JP5469710B2 - ウイルス増殖用の非腫瘍形成性mdck細胞株 - Google Patents
ウイルス増殖用の非腫瘍形成性mdck細胞株Info
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Description
本発明は、ワクチン物質の生産に利用することのできる新規非腫瘍形成性MDCK細胞に関する。非腫瘍形成性MDCK細胞は無血清培地に適応することができる。本発明は、さらに非腫瘍形成性MDCK細胞の増殖用培地処方物及び培養方法、並びに本発明の細胞株の非腫瘍形成性質を維持する方法に関する。本発明は、さらに非腫瘍形成性MDCK細胞を用いた細胞培養でのインフルエンザウイルスの生産方法に関する。本発明はまた、記載された方法によって得ることができるウイルス(例えば、インフルエンザ)、及びこのタイプのウイルスを含む免疫原性組成物及び/又はその成分に関する。
ワクチン接種は、年1度のインフルエンザの流行によりもたらされる病気を予防する上で最も重要な公衆衛生措置である。ワクチンの効率的な利用は、大量のワクチン物質(例えば、ウイルス)を、安定かつ培養の容易な供給源からすばやく生産できることに依る。ワクチンの早急な開発とそれらを十分に利用できるようにすることは、ヒト及び動物の多くの病気に対抗する上で重要である。ワクチン生産の遅延やその量の不足は、病気の発生に対処する上で問題となり得る。例えば、最近の研究では世界的流行性(パンデミック)インフルエンザに対するワクチンの生産に長期の準備期間を要することについての心配が示唆されている。例えば、非特許文献1(Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 356:1953)を参照のこと。効率的なワクチン生産には、宿主系から高収量で生産されるワクチン物質の大量増殖が必要である。異なるワクチン物質から満足のいく収量を得るためには異なる増殖条件が必要となる。ワクチン物質は、孵化卵、初代組織培養細胞、又は株化細胞で生産することができる。しかし、これらの宿主系は、現在以下で詳述する多くの制限を受けている。
本発明は、動物性タンパク質非含有(animal protein-free:APF)の製剤を含む血清含有又は無血清の培地処方物のいずれかで増殖するのに適応した非腫瘍形成性MDCK細胞を提供する。一の実施形態において、本発明の非腫瘍形成性MDCK細胞は付着性である。他の実施形態において、本発明の非腫瘍形成性MDCK細胞は、上皮形態を有している。さらに他の実施形態において、本発明の非腫瘍形成性MDCK細胞は付着性で、かつ上皮形態を有している。発癌性が一の実施形態において、アダルトヌードマウスモデルで実証された(例えば、Stilesら,1976, Cancer Res, 36:1353、及び後述の実施例2)。発癌性については、例えば、鶏胚への注入、及び/又は漿尿膜への局所適用による他のアッセイででもテストすることができる(Leightonら,1970, Cancer, 26:1024)。
本発明は、一部には、MDCK細胞を非腫瘍形成性の状態に維持する条件の下で培養できるという発見に基づく。本発明は、無血清培地処方物を包含する様々な細胞培養条件に適応し、また本明細書で「本発明の細胞」と呼ぶMDCK細胞株及びその他の細胞型を含む非腫瘍形成性細胞株を提供する。さらに、本発明は、本発明の細胞、及びその他の成分を含む細胞培養(cell culture)組成物を提供する。ここで言うその他の成分は、培地(例えば、本明細書で開示された培地)、培地成分、バッファ、化合物、その他の細胞型、ウイルス物質(例えば、ウイルスゲノム、ウイルス粒子)、及び異種タンパク質を含むが、これらに限定されない。本発明は、MDCK細胞を含む、一以上の特有の性質をもった非腫瘍形成性細胞の培養に有用な方法及び培地処方物も提供する。ここで言う特有の性質は、非腫瘍形成性であること(例えば、ヌードマウスで小結節を形成しないこと)、及び/又は付着性細胞として増殖すること、及び/又は上皮様形態を呈すること、及び/又は様々なウイルスの複製を支持することを含むが、これらに限定はされない。また、前記様々なウイルスは、オルソミクソウイルス(orthomyxovirus)、パラミクソウイルス(paramyxovirus)、ラブドウイルス(rhabdovirus)及びフラボウイルス(flavovirus)を含むが、これらに限られない。本発明の培養条件は、血清含有及び無血清培地処方物と共に動物性タンパク質非含有(APF)製剤を含む。さらに本発明は、MDCK細胞を含む非腫瘍形成性細胞でワクチン物質(例えば、インフルエンザウイルス)を生産する方法、非腫瘍形成性細胞からワクチン物質を調製すること、及び非腫瘍形成性細胞で生産されたワクチン物質を利用してインフルエンザ感染を予防する方法も提供する。本発明の細胞は、他の哺乳動物細胞株(例えば、Vero、PerC6、HEK-293、MRC-5及びWI-38細胞)中で効率的に複製されない低温適応性/温度感受性/弱毒性(ca/ts/att)インフルエンザ株(例えば、FluMist(登録商標)のウイルス株)の生産に特に有用である。
本発明に係る細胞は、一の実施形態において脊椎動物細胞である。他の実施形態において、本発明の細胞は、例えばハムスター、ウシ、サル又はイヌ由来の哺乳動物細胞であり、特に腎臓細胞又はそれ由来の細胞株である。さらなる他の実施形態において、本発明の細胞は、(例えば、ATCC CCL-34 MDCK由来の)MDCK細胞であり、具体的には本明細書中で「本発明のMDCK細胞」と称され、また「本発明の細胞」の用語に包含される。具体的実施形態において、本発明の細胞はATCC CCL-34 MDCK由来である。本発明の細胞は、当業分野で周知の方法によるCCL-34 MDCK細胞由来の細胞であってもよい。例えば、まずCCL-34 MDCK細胞を血清含有培地(例えば、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎仔血清(FBS)+4mMグルタミン+4.5g/Lグルコース、又は本明細書に記載の他の培地)で限られた回数継代し、続いて個々の細胞をクローニングし、そのクローンを特徴付けてもよい。倍加時間、発癌性の特徴、及びウイルス生産を含むがこれらに限定されない生物学的及び生理学的に優れた特性をもつクローンを、マスター細胞バンク(master cell bank:MCB)生成用に選択する。一の態様において、本発明の細胞は、選択した培地(例えば、本明細書に記載したような無血清又はAPF培地)での増殖に適応している。このような適応は、個々の細胞のクローニング前、クローニング時、又はクローニング後に起こり得る。特定の実施形態において、本発明の細胞は、MediV SF101、MediV SF102、MediV SF103、MediV SF104、又はMediV SF105で増殖できるように適応している。これらの培地での増殖に適応した本発明の細胞を、本明細書では、それぞれ「MDCK-SF101、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104、そしてMDCK-SF105」細胞と呼び、また、まとめて「MDCK-SF細胞」と呼ぶ。他の実施形態において、本発明の細胞は、血清含有培地(例えばダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)+10%ウシ胎仔血清(FBS)+4mMグルタミン+4.5g/Lグルコース)で増殖するように適応しており、そのような細胞を本明細書では「MDCK-S」細胞と呼ぶ。MDCK
