CN101568639B - 用于病毒生产的培养基补充物 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物作为培养物补充物用于病毒繁殖的用途。此外还公开了包含病毒和大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物的药物组合物，以及利用大环内酯多烯抗生素转染和感染细胞的方法，以及大环内酯多烯抗生素用于分离来自临床样品的病毒的用途。

Description

用于病毒生产的培养基补充物
本发明提供大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物作为用于病毒繁殖的培养物补充物的用途。此外，还描述了包含病毒和大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物的药物组合物，以及该组合物在癌症治疗和流行性感冒治疗中的用途。
目前，多种病毒疫苗(但不是流感疫苗)都利用经胰蛋白酶消化的原代细胞如来自猴肾和兔肾和仓鼠肾的细胞进行生产(参见例如WO9738094)。原代二倍体细胞培养有一些优点，例如使用简单的培养基和牛血清就可以轻易制备，以及对广泛范围内的多种病毒敏感。然而，原代二倍体细胞也有不利之处，例如被各种外来物质污染、品质和敏感性不统一；以及难以获得适于培养的组织(例如猴肾)。
相反，使用连续细胞系的优点在于，它们保持了感染病毒的天然抗原特征、它们是标准化的、它们对同一病毒的各种变体高度易感、而且它们能用微载体或悬浮发酵罐系统中的大量细胞来进行培养。
然而，这些优点本身使得这类细胞系适于用于疫苗生产。Mizrahi，ed.，Viral Vaccines，Wiley-Liss，New York(1990)，pp.39-67。例如，已经发现，只在哺乳动物细胞培养物中分离和传代的A型流感病毒有时候保持它们大部分或所有的原始抗原特征，在疫苗生产中这被证明是非常有利的(Romanova J.et al.，Virology、2003，307(1)：90-7；Romanova J.et al.，Virus Res.2004，103：187-93)。
然而，哺乳动物原代二倍体细胞培养物作为疫苗生产的宿主系统存在问题。这是由于例如外来物质对细胞培养物的污染、细胞培养物中细胞品质不统一、细胞对同一病毒的多种变体有不同敏感性、病毒滴度低、以及在获得和制备这种细胞培养物期间的高花费和困难等问题造成的。
此外，在已测试过的连续细胞系中，只有MDCK细胞被报道能支持病毒充分生长和分离(Frank et al.，J Clin.Microb.10：3236(1979)；Schepetink &Kok，J Virol.Methods 42：241-250(1993))。
另两个连续细胞系非洲绿猴肾(Vero)细胞和幼仓鼠肾(BK-21)已被鉴定出，并被世界卫生组织(WHO)批准用于生产人用疫苗。然而，被证明合格的Vero细胞先前却被发现不适合用于大规模生产人流感病毒疫苗。例如，与MDCK细胞相比，B型流感病毒在Vero细胞中的生长极大受限(Nakamurael al.，J Gen.Virol.56：199-202(1981))。另外，有人尝试用Vero细胞评价人A型流感病毒H1N1和H3N2对金刚烷胺(rimantadine)的敏感性，由于同MDCK细胞相比在这些细胞中的病毒滴度太低，未得出明确结果(Gorvakova EA etal.，J.Virol.，1996，70：5519-24)。
因此，这些及其他研究显示，流感病毒先前在Vero细胞中复制得不好，使得它们不适于大规模疫苗生产(Demidova et al.，Vopr.Virosol(Russian)346-352(1979)；Lau & Scholtissek，Virology 212：225-231(1995))。
Kaverin NV和Webster RG(J.Virol.，1995，69(4)：2700-3)描述了需要向流感病毒感染的Vero细胞的培养基中重复添加胰蛋白酶，以恢复A型流感病毒株的多重循环生长模式。然而重复添加胰蛋白酶相当费力和耗时，因为必须在培养的各个阶段添加胰蛋白酶(也参见Gorvakova EA et al.，J.Infect.Dis.，1995，172：250-3)。
DNA病毒科成员包含双链基因组。细小病毒科是唯一的例外。大多数DNA基因组不是单纯的线性分子。例如，乳多空病毒基因组是共价闭合的双链环，而嗜肝DNA病毒基因组是双螺旋环，其中一条链包含切口，另一条链包含裂隙。双链痘病毒基因组的末端是共价连接的，而疱疹病毒基因组却包含末端重复和内部重复。
DNA病毒分为下列科：细小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、虹彩病毒科(Iridoviridae)、杆状病毒科(Bacuoloviridae)和痘病毒科(Poxviridae)。
双链RNA病毒分为两组：呼肠孤病毒科(Reoviridae)和双RNA病毒科(Birnaviridae)。
