BR112016018145B1 - Artigo de fabricação compreendendo micrornas para tratamento e diagnóstico de condições médicas associadas à serotonina, adrenalina, noradrenalina, glutamato e corticotropina que liberam hormônio - Google Patents

Abstract

MicroRNAS E COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO OS MESMOS PARA TRATAMENTO E DIAGNÓSTICO DE CONDIÇÕES MÉDICAS ASSOCIADAS À SEROTONINA, ADRENALINA, NORADRENALINA, GLUTAMATO E CORTICOTROPINA QUE LIBERAM HORMÔNIO, compreende um método para tratamento de um transtorno bipolar em um indivíduo em necessidade respectiva é revelado; o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR-135, de um precursor respectivo ou de uma molécula de ácido nucleico codificando o referido miR-135 ou o referido precursor respectivo, tratando, assim, o transtorno bipolar; métodos de diagnóstico de um transtorno de humor em um indivíduo humano e de monitoramento do tratamento de um fármaco antidepressivo ou de um medicamento para tratamento de um transtorno de humor também são revelados.

Description

CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO

[001] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a microRNAs e, mais especificamente, mas não exclusivamente, ao uso dos mesmos para diagnóstico, tratamento e monitoramento do tratamento de doenças.

[002] Os transtornos de humor, tais como depressão profunda e transtornos de ansiedade, representam alguns dos mais comuns e proliferadores problemas de saúde em todo o mundo, afetando cerca de 10% da população. Apesar de muitas décadas de pesquisa, os mecanismos por trás do início da depressão, susceptibilidade e terapias disponíveis são apenas parcialmente compreendidos. Atualmente, apenas cerca de um terço dos pacientes respondem aos tratamentos disponíveis, portanto, há uma grande necessidade de um melhor entendimento da patologia.

[003] O dogma atual sobre a etiologia da depressão é de uma complexa interação entre fatores ambientais e predisposição genética, o que sugere um papel mecanicista para processos epigenéticos.

[004] A serotonina (5HT) é um neurotransmissor de monoamina produzido no cérebro pelo núcleo da rafe (RN | raphe nucleus) que se projeta amplamente por todo o cérebro para modular a variedade de funções cognitivas, emocionais e fisiológicas. A ligação entre a atividade serotonérgica desregulada e a depressão está bem estabelecida [Michelsen KA. et al., Brain Res Rev (2007) 55(2):329-42]. Os níveis de 5HT, bem como o circuito genético responsável por sua produção, secreção, recaptação e desativação, estão desregulados na depressão. Além disso, a maioria dos medicamentos antidepressivos atualmente disponíveis direciona a função das proteínas relacionadas ao sistema 5HT, resultando em um aumento dos níveis de 5HT na sinapse [Krishnan V e Nestler EJ, Nature (2008) 455: 894-902]. Terapêuticas disponíveis exigem um longo período de administração antes de o alívio dos sintomas ser observado.

[005] MicroRNAs (miRs) são um subconjunto de moléculas endógenas pequenas (cerca de 22 nucleotídeos) de RNA não codificados que reprimem a expressão do gene pós-transcricional. MiRs são transcritos como moléculas de miR primária que são processadas no núcleo de célula em miRs precursores com estruturas de haste e ansa, que são exportadas para o citoplasma onde são posteriormente processadas nos miRs maduros ativos. O miR maduro é posteriormente incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA e funciona principalmente através da ligação às regiões 3’ não traduzidas (3’ UTRs | 3’untranslated regions) de moléculas de mRNA específicos. A ligação ocorre através da sequência de sementes, uma sequência de 6-8 nucleotídeos na extremidade 5’ do miR, estes pares de bases em uma sequência de correspondência da semente complementar no mRNA 3’ UTR alvo. A ligação de um miR leva à desestabilização direta de mRNA ou repressão translacional, resultando na redução dos níveis de proteína do gene alvo.

[006] MiRs são abundantes no sistema nervoso, e a pesquisa inicial foi direcionada principalmente aos neurônios no contexto de desenvolvimento, câncer e distúrbios neurodegenerativos e processo normal, tal como plasticidade [Kosik KS. Nat Rev Neurosci (2006) 7:911-20]. Diversos estudos de triagem de miR relataram que os níveis de miR em diversas estruturas cerebrais de humanos ou roedores adultos são afetadas por uma gama de manipulações farmacológicas e comportamentais [O’Connor R. M. et al., Mol Psychiatry (2012) 17: 359-376]. Adicionalmente, foi sugerido que miRs desempenham uma função nos distúrbios psiquiátricos, tais como esquizofrenia, autismo e também depressão e ansiedade, ambos em modelos de humanos e ratos [Miller BH e Wahlestedt C, Brain Res (2010) 1338: 8999]. Vários estudos demonstraram recentemente o envolvimento de miRs nos genes relacionados à regulação 5HT [Millan MJ. Curr Opin Pharmacol (2011) 11(1):11-22], revelando a função emergente de miRs na regulação do sistema 5HT e sua associação potencial com distúrbios relacionados à depressão.

[007] O Pedido de Patente Norte-Americano n° 20100222413 (de Stoffel M. et al.) revela oligonucleotídeos quimicamente modificados para modular a expressão de microRNAs. O documento U.S. 20100222413 revela, ainda, métodos para silenciar os microRNAs (p.ex., miR-122, miR-16, miR- 192 e miR-194) para tratamento de doenças do sistema nervoso central.

SUMÁRIO

[008] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de um transtorno bipolar em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR-135, um precursor respectivo ou uma molécula de ácido nucleico codificando o miR-135 ou o precursor respectivo, tratando, assim, o transtorno bipolar.

[009] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR-135, um precursor respectivo ou uma molécula de ácido nucleico codificando o miR-135 ou o precursor respectivo para a fabricação de um medicamento identificado para tratar um transtorno bipolar em um indivíduo em necessidade respectiva.

[0010] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um artigo de fabricação, compreendendo um material de embalagem que embala um agente selecionado do grupo consistindo em um miR-135, um precursor respectivo e uma molécula de ácido nucleico codificando o miR-135 ou o precursor respectivo e um medicamento para tratamento de um transtorno bipolar.

[0011] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de monitoramento do tratamento de um fármaco antidepressivo ou um medicamento para tratamento de um transtorno de humor, o método compreendendo: (a) tratar um indivíduo humano em necessidade respectiva com um fármaco antidepressivo ou um medicamento para tratamento de um transtorno de humor; e (b) medir um nível de expressão de um miR-135 na amostra biológica do indivíduo humano antes e depois do tratamento, em que um nível de expressão mais elevado do miR-135 após o tratamento pelo fármaco antidepressivo ou pelo medicamento para tratamento do transtorno de humor, conforme comparado ao nível de expressão do miR-135 antes do tratamento pelo fármaco antidepressivo ou pelo medicamento para tratamento do transtorno de humor, é indicativo do tratamento eficaz.

[0012] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de diagnóstico de um transtorno de humor em um indivíduo humano em necessidade respectiva, o método compreendendo medir um nível de expressão de um miR-135 em uma amostra biológica do indivíduo humano, em que um nível de expressão mais baixo do miR-135, conforme comparado àquele em uma amostra biológica de um indivíduo humano saudável, é indicativo do transtorno de humor.

[0013] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo um miR-135, em que o miR-135 compreende uma modificação selecionada do grupo consistindo em um ácido nucleico bloqueado (LNA|locked nucleic acid) e 2’-Fluoroarabino-oligonucleotídeos (FANA|Fluoroarabinooligo- nucleotides). [0014] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo um miR135 modificado selecionado do grupo consistindo na ID SEQ. N° 194, ID SEQ. N° 195, ID SEQ. N° 196, ID SEQ. N° 197, ID SEQ. N° 198, ID SEQ. N° 199, ID SEQ. N° 200, ID SEQ. N° 201, ID SEQ. N° 202, ID SEQ. N° 203, ID SEQ. N° 204, ID SEQ. N° 205, ID SEQ. N° 206, ID SEQ. N° 207, ID SEQ. N° 208 e ID SEQ. N° 209.

[0014] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo um microRNA selecionado do grupo consistindo em miR- 335, miR-181, miR-182, miR-26, miR-27, miR-15 e miR-19, em que o microRNA compreende uma modificação selecionada do grupo consistindo em um ácido nucleico bloqueado (LNA) e 2’-Fluoroarabino- oligonucleotídeos (FANA).

[0015] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma composição farmacêutica, compreendendo o polinucleotídeo isolado de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0016] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de regulação ascendente de uma expressão de um gene selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4) em uma célula da glia, o método compreendendo: a regulação descendente de uma atividade ou expressão de um miR-135 ou um precursor respectivo da referida célula da glia e a medição de uma expressão do referido gene na referida célula da glia, regulando, assim, de forma ascendente, a expressão do gene.

[0017] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de regulação descendente de uma expressão de um gene selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4) em uma célula da glia, o método compreendendo: a regulação ascendente de uma atividade ou expressão de um miR-135 ou um precursor respectivo da referida célula da glia e a medição de uma expressão do referido gene na referida célula da glia, regulando, assim, de forma descendente, a expressão do gene.

[0018] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual uma elevação no nível de serotonina é terapeuticamente benéfica em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo um agente capaz de regular de forma descendente uma atividade ou empressão de um miR-135 alvo selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+ 2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4) em que o referido agente não é um miR-135, tratando, assim, a condição médica.

[0019] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a condição médica é selecionada do grupo consistindo em um transtorno bipolar, uma depressão, uma depressão profunda, uma ansiedade, um estresse, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, um vício, uma fobia social, uma esquizofrenia, um transtorno do sono, um transtorno alimentar, um transtorno de crescimento e um transtorno de reprodução.

[0020] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é selecionado do grupo consistindo em miR- 135a e miR-135b.

[0021] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 5862.

[0022] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 compreende miR-135*, conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 192-193.

[0023] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 compreende uma modificação selecionada do grupo consistindo em uma coluna vertebral de açúcar fosfato modificada e uma base modificada.

[0024] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 compreende uma modificação tanto na ligação de açúcar quanto na ligação internucleosídea.

[0025] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a modificação é selecionada do grupo consistindo em um fosforotioato, um fosforotioato quiral, um fosforoditioato, um fosfotriéster, um aminoalquil-fosfotriéster, um metilfosfonato, um alquilfosfonato, fosfonato quiral, um fosfinato, um fosforamidato, um aminoalquilfosforamidato, um tionofosforamidato, um tionoalquilfosfonato, um tionoalquilfosfotriéster, um boranofosfato, um fosfodiéster, uma 2’-O- metoxietila, uma 2’-O-metila, um 2’-flúor, um ácido nucleico bloqueado (LNA), um ácido nucleico peptídico (PNA|peptide nucleic acid) e 2’- Fluoroarabino- oligonucleotídeos (FANA).

[0026] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 194209.

[0027] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o transtorno bipolar é selecionado do grupo consistindo em Bipolar I, Bipolar II, Transtorno bipolar de ciclagem rápida, Ciclotimia e Transtorno Bipolar Sem Outra Especificação (BD-NOS).

[0028] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é selecionado do grupo consistindo na ID SEQ. N° 58, ID SEQ. N° 59, ID SEQ. N° 60, ID SEQ. N° 61 e ID SEQ. N° 62.

[0029] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 compreende miR-135* selecionado do grupo consistindo na ID SEQ. N° 192 e ID SEQ. N° 193.

[0030] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é selecionado do grupo consistindo na ID SEQ. N° 194, ID SEQ. N° 195, ID SEQ. N° 196, ID SEQ. N° 197, ID SEQ. N° 198, ID SEQ. N° 199, ID SEQ. N° 200, ID SEQ. N° 201, ID SEQ. N° 202, ID SEQ. N° 203, ID SEQ. N° 204, ID SEQ. N° 205, ID SEQ. N° 206, ID SEQ. N° 207, ID SEQ. N° 208 e ID SEQ. N° 209.

[0031] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o medicamento para tratamento de um transtorno bipolar é selecionado do grupo consistindo em um lítio, um medicamento antipsicótico e um medicamento estabilizador de humor.

[0032] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, (c) tratar o indivíduo humano quando um nível de expressão mais elevado do miR-135 for observado na etapa (b).

[0033] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, obter uma amostra biológica do indivíduo humano antes do tratamento.

[0034] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o transtorno de humor compreende um transtorno bipolar.

[0035] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o fármaco antidepressivo é selecionado do grupo consistindo em inibidores de reabsorção de serotonina seletiva (SSRI | selective serotonin reuptake inhibitors), antidepressivos tricíclicos e inibidores de reabsorção de noradrenalina (NRI | noradrenaline reuptake inhibitors).

[0036] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o medicamento para tratamento do transtorno de humor é selecionado do grupo consistindo em um lítio, um medicamento antipsicótico e um medicamento estabilizador de humor.

[0037] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo em um sangue completo, um soro, um plasma e leucócitos.

[0038] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o transtorno de humor é selecionado do grupo consistindo em um transtorno bipolar, uma depressão, uma depressão profunda, uma ansiedade, um estresse, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, um vício, uma fobia social, uma esquizofrenia, um transtorno do sono e um transtorno alimentar.

[0039] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o miR-135 é selecionado do grupo consistindo em miR- 135a ou miR-135b.

[0040] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o indivíduo é um indivíduo humano.

[0041] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e/ou científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado como é comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica a qual pertence o presente pedido de patente de invenção. Apesar de métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste documento poderem ser utilizados na prática ou teste de aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares estão descritos abaixo. Em caso de conflito, a especificação da patente, incluindo definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser necessariamente limitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0042] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são descritas neste documento, a título de exemplo somente, tendo como referência os desenhos anexos. Com referência específica aos desenhos em detalhes, sublinha-se que os elementos indicados são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. A este respeito, a descrição tomada com os desenhos torna evidente aos especialistas na técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.

[0043] Nos desenhos: As figuras 1A-I retratam a expressão de microRNA nos neurônios de serotonina (5HT). A figura 1A é uma ilustração gráfica de miRNAs expressos diferencialmente em neurônios 5HT. Valores normalizados Lowess são retratados como valores de mudança de dobra ln2 da intensidade do ponto traçado com relação às intensidades de logs médios (Gráfico MA); a figura 1B é uma validação dos resultados da matriz em tempo real miRs PCR indicando um aumento dos níveis de miR-375 nos neurônios 5HT comparado ao controle. N = 5 células 5HT, n = 4 não 5HT. As barras representam uma média ± de s.e.m. **P=0,0071; a figura 1C é uma validação dos resultados da matriz em tempo real miRs PCR indicando uma diminuição dos níveis de miR-135a nos neurônios 5HT comparado ao controle. N= 5 células 5HT, n = 4 não 5HT. **P=0,0075; a figura 1D é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para Slc6a4, com 5HT resultados de micro matriz e listando miRs escolhidos para testes in vitro; a figura 1E é um diagrama de van representando predições de bioinformática cruzadas para Htr1a com resultados de micro matriz 5HT e listando miRs escolhidos para testes in vitro; a figura 1F é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para Tph2 com resultados de micro matriz 5HT e listagem de miRs escolhidos para testes in vitro; a figura 1 é um diagrama de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para MaoA com resultados de micro matriz 5HT e listagem de miRs escolhidos para testes in vitro; a figura 1H é um gráfico que ilustra os resultados de ensaio de repórter luciferase indicando que o vmiR- 181c e o miR-27b podem direcionar o Tph2 3’UTR; e a figura 1I é um gráfico que ilustra os resultados de ensaio de repórter luciferase indicando que miR- 27b pode direcionar o Htr1a MaoA.

[0044] As figuras 2A-H retratam o direcionamento de microRNA de Slc6a4 3’UTR (ID SEQ. N° 25) e Htr1a 3’UTR (ID SEQ. N° 27). A figura 2A é uma ilustração do direcionamento miR-135a e miR-135b (ID SEQ. N° 24 e 26, respectivamente) do Slc6a4 3’UTR; a figura 2B é uma ilustração do direcionamento miR-135a e miR-135b (ID SEQ. N° 24 e 26, respectivamente) do Htr1a 3’UTR; a figura 2C é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase, indicando que o miR-135a e o miR-135b podem direcionar Slc6a4 3’UTR. Os dados do ensaio de luciferase retratam a atividade luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter luciferase de vagalume cotransfectado em células HEK293 transfectadas com 3’UTR do gene descrito e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico. Barras representam uma média ± de s.e.m. *P=0,014, ***P=0,0002, para miR-16 #p<0,0535, para miR-27 #P=0,0967; a figura 2D é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase indicando que o miR-135a, miR-135b, miR-335, miR- 181C e miR-26a podem direcionar Htr1a 3’UTR. ***P<0,0001, **P=0,0029; a figura 2E é um desenho da conservação slc6a4 3’UTR das combinações de sementes para miR-135 (ID SEQ. N° 27-41); a figura 2F é um desenho das combinações de sementes Htr1a 3’UTR para miR-135 (ID SEQ. N° 42-54), indicando que a semente 1 aparece apenas no rato 3’ UTR, e semente 2 é altamente conservada; a figura 2 é um gráfico que ilustra que a mutação na combinação de semente miR-135 no slc6a4 3’UTR bloqueou o efeito repressor de miR-135a e miR-135b. ***P<0,0001, **P=0,0032; e a figura 2H é um gráfico que ilustra a mutação na combinação de semente miR135 no Htr1a 3’ UTR individualmente e os dois juntos, indicando que o miR-135b direciona Htr1a através de ambas as combinações de sementes e miR-135a apenas pela semente 2. ***P<0,0001.

[0045] As figuras 3A-F retrata os níveis de miR-135a e miR-135b sob diferentes condições. A figura 3A é um gráfico que ilustra uma regulação descendente dos níveis de miR-135a no RN após estresse agudo. As barras representam uma média ± de s.e.m. (n=8 no grupo 0, n=10 no grupo 90 e n=9 no grupo 24) ***P<0,0001, *P=0,0357; a figura 3B é um gráfico que ilustra uma regulação descendente dos níveis de miR-135b no RN após estresse agudo. ***P<0,0001, **P=0,0055; a figura 3C é um gráfico que ilustra uma regulação ascendente dos níveis de miR-135a no RN após administração de imipramina aguda e crônica, independentemente de se os ratos foram expostos ao fracasso social. (N=8 em salina crônica de controle e imipramina crônica de controle, n=7 imipramina aguda, n=11 salina crônica do fracasso social, n=9 na imipramina crônica do fracasso social) **P=0,003; a figura 3D é um gráfico que ilustra uma regulação ascendente dos níveis de miR-135b no RN após administração de imipramina aguda e crônica, independentemente de se os ratos foram expostos ao fracasso social. **P=0,0093; a figura 3E é um gráfico que ilustra o aumento nos níveis de miR-135a no RN após administração aguda ou crônica de SSRI, e não NRI ou solução salina. (N=8 em cada grupo, além da solução salina aguda n=7) ***P<0,0001; a figura 3F é um gráfico que ilustra níveis inalterados de miR-135b no RN após administração aguda ou crônica de SSRI ou NRI.

[0046] As figuras 4A-H retratam superexpressão in vivo do miR- 135b. A figura 4A é um desenho esquemático dos lentivírus para a superexpressão do miR-135b; a figura 4B é um gráfico que ilustra os resultados PCR em tempo real, indicando superexpressão do miR-135b in vivo no núcleo de rafe dorsal (DRN | dorsal raphe nucleus) de ratos adultos. As barras representam uma média ± de s.e.m. (n=5 GFP injetado e n=3 miR- 135 OE) P=0,0032; as figuras 3C-D são desenhos de um local de injeção DRN pela demonstração de coloração GFP no local de injeções. (Mapa de seção adotado de Paxinos); a figura 4E é um gráfico que ilustra uma diminuição do tempo de imobilidade no teste de natação forçada em ratos superexpressando o miR-135b no RN em relação ao controle de ratos. (n=9 controle n=9 miR-135) P=0,0088 no minuto 3 e P=0,00330 para o minuto 4; a figura 4F é um gráfico que ilustra a diminuição do tempo de imobilidade no teste de suspensão da cauda em ratos superexpressando o miR-135b no RN em relação ao controle de ratos. P=0,07351; as figuras 4G-H são gráficos que ilustram nenhuma diferença na locomoção de gaiola em ratos superexpressando o miR-135b no RN em comparação aos controles.

[0047] A figura 5 retrata o ADRb1 3’UTR clonado acompanhando o gene da luciferase. O desenho do ADRb1 3’UTR (superior) intacto, abrigando quatro locais de ligação miR-19 e forma mutante (inferior) do ADRb1 3’UTR, faltando todos os quatro locais de ligação miR-19, clonaram a jusante ao gene da luciferase em plasmídeo Psicheck2.

[0048] As figuras 6A-E retratam que o miR-19b direciona ADRb1 3 ‘UTR através da combinação de sementes em sua 3’ UTR; as figuras 6A-B são gráficos que ilustram os níveis normalizados de luciferase, medidos em células HT22 que expressam níveis baixos de endógenos miR-19, após transfecção com plasmídeo GFP (figura 6A) ou plasmídeo de superexpressão (OE | overexpression) pre-miR-19b (figura 6B); as figuras 6C-E são gráficos que ilustram os níveis de luciferase normalizados medidos em células HEK293T que expressam altos níveis endógenos de miR-19. Transfecção com plasmídeo de controle (figura 6C), sonda de silenciamento (KD | knockdown) miR-19b (figura 6D) ou sonda de movimento como controle, e transfecção (figura 6E) com plasmídeo miArrest miR-19b ou plasmídeo miArrest de controle. *** P<0,005. Uma atividade luciferase de renila foi normalizada por níveis de expressão de luciferase de vagalume e apresentada como razão da atividade alcançada pela forma mutante do Adrb1-3’UTR (Adrb1-mut), na presença do tratamento de controle.

[0049] As figuras 7A-D retratam a expressão diferencial do miRNA na amígdala. As figuras 7A-B são gráficos que ilustram a expressão diferencial do miRNA na amígdala 90 minutos após estresse agudo. A figura 7A ilustra um resultado de matriz Agilent. A figura 7b ilustra resultados de matriz Affymetrix. Valores normalizados são retratados como relação de log2 (stress vs. controle) de intensidade local, traçada com relação às intensidades médias através das condições (N=2, 2). A intensidade de cada miRNA foi calculada como a intensidade média normalizada através de repetições biológicas. O miR-15a e o miR-15b são indicados em vermelho. O miR-124, um marcador neuronal bem estabelecido, não afetado pelo protocolo de estresse, é indicado em branco; a figura 7C ilustra que o miR-15a e miR-15b têm uma combinação de semente semi-conservada no receptor 3’UTR de tipo 1 do hormônio de liberação de corticotropina [(CRHR1, adaptado do targetscan(ponto)org]; e a figura 7D é um gráfico que ilustra a atividade de luciferase medida em células HEK293T co-transfectadas com superexpressão do miR-15b-EGFP ou expressando plasmídeo GFP e um plasmídeo relator de luciferase controlado por CRFR1-3’UTR. Uma atividade luciferase de renila foi normalizada por níveis de expressão de luciferase de vagalume.

[0050] A figura 8 é um gráfico que ilustra os resultados do ensaio de repórter luciferase indicando que o miR-182 provavelmente direciona o Htr1a 3’UTR. Os dados dos ensaios de luciferase retratam a atividade luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter de luciferase de vagalume co-transfectado em células HEK293, transfectadas com 3’UTR do gene descrito e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico.

[0051] A figura 9 é um gráfico ilustrando os resultados PCR em tempo real dos níveis de expressão do miR-182 no DRN de ratos adultos, indicando uma tendência para a regulação descendente da expressão após fracasso social crônico. Os dados representam uma média ± de controles s.e.m. n=7 e 18 ratos no grupo de fracasso social, # = p = 0,1.

[0052] A figura 10 é um diagrama de van representando previsões bioinformáticas in silico para direcionamento miR-182 em dois algoritmos, e lista de genes alvo em potencial, altamente relevantes para a função neuronal normal e patológica, aparecendo nesta previsão.

[0053] As figuras 11A-C retratam a superexpressão ou silenciamento do miR-182. A figura 11A é um desenho esquemático do lentivírus para uma superexpressão do miR-182; a figura 11B é um gráfico que ilustra os resultados PCR em tempo real, indicando uma superexpressão do miR-182 in vitro em linhagem de células N2A; e a figura 11 é um desenho esquemático do lentivírus por silenciamento do miR-182.

[0054] As figuras 12A-D mostram níveis de miR-19 no PFC após administração de NRI. A reboxetina NRI foi administrada tanto de forma aguda (uma vez) quanto crônica (por 18 dias). De nota, níveis de miR-19a e 19b-miR diminuíram no PFC após administração aguda de NRI (figura 12A e figura 12B, respectivamente), mas aumentou após a administração crônica de NRI (figura 12C e figura 12D, respectivamente).

[0055] As figuras 13A-D retratam níveis de miR-19 no PFC e amígdala dos ratos submetidos ao fracasso social. Os níveis de miR-19a e 19b-miR foram medidos em amostras de amígdala tiradas de ratos que foram submetidos a paradigma de fracasso social. De nota, os níveis de miR-19a e miR-19b no PFC foram elevados em ratos categorizados como sendo “Suscetíveis” ao fracasso social, relativo a ratos de controle (figura 13A e figura 13B, respectivamente). Os níveis de miR-19 também foram elevados na amígdala de ratos categorizados como sendo “Suscetíveis” ao fracasso social, relativo a ratos de controle (figura 13 C e figura 13D, respectivamente).

[0056] A figura 14 mostra o direcionamento de miRNA-19b CB1 3’UTR. A transfecção de células HT-22 com CB1 3’ UTR e plasmídeos superexpressando tanto miR-19b quanto controle GFP levam a uma diminuição de 50% nos níveis de luciferase normalizado.

[0057] As figuras 15A-B são desenhos esquemáticos de uma seção coronal do cérebro do rato. A figura 15A mostra vários núcleos do cérebro, incluindo o BLA (adaptado do cérebro do rato por Paxinos e Franklin); a figura 15B mostra uma distribuição CB1 no cérebro (adaptado do Atlas do Cérebro de Allen www(ponto)mouse(ponto)brain-map(ponto)org/). De nota, é evidente por esta distribuição que a CB1 é abundante no BLA.

[0058] A figura 16 é um desenho esquemático de um mecanismo proposto para a consolidação da memória no núcleo basolateral da amígdala (BLA | basolateral amygdala). A corticosterona (CORT) se liga a um receptor de glicocorticoide ligao à membrana ainda descaracterizada (mbGR|membrane-bound glucocorticoid receptor) que ativa a via Gs- cAMP/PKA para induzir a síntese de endocanabinoides (eCB|endocannabinoid). Endocanabinoides são liberados na sinapse onde eles se ligam aos receptores CB1 em terminais gabaérgicos, inibindo a liberação de GABA. Esta inibição da liberação de GABA desinibe a liberação de norepinefrina (NE | norepinephrine) e aumenta a ativação de NE dos adrenoceptores-(3 pós-sinápticos, aumentando a consolidação de memórias emocionalmente repugnantes.

[0059] As figuras 17A-B ilustram o Ago2 no complexo RISC. A figura 17A é um desenho esquemático da Ago2 no complexo RISC, mediando a interação entre o miRNA e o mRNA; a figura 17B ilustra uma análise do borrão ocidental realizada com anticorpo anti-Ago2. Este IP foi específico para a proteína Ago2, como pode ser visto quando comparando a amostra total do cérebro que foi precipitada uma vez com o anticorpo Ago2 e outra com o controle de IgG1. De nota, não houve nenhuma detecção da proteína Ago2 em amostras precipitadas com o controle de IgG1.

[0060] As figuras 18A-D retratam um teste de esquiva social. Os ratos foram colocados em um labirinto por 3 minutos sozinhos para habituação (figura 18A e figura 18B) e seu movimento foi gravado e traçado. Após 3 minutos, um novo rato ICR foi colocado na câmara ao lado do rato examinado (figura 18C e figura 18D) e o movimento do rato examinado foi gravado e traçado novamente.

[0061] A figura 19A retrata um desenho de um mapa de calor dos miRNAs selecionados regulados de forma ascendente nas matrizes.

[0062] A figura 19B retrata um desenho de um mapa de calor dos miRNAs selecionados regulados de forma descendente nas matrizes.

[0063] As figuras 20A-B retratam a expressão alog2 de miR-15a (figura 20A) e FKBP5 (figura 20B) dos resultados de micro matriz. Cada ponto vermelho refere-se a uma repetição de uma matriz. O grupo de controle (CNT) teve 4 repetições, o grupo de “Suscetíveis” (SUSC) teve 3 repetições e o grupo “Resiliente” (RESIL) teve 3 repetições. A linha preta mostrou a média das repetições em cada grupo.

[0064] A figura 20 C retrata uma sequência 3’ UTR do rato FKBP5 (extraído do targetscan.org).

[0065] As figuras 21A-B retratam os níveis de miR-15a amigdalar (figura 21A) e FKBP5 (figura 21B) em ratos “Suscetíveis” em relação a ratos de controle após o fracasso social. De nota, os níveis de miR-15a foram elevados na amígdala de ratos submetidos ao fracasso social e caracterizado como “Suscetíveis” (figura 21A). Os níveis FKBP5 foram menores na amígdala de ratos submetidos ao fracasso social e caracterizado como “Suscetíveis” (figura 21B).

[0066] A figura 22 é um desenho esquemático do 3’UTR do Stx1a, Sgk1 e Adrb2, cada um abrigando um único local de ligação miRNA-15.

[0067] A figura 23 mostra os níveis de miR-181 amigdalar em ratos submetidos ao fracasso social relativo a ratos de controle. De nota, os níveis de miR-181 foram elevados na amígdala de ratos submetidos ao fracasso social.

[0068] A figura 24 mostra diagramas de van representando as previsões bioinformáticas cruzadas para receptores miR-181 e glutamato.

[0069] A figura 25 é um desenho esquemático do 3’UTR intacto de 6 direcionamentos potenciais de miR-181.

[0070] A figura 26 mostra os níveis de expressão de miR182 no núcleo de rafe após estresse. De nota, um estresse de imobilização agudo de 30 minutos levou à níveis de diminuição da expressão de miR182 no RN quando testados 24 horas após o estresse medido pelo PCR em tempo real. **=P<0,01; n=8 em cada grupo.

[0071] As figuras 27-29 retratam os resultados de um ensaio de repórter luciferase indicando que o miR182 direciona DSCAM, L1CAM e TSNAX 3’UTR. A figura 27 ilustra dados dos ensaios de luciferase, retratando a atividade de luciferase de renila normalizada para a atividade de um repórter luciferase de vagalume co-transfectado em células N2a transfectadas com 3’UTR dos genes descritos e um vetor vazio ou um vetor superexpressando um miR específico. A mutação na combinação de sementes miR182 na L1cam (figura 28) e Tsnax (figura 29) 3’ UTRs bloqueou o efeito repressor do miR182. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

[0072] As figuras 30A-E retratam a validação da KD miR135 in vitro e in vivo. As figuras 30A-B ilustram os resultados de um ensaio repórter do luciferase indicando que o direcionamento de miR135 do Htr1a (figura 30A) e slc6a4 (figura 30B) foi bloqueado pela estrutura da KD miR135b; a figura 30C é um desenho esquemático da KD miR135b e controle de vetores virais; e as figuras 30D-E são desenhos de um local de injeção DRN (figura 30 adotada de Paxinos) e figura 30E é uma coloração GFP de DRN infectados com lentivírus da KD miR135.

[0073] As figuras 31A-G retratam o comportamento de ansiedade aumentado e resposta atenuada de SSRI nos ratos da KD miR135. A figura 31A ilustra que o comportamento dos ratos da KD miR135 foi semelhante aos ratos de controle no teste de campo aberto; a figura 31B ilustra o comportamento de ansiedade aumentado em ratos da KD miR135 em relação aos ratos de controle no labirinto de pulso elevado; a figura 31C ilustra que, no teste de transferência em luz negra, os ratos da KD miR135 gastaram mais tempo na câmara de luz em comparação com os ratos de controle sob condições de estresse basal, mas não após estresse agudo; a figura 31D ilustra que os ratos da KD miR135 visitaram a câmara de luz mais vezes se comparado aos ratos de controle, sob condições de estresse basal, mas não após estresse agudo; a figura 31E ilustra que os ratos da KD miR135 viajaram menos distância na câmara de luz em relação aos ratos de controle, sob condições de estresse basal, mas não após estresse agudo; a figura 31F não ilustra nenhuma diferença entre os ratos da KD miR135 e ratos de controle no teste de suspensão de cauda, ambos em condições basais e após administração de SSRI, no entanto, a diminuição do tempo de imobilidade foi observada após tratamento de SSRI se comparado à condição basal em ambos os grupos. (Figuras 31F-G). O tempo de imobilidade foi reduzido em SSRI em ambos os grupos, no entanto, a redução foi atenuada em ratos da KD miR135, em comparação aos ratos de controle nos últimos 2 minutos do teste. ~=p<0,1 *=p<0,05; **=p<0,01; ***=p<0,001. n=10-11 em cada grupo.

[0074] A figura 32 é um desenho esquemático do sistema de superexpressão induzível de ratos miR135. Ratos transgênicos expressam uma parada transacional em forma de sanduíche antes da sequência do miR135a e repórter GFP. Ratos transgênicos mutantes expressam o miR135a apenas em células positivas de 5-HT ePet.

[0075] As figuras 33A-C retratam a validação de uma linha de ratos superexpressando o miR135 em neurônios 5-HT. A figura 33A ilustra que o miR135 foi superexpressado no RN de ratos miR135OE se comparado aos ratos de controle. As figuras 33B-C ilustram que o mRNA dos genes alvo miR 135 forma regulados de forma descendente em ratos miR135OE RN, ambos Slc6a4 (figura 33B) e Htr1a (figura 33C). #=p<0,1 *=p<0,05; n=4 em cada grupo.

[0076] As figuras 34A-E retratam a diminuição do comportamento de ansiedade e depressão após fracasso social em ratos miR135OE. A figura 34A mostra que os ratos miR135OE têm um comportamento de ansiedade diminuído no teste de campo aberto; a figura 34B mostra menos comportamentos de ansiedade em relação aos ratos de controle miR135OE em um teste de transferência de luz negra; a figura 34 mostra uma diminuição do comportamento de ansiedade em relação aos ratos de controle no labirinto de pulso elevado dos ratos miR135OE; a figura 34 mostra uma tendência na diminuição do tempo da imobilidade de ratos miR135OE em comparação com ratos de controle em teste de suspensão de cauda; e a figura 34E mostra o tempo de imobilidade reduzido em ratos miR135OE se comparado com ratos de controle no teste de natação forçada.#=p<0,1 *=p<0,05;**=p<0,01 n=7-11 em cada grupo.

[0077] As figuras 35A-D ilustram a “impressão digital” do microRNA dos neurônios 5HT. (figura 35A) Ilustração esquemática do desenho experimental para determinar a “impressão digital” de microRNA neuronal 5HT. Os metencéfalos embrionários de rato ePet-EYFP foram dissecados e FACS classificadas para células positivas 5HT-YFP e negativas YFP. A expressão de miR das duas populações foi comparada usando o microarranjo microRNA Agilent; (figuras 35B-35D) Validação do fenótipo de célula por PCR em tempo real indicando que YFP (figura 35B) e TPH2 (figura 35C) foram significativamente enriquecidos em 5HT comparado às células não 5HT e aquela GAD67, um marcador GABAérgico, foi significativamente mais elevado nas células não 5HT (figura 35D). As barras representam uma média ± de s.e.m. ***P<0,001.

[0078] As figuras 36A-C ilustram a conservação evolucionária de variantes de miR-135. (figuras 36A-C) miR-135a-1 (figura 36A), miR-135a-2 (figura 36B) e miR-135b (figura 36C) são altamente conservados através da evolução, enquanto as sequências de miR maduro, destacadas na cor, são quase perfeitamente conservadas. Os dados modificados formam navegador de genoma UCSC (Kent WJ, 2002).

[0079] As figuras 37A-G ilustram que o miR-135 é regulado de forma ascendente em RN de rato adulto após tratamento com antidepressivo. (figura 37A) O alinhamento entre miR-135a e miR-135b maduro indicando uma diferença de nucleotídeo; (figura 37B) Níveis de expressão de miR-135a e miR-135b no RN de rato; (figura 37C) Perfil de expressão de vários miRs em RN de rato adulto indicando miR-135a é aproximadamente 5 vezes menos abundante que miR-124, e 2,5 vezes menos que miR-16. As barras representam uma média ± de s.e.m.; (figura 37D) Ratos expostos ao fracasso social demonstraram aumento da anulação social, a menos que tratados com imipramina crônica. A razão de interação é calculada como o tempo gasto na zona próxima do rato não familiar dividido pelo tempo gasto na mesma zona durante habitação multiplicada por 100. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05; (figuras 37E e 37F) os níveis de miR-135a foram regulados de forma ascendente no RN após administração de imipramina crônica (figura 37E) ou aguda (figura 37F) e foram inalterados após exposição ao protocolo de fracasso social crônico. As barras representam uma média ± de s.e.m. **P<0,01; (figura 37G) SSRI e não NRI ou solução salina, após administração aguda ou crônica, provocaram um aumento significativo nos níveis de miR-135a no RN. As barras representam uma média ± de s.e.m. ***P<0,001.

[0080] As figuras 38A-M ilustram que a superexpressão de miR-135 especificamente em neurônios 5HT provoca resiliência comportamental ao fracasso social. (figura 38A) Ilustração esquemática de modelo de rato de superexpressão condicional de miR-135. Ratos transgênicos com sequência de PARADA transcricional flanqueada a jusante do miR-135a e sequências GFP foram cruzadas com ratos recombinase ePet-Cre. Os ratos duplos transgênicos superexpressam miR-135a especificamente em células 5HT- positivas. Os ratos da mesma ninhada que carregam apenas o transgene para miR-135a e não o transgene ePet-Cre serviram como controles; (figura 38B) os níveis de expressão de miR-135a no RN foram regulados de forma ascendente por aproximadamente 2 vezes em ratos superexpressando (OE | overexpressing) miR-135 comparados aos controles; (figuras 38C e 38D) Genes alvo de miR-135, Slc6a4 (figura 38C) e Htr1a (figura 38D) mRNA foram regulados de forma descendente em ratos miR-135OE comparados às ninhadas de controle. As barras representam uma média ± de s.e.m. # P<0,1; *P<0,05; (figuras 38E a 38G) No teste de transferência de claro-escuro, os ratos miR-135OE e suas ninhadas de controle foram testadoss seja em condições ‘basais’ de estresse ou após fracasso social crônico. Não foram observadas diferenças entre os genótipos em condições ‘basais’, entretanto, após fracasso social crônico, os ratos OE miR-135 gastaram mais tempo na luz (figura 38E), visitaram o compartimento iluminado mais frequentemente (figura 38F) e viajaram uma distância mais longa na luz (figura 38G); o desempenho comportamental dos ratos miR-135OE não diferiu significativamente após o protocolo de fracasso social. Em contraste, os ratos de controle demonstraram aumento significativo nos comportamentos do tipo ansiedade em todos os parâmetros medidos do teste claro-escuro após fracasso social. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, ***P<0,001; (figuras 38H-38J) No teste de labirinto em cruz elevado, os ratos de controle que foram expostos ao fracasso social gastaram menos tempo (figura 38H), tiveram um número menor de visitas (figura 38I) e viajaram uma distância menor (figura 38J) nos braços abertos, comparado aos ratos de controle testados em condições ‘basais’. Não foram observadas diferenças significativas entre condições ‘basais’ e de estresse no grupo miR-135OE. As barras representam uma média ± de s.e.m. **P<0,01, ***P<0,001; (figuras 38K e 38L) No teste de nado forçado, não foram observadas diferenças significativas entre os grupos quando testados em condições ‘basais’ de estresse (figura 38K), entretanto, quando testados após fracasso social crônico, os ratos miR-135OE demonstraram diminuição da imobilidade comparado às ninhadas de controle (figura 38L). Gráficos de linha representam uma média ± de s.e.m. ***p<0,001; (figura 38M) não foram observadas diferenças na atividade de locomoção entre as ninhadas de miR- 135OE e de controle conforme medido pela distância total viajada no teste de campo aberto. As barras representam uma média ± s.e.m.

[0081] As figuras 39A-N ilustram que o silenciamento de miR-135 no RN de ratos adultos causou um aumento do comportamento do tipo ansiedade e atenuou a resposta aos antidepressivos. (figura 39A) Ilustração esquemática de estrutura de “captura de miR-135”; (figura 39B) ilustração esquemática de vetores virais de miR-135 KD e de controle; (figura 39C) A infecção por lentivírus de miR-135 KD aumentou os níveis de expressão de mRNA de Htr1a e Slc6a4 nas células RN46a que endogenamente expressam esses genes e miR-135; (figura 39D) O mapa da seção cerebral mostrando o local da injeção, adaptado do atlas de cérebro de rato Paxinos e Franklin (Paxinos, 1997) (painel esquerdo) e imunocoloração de GFP em DRD de ratos adultos infectados com lentivírus de miR-135KD; (figura 39E-39H) No teste de transferência de claro-escuro, os ratos miR-135KD gastaram menos tempo (figura 39E), tiveram menos visitas (figura 39F) e viajaram uma distância menor (figuras 39G e 39H) no compartimento claro, comparado ao rato de controle injetado com KD. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05; (figuras 39I a 39L) no teste de labirinto em cruz elevado, os ratos miR-135KD demonstraram tendência a gastar menos tempo (figura 39I), tiveram menos visitas (figura 39J) e viajaram uma distância significativamente menor (figuras 39K e 39L) nos braços abertos. As barras representam uma média ± de s.e.m. # P<0,1, *P<0,05; (figura 39M) No teste de nado forçado, os ratos miR-135KD não diferiram em seu tempo de imobilidade a partir do rato de controle quando testado em condições ‘basais’, entretanto, quando testados 30 minutos após administração de SSRI, os ratos miR-135KD demonstraram aumento do tempo de imobilidade, indicando resposta atenuada aos antidepressivos. As barras representam uma média ± de s.e.m. *p<0,05; ***p<0,001; (figura 39N) não foram observadas diferenças significativas na atividade de locomoção entre aos ratos miR-135KD e de controle, conforme medido pela distância total viajada no teste de campo aberto. As barras representam uma média ± de s.e.m.

[0082] As figuras 40A-O ilustram que a superexpressão de miR-135 nos neurônios 5HT altera os níveis de 5HT através do cérebro e bloqueia o fracasso social induzido pela redução de 5HT. (figuras 40A, 40D, 40G, 40J, 40M) Ilustração esquemática de locais de microdissecação de cérebros de ratos miR-135OE 5HT e de controle em condições basais ou após fracasso social crônico. PrL - córtex pré-límbico, BLA - amigdala basolateral, CA1V - hipocampo CA1 ventral, DRV - núcleo dorsal da rafe, parte ventral, MnR - núcleo mediano da rafe. O mapa da seção adotado de (Paxinos, 1997); (figuras 40B, 40E, 40H, 40K, 40N) os níveis de 5HT conforme medido por HPLC em diferentes locais do cérebro revelaram aumento dos níveis de 5HT nos ratos miR-135OE comparado aos controles em condições basais de estresse. Adicionalmente, os níveis de 5HT foram regulados de forma descendente nos ratos de controle expostos ao fracasso social comparado às condições basais de estresse, um efeito não observado nos ratos de 5HT miR- 135OE; (figuras 40C, 40F, 40I, 40L, 40O) O metabolismo de 5HT calculado como a razão entre os níveis do metabólito 5HIAA para os níveis de 5HT foi regulada para cima nos ratos de 5HT miR-135OE comparado aos controles em condições basais de estresse. Além disso, o metabolismo de 5HT foi reduzido no BLA, CA1V, DRV e MnR em 5HT miR-135OE expostos ao fracasso social crônico comparado aos ratos de controle do mesmo genótipo. No metabolismo de PrL, DRV e MnR, 5HT foi regulado de forma ascendente nos ratos de controle expostos ao fracasso social comparado às condições basais. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, **P<0.01, ***P<0,001.

[0083] As figuras 41A-E ilustram os níveis inferiores de miR-135 no sangue de pacientes humanos deprimidos; (figura 41A) os níveis de miR-135a no sangue total de pacientes humanos deprimidos são fortemente reduzidos comparado àqueles de controles saudáveis; (figura 41B) os níveis de miR-16 no sangue não diferem significativamente entre os grupos. As barras representam uma média ± de s.e.m. ***P<0,001; (figura 41C) os pacientes deprimidos tratados por 3 meses com terapia comportamental cognitiva (CBT | cognitive behavioral therapy) mostraram um aumento significativo nos níveis de miR-135a no sague total; (figura 41D) os níveis de miR-16 foram similares em todos os grupos de pacientes. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05; (figura 41E) A representação esquemática de um modelo sugerido descrevendo o envolvimento de miR-135 na regulação dos componentes de sinapse serotonérgica em condição normal (painel superior), depressão (painel médio) e administração de antidepressivo (painel inferior).

[0084] As figuras 42A-L ilustram os níveis de 5HT nas estruturas de RN de ratos miR-135OE em condições ‘basais’ e após condições crônicas de estresse. (figuras 42A, 42D, 42G, 42J) A ilustração esquemática de locais de microdissecação de RN dos cérebros de ratos de 5HT miR-135OE e de controle em condições basais ou após fracasso social crônico DRD - núcleo dorsal da rafe, parte dorsal, DRI - núcleo dorsal da rafe, parte interfascicular, DRVL - núcleo dorsal da rafe, parte ventrolateral, VLPAG - cinzenta periaquedutal ventrolateral; DRC - núcleo dorsal da rafe, parte caudal. Mapa da seção adotado de (Paxinos G., 1997); (figuras 42B, 42E, 42H, 42K) os níveis de 5HT em todas as áreas cerebrais ilustradas apesar do DRVL foram reduzidos nos ratos miR-135OE-5HT comparado aos controles em condições basais de estresse. Adicionalmente, os níveis de 5HT foram reduzidos nos ratos de controle expostos ao fracasso social comparado às condições basais, um efeito que falta nos ratos miR-135OE 5HT; (figuras 42C, 42F, 42I, 42L) O metabolismo de 5HT calculado como a razão entre os níveis do metabólito 5HIAA para os níveis de 5HT, foi aumentado nos ratos miR-135OE 5HT comparado aos controles em condições basais de estresse. Além disso, o metabolismo de 5HT foi reduzido em todas as áreas descritas em ratos miR- 135OE 5HT expostos ao fracasso social crônico comparado aos ratos do mesmo genótipo testados em condições basais. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001.

