ES2632122T3

ES2632122T3 - Método y dispositivo para producir un medio gaseoso que comprende vapor

Info

Publication number: ES2632122T3
Application number: ES07748345.1T
Authority: ES
Inventors: Michael Abrahamsson
Original assignee: STEAMEX GROUP SVERIGE AB
Current assignee: STEAMEX GROUP SVERIGE AB
Priority date: 2006-03-30
Filing date: 2007-03-16
Publication date: 2017-09-11
Anticipated expiration: 2027-03-16
Also published as: EP2010820A2; WO2007114775A3; US20090266545A1; EP2010820A4; EP2010820B1; WO2007114775A2; PL2010820T3; DK2010820T3

Abstract

Un miR-135, un precursor del mismo, o un polinucleótido exógeno que codifica dicho miR-135 o dicho precursor del mismo, para su uso en el tratamiento de una afección médica en la que un aumento del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficioso.

Description

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DESCRIPCIÓN

miR-135 y composiciones que lo comprenden para el tratamiento de afecciones médicas asociadas con la serotonina 5 Campo y antecedentes de la invención

La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a microARN y, más concretamente, pero no exclusivamente, al uso de los mismos para el diagnóstico, el tratamiento y el tratamiento de control de enfermedades.

Los trastornos del estado de ánimo, tales como la depresión mayor, representan algunos de los problemas de salud más comunes y proliferantes que afectan a aproximadamente el 10 % de la población mundial. A pesar de muchas décadas de investigación, los mecanismos que hay tras la aparición de la depresión, la susceptibilidad y las terapias

15 disponibles solo se entienden parcialmente. En la actualidad, solo aproximadamente un tercio de los pacientes responden a los tratamientos disponibles, por lo tanto, existe la gran necesidad de comprender mejor la patología. El dogma actual con respecto a la etiología de la depresión es de una compleja interacción entre los factores ambientales y la predisposición genética, lo que sugiere un papel mecanicista para los procesos epigenéticos.

La serotonina (5HT) es un neurotransmisor de monoamina producido en el cerebro por el núcleo del rafe (RN), que se proyecta extensamente a través del cerebro para modular una variedad de funciones cognitivas, emocionales y fisiológicas. El vínculo entre la actividad serotoninérgica desregulada y la depresión está bien establecido [Michelsen KA. et al., Brain Res Rev (2007) 55(2):329-42]. Los niveles de 5HT, así como los circuitos genéticos a cargo de su producción, secreción, recaptación y desactivación, están desregulados en la depresión. Además, la mayoría de los

25 fármacos antidepresivos de los que se dispone en la actualidad se dirigen a la función de las proteínas relacionadas con el sistema 5HT, lo que produce un aumento de los niveles de 5HT en la sinapsis [Krishnan V y Nestler E. J., Nature (2008) 455: 894-902]. La terapéutica disponible requiere un largo período de administración antes de observarse el alivio de los síntomas.

Los microARN (miR) son un subconjunto de moléculas de ARN pequeñas endógenas (aproximadamente 22 nucleótidos) que reprimen la expresión génica después de la transcripción. Los MiR se transcriben como moléculas primarias de miR que se procesan en el núcleo de la célula en miR precursores con estructuras de bucle de tallo, que se exportan al citoplasma donde se procesan además en los miR maduros activos. El miR maduro se incorpora posteriormente al complejo de silenciamiento inducido por ARN y funciona principalmente mediante la unión a las

35 regiones 3' no traducidas (3'UTR) de moléculas de ARNm específicas. La unión se produce a través de la secuencia de base, una secuencia de 6 a 8 nucleótidos en el extremo 5' del miR, uniéndose la base a una secuencia de coincidencia de base complementaria en la 3'UTR de ARNm diana. La unión de un miR conduce a la desestabilización directa o a la represión de la traducción del ARNm, produciendo en última instancia niveles reducidos de proteína del gen diana.

Los miR son abundantes en el sistema nervioso, y la investigación inicial se ha centrado principalmente en las neuronas en el contexto del desarrollo del cáncer y de los trastornos neurodegenerativos y en el proceso normal, tal como la plasticidad [Kosik K. S. Nat Rev Neurosci (2006) 7:911-20]. Además, se ha sugerido que los miR desempeñan un papel en los trastornos psiquiátricos tales como la esquizofrenia, el autismo y también la depresión

45 y la ansiedad, tanto en seres humanos como en modelos de ratón [Miller B. H. y Wahlestedt C., Brain Res (2010) 1338: 89-99]. Varios estudios han demostrado recientemente la participación de los miR en la regulación genes relacionados con la 5HT [Millan M. J. Curr Opin Pharmacol (2011) 11(1):11-22] revelando el papel emergente de los miR en la regulación del sistema 5HT y su posible asociación con trastornos relacionados con la depresión.

En A. Baudry et al: "MiR-16 targets the serotonin transporter: a new facet for adaptive responses to antidepressants", Science 2010, vol. 329, páginas 1537-1541, y A. Holleman et al: "miRNA-135a contributes to paclitaxel resistance in tumor cells both in vitro and in vivo", Oncogene 2011, vol. 30, páginas 4386-4398, se describe la implicación de determinados miR en ciertas afecciones médicas.

55 La solicitud de patente de EE.UU. n.º 20100222413 (concedida a Stoffel M. et al.) desvela oligonucleótidos modificados químicamente para modular la expresión de microARN. El documento US 20100222413 desvela además métodos de silenciamiento de los microARN (por ejemplo, miR-122, miR-16, miR-192 y miR-194) para el tratamiento de enfermedades del sistema nervioso central.

Sumario de la invención

La presente invención se dirige al la materia objeto como se define en las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a un miR-135, un precursor del mismo o un polinucleótido exógeno que codifica

65 dicho miR-135 o dicho precursor del mismo, para su uso en el tratamiento de una afección médica en la que un aumento del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficioso.

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De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el polinucleótido está bajo un control de la transcripción de un elemento regulador que actúa en cis en una célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el polinucleótido que bajo un control de la transcripción de un elemento regulador que actúa en cis en una célula cardiaca.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el miR-181 es como se expone en SEQ ID NO: 85-94.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, la afección médica se selecciona del grupo que consiste en convulsiones, enfermedad de Huntington, esquizofrenia, síndrome de X frágil, trastorno de ansiedad generalizada y cáncer.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el elemento regulador que actúa en cis es activo en una célula neuroglial o una célula cardiaca.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el sujeto es un sujeto humano.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por aumento de la expresión del gen Tph2, la modulación comprende la regulación por disminución del miR-181 y/o miR-27 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen Tph2 tras la regulación por disminución del miR-181 y/o miR-27 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el gen del receptor de glutamato se selecciona del grupo que consiste en receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grm1), receptor de glutamato ionotrópico, kainato 3 (Grik3), receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5), receptor de glutamato ionotrópico kainato 2 (Grik2) y receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7).

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Slc6a4, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-135 y/o miR-335 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen Slc6a4 tras la regulación por aumento del miR-135 y/o miR-335 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Htr1a, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-135, miR335, miR-181, miR-182 y/o miR-26 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen Htr1a tras la regulación por aumento del miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 y/o miR-26 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen MaoA, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-27 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen MaoA tras la regulación por aumento del miR-27 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Adrb1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-19 en la célula neuroglial o la célula cardiaca.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen Adrb1 tras la regulación por aumento del miR-19 en la célula neuroglial o la célula cardiaca.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen CB1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-19 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen CB1 tras la regulación por aumento de CB1 en la célula neuroglial.

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De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen del receptor de CRH de tipo 1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-15 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen del receptor de CRH de tipo 1 tras la regulación por aumento de miR-15 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen FKBP5, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-15 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la medición de una expresión del gen FKBP5 tras la regulación por aumento de miR-15 en la célula neuroglial.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el método comprende además la obtención de una muestra de sangre del sujeto antes del tratamiento.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el fármaco antidepresivo se selecciona del grupo que consiste en inhibidores selectivos de la recaptación de serotonina (SSRI), antidepresivos tricíclicos e inhibidores de la recaptación de noradrenalina (NRI).

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, la afección médica asociada con la serotonina es una afección psiquiátrica.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, la afección psiquiátrica se selecciona del grupo que consiste en una depresión, una ansiedad, un estrés, una fatiga, una función cognitiva deteriorada, una ataque de pánico, un comportamiento compulsivo, una adicción, una fobia social, un trastorno del sueño, un trastorno relacionado con la alimentación, un trastorno del crecimiento y un trastorno de la reproducción.

De acuerdo con algunas realizaciones de la divulgación, el miR-135 comprende miR-135a o miR-135b.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la materia al que pertenece la invención. Aunque se pueden usar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o en el ensayo de realizaciones de la invención, a continuación, se describen métodos y/o materiales ilustrativos. En caso de conflicto, prevalecerá la memoria descriptiva de la patente, incluyendo las definiciones. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos, y no pretenden ser necesariamente limitantes.

Breve descripción de los dibujos

Algunas realizaciones de la invención se describen en el presente documento, solo a modo de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos. Haciendo ahora referencia específicamente a los dibujos en detalle, se hace hincapié en que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y con fines ilustrativos de las realizaciones de la invención. En este sentido, la descripción tomada con los dibujos muestra de manera evidente a los expertos en la materia cómo se pueden poner en práctica las realizaciones de la invención.

