KR101485441B1 - 바이러스 제조용 배지 첨가제 - Google Patents

바이러스 제조용 배지 첨가제 Download PDF

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Abstract

바이러스의 증식을 위한 배양액 첨가제로서의 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체의 용도에 대해 설명한다. 또한, 바이러스 및 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 함유하는 약제학적 조성물 및 임상 샘플로부터의 바이러스 분리를 위한 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질의 용도뿐만 아니라 세포의 트랜스펙션 및 감염을 위한 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질의 사용방법에 대해 설명한다.
바이러스 제조용 배지 첨가제

Description

바이러스 제조용 배지 첨가제{MEDIUM SUPPLEMENT FOR VIRUS PRODUCTION}
본 발명은 바이러스 증식을 위한 배양 첨가제로서 사용되는 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체의 용도를 제공한다. 또한, 바이러스 및 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 포함하는 약제학적 조성물, 그리고 암 치료 및 인플루엔자 치료에서의 그 용도에 대해서 설명한다.
현재, 인플루엔자 이외의 다수의 바이러스 백신은 초기 트립신 처리 세포, 예를 들면, 원숭이 신장, 및 토끼 및 햄스터의 신장으로부터의 세포를 사용하여 제조된다(예를 들면, WO9738094 참조). 초기 2배체 세포 배양액은 간단한 배지 및 소 혈청을 사용한 용이한 제조 및 광범위의 다양한 바이러스에 대한 감도 등의 소정의 이점을 갖는다. 그러나, 초기 2배체 세포는 각종 외래 물질에 의한 오염, 변하기 쉬운 품질 및 감도 등의 불리함; 및 배양에 적합한 조직을 얻는데 있어서의 어려움(예를 들면, 원숭이 신장)이 있다.
반면, 연속 세포주를 사용하는 것의 이점은 감염된 바이러스 본래의 항원적 특성의 유지, 동일한 바이러스의 변이체에 대한 높은 감수성, 및 마이크로담체 또는 현탁 발효기 시스템을 사용한 세포의 양산에 따른 성장 능력이다.
그러나, 이들 이점 자체가 이러한 세포주가 백신 제조에 적합하게 사용되게 한다. Mizrahi, ed., Viral Vaccines, Wiley-Liss, New York(1990), pp. 39~67. 예를 들면, 포유류 세포 배양액에서 단독으로 분리 및 패시징된 인플루엔자 A 바이러스는 그들 본래의 항원적 특성의 대부분 또는 전부를 유지하는 것이 몇몇의 경우에 발견되었고, 이 특성은 백신 제조에 매우 이로운 것임이 증명되어 있다(Romanova J. et al., Virology, 2003, 307(1): 90~7; Romanova J. et al., Virus Res. 2004, 103: 187~93).
그러나, 포유류의 초기 2배체 세포 배양액은 백신 제조를 위한 숙주 시스템으로서는 어려움이 있다. 이것은 외래 물질로의 세포 배양액의 오염, 세포 배양액에서의 세포 품질의 가변성, 동일한 바이러스의 변이체에 대한 세포의 상이한 감도, 낮은 바이러스 역가, 및 이러한 세포 배양액을 얻고 제조하는데 있어서의 고비용과 어려움 등의 문제에 기인한다.
또한, 시험된 연속 세포주 사이에서 MDCK 세포만이 바이러스의 충분한 성장 및 분리를 잠재적으로 지지하는 것으로 보고 되어 있다(Frank et al., J Clin. Microb. 10:3236(1979); Schepetink&Kok, J Virol. Methods 42: 241~250(1993)).
2개의 다른 연속 세포주-아프리카 녹색 원숭이 신장(베로) 세포 및 새끼 햄스터 신장(BK-21)-는 세계 보건 기구(WHO)에 의해서 인간 백신의 제조용으로 특성화, 입증 및 승인되어 있다. 그러나, 베로 세포는 승인된 반면에 이미 인간 인플루엔자 바이러스 백신의 양산에 부적합한 것으로 밝혀져 있다. 예를 들면, 베로 세포에서 인플루엔자 B의 성장은 MDCK 세포에 비하여 크게 제한되었다(Nakamura el al., J Gen. Virol. 56: 199~202(1981)). 또한, 인간 H1N1 및 H3N2 인플루엔자 A 바이러스의 리만타딘 감도를 평가하기 위해서 베로 세포를 사용하는 시도는 MDCK 세포에 비하여 이들 세포에서 제조된 바이러스의 낮은 역가로 인하여 불명확한 결과를 제공했다(Gorvakova EA et al., J. Virol., 1996, 70: 5519~24).
따라서, 이들 및 기타 연구는 지금까지 베로 세포에서 인플루엔자 바이러스가 잘 복제되지 않아서 대량의 백신 제조가 부적합하게 되는 것을 나타낸다(Demidova et al., Vopr. Virosol(Russian) 346~352(1979); Lau&Scholtissek, Virology 212: 225~231(1995)).
Kaverin NV 및 Webster RG(J. Virol., 1995, 69(4): 2700~3)는 인플루엔자 바이러스 감염된 베로 세포의 배양액 배지에 트립신을 반복 첨가하여 인플루엔자 A 바이러스주의 복수회 성장 패턴을 회복시킬 필요성을 설명했다. 또한, 트립신의 반복 첨가의 필요성은 트립신이 배양의 각종 단계에서 첨가되어야만 하므로 상당히 힘들고 시간이 소요된다(Gorvakova EA et al., J. Infect. Dis., 1995, 172: 250~3 참조).
DNA 바이러스 패밀리의 멤버는 이중 가닥 게놈을 함유한다. 파르보비리다에 패밀리만이 예외이다. DNA 게놈의 대부분은 간단한 선형 분자가 아니다. 예를 들면, 파포바바이러스 게놈은 공유적으로 폐쇄된 이중 가닥의 환이고, 헤파드나바이러스 게놈은 한 가닥이 닉(nick)을 함유하고 다른 가닥이 갭을 함유하는 이중 환이다. 이중 가닥 폭스바이러스 게놈의 말단은 공유 결합되어 있고, 한편 헤르페스바이러스 게놈은 말단 및 내부 중복을 포함한다.
DNA 바이러스는 이하 패밀리: 파르보비리다에, 파포바비리다에, 아데노비리다에, 헤파드나비리다에, 헤르페스비리다에, 이리도비리다에, 바큐올로비리다에 및 폭스비리다에로 분류된다.
이중 가닥 RNA 바이러스는 레오비리다에 및 비르나비리다에의 2개의 군으로 분류된다.
네거티브 센스 게놈의 엔벨로프 단일 가닥 RNA를 함유하는 바이러스 패밀리는 비분절 게놈을 갖는 군(파라믹소비리다에, 라브도비리다에, 필로비리다에 및 보르나병 바이러스, 토가비리다에) 또는 분절 게놈을 갖는 군(오르토믹소비리다에, 분야비리다에 및 아레나비리다에)으로 분류된다. 오르토믹소비리다에 패밀리는 토고토 및 도리 바이러스 및 감염성 살모나네미아 바이러스뿐만 아니라, 인플루엔자의 바이러스 타입 A, B 및 C도 포함한다.