负链单链RNA包膜病毒分为基因组不分节段的病毒(副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、线状病毒科(Filoviridae)和波尔纳病病毒(Borna Disease Virus)、披膜病毒科(Togaviridae))或基因组分节段的(正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)和嵌沙样病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括A、B和C型流感病毒、以及托高土(Thogoto)和多里(Dhori)病毒和传染性鲑鱼贫血病毒(infectious salmonanemia virus)。
流感病毒粒子组成如下：内核是含有单链RNA基因组的核糖核蛋白(螺旋状核壳体)，外层是脂蛋白包膜，包膜内侧还有基质蛋白(M1)。A型流感病毒的分节段基因组由8个线状负极性单链RNA分子组成(C型流感病毒是7个分子)，其编码十种多肽，包括：RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1，M2)；从含脂质的包膜上伸出的两种表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP)。
基因组的转录和复制在核中发生，通过从质膜出芽进行装配。这些病毒可在混合感染期间重新分配它们的基因。流感病毒通过HA吸附至细胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸寡糖上。病毒粒子被胞吞后，在细胞内体中HA分子发生构象变化，促进膜融合，因而引发脱壳。核壳体迁移至核中，在那里进行病毒mRNA的转录。病毒mRNA通过独特的机制被转录，在该机制中，病毒核酸内切酶从细胞性异源mRNA切割下带帽的5端，该末端然后充当引物，用于通过病毒转录酶转录病毒RNA模板。转录产物在距模板末端15到22个碱基处终止，在这里寡聚(U)序列充当添加多聚(A)段的信号。在这样产生出的8种病毒RNA分子中，6种是单顺反子信息体，它们被直接翻译成HA、NA、NP和病毒聚合酶蛋白PB2、PB1和PA。另外两种转录产物进行剪接，各产生两种mRNA，它们按不同的阅读框翻译，产生M1、M2、NS1和NEP。换句话说，8种病毒RNA节段编码11种蛋白：9种结构蛋白和非结构蛋白，以及新近鉴定出的PB1-F2蛋白。
考虑到大量生产病毒粒子尤其是用于预防和治疗用途的病毒粒子的困难，本发明的一个目的是提供新的培养方法和添加物，其可提高在连续细胞系中繁殖的病毒的产量和品质。
该问题通过利用大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物作为病毒繁殖的培养物补充物而加以解决。优选，大环内酯多烯抗生素是两性霉素B或其衍生物或类似物。根据现有技术，大环内酯多烯抗生素已知显示出抗真菌性质，被广泛用于治疗和预防动物和人患者中的真菌感染。
除了大环内酯多烯抗生素的已知性质之外，本发明的发明人还意外发现，大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物也可以用于培养和繁殖那些通常难以培养、但在诸如预防、治疗和工业等应用中又大量需要的病毒粒子。有报道称，两性霉素B甲酯(其为两性霉素B的衍生物)能提高脑心肌炎病毒(Enzephalomyocarditis virus)RNA和SV40病毒DNA的感染性(Borden E.et al.，J.gen.Virol.，1979，42，297-303；Borden E.et al.，Archives of Virology，1981，69，161 165)，然而没有现有技术显示或指示其用于病毒培养用途。
利用本发明的大环内酯多烯抗生素和其衍生物或类似物，可增加病毒生长，也可提高病毒粒子甚至在低感染复数时的感染性。
根据本发明，可以被成功培养的病毒是DNA或RNA病毒，优选它们是RNA病毒，更优选属于正粘病毒科、小RNA病毒科和副粘病毒科。甚至更优选，病毒是A型流感病毒、B型流感病毒、C型流感病毒、鼻病毒和副流感病毒和其衍生物或类似物或片段。或者，麻疹病毒、腮腺炎病毒、风疹病毒和狂犬病病毒可以是根据本发明加以培养的有用系统。
在另一个具体实施方式中，所培养的病毒可以在若干结构和非结构基因中含有修饰，优选在NS1和/或PB1基因中。所述修饰是缺失、置换或插入至少一个核酸。
或者，用含有大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物的培养基培养的病毒也可以是肿瘤消解病毒(oncolytic virus)。
病毒衍生物、类似物或片段例如可以是任何仍可用于疫苗接种目的或显示肿瘤消解能力的病毒粒子。
这些病毒常常利用已被病毒感染的、且已被证明适于繁殖病毒粒子的细胞来加以培养。
本发明还提供一种感染细胞用于病毒培养的方法，其使用大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物，其包含下列步骤：
a)用至少一个感染性病毒粒子感染细胞
b)大环内酯多烯抗生素和其衍生物或类似物与胰蛋白酶一起被加入到接种物和/或培养基中
c)在适当条件下保温，继之以
