CN102181449B - 表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建方法及应用，从肝组织中获得hOCT1的野生型基因片段，定点突变获得P341L，M420del两个突变体基因片段，并与质粒载体连接，染入MDCK细胞，经G418抗性筛选，获得表达hOCT1野生型及两个突变体的细胞，再对细胞进行mRNA水平验证，并用hOCT1经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明的细胞模型可用于hOCT1的底物及抑制剂的筛选，预测药物在人体内的转运及可能发生的药物-药物相互作用。利用本发明提供的细胞模型可以预测该转运体的基因多态性对药物转运功能产生的影响，为临床合理用药、个性化用药提供依据。本发明设计合理，重复性好。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及稳定表达野生型及突变体人有机阳离子转运体1（hOCT1）的马丁达比狗肾上皮细胞（MDCK）模型的构建及应用。
技术背景
膜转运体是一类广泛分布于细胞膜上，通过主动或被动机制专门介导外源性和内源性化学物质进出的蛋白质，它们一般有饱和性和底物专属性。膜转运体为人们进行药物研究，尤其是在药效学、药动学、新药研发、药物靶向设计方面提供了一个新的、前景广阔的方向。有机阳离子/阴离子/两性离子转运家族（SLC22）在很多内源性胺类化合物及外源性物质包括很多临床应用的药物的转运和清除中发挥着重要作用。该家族中的多专属性有机阳离子转运体OCT1(SLC22A1)，是一个包含554个氨基酸的糖蛋白，包括12个跨膜区，N端和C端均位于细胞膜内侧，在第一个和第二个跨膜结构之间存在着一个较大的糖基化胞外环，在第六个和第七个跨膜结构之间有一个磷酸化位点的胞外环[1]，它的三维结构尚不明确。它在人体内主要分布于肝脏肝血窦一侧的肝细胞的基底外侧膜上，可以介导大量有机阳离子的吸收，对药物在肝脏中的处置起着重要作用。OCT1转运的经典底物有TEA (tetraethylammonium)、NMN(N-methylnicotinamide)、MPP+(1-methyl-4-phenylpyridinium)及一些药物如阿昔洛韦、金刚烷胺、地昔帕明、更昔洛韦、二甲双胍，甚至一些内源性物质如5-羟色胺，某些前列腺素。OCT1 的编码基因为SLC22A1，SLC22A1具有显著的遗传多态性，目前已在多个种族中发现了多个基因突变，其中相当一部分已被证实具有显著的临床意义。目前由转运体介导的药物转运已被认为是药物的第三相代谢，药物在转运体水平的相互作用也被认为是引起代谢性药物相互作用的主要原因之一。因此药物在研发阶段就需要了解其和转运体的关系。由于从动物实验得到的结果不能简单地外推到人，因此稳定表达人源性转运体的细胞模型是研究药物与转运体关系的高通量和有效的体外模型。本研究通过建立体外稳定表达hOCT1野生型及两个重要突变体的细胞模型，为体外研究hOCT1基因多态性对药物转运功能的影响，体外筛选hOCT1的底物及抑制剂的模型提供了理想的细胞模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定表达野生型及突变体人有机阳离子转运体1（hOCT1）的马丁达比狗肾上皮细胞（MDCK）模型（MDCK / hOCT1模型）的构建方法，通过以下步骤实现：
先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经RT-PCR获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamHⅠ，XhoⅠ两个酶切位点的特定引物（引物序列如SEQ ID No:4和5所示），获得人的野生型OCT1基因片段NM_003057，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，将该基因片段添A后与pMD19-T连接得pMD19-T/hOCT1质粒，再将其转入大肠杆菌DH5α进行质粒扩增，测序。测序正确，得到野生型基因后，以pMD19-T/hOCT1质粒为模板，通过定点突变（引物序列如SEQ ID No: 6-9所示），获得含hOCT1的两个突变体基因hOCT1P341L（其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示），hOCT1M420del（其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示）的质粒pMD19-T/hOCT1P341L，pMD19-T/hOCT1M420del，将质粒转入大肠杆菌DH5α进行质粒扩增，测序。测序正确后，将以上三种质粒通过大肠杆菌DH5α扩增，抽提质粒后，用BamHⅠ，XhoⅠ两个酶进行双酶切得到hOCT1, hOCT1P341L