인플루엔자 비리온은 단일 가닥 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보뉴클레오단백질 코어(나선형 뉴클레오캡시드), 및 매트릭스 단백질(M1)로 내부가 라이닝된 외부 지단백질 엔벨로프로 이루어진다. 인플루엔자 A 바이러스의 분절 게놈은 RNA 의존성 RNA 폴리머라아제 단백질(PB2, PB1 및 PA) 및 뉴클레오캡시드를 형성하는 뉴클레오단백질(NP); 매트릭스막 단백질(M1, M2); 엔벨로프를 함유하는 지질로부터 부여되는 2면 당단백질: 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA); 비구조 단백질(NS1) 및 핵 방출 단백질(NEP)을 포함하는, 10개의 폴리펩티드를 인코딩하는 선형, 네거티브 극성, 단일 가닥 RNA의 8개의 분자(인플루엔자 C의 경우 7개)로 이루어진다.
게놈의 전사 및 복제는 핵에서 발생하고, 조합은 플라즈마막 상의 버딩(budding)을 통하여 발생한다. 바이러스는 혼합 감염 동안 유전자를 재분류할 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 HA를 통하여 세포막 당단백질 및 당지질의 시알릴올리고당에 흡착된다. 비리온의 엔도시토시스에 따라서, HA 분자에 있어서의 배좌 변화가 막 융합이 일어나는 세포 엔도좀 내에서 발생하여 탈막(uncoating)을 야기한다. 뉴클레오캡시드는 바이러스 mRNA가 전사되는 핵으로 이동한다. 바이러스 mRNA는 바이러스 엔도뉴클레아제가 세포 이종 mRNA로 캡핑된 5'-종단을 개열하고, 이어서 바이러스 트랜스크립타아제에 의해서 바이러스 RNA 주형의 전사용 프라이머로서 작용하는 독특한 매커니즘에 의해서 전사된다. 전사는 그들의 주형의 종단으로부터 15~22 염기 위치에서 종결되고, 여기에서 올리고(U)시퀀스는 폴리(A)트랙의 첨가를 위한 신호로서 작용한다. 이렇게 제조된 8개의 바이러스 RNA 분자 중에서, 6개는 HA, NA, NP로 나타내어지는 단백질 및 바이러스 폴리머라아제 단백질, PB2, PB1 및 PA로 직접 전사되는 모노시스트론성 메시지이다. 다른 2개의 전사는 접합하여 각각 다른 판독 프레임에 번역되는 2개의 mRNA를 산출하여 M1, M2, NS1 및 NEP가 제조된다. 즉, 8개의 바이러스 RNA 세그먼트는 9개의 구조 단백질, 및 비구조 단백질, 그리고 최근 동정된 PB1-F2 단백질의 11개의 단백질을 코딩한다.
특히, 예방 및 치료적 적용에 필요한 바이러스 입자의 양산의 어려움의 관점에서, 본 발명의 목적은 새로운 배양법 및 연속 세포주에서 증식된 바이러스의 수율 및 품질을 증가시킬 수 있는 첨가제를 제공하는 것이다.
상기 문제는 바이러스 증식을 위한 배양액 첨가제로서 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 사용함으로써 해결된다. 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질은 암포테리신 B 또는 그들의 유도체 또는 유사체인 것이 바람직하다. 종래 기술에 따르면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질은 항진균 특성을 나타내는 것이 공지되어 있어 동물 및 인간 환자의 진균 감염의 치료 및 예방에 널리 사용된다.
이미 공지된 마크롤라이드 폴리엔성 항생 물질의 특성 이외에, 본 발명의 발명자들은 놀랍게도 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체가 배양되기 어려운 경우가 많고 예방, 치료 및 산업적 적용과 같이 각종 목적을 위한 대량으로 필요한 바이러스 입자의 배양 및 증식을 위해 사용될 수도 있다는 것을 발견했다. 바이러스 배양 목적을 위한 그 사용을 나타내거나 표시한 종래 기술은 없었지만, 암포테리신 B의 유도체인 암포테리신 B 메틸 에스테르는 엔제팔로미오카르디티스 바이러스 RNA 및 SV40 바이러스 DNA의 감염성을 증가시킨다고 기재되어 있다(Borden E. et al., J. gen. Virol., 1979, 42, 297~303; Borden E. et al., Archives of Virology, 1981, 69, 161~165).
본 발명에 따른 마크롤라이드 폴리엔성 항생 물질, 및 그 유도체 또는 유사체를 사용하면, 바이러스 성장을 증가시킬 수 있고, 또한 이것은 감염의 다중도가 낮더라도 바이러스 입자의 감염성을 증가시킬 수도 있다.
본 발명에 따르면, 성공적으로 배양될 수 있는 바이러스는 DNA 또는 RNA 바이러스이고, 바람직하게는 RNA 바이러스이며, 보다 바람직하게는 오르토믹소비리다에, 피코르나비리다에 및 파라믹소비리다에 패밀리에 속하는 것이다. 더욱 바람직하게는 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스, 인플루엔자 C 바이러스, 리노바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스 및 그 유도체 또는 유사체 또는 단편이다. 또한, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스, 광견병 바이러스도 본 발명에 따라 배양하기 위한 유용한 시스템일 수 있다.
다른 실시형태에 있어서, 배양된 바이러스는 몇몇의 구조 및 비구조 유전자의 변이, 바람직하게는 NS1 및/또는 PB1 유전자에서의 변이를 포함할 수 있다. 상기 변이는 적어도 1개의 핵산의 제거, 치환 또는 삽입이다.
또한, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 함유하는 배지에 의해서 배양된 바이러스는 종양 살상형 바이러스일 수도 있다.
바이러스 유도체, 유사체 또는 단편으로는 백신 접종의 목적으로 사용되거나 종양 살상 능력을 나타낼 수 있는 임의의 바이러스 입자가 예시될 수 있다.
바이러스는 바이러스 입자를 증식시킬 목적에 적용될 수 있는 것으로 나타내어진 바이러스 감염된 세포를 사용하여 배양되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 사용한 바이러스 배양을 위한 세포의 감염방법을 제공하고,
a) 세포를 적어도 하나의 감염성 바이러스 입자로 감염시키는 단계;
b) 마크롤라이드 폴리엔성 항생 물질, 및 그 유도체 또는 유사체를 감염원 및/또는 배양 배지에 트립신과 함께 첨가하는 단계;
c) 적절한 조건 하에서 배양하는 단계; 그 다음
d) 상기 바이러스 생성물을 채취하는 단계; 필요에 따라
e) 상기 바이러스를 정제 및/또는 특성화하는 단계를 포함한다.
