JP2011502466A - ウイルス産生のための培地栄養補助剤 - Google Patents
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Abstract
Description
従来の技術によると、マクロライド系ポリエン抗生物質は抗真菌特性を示すことが知られており、動物およびヒト患者における真菌感染の処置および予防に広範に用いられている。
a) 細胞を少なくとも1つの感染性ウイルス粒子に感染させる、
b) マクロライド系ポリエン抗生物質およびそれらの誘導体または類似体を、トリプシンとともに接種および/または培養培地に加える、
c) 適切な条件下におけるインキュベーション、次いで
d) ウイルス産物の収集、および必要であれば
e) ウイルスの精製および/または特徴決定。
実施例
(http://www.who.int/csr/disease/influenza/vaccinerecommendations1/en/)
細胞およびウイルス:
Vero細胞は無血清条件にて培養し、用いた培地は4 mMのL-グルタミンを補足したOptiPro(商標)SFMである。細胞は2〜3日毎に1:3〜1:4の割合で継代して培養する。用いた成長培地は4 mM L-グルタミンを補足したSFMである。
ウイルスの力価測定は、TCID50(組織培養感染量)アッセイ(96ウェルプレートにおいてウイルスの効力の統計学的測定が可能な、細胞に基づくアッセイ)により行った。ウイルスを連続的に希釈し、Vero細胞のサブコンフルエントの単層(96ウェルプレート)に感染させ、ウイルスを5μg/mlのトリプシンおよび250 ng/mlのアムホテリシンBの存在下、33℃(B型ウイルス)および37℃(A型ウイルス)にて成長させる。3〜6日間のインキュベーションの後、ウェルを細胞変性効果についてチェックし、力価をReed L.J. et al., 1938, Am.J.Hyg.27:493-497による式に基づいて算出する。
細胞およびウイルス:
Vero細胞は無血清条件にて培養し、用いた培地は4 mMのL-グルタミンを補足したOptiPro(商標)SFMである。細胞を、37℃、5%CO2にて、2〜3日毎に1:3〜1:4の割合で継代して培養する。
プラークアッセイ
ウイルスの力価測定をプラークアッセイにより行う。ウイルスを連続的に希釈し、Vero細胞のコンフルエントの単層に感染させ、オーバーレイは0.01%DEAE Dextrane、10x DMEM、飽和炭酸水素ナトリウム、5μg/mlのトリプシンおよび0または250 ngのアムホテリシンBを補足したVero成長培地からなる。
TCID50(組織培養感染量)アッセイは、96ウェルプレートにおいてウイルスの効力を統計学的に測定することができる細胞に基づくアッセイである。ウイルスを連続的に希釈し、Vero細胞のサブコンフルエントの単層(96ウェルプレート)に感染させ、ウイルスを 5μg/mlのトリプシンの存在下において、および250 ng/mlのアムホテリシンBの存在下または非存在下において、37℃にて成長させる。3日のインキュベーション期間の後、ウェルを細胞変性効果についてチェックし、力価をReed L.J. et al., 1938, Am.J.Hyg.27:493-497による式に基づいて算出する。
細胞およびウイルス:
Vero細胞は無血清条件にて培養し、用いた培地は4 mMのL-グルタミンを補足したOptiPro(商標)SFMである。細胞を37℃、5%CO2にて2〜3日毎に1:3〜1:4の割合で継代して培養する。
ウイルスの力価測定をTCID50(組織培養感染量)アッセイ(96ウェルプレートにおいてウイルスの効力の統計学的測定ができる細胞に基づくアッセイ)により行う。ウイルスを連続的に希釈し、Vero細胞のサブコンフルエントの単層(96ウェルプレート)に感染させ、ウイルスを5μg/mlのトリプシンおよび250 ng/mlのアムホテリシンBの存在下、33℃(B型ウイルス)および37℃(A型ウイルス)にて成長させる。3〜6日間のインキュベーションの後、ウェルを細胞変性効果についてチェックし、力価をReed L.J. et al., 1938, Am.J.Hyg.27:493-497による式に基づいて算出する。
この実施例において、Hoffmanらにより報告されているように(いくつかの変更を含む)、無血清Vero細胞をA/Wisconsin/67/2005(H3N2)様ウイルスの8分節をコードする8プラスミドによりトランスフェクトする(Hoffmann E. et al., ProcNatlAcadSci, 2002, 99:11411-6)。250 ng/mlのアムホテリシンBおよび5μg/mlのトリプシンを含有する成長培地を6時間後に加える。6日間のトランスフェクション後、アムホテリシンBの存在下において成長したトランスフェクトされたウイルスの明確な細胞変性効果が観察され、アムホテリシンBの非存在下においても細胞変性効果のサインが見える時に、ウイルスを部分的に収集する。アムホテリシンB非存在下のウイルスをさらに3日間モニターすると、細胞変性効果が進行している何らかのサインは示されない。力価を250 ng/mlのアムホテリシンBの存在下においてTCID50アッセイにより測定する。
細胞およびウイルス:
Vero細胞は無血清条件にて培養し、用いた培地は4 mMのL-グルタミンを補足したOptiPro(商標)SFMである。細胞を37℃、5%CO2にて2〜3日毎に1:3〜1:4の割合で継代して培養する。
