CN1964741A - 利用有机阳离子运载体3(oct3)相关分子治疗抑郁症、焦虑性神经症、药物成瘾和其他类似精神疾病的方法 - Google Patents

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Abstract

通过将OCT3基因的反义序列施用到脑中成功地构建出OCT3表达被抑制的小鼠。OCT3表达被抑制的小鼠显示出与精神疾病，例如抗抑郁效应和抗焦虑效应相关的表型，因此这种小鼠可以用于筛选精神疾病治疗剂。另外也表明OCT3表达或功能抑制剂作为抑郁症症状和焦虑性神经症的治疗剂实际上是有效的。

Description

利用有机阳离子运载体3(OCT3)相关分子 治疗抑郁症、焦虑性神经症、药物成瘾 和其他类似精神疾病的方法
技术领域
本发明涉及利用有机阳离子运载体OCT3治疗精神疾病，例如抑郁症、焦虑性神经症和药物依赖的用途。
背景技术
在药物治疗中已经使用多种药物制剂，但是其中一些制剂在生理条件下会变成阳性离子(阳离子)。近年来，涉及运载体(转运蛋白)的研究已经取得了显著进步(参见非专利文件1和2)，其中运载体位于细胞膜上，而且它能通过主动运输促进药物的组织转移、吸收、肾脏排泄和胆汁排泄。同时，与转运离子药物有关的有机阳离子运载体的基因克隆，结构和功能分析也已经取得了显著进步。
在这些运载体中，转运阳离子药物的重要运载体是有机阳离子运载体(OCT)(参见非专利文献3)。其中OCT1和OCT2已经分别在1994年(参见非专利文献4)和1996年(参见非专利文献5)被克隆。近端肾小管细胞已知通过将有机阳离子分泌到尿中而在降低有机阳离子毒性方面起重要作用。OCT1和OCT2都在肾内表达，因此预计OCT1或OCT2中的任何一个可能是重要的；但是，免疫组织学研究否定了这一可能性(参见非专利文件4和7)，这表明了其他OCTs是重要OCT的可能性。
1998年从大鼠胎盘中克隆出与OCT1有高度同源性的作为运载体的OCT3(参见非专利文献8)。在二十世纪九十年代初，利用基因序列和药理学特征已经阐明存在OCT3，而且开始明了OCT3与被称为uptake2的运载体或神经元外单胺运载体(EMT)相同，其中神经元外单胺运载体是在和OCT3大约相同的时间从人心肌中克隆出来的(参见非专利文献9)。
一系列研究更进一步地阐明OCT3的阳离子转运活性和组织分布不同于其他OCTs。特别地，免疫组织学研究显示OCT3不仅位于胎盘中，而且也位于肾、小肠、肺、心脏和脑中，其中OCT1特别地位于肝和肾，OCT2特别地位于肾(参见非专利文献10)。也显示OCT3是脑中神经细胞所缺少的，但是OCT3存在于神经支持细胞中，例如星形胶质细胞(参见非专利文献11)或血脑屏障中(参见非专利文献12)。此外，OCT3显而易见地存在于肾脏的近端肾小管细胞，而且现在认为OCT3是肾脏中排泄阳离子药物最重要的运载体之一(参见非专利文献13)。
OCT3的底物特异性也大大地不同于其他OCTs的底物特异性。已经已知OCT3具有转运多巴胺神经毒素MPP+、去甲肾上腺素、5-羟色胺、多巴胺、精神兴奋剂、抗抑郁剂等等的活性，但是这些物质不能被其他OCTs转运(参见非专利文献10)。
除上述之外，目前已经报告下列发现：
1)脑原位杂交显示OCT3仅仅出现在延髓最后区(area postrema)，在其他位点表达较低。因此，认为OCT3在调节恶心、食欲和心血管功能方面具有重要作用(参见非专利文献14)。
2)OCT3存在于是神经支持细胞的神经胶质细胞和星形胶质细胞中，并且在调节脑单胺浓度方面具有重要作用(参见非专利文献15)。
3)OCT3和OCT1在支气管平滑肌中表达，而且认为OCT3与类固醇吸入引起去甲肾上腺素抑制介导的急性支气管收缩有关(参见非专利文件16和17)。
4)已经证实人OCT3(也称为EMT)在高加索人中由单倍体*1至*12组成(参见非专利文献18)。
5)已经提出在小脑颗粒细胞中，OCT3对1-甲基-4-苯基吡啶(phenylpyridinium)(MPP+)的摄取很重要(参见非专利文献19)。
6)通过施用精神兴奋剂可以减少OCT3的表达(参见非专利文献20)。
7)在5-羟色胺运载体缺乏动物中，具有转运单胺活性的OCT3的表达在脑某些位点会代偿性地增加，其中单胺包括5-羟色胺(参见非专利文献21)。
8)利用肾脏衍生的表达的OCT3/EMT的HEK293细胞已经确认OCT3和OCT2具有转运胍丁胺活性，其中胍丁胺可以是治疗依赖性的药物的母体化合物(参见非专利文献22)。
9)许多种运载体存在于胎盘中，OCT3是其中之一(参见非专利文献23)。
10)OCT3/EMT在是人神经支持细胞的星形胶质细胞中表达，而且在单胺、药物等等的摄取中具有重要的作用(参见非专利文件24和25)。
11)OCT3在子宫颈上部的神经节细胞中表达并起作用(参见非专利文献26)。
12)OCT3/EMT在小肠衍生的Caco-2细胞的刷状缘膜侧面表达，而且在摄取底物到细胞的过程中具有重要的作用(参见非专利文献27和28)。
13)OCT1和OCT3与人胎盘中乙酰胆碱的定量调节有关(参见非专利文献29)。
14)培养的细胞系--马-达二氏犬肾(Madin-Darby canine kidney)(MDCK)细胞是只表达OCT2的细胞，其中没有检测到OCT1和OCT3的表达(参见非专利文献30)。
15)OCT2和OCT3在血脑屏障位于其中的大脑脉络丛中表达，而且OCT2对该位点转运胆碱非常重要(参见非专利文献31)。
16)表达OCT3/EMT的肾脏衍生的HEK293细胞接触一些P-糖蛋白配体会降低转运OCT3/EMT底物MPP+的能力(参见非专利文献32)。
17)在人神经胶质瘤衍生的SK-MG-1中，阳离子转移系统对胍丁胺的摄取很重要；但是，该阳离子转移系统不被OCT3调节的可能性很大(参见非专利文献33)。
18)在是大鼠小脑微血管细胞的RBE4细胞中观察到胆碱摄取；但是，该细胞不表达OCT3，因此认为其中涉及未鉴别的阳离子转移系统(参见非专利文献34)。
19)在通过基因修饰构建的OCT3缺乏小鼠中，OCT3/EMT底物MPP+在心脏中的摄取显著下降；但是在其他组织中没有观察到变化(参见非专利文献35)。
20)OCT3(小鼠中的ORCT3)和单胺代谢酶MAO-A在小鼠胎盘中位于相同的位点(参见非专利文献36)。
21)大鼠OCT3由11个外显子和10个内含子组成。更进一步地，小鼠OCT3与人OCT3的同源性为86％。免疫组织学发现OCT3位于近端小管中，因此认为OCT3在肾脏排泄阳离子药物方面具有重要作用(参见非专利文献13)。
22)培养的大鼠星形胶质细胞表达OCT3(参见非专利文献37)。
23) MPP+摄取的特征在包含OCT3的肾脏衍生的Caki-1细胞和包含OCT1的原代培养肝细胞之间完全不同。在Caki-1细胞中皮质甾酮抑制MPP+的摄取；但是认为应激反应期间血中皮质甾酮增加引起的OCT3功能降低对单胺摄取的变化基本上没有影响(参见非专利文献38)。
24)在培养的猪小管细胞中，性激素雌二醇和黄体酮显著降低去甲肾上腺素的摄取(参见非专利文献39)。
25)OCT3与神经元外单胺运载体″uptake2″等同，而且广泛分布在脑中，包括海马、大脑皮层和小脑(参见非专利文献40)。
26)在原代培养肝细胞中，将肾上腺素摄取到细胞中涉及OCT3/uptake2和P糖蛋白(参见非专利文献41)。
27)氧化应激反应引起的脑组织中多巴胺摄取降低与位于神经元中的单胺运输系统(uptake1)和OCT3/uptake2的摄取功能下降有关(参见非专利文献42)。
28)从大鼠胎盘中分离电压敏感阳离子转运蛋白OCT3(参见非专利文献43)。
29)OCT3/EMT位于人神经胶质细胞中(参见非专利文献44)。
30)1，1′-二异丙基-2，4′-花青(disprocynium24)是一种强有力的OCT3/uptake2抑制剂，静脉内给药可强烈抑制单胺排泄到尿中(参见非专利文献45)。
31)uptake2在摄取去甲肾上腺素到大鼠心肌细胞的过程中具有重要作用(参见非专利文献46)。
32)已经概述像OCT3的有机阳离子运载体OCT1和OCT2的特征、组织分布等等(参见非专利文献49)。
更进一步地，已经比较人和小鼠OCT3基因，这表明未发现的OCT3基因多态性和精神疾病之间存在某些关系的可能性；但是，没有提出具体的证据(参见非专利文献47)。
而且，OCT3/EMT/uptake2是在大鼠心肌中发现的运载体，利用单胺，例如多巴胺、5-羟色胺和去甲肾上腺素作为底物OCT3/EMT/uptake2位于神经元之外的其他细胞中，因此认为它在去除外周神经刺激释放的去甲肾上腺素方面很重要。
到目前为止，已经报告抗抑郁剂可以作为OCT3的可能底物。抗抑郁剂具有极强的抑制OCT3底物MPP+转运的活性；但是，这是因为抗抑郁剂的部分结构与单胺相似，也因为抗抑郁剂是强的阳离子药物。因此，这一药物倾向不能显示OCT3和抑郁症之间有关系。
用于讨论药物效力和OCT3之间的关系的另一个药物例子是β阻断剂，β阻断剂是抗高血压药物。这是因为β阻断剂(其是具有与单胺相似结构的抗高血压药)具有被OCT3转运的特性，而且OCT3在心脏中表达良好。(注意所有这些思想已在二十世纪九十年代早期到中期之间被舍弃)。据说这些发现已经引起注意，因为底物类型和运载体表达相一致。
第一个克隆OCT3的Kekuda等报道说OCT3在心脏中的表达最高，接下来是肺和肾脏，在脑中的表达极其低。后来，来自相同实验组的Wu等报告了OCT3在脑中的表达，而且其他几个组也报告了OCT3在神经支持细胞，例如神经胶质细胞中的表达；但是，到目前为止已经认为评估OCT3在中枢神经系统中的功能是无用的，因为OCT3在脑中表达的水平低，而且在神经中没有表达，因此到现在还没有进行研究。
更进一步地，报告显示OCT3缺乏动物的脑中MPP+的摄取没有差异，而且OCT3缺乏动物也没有异常行为。也认为这些结果是涉及OCT3与抑郁和焦虑的相关性研究缺乏进展的原因。
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发明公开的内容
发明解决的问题
本发明是在上述情形下进行的。本发明的目标是提供治疗精神疾病，例如抑郁症，焦虑或药物依赖的药物制剂，以及提供通过揭示精神疾病，例如抑郁症，焦虑或药物依赖和OCT3之间的关系筛选所述制剂的方法。
解决问题的方式