d)收获所产生的病毒，并且任选
e)纯化和/或鉴定该病毒。
结果意外发现，使用根据本发明的添加物或添加物混合物，病毒生长提高至少0.1log10、优选至少0.5log10、优选1log10、更优选至少2log10、甚至更优选至少2.5log10、甚至更优选至少5log10。
本发明还提供一种药物制剂，其包含病毒和大环内酯多烯抗生素或其衍生物。优选该病毒是减毒活病毒，或者根据本发明也可以是经灭活的完整病毒粒子、含部分抗原的疫苗(split vaccine)或亚单位疫苗。
根据另一个具体实施方式，该药物制剂可以含有流感病毒和/或肿瘤消解病毒，并含有大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物。根据所使用的病毒种类，该药物制剂可用于治疗或预防癌症或流感感染。
此外，本发明还可以用于分离或滴定病毒粒子。这具有特别重大的意义，因为在通过对细胞进行感染来培养病毒时，由于感染率(infection rate)不足且复制机制效率低，常常需要大量的病毒。通过在感染之前不久、或感染同时、或感染之后不久添加至少一种大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物，可以使病毒量大大降低。
附图说明
图1显示两性霉素B对流感病毒生长的影响
亚汇合(subconfluent)的Vero细胞处于不同的感染复数moi(0.001、0.0001和0.00001)。病毒生长培养基含有5μg/ml胰蛋白酶、以及0或250ng/ml两性霉素B。在每个感染复数(含有和不含有两性霉素B)，当较快生长的病毒的细胞病变效应达到50-95％时，收获病毒。所有在两性霉素B存在下保温的病毒与在无两性霉素B时生长的病毒相比，细胞病变效应出现得快，病毒滴度也升得快。比较的是TCID50滴度。
图1a显示对H1N1株的影响。
图1b显示对H3N2株的影响。
图1c显示对B型流感株的影响。
图2显示两性霉素B存在和不存在时的滴定结果。
a)用蚀斑测定法滴定两性霉素B存在(左列)和不存在(右列)下的B型流感/Vienna/32/2006(B/Malaysia/2506/2004样)病毒。在两性霉素B存在下生长的病毒，病毒产量提高大约2.5log。
b)A/New Caledonia/20/99(H1N1)样ΔNS1病毒被连续稀释，并且在250ng/ml两性霉素B存在和不存在条件下用TCID50测定法平行滴定。37℃保温3天后，评价各孔的细胞病变效应，并且计算滴度。
图3显示利用两性霉素B进行的剂量渐升研究。
亚汇合的单层Vero细胞用A/Vienna/28/2006(A/Wisconsin/67/2005样)(H3N2)病毒以感染复数0.001感染。感染后，生长培养基中添加不同浓度的两性霉素B(分别为0、31.25、62.5、125、250、500和1000ng/ml)。48小时后收获病毒，在两性霉素B存在下用TCID50测定法滴定。两性霉素B浓度在250-500ng/ml时产生最高病毒滴度。
通常，根据它们所具有的共轭双键的数目和是否具有糖苷连接的碳水化合物，根据本发明的大环内酯多烯抗生素和其衍生物和类似物被分成三烯、丁烷、戊烷、己烷和庚烷。综述参见Hamilton-Miller J.M.T.，Bacteriol.Reviews，1973、37，166-196。根据本发明的优选实施方式，该大环内酯多烯抗生素为庚烷，像例如两性霉素B、制念菌素(candidin)、七烯枝菌素(mycoheptin)、X-63、假丝霉素(candimycin)、DJ400B1、表霉素(perimycin)、抗真菌素4915、败菌素(eurotin)A、庚烷757、摩尼卡霉素(monicamycin)、新七烯(neoheptane)、制霉菌素(Nystatin)、菲律宾菌素(Filipin)、Primaricin、游霉素(Natamycin)和PA150，以及它们衍生物和类似物。
根据最优选的实施方式，大环内酯多烯抗生素是两性霉素B或其衍生物或类似物。两性霉素B可以通过培养结节链霉菌(Streptomyces nodosus)等生物，并且从培养物中提取而产生。两性霉素B实质上是高分子量大环内酯，其发色团有7个共轭双键。除了大的内酯核之外，两性霉素B具有其它的特征性基团，包括氨基糖。其衍生物或类似物可以是任何种类，只要其仍然提供病毒培养添加物所需的那些特征。举例来说，其可以被N-乙酰化、N-琥珀酰化、酯化或与CaCl2络合。例如，它可以是两性霉素B甲酯或含有两性霉素B的脂质体制剂。
根据另一种实施方式，两性霉素B与其衍生物的混合物，或多种两性霉素B衍生物的不同混合物也能被用作病毒培养添加物和用于本发明的方法。
根据本发明，以足够促进病毒培养的浓度使用大环内酯多烯抗生素和其衍生物和类似物。优选浓度在0.5ng/ml-5μg/ml，优选0.5ng/ml-2.5μg/ml，优选10ng/ml-900ng/ml，更优选100ng/ml-500ng/ml，更优选200ng/ml-400ng/ml。