En los dibujos:

Las FIG. 1A-I representan la expresión de microARN en neuronas de serotonina (5HT). La Figura 1A es una ilustración gráfica de miARN expresados diferencialmente en las neuronas 5HT. Los valores normalizados de Lowes se representan como un cambio de ln2 veces de la intensidad de la mancha con respecto al logaritmo de la intensidad media (gráfica de MA); la Figura 1B es una validación de los resultados de la matriz en la PCR en tiempo real de miR que indica niveles aumentados de miR-375 en las neuronas 5HT en comparación con el control. n = 5, células 5HT, n = 4, no 5HT. Las barras representan la media ± ETM **p = 0,0071; La Figura 1C es una validación de los resultados de la matriz en la PCR en tiempo real de los miR que indica la disminución de los niveles de miR-135a en las neuronas 5HT en comparación con el control. n = 5 células 5HT, n = 4 no 5HT. **p = 0,0075; La Figura 1D es un diagrama de Van que representa las predicciones bioinformáticas de cruce para Slc6a4 con los resultados de las micromatrices de 5HT y enumera los miR seleccionados para los ensayos in vitro; la Figura IE es un diagrama de Van que representa las predicciones bioinformáticas de cruce para Htr1a con los resultados de las micromatrices de 5HT y enumera los miR seleccionados para los ensayos in vitro; la Figura 1F es un diagrama de Van que representa las predicciones bioinformáticas de cruce para Tph2 con los resultados de las micromatrices de 5HT y enumera los miR seleccionados para los ensayos in vitro; la Figura 1G es un diagrama de Van que representa las predicciones bioinformáticas de cruce para MaoA con los resultados de las micromatrices de 5HT y enumera los miR seleccionados para los ensayos in vitro; la Figura 1H es una gráfica que ilustra los resultados del ensayo de indicador de luciferasa que indican que miR-181c y miR-27b

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6A) o el plásmido de sobreexpresión (OE) de pre-miR-19b (Figura 6B); las Figuras 6C-E son gráficas que ilustran los niveles de luciferasa normalizados medidos en células HEK293T que expresan niveles de miR-19 endógenos elevados. Transfección con el plásmido de control (Figura 6C), la sonda de desactivación (KD) de miR-19b (Figura 6D) o la sonda codificada como control, y transfección (Figura 6E) con plásmido miArrest de miR-19b o plásmido miArrest de control. ***p < 0,005. La actividad de la luciferasa de Renilla se normalizó mediante los niveles de expresión de la luciferasa de la luciérnaga y se presentó como la relación de la actividad alcanzada por la forma mutante de UTR de 3’ de Adrb1 (Adrb1-mut) en presencia del tratamiento de control. Las FIG. 7A-D representan la expresión diferencial de miARN en la amígdala. Las Figuras 7A-B son gráficas que ilustran la expresión diferencial de miARN en la amígdala 90 minutos después del estrés agudo. La Figura 7A ilustra los resultados de la matriz de Agilent. La Figura 7b ilustra los resultados de la matriz affymetrix. Los valores normalizados se representan como la relación log2 (estrés frente al control) de la intensidad del punto trazada en función de las intensidades medias a través de las condiciones (n = 2,2). La intensidad de cada miARN se calculó como la intensidad media normalizada a través de repeticiones biológicas. MiR-15a y miR-15b se indican en rojo. MiR-124, un marcador neuronal bien establecido que no está afectado por el protocolo de estrés, está indicado en blanco; la Figura 7C ilustra que miR-15a y miR-15b tienen un apareamiento de semilla semiconservado en el receptor UTR de 3’ de la hormona liberadora de corticotropina de tipo 1 [CRHR1, adaptado de targetscan.org]; y la Figura 7D es un gráfico que ilustra la actividad luciferasa medida en células HEK293T transfectadas junto con miR-15b-EGFP que sobreexpresan o expresan con GFP plásmido y un plásmido indicador de luciferasa controlado por CRFR1-UTR de 3’. La actividad de la luciferasa de Renilla se normalizó mediante los niveles de expresión de luciferasa de luciérnaga. La FIG. 8 es un gráfico que ilustra los resultados del ensayo con indicador de luciferasa que indican que miR-182 probablemente se dirija a la UTR de 3’ de Htr1a. Los datos de los ensayos de luciferasa representan la actividad luciferasa de renilla normalizada con respecto a la actividad de un indicador de luciferasa de luciérnaga cotransfectado en células HEK293 transfectadas con la UTR de 3’ del gen descrito y un vector vacío, o un vector que sobreexpresa un miR específico. La FIG. 9 es un gráfico que ilustra los resultados de PCR en tiempo real de los niveles de expresión de miR-182 en DRN de ratones adultos, que indican una tendencia a la disminución de la expresión tras un rechazo social crónico. Los datos representan la media ± ETM, n = 7 controles y 18 ratones en el grupo de rechazo social, # = p = 0,1. La Fig. 10 es un diagrama de van que representa las predicciones bioinformáticas in silico para las dianas de miR182 en dos algoritmos y una lista de genes diana potencialmente relevantes para la función neuronal normal y patológica que aparecen en esta predicción. Las FIG. 11A-C representan la sobreexpresión o desactivación de miR-182. La Figura 11A es una ilustración esquemática de lentivirus para la sobreexpresión de miR-182; la Figura 11B es un gráfico que ilustra los resultados de la PCR en tiempo real que indican la sobreexpresión de miR-182 in vitro en la estirpe celular N2A; y la Figura 11C es una ilustración esquemática de los lentivirus para la desactivación de miR-182. Las Fig. 12A-D representan los niveles de miR-19 en el PFC después de la administración de NRI. La reboxetina NRI se administró de forma aguda (una vez) o crónica (durante 18 días). Cabe señalar que los niveles de miR19a y miR-19b disminuyeron en el PFC después de la administración aguda de NRI (Figura 12A y Figura 12B, respectivamente), pero aumentaron después de la administración crónica de NRI (Figura 12C y Figura 12D, respectivamente). Las Fig. 13A-D representan los niveles de miR-19 en el PFC y la amígdala de ratones sometidos a rechazo social. MiR-19a y miR-19b se midieron en muestras de amígdala tomadas de ratones que fueron sometidos a un paradigma de rechazo social. Cabe señalar que los niveles de miR-19a y miR-19b en el PFC se elevaron en los ratones clasificados como "Susceptibles" al rechazo social en relación con los ratones de control (Figura 13A y Figura 13B, respectivamente). Los niveles de MiR-19 también fueron elevados en la amígdala de los ratones clasificados como "Susceptibles" al rechazo social en relación con el control de ratones (Figura 13C y Figura 13D, respectivamente). La FIG. 14 representa el miARN-19b dirigido a UTR de 3’ de CB1. La transfección de células HT-22 con UTR de 3’ de CB1 y los plásmidos que sobreexpresan miR-19b o el control de GFP conducen a una disminución del 50 % en los niveles de luciferasa normalizados. Las Fig. 15A-B son ilustraciones esquemáticas de una sección coronal del cerebro del ratón. La Figura 15A muestra varios núcleos en el cerebro incluyendo el BLA (adaptado del cerebro de ratón por Paxinos y Franklin); la Figura 15B muestra una distribución de CB1 en el cerebro (adaptada de Allen Brain Atlas www.mouse.brainmap.org/). Cabe señalar que es evidente por esta distribución que CB1 es abundante en el BLA. La FIG. 16 es una ilustración esquemática de un mecanismo propuesto para la consolidación de la memoria en el núcleo basolateral de la amígdala (BLA). La corticosterona (CORT) se une a un receptor glucocorticoide unido a la membrana (mbGR) aún sin caracterizar que activa la vía Gs-cAMP/PKA para inducir la síntesis de endocannabinoides (eCB). Los endocannabinoides se liberan en la sinapsis donde se unen a los receptores CB1 en los terminales GABAérgicos que inhiben la liberación de GABA. Esta inhibición de la liberación de GABA desinhibe la liberación de norepinefrina (NE) y aumenta la activación del NE de β-adrenorreceptores postsinápticos, aumentando la consolidación de los recuerdos emocionalmente desagradables. Las FIG. 17A-B ilustran Ago2 en el complejo RISC. La Figura 17A es una ilustración esquemática de Ago2 en el complejo RISC, que media la interacción entre el miARN y el ARNm; la Figura 17B ilustra un análisis de transferencia Western realizado con anticuerpo anti-Ago2. Este IP fue específico para la proteína Ago2 como puede verse cuando se compara la muestra cerebral total que se precipitó una vez con el anticuerpo Ago2 y una vez con el control de IgG1. Cabe señalar que no hubo detección de la proteína Ago2 en las muestras precipitadas con el control de IgG1.

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uso de miARN o secuencias que los regulan, tales como miR-135, miR-335, miR-181, miR-182, miR-26, miR-27, miR-15 y miR-19, como modalidades terapéuticas.

Así pues, de acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de una afección médica en la que una elevación del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficioso en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar a o expresar en una célula del sujeto un polinucleótido exógeno que codifique al menos un microARN o un precursor del mismo.

