma o cualquier otro elemento indeseable que se origine del soporte. Asi se han hecho cada vez más intentos para distribuir con tales soportes y, siempre que sea posible, se usen cultivos de células los cuales se infecten con una pequeña cantidad de virus que se va a producir, y los cuales se mantienen después bajo condiciones que promueven la replicación del virus dentro de las células infectadas, asi como la propagación de la infección de una célula a otra. Los virus producidos se cosechan después ya sea a partir del medio de cultivo en el cual las células se bañan, cuando involucra virus intracelulares que abandonen la célula después de su germinación (lo cual en particular tiene la ventaja de hacerlo posible para llevar a cabo varias cosechas de virus con el mismo cultivo celular ) , o tratando las células en si mismas cuando involucran virus intracelulares . Estas técnicas aseguran tener cultivos de células de buena -calidad; muchos desarrollos de la técnica anterior se han relacionado asi al mejoramiento de los cultivos de células y en particular al medio de cultivo usado. Para limitar los riesgos de contaminación de las células con agentes de microplasma, virus, encefalopatía espongiforme bovina o cualquier otro agente transmisible no convencional, se ha propuesto el uso de medio de cultivo libre de suero, y aún libre de proteina, como se describe en la Solicitud de Patente WO 96/15231. Alternativamente, la solicitud FR 2,732,347 propone el uso de un medio de cultivo celular el cual está libre de suero animal, pero el cual contiene extractos vegetales. Asi, debido al uso de tal medio para la etapa de cultivo de célula, se aumenta la seguridad de los productos obtenidos usando las células asi producidas. Sin embargo, cuando es un asunto para producir virus que forman parte de la composición de vacunas, las etapas que son consecutivas a esta fase de cultivo celular deben en si mismas exhibir también un máximo grado de seguridad-. Específicamente, en forma convencional y como se describe en la Patente Norteamericana 4525349, cuando las células en cultivo se usan para producir virus, una vez que la fase de cultivo celular se ha llevado a cabo, el medio que se usó para el cultivo celular se elimina y se reemplaza después con un nuevo medio en el cual las células se bañan por un momento para lavarse; este nuevo medio se elimina después; este procedimiento de lavado de células puede repetirse opcionalmente un cierto número de veces . Después, se introduce un nuevo medio dentro del cultivo celular, el cual permitirá en primer lugar que las células sobrevivan y que se infecten con los virus, y en segundo lugar que tengan a su disposición elementos que sean suficientes para hacer el soporte para la replicación de estos virus. Sin embargo, como se describe en el articulo "Protein-free culture of Vero cell: A substrate for replication of human pathogenic viruses", Cell Biology In terna tional , Vol . 1 7 No . 9, 1993 pp . 885-895, aún cuando el cultivo celular se lleve a cabo en un medio libre de proteinas, el medio de cultivo usado en la técnica anterior en esta etapa de multiplicación y propagación viral generalmente contiene suero fetal de becerro o, para limitar los problemas de contaminación, al menos albúmina humana. El uso de albúmina humana en esta etapa de un método para la fabricación de vacunas virales se considera estar sin riesgo para la calidad de la vacuna. Sin embargo, con la finalidad de eliminar completamente todos los riesgos, aún teóricos, seria deseable tener un medio el cual sea adecuado para la propagación y multiplicación de los virus sobre un soporte que consista de células en cultivo, el cual esté libre de proteina humana o animal, aún de origen recombinante, pero el cual sin embargo permita rendimientos de producción que sean compatibles con los requerimientos industriales para no aumentar los costos de producción de vacuna que comprenden virus producidos en células en cultivo. La finalidad de la invención es en particular proporcionar tal medio. Otra