놀랍게도 본 발명에 따른 첨가제 또는 첨가제의 혼합물을 사용하면, 적어도 0.1log10, 바람직하게는 적어도 0.5log10, 바람직하게는 1log10, 보다 바람직하게는 적어도 2log10, 더욱 바람직하게는 적어도 2.5log10, 더욱 바람직하게는 5log10의 바이러스 성장을 증가시킬 수 있다는 것이 나타내어져 있다.
또한, 본 발명은 바이러스 및 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다. 바이러스는 약독화 생바이러스인 것이 바람직하고, 본 발명에 따른 대안으로 전체 불활성화 비리온, 스플리트 또는 서브유닛 백신이 포함된다.
다른 실시형태에 따르면, 약제학적 제제는 인플루엔자 바이러스 및/또는 종양 살상형 바이러스를 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체와 함께 함유할 수 있다. 사용된 바이러스의 종류에 따르면, 약제학적 제제는 암 또는 인플루엔자 감염의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 바이러스 입자의 분리 또는 적정에 사용될 수도 있다. 이것은 바이러스의 배양을 위한 세포의 감염은 충분한 감염률의 결여 및 불충분한 복제 메커니즘으로 인하여 다량으로 필요한 경우가 많으므로 특히 중요하다. 바이러스의 양은 적어도 하나의 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 감염 절차 직전, 동시, 또는 직후에 첨가함으로써 크게 감소될 수 있다.
도 1은 인플루엔자 바이러스 성장에 있어서의 암포테리신 B의 효과를 나타낸다.
베로 세포의 서브 융합성 단일층은 감염 다중도 moi가 상이했다(0.001, 0.0001 및 0.00001). 바이러스 성장 배지는 5㎍/ml의 트립신, 및 0 또는 250ng/ml의 암포테리신 B를 함유했다. 각각의 moi에서, 보다 빠르게 성장하는 바이러스의 세포 변성 효과가 50과 95% 사이에 이르면 바이러스(암포테리신 B와 함께, 그리고 암포테리신 B 없이)를 채취했다. 암포테리신 B의 존재 하에 배양된 모든 바이러스에 관해서 세포 변성 효과가 있으므로 바이러스 역가는 암포테리신 B 없이 성장시킨 것들보다 빠르게 향상되었다. TCID50 역가를 비교했다.
도 1a는 H1N1주에 대한 효과를 나타낸다.
도 1b는 H3N2주에 대한 효과를 나타낸다.
도 1c는 인플루엔자 B주에 대한 효과를 나타낸다.
도 2는 암포테리신 B의 존재 및 부재 하의 적정 결과를 나타낸다.
a) 인플루엔자 B/비엔나/32/2006(A/말레이시아/2506/2004형) 바이러스는 암포테리신 B의 존재(좌 컬럼) 및 부재(우 컬럼) 하에 플라크 검정에 의해서 적정되었다. 암포테리신 B의 존재 하에 성장된 바이러스는 약 2.5log의 바이러스 수율이 증가했다.
b) (A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1))형 ΔNS1 바이러스는 250ng/ml의 암포테리신 B의 존재 및 부재 하에 일련으로 희석되어 TCID50 검정에 의해서 동시에 적정되었다. 37℃에서 3일 배양 후, 웰의 세포 변성 효과가 평가되었고, 역가가 산출되었 다.
도 3은 암포테리신 B를 사용한 용량 증가 연구를 나타낸다.
서브 융합성 단일층의 베로 세포는 0.001의 감염 다중도에서 A/비엔나/28/2006(A/위스콘신/67/2005형)(H3N2) 바이러스로 감염되었다. 감염 후, 상이한 농도(각각 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000ng/ml)의 암포테리신 B가 성장 배지에 첨가되었다. 약 48시간 후에 바이러스가 얻어졌고, 암포테리신 B의 존재 하에 TCID50 검정에 의해서 적정되었다. 250~500ng/ml의 범위 내의 농도를 사용하는 것은 가장 높은 바이러스 역가가 얻어졌다.
본 발명에 따른 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 및 그 유도체 및 유사체는 일반적으로 그들이 갖는 공역 2중 결합의 수 및 글리코시드 결합된 탄수화물의 존재 또는 결여에 따라서 트리엔, 테트란, 펜탄, 헥산 및 헵탄으로 나뉠 수 있다. 리뷰로는 Hamilton-Miller J. M. T., Bacteriol. Reviews, 1973, 37, 166~196을 참조한다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 따르면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질은 예를 들면, 암포테리신 B, 칸디딘, 마이코헵틴, X-63, 칸디마이신, DJ400 B1, 페리마이신, 안티펀긴 4915, 유로틴 A, 헵탄 757, 모니카마이신, 네오헵탄, 니스타틴, 필립핀, 프리마리신, 나타마이신 및 PA150 및 그 유도체 및 유사체와 같은 헵탄이다.
가장 바람직한 실시형태에 따르면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질은 암포테리신 B 또는 그 유도체 또는 유사체이다. 암포테리신 B는 스트렙토미세스 노도수 스(Streptomyces nodosus) 등의 유기체의 배양에 의해서 제조되어 그 배양액으로부터 추출될 수 있다. 암포테리신 B는 본래 7개의 공역 2중 결합의 발색단을 갖는 고분자량 대환상 락톤이다. 대형 락톤 핵 이외에, 암포테리신 B는 아미노당을 포함하는 기타 특징적 군을 갖는다. 그 유도체 또는 유사체는 바이러스의 배양을 위한 배양 첨가제로서의 사용에 필요한 특징을 제공하는 한 어떤 종이어도 좋다. 예를 들면, N-아세틸화물, N-숙시닐화물, 에스테르화물, 또는 CaCl2와의 복합체일 수 있다. 예를 들면, 암포테리신 B 메틸 에스테르 또는 암포테리신 B를 함유하는 리포좀형 제제일 수 있다.
또한, 다른 실시형태에 따르면, 암포테리신 B와 그 유사체의 혼합물 또는 암포테리신 B 유도체의 각종 혼합물이 본 발명에 따른 바이러스의 배양 및 방법을 위한 첨가제로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 및 그 유도체 및 유사체는 바이러스의 배양을 촉진시키기 충분한 농도로 사용된다. 상기 농도는 0.5ng/ml와 5㎍/ml 사이인 것이 바람직하고, 0.5ng/ml와 2.5㎍/ml 사이인 것이 바람직하며, 10ng/ml와 900ng/ml 사이인 것이 바람직하고, 100ng/ml와 500ng/ml 사이인 것이 보다 바람직하며, 200ng/ml와 400ng/ml 사이인 것이 보다 바람직하다.
본 발명에 따르면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 및 그 유도체 및 유사체가 임의의 DNA 또는 RNA 바이러스의 배양에 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 바이러스는 RNA 바이러스이다. 그들의 네거티브 센스 게놈의 엔벨로 프 단일 가닥 RNA를 함유하는 바이러스 패밀리는 비분절 게놈을 갖는 군(파라믹소비리다에, 라브도비리다에, 필로비리다에 및 보르나병 바이러스) 또는 분절 게놈을 갖는 군(오르토믹소비리다에, 분야비리다에 및 아레나비리다에)으로 분류된다. 오르토믹소비리다에 패밀리는 토고토 및 도리 바이러스 및 감염성 살모나네미아 바이러스뿐만 아니라, 인플루엔자의 A, B 및 C 타입의 바이러스도 포함한다.