-SF細胞及びMDCK-S細胞はまた、「本発明の細胞」及び「本発明のMDCK細胞」の用語に包含される。
エンザウイルス(例えばca/ts株)の複製を少なくとも6.0、少なくとも6.2、少なくとも6.4、少なくとも6.6、少なくとも6.8、少なくとも7.0、少なくとも7.2、少なくとも7.4、少なくとも7.6、少なくとも7.8、少なくとも8.0、少なくとも8.2、少なくとも8.4、少なくとも8.6、少なくとも8.8、少なくとも9.0、少なくとも9.2、少なくとも9.4、少なくとも9.6、又は少なくとも9.8のlog10 TCID50/mLにまで支持する。
本発明は、血清含有培地での非腫瘍形成性MDCK細胞の培養の方法及び培地処方物を提供する。本発明はまた、APF培地処方物を含む無血清培地での非腫瘍形成性MDCK細胞の適応方法、及びその後の培養方法も提供する。本発明のいくつかの態様において、前記培地はMDCK細胞が培養時に一以上の特性を維持するように処方されている。ここでいう一以上の特性は、非腫瘍形成性であること、付着性細胞として増殖すること、上皮様形態を有すること、及び様々なウイルスの複製を支持することを含むが、これらに限られない。本明細書で開示した培地処方物又はそれらの成分は、細胞培養組成物中に存在し得ることが意図されている。
本発明は、血清含有又は無血清培地処方物(上記)でのMDCK細胞(好ましくは非腫瘍形成性)、及びその他の動物細胞(腫瘍形成性又は非腫瘍形成性)の培養方法を提供する。特に、さらなる培養条件として、MDCK-S細胞及びMDCK-SF細胞を非腫瘍形成性状態で維持する役割を果たし得ることが意図されている。これらの培養条件は、付着表面の選択、細胞密度、温度、CO2濃度、培養方法、溶存酸素含有量、及びpHを含む。ただし、これらに限定はされない。
本発明は、本発明のMDCK細胞を使用する細胞培養でのウイルス生産の方法(本明細書では以降「本発明の方法」と呼ぶ)を提供する。一の実施形態において、本方法は以下のステップ、すなわち
i) 培養培地中で本発明のMDCK細胞の増殖させるステップ、
ii) 細胞にウイルスを感染させるステップ、及び
iii) さらなる培養期の後、非腫瘍形成性細胞内で複製されたウイルスを単離するステップ、
を含む。
本発明は、さらに本発明の方法で得ることのできるウイルス(例えばインフルエンザ)に関する。これらのウイルスを既知の方法で製剤化し、ヒトや動物に投与するワクチンを提供することができる。ウイルスは、完全ウイルス粒子(例えば、弱毒化した生ウイルス)として、又は不活性化/非組込み型ウイルス(例えば、ホルムアルデヒド、界面活性剤で処理したウイルス)として存在し得る。任意で、既知のウイルス成分(例えば、タンパク質)を当業者に既知の方法でウイルスから分離し、ワクチンの調製に使用することができる。
本明細書に記載の方法、工程及び組成物は、主としてワクチン用のインフルエンザウイルスの生産に関係している。インフルエンザウイルスは、セグメント化した一本鎖RNAゲノムを含む内部のリボ核タンパク質コアと、マトリックスタンパク質によって裏打ちされた外部のリポタンパク質エンベロープから構成されている。A型インフルエンザ及びB型インフルエンザは、それぞれ8セグメントの一本鎖のマイナス鎖センスRNAを含んでいる。A型インフルエンザゲノムは11種のポリペプチドをコードしている。第1〜3セグメントは、RNA依存性RNAポリメラーゼを構成する3つのポリペプチドをコードしている。第1セグメントは、ポリメラーゼ複合体タンパク質PB2をコードしている。残るポリメラーゼタンパク質PB1及びPAは、それぞれ第2セグメント及び第3セグメントにコードされている。さらに、いくつかのインフルエンザ株の第1セグメントは、PB1コード領域内の別の読み取り枠から生成される小タンパク質PB1-F2をコードしている。第4セグメントは、感染中の細胞への接着及び侵入に関与する表面糖タンパク質ヘマグルチニン(HA)をコードする。第5セグメントは、ウイルスRNAと結びつく主要な構造成分であるヌクレオカプシドヌクレオタンパク質(NP)ポリペプチドをコードしている。第6セグメントは、エンベロープ糖タンパク質ノイラミニダーゼ(NA)をコードしている。第7セグメントは、異なるスプライシングを受けたmRNAより翻訳される2種の基質タンパク質M1及びM2をコードしている。第8セグメントは、選択的スプライスシングを受けたmRNAから翻訳される2種の非構造タンパク質NS1及びNS2をコードしている。
株細胞におけるca/tsインフルエンザ株の感染拡大の測定とMDCK細胞で生産されるインフルエンザの特徴解析
卵を利用しない代替生産プラットフォームの開発や動物又は昆虫の培養細胞系でのインフルエンザワクチンの生産にはワクチン業界の努力があった。明らかな利点として、スケールアップが簡単なことと、工程制御が増えたこと、及びいくつかのワクチンでアレルギー反応の原因となっていた卵タンパク質の排除が挙げられる。細胞培養に基づく系は、スケールアップが素早くできるので、卵の供給不足が予想されると共にワクチンの迅速な生産が必要とされるインフルエンザの世界的流行時にさらなる利点を提供する。最初の実験では、計7種の異なる株細胞を用いて行った。すなわち、2種の二倍体肺線維芽細胞株(MRC-5株とWI-38株)(データは示さず)、ヒト網膜芽細胞腫及びヒト腎臓細胞株(それぞれPER.C6株と293株;通常これらはいずれもアデノウイルス産物の生産用に構築された)(データは示さず)、胎児アカゲザル肺細胞株(FRhL2)(データは示さず)、アフリカミドリザル腎臓由来細胞株(Vero)、及びMarin-Darbyイヌ腎臓由来(MDCK)細胞株である。MDCK細胞は、低温適応性、温度感受性、弱毒性(ca/ts/att)のリアソータントインフルエンザウイルス株H1N1、H3N2、潜在的パンデミックワクチン株H5N1、そしてB型株の4種全てを商業的に妥当なタイター(>107 Log TCID50/mL)まで増やすことのできることを試験した唯一の細胞株である(図1、データは示さず)。MDCK細胞で増殖したウイルスの遺伝学的な及び抗原性の特徴を卵で増殖したウイルスのそれと比較した。ゲノム配列に有意な差異は見られなかった(データは示さず)。またHAIタイターで測定された抗原性は同程度であった(表1)。