,hOCT1M420del三个基因片段。将载体质粒pcDNA3.1(+)也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述三个目的基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将三个目的基因片段与载体片段连接，构建pcDNA3.1(+)- hOCT1，hOCT1P341L，hOCT1M420del三种质粒。再将质粒分别转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418抗性筛选，得到稳定表达hOCT1野生型及两个常见突变体的MDCK细胞，分别为MDCK/ hOCT1,MDCK/ hOCT1P341L,
/hOCT1M420del后，提取单克隆细胞株的总RNA，RT-PCR后通过前述hOCT1的特定引物4.5进行PCR，mRNA水平验证基因的表达，通过经典底物，4-二甲氨基苯乙烯基）-N-甲基吡啶及N-甲基-4-苯基吡啶，并以四乙胺为hOCT1抑制剂进行细胞的摄取及抑制实验验证细胞功能。
本发明的另一个目的是提供该MDCK/ hOCT1模型在有机阳离子转运体1的hOCT1底物及抑制剂筛选中的应用。通过以下步骤实现：以4-二甲氨基苯乙烯基-N-甲基吡啶作为经典hOCT1荧光底物，与待测药物同时孵育，通过荧光强度判断待测药物对该转运体的抑制能力，抑制率超过50%，可以初步认为待测药物为hOCT1的抑制剂。
本发明的积极效果是：（1）随着临床上很多活性胺类药物的应用，有机阳离子转运体将会在研究药物的转运方面发挥更重要的作用。本研究建立的细胞模型可作为hOCT1的底物或抑制剂的筛选模型，预测药物在人体内的转运；（2）由于临床合用药物的增多，转运体介导的药物相互作用已经引起人们的重视，利用该细胞模型可以预测由OCT1介导的药物间的相互作用；（3）利用本研究构建的野生型及突变体hOCT1细胞模型可以预测该转运体的基因多态性对药物转运功能产生的影响，为临床合理用药、个性化用药提供依据。
附图说明
图 1A 是 cDNA文库PCR产物电泳鉴定，条带1为MarkerⅢ，条带2、3为PCR产物电泳图。
图1B是PCR产物连T载体后转化入DH5α后菌液PCR电泳鉴定。
图1C是菌液抽提质粒的电泳鉴定。
图1D是鉴定正确的质粒双酶切后电泳鉴定。
图2A是pMD19-T/hOCT1质粒为模板定点突变的PCR产物电泳鉴定，M1为pMD19-T/hOCT1P341L, M2为pMD19-T/hOCT1M420del 。
图 2B是定点突变PCR产物胶回收后转化得到的菌液，PCR产物电泳鉴定。
图 2C是pMD19-T/hOCT1P341L ,pMD19-T/hOCT1M420del两种质粒的电泳鉴定。
图2D是pMD19-T/hOCT1P341L，pMD19-T/hOCT1M420del两种质粒的双酶切产物电泳鉴定。
图 3是pcDNA3.1(+)连hOCT1转化后的质粒(A)及酶切鉴定(B)电泳图。条带1为DL15000 Marker，条带2,3,4为三个质粒样品。
图4是pcDNA3.1(+)连hOCT1P341L转化后的质粒(A)及酶切鉴定(B)电泳图。条带1为DL15000 Marker，条带2,3，4,5为四个质粒样品。
图5是pcDNA3.1(+)连/hOCT1M420del转化后的质粒(A)及酶切鉴定(B)电泳图 条带1为DL15000 Marker，条带2,3,4,5为四个质粒样品。
图6是在有或无抑制剂TEA+（3mM/L）存在下，ASP+（5µmol/L）在MDCK/hOCT1（A）、MDCK/ hOCT1P341L（B）及MDCK/hOCT1M420del（C）中的积聚。
图7是未转染 hOCT1的MDCK细胞和积聚ASP+显著提高的MDCK/hOCT1（*1-31）、MDCK/ hOCT1P341L（*2-19）、MDCK/hOCT1M420del（*3-5）单克隆细胞，在有或无抑制剂TEA存在下与10μmol/L ASP+孵育后的荧光显微图像。
图8是在有或无抑制剂TEA（3mmol/L）存在下，MPP+（15µmol/L）在MDCK/hOCT1（A）、MDCK/ hOCT1P341L（B）及MDCK/ hOCT1M420del（C）中的相对积聚量。
图9是单克隆细胞cDNA PCR产物电泳鉴定，MDCK/hOCT1(A), MDCK/ hOCT1P341L
(B), MDCK/hOCT1M420del (C)，其中con为未转染hOCT1的MDCK细胞，*1-8,16,23,31,35为MDCK/hOCT1单克隆细胞；*2-8,19,27,30为 MDCK/ hOCT1P341L单克隆细胞；*3-5,6,10,11 MDCK/ hOCT1M420del单克隆细胞。
图10是药物对MDCK/hOCT1*1-31细胞积聚ASP+的影响。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例
1
1.