如上所述，到目前为止一直没有OCT3缺乏动物与野生型动物相比显示出行为差异的报道。鉴于发现在5-羟色胺运载体缺乏动物中，具有转运单胺，包括转运5-羟色胺活性的OCT3的表达在脑的某些位点会代偿性地增加，本发明人考虑了如下假设。特别地，他们猜测在上述OCT3缺乏动物中，其他有单胺转运活性的运载体在动物发育期间出现过表达，因此弥补了OCT3的功能。发明人更进一步地猜测通过抑制OCT3在成熟动物脑中的表达构建显示行为变化的动物是可能的。因此，发明人实施了专门的研究，构建出OCT3表达被抑制，导致出现行为变化的小鼠。
发明人通过将针对OCT3的反义序列直接施用到脑中构建出OCT3表达被抑制的小鼠。虽然多个位点都可以被认为是反义目标位点，但在本发明的实验中使用了包含靶基因OCT3的起始密码子的序列。而且，发明人的注意力集中在OCT3在血脑屏障(血脑屏障是脑室和血液之间的接触点)中表达这一发现上，因此选择脑室作为施用上述反义序列的位点。通常当目标位于脑实质时也有直接将反义序列施用给靶组织的方法，但是通常利用硫附着于磷酸基上的磷硫酰反义序列来抑制它们的核苷酸序列的降解。但是，考虑到上述磷硫酰形式有毒，经常在实验中引起组织死亡和导致实验困难的事实，发明人完成了将反义序列施用到脑室，这具有创造性和创新性。
为了研究按照如上所述的方法构建的小鼠和各种精神疾病之间的关系，本发明人对抑郁症样症状和焦虑症状的影响进行了研究。更准确地说，他们对上述小鼠进行了强迫游泳测试，并且观察了探究行为。结果，本发明人揭示上述小鼠在游泳期间没有显示不动性，显示出抗抑郁效应。发明人也发现小鼠的探究行为增强了，并观察到抗焦虑效应。而且，发明人证实这些小鼠中OCT3表达显著下降。
如上所述的结果证明在动物试验水平，抑制OCT3基因表达的物质(例如：反义核酸)实际上能有效对抗各种精神疾病。也就是说，本发明的在OCT3表达抑制动物中会观察到抗抑郁效应或抗焦虑效应的行为变化的发现已经显示抑制OCT3表达或功能的物质实际上是抑郁症和焦虑紊乱的有效治疗剂。
更进一步地，本发明人研究了抑制OCT3基因表达和使用抗抑郁剂的联合效应。结果，他们新发现抑制OCT3表达增强了抗抑郁剂的效果。也就是证明了调节OCT3表达的化合物作为与抗抑郁剂一起使用的伴随药物是有效的。
而且，本发明人发现靶向OCT3的小分子化合物实际上具有和抗抑郁剂一样的效果。也就是说，已经显示靶向OCT3的化合物实际上具有针对精神疾病，例如抑郁症的治疗效果。
而且，上述结果表明通过抑制单个基因(OCT3)的表达，实际上可以成功地构建表型很容易与野生型相区别的动物。如上所述，发明人通过抑制OCT3基因的表达，首次成功地构建出很容易与野生型动物相区别的动物，从而完成了本发明。本发明的动物非常有用，因为他们具有与精神疾病，例如抑郁症和焦虑相关的表型。
本发明的上述OCT3基因敲除动物是非常有用的，例如可用于筛选精神疾病治疗剂，或鉴定引起精神疾病的物质。通过上述方法获得(鉴定)的物质(化合物)实际上能改变(增强或消除)本发明的动物的表型，因此据说能成为具有精神疾病治疗效果的物质，或者极有可能引起精神疾病的物质。
而且，在上述OCT3表达被抑制的小鼠中观察到精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加。也就是说，即使单次施用精神兴奋剂仍会显示与重复施用精神兴奋剂诱导的反向耐受现象相同的行为。在本发明中，不用重复施用精神兴奋剂已经成功地构建出显示出精神兴奋剂诱导的反向耐受现象的小鼠(就是显示精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加的小鼠)。上述动物在分析药物依赖的发生机理方面是有用的。更进一步地，上述动物可以优选用于筛选治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。
本发明涉及具有与精神疾病，例如抑郁症、焦虑和精神兴奋剂依赖相关的表型的OCT3敲除动物。本发明也涉及治疗所述精神疾病的药物制剂和筛选所述药物制剂的方法。更具体地说，本发明提供：
[1]包含抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂；
[2][1]的治疗剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达的物质是下列中的一种或多种化合物：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；和
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸；
[3]包含抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质的功能的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂；
[4][3]的治疗剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质是下列
(a)或(b)的化合物：
(a)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的抗体；和
(b)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的小分子化合物；
[5][1]到[4]任何一项的治疗剂，其中精神疾病是抑郁症或焦虑性神经症；
[6]包含增强有机阳离子运载体OCT3蛋白质的表达或功能的物质作为活性成分的精神兴奋剂依赖治疗剂；
[7]基因敲除非人动物，其中有机阳离子运载体OCT3基因的表达被人工抑制；
[8][7]的基因敲除非人动物，其中OCT3基因的表达被下列任何一个核酸的作用抑制：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；和
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸；
[9][7]的基因敲除非人动物，显示出下列任何一个表型：
(a)抗抑郁症样作用；
(b)精神兴奋剂诱导的自发运动活性增强；和
(c)抗焦虑作用；
[10][7]到[9]任一项的基因敲除非人动物，其中非人动物是啮齿类动物；
[11]筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽；
(b)测定蛋白质或其部分肽与测试化合物的结合活性；和
(c)选择结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽的化合物；
[12]筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞；
(b)测定有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较；
[13]筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触包含含有一种结构的DNA的细胞，在该结构中报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定报告基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较；
[14]筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达该蛋白质的细胞或细胞抽提物；
(b)测定蛋白质的活性；和
(c)选择降低蛋白质活性的化合物，其中蛋白质的活性与不存在测试化合物时测定的活性进行比较；
[15]鉴定引起精神疾病的化合物的方法，包括步骤：
(a)将测试化合物施用给[7]到[10]任一项的基因敲除非人动物；
(b)观察依赖于非人动物表型的行为；和
(c)确定消除依赖于该表型的行为的化合物是引起精神疾病的化合物；
[16][11]到[15]任何一项的方法，其中精神疾病是抑郁症或焦虑性神经症；
[17]筛选精神兴奋剂依赖治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞；
(b)测定有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较；
[18]筛选精神兴奋剂依赖治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触包含含有一种结构的DNA的细胞，在该结构中报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定报告基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较；
[19]筛选精神兴奋剂依赖治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达该蛋白质的细胞或细胞抽提物；
(b)测定蛋白质的活性；和
(c)选择增加蛋白质活性的化合物，其中蛋白质的活性与不存在测试化合物时测定的活性进行比较；
[20]筛选精神兴奋剂依赖治疗剂的方法，包括步骤：
(a)将测试化合物施用给[7]到[10]任一项的基因敲除非人动物；
(b)观察依赖于非人动物表型的精神兴奋剂诱导的自发运动活性；和
(c)选择消除运动活性的化合物；
[21]构建[7]的基因敲除非人动物的方法，包括将针对OCT3基因的转录产物或其部分的反义核酸施用到非人动物脑中的步骤；
[22]包含抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质作为活性成分的抗抑郁剂作用增强剂；
[23][22]的抗抑郁剂作用增强剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达的物质是选自下列中的一种或多种的化合物：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；和
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸；