MDCK細胞及びVero細胞を96ウェルブラックプレートで4日間増やした(DMEM+4 mMグルタミン+PEN/Strep)。各ウェルをca/ts B型ンフルエンザ株(B/HongKong/330/01、及びB/Yamanashi/166/98)で〜0.01のMOIにてDMEM+4mMグルタミン+60mU/mL TPCKトリプシン中で感染させた。ウイルスに感染したプレートを固定し、免疫染色した後、感染の広がりを以下のように測定した。ウイルスを含んだ培地を各プレートから除き、プレートを200μl/ウェルのDPBS(Ca2+/Mg2+非含有)で1回洗浄し、その後プレートを200μl/ウェルの冷やした4%(v/v)パラホルムアルデヒド/PBSで固定した。プレートを200μl/ウェルのDPBS(Ca2+/Mg2+非含有)で2回洗浄し、続いて細胞を一次抗体(0.1%サポニン+1%BSA/PBSで1:1000の比率で希釈したヒツジ抗Yamanashi B型、及びヒツジ抗HongKong B型)と共にインキュベートした。1時間のインキュベーションの後、一次抗体を除き、細胞をPBS中の0.1%Tween20で3回洗浄し、ウェルを二次抗体(0.1%サポニン+1%BSA/PBSを用いて1:100の比率で希釈したFITC標識したウサギ抗ヒツジ抗体)と共にインキュベートした。ウェルを毎日4日間、蛍光顕微鏡を用いて視覚化し、画像を毎日SPOTプログラムを用いて取り込んだ。
蛍光焦点アッセイを用いて、MDCK細胞及びVero細胞でca/tsのB型インフルエンザ株の感染の広がりがあるか否かを評価した。また、50個のVeroクローン細胞間でウイルス感染の広がりに何らかの違いがあるかどうかも評価した。単分子層の蛍光は、MDCK細胞では4日間にわたって増加したが、Vero細胞では増加しなかったので(図1A参照)、Vero細胞はca/tsのB型株の生産に対して許容状態にないが、MDCK細胞は許容状態にあると結論付けられた。このデータは、B型株がMDCK細胞では7〜7.5log10TCID50生産されるが、Vero細胞ではわずか4〜4.5log10TCID50しか生産されないことを示した初期の実験データに類似している(データは示さず)。
非腫瘍形成性血清MDCK細胞の誘導
MDCK細胞は、昔からインフルエンザウイルスのタイトレーションに使用されてきた(Zambon著,1988,in Textbook of Influenza,Nicholson編, Webster and Hay, ch24, pg 324-332, Blackwell Science)。それ故、ワクチン物質生産のためインフルエンザの増殖用に使用することができた。しかし、MDCK細胞は、伝統的にFBSを追加したイーグル最小必須培地(Eagle’s Minimal Essential Medium;EMEM)のような基本培地処方物で増殖されていた。そのような条件下で及び/又は長期間インキュベートするとMDCK細胞が腫瘍形成性となる可能性があることを示した報告が多数ある(例えば、Gaushら,Proc Soc Exp Biol Med,122:931;Leightonら,1968,Science,63:472;及びLeightonら,1970,Cancer,26:1022を参照されたい)。ゆえに、ワクチン物質の生産にMDCK細胞を使用することについては懸念があり、その他の細胞株の開発(例えば、PER.C6及びVERO)に努力が向けられた。残念なことに、インフルエンザ株の全てが他の哺乳動物細胞株中で十分に増殖するわけではない。特に弱毒化されたインフルエンザ生ワクチンであるFluMist(登録商標)を含む低温適応したインフルエンザウイルスは、MDCK細胞内でのみ適当なタイター(>107 TCID50/mL)まで増殖できる(上記実施例1を参照)。MDCK細胞の特徴解析を行った初期の報告では、MDCK細胞の早期の継代では腫瘍形成性が起き得ないことを示している(Gaushら,1966, Proc Soc Exp Biol Med.122:931)。非腫瘍形成性の状態にMDCK細胞を維持する培地及び継代プロトコルを確立することが本実験の目標であった。
材料
MDCK細胞(ATCC, Cat. No:CCL-34);T-25、T-75、T-225フラスコ(Corning社、Cat No.: 430639, 430641, 431082);ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)粉末(Gibco社、Grand Island NY, Formulation No.:01-5052EF);ガンマ線照射済みウシ胎仔血清(JRH社、Lenexa KS, Cat. No.:12107-500M);L-グルタミン(JRH社、Lenexa KS, Cat. No.: 59202-100M);D-グルコース(Amresco社、Cat. No.:0188-1KG);Ca2+及びMg2+非含有のダルベッコリン酸バッファ(DPBS)(Gibco社、Grand Isand NY, Cat. No.:21600-069);0.05%トリプシン-EDTA(Gibco社、Grand Island NY, Cat. No.:25300);ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:D2650);0.4%(w/v)トリパンブルー染料/PBS溶液(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:T8154);CO2インキュベータ(Forma Scientific社、Model No.:3110);YSIバイオアナライザ(YSI社、Model No.: 2700 select);VITROS化学システム(Ortho clinic社、Model: DT60 II);改良型ノイバウア血球測定器(Hausser Scientific社、Bright-Line 0.1mm deep/Reichert, Bright-Line 0.1mm deep)。
血清MDCK細胞のバイアルをATCCから入手した。細胞をT-75フラスコ内の10%(v/v)FBS、4.5g/Lグルコース、2.2g/L NaHCO3、及び4mM L-グルタミンを追加したDMEM培地で増やした。細胞を接種後3〜4日で継代するとともに、もし細胞を4日目に継代するのであれば接種後3日目に全培地交換を行った。細胞を以下に記載のようにTフラスコから回収した。