De acuerdo con una realización específica, para el tratamiento de una afección médica en la que una elevación del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficioso, el microARN comprende miR-135, miR-335, miR-26 y miR-182.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de adrenalina o noradrenalina es terapéuticamente beneficioso en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar a o expresar en una célula del sujeto un polinucleótido exógeno que codifique un microARN o un precursor del mismo.

De acuerdo con una realización específica, para el tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de adrenalina o noradrenalina es terapéuticamente beneficioso, el microARN comprende miR-19.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de hormona liberadora de corticotropina (CRH) es terapéuticamente beneficioso en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar a o expresar en una célula del sujeto un polinucleótido exógeno que codifique un microARN o un precursor del mismo.

De acuerdo con una realización específica, para el tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de hormona liberadora de corticotropina (CRH) es terapéuticamente beneficioso, el microARN comprende miR-15.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se proporciona un método de tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de receptor de glutamato es terapéuticamente beneficioso en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el método administrar a o expresar en una célula del sujeto un polinucleótido exógeno que codifique un microARN o un precursor del mismo.

De acuerdo con una realización específica, para el tratamiento de una afección médica en la que un nivel bajo de receptor de glutamato es terapéuticamente beneficioso, el microARN comprende miR-181.

El término "tratar" se refiere a inhibir o detener el desarrollo de una enfermedad, de un trastorno o de una afección y/o provocar la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, de un trastorno o de una afección, o evitar que ocurra una enfermedad, un trastorno o una afección médica en un sujeto que puede estar en riesgo de sufrir la enfermedad, el trastorno o la afección, pero que todavía no haya sido diagnosticado de la enfermedad, el trastorno o la afección. Los expertos en la materia comprenderán que se pueden usar diversas metodologías y ensayos para evaluar el desarrollo de una enfermedad, de un trastorno o de una afección y, de manera similar, pueden usarse diversas metodologías y ensayos para evaluar la reducción, remisión o regresión de una enfermedad, de un trastorno o de una afección.

Como se usa en el presente documento, el término “sujeto” incluye mamíferos, preferentemente seres humanos de cualquier edad que padecen la patología. Preferentemente, este término abarca individuos que están en riesgo de desarrollar la patología.

Como se usa en el presente documento, la expresión "afección médica en la que una elevación del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficiosa" se refiere a una enfermedad o un trastorno en el que el aumento del nivel de serotonina puede prevenir la aparición de una enfermedad o de síntomas médicos asociados con la misma,

o detener la progresión de la enfermedad o de síntomas asociados con la misma (como se detalla a continuación).

Como se usa en el presente documento, el término “serotonina” se refiere al neurotransmisor de monoamina [también denominado 5-hidroxitriptamina (5-HT)]. La serotonina se expone, por ejemplo, en el número CAS 50-67-9.

De acuerdo con una realización, se proporciona un método de aumento del nivel de serotonina en una hendidura sináptica, comprendiendo el método administrar a o expresar en una célula neuroglial, por ejemplo, neurona serotonérgica del sujeto un polinucleótido exógeno que codifique al menos un microARN o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "hendidura sináptica" se refiere a la zona entre dos neuronas a través de la que pasan señales eléctricas o químicas.

Una "célula neuroglial" se refiere a una neurona o una célula glial (por ejemplo, oligodendrocitos o astrocitos).

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Como se usa en el presente documento, la expresión "neurona serotoninérgica" se refiere a una neurona que segrega serotonina o que es capaz de recaptar serotonina (es decir, transportadores de serotonina expresados en sus superficies celulares).

La afección médica en la que una elevación del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficiosa puede comprender, por ejemplo, cualquier trastorno del estado de ánimo incluyendo depresión, ansiedad, estrés, fatiga, deterioro de la función cognitiva, ataque de pánico, comportamiento compulsivo, adicción, fobia social; trastorno del sueño, trastorno relacionado con la alimentación, trastorno del crecimiento y trastorno reproductivo.

De acuerdo con una realización específica, la afección médica en la que una elevación del nivel de serotonina es terapéuticamente beneficiosa comprende la depresión.

De acuerdo con una realización, cuando la afección médica es depresión o ansiedad, el microARN es miR-135.

Se apreciará que la depresión o la ansiedad pueden no estar necesariamente relacionadas con la serotonina.

Como se usa en el presente documento, la expresión "afección médica en la que un nivel bajo de adrenalina o noradrenalina es terapéuticamente beneficioso" se refiere a una enfermedad o a un trastorno en el que la disminución de la expresión o actividad de la adrenalina o noradrenalina puede prevenir la aparición de una enfermedad o síntomas médicos asociados con la misma o detener la progresión de la enfermedad o de los síntomas médicos asociados con la misma (como se detalla mejor en el presente documento más adelante).

Como se usa en el presente documento, el término “adrenalina” se refiere a la hormona y al neurotransmisor (también conocido como epinefrina). La adrenalina se expone, por ejemplo, en el número CAS 51-43-4.

Como se usa en el presente documento, el término "noradrenalina" se refiere a la catecolamina que actúa como una hormona y un neurotransmisor (también conocido como norepinefrina). La noradrenalina se expone, por ejemplo, en los números CAS (1) 51-41-2 (1) y 138-65-8(dl).

La afección médica en la que un nivel bajo de adrenalina o noradrenalina es terapéuticamente beneficioso puede comprender, por ejemplo, trastorno relacionado con el estrés, ansiedad, deterioro de la memoria, afecciones cardiacas (por ejemplo, palpitaciones, taquicardia, arritmia), dolores de cabeza, temblores, hipertensión y edema pulmonar agudo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "afección médica en la que un nivel bajo de hormona liberadora de corticotropina (CRH) es terapéuticamente beneficioso" se refiere a una enfermedad o a un trastorno en el que la disminución de la expresión o actividad de CRH puede prevenir la aparición de una enfermedad o síntomas médicos asociados con la misma o detener la progresión de la enfermedad o de los síntomas médicos asociados con la misma (como se detalla mejor en el presente documento más adelante).

Como se usa en el presente documento, la expresión "hormona liberadora de corticotropina (CRH)" se refiere a la hormona polipeptídica y al neurotransmisor (también conocido como factor de liberación de corticotropina (CRF) o corticoliberina). La CRH se expone, por ejemplo, en NP_000747.1.

La afección médica en la que un nivel bajo de CRH es terapéuticamente beneficioso puede comprender, por ejemplo, estrés, depresión, ansiedad, estrés, fatiga, deterioro de la función cognitiva, ataque de pánico, comportamiento compulsivo, adicción, fobia social; trastorno del sueño, trastorno relacionado con la alimentación, trastorno del crecimiento y trastorno reproductivo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "afección médica en la que un nivel bajo de receptor de glutamato es terapéuticamente beneficioso" se refiere a una enfermedad o a un trastorno en el que la disminución de la expresión o actividad de un receptor de glutamato puede prevenir la aparición de una enfermedad o síntomas médicos asociados con la misma o detener la progresión de la enfermedad o de los síntomas médicos asociados con la misma (como se detalla mejor en el presente documento más adelante).

Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor de glutamato" se refiere a un receptor sináptico localizado normalmente en las membranas de células neuronales (por ejemplo, Grm1, Grik3, Grm5, Gria2, Grik2 y Grm7). El receptor de glutamato se expone, por ejemplo, en NP_000822.2 [receptor de glutamato ionotrópico cainato 3 (Grik3)]; NP_001159719.1, NP_068775.1, NP_786944.1 [receptor de glutamato ionotrópico cainato 2 (Grik2)]; NP_000833.1, NP_001137303.1 [receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5)]; NP_000835.1, NP_870989.1 [receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7)]; NP_000829.2, NP_001107801.1 [receptor de glutamato metabotrópico (Grm1)].

La afección médica en la que un nivel bajo de receptor de glutamato es terapéuticamente beneficioso puede comprender, por ejemplo, ataques (por ejemplo, epilepsia), enfermedad de Huntigton, esquizofrenia, síndrome de X frágil, trastorno de ansiedad generalizado y cáncer (por ejemplo melanoma).

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Preferentemente, los oligonucleótidos o polinucleótidos usados son los modificados bien en la cadena principal, los enlaces internucleósidos o las bases, como se describe ampliamente a continuación.

Los ejemplos específicos de oligonucleótidos o polinucleótidos preferidos útiles de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen oligonucleótidos o polinucleótidos que contienen estructuras principales modificadas o enlaces internucleósidos no naturales. Los oligonucleótidos o polinucleótidos que tienen estructuras principales modificadas incluyen aquellos que conservan un átomo de fósforo en la cadena principal, como se describe en las patentes de EE.UU. n.º4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; y 5.625.050.

Las estructuras principales oligonucleotídicas o polinucleotídicas modificadas preferidas incluyen, por ejemplo: fosforotioatos; fosforotioatos quirales; fosforoditioatos; fosfotriésteres; aminoalquilfosfotriésteres; metil y otros alquilfosfonatos, incluyendo fosfonatos de 3'-alquileno y fosfonatos quirales; fosfinatos; fosforamidatos, incluyendo 3'aminofosforamidato y aminoalquilfosforamidatos; tionofosforamidatos; tionoalquilfosfonatos; tionoalquilfosfotriésteres; y boranofosfatos que tienen enlaces 3'-5' normales, análogos enlazados 2'-5' de estos y aquellos que tienen polaridad invertida, en la que los pares adyacentes de unidades nucleosídicas están unidos de 3'-5' a 5'-3' o de 2'-5' a 5'-2'. También se pueden usar diversas sales, sales mixtas y formas de ácido libre de las modificaciones anteriores.