ウイルスの力価測定を、TCID50(組織培養感染量)アッセイ(96ウェルプレートにおいてウイルス効力を統計学的に測定できる細胞に基づくアッセイ)により行った。ウイルスを連続的に希釈し、Vero細胞のサブコンフルエントの単層(96ウェルプレート)に感染させ、ウイルスを5μg/mlのトリプシンおよび250 ng/mlのアムホテリシンB の存在下において33℃(B型ウイルス)および37℃(A型ウイルス)にて成長させる。6日までのインキュベーション期間の後、ウェルを細胞変性効果についてチェックし、力価をReed L.J. et al., 1938, Am.J.Hyg.27:493-497による式に基づいて算出する。
インフルエンザB型ウイルス感染が確認された患者からの9臨床サンプルを、アムホテリシンBの存在下または非存在下においてVero細胞におけるウイルス単離の頻度について評価した。アムホテリシンBを加えなかった場合、3検体からのウイルスのみが成功裡に単離された。500 ng/mlのアムホテリシンBを保持培地に加えた場合、9プローブ全てが同時に陽性であった。
Claims (17)
- ウイルスの増殖のための培養栄養補助剤としての、マクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体の使用。
- マクロライド系ポリエン抗生物質がアムホテリシンBまたはそれらの誘導体もしくは類似体である、請求項1に記載の使用。
- マクロライド系ポリエン抗生物質が、0.5 ng/ml〜5μg/ml、好ましくは0.5 ng/ml〜2.5μg/ml、好ましくは10 ng/ml〜900 ng/ml、より好ましくは100ng/ml〜500 ng/ml、より好ましくは200 ng/ml〜400 ng/mlの濃度である、請求項1または2に記載の使用。
- ウイルスがDNAまたはRNAウイルスである、請求項1〜3のいずれかに記載の使用。
- ウイルスが、オルトミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、トガウイルス科またはパラミクソウイルス科のファミリーのメンバーである、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
- RNAウイルスが、インフルエンザA型ウイルス、インフルエンザB型ウイルス、インフルエンザC型ウイルス、ライノウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルスまたはパラインフルエンザウイルス、およびそれらの誘導体または類似体またはフラグメントからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の使用。
- RNAウイルスが、NS1および/またはPB1遺伝子内に修飾を含有する、請求項1〜6のいずれかに記載の使用。
- 前記修飾が、少なくとも1つの核酸欠失、地下または挿入である、請求項1〜7のいずれかに記載の使用。
- ウイルスが腫瘍溶解ウイルスである、請求項1〜8のいずれかに記載の使用。
- 細胞が、BSC-1細胞、LLC-MK細胞、CV-1細胞、CHO細胞、COS細胞、ネズミ細胞、ヒト細胞、HeLa細胞、293細胞、VERO細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、MDOK細胞、CRFK細胞、RAF細胞、TCMK細胞、LLC-PK細胞、PK15細胞、Wl-38細胞、MRC-5細胞、T-FLY細胞、BHK細胞、SP2/0細胞、NS0、PerC6(ヒト網膜細胞)、ニワトリ胚細胞またはそれらの誘導体、有胚卵細胞、有胚ニワトリ卵またはそれらの誘導体からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれかに記載の使用。
- 少なくとも0.1 log10、好ましくは少なくとも0.5 log10、より好ましくは少なくとも1 log10、より好ましくは少なくとも2 log10、さらにより好ましくは少なくとも2.5 log10のウイルス成長の増加を含む、請求項1〜10のいずれかに記載の使用。
- ウイルスのRNA分節を含有する発現プラスミドによるVero細胞のトランスフェクションのための、マクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体の使用。
- マクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体を用いるウイルス培養のために細胞を感染させる方法であって、以下の工程を含む方法:
a)細胞を少なくとも1つの感染性ウイルス粒子に感染させる、
b)マクロライド系ポリエン抗生物質およびそれらの誘導体または類似体をトリプシンとともに接種菌液および/または培養培地に加える、
c)適切な条件下におけるインキュベーション、次いで
d)ウイルス産物の収集、および必要に応じて
e)ウイルスの精製および/または特徴決定。 - 生きた弱毒化ウイルスおよび少なくとも1つのマクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体を含む医薬製剤。
- ウイルス粒子がインフルエンザウイルスおよび腫瘍溶解ウイルスからなる群から選択される、請求項14に記載の医薬製剤。
- ウイルス性癌の治療またはインフルエンザ感染の処置のための、請求項14または15に記載の医薬製剤の使用。
- a)マクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体の存在下において細胞を患者の気道からのウイルス粒子に感染させ、
b)ウイルスの成長を促進するために、マクロライド系ポリエン抗生物質またはそれらの誘導体もしくは類似体の存在下において適切な条件下にて細胞をインキュベートし、
c)ウイルスを単離し、特徴決定する、
臨床サンプルからウイルスを単離する方法。
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