MDCK-S細胞を上記のTフラスコ内でバンクに必要な細胞の総必要量を回収できるまで増やした(4×106細胞/バイアル×バイアル数)。MDCK-S細胞が対数増殖期にあるとき(接種後3日目)に記載したトリプシン処理によって当該細胞を回収した。個々のフラスコ由来のMDCK-S細胞の懸濁液をプールし、150〜250Gで7±1分間遠心して細胞を回収した。各チューブから上清を吸引して除き、沈殿した細胞を新しい完全成長培地(DMEM+10%FBS+4.5g/Lグルコース+4mMグルタミン)で再懸濁した。異なる遠心ボトル由来の細胞懸濁液をプールし、細胞懸濁液を適当なサイズのピペットで吸引/排出によって数回上下させ、大きな細胞塊をバラバラにした。総細胞数を測定し、4×106細胞/バイアルで冷凍できるバイアルの総数を決定した。
細胞を細胞成長曲線の実験前に少なくとも4回(解凍後)、成長培地にて継代した。MDCK-S細胞を、T-225フラスコ内で少なくとも総細胞数2.7×107個得るために増やした。フラスコを上記のトリプシン処理前にコンフルエントの80〜95%まで増やした。回収したMDCK-S細胞をプールし、細胞懸濁液をピペットで吸引/排出によって数回上下させ、大きな細胞塊をバラバラにした。2サンプル(0.5mL)を細胞カウント用に取り、細胞密度を測定した。2サンプルのカウントが、相互に15%以内にない場合には再度測定を行った。その後、総計2.7×107MDCK細胞を総量540mLの完全成長培地に希釈した(5.0×104細胞/mL)。それから、このMDCK-S細胞懸濁液を14本のT-75フラスコ(35mL/T-75フラスコ)に分注した。そのフラスコを37±1℃、5% CO2インキュベータに置いた。
核型試験は、フロリダ州メルボルンのApplied Genetics Laboratoriesで行われた。簡単に言えば、T-225フラスコで増殖したMDCK-S細胞をApplied Genetics Laboratories社に送った。細胞は上で記載した方法により維持され、また継代された。細胞が有糸分裂状態の細胞を十分に含んでいると思われるときは、その細胞を有糸分裂解析用に回収した。細胞をコルセミド(0.02μg/mL)で37℃にて150分間処理した。その後、細胞をトリプシン処理して回収し、200Gで5分間遠心した。上清を吸引にて除去し、予熱した低張溶液に再懸濁し、37℃で10分間インキュベートした。膨張した細胞を遠心で沈殿させ、それからCarnoy’s溶液(3:1 メタノール:氷酢酸)中で室温にて40分間インキュベートして固定した。細胞を再度遠心し、その後その細胞を少なくとも2回Carnoy’s固定剤で洗浄した。最後の遠心の後、細胞を1〜3mLの新しい固定剤で再懸濁し、乳白色の細胞懸濁液を生成した。最終細胞懸濁液の液滴をきれいなスライド上に落とし、風乾した。
MDCK-S PRE-MCBの静菌活性、及び静真菌活性をBioreliance Inc.社(ロックビル,メリーランド)でテストした。本アッセイは、US 26及びUS21 CFR 610.12要件を満たして行われた。本アッセイは、0.1 mLのテストサンプルを含む適当な培地とコントロール生物のみを含む培地に接種したコントロール生物(バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、クロストリジウム・スポロゲネス(Clostridium sporogenes)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、シュードモナス・エアルギノサ(Pseudomonas aeruginosa)、アスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger))の増殖と違いがあるか否かをテストするものである。簡単に言えば、被験物質を3本のTSB(大豆カゼイン分解培地)チューブ、4本のTHIO(fluid thioglycollate medium:流動性チオグリコール酸培地)、2本のSAB(Sabourand Dextrose Agar:Sabourandデキストロースアガー)、及び1本のPYG(peptone yeast extract:ペプトン酵母エクストラクト)に接種した。その後、100cfu未満のコントロール生物を含む各コントロール生物を適当なタイプの培地に接種した。ポジティブコントロールは、TSB及びTHIOのバチルス・サブチルス、TSB及びSAB(20〜25℃及び30〜35℃)のカンジダ・アルビカンス、THIO及びPYGのクロストリジウム・スポロゲネス、シュードモナス・エアルギノサ、及びアスペルギルス・ニガーからなる。ネガティブコントロールは、滅菌したPBSである。培地を3〜5日間インキュベートし、生物の増殖を確認した。
冷凍MDCK-S細胞のバイアル(MDCK preMCB lot No.747p105)をBioreliance社に送った。細胞は上記で説明したようにTフラスコ内で増やされて培養された。5×105cells/mLの濃度の細胞溶解物を調製し、−70℃で冷凍した。被験物質をマイコプラズマ・ニューモニエ(Mycoplasma pneumoniae)、マイコプラズマ・オラレ(Mycoplasma orale)、及びマイコプラズマ・ハイオライニス(Mycoplasma hyorhinis)の増殖を抑制する能力についてアガーブロス/プレートで、及び/又はVERO細胞内でテストした。
無胸腺ヌードマウス(nu/nu)における腫瘍形成の評価は、BioReliance(登録商標)(ロックビル、MD)によって行われた。簡単に説明すると、30匹のメス無胸腺マウス(4週齢)の皮下に、0.2mL(1×107細胞/マウス)のポジティブコントロール(18Cl-10T細胞)、ネガティブコントロール(シリアンハムスター胚細胞;SHE細胞)、又はテスト細胞(血清MDCK細胞、747p105高継代)を注射した。前記動物を注射前に無作為に選択し、全マウスに22ゲージ針を用いて同日に注射した。全動物を就業日に毎日観察し、注射部位を84日の期間、1週間に2回、病変発生の確認のため触診した。それぞれの病変を測定し、病変サイズの増加が見らる間は動物を維持した。この病変サイズの増加が見られる期間は、最大で3ヶ月間であった。84日後に全マウスを絞めて解剖し、注射部位、肺、肩甲リンパ節、及び全病変部を組織病理学的方法で解析した。
T-75フラスコに5×104細胞/mL(DMEM 35mL+10%FBS+4mMグルタミン)を接種し、37℃、5%CO2維持されたインキュベータで3日間、増やした。接種後3日目にTフラスコあたりの全細胞をトリプシンEDTAを用いて回収することによって測定した。また、細胞のカウントは、トリパンブルー分染排除法で測定した。残りのTフラスコは、その後次のように感染させた。増殖培地を吸引して除去し、細胞を1フラスコあたり10mLのDPBS(Ca2+/Mg2+なし)で2回洗浄した。0.01の感染多重度(MOI)でそれぞれのTフラスコに感染させるウイルス量を以下の方程式により測定した。