[0085] As figuras 43A-L ilustram os níveis de 5HT nas estruturas cerebrais dos ratos miR-135OE em condições ‘basais’ e após condições crônicas de estresse. (Figuras 43A, 43D, 43G, 43J) A ilustração esquemática dos locais de microdissecação dos cérebros de rato miR-135OE 5HT e de controle em condições basais ou após fracasso social crônico. IL - córtex infralímbico, BNST - núcleo da estria terminal, CeA - amigdala central, S - subículo. Mapa da seção adotada de (Paxinos G., 1997); (figuras 43B, 43E, 43H, 43K) os níveis em todas as áreas cerebrais ilustradas foram reduzidos nos ratos miR-135OE-5HT comparado aos controles em condições basais de estresse. Adicionalmente, os níveis de 5HT foram reduzidos em ratos de controle expostos ao fracasso social comparado às condições basais, um efeito que falta nos ratos miR-135OE 5HT; (figuras 43C, 43F, 43I, 43L) O metabolismo 5HT calculado como a razão entre os níveis do metabólito 5HIAA para os níveis de 5HT foi aumentada nos ratos miR-135OE 5HT comparado aos controles em condições basais de estresse. Além disso, o metabolismo 5HT foi reduzido em todas as áreas descritas em miR-135OE 5HT exposto ao fracasso social crônico comparado aos ratos do mesmo genótipo testados em condições basais. As barras representam uma média ± de s.e.m. *P<0,05, **P<0.01, ***P<0,001.

[0086] A figura 44 ilustra modificações para oligonucleotídeos de miR-135. 5’Ph ilustra uma fosfilação 5’ enquanto sublinhado negrito ilustra uma 2’ O-metilação.

DESCRIÇÃO DE APLICAÇÕES ESPECÍFICAS

[0087] O presente pedido de patente de invenção, em algumas de suas aplicações, se relaciona com microRNAs e, mais especialmente, mas não exclusivamente, com a utilização dos mesmos para a doença, diagnóstico, acompanhamento e tratamento.

[0088] Os princípios e o funcionamento do presente pedido de patente de invenção podem ser melhor compreendidos tendo como referência os desenhos e descrições que o acompanha.

[0089] Antes de explicar pelo menos uma aplicação do presente pedido de patente de invenção em detalhes, deve ser entendido que o presente pedido de patente de invenção não está necessariamente limitado em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificado pelos exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou realizado de várias maneiras. Também, deve ser entendido que a fraseologia e a terminologia empregada neste documento têm o propósito de descrição e não deve ser considerado como limitação.

[0090] A ligação entre a atividade serotoninérgica desregulada e transtornos psiquiátricos como ansiedade e depressão foi estabelecida anteriormente, no entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a essas patologias não são totalmente compreendidos. MicroRNAs (miRs) são um subconjunto de pequenas moléculas de RNA que regulam a expressão do gene pós-transcricionalmente e são abundantes no cérebro.

[0091] Reduzindo-se o presente pedido de patente de invenção à prática, os presentes inventores revelaram que microRNAs específicos (miRs) estão envolvidos na regulação de genes relacionados à serotonina (5HT) neuróglia e, portanto, estão envolvidos na modulação de condições médicas associadas aos níveis de serotonina aberrante, tais como distúrbios psiquiátricos.

[0092] Conforme ilustrado mais abaixo e na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores determinaram o padrão de expressão miRs nos neurônios 5HT, obtidos a partir do núcleo de rafe (RN) de ratos de repórter 5HT (ePET-YFP), utilizando micro matriz miRs (ver Tabelas 2A-B nos Exemplos e a seção que segue). O perfil único de expressão miRs dos neurônios serotonérgicos, obtidos a partir da matriz, foi analisado bioinformaticamente para identificar miRs que presumidamente visavam genes chaves serotonérgicos relacionados, tais como transportador de serotonina (Slc6a4, figura 1D), auto receptor de serotonina (Htr1a, figura 1E), triptofano hidroxilase 2 (Tph2, figura 1F) e monoamina hidroxilase (MaoA, figura 1G). O direcionamento do miRNA dos 3’UTRs para estes genes foram testadoss, ainda, in vitro, ilustrando miRs específicos (p.ex., miR-135) que especificamente direciona e regula os genes neuronais 5HT (ver figuras 1H-I e figuras 2C-D). Os presentes inventores ilustraram, ainda, que os níveis de expressão miR-135 são alterados no RN após estresse agudo (figuras 3A-D) e após o tratamento com antidepressivos (figuras 3E-F). A superexpressão in vivo do miR-135 no RN de ratos adultos reduziu o comportamento semelhante a depressão após fracasso social (figuras 4A-H). Além disso, os presentes inventores ilustraram a atividade do miR-182 como um regulador da atividade neuronal (via repressão direta de Htr1a, figura 8) e do comportamento psicopatológico (figura 9) e do miR-15 como regulador da resposta ao estresse [via repressão direta de CRH1R (figuras 7A-B), proteína de ligação 5 FK506 (FKBP5) (figuras 21A-B) e Stx1a, Sgk1 e Adrb2 (figura 22)]. Os presentes inventores também ilustraram o direcionamento específico dos receptores beta-adrenérgicos (Adrb1) e do receptor canabinoide 1 (CB1) por miR-19. A superexpressão miR-19 reprimiu o Adrb1 (figuras 6A-C) enquanto o silenciamento de miR-19 reforçou a expressão do Adrb1 (figuras 6D-E). A superexpressão miR-19 também reprimiu o CB1 (figura 14). Os presentes inventores também têm direcionamentos descobertos para o miR- 181. Especificamente, os presentes inventores ilustraram que o miR-181 regula exclusivamente os receptores de glutamato (figuras 24 e 25). Tomados em conjunto, estes resultados fundamentaram o uso de miRNAs ou sequências que regulam os mesmos, tais como miR-135, miR-335, miR-181, miR-182, miR-26, miR-27, miR-15 e miR-19, como modalidades terapêuticas.

[0093] Ao reduzir, ainda, o presente pedido de patente de invenção à prática, o presente inventor descobriu que o miR135 pode ser utilizado como um potente agente terapêutico para tratamento de transtorno bipolar, que afeta cerca de 4% das pessoas.

[0094] Ao reduzir, ainda, o presente pedido de patente de invenção à prática, os presentes inventores descobriram que o miR-135 é significativamente regulado de forma descendente no sangue de pacientes humanos deprimidos (conforme comparado aos controles saudáveis) e é regulado de forma ascendente após melhora da pontuação psiquiátrica dos pacientes. De fato, foi descoberto que o miR-135 é um elemento regulatório essencial responsável por manter o tom serotonérgico intacto em condições normais, e essencial para a resposta cerebral aos antidepressivos (veja modelo esquemático na figura 41E).

[0095] Foi descoberto que os níveis aumentados de miR-135 reprimem ambos os níveis de Slc6a4 e Htr1a pré-sináptico, causando um aumento em 5HT na fenda sináptica, que é associada com diminuições nos sintomas depressivos. Outra análise de bioinformática conduzida pelos presentes inventores, previu novos alvos para miR135 que estão associados com transtornos neuropsiquiátricos incluindo transtorno bipolar afetivo ou ação de lítio. Esses alvos podem, assim, ser utilizados como alvos para intervenção terapêutica em transtornos neuropsiquiátricos.

[0096] O presente ensaio fornece, ainda, um teste não invasivo para ambos os pacientes de triagem para condições psiquiátricas e tratamento de monitoramento. Juntos, esses resultados colocam miR-135 como um instrumento central para o diagnóstico e gerenciamento de condições psiquiátricas como transtornos de humor nos quais o monitoramento contínuo de equilíbrio psicológico de pacientes é crítico.

[0097] Assim, de acordo com um aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica em um indivíduo em necessidade da mesma, o método compreende administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando, pelo menos, um microRNA ou um precursor respectivo.

[0098] De acordo com uma aplicação específica, para tratamento de uma condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica, o microRNA compreende miR-135, miR-335, miR-26 e miR-182.

[0099] De acordo com um aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de um transtorno bipolar em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR- 135, um precursor respectivo ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o miR-135 ou o precursor respectivo, tratando, assim, o transtorno bipolar.

[00100] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade das mesmas, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando um microRNA ou um precursor respectivo.

[00101] De acordo com uma aplicação específica, para tratamento de uma condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-19.

[00102] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH | corticotropin-releasing hormone) é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade dos mesmos, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando uma microRNA ou um precursor respectivo.

[00103] De acordo com uma aplicação específica, para tratamento de uma condição médica na qual o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-15.

[00104] De acordo com outro aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual um nível de receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando um microRNA ou um precursor respectivo.

[00105] De acordo com uma aplicação específica, para tratamento de um condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico, o microRNA compreende miR-181.

[00106] O termo “tratamento” refere-se à inibição ou contenção do desenvolvimento de uma doença, distúrbio ou condição e/ou causando a redução, remissão ou regressão da doença, distúrbio ou condição ou impedindo uma doença, distúrbio ou condição médica de ocorrer em um indivíduo que pode estar em risco da doença, distúrbio ou condição, mas ainda não foi diagnosticado como tendo o a doença, distúrbio ou condição. Os especialistas na técnica vão entender que várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar o desenvolvimento de doença, distúrbio ou condição, e da mesma forma, várias metodologias e ensaios podem ser utilizados para avaliar a redução, a remissão ou a regressão de uma doença, distúrbio ou condição.

[00107] Conforme utilizado neste documento, o termo “indivíduo” ou “indivíduo em necessidade respectiva” inclui mamíferos, tais como seres humanos de ambos os sexos, em qualquer idade que sofram de patologia ou que correm o risco de desenvolver a patologia.

[00108] Conforme utilizado neste documento, a frase “condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica” refere-se a uma doença ou distúrbio em que aumentar o nível de serotonina pode prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante). Conforme utilizado neste documento, o termo “serotonina” refere-se ao neurotransmissor monoamina [também conhecido como 5-hidroxitriptamina (5-HT)]. A serotonina está prevista, por exemplo, nos números CAS 50-67-9.

[00109] De acordo com uma aplicação, é fornecido um método aumentar um nível de serotonina em uma fenda sináptica, o método compreendendo administrar ou expressar em uma célula neuróglia, p.ex., neurônio serotonérgico do indivíduo um polinucleotídeo exógeno, codificando pelo menos um microRNA ou um precursor respectivo.

[00110] Conforme utilizado neste documento, o termo “fenda sináptica” refere-se à área entre dois neurônios por onde passam sinais elétricos ou químicos.

[00111] Uma “célula neuróglia” refere-se a um neurônio ou uma célula glial (p.ex., oligodendrócitos ou astrócitos).

[00112] Conforme utilizado neste documento, o termo “neurônio serotonérgico” refere-se a um neurônio que segrega a serotonina ou é capaz de recaptação de serotonina (i.e, pelos transportadores de serotonina expressados em suas superfícies da célula).

[00113] A condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica pode incluir, por exemplo, qualquer transtorno de humor, incluindo depressão, depressão profunda, ansiedade, estresse, fadiga, perturbações da função cognitiva, ataques de pânico, comportamento compulsivo, vício, fobia social, esquizofrenia, transtorno do sono, transtorno relacionado aos alimentos (p.ex., transtorno alimentar), distúrbio de crescimento e reprodução.

[00114] De acordo com uma aplicação específica, a condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica compreende a depressão.

[00115] De acordo com uma aplicação específica, a condição médica na qual uma elevação do nível de serotonina é terapeuticamente benéfica compreende um transtorno bipolar.

[00116] Conforme utilizado neste documento, o termo “transtorno bipolar”, também conhecido como transtorno bipolar afetivo, transtorno maníaco-depressivo ou depressão maníaca, refere-se à doença mental classificada como transtorno de humor. Tipicamente, indivíduos com transtorno bipolar experimentam um ou mais episódios de um estado elevado de forma anormal, clinicamente referido como mania. Mania pode ocorrer com diferentes níveis de gravidade. Em níveis mais leves de mania, ou “hipomania”, indivíduos podem parecer enérgicos, emotivos e podem ser altamente produtivos. Conforme a mania se torna mais grave, os indivíduos começam a se comportar de forma irregular e impulsiva, frequentemente tomando decisões ruins devido a ideias não realistas sobre o futuro e podem ter grande dificuldade com o sono. No nível mais grave, os indivíduos podem experimentar psicose. Os episódios maníacos tipicamente alternam com episódios ou sintomas de depressão, ou episódios misturados que apresentam características de mania e depressão. Tais episódios são normalmente separados por períodos de estado normal. Os episódios maníacos e depressivos podem durar de alguns dias a vários meses, mas em alguns pacientes, depressão e mania podem alternar rapidamente, denominado como ciclagem rápida.

[00117] Transtorno bipolar, de acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, engloba qualquer tipo de transtorno bipolar e qualquer forma e/ou subforma de transtorno bipolar, incluindo, mas não se limitando a, mania, mania aguda, mania grave, hipomania, depressão, depressão moderada, distimia, depressão grave, episódios de mania e/ou depressão, psicose/sintomas psicóticos (p.ex., alucinações, delírios), estado bipolar misto, transtorno bipolar I, transtorno bipolar II, transtorno bipolar de ciclagem rápida, Ciclotimia e/ou Transtorno Bipolar Sem Outra Especificação (BD-NOS).

[00118] De acordo com uma aplicação, tratar um transtorno bipolar pode ser efetuado pela administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR-135, um precursor respectivo ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o miR-135 ou o precursor respectivo.

[00119] De acordo com uma aplicação, tratar um transtorno bipolar pode ser efetuado, ainda, pela administração ao indivíduo de um medicamento para tratamento de um transtorno bipolar.

[00120] Medicamentos exemplares para tratamento de um transtorno bipolar que pode ser utilizado de acordo com os presentes ensinamentos incluem, mas não se limitam a, lítio, medicamentos antipsicóticos e medicamentos estabilizadores de humor, conforme descrito com mais detalhes abaixo.

[00121] De acordo com uma aplicação, é fornecido um uso de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um miR-135, um precursor respectivo ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o miR-135 ou o precursor respectivo para a fabricação de um medicamento identificado para tratar um transtorno bipolar em um indivíduo em necessidade respectiva.

[00122] Assim, de acordo com uma aplicação, quando a condição médica é um transtorno de humor, por exemplo, transtorno bipolar, depressão ou ansiedade, o microRNA é miR-135.

[00123] Será apreciado que o transtorno de humor, por exemplo, transtorno bipolar, depressão ou ansiedade, pode não estar necessariamente relacionado à serotonina.

[00124] De acordo com uma aplicação, é fornecido um método de tratamento de uma condição médica na qual uma elevação no nível de serotonina é terapeuticamente benéfica em um indivíduo em necessidade respectiva, o método compreendendo administrar ao indivíduo um agente capaz de regular de forma descendente uma atividade ou empressão de um miR-135 alvo selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+ 2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4).

[00125] De acordo com uma aplicação específica, o agente não é miR- 135.

[00126] Agentes que podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos (p.ex., capazes de regular de forma descendente uma atividade ou expressão de um gene alvo de miR-135) são descritos em detalhes abaixo.

[00127] Conforme utilizado neste documento, a frase “condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfico” refere-se a uma doença ou transtorno no qual diminuindo a expressão ou atividade de adrenalina ou noradrenalina pode-se prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante).

[00128] Conforme utilizado neste documento, o termo “adrenalina” refere-se ao hormônio e ao neurotransmissor (também conhecido como epinefrina). A adrenalina está prevista, por exemplo, no número CAS 51-434.

[00129] Conforme utilizado neste documento, o termo “noradrenalina” refere-se a catecolamina, agindo como um hormônio e neurotransmissor (também conhecido como norepinefrina). A noradrenalina é prevista, p.ex., em números CAS (l) 51-41-2 (l) e 138-65-8(dl).

[00130] A condição médica na qual um baixo nível de adrenalina ou noradrenalina é terapeuticamente benéfica pode incluir, por exemplo, transtornos de estresse, ansiedade, deficiência de memória, doenças do coração (p.ex., palpitações, taquicardia e arritmia), dores de cabeça, tremores, hipertensão e edema pulmonar agudo.

[00131] Conforme utilizado neste documento a frase “condição médica em que o nível do hormônio de baixa liberação de corticotropina (CRH) é terapeuticamente benéfico” refere-se a uma doença ou transtorno no qual se diminuindo a expressão ou atividade de CRH pode se prevenir a ocorrência de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados (como mais detalhado adiante).

[00132] Conforme utilizado neste documento, o termo “hormônio liberador de corticotropina (CRH)” refere-se ao hormônio polipeptídeo e neurotransmissor (também conhecido como fator liberador de corticotropina (CRF | corticotropin-releasing factor) ou corticoliberina). O CRH está previsto, p.ex. no NP_000747.1.

[00133] A condição médica na qual um baixo nível de CRH é terapeuticamente benéfico pode incluir, por exemplo, estresse, depressão, ansiedade, fadiga, função cognitiva prejudicada, ataques de pânico, comportamento compulsivo, vício, fobia social, transtorno do sono, alimentares, transtorno de crescimento, transtorno de reprodução e obesidade.

[00134] Conforme utilizado neste documento, a frase “condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico” refere-se a uma doença ou distúrbio no qual se diminuindo a expressão ou a atividade de um glutamato receptor pode se prevenir o aparecimento de uma doença ou sintomas médicos associados, ou deter a progressão da doença ou sintomas médicos associados com os mesmos (como mais detalhado adiante).

[00135] Conforme utilizado neste documento, o termo “receptor de glutamato” refere-se a um receptor sináptico normalmente localizado sobre as membranas das células neuronais (p.ex., Grm1, Grik3, Grm5, Gria2, Grik2 e Grm7). O receptor de glutamato está previsto, p.ex., no NP_000822.2 [receptor de glutamato ionotrópico, cainato 3 (Grik3 | glutamate receptor ionotropic kainate 3)]; NP_000817.2, NP_001077088.1, NP_001077089.1 [receptor de glutamato ionotrópico AMPA 2(Gria2)]; NP_001159719.1, NP_068775.1, NP_786944.1 [receptor de glutamato ionotrópico, cainato 2 (Grik2)]; NP_000833.1, NP_001137303.1 [receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5 | glutamate receptor metabotropic)]; NP_000835.1, NP_870989.1 [receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7)]; NP_000829.2, NP_001107801.1 [receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grm1)].

[00136] A condição médica em que um nível do receptor de baixo glutamato é terapeuticamente benéfico pode compreender, por exemplo, convulsões (p.ex., epilepsia), doença de Huntigton’s, esquizofrenia, síndrome do X frágil, transtorno de ansiedade generalizada e câncer (p.ex., melanoma).

[00137] Conforme utilizado neste documento, o termo “microRNA ou um precursor respectivo” refere-se a moléculas microRNA (miRNA) atuando como reguladores póstranscricionais. Os microRNAs são normalmente processados dos pré-miR (precursores pré-microRNA). Pré-miRs são um conjunto de moléculas de miRNA de precursores transcritos pelo RNA polimerase III que eficientemente transformado em miRNAs funcionais, p.ex., sobre transfecção em células cultivadas. Um pre-miR pode ser utilizado para eliciar a atividade específica do miRNA em tipos de células que normalmente não expressam esse miRNA, abordando assim a função de seu direcionamento diminuindo sua expressão em um experimento de “ganho de função (miRNA)”. O projeto Pre-miR existe para todos os miRNAs conhecidos, listados nos Registros do miRNA e podem ser facilmente projetados para qualquer pesquisa. Os microRNAs podem ser administrados à célula por se ou codificado a partir de uma molécula precursora ligada em uma estrutura de ácido nucleico, como descrito mais adiante. De acordo com uma aplicação, esse termo engloba qualquer tipo de micoRNA incluindo 5 prime (isto é, miR) ou 3 prime (isto é, miR*) e seus precursores.

[00138] Conforme utilizado neste documento, o termo “miR-135 ou um precursor respectivo” significa englobar qualquer tipo de miR-135 incluindo miR-135a e miR-135b 5 prime (isto é, miR-135) ou 3 prime (isto é, miR-135*) e seus precursores. Precursor miR-135 exemplar inclui, mas não se limita a, miR-135a-1 conforme estabelecido no Acesso N° MI0000452, ENTREZGENE 406925 e ID SEQ. N° 58; miR-135a-2 conforme estabelecido no Acesso N° MI0000453, ENTREZGENE: 406926 e ID SEQ. N° 59; e miR- 135b conforme estabelecido no Acesso N MI0000810, ENTREZGENE: 442891 e ID SEQ. N° 60. miR-135 maduro exemplar inclui, mas não se limita a, miR-135a conforme estabelecido no Acesso N° MIMAT0000428 (ID SEQ. N° 61) e miR-135b conforme estabelecido no Acesso N° MIMAT0000758 (ID SEQ. N° 62). miR-135* maduro exemplar inclui, ma snão se limita a, miR- 135a* conforme estabelecido no Acesso N° MIMAT0004595 (ID SEQ. N° 192) e miR-135b* conforme estabelecido no Acesso N° MIMAT0004698 (ID SEQ. N° 193).

[00139] Deve-se observar que os microRNAs dos ensinamentos presentes possam ligar, anexar, regular, processar, interferir, aumentar, estabilizar e/ou desestabilizar qualquer microRNA alvo. Esse alvo pode ser qualquer molécula, incluindo, mas não se limitando a, as moléculas de DNA, moléculas de RNA e polipeptídeos, tais como, mas não limitado a, genes relacionados a serotonina, tais como o transportador de serotonina (i.e. SERT ou Slc6a4), o gene do receptor inibitório 1A de serotonina (Htr1a), triptofano hidroxilase 2 (Tph2) e monoamina hidroxilase (MaoA); receptores de adrenalina ou noradrenalina (receptores adrenérgicos tais como Adr1); Adenilato ciclase tipo 1 (ADCY1); receptores CRH como Crh1R; ou qualquer outras moléculas, p.ex., proteína de ligação FK506 5 (FKBP5), receptor canabinoide 1 (CB1), Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down (Dscam), proteína X associada à translina (Tsnax) e molécula de adesão celular L1 (L1cam), bem como outros alvos associados com transtornos neuropsiquiátricos relacionados ao estresse (p.ex, transtorno bipolar) incluindo aqueles listados na Tabela 1, abaixo. Tabela 1: ALVOS PUTATIVOS DE miR-135 ASSOCIADO COM TRANSTORNOS NEUROPSIQUIÁTRICOS RELACIONADOS AO ESTRESSE

[00140] Deve-se observar que os microRNAs do presente pedido de patente de invenção podem ser identificados através de vários bancos de dados, incluindo, por exemplo, o registro de microRNA (www(ponto)sanger(ponto)ac(ponto)uk/Software/Rfam/mirna/ind ex(ponto)shtml).

[00141] Os métodos do presente pedido de patente de invenção podem ser efetuados ao se administrar ao indivíduo um microRNA (p.ex., miR-135) ou um causador respectivo ou expressar em uma célula do indivíduo uma molécula de ácido nucleico exógena (p.ex., polinucleotídeo) codificando o microRNA. (p.ex., miR-135) ou o precursor respectivo. O termo “polinucleotídicas” refere-se a um oligômero de cadeia única ou cadeia dupla ou polímero de ácido ribonucleico (RNA), Ácido desoxirribonucleico (DNA) ou miméticos respectivos. Este termo inclui polinucleotídeos e/ou oligonucleotídeos derivados de moléculas de ácidos nucleicos de ocorrências naturais (p.ex., o RNA ou DNA), polinucleotídicos sintéticos e/ou moléculas do oligonucleotídeos, compostas de bases naturais, açúcares e ligações internucleosídeas covalentes (p.ex., estrutura), bem como de polinucleotídeos sintéticos e/ou oligonucleotídeos tendo porções não-naturais, que funcionam da mesma forma às respectivas partes que ocorre naturalmente. Os referidos oligonucleotídeos modificados ou substituídos podem ser preferidos em vez das formas nativas por causa de propriedades desejáveis, tais como, por exemplo, absorção celular melhorada, afinidade melhorada para alvo de ácido nucleico e estabilidade aumentada na presença de nucleases.

[00142] O comprimento do polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é opcionalmente de 100 nucleotídeos ou menos, opcionalmente de 90 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 80 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 70 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 60 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 50 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 40 nucleotídeos ou menos, opcionalmente 30 nucleotídeos ou menos, p.ex., 29 nucleotídeos, 28 nucleotídeos, 27 nucleotídeos, 26 nucleotídeos, 25 nucleotídeos, 24 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 22 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 17 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, opcionalmente, entre 12 e 24 nucleotídeos, opcionalmente entre 5-15, opcionalmente, entre 5-25, mais de preferência, aproximadamente 20-25 nucleotídeos.

[00143] Os polinucleotídeos (incluindo oligonucleotídeos) projetados de acordo com os ensinamentos do presente pedido de patente de invenção podem ser gerados de acordo com qualquer método de síntese de oligonucleotídeos conhecido na técnica, incluindo tanto sínteses enzimáticas quanto sínteses e fase sólida. Equipamentos e reagentes para execução da síntese de fase sólida estão comercialmente disponíveis a partir, por exemplo, da Applied Biosystems. Quaisquer outros meios para tal síntese também podem ser empregados; a síntese real dos oligonucleotídeos encontra-se dentro das capacidades de um especialista na técnica e pode ser realizada através de metodologias estabelecidas conforme detalhado em, por exemplo: Sambrook, J. and Russell, D. W. (2001), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”; Ausubel, R. M. et al., eds. (1994, 1989), “Current Protocols in Molecular Biology,” Volumes I-III, John Wiley & Sons, Baltimore, Maryland; Perbal, B. (1988), “A Practical Guide to Molecular Cloning,” John Wiley & Sons, New York; e Gait, M. J., ed. (1984), “Oligonucleotide Synthesis”; utilizando química de fase sólida, p.ex., fosforamidita cianoetil, seguida de desproteção, dessalinização e purificação por, por exemplo, um método automatizado de tritil-on ou HPLC.

[00144] Será apreciado que um polinucleotídeo, compreendendo uma molécula de RNA pode ser produzido biologicamente usando um vetor de expressão como é descrita, ainda, a seguir. Alternativamente, um polinucleotídeo compreendendo uma molécula de RNA pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos diversamente modificados, conforme descrito abaixo.

[00145] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é um polinucleotídeo modificado. Polinucleotídeos podem ser modificados usando vários métodos conhecidos na técnica.

[00146] Assim, os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem ser sintetizados para incluir uma modificação que transmite uma característica desejada. Por exemplo, a modificação pode melhorar a estabilidade, termodinâmica de hibridização com um ácido nucleico alvo, direcionando a um tecido particular ou tipo de célula, ou permeabilidade de célula, por exemplo, por um mecanismo independente ou dependente de endocitose. As modificações também podem aumentar a especificidade da sequência, e consequentemente diminuir o direcionamento fora do local. As modificações químicas são descritas com mais detalhes abaixo.

[00147] De acordo com uma aplicação, os polinucleotídeos compreendem uma modificação única. De acordo com outra aplicação, os polinucleotídeos compreendem duas, três, quatro, cinco ou mais modificações.

[00148] Por exemplo, os oligonucleotídeos ou polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem compreender nucleosídeos heterocílicos, consistindo de bases de pirimidinas e purinas, ligadas em uma ligação fosfodiéster de 3’ a 5’.

[00149] Oligonucleotídeos ou polinucleotídeos preferencialmente utilizados são aquele modificados quer na coluna vertebral (p.ex., coluna vertebral de açúcar-fosfato), ligações internucleosídeas ou bases, conforme amplamente descrito neste documento.

[00150] Exemplos específicos de oligonucleotídeos preferenciais ou polinucleotídeos úteis, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, incluem oligonucleotídeos ou polinucleotídeos contendo uma estrutura modificada ou ligações não naturais internucleosídeas. Oligonucleotídeos ou polinucleotídeos tendo uma estrutura modificada incluem aqueles que mantêm um átomo de fósforo na estrutura, conforme divulgado nas Patentes Norte-Americanas N°: 4.469.863; 4.476.301; 5.023.243; 5.177.196; 5.188.897; 5.264.423; 5.276.019; 5.278.302; 5.286.717; 5.321.131; 5.399.676; 5.405.939; 5.453.496; 5.455.233; 5.466.677; 5.476.925; 5.519.126; 5.536.821; 5.541.306; 5.550.111; 5.563.253; 5.571.799; 5.587.361; 5.625.050 e 8.017.763, bem como no Pedido de Patente Norte-Americana N° 20100222413, incorporado aqui poe referência.

[00151] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo compreende uma ligação internucleotídica modificada por fósforo na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo.

[00152] Estruturas preferencialmente modificadas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos incluem, por exemplo: fosforotioatos; fosforotioatos quirais; fosforoditioatos; fosfotriesteres; fosfotriesteres aminoalkila; metila e outros fosfonatos alquila, incluindo fosfonatos alquilenos-3’ e fosfonatos quirais; Fosfinatos; fosforamidatos, incluindo fosforamidatos amino-3’ e aminoalquilfosforamidatos; tionofosforamidatos; tionoalquilfosfonatos; tionoalquilfosfotriésteres; e boranofosfatos tendo ligações normais de 3-5’, análogos dos mesmos ligados de 2’-5’, e aqueles tendo polaridade invertida, onde os pares adjacentes de unidades de nucleosídeos são ligados de 3’-5’ a 5’-3’ ou 2’-5’ a 5’-2’ e fosponato de boro. Vários sais, sais mistos e formas de ácido livre das modificações acima também podem ser utilizados.

[00153] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende um fósforotioato na ligação internucleotídica na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo.

[00154] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende um boranofosfato na ligação internucleotídica na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo.

[00155] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende um fosfonato de metila na ligação internucleotídica na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo.

[00156] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende um fosfodiéster na ligação internucleotídica na extremidade 5’ ou 3’ da sequência de nucleotídeo.

[00157] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo compreende uma modificação de açúcar (p.ex., modificação de ribose).

[00158] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo compreende uma modificação correspondendo à posição 2 da ribose.

[00159] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende, pelo menos, um nucleotídeo 2’-modificado, p.ex., um 2’-desóxi, 2’-flúor, 2’-desoxi-2’-flúor, 2’-O-metila, 2’-O-metoxietila (2’-O-MOE), 2’-O- aminopropila (2’-O-AP), 2’-O-dimetilaminoetila (2’-O-DMAOE), 2’-O- dimetilaminopropila (2’-O-DMAP), 2’-O-dimeilaminoetiloxietila (2’-O- DMAEOE), 2’-Fluoroarabino-oligonucleotídeos (FANA), ou 2’-O--N- metilacetamido (2’-O-NMA).

[00160] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende, pelo menos, um nucleotídeo 2’-O-metil-modificado e, em algumas aplicações, todos os nucleotídeos do polinucleotídeo modificado inclui uma modificação de 2’-O-metila.

[00161] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende uma ligação internucleotídica modificado e uma modificação de estrutura principal de açúcar.

[00162] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado compreende uma ligação internucleotídica modificado por fósforo e uma modificação de estrutura principal de açúcar (p.ex., nucleotídeo 2’- modificado).

[00163] Polinucleotídeos de miR-135 modificados exemplares incluem, mas não se limitam às ID SEQ. N° 194209.

[00164] Alternativamente, estruturas de oligonucleotídeos ou polinucleotídeos modificadas que não incluem um átomo de fósforo em si têm estruturas formadas por ligações de internucleosídeos de alquila ou cicloalquila de cadeia curta, heteroátomo misto e ligações de internucleosídeos de alquila ou cicloalquila, ou uma ou mais ligações de internucleosídeos heteroatômicos de cadeia curta ou heterocíclicas. Estes incluem aqueles que têm vínculos morfolinos (formados em parte a partir da porção de açúcar de uma nucleosídeo); estruturas de siloxano; sulfeto, sulfóxido e estruturas de sulfona; estruturas de formacetil e tioformacetil; estruturas de formacetil e tioformacetil de metileno; estruturas contendo alceno; estruturas de sulfamato; estruturas de metileno-imino e metileno- hidrazina; estruturas de sulfonato e sulfonamida; estruturas de amida; e outros tendo partes misturadas de componentes de N, O, S e CH2, conforme divulgado nas Patentes Norte-Americanas N°: 5.034.506; 5.166.315; 5.185.444; 5.214.134; 5.216.141; 5.235.033; 5.264.562; 5.264.564; 5.405.938; 5.434.257; 5.466.677; 5.470.967; 5.489.677; 5.541.307; 5.561.225; 5.596.086; 5.602.240; 5.610.289; 5.602.240; 5.608.046; 5.610.289; 5.618.704; 5.623.070; 5.663.312; 5.633.360; 5.677.437; e 5.677.439.

[00165] Outros oligonucleotídeos ou polinucleotídeos que podem ser utilizados, de acordo com o presente pedido de patente de invenção, são aqueles modificados tanto em açúcar quanto na ligação internucleosídea, i.e., a estrutura das unidades de nucleotídeo é substituída com grupos novos. As unidades base são mantidas para complementação com o polinucleotídeo alvo apropriado. Um exemplo de um oligonucleotídeo mimético inclui um peptídeo de ácidos nucleicos (PNA | peptide nucleic acid). Um oligonucleotídeo PNA refere-se a um oligonucleotídeo onde a estrutura do açúcar é substituída pela estrutura de amida, contendo, em especial, uma estrutura aminoetilglicina. As bases são mantidas e são vinculadas, direta ou indiretamente, a átomos de nitrogênio-aza da parte da estrutura de amida. Patentes Norte-Americanas que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas às Pat. Norte-Americanas N°. 5.539.082; 5.714.331; e 5.719.262; cada uma das quais é aqui incorporada por referência. Outras modificações da estrutura, que podem ser utilizadas no presente pedido de patente de invenção, são divulgadas na Patente Norte-Americana N°. 6.303.374.

[00166] De acordo com uma aplicação, os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem ter uma modificação química em um nucleotídeo em uma região interna (isto é, não terminal) tendo não complementaridade com o ácido nucleico alvo. Por exemplo, um nucleotídeo modificado pode ser incorporado na região de um miRNA que forma uma protuberância. A modificação pode incluir um ligante anexado ao miRNA, por exemplo, por um ligante. A modificação pode, por exemplo, melhorar a farmacocinética ou estabilidade do polinucleotídeo, ou melhorar as propriedades de hibridização (p.ex., termodinâmica de hibridização) do polinucleotídeo para um ácido nucleico alvo.

[00167] Em algumas aplicações, a orientação de uma modificação ou ligante incorporado dentro da ou preso à região de protuberância de um polinucleotídeo é orientada para ocupar o espaço na região de protuberância. Por exemplo, a modificação pode incluir uma base ou açúcar modificado na cadeia de ácido nucleico ou um ligante que funciona como um intercalador. Esses são localizados, de preferência, na protuberância. O intercalador pode ser um composto aromático, por exemplo, um aromático policíclico ou aromático heterocíclico. Um intercalador policíclico pode ter capacidades de empilhamento, e pode incluir sistemas com 2, 3 ou 4 anéis fundidos. Em algumas aplicações, a orientação de uma modificação ou ligante incorporado dentro da ou preso à região de protuberância do polinucleotídeo é orientada para ocupar o espaço na região de protuberância. Essa orientação facilita as propriedades de hibridização melhoradas ou uma característica de outra forma desejada do polinucleotídeo.

[00168] Em uma aplicação, o polinucleotídeo pode incluir um ligante de aminoglicosídeo, que pode fazer com que o polinucleotídeo tenha propriedades melhoradas de hibridização ou especificidade de sequência melhorada. Aminoglicosídeos exemplares incluem polilisina glicosiladas; polilisina galactosilada; neomicina B; tobramicina; canamicina A; e conjugados acridina de aminoglicosídeos, como Neo-N-acridina, Neo-S- acridina, Neo-C-acridina, Tobra-N-acridina, e KanaA-N-acridina. O uso de um análogo de acridina pode aumentar a especificidade da sequência. Por exemplo, neomicina B tem alta afinidade para RNA conforme comparado ao DNA, mas especificidade de sequência baixa. Em algumas aplicações, o análogo de guanidina (o guanidinoglicosídeo) de um ligante de aminoglicosídeo é preso a um agente de polinucleotídeo. Em um guanidinoglicosídeo, o grupo amina no aminoácido é trocado para um grupo guanidina. O anexo de um análogo de guanidina pode melhorar a permeabilidade da célula do polinucleotídeo.

[00169] Um polinucleotídeo pode ser projetado e sintetizado para incluir uma região de não complementaridade (p.ex., uma região que 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos de comprimento) flanqueada por regiões de complementaridade suficiente para formar um duplex (p.ex., regiões que têm 7, 8, 9, 10 ou 11 nucleotídeos de comprimento) com um RNA alvo.

[00170] Para aumento da resistência de nuclease e/ou afinidade de ligação para o alvo, os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem incluir ligações de 2’-O-metila, 2’-flúor, 2’-O-metoxietila, 2’-O-aminopropila, 2’-amino, e/ou fosforotioato. A inclusão de ácidos nucleicos bloqueados (LNA), por exemplo, inclusão de análogos de ácido nucleico, em que o anel de ribose é “bloqueado” por uma ponte de metileno conectando o átomo de 2’-O e o átomo de 4’-C, ácidos nucleicos de etileno (ENA), por exemplo, ácido nucleicos em ponte de 2’-4’-etileno, e certas modificações de nucleobase como 2-amino-A, 2-tio (p.ex., 2-tio-U), modificações de grampo G, também pode aumentar afinidade de ligação ao alvo. A inclusão dos açúcares de piranose na estrutura principal de oligonucleotídeo também pode diminuir a clivagem endonucleolítica.

[00171] Um polinucleotídeo pode ser ainda modificado ao incluir um grupo catiônico 3’, ou ao inverter o nucleosídeo no terminal com uma ligação 3’-3’. Em outra alternativa, o terminal 3’ pode ser bloqueado com um grupo aminoalquila, por exemplo, um dT C5-aminoalquila 3’. Outros conjugados 3’ podem inibir a clivagem exonucleolítica 3’-5’. Embora não estando limitado pela teoria, um conjugado 3’, como naproxeno ou ibuprofeno, pode inibir a clivagem exonucleolítica ao bloquear estericamente a exonuclease da ligação à extremidade 3’ do oligonucleotídeo. Mesmo pequenas cadeias de alquila, grupos arila ou conjugados heterocíclios ou açúcares modificados (D-ribose, desoxirribose, glicose etc.) podem bloquear 3’-5’-exonucleases.

[00172] O terminal 5’ pode ser bloqueado com um grupo aminoalquila, por exemplo, um substituinte 5’-O-alquilamino. Outros conjugados 5’ podem inibir a clivagem exonucleolítica 5’-3’. Embora não estando limitado pela teoria, um conjugado 5’, como naproxeno ou ibuprofeno, pode inibir a clivagem exonucleolítica ao bloquear estericamente a exonuclease da ligação à extremidade 5’ do oligonucleotídeo. Mesmo pequenas cadeias de alquila, grupos arila ou conjugados heterocíclicos ou açúcares modificados (D-ribose, desoxirribose, glicose etc.) podem bloquear as 3’-5’-exonucleases.

[00173] Em uma aplicação, o polinucleotídeo inclui uma modificação que melhora o direcionamento, por exemplo, uma modificação de direcionamento descrito aqui. Exemplos de modificações que direcionam os agentes de oligonucleotídeo de filamento único para tipos de célula particulares incluem açúcares de carboidrato como galactose, N- acetilgalactosamina, manose; vitaminas tais como folatos; outros ligantes como imitadores de RGDs e RGD; e moléculas pequenas incluindo naproxeno, ibuprofeno ou outras moléculas de ligação de proteína conhecidas.

[00174] O polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção pode ser construído usando síntese química e/ou reações de ligação enzimática usando procedimentos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polinucleotídeo pode ser quimicamente sintetizado usando nucleotídeos de ocorrência natural ou nucleotídeos diversamente modificados projetados para aumentar a estabilidade biológica das moléculas ou para aumentar a estabilidade física do duplex formado entre o polinucleotídeo e os ácidos nucleicos alvos, por exemplo, derivados de fosforotioato e nucleotídeos substituídos por acridina podem ser utilizados.

[00175] Oligonucleotídeos ou polinu-cleotídeos do presente pedido de patente de invenção também podem incluir substituições ou modificações de bases. Conforme utilizado neste documento, bases “não modificadas” ou “naturais” incluem as bases purina adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidina timina (T), citosina (C) e uracila (U). Bases “Modificadas” incluem, mas não são limitadas a outras bases sintéticas e naturais, tais como: 5-metilcitosina (5-me-C); 5-hidroximetil citosina; xantina; hipoxantina; 2- aminoadenina; 6-metila e outros derivados alquílicos de adenina e guanina; 2- propil e outros derivados alquílicos de adenina e guanina; 2-tiouracila, 2- tiotimina, e 2-tiocitosina; 5-halouracila e citosina; 5-propinila uracila e citosina; 6-azo uracila, citosina e timina; 5-uracila (pseudouracila); 4- tiouracila; 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquila, 8-hidroxila e outras adeninas 8-substituídas e guaninas; 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometil, e outras uracilas 5-substituídas citosinas; 7-metilguanina e 7-metiladenina; 8- azaguanina e 8-azaadenina; 7-deazaguanina e 7-deazaadenina; e 3- deazaguanina e 3-deazaadenina. Bases modificadas adicionais incluem aquelas divulgadas em: Pat. Norte-Americana N°. 3.687.808; Kroschwitz, J. I., ed. (1990), “The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,” páginas 858-859, John Wiley & Sons; Englisch et al. (1991), “Angewandte Chemie,” International Edition, 30, 613; e Sanghvi, Y. S., “Antisentido Research and Applications,” Cápitulo 15, páginas 289-302, S. T. Crooke e B. Lebleu, eds., CRC Press, 1993. Tais bases modificadas são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos do presente pedido de patente de invenção. Estas incluem 5- pirimidinas substituídas, 6-azapirimidinas, e N-2, N-6, e O-6-purinas substituídas, incluindo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracila, e 5- propinilcitosina. Subistituições de 5-metilcitosina foram mostradas para aumentar a estabilidade frente e verso de ácidos nucleicos por 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S. et al. (1993), “Antisentido Research and Applications,” páginas 276-278, CRC Press, Boca Raton), e são substituições de base atualmente preferidas, especialmente quando combinada com modificações de açúcar 2’-O-metoxietílico.

[00176] De acordo com uma aplicação, o polinucleotídeo modificado é modificado, ainda, de modo a ser anexado a um ligante que é selecionado para melhorar a estabilidade, distribuição ou absorção celular do agente, por exemplo, colesterol.

[00177] Desse modo, o polinucleotídeo pode ser modificado para incluir uma porção de não nucleotídeo, por exemplo, uma porção de colesterol. A porção de não nucleotídeo (p.ex., porção de colesterol) pode ser anexada, por exemplo, para a extremidade 3’ ou 5’ do polinucleotídeo.

[00178] De acordo com uma aplicação específica, o miRNA polinucleotídico do presente pedido de patente de invenção tem uma sequência de ácido nucléico, conforme estabelecido adiante na ID SEQ. N° 58-94 (veja Tabela 1A). Tabela 1A: SEQUÊNCIAS POLINUCLEOTÍDICAS DE MIRNA

[00179] Conforme mencionado acima e mostrado na seção de exemplos a seguir, os microRNAs são moléculas transformadas, derivadas de precursores específicos (ou seja, pré-miRNA), a regulação ascendente de uma função de miRNA específica pode ser efetuada utilizando uma molécula precursora miRNA específica.

[00180] De acordo com uma aplicação específica, o miR-135 compreende miR-135a ou miR-135b.

[00181] De acordo com uma aplicação específica, o polinucleotídeo de miR-135 precursor do presente pedido de patente de invenção tem uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 58-60.

[00182] De acordo com uma aplicação específica, o polinucleotídeo de miR-135 maduro do presente pedido de patente de invenção tem uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 61-62.

[00183] De acordo com uma aplicação específica, o polinucleotídeo de miR-135* maduro do presente pedido de patente de invenção tem uma sequência de ácido nucleico conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 192-193.

[00184] Também contempladas são sequências homólogas aos miRNAs e seus precursores. O nível de homologia deve ser relativamente alto para o miRNA maduro, mas mais pedidos de liberdade são permitidos no nível precursor (p.ex., pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais), enquanto as alterações de sequência estão na sequência em grampo e não no segmento de ácido nucleico, correspondente do miR madura.

[00185] Tais agentes polinucleotídicos do precursor são normalmente administrados para as células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) como parte de uma estrutura de expressão. Neste caso, o agente polinucleotídico é ligado em uma estrutura de ácido nucleico sob o controle de um elemento regulatório de ação cis (p.ex., promotor) capaz de dirigir uma expressão do microRNA nas células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) de forma constitutiva ou induzível.

[00186] Exemplos de agentes polinucleotídicos de microRNA do presente pedido de patente de invenção incluem, mas não estão limitados a miR-15 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029485), miR-19 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029489.1), miR-26 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029500 e NR_029499), miR-27 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029501), miR-135 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029677.1, NR 029678.1, NR 029893.1), miR- 335 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029899.1), miR-181(p.ex., GenBank accession n° NR_029611.1) e miR-182 (p.ex., acesso GenBank n° NR_029614).