[24]包含抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质作为活性成分的抗抑郁剂作用增强剂；
[25][24]的抗抑郁剂作用增强剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质是下列(a)或(b)的化合物：
(a)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的抗体；和
(b)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的小分子化合物；和
[26]包含抗抑郁剂和[22]到[25]中任一项的抗抑郁作用增强剂作为活性成分的具有抗抑郁效果的药物组合物。
而且，本发明提供：
[27]治疗和/或防止精神疾病的方法，包括给个体(例如：病人等)施用抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达或抑制OCT3蛋白质功能的物质；
[28]治疗和/或防止精神兴奋剂依赖的方法，包括给个体(例如：病人等)施用增强有机阳离子运载体OCT3基因表达或增强OCT3蛋白质功能的物质；
[29]抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质或抑制OCT3蛋白质功能的物质在制备精神疾病治疗剂中的用途；和
[30]增强有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质或增强OCT3蛋白质功能的物质在制备精神兴奋剂依赖治疗剂中的用途；
附图简述
图1是显示连续脑内输注针对OCT3的反义核酸对抑郁模型的影响的图表，它显示在抑郁模型中低剂量的针对OCT3的反义核酸与低剂量的抗抑郁剂丙咪嗪结合产生协同效应。a：相对于溶剂组p＜0.01，b：相对于OCT3-ScrASp＜0.01，c：相对于(OCT-AS 0+IMI 0)p＜0.01，d：相对于(OCT-AS 0+IMI4)p＜0.01，e：相对于(OCT-AS 0.075+IMI 0)p＜0.01。
图2是显示连续脑内输注被OCT3相对选择性转运的去甲变肾上腺素对抑郁模型的影响的图表。a：相对于溶剂组p＜0.01。
图3是连续脑内输注针对OCT3的反义核酸的大鼠内OCT3蛋白质的表达下降的图表。a：相对于溶剂组p＜0.01，b：相对于OCT3-ScrAS p＜0.01。
图4是显示连续脑内输注针对OCT3的反义核酸对精神兴奋剂诱导的自发运动活性的影响的图表。
图5是显示连续脑内输注针对OCT3的反义核酸对焦虑活性的影响的图表。左边的图表显示由探究行为引起的举起行为的计数。右边的图表显示自发运动活性的计数。
实施本发明的最佳方式
本发明揭示抑制有机阳离子运载体OCT3(在本发明中有时简称为″OCT3″)的表达的物质具有针对精神疾病，例如抑郁症和焦虑(神经官能症)的治疗效果。因此，本发明涉及包括抑制OCT3基因或OCT3蛋白质表达或抑制OCT3基因编码的该蛋白质(OCT3蛋白质)的功能(活性)的物质的精神疾病治疗剂。
本发明的优选实施例提供包含抑制OCT3基因表达的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂(治疗精神疾病的制剂和药物组合物)。
已经已知本发明的OCT3存在于各种生物体中。本发明的OCT3包括各种生物体的OCT3。例如：本发明的OCT3包括人OCT3、小鼠OCT3和大鼠OCT3。编码这些OCT3的基因的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：1(人)，SEQID NO：3(小鼠)和SEQ ID NO：5(大鼠)中。而且，由这些核苷酸序列编码的蛋白质的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：2(人)，SEQ ID NO：4(小鼠)和SEQ IDNO：6(大鼠)中。与上述序列表中的序列具有高同源性(通常70％或以上，优选80％或以上，更优选90％或以上，最优选95％或以上的同源性)和具有OCT3功能(例如有机阳离子运载体的功能)的其他蛋白质也包括在本发明中作为OCT3。上述蛋白质包括，例如：在SEQ ID NO：2、4或6任一一项描述的蛋白质的氨基酸序列中包含一个或多个氨基酸添加、缺失、替换或插入的蛋白质。而且，氨基酸变化的数目通常是30个氨基酸或更少；优选十个氨基酸或更少；更优选五个氨基酸或更少；最优选三个氨基酸或更少。
预计本发明的上述治疗剂对其具有治疗效果的″精神疾病″的例子包括抑郁症、焦虑性神经症、躁狂症、躁狂-抑郁症、精神分裂症和注意力缺乏多动症(ADHD)。本发明中″精神疾病″优选包括抑郁症和焦虑性神经症。
抑郁症是通常以感觉悲伤，孤独，绝望和内疚为特征的短期精神状况或慢性精神疾病，而且涵盖了精神运动性阻滞，挫折感(less frequentfrustration)、社交退缩和植物神经症状(例如食欲降低和失眠)伴随的紊乱。而且，焦虑紊乱通常指以突然的焦虑发作作为主要症状的紊乱。通常，在发作期间伴有心跳和脉率升高、呼吸困难、眩晕和颤抖。所谓的″恐慌紊乱″也包括在上述的焦虑性神经症中。
在本发明中抑制OCT3基因表达的物质包括，例如：抑制OCT3转录或抑制从所述转录产物翻译的物质。上述表达抑制物质的优选实施例包括，例如：选自下列(a)到(c)中一种或多种的化合物(核酸)：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸。
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸。
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达的活性的核酸。
本发明中的″核酸″指RNAs或DNAs。而且，以化学方法合成的核酸类似物，例如所谓的PNAs(肽核酸)也包括在本发明中作为核酸。在PNAs中，是核酸基本骨架结构的戊糖-磷酸盐骨架被由甘氨酸单元构成的聚酰胺骨架取代。PNAs具有与核酸非常相似的三维结构。
本领域熟练技术人员已经公知的抑制具体内源基因表达的方法包括那些利用反义技术的方法。多种因素有助于通过反义核酸抑制靶基因表达。这些因素包括，例如，通过三股螺旋形成抑制转录起始；通过与序列在RNA聚合酶产生的局部开环结构位点形成杂交体抑制转录；通过与人工合成的RNA形成杂交体抑制转录；通过与内含子外显子连接处的序列形成杂交体抑制拼接；通过与剪接体形成位点的序列形成杂交体抑制拼接；通过与mRNAs形成杂交体抑制由细胞核转移到细胞质；通过与加帽位点或多聚(A)位点的序列形成杂交体抑制拼接；通过与翻译起始因子结合位点的序列形成杂交体抑制翻译起始；通过与靠近起始密码子的核糖体结合部位的序列形成杂交体抑制翻译；通过与mRNAs的翻译区或多核蛋白体结合部位的序列形成杂交体抑制肽链延伸；通过与蛋白质和核酸相互作用的位点的序列形成杂交体抑制基因表达。因此，反义核酸通过抑制多个处理步骤，例如转录、拼接和翻译来抑制靶基因表达(Hirashima and Inoue，Shin SeikagakuJikkenkoza 2(New Lecture for Experimental Biochemistry 2)，Kakusan IV(Nucleic Acid IV)，Replication and Expression of Genes；Ed.，JapaneseBiochemical Society，Tokyo Kagaku Dozin Co.，Ltd.，pp.319-347，1993)。
用于本发明的反义核酸可以通过如上所述的任何一种作用抑制OCT3基因的表达。在一个实施例中，反义序列被设计成与OCT3基因mRNA的5′非翻译区互补。因此，预计该反义序列能有效抑制基因的翻译。与编码区或3′非翻译区互补的序列也可以用于这一用途。因此，用于本发明的反义核酸包括含有相当于OCT3基因的翻译区和未翻译区序列的反义序列的核酸。使用的反义核酸被连接在合适启动子的下游，优选与3′端包含转录终止信号的序列连接。这样制备得到的核酸可以通过已知的方法转化目的动物。反义核酸序列优选与靶基因序列或其部分互补；但是，不需要完全互补，只要反义核酸能有效抑制靶基因表达就可以。转录的RNAs与靶基因转录产物优选具有90％或更高的互补性，最优选95％或更高的互补性。用来有效抑制靶基因(OCT3)表达的反义核酸的长度优选是至少15个核苷酸，或者更长些，但小于25个核苷酸。而且，本发明的反义核苷酸不局限于这一长度。
本发明的反义核酸不受特别限制；但是，它们可以基于从GenBank登记号码NM_019230中获得的大鼠OCT3基因的388位点到408位点的核苷酸序列，或者基于从GenBank登记号码NM_011395中获得的小鼠OCT3基因的377位点到397位点的核苷酸序列构建。一个实例是与序列5′-tggtcgaacgtgggcatggtg-3′(SEQ ID NO：7)互补的RNAs。
也可以利用核酶或核酶编码DNA抑制OCT3基因表达。核酶指具有催化活性的RNA分子。核酶具有多种活性，对作为RNA切割酶的核酶的集中研究已经允许设计以位点特异方式切割RNAs的核酶。核酶，例如I组内含子类型的核酶和是RNase P核酶的M1 RNA的长度为400个核苷酸或以上。其他的核酶，例如锤头核酶和发夹式核酶具有包含大约40个核苷酸的活性位点(M.Koizumi and E.Otsuka，Tanpakushitsu Kakusan Koso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，1990，35，2191)。
例如：锤头核酶的自溶域切割序列G13U14C15中C15的3′侧。U14和A9之间的碱基配对在这一活性中起重要作用，而且A15或U15被切割，而不是C15被切割(Koizumi，M.et al.，FEBS Lett，228：228，1988)。可以通过设计核酶，使底物结合部位与靠近靶位点的RNA序列互补来制备识别靶RNA序列UC，UU或UA的限制性内切酶样RNA切割核酶(Koizumi，M.et al.，FEBS Lett，239：285，1988；M.Koizumi and E.Otsuka，Tanpakushitsu KakusanKoso(Protein，Nucleic acid，and Enzyme)，35：2191，1990；and Koizumi，M.et al.，Nucl.Acids Res.，17：7059，1989)。