根据本发明，大环内酯多烯抗生素和其衍生物和类似物能被用于培养任何DNA或RNA病毒。在一个优选实施方案中，病毒是RNA病毒。含有带负链单链RNA包膜病毒分为具有非节段型基因组的病毒(副粘病毒科、弹状病毒科、线状病毒科和波尔纳病病毒)或具有节段型基因组的病毒(正粘病毒科、布尼亚病毒科和嵌沙样病毒科)。正粘病毒科包括A、B和C型流感病毒、以及托高土和多里病毒和传染性鲑鱼贫血病毒。
正粘病毒科的基因组由6至8个负极性(与mRNA互补的)单链RNA分子组成。流感病毒粒子由含有单链RNA基因组的内部核糖核蛋白核心(螺旋状核壳体)和内层衬有基质蛋白(M1)的外层脂蛋白包膜组成。A型流感病毒的区段基因组由8个线状负极性单链RNA分子组成(C型流感病毒是7个分子)，其编码十个多肽：包括：RNA依赖的RNA聚合酶蛋白(PB2、PB1和PA)和形成核壳体的核蛋白(NP)；基质膜蛋白(M1，M2)；从含脂质的包膜伸出的两个表面糖蛋白：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)；非结构蛋白(NS1)和核输出蛋白(NEP)。
示例性的，使用大环内酯多烯抗生素和其衍生物和类似物作为培养物添加物进行繁殖或进行这里所述任何方法的病毒可以是流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)、鼻病毒和副流感病毒(PIV)、麻疹和腮腺炎病毒、风疹病毒和狂犬病病毒。
用于本发明的病毒可以选自天然发生的病毒株、变体或突变体；诱变的病毒(例如通过暴露于诱变剂、重复传代和/或在非许可性寄主中传代而生成的)；再分配体(在分节段的病毒基因组的情况中)；和/或遗传工程改造的病毒(例如使用″反向遗传学″技术进行改造)。
优选，通过添加大环内酯多烯抗生素而进行培养的病毒选自A型流感病毒、B型流感病毒或C型流感病毒。
根据本发明，病毒在基因组内可以含有导致表达和产生病毒的衍生物或类似物的修饰。在另一个具体实施方式中，该修饰可以位于NS1基因和/或PB1基因中。这可以导致产生含有完全缺失或者修饰的NS1蛋白质、和/或完全缺失或修饰的PB1-F2蛋白、或从PB1基因组片段表达的修饰的PB2蛋白的病毒。NS1基因内的修饰可以是缺失、插入或置换。这种修饰的RNA病毒的例子在WO99/64068和WO99/64571中公开，其通过参考并入本文，其中NS1基因内的修饰导致具有干扰素拮抗剂表型的RNA病毒，该表型导致减毒作用。
PB1-F2的功能已经由Chen W.et al.，Nat Med.2001，12：1306-12详细描述。Zamarin D.et al.，J.Virol.，2006，80，7976-7983描述了PB1-F2蛋白内经证实负责能在小鼠中引起病毒性致病机理的修饰。
或者，该病毒还可以是肿瘤消解病毒。肿瘤消解病毒典型的主要特征是它们的条件复制表型，其允许它们在恶性肿瘤细胞而不是正常组织中生长。在本发明的最优选实施方案中，它可以是肿瘤消解型A型流感病毒，其在NS 1基因中有修饰，不能在有IFN活性(IFN competent)的系统中生长，但在不表达功能性IFN的系统中能有效复制。
用于在补充有大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物的培养基中培养病毒的细胞可以是任何能在合成培养基中体外生长、并能用于繁殖病毒的细胞。在本发明范围内，术语″细胞″指单个细胞、组织、器官、昆虫细胞、鸟类细胞、哺乳动物细胞、杂交瘤细胞、原代细胞、连续细胞系、和/或遗传工程化的细胞、例如表达病毒的重组细胞的培养物。这些可以例如是BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠类细胞、人细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、W1-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0、PerC6(人视网膜细胞)、鸡胚细胞或衍生物、含胚卵细胞、鸡的含胚卵或其衍生物。优选，细胞系是VERO细胞系。
用来产生病毒的培养基可以是本领域已知的任何适于病毒培养的培养基。优选，培养基是合成培养基。这可例如是基础培养基，如改良的Eagle氏培养基MEM、极限必需培养基MEM、Dulbecco改良的Eagle培养基D-MEM、D-MEM-F12培养基、William氏E培养基、RPMI培养基和其类似物和衍生物。这些还可以是专业细胞培养和病毒生长培养基，如VP-SFM、OptiProTM SFM、
Figure G2007800460588D00081
培养基、HyQ SFM4MegaViTM、EX-CELLTM VeroSFM、EPISERF、ProVero、任何293或CHO培养基和其类似物和衍生物。这些培养基可以补充有本领域已知的任何适于细胞和病毒培养的添加剂，例如动物血清和其经过分级分离之后的级分或类似物、氨基酸、生长因子、激素、缓冲液、微量元素、胰蛋白酶、丙酮酸钠、维生素、L-谷氨酰胺和生物缓冲液。优选培养基是补充有L-谷胺酰胺和胰蛋白酶的OptiPROTM SFM。