[00187] Tais agentes de polinucleotídeo precursor são tipicamente administrados às células alvo (p.ex., células de neuroglia, células de plexo coroide (CP | choroid plexus), células-tronco ou células-tronco diferenciadas) como parte de uma estrutura de expressão. Nesse caso, o agente de polinucleotídeo é ligado em uma estrutura de ácido nucleico sob o controle de um elemento regulatório de ação cis (p.ex., promotor) capaz de direcionar uma expressão do microRNA nas células alvo (p.ex., células de neuroglia, células de CP, células-tronco ou células-tronco diferenciadas) em uma maneira constitutiva ou indutível.

[00188] Exemplos de promotores específicos de células dos neurônios incluem, mas não estão limitados a promotor do gene enolase de neurônio específico, promotor de sinapses, promotor sinapses reforçadas, promotor de calmodulina cálcica e promotor de Thy1.

[00189] Um promotor específico de célula de neuroglia exemplar inclui promotor de proteína acídica fibrilar glial (GFAP | glial fibrillary acidic protein).

[00190] Exemplos de promotores específicos de plexo coroide incluem, mas não se limitam a uma variante de entrelaçamento R do promotor de receptor do fator de liberação de corticotrofina do tipo 2 (CRFR2R), um receptor acoplado à proteína a G (GPR125) é um promotor de transtiretina.

[00191] De acordo com uma aplicação, a sequência do promotor (p.ex., promotor específico do plexo coroide) é colocada 3’ para a sequência do polinucleotídeo (p.ex., sequência de polinucleotídeo de miR-135) em uma estrutura de ácido nucleico de modo que a expressão da mesma seja constitutiva, mas específica do tecido.

[00192] De acordo com outra aplicação, a sequência do promotor específico do plexo coroide é situada em relação à sequência do polinucleotídeo (p.ex., sequência de polinucleotídeo de miR-135) em uma estrutura de ácido nucleico de modo que a expressão da mesma seja específica do tecido, mas também pode ser controlada em uma maneira exogenamente regulável.

[00193] A fim de garantir que o polinucleotídeo de interesse seja expresso tanto especificamente nas células do plexo coroide quanto em uma maneira exogenamente controlável, uma estrutura de ácido nucleico pode ser projetada de modo que compreenda um polinucleotídeo que codifica um transativador sob o controle do promotor específico do plexo coroide. O polinucleotídeo pode ser inserido na mesma estrutura de ácido nucleico ou em uma estrutura adicional sob o controle de um promotor induzível. O transativador em combinação com um indutor age para regular a expressão do promotor induzível.

[00194] Os promotores induzíveis adequados para uso com o presente pedido de patente de invenção são, de preferência, elementos de resposta capazes de direcionar a transcrição da sequência de polinucleotídeo. Um elemento de resposta adequado pode ser, por exemplo, um elemento de resposta de tetraciclina (tal como descrito por Gossen e Bujard (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-551, 1992); um element de resposta induzível por ectisona (No D et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 93:3346-3351, 1996) um elemento de resposta de íon de metal tal como descrito por Mayo et al. (Cell. 29:99-108, 1982); Brinster et al. (Nature 296:39-42, 1982) e Searle et al. (Mol. Cell. Biol. 5:1480-1489, 1985); um elemento de resposta de choque térmico tal como descrito por Nouer et al. (in: Heat Shock Response, ed. Nouer, L., CRC, Boca Raton, Fla., pp167-220, 1991); ou um elemento de resposta de hormônio tal como descrito por Lee et al. (Nature 294:228-232, 1981); Hynes et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2038-2042, 1981); Klock et al. (Nature 329:734-736, 1987); e Israel and Kaufman (Nucl. Acids Res. 17:2589-2604, 1989). De preferência, o elemento de resposta é um elemento de resposta induzível por ectisona, com mais preferência o elemento de resposta é um elemento de resposta de tetraciclina.

[00195] Elementos intensificadores podem estimular a transcrição em até 1.000 vezes de promotores homólogos ou heterólogos vinculados. Intensificadores estão ativos quando colocados a jusante ou a montante do local de iniciação da transcrição. Muitos elementos intensificadores derivados de vírus têm um alcance amplo acolhimento e são ativos em uma variedade de tecidos. Por exemplo, o intensificador de gene precoce SV40 é apropriado para muitos tipos de células. Outras combinações do intensificador/promotor que são adequadas para o presente pedido de patente de invenção incluem os derivados do poliomavírus, humano ou citomegalovírus murino (CMV | murine cytomegalovirus) e as longas repetições em tandem (LTRs | long tandem repeats) de vários retrovírus, como o vírus da leucemia de murino, vírus do sarcoma de Rous ou murino e HIV. Vide Gluzman, Y. e Shenk, T., eds. (1983). Enhancers and Eukaryotic Gene Expression, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., que está incorporado neste documento por referência.

[00196] Sequências de poliadenilação também podem ser adicionadas às estruturas de expressão do presente pedido de patente de invenção, a fim de aumentar a eficiência da expressão da fração detectável. Dois elementos distintos da sequência são necessários para poliadenilação precisa e eficiente: sequências GU ou U-rich localizadas a jusante do local de poliadenilação e uma sequência altamente conservada de seis nucleotídeos, nomeadamente AAUAAA, localizada a 1130 nucleotídeos acima do local. Sinais de terminação e poliadenilação adequadas o presente pedido de patente de invenção incluem os derivados de SV40.

[00197] Além das aplicações já descritas, as estruturas de expressão do presente pedido de patente de invenção podem tipicamente conter outros elementos especializados destinados a aumentar o nível de expressão dos ácidos nucleicos clonados ou para facilitar a identificação das células que transportam o DNA recombinante. Por exemplo, um número de vírus animais contêm sequências de DNA que promovem replicação extra cromossômica do genoma viral em tipos de células permissivas. Plasmídeos, tendo estes réplicões virais são replicados episomalmente, enquanto os elementos adequados são fornecidos por genes que também encontram o plasmídeo ou com o genoma da célula hospedeira.

[00198] As estruturas de expressão do presente pedido de patente de invenção podem ou não incluir um réplicão eucariótico. Se houver um réplicão eucariótico, o vetor é capaz de amplificação em células eucarióticas, utilizando o marcador selecionável apropriado. Se a estrutura não compreende um réplicão eucariótico, não é possível uma amplificação epissomal. Em vez disso, o DNA recombinante se integra no genoma da célula projetada, onde o promotor direciona a expressão do ácido nucleico desejado.

[00199] A estrutura de ácidos nucleicos pode ser introduzida nas células alvo (p.ex. células neuróglias ou células cardíacas) do presente pedido de patente de invenção, utilizando um método/veículo de entrega apropriado do gene (transfecção, transdução, etc.) e um sistema de expressão adequado.

[00200] Exemplos de vetores de expressão mamíferos incluem, mas não estão limitados a pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, e pNMT81, que estão disponíveis a partir da Invitrogen, pCI disponíveis da Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV e pBK- CMV, disponíveis da Strategene, pTRES disponível da Clontech, e seus derivados.

[00201] Vetores de expressão contendo elementos reguladores de vírus eucariotas como retrovírus também podem ser utilizados. Vetores SV40 incluem pSVT7 e pMT2, por exemplo. Vetores derivados do vírus do papiloma bovino incluem pBV-1MTHA e vetores derivados do vírus Epstein. Vírus de barras incluem pHEBO e p2O5. Outros vetores exemplares incluem pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5 e baculovírus pDSVE.

[00202] A estrutura de expressão também pode ser um vírus. Exemplos de estruturas virais incluem, mas não estão limitados a vetores adenovírais, vetores retrovirais, vetores virais vaccínia, vetores de vírus adeno-associado, vetores virais polioma, vetores alfavirais, vetores rhabdovirais, vetores virais lenti e vetores herpéticos.

[00203] Vetores retrovirais representam uma classe de vetores particularmente adequados para uso com o presente pedido de patente de invenção. Retrovírus defeituosos são rotineiramente utilizados na transferência de genes em células de mamíferos (para uma revisão, ver Miller, A. D. (1990). Blood 76, 271). Um retrovírus recombinantes, compreendendo os polinucleotídeos do presente pedido de patente de invenção, pode ser construído utilizando técnicas moleculares conhecidas. Porções do genoma retroviral podem ser removidas para processar a maquinaria de replicação de retrovírus defeituoso e o retrovírus deficiente de replicação pode, então, ser encapsidado em viriões, que pode ser utilizado para infectar células alvo através da utilização de um ajudante de vírus enquanto empregando técnicas padrão. Protocolos para a produção de retrovírus recombinantes e para infectar as células com vírus in vitro ou in vivo podem ser encontrados em, por exemplo, Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology (Greene Publishing Associates, Inc. & John Wiley & Sons, Inc.). Retrovírus têm sido utilizados para introduzir uma variedade de genes em muitos tipos de células diferentes, incluindo células neuronais, células epiteliais, células endoteliais, linfócitos, mioblastos, hepatócitos e células da medula óssea.

[00204] De acordo com uma aplicação, um vetor lentiviral, um tipo de vetor retroviral, é utilizada de acordo com os ensinamentos presentes. Vetores lentivirais são amplamente utilizados como vetores devido à sua capacidade de integrar o genoma tanto das células que não se dividem quanto as que se dividem. O genoma viral, na forma de RNA, é transcrito reverso quando o vírus entra na célula para produzir o DNA, que é então inserido no genoma em uma posição aleatória pela enzima integrase viral. O vetor (um pró-vírus) permanece no genoma e é passado para a descendência da célula quando ela se divide. Por razões de segurança, vetores lentivirais nunca carregam os genes necessários para a sua replicação. Para produzir um lentivirus, vários plasmídeos são transfectados em uma linha celular chamada encapsidação, ou comumente, HEK 293. Um ou mais plasmídeos, geralmente referidos como plasmídeos de encapsidação, codificam as proteínas do vírião, tais como o capsídeo e o transcriptase reverso. Outro plasmídeo contém o material genético para ser entregue pelo vetor. Ele é transcrito para produzir o genoma viral do RNA de cadeia única e é marcado pela presença da sequência * (psi). Esta sequência é utilizada para encapsidar o genoma no vírião.

[00205] Um exemplo específico de um vetor lentiviral adequado para introduzir e expressar as sequências polinucleotídicas do presente pedido de patente de invenção em células neuróglia ou células cardíacas é o vetor lentiviral pLKO.1.

[00206] Outro vetor de expressão adequado que pode ser utilizado, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, é o vetor de adenovírus. O adenovírus é um vetor de transferência do gene extensivamente estudado e rotineiramente utilizado. As vantagens de um vetor de adenovírus incluem eficiência de transdução relativamente alta em células quiescentes e que se dividem; tropismo natural para uma ampla gama de tecidos epiteliais e fácil produção de altos títulos (Russel, W. C. (2000) J Gen Virol 81, 57-63). O DNA do vírus adenoide é transportado para o núcleo, mas não integra o mesmo. Assim, o risco de mutagênese com vetores adenovírus é minimizado, enquanto a expressão de curto prazo é particularmente adequada para tratamento de células cancerosas. Vetores adenovírus utilizados em tratamentos de câncer experimental são descritos por Seth et al. (1999). “Adenoviral vectors for cancer gene therapy” pp. 103120, P. Seth, ed., Adenoviruses: Basic Biology to Gene Therapy, Landes, Austin, TX).

[00207] Um vetor de expressão viral adequado também pode ser um vetor de adenovírus/retrovírus quimérico, combinando componentes retrovirais e adenovirais. Tais vetores podem ser mais eficientes do que vetores de expressão tradicional para transdutar células tumorais (Pan et al. (2002). Cancer Letts 184, 179-188).

[00208] Vários métodos podem ser utilizados para introduzir as estruturas de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção nas células do mamífero. Tais métodos são geralmente descritos em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) and Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluem, por exemplo, transfecção estável e transitória, lipofecção, eletroporação e infecção com vetores virais recombinantes. Além disso, vide Patentes Norte- americanas n° 5.464.764 e 5.487.992 para métodos de seleção positivo- negativos.

[00209] Ao introduzir as estruturas de expressão do presente pedido de patente de invenção em células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) por infecção viral, a dose viral para a infecção é de, pelo menos, 103 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 , 10 ou partículas pfu e virais mais altas.

[00210] A fim de contornar a barreira hematoencefálica, as estruturas do presente pedido de patente de invenção podem ser administradas diretamente no cérebro (através do ventrículo), no bulbo olfativo (através de uma administração intranasal), através da medula espinhal (p.ex., por um cateter epidural) ou pela expressão do plexo coroide, conforme mais detalhado aqui.

[00211] De forma alternativa, sistemas com base em lipídios podem ser utilizados para a entrega dessas estruturas às células alvo (p.ex., células cerebrais, como as células neuróglia) do presente pedido de patente de invenção.

[00212] Lipossomas incluem qualquer estrutura sintética (i.e., não naturais) composta de bicamadas lipídicas, que incluem um volume. Lipossomas incluem emulsões, espumas, micelas, monocamadas insolúveis, cristais líquidos, dispersões de fosfolipídios, camadas lamelares e afins. Os lipossomas podem ser preparados por qualquer um dos métodos conhecidos na técnica [Monkkonen, J. et al., 1994, J. Drug Target, 2:299-308; Monkkonen, J. et al., 1993, Calcif. Tissue Int., 53:139-145; Lasic D., Liposomes Technology Inc., Elsevier, 1993, 63-105. (Capítulo 3); Winterhalter M, Lasic D, Chem Phys Lipids, 1993 September; 64(1-3):35- 43]. Os lipossomas podem ser carregados positivamente, neutro ou negativamente. Para absorção do Sistema de Fagócitos Mononucleares (MPS | mononuclear phagocyte system), os lipossomas podem ser hidrofóbicos desde que o mascaramento hidrofílico da membrana em lipossomas (p.ex. pelo uso de lipídios de polietilenoglicol ligados e partículas hidrofílicas) possam ser menos propensos a absorção de MPS. Opcionalmente, os lipossomas não compreendam lipídios blindados estericamente como gangliosídeos GM1 e fosfatidilinositol, desde que esses lipídios impeçam a absorção MPS.

[00213] Os lipossomas podem ser uma camada lipídica única ou podem ser multilamelares. Se o agente terapêutico for hidrofílico, sua entrega pode ser melhorada utilizando vesículas unilamelares grandes por causa de seu maior volume interno. Por outro lado, se o agente terapêutico for hidrofóbico, sua entrega pode ser melhorada utilizando vesículas multilamelares. Alternativamente, o agente terapêutico (p.ex. oligonucleotídeos) pode não ser capaz de penetrar a bicamada lipídica e, consequentemente, permaneceria adsorvido à superfície dos lipossomas. Neste caso, aumentando a área de superfície do lipossoma, pode-se melhorar ainda mais a entrega do agente terapêutico. Lipossomas apropriados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, são lipossomas não tóxicos, tais como, por exemplo, aqueles preparados a partir de fosfatidil- colina fosfoglicerol e colesterol. O diâmetro dos lipossomas utilizado pode variar de 0,1-1,0 micra. No entanto, outras escalas de tamanho adequadas para a fagocitose por células fagocíticas também podem ser utilizadas. Para dimensionar os lipossomas, homogeneização pode ser utilizada, com base na energia de corte para fragmentar lipossomas grandes em outros menores. Homogeneizadores que podem ser convenientemente utilizados incluem microfluidizadores, produzidos pela Microfluidics de Boston, MA. Em um procedimento típico de homogeneização, os lipossomas são recirculados através de um homogeneizador de emulsão padrão até que os tamanhos dos lipossomas selecionados sejam observados. A distribuição de tamanho de partículas pode ser monitorada pela discriminação de tamanho de partícula convencional por raio laser. A extrusão de lipossomas através de uma membrana de policarbonato de pequenos poros ou uma membrana cerâmica assimétrica é um método eficaz para reduzir tamanhos de lipossomas para uma

[00214] distribuição de tamanho, relativamente bem definida. Normalmente, a suspensão é um ciclo através da membrana de uma ou mais vezes até que a distribuição de tamanho do lipossoma desejado seja alcançada. Os lipossomas podem ser extrudados através de membranas de poros sucessivamente menores para alcançar uma redução gradual no tamanho de lipossomas.

[00215] Qualquer método conhecido na técnica pode ser utilizado para incorporar um agente polinucleotídico lipossoma de microRNA. (miR-135 ou o precursor respectivo) Por exemplo, o agente polinucleotídico de microRNA (miR-135 ou o precursor respectivo) pode ser encapsulado no lipossoma. Alternativamente, ele pode ser adsorvido na superfície do lipossoma. Outros métodos que podem ser utilizados para incorporar um agente farmacêutico no lipossoma do presente pedido de patente de invenção são descritos por Alfonso et al., [The science and practice of pharmacy, Mack Publishing, Easton Pa 19th ed., (1995)] e aqueles descritos por Kulkarni et al., [J. Microencapsul.1995, 12 (3) 229-46].

[00216] Os lipossomas utilizados nos métodos do presente pedido de patente de invenção podem cruzar as barreiras do sangue. Assim, de acordo com uma aplicação, os lipossomas do presente pedido de patente de invenção, não constituem uma barreira sangue direcionando um polissacarídeo (p.ex., manose) em sua porção de membrana. Optionalmente, os lipossomas do presente pedido de patente de invenção não incluem peptídeos em sua porção de membrana que direcionam os lipossomas a um receptor em uma barreira de sangue. Exemplos de tais peptídeos incluem, mas não estão limitados a transferrina, insulina, IGF-1, anticorpo receptor anti-transferrina IGF-2, anticorpo receptor anti-insulina, anticorpo receptor anti-IGF-1 e anticorpo receptor anti-IGF-2.

[00217] A fim de determinar os lipossomas que são especialmente adequados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, um ensaio de triagem pode ser executado como os ensaios descritos na Patente Norte-Americana. Appl. No. 20040266734 e Patente Norte- Americana. Appl. No. 20040266734; e em Danenberg et al., Journal of cardiovascular pharmacology 2003, 42:671-9; Circulation 2002, 106:599-605; Circulation 2003, 108:2798-804.

[00218] Outros vetores com base não lipídica que podem ser utilizados, de acordo com esse aspecto do presente pedido de patente de invenção, incluem, mas não estão limitados à polilisina, dendrímeros e gagômeros.

[00219] Independentemente do método ou estrutura empregada, é fornecida uma célula isolada que compreende a estrutura de ácido nucleico, codificação um microRNA, conforme detalhado acima.

[00220] Conforme utilizado neste documento, o termo “isolado” refere-se a parcialmente separado do ambiente natural, por exemplo, o corpo humano.

[00221] De acordo com uma aplicação, é fornecida uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico, expressando pelo menos uma unidade organizacional de microRNA ou um precursor respectivo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR-15, miR-19, miR-26, miR-27, miR-181 e miR-182 sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.

[00222] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada neuróglia compreendendo uma estrutura de ácido nucleico expressando, pelo menos, um microRNA ou um precursor mesmo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR- 26 e miR-182 sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.

[00223] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada, composta por uma estrutura de ácido nucleico, expressando um miR-19 ou um precursor respectivo sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.

[00224] De acordo com uma aplicação específica, é fornecida uma célula isolada, compreendendo a estrutura de um ácido nucleico, expressando um miR-15 ou um precursor respectivo sob um controle transcricional de um elemento regulatório de ação cis.

[00225] De acordo com uma aplicação específica, a célula é uma célula neuróglia ou uma célula cardíaca.

[00226] De acordo com uma aplicação específica, a célula neuróglia é um neurônio como um neurônio serotonérgico.

[00227] Os microRNAs ou seus precursores devem ser fornecidos para as células, ou seja, células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) do presente pedido de patente de invenção in vivo (ou seja, dentro do organismo ou objeto) ou ex vivo (p.ex., em uma cultura de tecido). No caso de as células serem tratadas ex vivo, o método de preferência inclui uma etapa de administração das tais células de volta ao indivíduo (terapia celular ex vivo terapia).

[00228] Para terapia ex vivo, as células (p.ex., células da glia, tais como oligodendrócitos, células CP, células estaminais e/ou células estaminais diferenciadas) são tratadas preferencialmente com o agente do presente pedido de patente de invenção (p.ex., microRNA, p.ex., miR-135 ou um precursor respectivo, ou um polinucleotídeo codificando o microRNA, p.ex., miR-135 ou um precursor respectivo), depois que eles são administrados ao indivíduo em necessidade respectiva.

[00229] A administração de células ex vivo tratadas, do presente pedido de patente de invenção, pode ser efetuada utilizando qualquer rota apropriada de introdução, como intravenosa, intraperitoneal, intra-renal, faixa intra-gastrointestinal, subcutânea, transcutânea, intramuscular, intracutânea, intratecal, epidural e retal. De acordo com aplicações atualmente preferidas, as células tratadas ex vivo, do presente pedido de patente de invenção, podem ser introduzidas no indivíduo utilizando intravenosa, intra-renal, faixa intra- gastrointestinal e/ou administração intraperitoneal.

[00230] As células do presente pedido de patente de invenção (p.ex., células da glia, tais como oligodendrócitos, células CP, células estaminais, células estaminais diferenciadas e/ou células cardíacas) podem ser ou derivadas de fontes autólogas ou de origens alogênicas, como cadáveres humanos ou doadores. Uma vez que células não autólogas são susceptíveis a induzir uma reação imune quando administradas ao organismo, várias abordagens têm sido desenvolvidas para se reduzir a probabilidade de rejeição de células não autólogas. Estas incluem suprimir o sistema imunológico destinatário ou encapsular as células não autólogas em imunoisolação, membrana semipermeável antes do transplante.

[00231] Técnicas de encapsulamento são geralmente classificadas como microencapsulação, envolvendo pequenos veículos esféricos, e macroencapsulação, envolvendo membranas de folha plana e fibra oca maiores (Uludag, H. et al. (2000). Technology of mammalian cell encapsulation. Adv Drug Deliv Rev 42, 29-64).

[00232] Métodos de preparação de microcápsulas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aquelas divulgadas em: Lu, M. Z. et al. (2000). Cell encapsulation com alginate and alpha-phenoxycinnamylidene- acetylated poly(allylamine). Biotechnol Bioeng 70, 479-483; Chang, T. M. e Prakash, S. (2001) Procedures for microencapsulation of enzymes, cells and genetically engineered microorganisms. Mol Biotechnol 17, 249-260; and Lu, M. Z., et al. (2000). A novel cell encapsulation method using photosensitive poly(allylamine alpha-cyanocinnamylideneacetate). J Microencapsul 17, 245521.

[00233] Por exemplo, microcápsulas são preparadas com colágeno modificado em um complexo com um escudo ter-polímero de metilacrilato de 2-hidroxietila (HEMA | hydroxyethyl methylacrylate), ácido metacrílico (MAA| methacrylic acid) e metacrilato de metila (MMA|methyl methacrylate), resultando em uma espessura da cápsula de 25 μm. Tais microcápsulas podem ser ainda mais encapsuladas com um adicional de 2-5 μm de capsulas de polímero-ter a fim de lhes conferir uma superfície lisa carregada negativamente para minimizar a absorção de proteínas do plasma (Chia, S. M. et al. (2002). Multi-layered microcapsules for cell encapsulation. Biomaterials 23, 849-856).

[00234] Outras microcápsulas são com bases em alginato, um polissacarídeo marinho (Sambanis, A. (2003). Encapsulated islets in diabetes treatment. Diabetes Thechnol Ther 5, 665-668), ou seus derivados. Por exemplo, microcápsulas podem ser preparadas pela complexação do polieletrolito entre o alginato de sódio poliânico e sulfato de sódio de celulose e o hidrocloridrato de poli(metileno-co-guanidina) de policação na presença de cloreto de cálcio.

[00235] Deve-se observar que o encapsulamento da célula é melhorado quando cápsulas menores são usadas. Assim, por exemplo, o controle de qualidade, estabilidade mecânica, propriedades de difusão e atividades in vitro de células encapsuladas melhoraram quando o tamanho da cápsula foi reduzido de 1 mm para 400 μm (Canaple, L. et al. (2002). Improving cell encapsulation through size control. J Biomater Sci Polym Ed 13, 783-96). Além disso, biocapsulas de nanoporos com tamanho de poros bem controlados, tão pequeno quanto 7 nm, químicas de superfície costuradas e microarquiteturas precisas foram consideradas para imuno-isolar microambientes para as células com êxito (Consulte: Williams, D. (1999). Small is beautiful: microparticle and nanoparticle technology in medical devices. Med Device Technol 10, 6-9; e Desai, T. A. (2002). Microfabrication technology for pancreatic cell encapsulation. Expert Opin Biol Ther 2, 633646).

[00236] Exemplos de agentes imunossupressores que podem ser utilizados em conjunto com o tratamento ex vivo incluem, mas não se limitando a metotrexato, ciclofosfamida, ciclosporina, ciclosporina A, cloroquina, hidroxicloroquina, sulfasalazina (sulfasalazopirina), sais de ouro, D-penicilamina, leflunomida, azatioprina, anakinra, infliximab (REMICADE.sup.R), etanercepte, bloqueadores de TNF alfa, um agente biológico que direcione uma citocina inflamatória e fármacos anti- inflamatórios não esteroides (NSAIDs | non-steroidal anti-inflammatory drug). Exemplos de AINEs incluem, mas não estão limitados a ácido acetil salicílico, salicilato de magnésio de colina, diflunisal, salicilato de magnésio, salsalato, salicilato de sódio, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, flurbiprofeno, indometacina, cetoprofeno, cetorolaco, meclofenamato, naproxeno, nabumetona, fenilbutazona, piroxicam, sulindaco, tolmetina, paracetamol, ibuprofeno, inibidores de Cox-2 e tramadol.

[00237] Para a terapia in vivo, o agente (p.ex., microRNA, p.ex., miR- 135, um precursor respectivo ou um polinucleotídico codificando o microRNA ou o precursor respectivo) é administrado ao indivíduo por si só ou como parte de uma composição farmacêutica. De preferência tais composições são formuladas para permitir a passagem através da barreira hematoencefálica (BBB|blood brain barrier).

[00238] Abordagens convencionais para a entrega do fármaco para o sistema nervoso central (CNS| central nervous system) incluem: estratégias neurocirúrgicas (p.ex., injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (p.ex., a produção de uma proteína de fusão quimérica que compreende um peptídeo de transporte que tem uma afinidade com uma molécula de superfície celular endotelial em combinação com um agente que é incapaz de cruzar a BBB em si) em uma tentativa de explorar uma das vias de transporte endógena da BBB; estratégias farmacológicas destinadas a aumentar a solubilidade lipídica de um agente (p.ex., conjugação de agentes aos transportadores de lipídios ou colesterol); e a perturbação transitória da integridade da BBB por interrupção de hiper-osmóticos (resultante da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou o uso de um agente biologicamente ativo tais como um peptídeo angiotensina).

[00239] Métodos para administração de fármacos por trás da BBB incluem a implantação intracerebral (tais como com agulhas) e distribuição avançada da convecção. Manitol pode ser utilizado, evitando a BBB. Da mesma forma, administração da mucosa (p.ex., nasal) pode ser utilizada para ignorar a BBB.

[00240] Os agentes de microRNA polinucleotídicos do presente pedido de patente de invenção também podem ser administrados a um organismo em uma composição farmacêutica onde é misturado com transportadores apropriados ou excipientes.

[00241] Conforme utilizado neste documento uma “composição farmacêutica” refere-se a uma preparação de um ou mais dos princípios ativos descritos com outros componentes químicos tais como transportadores fisiologicamente adequados e excipientes. O propósito de uma composição farmacêutica é facilitar a administração de um composto de um organismo.

[00242] Neste documento o termo “princípio ativo” refere-se ao peptídeo responsável pelo efeito biológico, (p.ex., miroRNA, p.ex., miR-135, um precursor respectivo ou um polinucleotídeo que codifica o microRNA ou o precursor respectivo).

[00243] Doravante, as frases “transportador fisiologicamente aceitável” e “transportador farmaceuticamente aceitável”, podem ser usadas de forma intercambiável, referindo-se a um transportador ou um diluente que não causa irritação significativa a um organismo e não revoga a atividade biológica e propriedades do composto administrado. Um adjuvante é incluído sob estas frases.

[00244] Neste documento o termo “excipiente” refere-se a uma substância inerte adicionada a uma composição farmacêutica para facilitar ainda mais a administração de um princípio ativo. Exemplos, sem limitação, de excipientes incluem carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, diversos açúcares e tipos de amido, derivados de celulose, gelatina, óleos vegetais e polietileno glicóis.

[00245] Técnicas para a formulação e administração de drogas podem ser encontradas em “Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PA, edição mais recente, que está incorporada neste documento por referência.

[00246] Vias adequadas de administração podem, por exemplo, incluir oral, retal, transmucoso, especialmente transnasal, entrega intestinal ou parenteral, incluindo intramuscular, subcutânea e injeções de haste intramedular, bem como intratecal, intraperitoneal, intranasal, intranasal ou injeções intra-oculares.

[00247] Alternadamente, pode-se administrar a composição farmacêutica de forma local, ao invés de sistêmica, por exemplo, através da injeção da composição farmacêutica diretamente em uma região de tecido de um paciente.

[00248] As composições farmacêuticas do presente pedido de patente de invenção podem ser fabricadas por processos conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de mistura convencional, dissolução, granulação, fabricação de drágea, levigamento, emulsionantes, encapsulamento, captura ou processos de liofilização.

[00249] As composições farmacêuticas, para uso em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, podem, portanto, ser formuladas de modo convencional, utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis, compreendendo excipientes e auxiliares que facilitam a transformação dos princípios ativos em preparações que, podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada é dependente da via de administração escolhida.

[00250] Para a injeção, os princípios ativos da composição farmacêutica podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em buffers fisiologicamente compatíveis, como solução de Hank, solução de Ringer ou solução fisiológica de sal. Para administração do transmucoso, penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada são utilizados na formulação. Tais penetrantes são geralmente conhecidos na técnica.

[00251] Para administração oral, a composição farmacêutica pode ser formulada prontamente combinando os compostos ativos com os transportadores farmaceuticamente aceitáveis conhecidas na técnica. Esses transportadores permitem a composição farmacêutica a ser formulada como comprimidos, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, lamas, suspensões e afins, para a ingestão oral de um paciente. Preparações farmacológicas para o uso oral podem ser feitas utilizando um excipiente sólido, opcionalmente efetuando a moagem da mistura resultante, e processamento da mistura de grânulos, depois de adicionar os auxiliares adequados, se desejado, para obter comprimidos ou núcleos drágea. Excipientes adequados são, nomeadamente, enchimentos, tais como açúcares, incluindo a lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, fécula de batata, gelatina, goma tragacanto, celulose metila, celulose- hidroxipropilmetila, carbometilcelulose de sódio; e/ou polímeros fisiologicamente aceitáveis, tais como polivinilpirrolidona (PVP|polyvinylpyrrolidone). Se desejado, agentes de desintegração podem ser adicionados, como pirrolidona polivinila reticulada, ágar, ou ácido algínico ou um sal respectivo como alginato de sódio.

[00252] Núcleos de drágea são fornecidos com revestimentos adequados. Para este efeito, soluções de açúcar concentrado podem ser usadas, o que pode conter, opcionalmente, goma arábica, talco, pirrolidona polivinila, gel de carbopol, polietilenoglicol, dióxido de titânio, soluções de laca e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos comprimidos ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos ativos.

[00253] Composições farmacêuticas que podem ser usadas por via oral, incluem cápsulas duras de gelatina, bem como cápsulas moles, capsulas seladas feitas de gelatina e um plastificante, tais como o glicerol ou sorbitol. As cápsulas duras podem conter os princípios ativos em mistura com enchimento como lactose, ligantes como amidos, lubrificantes, tais como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os princípios ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos adequados, tais como óleos graxos, parafina líquida ou polietilenoglicóis líquidos. Além disso, podem ser adicionados estabilizadores. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para a rota escolhida da administração.

[00254] Para administração bucal, as composições podem assumir a forma de comprimidos ou pastilhas formuladas de forma convencional.

[00255] Para administração por inalação nasal, os princípios ativos para uso, de acordo com o presente pedido de patente de invenção, convenientemente são entregues sob a forma de uma apresentação de spray aerossol a partir de um pacote pressurizado ou um nebulizador com a utilização de um propulsor apropriado, p.ex., diclorodifluorometano, tricloromonofluormetano, dicloro-tetrafluoroetano ou dióxido de carbono. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada, fornecendo uma válvula para entregar uma quantidade de inaladores. Cápsulas e cartuchos de, p.ex., gelatina para uso em um distribuidor pode ser formulada contendo uma mistura de pó do composto e uma base em pó apropriada, como a lactose ou o amido.

[00256] A composição farmacêutica descrita neste documento pode ser formulada para administração parentérica, p.ex., por injeção ou contínua infusão do bolo. Formulações para injeção podem ser apresentadas sob forma de dosagem de unidade, p.ex., em ampolas ou em recipientes de doses múltiplas com opcionalmente, um conservante adicionado. As composições podem ser suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos e podem conter agentes formulatórios como suspensão, estabilização e/ou agentes de dispersão.

[00257] Composições farmacêuticas para administração parenteral incluem soluções aquosas de preparação ativa na forma solúvel em água. Além disso, suspensões dos princípios ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa ou aquosa apropriada. Solventes lipofílicos adequados ou veículos incluem óleos graxos, tais como o óleo de gergelim, ou ésteres sintéticos de ácidos graxos como oleato de etila, triglicérides ou lipossomas. Suspensões aquosas de injeção podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores apropriados ou agentes que aumentam a solubilidade dos princípios ativos para permitir a preparação de soluções altamente concentradas.

[00258] Alternativamente, o princípio ativo pode ser em forma de pó para constituição com um veículo adequado, p.ex., solução à base de água estéril, apirógena, antes do uso.

[00259] A composição farmacêutica do presente pedido de patente de invenção também pode ser formulada em composições retais como supositórios ou enemas de retenção, utilizando, p.ex., bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau ou outros glicerídeos.

[00260] Composições farmacêuticas adequadas para uso no contexto do presente pedido de patente de invenção incluem composições em que os princípios ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para atingir o objetivo pretendido. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de princípios ativos (p.ex., miroRNA) eficazes para prevenir, aliviar ou amenizar os sintomas de uma doença (p.ex., transtornos de humor, tais como transtorno bipolar) ou prolongar a sobrevivência do indivíduo a ser tratado.

[00261] De acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, a superexpressão odo miR-135 tem um efeito antidepressivo.

[00262] A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está dentro da capacidade daqueles especialistas na técnica, especialmente à luz da divulgação detalhada, apresentada neste documento.

[00263] Para qualquer preparação utilizada nos métodos do presente pedido de patente de invenção, a quantidade terapeuticamente efetiva ou a dose podem ser estimadas inicialmente a partir de ensaios in vitro e de cultura de células. Por exemplo, uma dose pode ser formulada em modelos animais para atingir uma concentração desejada ou título. Tais informações podem ser usadas para determinar com mais precisão doses uteis em humanos.

[00264] A toxicidade e eficácia terapêutica dos princípios ativos descritos neste documento podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão in vitro, em culturas de células ou animais experimentais. Os dados obtidos a partir destes ensaios in vitro e de cultura de células e estudos em animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para uso em humanos. A dosagem pode variar dependendo da forma de dosagem empregada e a via de administração utilizada. A composição exata, via de administração e dosagem podem ser escolhidas pelo médico individual, tendo em conta as condições do paciente. (Vide, p.ex., Fingl, et al., 1975, in “The Pharmacological Basis of Therapeutics”, Ch. 1 p.1).

[00265] O intervalo e quantidade de dosagem podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis suficientes de plasma do princípio ativo para induzir ou suprimir o efeito biológico (concentração mínima eficaz [MEC | minimal effective concentration]). A MEC irá variar para cada preparação, mas pode ser estimada a partir de dados in vitro. As dosagens necessárias para atingir a MEC vão depender de suas características individuais e via de administração. A detecção de ensaios pode ser utilizada para determinar as concentrações de plasma.

[00266] Dependendo da severidade e capacidade de resposta da condição a ser tratada, a dosagem pode ser de administração única ou plural, com curso de tratamento durando de vários dias a várias semanas ou até a cura ser realizada ou diminuição do estado da doença ser alcançada.

[00267] A quantidade de uma composição a ser administrada será, claro, dependente do indivíduo a ser tratado, da severidade da aflição, da forma de administração, do julgamento do médico que prescreveu, etc. A dosagem e o tempo de administração será sensíveis a uma monitorização cuidadosa e contínua da condição de mudança individual.

[00268] Deve-se observar que existem modelos animais, pelos quais os agentes do presente pedido de patente de invenção possam ser testados antes do tratamento humano. Por exemplo, modelos animais de depressão, estresse, ansiedade, tais como o modelo do desamparo aprendido (LH), modelo de estresse crônico suave (CMS), modelo de estresse de fracasso social (SDS), modelo de privação materna e modelo de privação do sono podem ser utilizados. Por exemplo, os modelos animais de transtorno bipolar incluem, por exemplo, ratos transgênicos com expressão neuroespecífica de Polg mutante (D181A) [conforme ensinado por Kato et al., Neuroscience and Biobehavioral Reviews (2007) 6 (31):832- 842, incorporado aqui por referência], bem como os modelos de rato de mania bem-estabelecida de hiperatividade induzida por anfetamina [ensinado, por exemplo, na Patente US N° 6.555.585] e hiperatividade induzida por Cetamina [ensinada, por exemplo, em Ghedim et al., Journal of Psychiatric Research (2012) 46: 15691575], incorporado por referência, podem ser utilizados.

[00269] Composições do presente pedido de patente de invenção podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo dispensador, tais como um Kit aprovado FDA, que pode conter uma ou mais formas de dosagem da unidade que contém o princípio ativo. O pacote pode, por exemplo, incluir folha de metal ou de plástico, tais como um blister. O dispositivo do bloco ou do distribuidor pode ser acompanhado a partir das instruções para a administração. O pacote ou distribuidor podem ser alojados por uma nota associada com o recipiente em uma forma elaborada por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, e tal nota é reflexiva de aprovação pela agência da forma das composições ou administração humana ou veterinária. Esta nota, por exemplo, pode ser de rotulação aprovada pela Administração Federal de Alimentos e Medicamentos para prescrição de fármacos ou da inserção de um produto aprovado. Composições compreendendo uma preparação do presente pedido de patente de invenção formulada em um transportador farmacêutico compatível podem também ser preparadas, posicionadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada, como é mais detalhado acima.

[00270] Deve-se observar que as composições terapêuticas do presente pedido de patente de invenção podem incluir, além de microRNA (p.ex., miR- 135 ou polinucleotídeos que codifica o mesmo), outros medicamentos conhecidos para tratamento de depressão, estresse, ansiedade, privação de sono, etc., tais como, mas não se limitando a inibidores seletivos da recaptação de serotonina (SSRIs), inibidores de recaptação de serotonina- noradrenalina (SNRIs), antidepressivos noradrenérgicos e serotonérgicos específicos (NaSSAs), inibidores da recaptação de norepinefrina (noradrenalina) (NRI), inibidores da recaptação de noradrenalina-dopamina, intensificadores de recaptação de serotonina, desinibidores de noradrenalina- dopamina, antidepressivos tricíclicos (p.ex., imipramina), inibidores da oxidase monoamina (MAOIs). Estes fármacos podem ser incluídos no artigo da manufatura em embalagens únicas ou separadas.

[00271] De acordo com uma aplicação, a composição terapêutica do presente pedido de patente de invenção compreende, além do microRNA (p.ex., miR-135 ou polinucleotídeo que codifica o mesmo), um medicamento para tratamento de um transtorno bipolar. Qualquer medicamento ou qualquer combinação de medicamentos para tratamento de um transtorno bipolar podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos, incluindo, mas não se limitam a, lítio (p.ex., carbonato de Lítio, citrato de Lítio, sulfato de Lítio), medicamentos antipsicóticos (p.ex., antipsicóticos típicos e antipsicóticos atípicos, conforme detalhado abaixo), medicamentos estabilizadores de humor (p.ex., ácido Valproico (VPA, Valproato), minerais, anticonvulsivos, antipsicóticos) e antidepressivos.

[00272] Os medicamentos antipsicóticos típicos exemplares que podem ser utilizados, de acordo com os presentes ensinamentos, incluem, mas não se limitam a, medicamentos de potência Baixa: Clorpromazina (Largactil, Torazina), Clorprotixeno (Truxal), Tioridazina (Mellaril), Mesoridazina e Levomepromazina; medicamentos de potência Média: Loxapina (Loxapac, Loxitano), Molindona (Moban), Perfenazina (Trilafon) e Tiotixeno (Navane); medicamentos de potência Alta: Haloperidol (Haldol, Serenace), Flufenazina

[00273] (Prolixin), Droperidol, Zuclopentixol (Clopixol), Flupentixol (Depixol), Proclorperazina e Trifluoperazina (Stelazina). Além disso, Proclorperazina (Compazina, Buccastem, Stemetil) e Pimozida (Orap) podem ser utilizados.

[00274] Os medicamentos antipsicóticos atípicos exemplares (também referidos como antipsicóticos de segunda geração) que podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos, incluem, mas não se limitam a, Amisulprida (Solian), Aripiprazol (Abilify), Asenapina (Saphris), Blonanserina (Lonasen), Bitopertina (RG1678), Brexpiprazol (OPC-34712), Carpipramina (Prazinil), Clocapramina (Clofekton), Clozapina (Clozaril), Cariprazina (RGH-188), Iloperidona (Fanapt), Lurasidona (Latuda), LY2140023, Melperona (Buronil), Mosapramina (Cremin), Olanzapina (Zyprexa), Paliperidona (Invega), Perospirona (Lullan), Pimavanserina (ACP- 103), Quetiapina (Seroquel), Remoxiprida (Roxiam), Risperidona (Risperdal), (Serdolect), Sulpirida (Sulpirid), Vabicaserina (SCA-136), Ziprasidona (Geodon), Zotepina (Nipolept) e Zicronapina (Lu 31-130).

[00275] Estabilizadores de humor exemplares que podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos incluem, mas não se limitam a, minerais (p.ex., lítio); estabilizadores de humor anticonvulsivos incluindo ácido Valproico (Depakina), divalproex sódico (Depakote), e valproato sódico (Depacon, Epilim), Lamotrigina (Lamictal), Carbamazepina (Tegretol), Oxcarbazepina (Trileptal), Topiramato (Topamax), Riluzol (Rilutek) e Gabapentina (Neurontin); antipsicóticos (conforme descrito acima); e sumplementos alimentares (p.ex., ácido graxos ômega-3).

[00276] Antidepressivos exemplares que podem ser utilizados de acordo com os presentes ensinamentos incluem, mas não se limitam a, inibidores de reabsorção de serotonina Seletiva (SSRIs, tais como Citalopram, Escitalopram, Fluoxetina, Fluvoxamina, Paroxetina e Sertralina); inibidores de reabsorção de Serotonina-norepinefrina (SNRIs, tais como Desvenlafaxina, Duloxetina, Milnacipran e Venlafaxina); antidepressivos Noradrenérgicos e serotonérgicos específicos (tais como Mianserina e Mirtazapina); inibidores de reabsorção de Norepinefrina (noradrenalina) (NRIs, tais como Atomoxetina, Mazindol, Reboxetina e Viloxazina); inibidores de reabsorção de Norepinefrina-dopamina (tais como Bupropion); potenciadores de reabsorção de serotonina Seletiva tais como Tianeptina); desinibidores de Norepinefrina-dopamina (NDDIs, tais como Agomelatina); antidepressivos tricíclicos (incluindo antidepressivos tricíclicos de amina Terciária e antidepressivos tricíclicos de amina Secundária); e inibidor de Monoamina oxidase (MAOIs).

[00277] De acordo com uma aplicação, o fármaco antidepressivo compreende inibidores de reabsorção de serotonina seletiva (SSRI), antidepressivos tricíclicos e inibidores de reabsorção de noradrenalina (NRI).

[00278] De acordo com uma aplicação específica, o fármaco antidepressivo compreende inibidores de reabsorção de serotonina seletiva (SSRI).

[00279] Será apreciado que estratégias terapêuticas não farmacêuticas adicionais podem ser empregadas em combinação com os presentes ensinamentos, incluindo, mas não se limitando a, psicologia clínica, terapia eletroconvulsiva, internação involuntária, terapia de luz, psicoterapia, estímulo magnético transcraniano e terapia cognitiva comportamental.

[00280] Os presentes inventores mostraram a superexpressão dos resultados de miR-27 na supressão de MaoA (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados de miR-135 na supressão da Slc6a4 (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados demiR-135, miR-335, miR-26, miR-181 ou miR-182 na supressão do Htr1a (vide Exemplo 1, adiante), superexpressão dos resultados de miR-19 na supressão de Adr1 (vide Exemplo 2, adiante) e na supressão de CB1 (vide Exemplo 3B adiante) e a superexpressão dos resultados de miR-15 na supressão de Crh1R (vide Exemplo 4, adiante) e na supressão de FKBP5 (vide Exemplo 4B, adiante).

[00281] Assim, de acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene do transportador (Slc6a4) de serotonina em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um microRNA ou precursor respectivo, no qual o microRNA é selecionado do grupo constituído por miR-135 e miR-335.

[00282] Conforme utilizado neste documento, o termo “transportador de serotonina (Slc6a4)” refere-se à proteína de transporte da monoamina (também chamada SERT) envolvida na recaptação da serotonina da fenda sináptica. Um exemplar de Slc6a4 está previsto em NP_001036.1.

[00283] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão do gene da serotonina (Htr1a) de um gene do receptor inibitório 1A em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de uma microRNA ou precursor respectivo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo constituído por miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 e miR-26.