finalidad de la invención es proporcionar un medio y un método para la propagación y multiplicación viral el cual permite entonces que se lleve a cabo, cuando se desee, una etapa de inactivación de virus. Para lograr estas diversas finalidades, un objeto de la presente invención es un medio para la propagación y multiplicación viral en células en cultivo, caracterizado en que está libre de proteina humana o animal, aún de origen recombinante, y en que comprende elementos de origen vegetal. De acuerdo con una característica de la invención, el medio para la propagación y multiplicación viral comprende proteinas o glicoproteinas extraídas de papas o de pepino, que tienen un potencial mitogénico y que tienen un peso molecular entre 1,000 y 200,000 daltons. De acuerdo con una modalidad particular, el medio de acuerdo con la presente invención comprende hidrolizados vegetales . De acuerdo con una característica particular de la invención, las proteinas o glicoproteinas se extraen de papas . De acuerdo con otra característica de la invención, las proteinas o glicoproteinas se obtienen de la siguiente manera : - lavado y molido de vegetales, - dilución en medio acuoso, - coagulación por calor de la mezcla obtenida, - purificación por cromatografia. De acuerdo, con una característica de la invención, los hidrolizados vegetales se obtienen por hidrólisis química y/o enzimática de materias primas tales como algodón, soya, trigo o arroz. Se han obtenido resultados particularmente buenos con los productos del rango HyPep™ suministrados por la compañía Quest International, en particular con los productos que comprenden una alta proporción de péptidos con una masa molecular menor de 1000 daltons. De acuerdo con otra característica, el medio para la propagación y multiplicación viral de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la multiplicación viral en células Vero. De acuerdo con otra característica, el medio para la propagación y multiplicación viral de acuerdo con la invención es particularmente adecuado para la multiplicación de los virus de encefalitis Japonesa, virus de poliomielitis y virus de rabia. Un objeto de la presente invención es también un método para fabricar vacunas virales el cual comprende una fase de producción viral en las células en cultivo, caracterizado en que la fase de propagación y multiplicación de virus se lleva a cabo en la presencia de un medio el cual está libre de proteina humana o animal, aún de origen recombinante, y el cual comprende extractos vegetales. La presente invención se entenderá mejor al leer la descripción que sigue. • El medio y el método de acuerdo con la invención, son adecuados para la producción de todos los virus que sean capaces de replicarse en cultivos de células. Pueden en particular ser virus que pertenecen a las siguientes familias: ortomixovirus, paramixovirus, reovirus, picornavirus, flavivirus, arenavirus, herpesvirus, poxvirus y adenovirus. También pueden ser virus recombinantes. En particular, la invención es particularmente adecuada para la producción de virus los cuales pueden formar parte de la composición de vacunas, y en particular de vacunas humanas para las cuales los requerimientos de seguridad son máximos. En particular pueden ser los virus de la poliomielitis, rabia, encefalitis Japonesa, fiebre amarilla, rubéola, paperas, fiebre de Dengue o sarampión, los virus de las diversas formas de hepatitis, los virus del SIDA y varicela, herpesvirus, virus de enfermedades causadas por el virus sincitial respiratorio, citomegalovirus, EBV, rotavirus o la influenza. La presente invención es particularmente ventajosa para producir los virus que son responsables de la poliomielitis, rabia, encefalitis Japonesa, rubéola, varicela, hepatitis A, influenza, fiebre de Dengue, sarampión o paperas. Las células que pueden usarse para la producción de virus de acuerdo con la invención son células que pueden multiplicarse en cultivo y las cuales son permisivas a los virus cuya producción se desea. Pueden ser en particular células