特别地，大环内酯多烯抗生素或衍生物或类似物还可以用于提高感染率(infenction rate)的效力。为增加对细胞的感染，将细胞同时与病毒粒子和大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物接触。或者，可在添加病毒粒子至细胞前不久、添加的同时、或添加之后不久，用大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物预处理细胞。优选的时间是感染前1小时或感染后1小时，更优选感染前0.5小时或感染后0.5小时。
现有技术已知高感染复数(MOI)导致产生大量感染性降低或没有感染性的缺陷病毒粒子。因此，出于经济上的和科学上的原因，提供能以低(MOI0.001)或甚至优选非常低MOI(MOI 0.0001直至0.00001)或甚至更低MOI感染细胞的手段(means)应该是有利的。
使用根据本发明的添加物或添加物混合物，能使病毒生长提高至少0.1log10、至少0.5log10、优选至少1log10、更优选至少2log10、甚至更优选至少2.5log10、甚至更优选至少5log10。
本发明的更进一步的具体实施方式是大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物用于用编码病毒RNA区段的表达质粒转染Vero细胞的用途。同样，在细胞用含有病毒完整基因组的全部或一部分的表达质粒转染之前不久、转染的同时、或在转染之后不久，向培养基中加入大环内酯多烯抗生素。
本发明更进一步的具体实施方式提供一种药物制剂，其包含减毒活病毒或灭活病毒，并包含大环内酯多烯抗生素或其衍生物，任选还含有药学上可接受的载体。优选，病毒是流感病毒和/或肿瘤消解病毒。
如果该药物制剂包含肿瘤消解病毒，其能被用于癌症的病毒治疗。如果该药物制剂包含流感病毒，它能被用于治疗流感病毒感染。
优选，该药物制剂包含减毒活病毒，但也能使用灭活病毒或其它病毒。
所述制剂可以以适当的量施用。适当的量可以是2至10log病毒粒子、更优选5至9log病毒粒子、更优选6.5至8log病毒粒子。
根据本发明使用的制剂优选以合适的制剂形式提供。优选这种制剂带有药学上可接受的载体。
所述载体包含例如助剂、缓冲液、盐和防腐剂。优选提供现成的输注溶液。由于病毒制剂相对稳定，基于病毒或它们的衍生物的药物具有相当大的优点，即它们可作为耐储存的溶液、或作为现成即可使用形式的制剂出售。前者优选是在冰箱温度直至室温的制剂中耐储存。然而，根据本发明使用的制剂也可以以冷冻或冻干形式提供，其可以在需要时解冻或复原。
通常，该制剂经鼻内或肌肉内施用。然而同样地，也可选择其它肠胃外或粘膜施用方式，这些方式经由全身或局部应用将活性物质带到感染或肿瘤部位。
本发明还提供一种加快标准TCID50测定、基于TCID50的测定或蚀斑测定、和提高这些测定的质量和敏感性的手段(means)。通过利用大环内酯多烯抗生素来培养病毒，病毒生长被加速，因此能够更早地分析该测定，并且可在较早时间点获得更精确的滴定结果。
此外，本发明提供用于从临床样品分离病毒的方法，其中在有大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物的情况下，用来自患者呼吸道的病毒粒子感染细胞，例如Vero细胞，受感染细胞在有大环内酯多烯抗生素或其衍生物或类似物存在的情况下在适当条件下保温以促进病毒的生长，并且分离并鉴定该病毒。
流感病毒监视程序需要从临床样品分离流感病毒的高效系统。通常这个程序包括用取自鼻咽洗漱物的材料感染鸡的含胚卵或MDCK细胞。该程序的效力在年与年之间有差异，取决于病毒类型和细胞底物。已知在卵中分离以及有时候在MDCK中分离可生成突变的病毒变体，该变体不同于在人群中传播的真的病毒。曾经显示Vero细胞可作为流感病毒分离和鉴定的较好底物，因为源自Vero的病毒的性质更好地反映了人病毒的天性(Romanova J.，et al.2003)。可是同时不幸的是，Vero细胞系对病毒分离的敏感性低于MDCK细胞。
根据本发明，两性霉素B改进了流感病毒在Vero细胞中从临床样品的分离。利用根据本发明的方法，能够提高阳性分离病例的百分比，而通常该病毒很难从临床样品中在Vero细胞中被再分离。
参考以下实施例将更充分地理解上述描述。然而，这样的例子仅仅是实践本发明的一个或多个具体实施方式的代表性方法，不应该被视为限制本发明的范围。
实施例
实施例1
本实验的目标是确定两性霉素B对感染复数渐减的各种流感病毒的作用。所选择的三种病毒反映了当前流行的H1N1、H3N2和B亚型，这也是WHO为北半球2006/07季节性疫苗推荐的亚型。(http://www.who.int/csr/disease/influenza/vaccinerecommendationsl/en/)。
亚汇合的无血清单层Vero细胞用渐减的感染复数感染，即感染复数0.001、0.0001或0.00001。使用两种代表性的A型流感病毒：A/NewCaledonia/20/99(H1N1)和A/Vienna/28/2006(H3N2)(A/Wisconsin/67/2005样病毒)，以及一种B型流感候选株：B/Vienna/32/2006(B/Malaysia/2506/2004样病毒)。感染后添加的生长培养基补充有5μg/ml胰蛋白酶，以及分别补充有0或250ng/ml两性霉素B。当在较快生长的病毒上观察到50％或更高的细胞病变效应时，收获所有用相同感染复数感染的细胞(0和250ng/ml两性霉素B)的上清液。病毒滴度用TCID50测定法来决定。