[00284] Conforme utilizado neste documento, o termo “gene receptor inibitório 1A de serotonina (Htr1a)” refere-se ao receptor acoplado à proteína G que funciona como um autorreceptor no neurônio pré-sináptico e mediado por inibição da liberação de serotonina. Um exemplar Htr1a está previsto em NP_ 000515.2.

[00285] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene de hidroxilase monoamina (MaoA) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-27 ou um precursor respectivo.

[00286] Conforme utilizado neste documento, o termo “hidroxilase monoamina (MaoA)” refere-se à enzima que degrada neurotransmissores amina, tais como a dopamina, noradrenalina e serotonina. Um MaoA exemplar está previsto em NP_000231.1.

[00287] De acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a expressão de um gene triptofano hidroxilase 2 (Tph2) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de uma microRNA ou precursor respectivo na célula neuróglia, caracterizado pelo microRNA ser selecionado do grupo constituído por miR-181 e miR27.

[00288] Conforme utilizado neste documento, o termo “triptofano hidroxilase 2 (Tph2)” refere-se a enzima que catalisa a primeira etapa, limitante de taxa na biossíntese de serotonina. No exemplar Tph2 está previsto em NP_NP_775489.2.

[00289] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor beta adrenérgico 1 (Adrb1) em uma célula neuróglia ou células cardíacas, o método compreendendo uma modulação de atividade ou expressão de uma miR-19 ou um precursor respectivo.

[00290] Conforme utilizado neste documento, o termo “1(Adrb1) de receptores adrenérgicos beta” refere-se ao receptor que media os efeitos fisiológicos da adrenalina e noradrenalina. Um exemplar Adrb1 está previsto em NP_000675.1.

[00291] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor beta-2 adrenérgico (Adrb2) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor respectivo.

[00292] Conforme utilizado neste documento, o termo “receptor beta-2 adrenérgico (Adrb2)” refere-se ao receptor que está diretamente associado com o canal de cálcio tipo-L classe Ca(V)1.2. O Adrb2 está previsto, p.ex. NP_000015.1.

[00293] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor do tipo 1 CRH em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de miR-15 ou um precursor respectivo.

[00294] Conforme utilizado neste documento, o termo “CRH de tipo 1” refere-se ao receptor que liga o hormônio liberador de corticotropina (CRH | corticotropin-releasing hormone). O tipo 1 CRH está previsto, p.ex., em NP_001138618.1, NP_001138619.1, NP_001138620.1 e NP_004373.2.

[00295] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene receptor de glutamato em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de miR-181ou um precursor respectivo.

[00296] De acordo com outra aplicação, o gene receptor de glutamato compreende o receptor de glutamato metabotrópico 1 (Grm1), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 3 (Grik3), receptor de glutamato metabotrópico 5 (Grm5), receptor de glutamato ionotrópico, cainato 2 (Grik2) e receptor de glutamato metabotrópico 7 (Grm7), conforme descrito em mais detalhes acima.

[00297] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down (Dscam) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor respectivo.

[00298] Conforme utilizado neste documento, o termo “Molécula de Adesão Celular de Síndrome de Down (Dscam)” refere-se a molécula de adesão celular que desempenha um papel na evasão auto neuronal. A Dscam está prevista, p.ex., em NP_001380.2.

[00299] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da molécula de adesão celular L1 (L1cam) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor respectivo.

[00300] Conforme utilizado neste documento, o termo “Molécula de adesão celular L1 (L1cam) “refere-se a molécula de adesão celular neuronal. A L1cam está prevista p.ex. em NP_000416.1, NP_001137435.1, NP_076493.1.

[00301] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da proteína X associado à translina (Tsnax) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-182 ou um precursor respectivo.

[00302] Conforme utilizado neste documento, o termo “gene da proteína X associado à translina (Tsnax)” refere-se à proteína que interage especificamente com translina. A Tsnax está prevista p.ex. em NP_005990.1.

[00303] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular uma expressão de um gene receptor canabinoide 1 (CB1) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-19 ou um precursor respectivo.

[00304] Conforme utilizado neste documento, o termo “receptor canabinoide 1 (CB1)” refere-se ao receptor da membrana celular (também conhecido como CNR1). O CB1 é previsto, p.ex. em NP_001153698.1, NP_001153730.1, NP_001153731.1, NP_057167.2, NP_149421.2.

[00305] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene da proteína de ligação FK506 5 (FKBP5) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor respectivo.

[00306] Conforme utilizado neste documento, o termo “proteína de ligação FK506 5 (FKBP5)” refere-se à proteína que liga especificamente à Imunossupressão FK506 e a rapamicina. A FKBP5 é prevista p.ex. em NP_001139247.1, NP_001139248.1, NP_001139249.1, NP_004108.1.

[00307] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de um gene sintaxina 1a (Stx1a) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão de um miR-15 ou um precursor respectivo.

[00308] Conforme utilizado neste documento, o termo “sintaxina 1a (Stx1a)” refere-se a proteínas específicas do sistema nervoso. A Stx1a é prevista p.ex. em NP_001159375.1, NP_004594.1.

[00309] De acordo com outra aplicação, é fornecido um método para regular a expressão de uma quinase regulada por soro/glicocorticoide (Sgk1) em uma célula neuróglia, o método compreendendo a modulação de uma atividade ou expressão of a miR-15 ou um precursor respectivo.

[00310] Conforme utilizado neste documento, o termo “quinase regulada por soro/glicocorticoide (Sgk1)” refere-se à quinase de proteína serina/treonina. A Sgk1 está prevista p.ex. em NP_001137148.1, NP_001137149.1, NP_001137150.1, NP_005618.2.

[00311] Os ensinamentos presentes contemplam regular para mais (i.e, aumentar) ou regular para menos (ou seja, diminuir) os níveis de expressão dos genes acima mencionados.

[00312] A regulação descendente da expressão gênica, de acordo com os ensinamentos presentes, é normalmente realizada ao se administrar ou expressar em células alvo (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas) um polinucleotídeo de microRNA (como descrito em mais detalhes acima, neste documento).

[00313] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Slc6a4, a modulação compreende aumentar o miR-135 e/ou o miR-335.

[00314] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Htr1a, a modulação compreende aumentar o miR-135, miR-335, miR-181, miR-182 e/ou o miR-26.

[00315] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene MaoA, a modulação compreende aumentar o miR-27.

[00316] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene Adrb1, a modulação compreende aumentar o miR-19.

[00317] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene receptor CRH tipo 1, a modulação compreende aumentar o miR-15.

[00318] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene CB1, a modulação compreende aumentar o miR-19.

[00319] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender diminuir a expressão do gene FKBP5, a modulação compreende aumentar o miR-15.

[00320] De acordo com uma aplicação, é fornecido um método de regulação descendente de uma expressão de um gene selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4) em uma célula da glia, o método compreendendo: a) a regulação ascendente de uma atividade ou expressão de um miR-135 ou um precursor respectivo da referida célula da glia; e b) a medição de uma expressão do referido gene na referida célula da glia, regulando, assim, de forma descendente, a expressão do gene.

[00321] De acordo com uma aplicação específica, a regulação descendente da expressão do gene é efetuada pela regulação ascendente de uma atividade ou expressão de um microRNA ou um precursor respectivo que não seja miR-135.

[00322] De acordo com uma aplicação específica, a regulação descendente da expressão do gene alvo miR-135 é efetuada pela administração ao indivíduo de um agente capaz de regular de forma descendente uma atividade ou expressão do gene alvo de mir-135.

[00323] A regulação descendente de um gene (p.ex., gene alvo de miR- 135) ou produto de gene pode ser efetuada no nível genômico e/ou de transcrito usando uma variedade de moléculas que interferem na transcrição e/ou tradução [por exemplo, agentes de silenciamento de RNA (p.ex., antissentido, siRNA, shRNA, micro-RNA), Ribozima, DNAzima e um sistema CRISPR (p.ex., CRISPR/Cas)] ou no nível de proteína usando, por exemplo, antagonistas, enzimas que clivam o polipeptídeo e similar.

[00324] Abaixo é apresentada uma lista de agentes capazes de regular de forma descendente o nível de expressão e/ou atividade de um gene ou produto de gene de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção.

[00325] Um exemplo de um agente capaz de regular de forma descendente uma atividade de um produto de gene de polipeptídeo é um anticorpo ou fragmento de anticorpo capaz de ligar especificamente o produto de gene (isto é, proteína). Tal inibição é valiosa para polipeptídeos extracelulares, de superfície de célula ou secretados em particular. Conforme utilizado neste documento, o termo “epitopo” refere-se a qualquer determinante antigênico em um antígeno para ao qual o parátopo de um anticorpo se liga.

[00326] Determinantes epitópicos normalmente consistem em agrupamentos de moléculas de superfície quimicamente ativa tais como aminoácidos ou cadeias laterais de carboidrato e normalmente têm características estruturais tridimensionais, bem como características de carga específicas.

[00327] O termo “anticorpo” conforme utilizado neste pedido de patente de invenção inclui moléculas intactas, bem como fragmentos funcionais do mesmo, tais como Fab, F(ab’)2, e Fv que são capazes de se ligar aos macrófagos. Esses fragmentos funcionais de anticorpo são definidos a seguir: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmentos de ligação de antigen monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido pela digestão do anticorpo total com a enzima papaína para render uma cadeia leve intacta e uma porção de uma cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtida pelo tratamento do anticorpo total com pepsina, seguido pela redução, para render uma cadeia leve intacta e uma porção da cadeia pesada; dois fragmentos Fab’ são obtidos por molécula de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido pelo tratamento do anticorpo total com a enzima pepsina sem redução subsequente; F(ab’)2 é um dímero de dois fragmentos Fab’ mantidos juntos pelas ligações de dissulfeto; (4) Fv, definido como um fragmento geneticamente projetado contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressa como duas cadeias; e (5) anticorpo de cadeia simples (“SCA”|Single chain antibody), uma molécula geneticamente projetada contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligada por um ligante de polipeptídeo adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida.

[00328] Métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais, bem como fragmentos do mesmo são bem conhecidos na técnica (Veja, por exemplo, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporado aqui por referência).

[00329] A regulação descendente de um gene (p.ex., gene alvo de miR- 135) pode ser também alcançada pelo silenciamento de RNA. Conforme utilizado neste documento, a expressão “silenciamento de RNA” refere-se a um grupo de mecanismos regulatórios [por exemplo, interferência de RNA (RNAi|RNA interference), silenciamento gênico transcricional (TGS|transcriptional gene silencing), silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS|post-transcriptional gene silencing), supressão, co-supressão, e repressão translacional] mediados pelas moléculas de RNA que resultam na inibição ou “silenciamento” da expressão de um gene de codificação de proteína correspondente. O silenciamento do RNA foi observado em muitos tipos de organismos, incluindo plantas, animais e fungos.

[00330] Conforme utilizado neste documento, o termo “agente de silenciamento de RNA” refere-se a um RNA que é capaz de inibir especificamente ou “silenciar” a expressão de um gene alvo. Em certas aplicações, o agente de silenciamento de RNA é capaz de prevenir processamento completo (p.ex., a tradução e/ou expressão completa) de uma molécula de mRNA através de um mecanismo de silenciamento pós- transcricional. Os agentes de silenciamento de RNA incluem molécula de RNA não codificantes, por exemplo, duplexes de RNA compreendendo cadeias emparelhadas, bem como RNAs precursores dos quais tais RNAs não codificantes pequenos podem ser gerados. Os agentes de silenciamento de RNA exemplares incluem dsRNAs tais como siRNAs, miRNAs e shRNAs. Em uma aplicação, o agente de silenciamento de RNA é capaz de induzir interferência de RNA. Em outra aplicação, o agente de silenciamento de RNA é capaz de mediar a repressão translacional.

[00331] De acordo com uma aplicação do presente pedido de patente de invenção, o agente de silenciamento de RNA é específico ao RNA alvo (p.ex., gene alvo) e não ultrapassa inibição ou silencia um gene ou uma variante de processamento que exibe 99% ou menos homologia global ao gene alvo, por exemplo, menos de 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81% de homologia global ao gene alvo.

[00332] Inteferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento gênico pós-transcricional específico de sequência em animais mediado pelos RNAs de interferência curta (siRNAs|short interfering RNAs). O processo correspondente nas plantas pe comumente refereido como silenciamento gênico pós-transcricional ou silenciamento de RNA e é também referido como supressão nos fungos. Pensa-se que o processo de silenciamento gênico pós-transcricional seja um mecanismo de defesa celular evolutivamente conservado utilizado para prevenir a expressão de genes estrangeiros e é comumente compartilhado por flora e fila diversa. Tal proteção da expressão do gene estrangeiro pode ter evoluído em resposta à produção de RNAs de duplo filamento (dsRNAs|double strand RNAs) derivados de infecção viral e de integração aleatória de elementos transposon em um genoma hospedeiro através de uma resposta celular que especificamente destrói o RNA de filamento único homólogo ou RNA genômico viral.

[00333] A presença de dsRNAs longos nas células estimula a atividade de uma enzima ribonuclease III referida como dicer. Dicer está envolvido no processamento do dsRNA em peças curtas de dsRNA conhecidas como RNAs de interferência curta (siRNAs). Os RNAs de interferência curta derivados da atividade de dicer são tripicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos de comprimento e compreendem cerca de 19 duplexes de par de base. A resposta do RNAi também configure um complexo de endonuclease, comumente referido como um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC|RNA-induced silencing complex), que medeia a clivagem de RNA de filamento único tendo sequência complementar à cadeia antissentido do duplex de siRNA. A clivagem do RNA alvo ocorre no meio da região complementar à cadeia antissentido do duplex de siRNA.

[00334] Consequentemente, algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção comtemplam o uso de dsRNA para regular de forma descendente a expressão de proteína a partir do mRNA.

[00335] De acordo com uma aplicação, o dsRNA é maior que 30 bp. O uso de dsRNAs longos (isto é, dsRNA maior que 30 bp) tem sido muito limitado devido à crença que essas regiões mais longas de RNA de duplo filamento resultarão na indução do interferon e resposta de PKR. Entretanto, o uso de dsRNAs longos pode fornecer numerosas vantagens em que a célula pode selecionar a sequência de silenciamento ideal aliviando a necessidade de testar numerosos siRNAs; dsRNAs longos permitirão que as bibliotecas de silenciamento tenham menos complexidade do que seria necessário para siRNAs; e, talvez o mais importante, dsRNA longos poderiam prevenir mutações de escape quando utilizados como terapêuticos.

[00336] Vários estudos demonstram que dsRNAs longos podem ser utilizados para silenciar a expressão de gene sem induzir a resposta ao estresse ou causando efeitos fora do alvo significativos - veja, por exemplo [Strat et al., Nucleic Acids Research, 2006, Vol. 34, No. 13 3803- 3810; Bhargava A et al. Brain Res. Protoc. 2004; 13:115-125; Diallo M., et al., Oligonucleotides. 2003; 13:381-392; Paddison P.J., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99:1443-1448; Tran N., et al., FEBS Lett. 2004;573:127- 134].

[00337] O presente pedido de patente de invenção, de acordo com algumas aplicações respectivas, também contempla a introdução de dsRNA longos especificamente projetados para não induzir o interferon e caminhos PKR para regular de forma descendente a expressão do gene. Por exemplo, Shinagwa and Ishii [Genes & Dev. 17 (11): 13401345, 2003] desenvolveram um vetor, chamado pDECAP, para expressar RNA longos de duplo filamento de um promotor de RNA polimerase II (Pol II). Porque os transcritos de pDECAP não têm a estrutura de cobertura 5’ e a cauda 3’-poli(A) que facilita exportar ds-RNA para o citoplasma, ds-RNA longo de pDECAP não induz a resposta do interferon.

[00338] Outro método de evasão do interferon e caminhos de PKR nos sistemas de mamífero é pela introdução de pequenos RNAs inibitórios (siRNAs) seja através de transfecção ou expressão endógena.

[00339] O termo “siRNA” refere-se a duplexes de RNA inibitório pequeno (geralmente entre 18 e 30 pares de base) que induzem a o camino de intereferência de RNA (RNAi). Tipicamente, siRNAs são quimicamente sintetizados como 21meros com uma região duplex central de 19 bp e saliências 3’ de base 2 simétricas nos terminais, embora tenha sido descrito recentemente que duplexes de RNA químicamente sintetizados de 25 a 30 comprimento de base podem ter tanto quanto um aumento de 100 vezes na potencia comparado com 21meros na mesma localização. A potência aumentada observada obtida usando RNAs mais longos no acionamento de RNAi é teorizada para resultar do fornecimento de Dicer com um substrato (27mero) em vez de um produto (21mero) e que isso melhora a taxa de eficiencia de entrada do duplex de siRNA em RISC.

[00340] Foi descoberto que a posição da saliência 3’ influencia a potência de um siRNA e duplexes assimétricos tendo uma saliência 3’ na cadeia antissentido são geralmente mais potentes do que aqueles com a saliência 3’ na cadeia de sentido (Rose et al., 2005). Isso pode ser atribuído ao carregamento de filamento assimétrico em RISC, já que os padrões de eficácia opostos são observados ao direcionar o transcrito antissentido.

[00341] Os filamentos de um RNA de interferência de duplo filamento (p.ex., um siRNA) podem ser conectados para formar uma hairpina ou estrutura em ansa pedunculada (p.ex., um shRNA). Desso modo, conforme mencionado, o agente de silenciamento de RNA de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção também podem ser um RNA de hairpina curta (shRNA|short hairpin RNA).

[00342] O termo “shRNA”, Conforme utilizado neste documento, refere-se a um agente de RNA tendo uma estrutura em ansa pedunculada, compreendendo uma primeira e uma segunda região de sequência de complementaridade, o grau de complementaridade e orientação das regiões que são suficientes, de modo que o pareamento de base ocorra entre as regiões, a primeira e a segunda regiões sendo unidas por uma região de laço, o laço resultando de uma falta de pareamento de base entre os nucleotídeos (ou análogos de nucleotídeo) dentro da região de laço. O número de nucleotídeos no laço é um número entre e incluindo 3 a 23, ou 5 a 15, ou 7 a 13, ou 4 a 9, ou 9 a 11. Alguns dos nucleotídeos no laço podem estar envolvidos nas interações de pares de base com outros nucleotídeos no laço. Exemplos de sequências de oligonucleotídeo que podem ser usadas para formar o laço incluem 5’-UUCAAGAGA-3’ (Brummelkamp, T. R. et al. (2002) Science 296: 550) e 5’-UUUGUGUAG-3’ (Castanotto, D. et al. (2002) RNA 8:1454). Será reconhecido por um especialista na técnica que o oligonucleotídeo de cadeia simples resultante foram uma estrutura em ansa pedunculada ou em grampo compreendendo uma região de duplo filamento capaz de interagir com o mecanismo de RNAi.

[00343] A síntese de agentes de silenciamento de RNA adequados para uso com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser efetuada da seguinte forma. Primeiro, a sequência de mRNA do gene alvo é digitalizada a jusante do códon de partida AUG para sequência de dinucleotídeo AA. A ocorrência de cada AA e os 19 nucleotídeos 3’ adjacentes é registrada como locais alvo de siRNA potencial. De preferência, os locais alvo de siRNA são selecionados do quadro de leitura aberta, como regiões não traduzidas (UTRs|untranslated regions), são mais ricos em locais de ligação de proteína regulatória. As proteínas de ligação de UTR e/ou complexos de iniciação à tradução podem interferir na ligação do complexo de endonuclease de siRNA [Tuschl ChemBiochem. 2:239-245]. Será apreciado, então, que os siRNAs direcionados para as regiões não traduzidas também podem ser eficazes, conforme demonstrado por GAPDH em que siRNA direcionado para a UTR 5’ mediou cerca de 90% de aumento no mRNA de GAPDH celular e no nível de proteína completamente abolido (www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html).

[00344] Em segundo lugar, os locais alvo potenciais são comparados a uma base de dados genômica apropriada (p.ex., humano, rato, ratazana etc.) usando qualquer software de alinhamento de sequência, tal como o software BLAST disponível junto ao servidor NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Os locais alvo putativos que exibem homologia significativa a outras sequências de codificação são filtrados.

[00345] As sequências alvo de qualificação são selecionadas como modelo para a síntese de siRNA. As sequências preferidas são aquelas incluindo o baixo teor de G/C já que essas provaram ser mais eficazes em mediar o silenciamento do gene como comparado àqueles com teor de G/C maior que 55%. Vários locais alvo são preferencialmente selecionados ao longo do comprimento do gene alvo para avaliação. Para melhor avaliação dos siRNAs selecionados, um controle negativo é utilizado, de preferência, em conjunto. siRNA de controle negativo inclui, de preferência, a mesma composição de nucleotídeo como os siRNAs, mas não tem homologia significativa para o genoma. Assim, uma sequência de nucleotídeo misturada do siRNA é preferencialmente usada, contanto que não exiba nenhuma homologia significativa a nenhum outro gene.

[00346] Será apreciado que o agente de silenciamento de RNA de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção não precisa ser limitado àquelas moléculas contendo apenas RNA, mas engloba, ainda, nucleotídeos e não nucleotídeos quimicamente modificados.

[00347] Em algumas aplicações, o agente de silenciamento de RNA fornecido aqui pode ser funcionalmente associado com um peptídeo de penetração da célula. Conforme utilizado neste documento, um “peptídeo de penetração da célula” é um peptídeo que compreende uma sequência de aminoácido curta (cerca de 12 a 30 resíduos) ou motivo funcional que confere as propriedades de translocação independentes de energia (isto é, não endocitóticas) associadas com transporte do complexo permeável de membrana através das membranas de plasma e/ou nuclear de uma célula. O peptídeo de penetração da célula utilizado no complexo permeável da membrana de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção preferencialmente compreende, pelo menos, um resíduo de cisteína não funcional, que é livre ou derivado para formar uma ligação de dissulfeto com um ácido ribonucleico de duplo filamento que foi modificado para tal ligação. Os motivos de aminoácido representativos que conferem tais propriedades são listados na Patente Norte-americana N° 6.348.185, os conteúdos desse são expressamente incorporados aqui por referência. Os peptídeos de penetração da célula de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção preferencialmente incluem, mas não se limitam a, penetratina, transportan, pIsl, TAT(48-60), pVEC, MTS, e MAP.

[00348] mRNAs a serem direcionados usando agentes de silenciamento de RNA incluem, mas não se limitam a, aqueles cuja expressão está correlacionada com um traço fenotípico indesejado. mRNAs exemplares que podem ser direcionados são aqueles que codificam as proteínas truncadas, isto é, compreende exclusões. Consequentemente, o agente de silenciamento de RNA de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser direcionado para uma região de ligação em ponte em qualquer lado da exclusão. Introdução de tais agentes de silenciamento de RNA em uma célula causaria uma regulação descendente da proteína mutada, ao deixar a proteína não mutada não afetada.

[00349] Outro agente capaz de regular de forma descendente um gene (p.ex., gene alvo de miR-135) é uma molécula de DNAzima capaz de clivar especificamente um transcrito de mRNA ou sequência de DNA do gene alvo. DNAzimas são polinucleotídeos de duplo filamento que são capzes de clivar ambas as sequências alvo de filamento único e duplo (Breaker, R.R. and Joyce, G. Chemistry and Biology 1995;2:655; Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 1997;943:4262) Um modelo geral (o modelo “1023” model) para a DNAzima foi proposto. DNAzimas “10-23” têm um domínio catalítico de 15 desoxirribonucleotídeos, flanqueados por dois domínios de reconhecimento de substrato de sete a nove desoxirribonucleotídeos cada. Esse tipo de DNAzima pode efetivamente clivar seu RNA de substrato nas junções de purina:pirimidina (Santoro, S.W. & Joyce, G.F. Proc. Natl, Acad. Sci. USA 199; for rev of DNAzymes see Khachigian, LM [Curr Opin Mol Ther 4:119-21 (2002)].

[00350] Exemplos de construção e amplificação de DNAzimas sintéticas, projetadas reconhecendo os locais de clivagem alvo de filamento único e duplo foram revelados na Patente Norte-americana N° 6.326.174, de Joyce et al. DNAzimas de projeto similar direcionados contra o receptor de Urocinase humana foram recentemente observadas para inibir a expressão do receptor de Urocinase, e inibir com sucesso a metástase da célula de câncer de cólon in vivo (Itoh et al, 20002, Abstract 409, Ann Meeting Am Soc Gen Ther www.asgt.org). Em outra aplicação, DNAzimas complementares aos oncogêneses bcr-ab1 foram bem-sucedidas na inibição da expressão de oncogenes em células de leucemia e diminuição das taxas de recaída em transplante de medula óssea autóloga nos casos de CML e ALL.

[00351] A regulação descendente de um gene (p.ex., gene alvo de miR- 135) também pode ser efetuada pelo uso de um polinucleotídeo antissentido capaz de hibridizar especificamente com um transcrito de mRNA que codifica o gene.

[00352] O projeto das moléculas antissentido que podem ser usadas para regular de forma descendente eficazmente um gene precisa ser efetuado ao considerar dois aspectos importantes para a abordagem antissentido. O primeiro aspecto é distribuição do oligonucleotídeo no citoplasma das células apropriadas, enquanto o segundo aspecto é projeto de um oligonucleotídeo que se liga especificamente ao mRNA designado dentro das células em uma maneira que inibe a tradução do mesmo.

[00353] Outro agente capaz de regular de forma descendente um gene (p.ex., gene alvo de miR-135) é uma molécula de ribozima capaz de clivar especificamente um transcrito de mRNA que codifica um gene. As ribozimas estão sendo cada vez mais usadas para a inibição específica de sequência da expressão de gene pela clivagem dos mRNAs que codificam proteínas de interesse [Welch et al., Curr Opin Biotechnol. 9:486-96 (1998)]. A possibilidde de projetar as ribozimas para clivar qualquer RNA alvo específico specific tonrou-as ferramentas valiosas tanto na pesquisa básica quando em aplicações terapêuticas. Na area terapêutica, as ribozimas foram exploradas para direcionar os RNAs virais em doenças infecciosas, oncogenes dominantes em cânceres e mutações somáticas específicas em transtornos genéticos [Welch et al., Clin Diagn Virol. 10:163-71 (1998)]. Maisnotavelmente, vários protocolos de terapia gênica de ribozima para paicentes com HIV já estão nos ensaios de Fase 1. Mais recentemente, as ribozimas foram usadas para pesquisa de animal transgênico, validação de gene alvo e elucidação do caminho. Várias ribozimas estão em vários estágios de estudos clínicos. ANGIOZYME foi a primeira ribozima quimicamente sintetizada para ser estudada em testes clínicos humanos. ANGIOZYME especificamente inibe a formação do VEGF-r (receptor de Fator de Crescimento Endotelial Vascular | Endothelial Growth Factor receptor), um componente principal no caminho da angiogênese. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., bem como outras empresas demonstraram a importância de terapêuticos antiangiogênese em modelos animais. HEPTAZIMA, uma ribozima projetada para destruir seletivamente o RNA do Vírus da Hepatite C (HCV), foi descoberta como sendo eficaz na diminuição do RNA de Hepatite C viral nos ensaios de cultura de célula (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - página da WEB).

[00354] Outro agente capaz de regular de forma descendente um gene (p.ex., gene alvo de miR-135) é uma tecnologia de endonuclease guiada por RNA, por exemplo, sistema CRISPR.

[00355] Conforme utilizado neste documento, o termo “sistema CRISPR”, também conhecido como Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, refere-se coletivamente a transcritos e outros elementos envolvidos na expressão de ou direcionamento da atividade dos genes associados com CRISPR, incluindo sequências que codificam um gene Cas (p.ex., endonuclease 9 associada com CRISPR), uma sequência tracr (CRISPR de ativação trans) (p.ex., tracrRNA ou um tracrRNA parcial ativo), uma sequência tracr-mate (englobando uma “repetição direta” e uma repetição direta parcial processada com tracrRNA) ou uma sequência guia (também referida como um “espaçador”) incluindo, mas não se limitam a, uma sequência de crRNA ou uma sequência de sgRNA (isto é, RNA guia simples).

[00356] Em algumas aplicações, um ou mais elementos de um sistema CRISPR é derivado de um sistema CRISPR tipo I, tipo II, ou tipo III. Em algumas aplicações, um ou mais elementos de um sistema CRISPR (p.ex., Cas) é derivado de um organismo particular compreendendo um sistema CRISPR endógeno, tal como Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitides, Streptococcus thermophilus ou Treponema denticola.

[00357] Em geral, um sistema CRISPR é caracterizado pelos elementos que promover a formação de um complexo CRISPR no local de uma sequência alvo (também referido como um protoespaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno).

[00358] No contexto da formação de um complexo CRISPR, “sequência alvo” refere-se a uma sequência a qual uma sequência guia (isto é, RNA guia) é projetada para ter complementaridade, onde a hibridização entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. Complementaridade total não é necessariamente requerida, contanto que haja complementaridade suficiente para causar hibridização e promover formação de um complexo CRISPR. Assim, de acordo com algumas aplicações, a homologia global para a sequência alvo pode ser de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99%. Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, tal como polinucleotídeos de DNA ou RNA. Em algumas aplicações, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula.

[00359] Assim, o sistema CRISPR compreende dois componentes distintos, um RNA guia (gRNA | guide RNA) que hibridiza com a sequência alvo, e uma nuclease (p.ex., proteína Cas9 Tipo II), em que o gRNA direciona a sequência alvo e a nuclease (p.ex., proteína Cas9) cliva a sequência alvo ou silencia os genes alvo. O RNA guia pode compreender uma combinação de um crRNA e tracrRNA bacteriano endógeno, isto é, o gRNA combina a especificidade de direcionamento do crRNA com as propriedades de armação do tracrRNA (requerido para ligação de Cas9). Alternativamente, o RNA guia pode compreender um RNA guia simples (sgRNA | simple guide RNA) capaz de ligar diretamente Cas.

[00360] Tipicamente, no contexto de um sistema CRISPR endógeno, a formação de um complexo CRISPR (compreendendo uma sequência guia hibridizada ara uma sequência alvo e complexada com uma ou mais proteínas Cas) resulta na clivagem de um ou ambos os filamentos dentro ou perto (p.ex., dentro de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 50, ou mais pares de base) da sequência alvo. Isso resulta no rompimento do gene de interesse (isto é, alvo sequência), por exemplo, através de inserções ou exclusões.

[00361] De acordo com uma aplicação, a proteína Cas (p.ex., Cas9) não tem atividade nuclease (isto é, cataliticamente inativa) e é dito ser ‘morta’ (dCas9). A proteína Cas9 cataliticamente inativa pode ser usada de acordo com os presentes ensinamentos para ligar ao DNA (com base na especificidade do RNA guia), isso tipicamente resulta no bloqueio da ligação ou alongamento de RNA polimerase, levando à supressão de transcrição. Assim, dCas9 pode ser usada para repressão de transcrição.

[00362] Conforme mencionado, uma sequência tracrRNA, que pode compreender ou consistir em toda ou uma porção de uma sequência tracr tipo selvagem (p.ex., cerca de ou mais que cerca de 20, 26, 32, 45, 48, 54, 63, 67, 85, ou mais nucleotídeos de uma sequência tracr tipo selvagem), pode também formar parte de um complexo CRISPR, tal como por hibridização ao longo de, pelo menos, uma porção da sequência tracrRNA para toda ou uma porção de uma sequência tracr-mate que é operacionalmente ligada à sequência guia (p.ex., crRNA).

[00363] Em algumas aplicações, a sequência tracr tem complementaridade suficiente para uma sequência tracr mate para hibridizar e participar na formação de um complexo CRISPR. Como com a sequência alvo, uma complementaridade completa não é necessária, contanto que haja suficiente para ser funcional. Em algumas aplicações, a sequência tracr tem, pelo menos, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou 99% de complementaridade de sequência ao longo do comprimento da sequência tracr mate quando idealmente alinhada.

[00364] Introdução de CRISPR/Cas em uma célula pode ser efetuada usando um ou mais vetores de acionamento de expressão de um ou mais elementos de um sistema CRISPR de modo que a expressão dos elementos da formação direta do sistema CRISPR de um complexo CRISPR em um ou mais locais alvo. Por exemplo, uma enzima Cas, uma sequência guia ligada em uma sequência tracr-mate, e uma sequência tracrRNA poderia ser cada ligada operacionalmente para separar os elementos regulatórios em vetores separados. Alternativamente, dois ou mais dos elementos expressos a partir dos mesmos elementos regulatórios ou diferentes, podem ser combinados em um vetor simples, com um ou mais vetores adicionais provendo quaisquer componentes do sistema CRISPR não incluídos no primeiro vetor. Os elementos do sistema CRISPR que são combinados em um vetor simples podem estar dispostos em qualquer orientação adequada, tal como um elemento localizado 5’ com relação a (“a montante” de) ou 3’ com relação a (“a jusante” de) um segundo elemento. A sequência de codificação de um elemento pode estar localizada no mesmo filamento ou oposto da sequência de codificação de um segundo elemento, e orientado na mesma direção ou oposta. Um promotor simples pode acionar a expressão de um transcrito que codifica uma enzima CRISPR e uma ou mais da sequência guia, sequência tracr-mate (opcionalmente ligada operacionalmente à sequência guia), e uma sequência tracrRNA incorporada dentro de uma ou mais sequências íntron (p.ex., cada em um íntron diferente, dois ou mais em pelo menos um íntron ou todos em um único íntron).

[00365] Alternativamente, de acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, o aumento da expressão do gene é afetado ao se administrar ou expressar em células alvo (p.ex. células neuróglias ou células cardíacas) um agente capaz de diminuir a expressão de um microRNA.

[00366] A regulação descendente de microRNAs pode ser efetuada em nível genômico e/ou de transcrição utilizando uma variedade de moléculas que interferem com a transcrição e/ou tradução (p.ex., agentes silenciadores de RNA, Ribozima, DNAzima e antissentido), conforme discutido acima.

[00367] Métodos de regulação descendente da expressão de microRNA são conhecidos na técnica.

[00368] Agentes de ácido nucleico que regulam de forma descendente a atividade de miR incluem, mas não estão limitados a um alvo mimético, um gene resistente a microRNA e um inibidor de miRNA.

[00369] O alvo mimético ou o alvo resistente a microRNA são essencialmente complementares ao microRNA desde que uma ou mais das seguintes incompatibilidades sejam permitidas:

[00370] (a) uma incompatibilidade entre os nucleotídeos na extremidade 5’ do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondentes no alvo mimético ou alvo resistente a microRNA; uma incompatibilidade entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 1 para a posição 9 do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondentes no alvo mimético ou um alvo resistente a microRNA; ou três incompatibilidades entre qualquer um dos nucleotídeos na posição 12 para a posição 21 do microRNA e a sequência de nucleotídeos correspondente no alvo mimético e ao alvo resistente a microRNA, desde que não existam mais de duas diferenças consecutivas.

[00371] O RNA mimético alvo é essencialmente similar ao RNA alvo, modificado para torná-lo resistente à clivagem induzida de miRNA, modificando, p.ex., a sequência de seu tal modo que uma variação é apresentada no nucleotídeo da sequência alvo, complementar aos nucleotídeos 10 ou 11 do miRNA, resultando em uma incompatibilidade.

[00372] Alternativamente, pode ser implementado um alvo resistente a microRNA. Assim, uma mutação silenciosa pode ser introduzida no local de ligação do microRNA do gene alvo, para que o DNA e as sequências de RNA resultantes sejam alteradas de uma maneira que impeça a ligação do microRNA, mas a sequência de aminoácidos da proteína seja alterada. Assim, uma nova sequência pode ser sintetizada em vez do local de ligação existente, em que a sequência de DNA é alterada, resultando em falta de ligação do miRNA ao seu alvo.

[00373] De acordo com uma aplicação específica, o mimético alvo ou alvo resistente a microRNA está ligado ao promotor naturalmente associado com o pre-miRNA, reconhecendo o gene alvo e introduzidos na célula. Desta forma, o mimético alvo de miRNA ou o alvo resistente a microRNA será expresso sob as mesmas circunstâncias que o miRNA e o mimético alvo e o alvo resistente a microRNA vai substituir o mimético/alvo resistente a microRNA não-alvo degradado pela miRNA induzida por clivagem.

[00374] Alelos miRNA não funcionais ou genes alvo miRNA resistentes também podem ser introduzidos por recombinação homóloga, substituindo os alelos miRNA de codificação ou genes-alvo sensível a miRNA.

[00375] Expressão recombinante é efetuada pela clonagem do ácido nucleico de interesse (p.ex., miRNA, gene alvo, agente silenciador, etc.) em uma estrutura da expressão de ácido nucleico sob a expressão de um promotor adequado.

[00376] Em outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, ácidos nucleicos de cadeia única são utilizados como inibidores de miRNA. Um inibidor de miRNA está tipicamente entre cerca de 17 a 25 nucleotídeos de comprimento e compreende uma sequência de 5’ a 3’ que é de, pelo menos, 90% complementar à sequência de 5’ a 3’ de um miRNA maduro. Em determinadas aplicações, uma molécula do inibidor de miRNA tem 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ou 25 nucleotídeos de comprimento ou qualquer intervalo derivável nele. Além disso, um inibidor de miRNA tem uma sequência (de 5’ a 3’) que é de, pelo menos 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 99.1, 99.2, 99.3, 99.4, 99.5, 99.6, 99.7, 99.8, 99.9 ou 100% complementares, ou qualquer intervalo derivável nele, para a sequência de 5’ a 3’ de um miRNA maduro, particularmente, um miRNA maduro e de ocorrência natural.

[00377] Em outras aplicações do presente pedido de patente de invenção, a regulação descendente do microRNA pode ser efetuada usando um polinucleotídeo anrtissentido capaz de hibridizar especificamente com um microRNA ou com um precursor respectivo.

[00378] Será apreciado que os agentes antissentido de microRNA (p.ex., oligos anti-miRNA) do presente pedido de patente de invenção também podem compreender modificações químicas, modificações moleculares e/ou a adição de porções, por exemplo, uma porção de colesterol (p.ex., antagomirs).

[00379] Os inibidores de miRNA podem ser contatados com as células utilizando técnicas de transfecção transiente. Os inibidores de miRNA estão comercialmente disponíveis a partir de empresas como a Applied Biosystems.

[00380] Alternativamente, os inibidores de miRNA podem ser parte de um vetor de expressão, como descritos acima. Neste caso, as células podem ser transfectadas transitoriamente ou de forma estável com o vetor.

[00381] De acordo com uma aplicação específica, quando a regulação compreender aumentar a expressão do gene Tph2, a modulação compreende diminuir o miR-181 e/ou miR-27.

[00382] De acordo com outra aplicação específica, é fornecido um método de regulação ascendente de um gene selecionado do grupo consistindo em polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4) em uma célula da glia, o método compreendendo: (a) a regulação descendente de uma atividade ou expressão de um miR-135 ou um precursor respectivo da referida célula da glia; e (b) a medição de uma expressão do referido gene na referida célula da glia, regulando, assim, de forma ascendente, a expressão do gene.

[00383] De acordo com uma aplicação específica, a regulação ascendente de qualquer um desses genes é efetuada por um método diferente da regulação descendente de uma atividade ou expressão de um microRNA (p.ex., miR-135) ou um precursor respectivo. Assim, a regulação ascendente de uma atividade ou expressão de um gene pode ser efetuada pela superexpressão do gene ou um alvo do mesmo.

[00384] De acordo com uma aplicação, a regulação descendente da expressão de um microRNA é efetuada pelo uso de uma sequência de ácido nucleico que liga especificamente e regula de forma descendente a expressão do gene microRNA. Uma sequência exemplar de ácido nucleico que pode ser utilizada, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, pode ser adquirida de qualquer fabricante, como por exemplo, da Genecopoeia (miArrest, inibidores baseados em vetor de microRNA).

[00385] Assim, de acordo com outra aplicação, é fornecido um polinucleotídeo isolado, compreendendo uma sequência de ácido nucléico, para regular de forma descendente uma expressão de miR-181, miR-182, miR-26, miR-27, miR-135, miR-335, miR-15 e miR-19 ou um precursor respectivo.

[00386] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-181 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 134-137 e ID SEQ. N° 154-157.

[00387] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-182 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 138-141 e ID SEQ. N° 147.

[00388] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-26 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 126-129 e ID SEQ. N° 145-146.

[00389] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-27 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 130-133 e ID SEQ. N° 152-153.

[00390] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-135 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 110-113 e ID SEQ. N° 142-143.

[00391] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-335 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 114-117 e ID SEQ. N° 144.

[00392] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-15 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 118-121 e ID SEQ. N° 150-151.

[00393] Polinucleotídeos exemplares que podem ser utilizados, em conformidade com o presente pedido de patente de invenção, para regular de forma descendente uma expressão de miR-19 incluem, mas não estão limitados a aqueles previstos nas ID SEQ. N° 122-125 e ID SEQ. N° 148-149.

[00394] Tais sequências de ácidos nucleicos podem, ainda, compreender um vetor de expressão conforme descrito em mais detalhes neste documento.

[00395] O presente pedido de patente de invenção contempla, ainda, avaliar a expressão do gene (p.ex., transcrição ou polipeptídeo) após diminuir ou aumentar o nível de microRNA na célula (p.ex., células neuróglias ou células cardíacas).