Como alternativa, las estructuras principales de oligonucleótidos o polinucleótidos modificadas que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras principales que están formadas por enlaces internucleósido de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, enlaces internucleósido de heteroátomo mixto y de alquilo o cicloalquilo, o uno

o más enlaces internucleósido heteroatómicos o heterocíclicos de cadena corta. Estos incluyen los que tienen enlaces morfolino (formados en parte por la parte de azúcar de un nucleósido); estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilen-formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulfamato; estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes componentes de N, O, S y CH2 mixtas, como se desvela en las patentes de EE.UU. n.º5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; EP 2 739 736 B1 15 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; y 5.677.439.

Otros oligonucleótidos o polinucleótidos que se pueden usar de acuerdo con la presente invención son los modificados tanto en el azúcar como en el enlace internucleosídico, es decir, la cadena principal de las unidades de nucleótidos se reemplaza por grupos nuevos. Las unidades de base se mantienen para la complementación con la diana de polinucleótido apropiada. Un ejemplo de dicho oligonucleótido mimético incluye un ácido peptidonucleico (PNA). Un oligonucleótido de PNA se refiere a un oligonucleótido en el que la cadena principal de azúcar se reemplaza por una cadena principal que contiene amida, en particular, una cadena principal de aminoetilglicina. Las bases se conservan, y están unidas directa o indirectamente a átomos de aza-nitrógeno de la parte amida de la cadena principal. Las patentes de los Estados Unidos que enseñan la preparación de compuestos de PNA incluyen, pero sin limitación, las patentes de EE.UU. n.º 5.539.082; 5.714.331; y 5.719.262; estando cada una de ellas incorporada en el presente documento por referencia. Otras modificaciones de la cadena principal que pueden usarse en la presente invención se describen en la patente de EE.UU. n.º 6.303.374.

Los oligonucleótidos o polinucleótidos de la presente invención también pueden incluir modificaciones o sustituciones de bases. Como se usa en el presente documento, las bases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases purínicas adenina (A) y guanina (G), y las bases pirimidínicas timina (T), citosina (C) y uracilo (U). Las bases "modificadas" incluyen, pero sin limitación, otras bases sintéticas y naturales, tales como: 5-metilcitosina (5me-C); 5-hidroximetilcitosina; xantina; hipoxantina; 2-aminoadenina; 6-metil-y otros derivados de alquilo de adenina y guanina; 2-propil-y otros derivados de alquilo de adenina y guanina; 2-tiouracilo, 2-tiomeimina y 2-tiocitosina; 5halouracilo y citosina; 5-propinil-uracilo y citosina; 6-azo-uracilo, citosina y timina; 5-uracilo (pseudouracilo); 4tiouracilo; 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas; 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo, y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos; 7-metilguanina y 7-metiladenina; 8-azaguanina y 8-azaadenina; 7-desazaguanina y 7-desazaadenina; y 3-desazaguanina y 3-desazaadenina. Otras bases modificadas incluyen las desveladas en: la patente de EE.UU. n.º 3.687.808; Kroschwitz, J. I., ed. (1990), "The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering" páginas 858-859, John Wiley & Sons; Englisch et al. (1991), "Angewandte Chemie," Edición internacional, 30, 613; y Sanghvi, Y. S., "Antisense Research and Applications", Capítulo 15, páginas 289-302, S. T. Crooke y B. Lebleu, eds., CRC Press, 1993. Dichas bases modificadas son particularmente útiles para aumentar la afinidad de unión de los compuestos oligoméricos de la invención. Éstas incluyen pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2-, N-6-y O-6-sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina. Las sustituciones 5-metilcitosina han demostrado aumentar la estabilidad del dúplex de ácidos nucleicos en 0,6-1,2 ºC (Sanghvi, Y. S. et al. (1993), "Antisense Research and Applications", páginas 276-278, CRC Press, Boca Raton), y son actualmente sustituciones de bases preferidas, aún más particularmente cuando se combinan con modificaciones de azúcar 2'-O-metoxietilo.

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De acuerdo con una realización específica, el polinucleótido de miARN de la presente divulgación tiene una secuencia de ácido nucleico como se expone en las SEQ ID NO: 58-94 (véase la Tabla 1A).

Tabla 1A: Secuencias polinucleotídicas de miARN

Secuencia: miARN

SEQ ID NO: 77-80: miR-15

SEQ ID NO: 72-76: miR-19

SEQ ID NO: 65-69: miR-26

SEQ ID NO: 81-84: miR-27

SEQ ID NO: 58-62: miR-135

SEQ ID NO: 85-94: miR-181

SEQ ID NO: 70-71: miR-182

SEQ ID NO: 63-64: miR-335

Como se ha mencionado anteriormente y se muestra en el apartado de ejemplo que se presenta más adelante, los microARN son moléculas procesadas derivadas de precursores específicos (es decir, pre-miARN), y la regulación por aumento de una función de miARN específica puede efectuarse usando una molécula precursora de miARN específica.

También se contemplan secuencias homólogas a los miARN y sus precursores. El nivel de homología debe ser relativamente alto para el miARN maduro, pero se permite más órdenes de libertad a nivel de precursor (por ejemplo, al menos el 60, 70, 80, 85, 90, 95 % o más) siempre y cuando las alteraciones de secuencia estén en la secuencia horquillada y no en el segmento de ácido nucleico correspondiente al miR maduro.

Dichos agentes polinucleotídicos precursores se administran normalmente a las células diana (por ejemplo, células neurogliales o células cardiacas) como parte de una construcción de expresión. En este caso, el agente polinucleotídico se liga en una construcción de ácido nucleico bajo el control de un elemento regulador que actúa en cis (por ejemplo, promotor) capaz de dirigir una expresión del microARN en las células diana (por ejemplo, células neurogliales o células cardiacas) de una manera constitutiva o inducible.

Los ejemplos de agentes polinucleotídicos de microARN de la presente invención incluyen, pero sin limitación, miR15 (por ejemplo, ARN con n.º de acceso del GenBank NR_029485), miR-19 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029489.1), miR-26 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029500 y NR_029499), miR-27 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029501 RNA), miR-135 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029677.1), miR-335 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029899.1), miR-181 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029611.1) y miR-182 (por ejemplo, n.º de acceso del GenBank NR_029614).

Los ejemplos de promotores específicos de células neuronales incluyen, pero sin limitación, promotor de gen de enolasa específica de las neuronas, promotor de sinapsina, promotor de sinapsina potenciado, promotor de calmodulina de calcio y promotor de Thy1.

Los ejemplos de promotores específicos de las células cardiacas incluyen, pero sin limitación, promotor NCX1 cardiaco y promotor de cadena pesada de α-miosina (αMHC).

Las construcciones de expresión de la presente invención también pueden incluir secuencias adicionales que las hacen adecuadas para la replicación y la integración en eucariotas (por ejemplo, vectores lanzadera). Los vectores de clonación típicos contienen secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación). Las construcciones de expresión de la presente invención pueden incluir además un potenciador, que puede ser adyacente o distante a la secuencia promotora, y puede funcionar en la regulación por aumento de la transcripción a partir de las mismas.

Los elementos potenciadores pueden estimular la transcripción hasta 1.000 veces a partir de promotores homólogos

o heterólogos unidos. Los potenciadores son activos cuando se sitúan cadena abajo o cadena arriba del sitio de iniciación de la transcripción. Muchos elementos potenciadores derivados de virus tienen una amplia selección de hospedadores y son activos en una variedad de tejidos. Por ejemplo, el potenciador de genes precoces de SV40 es adecuado para muchos tipos de células. Otras combinaciones de potenciador/promotor que son adecuadas para la presente invención incluyen las derivadas de virus de polioma, o citomegalovirus (CMV) humano o murino y las repeticiones en tándem largas (LTR) de diversos retrovirus, tales como el virus de la leucemia murina, el virus del sarcoma murino o Rous, y el VIH. Véase Gluzman, Y. y Shenk, T., eds. (1983). “Enhancers and Eukaryotic Gene Expression”, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, que se incorpora en el presente documento por referencia..

También se pueden añadir secuencias de poliadenilación a las construcciones de expresión de la presente invención con el fin de aumentar la eficacia de la expresión de la fracción detectable. Se requieren dos elementos de

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secuencia distintos para una poliadenilación precisa y eficaz: secuencias ricas en GU o U situadas cadena abajo del sitio de poliadenilación, y una secuencia altamente conservada de seis nucleótidos, en concreto, AAUAAA, situada de 11 a 30 nucleótidos cadena arriba del sitio. Las señales de terminación y poliadenilación adecuadas para la presente invención incluyen las derivadas de SV40.

Además de las realizaciones ya descritas, las construcciones de expresión de la presente invención pueden contener normalmente otros elementos especializados destinados a aumentar el nivel de expresión de ácidos nucleicos clonados o a facilitar la identificación de células que portan el ADN recombinante. Por ejemplo, una serie de virus animales contienen secuencias de ADN que potencian la replicación extracromosómica del genoma vírico en tipos de células permisivos. Los plásmidos que portan estos replicones virales se replican episomalmente siempre y cuando los factores apropiados sean proporcionados bien por genes portados sobre el plásmido o con el genoma de la célula hospedadora.