目的基因的制备
1.1
野生型目的基因的获得
(1) 根据人OCT1的DNA序列设计两条PCR引物。上下游引物分别设计一个酶切位点，BamHⅠ，XhoⅠ(下划线标出)
SEQ ID No:4 上游引物：ATGGGATCCATGCCCACCGTGGATGACAT
SEQ ID No:5 下游引物：ATGCTCGAGTCAGGTGCCCGAGGGTTCT
(2) TRIzol 法从人肝组织中提取总RNA，RT-PCR获得cDNA，再以cDNA为模板获得目的基因片段。
经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，得到长度约1.7kb的条带（见图1A），位置正确，认为获得目的基因。
(3) 将位置正确的PCR产物胶回收，回收产物进行添A反应，反应产物进行电泳鉴定并且胶回收，回收产物与pMD19-T Vector（T载体）相连。
(4) 转化 将连接产物转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞，于含氨苄LB固体培养基上，37℃孵箱培养过夜。待次日培养基上长出菌斑后，挑取培养基上的单菌落至液体含氨苄的LB培养基中，37℃摇床培养8-12h。保菌，菌液PCR后电泳鉴定，长度约1.7kb的目的条带（见图1B），初步鉴定转化成功。将鉴定正确的菌液用试剂盒抽提质粒，质粒进行电泳鉴定，结果符合一般质粒的特征(见图1C)，最上面条带为线性质粒，长度约4.4kb，最亮一条为环形质粒，认为得到了pMD19-T/hOCT1质粒。
将鉴定正确的质粒进行双酶切反应。酶切体系(10μL)：pMD19-T/hOCT1质粒 5μL，10×H buffer 1μL，XhoⅠ1μL, BamHⅠ 1μL，灭菌水 2μL ，37℃，2h。
2h后酶切产物电泳鉴定（见图1D），得到三片段，最大的约4.4kb为未切完全的线性质粒，中间的约2.7kb，为T载体片段，最小的约1.7kb为hOCT1基因片段，进一步说明连接T载体并转化入DH5α成功。将鉴定正确的质粒测序，测序结果表明得到hOCT1野生型基因，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
P341L
，
hOCT1M420del
两个突变型基因的获得
(1) 以1.1中得到的pMD19-T/hOCT1质粒为模板，定点突变PCR来获得两个突变型基因，设计定点突变引物如下：
突变体1 hOCT1P341L：1022C→T
SEQ ID No:6 上游引物 5’- ACCTGTTCCGCACGC T GCGCCTGAGGAAGCGC-3’
SEQ ID No:7 下游引物 5’- GCGCTTCCTCAGGCGC A GCGTGCGGAACAGGT-3’
突变体2 hOCT1M420del：1258delATG(1258-1260)
SEQ ID No:8 上游引物 5’- GGGCAGCCTGCCTCGTC ATTTTTATCTCACCTGACC -3 ’
SEQ ID No:9 下游引物 5’- GGTCAGGTGAGATAAAAAT GACGAGGCAGGCTGCCC-3’
反应结束后DpnⅠ，37℃，消化1h，除去模板质粒。突变产物电泳鉴定（见图2A），有约为4.4kb的目的条带，但也有杂条带。因此在DpnⅠ消化掉模板后进行目的条带切胶回收，再次电泳鉴定无杂条带后，将突变产物转入大肠杆菌DH 5α感受态细胞，次日挑单菌落摇菌，菌液PCR鉴定（见图2B），提质粒（见图2C）双酶切鉴定（见图2D）得到长度为 2.7kb，1.7kb的两个片断，鉴定说明得到pMD19-T/hOCT1P341L,
pMD19-T/hOCT1M420del两个质粒，测序结果表明得到hOCT1P341L，hOCT1M420del两个突变型基因，核苷酸序列如SEQ ID No:2和SEQ ID No:1所示。
P341L
，
hOCT1M420del
三种质粒的构建
将测序正确的pMD19-T/hOCT1，pMD19-T/hOCT1P341L，pMD19-T/hOCT1M420del
质粒进行扩增，抽提质粒，双酶切，胶回收，得到hOCT1，hOCT1P341L，hOCT1M420del三种基因片段。同时扩增pcDNA3.1(+)质粒，同样的双酶切，胶回收得到pcDNA3.1(+)载体片段。
酶切体系（50μL）：pMD19-T/hOCT1 质粒 25μL,
10×K
buffer 5μL,
XhoⅠ
1μL,
BamHⅠ
1μL,
灭菌水
18μL
其余三种质粒也按该体系酶切，37℃，5h。
将三种目的基因片段分别与载体片段连接，
连接体系(10μL): hOCT1
7μL,
pcDNA3.1(+)
1μL,
T4 连接酶
1μL,
10×buffer
1μL, 16℃，反应12h
将连接产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细菌。转化次日，挑取单菌落，摇菌，菌液PCR鉴定正确后，抽提质粒，电泳鉴定（见图3A,4A,5A）后，双酶切鉴定（见图3B,4B,5B），均得到约为5.4kb的pcDNA3.1(+)载体片度和约为1.7kb的目的基因片段，初步鉴定质粒正确。将鉴定正确的质粒测序，测序结果表明pcDNA3.1(+)/hOCT1，hOCT1P341L，hOCT1M420del三种质粒构建成功。