[00396] Assim, a presença e/ou nível de um gene alvo (p.ex., Slc6a4, Htr1a, MaoA, Adrb1, Adrb2, receptor CRH tipo 1, Tph2, Grm1, Grik3, Grm5, Grik2, Grm7, Gria2, Dscam, L1cam, Tsnax, Sgk,1 Stx1a, Adcyap1, Adcyap1r1, Adra2a, Ank3, Arc, Arhgap6, Atf3, Bace1, Cacna1d, Cadm3, Cplx1, Cplx2, Csmd1, Csnk1g1, Dcx, Diras2, Dlg2, Elk1, Frk, Fut9, Gabrb2, Gata3, Ghsr, Gpr3, Gria3, Grk5, Gsk3b, Hcn1, Hcn2, Impa1, Kalrn, Kcnn3, Kpna3, Myt1l, Ncoa2, Ndrg4, Nos1ap, Nr3c2, Ntng1, Nucks1, Pde1a, Pde4a, Pde8b, Plcb1, Prlr, Rab1b, Rap2a, Rorb, Sirt1, Slc12a6, Slc5a7, Sp1, Sv2b, Syne1, Syt1, Syt2, Syt3, Tgfbr2, Thrb, Trpc6, Vamp2, Wnt3 e/ou Zbed4) sequência de ácido nucleico (p.ex., transcrição) pode ser determinada utilizando um polinucleotídeo isolado (p.ex., uma sonda polinucleotídica, uma sonda/iniciador polinucleotídico(a)) capaz de se hibridizar a sequência de ácido nucléico de um gene alvo (p.ex., Slc6a4, conforme previsto em p.ex., NM_001045.4, ou uma porção respectiva; Htr1a, conforme previsto em p.ex., NM_000524.3, ou uma porção respectiva; MaoA, conforme previsto em p.ex., NM_000240.3, ou NM_001270458.1, ou uma porção respectiva; Adrb1, conforme previsto em p.ex., NM_000684.2, ou uma porção respectiva; Adrb2, conforme previsto em p.ex., NM_000024.5, ou uma porção respectiva; receptor CRH tipo 1, conforme previsto em p.ex., NM_001145146.1 e NM_001145147.1, ou uma porção respectiva; CB1 conforme previsto em p.ex., NM_001160226.1 e NM_033181.3, ou uma porção respectiva; FKBP5, conforme previsto em p.ex., NM_001145775.1 e NM_001145777.1, ou uma porção respectiva; Tph2, conforme previsto em p.ex., NM_173353.3, ou uma porção respectiva; Grm1, conforme previsto em p.ex., NM_000838.3 e NM_001114329.1, ou uma porção respectiva; Grik3, conforme previsto em p.ex., NM_000831.3, ou uma porção respectiva; Grm5, conforme previsto em p.ex., NM_000842.3 e NM_001143831.2, ou uma porção respectiva; Grik2, conforme previsto em p.ex., NM_001166247.1 e NM_021956.4, ou uma porção respectiva; Grm7, conforme previsto em p.ex., NM_000844.3 e NM_181874.2, ou uma porção respectiva; Gria2, conforme previsto em p.ex., NM_000826.3 e NM_001083619.1, ou uma porção respectiva; Dscam, conforme previsto em p.ex., NM_001389.3, ou uma porção respectiva; L1cam, conforme previsto em p.ex., NM_000425.3, NM_001143963.1 e NM_024003.2, ou uma porção respectiva; Tsnax, conforme previsto em p.ex., NM_005999.2, ou uma porção respectiva; Sgk1, conforme previsto em p.ex., NM_001143676.1, NM_001143677.1 e NM_001143678.1, ou uma porção respectiva e/ou Stx1a, conforme previsto em p.ex., NM_001165903.1, NM_004603.3, ou uma porção respectiva, Adcyap1, conforme previsto em p.ex., NM_001117.4, NM_001099733.1 ou uma porção respectiva, Adcyap1r1, conforme previsto em p.ex., NM_001118.4, NM_001199635.1, NM_001199636.1, NM_001199637.1 ou uma porção respectiva, Adra2a, conforme previsto em p.ex., NM_000681.3 ou uma porção respectiva, ANK3, conforme previsto em p.ex., NM_001149.3, NM_001204403.1, NM_001204404.1 ou NM_020987.3, ou uma porção respectiva, Arc, conforme previsto em p.ex., NM_015193.4 ou uma porção respectiva, Arhgap6, conforme previsto em p.ex., NM_001287242.1, NM_006125.2, NM_013423.2, NM_013427.2 ou uma porção respectiva, Atf3, conforme previsto em p.ex., NM_001030287.3, NM_001040619.2, NM_001206484.2, NM_001206486.2, NM_001206488.2, NM_001674.3 ou uma porção respectiva, Bace1, conforme previsto em p.ex., NM_001207048.1, NM_001207049.1, NM_012104.4, NM_138971.3, NM_138972.3, NM_138973.3 ou uma porção respectiva, Cacna1d, conforme previsto em p.ex., NM_000720.3, NM_001128839.2, NM_001128840.2 ou uma porção respectiva, Cadm3, conforme previsto em p.ex., NM_001127173.1, NM_021189.3 ou uma porção respectiva, Cplx1, conforme previsto em p.ex., NM_006651.3 ou uma porção respectiva, Cplx2, conforme previsto em p.ex., NM_001008220.1, NM_006650.3 ou uma porção respectiva, Csmd1, conforme previsto em p.ex., NM_033225.5 ou uma porção respectiva, Csnk1g1, conforme previsto em p.ex., NM_022048.3 ou uma porção respectiva, Dcx, conforme previsto em p.ex., NM_000555.3, NM_001195553.1, NM_178151.2, NM_178152.2, NM_178153.2 ou uma porção respectiva, Diras2, conforme previsto em p.ex., NM_017594.3 ou uma porção respectiva, Dlg2, conforme previsto em p.ex., NM_001142699.1, NM_001142700.1, NM_001142702.1, NM_001206769.1, NM_001364.3 ou uma porção respectiva, Elk1, conforme previsto em p.ex., NM_001114123.2, NM_001257168.1, NM_005229.4 ou uma porção respectiva, Frk, conforme previsto em p.ex., NM_002031.2 ou uma porção respectiva, Fut9, conforme previsto em p.ex., NM_006581.3 ou uma porção respectiva, Gabrb2, conforme previsto em p.ex., NM_000813.2, NM_021911.2 ou uma porção respectiva, Gata3, conforme previsto em p.ex., NM_001002295.1, NM_002051.2 ou uma porção respectiva, Ghsr, conforme previsto em p.ex., NM_004122.2, NM_198407.2 ou uma porção respectiva, Gpr3, conforme previsto em p.ex., NM_005281.3 ou uma porção respectiva, GRIA3, conforme previsto em p.ex., NM_000828.4, NM_001256743.1, NM_007325.4 ou uma porção respectiva, Grk5, conforme previsto em p.ex., NM_005308.2 ou uma porção respectiva, GSK3B, conforme previsto em p.ex., NM_001146156.1, NM_002093.3 ou uma porção respectiva, Hcn1, conforme previsto em p.ex., NM_021072.3 ou uma porção respectiva, Hcn2, conforme previsto em p.ex., NM_001194.3 ou uma porção respectiva, IMPA1, conforme previsto em p.ex., NM_001144878.1, NM_001144879.1, NM_005536.3 ou uma porção respectiva, Kalrn, conforme previsto em p.ex., NM_001024660.3, NM_003947.4, NM_007064.3, ou uma porção respectiva, KCNN3, conforme previsto em p.ex., NM_001204087.1, NM_002249.5, NM_170782.2 ou uma porção respectiva, Kpna3, conforme previsto em p.ex., NM_002267.3 ou uma porção respectiva, Myt1l, conforme previsto em p.ex., NM_015025.2 ou uma porção respectiva, Ncoa2, conforme previsto em p.ex., NM_006540.2 ou uma porção respectiva, Ndrg4, conforme previsto em p.ex., NM_020465.3, NM_022910.3, NM_001130487.1, NM_001242836.1 ou uma porção respectiva, NOS1AP, conforme previsto em p.ex., NM_001126060.1, NM_001164757.1, NM_014697.2 ou uma porção respectiva, Nr3c2, conforme previsto em p.ex., NM_000901.4, NM_001166104.1 ou uma porção respectiva, Ntng1, conforme previsto em p.ex., NM_001113226.1, NM_001113228.1, NM_014917.2 ou uma porção respectiva, Nucks1, conforme previsto em p.ex., NM_022731.4 ou uma porção respectiva, Pde1a, conforme previsto em p.ex., NM_005019.4, NM_001003683.2, NM_001258312.1 ou uma porção respectiva, Pde4a, conforme previsto em p.ex., NM_001111307.1, NM_001111308.1, NM_001111309.1 ou uma porção respectiva, Pde8b, conforme previsto em p.ex., NM_003719.3, NM_001029851.2, NM_001029852.2 ou uma porção respectiva, Plcb1, conforme previsto em p.ex., NM_015192.3, NM_182734.2 ou uma porção respectiva, Prlr, conforme previsto em p.ex., NM_000949.5, NM_001204315.1, NM_001204316.1 ou uma porção respectiva, Rab1b, conforme previsto em p.ex., NM_030981.2 ou uma porção respectiva, Rap2a, conforme previsto em p.ex., NM_021033.6 ou uma porção respectiva, Rorb, conforme previsto em p.ex., NM_006914.3 ou uma porção respectiva, Sirt1, conforme previsto em p.ex., NM_001142498.1, NM_012238.4 ou uma porção respectiva, Slc12a6, conforme previsto em p.ex., NM_133647.1, NM_005135.2, NM_001042495.1 ou uma porção respectiva, Slc5a7, conforme previsto em p.ex., NM_021815.2 ou uma porção respectiva, Sp1, conforme previsto em p.ex., NM_138473.2, NM_003109.1, NM_001251825.1 ou uma porção respectiva, Sv2b, conforme previsto em p.ex., NM_001167580.1, NM_014848.4 ou uma porção respectiva, Syne1, conforme previsto em p.ex., NM_033071.3, NM_182961.3 ou uma porção respectiva, Syt1, conforme previsto em p.ex., NM_001135805.1, NM_001135806.1, NM_005639.2 ou uma porção respectiva, Syt2, conforme previsto em p.ex., NM_001136504.1, NM_177402.4 ou uma porção respectiva, Syt3, conforme previsto em p.ex., NM_001160328.1, NM_001160329.1, NM_032298.2 ou uma porção respectiva, Tgfbr2, conforme previsto em p.ex., NM_001024847.2, NM_003242.5 ou uma porção respectiva, Thrb, conforme previsto em p.ex., NM_000461.4, NM_001128176.2, NM_001128177.1, NM_001252634.1 ou uma porção respectiva, Trpc6, conforme previsto em p.ex., NM_004621.5 ou uma porção respectiva, Vamp2, conforme previsto em p.ex., NM_014232.2 ou uma porção respectiva, Wnt3, conforme previsto em p.ex., NM_030753.4 ou uma porção respectiva e/ou Zbed4, conforme previsto em p.ex., NM_014838.2 ou uma porção respectiva). Tais polinucleotídeos podem ser de qualquer tamanho, tal como um polinucleotídeo curto (p.ex., de 15-200 bases) e polinucleotídeos intermediários (p.ex., de 200-2000 bases) ou um polinucleotídeo longo, maior que 2000 bases.

[00397] A sonda de polinucleotídeo isolado utilizada pelo presente pedido de patente de invenção pode ser de qualquer molécula de RNA, direta ou indiretamente rotulada (p.ex., oligonucleotídeo de RNA, uma molécula de RNA transcrita in vitro), molécula de DNA (p.ex., oligonucleotídeo, molécula de cDNA, molécula genômica) e/ou um análogo respectivos [p.ex., ácido nucleico peptídeo (PNA] que é específico para a transcrição do gene do RNA alvo do presente pedido de patente de invenção.

[00398] Os oligonucleotídeos projetados de acordo com os ensinamentos do presente pedido de patente de invenção podem ser gerados de acordo com qualquer método de síntese dos oligonucleotídeos conhecido na técnica, conforme descrito em detalhes abaixo.

[00399] O oligonucleotídeo do presente pedido de patente de invenção é base de pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 22, pelo menos 25, pelo menos 30 ou pelo menos 40, especificamente hibridizáveis com sequência de alterações descritas abaixo.

[00400] Os oligonucleotídeos do presente pedido de patente de invenção podem compreender a nucleosídeos heterocíclicos que consistem em purinas e as bases pirimidinas, combinadas em uma ligação fosfodiéster de 3’ a 5’.

[00401] Os oligonucleotídeos utilizados preferivelmente são aqueles modificados em uma coluna vertebral, (p.ex., coluna vertebral de açúcar- fosfato), ligações internucleosídeas e/ou bases, conforme está amplamente descrito abaixo.

[00402] O polinucleotídeo isolado utilizado pelo presente pedido de patente de invenção pode ser rotulado direta ou indiretamente utilizando uma molécula etiqueta ou rotulo. Tais rótulos podem ser, por exemplo, moléculas fluorescentes (p.ex., fluoresceína ou Texas Red), molécula radioativa (p.ex., 32P-Y-ATP ou 32P-α-ATP) e substratos cromogênicos [p.ex., Fast Red, BCIP/INT, disponível em (ABCAM, Cambridge, MA)]. A rotulagem direta pode ser conseguida conjugando covalentemente uma molécula rótulo com um polinucleotídeo (p.ex., utilizando uma síntese de fase sólida) ou incorporando através da polimerização (p.ex., utilizando uma reação de transcrição in vitro ou rotulagem primária aleatória). A selagem indireta pode ser conseguida conjugando ou incorporando covalentemente com o polinucleotídeo uma molécula-etiqueta não rotulada (p.ex. Digoxigenina ou biotina) e sujeitando subsequentemente o polinucleotídeo com uma molécula rotulada (p.ex., anticorpos anti-Digoxigenina ou estreptavidina) capaz de reconhecer especificamente a etiqueta não rotulada.

[00403] Os polinucleotídeos supracitados podem ser empregados em uma variedade de métodos de detecção de RNA, tais como a análise Northern Blot, transcrição reversa PCR (RT-PCR) [p.ex., um RT-PCR semi- quantitativo, RT-PCR quantitativo utilizando, por exemplo, o Light CyclerTM (Roche)], hibridização do RNA in situ (RNA-ISH), mancha do RT-PCR in situ [p.ex., conforme descrito em Nuovo GJ, et al. 1993, Intracelular localization of polymerase chain reaction (PCR)-amplified hepatitis C cDNA. Am J Surg Pathol. 17: 68390, e Komminoth P, et al. 1994, Evaluation of methods for hepatitis C virus detection in archival liver biopsies. Comparison of histology, immunohistochemistry, in situ hybridization, reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) e in situ RT-PCR. Pathol Res Pract., 190: 1017-25] e análise de microarranjos dos oligonucleotídeos [p.ex., utilizando o microarranjo Affymetrix (Affymetrix®, Santa Clara, CA)].

[00404] A presença e/ou nível da sequência de aminoácidos (p.ex., proteína) do gene alvo (p.ex., Slc6a4, Htr1a, MaoA, Adrb1, Adrb2, receptor CRH tipo 1, CB1, FKBP5, Tph2, Grm1, Grik3, Grm5, Grik2, Grm7, Gria2, Dscam, L1cam, Tsnax, Sgk,1 Stx1a, Adcyap1, Adcyap1r1, Adra2a, Ank3, Arc, Arhgap6, Atf3, Bace1, Cacna1d, Cadm3, Cplx1, Cplx2, Csmd1, Csnk1g1, Dcx, Diras2, Dlg2, Elk1, Frk, Fut9, Gabrb2, Gata3, Ghsr, Gpr3, Gria3, Grk5, Gsk3b, Hcn1, Hcn2, Impa1, Kalrn, Kcnn3, Kpna3, Myt1l, Ncoa2, Ndrg4, Nos1ap, Nr3c2, Ntng1, Nucks1, Pde1a, Pde4a, Pde8b, Plcb1, Prlr, Rab1b, Rap2a, Rorb, Sirt1, Slc12a6, Slc5a7, Sp1, Sv2b, Syne1, Syt1, Syt2, Syt3, Tgfbr2, Thrb, Trpc6, Vamp2, Wnt3 e/ou Zbed4) pode ser determinado utilizando, por exemplo, um anticorpo específico através da formação de um imunocomplexo [ou seja, um complexo formado entre o gene alvo antígeno (uma sequência de aminoácidos) presente na amostra biológica e o anticorpo específico].

[00405] O imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção pode ser formado em uma variedade de temperaturas, concentrações salinas e valores de pH que podem variar dependendo do método e da amostra biológica utilizados e os especialistas na técnica são capazes de ajustar as condições adequadas para a formação de cada imunocomplexo.

[00406] O termo “anticorpo” conforme utilizado neste pedido de patente de invenção inclui as moléculas intactas bem como os fragmentos funcionais da mesma, como Fab, F(ab’)2, Fv ou moléculas de domínio simples como o VH e o VL para um epitopo de um antígeno. Estes fragmentos de anticorpos funcionais são definidos a seguir: (1) Fab, o fragmento que contém um fragmento de ligação antigênica monovalente de uma molécula de anticorpo, pode ser produzido por digestão de anticorpo completo com a enzima da papaína para a produção de uma cadeia leve intacta e uma parte de uma cadeia pesada; (2) Fab’, o fragmento de uma molécula de anticorpo que pode ser obtida tratando todo o anticorpo com pepsina, seguido da redução, para a produção de uma cadeia leve intacta e uma parte da cadeia pesada, os fragmentos Fab’ são obtidos por moléculas de anticorpo; (3) (Fab’)2, o fragmento do anticorpo que pode ser obtido tratando todo o anticorpo com a enzima de pepsina sem a redução subsequente; F(ab’)2 é um dímero de dois fragmentos Fab’ retidos juntos por duas ligações de dissulfetos, (4) Fv, definido como um fragmento da engenharia genética contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada expressada como duas cadeias; (5) Anticorpos de cadeia simples (“SCA”), uma molécula geneticamente modificada contendo a região variável da cadeia leve e a região variável da cadeia pesada, ligada ao ligante de polipepirida adequado como uma molécula de cadeia simples geneticamente fundida, e (6) Anticorpos de domínio simples são compostos de um VH simples ou de domínios VL que apresentam afinidade suficiente com o antígeno.

[00407] Os métodos de produção de anticorpos policlonais e monoclonais, bem como os fragmentos do mesmo são amplamente conhecidos na técnica (Vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: Um Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988, incorporado aqui com referência).

[00408] Os fragmentos de anticorpos de acordo com o presente pedido de patente de invenção podem ser preparados por hidrólise proteolítica do anticorpo ou por expressão em E. coli ou células de mamíferos (p.ex., cultura de células do ovário de hamsters chineses ou outros sistemas de expressão de proteínas) do DNA codificando o fragmento. Os fragmentos de anticorpos podem ser obtidos por digestão de pepsina ou papaína dos anticorpos totais através de métodos convencionais. Por exemplo, os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina para fornecer um fragmento 5S denotado F(ab’)2. Este fragmento pode ser adicionalmente clivado utilizando um agente redutor de tiol, e opcionalmente um grupo bloqueador para grupos sulfidrila resultantes da clivagem de ligações de dissulfureto, para produzir fragmentos 3.5S Fab’ monovalentes. Alternativamente, uma clivagem enzimática utilizando pepsina produz dois fragmentos Fab’ monovalentes e um fragmento Fc diretamente. Estes métodos são descritos, por exemplo, por Goldenberg, Patente Americana Nos. 4,036,945 e 4,331,647, e referências contidas no mesmo, cujas patentes estão aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Vide também Porter, R. R. [Biochem. J. 73: 119126 (1959)]. Outros métodos de clivagem de anticorpos, tais como a separação das cadeias pesadas para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalente, a clivagem adicional de fragmentos, ou outras técnicas enzimáticas, químicas ou genéticas também podem ser usadas uma vez que os fragmentos unem o antígeno que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

[00409] Os fragmentos Fv compreendem a uma associação de cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente conforme descrito em Inbar et al. [Proc. Nat’l Acad. Sci. EUA 69:2659-62 (19720]. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfeto intermolecular ou reticuladas por agentes químicos como o glutaraldeído. Preferivelmente, os fragmentos Fv compreendem às cadeias VH e VL conectadas por um ligante peptídeo. Estas proteínas de ligação antígena de cadeia simples (scFv) são preparadas construindo um gene estrutural compreendendo às sequências de DNA codificando os domínios VH e VL conectados por um oligonucleotídeo. O gene estrutural é inserido dentro de um vetor de expressão, que é subsequentemente introduzido dentro de uma célula hospedeira como a E- coli. A célula hospedeira recombinante sintetiza uma cadeia de polipeptídeo simples com um peptídeo vinculador ligando os dois domínios V. Métodos para a produção de scFvs são descritos, por exemplo, por Whitlow e Filpula, Methods 2: 97-105 (1991); Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Pack et al., Bio/Technology 11:1271-77 (1993); e Patente Americana No. 4,946,778, incorporados aqui por referência em sua totalidade.

[00410] Outra forma de um fragmento de anticorpo é uma codificação de peptídeo para uma região determinante de complementaridade (CDR | complementarity-determining region). Peptídeos CDR (“unidades de reconhecimento mínimo”) podem ser obtidos através da estrutura de genes codificando o CDR de um anticorpo de interesse. Tais genes são preparados, por exemplo, utilizando a reação em cadeia de polimerase para sintetizar a região variável a partir do RNA das células de produção de anticorpos. Vide, por exemplo, Larrick e Fry [Methods, 2: 106-10 (1991)].

[00411] Os anticorpos também podem ser produzidos utilizando várias técnicas conhecidas na técnica, incluindo as bibliotecas de apresentação em fagos [Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)]. As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação dos anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) e Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. Similarmente, os anticorpos humanos podem ser produzidos através da introdução de loci de imunoglobulina humana em animais transgênicos, por exemplo, ratos em que os genes de imunoglobulina endógena foram parcial ou completamente inativados. Mediante o estímulo, a produção de anticorpos humanos é observada, o que se assemelha bastante àqueles vistos em humanos em todos os aspectos, incluindo o rearranjo dos genes, as montagens, e o repertório do anticorpo. Esta abordagem é descrita, por exemplo, na Patente Americana Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, e na seguinte publicação cientifica: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13, 65-93 (1995).

[00412] Exemplos de anticorpos que podem ser utilizados de acordo com o presente pedido de patente de invenção incluem, por exemplo, anticorpos anti-Slc6a4 disponíveis, por exemplo, a partir da Empresa Abnova, Abgent e MBL Internacional; anticorpos anti-Htr1a disponíveis, por exemplo, a partir da Novus Biologicals, Acris Antibodies GmbH e Abnova anticorpos anti-MaoA anticorpos disponíveis, por exemplo, da Abnova Corporation, Proteintech Group, Inc. e Abgent; anti-Adrb1 anticorpos disponíveis, por exemplo, da Biorbyt, Abgent e anticorpos em linha; anti-Adrb2 anticorpos disponíveis, por exemplo, da Tocris Bioscience, Abnova Corporation e anticorpos em linha; anti-CRH receptor tipo 1 do anticorpo disponível, por exemplo, do MyBioSource.com, Abcam e Novus Biologicals; anticorpos anti- CB1 disponíveis, por exemplo, de Santa Cruz Biotechnology, Inc. e Epitomics, Inc.; anticorpos anti-FKBP5 disponíveis, por exemplo, de BD Biosciences e Abnova Corporation; anticorpos anti-Tph2 disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals e Acris Antibodies GmbH; anticorpos anti- Grm1 disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals a Biorbyt; anticorpos anti-Grik3 disponíveis, por exemplo, de Acris Antibodies GmbH e Atlas Antibodies; anticorpos anti-Grm5 disponíveis, por exemplo, de Biorbyt and Acris Antibodies GmbH; anti-Grik2 disponíveis, por exemplo, de Proteintech Group, Inc., Aviva Systems Biology e Abgent; anticorpos anti-Grm7 disponíveis, por exemplo, de Acris Antibodies GmbH e anticorpos em linha; anticorpos anti-Gria2 disponíveis, por exemplo, de Proteintech Group, Inc. e Abnova Corporation; anticorpos anti-Dscam disponíveis, por exemplo, de Novus Biologicals e R&D Systems; anticorpos anti-L1cam disponíveis, por exemplo, de GeneTex, Novus Biologicals e Acris Antibodies GmbH; anticorpos anti-Tsnax disponíveis, por exemplo, de BD Biosciences e GenWay BioEmpresatech, Inc.; anticorpos anti-Sgk1 disponíveis, por exemplo, de Epitomics, Inc. e Acris Antibodies GmbH; e/ou anticorpos anti- Stx1a disponíveis, por exemplo, de MBL International e Spring Bioscience.

[00413] Vários métodos podem ser utilizados para detectar a formação do imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção e os especialistas na técnica são capazes de determinar qual método é adequado para cada imunocomplexo e/ou o tipo de células usadas para o diagnóstico.

[00414] O anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htr1a; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrb1; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Cb1; anticorpo anti- FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grm1; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti-Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-L1cam; anticorpo anti- Tsnax; anticorpo anti-Sgk1 e/ou anticorpo anti-Stx1a) utilizado no imunocomplexo do presente pedido de patente de invenção pode ser rotulado utilizando os métodos conhecidos na técnica. Deve-se observar que os anticorpos rotulados possam ser tanto anticorpos primários (ou seja, que se unem ao antígeno específico, por exemplo, um antígeno específico de gene) ou anticorpos secundários (p.ex., anticorpos de coelho e cabra marcados, anticorpo de rato marcado anti-humano) que unem os anticorpos primários. O anticorpo pode ser diretamente conjugado com um rótulo ou podem ser conjugados com uma enzima.

[00415] Os anticorpos do presente pedido de patente de invenção podem ser rotulados de forma fluorescente (utilizando uma tinta fluorescente para um anticorpo), radiorrotulado (utilizando anticorpos radiorrotulados, por exemplo, 125I), ou conjugados com uma enzima (p.ex., peroxidase de rábano ou fosfatase alcalina) e utilizado juntamente com um substrato cromogênico para produzir uma reação colorimétrica. Os substratos cromogênicos utilizados pelos anticorpos conjugados por enzima do presente pedido de patente de invenção incluem, porém não são limitados a, AEC, Fast red, substrato ELF-97 [2-(5’-cloro-2-fosforiloxifenil)-6-cloro-4 (3H)- quinazolinona], fosfato de p-nitrofenila (PNPP), difosfato de fenolftaleína, e fosfato ELF-39 , BCIP / INT, Vector Red (VR), salmão e fosfato magenta (Avivi C., et al., 1994, J Histochem. Cytochem. 1994; 42: 551-4) para a enzima fosfatase alcalina e Nova Red, diaminobenzidina (DAB), vetor (R) SG substrato, substrato quimioluminescente à base de luminol pela enzima peroxidase. Estes substratos enzimáticos estão disponíveis no mercado na Sigma (St. Louis, MO, USA), Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, EUA), Vector Laboratories Inc. (Burlingame, CA, USA), Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA, USA), Dako Cytomation (Denmark).

[00416] A detecção do imunocomplexo em uma amostra biológica, como amostras de sangue ou de soro, que podem conter polipeptídeos de gene alvo solúveis (p.ex., secretados, derramados) pode ser realizada utilizando a seleção de células ativadas por fluorescência [FACS 1 fluorescence activated cell sorting], enzimas ligadas ao ensaio imunoabsorvente [ELISA 1 enzyme linked immunosorbent assay], análises Western blot e radioimunoensaio [RIA 1 Western blot and radio-immunoasssay], imunoprecipitação [IP 1 immunoprecipitation] ou através de uma abordagem com base no peso molecular.

[00417] Para o Western bolt, as proteínas são extraídas a partir de uma amostra celular e são submetidas a eletroforese (p.ex., SDS-PAGE) e borradas para uma membrana (p.ex., nylon ou PVDF). A membrana é, então, interagida com um anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htr1a; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrb1; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Cb1; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grm1; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti-Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-L1cam; anticorpo anti- Tsnax; anticorpo anti-Sgk1 e/ou anticorpo anti-Stx1a) que pode ser tanto rotulado ou adicionalmente submetido a um anticorpo rotulado secundariamente. A detecção pode ser por autorradiografia, reação colorimétrica ou quimiluminescência. Este método permite tanto a quantificação de uma quantidade de substratos quanto a determinação de sua identidade através de uma posição relativa na membrana que é indicativa de uma migração de distância em um gel de acrilamida durante a electroforese.

[00418] No caso de a concentração do antígeno na amostra biológica ser baixa, a detecção do antígeno (sequência de aminoácidos do gene alvo) pode ser realizada por imunoprecipitação (IP). Para a análise da imunoprecipitação, o anticorpo específico (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htr1a; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrb1; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Cb1; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grm1; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti-Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-L1cam; anticorpo anti- Tsnax; anticorpo anti-Sgk1 e/ou anticorpo anti-Stx1a) pode interagir diretamente com uma amostra (p.ex., lisado celular) incluindo o polipeptídeo do gene alvo e o complexo formado pode ser detectado ainda utilizando um anticorpo secundário conjugado com os rebordos (p.ex., se o anticorpo específico é um anticorpo monoclonal de rato, o anticorpo secundário pode ser um anticorpo antirrato conjugado para, por exemplo, os rebordos Sefarose). Os rebordos podem ser, então, precipitados por centrifugação, seguindo quais proteínas precipitadas (p.ex., polipeptídeo do gene alvo e anticorpos específicos) podem ser separadas dos rebordos (p.ex., utilizando a desnaturação em 95 °C) e ainda submetidas à análise Western blot utilizando anticorpos. Como alternativa, o anticorpo específico e o anticorpo secundário conjugado ao rebordo podem ser adicionados à amostra biológica contendo o antígeno (polipeptídeo do gene alvo) para formar assim um imunocomplexo. Alternativamente, se o polipeptídeo do gene alvo for uma proteína altamente glicosilada, pode ser também precipitado utilizando um substrato capaz ligar peptídeos glicosilados como o Concavalin A (GE Healthcare Bio-Sciences, Uppsala, Suécia) que pode também ser conjugado ao rebordo, seguido por anticorpos específicos da análise Western blot conforme descrito acima.

[00419] A análise FACS permite a detecção dos antígenos presentes nas membranas da célula. Em suma, os anticorpos específicos, conforme descrito acima, são ligados à fluoróforos e a detecção é realizada por meio de uma máquina de classificação celular que lê o comprimento de ondas de luz emitido de cada célula conforme esta passa através do facho de luz. Este método pode empregar dois ou mais anticorpos simultaneamente.

[00420] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando o ELISA. Em suma, uma amostra contendo o antígeno do gene alvo é fixada a uma superfície tal como um poço de uma placa de microtitulação. Um anticorpo específico antígeno (p.ex., anticorpo anti-Slc6a4; anticorpo anti-Htr1a; anticorpo anti-MoaA; anticorpo anti-Adrb1; anticorpo anti-Adrb2; anticorpo receptor anti-CRH tipo 1; anticorpo anti-Cb1; anticorpo anti-FKBP5; anticorpo anti-Tph2; anticorpo anti-Grm1; anticorpo anti-Grik3; anticorpo anti-Grm5; anticorpo anti-Grik2; anticorpo anti-Grm7; anticorpo anti-Gria2; anticorpo anti-Dscam; anticorpo anti-L1cam; anticorpo anti-Tsnax; anticorpo anti-Sgk1 e/ou anticorpo anti-Stx1a) acoplado a uma enzima é aplicado e permitido para ligar-se ao antígeno. A presença de um anticorpo é então detectada e quantificada por uma reação colorimétrica empregando a enzima acoplada ao anticorpo. As enzimas comumente empregadas neste método incluem a peroxidase de rábano e fosfatase alcalina. Se bem calibrada e dentro da faixa linear de resposta, a quantidade de substrato presente na amostra é proporcional à quantidade de coloração produzida. Um substrato padrão é geralmente empregado para aprimorar a efetividade quantitativa.

[00421] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando o rádioimunoensaio (RIA | radioimmunoassay). Em uma versão, este método envolve a precipitação do antígeno desejado (polipeptídeo do gene alvo) com um anticorpo específico e anticorpo radiorrotulado ligado à proteína (p.ex., proteína A rotulada com I125) imobilizado em uma carreira precipitável como rebordos de agarose. O número de contagens nos grânulos precipitados é proporcional à quantidade de antígenos.

[00422] Em uma versão alternativa do RIA, um antígeno rotulado e um anticorpo não rotulado ligado à proteína são empregados. Uma amostra contendo uma quantidade desconhecida de antígeno é adicionada em quantidades variantes. A queda nas contagens de precipitados a partir do antígeno rotulado é proporcional à quantidade de antígeno na amostra adicionada.

[00423] A presença e/ou nível de polipeptídeo do gene alvo também pode ser determinado utilizando a abordagem com base no peso molecular. Uma vez que o imunocomplexo apresenta um peso molecular mais alto do que seus componentes, os métodos capazes de detectar tal alteração no peso molecular podem também ser empregados. Por exemplo, o imunocomplexo pode ser detectado através de arranjo de retardação do gel. Em suma, um gel de acrilamida não desnaturante é carregado com amostras. Uma alteração no tamanho (peso molecular) do produto proteína como comparado com seus componentes é indicativo da presença de um imunocomplexo. Tal alteração para um peso molecular mais alto pode ser visualizado utilizando uma coloração de proteína não específico, tal como uma mancha prateada ou uma mancha azul Commassie.

[00424] A detecção in situ do polipeptídeo do gene alvo em uma amostra biológica como uma seção de tecido (p.ex., incluído em parafina ou criocorte) pode ser realizada utilizando os métodos de coloração imunológicos que detectam a ligação de anticorpos nas células in situ. Exemplos e procedimentos de manchas imunológicas incluem, mas não se limitam a, imunohistoquímica marcada por fluorescência (utilizando uma tinta flourescente conjugada com um anticorpo), imunohistoquímica radiorrotulada (utilizando anticorpos radiorrotulados, por exemplo, 125I), e imunocitoquímica [usando uma enzima (p.ex., horseradish peroxidase ou fosfatase alcalina) e um substrato cromogênico para produzir uma reação colorimétrica]. Deve-se observar que as enzimas conjugadas com os anticorpos possam utilizar vários substratos cromogênicos conforme descrito abaixo.

[00425] Preferivelmente, a coloração imunológica utilizada pelo presente pedido de patente de invenção é imunohistoquímica e/ou imunocitoquímica.

[00426] A coloração imunológica é preferivelmente seguida pela contracoloração das células utilizando uma tinta que se une aos compartimentos da célula não coloridas. Por exemplo, se o anticorpo rotulado se une aos antígenos presentes no citoplasma da célula, uma mancha nuclear (p.ex., coloração Hematoxilina-Eosina) é um contracoloração apropriado.

[00427] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Tph2 seguindo a baixa regulação do miR- 181 e/ou do miR-27.

[00428] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Slc6a4 seguindo a alta regulação do miR- 135 e/ou do miR-335.

[00429] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Htr1a seguindo a alta regulação do miR- 135, miR-335, miR-181, miR-182 e/ou miR-26.

[00430] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene MaoA seguindo a alta regulação do miR- 27.

[00431] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene Adrb1 seguindo a alta regulação do miR- 19.

[00432] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene CB1 seguindo a alta regulação do CB1.

[00433] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene receptor CRH tipo 1 seguindo a alta regulação do miR-15.

[00434] De acordo com uma aplicação, o método compreende a medição de uma expressão do gene FKBP% seguindo a alta regulação do miR-15.

[00435] Conforme mencionado anterior-mente, os presentes inventores ainda perceberam que o nível de miR-135 é significativamente regulado de forma descendente nas amostras de sangue dos seres humanos que sofrem de transtornos de humor incluindo depressão, ansiedade, transtorno bipolar e estresse (conforme comparado aos seres humanos saudáveis) e é regulado de forma ascendente nas amostras de sangue de seres humanos que são tratados com uma terapia antidepressiva (conforme comparado ao mesmo indivíduo antes do início do tratamento ou indivíduos humanos não tratados).

[00436] Assim, é fornecido um método de diagnóstico de um transtorno de humor em um indivíduo humano em necessidade respectiva, o método compreendendo medir um nível de expressão de um miR-135 em uma amostra biológica do indivíduo humano, em que um nível de expressão inferior do miR-135, conforme comparado àquele em uma amostra biológica de um indivíduo saudável, é indicativo do transtorno de humor.

[00437] Qualquer transtorno de humor pode ser diagnosticado de acordo com o presente pedido de patente de invenção, incluindo, não se limitando a, um transtorno bipolar, uma depressão, uma depressão profunda, uma ansiedade, um estresse, uma fadiga, uma função cognitiva prejudicada, um ataque de pânico, um comportamento compulsivo, um vício, uma fobia social, uma esquizofrenia, um transtorno do sono e um transtorno alimentar (p.ex., Anorexia nervosa, Bulimia nervosa, Transtornos alimentares Não Especificados de Outra Maneira, Transtorno de compulsão alimentar (BED|binge eating disorder) ou Transtorno alimentar pica).

[00438] A medição do nível de expressão de miR-135 (p.ex., miR- 135a) é tipicamente efetuada em uma amostra biológica.

[00439] De acordo com uma aplicação específica, o termo “amostra biológica” refere-se a fluidos corporais como sangue total fresco, sangue total fracionado, plasma do sangue, soro do plasma, fluido cerebroespinhal (CSF | cerebrospinal fluid), urina, fluidos linfáticos e várias secreções externas dos tratos respiratório, intestinal e geniturinário, lágrimas, saliva, leite, bem como células brancas do sangue incluindo células mononucleares (p.ex., linfócitos, monócitos, células dendríticas).

[00440] Tipicamente, sangue total e sangue total fracionado (isto é, amostra de sangue fracionador, por exemplo, por centrifugação, em componentes separados) compreendem todos os componentes do sangue incluindo plasma sanguíneo, leucócitos, plaquetas e eritrócitos. O soro do sangue é o componente do sangue que não é nem uma célula sanguínea nem um fator de coagulação, está no plasma sanguíneo com os fibrinogênios removidos. O soro inclui proteínas não utilizadas na coagulação do sangue (coagulação) e os eletrólitos, anticorpos, antígenos, hormônios e quaisquer substâncias exógenas (p.ex., fármacos e micro-organismos). Além disso, o plasma sanguíneo compreende todos os componentes do soro junto dos fatores de coagulação.

[00441] De acordo com uma aplicação específica, a amostra biológica é uma amostra de sangue total.

[00442] De acordo com uma aplicação específica, a amostra biológica é uma amostra de soro ou plasma.

[00443] De acordo com uma aplicação específica, a amostra biológica é uma amostra de célula mononuclear.

[00444] De acordo com uma aplicação específica, a amostra de célula é desprovida de eritrócitos.

[00445] De acordo com uma aplicação específica, a amostra biológica é pelo menos 90% de leucócitos (p.ex., pelo menos 90% de células mononucleares).

[00446] A medição de um nível de expressão de um miR-135 pode ser realizada por qualquer método conhecido de um especialista com habilidade comum na técnica, como, por exemplo, por análise northern blot, ensaio de proteção RNase, e PCR (p.ex., PCR em tempo real).

[00447] Conforme mencionado, um nível de expressão inferior do miR-135 conforme comparado àquele em uma amostra biológica de um indivíduo humano saudável (isto é, um indivíduo que não é afetado por um transtorno de humor) é indicativo do transtorno de humor.

[00448] De acordo com uma aplicação, um nível de expressão inferior do miR-135 conforme comparado àquele em uma amostra biológica de um indivíduo humano saudável é estatisticamente significativo.

[00449] O nível de expressão de miR-135 em um indivíduo humano que tem um transtorno de humor pode ser inferior por cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100% como comparado àquele de um indivíduo humano saudável.

[00450] O diagnóstico pode ser avaliado, ainda, e estabelecido usando métodos de padrão Ouro. Tipicamente, ao menos um de um histórico médico completo do paciente, avaliação física e avaliação total dos sintomas ajuda a determinar o transtorno (transtorno de humor incluindo depressão ou transtorno bipolar). Os questionários padronizados podem ser úteis para o diagnóstico de depressão, tais como Escala de Avaliação de Hamilton para Depressão e o Inventário de Depressão de Beck.

[00451] O diagnóstico de transtorno bipolar pode ser avaliado, ainda, usando critérios típicos. Os critérios mais amplamente utilizados para diagnóstico de transtorno bipolar são o Diagnóstico da Associação Psiquiátrica Americana e Manual Estatístico de Transtornos Mentais (p.ex., versão DSM-IV-TR), e a Classificação de Doenças e Problemas Relacionados à Saúde Estatística Internacional da Organização Mundial de Saúde World Health (p.ex., ICD-10).

[00452] Além disso, os testes podem ser realizados para excluir doenças médicas tais como hipo- ou hipertireoidismo, perturbação metabólica, uma infecção sistêmica ou doença crônica e sífilis ou infecção por HIV. Um EEG pode ser utilizado para excluir epilepsia e uma tomografia da cabeça pode excluir lesões cerebrais.

[00453] Os presentes inventores mostraram, ainda, que os níveis sanguíneos de miR-135 (p.ex., miR-135a) são regulados de forma ascendente nos seres humanos após uma terapia com antidepressivo (veja o Exemplo 16 da seção Exemplos que segue).

[00454] Assim, de acordo com outra aplicação do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de monitoramento de tratamento de um fármaco antidepressivo ou um medicamento para tratamento de um transtorno de humor (p.ex., transtorno bipolar), o método compreendendo: (a) tratar um indivíduo humano em necessidade respectiva com um fármaco antidepressivo ou um medicamento para tratamento de um transtorno de humor; e (b) medir um nível de expressão de um miR-135 em uma amostra biológica do indivíduo humano antes ou depois do tratamento, em que um nível de expressão mais elevado do miR-135 após o tratamento pelo fármaco antidepressivo ou pelo medicamento para tratamento do transtorno de humor conforme comparado ao nível de expressão do miR-135 antes do tratamento pelo fármaco antidepressivo ou pelo medicamento para tratamento do transtorno de humor é indicativo do tratamento eficaz.

[00455] De acordo com uma aplicação, o método compreende, ainda, (c) tratar o indivíduo humano quando um nível de expressão mais elevado do miR-135 é observado na etapa (b) para melhorar o tratamento.

[00456] A amostra biológica (p.ex., sangue total fresco, sangue total fracionador, plasma sanguíneo ou soro do sangue) é tipicamente obtida do indivíduo humano seguindo para tratamento com um fármaco antidepressivo ou com um medicamento para tratamento de um transtorno de humor, entretanto, uma amostra de sangue também pode ser obtida do indivíduo antes do tratamento para outra comparação dos níveis de miR-135.

[00457] De acordo com uma aplicação específica, miR-135 compreende miR-135a.

[00458] Conforme utilizado aqui, o termo “droga antidepressiva” refere-se a qualquer medicamento utilizado para aliviar os distúrbios de humor, tal como a depressão agudo e a distimia, e os distúrbios de ansiedade, tais como os distúrbios de ansiedade social. Como exemplo de drogas antidepressivas incluem, mas não limitam-se a, inibidores seletivos de recaptação de serotonina (SSRIs, tais como Citalopram, Escitalopram, Fluoxetina, Fluvoxamina, Paroxetina e Sertralina); Inibidores seletivos de recaptação de serotonina-norepinefrina (SNRis, como Desvenlafaxina, Duloxetina, Milnacipran e Venlafaxina); Noradrenergico e antidepressivos serotonérgico específicos (como Mianserina e Mirtazapina); Norepinefrina (noradrenalina) inibidores de recaptação (NRIs, como Automoxetina, Mazindol, Reboxetina e Viloxazina); Inibidores de recaptação de dopamina norepinefrina (como o Bupropion); Seletores de recaptação de serotonina seletiva (como Tianeptina); Desinibidores de dopamina norepinefrina (NDDIs, como Agomelatina); Antidepressivos tricíclicos (incluindo os Antidepressivos tricíclicos de amina terciária e Antidepressivo tricíclico de amina secundária); e Inibidor da monoamina oxidase (MAOIs|).

[00459] De acordo com uma aplicação, a droga antidepressiva compreende inibidores de recaptação de serotonina seletiva (SSRI), antidepressivos tricíclicos ou inibidores de recaptação de noradrenalina (NRI).

[00460] De acordo com uma aplicação específica, a droga antidepressiva compreende inibidores de recaptação de serotonina seletiva (SSRI).

[00461] Conforme utilizado neste documento, o termo “um medicamento para tratamento de um transtorno de humor” refere-se a qualquer medicamento ou qualquer combinação de medicamentos utilizados para tratamento de um transtorno de humor incluindo transtorno bipolar. Medicamentos exemplares incluem, mas não se limitam a, lítio (p.ex., carbonato de Lítio, citrato de Lítio, sulfato de Lítio), medicamentos antipsicóticos (p.ex., antipsicóticos típicos e antipsicóticos atípicos, conforme detalhado anteriormente) e medicamentos estabilizadores do humor (p.ex., Ácido valproico (VPA, Valproato), minerais, anticonvulsivos, antipsicóticos, conforme detalhado anteriormente).

[00462] Outras opções de tratamento que estão englobadas pelos presentes métodos (sozinhos ou em combinação com o acima) incluem estratégias terapêuticas não farmacêuticas, incluindo, mas não se limitam a, psicologia clínica, terapia eletroconvulsiva, internação involuntária, terapia de luz, psicoterapia, estímulo magnético transcraniano e terapia cognitivo- comportamental.

[00463] Um tratamento de transtorno de humor/antidepressivo eficiente é determinado quando um nível significativamente alto da expressão do miR-135 é obtido na sequência do tratamento, conforme comparado ao nível de expressão miR-135 anterior ao tratamento.

[00464] O nível de expressão de miR-135 em um indivíduo após tratamento pode ser maior que cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 100%, conforme comparado com aquele do indivíduo antes do tratamento antidepressivo ou de transtorno de humor.

[00465] Monitorar o tratamento pode também ser efetivo avaliando o bem-estar do paciente, e adicionalmente ou alternativamente, submetendo o sujeito à testes comportamentais, MRI ou qualquer outro método conhecido por um especialista na técnica.

[00466] Espera-se que durante a vida de uma patente em amadurecimento a partir desta aplicação muitos inibidores relevantes de miRNAs ou alternativamente as modificações Mirna serão desenvolvidas e espera-se que o escopo do termo microRNAs inclua toda estas novas tecnologias a priori.

[00467] Conforme utilizado aqui o termo “cerca de” refere-se a ± 10%.

[00468] Os termos “compreende”, “compreendendo”, “inclui”, “incluindo”, “tendo” e suas conjugações derivadas significam “incluindo, mas não limitado a”.

[00469] O termo “consistindo de” significa “incluindo e limitado a”.

[00470] O termo “consistindo essencialmente em” significa que a composição, método ou estrutura podem incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, porém somente se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alterarem materialmente as características básicas e recentes da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00471] Conforme utilizado aqui, a forma singular “um”, “uma” e “o, a” incluem referências plurais salvo se o contexto indicar claramente em contrário. Por exemplo, o termo “um composto” ou “pelo menos um composto” pode incluir uma variedade de compostos, incluindo as misturas do mesmo.

[00472] Ao longo deste pedido, várias aplicações deste pedido de patente de invenção podem estar presentes em um formato de leque. Deve-se entender que a descrição no formato de leque é meramente para a conveniência e brevidade e não deve ser construído como uma limitação inflexível no escopo do presente pedido de patente de invenção. Por conseguinte, a descrição de um leque deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todas as possíveis subgamas, bem como os valores numéricos individuais dentro de tal leque. Por exemplo, a descrição de uma faixa, tal como de 1 a 6, deve ser considerada como tendo divulgado especialmente subgamas como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., bem como números individuais dentro daquela faixa, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independentemente da amplitude da faixa.

[00473] Sempre que uma faixa numérica é indicada aqui tem a intenção de incluir qualquer numeral citado (fração ou integral) dentro da faixa indicada. As frases “oscilando/oscila entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “oscilando/oscila de” um primeiro número indicado “para” um segundo número indicado são utilizados aqui de forma intercambiável e tem a intenção de incluir o primeiro e o segundo números indicados e todos os numerais fracionados e integrais entre eles.

[00474] Conforme utilizado aqui, o termo “método” refere-se às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para o alcance de uma dada tarefa incluindo, mas não limitada àquelas maneiras, meios, técnicas e procedimentos sejam conhecidos ou recém-desenvolvidos a partir das maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos pelos praticantes das artes química, farmacológica, biológica, bioquímica e médica.

[00475] Aprecia-se que certos recursos do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de esclarecimento, descritos no contexto das aplicações separadas, podem também ser fornecidos em combinação em uma aplicação simples. Inversamente, vários recursos do presente pedido de patente de invenção, que são, para fins de simplificação, descritos no contexto de uma aplicação simples, podem também ser fornecidos separadamente ou em qualquer subcombinação adequada ou conforme adequado em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Certos recursos descritos no contexto de várias aplicações não têm que ser considerados como recursos essenciais daquelas aplicações, salvo se a aplicação estiver inoperante sem tais elementos.

[00476] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção conforme delineado abaixo e conforme reivindicado na seção das reivindicações abaixo encontram suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[00477] É feita agora referência aos seguintes exemplos, que juntamente com as descrições acima ilustram o presente pedido de patente de invenção de forma não limitante.

[00478] De modo geral, a nomenclatura utilizada aqui e os procedimentos laboratoriais utilizados no presente pedido de patente de invenção incluem técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e DNA recombinantes. Tais técnicas são extensivamente exploradas na literatura. Vide, por exemplo, “Molecular Cloning: A laboratory Manual” Sambrook et al., (1989); “Current Protocols in Molecular Biology” Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., “Current Protocols in Molecular Biology”, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, “A Practical Guide to Molecular Cloning”, John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., “Recombinant DNA”, Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) “Genome Analysis: A Laboratory Manual Series”, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias, conforme estabelecidas na Patentes Norte-Americanas N°. 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; “Cell Biology: A Laboratory Handbook”, Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); “Current Protocols in Immunology” Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), “Basic and Clinical Immunology” (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), “Selected Methods in Cellular Immunology”, W. H. Freeman and Co., Nova Iorque (1980); imunoensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e na literatura científica; vide, por exemplo, as Patentes Norte-Americanas N°. 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; “Oligonucleotide Synthesis” Gait, M. J., ed. (1984); “Nucleic Acid Hybridization” Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); “Transcription and Translation” Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); “Animal Cell Culture” Freshney, R. I., ed. (1986); “Immobilized Cells and Enzymes” IRL Press, (1986); “A Practical Guide to Molecular Cloning” Perbal, B., (1984) e “Methods in Enzymology” Vol. 1-317, Academic Press; “PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications”, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., “Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual” CSHL Press (1996); os quais estão incorporados por referência como se estabelecidos no presente em sua totalidade. Outras referências gerais são fornecidas ao longo de todo este documento. Os procedimentos aqui contidos são tidos como bem conhecidos na técnica e são fornecidos para a conveniência do leitor. Todas as informações aqui contidas estão incorporadas no presente documento por referência.