发夹式核酶也可以用于本发明的用途。例如，这种核酶是在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中发现的(Buzayan，J.M.，Nature，323：349，1986)。也可以由发夹式核酶产生靶特异性RNA切割核酶(Kikuchi，Y.and Sasaki，N.，Nucl.Acids Res.，19：6751，1991；Kikuchi，H.，Kagaku to Seibutsu(Chemistry andBiology)，30：112，1992)。因此，在本发明中，可以通过利用核酶特异消化OCT3基因转录产物抑制OCT3基因表达。
也可以利用序列与靶基因序列相同或相似的双链RNAs，通过RNA干扰(RNAi)来实施对内源基因表达的抑制。在本发明中，因RNAi效应而具有抑制活性的核酸也泛指siRNAs。RNAi是通过将双链RNAs引入细胞等等中可以诱导靶基因mRNA破坏，抑制靶基因表达的现象，其中双链RNAs由与靶基因的mRNA同源的有义RNAs和由它们的互补链组成的反义RNAs组成。因此，RNAi可以抑制靶基因的表达，作为可以替换利用复杂和低效同源重组进行的常规基因破坏方法的敲除基因的简单方法和适用于基因治疗的方法正在引起大家的注意。用于RNAi的RNAs不必和OCT3基因或该基因的部分区域完全一致；但是，完全同源是优选的。
上述的(c)中的核酸的优选实施例是对OCT3基因具有RNAi(RNA干扰)效应的双链RNAs(siRNAs)。更具体的例子包括包含相当于SEQ ID NO：1，3或5中的任何一个核苷酸序列的部分序列的有义和反义RNAs的双链RNAs(siRNAs)。
虽然RNAi的详细机理仍然部分不清楚，但是人们相信被称为DICER的酶(RNase III核酸酶族的成员)接触双链RNAs，其中双链RNAs被降解为称为小干扰RNAs或siRNAs的小片段。具有本发明的RNAi效应的双链RNAs也包括DICER引起降解之前的双链RNAs。换句话说，因为预计即使没有RNAi效应的长RNA会在细胞内降解形成具有RNAi效应的siRNAs，因此本发明的双链RNAs的长度不特别受限制。
例如：可以用DICER预降解相当于本发明的OCT3基因的mRNA的全长或几乎全长区域的长双链RNA，降解产物可以用作治疗精神疾病的药物。预计这种降解产物包括具有RNAi效应的双链RNA分子(siRNAs)。在这种方法中，选择预计具有RNAi效应的mRNA区域不是特别必需的。因此，在本发明的OCT3基因的mRNA上精确限定具有RNAi效应的区域(s)不是特别必需的。
就上述RNA分子而言，一端具有封闭结构的分子，例如包含发夹结构的siRNAs(shRNAs)也包含在本发明中。因此，能够在分子内形成双链RNA结构的单链RNA分子也包含在本发明中。
本领域熟练技术人员基于是双链RNAs的目标靶的本发明的OCT3基因的核苷酸序列，能够适当地构建本发明的上述″能通过RNAi效应进行抑制的双链RNAs″。举例来说，可以基于SEQ ID NO：1，3或5中的任何一个核苷酸序列构建本发明的双链RNA。因此，基于SEQ ID NO：1，3或5中的任何一个核苷酸序列，适当选择是核苷酸序列的转录产物的mRNA的任意连续RNA区域并构建相当于该区域的双链RNA在本领域熟练技术人员的标准操作范围内。本领域熟练技术人员也可以利用标准方法适当地从是该序列的转录产物的mRNA序列中选择具有较强的RNAi效应的siRNA序列。另外，如果确定了一条链(例如：SEQ ID NO：1，3或5中的任意一个核苷酸序列)，本领域熟练技术人员能很容易地知道另一条链(互补链)的核苷酸序列。利用市场上可买到的核酸合成仪，本领域熟练技术人员能适当地制备siRNAs。而且，可以用常见的委托合成服务合成想要的RNA。
而且，能表达本发明的上述RNAs的DNAs(载体)也包含在能抑制本发明的OCT3基因表达的化合物的优选实施例中。能表达本发明的上述双链RNAs的DNAs(载体)的实例有其中编码双链RNA的一条链的DNA和编码双链RNA的另一条链的DNA都与启动子连接使两条DNA都能够表达的DNAs。本领域熟练技术人员利用标准基因工程方法能适当地构建本发明的上述DNAs。更具体地，通过将编码本发明的RNAs的DNAs适当地插入到多种已知的表达载体中可以构建本发明的表达载体。
而且，本发明的表达抑制物质包括，例如：通过与OCT3表达调节区域(例如启动子区域)结合抑制OCT3表达的化合物。例如，通过利用化合物对OCT3启动子的DNA片段的结合活性作为指示物的筛选法，可以获得这种化合物。而且，本领域熟练技术人员利用公知的方法，包括报告物测定法能够适当地确定想要的化合物是否能够抑制本发明的OCT3表达。
而且，本发明提供包含抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂。抑制作为有机阳离子运载体的OCT3蛋白质的功能抑制有机阳离子，包括神经递质的转运，因此会提高神经递质的功能；因此，认为它在精神疾病的治疗中是有效的。而且，抑制这一功能的化合物被认为是有效的精神疾病治疗剂。
本发明中抑制OCT3蛋白质功能的物质包括，例如：下列(a)或(b)的化合物：
(a)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的抗体；
(b)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的小分子化合物。
利用本领域熟练技术人员已知的方法可以制备结合OCT3蛋白质的抗体(抗OCT3抗体)。当抗体是多克隆抗体时，例如可以利用下列方法制备：通过用天然OCT3蛋白质或在微生物，例如大肠杆菌中以GST融合蛋白质形式表达的(重组体)OCT3蛋白质或其部分肽免疫小动物，例如兔子，获取抗血清。利用硫酸铵沉淀，蛋白质A柱，蛋白质G柱，DEAE离子交换层析，其上固定了OCT3蛋白质或其合成肽的亲和层析柱等等，可以从血清中纯化抗体。另外，可以通过，例如用OCT3蛋白质或其部分肽免疫小动物，例如小鼠，接着除去脾脏，轻轻磨碎脾脏分离细胞，接着利用如聚乙二醇的试剂将细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，然后筛选融合的细胞(杂交瘤)选择出产生结合OCT3蛋白质的抗体的克隆的方法来制备单克隆抗体。然后将杂交瘤移植到小鼠腹腔中，并从同一只小鼠收集腹水。因此，利用如硫酸铵沉淀，蛋白质A柱，蛋白质G柱，DEAE离子交换层析，其上固定了OCT3蛋白质或合成肽的亲和层析柱等等可以纯化这样制备的单克隆抗体。
本发明的抗体形式不受特别限制，只要他们能够结合本发明的OCT3蛋白质就可以，除上述的多克隆抗体和单克隆抗体之外，抗体还包括人抗体，通过基因重组获得的人源化抗体以及他们的抗体片段和抗体修饰产物。
被用作获取抗体的致敏抗原的本发明的OCT3蛋白质在动物种类方面并不特别受限制，其中动物种类是从中获取该蛋白质的动物种类；但是，来源于哺乳动物的蛋白质，例如来源于小鼠或人的蛋白质是优选的，而且来源于人的蛋白质是特别优选的。本领域熟练技术人员利用本说明书公开的基因序列或氨基酸序列可以适当地获得人衍生蛋白质。
在本发明中用作免疫抗原的蛋白质可以是来源于那些蛋白质的全长蛋白质或部分肽。这种部分蛋白质肽包括，例如：蛋白质的氨基(N)末端片段和羧基(C)末端片段。这里使用的″抗体″指与全长蛋白质或其片段反应的抗体。
除通过用抗原免疫非人动物获取上述杂交瘤上之外，还可以通过用蛋白质，表达蛋白质的细胞或那些细胞的溶解产物致敏人淋巴细胞，例如感染了EB病毒的人淋巴细胞，并将这些致敏的淋巴细胞与永生的人骨髓瘤细胞，例如U266细胞融合在体外制备能产生想要的具有蛋白结合活性的人抗体的杂交瘤。
发明中针对OCT3蛋白质的抗体通过与OCT3蛋白质结合抑制其功能，因此例如可以预计其治疗或改善精神疾病的效果。当获取的抗体将施用给人(抗体治疗)时，为了降低抗原性优选人和人源化抗体。
而且，作为能抑制OCT3蛋白质功能的材料，本发明包括结合OCT3蛋白质的低分子量材料(小分子化合物)。在本发明中能结合OCT3蛋白质的低分子量材料可以是天然或人工化合物。通常，通过本领域技术人员熟知的方法可以合成或获取他们。而且，通过如下所述的筛选法可以获取本发明中的这种化合物。
而且，认为是OCT3蛋白质底物的化合物具有竞争抑制OCT3运载体活性的潜能。例如：已经已知β阻断剂(治疗心力衰竭等的药物)，例如普萘洛尔(propranorol)是通过OCT3转运的。β阻断剂不能通过血脑屏障，但是，可以被转运到中枢神经系统、能竞争抑制OCT3转运活性的β阻断剂类似物预计能抑制上述OCT3蛋白质在脑中的功能。也就是说，这种抑制剂也包括在本发明的上述小分子化合物中。
结合OCT3蛋白质的上述(b)的小分子化合物包括，例如对OCT3具有高亲合力的化合物。这种化合物的实例包括是去甲肾上腺素的非活性代谢物的去甲变肾上腺素。去甲变肾上腺素是上述小分子化合物的优选实例，因为如实施例所述已经证实它实际上具有抗抑郁活性。
而且，除去甲变肾上腺素之外，对OCT3具有亲合力的小分子化合物的实例包括3-甲氧基异丙肾上腺素、3-氧-甲基异丙肾上腺素、喹酮心安、(-)异丙肾上腺素、(-)肾上腺素、1-甲基-4-苯基吡啶(phenylpyridinium，MPP+)、2-氯乙基-3-肌氨酰胺-1-亚硝脲(2-chloroethyl-3-sarcosinamide-1-nitrosourea，SarCNU)、1，1′-二异丙基-2，4′-花青(disprocynium 24)、decynium 22、花青863、皮质甾酮、雌二醇、达舒平、利多卡因和普鲁卡因酰胺。
而且，上述化合物包括具有由其他目标靶介导的多种药理学效应，而不单独靶向OCT3的化合物。例如：3-甲氧基异丙肾上腺素、3-氧-甲基异丙肾上腺素、喹酮心安、(-)异丙肾上腺素、(-)肾上腺素具有抗高血压效应；SarCNU具有抗肿瘤效应；达舒平、利多卡因和普鲁卡因酰胺具有抗心律不齐效应；皮质甾酮和雌二醇具有甾类激素样效应。而且，1-甲基-4-苯基吡啶(phenylpyridinium)(MPP+)被称为多巴胺神经毒素。disprocynium 24、decynium 22和花青863是有效的OCT3抑制剂；但是，同时他们对其他OCT亚型也显示出有效的抑制活性。
