CN101400697A - 寻常鱼鳞病、特异反应性和其他病症的预防/治疗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及预防/治疗寻常鱼鳞病(IV)、特异反应性和潜在地其他与聚丝蛋白基因序列中功能失去突变相关的病症。该预防/治疗基于试剂的使用，该试剂能使宿主翻译系统连读聚丝蛋白基因突变等位基因中存在的无义突变。

Description

寻常鱼鳞病、特异反应性和其他病症的预防/治疗
发明领域
本发明涉及寻常鱼鳞病(IV)、特异反应性和潜在地其他与聚丝蛋白基因序列中功能失去突变相关的病症的预防/治疗。该预防/治疗基于试剂的使用，所述试剂能使宿主的翻译系统连读聚丝蛋白基因的突变等位基因中存在的无义突变。
发明背景
寻常鱼鳞病(IV；OMIM# 146700)是人类最普遍的角质化遗传病症和最常见的单基因病症之一。最广泛提及的发生率数字是1/250，该数字基于对6051名健康的英国学童的调查1。IV与特异反应性体质的关系得到了充分确定；37-50％患有IV的人具有特异反应性体质，具体地特异反应性皮炎(湿疹)1，15，且相反之，大约8％特异反应性皮炎患者具有典型的IV特征1，16。
IV的表型特征包括掌超线性，毛发角化病和最明显见于下腹部、手臂和腿部的细小鳞屑2。聚丝蛋白(丝聚集蛋白)在角质层形成中十分重要3-5。滤泡内表皮颗粒层中的透明角蛋白颗粒主要由400kDa蛋白聚丝蛋白原(profilaggrin)组成。在独特的短N末端结构域之后，大部分聚丝蛋白原分子由324个氨基酸聚丝蛋白序列的10-12个重复序列组成6。随着颗粒细胞的末端分化，聚丝蛋白原通过蛋白水解裂解为～37kDa聚丝蛋白肽和含有S100样钙结合结构域的N末端结构域。聚丝蛋白迅速聚集为角蛋白细胞骨架，从而颗粒细胞瓦解为扁平的无核鳞片。该浓缩的细胞骨架在角质化细胞包膜(CCE)形成过程中通过转谷氨酰胺酶而交联。CCE是皮肤最外面的屏障层，其不仅防止水分流失，而且还阻止过敏原和传染性病原体的进入7。因此，聚丝蛋白是促进表皮分化和维持屏障功能的关键蛋白质。
免疫印迹研究显示聚丝蛋白在IV患者的皮肤和/或角质形成细胞中缺乏或明显减少8-10。另外，在一些患有IV的个体中证明了减少的聚丝蛋白mRNA11。隐性小鼠突变体，絮片状尾部(ft)，具有人类IV的组织学和超结构标记12，并且获得了与鼠科聚丝蛋白基因座(FLG)的强烈遗传连锁17， 18。尽管生化分析显示了ft/ft纯合体中的缺陷性聚丝蛋白原操作，但是迄今尚未鉴定在FLG基因中的任何基因组突变。
本发明人揭示了编码聚丝蛋白的基因中的某些功能失去突变，而且随继的聚丝蛋白减少/损失与IV和其他病症如特异反应性皮炎(湿疹)、哮喘、银屑病和/或变态反应的发展相关。该工作是多篇处于印刷中的论文(SmithF.J.D.等，2006；Palmer C.N.A.等，2006)和共同未决的专利申请GB0525492.5的主题。除通过基因治疗应用的潜在治疗外，如果利用为克服至少一些鉴定的聚丝蛋白突变而设计的小分子药物能治疗IV，则将是理想的。
因此，本发明的目的包括提供用于预防和/或治疗IV和其他相关病症的手段。
发明概述
本发明部分基于本发明人关于某些试剂容许连读聚丝蛋白基因中功能失去突变的能力的工作。
本发明的第一个方面提供能够连读聚丝蛋白基因中功能失去突变的试剂用于制备用于治疗IV和/或相关疾病药物的用途。
在另一方面，提供了治疗IV和/或其他相关疾病的方法，该方法包括向受试者施用能够连读聚丝蛋白基因中功能失去突变的试剂。
应该意识到本发明能够治疗IV和/或治疗易发展IV的动物受试者，尤其是人类受试者。另外，由于严重或轻微形式的IV和其他疾病的联系，该治疗可以用于可能易患有或患有特异反应性皮炎(湿疹)、哮喘、银屑病或变态反应，如接触型变态反应和食物变态反应(例如，花生变态反应)的受试者。关于皮肤病症，低水平的聚丝蛋白表达能够导致轻微和/或亚临床疾病的发展。这样，本发明还可以涉及预防和/或治疗所述轻微和/或亚临床形式疾病。的确，许多皮肤病症是未确诊的，且这样的治疗被更多地认为是美容治疗。因此，本发明还延伸到任何这样的美容治疗中。