EXEMPLO 1 EXPRESSÃO DIFERENCIAL DE miRS EM NEURÔNIOS DE SEROTONINA MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS MICROARRANJO DE MICRORNA DOS NEURÔNIOS 5HT

[00479] Células cerebelares do dia embrionário 12 de ratos ePET YFP foram cultivadas e classificadas para distinguir os neurônios 5HT dos neurônios não 5HT circunvizinhos. O RNA total incluindo a população de miRNA foi purificado, rotulado e hibridizado no Microarranjo miRNA de Ratos Agilent (Agilent Tech, Mississauga, ON, Canadá) número designado 021828 com base na Sanger miRBase verso 12,0 de acordo com as instruções do fabricante. As microsséries foram escaneadas e os dados foram extraídos e processados utilizando o Feature Extraction Software (Agilent Technologies). Na sequência do escaneamento, a intensidade dos dados de saída dos arquivos GeneView.txt foi analisada para quantificar a expressão relativa diferencial dos microRNAs utilizando o the Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, MO). Os dados foram transformados em log2, quantil normalizado e filtrada de acordo com a sinalização “gIsGeneDetected” no arquivo GeneView. De 666 miRs murino, restaram 198 para análises adicionais nesta etapa de filtragem. Os miRs diferencialmente expressados foram, então, identificados utilizando um limiar de 1,5 vezes muda com significância de acordo com a ANOVA. Os contrastes foram calculados dentro do teste da ANOVA. A correção Benjamini e Hochberg foi utilizada para uma redução de falso positivo (correção de teste múltiplo).

CLONAGEM DE 3’UTRS DENTRO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DE LUCIFERASE PSICHECK2

[00480] Sequências 3’UTR de Slc6a4, Htr1a, MaoA e Tph2 foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico de ratos, ou cDNA cerebral total. Fragmentos 3’UTR PCR foram ligados dentro do vetor leve pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e, na sequência, subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3’ da luciferase do plasmídeo relator Psicheck2 (Promega). Sequências 3’UTR mutadas, falta das sequências de semente miR-135, foram sintetizadas com ressaltos importantes através da sequência de combinação de semente. A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.

ENSAIOS DE LUCIFERASE E TRANSFECÇÕES

[00481] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formatos de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietilenoimina com os seguintes plasmídeos: 5 ng de plasmídeo Psicheck2- 3’UTR e 25 ng de vetor superexpressante para um miRNA específico, ou plasmídeos de superexpressão de vetor miR vazio. 24 horas seguintes à transfecção as células foram lisadas e a atividade dos relatores de luciferase foram ensaiadas conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.

ANIMAIS E ALOJAMENTO

[00482] Ratos machos adultos C57BL/6J, de 10 semanas (Harlan, Jerusalem, Israel) foram alojados em temperatura ambiente controlada (22 ± 1°C) em um ciclo reverso de 12 horas de luz/escuridão. Alimentos e água foram disponibilizados ad libitum. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais [Institutional Animal Care e Use Committee] do Instituto Weizmann de Ciência.

PARADIGMAS DE ESTRESSE AGUDO POR IMOBILIZAÇÃO

[00483] Ratos adultos foram introduzidos em um tubo ventilado de 50 ml por 30 minutos durante seu ciclo de escuridão.

FRACASSO SOCIAL CRÔNICO

[00484] Os ratos foram submetidos ao protocolo de fracasso social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo e interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claros e perfurados foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias.

TRATAMENTO ANTIDEPRESSIVO

[00485] Os ratos receberam injeção i.p. de Imipramina tricíclica, ou Fluoxetina SSRI, ou Reboxetina NRI (20 mg/kg em salina) ou salina. Injeções crônicas foram realizadas por 18-2 dias consecutivos, e uma injeção aguda foi realizada 24 horas antes das microdissecações cerebrais.

MICRODISSECAÇÃO DOS NÚCLEOS DAS RAFES E COLETAS DE PLASMA

[00486] Amostras cerebrais foram tomadas de núcleos das rafes (RN) de ratos após a remoção do cérebro e a colocação do mesmo em matriz cerebral acrílica (Stoelting). Pedaços foram retirados utilizando as lâminas do tipo navalha padrão (GEM) com base nos marcadores atômicos designados. Foram usadas seringas 14G embotadas para extrair a região do RN de pedaços de 3 mm removidos da matriz. Adicionalmente, sangues-troncos foram coletados nos tubos contendo EDTA a fim de evitar a coagulação. Após a centrifugação em 3.500 g por 30 minutos a 4°C, o plasma foi separado e mantido em - 70°C até a purificação do RNA.

PURIFICAÇÃO DO MICRORNA E ANÁLISE DE EXPRESSÃO RT-PCR QUANTITATIVA

[00487] mRNAs, incluindo os microRNAs, foram isolados dos neurônios classificados, perfurações cerebrais congeladas e plasma utilizando o minikit miRNeasy (Qigen) de acordo com as instruções do fabricante, e tratados utilizando o kit mRNA de transcrição Reversa miScript para gerar cDNA. Amostras de cDNA foram, então, analisadas utilizando o kit SYBR®Green PCR (Qiagen) de acordo com as orientações do fabricante no termociclador AB 7500 (Biossistemas Aplicados). Iniciadores específicos para cada miR foram utilizados juntamente com o iniciador universal comercial, enquanto que o U6 snRNA foi utilizado como controle interno. Tabela 1B: SEQUÊNCIA DE INICIADORES UTILIZADOS PARA PCR EM TEMPO REAL Tabela 1C: SEQUÊNCIAS DE INICIADORES UTILIZADOS PARA A CLONAGEM MOLECULAR CLONAGEM DE miR135B SOBRE O VETOR DE EXPRESSÃO VIRAL

[00488] O pre-miR-135b foi amplificado pelo PCR a partir do DNA genômico do rato com os iniciadores adicionando locais Agel de enzimas de restrição e, então, foi o inSlc6a4ed para o vetor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Depois da sequência do pGEM-T Easy e da digestão de ambos os vetores pGEM-T Easy e o pEGFP (Clontech laboratories Inc., Mountain View, CA) com o Agel, a sequência miR-135b prematura foi ligada ao vetor pEGFP para construir a expressão plasmídeo pEGFP-miR-135b. Finalmente, o pEGFP-miR-135b foi cortado pelo BamHi e o BsrGI paralelamente ao corte da plasmídeo pCSC-E/Syn-eGFP com as mesmas enzimas, e a sequência miR-135b-eGFPfoi ligada à pCSC-E/Syn para construir o plasmídeo pCSC- eSNY-pre-miR-135b-eGFP que foi confirmada pela análise endonuclease de restrição e o sequenciamento do DNA.

PRODUÇÃO DE VETORES LENTIVIRAIS

[00489] Lentivírus recombinantes foram produzidos pela transfecção transiente nas células HEK293T, conforme descrito anteriormente [Naldini L et al., Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93:11382-8]. Em suma, as infecções por lentivírus foram colidas em 48 e 72 horas após a transfecção, filtrada através de filtros de acetato de celulose de poro 0,45 pm e concentrada por ultracentrifugação.

INJEÇÕES INTRACEREBRAIS DOS LENTIVÍRUS

[00490] Para fornecer um controle de precisão sobre a cirurgia extereotáxica e o local de transporte lentiviral, os inventores usaram um instrumento estereotáxico orientado por computador e um monoinjetor motorizado (Instrumento Estereotáxico Angle TwoTM, myNeurolab). Conforme descrito anteriormente [Singer O. et al. Nat Neurosci (2005).8, 1343-9] os ratos foram colocados em um aparato estereotáxico sob anestesia geral, e coordenadas foram determinadas conforme definido por Franklin e Paxinos atlas. A preparação lentiviral foi transportada utilizando uma seringa Hamilton conectada com o sistema nanoinjetor motorizado e a solução injetada em uma taxa de 0,2 pl a cada 1 minuto. Após um período de recuperação de duas semanas, os ratos foram submetidos a estudos comportamentais e psicológicos e no final anestesiados e perfundidos com fosfato regulados a 4% de paraforrmaldeído. Os cérebros fixos foram seccionados em série para pedaços de 30μ, a fim de confirmar a precisão do local da injeção, utilizando imunohistoquímica.

IMUNOHISTOQUÍMICA

[00491] O procedimento utilizado para a imunohistoquímica foi desempenhado conforme descrito anteriormente [Chen A et al. J Neurosci (2006) 26: 5500-10]. Para a imunocoloração GFP, os inventores usaram anticorpo anti-GFP biotinilado cultivado em coelhos como anticorpo primário (Abcam, Cambridge, UK), e estreptavidina conjugada Cy2 como anticorpo secundário (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, U.S.A).

AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS

[00492] Todas as avaliações comportamentais foram realizadas durante a fase de escuridão seguindo da habituação para a sala de teste por 2 horas anteriores a cada teste.

TESTE DE SUSPENSÃO PELA CAUDA

[00493] O teste de suspensão pela cauda foi realizado no TSE [Tail Suspension Monitor 1 Monitor de Suspensão pela Cauda] (Sistemas TSE, Bad Homburg, Alemanha). Cada rato foi preso pela ponta da cauda e suspenso a partir de um sensor de força por 10 minutos. O tempo passado imóvel e o tempo passado lutando foram calculados e registrados pelo software com base no limiar pré-estabelecido.

TESTE DE NADO FORÇADO MODIFICADO

[00494] O teste de suspensão pela cauda foi realizado conforme previamente descrito [Krishnan V and Nestler EJ, Nature (2008) 455: 894902]. Em suma, o aparato usou um balde plástico, 18 cm de diâmetro, preenchido com água a 25oC com uma profundidade de 15 cm. Cada rato foi colocado no centro do balde para iniciar um vídeo de6 minutos gravado da seção de teste. A duração do tempo passado imóvel durante os 2-6 minutos de teste foi classificado automaticamente utilizando o EtoVision XT (Noldus, Wageningen, Holanda).

ATIVIDADE LOCOMOTORA

[00495] Para controlar a possibilidade dos efeitos comportamentais oriundas das diferenças em movimento ambulatorial, a atividade locomotora dos ratos foi examinada por um período de 48 horas, que foi precedido por alguns dias de habituação. Os ratos foram alojados sozinhos em gaiolas especializadas e a locomoção foi medida utilizando o sistema InfraMot (Sistemas TSE, Bad Hamburg, Alemanha).

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00496] Os dados foram expressos como médias de +/- SEM. Para testar a significância estatística, o teste t dos estudantes foi utilizado em casos onde somente dois grupos foram comparados, tais como entre a validação de microarranjo qPCR. Uma maneira que o ANOVAs foi utilizado para comparar entre os múltiplos grupos tais como entre os tratamentos diferentes no ensaio de luciferase. Duas maneiras que o ANOVAs foi utilizado nos casos de 2 variáveis independentes, tais como a injeção SSRI NRI, ambos em durações agudos e crônicas. Testes t posteriores foram utilizados quando necessário para revelar a significância estatística. As diferenças entre os grupos foram consideradas significativas quando P<0,05.

RESULTADOS

[00497] Os neurônios 5HT foram isolados do RN dos embriões ePET YFP, e seus perfis de expressão miR foram comparados com os neurônios não 5HT, obtidos dos mesmos núcleos, utilizando o microarranjo miR (figura 1A). Quatorze miRs foram descobertos como regulado de forma ascendente e vinte e sete regulado de forma descendente por mais de 2 vezes nos neurônios 5Ht comparados com os neurônios não 5HT (vide Tabelas 2A-B, abaixo). A validação representativa dos resultados do arranjo foi realizada utilizando o PCR em tempo real para os miRs regulado de forma ascendente em neurônios 5HT como o miR-375 (P=0,0071; figura 1B) e regulado de forma descendente como o miR-135a (P=0,0075; figura 1C). A fim de estudar ainda o papel dos miRs como moduladores dos neurônios 5HT, análises bioinformáticas extensivas foram realizadas de uma maneira hipotética. Visando a previsão dos genes relacionados com a serotonina conhecidos que tenham sido previamente demonstrados como associados com as psicopatologias, foram cruzados com os resultados do microarranjo. As quatro proteínas seguintes codificando os genes alvo expressadas nos neurônios 5HT no RN foram escolhidas para teste: transportador de serotonina, responsável pela recaptação 5HT (também conhecida como SERT ou Slc6a4); o receptor 1a inibidor de serotonina (também conhecido como Htr1a); triptofano hidroxilase 2 (Tph2), a taxa de limitação da enzima de sínteses 5HT no cérebro; e a monoamina hidroxilase (MaoA), que desativa o 5HT. As previsões almejadas do microRNA para estes genes foram realizadas utilizando dois algoritmos diferentes com base na web: o Escaneamento Alvo [www(ponto)targetscan(ponto)org] e o Miranda [www(ponto)microrna(ponto)org] e foram cruzadas com a lista de 91 miRs alterados por, pelo menos, ± 1,5 no arranjo miR dos neurônios 5HT, comparado com as células não 5HT. Com base nos dados do arranjo miRs e nas análises bioinformáticas, oito miRs foram escolhidos para estudos adicionais in vitro (figura 1D-G). Tabela 2A: LISTA DE MIRS REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE EM NEURÔNIOS 5HT COMPARADOS COM NÃO SEROTONÉRGICOS (POR MAIS QUE DUAS VEZES). Tabela 2B: LISTA DE MIRS REGULADOS DE FORMA DESCENDENTE EM NEURÔNIOS 5HT COMPARADOS COM NÃO SEROTONÉRGICOS (POR MAIS QUE 2 VEZES).

[00498] Ensaios luciferase in vitro foram realizados para testar as interações miR-alvo entre o 3’UTR do 5HT testado relacionado com o gene e os miRs previstos para alvejá-lo putativamente. Os inventores descobriram que Tph2 3’UTR foi severamente reprimido (por aproximadamente 20%) por miR-27b (P = 0,0051) e miR-181C (P = 0,0305, figura 1H) e MaoA 3’UTR também foi reprimido por miR-27b (P = 0,0008, figura 1I). miR-135 alvejando de 3’UTR (figura 2A e 2C) e Htr1a 3’UTR (figura 2B e 2D) resultou em repressão robusta de tradução destas transcrições. Enquanto o miR-135a leva a uma repressão de aproximadamente 30% para o Slc6a4 (P=0,014) e Htr1a (P < 0,0001), miR-135b causou uma repressão de aproximadamente 50% para o Slc6a4 (P = 0,0002) e Htr1a (P < 0,0001). Adicionalmente, uma repressão significante do Htr1a 3’UTR foi gerada pelo miR-335 (P<0,0001), miR-181c (P=0,0029) e miR-26a (P<0,0001, figura 2D). Uma abordagem genômica adicional da análise bioinformática revelou uma forte conservação da combinação de semente miR-135 no slc6a4 3’UTR (figura 2E) e em uma de duas correspondências de semente identificadas no Htr1a 3’UTR (figura 2F). Estudos de mutação no 3’UTR da transcrição Slc6a4, que removeu a combinação de semente miR do miR-135, revelou que tanto o miR-135 quanto o miR-135b alvejando o Slc6a4 foi mediado através da sequência de combinação de semente. A repressão induzida pelo miR-135 foi totalmente bloqueada pela mutação no Slc6a4 3’UTR (figura 2G). A mutação da combinação de semente Htr1a miR-135 individualmente ou ambas, revelou que miR-135 estava reprimindo o Htr1a 3’UTR através da combinação de semente distal e não proximal enquanto que o miR-135b age através de ambos os locais previstos (figura 2H).

[00499] Os inventores testaram ainda a regulação da expressão RN- miR-135 in vivo seguindo os estímulos ambientais diferentes ou tratamentos farmacológicos. Na sequência da manipulação dos ratos (ou seja, estresse por manipulação agudo) o RN foi removido, o RNA foi extraído e os níveis de miR-135 foram testados utilizando o PCR em tempo real. Uma vez que os níveis de 5HT são conhecidos por ser alertados por estresse agudo, os inventores testaram os níveis do miR-135 em pontos de tempo diferentes após o estresse por restrição agudo, e descobriram que tanto o miR-135a quanto o miR-135b foram regulados de forma descendente por 90 minutos seguindo o estresse agudo (P<0,001). Os níveis reduzidos destes miRs ainda permaneceram por 24 horas após estresse, comparado com o rato de controle (P=0,0357 para miR-135a, figura 3A; P=0,0055 para o miR 135b, figura 3B). Ademais, uma vez que as funções neuronais e os níveis de expressão Slc6a4 e Htr1a são conhecidos por ser fortemente afetados em pacientes deprimidos e seguindo as medicações antidepressivas, os inventores testaram os níveis de duas variantes miR em ratos expostos ao modelo ambiental para a indução de comportamento do tipo depressivo (modelo de fracasso social crônico) e para o antidepressivo tricíclico, Imipramina. Interessantemente, o estresse por fracasso social crônico não altera os níveis do miR-135 no núcleo de rafe, entretanto, a Imipramina administrada agudamente ou cronicamente, ambos em ratos estressados ou não estressados, aumentou os níveis de expressão miR-135a (P=0,003; figura 3C) e miR-135b (P=0,0093; figura 3D) no RN. Uma vez que a Imipramina não é um inibidor de recaptação 5HT específico, os inventores ainda testaram o efeito de ambos os inibidores de recaptação de serotonina seletiva agudo e crônico (SSRI), Fluoxetina, e os inibidores de recaptação de noradrenalina (NRI), Reboxetina, e descobriram um robusto aumento nos níveis de miR-135a seguindo tanto o tratamento SSRI agudo quanto o crônico (P<0,0001, figura 3E), e não nos níveis de miR-135b no RN (figura 3F).

[00500] Para explorações adicionais da importância dos níveis de miR- 135 em todo o contexto animal os inventores manipularam os níveis de miR- 135 in vivo especificamente no RN de ratos adultos e testaram seu efeito nos comportamentos do tipo depressivo em ratos. Para este fim, os inventores construíram lentivírus recombinantes superexpressando o miR-135b especificamente em neurônios utilizando o promotor de sinapsina aprimorado, que também coexpressou o repórter GFP (vide seção de materiais e procedimentos adicionais acima e na figura 4A). Os inventores testaram os lentivírus in vivo injetando-os dentro do RN de ratos adultos, e compararam os níveis de miR-135b no RN para os lentivírus de controle injetados nos ratos. Análises de PCR em tempo real dos níveis de miR-135b revelaram uma indução de 10 vezes comparada com os lentivírus de controle injetados nos ratos (P=0,0032, figura 4B). Os ratos adultos injetados com a superexpressão miR-135b foram expostos a fracasso social crônico, para iniciar os comportamentos do tipo depressivo, e foram subsequentemente testados comportamentalmente. Seguindo o teste comportamental, os ratos foram perfundidos e os cérebros foram analisados para a localização do local de injeção (figuras 4C-D). RN de ratos com miR-135 superexpressados demonstraram um tempo de imobilidade reduzido no nado forçado (P=0,0088 no minuto 3 e P=0,00330 para o minuto 4; figura 4E) e nos testes de suspensão da cauda (P=0,07356 no último do 5° minuto do teste, figura 4F) sem nenhuma alteração observada na locomoção em sua gaiola (figuras 4G- H), sugerindo um efeito antidepressivo para a superexpressão miR-135.

[00501] Com tudo isso, os presentes inventores determinaram a impressão digital da expressão dos miRs específicas no RN dos neurônios serotogênico e não serotogênicos. Os presentes inventores cruzaram estes dados únicos estabelecidos com a previsão bioinformática para os miRs alvejando o 5HTrelacionado com o gene. Os presentes inventores testaram in vitro a previsão alvo para Tph2, MaoA, Slc6a4 e Htr1a utilizando ensaios luciferase 3’UTR’s e em estudos de mutilação e revelaram, entre outras interações miR alvo, um forte efeito inibidor para o miR-135 para o Sl6a4 e para o Htr1a 3’UTR. Finalmente, os presentes inventores demonstraram que a superexpressão específica do local do miR-135 no RN de ratos adultos leva à uma diminuição dos comportamentos do tipo depressivo seguindo a fracasso social.

EXEMPLO 2

[00502] O miR-19 especificamente objetiva o receptor adrenérgico beta tipo um (Adrb1)

MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS CLONAGEM DE 3’UTRS DENTRO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA LUCIFERASE PSICHECK2

[00503] A sequência 3’UTR de ADRb1 foi ampliada a partir do DNA genômico do rato. As sequências 3’UTR mutadas, faltando todas as quatro correspondências de semente miR-19, foram sintetizadas pelo Epoch Biolabs, Inc. (TX, USA). Fragmentos 3’UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3’ da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.

ENSAIOS DE LUCIFERASE E TRANSFECÇÕES

[00504] As células HEK293T ou células neuronais HT22 foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formatos de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os seguintes plasmídeos: Plasmídeo Psicheck2-3’UTR, a superexpressão pre-mmu-miR- 19b em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech), plasmídeo miR-19b de silenciamento (KD) (Genocopoeia) ou plasmídeo KD de controle (Genocopoeia). 24 horas seguintes à transfecção as células foram lisadas e a atividade dos relatores de luciferase foram arranjados, conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.

RESULTADOS

[00505] As análises bioinformáticas para o estresse relacionado aos genes com sequências alvo miRNA distintas, evolucionárias e conservadas que contêm várias repetições em seu 3’UTR revelaram o miR-19 como um forte candidato para o alvo do receptor adrenérgico beta tipo um (Adrb 1), com três correspondências de semente miR-19 fortemente conservadas e uma menos conservada no Adrb1 3’UTR. O Adrb1 é um receptor adrenérgico que é expresso em várias regiões do cérebro incluindo a amídala, hipocampos e núcleos para ventriculares (PVN | paraventricular nucleus). O Adrb1 amigdalar foi previamente descrito como afetando o comportamento do tipo ansiedade [Fu A et al., Brain Res (2008) 1211: 85-92; Rudoy CA e Van Bockstaele EJ, Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry (2007) 31: 111929] e a memória do medo [Roozendaal B et al., J Neurosci (2004) 24: 8161-9; Roozendaal B et al., Neuroscience (2006) 138: 901-10]. De forma intrigante, o Adrb1 foi descoberto em células CRF positivas da amígdala e é um receptor acoplado à proteína G (GPCR) que exerce seu efeito através do Gs ativando ainda a adenilato ciclase (AC). Há 10 genes conhecidos codificando para o AC, a saber, o ADCY1-10. Três destes (ADCY1, ADCY7 e ADCY9) foram previstos bioinformaticamente como alvejados pelo miR-19. O ADCY1 tem uma expressão específica do cérebro e foi previamente mostrado que a superexpressão da mesma no cerebelo no rato aprimora o reconhecimento da memória e o LTP [Wang H et al., Nat Neurosci (2004) 7: 635-42].

[00506] A fim de investigar se o miR-19 de fato regula a expressão Adrb1 ou ADCY1 através de suas sequências alvo presumidas no Adrb1- 3’UTR ou ADCY1-3’UTR, formas intactas ou mutadas do Adrb1-3’UTR (figura 5) ou ADCY1-3’UTR foram clonados em fluxo descendente do gene luciferase no plasmídeo de expressão Psicheck2. Na forma mutada do ADRb1-3’UTR todas as quatro correspondências de semente para o miR-19b estavam faltando (figura 5). Na forma mutada do ADCY1-3’UTR parcial, comente a combinação de semente conservada (de 3) estavam faltando.

[00507] O ensaio de luciferase foi utilizado para determinar a natureza da interação entre o miR-19 e o Adrb1-3’UTR e também entre o miR-19 e o ADCY1-3’UTR. Nas células HT22, que expressam endogenamente baixos níveis de miR-19, nenhuma diferença foi encontrada entre os níveis luciferase controlados tanto pela forma intacta ou mutada do ADRb1-3’UTR (figura 6A). Entretanto, quando o miR-19b foi superexpressado nas células HT22, os níveis de luciferase foram significantemente (aproximadamente 2 vezes) inferiores a quando conduzido pela forma intacta relativa à forma mutada do ADRb1-3’UTR (ademais de uma redução geral, aparentemente não específica na expressão luciferase normalizada (figura 6B)). Em células HEK293T que expressa endogenamente altos níveis de miR-19, os níveis de expressão luciferase regulados pelo ADRb1-3’UTR foram de 2 a 4 vezes menores do que aqueles expressados quando regulados pela forma mutada do ADRb1- 3’UTR (figuras 6C).

[00508] O sistema MiRs de silenciamento (KD) foi utilizado, a fim de manipular os níveis de miR-19 em células HEK293T. A saber, (1) sondas miRCURY LNA KD (Exiqon, MA, EUA figura 6D), e (2) plasmídeo baseado na sequência de silenciamento (Genecopoeia, Rockville, MD, EUA, Figure 6E). Os níveis LNA-Anti-miR-19b luciferase aprimorados quando regulados sob o ADRb1-3’UTR em aproximadamente 20% relativo para controlar a sonda KD misturados e não tem efeito na forma mutada do ADRb1-3’UTR (figura 6D). Onde, plasmídeo com base no miR-19b KD, causou até 2 aprimoramentos de vezes na expressão luciferase regulada pela forma intacta do ADRb1-3’UTR relativo à sequência KD Controle (figura 6E). Nenhum resgate completo dos níveis de luciferase relativo àquele conduzido pela forma mutante do ADRb1-3’UTR foi alcançado. Isso pode ser explicado seja pela especificidade do miR-19b da sonda/sequência genômica (perfuraram a regulação miR-19), os altos níveis do miR-19 nas células HEK293T que podem ser difíceis de regular completamente para baixo, ou o efeito do outro possível miRNA expressado nas células HEK293T que pode unir-se às mesmas sequências da combinação de semente no ADRb1-3’UTR.

EXEMPLO 3A miR-19A E miR-19B SÃO REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE NO PFC E NA AMÍGDALA SEGUINDO O ESTRESSE CRÔNICO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ANIMAIS E ALOJAMENTO

[00509] Ratos miR 17-92 flx/flx [Ventura A et al, Cell (2008) 875- 86:(5)132;7], foram reproduzidos em cruzamento com ratos CamKIIa-Cre [Dragatsis I et al Genesis. (2000) 26(2):133-5]. Ratos transgênicos ou ratos adultos machos C57BL/6J foram alojados em uma temperatura ambiente controlada (22 ± 1°C) em um ciclo reverso de 12 horas de luz/escuridão. Alimentos e água foram disponibilizados ad libitum. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Weizmann de Ciências.

GERAÇÃO DE LENTIVÍRUS PARA A MANIPULAÇÃO miR-19B EM CÉREBROS ADULTOS

[00510] A sequência MiR-19b foi clonada dentro de um plasmídeo lentiviral, seguindo o promotor III-H1 de RNA polimerase. Ademais, a sequência Pré-miR-19b foi clonada seguindo um promotor neuronal específico (Sinapsina aprimorada, ESyn) em uma plasmídeo lentiviral. Os lentivírus foram gerados para ambos os experimentos in vivo, miR-19b-KD e superexpressões-Pre-miR-19b (OE). Estes lentivírus foram utilizados para manipular os níveis miR-19b nas regiões alvo onde os níveis miR-19 foram tidos como alterados, seguindo um estímulo comportamental/farmacológico.

GERAÇÃO DE RATOS FALTANDO O miR-19 NO CEREBELO

[00511] A fim de gerar ratos com falta do miR-19 no cerebelo, os inventores, estão, reproduziram ratos carregando o gene que codifica a recombinase Cre sob o promotor CamKIIa com ratos carregando uma forma condicional dos miRs com ramificação miR17~92. A família MiR-19 inclui o miR-19a e o miR-19b. No genoma miR-19 do rato há duas cópias idênticas, miR-19b e miR-19b-2. O MiR19a e o miR-19b-1 estão localizados na mesma ramificação miRNA, a saber, miT17~92, onde o miR-19b-2 está localizado em diferentes locais genômicos, miR106a~363. Este último parece ter pouca ou nenhuma expressão nos tecidos do rato e, portanto, o silenciamento da ramificação miR17~92 é expressada como suficiente para permitir um efeito profundo sobre os níveis de expressão miR-19a e miR-19b no cerebelo.

ESTÍMULOS COMPORTAMENTAIS/FARMACOLÓGICO

[00512] Ratos com falta da ramificação miR-17~92 no cerebelo, ou ratos onde o miR-19 foi especificamente manipulado (níveis superexpressados de ADRb1, ADCY1 e outras transcrições e produtos do gene. Estes animais também serão testados para o comportamento do tipo ansiedade, atividades locomotoras e desempenho da memória. Ademais, os níveis da expressão do miR-19a e do miR-19b são examinados em regiões diferentes de interesse (P.EX. do hipotálamo, amígdala e cerebelo) seguindo um tratamento sistêmico 0agudo e crônico com inibidor de racaptação de Noradrenalina Reboxetina em ratos WT.

RESULTADOS

[00513] A ligação psicológica entre o miRNA-19 e o Adrb1 foi estudada, avaliando o nível do miR-19a/b no córtex pré-frontal (PFC) dos ratos que foram injetados com Reboxetina, um inibidor de recaptação de noradrenalina (NRI), seja aguda ou cronicamente (figuras 12A-D). Conforme mostrado nas figuras 12A-D, os níveis de miR-19a/b foram regulados de forma descendente seguindo a administração aguda de Reboxetina (figuras 12A, B) e regulado de forma ascendente seguindo a administração crônica de Reboxetina (figuras 12C, D).

[00514] Na sequência, os níveis de miR-19 foram avaliados seguindo o estresse por medição dos níveis de miR-19 a e b no PFC e amígdala dos ratos submetidos ao protocolo de fracasso social (figuras 12A-D). Conforme mostrado nas figuras 13A-D, os níveis de miR-19 a e b aumentaram tanto para o PFC como para a amígdala seguindo o estresse crônico. Estes resultados ilustram o envolvimento do miR-19 na regulação da resposta ao estresse central.

EXEMPLO 3B MIRNA-19 E RECEPTOR CANABINOIDE 1 (CB1) MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS ANIMAIS E ALOJAMENTO

[00515] Conforme descrito no Exemplo 3A, acima.

GERAÇÃO DE LENTIVÍRUS PARA A MANIPULAÇÃO MIRNA-19B EM CÉREBROS ADULTOS

[00516] Conforme descrito no Exemplo 3A, acima.

RESULTADOS

[00517] O CB1 é um dos GPCRs mais abundantemente expressados no cérebro e é particularmente enriquecido no córtex, amígdala, hipotálamo, gânglio basal, e cerebelo (figuras 15A-B) [Herkenham M. et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience (1991) 11:563-583; Mackie, K. Handbook of experimental pharmacology (2005) 299-325]. Os receptores CB1 são altamente expressados em axônios e terminais do axônio, onde estão bem posicionados quanto à modulação da neurotransmissão. Os inventores descobriram que o CB1 contém 2 locais de semente que são compatíveis com o miRNA-19.

[00518] O ensaio de luciferase foi utilizado para determinar a natureza da interação entre o miRNA-19 e o CB1-3’UTR. Quando o miRNA-19b foi superexpressado em células HT22 juntamente com o 3’UTR do CB1, os níveis de luciferase foram significantemente (50%) mais baixos quando comparados com o GFP superexpressado com o mesmo 3’UTR (figura 14), suportando um possível papel para o miR-19 na regulação dos níveis de CB1. Experimentos de mutação adicionais são realizados para verificar o papel da sequência de semente miR-19 prevista para a regulação observada (conforme descrito para o Adrb1 acima).

[00519] De forma interessante, estudos prévios demonstraram convincentemente que a consolidação das memórias aversivas é facilitada pela conversa cruzada entre a sinalização glucocorticoide, noradrenalínica e canabinoide nos núcleos basolaterais da amígdala (BLA | basolateral nucleus of the amygdala) [Roozendaal, B. et al. Neurobiology of learning and memory (2006) 86:249-255]. Um modelo proposto por Hill e McEwen [Hill M.N. and McEwen B.S. Proc of the Nat Acad of Sci of the USA (2009) 106:4579-4580] mostrou um possível mecanismo de ação no BLA para a consolidação da memória (figura 16).

[00520] Conforme mostrado nos presentes resultados, o MiRNA-19 aparece para regular ambos Adrb1 e CB1 in vitro. A superexpressão e o de silenciamento do miR-19 usando, por exemplo, o lentivírus transportado especificamente para o BLA onde pode alterar os níveis de Adrb1 e CB1, são desempenhados, bem como testes que examinam o desempenho dos ratos quanto aos paradigmas de aprendizado e de memória como o condicionamento do medo com e sem exposição a estímulos estressantes.

EXEMPLO 3C IDENTIFICAÇÃO DE MIRNA DIFERENCIALMENTE EXPRESSADOS EM RATOS SUBMETIDOS AO ESTRESSE CRÔNICO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS IMUNOPRECIPITAÇÃO DA PROTEÍNA AGO2

[00521] Tanques de 3 amígdalas de 3 animais que são parte do mesmo grupo (“Suscetíveis”, “Resilientes” ou Controle) foram homogeneizados no tampão NP40 que foi suplementado com inibidor RNase, inibidor e inibidor de fosfatos. As amostras foram mantidas sobre constante agitação por 2 horas a 4°C. As amostras foram, então, centrifugadas por 20 minutos a 12,000 rpm a 4°C. Em uma microcentrífuga, o sobrenadante foi colocado em um tubo fresco mantido em gelo e a grânulos foi descarregada. A proteína G magnética do rebordo (Dynabeads, Invitrogen) foi incubada com o anticorpo monoclonal Ago2 (WAKO) com rotação em temperatura ambiente por 10 minutos. Após várias lavagens, as amostras foram adicionadas aos rebordos da proteína G revestida de Ago2 e incubadas a noite toda em 4°C sob agitação. No dia seguinte, os rebordos foram lavados 3 vezes com PBS. Para a purificação RNA, os rebordos foram homogeneizados no tampão RLT do kit RNase, protocolo suplementares miRNA). Para a análise western blot, os rebordos foram fervidos em tampão de amostras para liberar a proteína dos rebordos.

MICROARRANJO E PURIFICAÇÃO DO RNA

[00522] O RNA das amostras de imunoprecipitação Ago2 foi isolado utilizando o kit Rneasy plus (Qiagen) seguindo o Protocolo 1 suplementar Quagen: Purificação do RNA total contendo miRNA. O RNA para todas as outras finalidades foi isolado de perfurações cerebrais congeladas utilizando o minikit miRNeasy (Qiagen) de acordo com as recomendações do fabricante, e a integridade do RNA foi avaliada utilizando o bioanalisador Agilent 2100. O RNA derivado dos tecidos de ratos estressados seguindo a imunossupreção Ago2 foi ainda analisado nos arranjos Affymetrix miRNA 2,0 (protocolo RNA enriquecido) e arranjo Affymetrix Mouse Gene 1,0 ST.

RESULTADOS

[00523] A fim de identificar e estudar os miRNAs expressados diferentemente isolados da amígdala de ratos submetidos ao paradigma de estresse crônico e/ou associado com o fenótipo comportamental “Resiliente” ou “Suscetível”, o protocolo de fracasso social foi utilizado (vide seção de Métodos).

[00524] A fim de identificar uma conexão genuína entre os miRNAs e seu 3’UTR dos genes alvo seguindo o paradigma de fracasso social, uma imunoprecipitação (IP) do complexo Ago2 foi realizada e a população de miRNAs e mRNAs coprecipitados foi analisado. Quando o miRNA maduro foi formado, foi incorporado ao complexo RISC. Enquanto no complexo RISC, o Ago2 facilita a interação entre um miRNA específico e seu mRNA 3’UTR alvo [Meister G. et al., Molecular cell (2004) 15:185-197] (figura 17A).

[00525] A fim de verificar que o complexo Ago2 pode de fato ser precipitado com seu RNA unido, o IP foi realizado na amígdala dos ratos neutros. O IP foi realizado utilizando os rebordos magnéticos de proteína G que foram reagidos com anticorpo Ago2 monoclonal. Conforme mostrado na figura 17B, uma banda Ago2 específica foi precipitada de um extrato de células NIH 3T3 (figura 17B, linha 1) ou de um extrato do tecido da amígdala (figura 17B, linha 2).

[00526] Para demonstrar a especificidade do IP, uma amostra cerebral total foi dividida em duas, onde uma foi precipitada com anti-Ago2 e a outra com um anticorpo IgG1 de controle não específico. Uma banda Ago2 específica estava presente somente no precipitado Ago2 (figura 17B, linhas 3, 4).

[00527] Assim, ao puxar para baixo o complexo Ago2 e analisar as populações de miRNA bem como as de mRNA no material precipitado, havia uma chance maior de descobrir uma conexão correta entre uma dada miRNA e seu mRNA 3’UTR alvejado em regiões cerebrais específicas.

ISOLAMENTO DO AGO 2 ASSOCIADO AO RNA DA AMÍGDALA DE RATOS SUBMETIDOS AO PARADIGMA DE FRACASSO SOCIAL

[00528] Na sequência, com base em resultados específicos do experimento Agos2 IP, a mesma estratégia foi implementada a fim de revelar potenciais diferentes no miRNA e seus mRNAs alvo no cérebro de ratos que foram submetidos ao protocolo de fracasso social.

[00529] Depois de 10 dias de paradigma de fracasso social, os ratos foram categorizados em 3 grupos: Controle, “Suscetível” e “Resiliente”. Um rato foi categorizado como “Suscetível” quando apresentou uma esquiva social quando encontrava um novo rato da mesma raça que o atacou durante o paradigma de fracasso social. Um rato foi caracterizado como “Resiliente” se não evitar o novo rato agressivo e interagir com o mesmo. A maioria dos ratos submetidos à fracasso social apresentou tipicamente uma esquiva social e, portanto, seria classificado como “Suscetível”. Aproximadamente somente 10-20% dos ratos em um experimento são esperados que sejam “Resiliente”. Abaixo é mostrado um exemplo de teste conduzido de esquiva social.

[00530] Conforme demonstrado na figura 18A, o rato foi colocado sozinho em um labirinto social por 3 minutos para a habituação. A câmera captou os movimentos do rato através do labirinto. Na figura 18C, o mesmo rato foi exposto a um rato recente ICR que foi colocado além de uma divisória. A câmera captou o rato no canto mais distante da arena longe da localização do rato recente. A resposta foi considerada como esquiva social e, assim, este rato foi classificado como “Suscetível”. Em contrapartida, na figura 18B e na figura 18D o rato não apresentou esquiva social e, assim, foi classificado como “Resiliente”.

[00531] Quarenta ratos foram submetidos ao paradigma de fracasso social e quarenta ratos serviram como controle. Na sequência do teste de esquiva social 9 ratos “Resilientes”, 9 ratos “Suscetíveis” e 12 ratos controle foram selecionados para a microdissecação cerebral. As amostras cerebrais foram coletadas 8 dias após o teste de esquiva social da amígdala, BNST, PFC, rafe dorsal e hipocampo juntamente com o sangue-tronco.

[00532] Grupos de 3 perfurações da amígdala obtidas de 3 ratos diferentes foram combinados e a imunoprecipitação com anti-Ago2 foi realizada. Na sequência ao IP, o RNA foi extraído do material precipitado. Após puxar 3 amígdalas de cada grupo, haviam 3 amostras de RNA dos ratos “Resilientes”, 3 amostras de RNA dos ratos “Suscetíveis” e

[00533] 4 amostras de RNA dos ratos de controle - um total de 10 amostras de RNA. Cada amostra foi testada em um microarranjo ST do rato bem como no arranjo miRNA (ambos Affymetrix). Os genes e os miRNAs que foram regulados de forma ascendente ou baixo em cada um dos 2 grupos: “Suscetível” ou “Resiliente” relativo ao grupo de controle, foram examinados. Se uma interação entre certo mRNA e um gene alvo acontece, os inventores esperaram por uma correlação oposta em seus níveis totais. Entretanto, o mRNA presente no complexo RISC (precipitado com anti-Ago2) foram esperados que estivessem com níveis altos por conta de ainda não terem sido fragmentados, assim enquanto olhando os dados do arranjo, os inventores examinaram os miRNAs e o mRNA alvo potencial que foram ambos ou elevados ou regulados de forma descendente relativo à amostra de controle porque esta era uma indicação de que interagiram no complexo RISC.

RESULTADOS DO MICROARRANJO

[00534] A Tabela 3 abaixo ilustrou os resultados dos arranjos preliminares analisados utilizando os filtros convencionais. TABELAS 3A-B: LISTA DE MIRNAS AMIGDALARES REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE (TABELA 3A) OU REGULADOS DE FORMA DESCENDENTE (TABELA 3B), SEGUINDO O IP COM AGO2 (Tabela 3A) (Tabela 3B)

[00535] *Para ambas as Tabelas 3A-B, os dados foram apresentados como alterações sucessivas para ratos “Suscetíveis” ou “Resilientes” comparados com os de Controle. Os valores em negrito foram significantemente alterados.

[00536] Vários miRNAs, que foram significantemente regulados de forma ascendente nos grupos de ratos “Suscetíveis” e “Resilientes”, foram selecionados e ilustrados no mapa de calor (vide figura 19A-B). Arranjo de expressão do gene (mRNA) Tabela 4: LISTA DE mRNAS AMIGDALARES REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE SEGUINDO O IP COM AGO2. (Tabela 4, Continuação)

[00537] *Os dados são apresentados como alterações sucessivas para ratos “Suscetíveis” ou “Resilientes” comparados com os de Controle. Os valores em negrito foram significantemente alterados. Tabela 5: Lista de mRNAs amigdalares regulados de forma descendente seguindo o IP com Ago2.

[00538] Vários miRNAs potenciais e seus alvos putativos no cérebro foram analisados.

EXEMPLO 4A miR-15A E miR-15B COMO REGULADORES DA RESPOSTA AO ESTRESSE. MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS EXTRAÇÃO DO RNA TOTAL

[00539] O tecido da amígdala foi dissecado 90 minutos seguintes ao procedimento de estresse agudo. O RNA total foi isolado utilizando o kit miRNeasy (Qiagen) a fim de preservar os miRNAs. Perfurações cerebrais congeladas foram transferidas dentro do lise tampão e imediatamente homogeneizadas. As culturas primárias neuronais ou as culturas de células N2a foram lisados em poços, em gelo. O processamento adicional foi feito de acordo com as recomendações do fabricante. Os extratos de RNA foram armazenados a -80° C até o seu uso.

ARRANJO MIRNA

[00540] A expressão diferencial do mRNA foi testada pelos microarranjos de miRNA da Agilent (Agilent, Santa Clara, CA, EUA) ou Affymetrix (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Para a avaliação da expressão diferencial do mRNA utilizando o arranjo Agilent, 100 ng de RNA total por amostra (3 amostras de controle e duas amostras de estresse agudo) foram, cada uma, rotuladas e hibridizadas, de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram escaneados utilizando um scanner de microarranjo Agilent. Os dados foram extraídos utilizando o software v9 Agilent Feature Extraction e analisados utilizando o Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, Missouri, EUA). Os dados dos arquivos geneView.txt foram submetidos à transformação de log e à normalização do quantil. Para a avaliação da expressão diferencial do mRNA utilizando o arranjo Affymetrix, 1 μg de RNA total por amostra (duas amostras de controle e duas amostras de estresse agudo) foram, cada uma, rotuladas e hibridizadas de acordo com as instruções do fabricante. Os arranjos foram escaneados utilizando um scanner de microarranjo Affymetrix. Os dados foram extraídos utilizando o software de scanner Affymetrix e normalizados utilizando os parâmetros padrão do software Affymetrix miRNAQCtool (ajuste de fundo, normalização quantil, transformação de log e determinação do limiar). Os dados normalizados dos quatro arquivos foram importados do software Partek Genomics. Os genes não apresentados em nenhum dos microarranjos foram filtrados. Devido à diferença da distribuição do miRNA, diferentes intervalos de log de cortes (correspondente a cerca de 1 erro padrão para cada arranjo) foram escolhidos para cada arranjo: 0,2 para o Agilent e 0,4 para o Affymetrix, os miRNAs com intervalos maiores que os cortes foram comparados entre os arranjos e os miRNAs comuns são reportados.

CLONAGEM DE 3’UTRS DENTRO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA LUCIFERASE PSICHECK2

[00541] A sequência 3’UTR de CRFR1 foi ampliada a partir do DNA genômico do rato. Fragmentos 3’UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3’ da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.

ENSAIOS DE LUCIFERASE E TRANSFECÇÕES

[00542] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em formato 48 poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os

[00543] seguintes plasmídeos: plasmídeo Psicheck2-3’UTR, superexpressão pre-mmu-miR-15 em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech). 24 horas após a transfecção, as células foram lisadas e a atividade dos relatores de luciferase foi testada, conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase de renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3’UTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.

RESULTADOS

[00544] O miR-15a e o miR-15b emergiram, conforme regulado de forma ascendente 90 minutos depois do estresse por restrição aguda (figura 7A-B). Ambos miR-15a e miR-15b foram bioinformaticamente previstos para o CRFR1-3’UTR alvo (figura 7C). A superexpressão in vitro do miR-15b nas células HEK293T reduziram significantemente os níveis da expressão luciferase controlada pelo CRFR1-3’UTR (figura 7D).