Las construcciones de expresión de la presente invención pueden o no incluir un replicón eucariota. Si está presente un replicón eucariota, el vector es capaz de la amplificación en células eucariotas usando el marcador seleccionable apropiado. Si la construcción no comprende un replicón eucariota, no es posible una amplificación episomal. En su lugar, el ADN recombinante se integra en el genoma de la célula diseñada, en el que el promotor dirige la expresión del ácido nucleico deseado.

La construcción de ácido nucleico puede introducirse en las células diana (por ejemplo, células neurogliales o células cardiacas) de la presente invención usando un vehículo/método apropiado de administración génica (transfección, transducción, etc.) y un sistema de expresión apropiado.

Los ejemplos de vectores de expresión de mamífero incluyen, pero sin limitación, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1 pNMT41 y pNMT81, que están disponibles en Invitrogen; pCI que está disponible en Promega; pMbac, pPbac, pBKRSV y pBK-CMV, que están disponibles en Strategene; pTRES que está disponible en Clontech, y sus derivados.

También se pueden usar vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2, por ejemplo. Los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus Epstein-Barr incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5 y baculovirus pDSVE.

Pueden usarse sistemas basados en lípidos para la administración de estas construcciones a las células diana (por ejemplo, células neurogliales o células cardiacas) de la presente invención.

Los liposomas incluyen cualquier estructura sintética (es decir, no natural) compuesta de bicapas lipídicas, que encierran un volumen. Los liposomas incluyen emulsiones, espumas, micelas, monocapas insolubles, cristales líquidos, dispersiones de fosfolípidos, capas laminares y similares. Los liposomas se pueden preparar mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. [Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145; Lasic D. D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (capítulo 3); Winterhalter M, Lasic D. D., Chem Phys Lipids, septiembre de 1993; 64(1-3):35-43].

Los liposomas pueden estar cargados positivamente, neutros o cargados negativamente. Para la captación del Sistema de Fagocitos Mononucleares (MPS), los liposomas pueden ser hidrófobos, ya que el enmascaramiento hidrófilo de la membrana liposómica (por ejemplo, mediante el uso de lípidos unidos a polietilenglicol y partículas hidrófilas) puede ser menos propenso a la captación de MPS. También es preferible que los liposomas no comprendan lípidos protegidos estéricamente tales como gangliósido-GM1 y fosfatidilinositol, ya que estos lípidos previenen la captación de MPS.

Los liposomas pueden ser una sola capa lipídica o pueden ser multilaminares. Si el agente terapéutico es hidrófilo, su liberación puede mejorarse más usando vesículas unilaminares grandes debido a su mayor volumen interno. Por el contrario, si el agente terapéutico es hidrófobo, su administración puede mejorarse más usando vesículas multilaminares. Como alternativa, el agente terapéutico (por ejemplo, el oligonucleótido) puede no ser capaz de penetrar en la bicapa lipídica y, por consiguiente, permanecería adsorbido a la superficie del liposoma. En este caso, el aumento del área superficial del liposoma puede mejorar más la administración del agente terapéutico. Los liposomas adecuados de acuerdo con la invención son liposomas no tóxicos tales como, por ejemplo, los preparados a partir de fosfatidil-colina fosfoglicerol y colesterol. El diámetro de los liposomas usados puede variar de 0,1 a 1,0 micrómetros. Sin embargo, también se pueden usar otros intervalos de tamaños adecuados para la fagocitosis por parte de células fagocíticas. Para el calibrado de los liposomas, puede usarse la homogeneización, que se basa en la energía de cizalla para fragmentar los liposomas grandes en más pequeños. Los homogeneizadores que se pueden usar convenientemente incluyen microfluidizadores producidos por Microfluidics de Boston, MA. En un procedimiento de homogeneización típico, los liposomas se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión convencional hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados. La distribución del tamaño de partícula se puede controlar mediante la diferenciación convencional del tamaño de partícula del haz láser. La extrusión de

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liposomas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica es un método eficaz para reducir el tamaño de los liposomas a una distribución de tamaños relativamente bien definida. Por lo general, se hace circular la suspensión a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución del tamaño de liposoma deseada. Los liposomas pueden extruirse a través de membranas de poro sucesivamente menor para conseguir una reducción gradual del tamaño de los liposomas.

Se puede usar cualquier método conocido en la técnica para incorporar un agente polinucleotídico de microARN a un liposoma. Por ejemplo, el agente polinucleotídico de micro-ARN puede encapsularse dentro del liposoma. Como alternativa, puede adsorberse sobre la superficie del liposoma. Otros métodos que pueden usarse para incorporar un agente farmacéutico a un liposoma de la presente invención son los descritos por Alfonso et al.,[“The science and practice of pharmacy”, Mack Publishing, Easton Pa 19ª ed., (1995)] y los descritos por Kulkarni et al., [J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46].

Los liposomas usados en los métodos de la presente invención atraviesas preferentemente las barreras sanguíneas. Por lo tanto, los liposomas de la presente invención preferentemente no comprenden un polisacárido dirigido a la barrera sanguínea (por ejemplo, manosa) en su parte de membrana. Preferentemente, los liposomas de la presente invención no comprenden péptidos en su parte de membrana que dirigen los liposomas a un receptor sobre una barrera sanguínea. Los ejemplos de dichos péptidos incluyen, pero sin limitación, transferrina, insulina, IGF-1, anticuerpo anti-receptor de transferrina IGF-2, anticuerpo anti-receptor de insulina, anticuerpo anti-receptor de IGF-1 y anticuerpo anti-receptor de IGF-2.

Con el fin de determinar liposomas que sean especialmente adecuados de acuerdo con la presente invención, se puede realizar un ensayo de detección tal como los ensayos descritos en la solicitud de patente de EE.UU. n.º 20040266734 y la solicitud de patente de EE.UU. n.º 20040266734; y en Danenberg et al., Journal de cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9; “Circulation” 2002, 106:599-605; “Circulation” 2003, 108:2798-804.

Otros vectores no basados en lípidos que se pueden usar de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen, pero sin limitación, polilisina y dendrímeros.

La construcción de expresión también puede ser un virus. Los ejemplos de construcciones víricas incluyen, pero sin limitación, vectores adenovíricos, vectores retrovíricos, vectores víricos vaccinia, vectores víricos adeno-asociados, vectores víricos de polioma, vectores alfavíricos, vectores de rhabdovirus, vectores lentivíricos y vectores herpéticos.

Los vectores retrovíricos representan una clase de vectores particularmente adecuados para su uso con la presente invención. Los retrovirus defectuosos se usan habitualmente en la transferencia de genes a células de mamífero (para una revisión, véase Miller, A. D. (1990). Blood 76, 271). Se puede construir un retrovirus recombinante que comprenda los polinucleótidos de la presente invención usando técnicas moleculares bien conocidas. Pueden eliminarse partes del genoma retrovírico para hacer defectuosa la maquinaria de replicación del retrovirus, y el retrovirus deficiente en la replicación puede envasarse en viriones, que pueden usarse para infectar células diana mediante el uso de un virus auxiliar, empleando técnicas convencionales. Los protocolos para producir retrovirus recombinantes y para infectar células con virus in vitro o in vivo se pueden encontrar, por ejemplo, en Ausubel et al. (1994) “Current Protocols in Molecular Biology” (Greene Publishing Associates, Inc. & John Wiley & Sons, Inc.). Se han usado retrovirus para introducir una variedad de genes en muchos tipos de células diferentes, incluyendo células neuronales, células epiteliales, células endoteliales, linfocitos, mioblastos, hepatocitos y células de médula ósea.

De acuerdo con una realización, se usa un vector lentivírico, un tipo de vector retrovírico, de acuerdo con las presentes enseñanzas. Los vectores lentivíricos se usan ampliamente como vectores debido a su capacidad para integrarse en el genoma de las células que no se dividen, así como las que se dividen. El genoma vírico, en forma de ARN, se transcribe inversamente cuando el virus entra en la célula para producir ADN, que luego es insertado en el genoma en una posición aleatoria por la enzima integrasa vírica. El vector (un provirus) permanece en el genoma y se transmite a la progenie de la célula cuando se divide. Por razones de seguridad, los vectores lentivíricos nunca portan los genes necesarios para su replicación. Para producir un lentivirus, se transfectan varios plásmidos en una denominada estirpe celular de encapsulamiento, comúnmente HEK 293. Uno o más plásmidos, denominados generalmente plásmidos de encapsulamiento, codifican las proteínas de virión, tales como la cápside y la transcriptasa inversa. Otro plásmido contiene el material genético que va a ser suministrado por el vector. Se transcribe para producir el genoma vírico de ARN monocatenario, y está marcado por la presencia de la secuencia ψ (psi). Esta secuencia se usa para encapsular el genoma en el virión.

Un ejemplo específico de un vector lentivírico adecuado para introducir y expresar las secuencias polinucleotídicas de la presente invención en células neurogliales o células cardiacas es el vector de lentivirus pLKO.1.