细胞的稳定转染
将鉴定正确的pcDNA3.1(+)/hOCT1，hOCT1P341L，hOCT1M420del质粒扩增，用试剂盒抽提质粒，提出质粒双酶切鉴定正确后后，测定浓度，用于转染。质粒3μg, Lipofectamine™ 2000 6µl (质粒：脂质体=1:2)与无血清DMEM培养基混合孵育30min后，转染细胞，6h后换有血清DMEM培养基继续培养48h，换含700μg/mL
G418的含血清培养基进行细胞筛选。筛选14天后，对照组细胞全部死亡，转染组细胞有大量生长，将存活的细胞消化，稀释，有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700μg/mL
G418的培养基继续培养，隔天换液。约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24孔板培养。按上述方法，MDCK/hOCT1(野生型)，MDCK/ hOCT1P341L
(P341L突变体)，MDCK/hOCT1M420del
(MM420del突变体)，各筛选出42株，30株，28株单克隆。
单克隆细胞的功能鉴定
3.1
细胞对荧光底物
ASP+((4-
二甲氨基苯乙烯基）
-N-
甲基吡啶
)
的积聚
将MDCK和MDCK/hOCT1细胞以2×105每孔种于24孔板，生长48h后进行积聚实验。每株细胞分两组，一组为底物组；另一组为抑制剂组，每组平行三份。细胞用37℃PBS洗两遍后，底物组加200µl HBSS，抑制剂组加200µl含3mmol/L TEA+的HBSS，孵育10min后吸掉孵育液，底物组分别加入含5µmol/L (或10µmol/L) ASP+的HBSS 200µl，抑制组加含同样浓度ASP+且含3mmol/L TEA+的HBSS 200µl，37℃孵育60min，每个浓度平行三份。积聚结束后以激发波长475nm，发射波长605nm检测荧光强度，同时在荧光显微镜下观察荧光强度。经初步筛选，确定五株MDCK/hOCT1，四株MDCK/ hOCT1P341L，四株MDCK/ hOCT1M420del单克隆细胞株积聚ASP+活性明显提高，且在抑制剂TEA+存在下，细胞积聚ASP+能力明显降低，参见图6，图中数据以mean±SD表示，n=3。*1-8,16,23,31,35为MDCK/hOCT1单克隆细胞株；*2-8,19,27,30为MDCK/ hOCT1P341L单克隆细胞株；*3-5,6,10,11为MDCK/hOCT1M420del单克隆细胞株。同样在荧光显微镜下可见MDCK/hOCT1、MDCK/ hOCT1P341L，MDCK/hOCT1M420del的荧光强度明显大于未转染hOCT1的细胞MDCK细胞，TEA+存在下，转染hOCT1的细胞荧光强度明显减弱（见图7）。
经典底物
MPP+(N-
甲基
-4-
苯基吡啶
)
进一步验证
将3.1中筛选出的MDCK/hOCT1细胞进行经典底物MPP+积聚实验，以进一步验证其功能。MDCK和MDCK/hOCT1细胞2×105每孔种于24孔板，生长48h后进行积聚实验。每株细胞分两组，一组为底物组；另一组为抑制剂组，每组平行三份。细胞用37℃ HBSS洗两遍后，底物组加200µl HBSS，抑制剂组加200µl含3mmol/L TEA+的HBSS，孵育10min，吸弃孵育液，底物组加入含15µmol/L MPP+的HBSS 200µl，抑制剂组加含15µmol/L MPP+及3mmol/L TEA+的HBSS 200µl，37℃孵育30min后，吸弃孵育液，用冰的HBSS洗三遍，加入100µl 0.2%的SDS裂解十分钟后吹打，收集细胞裂解液于dorf管中，13000rpm离心10min除去泡沫。取10µl裂解液以BCA法测定蛋白浓度，另取裂解液70µl，加入140µl乙腈，涡旋5min后，13000rpm离心15min，取上清，以LC-MS法测定裂解液中MPP+浓度。计算每毫克蛋白每分钟的积聚量（pmol/min/mg protein），并以MDCK/hOCT1积聚量与空白MDCK细胞的积聚量的比值表征细胞对MPP+的积聚能力，参见图8，图中数据以mean±SD表示，n=3。*1-8,16,23,31,35为MDCK/hOCT1单克隆细胞株；*2-8,19,27,30 为MDCK/ hOCT1P341L的单克隆细胞株；*3-5,6,10,11为MDCK/hOCT1M420del单克隆细胞株。空白MDCK对MPP+积聚量为1.44pmol/min /mg protein。
水平检测
hOCT1
的表达情况
TRIzol 法从MDCK/hOCT1，MDCK/ hOCT1P341L，MDCK/hOCT1M420del
单克隆细胞中提取总RNA，RT-PCR获得cDNA，再以cDNA为模板获得目的基因片段，以β-actin为内参。
目的基因引物如SEQ ID No:4和5所示。
人β-actin特异性引物如SEQ ID No:10和11所示：
SEQ ID No:10