血清MDCK細胞の冷凍バイアル2本を、2本のT-75フラスコに分離して完全成長培地(DMEM+10% FBS+4mMグルタミン+4.5g/Lグルコース)中で解凍した。解凍による細胞生存率は、それぞれ97%と98%であった。細胞は、解凍後3日間でコンフルエントに達した。細胞形態は、上皮様で、ATCCより入手したストック株に似ていた(図3)。これらの細胞を5回継代し、血清増殖MDCK細胞(MDCK-S細胞)の前マスター細胞バンク(Pre-master cell bank;PreMCB)を樹立した。図2は、MDCK-Sの前マスター細胞バンク(PreMCB)の誘導に用いられる方法を概説している。
Taub培地における無血清MDCK細胞の誘導
上記実施例2で詳述した結果は、MDCK細胞を上皮形態及び正常な核型、同時に低温適応性インフルエンザ株を複製する能力を維持した状態で培養することが可能なことを証明している。さらに、本発明者らは、上記実験で開発された条件下でMDCK細胞を培養すると、非腫瘍形成性のMDCK細胞を生じることを立証した。しかし、実施例2で使用した培地は、ウシ胎仔血清(FBS)を含んでいる。FBSは、複合成分混合物であり、ロット間の変動の問題が報告されている。また、ウシの牛海綿状脳症(BSE)に伴う現在継続中の問題が、安全面での不安をもたらしている。MDCK-S細胞株の非腫瘍形成性の性質と増殖特性を維持する無血清培地の開発は、治療及び予防接種用に生産される生物製剤の安全性を高める上で重要である。
材料
MDCK細胞(ATCC, Cat. No:CCL-34);T-25、T-75、T-225フラスコ(Corning社、Cat No.: 430639, 430641, 431082);ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)粉末(Gibco社、Grand Island NY, 製剤番号:01-5052EF);Ham F12栄養素混合物粉末(Gibco社、Grand Island NY, 製剤番号:21700-075);ガンマ線照射済みウシ胎仔血清(JRH社、Lenexa KS, Cat. No.:12107-500M);L-グルタミン(JRH社、Lenexa KS, Cat. No. 59202-100M);D-グルコース(Amresco社、Cat. No.:0188-1KG);Ca2+及びMg2+非含有のダルベッコリン酸バッファ(DPBS)(Gibco社、Grand Isand NY, Cat. No.:21600-069);インスリン粉末(Serological社、Cat. No.4506);トランスフェリン(APO型)(Gibco社、Grand Island NY, Cat. No.:11108-016);プロスタグランジンE1(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:P7527);ヒドロコルチゾン(Mallinckrodt社、Cat. No.:8830(-05));トリヨードチロニン(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:T5516);亜セレン酸ナトリウム(EMD社、Cat. No.:6607-31);0.05%トリプシン-EDTA(Gibco社、Grand Island NY, Cat. No.:25300);ライマメ・トリプシンインヒビター(Worthington社、Cat. No.:LS002829);ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:D2650);0.4%(w/v)トリパンブルー/PBS溶液(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:T8154);改良型ノイバウェル血球測定器(Hausser Scientific社、Bright-Line 0.1mm deep/Reichert, Bright-Line 0.1mm deep);YSIバイオアナライザ(YSI社、Model No.: 2700 select);VITROS化学システム(Ortho clinic社、Model: DT60 II)。
Taub's培地(TaubとLivingston, 1981, Ann NY Acad Sci.,372:406)は、4.5 g/Lグルコース及び4mMグルタミンを含むDMEM/Ham F12(1:1)からなる無血清培地処方物を基礎培地処方として、表3に示したようなホルモン/因子を添加したものである。
5mg/mlのストック溶液は、適当量のインスリンを0.01NのHClに溶かして作製された。その溶液を0.2ミクロンの滅菌フィルターに通し、Nalgene社の冷凍バイアルに分注し、4℃で保存した。
5mg/mlのストック溶液は、適当量のトランスフェリンをMilliQ水に溶かして作製された。その溶液を滅菌フィルターに通し、その後Nalgene社の冷凍バイアルに分注し、<−20℃で保存した。
ストック溶液は、適当量のT3を0.02NのNaOHに溶かし、10−4M溶液を得ることによって作製された。このストック溶液を0.02NのNaOHでさらに5×10−9Mストック溶液の濃度にまで希釈し、滅菌フィルターに通し、その後Nalgene社の冷凍バイアルに分注した後、<−20℃で保存した。
10−3Mストック溶液は、適当量のヒドロコルチゾンを100%のEtOHに溶かして作製された。これをNalgene社の冷凍バイアルに分注した。そのバイアルを4℃で3〜4ヶ月間保存した。
50μg/mLのストック溶液は、適当量のプロスタグランジンE1を100%のEtOHに溶かして作製された。これをNalgene社の冷凍バイアルに分注した後、<−20℃で保存した。
10−2Mのストック溶液は、適当量のセレン化ナトリウムをWFI水、又はMilliQ水に溶かして作製された。これをさらに水で10−5の最終濃度にまで希釈し、滅菌フィルターに通し、その後、4℃で保存した。
ATCC由来のMDCK細胞の冷凍バイアル(継代54)を、無血清Taub's培地に継代する前に4.5g/Lグルコース、2.2g/L NaHCO3、及び4mM L-グルタミンを含んだ10%FBS DMEM培地で5回継代して増やした(上記のようにした)。T-75フラスコで増やした血清MDCKをトリプシン処理で回収した。使用した増殖培地を除き、細胞単分子層をDPBS(カルシウム及びマグネシウムなし)で2回洗浄した。その後、DPBSを廃棄した。適当量の予熱したトリプシン-EDTAを加え(3mL/T-75)、Tフラスコを37℃、5%CO2インキュベータで約15分間インキュベートした。フラスコを手のひらで数回叩き、細胞を完全に剥離させた。等量のライマメ・トリプシンインヒビターを加え、トリプシンを中和した後、サンプルを二つ取り、細胞懸濁液の細胞濃度を測定した。それから1.75×106細胞を新しいT75フラスコのTaub's培地35mLに希釈した。そのフラスコを5%CO2、37±1℃に維持された細胞培養インキュベータ内に入れた。細胞を接種後3日継代培養するか、全培地交換を接種後3日目に行い、続く4日目に継代した。