能够被克服的功能失去突变通常是无义突变。这样的突变典型地是单碱基修饰，所述单碱基修饰导致过早终止密码子的产生(即，TGA，TAG或TAA)。尽管本发明人已经在聚丝蛋白基因中鉴定了大量导致功能失去的突变，但是一种突变特别导致符合读框地生成过早终止密码子。该突变是在FLG基因的位置1501处的1个碱基取代。该突变是1501C>T(从起始ATG开始编号)，其导致胞苷被胸苷取代，且相应的在位置501处精氨酸变为终止密码子(R501X)的氨基酸改变。由于该突变发生在第一个聚丝蛋白重复序列中并且导致终止密码子的产生，所以不产生聚丝蛋白肽的功能拷贝。尽管，本发明人已经鉴定了聚丝蛋白基因中的其他突变，但是该突变是迄今为止在欧洲高加索人群中最为常见的，且本发明优选的方面是克服该突变。
受试者可以是任何需要预防性或治疗性处理的受试者，且适宜地，可以是新生儿或甚至胎儿。然而，受试者可以处于生命的任何阶段，且因此包括新生儿、儿童和成年人。
存在大量已知的能够诱导连读无义突变的试剂。一类试剂是某些氨基糖苷类抗生素，包括庆大霉素、巴龙霉素、新霉素和妥布霉素(Bidou L.等，基因治疗(Gene Therapy)11：619-627，2004；Howard MT.，等神经学年刊(Ann Neurol)，55：422-426，2004)。
另一类包括负霉素的试剂记述在US2005/0014835中，将其引入作为参考。最终的突变tRNA能够作为无义突变阻抑制子生成。这些从突变的tRNA基因中生成，所述突变的tRNA基因导致生成这样的tRNA，所述tRNA具有改变的反密码子因而它们具有连读由无义突变产生的密码子的能力。这记述在例如Panchal RG等，人类基因治疗(Human Gene Therapy)，10：2209-2219(1999)中。
除上述经鉴定的试剂外，可能存在其他合适的突变阻抑制子，且本发明还提供了鉴定阻抑制子的方法。
因此，在另一个方面，提供了测试试剂连读无义突变能力的方法，该方面包括下列步骤：
a)提供突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体；
b)使测试试剂和所述构建体相接触；和
c)检查该测试试剂是否能够影响突变聚丝蛋白基因的连读和报道基因的表达。
任何合适的已鉴定的试剂能够用于治疗IV和/或本文所提及的其他相关疾病，或实际上任何由无义突变引起的疾病/遗传病症。
应该意识到所述构建体应该受到适当的转录控制元件如启动子和终止子序列的控制。而且，该构建体中存在包含内部无义序列的聚丝蛋白核酸序列。无需使用完整的聚丝蛋白核酸序列，仅需要一部分。适宜地，聚丝蛋白核酸序列可以是10-1000bp的长度，更优选地15-200bp的长度。
典型的突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体包括符合读框地与3’报道基因序列相连接的5’突变聚丝蛋白核酸序列。照这样，为了实现任何的报道基因序列表达，必须连读位于5’聚丝蛋白序列中的无义/终止密码子。
优选的构建体还包括另外的聚丝蛋白序列5’的阳性对照报道基因。如应该意识到地，全部序列符合读框地彼此连接。对于这样的构建体，提供了5’阳性对照报道基因，因此使用者可以确保该构建体适当地发挥功能。如果没有发生聚丝蛋白基因连读，则只有该阳性报道基因提供可检测到的信号。然而，如果发生聚丝蛋白序列的连读，该阳性对照报道基因和聚丝蛋白序列的3’报道基因两者均提供可检测到的信号。备选地，该阳性报道基因可以在单独启动子的控制下存在于构建体中，或该阳性报道基因可以由单独的共转染质粒所编码。
对于报道基因或阳性对照报道基因的使用而言合适的报道基因是技术人员所熟知的，且包括例如萤光素酶基因，β半乳糖苷酶基因，荧光基因诸如绿色荧光蛋白等，氯霉素乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶等。此外，从不同生物体物种能够获得特定基因的不同形式。
特别优选的构建体包括作为阳性对照报道基因的海肾萤光素酶基因，突变聚丝蛋白核酸序列和作为报道基因的萤火虫萤光素酶基因，其受到利用例如HSV-TK启动子和SV40-多聚A终止子信号的适当地转录控制，如示意性显示于图1中。然而，可以设想许多其他适合的构建体，且报道基因可以是当其表达时，仅容许细胞在特定生长培养基中存活的报道基因。
通过本领域技术人员熟知的技术可以进行任何具体的报道基因表达的检测。