上游引物：CTGGGACGACATGGAGAAAA
SEQ ID No:11
下游引物:AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC
。
PCR产物电泳鉴定表明，空白细胞只得到约为560bp的β-actin片段，挑选出的单克隆细胞还含有约1.7kb的hOCT1片段，表明构建的细胞模型内已有hOCT1基因的表达（见图9）。
综合hOCT1的两种底物积聚及抑制实验，以及RT-PCR的基因鉴定结果，可以选出MDCK/hOCT1*1-31,
MDCK/hOCT1*2-19, MDCK/hOCT1*3-5，分别作为建立成功的MDCK/hOCT1，MDCK/ hOCT1P341L，MDCK/hOCT1M420del细胞模型，进行hOCT1野生型及突变体的功能研究，hOCT1底物及抑制剂的筛选。
在
hOCT1
抑制剂及底物筛选中的应用
考察延胡索，盐酸麻黄碱，盐酸伪麻黄碱，马钱子碱，水杨酸毒扁豆碱，野百合碱等生物碱对MDCK/hOCT1*1-31细胞摄取荧光底物ASP+的抑制作用。将MDCK/hOCT1*1-31单克隆细胞种于24孔板，2×105每孔，48h后进行积聚实验。细胞分为对照组和受试组，用HBSS洗两遍，对照组细胞加含1μmol/L ASP+ 的HBSS溶液200μL，受试组加含1μmol/L ASP+及受试药物100μmol/L的HBSS200μL，37℃孵育30min后酶标仪检测荧光强度（激发波长475nm，发射波长605nm）。以受试组荧光强度与对照组荧光强度的比值表征待测药物对ASP+积聚的抑制作用，比值越小，表明抑制作用越强。结果显示延胡索乙素，马钱子碱，水杨酸毒扁豆碱，对MDCK/hOCT1积聚ASP+的抑制作用大于50%（见图10）。
<110> 浙江大学
<120> 表达人有机阳离子转运体1的细胞模型构建及应用
<160> 11
<210> 1
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(1665)
<223>人有机阳离子转运体1 cDNA序列
<440>1
atg ccc acc gtg gat gac att ctg gag cag gtt
ggg gag tct ggc 45
tgg ttc cag aag caa gcc ttc ctc atc tta tgc
ctg ctg tcg gct 90
gcc ttt gcg ccc atc tgt gtg ggc atc gtc ttc
ctg ggt ttc aca 135
cct gac cac cac tgc cag agt cct ggg gtg gct
gag ctg agc cag 180
cgc tgt ggc tgg agc cct gcg gag gag ctg aac
tat aca gtg cca 225
ggc ctg ggg ccc gcg ggc gag gcc ttc ctt ggc
cag tgc agg cgc 270
tat gaa gtg gac tgg aac cag agc gcc ctc agc
tgt gta gac ccc 315
ctg gct agc ctg gcc acc aac agg agc cac ctg
ccg ctg ggt ccc 360
tgc cag gat ggc tgg gtg tat gac acg ccc ggc
tct tcc atc gtc 405
act gag ttc aac ctg gtg tgt gct gac tcc tgg
aag ctg gac ctc 450
ttt cag tcc tgt ttg aat gcg ggc ttc ttc ttt
ggc tct ctc ggt 495
gtt ggc tac ttt gca gac agg ttt ggc cgt aag
ctg tgt ctc ctg 540
gga act gtg ctg gtc aac gcg gtg tcg ggc gtg
ctc atg gcc ttc 585
tcg ccc aac tac atg tcc atg ctg ctc ttc cgc
ctg ctg cag ggc 630
ctg gtc agc aag ggc aac tgg atg gct ggc tac
acc cta atc aca 675
gaa ttt gtt ggc tcg ggc tcc aga aga acg gtg
gcg atc atg tac 720
cag atg gcc ttc acg gtg ggg ctg gtg gcg ctt
acc ggg ctg gcc 765
tac gcc ctg cct cac tgg cgc tgg ctg cag ctg
gca gtc tcc ctg 810
ccc acc ttc ctc ttc ctg ctc tac tac tgg tgt
gtg ccg gag tcc 855
cct cgg tgg ctg tta tca caa aaa aga aac act
gaa gca ata aag 900
ata atg gac cac atc gct caa aag aat ggg aag
ttg cct cct gct 945