Vero, células CV-1, células LLC- K2, células MDCK, ... células MDBK, células WI-38, células MRC5, (fibroblastos humanos) o células BHK21. Se han obtenido resultados particularmente buenos con los cultivos de células Vero o cultivos de células MRC5. El cultivo celular puede llevarse a cabo de acuerdo con las diversas técnicas usualmente empleadas; en un cultivador celular, en botellas giratorias, en matraces de Roux, en Multitrays™, en Cell-Cubes™. Por razones industriales, se prefiere llevar a cabo el cultivo celular en cultivadores celulares usando microsoportes que consisten de, por ejemplo lechos de Cytodex™. Este cultivo celular puede llevarse a cabo bajo diversas condiciones, en particular con respecto al medio usado; de hecho es posible implementar la presente invención aún si el medio de cultivo usado para la fase de cultivo celular contiene suero o al menos proteina humana o animal; en este caso, desde luego, será necesario llevar a cabo un lavado completo de las células antes de su infección, para no perder la ventaja provista al implementar la invención con respecto a la ausencia de riesgo de contaminación. Sin embargo, se prefiere el uso de cultivos de células obtenidos usando un medio de cultivo celular el cual también está libre de proteinas de origen humano o animal. Dependiendo de la naturaleza de las células usadas y los virus que se van a producir, puede variar el momento más apropiado para llevar a cabo la infección de virus con un inoculo del virus. Generalmente, este procedimiento se lleva a cabo más bien a la mitad o al final de la fase de crecimiento exponencial; de hecho se ha notado que, bajo estas condiciones, los resultados obtenidos son particularmente satisfactorios. De acuerdo con la invención, el medio de cultivo usado para la etapa de propagación y multiplicación viral es un medio el cual está libre de proteina humana, viral o recombinante, pero la cual comprende proteinas o glicoproteinas extraídas de papas o de pepino, que tienen un potencial mitogénico y que tiene un peso molecular entre 1000 y 200,000 daltons y/o hidrolizados de extractos vegetales. Este medio es un medio el cual puede comprender todos o parte de los elementos convencionalmente usados para la multiplicación viral, tal como medio HAM F 12, pero el cual está suplementado con extractos vegetales obtenidos por ejemplo de la manera siguiente: - reducción de la pulpa vegetal, - tratamiento de la pulpa obtenida con un solvente, - evaporación del solvente, - purificación del extracto obtenido por cromatografia. El potencial mitogénico de las proteinas o glicoproteinas las cuales son adecuadas para los propósitos de la invención puede valorarse en particular usando pruebas para analizar el crecimiento de células y la actividad mitogénica tales como las pruebas de coloración M.T.T. Los extractos vegetales los cuales son adecuados para los propósitos de la invención son en particular aquellos descritos en la Solicitud de Patente FR 2,732,347. También pueden usarse los productos vendidos por la compañía Biomedia bajo el nombre GCR1003, TCR1005 o BCR1008, solos o en combinación, o el producto Prolifix el cual también se vende por esta compañía y el cual comprende todos los elementos nutrientes del medio convencional HAM F 12 suplementado con extractos vegetales adecuados. Alternativamente, es posible usar un medio convencional HAM F 12 suplementado con hidrolizados vegetales tales como los productos HyPep™ en una proporción de 5 g/1. También es posible usar un medio que comprende las proteinas o glicoproteinas obtenidas por coagulación por calor de la pulpa vegetal y los hidrolizados vegetales tales como aquellos mencionados anteriormente. Además, es posible agregar, a estos medios, cualquier otro elemento el cual probablemente mejore o facilite una de las etapas que conduce a la producción de una vacuna, tal como es posible modificar ligeramente este medio sin cambiar las propiedades del mismo. Los ejemplos que siguen ilustran las modalidades de la invención, en una forma no limitante.