오르토믹소비리다에의 게놈은 네거티브 극성의 6~8개의 단일 가닥 RNA 분자(mRNA에 상보적)로 이루어진다. 인플루엔자 비리온은 단일 가닥 RNA 게놈을 함유하는 내부 리보뉴클레오단백질 코어(나선형 뉴클레오캡시드), 및 매트릭스 단백질(M1)로 내부가 라이닝된 외부 지단백질 엔벨로프로 이루어진다. 인플루엔자 A 바이러스의 분절 게놈은 RNA 의존성 RNA 폴리머라아제 단백질(PB2, PB1 및 PA) 및 뉴클레오캡시드를 형성하는 뉴클레오단백질(NP); 매트릭스막 단백질(M1, M2); 엔벨로프를 함유하는 지질로부터 부여되는 2면 당단백질: 헤마글루티닌(HA) 및 뉴라미니다아제(NA); 비구조 단백질(NS1) 및 핵 방출 단백질(NEP)을 포함하는, 10개의 폴리펩티드를 인코딩하는 선형, 네거티브 극성, 단일 가닥 RNA의 8개의 분자(인플루엔자 C의 경우 7개)로 이루어진다.
예를 들면, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 및 그 유도체 및 유사체를 배양액 첨가제로서 사용하는 본 발명에서 설명된 증식 또는 임의의 방법에 사용된 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포 융합 바이러스(RSV), 뉴캐슬병 바이러스(NDV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 리노바이러스 및 파라인플루엔자 바이러스(PIV), 홍역 및 볼거리 바이러스, 풍진 바이러스 및 광견병 바이러스일 수 있다.
본 발명에서 사용된 바이러스는 자연 발생주, 변이체 또는 변이체; 돌연변이화된 바이러스(예를 들면, 돌연변이원에의 노출, 복제를 허용하지 않는 숙주 내에서 복수의 패시지 및/또는 패시지의 반복에 의해 발생됨); 재조합체(분절 바이러스 게놈의 경우); 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스(예를 들면, "역 유전학" 기술을 사용함)로부터 선택되어도 좋다.
마크롤라이드 폴리엔 항생 물질을 첨가함으로써 배양된 바이러스는 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 또는 인플루엔자 C 바이러스의 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 바이러스는 바이러스의 유도체 또는 유사체가 발현 및 제조되게 하는 게놈 내에서의 변이를 포함할 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 변이는 NS1 유전자 및/또는 PB1 유전자 내에 있을 수 있다. 이것은 완전하게 제거되거나 변이된 NS1 단백질 및/또는 완전하게 제거되거나 변이된 PB1-F2 단백질 또는 PB1 유전자 단편으로부터 발현된 변이된 PB2 단백질을 함유하는 바이러스가 제조되게 할 수 있다. NS1 유전자 내의 변이는 제거, 삽입 또는 치환일 수 있다. 이렇게 변이된 RNA 바이러스의 예는 본 발명에 참조로 도입되어 있는 WO99/64068 및 WO99/64571에 개시되어 있고, 여기에서, NS1 유전자 내의 변이는 감쇠에 책임이 있는 인터페론 길항물질 발현형을 갖는 RNA 바이러스를 초래한다.
PB1-F2의 기능은 Chen W. et al., Nat Med. 2001, 12:1306~12에 상세하게 설명되어 있다. 마우스에서 바이러스 병원성에 기여하는 것으로 나타난 PB1-F2 단백질 내의 변이는 Zamarin D. et al., J. Virol., 2006, 80, 7976~7983에 설명되어 있다.
또한, 바이러스는 종양 살상형 바이러스일 수도 있다. 종양 살상형 바이러스의 전형적인 주요 특성은 그들이 정상 조직 이외의 악성 세포에서 성장하게 하는 조건성 복제 발현형인 것이다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, IFN-요구 시스템에서는 성장하지 않고 기능성 IFN의 발현이 결여된 시스템에서 효과적으로 복제하는 NS1 유전자 내에 변이를 갖는 종양 살상형 인플루엔자 A 바이러스일 수 있다.
마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체가 첨가된 배양 배지를 사용한 바이러스의 배양에 사용된 세포는 합성 배지 내에서 체외 성장할 수 있고 바이러스 증식에 사용될 수 있는 세포이면 어느 세포라도 좋다. 본 발명의 범위 내에서, 용어 "세포"는 개체 세포, 조직, 기관, 곤충 세포, 조류 세포, 포유류 세포, 융합 세포, 초기 세포, 연속 세포주, 및/또는 바이러스로 발현되는 재조합 세포 등의 유전자 조작 세포의 배양액을 의미한다. 이들은 예를 들면, BSC-1 세포, LLC-MK 세포, CV-1 세포, CHO 세포, COS 세포, 마우스 세포, 인간 세포, HeLa 세포, 293 세포, 베로 세포, MDBK 세포, MDCK 세포, MDOK 세포, CRFK 세포, RAF 세포, TCMK 세포, LLC-PK 세포, PK15 세포, WI-38 세포, MRC-5 세포, T-FLY 세포, BHK 세포, SP2/0 세포, NS0, PerC6(인간 망막 세포), 닭 배아 세포 또는 유도체, 부화란 세포, 부화계란 또는 그 유도체일 수 있다. 세포주는 베로 세포주인 것이 바람직하다.
바이러스의 제조에 사용된 배양 배지는 바이러스 배양에 적용할 수 있는 종 래부터 공지된 임의의 배지일 수 있다. 배지는 합성 배지인 것이 바람직하다. 이것은 예를 들면, Modified Eagle's media MEM, 최소 필수 배지 MEM, 둘베코의 modified Eagle's media D-MEM, D-MEM-F12 배지, 윌리엄의 E 배지, RPMI 배지 및 그 유사체 및 유도체로서의 기본 배지일 수 있다. 이들은 VP-SFM, OptiProTM SFM, AIM V® 배지, HyQ SFM4MegaVirTM, EX-CELLTM Vero SFM, EPISERF, ProVero, 임의의 293 또는 CHO 배지 및 그 유사체 및 유도체로서의 전문 세포 배양 및 바이러스 성장 배지일 수 있다. 이들 배지에는 세포 및 바이러스 배양에 적용할 수 있는 종래부터 공지된 임의의 첨가제, 예를 들면 동물 혈청 및 그 분획물 또는 유사체, 아미노산, 성장 인자, 호르몬, 버퍼, 미량 원소, 트립신, 피루브산 나트륨, 비타민, L-글루타민 및 생물학적 버퍼가 첨가될 수 있다. 바람직한 배지는 L-글루타민 및 트립신이 첨가된 OptiPROTM SFM이다.