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acc gaa aag ctg 990
agc cct tca ttt gca gac ctg ttc cgc acg ccg
cgc ctg agg aag 1035
cgc acc ttc atc ctg atg tac ctg tgg ttc acg
gac tct gtg ctc 1080
tat cag ggg ctc atc ctg cac atg ggc gcc acc
agc ggg aac ctc 1125
tac ctg gat ttc ctt tac tcc gct ctg gtc gaa
atc ccg ggg gcc 1170
ttc ata gcc ctc atc acc att gac cgc gtg ggc
cgc atc tac ccc 1215
atg gcc atg tca aat ttg ttg gcg ggg gca gcc
tgc ctc gtc atg 1260
att ttt atc tca cct gac ctg cac tgg tta aac
atc ata atc atg 1305
tgt gtt ggc cga atg gga atc acc att gca ata
caa atg atc tgc 1350
ctg gtg aat gct gag ctg tac ccc aca ttc gtc
agg aac ctc gga 1395
gtg atg gtg tgt tcc tcc ctg tgt gac ata ggt
ggg ata atc acc 1440
ccc ttc ata gtc ttc agg ctg agg gag gtc tgg
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gcg gga gtg acg 1530
cta ctt ctt cca gag acc aag ggg gtc gct ttg
cca gag acc atg 1575
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ccc aaa gaa aac 1620
acg att tac ctt aag gtc caa acc tca gaa ccc
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<210> 2
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(1665)
<223>人有机阳离子转运体1突变体1022C→TcDNA序列
<440>2
atg ccc acc gtg gat gac att ctg gag cag gtt
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atg gcc atg tca aat ttg ttg gcg ggg gca gcc
tgc ctc gtc atg 1260
att ttt atc tca cct gac ctg cac tgg tta aac
atc ata atc atg 1305
tgt gtt ggc cga atg gga atc acc att gca ata
caa atg atc tgc 1350
ctg gtg aat gct gag ctg tac ccc aca ttc gtc
agg aac ctc gga 1395
gtg atg gtg tgt tcc tcc ctg tgt gac ata ggt
ggg ata atc acc 1440
ccc ttc ata gtc ttc agg ctg agg gag gtc tgg
caa gcc ttg ccc 1485
ctc att ttg ttt gcg gtg ttg ggc ctg ctt gcc
gcg gga gtg acg 1530
cta ctt ctt cca gag acc aag ggg gtc gct ttg
cca gag acc atg 1575
aag gac gcc gag aac ctt ggg aga aaa gca aag
ccc aaa gaa aac 1620
acg att tac ctt aag gtc caa acc tca gaa ccc
tcg ggc acc tga 1665
<210> 3
<211> 1665
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> CDS
<222> (1)…(1662)
<223>人有机阳离子转运体1突变体1258delATG
cDNA序列
<440>3
atg ccc acc gtg gat gac att ctg gag cag gtt
ggg gag tct ggc 45
tgg ttc cag aag caa gcc ttc ctc atc tta tgc
ctg ctg tcg gct 90
gcc ttt gcg ccc atc tgt gtg ggc atc gtc ttc