如图1a、1b和1c所示，对于所测试的所有三种病毒，都可以得出两性霉素B对病毒复制具有正面影响的结论。对于A/New Caledonia/20/99(H1N1)而言，可观察到两性霉素B对病毒生长的影响。在两性霉素B存在下，随着moi(感染复数)渐减，滴度范围为从8E+05到2E+07TCID50/ml。在最低moi时，不添加两性霉素B导致病毒少1log。就A/New Caledonia/20/99来说，最低moi 0.00001就病毒生长和两性霉素B的影响而言似乎是最佳的。
A/Vienna/28/2006(H3N2)病毒证实了H1N1病毒的结果，显示对该物质影响的敏感性甚至更高。在所有三个试验过的moi上，当在两性霉素B存在下生长并且在相同时间点收获时，病毒滴度最少高1log。
在B/Vienna/32/2006(B/Malaysia/2506/2004样病毒)病毒上甚至观察到该物质更惊人的效果。在两性霉素存在下生长的病毒所测量的滴度范围为1.E+07(moi 0.001)到1E+06(moi 0.00001)TCID50/ml。相反，当不添加两性霉素时，病毒几乎不复制，导致滴度低于3E+05TCID50/ml，最低moi时则根本没获得病毒。与A型病毒相比，B型病毒显示对该物质的最大敏感性。部分原因是，该病毒适应了在有两性霉素B的情况下在无血清Vero细胞上生长。
总之，能得出结论说，两性霉素B对上面讨论的所有三种病毒亚型的病毒都有明确的效果。
材料和方法：
细胞和病毒：
Vero细胞在无血清条件下培养，所使用的培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的OptiProTM SFM。每2到3天以1∶3至1∶4的比例传代来培养细胞。所用的生长培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的SFM。
A/New Caledonia/20/99源自NIBSC，产品号码03/208，在MDCK细胞上传代3次。通过将源自MDCK的病毒在两性霉素B不存在下在Vero细胞中传代4次，使其适应在无血清Vero细胞上的生长。
A/Vienna/28/2006(H3N2)(一种A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒)分离自临床样品，在MDCK细胞上传代1次，随后先在两性霉素B存在下、又在两性霉素B不存在下，在无血清Vero细胞上传代5次。
B/Vienna/32/2006(一种B/Malaysia/2506/2004样病毒)分离自临床样品，在MDCK细胞中传代2次，然后在两性霉素B存在下传代6次以适应在无血清Vero细胞上生长。
效价测定(potent assay)
用TCID50(组织培养感染剂量)测定法滴定病毒，该测定法是一种基于细胞的测定法，允许在96孔板中统计学确定病毒效价。病毒被连续稀释，感染亚汇合的单层Vero细胞(96孔板)，在5μg/ml胰蛋白酶和250ng/ml两性霉素B存在下，在33℃(B型病毒)和37℃(A型病毒)下使病毒生长。保温3至6天后，检查孔中的细胞病变效应，根据Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27：493-497的公式计算滴度。
实施例2
一种B型病毒(B/Malaysia/2506/2004样)和一种A/H1N1病毒(A/NewCaledonia/20/99(H1N1)样ΔNS1)在两性霉素B存在和不存在下用两种不同方法滴定。在两种情况下都观察到该物质对最终病毒滴度的明确效果，如图2a和b所示。
在图2a中，B/Vienna/32/2006病毒(B/Malaysia/2506/2004样病毒)被连续稀释，用蚀斑测定法在250ng/ml两性霉素存在和不存在条件下平行滴定。33℃保温5天后，计算蚀斑，直接比较蚀斑数目。
在图2b中，A/New Caledonia/20/99(H1N1)样ΔNS1病毒被连续稀释，用TCID50测定法在250ng/ml两性霉素B存在和不存在条件下平行滴定。37℃保温3天后，评价孔的细胞病变效应，并计算滴度。
如图2a中所示，同样的病毒在两性霉素B存在下生长可使滴度高出2log以上。两性霉素B存在时，B型病毒滴度达到1E+08pfu/ml以上。这一结果清楚显示，通过添加该物质使蚀斑测定的敏感性显著提高。
在图2b中，在两性霉素B存在和不存在下用TCID50滴定A/H1N1病毒。这时同样观察到滴度显著提高，敏感性几乎提高1log。
材料和方法：
细胞和病毒：
Vero细胞在无血清条件下培养，所用的培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的OptiProTM SFM。每2到3天以1∶3至1∶4的比例在37℃、5％CO2下传代来培养细胞。
B/Vienna/32/2006源自于一种B/Malaysia/2506/2004样临床分离物，在MDCK细胞中分离(传代2次)，然后在两性霉素B存在下在33℃传代6次以适应在无血清Vero细胞上生长。