Otro vector de expresión adecuado que puede usarse de acuerdo con este aspecto de la presente invención es el vector de adenovirus. El adenovirus es un vector de transferencia de genes ampliamente estudiado y usado habitualmente. Las principales ventajas de un vector de adenovirus incluyen una eficiencia de transducción relativamente alta de células que se dividen y quiescentes, un tropismo natural a una amplia selección de tejidos

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En el presente documento, la expresión "principio activo" se refiere al péptido responsable del efecto biológico.

De aquí en adelante, las expresiones "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable", que pueden usarse indistintamente, se refieren a un vehículo o diluyente que no causa irritación significativa a un organismo ni anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. Un adyuvante se incluye en estas expresiones.

En el presente documento, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar además la administración de un principio activo. Los ejemplos, sin limitación, de excipientes incluyen carbonato cálcico, fosfato cálcico, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.

Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se pueden encontrar en "Remington’s Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición, que se incorpora en el presente documento por referencia.

Las vías de administración adecuadas pueden incluir, por ejemplo, la administración oral, rectal, transmucosa, en especial, transnasal, intestinal o parenteral, incluyendo inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecal, intraventricular directa, intravenosa, inrtaperitoneal, intranasal o intraocular.

Como alternativa, se puede administrar la composición farmacéutica de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo, mediante la inyección de la composición farmacéutica directamente en una región tisular de un paciente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden fabricar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.

Las composiciones farmacéuticas para su uso de acuerdo con la presente invención se pueden formular así de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprendan excipientes y adyuvantes que faciliten el procesamiento de los principios activos en preparaciones que puedan usarse farmacéuticamente. La formulación adecuada depende de la vía de administración seleccionada.

Para la inyección, los principios activos de la composición farmacéutica se pueden formular en soluciones acuosas, preferentemente en tampones fisiológicamente compatibles tales como solución de Hank, solución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosa, se usan, en la formulación, penetrantes apropiados para la barrera que se vaya a traspasar. Dichos penetrantes se conocen en general en la técnica.

Para la administración oral, la composición farmacéutica se puede formular fácilmente combinando los compuestos activos con vehículos farmacéuticamente aceptables bien conocidos en la técnica. Dichos vehículos permiten que la composición farmacéutica sea formulada como comprimidos, pastillas, grageas, cápsulas, líquidos, geles, jarabes, pastas, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente. Los preparados farmacológicos para su uso oral se pueden hacer usando un excipiente sólido, opcionalmente moliendo la mezcla resultante, y procesando la mezcla de gránulos, después de añadir los adyuvantes adecuados si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, cargas tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparados de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carbometilcelulosa sódica; y/o polímeros fisiológicamente aceptables tales como polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes desintegrantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.

Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este fin, se pueden usar soluciones de azúcar concentradas que pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol, polietilenglicol, dióxido de titanio, soluciones de laca y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para su identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas que se pueden usar por vía oral incluyen cápsulas de ajuste a presión hechas de gelatina, así como cápsulas blandas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas de ajuste a presión pueden contener los principios activos en mezcla con cargas tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones, lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y, opcionalmente, estabilizantes. En las cápsulas blandas, los principios activos pueden disolverse o suspenderse en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizantes. Todas las formulaciones para la administración oral deben estar a dosis adecuadas para la vía de administración seleccionada.

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Como se usa en el presente documento, la expresión "monoamina hidroxilasa (MaoA)" se refiere a la enzima que degrada los neurotransmisores de amina, tales como la dopamina, la norepinefrina y la serotonina. Un ejemplo de MaoA se expone en NP_000231.1.

De acuerdo con una realización de la presente divulgación, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de triptófano hidroxilasa 2 (Tph2) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un microARN o un precursor del mismo en la célula neuroglial, en la que el microARN se selecciona del grupo que consiste en miR-181 y miR27.

Como se usa en el presente documento, la expresión "triptófano hidroxilasa 2 (Tph2)" se refiere a la enzima que cataliza la primera etapa y la etapa limitante de la velocidad en la biosíntesis de serotonina. Se expone una Tph2 ilustrativa en NP_NP_775489.2.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen del receptor beta adrenérgico 1 (Adrb1) en una célula neuroglial o célula cardiaca, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-19 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor beta adrenérgico 1 (Adrb1)" se refiere al receptor que media los efectos fisiológicos de la adrenalina y la noradrenalina. Un ejemplo de Adrb1 se expone en NP_000675.1.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen del receptor beta adrenérgico 2 (Adrb2) en una célula neuroglial o célula cardiaca, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-15 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor beta adrenérgico 2 (Adrb2)" se refiere al receptor que está directamente asociado con el canal de calcio de tipo L de clase C Ca(V)1.2. Adrb2 se expone, por ejemplo, en NP_000015.1.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen receptor de CRH de tipo 1 en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-15 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "CRH de tipo 1" se refiere al receptor que se une a la hormona liberadora de corticotropina (CRH). La CRH de tipo 1 se expone, por ejemplo, en NP_001138618.1, NP_001138619.1, NP_001138620.1 y NP_004373.2.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de receptor de glutamato en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-181 o un precursor del mismo.

De acuerdo con otra realización, el gen del receptor de glutamato comprende el receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grm1), receptor de glutamato ionotrópico, kainato 3 (Grik3), receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5), receptor de glutamato ionotrópico kainato 2 (Grik2) y receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7), como se describe más detalladamente anteriormente.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de la molécula de adhesión celular del síndrome de Down (Dscam) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-182 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de adhesión celular del síndrome de Down (Dscam)" se refiere a la molécula de adhesión celular que desempeña un papel en la autoevolución neuronal. Dscam se expone, por ejemplo, en NP_001380.2.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de la molécula de adhesión celular L1I (L1cam) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-182 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "molécula de adhesión celular L1 (L1cam)" se refiere a la molécula de adhesión celular neuronal. L1cam se expone, por ejemplo, en NP_000416.1, NP_001137435.1, NP_076493.1.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de la proteína X asociada a Translin (Tsnax) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-182 o un precursor del mismo.

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Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína X asociada a Translin (Tsnax)" se refiere a la proteína que interactúa específicamente con translin. Tsnax se expone, por ejemplo, en NP_005990.1. De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen del receptor canabinoide 1 (CB1) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-19 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "receptor canabinoide 1 (CB1)" se refiere al receptor de membrana celular (también conocido como CNR1). CB1 se expone, por ejemplo, en NP_001153698.1, NP_001153730.1, NP_001153731.1, NP_057167.2, NP_149421.2.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de la proteína 5 de unión a FK506 (FKBP5) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-15 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "proteína 5 de unión a FK506 (FKBP5)" se refiere a la proteína que se une específicamente a los inmunosupresores FK506 y rapamicina. FKBP5 se expone, por ejemplo, en NP_001139247.1, NP_001139248.1, NP_001139249.1, NP_004108.1.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de sintaxina 1a (Stx1a) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-15 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "sintaxina 1a (Stx1a)" se refiere a la proteína específica del sistema nervioso. Stx1a se expone, por ejemplo, en NP_001159375.1, NP_004594.1.

De acuerdo con otra realización, se proporciona un método de regulación de una expresión de un gen de quinasa regulada por suero/glucocorticoide (Sgk1) en una célula neuroglial, comprendiendo el método la modulación de una actividad o expresión de un miR-15 o un precursor del mismo.

Como se usa en el presente documento, la expresión "quinasa regulada por suero/glucocorticoide (Sgk1)" se refiere a proteína quinasa serina/treonina. Sgk1 se expone, por ejemplo, en NP_001137148.1, NP_001137149.1, NP_001137150.1, NP_005618.2.

Las presentes enseñanzas contemplan la regulación por aumento (es decir, el aumento) o la regulación por disminución (es decir, la disminución) de los niveles de expresión de los genes anteriormente mencionados.

La regulación por disminución de la expresión génica de acuerdo con las presentes enseñanzas normalmente se lleva a cabo administrando o expresando en las células diana (por ejemplo, célula neuroglial o célula cardiaca) un polinucleótido de microARN (como se describe con más detalle con anterioridad).

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Slc6a4, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-135 y/o miR-335.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Htr1a, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-135, miR-335, miR-181, miR182 y/o miR-26.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen MaoA, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-27.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen Adrb1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-19.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen del receptor de CRH de tipo 1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-15.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen CB1, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-19.

De acuerdo con una realización específica, cuando la regulación comprende la regulación por disminución de la expresión del gen FKBP5, la modulación comprende la regulación por aumento del miR-15.

Como alternativa, de acuerdo con otra realización de la presente divulgación, la regulación por aumento de la expresión génica se afecta administrando o expresando en las células diana (por ejemplo, célula neuroglial o célula cardiaca) un agente capaz de regular por disminución una expresión de un microARN.