특히, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질 또는 유도체 또는 유사체는 감염률의 유효성을 증가시키기 위해서도 사용될 수 있다. 세포의 감염을 증가시키기 위해서, 세포는 바이러스 입자 및 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체와 동시에 접촉된다. 또한, 세포는 바이러스 입자가 세포에 첨가되기 직전, 동시 또는 직후에 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체로 전처리될 수 있다. 따라서, 바람직한 시간 범위는 감염 전 또는 후 1시간 사이이고, 보다 바람직하게는 감염 전 또는 후 0.5시간 사이이다.
감염 다중도(MOI)가 높으면 감소된 감염성을 나타내거나 감염성을 나타내지 않는 결손 바이러스 입자가 다수 제조되게 된다. 따라서, 낮거나(0.001의 MOI) 또는 매우 낮은 MOI(0.0001~0.00001의 MOI), 또는 더 낮은 MOI가 세포의 감염에 사용될 수 있는 방법을 제공하는 것은 경제적 및 과학적 이유로 유리할 수 있다.
본 발명에 따른 첨가제 또는 첨가제의 혼합물을 사용하면, 바이러스 성장이 적어도 0.1log10, 적어도 0.5log10, 바람직하게는 적어도 1log10, 보다 바람직하게는 적어도 2log10, 더욱 바람직하게는 적어도 2.5log10, 더욱 더 바람직하게는 적어도 5log10 증가될 수 있다.
본 발명의 다른 실시형태는 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체를 바이러스 RNA 세그먼트를 코딩하는 발현 플라스미드로 베로 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용하는 것이다. 재차, 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질은 바이러스 완전 게놈의 전체 또는 일부를 함유하는 발현 플라스미드로 세포를 트랜스펙션하기 직전, 동시, 또는 직후에 배양 배지에 첨가된다.
본 발명의 다른 실시형태는 약독화 생바이러스 또는 불활성화 바이러스 및 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체를 포함하는 약제학적 제제와 필요에 따라서 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제공한다. 바이러스는 인플루엔자 바이러스 및/또는 종양 살상형 바이러스인 것이 바람직하다.
약제학적 제제가 종양 살상형 바이러스를 포함하는 경우, 바이러스성 암 치료에 사용될 수 있다. 약제학적 제제가 인플루엔자 바이러스를 포함하는 경우, 인플루엔자 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다.
약제학적 제제는 약독화 생바이러스를 포함하는 것이 바람직하지만, 불활성화 바이러스 또는 기타 바이러스도 사용될 수 있다.
상기 제제는 적정량으로 투여될 수 있다. 적정량은 바이러스 입자의 2~10logs의 범위 내이고, 바람직하게는 5~9logs, 보다 바람직하게는 6.5~8logs이다.
본 발명에 따른 제제는 적절한 제제로 제공된다. 약제학적으로 허용되는 담체를 가진 제제인 것이 바람직하다.
후자는 예를 들면, 보조제, 버퍼, 염 및 방부제를 포함한다. 즉시 사용 가능한 수액 제품이 제공되는 것이 바람직하다. 바이러스 제제는 상대적으로 안정하므로, 바이러스 또는 그 유도체에 기초한 의약품은 보관 안정성 용액, 또는 즉시 사용 가능한 형태의 제제로서 시판될 수 있는 중요한 이점을 갖는다. 전자는 냉장 온도~실온에서 제제로 안정하게 보존되는 것이 바람직하다. 그러나, 본 발명에 따라서 사용된 제제는 필요에 따라서 해동 또는 복귀될 수 있는 냉동 또는 동결 건조 형태로 제공되어도 좋다. 일반적으로, 제제는 비강내 또는 근육내 투여될 수 있다. 그러나, 다른 모체 또는 점막 방식의 투여도 선택될 수 있어 이것은 감염 또는 종양 부위에 활성 물질이 전신 또는 국부적으로 적용될 수 있다.
또한, 본 발명은 표준 TCID50, TCID50계 또는 플라크 검정의 품질 및 감도를 가속 및 증가시키는 방법을 제공한다. 바이러스의 배양을 위해서 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질을 사용함으로써, 바이러스의 성장이 가속되어 검정이 조기에 분석될 수 있어 보다 정확한 적정 결과가 조기 시점에 달성될 수 있다.
또한, 본 발명은 임상 샘플로부터의 바이러스 분리방법을 제공하고, 여기에서, 세포, 예를 들면 베로 세포를 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체의 존재 하에서 환자의 기도로부터 바이러스 입자에 의해 감염시키고, 감염된 세포를 마크롤라이드 폴리엔 항생 물질, 또는 그 유도체 또는 유사체 존재 하의 적절한 조건 하에서 배양하여 바이러스 성장을 촉진시키고, 상기 바이러스를 분리 및 특성화한다.
인플루엔자 바이러스 검사 프로그램은 임상 표본으로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하기 위해 유효한 시스템을 요구한다. 일반적으로 이러한 절차는 비강 인후 세정으로부터 취한 물질을 사용하여 부화 계란 또는 MDCK 세포를 감염시키는 것을 포함한다. 상기 절차의 효능은 바이러스의 형태 및 세포 기질에 따라서 매년 달라진다. 계란 및 종종 MDCK에서의 분리는 인간 집단에서 순환하는 실제 바이러스와 다른 돌연변이 바이러스 변이체를 발생시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 바이러스로부터 유도된 베로의 특성은 인간 바이러스의 성질에 보다 가깝게 반영되므로 베로 세포가 인플루엔자 바이러스 분리 및 특성화에 보다 우수한 기질일 수 있다는 것이 나타내어져 있다(Romanova J., et al. 2003). 동시에, 불행하게도 바이러스 분리를 위한 베로 세포주의 감도는 MDCK 세포보다 낮다.
본 발명에 따르면, 암포테리신 B는 베로 세포에 있어서의 임상 샘플로부터의 인플루엔자 바이러스 분리를 향상시킨다. 바이러스는 통상적으로 베로 세포에 있어서의 임상 표본으로부터 재분리되기 매우 어려우므로, 본 발명에 따른 방법을 사용함으로써 긍정적인 분리 사례의 백분율이 증가될 수 있다.
상기 설명은 이하 실시예를 참조하여 보다 완전하게 이해될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명의 1개 이상의 실시형태를 실행하는 대표적인 방법일 뿐이고, 본 발명의 범위에 제한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
본 실험의 목표는 감염 다중도의 감소시 각종 인플루엔자 바이러스에 대한 암포테리신 B의 효과를 측정하는 것이다. 선택된 3종의 바이러스는 WHO에 의해서 북반구에서 계절 백신 2006/07로 추천된 바와 같은 현재 유행하는 H1N1, H3N2 및 B의 아형을 반영하고 있다(http://www.who.int/csr/disease/influenza/ vaccinerecommedations1/en/).