因此，当不包括去甲变肾上腺素的上述化合物被用作本发明的药物制剂时，优选通过衍生上述化合物来除去对OCT3以外的目标靶的亲合力。因此，如上所述的各种化合物的衍生物作为本发明的小分子化合物也是有用的。
本发明的优选实施例提供包含对OCT3具有亲合力的化合物或这些化合物的衍生物作为活性成分的精神疾病治疗剂，其中化合物选自下列中的一种或多种：去甲变肾上腺素、3-甲氧基异丙肾上腺素、3-氧-甲基异丙肾上腺素、喹酮心安、(-)异丙肾上腺素、(-)肾上腺素、1-甲基-4-苯基吡啶(phenylpyridinium)(MPP+)、2-氯乙基-3-肌氨酰胺-1-亚硝脲(2-chloroethyl-3-sarcosinamide-1-nitrosourea，SarCNU)、1，1′-二异丙基-2，4′-花青(disprocynium 24)、decynium 22、花青863、皮质甾酮、雌二醇、达舒平、利多卡因和普鲁卡因酰胺组成的群组。
而且，在本发明中能抑制OCT3蛋白质功能的物质包括具有针对OCT3蛋白质的显性负性特性的OCT3蛋白质突变体。″具有针对OCT3蛋白质的显性负性特性的OCT3蛋白质突变体″是具有通过表达编码该蛋白质的基因，来减少或降低内源野生型蛋白质活性的功能的蛋白质。
而且，通过以本发明的OCT3的阳离子运载体活性作为指示物的筛选法可以适当地获取本发明的功能抑制物质。
而且，本发明提供包含增强有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达或功能(活化)的物质作为活性成分的治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。上述″蛋白质表达增强″包括基因转录的增强，转录产物的翻译增强等等。
通常，精神兴奋剂是用来保持清醒和消除疲劳的中枢神经系统兴奋剂，通常指脱氧麻黄碱或与脱氧麻黄碱相似的合成药物。本发明中精神兴奋剂也包括上述脱氧麻黄碱之外的化合物，而且精神兴奋剂类似物等等也包括在其中。例如：脱氧麻黄碱以外的精神兴奋剂包括安非他明和MDMA。而且，精神兴奋剂类似物包括，例如：苯哌啶醋酸甲酯(商品名：利他林)。
安非他明和脱氧麻黄碱具有非常相似的化学结构，而且会引起相同的药理学效应。其滥用在日本已构成问题最多的精神兴奋剂是通常以其盐酸化物形式被非法销售和滥用的脱氧麻黄碱。附着了一个甲基的脱氧麻黄碱具有更高的药理学效能。
精神兴奋剂的使用会引起心率、呼吸和血压增加、瞳孔扩张和食欲下降。依赖性会随着精神兴奋剂的连续使用而发生，依赖性的症状包括出汗，头痛，视力模糊，眩晕，失眠，焦虑，以及对精神兴奋剂的敏感性增加(反向耐受性)等等。反向耐受现象会持续较长的时期，而且在连续使用精神兴奋剂之后，即使长期停药也很容易再次出现。用现有的精神疾病治疗剂不能治疗它，因此认为它是神经元功能的不可逆变化引起的。当重复给实验动物施用精神兴奋剂时，观察到精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加，而且用现有的精神疾病治疗剂是不能治疗这一现象。因此，可作为精神兴奋剂替代物的能增加自发运动活性的物质作为治疗精神兴奋剂依赖的制剂是有效的。在本发明中，当小鼠中的OCT3蛋白质的表达被抑制时，观察到与重复施用精神兴奋剂引起的反向耐受现象相同的行为。也就是说，增强OCT3蛋白质表达或功能(活性)的制剂作为治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂是有效的。
本领域熟练技术人员利用如上所述的报告物测定或者通过以OCT3运载体活性作为指示物的方法，能够获取本发明的上述功能增强制剂。
而且，本发明的抑制OCT3基因表达的物质和抑制OCT3蛋白质功能的物质本身对精神疾病，例如，抑郁症和焦虑性神经症具有治疗作用；但是，当与已知的抗抑郁剂一起使用时，他们也具有增强抗抑郁剂的效果的活性。
因此，本发明提供包含抑制OCT3基因表达的物质或者抑制OCT3蛋白质功能的物质作为活性成分的抗抑郁活性增强剂(抗抑郁剂伴随制剂)。而且，本发明涉及包含本发明的抗抑郁剂和抗抑郁活性增强制剂作为活性成分的药物组合物。
与本发明的抗抑郁剂作用增强制剂联合使用时其作用(效应)被增强的抗抑郁剂的实例有丙咪嗪、包括结构与丙咪嗪相似的三环抗抑郁药的典型抗抑郁剂、选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)，以及5-羟色胺和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(SNRI)。
而且，本发明提供以人工抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达为特征的OCT3敲除非人动物(在这里有时被称为″敲除的非人动物″或简称″动物″)。
本发明的基因敲除非人动物可用于筛选精神疾病，例如抑郁症和焦虑性神经症的治疗药物。而且，他们作为分析上述疾病机理的疾病动物模型是非常有用的。
本发明的敲除动物包括其中基因表达在反义RNAs或者siRNAs的作用下被抑制的所谓的″knockdown animal″。
这里使用的″OCT3基因表达被人工抑制″指，例如：(1)OCT3基因表达被OCT3基因的一个或两个基因对的突变，例如，插入、缺失和qudai抑制的情形，(2)基因表达被本发明的核酸(例如，反义RNAs或siRNAs)的作用抑制的情形。
这里使用的术语″抑制″包括与野生型动物相比，本发明的动物中OCT基因表达的完全抑制和OCT3表达量的显著降低。
上述(1)包括只抑制OCT3基因的基因对中的一个基因的表达。基因突变位点在本发明不受限制，只要位点能抑制基因表达就可以。例如：它包括外显子位点和启动子区域。
本领域熟练技术人员利用通常已知的基因工程方法能够产生本发明的敲除动物。例如：按照如下方法能够产生敲除小鼠：首先，从小鼠中分离包含本发明的OCT3基因的外显子部分的DNA，并将合适的标记基因插入该DNA片段中构建出靶向载体。通过电穿孔等的方法将靶向载体导入小鼠ES细胞系，并选择已经发生同源重组的细胞系。插入的标记基因优选是抗生素抗性基因，例如，新霉素抗性基因。当抗生素抗性基因被插入时，通过在包含该抗生素的培养基中简单培养细胞可以选择已经发生同源重组的细胞系。而且，当胸苷激酶这样的基因被连接到靶向载体上时，进行更高效的选择是可能的。这样可以清除发生非同源重组的细胞系。而且，为了高效获取本发明的基因的基因对中的一个基因在其中失活的细胞系，可以通过PCR和Southern印迹对同源重组体进行检验。
当选择其中同源重组已经发生的细胞系时，因为在同源重组位点以外的位点有基因插入引起的未知的基因破坏的危险，因此优选使用多重克隆以产生嵌合体。通过将获取的ES细胞系注射到小鼠胚层中，可以获取嵌合的小鼠。通过杂交这些嵌合的小鼠，可以获得本发明的OCT3基因的基因对中的一个基因在其中失活的小鼠。更进一步地，通过杂交这些嵌合的小鼠，可以获得其中本发明的基因的基因对中的两个基因都失活的小鼠。使用类似的方法可以遗传修饰小鼠以外的、已经建立ES细胞的动物。
本发明的上述敲除动物优选是以OCT3基因表达抑制为特征的敲除(knockout)(knockdown)动物，其中抑制是由于将本发明的上述核酸引入非人动物中引起的。
通过将具有能使本发明的核酸(反义RNAs，siRNAs)表达的结构的载体引入非人动物可以构建上述knockdown动物。
而且，构建本发明的如上构建的敲除非人动物的方法也包括在本发明内。目前构建方法的优选实施例是包括将本发明的核酸施用到本发明的动物脑中的步骤的构建敲除非人动物的方法。更具体地说，例如：该方法包括将针对OCT基因转录产物或其部分的反义核酸施用到本发明的动物脑中，优选施用到脑室的步骤。例如，可以通过实施例中描述的方法完成给药过程。
本发明的上述反义核酸并不特别受限制；但是，优选将他们设计成具有如下特征：(1)他们是包含目标基因OCT3的起始密码子的反义序列；(2)反义序列的合适长度的是18-25mer；(3)起始密码子上游的长度优选不太长，因为有覆盖转录控制区域的可能；(4)避免导致反义序列形成单体(单链与自身结合)或二聚体(两条反义链互相与彼此结合)的设计。
在本发明中，敲除动物的种类不受限制，只要他们是非人动物就可以；但是，他们通常是哺乳动物，优选灵长目动物。更具体地，本发明的动物优选是啮齿类动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠(鼠类)或猴子，更优选小鼠或猴子。
在优选实施例中，本发明的基因敲除非人动物不受限制；但是，动物中OCT3基因的表达被核酸(a)到(c)中的任何一种的作用抑制。
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸。
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸。
(c)具有利用RNAi效应抑制OCT3基因表达活性的核酸。
本发明的OCT3基因敲除(knockout)(knockdown)非人动物是以显示出与精神疾病，例如抑郁症，焦虑性神经症和精神兴奋剂依赖相关的表型为特征的动物。更具体地，本发明的动物是特征在于显示下列表型(a)到(c)中的至少一种表型的基因敲除非人动物：
(a)抗抑郁症样作用
(b)增加的精神兴奋剂诱导的自发运动活性
(c)抗焦虑作用
当让实验动物在防止他们接触底部和爬出来的容器中游泳后再让他们又在相同的容器中游泳(强迫游泳测试)时，动物陷于绝望状态，而且在大部分实验时间显示不动。认为这一情形是″抑郁症″。其中不动(″抑郁状态″)被改善或完全减弱的动物是本发明的显示上述表型(a)，即″抗抑郁症样作用”的动物的实例。
依赖会随着重复使用精神兴奋剂而发生，其症状包括对精神兴奋剂的敏感性增加(反向耐受性)。在给实验动物重复施用精神兴奋剂时，也观察到精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加。具有这一状态的动物是本发明的显示上述表型(b)，即″增加的精神兴奋剂诱导的自发运动活性″的动物的实例。