A/New Caledonia/20/99(H1N1)样ΔNS1病毒含有来自A/NewCaledonia/20/99(H1N1)病毒的表面蛋白质HA和NA以及来自A/PuertoRico/8/34的内部区段，而一部分NS(非结构性)区段被缺失。该病毒通过反向遗传学生成，在两性霉素B存在下在37℃在Vero细胞上传代。
效价测定
蚀斑测定
用蚀斑测定法滴定病毒。病毒被连续稀释，感染汇合的单层Vero细胞，覆盖层由Vero生长培养基组成，该培养基还补充有0.01％DEAE葡聚糖、10xDMEM、饱和碳酸氢钠、5μg/ml胰蛋白酶以及0或250ng两性霉素B。
TCID50测定
TCID50(组织培养感染剂量)测定法是一种基于细胞的测定法，允许在96孔板中用统计学方法确定病毒效价。病毒被连续稀释，感染亚汇合的单层Vero细胞(96孔板)，病毒在5μg/ml胰蛋白酶存在下，在250ng/ml两性霉素B存在或不存在下在37℃生长。保温3天后，检查孔中的细胞病变效应，根据Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27：493-497的公式计算滴度。
实施例3
在本实验中，Vero细胞用A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒感染后，添加不同剂量的两性霉素B。通过提高两性霉素B的浓度，病毒复制被提高，浓度在62.5-1000ng/ml时显示清楚效果。
亚汇合的无血清单层Vero细胞用A/Vienna/28/2006(H3N2)(A/Wisconsin/67/2005样)病毒以感染复数0.001感染。病毒在不同浓度的两性霉素B存在下生长，即两性霉素B 0、31.25、62.5、125、250、500和1000ng/ml。48小时后收获病毒，在250ng/ml两性霉素B存在下用TCID50测定滴定。
获得的滴度范围为8E+05至4E+07TCID50/ml。在两个最低浓度(0和31.25ng/ml)时，病毒滴度低于1E+06TCID50/ml，而在250和500ng/ml两性霉素B时，病毒滴度增加到超过3E+07TCID50/ml。对结果的示例性说明参见图3。
材料和方法：
细胞和病毒：
Vero细胞在无血清条件下培养，所用的培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的OptiProTMSFM。通过每2至3天以1∶3至1∶4比例传代，在37℃、5％CO2环境下培养细胞。
分离自临床样品的A/Vienna/28/2006(H3N2)(一种A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒)在MDCK细胞上传代1次，随后先在两性霉素B存在下、然后在两性霉素B不存在下，在无血清Vero细胞上传代5次。
效价测定
通过TCID50(组织培养感染剂量)测定法滴定病毒，该测定法是一种基于细胞的测定法，允许用统计的方法在96孔板中确定病毒效价。病毒被连续稀释，感染亚汇合的单层Vero细胞(96孔板)，在33℃(B性病毒)和37℃(A型病毒)，在5μg/ml胰蛋白酶和250ng/ml两性霉素B存在下，使病毒生长。保温3至6天后，检查孔中的细胞病变效应，根据Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27：493-497的公式计算滴度。
实施例4
用两性霉素B在转染后有效拯救病毒
在本实施例中，如Hoffman et al.所述但进行了若干改良(Hoffmann E.etal.，Proc Natl Acad Sci，2002，99：11411-6)，无血清Vero细胞用8个质粒转染，该8个质粒编码A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒的8个区段。6小时后添加含有250ng/ml两性霉素B和5μg/ml胰蛋白酶的生长培养基。转染后6天，当在两性霉素B存在的情况下生长的转染病毒中可以观察到清楚的细胞病变效应、并且在两性霉素B不存在的细胞中也可见细胞病变效应迹象时，收获部分病毒。没有两性霉素B的病毒又进一步监视3天，没有显示任何细胞病变效应进展的征兆。在250ng/ml两性霉素B存在下用TCID50测定法确定滴度。
如表1所说明的，在有两性霉素B存在的情况下获得2E+04TCID50/ml的滴度，而两性霉素B不存在时没有检测到病毒。
这一实施例清楚地显示，在没有两性霉素B的情况下无法生长的病毒仅在有两性霉素B的情况下就能被有效拯救。
材料和方法：
细胞和病毒：
Vero细胞在无血清条件下培养，所使用的培养基是补充有4mM L-谷氨酰胺的OptiProTM SFM。在37℃、5％CO2下每2至3天以1∶3至1∶4比例传代，来培养细胞。