혈청이 없는 베로 세포의 서브 융합성 단일층을 0.001, 0.0001 또는 0.00001의 감염 다중도로 감소시키면서 감염시킨다. 인플루엔자 B의 한 후보로서 B/비엔나/32/2006(B/말레이시아/2506/2004형)뿐만 아니라, 2개의 대표적인 인플루엔자 A 바이러스, A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1) 및 A/비엔나/28/2006(H3N2)(A/위스콘신/67/2005형)이 사용된다. 감염 후에 첨가된 성장 배지는 0 또는 250ng/ml의 암포테리신 B 뿐만 아니라 5㎍/ml의 트립신이 각각 첨가된다. 빠르게 성장하는 바이러스에서 50% 이상의 세포 변성 효과가 관찰되면, 동일한 감염 다중도(0 및 250ng/ml의 암포테리신 B)로 감염된 모든 세포의 상청액을 채취한다. 바이러스 역가를 TCID50 검정에 의해서 측정한다.
도 1a, 1b 및 1c에 나타낸 바와 같이, 3종의 바이러스는 모두 바이러스 복제에 대한 암포테리신 B의 긍정적 효과가 시험된 것으로 결론지을 수 있다. A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)에 관해서, 바이러스 성장에 대한 암포테리신 B의 효과가 관찰될 수 있다. 암포테리신 B 존재 하에, moi(감염 다중도)의 감소에 따라 역가는 8E+05~2E+07 TCID50/ml의 범위이고, 최저 moi에서 암포테리신 B가 첨가되지 않은 경우 1log 이하의 바이러스가 얻어진다. A/뉴 칼레도니아/20/99의 경우에 있어서, 0.00001의 최저 moi가 바이러스 성장 및 암포테리신 B의 효과의 관점에서 최적인 것으로 보인다.
A/비엔나/28/2006(H3N2) 바이러스로부터 H1N1 바이러스의 결과가 상기 물질의 효과에 대하여 보다 우수한 감도를 나타내는 것을 알 수 있다. 1log 초과의 MOI의 최소값이 시험된 3개 모두에서, 암포테리신 B의 존재 하에 성장되는 경우에 바이러스 역가 미만이 얻어지고, 동일한 시점에서 채취된다.
물질의 보다 현저한 효과는 B/비엔나/32/2006(B/말레이시아/2506/2004형) 바이러스에서 관찰된다. 암포테리신의 존재 하에 성장된 바이러스에 대하여 측정된 역가는 1.E+07(moi 0.001)~1E+06(moi 0.00001) TCID50/ml의 범위이다. 반면, 암포테리신이 첨가되지 않은 경우, 바이러스는 3E+05 TCID50/ml 미만의 역가에 이르러 거의 복제되지 않고, 최저 moi에 관해서는 바이러스가 전혀 얻어지지 않는다. A 바이러스에 비하여, B 바이러스가 물질에 대하여 가장 우수한 감도를 나타낸다. 이것은 암포테리신 B 존재 하에 혈청이 없는 베로 세포 상에 성장하도록 적응된다는 사실에 의해서 일부 설명될 수 있다.
일반적으로, 상술한 바이러스 서브타입 3종 모두의 바이러스 성장에 대한 암 포테리신 B의 명백한 효과가 있다는 것을 결론지을 수 있다.
재료 및 방법:
세포 및 바이러스:
베로 세포는 혈청이 없는 조건에서 배양되고, 사용된 배지는 4mM L-글루타민이 첨가된 OptiProTM SFM이다. 세포는 2~3일 마다 1:3~1:4의 비율로 패시징함으로써 배양된다. 사용된 성장 배지는 4mM L-글루타민이 첨가된 SFM이다.
A/뉴 칼레도니아/20/99는 NIBSC, 제품 번호 03/208로부터 유도되고, MDCK 세포 상에 3회 패시징된다. 혈청이 없는 베로 세포 상의 성장에 대한 적응은 MDCK 유도된 바이러스를 암포테리신 B 부재 하에 베로 세포에서 4회 패시징함으로써 이루어진다.
A/비엔나/28/2006(H3N2) 및 A/위스콘신/67/2005(H3N2)형 바이러스는 임상 표본으로부터 분리되었고, MDCK 세포 상에 1회 패시징된 후, 암포테리신 B 존재 및 부재 하에 혈청이 없는 베로 세포 상에 5회 패시징된다.
B/비엔나/32/2006, B/말레이시아/2506/2004형 바이러스는 MDCK 세포(2 패시지)에서 임상 표본으로부터 분리된 후, 암포테리신 B 존재 하에 6회 패시징하는 혈청이 없는 베로 세포 상에 성장하도록 적응시켰다.
효력 검정
바이러스의 적정은 TCID50(조직 배양액 감염 용량) 검정, 96웰 플레이트에서 바이러스의 효력의 통계적 측정을 가능하게 하는 세포에 기초한 검정에 의해서 행 했다. 바이러스를 일련으로 희석하고, 베로 세포의 서브 융합성 단일층(96웰 플레이트)을 감염시키고, 바이러스를 5㎍/ml의 트립신, 및 250ng/ml의 암포테리신 B의 존재 하에 33℃(B 바이러스) 및 37℃(A 바이러스)에서 성장시킨다. 3~6일 배양 후, 웰을 세포 변성 효과에 대해 체크하고, 역가를 Reed L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493~497에 의한 식에 기초하여 산출한다.
실시예 2
B 바이러스(B/말레이시아/2506/2004형) 및 A/H1N1 바이러스(A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)형 ΔNS1)를 암포테리신 B의 존재 및 부재 하에서 2종의 다른 방법에 의해서 적정한다. 2가지 경우 모두에 있어서, 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 최종 바이러스 역가에 대한 물질의 명백한 효과를 관찰할 수 있다.
도 2a에 있어서, B/비엔나/32/2006(B/말레이시아/2506/2004형) 바이러스를 일련으로 희석하고, 플라크 검정에 의해서 250ng/ml의 암포테리신의 존재 및 부재 하에서 동시에 적정한다. 33℃에서 배양 5일 후, 플라크를 카운팅하고, 그 수를 직접 비교한다.
도 2b에 있어서, (A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)형 ΔNS1 바이러스를 일련으로 희석하고, TCID50 검정에 의해서 250ng/ml의 암포테리신의 존재 및 부재 하에서 동시에 적정한다. 37℃에서 배양 3일 후, 세포 변성 효과에 관하여 웰을 평가하고 역가를 산출한다.
도 2a에 나타내어진 바와 같이, 암포테리신 B 존재 하에서는 동일한 바이러스를 성장시킨 경우, 2log를 초과하는 높은 역가가 얻어진다. 암포테리신 B의 존재 하에서는 B 바이러스의 역가는 1E+08 pfu/ml를 초과하기에 이른다. 이러한 결과는 플라크 검정의 감도는 물질의 첨가에 의하여 현저하게 증가된다는 것을 명백하게 나타낸다.
도 2b에 있어서, A/H1N1 바이러스를 암포테리신 B의 존재 및 부재 하에서 TCID50에 의해서 적정한다. 또한, 여기에서 역가의 현저한 증가가 관찰되고, 약 1log의 감도 증가가 달성된다.