而且，当暴露于新的开放空间时，动物最初显示出探究行为(移动和举起(rearing)行为)；但是，这种行为随时间减弱。上述行为减弱而维持探究行为的动物是本发明的显示上述表型(c)，即″抗焦虑作用″的动物的实例。
本发明的上述动物对于筛选精神疾病治疗剂，鉴定精神疾病病因，以及分析化学制剂依赖的发生机理非常有用。
而且，本发明提供了筛选精神疾病(例如，抑郁症和焦虑性神经症)和精神兴奋剂依赖的治疗剂的方法，而且提供了鉴定引起精神疾病的化合物的方法。上述″治疗剂″也包括伴随治疗药物的制剂(治疗药物作用增强剂)。因此，本发明的一个实施例涉及筛选在治疗精神疾病(例如，抑郁症和焦虑性神经症)或精神兴奋剂依赖时使用的伴随药物(例如，治疗药物作用增强剂)的方法。
本发明的筛选方法的优选实施例是利用与有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽的结合作为指示物的方法。通常，预计结合OCT3蛋白质或其部分肽的化合物具有抑制OCT3蛋白质功能的效果。
更详细地说，本发明的上述方法包括下列步骤(a)到(c)：
(a)让有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽接触测试化合物；
(b)测定蛋白质或其部分肽与测试化合物的结合活性；和
(c)选择结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽的化合物；
在本发明的上述方法中，测试化合物首先接触OCT3蛋白质或其部分肽。依据检测测试化合物与OCT3蛋白质或其部分肽的结合的指示物，OCT3蛋白质或其部分肽可以是，例如，纯化形式、细胞内或细胞外表达的形式，或结合亲和层析柱的形式。根据需要可以适当地标记这些方法中使用的测试化合物。标记包括放射标记、荧光标记等等。
接着在本发明中，测定测试化合物对OCT3蛋白质或其部分肽的结合活性。例如，可以利用附着于结合OCT3蛋白质或其部分肽的测试化合物上的标记检测测试化合物与OCT3蛋白质或其部分肽的结合。另外，可以将检测OCT3蛋白质活性的变化作为指示物，其中当测试化合物结合细胞内或细胞外表达的OCT3蛋白质或其部分肽时，会导致变化发生。
然后在本发明中选择结合OCT3蛋白质或其部分肽的测试化合物。
预计通过本发明的方法选择出(获得)的化合物具有对OCT3蛋白质的抑制效应。例如：预计他们是治疗精神疾病的药物(例如，治疗药物或治疗药物作用增强剂)。
在本发明的筛选方法的另一个实施例中，OCT3基因的表达水平被用作信号。降低OCT3基因表达水平的化合物预计是精神疾病治疗剂。另一方面，增加OCT3基因表达水平的化合物预计是治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。
本发明的上述方法是筛选精神疾病治疗剂的方法。例如，该方法包括下列步骤(a)到(c)：
(a)让表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞接触测试化合物；
(b)测定所述有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择降低所述表达水平的化合物，其中所述表达水平与不存在测试化合物时测量的表达水平进行比较。
而且，本发明的上述方法是筛选治疗精神兴奋剂依赖的制剂的方法。例如，该方法包括下列步骤(a)到(c)：
(a)让表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞接触测试化合物；
(b)测定所述有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择增加所述表达水平的化合物，其中所述表达水平与不存在测试化合物时测量的表达水平进行比较。
在本发明中，测试化合物首先接触表达OCT3基因的细胞。使用的″细胞″来源包括来源于人、小鼠、大鼠等等的细胞，但不局限于此。表达内源OCT3基因的细胞或表达已经被导入细胞的外源OCT3基因的细胞可以作为″表达OCT3基因的细胞″使用。通常通过将包含OCT3基因的表达载体引入宿主细胞，可以构建出表达外源OCT3基因的细胞。通过一般的基因工程方法可以构建这种表达载体。
在本发明的方法中使用的测试化合物不特别受限制，包括，例如：单个化合物，例如，天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质，肽，以及化学制剂库(chemical libraries)、来自基因库的表达产物、细胞抽提物、细胞培养上清液、细菌发酵产物、海洋生物提取物和植物提取物。
非限制的典型情形是，通过将测试化合物添加到表达OCT3基因的细胞的培养基中使测试化合物接触表达OCT3基因的细胞。当测试化合物是蛋白质时，可以通过将允许蛋白质表达的DNA载体引入细胞来实现接触。
这些方法的下一步包括确定OCT3基因的表达水平。在这里短语″基因表达″指转录和翻译两个过程。利用本领域熟练技术人员已知的方法可以确定基因表达水平。例如，可以依照常规方法从表达OCT3基因的细胞提取mRNAs，并利用这些mRNA作为模板，然后利用Northern杂交或RT-PCR可以确定基因的转录水平。或者，通过收集来自表达OCT3家族基因的细胞的蛋白质级分，然后利用电泳法，例如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可以检测OCT3蛋白质的表达。而且，利用针对OCT3蛋白质的抗体，通过Western印迹分析检测OCT3蛋白质的表达可以确定该基因的翻译水平。用于检测OCT3蛋白质的抗体的种类不受限制，只要可以检测蛋白质就行。这种抗体包括，例如：单克隆和多克隆抗体。
接下来，在本发明的方法中选择了增加或降低表达水平的化合物，其中表达水平与没有接触测试化合物时测定的水平(对照)相比较。引起降低的化合物是治疗精神疾病的制剂，而引起增加的化合物是治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。
本发明的筛选方法的另一个实施例是利用报告基因的表达作为指示物，鉴定降低或增加本发明的有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平的化合物的方法。
本发明的上述方法是筛选精神疾病治疗剂的方法，包括，例如，下列步骤(a)到(c)；
(a)让测试化合物接触包含DNA的细胞，所述DNA具有如下结构，该结构使报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并
(c)选择降低所述表达水平的化合物，其中所述表达水平与不存在测试化合物时测量的表达水平进行比较。
而且，本发明的上述方法是筛选治疗精神兴奋剂依赖的制剂的方法，包括，例如：下列步骤(a)到(c)：
(a)让测试化合物接触包含DNA的细胞，所述DNA具有如下结构，该结构使报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定所述报告基因的表达水平；并
(c)选择增加所述表达水平的化合物，其中所述表达水平与不存在测试化合物时测量的表达水平进行比较。
在这些方法中，测试化合物首先接触包含DNA的细胞(或这些细胞的提取物)，，所述DNA具有如下结构，其中在该结构中报告基因可操作性地与OCT3基因的转录调控区域连接。这里使用的短语″可操作性地连接″指OCT3基因的转录调控区域以如下方式与报告基因连接，当转录因子结合OCT3基因的转录调控区域时，这种连接方式会诱导报告基因表达。因此，即使报告者基因和另一个基因连接并因此与该基因产物形成融合蛋白质，仍可以利用该短语″可操作性地连接″来表述这种连接，只要当转录因子结合OCT3基因的转录调控区域时能诱导融合蛋白质的表达就可以。利用已知方法，以OCT3基因的cDNA核苷酸序列为基础，本领域熟练技术人员可以从基因组中获取OCT3基因的转录调控区域。
这些方法中使用的报告基因的种类不受限制，只要其表达可以检测就行。这种报告基因包括，例如：CAT基因、lacz基因、荧光素酶基因和GFP基因。″包含具有如下结构的DNA以使得报告基因与OCT3基因的转录调控区域可操作性地连接的细胞″包括，例如：导入了插入这种结构的载体的细胞。利用常规基因工程技术，本领域熟练技术人员可以制备这种载体。利用常规方法，例如磷酸钙沉淀，电穿孔，lipofectamine方法，显微注射等等可以将这种载体导入细胞。″包含具有如下结构的DNA以使得报告基因与OCT3基因的转录调控区域可操作性地连接的细胞″也包括这种结构已经被插入它们的染色体的细胞。利用本领域熟练技术人员常规使用的方法，例如，利用同源重组的基因转移方法，可以将DNA结构插入染色体。
这些″包含具有如下结构的DNA以使得报告基因与OCT3基因的转录调控区域可操作性地连接的细胞″的提取物包括，例如通过将DNAs添加到市场上可买到的体外转录翻译试剂盒中包括的细胞抽提物中制备得到的混合物，其中添加的DNAs包含如下结构，使得报告基因与OCT3基因的转录调控区域可操作性地连接。
在该方法中，通过将测试化合物添加到″包含具有如下结构的DNA，以使得报告基因与OCT3基因的转录调控区域可操作性地连接的细胞″的培养基中，或者通过将测试化合物添加到包含这种DNAs的上述市场上可买到的细胞抽提物中，可以实现″接触″。当测试化合物是蛋白质时，例如，通过将表达那些蛋白质的DNA载体引入细胞可以实现接触。
这些方法的下一步是确定报告基因的表达水平。，可以依据报告基因的种类，通过本领域熟练技术人员已知的方法确定报告基因的表达水平。例如，当报告基因是CAT基因时，可以通过检测由CAT基因产物介导的氯霉素的乙酰化来确定其表达水平。当报告基因是lacZ基因时，通过检测lacZ基因表达产物的催化作用介导的在产色化合物中的显色变化，可以确定其表达水平。当报告基因是荧光素酶基因时，通过检测由荧光素酶基因表达产物的催化作用介导的荧光化合物的荧光，可以确定其表达水平。另外，当报告基因是GFP基因时，通过检测GFP蛋白质的荧光可以确定其表达水平。
在本发明的方法中，选择出了降低(抑制)或增加(增强)报告基因的表达水平的化合物，其中所述表达水平与不存在测试化合物时测量的表达水平进行比较。引起降低(抑制)的化合物变成治疗精神疾病的制剂，而引起增加(增强)的化合物变成治疗精神兴奋剂依赖的制剂。