A/Vienna/28/2006(H3N2)是一种来源于临床样品的A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒，在MDCK细胞上传代1次，随后先在两性霉素B存在下、又在两性霉素B不存在下在无血清Vero细胞上传代5次。病毒节段被克隆入质粒，这些质粒既能以病毒RNA作为模板转录成基因组，又能以病毒RNA作为模板转录成mRNA以进一步加工成病毒蛋白质(Hoffmann et al；Eight-plasmid system for the rapid generation of influenza virusvaccines，Vaccine(20).2002)，其中这些质粒被相应改进。所有8个质粒通过电穿孔转染入Vero细胞。转染6小时之后，添加含有5μg/ml胰蛋白酶以及分别含有0和250ng/ml两性霉素B的无血清培养基。6天后收获部分转染子病毒，并进一步观察3天。
效价测定
通过TCID50(组织培养感染剂量)测定法滴定病毒，该测定法是一种基于细胞的测定法，允许用统计学方法在96孔板中确定病毒效价。病毒被连续稀释，感染亚汇合的单层Vero细胞(96孔板)，病毒在33℃(B型病毒)和37℃(A型病毒)下，在5μg/ml胰蛋白酶和250ng/ml两性霉素B存在下生长。保温最多6天后，检查孔中的细胞病变效应，根据Reed L.J.et al.，1938，Am.J.Hyg.27：493-497的公式计算滴度。
表1显示转染后两性霉素B存在和不存在下的病毒拯救。Vero细胞用8个质粒转染，该8个质粒编码A/Wisconsin/67/2005(H3N2)样病毒的8个区段。转染6小时后，添加含有5μg/ml胰蛋白酶和0或250ng/ml两性霉素B的培养基。病毒用TCID50测定法滴定。
  添加两性霉素B[+/-]   滴度[TCID50/ml]
  +   2.0E+04
  -   ＜1.0E+01
实施例5
在Vero细胞中利用两性霉素B从临床样品中分离病毒：
来自患有已证实的B型流感病毒感染患者的9个临床样品被用来评价两性霉素B存在或不存在下Vero细胞中的病毒分离频率。不添加两性霉素B时，只成功分离到3个样品中的病毒。而当维持培养基中添加500ng/ml两性霉素B时，所有9个探测物都是阳性的。

Claims (19)

1.两性霉素B作为繁殖A型或B型流感病毒的培养物补充物的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中所述两性霉素B浓度为0.5ng/ml-5μg/ml。
3.根据权利要求1的用途，其中所述两性霉素B浓度为0.5ng/ml-2.5μg/ml。
4.根据权利要求1的用途，其中所述两性霉素B浓度为10ng/ml-900ng/ml。
5.根据权利要求1的用途，其中所述两性霉素B浓度100ng/ml-500ng/ml。
6.根据权利要求1的用途，其中所述两性霉素B浓度为200ng/ml-400ng/ml。
7.根据权利要求1-6之一的用途，其中所述病毒在NS1和/或PB1基因内含有修饰。
8.根据权利要求7的用途，其中所述修饰是缺失、置换或插入至少一个核酸。
9.根据权利要求1至8中任何一项的用途，其中病毒的繁殖用到了细胞，所述细胞选自由BSC-1细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、CHO细胞、COS细胞、鼠类细胞、HeLa细胞、293细胞、VERO细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、MDOK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、TCMK细胞、LLC-PK细胞、PK15细胞、W1-38细胞、MRC-5细胞、T-FLY细胞、BHK细胞、SP2/0细胞、NS0、人视网膜细胞PerC6、鸡胚细胞或衍生物、含胚卵细胞、鸡的含胚卵或其衍生物组成的组。
10.根据权利要求1至9中任何一项的用途，其包含病毒生长提高至少0.1log10。
11.根据权利要求1至9中任何一项的用途，其包含病毒生长提高至少0.5log10。
12.根据权利要求1至9中任何一项的用途，其包含病毒生长提高至少1log10。
13.根据权利要求1至9中任何一项的用途，其包含病毒生长提高至 少2log10。
14.根据权利要求1至9中任何一项的用途，其包含病毒生长提高至少2.5log10。
15.两性霉素B用于用含有A型或B型流感病毒RNA节段的表达质粒转染Vero细胞的用途。
16.对细胞进行感染以培养A型或B型流感病毒的方法，其使用两性霉素B，其包含下列步骤：
a)用A型或B型流感病毒的至少一个感染性病毒粒子感染细胞，
b)将两性霉素B与胰蛋白酶一起加入到接种物和/或培养基中，
c)在适当条件下保温，继之以
d)收获所产生的病毒，并且任选
e)纯化和/或鉴定该病毒。
17.药物制剂，包含A型和/或B型流感病毒的减毒活病毒和两性霉素B。
18.根据权利要求17的药物制剂用于制备治疗流感感染的药物组合物的用途。
19.从临床样品分离A型或B型流感病毒的方法，其中
a)在两性霉素B存在的情况下，细胞用来自患者呼吸道的病毒粒子感染，
b)在两性霉素B存在的情况下，在适当的条件下保温细胞，以促进A型或B型流感病毒生长，并
c)分离和鉴定该A型或B型流感病毒。 
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