재료 및 방법:
세포 및 바이러스:
베로 세포는 혈청이 없는 조건에서 배양하고, 사용된 배지는 4mM L-글루타민이 첨가된 OptiProTM SFM이다. 세포는 2~3일 마다 37℃, 5% CO2에서 1:3~1:4의 비율로 패시징함으로써 배양한다.
B/비엔나/32/2006은 B/말레이시아/2506/2004형 임상 분리물로부터 유도하고, MDCK 세포(2 패시지)에서 분리한 후, 암포테리신 B 존재 하에서 33℃에서 6회 패시징하여 혈청이 없는 베로 세포 상에 성장하도록 적응시켰다.
A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1)형 ΔNS1 바이러스는 A/뉴 칼레도니아/20/99(H1N1) 바이러스로부터의 표면 단백질 HA 및 NA, 및 A/푸에르토리코/8/34로부터의 내부 세그먼트를 함유하고, 반면 NS(비구조) 세그먼트의 부분은 제거한다. 이러한 바이러스를 역 유전학에 의해서 발생시켜 암포테리신 B 부재 하에 37℃에서 베로 세포 상에 패시징한다.
효력 검정
플라크 검정
바이러스의 적정은 플라크 검정에 의해서 행했다. 바이러스를 일련으로 희석하고, 베로 세포의 융합성 단일층을 감염시키고, 오버레이는 0.01% DEAE 덱스트란, 10x DMEM, 포화 탄산수소 나트륨, 5㎍/ml의 트립신, 및 0 또는 250ng의 암포테리신 B가 첨가된 베로 성장 배지로 이루어진다.
TCID50 검정
TCID50(조직 배양액 감염 용량) 검정은 96웰 플레이트에서 바이러스 효력의 통계적 측정을 가능하게 하는 셀에 기초한 검정이다. 바이러스를 일련으로 희석하고, 베로 세포(96웰 플레이트)의 서브 융합성 단일층을 감염시키고, 바이러스를 5㎍/ml의 트립신의 존재 및 250ng/ml의 암포테리신 B의 부재 또는 존재 하에서 37℃에서 성장시킨다. 3일의 배양 기간 후, 웰을 세포 변성 효과에 대해 체크하고, 역가를 Reed L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493~497에 의한 식에 기초하여 산출한다.
실시예 3
본 실험에 있어서, A/위스콘신/67/2005(H3N2)형 바이러스에 의한 베로 세포의 감염 후에 상이한 용량의 암포테리신 B를 첨가한다. 암포테리신 B의 농도를 증가시킴으로써, 바이러스 복제가 향상될 수 있고, 62.5와 1000ng/ml 사이의 농도에서 명백한 효과를 나타낸다.
서브 융합성 단일층의 혈청이 없는 베로 세포를 A/위스콘신/67/2005형 바이러스인 A/비엔나/28/2006(H3N2)에 의해 0.001의 감염 다중도로 감염시킨다. 바이러 스를 0, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 및 1000ng/ml의 상이한 농도의 암포테리신 B 존재 하에서 성장시킨다. 바이러스를 48 시간 후에 채취하고, 250ng/ml의 암포테리신 B 존재 하에서 TCID50 검정에 의해 적정한다.
역가는 8E+05~4E+07 TCID50/ml의 범위 내로 얻어졌다. 2개의 최저 농도(0 및 31.25ng/ml)에서 바이러스 역가는 1E+06 TCID50/ml 미만이고, 한편 암포테리신 B 250 및 500ng/ml에서는 바이러스 역가가 3E+07 TCID50/ml를 초과하여 증가한다. 도 3에 그 결과를 나타낸다.
재료 및 방법:
세포 및 바이러스:
베로 세포를 혈청이 없는 조건에서 배양하고, 사용된 배지는 4mM L-글루타민이 첨가된 OptiProTM SFM이다. 세포는 2~3일 마다 37℃, 5% CO2에서 1:3~1:4의 비율로 패시징함으로써 배양시킨다.
임상 표본으로부터 유도되어 분리된 A/위스콘신/67/2005형의 A/비엔나/28/2006(H3N2)을 MDCK 세포 상에 1회 패시징한 후, 암포테리신 B 존재 및 부재하에서 혈청이 없는 베로 세포 상에 5회 패시징한다.
효력 검정
바이러스의 적정을 96웰 플레이트에서 바이러스 효력의 통계학적 측정을 가능하게 하는 세포에 기초한 검정인 TCID50(조직 배양액 감염 용량) 검정에 의해서 행했다. 바이러스를 일련으로 희석하고, 서브 융합성 단일층의 베로 세포가 감염시 키고, 바이러스를 5㎍/ml의 트립신, 및 250ng/ml의 암포테리신 B의 존재 하에서 33℃(B 바이러스) 및 37℃(A 바이러스)에서 성장시킨다. 3~6일 배양 후, 웰을 세포 변성 효과에 대해 체크하고, 역가를 Reed L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493~497에 의한 식에 기초하여 산출한다.
실시예 4
트랜스펙션 후 바이러스의 효율적 보호를 위한 암포테리신 B의 용도
본 실시예에 있어서, 혈청이 없는 베로 세포를 Hoffman et al.에 의해 설명된 바와 같이 소정의 변이를 포함하는 A/위스콘신/67/2005(H3N2)형 바이러스의 8개의 세그먼트를 인코딩하는 8개의 플라스미드로 트랜스펙션한다(Hoffmann E. et al., ProcNatlAcadSci, 2002, 99: 11411~6). 250ng/ml의 암포테리신 B 및 5㎍/ml의 트립신을 함유하는 성장 배지를 6시간 후에 첨가한다. 암포테리신 B의 존재 하에서 성장된 트랜스펙션된 바이러스의 명백한 세포 변성 효과가 관찰되고 세포 변성 효과의 신호가 암포테리신 B의 부재 하에서도 나타나는 경우, 트랜스펙션 6일 후, 바이러스를 일부 채취했다. 암포테리신 B가 없는 바이러스는 세포 변성 효과가 진행되는 신호가 나타나지 않는지 3일 더 모니터한다. 역가를 250ng/ml의 암포테리신 B 존재 하에 TCID50 검정에 의해서 측정한다.
표 1에 나타낸 바와 같이, 암포테리신 B 존재 하에 2E+04 TCID50/ml의 역가가 얻어지고, 한편 암포테리신 B 부재 하에서는 바이러스가 검출되지 않는다.
본 실시예는 암포테리신 B만의 존재 하에서 성장하지 않는 바이러스라도 효과적으로 보호될 수 있다는 것을 명백하게 나타낸다.
재료 및 방법:
세포 및 바이러스:
베로 세포를 혈청이 없는 조건에서 배양하고, 사용된 배지는 4mM L-글루타민이 첨가된 OptiProTM SFM이다. 세포를 2~3일 마다 37℃, 5% CO2에서 1:3~1:4의 비율로 패시징함으로써 배양한다.
A/비엔나/28/2006(H3N2)은 암포테리신 B 존재 및 부재 하에서 MDCK 세포 상에 1회 패시징한 후, 혈청이 없는 베로 세포 상에 5회 패시징한 임상 표본으로부터 유도된 A/위스콘신/67/2005형의 바이러스이다.