EJEMPLO 1: PRODUCCIÓN E VACUNAS CONTRA LA ENCEFALITIS JAPONESA Se usan células Vero para producir el virus que es responsable de la encefalitis Japonesa. Las células usadas son células derivadas de la cepa distribuida por ATCC (American Type Culture Collection) bajo el No. ATCC-CCL 81 VERO F 1415, la cual está en el paso 124vo y la cual se lleva al paso 137vo en la forma convencional. El virus cuya producción se desea es el virus de la cepa P3, en el paso 88vo, suministrado por NVSI . El recipiente de un cultivador celular de 15 litros se llena con medio Iscove suplementado con 4% de suero de becerro que contiene microportadores Cytodex 1™ en una concentración de 3.5 g/1. El medio se siembra con un inoculo de células Vero en una proporción de 200,000 células/ml. El cultivo se amplifica y subcultiva dos veces a la semana cada 4 ó 5 dias. Las concentraciones de células que se obtienen están entre 2 y 3xl06 • por ml . La suspensión de células obtenidas se lava después con el medio para la propagación viral, con la finalidad de eliminar la cantidad máxima de suero de becerro residual. Para probar comparativamente un medio de acuerdo con la invención con un medio de la técnica anterior, el mismo procedimiento se lleva a cabo en paralelo, en varios cultivadores celulares idénticos, con 2 medios diferentes: - un medio de acuerdo con la invención que consiste del medio HAM F 12 (suministrado por Life Technologies Gibco) suplementado con medio Prolifix II suministrado por la compañía Biomedia, en una concentración la cual es 10 veces la indicada en su catálogo de 1996, en una proporción de 1 volumen de Prolifix II concentrado 10 veces por 10 volúmenes de HAM F 12, - un medio de acuerdo con la técnica anterior que consiste del medio Iscove (suministrado por Life Technologies Gibco) suplementado con albúmina humana para obtener una concentración final de albúmina en el medio de 0.3%. Después de enjuagar, se introduce un inoculo de virus dentro de cada uno de los cultivadores celulares en una cantidad correspondiente a una MOI (Multiplicidad De Infección) de 1/6000. Los contenidos de los cultivadores celulares se mantiene agitando después a una temperatura de 37 °C durante 3 dias, y después se lleva a cabo la Ia cosecha recuperando el medio para la propagación viral, el cual se ha vuelto una suspensión viral, el cual se reemplaza en cada uno de los cultivadores celulares con una • cantidad igual del medio fresco de la misma naturaleza; después se lleva a cabo una cosecha del medio para la propagación cada 24 horas, hasta que se hayan recuperado 5 cosechas. Cada una de las cosechas se filtra a través de un filtro con un umbral de corte de 0.22 µm, y se almacena a +5°C mientras se espera a mezclarse con las otras 4 cosechas del mismo cultivador de célula. Cuando se han llevado a cabo las 5 cosechas, se mezclan juntas y está mezcla se concentra entonces por filtración hasta un factor de 100. La mezcla que consiste de las 5 cosechas del mismo cultivador celular constituye un lote . Para determinar la cantidad de virus producida, una prueba de actividad infecciosa se lleva a cabo para cada uno de los lotes producidos. La prueba se lleva a cabo en dos formas diferentes: ya sea por una actividad infecciosa medida sobre una capa de células, o por actividad infecciosa medida en ratones por inoculación intracerebral dentro de los ratones, observación de los animales durante 14 dias y cálculo de la LD50. Los resultados se expresan como Log 10 de las partículas infecciosas por litros de cultivador celular. Cuando se considera la titulación de células, la media de los resultados obtenidos para los diversos lotes producidos usando un medio de acuerdo con la invención es 8.84, mientras que la media obtenida para los lotes producidos usando un medio de acuerdo con la técnica anterior es 7.85. Si se considera la titulación en ratones, la media para los lotes producidos de acuerdo con la invención es esta vez 9.92, mientras que la media para los lotes producidos con un medio de acuerdo con la técnica anterior es 9.30. Asi se observa, inesperadamente, que los resultados obtenidos con el medio de acuerdo con la invención