本发明的筛选方法的另一个实施例利用有机阳离子运载体OCT3蛋白质的活性作为指示物。
本发明的上述方法是筛选治疗精神疾病的制剂的方法，包括，例如，下列步骤(a)到(c)；
(a)让有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达所述蛋白质的细胞或细胞抽提物接触测试化合物；
(b)测定所述蛋白质的活性；和
(c)选择降低所述蛋白质的活性的化合物，其中所述活性与不存在测试化合物时测量的活性进行比较。
而且，本发明的上述方法是筛选治疗精神兴奋剂依赖的制剂的方法，包括，例如，下列步骤(a)到(c)：
(a)让有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达所述蛋白质的细胞或细胞抽提物接触测试化合物；
(b)测定所述蛋白质的活性；和
(c)选择增加所述蛋白质的活性的化合物，其中所述活性与不存在测试化合物时测量的活性进行比较。
在本方法中，有机阳离子运载体OCT3蛋白质，或表达所述蛋白质的细胞或细胞抽提物首先接触测试化合物。
然后，测定OCT3蛋白质的活性。OCT3蛋白质的活性包括，例如，转运单胺和单胺有关试剂的活性。更具体地说，包括转运多巴胺、5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺神经毒素MPP+、精神兴奋剂等等的活性。利用本领域熟练技术人员公知的方法可以对活性进行测量。
例如：通过用放射性同位素标记可以被OCT3转运的上述物质，接着将这些材料暴露在测试化合物和表达OCT3的细胞中，然后在一定时间周期之后比较细胞吸收的放射性同位素标记的物质的放射性，可以对转运上述单胺和单胺有关试剂的活性的调节进行评估。即使不可能利用放射性同位素标记，也可以通过测量装置，例如高效液相色谱法(HPLC)评估转运上述单胺和单胺有关试剂的活性，如果物质的胞内浓度足够高的话。
更进一步地，选择降低(抑制)或增加(增强)所述蛋白质活性的化合物，其中所述活性与不存在测试化合物时测量的活性进行比较。降低(抑制)活性的化合物变成治疗精神疾病的制剂，而增加(增强)活性的化合物变成治疗精神兴奋剂依赖的制剂。
本发明更进一步地涉及利用本发明的上述动物鉴定引起精神疾病的化合物和筛选治疗精神兴奋剂依赖的制剂的方法。
本发明的方法是鉴定引起精神疾病的化合物的方法，包括下列步骤(a)到(c)：
(a)给本发明的基因敲除非人动物施用测试化合物；
(b)观察依赖于上述非人动物表型的行为；和
(c)确定消除依赖于上述表型的行为的化合物是引起精神疾病的化合物。
本发明的方法是鉴定引起精神疾病的化合物的方法，其中用依赖于本发明的动物的表型的行为作指示物。
首先，将测试化合物施用给上述基因敲除非人动物。可以通过口服或肠胃外途径施用测试化合物；但是，优选肠胃外给药，特别是注射、经鼻给药、经肺给药或经皮给药等等。注射类型的实例有，例如：静脉注射、肌内内注射、腹膜内注射和皮下注射。可以系统或局部施用注射剂。
当DNAs是测试化合物时，可以通过病毒载体，例如逆转录病毒、腺病毒，仙台病毒和非病毒载体，例如脂质体将他们施用到体内。施用方法的实例包括体内和先体外后体内(ex vivo)方法。
然后在本方法中观察依赖于OCT3基因敲除非人动物表型的行为。OCT3基因敲除非人动物的表型优选显示出，例如(a)抗抑郁症样作用或(c)抗焦虑作用。
特别地，在上述方法中，″依赖于上述表型的行为被消除″指，例如，强迫游泳测试中不动状态的丧失和在新地方的探究行为(移动，举起行为等等)的持续。
而且，在本发明中，选择消除依赖于这些表型的行为的化合物。确定选择的化合物是引起精神疾病的化合物。用这些已经鉴定的引起精神疾病的化合物作为阐明精神疾病机理的试剂是有用的。
而且，本发明的上述方法是筛选治疗精神兴奋剂依赖的制剂的方法，包括下列步骤(a)到(c)：
(a)给本发明的基因敲除非人动物施用测试化合物；
(b)观察依赖上述非人动物表型的精神兴奋剂诱导的自发运动活性；和
(c)选择消除(降低)上述运动活性的化合物。
确定在上述步骤(c)中选出的化合物是治疗精神兴奋剂依赖的制剂。
当利用本发明的试剂或治疗化合物作为药物制剂时，可以直接将试剂和化合物施用给病人，也可以以通过已知制药方法制备的药物组合物形式施用它们。例如：通过与药理学上可接受的载体(例如，赋形剂、粘合剂、崩解剂、调味剂、矫正剂、乳化剂、稀释剂和增溶剂)混合，可以将本发明的药物或化合物配制成适合口服或肠胃外给药的形式，例如片剂、丸剂、粉剂、颗粒、胶囊、锭剂、糖浆、液体、乳状液、悬浮液、注射剂(例如，液体和悬浮液)、栓剂、吸入剂、经皮吸收剂、滴眼剂和眼膏。
本发明也涉及治疗或预防精神疾病的方法，该方法包括给个体(例如，病人等等)施用本发明的精神疾病治疗剂或抗抑郁作用增强剂。本发明也涉及治疗或预防精神兴奋剂依赖的方法，该方法包括给个体(例如，病人等等)施用本发明的治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。
本发明的治疗方法中的个体通常是具有上述疾病的病人，对他们没有特殊限制；但优选的个体是人。
通常利用本领域熟练技术人员已知的方法，例如动脉内注射、静脉注射和皮下注射给病人施用药物。施用的剂量会随病人的体重和年龄，给药方法等而变化，但本领域熟练技术人员能够恰当选择合适的剂量。而且，如果化合物可由DNAs编码，就可以将DNAs整合到基因治疗载体中以实施基因治疗。
基因治疗载体的实例包括病毒载体，例如逆转录病毒载体、腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，以及非病毒载体，例如脂质体。利用这些载体，可以通过先体外后体内方法，体内方法等等将目的DNAs施用到病人体内。
而且，本发明涉及抑制OCT3表达或OCT3功能的物质在制备治疗精神疾病的治疗剂或制备抗抑郁剂作用增强剂中的用途。
这里引用的全部在前参考文献都在此引入作为参考。
实施例
在下文中参考实施例对本发明进行了具体解释，但是不应认为本发明被限制于此。
[实施例1]调节OCT3表达对抑郁症样症状的影响
当让已经在防止实验动物接触容器底部和爬出来的容器中游泳的实验动物再次在相同的容器中游泳时，动物陷于绝望状态，而且大部分实验时间显示不动。施用抗抑郁剂(实例：利眠宁100mg/kg，丙咪嗪16mg/kg)会缩短这一不动状态，因此筛选抗抑郁剂时，经常会使用这一实验(强迫游泳测试)(Behav Brain Res.73，43-46，1996)。因此，在这个模型中，本发明人研究了调节OCT3表达的影响，以及其与抗抑郁剂-丙咪嗪的联合使用。
用雄性ddY小鼠进行实验。让购买后饲养了三天或三天以上的小鼠在烧杯(直径15cm，高度20cm)中游泳300秒。测量不动的时间，然后将小鼠分组，使每个组的平均不动时间大约相同。在游泳次日，依照报告文献(J.Chem.Neuroanat.2000.20：375-87)利用渗透泵，将构建自OCT3基因序列的反义序列(OCT3反义序列)连续地输注到脑室中。更进一步地，也准备输注Ringer溶液(是反义序列的溶剂)的组(溶剂组)和输注具有与反义序列相同碱基、但是与已知基因没有同源性的随机序列的cDNA序列的组(混杂OCT3反义组)，其中Ringer溶液是反义溶剂。在输注一星期后，让小鼠回到烧杯中让他们游泳300秒，测量不动时间。在这次测试开始前30分钟，腹膜内施用抗抑郁剂丙咪嗪。
结果显示在溶剂组出现了抑郁症样症状，而且小鼠在300秒游泳时间的大部分时间里显示不动(平均值：234±9秒)(图1A)。在连续输注OCT3反义序列(0.25μg/0.25μl/hr)的组，不动显著降低(平均值：69±13秒)。混杂的OCT3反义组不显示任何影响(平均值：236±6秒)(图1A)。
也研究了联合使用抗抑郁剂的影响。在强迫游泳测试中，在溶剂组(平均值：242±4秒)和低剂量抗抑郁剂丙咪嗪组(4mg/kg)或低剂量OCT3反义组(0.075μg/0.25μl/hr)之间没有观察到差异[丙咪嗪组(4mg/kg)平均值：245±15秒；OCT3反义组(0.075μg/0.25μl/hr)平均值：241±6秒]。但是，他们的联合使用显著减少了不动状态(平均值：123±33秒)(图1B)。
接下来，研究了对OCT3具有高亲合力的去甲变肾上腺素的影响。如实施上述反义实验一样，在第一次强迫游泳测试的次日，连续地将去甲变肾上腺素输注到脑室中(2.5μg/0.25μl/hr)。在输注一星期后，让小鼠再次在烧杯中游泳，测量不动时间。结果与溶剂组(平均值：228±13秒)相比，去甲变肾上腺素显著降低了不动时间(平均值：108±29秒)(图2)。
更进一步地，与假手术组相比，脑室内输注(一到两周)OCT3反义序列会降低脑中OCT3表达大约30％。但是，这一效果与前面报道的将反义序列输注到脑室中的效果基本相同(图3)。在混杂OCT3反义组，OCT3表达不受影响(图3)。
[实施例2]OCT3表达调节对药物依赖样症状的影响
连续使用精神兴奋剂会导致依赖性的发生，其症状包括对精神兴奋剂的敏感性增加(反向耐受性)。反向耐受现象会持续较长时间，而且在连续使用精神兴奋剂之后，即使长期停药也很容易再次出现。其用现有的精神疾病治疗药物不能治疗，因此认为它是神经元功能的不可逆变化引起的。当重复给实验动物施用精神兴奋剂时，观察到精神兴奋剂依赖的自发运动活性增加，而且用现有的精神疾病治疗药物不能治疗这一现象。因此，经常利用由重复给实验动物施用精神兴奋剂引起的精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加来分析药物依赖发生的机理。因此，在这个模型中，本发明的发明人研究了OCT3表达调节的影响。
用雄性ddY小鼠进行实验。饲养了三天或三天以上的小鼠被分成两组。依照报告文献(J.Chem.Neuroanat.2000.20：375-87)利用渗透泵，将构建自OCT3基因序列的反义序列(OCT3反义序列)连续地输注到一组的脑室中。另一组接受假手术。在输注一星期后施用精神兴奋剂脱氧麻黄碱(1mg/kg)，并测量精神兴奋剂诱导的自发运动活性。
结果显示输注OCT3反义序列的小鼠中精神兴奋剂诱导的自发运动活性增加。也就是说，即使单次施用精神兴奋剂仍会显示与重复施用精神兴奋剂诱导的反向耐受现象相同的行为(图4)。而且，与假手术组相比，脑室内输注(一到两周)OCT3反义序列会降低脑中OCT3表达大约30％。但是，这一效果与前面报道的将反义序列输注到脑室中的效果基本相同。