ctg ggt ttc aca 135
cct gac cac cac tgc cag agt cct ggg gtg gct
gag ctg agc cag 180
cgc tgt ggc tgg agc cct gcg gag gag ctg aac
tat aca gtg cca 225
ggc ctg ggg ccc gcg ggc gag gcc ttc ctt ggc
cag tgc agg cgc 270
tat gaa gtg gac tgg aac cag agc gcc ctc agc
tgt gta gac ccc 315
ctg gct agc ctg gcc acc aac agg agc cac ctg
ccg ctg ggt ccc 360
tgc cag gat ggc tgg gtg tat gac acg ccc ggc
tct tcc atc gtc 405
act gag ttc aac ctg gtg tgt gct gac tcc tgg
aag ctg gac ctc 450
ttt cag tcc tgt ttg aat gcg ggc ttc ttc ttt
ggc tct ctc ggt 495
gtt ggc tac ttt gca gac agg ttt ggc cgt aag
ctg tgt ctc ctg 540
gga act gtg ctg gtc aac gcg gtg tcg ggc gtg
ctc atg gcc ttc 585
tcg ccc aac tac atg tcc atg ctg ctc ttc cgc
ctg ctg cag ggc 630
ctg gtc agc aag ggc aac tgg atg gct ggc tac
acc cta atc aca 675
gaa ttt gtt ggc tcg ggc tcc aga aga acg gtg
gcg atc atg tac 720
cag atg gcc ttc acg gtg ggg ctg gtg gcg ctt
acc ggg ctg gcc 765
tac gcc ctg cct cac tgg cgc tgg ctg cag ctg
gca gtc tcc ctg 810
ccc acc ttc ctc ttc ctg ctc tac tac tgg tgt
gtg ccg gag tcc 855
cct cgg tgg ctg tta tca caa aaa aga aac act
gaa gca ata aag 900
ata atg gac cac atc gct caa aag aat ggg aag
ttg cct cct gct 945
gat tta aag atg ctt tcc ctc gaa gag gat gtc
acc gaa aag ctg 990
agc cct tca ttt gca gac ctg ttc cgc acg ccg
cgc ctg agg aag 1035
cgc acc ttc atc ctg atg tac ctg tgg ttc acg
gac tct gtg ctc 1080
tat cag ggg ctc atc ctg cac atg ggc gcc acc
agc ggg aac ctc 1125
tac ctg gat ttc ctt tac tcc gct ctg gtc gaa
atc ccg ggg gcc 1170
ttc ata gcc ctc atc acc att gac cgc gtg ggc
cgc atc tac ccc 1215
atg gcc atg tca aat ttg ttg gcg ggg gca gcc
tgc ctc gtc att 1260
ttt atc tca cct gac ctg cac tgg tta aac atc
ata atc atg tgt 1305
gtt ggc cga atg gga atc acc att gca ata caa
atg atc tgc ctg 1350
gtg aat gct gag ctg tac ccc aca ttc gtc agg
aac ctc gga gtg 1395
atg gtg tgt tcc tcc ctg tgt gac ata ggt ggg
ata atc acc ccc 1440
ttc ata gtc ttc agg ctg agg gag gtc tgg caa
gcc ttg ccc ctc 1485
att ttg ttt gcg gtg ttg ggc ctg ctt gcc gcg
gga gtg acg cta 1530
ctt ctt cca gag acc aag ggg gtc gct ttg cca
gag acc atg aag 1575
gac gcc gag aac ctt ggg aga aaa gca aag ccc
aaa gaa aac acg 1620
att tac ctt aag gtc caa acc tca gaa ccc tcg
ggc acc tga 1662