son equivalentes a aquellos obtenidos en un medio de la técnica anterior, mientras que se esperaba que la consecuencia del déficit de albúmina, la cual es una proteina considerada por jugar un papel importante en el transporte de los elementos nutrientes dentro de la célula, por ser una disminución considerable en la cantidad de virus producido. Los lotes obtenidos se inactivaron después agregando una solución de formaldéhido en una cantidad que da una concentración final en la mezcla de 1/4000 y manteniendo a temperatura ambiente con agitación continua durante 14 dias. La verificación de la inactivación por medio de un control de acuerdo con el protocolo recomendado por la WHO (Technical Bulletin 771 de 1988) muestra que los lotes producidos cumplen con las recomendaciones de WHO. Estos lotes inactivados se purificaron después por cromatografia de intercambio iónico y por filtración en gel para eliminar de ahi todas las proteinas virales e impurezas residuales que no son deseadas en las vacunas. La mezcla obtenida se formuló después para, permitir la producción de dosis de vacuna. La buena calidad de las vacunas producidas se verificó usando la prueba de inmunogenicidad en ratones la cual es recomendada por WHO para las vacunas contra la encefalitis Japonesa, y la cual consiste en la determinación de la cantidad de anticuerpos neutralizantes producidos por los ratones inmunizados. Puesto que la actividad de las vacunas producidas de acuerdo con el método de la invención no es más baja que la de las vacunas de la técnica anterior, esto confirma que es posible, usar el medio y el método de acuerdo con la invención, para producir vacunas virales bajo condiciones de seguridad incrementada dispensando con el uso de albúmina. EJEMPLO 2 : COMPARACIÓN DE DIVERSOS MEDIOS DE ACUERDO CON LA INVENCIÓN Para probar comparativamente diversos medios, se usaron matraces de 150-cm3, los cuales se llenaron con 50 ml de medio Iscove suplementado con 4% de suero de becerro. Este medio se sembró con un inoculo de células de Vero en una proporción de 250,000 células/cm2. Los matraces se dejaron durante 4 a 5 dias a 37°C y se enjuagaron después por medio del medio para la multiplicación y propagación viral. El medio usado es como sigue: - un medio A, el cual es un medio de acuerdo con la técnica anterior, que consiste de medio Iscove (suministrado por Life Technologies Gibco) suplementado con albúmina humana para obtener una concentración final de albúmina en el medio de 0.3%, - un medio B que consiste de medio HAM F 12 suplementado con las siguientes moléculas mitogénicas: * BCR 1008 en una proporción de 10"3 g/1 * TCR 1005 en una proporción de 10"4 g/1 * GCR 1003 en una proporción de 10"4 g/1 - un medio C que consiste del medio mencionado anteriormente (HAM F 12 suplementado con BCR 1008, TCR 1005 y GCR 1003), pero que comprende también 1 g/1 del producto HyPep 4602 el cual consiste de hidrolizado de gluten suministrado por la compañía Questel International, - un medio C el cual es idéntico al medio C, pero en el cual la concentración de HyPep 4602 es 5 g/1, - un medio D que consiste de medio HAM F 12 suplementado con HyPep 4602 en una proporción de 1 g/1, pero que carece de las moléculas mitogénicas BCR 1008, TCR 1005 ó GCR 1003 - un medio D' el cual es idéntico al medio D, pero en el cual la concentración de HyPep 4602 es 5 g/1. Después de lavar, un inoculo de virus de encefalitis Japonesa el cual es idéntico a aquel del ejemplo previo que se introduce dentro de cada uno de los matraces en una cantidad de corresponde a una MOI de 1/6000. Los contenidos de los matraces se mantuvieron después durante 3 dias a 37°C, antes de llevar a cabo la Ia cosecha. Las cosechas subsecuente.s se llevaron a cabo de la misma manera como aquella descrita en el ejemplo previo. Las pruebas para determinar las dosificaciones infecciosas se llevaron a cabo en células BHK21 y dieron los resultados siguientes, los cuales se expresan en TCID50/ml (Log 10) : Medio A: 4.6 Medio B: 5.1 Medio C: 5.0 Medio C : 5.6 Medio D: 5.4 Medio D' : 6.3 Estos resultados confirman que el medio de acuerdo con la invención hace posible obtener rendimientos