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L1cam, anticuerpo anti-Tsnax, anticuerpo anti-Sgk1 y/o anticuerpo anti-Stx1a) puede interaccionar directamente con una muestra (por ejemplo, lisado celular) que incluya el polipéptido del gen diana, y el complejo formado puede detectarse además usando un anticuerpo secundario conjugado a perlas (por ejemplo, si el anticuerpo específico es un anticuerpo monoclonal de ratón, el anticuerpo secundario puede ser un anticuerpo anti-ratón conjugado con, por ejemplo, perlas de sefarosa). Las perlas pueden precipitarse después por centrifugación, después de lo que las proteínas precipitadas(por ejemplo, el polipéptido del gen diana y los anticuerpos específicos) se pueden separar de las perlas (por ejemplo, usando desnaturalización a 95 ºC) y someterse además a análisis de transferencia Western usando anticuerpos. Como alternativa, el anticuerpo específico y el anticuerpo secundario conjugado con perlas pueden añadirse a la muestra biológica que contiene el antígeno (polipéptido del gen diana) para formar de este modo un inmunocomplejo. Como alternativa, si el polipéptido del gen diana es una proteína altamente glicosilada, también puede precipitarse usando un sustrato capaz de unirse a polipéptidos glicosilados tales como Concavalina A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suecia) que también puede conjugarse con perlas, seguido del análisis de transferencia Western de anticuerpos específicos como se ha descrito anteriormente.

El análisis FACS permite la detección de antígenos presentes en las membranas celulares. En resumen, los anticuerpos específicos, como se ha descrito anteriormente, están unidos a fluoróforos, y la detección se realiza por medio de una máquina de clasificación de células que lee la longitud de onda de la luz emitida desde cada célula a medida que pasa a través de un haz de luz. Este método puede emplear dos o más anticuerpos simultáneamente.

La presencia y/o el nivel del polipéptido del gen diana pueden determinarse también usando ELISA. En resumen, se fija una muestra que contiene el antígeno del gen diana a una superficie tal como un pocillo de una placa de microvaloración. Se aplica un anticuerpo específico del antígeno (por ejemplo, anticuerpo anti-Slc6a4, anticuerpo anti-Htr1a, anticuerpo anti-MaoA, anticuerpo anti-Adrb1, anticuerpo anti-Adrb2, anticuerpo anti-receptor de CRH de tipo 1, anticuerpo anti-CB1, anticuerpo anti-FKBP5, anticuerpo anti-Tph2, anticuerpo anti-Grm1, anticuerpo anti-Grik3, anticuerpo anti-Grm5, anticuerpo anti-Grik2, anticuerpo anti-Grm7, anticuerpo anti-Gria2, anticuerpo anti-Dscam, anticuerpo anti-L1cam, anticuerpo anti-Tsnax, anticuerpo anti-Sgk1 y/o anticuerpo anti-Stx1a) acoplado a una enzima, y se permite la unión al antígeno. La presencia del anticuerpo se detecta entonces y se cuantifica mediante una reacción colorimétrica que emplea la enzima acoplada al anticuerpo. Las enzimas comúnmente empleadas en este método incluyen peroxidasa de rábano picante y fosfatasa alcalina. Si está bien calibrada y dentro del intervalo lineal de respuesta, la cantidad de sustrato presente en la muestra es proporcional a la cantidad de color producido. En general, se emplea un patrón de sustrato para mejorar la exactitud cuantitativa.

La presencia y/o el nivel de un polipéptido de gen diana también puede determinarse usando radioinmunoensayo (RIA). En una versión, este método implica la precipitación del antígeno deseado (polipéptido del gen diana) con un anticuerpo específico y una proteína de unión al anticuerpo radiomarcada (por ejemplo, proteína A marcada con I125) inmovilizada sobre un vehículo precipitable tal como perlas de agarosa. El número de recuentos en el sedimento precipitado es proporcional a la cantidad de antígeno.

En una versión alternativa del RIA, se emplea un antígeno marcado y una proteína de unión al anticuerpo no marcada. Se añade una muestra que contiene una cantidad desconocida de antígeno en cantidades variables. La disminución en los recuentos precipitados del antígeno marcado es proporcional a la cantidad de antígeno en la muestra añadida.

La presencia y/o el nivel de un polipéptido de un gen diana también pueden determinarse usando una metodología basada en el peso molecular. Dado que el inmunocomplejo presenta un peso molecular superior al de sus componentes, también se pueden emplear métodos capaces de detectar dicho cambio en el peso molecular. Por ejemplo, el inmunocomplejo se puede detectar mediante un ensayo de retardo de gel. En resumen, se carga un gel de acrilamida no desnaturalizante con muestras. Un cambio en el tamaño (peso molecular) del producto proteico en comparación con sus componentes es indicativo de la presencia de un inmunocomplejo. Dicho cambio a un peso molecular superior se puede ver usando una tinción de proteína no específica, tal como tinción de plata o tinción de azul de Commassie.

La detección in situ del polipéptido del gen diana en una muestra biológica tal como un corte tisular (por ejemplo, inclusión en parafina o criosección) se puede realizar usando métodos de tinción inmunológica que detecten la unión de anticuerpos sobre las células in situ. Los ejemplos de procedimientos de tinción inmunológica incluyen, pero sin limitación, inmunohistoquímica marcada fluorescentemente (usando un colorante fluorescente conjugado a un anticuerpo), inmunohistoquímica radiomarcada (usando anticuerpos radiomarcados, por ejemplo, 125I) e inmunocitoquímica [usando una enzima (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante o fosfatasa alcalina) y un sustrato cromogénico para producir una reacción colorimétrica]. Se apreciará que las enzimas conjugadas a anticuerpos pueden utilizar diversos sustratos cromogénicos como se ha descrito anteriormente en el presente documento.

Preferentemente, la tinción inmunológica usada por la presente divulgación es inmunohistoquímica y/o inmunocitoquímica.

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Purificación de microARN y análisis de expresión por RT-PCR cuantitativa

Se aislaron ARNm, incluyendo microARN, de neuronas clasificadas, punzones cerebrales congelados y plasma usando el mini kit miRNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se trataron usando miARN

5 del kit miScript de transcripción inversa para generar ADNc. A continuación, se analizaron las muestras de ADNc usando el kit de PCR SYBR®Green (Qiagen) de acuerdo con las directrices del fabricante en el termociclador AB 7500 (Applied Biosystems). Se usaron cebadores específicos para cada miR junto con el cebador universal comercial, mientras que se usó ARNsr de U6 como control interno.

10 Tabla 1B: Secuencias de cebadores usadas para la PCR en tiempo real

SEQ ID NO: Secuencia de cebador Gen

1: TATGGCTTTTTATTCCTATGTGA miR135a

2: TATGGCTTTTCATTCCTATGTGA miR135b

3: TTTGTTCGTTCGGCTCGCGTGA miR375

4: GATGACACGCAAATTCGTGAA U6

5: TAAGGCACGCGGTGAATGCC miR124

Tabla 1C: Secuencias de cebadores usadas para la clonación molecular

Secuencia de cebador: Orientación Tamaño del producto Gen

AGTTCTGCCGCTGATGATG (SEQ ID NO: 6): sentido 2.600 con 2 UTR de 3’ de Htr1a 1

antisentido: UTR de 3’ de Htr1a 2

TGCCTTTAATGCAAAACAGC (SEQ ID NO: 8): sentido 2.000 con 4 UTR de 3’ de MaoA 3

antisentido: UTR de 3’ de MaoA 4

ATCCGCATGAATGCTGTGTA (SEQ ID NO: 10): sentido 760 con 6 UTR de 3’ de Slc6a4 5

GTGGGTGGTGGAAGAGACAC (SEQ ID NO: 11): antisentido UTR de 3’ de Slc6a4 6

CCTACACGCAGAGCATTGAA (SEQ ID NO: 12): sentido 870 con 8 UTR de 3’ de Tph2 7

ACATCCCTGTGGGATTTGAG (SEQ ID NO: 13): antisentido UTR de 3’ de Tph2 8

TGTCTTGCTTATATTTTCTCAGT AG (SEQ ID NO: 14): sentido 320 con 6 UTR de 3’ de Slc6a4 mutada 9

antisentido: 440 con 5 UTR de 3’ de Slc6a4 mutada 10

AAAGATCCCTTTCCCCAATG (SEQ ID NO: 16): sentido 1.400 con 12 UTR de 3’ de Htr1a corta 11

CAGTGCGTCTTCTCCACAGA (SEQ ID NO: 17): antisentido UTR de 3’ de Htr1a corta 12

imagen23: sentido 1.300 con 12 UTR de 3’ de Htr1a mutada Semilla 1 13

antisentido: 120 con 11 UTR de 3’ de Htr1a mutada Semilla 1 14

imagen24: sentido 170 con 12 UTR de 3’ de Htr1a mutada Semilla 2 15

imagen25: antisentido 1.260 con 11 UTR de 3’ de Htr1a mutada Semilla 2 16

sentido: 199 con 18 Pre-mmu-miR135b 17

antisentido: Pre-mmu-miR135b 18

15 Clonación de vector vírico de sobreexpresión de miR135b Se amplificó por PCR pre-miR-135b a partir de ADN genómico de ratón con cebadores añadiendo sitios AgeI de enzima de restricción y luego se incubó en el vector pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Después de la 37

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Aproximadamente solo se espera que del 10 al 20 % de los ratones de un experimento sean "Resilientes". A continuación, se muestra un ejemplo del ensayo de evitación social realizado.

Como se demuestra en la Figura 18A, se colocó solo el ratón en el laberinto social durante 3 minutos para su

5 habituación. La cámara rastreó los movimientos del ratón por todo el laberinto. En la Figura 18C, se expuso el mismo ratón a un nuevo ratón ICR que se colocó más allá de un divisor. La cámara siguió al ratón en la esquina más alejada de la arena, lejos de la ubicación del nuevo ratón. Esta respuesta se consideró como de evitación social y, por lo tanto, este ratón fue clasificado como "Susceptible". Por el contrario, en la Figura 18B y Figura 18D el ratón no mostró evitación social, y por lo tanto, se clasificó como "Resiliente".