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1的特异性上游引物
<440> 4
atg gga tcc atg ccc acc gtg gat gac at
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1的特异性下游引物
<440> 5
atg ctc gag tca ggt gcc cga ggg ttc t
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1定点突变为1022C→T突变体的特异性上游引物
<440> 6
acc tgt tcc gca cgc tgc gcc tga gga agc gc
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1定点突变为1022C→T突变体的特异性下游引物
<440> 7
gcg ctt cct cag gcg cag cgt gcg gaa cag gt
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1定点突变为1258delATG突变体的特异性上游引物
<440> 8
ggg cag cct gcc tcg tca ttt tta tct cac ctg
acc
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hOCT1定点突变为1258delATG突变体的特异性下游引物
<440> 9
ggt cag gtg aga taa aaa tga cga ggc agg ctg
ccc
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β-actin特异性上游引物
<440> 10
ctg gga cga cat gga gaa aa
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人β-actin特异性下游引物
<440> 11
aag gaa ggc tgg aag agt gc
Claims (3)
1.一种表达人有机阳离子转运体1hOCT1的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
先从冰冻人肝组织中提取总RNA，经RT-PCR获得人的cDNA文库，以该cDNA为模板，通过设计含有BamH Ⅰ，Xho Ⅰ两个酶切位点的特定引物SEQ ID No:4和SEQ ID No:5，获得人的野生型OCT1基因NM_003057的编码序列，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，将该基因片段添A后与pMD19-T连接得pMD19-T/hOCT1质粒，再将其转入大肠杆菌DH5α进行质粒扩增，测序，测序正确，得到野生型基因后，以pMD19-T/hOCT1质粒为模板，通过定点突变，获得含hOCT1的核苷酸序列如SEQ ID No:2所示的hOCT1P341L和核苷酸序列如SEQ IDNo:3所示的hOCT1M420del两个突变体基因的质粒pMD19-T/hOCT1P341L，pMD19-T/hOCT1M420del，将质粒转入大肠杆菌DH5α进行质粒扩增，测序，测序正确后，将以上三种质粒通过大肠杆菌DH5α扩增，抽提质粒后，用BamH Ⅰ，Xho Ⅰ两个酶进行双酶切得到hOCT1,hOCT1P341L,hOCT1M420del三个基因片段，将载体质粒pcDNA3.1(+)也用同样的两个酶双酶切，得到含有与上述三个基因片段相同酶切位点的载体片段，通过T4连接酶分别将三个基因片段与载体片段连接，构建pcDNA3.1(+)-hOCT1，pcDNA3.1(+)-hOCT1P341L，pcDNA3.1(+)-hOCT1M420del三种质粒，再将质粒分别转染MDCK细胞，经过氨基糖苷类抗生素G418抗性筛选，得到稳定表达hOCT1野生型及两个常见突变体的MDCK细胞，分别为MDCK/hOCT1,MDCK/hOCT1P341L,MDCK/hOCT1M420del，然后提取单克隆细胞株的总RNA，RT-PCR后通过前述hOCT1的特定引物进行PCR，mRNA水平验证基因的表达，通过经典底物4-(4-二甲氨基苯乙烯基）-N-甲基吡啶或N-甲基-4-苯基吡啶，并以四乙胺为hOCT1抑制剂进行细胞的摄取及抑制实验验证细胞功能。
2.根据权利要求1所述的一种表达hOCT1的MDCK细胞模型的构建方法，其特征在于，所述定点突变所用引物序列如SEQ ID No:6-9所示。
3.根据权利要求1所述方法构建的一种表达hOCT1的MDCK细胞模型在有机阳离子转运体1抑制剂筛选中的应用，其特征在于，通过以下步骤实现：以4-(4-二甲氨基苯乙烯基)-N-甲基吡啶作为经典hOCT1荧光底物，与待测药物同时孵育，通过荧光强度判断待测药物对该转运体的抑制能力，抑制率超过50%，可以初步认为待测药物为hOCT1的抑制剂。
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