使用した培地を除き、細胞単分子層をDPBS(カルシウム及びマグネシウムなし)で2回洗浄した。適当量の予熱したトリプシン-EDTAを加え(3mL/T-75、7.5mL/T-225)、そのTフラスコを37℃、5%CO2インキュベータで約15分間インキュベートした。フラスコを手のひらで数回叩き、細胞を完全に剥離させた。その後トリプシンを、等量のライマメ・トリプシンインヒビターを加えること(3mL/T-75、7.5mL/T-225)によって阻害した。細胞懸濁液を適切なサイズのピペットで上下に吸引、排出をすることによって均質にした。0.5mLの二つの細胞懸濁液サンプルを、細胞数をカウントするために取った。二つのカウント結果がお互いに15%以内にない場合は、細胞のカウントを繰り返した。カウント後、細胞を新しいフラスコの予熱した新しいTaub's培地で0.05×106生細胞/mLに希釈し、総量35mL/T75、又は100mL/T-225とした。その後、フラスコを37±1℃、5%CO2の環境下でインキュベートした。細胞を3日目に新しいTフラスコに継代する(下記のように)か、又は全培地交換を行い、接種後4日目に新しいTフラスコに継代した。
Taub's無血清に適応したMDCK細胞株(MDCK-T)の前マスター細胞バンクを、上記実施例2のように調製した。ただし、2×冷凍培地はTaub's培地+15%DMSOとした。
MDCK-T pre-MCBの核型テスト、無菌テスト及びマイコプラズマテストを、実施例2に記載したように行った。ただし、血清含有完全培地の代わりにTaub's培地を使用した。さらに、T-75フラスコでのMDCK-T細胞の成長曲線の特徴、及びMDCK-T細胞での低温適応性インフルエンザ株の複製を、実施例2に記載したように行った。ただし、血清含有完全培地の代わりにTaub's培地を使用した。腫瘍形成能実験は、上記実施例2のようにBioRelianceによって継代88/29におけるMDCK-T(pre-MCB+20継代)で行われた。
MDCK-T preMCB(継代64/5)細胞の冷凍バイアルを、T-75フラスコ内の無血清Taub's培地中で解凍した。細胞生存率は97%であった。また5.25×106細胞を解凍時に冷凍バイアルから回収した。細胞は解凍後3日でコンフルエントに達した。細胞形態は、親細胞であるMDCK-S細胞に似た上皮様細胞形態を示した(図9)。
MDCK-T preMCBを細菌汚染、真菌汚染、又はマイコプラズマ汚染のいずれかの存在についてテストした。MDCK-T pre-MCBは無菌テスト(細菌及び真菌の汚染を確認するための直接接種法を用いた4培地無菌テスト)に合格し、マイコプラズマの存在(アガー培養可能、及び非アガー培養可能アッセイ)についてネガティブであることがわかった。被験物質は、静菌性/静真菌性テスト、及び静マイコプラズマ性テストのどちらもポジティブコントロールの増殖を阻害しないこともわかった。
MediV無血清培地における無血清MDCK細胞の誘導
実施例3で詳述した結果は、無血清Taub's培地での増殖に適応したMDCK細胞(MDCK-T)が卓越した増殖特性を有し、またca/tsインフルエンザ株の複製を支持できるものの、腫瘍形成性であることを証明している。それゆえ、これらの結果は、MDCK細胞が文献で報告された標準的な無血清培地処方で容易に形質転換し得ることを示している。本発明にしたがって、いくつかのさらなる無血清培地処方物を開発し、MDCK-S細胞の非腫瘍形成性の性質を維持する能力をテストした。MDCK-S細胞を、新しい無血清製剤MediV SFM101、102及び103のそれぞれに適応させた。これらの無血清適応細胞株を、それぞれMDCK-SF101、-SF102及び-SF103とし、まとめて「MDCK-SF」と呼ぶ。PreMCBを、各MDCK-SF適応細胞株について作製した。MDCK-SF細胞株PreMCBを、細菌/真菌汚染、及びマイコプラズマ汚染についてテストした(最終結果待ち)。またMDCK-SF preMCBを核型解析でもテストした。その結果、MDCK-SF101及びMDCK-SF102細胞は、78本の最頻値染色体数を有し、染色体数はそれぞれ70本〜82本、及び60本〜80本に及んでいた。さらに、それぞれの無血清培地バンク由来の細胞をPreMCBのバイアルから起こして少なくとも新たに20回継代した。そして、MDCK-SF103を核型及びインビボアダルトヌードマウスモデルでの腫瘍形成能についてテストした。継代87のMDCK-SF103は、78本の最頻値染色体数を有し、染色体数は66本〜80本に及んでいたことから、非腫瘍形成性であるとみなした。
材料
MDCK細胞(ATCC, Cat. No:CCL-34);T-25、T-75、T-225フラスコ(Corning社、Cat No.: 430639, 430641, 431082);ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)粉末(Gibco社、Grand Island NY, Formulation No.:01-5052EF);Ham F12栄養素混合物粉末(Gibco社、Grand Island NY, Formulation No.:21700-075);ガンマ線照射済みウシ胎仔血清(JRH社、Lenexa KS, Cat. No.:12107-500M);L-グルタミン(JRH社、Lenexa KS, Cat. No. 59202-100M);D-グルコース(Amresco社、Cat. No.:0188-1KG);Ca2+及びMg2+非含有のダルベッコリン酸バッファ(DPBS)(Gibco社、Grand Isand NY, Cat. No.:21600-069);インスリン粉末(Serological社、Cat. No.4506);トランスフェリン(APO型)(Gibco社、Grand Island NY, Cat. No.:11108-016);プロスタグランジンE1(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:P7527);ヒドロコルチゾン(Mallinckrodt社、Cat. No.:8830(-05));トリヨードチロニン(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:T5516);亜セレン酸ナトリウム(EMD社、Cat. No.:6607-31);0.05%トリプシン-EDTA(Gibco社、Grand Island NY, Cat. No.:25300);ライマメ・トリプシンインヒビター(Worthington社、Cat. No.:LS002829);ジメチルスルホキシド(DMSO)(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:D2650);0.4%(w/v)トリパンブルー/PBS溶液(Sigma社、St. Louis MS, Cat. No.:T8154);改良型ノイバウェル血球測定器(Hausser Scientific社、Bright-Line 0.1mm deep/Reichert, Bright-Line 0.1mm deep);YSIバイオアナライザ(YSI社、Model No.: 2700 select);VITROS化学システム(Ortho clinic社、Model: DT60 II)。