[实施例3]调节OCT3表达对新地方的焦虑和探究行为的影响
当暴露于新的开放空间时，动物会显示出探究行为(移动和举起行为)；但是这种行为会随时间推移而减少。因为给药抗焦虑药物减少了探究行为随时间推移而减少的这种行为，动物保持了它们的探究行为，它们可被用于筛选抗焦虑药物。因此，在这个模型中，本发明人研究了调节OCT3表达的影响。
用雄性ddY小鼠进行实验。饲养了三天或三天以上的小鼠被分成两组。依照报告文献(J.Chem.Neuroannant.2000.20：375-87)用渗透泵，将构建自OCT3基因序列的反义序列(OCT3反义序列)连续地输注到一组的脑室中。另一个组接受假手术。输注一周后，将动物放在新的大笼子中，测量移动和举起行为90分钟。
结果，在假手术组，移动随时间减少；但是将输注OCT3反义序列的小鼠放在笼子里后，他们的移动立即显示出显著增加，而且这一行为会延续90分钟(右侧，图5)。更进一步地，在输注OCT3反义序列的小鼠中也观察到探究行为的另一个迹象举起行为的显著增加(左侧，图5)。而且，与假手术组相比，脑室内输注(一到两周)OCT3反义序列会降低脑中OCT3表达大约30％。但是，这一效果与前面报道的将反义序列输注到脑室中的效果基本相同。
工业实用性
本发明人首次构建的OCT3基因敲除动物显示出很容易与野生型动物的表型相区别的与精神疾病有关的表型。利用本发明所述的动物可以进行对精神疾病，例如抑郁症、焦虑性神经症和药物依赖相关的化合物或这些精神疾病治疗剂的筛选。通过本发明的筛选方法获得的化合物实际上具有在动物水平改变表型的效果，因此预计他们是高效的制剂。
而且，本发明的上述动物作为阐明每个精神疾病机理的疾病模型动物是非常有用的。具有本发明的抗抑郁表型的小鼠显示出显著的抗抑郁效应(例如，在强迫游泳测试中，游泳超过五分钟)，因此作为疾病模型动物非常有用。
而且，本发明也在动物试验水平证明调节OCT3表达的物质实际上对上述紊乱具有治疗作用。也就是说，利用反义序列和载体通过基因转移调节OCT3表达，以及利用高度特异的小分子化合物调节OCT3的功能对治疗上述紊乱是有用的。
除遗传因素之外，也强烈指出环境因素，例如应激，与精神疾病，例如抑郁症和焦虑有关，因此当暴露于严重的应激中时，即使健康的个体也可能发展成这种紊乱。因此，发明人的通过施用反义序列降低目标分子OCT3的表达在正常动物中能获得抗焦虑和抗抑郁效应的发现是一项重大发现，这一有价值的发现显示OCT3功能调节对受环境因素大大影响的抑郁症和焦虑如何重要。
更进一步地，发现本发明的抑制OCT3表达的物质具有增强抗抑郁剂活性的效果。因此，所述物质可以作为抗抑郁作用增强剂起作用，而且作为现有的抗抑郁剂的伴随药物非常有用。通过联合使用本发明的抗抑郁作用增强剂可以促进抗抑郁活性，即使现有的抗抑郁剂的剂量不能显示充分的抗抑郁效果时也会出现这一结果。例如：当现有的抗抑郁剂因为副作用难以足量施用时，通过联合使用本发明的抗抑郁剂增强活性，利用可使所述副作用降低的低剂量可以获得预期效果。

Claims (26)

1.包含抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂。
2.权利要求1的治疗剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达的物质是选自下列中的一种或多种的化合物：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；或
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸。
3.包含抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质作为活性成分的精神疾病治疗剂。
4.权利要求3的治疗剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质是下列(a)或(b)的化合物：
(a)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的抗体；和
(b)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的小分子化合物。
5.权利要求1-4任一项的治疗剂，其中精神疾病是抑郁症或焦虑性神经症。
6.包含增强有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达或功能的物质作为活性成分的治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂。
7.基因敲除非人动物，其中有机阳离子运载体OCT3基因的表达被人工抑制。
8.权利要求7的基因敲除非人动物，其中OCT3基因的表达被下列任何一种核酸的作用抑制：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；和
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸。
9.权利要求7的基因敲除非人动物，其显示下列任何一种表型：
(a)抗抑郁症样作用；
(b)精神兴奋剂诱导的自发运动活性增强；和
(c)抗焦虑作用。
10.权利要求7-9任一项的基因敲除非人动物，其中非人动物是啮齿类动物。
11.筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽；
(b)测定蛋白质或其部分肽与测试化合物的结合活性；和
(c)选择结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质或其部分肽的化合物。
12.筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞；
(b)测定有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较。
13.筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触包含DNA的细胞，所述DNA含有如下结构，在所述结构中报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定报告基因的表达水平；和
(c)选择降低表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较。
14.筛选精神疾病治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达该蛋白质的细胞或细胞抽提物；
(b)测定蛋白质的活性；和
(c)选择降低蛋白质活性的化合物，其中蛋白质的活性与不存在测试化合物时测定的活性进行比较。
15.鉴定引起精神疾病的化合物的方法，包括步骤：
(a)给权利要求7-10任一项的基因敲除非人动物施用测试化合物；
(b)观察依赖于非人动物表型的行为；和
(c)确定消除依赖于该表型的行为的化合物是引起精神疾病的化合物。
16.权利要求11-15任一项的方法，其中精神疾病是抑郁症或焦虑性神经症。
17.筛选治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触表达有机阳离子运载体OCT3基因的细胞；
(b)测定有机阳离子运载体OCT3基因的表达水平；和
(c)选择增加表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较。
18.筛选治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触包含含有一种结构的DNA的细胞，在该结构中报告基因可操作性地与有机阳离子运载体OCT3基因的转录控制区域连接；
(b)测定报告基因的表达水平；和
(c)选择增加表达水平的化合物，其中表达水平与不存在测试化合物时测定的表达水平进行比较。
19.筛选治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂的方法，包括步骤：
(a)让测试化合物接触有机阳离子运载体OCT3蛋白质或表达该蛋白质的细胞或细胞抽提物；
(b)测定蛋白质的活性；和
(c)选择增加蛋白质活性的化合物，其中蛋白质的活性与不存在测试化合物时测定的活性进行比较。
20.筛选治疗精神兴奋剂依赖的治疗剂的方法，包括步骤：
(a)给权利要求7-10任一项的基因敲除非人动物施用测试化合物；
(b)观察依赖于非人动物表型的精神兴奋剂诱导的自发运动活性；和
(c)选择消除运动活性的化合物。
21.构建权利要求7的基因敲除非人动物的方法，包括将针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸施用到非人动物脑中的步骤。
22.包含抑制有机阳离子运载体OCT3基因表达的物质作为活性成分的抗抑郁剂作用增强剂。
23.权利要求22的抗抑郁剂作用增强剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质表达的物质是选自下列中的一种或多种的化合物：
(a)针对OCT3基因转录产物或其部分的反义核酸；
(b)具有特异切割OCT3基因转录产物的核酶活性的核酸；和
(c)具有通过RNAi效应抑制OCT3基因表达作用的核酸。
24.包含抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质作为活性成分的抗抑郁剂作用增强剂。
25.权利要求24的抗抑郁剂作用增强剂，其中抑制有机阳离子运载体OCT3蛋白质功能的物质是下列(a)或(b)的化合物：
(a)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的抗体；和
(b)结合有机阳离子运载体OCT3蛋白质的小分子化合物。
26.包含抗抑郁剂和权利要求22-25中任一项的抗抑郁作用增强剂作为活性成分的具有抗抑郁效果的药物组合物。
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