10 Se sometieron cuarenta ratones al paradigma de rechazo social y cuarenta ratones sirvieron de control. Tras el ensayo de evitación social, se seleccionaron 9 ratones "resilientes", 9 ratones "sensibles" y 12 ratones de control para la microdisección cerebral. Se recogieron muestras cerebrales 8 días después del ensayo de evitación social de la amígdala, BNST, PFC, rafé dorsal e hipocampo junto con la sangre del tronco.

15 Se combinaron 3 perforaciones de amígdala obtenidas de 3 ratones diferentes y se realizó la inmunoprecipitación con anti-Ago2. Después de la IP, se extrajo ARN del material precipitado. Después de la extracción de 3 amígdalas de cada grupo, había 3 muestras de ARN de los ratones "Resilientes", 3 muestras de ARN de los ratones "Susceptibles" y 4 muestras de ARN de los ratones de control -un total de 10 muestras de ARN. Se ensayó cada

20 muestra en una micromatriz ST de ratón, así como en matriz de miARN (ambas de Affymetrix). Se examinaron los genes y los miARN regulados por aumento o por disminución en cada uno de los 2 grupos: "Susceptible" o "Resiliente" en relación con el grupo de control. Cuando se produjo una interacción entre un determinado miARN y un gen diana, los inventores esperaban una correlación opuesta en sus niveles totales. Sin embargo, se esperaba que el ARNm presente en el complejo RISC (precipitado con el anti-Ago2) estuviera en niveles altos debido a que

25 aún no se había fragmentado; por lo tanto, al mirar los datos de la matriz, los inventores examinaban los miARN y las posibles dianas de ARNm que se regularon bien por aumento o disminución con respecto a la muestra de control, porque esto era una indicación de su interacción con el complejo RISC.

Resultados de las micromatrices

30 La Tabla 3, que se presenta a continuación, ilustra los resultados matriciales preliminares analizados usando filtros convencionales.

Tablas 3A-B: Lista de miARN de amígdala regulados por aumento (Tabla 3A) o por disminución (Tabla 3B) tras la IP 35 con Ago2

(Tabla 3A)

Regulado por aumento: Susceptible al cambio Resiliente al cambio

mmu-miR-301a_st: 1,96 2,11

mmu-miR-15a_st: 1,66 1,87

mmu-miR-29a_st: 1,42 1,82

mmu-miR-19b_st: 1,97 2,34

mmu-miR-146b st: 1,55 1,94

mmu-miR-181d_st: 1,54 1,64

mmu-miR-146a_st: 1,41 1,60

mmu-miR-27b_st: 1,45 1,91

mmu-miR-20a_st: 1,57 1,52

mmu-miR-30a_st: 1,34 1,65

mmu-miR-100_st: 1,41 1,55

mmu-miR-153_st: 1,44 1,92

mmu-miR-194_st: 1,57 1,78

mmu-miR-30c_st: 1,40 1,66

mmu-miR-23a_st: 1,51 1,70

mmu-miR-106a_st: 1,62 1,61

mmu-miR-30b_st: 1,43 1,70

mmu-miR-195_st: 1,59 1,98

mmu-miR-30e_st: 1,36 1,56

mmu-miR-126-3p_st: 1,58 1,76

mmu-let-7i_st: 1,49 1,57

mmu-miR-434-5p_st: 1,30 1,55

mmu-miR-376b_st: 1,64 1,99

mmu-miR-495_st: 1,45 1,82

mmu-miR-369-5p_st: 1,60 1,77

mmu-miR-421_st: 1,71 1,53

mmu-miR-543_st: 1,52 1,69

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mmu-miR-410_st: 1,44 1,76

mmu-miR-34b-5p_st: 2,18 1,53

(Tabla 3B)

Regulado por disminución
Regulado por disminución
Regulado por disminución

mmu-miR-210_st: -1,59 -2,13

mmu-miR-298_st: -1,75 -2,08

mmu-miR-423-5p_st: -1,68 -1,94

mmu-miR-346_st: -1,74 -1,96

mmu-miR-139-3p_st: -1,71 -2,13

mmu-miR-320_st: -1,74 -2,03

mmu-miR-485_st: -1,53 -1,88

mmu-miR-491_st: -1,53 -2,01

mmu-miR-31_st: -1,30 -1,53

mmu-miR-92b_st: -1,20 -1,53

mmu-miR-93_st: -1,36 -1,50

mmu-miR-125a-3p_st: -1,32 -1,55

mmu-miR-134_st: -1,47 -1,63

mmu-miR-323-5p_st: -1,43 -1,76

mmu-miR-345-5p_st: -1,30 -1,62

mmu-miR-341_st: -1,36 -1,89

mmu-miR-370_st: -1,33 -2,04

mmu-miR-433_st: -1,49 -1,75

mmu-miR-455_st: -1,40 -1,61

*Para ambas Tablas 3A-B, los datos se presentan como el cambio para los ratones "Susceptibles" o "Resilientes" en comparación con el Control. Los valores en negrita están modificados significativamente.

Varios miARN, que han sido regulados por aumento significativamente en los grupos de ratones "Susceptibles" y "Resilientes", se han seleccionado e ilustrado en un mapa térmico (véanse las Figuras 19A-B). Matriz de expresión génica (ARNm) Tabla 4: Lista de ARNm de amígdala regulados por amento tras la IP con Ago2

Regulado por aumento: Susceptible al cambio Resiliente al cambio

Tnrc18: 1,36 1,23

Ifi30: 1,34 1,21

Adamts9: 1,79 1,52

Fkbp5: 1,35 1,26

Adhl: 1,42 1,05

Pxdn: 1,32 1,19

Impdh2: 1,41 1,02

Pdzd2: 1,31 1,31

Csmd3: 1,33 1,44

Usfl: 1,33 1,20

A2m: 1,71 1,09

Ccnd3: 1,34 1,10

Rrh: 1,33 1,02

Wfikkn2: 1,40 1,07

Fras1: 1,48 1,34

Notch2: 1,50 1,22

Fam38a: 1,33 1,18

Histlh3f: 1,31 1,19

Fam167a: 1,31 1,05

Calml4: 1,68 1,11

Tspan4: 1,30 1,21

Dnahc6: 1,38 1,07

Jag2: 1,31 1,19

Shank2: 1,60 1,42

Dock6: 1,33 1,10

Mamdc2: 1,30 1,20

Sgms2: 1,39 1,13

Iqub: 1,51 1,11

Ubxn11: 1,36 1,06

Wfdc2: 1,53 1,11

46

E12759827

Spef2: 1,33 1,16

Fggy: 1,31 1,14

Pcolce2: 1,37 1,16

Thbsl: 1,32 1,13

Dnahc7b: 1,40 1,13

Nt5dc2: 1,41 1,12

Slc4a2: 1,34 1,07

Adamts17: 1,40 1,35

Plscr2: 1,34 1,21

Clic6: 1,43 1,13

St6galnac2: 1,38 1,08

Amigo2: 1,33 1,06

Trio: 1,33 1,15

Lamb1-1: 1,35 1,20

Sema3b: 1,40 1,01

Fap: 1,39 1,10

Freml: 1,51 1,20

Ponl: 1,34 1,03

Plin4: 1,43 1,24

Steapl: 1,36 1,10

Rdh5: 1,52 1,13

Cldn2: 1,56 1,11

Frrs1: 1,37 1,10

Spef2: 1,36 1,07

Slcola5: 1,31 1,13

Ltc4s: 1,35 1,17

Mfsd7c: 1,37 1,14

Acss3: 1,32 1,16

Hif3a: 1,36 1,17

Serpinb8: 1,40 1,18

Pcolce: 1,36 1,16

Dnmt3a: 1,20 1,19

GILZ (Tsc22d3): 1,19 1,15

Sdk2: 1,29 1,36

Prg4: 1,16 1,72

Fbnl: 1,24 1,10

Slitrk6: 1,11 1,28

Plxnal: 1,30 1,16

Plxnb2: 1,25 1,10

Sema4b: 1,29 1,14

* Los datos se presentan como el cambio para los ratones "Susceptibles" o "Resilientes" en comparación con el Control. Los valores en negrita están modificados significativamente

Tabla 5: Lista de ARNm de amígdala regulados por disminución tras la IP con Ago2

Regulado por disminución: Susceptible al cambio Resiliente al cambio

Cyp2d10: -1,22 -1,34

Lonrf1: -1,32 -1,31

Btnl5: -1,64 -1,54

B2m: -1,33 -1,20

Tekt5: -1,36 -1,10

Prp2: -1,51 -1,02

Krtap5-1: -1,34 -1,10

Krtap5-4: -1,33 -1,10

Klhl38: -1,38 -1,07

Th: -1,42 -1,03

Pcsk9: -1,33 -1,20

Dnahc3: -1,39 -1,22

Sgpp2: -1,37 -1,03

Opalin: -1,49 -1,28

Se analizan varios posibles miARN y sus posibles dianas en el cerebro.

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Claims

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