各MediV無血清培地処方物は、基礎培地としてTaub's培地(上記実施例2の方法の項参照)を用い、以下の補足剤を添加している。
ATCC由来のMDCK細胞の冷凍バイアルを、MediV SFM培地処方物(MediV SFM101、MediV SFM102、又はMediV SFM103)に継代する前に4.5g/Lグルコース、2.2g/L NaHCO3、及び4mM L-グルタミンを含んだ10%FBS DMEM培地で5回継代して増やした(上記のようにした)。T-75フラスコで増やした血清MDCKをトリプシン処理で回収した。使用した増殖培地を除き、細胞単分子層をDPBS(カルシウム及びマグネシウムなし)で2回洗浄した。その後、DPBSを廃棄した。適当量の予熱したトリプシン-EDTAを加え(3mL/T-75)、Tフラスコを37℃、5%CO2インキュベータで約15分間インキュベートした。フラスコを手のひらで数回叩き、細胞を完全に剥離させた。等量のライマメ・トリプシンインヒビターを加え、トリプシンを中和した後、サンプルを二つ取り、細胞懸濁液の細胞濃度を測定した。その後、1.75×106細胞を新しいT75フラスコ中の所望のMediV SFM培地35mLに希釈した。そのフラスコを5%CO2、37±1℃に維持された細胞培養インキュベータ内に入れた。細胞を接種後3日継代培養するか、全培地交換を接種後3日目に行い、続く4日目に継代した。細胞は、上記と同じ方法を用いたMediV SF104及びMediV SF105にも適応すると思われる。
使用した培地を除き、細胞単分子層をDPBS(カルシウム及びマグネシウムなし)で2回洗浄した。適当量の予熱したトリプシン-EDTAを加え(3mL/T-75、7.5mL/T-225)、Tフラスコを37℃、5%CO2インキュベータで約15分間インキュベートした。フラスコを手のひらで数回叩き、細胞を完全に剥離させた。その後、トリプシンを、等量のライマメ・トリプシンインヒビターを加えること(3mL/T-75、7.5mL/T-225)によって阻害した。細胞懸濁液を適切なサイズのピペットで上下に吸引、排出をすることによって均質にした。0.5mLの二つの細胞懸濁液サンプルを、細胞数カウント用に取った。二つのカウント結果がお互いに15%以内にない場合は、細胞のカウントを繰り返した。カウント後、細胞を新しいフラスコの予熱した適当な新しいMediV SFM培地処方物で0.05×106生細胞/mLに希釈し、総量35mL/T75、又は100mL/T-225とした。その後、フラスコを37±1℃、5%CO2の環境下でインキュベートした。細胞を3日目に新しいTフラスコに継代する(下記のように)か、又は全培地交換を行い、接種後4日目に新しいTフラスコに継代した。注記:MDCK-SF細胞については、いつもその細胞が適応したときと同じMediV SFM培地処方物で継代すること。
無血清適応MDCK細胞株の前マスター細胞バンクを、上記実施例1のように調製した。ただし、2×冷凍培地は適当なMediV SFM培地処方物+15%DMSOとした。
MDCK-SF pre-MCBの核型テスト、無菌テスト及びマイコプラズマテストを本明細書に記載の手順、例えば実施例2に記載の手順にしたがってテストした。ただし、血清含有完全培地の代わりに適当なMediV SFM培地処方物を使用した。さらに、T-75フラスコでのMDCK-SF細胞の成長曲線の特徴、及びMDCK-SF細胞での低温適応性インフルエンザ株の複製を、実施例2に記載したように実験した。ただし、血清含有完全培地の代わりに適当なMediV SFM培地処方物を使用した。さらに、腫瘍形成能実験が、さらなる継代(例えば、pre-MCB+20継代)の後に上記実施例2のような通常民間の受託業者(例えば、BioReliance)によってMDCK-SF細胞で行われ得る。
MDCK-SF101細胞及びMDCK-SF102細胞の核型を継代71/9で、またMDCK-SF103細胞の核型を継代87でテストした。MDCK-T、MDCK-SF101、及びMDCK-SF102の100個の中期細胞における染色体数の分布を図14に、またMDCK-SF103のそれを図19に示す。MDCK-T細胞は、MDCK-SF101、MDCK-SF102又はMDCK-SF103の各細胞(それぞれ70本〜82本、60本〜80本、及び66本〜80本)と比べると、染色体数が広範囲に広がる結果(52本〜84本)を示すことがわかった。MDCK-SF101、MDCK-SF102及びMDCK-SF103の各細胞の染色体数の広がりは、非腫瘍形成性MDCK-S血清増殖細胞(70本〜84本)で見られたものに非常に近い。これは、MediV SF101、MediV SF102、及びMediV SF103培地処方物が、当該製剤で増殖したMDCK細胞の正常な染色体数をより適切に維持できることを示唆している。
培養におけるヒト上皮細胞の感染
ヒト起源の細胞内におけるMDCK及び卵で作られたワクチンの複製後の生化学的、生物学的及び構造的類似性を評価するため、ワクチンを正常なヒト気管支上皮細胞(human bronchial epithelial cells:NHBE)等の関連二倍体ヒト細胞で1回継代する。この継代は、ヒトの気道内における感染の一形態を模倣するのに役立ち、また子孫ウイルスとの比較を可能にする。この子孫ウイルスは、詰まるところ免疫反応の有効な誘導に関与する。ワクチンのヘマグルチニン活性(結合及び融合)並びにノイラミニダーゼ活性を、電子顕微鏡法、感染総粒子率、ウイルスゲノムの等価性を含む他の生化学的及び構造的実験と共にこれらの材料で測定した。概して、これらの比較は、効率的かつ安全な卵で作られたワクチンに対する細胞由来ワクチンの比較可能性を証明するのに役立つ。細菌及び真菌汚染の有無をテストする方法は当該分野では周知であり、通常民間の受託業者(例えば、BioReliance(登録商標);Rockville, MD)で行われる。実施され得る分析的研究の概要は、表5にまとめた。
マスター細胞バンクの製造、テスト、及び特徴解析
マスター細胞バンク(MCB)の作製を始めるために、一以上の上記preMCB(実施例2〜4参照)由来の細胞を、生成する細胞が遺伝学的に一つの群に由来することを確実にするために限定希釈法により生物学的にクローン化した。その後、クローンを、倍化時間や関連する腫瘍形成性、そしてウイルス生産を含む様々な表現型特性についてスクリーニングした。最初の概念実証実験で、54個のMDCKクローンがFCSを含む培地で得られた。これらのクローンを継代し、それぞれを低感染多重度のca A/New Caledonia/20/99で感染させた。感染後数日して上清を取り出し、上清中のウイルス量をTCID50で測定した。少数のクローンは、クローンでない親細胞における生産を超える比較的高いタイターのウイルスを生産していた。生物学的及び生理学的に優れた特性を持つクローンをマスター細胞バンク(MCB)の樹立に使用した。