상기 바이러스의 세그먼트는 바이러스 단백질로 더 가공하기 위한 mRNA뿐만 아니라 동시에 게놈용 주형로서의 바이러스 RNA의 전사를 가능하게 하는 플라스미드로 클로닝하고(Hoffmann et al; Eight-plasmid system for the rapid generation of influenza virus vaccines, Vaccine(20). 2002), 여기서 상기 플라스미드는 변이된 것이다. 8개의 플라스미드 모두를 전기 천공법에 의해서 베로 세포에 트랜스펙션한다. 트랜스펙션 6시간 후, 0 및 250ng/ml의 암포테리신 B뿐만 아니라 5㎍/ml의 트립신도 함유하는 혈청이 없는 배지를 각각 첨가한다. 6일 후, 트랜스펙션된 바이러스를 일부 채취하고, 3일 더 관찰한다.
효력 검정
바이러스의 적정을 96웰 플레이트에서 바이러스 효력의 통계학적 측정을 가능하게 하는 세포에 기초한 검정인 TCID50(조직 배양액 감염 용량) 검정에 의해서 행했다. 바이러스를 일련으로 희석하고, 서브 융합성 단일층의 베로 세포(96웰 플레이트)를 감염시키고, 바이러스를 5㎍/ml의 트립신, 및 250ng/ml의 암포테리신 B의 존재 하에서 33℃(B 바이러스) 및 37℃(A 바이러스)에서 성장시킨다. 6일까지 배양 후, 웰을 세포 변성 효과에 대해 체크하고, 역가를 Reed L. J. et al., 1938, Am. J. Hyg. 27: 493~497에 의한 식에 기초하여 산출한다.
표 1은 암포테리신 B 존재 및 부재 하에 있어서의 트랜스펙션 후의 바이러스의 보호를 나타낸다. 베로 세포에 A/위스콘신/67/2005(H3N2)형 바이러스의 8개의 세그먼트를 인코딩하는 8개의 플라스미드를 트랜스펙션한다. 트랜스펙션 6시간 후, 250ng/ml의 암포테리신 B 및 5㎍/ml의 트립신을 함유하는 배지를 첨가한다. 바이러스를 TCID50 검정에 의해서 적정한다.
암포테리신 B의 첨가[+/-] 역가[TCID50/ml]
+ 2.0E+04
- <1.0E+01
실시예 5
암포테리신 B를 사용한 베로 세포에 있어서의 임상 샘플로부터의 바이러스의 분리:
인플루엔자 B 바이러스 감염이 확인된 환자로부터의 9개의 임상 샘플에 대하여 암포테리신 B 존재 또는 부재 하에서 베로 세포 상의 바이러스 분리의 빈도를 평가했다. 암포테리신 B가 첨가되지 않은 경우의 3개의 표본으로부터의 바이러스만이 성공적으로 분리되었다. 동시에, 9개의 프로브 모두 500ng/ml의 암포테리신이 유지 배지에 첨가된 경우에 포지티브였다.

Claims (17)

  1. 암포테리신 B를 유효성분으로 포함하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식용 배양 첨가제.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 암포테리신 B는 0.5ng/ml 내지 5㎍/ml의 농도인 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식용 배양 첨가제.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 인플루엔자 A 및 B 바이러스의 증식은 BSC-1 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피세포; epithelial cells of African green monkey kidney origin), LLC-MK 세포(붉은털 원숭이의 신장 상피 세포; kidney epithelial cells of Rhesus monkey), CV-1 세포(아프리카 녹색 원숭이의 신장 섬유모세포; African green monkey kidney fibroblast cell), CHO 세포(중국 햄스터 난소세포; Chinese hamster ovary cell), COS 세포(아프리카 원숭이 신장 조직으로부터 유래된 유사 섬유모세포; fibroblast-like cell line derived from African monkey kidney tissue), 마우스 세포, 인간 세포, HeLa 세포(인간 세포주; human cell line), 293 세포(인간 배아 신장 293 세포; Human Embryonic Kidney 293 cells), VERO 세포(아프리카 녹색 원숭이 기원의 신장 상피 세포; kidney epithelial cells of African green monkey origin), MDBK 세포(마딘 더비 소 신장 세포주; Mardin Darby bovine Kidney cell line), MDCK 세포(마딘 더비 개 신장 세포;Mardin Darby Canine Kidney cell), MDOK 세포(마딘 더비 양 신장 세포; Mardin Darby Ovine Kidney cell), CRFK 세포(크랜들 리스 고양이 신장 세포; Crandell Rees Feline Kidney cell), RAF 세포(포도막흑색종 세포주; uveal melanoma cell line), TCMK 세포(생쥐 신장 세포; Mus musculus kidney cells), LLC-PK 세포(돼지 신장세포; pig kidney cell), PK15 세포(돼지 신장 상피 세포; porcine kidney epithelial cell), WI-38 세포(인간 폐 섬유모세포주; Human lung fibroblast cell line), MRC-5 세포(인간 태아 폐 섬유모세포; Human Fetal Lung Fibroblast Cell), T-FLY 세포(초파리로부터의 상피세포주; epithelial cell line from fruit fly), BHK 세포(어린 햄스터 신장세포; baby hamster kidney cell), SP2/0 세포(마우스 골수종세포; mouse myeloma cell), NS0(마우스 골수종세포; mouse myeloma cell), PerC6(인간 망막 세포), 닭 배아 세포, 부화란 세포, 및 부화 계란으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식용 배양 첨가제.
  11. 제 1 항에 있어서,
    0.1log10 이상의 인플루엔자 A 및 B 바이러스 성장 증가가 포함되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식용 배양 첨가제.
  12. 제 1 항에 있어서,
    인플루엔자 A 및 B 바이러스 세그먼트를 함유하는 발현 플라스미드로 베로 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 A 및 B 바이러스 증식용 배양 첨가제.
  13. a) 세포를 적어도 하나의 감염성 인플루엔자 A 및 B 바이러스 입자로 감염시키는 단계;
    b) 암포테리신 B를 감염원 및 배양 배지 중 어느 하나 이상에 트립신과 함께 첨가하는 단계;
    c) 배양하는 단계; 그 다음
    d) 상기 인플루엔자 A 및 B 바이러스 생성물을 채취하는 단계;
    e) 상기 인플루엔자 A 및 B 바이러스를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 사용한 인플루엔자 A 및 B 바이러스 배양을 위한 세포의 감염방법.
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. a) 세포를 암포테리신 B의 존재 하에서, 환자의 기도로부터 얻어진 인플루엔자 A 및 B 바이러스 입자로 감염시키는 단계;
    b) 상기 세포를 암포테리신 B 존재하에 배양하여 인플루엔자 A 및 B 바이러스 성장을 촉진시키는 단계;
    c) 상기 인플루엔자 A 및 B 바이러스를 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 임상 샘플로부터의 인플루엔자 A 및 B 바이러스 분리방법.
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