EXEMPLO 4B EFEITO DO miR15 NO FKBP5 MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

[00545] Conforme ilustrado no Exemplo 4A, abaixo.

RESULTADOS

[00546] De acordo com os resultados do arranjo, o miR-15a e a proteína 5 de ligação FK506 (também conhecida como FKBP5) foram ambos regulados de forma ascendente nos ratos “Suscetíveis” e “Resilientes”, relativos ao grupo de controle (figuras 20A-B), sugerindo sua regulação ascendente no complexo RIC como um resultado do estresse crônico.

[00547] Estudos genéticos vêm identificando um papel para o FKBP5 no distúrbio do estresse pós-traumático, depressão e ansiedade. Por exemplo, descobriu-se que os polimorfismos de nucleotídeo simples (SNPs | single nucleotide polymorphisms) no FKBP5 interagem com o trauma de infância para prever a severidade do distúrbio do estresse pós-traumático adulto (PTSD | posttraumatic estresse disorder) [Binder, E.B. et al., Nature genetics (2004) 36:1319-1325]. Estas descobertas sugerem que os indivíduos com estes SNPs que são abusados quando crianças são mais suscetíveis ao PTSD quando adultos. O FKBP5 também foi encontrado como menos expressados em indivíduos com PTSD atual [Yehuda, R. et al., Biological psychiatry (2009) 66:708-711]. O gene FKBP5 foi encontrado como tendo vários locais de poliadenilação e está estatisticamente associado a uma taxa mais elevada de transtornos depressivos [Binder et al. supra].

[00548] Análises adicionais do 3' UTR of FKBP5 revelaram que tem uma sequência de combinação de semente para o miR-15 (figura 20C).

[00549] Se de fato o miR-15a regula o FKBP5 ARNm, esperava-se que, embora tanto o miR-15a e o FKBP5 seria regulado de forma ascendente no precipitado Ago-2 (tal como mostrado pelos resultados de microarranjo, figura 20B), os níveis totais de mRNA ou de proteína da FKBP5 na amostra da amígdala seria diminuído.

[00550] A fim de analisar se a interação entre o miR-15a e o FKBP5 ocorre na amígdala, foi realizada uma análise de PCR em tempo real em amostras de RNA total obtido a partir da amígdala de ratos “Suscetíveis” e de controle. Conforme mostrado nas figuras 21A-B, os níveis de miR-15a foram aumentados no extrato de RNA total feitos a partir de ratos suscetíveis ao passo que os níveis FKBP5 foram reduzidos. Estes resultados indicam que o miR-15a reprime os níveis de FKBP5 na amígdala seguinte à condição de estresse crônico.

[00551] A clonagem das formas 3’UTR intactas e mutadas de FKBP5 para análise de arranjos de luciferase é realizada de modo a descobrir se uma interação direta entre o miR-15a e FKBP5 ocorre in vitro.

[00552] Além do FKBP5, o miR-15 pode potencialmente regular um número de genes que estão envolvidos na resposta ao estresse, incluindo o Stx1a (sintaxina 1a), Sgk1 (soro/glicocorticoide quinase regulada) e ADRB2 (figura 22).

EXEMPLO 4C O miR-181 REGULA OS RECEPTORES DE GLUTAMATO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS CLONAGEM DE 3’UTRS DENTRO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA LUCIFERASE PSICHECK2

[00553] Sequências 3’UTR de Grm1, Grik3, Grm5, Grik2 e Grm7 foram amplificadas por PCR a partir do DNA genômico do rato. Fragmentos 3’UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) ou vetor pJET1,2 (Fermentas), de acordo com as orientações do fabricante, e na sequência subclonados dentro de um local NotI ou XhoI simples na extremidade 3’ da luciferase no plasmídeo relator do Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.

FRACASSO SOCIAL CRÔNICO

[00554] Os ratos foram submetidos ao protocolo de fracasso social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo, onde interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claras e perfuradas foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias.

RESULTADOS

[00555] Níveis de miR-181d foram significativamente aumentados em ratos que sofreram de estresse crônico (figura 23). Na tentativa de encontrar as interações entre o miR-181 e potenciais ARNm alvos, os inventores descobriram que o miR-181 pode potencialmente regular muitos tipos de receptores de glutamato Em geral, os receptores de glutamato podem ser divididos em dois grupos, os receptores de glutamato ionotrópicos (iGluRs), que formam a poro de canal iônico que é acionado quando o glutamato liga-se ao receptor, e os receptores de glutamato metabotrópicos (mGluRs), que, indiretamente, ativam os canais de íons no plasma membrana através de uma cascata de sinalização que envolve as proteínas G.

[00556] Dos muitos subtipos específicos de receptores de glutamato, é costume referir-se a subtipos principais de um produto químico que se liga a ele de forma mais seletiva do que o glutamato. A pesquisa, no entanto, está em curso, conforme os subtipos são identificados e as afinidades químicas são medidas. Vários compostos são rotineiramente utilizados em pesquisa de receptores de glutamato e associados com os subtipos de receptores: Tabela 6: RECEPTORES DE GLUTAMATO CATEGORIZADOS DENTRO DOS SUBGRUPOS.

[00557] Conforme ilustrado nas figuras 24 e 25, de todas as metas previstas conservadas do miR-181, há 6 receptores de glutamato (Grm1, Grik3, Grm5, Gria2, Grik2 e Grm7).

[00558] Foi demonstrado anteriormente que o miR-181a controla a expressão Gria2 de superfície em neurônios do hipocampo [Saba. R. et al., Molecular and Cellular Biology (2012) 32(3):619-32]. Arranjos luciferase estão sendo realizados a fim de verificar a interação miRNA-mRNA. Além disso, uma linha de ratos miR-181 KO condicional é cruzado com uma linha específica cre obtendo-se assim uma supressão de miR-181 em núcleos específicos do cérebro.

EXEMPLO 5A miR-182, UM SINTONIZADOR PRECISO DE ATIVIDADE NEURONAL NORMAL E DE COMPORTAMENTO PSICOPATOLÓGICO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS CLONAGEM DE 3’UTRS DENTRO DO PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DA LUCIFERASE PSICHECK2

[00559] A sequência 3’UTR de Htr1a foi ampliada a partir do DNA genômico do rato. Fragmentos 3’UTR PCR foram ligados dentro do vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante e na sequência subclonados dentro de um local Notl simples na extremidade 3’ da luciferase no plasmídeo relator Psicheck2 (Promega). A orientação de clonagem foi verificada por cortes diagnósticos e por sequenciamento.

ENSAIO DE LUCIFERASE E TRANFECÇÕES

[00560] As células HEK293T foram cultivadas em poli-L-lisina em 48 formato de poços para uma confluência de 70-85% e transfectadas utilizando Polietileneimina com os seguintes plasmídeos. A plasmídeo Psicheck2- 3’UTR, superexpressão pre-mmu-miR-182 em plasmídeo pEGFP ou plasmídeo pEGFP sozinho (clontech). 24 horas seguintes à transfecção as células foram lisadas e a atividade do relator de luciferase foram arranjadas conforme previamente descrito [Chen A. et al. Mol Endocrinol (2005) 19: 441-58]. Os valores de luciferase renila foram normalizados para controlar os níveis de luciferase vagalume (transcrito a partir do mesmo vetor, mas não afetado pelo 3ÚTR testado) e com a média calculada através de seis repetições de poço por condição.

FRACASSO SOCIAL CRÔNICO

[00561] Os ratos foram submetidos ao protocolo de fracasso social, conforme previamente descrito [Krishnan V. et al. Cell (2007) 131: 391-404]. Em suma, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo e interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante este tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso mostrou uma postura de subordinação. Divisórias de plexigás claros e perfurados foram, então, colocadas entre os animais e os ratos permaneceram na mesma gaiola por 24 horas para permitir um contato sensorial. O procedimento foi, então, repetido com um rato ICR não familiar por cada um dos próximos 10 dias.

MICRODISSECAÇÃO DOS NÚCLEOS DAS RAFES E COLETAS DE PLASMA

[00562] Amostras cerebrais foram tomadas de núcleos das rafes (RN) de ratos após a remoção do cérebro e a colocação do mesmo em matriz cerebral acrílica (Stoelting). Pedaços foram retirados utilizando as lâminas tipo navalha padrão (GEM) com base nos marcadores atômicos designados. Foram usadas seringas 14G embotadas para extrair a região do RN de pedaços de 3 mm removidos da matriz.

PURIFICAÇÃO DO MicroRNA E ANÁLISE DE EXPRESSÃO RT-PCR QUANTITATIVA

[00563] mRNAs, incluindo os microRNAs, foram isolados dos neurônios classificados, perfurações cerebrais congeladas e plasma utilizando o minikit miRNeasy (Qigen), de acordo com as instruções do fabricante, e tratados utilizando o kit mRNA de transcrição Reversa miScript para gerar cDNA. Amostras de cDNA foram, então, analisadas utilizando o kit SYBR®Green PCR (Qiagen), de acordo com as orientações do fabricante no termociclador AB 7500 (Applied Biosystems). Iniciadores específicos para cada miR foram utilizados juntamente com o iniciador universal comercial, enquanto que o U6 snRNA foi utilizado como controle interno.

CLONAGEM DE miR182 SOBRE O VETOR DE EXPRESSÃO VIRAL

[00564] O Pre-miR-135b foi amplificado pelo PCR a partir do DNA genômico do rato com os iniciadores, adicionando locais AgeI de enzimas de restrição e, então, foi inSlc6a4ed para o vetor pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI). Após a sequenciação do pGEM-T Easy e da digestão de ambos os vetores pGEM-T Easy e pEGFP (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA) com o AgeI, a sequência prematura de miR-182, foi ligada ao vetor pEGFP para construir o plasmídeo de expressão pEGFP-miR-182. Posteriormente, o pEGFP-miR-182 foi cortado por BamHI e BsrGI em paralelo ao corte pCSC-E/Syn-eGFP plasmídeo com as mesmas enzimas, e a sequência de miR-182-eGFP foi ligada ao pCSC-E/Syn para construir o pcSC-eSNY-pre-miR-182-eGFP plasmídeo, que foi confirmado por análise com endonucleases de restrição e sequenciação de DNA.

PRODUÇÃO DE VETORES LENTIVIRAIS

[00565] Lentivírus recombinantes foram produzidos pela transfecção transiente nas células HEK293T, conforme descrito anteriormente [Naldini L et al., Proc Natl Acad Sci U S A (1996) 93:11382-8]. Em suma, os lentivírus infecciosos foram colhidos em 48 e 72 horas após a transfecção, filtrados através de filtros de acetato de celulose com poro de 0,45 pm e concentrados por ultracentrifugação.

RESULTADOS

[00566] Até o momento o miR-182 foi relatado principalmente em estudos relacionados ao câncer, tais como células de adenocarcinoma de pulmão humano, glioma, câncer de mama, câncer de bexiga, melanoma e reparo de DNA. Além disso, o miR-182 foi tido como envolvido em processos de desenvolvimento, tais como desenvolvimento do ouvido interno e da retina, e no sistema imunológico na ativação dos linfócitos T e na doença de lúpus. No sistema nervoso, o mi-R182 foi implicado em órgãos sensoriais específicos dos gânglios da raiz dorsal do rato e como um modulador do relógio circadiano, enquanto uma correlação entre as variações genéticas de pre-miR-182 foram encontradas em pacientes com depressão grave [Saus E et al., Hum Mol Genet. (2010) 19(20):4017-25]. Além disso, o miR-182 foi listado entre outros 12 miRs como regulados de forma descendente em ratos machos resilientes a comportamentos indefesos aprendidos do córtex pré- frontal. (2011) 1-11].

[00567] A Análise Bioinformática de Htr1a 3’UTR realizada como parte da análise de microarranjo 5HT miRs implicou em uma possível segmentação deste gene por miR-182. Portanto, os inventores realizaram os testes in vitro através de um arranjo de luciferase, o qual revelou uma forte repressão do Ht1a 3’UTR por miR-182 (figura 8). Duas sequências de combinações de semente conservadas de miR-182 apareceram no Htr1a do rato 3 ‘UTR.

[00568] Estudos de regulação indicaram uma forte tendência a diminuição da regulação do miR-182 em níveis de expressão do RN de ratos machos adultos expostos a fracasso social crônico em comparação com os controles (figura 9), sugerindo o envolvimento do miR-182 em resposta aos estímulos ambientais moleculares conhecidos como comportamentos doo tipo depressivos induzidos.

[00569] A geração de análise bioinformática adicional visando previsões para o miR-182 em dois bancos de dados revelou uma longa lista de potenciais alvos, incluindo genes relacionados à atividade neuronal, tanto em condições normais quanto em patológicas (figura 10).

[00570] De forma a testar ainda mais o miR-182 in vitro para identificação de interações miR alvo específicas, e para revelar o miR-182 em função de regulação de comportamentos normais e patológicos in vivo, o plasmídeo e os sistemas lentivirais para manipulação do miR-182 foram desenvolvidos. A superexpressão de lentivírus específicos neuronais foi transformada (figura 11A) e testada in vitro na linha de célula neuronal N2a. Estes resultados demonstram um aumento de miR-182 em níveis de células infectadas com a superexpressão de lentivírus do miR-182 em comparação com o controle (figura 11B). Sequência de plasmídeo de silenciamento específica para miR-182 chamado miArrest (Genecopoeia, Rockville, MD, EUA, figura 11C) foi comprada e subclonada para estruturas virais (figura 11C). Estes sistemas são testados em culturas de células e pelo local da injeção específico para cérebros de ratos adultos.

[00571] Ratos nulos para miR-182 são desenvolvidos a fim de investigar o papel dos miRs no desenvolvimento de retina. Recentemente, os inventores obtiveram pares reprodutores para esta linha, e sobre uma geração de uma colônia, miR-182 KO e seus companheiros de gaiolas WT estão sendo fenotipados comportamental e fisiologicamente.

EXEMPLO 6 REGULAÇÃO DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO miR182 POR ESTRESSE AGUDO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

[00572] Conforme descrito no Exemplo 5A acima

RESULTADOS

[00573] O efeito do estresse agudo sobre o nível miR182 foi examinado. Tal como ilustrado na figura 26, o estresse de imobilização aguda conduziu à diminuição dos níveis de expressão do miR182 em núcleo da rafe de ratos (RN), 24 horas após a indução do estresse (P <0,01). O miR182 demonstrou uma redução dos níveis de expressão no núcleo da rafe tanto após o estresse agudo quanto após o crônico, sugerindo que tem um papel na modulação das respostas moleculares ao estresse no núcleo de rafe, possivelmente afetando seu gene alvo HT1A modulando os níveis de 5-HT na sinapse.

ARRANJO DE INTERAÇÃO miR-ALVO PARA OS GENES ALVO miR182 PREVISTOS

[00574] Usando um arranjo de luciferase, onze genes alvo de miR182 previstos escolhidos após bioinformática extensivas, foram examinados (figura 27). Os 3’UTRs dos genes-alvo foram testadoss in vitro para verificar se o miR182 tem um efeito repressivo conforme medido pela atividade do gene repórter da luciferase conjugada. Dos onze genes testados três genes: Dscam (Molécula de Adesão Celular da Síndrome de Down), L1CAM (molécula de adesão celular L1) e Tsnax (proteína X associada à translina) demonstraram efeito repressivo por miR182 como no arranjo de luciferase (figura 27). Ao testar o 3’UTR do gene alvo de miR182 listado acima, uma sequência conservada de combinação de semente miR182 foi observada tanto no Tsnax, L1CAM quanto no Dscam, sugerindo que esta interação miR-alvo tem um papel funcional (dados não mostrados).

[00575] Em seguida, foi verificado o efeito repressivo direto do miR182 nestes três genes. Portanto, os 3’UTRs foi mutado para remover a sequência de combinação de semente miR182 e comparou-se os 3’UTRs regulares com os mutantes uma in vitro por arranjo de luciferase. O efeito repressivo do miR182 em L1CAM 3’UTR foi abolido quando sua sequência de combinação de semente foi mutada (figura 28), e da mesma forma o efeito do miR182 em Tsnax foi abolido no 3’UTR mutante (figura 29), indicando que o miR182 alvejava este gene diretamente. Uma verificação semelhante para Dscam e Htr1a com mutação 3’UTR é executada.

[00576] Um modelo de ratos com falta de miR182 é utilizado para estudar a interação entre o miR182 e seus genes-alvo in vivo. Os inventores estão examinando o fenótipo comportamental de ratos miR182KO em testes de comportamento social, aprendizagem e memória, e os comportamentos do tipo esquizofrenia.

EXEMPLO 7 ESTABELECIMENTO DE UM SISTEMA DE SILENCIAMENTO DO miR135; CLONAGEM, GERAÇÃO DE LENTIVÍRUS E VALIDAÇÕES IN VITRO E IN VIVO MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS CLONAGEM DE VETOR VIRAL miR135 KD

[00577] O plasmídeo miR135b KD pEZX-H1-miR135KD-CMV- mCherry e o controle pEZX-H1-controle KD-CMV-mCherry foram adquiridos a partir da GeneCopeia (EUA). O promotor H1 e a sequência de KD foram amplificados utilizando iniciadores de flanqueamento com NheI e ligados ao pGEM-T Easy. Após o sequenciamento do pGEM-T Easy e da digestão de ambos pGEM-T Easy e p156-pRRL-CMV-GFP com o local NheI, H1-KD miR e o apelidado p156 foram ligados para gerar p156-pRRL- H1-miR135bKD-CMV-GFP e p156-pRRL-H1-controle KD-CMV-GFP.

RESULTADOS

[00578] Para avaliar o efeito dos níveis de miR135 diminuídos em RN de ratos de 5-HT relacionados com comportamentos, um inibidor miR135b baseado em plasmídeo foi utilizado e a sua eficiência foi testada num ensaio de luciferase. Neste arranjo, as células HEK293T foram cosseccionadas com plasmídeos miR135OE, miR135KD e 3’UTR, e a capacidade do plasmídeo miR135bKD bloquear o efeito repressor do miR135 em SLC6A4 e Htr1a 3 ‘UTR foi testado. O efeito repressor do miR135b do Htr1a 3’UTR foi bloqueado elo plasmídeo miR135KD (figura 30A). Similarmente, o efeito do miR135b no Slac6a4 3’UTR foi bloqueado pelo miR135KD (figura 30B). Estes resultados indicam que o plasmídeo miR135KD de fato bloqueia a atividade biológica do miR135.

[00579] A sequência miR135KD e uma sequência de controle que foram subclonadas para um vetor viral (figura 30C) e lentivírus expressando o diferente da sequência de silenciamento (KD) foram gerados. A fim de testar a capacidade dos lentivírus para infectar o tecido cerebral, o RN dos ratos foi infectado com qualquer um dos lentivírus.

[00580] De fato, a infecção causou a expressão do GFP (figuras 30D- E) demonstrando a capacidade dos lentivírus miR135bKD de infectar o tecido cerebral.

EXEMPLO 8 EFEITOS COMPORTAMENTAIS DO SILENCIAMENTO DO miR135 NO RN DE RATOS ADULTOS. MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS

[00581] Os ratos foram caracterizados comportamentalmente utilizando os testes para a ansiedade e comportamentos do tipo depressivo semelhantes aos descritos no Exemplo 6 acima.

RESULTADOS

[00582] Após a validação in vitro e in vivo dos lentivírus miR135KD, eles foram utilizados para manipular os níveis de miR135 no RN e para testar os seus efeitos sobre o comportamento dos ratos. Os ratos adultos foram injetados ou com lentivírus miR135KD ou com lentivírus KD de controle para o RN e depois do período de recuperação foram testados para a ansiedade e comportamentos do tipo depressivo. Uma vez que o miR135 reprime os reguladores negativos de 5-HT, espera-se que o miR135KD leve à diminuição dos níveis de 5-HT na sinapse e, portanto, a um aumento dos comportamentos do tipo ansiedade e depressão.

[00583] No teste de campo aberto não foram observadas diferenças entre os grupos (figura 31-A), no entanto, no teste de labirinto para pulso elevado, os ratos miR135KD demonstraram um comportamento tipo de ansiedade mais alto, demonstrando uma tendência a passar menos tempo nos braços de abertura (P = 0,0644) e visitar menos vezes os braços de abertura (P = 0,0572 figura 31B). Além disso, os ratos miR135KD caminharam significativamente por uma distância menor nos braços de abertura (P = 0,0433) e tiveram maior tendência a visitar os braços de abertura (P = 0,0124 figura 31B). Da mesma forma, no teste de luz negra realizado sob condições de estresse basais, os ratos miR135KD demonstraram um aumento significativo no comportamento do tipo ansiedade em comparação com os controles por gastarem menos tempo à luz (P = 0,0454 figura 31C), visitando menos vezes a câmara de luz (P = 0,0107 figura 31D) e andando uma distância menor na câmara de luz (P = 0.0402s figura 31E). Os resultados ilustraram uma diminuição nos níveis miR135 de 40 min. e 24 horas após o estresse agudo (figura 30A-B), portanto, a presente teoria era que os ratos R135KD estressados não diferem de seus controles em comportamentos do tipo ansiedade, como quando testados após estresse agudo, uma vez que os ratos de controle também teriam níveis miR135 diminuídos devido ao estresse. De fato, não havia nenhuma diferença entre os grupos quando retestados no teste de transferência de luz negra em qualquer um dos parâmetros, tanto quando testada 40 minutos como 24 horas após o estresse agudo (figura 31C-E).

[00584] Comportamentos do tipo depressivo de miR135KD foram testados tanto em condições basais como após a manipulação farmacológica. Uma vez que os níveis de miR135 mostraram um aumento no RN após a administração de SSRI (figura 31E), especulou-se que a redução de níveis de miR135 pode levar a uma resposta reduzida ao SSRI. No teste de suspensão pela cauda realizado tanto em níveis basais como após a administração de SSRI, não houve diferença entre os ratos KD miR135b e os ratos KD de controle quanto ao tempo de imobilidade (figura 31F), e a diminuição esperada no tempo de imobilidade devido a um tratamento por SSRI foi observada (P <0,0008). No entanto, no teste de nado forçado, adicionalmente ao efeito principal para o SSRI injetável (P <0,0001), os ratos miR135KD injetados com SSRI ficaram mais imóveis nos últimos 2 minutos de teste, em comparação com ratos KD de controle (P = 0,0141 5 minutos, P = 0,0404 6 minutos; figura 31G sugerindo uma atenuação dos efeitos antidepressivos SSRI, reduzindo os níveis miR135 no RN. Este resultado implica que o miR135 é parte da alternância endógena levando a mudanças comportamentais provocadas pelo SSRI.

EXEMPLO 9 SUPEREXPRESSÃO miR135 NOS NEURÔNIOS 5-HT MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

[00585] Os ratos com superexpressão do miR135a em neurônios 5-HT foram comparados com controles da mesma ninhada, tanto nos níveis de expressão de miR135 como em seus genes alvo e comportamentalmente.

RESULTADOS

[00586] Os efeitos da manipulação dos níveis de miR135 especificamente em neurônios 5-HT no RN de ratos foram testados para comportamentos do tipo ansiedade e depressão. Para esse efeito, um sistema genético foi desenvolvido utilizando o sistema Cre-loxP. Especificamente, a especificidade do 5-HT foi obtida utilizando os ratos ePet Cre que expressa a recombinase Cre especificamente nos neurônios RN positivos de 5-HT e superexpressão miR135 foi realizada através do cruzamento da linha de Cre específica do 5-HT (ePet Cre) com a linha de rato transgênico com superexpressão condicional para o miR135a (figura 32).

[00587] O nível de expressão miR135 no RN de ratos que sobrexpressam o miR135 especificamente em neurônios 5-HT (miR135OE) foi testado para o PCR em tempo real para o miR135 e comparado com ratos de controle, positivo para o alelo superexpressão condicional do miR135, mas negativo para ePet CRE. Os ratos miR135OE demonstraram cerca de 2 vezes de superexpressão em comparação com ratos de controle (figura 33A, P <0,05). Os níveis de superexpressão do miR135 foram semelhantes aos níveis medidos no RN de ratos após a administração do SSRI, sugerindo que esta linha de ratos era um bom modelo para o estudo das características antidepressivas do miR135. Além disso, o miR135 do gene alvo ARNm, Slc6a4 (figura 33B, P <0,05) e Htr1a (figura 33C, P <0,1) foram sub- regulados no RN de ratos miR135OE comparado com o controle demonstrando a repressão in vivo pelo miR135 dos seus genes-alvo.

[00588] A fim de testar a sobrexpressão do miR135 especificamente em neurônios 5-HT, os ratos miR135OE e seus controles da mesma ninhada foram expostos ao paradigma de fracasso social crônico, um processo conhecido por induzir os comportamentos do tipo depressão e ansiedade e, posteriormente, foram testados para a comportamentos do tipo ansiedade e depressão.

[00589] Os ratos miR135OE demonstraram um aumento no comportamento do tipo ansiedade após fracasso social em relação aos companheiros da gaiola de controle. Em campo aberto, uma tendência para o aumento da ansiedade foi observada em ratos miR135OE em relação ao tempo e ao número de visitas ao centro (P <0,1, figura 34A). Durante o teste de transferência de luz negra os ratos miR 135OE passaram mais tempo na luz (P <0,05, figura 34B) e menos tempo na câmara de luz (P <0,01, figura 34B). Resultados semelhantes foram observados no labirinto de pulso elevado (P <0,05, figura 34B), enquanto os ratos miR135OE passaram mais tempo nos braços de abertura (P <0,05, figura 34C) e percorreram maior distância nos braços de abertura (P <0,05, figura 34C).

[00590] Comportamentos do tipo depressão de ratos miR135OE após fracasso social foram mais baixos do que os companheiros de controle. Uma tendência para a diminuição do tempo de imobilidade dos ratos miR135OE em comparação com os controles foi observado no teste de suspensão pela cauda (P <0.1, figura 34D), juntamente com uma significativa diminuição do tempo de imobilidade no teste de nado forçado (P <0,05, figura 34E).

MATERIAIS E PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS PARA SEÇÃO DE miR-135 MICROARRANJO DE MicroRNA DE NEURÔNIOS 5HT

[00591] As células do metencéfalo do dia embrionário 12 de ratos ePet-EYFP foram classificadas por FACS para distinguir os neurônios positivos 5HT YFP das células negativas não 5HT YFP ao redor conforme anteriormente descrito (Wylie et al., 2010). O RNA total, incluindo a população de miRNA, com 3 repetições biológicas de cada tipo de célula foi purificado, rotulado e hibridizado no Microarranjo de miRNA de Rato Agilent Mouse (Agilent Tech, Mississauga, ON, Canada) número do projeto 021828 com base na liberação de miRBase Sanger 12.0 de acordo com as instruções do fabricante. Os microarranjos foram digitalizados e os dados foram extraídos e processados usando o Software de Extração de Característica (Agilent Technologies). Após digitalização, os dados de saída de intensidade dos arquivos GeneView.txt foram analisados para quantificar expressão relativa diferencial dos microRNAs usando o Partek® Genomics Suite (Partek Inc., St. Louis, MO). Os dados foram transformados em log2, cuantil normalizado e filtrado de acordo com a bandeira “gIsGeneDetected” no arquivo GeneView. De 666 miRs de murino, 198 permaneceram para análise adicional após essa etapa de filtragem. miRs expressos de forma diferencial foram, então, identificados usando um limiar de uma mudança de 1,5 vez.

CLONAGEM DE TRANSCRITOS 3’ UTRS ALVO EM PLASMÍDEO DE EXPRESSÃO DE PSICHEK-2 LUCIFERASE

[00592] Sequências de 3’ UTRs de Slc6a4 e Htr1a foram PCR amplificados a partir do DNa genômico do rato. Os fragmentos de PCR 3’UTRs foram ligados no vetor fácil pGEM-T (Promega) de acordo com as orientações do fabricante, e subclonado adicionalmente em um local único de NotI na extremidade 3’ da luciferase no plasmídeo repórter psiCHECK-2 (Promega). As sequências 3’ UTR mutadas, sem sequências de semente miR- 135, foram sintetizadas com saliências do iniciador através da sequência de correspondência de semente. A orientação de clonagem foi verificada pelos cortes de diagnóstico e sequenciamento. Tabela 7: INICIADORES DE OLIGONUCLEOTÍDEO UTILIZADOS PARA CLONAGEM.

ENSAIOS DE TRANSFECÇÃO E LUCIFERASE

[00593] As células HEK293T foram cultivas em poli-L-lisina em uma placa de cultura de tecido de 70 a 85% de confluência e transfectada usando polietilenoimina com os seguintes plasmídeos: plasmídeo psiCHECK-2 contendo o 3’ UTR tipo selvagem ou mutado e o vetor de superexpressão para um miRNA específico (miR-135a conforme estabelecido na ID SEQ. N° 210 ou miR-135b conforme estabelecido nas ID SEQ. N° 211), ou plasmídeos de superexpressão vazia. Vinte e quarto horas após transfecção, as células foram lisados e as atividades repórter luciferase foram avaliadas conforme previamente descrito (Kuperman et al., 2011). Os valores de luciferase Renilla foram normalizados para controlar o nível de luciferase do vagalume, transcritos a partir do mesmo vetor, mas não afetados por 3’ UTR, então testados e mediados através de seis repetições por condição.

ANIMAIS E ALOJAMENTO

[00594] Ratos machos C57BL/6 adultos (Harlan, Jerusalem, Israel) foram utilizados para os experimentos lentivirais in vivo. Os ratos ePet-Cre que expressam Cre recombinase especificamente em neurônicos serotonérgicos foram utilizados conforme descrito anteriormente (Scott et al., 2005). Os ratos transgênicos que carregam um cassete condicional para superexpressão de miR-135 também foram utilizados. Os ratos foram alojados em uma sala com temperatura controlada (22 ± 1°C) em um ciclo claro/escuro de 12 h reverso. Alimento e água estavam disponíveis ad libitum. Todos os protocolos experimentais foram realizados nos ratos machos e foram aprovados pelo Comitê de Uso e Cuidado Animal Institucional do Instituto Weizmann de Ciências.

MODELO DE RATO DE HIPERATIVIDADE INDUZIDA POR ANFETAMINA

[00595] Nesses experimentos, os ratos são igualmente divididos em 4 grupos de tratamento. Os ratos são pré-tratados com miR-135, lítio, valproato, ou solução salina (controle) e, então, metade dos ratos em cada grupo são administrados com anfetamina (0,5 mg/kg subcutaneamente (s.c.)) e a outra metade é dada solução salina (s.c.).

[00596] Alternativamente, os ratos são primeiro administrados com anfetamina (0,5 mg/kg subcutaneamente (s.c.)) ou solução salina (s.c.) seguida pelo tratamento com miR-135, lítio, valproato, ou solução salina (controle).

[00597] Dez minutos depois, todos os ratos são colocados no medidor de atividade, os ratos pré-tratados ou tratados com miR-135 são comparados aos ratos não tratados (grupo de controle) e ao ratos pré-tratados ou tratados com lítio ou com valproato. Uma semana depois, o procedimento é repetido.

MODELO DE RATO DE HIPERATIVIDADE INDUZIDA POR CETAMINA

[00598] Nesses experimentos, os ratos são igualmente divididos em 4 grupos de tratamento: controle, lítio, valproato e ratos tratados com miR-135 e são tratados da seguinte maneira: Os ratos são pré-tratados (por 14 dias) com miR-135, lítio (47,5 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia), valproato (200 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia), ou com solução salina (i.p., duas vezes ao dia) como um controle. Entre os dias 8 e 14, esses ratos são tratados com cetamina (25 mg/kg, i.p.) ou solução salina.

[00599] Em um protocolo reverso, os ratos são administrados com cetamina (25 mg/kg, i.p.) ou solução salina primeiro seguido pela administração de miR-135, lítio, valproato, ou solução salina por 7 dias. Então a atividade do rato é monitorada conforme discutido aqui.

FRACASSO SOCIAL CRÔNICO

[00600] Os ratos foram submetidos a um protocolo de fracasso social, conforme descrito anteriormente (Elliott et al., 2010). Em resumo, os ratos foram colocados em uma gaiola de um rato ICR agressivo onde eles interagiram fisicamente por cinco minutos. Durante esse tempo, o rato ICR atacou o rato intruso e o intruso exibiu postura subordinada. As divisórias claras perfuradas de Plexiglás foram, então, colocadas entre os animais e o rato permaneceu na mesma gaiola por 24 horas para permitir contato sensorial. O procedimento foi então repetido com rato ICR não familiar por 10 dias consecutivos.

TRATAMENTO ANTIDEPRESSIVO

[00601] Os ratos receberam injeção i.p. da imipramine tricíclica, do SSRI, fluoxetina, ou do NRI, reboxetina (20 mg/kg em solução salina), ou solução. As injeções crônicas foram realizadas por 18 a 21 dias consecutivos, e injeção aguda foi realizada 24 horas antes da microdissecação do cérebro. Para teste comportamental, os ratos foram injetados com 20 mg/kg de SSRI i.p. 30 minutos antes do teste.

MICRODISSECAÇÃO DO CÉREBRO

[00602] As amostras do cérebro foram tomadas dos núcleos da rafe (RN) dos ratos usando uma matriz de cérebro acrílica (Stoelting). Fatias foram tiradas usando giletes padrão com base nos marcadores anatômicos designados. Seringas Blunted 14G foram utilizadas para extrair a região da rafe de fatias de 2 mm e o tecido foi mantido a -70°C até purificação de RNA.

PURIFICAÇÃO DE MicroRNA E ANÁLISE DE EXPRESSÃO DE PCR EM TEMPO REAL

[00603] mRNAs incluindo microRNAs foram isolados usando minikit miRNeasy (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante, e tratados usando kit de transcrição Reversa miScript para gerar o cDNA. Amostras foram, então, analisadas usando kit PCR SYBR®Green (Qiagen) de acordo com as orientações do fabricante no termociclador AB 7500 (Applied Biosystems). Os iniciadores específicos para cada miR foram utilizados juntos com o iniciador universal comercial, enquanto snRNA U6 foi utilizado como um controle interno. Para quantificação de mRNA, iniciadores específicos foram projetados para cada transcrito usando o software “iniciador expresso 2” e a expressão foi testada usando PCR em tempo real conforme descrito anteriormente (Haramati et al., 2011). Tabela 8: INICIADORES DE OLIGONUCLEOTÍDEO UTILIZADOS PARA PCR EM TEMPO REAL DE MicroRNA Tabela 9: INICIADORES DE OLIGONUCLEOTÍDEO UTILIZADOS PARA PCR EM TEMPO REAL DE mRNA

CLONAGEM DE ESTRUTURAS LENTIVIRAIS DE SILENCIAMENTO DE miR-135, PRODUÇÃO DE LENTIVÍRUS E VERIFICAÇÕES IN VITRO

[00604] Plasmídeo de silenciamento (KD) de miR-135 pEZX-H1-miR- 135KD-CMV-mCherry e pEZX-H1-control KD-CMV-mCherry de controle foram comprados da GeneCopeia (USA). O promotor H1 e a sequência de KD foram amplificados utilizando iniciadores contendo local de flanqueamento de NheI e foram ligados ao vetor pGEM-T Easy. O fragmento de KD H1-135 KD foi subclonado na estrutura lentiviral p156-pRRL-CMV- GFP utilizando o local de restrição de NheI resultando nas estruturas lentivirais p156-pRRL-H1-miR-135bKD-CMV-GFP e p156-pRRLH1- controle KD-CMV-GFP, que foram confirmadas, ainda, por sequenciamento de DNA. Os lentivírus recombinants foram produzidos por transfecção transiente nas células HEK293T, conforme descrito anteriormente (Tiscornia et al., 2006). Em resumo, os lentivírus infecciosos foram colhidos 48 e 72 horas pós-transfecção, filtrados através de filtros de acetato de celulose com poro de 0,45 μm e concentrados por ultracentrifugação. Para verificação eficaz de KD de miR-135, as linhagens de célula da rafe do rato (RN46A) foram infectadas com KD de miR-135 ou lentivírus de KD de controle, e 48 depois, mRNA foram colhidos e os níveis de expressão de Htr1a e Slc6a4 foram testadoss usando PCR em tempo real.

INFECÇÕES INTRACEREBRAIS DE LENTIVÍRUS

[00605] Para cirurgia estereotáxica e distribuição, um instrumento estereotáxico guiado por computador e um nanoinjetor motorizado foram utilizados (Angle TwoTM Stereotaxic Instrument, myNeurolab) conforme descrito anteriormente (Lebow et al., 2012). Os ratos foram colocados em um aparelho estereotáxico sob anesthesia geral e a preparação lentiviral foi distribuída para coordenadas determinadas conforme definido pelos atlas Franklin e Paxinos para DR: ML 0 mm; AP - 4,6 mm; DV -3,9 mm em inclinação 300. As injeções foram realizadas em uma taxa de 0,2 μl / 1 min. Após duas semanas do período de recuperação, os ratos foram submetidos a estudos comportamentais e fisiológicos. Após fenotipagem, os ratos foram anestesiados e perfundidos com paraformaldeído a 4% tamponado de fosfato. Os cérebros fixados foram seccionados em série em fatias de 30 mm a fim de confirmar a localização do local da injeção, utilizando imuno-histoquímica.

IMUNO-HISTOQUÍMICA

[00606] O procedimento utilizado para imunohistoquímica é conforme descrito anteriormente (Regev et al., 2011). Para imunocoloração de GFP, o anticorpo anti-GFP biotinilado foi utilizado levantado na cabra como anticorpo primário (Abcam, Cambridge, RU), e estreptavidina conjugada Cy2 como anticorpo secundário (Jackson Immunoresearch Laboratories Inc, West Grove, PA, USA).

AVALIAÇÕES COMPORTAMENTAIS

[00607] Todas as avaliações comportamentais foram realizadas durante a fase escura após habituação à sala de teste por 2 horas antes de cada teste. Os ratos foram testadoss para comportamento do tipo ansiedade utilizando os testes de labirinto em cruz elevado, transferência claro-escuro e de campo aberto e para comportamento do tipo depressão usando o teste de nado forçado.

[00608] Teste de campo aberto: O teste de campo aberto foi realizado em uma caixa branca 50 x 50 x 22 cm, iluminada para 120 lux. Os ratos foram colocados na caixa por 10 minutos. A locomoção dos ratos na caixa foi quantificada usando um sistema de monitoramento por vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburg, Alemanha).

[00609] Teste de transferência claro-escuro: O aparelho do teste de transferência de claro-escuro consistiu em um caixa de cloreto de polivinila dividida em um compartimento escuro preto (14 x 27 x 26 cm) e um compartimento claro branco conectado iluminado com 1200 lux (30 x 27 x 26 cm). Durante o teste de 5 minutos, o tempo gasto no compartimento claro, a distância viajada na luz e o número de transições de claro-escuro foram quantificados com um sistema de monitoramento por vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburg, Alemanha).

[00610] Teste de labirinto em cruz elevado: Esse aparelho de teste tem o formato de um sinal de mais e contém 2 paredes de barreira e 2 braços abertos iluminados (6 lux). Durante o teste de 5 minutos, a distância viajada e o tempo gasto nos braços abertos foram automaticamente classificados usando um sistema de monitoramento por vídeo (VideoMot2; TSE Systems, Bad Hamburg, Alemanha).

[00611] Teste de nado forçado modificado: O teste de nado forçado foi realizado conforme descrito anteriormente (Krishnan et al., 2007). O aparelho é um balde de plástico, com um diâmetro de 18 cm, preenchido com água a 25°C a uma profundidade de 15 cm. Cada rato foi colocado no centro do balde para iniciar uma sessão de teste gravada em vídeo de 6 minutos. A duração do tempo gasto imóvel nos 3 a 6 minutos do teste foi automaticamente classificada usando EthoVision XT (Noldus, Wageningen, Países Baixos).

[00612] Teste de anulação social: No teste de anulação social, os ratos for a colocados em uma arena de 15 cm x 35 cm com uma pequena câmara vizinha de 15 cm x 8 cm separada por uma divisória com pequenas fendas abertas que permitem contato sensorial total. Os ratos testados foram deixados habituar-se à arena por três minutos, e então um rato ICR não familiar foi colocado na câmara vizinha por mais 3 minutos. O tempo gasto perto da divisória foi quantificado usando monitoramento por vídeo através do software Ethovision (Noldus, Wageningen, Países Baixos). A razão de interação foi calculada ao dividir o tempo que os ratos gastaram em uma área definida perto do ICR não familiar pelo tempo que os ratos gastaram na mesma área durante a habituação e multiplicado por 100.

MICRODISSECAÇÕES, PREPARAÇÃO DA AMOSTRA E ANÁLISE DE HPLC-ED DAS CONCENTRAÇÕES DE 5HT E 5-HIAA

[00613] As microdissecações foram realizadas conforme descrito anteriormente (Neufeld-Cohen et al., 2010a) usando a técnica de microdissecação Palkovits (Palkovitz, 1988). As seções cerebrais coronais (300 μm) foram tiradas usando um criostato Leica CM1950 (North Central Instruments, EUA). As seções foram montadas nas lâminas de vidro e microdissecadas em uma placa fria a -10°C sob um estereomicroscópio usando agulhas de microdissecação com diâmetros internos variáveis. As microdissecações foram, cada, colocadas em um tubo contendo 100 μL de tampão de acetato (3,0 g/L de acetato de sódio, 4,3 mL/L de ácido acético glacial; pH ajustado para 5,0). Em seguida, as amostras foram homogeneizadas e centrifugadas a 4°C e 13.000 rpm por 3 min. O pélete foi reconstituído com 175 μL de NaOH a 0,2 M para teor de proteína, e 50 μL do sobrenadante foram utilizados para detecção de 5HT e ácido 5-hidroxi- indolacético (HIAA) usando cromatografia líquida de alta eficiência com detecção eletroquímica (HPLC-ED | high performance liquid chromatography com electrochemical detection) conforme descrito anteriormente (Evans et al., 2008). As amostras foram colocadas em amostrador automático ESA modelo 542 injetando as amostras no sistema cromatográfico de HPLC (ESA, Chelmsford, MA, EUA). O sistema de HPLC também consistiu em um Módulo de Distribuição de Solvente ESA Modelo 582 para bombear a fase móvel (9,53 g/L de di-hidrato ortofosfato de di-hidrogênio de potássio, 300 mg/L de ácido octanossulfônico, 35 mg/L de EDTA, 920 mL/L de HPLC grau H20 e 80 mL/L de HPLC grau metanol; pH ajustado para 3,4 usando ácido ortofosfórico) através do sistema cromatográfico. A fase estacionária, onde a separação cromatográfica ocorreu, consistiu em um sistema de coluna/pré- coluna integrada (Ultrasphere-XL 3 μm Octyl Guard Cartridge, 5/70 x 4,6 mm; MAC-MOD Analytical, EUA). A detecção eletroquímica foi realizada usando um detector ESA Modelo 5200A Coulochem II com potenciostatos duplos conectados a um Célula de Condicionamento ESA 5021 com o potencial de eletrodo ajustado a 0 mV e uma Célula de Microdiálise ESA 5014B com os potenciais de eletrodo do canal 1 e canal 2 ajustados a 25 mV e 250 mV, respectivamente. Para cada execução, as alturas de pico média de concentrações conhecidas de 5HT e 5-HIAA foram determinadas manualmente usando software de análise de cromatografia (EZChrom Elite para Windows, Versão 2.8; Agilent Technologies, EUA) e utilizadas para calcular a concentração das amostras desconhecidas. As concentrações de tecido de 5HT e 5-HIAA foram padronizadas para a quantidade de proteína.

ESTUDOS DE AMOSTRA HUMANA

[00614] Estudo de controle de caso: Onze pacientes do sexo masculino diagnosticados com depressão profunda (N=9) ou transtorno bipolar (N=2) e doze controles do sexo masculino saudáveis foram selecionados a partir de um estudo descrito em detalhes em (Menke et al., 2012). Em resumo, os pacientes foram recrutados do Instituto de Psiquiatria Max-Planck e os exames de sangue para RNA foram realizados dentro dos primeiros cinco dias da internação do paciente para uma síndrome depressiva. A pontuação média de HRDS na internação foi de 24,3 (SD: 5,3 e faixa de 17 a 32). Os controles rastreados quanto à ausência de transtornos psiquiátricos ao longo da vida usando a Entrevista Diagnóstica Compósita Internacional (CIDI | Composite International Diagnostic Interview) (Wittchen HU, 1999) e para ausência de sintomas psiquiátricos atuais usando o HRDS. O sangue total foi coletado usando um tubo de coleta de RNA de sangue total PAXgene (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Suíça) após 2 horas de jejum às 6 pm. RNA total foi isolado das amostras de sangue total PAXgene usando o Kit de RNA Sanguíneo PAXgene com o método Qiagen para purificação da coluna dos ácidos nucleicos (PreAnalytiX GmbH, Hombrechtikon, Suíça). A qualidade, a concentração e a pureza do RNA foram avaliadas usando um Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, EUA) e absorção UV de 260 nm (Nanofotômetro, Alemanha).