ワクチン物質の製法と製剤
近年認可されたポリオワクチンの生産に使用されるものに類似するスケールアップ性の高いマイクロキャリア技術の使用をMDCK細胞でのインフルエンザの生産に使用可能にした。デキストランでできた球状ビーズは、2〜10Lバイオリアクター内でMDCK細胞の増殖を支持するのに優れている。SFMV103培地中で増殖した親MDCK細胞は、Cytodex 1マイクロキャリアで、両スピナーフラスコのバッチモードで2×106核/mlの密度まで増殖することができることがわかった。また、MDCK細胞を最大10Lスケールのバイオリアクター内で1×106細胞/ml以上まで増やした(データ示さず)。最初のパイロットスケールでの稼動で、MDCK細胞が無血清法でワクチンインフルエンザ株を高タイターで生産できることが証明された。またそのタイターは、Tフラスコ内で血清増殖細胞を使用して得た生産性と同等か又はそれ以上であることがわかった。図20Aで示したように、250mLのスピナーフラスコ内のCytodexビーズ中で増殖したMDCK細胞は、高タイターのH1N1、H3N2及びB型ワクチン株を生産した。医療用製造については、インフルエンザウイルスをMDCK細胞内で20L〜150L規模で生産することができる。一方、商業規模生産の場合、2,500Lのバイオリアクターを利用することもできる。図20Bは、商業生産レベルまでスケールアップした細胞培養を利用できる一のプロセスを概説している。まず、使用する細胞バンクをT-75フラスコからT-225フラスコ、1Lスピナーフラスコ、20Lバイオリアクター、そして300Lバイオリアクターへと連続的に増やし、最終的には2500Lバイオリアクターにまで拡大する。最適細胞密度が得られたときに、培養液にマスターウイルス株を接種する。その後、ウイルスを培養液上清から一括回収する。
前臨床動物モデル
フェレットは丈夫な動物モデルで、弱毒化したインフルエンザワクチン及びワクチン株の成分の弱毒性、並びに免疫原性を評価するのに使用される。MCBから作られた細胞由来のインフルエンザ株の性能を、卵で作られた同一株と比較する。コントロール実験におけるこれらの材料の直接的な比較は、これらのウイルス産物の比較の確かさを高レベルにすることができる。
Claims (11)
- インフルエンザウイルスの生産方法であって、
(a) Taub’s培地、脂質及び小麦加水分解物を含有する無血清培地を含む細胞培養組成物中で、付着性かつ非腫瘍形成性のMDCK(Madin Darby Canine Kidney)細胞を増殖させる工程であって、ただし、Taub’s培地が、DMEMとHam’s F12の50:50混合培地、4.5g/Lのグルコース、2.2g/LのNaHCO 3 、4mMのL-グルタミン、5μg/mLのインスリン、5μg/mLのトランスフェリン、5pMのトリヨードチロニン、50nMのヒドロコルチゾン、25ng/mLのプロスタグランジンE1、及び10nMの亜セレン酸ナトリウムを含有する、前記工程、
(b) 前記MDCK細胞に、1種若しくはそれ以上のインフルエンザウイルスを感染させる工程、
(c) 前記細胞を、前記細胞培養組成物中でインキュベーションする工程、並びに、
(d) 前記細胞培養組成物から前記インフルエンザウイルスを単離する工程、
を含む前記方法。 - 前記無血清培地が、下記の(a)〜(c)の培地からなる群から選択される請求項1に記載の方法。
(a) MediV SF103培地、ただしこの培地は、Taub’s SF培地(DMEMとHam’s F12の50:50混合培地、4.5g/Lのグルコース、2.2g/LのNaHCO 3 、4mMのL-グルタミン、5μg/mLのインスリン、5μg/mLのトランスフェリン、5pMのトリヨードチロニン、50nMのヒドロコルチゾン、25ng/mLのプロスタグランジンE1、及び10nMの亜セレン酸ナトリウムを含有する培地)、1×最終濃度の脂質濃縮物、及び2.5g/Lの小麦ペプトンE1を含む培地である
(b) MediV SF104培地、ただしこの培地は、0.01μg/mLのEGFを含有するMediV SF103培地である
(c) MediV SF105培地、ただしこの培地は、トランスフェリンを含有せず、0.01μg/mLのEGF、及び10:1〜70:1の比率のクエン酸第二鉄アンモニウム:トロポロン又は硫酸第二鉄アンモニウム:トロポロンを含有するMediV SF103培地である - 前記MDCK細胞が、ATCC寄託番号PTA-6500として寄託されたMDCK-S細胞株由来であるか、或いは、ATCC寄託番号CCL34として寄託された細胞株由来である、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記MDCK細胞が、ATCC寄託番号PTA-6503として寄託されたMDCK-SF103細胞株由来である、請求項3に記載の方法。
- 前記MDCK細胞が、少なくとも20回継代されたものである、請求項3又は4に記載の方法。
- 前記MDCK細胞が、少なくとも50回継代されたものである、請求項5に記載の方法。
- 前記インフルエンザウイルスが、リアソータントインフルエンザウイルスである、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記リアソータントインフルエンザウイルスが、弱毒性、温度感受性又は低温適応性のマスター株の関係するヘマグルチニン抗原及び/又はノイラミニダーゼ抗原を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記マスター株が、A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66、PR8、B/Leningrad/14/17/55、B/14/5/1、B/USSR/60/69、B/Leningrad/179/86、B/Leningrad/14/55、及びB/England/2608/76からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記ヘマグルチニン抗原及び/又はノイラミニダーゼ抗原が、インフルエンザA型ゲノム由来である、請求項8又は9に記載の方法。
- 前記ヘマグルチニン抗原及び/又はノイラミニダーゼ抗原が、インフルエンザB型ゲノム由来である、請求項8又は9に記載の方法。
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