que son tan buenos como, y no mejores que, el medio de acuerdo con la técnica anterior el cual contiene albúmina. EJEMPLO 3 : PRODUCCIÓN DE VACUNA CONTRA LA RABIA Un cultivo celular Vero se preparó en un cultivador celular 2-1 en un medio convencional y, después de lavar, las células se infectaron después con virus de rabia con una MOI de 1/1000 y se mantuvieron en un medio el cual es idéntico al descrito en el Ejemplo 1 (es decir, medio HAM F 12 suplementado con Profilix™ II); el mismo experimento se llevó a cabo en una forma enteramente idéntica, en otro cultivador celular del mismo volumen, siendo la única diferencia el uso de un medio para la propagación y multiplicación viral de la técnica anterior que comprende albúmina humana. Las cosechas se llevaron a cabo sucesivamente 4, 5, 6 y 7 dias después de la infección. Los cálculos llevados a cabo en las cosechas obtenidas usando el medio de acuerdo con la invención y en las cosechas obtenidas usando el medio de acuerdo con la técnica anterior hicieron posible obtener resultados comparables en ambos medios; en forma similar, las concentraciones infecciosas de los virus obtenidos son equivalentes . Estos resultados demuestran asi la posibilidad de producir virus en contra de la rabia en células. EJEMPLO 4 : PRODUCCIÓN DE VACUNA CONTRA POLIOMIELITIS Se llevaron a cabo pruebas para la producción de virus de poliomielitis tipo 1 en cultivo celular Vero. Las dosificaciones infecciosas de los virus obtenidos usando un medio para la propagación y multiplicación viral de acuerdo con la invención que tiene la composición descrita en el Ejemplo 1 son equivalentes a la media de las dosificaciones infecciosas obtenidas con las cosechas llevadas a cabo con el medio usado para fabricar las vacunas comercialmente disponibles actualmente.

Claims (10)

1. REIVINDICACIONES 1. El uso de un medio de cultivo que esta libre de proteina humana o animal, aún de origen recombinante, y el cual comprende extractos vegetales para la propagación y multiplicación viral en células en cultivo.
2. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, de acuerdo con el cual el medio comprende proteinas o glicoproteinas mitogénicas extraídas de papas o de pepino.
3. 3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de acuerdo con el cual los extractos vegetales se obtienen de la manera siguiente: M reducción de la pulpa de papa o pepino, M tratamiento de la pulpa con un solvente, M tratamiento por coagulación por calor, M purificación por cromatografia.
4. 4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de acuerdo con el cual el medio de cultivó comprende hidrolizados de extractos vegetales.
5. 5. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de acuerdo con el cual las células usadas para el soporte de la propagación y multiplicación viral son células Vero.
6. 6. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de acuerdo con el cual los virus producidos son virus de encefalitis Japonesa, rabia, poliomielitis, hepatitis A, influenza, fiebre de Dengue, sarampión, paperas, varicela y rubéola.
7. 7. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de acuerdo con el cual los virus producidos son virus de encefalitis Japonesa que se pretenden usar en vacunas humanas.
8. 8. Un método para fabricar vacunas virales el cual comprende una fase de producción viral sobre células en cultivo, caracterizado porque la fase de propagación y multiplicación de virus se lleva a cabo en la presencia de un medio que está libre de proteiná humana o animal, aún de origen recombinante, pero el cual comprende extractos vegetales .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación precedente, caracterizado porque el medio para la propagación y multiplicación viral comprende proteinas o glicoproteinas extraídas de papa o de pepino, que tienen un potencial mitogénico y que tienen un peso molecular entre 1000 y 200,000 daltons.
10. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 8 y 9, caracterizado porque el medio para la propagación y multiplicación viral comprende hidrolizados vegetales . , - - r r ..i ^^ ,,^.... , -imftr i -- i t a ¿ tM? ^ tß^¡ ¡ j^^¿?íl?t+*^ ^ ^^*Ji^