[00615] Terapia Cognitivo-Comportamental (CBT): Os pacientes para essa análise foram derivados de um teste clínico aleatório designado para identificar neuroimagem e outros preditores biológicos de remissão para terapia cognitivo-comportamental (CBT). Todos os pacientes forneceram consentimento informado por escrito antes da participação no estudo. O estudo foi conduzido de acordo com a Declaração de Helsinki e suas emendas e aprovado pelo Quadro de Revisão Institucional de Emory. O prjeto de estudo é descrito em detalhes em (Dunlop et al., 2012). Em resumo, os participantes elegíveis foram pacientes ambulatoriais adultos entre 18 e 60 anos de idade que atenderam aos critérios do Manual de Diagnóstico e Estatística de Transtornos Mentais (Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders), Quarta Edição (DSM-IV) para um diagnóstico primário de MDD sem características psicóticas. Os pacientes receberam 16 sessões de CBT. A CBT fornecida seguiu um protocolo padronizado (Beck et al., 1979). Todos os pacientes foram avaliados para mudança do sintoma semanalmente pelas primeiras 6 semanas usando a Escala de Classificação de Depressão de Hamilton (HRDS) e, então, a cada duas semanas pelas seis semanas restantes. Todos os pacientes tiveram uma pontuação HRDS de 15 ou mais na randomização. A partir desse estudo, 12 pacientes que fizeram exame de sangue para RNA na base de referência, semana 2 (N = 16) e semana 12 foram selecionados. Nenhum tratamento com fármaco atual foi permitido no exame de sangue da base de referência. 75% dos pacientes eram mulheres e 87% de Ancestrais Europeus. A idade média no grupo CBT foi de 42,4 (SD: 9,6) anos. O sangue total foi coletado nos tubos de RNA Tempus (Applied Biosystems) e extraído usando o kit Reagente de Isolamento de RNA Tempus Spin (Applied Biosystems). A qualidade e a quantidade de RNA foram medidas usando o Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA) e métodos fotométricos (Nanophotometer, Implen, Munique, Alemanha), respectivamente.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

[00616] Os dados foram expressos como média +/de SEM. Para testar a significância estatística, o teste t student foi utilizado nos casos onde apenas dois grupos foram comparados, tal como validação de dados de PCR em tempo real de microarranjo. ANOVA de uma via foi usada para comparação entre múltiplos grupos, tal como entre diferentes tratamentos no ensaio de luciferase. ANOVA de duas vias foi usada nos casos de duas variáveis independentes, tais como injeções de SSRI ou NRI, ambas em administração aguda ou crônica. A análise de medição repetida foi utilizada quando necessária. Os testes t post hoc foram utilizados conforme necessário para revelar a significância estatística. A análise estatística foi realizada usando o software Jmp7, e as diferenças entre os grupos foram consideradas significativas quando p < 0,05.

EXEMPLO 10 “IMPRESSÃO DIGITAL” DE MicroRNA DE NEURÔNIOS 5HT

[00617] Os neurônios 5HT foram isolados do RN de embriões ePet- EYFP, e seu perfil de expressão de miR foi comparado às células não 5HT, obtidas da mesma área do cérebro, usando microarranjo de miR (figura 35A). A validação de classificação de célula foi realizada ao comparar os níveis de expressão do mRNA de genes marcadores relevantes. YFP, o marcador fluorescente para os neurônios ePET-positivos foi significativamente enriquecido na população de 5HT (figura 35B), triptofano hidroxilase 2 (TPH2), uma enzima principal na produção de 5HT, foi robustamente expresso nas células 5HT (figura 35C) e glutamato descarboxilase 67 (GAD67), a enzima que catalisa a síntese de GABA, um neurotransmissor comum de não 5HT no RN, era abundante nas células não 5HT (figura 35D). A “impressão digital” de miR obtida do microarranjos (figura 1A) continha quatorze (Tabela 10, abaixo) e vinte e sete (Tabela 11, abaixo) miRs que foram expressos 2 vezes mais ou menos, respectivamente, nos neurônios 5HT comparado aos neurônios não 5HT. A validação representativa dos resultados de matriz foi realizada usando PCR em tempo real para miRs altamente expressos nos neurônios 5HT tais como miR-375 (figura 1B), e para miRs expressos em níveis inferiores nos neurônios 5HT tais como miR-135a (figura 1C). Tabela 10: RESULTADOS DE MICROARRANJOS DE MicroRNA - LISTA DOS MicroRNAS EXPRESSOS PELO MENOS DUAS VEZES MAIS ALTO NOS NEURÔNIOS 5HT COMPARADO ÀS CÉLULAS NÃO 5HT DO RN DO RATO TABELA 11: RESULTADOS DE MICROARRANJOS DE MicroRNA - LISTA DOS MicroRNAS EXPRESSOS PELO MENOS DUAS VEZES MAIS BAIXO NOS NEURÔNIOS 5HT COMPARADO ÀS CÉLULAS NÃO 5HT DO RN DO RATO

[00618] A fim de estudar, ainda, o papel potencial dos miRs como moduladores de neurônios 5HT, análise bioinformática extensiva foi realizada em uma maneira orientada por hipótese. A predição do direcionamento de genes relacionados a 5HT conhecidos em neurônios serotonérgicos que foram anteriormente demonstrados estar associados com psicopatologias, foi bioinformaticamente cruzada com os resultados do microarranjo. As predições do direcionamento de miR para esses genes foram realizadas usando dois algoritmos diferentes com base no alvo da análise

[00619] (www(ponto)targetscan(ponto)org) e MiRanda (www(ponto)microrna(ponto)org) e foram cruzadas com a lista de 91 miRs alterados por pelo menos ± 1,5 vez no arranjo de miR do neurônio 5HT, comparado às células não 5HT 5HT. Dois genes alvo de codificação de proteína expressos nos neurônios 5HT no RN foram selecionados: o transportador de serotonina, responsável pela reabsorção de 5HT (também conhecido como SERT ou Slc6a4) e receptor inibitório de serotonina 1a (também conhecido como Htr1a). Com base nos dados de arranjo de miR e na análise bioinformática, sete miRs foram escolhidos para validação in vitro adicional (figuras 1D e E).

EXEMPLO 11 miR-135 DIRECIONA OS TRANSCRITOS DE HTR1A E SLC6A4

[00620] Os ensaios de luciferase in vitro foram realizados para testar a interação de miR-alvo entre 3’UTR dos genes testados relacionados com 5HT e os miRs preditos para direcionar putativamente esses transcritos. O direcionamento de miR-135 de Slc6a4 3’UTR (figuras 2A, 2C) e Htr1a 3’UTR (figuras 2B, 2D) resultou em repressão robusta de tradução desses transcritos. Adicionalmente, a repressão significativa de Htr1a 3’UTR foi mediada por miR-335, miR-181c e miR-26a (figura 2D). Devido ao forte efeito de miR-135 em ambos Htr1a e Slc6a4, os presentes estudos focaram, ainda, nessa interação de miR-alvo. Outra análise bioinformática revelou que o miR-135 tem 3 variantes altamente conservadas, miR-135a-1, miR-135a-2 e miR-135b (figura 36A-C). Além disso, a sequência de correspondência de semente miR-135 no Slc6a4 3’UTR é altamente conservada (figura 2E), e em uma saída das duas correspondências de semente no Htr1a 3’UTR, forte conservação foi observada (figura 2F). Estudos de mutação no 3’UTR do transcrito Slc6a4, nos quais a sequência de correspondência de semente miR- 135 foi removida, revelaram que ambos os direcionamentos de miR-135a e miR-135b de Slc6a4 foram mediados através de sua sequência de correspondência de semente, uma vez que a repressão induzida pelo miR-135 foi totalmente bloqueada pela mutação em Slc6a4 3’UTR (figura 2G). A mutação das correspondências de semente de Htr1a miR-135, individualmente ou juntos, revelou que o miR-135a reprime Htr1a 3’UTR através da correspondência de semente distal e não proximal enquanto miR- 135b age através de ambos os locais preditos (figura 2H).

EXEMPLO 12 OS NÍVEIS DE RN-miR-135 SÃO REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE PELOS ANTIDEPRESSIVOS

[00621] Uma vez que ambos Htr1a (Savitz et al., 2009) e Slc6a4 (Murphy et al., 2008) foram previamente associados com depressão e maquinaria celular antidepressiva, o presente inventor procurou examinar a regulação da expressão de miR-135 em resposta ao tratamento antidepressivo. O miR-135a e o miR-135b maduros diferem em apenas um nucleotídeo (figura 37A), também são diferencialmente expressos no RN conforme observado na PCR em tempo real conduzida no cDNA obtido de RN microdissecado de ratos adultos tipo selvagem (figura 37B). miR 135b foi expresso aproximadamente 10 vezes menos que o miR-135a, enquanto o último é expresso altamente de forma relativa, apenas 5 vezes menos que miR-124, o miR mais abundante no cérebro e 2,5 vezes menos que miR-16 que foi previamente mostrado para ter um papel no controle das funções de 5HT (figura 37C). Considerando que o miR-135a é expresso em níveis mais elevados no RN do que no miR-135b, e também foi a variante diferentemente alterada no microarranjo de 5HT, o presente inventor focou nos estudos de regulação nessa forma. Em seguida, os níveis de miR-135a foram testadoss nos ratos expostos a um modelo de fracasso social crônico (um modelo ambiental utilizado para a indução de comportamentos do tipo depressão) e para tratamento crônico com a imipramina antidepressiva tricíclica.

[00622] Usando o teste de anulação social, foi verificado que o fracasso social pode provocar anulação social e a administração de antidepressivos pode reverter isso (figura 37D). De fato, apenas os ratos expostos ao fracasso social e injetados com solução salina e não aqueles que receberam imipramina desenvolveram anulação social como implicado por uma razão de interação menor que 100% (figura 37D). Curiosamente, o estresse de fracasso social crônico não alterou os níveis de miR-135a no RN, entretanto, imipramina administrada cronicamente (figura 37E) ou de forma aguda (figura 37F), ambas em ratos estressados e não estressados, aumentou significativamente os níveis de expressão de miR-135a no RN. Uma vez que a imipramina não é um inibidor de reabsorção de 5Ht específico, os efeitos de ambas as administrações aguda e crônica do inibidor de reabsorção de serotonina seletiva (SSRI), fluoxetina, e o inibidor de reabsorção de noradrenalina (NRI), reboxetina, foram testadoss adicionalmente, um aumento robusto nos níveis de miR-135a no RN após tratamento com SSRI agudo e crônico foi encontrado, e ainda não foram observadas diferenças após o tratamento com NRI tratamento (figura 37G).

EXEMPLO 13 SUPEREXPRESSÃO DE miR-135 ESPECIFICAMENTE EM NEURÔNIOS 5HT REDUZ A ANSIEDADE E COMPORTAMENTOS DO TIPO DEPRESSÃO APÓS FRACASSO SOCIAL

[00623] Para explorar adicionalmente o papel de 5HT-miR-135 in vivo, um modelo de rato foi estabelecido que especificamente superexpressa miR-135 nos neurônios 5HT de RN (miR-135OE). Os ratos que expressam Cre recombinase especificamente nos neurônios RN 5HT-positivos (ePet-Cre) foram cruzados com linhagem de rato transgênico que carrega um cassete condicional de miR-135a (figura 38A). Como controles, os ratos positivos para o transgene de superexpressão de miR-135 e negativos para o ePet-Cre foram utilizados. O nível de expressão de miR-135a no RN de ratos que superexpressam miR-135a, especificamente nos neurônios 5HT, foi testado por PCR em tempo real, e foi demonstrado ser superexpresso por aproximadamente 2 vezes comparado aos ratos de controle (figura 38B). Os níveis de superexpressão de miR-135 nesse modelo de rato eram similares àqueles medidos no RN de ratos após administração do SSRI. Adicionalmente, os níveis de transcritos alvo de miR-135 Slc6a4 (figura 38C) e Htr1a (figura 38D) foram reduzidos no RN de ratos miR-135OE comparado aos ratos de controle, demonstrando repressão in vivo de genes alvo de miR- 135.

[00624] O miR-135OE e seus controles de ninhada foram caracterizados de forma comportamental nos testes para ansiedade e comportamentos do tipo depressão, seja sob condições ‘basais’ ou após protocolo de fracasso social crônico. Sob as condições ‘basais’, não foram observadas diferenças entre miR-135OE e ratos de controle nos testes para ansiedade e comportamentos do tipo depressão (figura 38E-J, barras esquerdas e 38K). Entretanto, os ratos miR-135OE demonstraram uma resiliência significativa aos efeitos de fracasso social crônico. No teste de transferência de claro-escuro, os ratos miR-135OE expostos ao fracasso social gastaram mais tempo na luz (figura 38E), visitaram o compartimento iluminado mais frequentemente (figura 38F) e viajaram distâncias mais longas na luz (figura 38G) em relação aos ratos de controle. O desempenho comportamental dos ratos miR-135OE não diferiu significativamente após o protocolo de fracasso social. Em contraste, os ratos de controle demonstraram aumentos significativos nos comportamentos do tipo ansiedade em todos os parâmetros medidos do teste de claro-escuro após fracasso social (figura 38E- G). Resultados similares foram observados no teste de labirinto em cruz elevado já que os ratos de controle que foram expostos ao fracasso social gastaram menos tempo (figura 38H), tiveram menos visitas (figura 38I) e viajaram uma distância menor (figura 38J) nos braços abertos comparado aos ratos miR-135OE testado sob as mesmas condições. Não foram observadas diferenças significativas entre as condições ‘basais’ e de estresse no grupo miR-135OE. Resultados similares foram observados nos testes de avaliação de comportamentos do tipo depressão. Embora não tenham sido observadas diferenças sob condições ‘basais’ (figura 38K), quando testados após fracasso social crônico, os ratos miR-135OE exibiram tempo de imobilidade significativamente menor no teste de nado forçado comparado aos controles (figura 38L), que é interpretado como diminuição do comportamento do tipo depressão. Essas diferenças não poderiam contar para alterações na atividade locomotora uma vez que a distância viajada no campo aberto foi similar em ambos os genótipos (figura 38M). Tomados em conjunto, a superexpressão de miR-135 especificamente nos neurônios 5HT protegeu contra o efeito adverso de estresse crônico na ansiedade e comportamentos do tipo depressão.

EXEMPLO 14 SILENCIAMENTO DE miR-135 EM RN DE RATOS ADULTOS AUMENTOU OS COMPORTAMENTOS DO TIPO ANSIEDADE E DIMINUIU A RESPOSTA AOS ANTIDEPRESSIVOS

[00625] Para determinar a importância de níveis endógenos de miR- 135 em mediar comportamentos do tipo depressão em resposta ao tratamento com antidepressivo e comportamentos do tipo ansiedade em condições ‘basais’, um sistema com base lentiviral foi estabelecido para especificamente silenciar (KD) os níveis endógenos de miR-135 no RN dos ratos tipo selvagem. O plasmídeo de expressão contendo um inibidor de miR-135 (captura de miRNA, figura 39A) ou sequência de controle foram subclonados em uma estrutura lentiviral contendo o promotor H1 e o repórter GFP (figura 39B) para permitir expressão constitutiva da sequência de captura de miR- 135. A eficácia dos lentivírus, produzidos a partir dessas estruturas, para suprimir a expressão dos genes alvo Htr1a e Slc6a4 foi testada in vitro através da infecção das células RN46A, que expressa endogenamente Htr1a, Slc6a4 e miR-135. A célula RN46A infectada com lentivírus de KD miR-135 KD expressou níveis significativamente mais elevados de mRNA de Htr1a e Slc6a4 conforme testado por PCR em tempo real comparado às células infectadas por lentivírus de controle de KD (figura 39C).

[00626] RN de ratos adultos tipo selvagem foi infectado com miR- 135KD ou lentivírus de controle, e após um período de recuperação, os comportamentos dos ratos foram avaliados usando testes para ansiedade e comportamentos do tipo depressão. A eficácia da infecção foi subsequentemente verificada usando imuno-histoquímica GFP (figura 39D). No teste de transferência de claro-escuro, os ratos miR-135KD demonstraram um aumento significativo no comportamento do tipo ansiedade comparado aos ratos injetados com controle (figura 39E-H). Os ratos miR-135 KD gastaram menos tempo (figura 39E), visitaram menos (figura 39F) e andaram distância mais curtas no compartimento iluminado (figura 39G). Similarmente, no teste de labirinto em cruz elevado, os ratos miR-135 KD demonstraram aumento dos comportamentos do tipo ansiedade comparado aos ratos injetados com controle. Os ratos miR-135 KD mostram uma tendência a gastar menos tempo (figura 39I), visitar menos (figura 39J) e viajar distância significativamente menor (figura 39K) nos braços abertos do labirinto (figura 39I-L).

[00627] Comportamentos do tipo depressão dos ratos miR-135 KD foram testados em ambos sob condições ‘basais’ e após tratamento com SSRI. No teste de nado forçado, não foram observadas diferenças entre os grupos em condições ‘basais’ (figura 39M). Entretanto, após administração do SSRI, os ratos miR-135 KD estavam mais significativamente imóveis comparado aos ratos injetados com controle (figura 39M), sugerindo um papel importante para os níveis de RN-miR-135 endógeno em mediar efeitos antidepressivos induzidos por SSRI. Os níveis reduzidos de miR-135 no RN não afetaram a atividade locomotora desses ratos (figura 39N).

EXEMPLO 15 A SUPEREXPRESSÃO DE miR-135 ALTEROU OS NÍVEIS E METABOLISMO DE 5HT

[00628] Para avaliar se alterações nos níveis de miR-135 também são refletidas nas concentrações de tecido do 5HT central e sua rotatividade, as subdivisões de RN foram microdissecadas e as regiões do cérebro inervadas pelas áreas do modelo de rato miR-135 OE e ninhadas de controle. As figuras 40A-40O, as figuras 42A-L e as figuras 43A-L descrevem concentrações de tecido de 5HT e o metabolismo de 5HT (razão de 5HIAA/5HT) nesses ratos em condições ‘basais’ e após protocolo de fracasso social.

[00629] As concentrações de tecido de 5HT e o metabolismo de 5HT dentro de um circuito neural relacionado com ansiedade e depressão foram influenciadas pelo genótipo de miR-135, bem como a manipulação de fracasso social de miR-135 OE diminuiu as concentrações de 5Ht no tecido, e aumentou o metabolismo de serotonina, um padrão consistente com aumento da rotatividade de serotonina, nas regiões do cérebro implicadas na regulação de comportamento relacionado à ansiedade e resiliência ao estresse, tal como córtex pré-límbico (PrL), córtex infralímbico (IL), amígdala basolateral (BLA), região CA1 do hipocampo ventral (CA1V), subículo (S), núcleo de leito de stria terminalis (BNST), núcleocentral da amígdala (CeA), partes dorsal, ventral, caudal e interfascicular do núcleo dorsal da rafe (DRD, DRV, DRC, DRI), e núcleo mediano da rafe (MnR) (figuras 40A-40O, figuras 42A L e figuras 43A-L). Esses resultados estão em linha com a diminuição miR- 135 OE da expressão de Htr1a e Slc6a4 (figuras 38C-D) em condições ‘basais’, efeitos que seriam esperados para resultar em aumento de taxas de disparo neuronal serotonérgico e sinalização serotonérgica, respectivamente.

[00630] O fracasso social diminuiu as concentrações de 5HT no tecido e aumentou o metabolismo de 5HT nas regiões do cérebro relacionados à ansiedade nos ratos de controle, um padrão consistente com aumento de rotatividade de serotonina, incluindo o PrL e o BNST (figuras 40A-40O e figuras 42A-L), persistente com estudos prévios demonstrando ativação induzida por fracasso social de subconjuntos relacionados à ansiedade de neurônios serotonérgicos no DRD e DRC. Esses efeitos de fracasso social foram impedidos nos ratos miR-135OE, sugerindo uma explicação mecanicista para a resiliência comportamental para estresse crônico observado nesses ratos.

EXEMPLO 16 OS NÍVEIS DE miR-135A NO SANGUE SÃO REGULADOS DE FORMA DESCENDENTE EM PACIENTE DEPRIMIDOS E REGULADOS DE FORMA ASCENDENTE PELA TERAPIA

[00631] Uma vez que os níveis de miRs circulantes foram mostrados para correlacionar com estados de doença, o presente inventor testou se os níveis de miR-135 no sangue são alterados em pacientes humanos deprimidos. Os níveis relativos de miR-135a e miR-16 foram testados em dois conjuntos de amostras de sangue humano. Um comparou os pacientes deprimidos com os controles saudáveis correspondentes, o outro, as alterações nos níveis de miRNA durante o tempo nos pacientes deprimidos que receberam 3 meses de terapia cognitivo-comportamental (CBT). Os níveis de miR-135a foram robustamente reduzidos em pacientes atualmente deprimidos (Escala de Classificação de Depressão de Hamilton média (HRDDS)= 24,3 (SD: 5.3), isto é com sintomas depressivos de moderados a graves) comparado aos controles (figura 41A), enquanto não foram observadas alterações significativas em miR-16 (figura 41B). Comparar os níveis sanguíneos de miR-135a em pacientes deprimidos antes e três meses após o tratamento revelou um aumento significativo em níveis de miR-135a após CBT (figura 41C). Não foi observado efeito nas mesmas amostras sanguíneas para os níveis de miR-16 (figura 41D). Esses resultados sugerem os níveis de miR-135a no sangue humano como um possível biomarcador para o estado de depressão e resposta ao tratamento.

EXEMPLO 17 EFEITO ANTIBIPOLAR DE miR-135 EM MODELO DE RATO DE HIPERATIVIDADE INDUZIDA POR ANFETAMINA

[00632] Para avaliar o efeito antibipolar de miR-135 pré-clinicamente, um modelo de hiperatividade induzida por anfetamina in vivo de mania em ratos é utilizado, que é relevante à fase maníaca de transtorno bipolar. Esse modelo foca em um aumento induzido no nível de atividade do animal (hiperatividade) como um paralelo à hiperatividade do paciente maníaco. A reversão da hiperatividade induzida em roedores, pelo pré-tratamento com um fármaco indica a possível eficácia desse fármaco no tratamento de mania humana. A descoberta mais consistente com lítio (o fármaco padrão para mania) é a redução na criação. A criação é seguida nos modelos pela observação da atividade vertical dos animais.

[00633] Consequentemente, o pré-tratamento dos ratos com miR-135 antes da hiperatividade induzida por anfetamina está sendo testado para tratamento de transtorno bipolar. Além disso, o tratamento de ratos com miR- 135 após hiperatividade induzida por anfetamina está sendo testado para tratamento de transtorno bipolar.

[00634] Os ratos são alojados em um ciclo de claro/escuro de 12h e o teste comportamental é conduzido na fase clara. Especificamente, as atividades do rato são seguidas em um medidor de atividade (Elvicom, Israel) com base em 2 níveis de raios laser e equipadas com um sistema computadorizado que pode contar os movimentos verticais dos ratos (criação). As atividades são registradas por 30 minutos para cada sessão, e o movimento apropriado resultante é relatado por 30 minutos.

[00635] As atividades dos ratos pré-tratados ou tratados com miR-135 são comparadas aos ratos não tratados (grupo de controle) e aos ratos pré- tratados ou tratados com os fármacos padrão para mania, isto é, lítio ou valproato. Os ratos são seguidos antes e depois de serem desafiados com anfetamina. As análises estatísticas são conduzidas usando uma ANOVA de via dupla.

EXEMPLO 18 EFEITO ANTIBIPOLAR DE miR-135 EM MODELO DE RATO COM MANIA INDUZIDA POR CETAMINA

[00636] Para avaliar o efeito antibipolar de miR-135 pré-clinicamente, um modelo de hiperatividade induzida por cetamina de mania em ratos é utilizado. A cetamina induz hiperlocomoção de ratos tratados, que podem ser monitorados conforme discutido

[00637] Os ratos são pré-tratados (por 14 dias) com miR-135 ou com os fármacos padrão para mania, isto é, lítio (47,5 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia) ou valproato (200 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia), ou com solução salina (i.p., duas vezes ao dia) como um controle. Entre os dias 8 e 14, esses ratos são tratados com cetamina (25 mg/kg, i.p.) ou solução salina.

[00638] Em um protocolo reverso, os ratos primeiro recebem cetamina (25 mg/kg, i.p.) ou solução salina seguido pela administração de miR-135, lítio, valproato, ou solução salina por 7 dias.

[00639] As atividades dos ratos pré-tratados ou tratados com miR-135 são comparadas a ratos não tratados (grupos de controle) e a ratos pré-tratados ou tratados com fármacos padrão para mania, isto é, lítio ou valproato. Os ratos são seguidos antes e depois de serem desafiados com cetamina. As análises estatísticas são conduzidas usando uma ANOVA de via dupla.

DISCUSSÃO

[00640] No estudo atual, o papel de miR específico foi elucidado na regulação da atividade do sistema de 5HT, em condições ‘basais’ e desafiadas. A “impressão digital” única de expressão de miR foi determinada nos neurônicos serotonérgicos e vários genes alvo ligados a 5HT foram identificados de forma bioinformática. Os ensaios de luciferase in-vitro e estudos de mutação revelaram um forte efeito repressivo para miR-135 em ambos os transcritos Slc6a4 e Htr1a. De forma intrigante, os níveis de miR- 135 no RN foram robustamente regulados de forma ascendente após administração de SSRI aguda e crônica. Os modelos de ratos geneticamente modificados, que expressam níveis superiores e inferiores de miR-135 demonstraram maiores alternações no comportamento do tipo ansiedade e depressão, níveis e metabolismo de 5HT, e resposta comportamental ao tratamento antidepressivo. Finalmente, os níveis de miR-135 no sangue de pacientes humanos deprimidos e resposta ao tratamento foram apresentados.

[00641] O uso do modelo de rato ePet-EYFP para o isolamento de células 5HT e não 5HT do RN do rato permitiu determinar pela primeira vez o perfil de miR específico de neurônios serotonérgicos. Embora essa abordagem tenha sido bem-sucedida e informativa, ainda, a fim de classificar eficazmente os neurônicos positivos 5HT, o tecido cerebral embrionário e não adulto de RN de rato foi utilizado, que significa que ao menos parte dos miRs apresentados no perfil de miRs 5HT pode ser relevante para processos de desenvolvimento e funções neuronais de 5HT não adultas. Não obstante, a sinalização serotonérgica durante os períodos de desenvolvimento específicos é conhecida por afetar fenótipos de ansiedade de adulto (Gross et al., 2002). Curiosamente, miR-375, comumente associado com diferenciação de célula beta pancreática, foi robustamente expresso nos neurônios 5HT comparado ao controle, apoiando o trajeto de comportamento comum sugerido desses tecidos.

[00642] A análise bioinformática sugeriu várias interações de miT-alvo putativo entre o receptor de serotonina 1A (Htr1a) e o transportador de serotonina (SERT ou Slc6a4) 3’UTRs e miRs diferencialmente expressos no microarranjo de 5HT. Htr1a e Slc6a4 foram mostrados para desempenhar um papel importante no sistema serotonérgicos, nos transtornos de depressão e ansiedade, e na resposta aos antidepressivos (Savitz et al., 2009) e (Murphy et al., 2008). Htr1a é um receptor acoplado à proteína G inibitório que é expresso como um autorreceptor nas células de produção de 5HT e pós- sinapticamente através do cérebro de locais de projeção de 5HT. O estímulo de autorreceptores de Htr1a inibe o disparo neuronal serotonérgico e a liberação de serotonina em terminais nervosos e foi postulado para ser uma das causas para o atraso terapêutico que é comumente relatado para a maioria dos antidepressivos serotonérgicos tais como SSRIs. Slc6a4 é um transportador de membrana de plasma que termina a ação da serotonina pela reciclagem da mesma a partir da fenda sináptica em neurônios pré-sinápticos, em uma maneira dependente de sódio. Slc6a4 é o alvo direto dos antidepressivos mais comumente utilizados, tanto a geração anterior de antidepressivos tricíclicos que inibem diferentes atividades de transportador de reabsorção de monoamina incluindo Slc6a4, ou os SSRIs mais específicos. A diminuição da atividade de ambos o Slc6a4 e o Htr1a pré-sináptico seria esperada para aumentar os níveis de 5HT na sinapse, que são consistentes com ação antidepressiva e diminui nos sintomas depressivo. Os ensaios de luciferase confirmaram as variantes de miR-135 como repressores significativos de ambos os transcritos de Slc6a4 e Htr1a. Os estudos de mutação demonstraram, ainda, a importância de locais de ligação de semente de miR-135 nos 3’UTRs de Htr1a e Slc6a4 na mediação dos efeitos repressivos de miR-135 observados. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) no 3’UTR de Slc6a4 e Htr1a humano, relatados previamente para esses genes (Piva et al., 2010), não estão dentro das sequências de correspondência de semente de miR-135.

[00643] miR-135 foi previamente relatado para estar principalmente envolvido nas patologias relacionadas ao câncer e processos de desenvolvimentos. miR-135 foi demonstrado para direcionar o gene da polipose adenomatosa coli e como uma consequência para promover o câncer colorretal, para modificar a resistência à quimioterapia e para regular JAK2 no linfoma de Hodgkin clássico. O papel de miR-135 nos processos de desenvolvimento foi demonstrado em megacariocitopoiese, desenvolvimento cerebral suíno, e mineralização em diferenciação osteogênica pela regulação de Smad5, um transdutor principal do sinal osteogênico de BMP2. Adicionalmente, miR-135 foi sugerido para estar envolvido na regulação da pressão sanguínea pela supressão de NR3C2 e para ter um papel potencial na insuficiência cardíaca.

[00644] Vários estudos de triagem de microRNA reportaram que os níveis de microRNA em vários roedores adultos ou estruturas cerebrais do rato são afetados por uma faixa de manipulações comportamentais e farmacológicas (Kye et al., 2011). Desafios estressantes foram mostrados para alterar a expressão de miR em diferentes locais do cérebro usando paradigmas diferentes (Smalheiser et al., 2011). O presente inventor demonstrou recentemente o envolvimento de miR-34 na regulação dos comportamentos do tipo ansiedade (Haramati et al., 2011), enquanto miR-22, miR-138-2, miR- 148a, e miR-488 foram associados com transtorno de pânico (Muinos- Gimeno et al., 2011). Estudos usando ratos, apresentados no manuscrito atual, revelaram uma regulação ascendente clara de miR-135 após administração de antidepressivo. Outra comparação de antidepressivos de SSRI e NRI demonstrou um efeito de SSRI e não específico de NRI, sugerindo adicionalmente um papel para miR-135 na biologia dos neurônios 5HT. Embora o estresse crônico esteja associado com aumento de suscetibilidade para o desenvolvimento de depressão, de forma surpreendente, as condições de estresse crônico não afetaram os níveis de miR-135 no RN. O tratamento de SSRI crônico foi relatado para promover a redução nos níveis de proteína de Slc6a4 e Htr1a, mas não mRNA [Slc6a4 (Benmansour et al., 2002), Htr1a (Savitz et al., 2009)] sugerindo o possível envolvimento de um mecanismo na mediação da atividade de SSRI. miR-16 foi mostrado para direcionar Slc6a4 e para ter um papel na resposta antidepressiva (Baudry et al., 2010), enquanto a administração de lítio foi mostrada para alterar a expressão de miRs (Creson et al., 2011). Uma associação foi encontrada entre variantes em miR-182 (Saus et al., 2010) e miR-30e (Xu et al., 2010b) em pacientes com depressão profunda, e a expressão de miRs foi alterada no córtex pré-frontal dos pacientes com depressão suicida (Smalheiser et al., 2012). Adicionalmente, miR448 foi mostrado para controlar a expressão de vários receptores de 5HT como parte do desenvolvimento do tecido adiposo e o polimorfismo no receptor de serotonina 1B modera a regulação por miR96 e associa com comportamentos agressivos (Jensen et al., 2009). Finalmente, o local de direcionamento de miR510 do receptor tipo 3E de serotonina foi mostrado para desempenhar um papel na síndrome do intestino irritável.

[00645] O tratamento antidepressivo foi relatado para ativar o trajeto de transdução de sinal de cAMP e para promover a inibição de CREB aos locais CRE. A análise do promotor das regiões de flanqueamento de miR-135 5’ identificou vários locais CRE putativos, sugerindo um mecanismo potencial para a regulação ascendente de miR-135 observado por SSRI. Tomados em conjunto, a regulação ascendente dos níveis de expressão de miR-135 no RN após administração de antidepressivo, junto dos resultados que demonstram o direcionamento miR-135 de Htr1a e Slc6a4, sugere que o miR-135 é um antidepressivo endógeno.

[00646] Para apoiar, ainda, uma função para miR-135 como um antidepressivo endógeno, uma série de experimentos foi conduzida, em que os níveis de miR-135 foram manipulados in vivo e os efeitos no comportamento do animal foi avaliado. O modelo de rato transgênico que superexpressa miR- 135 especificamente nos neurônios 5HT, nos níveis equivalentes àqueles observados após o tratamento com antidepressivo, mostrou um forte efeito protetor a partir dos efeitos comportamentais adversos de fracasso social crônico. Esses resultados se assemelham ao efeito observado quando Htr1a (Bortolozzi et al., 2012) ou Slc6a4 (Thakker et al., 2005) foram derrubados usando abordagens de siRNA, mostrando comportamentos do tipo depressão reduzidos, ou quando os níveis do autorreceptor de Htr1a foram aumentados usando um modelo de ratos transgênicos elegantes, levando à elevação nos comportamentos do tipo ansiedade e depressão e resposta reduzida aos antidepressivos (Richardson-Jones et al., 2010). Em contraste, os modelos de rato de silenciamento do desenvolvimento para Htr1a (Savitz et al., 2009) e Slc6a4 (Holmes et al., 2003) mostraram aumentos paradoxais nos comportamentos do tipo ansiedade e depressão, os quais foram sugeridos para serem mediados pelas alterações compensatórias de desenvolvimento. Além do Htr1a e Slc6a4, também é provável que o miR-135a afete outros genes nos neurônios de serotonina que podem possivelmente contribuir para os fenótipos observados.

[00647] Usando uma abordagem complementar, os níveis de miR-135 foram derrubados especificamente no RN de ratos tipo selvagem adultos usando lentivírus e nos ratos foi avaliado em condições ‘basais’ (desestressadas) e após administração de SSRI. Em contraste aos comportamentos observados pelos ratos que superexpressam miR-135, os níveis reduzidos desse miR causou um aumento robusto no comportamento do tipo ansiedade e atenuou a resposta aos antidepressivos. Esses resultados apoiam uma função importante para miR-135 na manutenção das respostas intactas aos desafios em condições ‘basais’ e sua função essencial no mecanismo de ação antidepressiva. Essas descobertas estão de acordo com a literatura publicada, que mostra que níveis mais elevados de Htr1a estão associados com o aumento de desespero comportamental e respostas embotadas aos antidepressivos (Richardson-Jones et al., 2010). Além disso, o polimorfismo no gene Htr1a humano foi associado com a ligação mais elevada do autorreceptor de Htr1a e aumento da ansiedade e depressão (Fakra et al., 2009). Em contraste, os níveis inferiores de expressão de Slc6a4, devido a uma variante de promotor mais curta, foram relatados para estar associados com aumento da ansiedade e depressão e redução da resposta aos antidepressivos (Homberg and Lesch, 2011).

[00648] O apoio adicional para uma função de miR-135 nos circuitos de 5HT surgiu a partir dos dados de HPLC indicando uma alteração robusta nos níveis de 5HT e seu metabolismo através do cérebro do modelo de rato miR-135OE. Os níveis de 5HT eram mais baixos, enquanto o metabolismo de 5HT era mais elevado, nos ratos miR-135OE comparado aos controles em condições ‘basais’ de estresse, ambos no subnúcleo da rafe onde 5HT é sintetizado e nos locais de projeção importantes para controlar os comportamentos do tipo ansiedade e depressão. Esse padrão de alteração nos níveis de 5HT e metabolismo de 5HT é consistente com o aumento do disparo neuronal serotonérgico e o aumento da sinalização serotonérgica nos ratos miR-135OE. Essas diferenças poderiam ser um resultado de alterações compensatórias associadas com a superexpressão de miR-135 desde o desenvolvimento até a maioridade. Entretanto, apesar dos níveis ‘basais’ de baixos, os ratos demonstraram comportamentos normais em condições ‘basais’, provavelmente devido ao sistema de 5HT mais ativo, conforme pode ser descrito pelo metabolismo de 5HT mais elevado em condições ‘basais’.

[00649] Concebivelmente, os níveis de expressão inferiores de Slc6a4 e Htr1a que funcionam como inibidores de secreção de 5HT no RN permitem que os ratos funcionem normalmente com níveis inferiores de 5HT. Curiosamente, o estresse crônico causou uma diminuição nos níveis de 5HT acompanhado por um aumento no metabolismo de 5HT em algumas áreas do cérebro de ratos de controle conforme esperado, enquanto nos ratos miR- 135OE esses efeitos não foram observados. Essas alterações podem fornecer uma explicação mecanicista para a resiliência comportamental para estresse crônico observado nos ratos miR-135OE.

[00650] O possível uso de miRs circulantes como um biomarcador não invasivo para condições patológicas é um campo crescente, que é promovido por níveis relativamente altos e estabilidade dos miRs na circulação. Enquanto pouco se sabe sobre a função e origem dos miRs extracelulares, os miRs circulantes foram associados com estados patofisiológicos, tais como tipos diferentes de câncer, doenças cardíacas, lesão hepática oxidativa, sepsia, gravidez e mais. No estudo atual, os níveis de miR-135 no sangue total de pacientes deprimidos foram determinados e uma diminuição robusta nos níveis de miR-135 no sangue de pacientes deprimidos, comparado aos controles de correspondência, foi observada. Essas descobertas estão em linha com os dados anteriores dos modelos animais indicando miR-135 para ser um antidepressivo endógeno, e sugerem miR-135 como um possível biomarcador para estado de depressão e possivelmente para resposta ao tratamento.

[00651] Para concluir, o presente inventor propõe que o miR-135, expresso pelos neurônios 5HT, seja um elemento regulatório essencial responsável por manter intacto o tom serotonérgico em condições normais e essencial para a resposta cerebral aos antidepressivos (vide modelo esquemático na figura 41E). Níveis elevados de miR-135 reprimem ambos os níveis de Slc6a4 e Htr1a pré-sinápticos, causando um aumento no 5HT na fenda sináptica, o que está associado a diminuições nos sintomas depressivos.

[00652] Análises de bioinformática adicionais conduzidas pelos presentes inventores previram que os seguintes alvos miR135 a serem associados com transtornos neuropsiquiátricos relacionados ao estresse incluem transtorno afetivo bipolar ou ação de lítio: polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1 ou PACAP); receptor 1 do polipeptídeo de ativação de adenilato ciclase 1 (Adcyap1r1); receptor adrenérgico, alfa 2a (Adra2a); uma anquirina 3 (ANK3); proteína associada ao citoesqueleto de atividade regulada (Arc); proteína 6 de ativação de Rho GTPase (Arhgap6); fator de transcrição de ativação 3 (Atf3); enzima de clivagem beta-site APP 1 (Bace1); canal de cálcio, voltagem-dependente, tipo L, subunidade alfa 1D (Cacna1d); molécula de adesão de célula 3 (Cadm3); complexina 1 (Cplx1); complexina 2 (Cplx2); domínios múltiplos de CUB e Sushi 1 (Csmd1); caseína cinase 1, gama 1 (Csnk1g1); duplacortina (Dcx); família DIRAS, ligação de GTP do tipo RAS 2 (Diras2); discos, homólogo 2 amplo (Drosophila) (Dlg2); ELK1, membro da família oncogênse ETS (Elk1); cinase Fyn relacionada (Frk); fucosiltransferase 9 (alfa (1,3) fucosiltransferase) (Fut9); receptor de ácido gama-aminobutírico (GABA-A), subunidade beta 2 (Gabrb2); proteína de ligação de GATA 3 (Gata3); receptor secretagogo de hormônio de crescimento (Ghsr); receptor acoplado à proteína G 3 (Gpr3); um receptor glutamato, AMPA3 ionotrópico (alfa 3) (GRIA3); receptor glutamato, ionotrópico, cainato 3 (Grik3); receptor cinase acoplado à proteína G 5 (Grk5); uma sintase cinase-3beta de glicogênio (GSK3B); canal 1 de potássio fechado de nucleotídeo cíclico ativado por hiperpolarização (Hcn1), K+2 fechado de nucleotídeo cíclico, ativado por hiperpolarização (Hcn2), receptor 1A de 5-hidroxitriptamina (serotonina) (Htr1a); inositol monofosfatase (IMPA1), calirina, RhoGEF cinase (Kalrn); um canal ativado por cálcio intermediário de potássio/de condutância pequena, subfamília N, membro 3 (KCNN3); carioferina alfa 3 (importina alfa 4) (Kpna3); fator de transcrição de mielina tipo 1 (Myt1l); coativador 2 de receptor nuclear (Ncoa2); Gene 4 Regulado de forma descendente N-Myc (Ndrg4); uma proteína de adaptador de sintase de óxido nítrico 1 (neuronal) (NOS1AP); subfamília 3 do receptor nuclear, grupo C, membro 2 (Nr3c2); netrina G1 (Ntng1); caseína cinase nuclear e substrato de cinase dependente de ciclina 1 (Nucks1); fosfodiesterase 1A, dependente de calmodulina (Pde1a); fosfodiesterase 4A, cAMP específico (Pde4a); fosfodiesterase 8B (Pde8b); fosfolipase C, beta 1 (Plcb1); receptor prolactina (Prlr); RAB1B, membro RAS da família oncogene (Rab1b); Proteína Rap-2a Relacionada a Ras (Rap2a); Receptor Beta Órfão Relacionado a Retinoide (Rorb); sirtuína 1 (regulação de informação do tipo compatível silenciosa 2, homólogo) 1 (Sirt1); família de transportador soluto 12, (transportadores de potássio/cloreto) membro 6 (Slc12a6); família de transportador soluto 5 (transportador de colina), membro 7 (Slc5a7); família de transportador soluto 6 (transportador de neurotransmissor, serotonina), membro 4 (Slc6a4); fator de transcrição de transação 1 (Sp1); glicoproteína de vesícula sináptica 2 b (Sv2b); envelope nuclear sináptico 1 (codifica nesprina-1) (Syne1); sinaptotagmin I (Syt1); sinaptotagmin II (Syt2); sinaptotagmin III (Syt3); fator de crescimento transformante, beta receptor II (Tgfbr2); receptor de hormônio da tireoide, beta (Thrb); canal de cátion potencial de receptor transiente receptor, subfamília C, membro 6 (Trpc6); proteína de membrana associada à vesícula 2 (Vamp2); local de integração MMTV relacionado com wingless 3 (Wnt3); e dedo de zinco, domínio BED contendo 4 (Zbed4).

[00653] Em conjunto, esses dados sugerem que o miR-135a pode desempenhar um papel crítico na patofisiologia do transtorno afetivo bipolar, em seu tratamento e diagnóstico.

[00654] Embora o presente pedido de patente de invenção tenha sido descrito em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes aos especialistas na técnica. Por conseguinte, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadrem no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.

[00655] Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionados no presente relatório descritivo são aqui incorporados em sua totalidade no relatório descritivo, na mesma medida como se cada publicação individual, patente ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado para ser aqui incorporado por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência a este pedido não deverá ser interpretada como uma admissão de que essa referência esteja disponível como técnica prévia ao presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os cabeçalhos das seções são utilizados, eles não deverão ser interpretados como necessariamente limitantes.

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[00700] T1 - Neurônio GABAérgico CORT T2 - Inibição de Liberação de GABA por CB que desinibe a liberação NE 1 T3 - Neurônio noradrenérgico T4 - Liberação NE melhorada - consolidação de memória aprimorada. T5 - Neurônio Noradrênico T6 - Incorporado de Hill M.N. e McEwen B. S. Proc. Of the Nat. Acad. of Sci. of the USA (2009) 106:4579-4580. Figura 17A

[00701] T7 - Incorporado de Meister G. et al., molecular cell (2004) 15:185-197 Figura 18A, B, C,

[00702] T8 - Suscetível T9 - Resiliente T10 - Habituação T11 - Rato não familiar Figura 35A

[00703] T12 - cérebro ePet YFP T13 - Neurônios RN T14 - sem 5HT T15 - Microarranjo de microRNA

Claims (8)

1. Artigo de fabricação, caracterizado por compreender um material de embalagem que embala um agente selecionado do grupo consistindo em um miR-135, um precursor respectivo e uma molécula de ácido nucleico que codifica o referido miR-135 ou o referido precursor respectivo, e um medicamento para tratamento de um transtorno bipolar, em que o referido miR-135 é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62 e, opcionalmente, compreende uma modificação selecionada a partir do grupo que consiste em um esqueleto de açúcar-fosfato modificado e uma base modificada.

2. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido miR-135 ser selecionado do grupo consistindo em miR-135a e miR-135b.

3. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido miR-135 é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 e SEQ ID NO: 62.

4. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido miR-135 compreende uma modificação tanto em um açúcar quanto em uma ligação internucleosídica.

5. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida modificação é selecionada a partir do grupo que consiste em um fosforotioato, um fosforotioato quiral, um fosforoditioato, um fosfotriéster, um aminoalquil fosfotriéster, um metil fosfonato, um alquil fosfonato, um fosfonato quiral, um fosfinato, um fosforamidato, um aminoalquilfosforamidato, um tionofosforamidato, um tionoalquilfosfonato, um tionoalquilfosfotriéster, um boranofosfato, um fosfodiéster, um 2'-O-metoxietil, um 2'-O-metil, um 2'-fluoro, um ácido nucleico bloqueado (LNA), um ácido nucleico peptídico (PNA) e um ácido 2'-Fluoro arabino nucleico (FANA).

6. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido miR-135 é selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 194, SEQ ID NO: 198, SEQ ID NO: 200, SEQ ID NO: 203, SEQ ID NO: 207 e SEQ ID NO: 209.

7. Artigo de fabricação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento para o tratamento de um distúrbio bipolar é selecionado a partir do grupo que consiste em Amisulprida, Aripiprazol, Asenapina, Blonanserina, Bitopertina, Brexpiprazol, Carpipramina, Clocapramina, Clozapina, Cariprazina, Iloperidona, Lurasidona, LY2140023, Melperona, Mosapramina, Olanzapina, Paliperidona, Perospirona, Pimavanserina, Quetiapina, Remoxiprida, Risperidona (Risperdal), Sulpiridal, Sulpirida , Vabicaserina, Ziprasidona, Zotepina e Zicronapina.

8. Artigo de fabricação de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento para tratamento de transtorno bipolar é selecionado do grupo constituído por Carpipramina, Olanzapina, Lurasidona e Quetiapina.