第一轮筛选后，合适地，可以通过测试从患有与无义突变相关疾病的患者获得的细胞或细胞系上的试剂，而测试任何可能有用的试剂，从而确定/确证该试剂能够导致连读突变。
应该意识到该方法可以在本领域中已知的基于细胞的或无细胞的系统中进行。
现在进一步通过实施例并参考附图描述本发明，它们显示：
图1显示用于检验聚丝蛋白无义突变连读试剂的构建体。A：通过2bp的缺失从pRL-TK中的R-luc突变的TAA终止密码子，和与FLG和f-Luc符合读框地插入的Xba I位点；B：克隆到pSP-luc+NF的Nco I位点中的FLG寡核苷酸盒；C：从f-Luc突变的ATG密码子用于减少“渗漏的”(leaky)表达。
图2显示用于克隆进入pSP-luc+的FLG寡核苷酸盒；
图3显示TR3构建体：来自染色体6p22.1的人Arg(CGA)tRNA基因；
图4显示TR4B构建体：来自染色体15q26.1的人tRNA-Arg(TCG)基因；
图5显示预测的TR3和TR4B阻抑制子tRNA的二级结构，其显示了突变的反密码子环。用粗体显示反密码子环，且标记了容许该环与TGA密码子配对的G>A突变。所示碱基是由DNA所预测的，而不说明转录后修饰；
图6显示聚丝蛋白R501X突变的连续(a)用pRLF-FLG-WT或pRLF-FLG-501X报道基因质粒瞬时转染表皮细胞系293的连读。转染后48小时，按照制造商的方案溶解细胞并利用Promega双萤光素酶测定系统测定萤光素酶。
未转染的细胞不提供海肾或萤火虫信号。含有野生型聚丝蛋白序列的阳性对照构建体pRLF-FLG-WT提供阳性海肾和萤火虫信号。相反地，pRL-FLG-501X构建体提供同等的海肾信号但在缺乏任何连读试剂的情况下，不提供可检测到的萤火虫信号。这证明pRLF-FLG-501X构建体不是“渗漏的”，且因此适合于检验或连读试剂。
(b)用含有人聚丝蛋白基因片段的pRLF-FLG-501X共报道基因瞬时转染293细胞系，所述人聚丝蛋白基因片段携带符合读框地克隆在海肾和萤火虫萤光素酶之间的R501X突变。
以针对海肾萤光素酶活性进行了标准化的萤火虫萤光素酶活性测量连读活性。进行了四次重复阅读并进行平均。阻抑制子tRNAs TR3和TR4BsupTGA容许聚丝蛋白R501X无义突变的连读。庆大霉素以剂量依赖的形式，容许聚丝蛋白R501X突变的连读。
图7显示庆大霉素在来自寻常鱼鳞病个体(FLG R501X纯合体)的角质形成细胞中诱导聚丝蛋白的重新表达。
原代角质形成细胞在无血清KGM中生长，并通过从低(0.09mM)向高钙培养基(1.89mM)中的转移诱导其分层(分化)。利用甲醇/丙酮固定培养物，并通过间接免疫荧光利用了针对人聚丝蛋白重复序列的Novocastra单克隆抗体15C10对培养物进行染色。利用1mg/ml DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)复染细胞核；(a)正常对照角质形成细胞在分化后表达聚丝蛋白，(b)R501X纯合体角质形成细胞在分化后不表达聚丝蛋白，(c)R501X纯合体角质形成细胞在600μg/ml庆大霉素的存在下(用药物培养96小时)，在分化后表达聚丝蛋白；和
图8显示庆大霉素处理后来自R501X患者的聚丝蛋白表达。在器官培养中，用600μg/ml庆大霉素培养来自患有明显寻常鱼鳞病的R501X纯合体患者的皮肤活组织切片物质96小时，恢复聚丝蛋白表达(箭头)。培养后，活组织切片用福尔马林固定，石蜡包埋，并利用Novocastra抗人聚丝蛋白重复单克隆抗体15C10，以免疫过氧化物酶检测对其进行免疫组化处理；A：未处理的活组织切片；B庆大霉素处理
方法和结果
实施例1：用于检验连读试剂的共报道基因构建体
将对应于人聚丝蛋白基因碱基数1480-1523的寡核苷酸盒，(FLG；从ATG起始密码子开始编号编码序列；Genbank登记号NM_002016.1)，克隆到唯一的Nco I限制性位点中，该位点在质粒载体pSP-luc+NF(Promega)中跨越萤火虫萤光素酶基因(f-Luc)的ATG密码子。图2中显示的寡核苷酸盒具有增加的突出端，其对应于Nco I的黏性末端。这些盒对应于含有密码子501的人FLG基因区域，即普通的R501X突变位点。形成了野生型和R501X突变形式。通过DNA测序，鉴定并核实了具有处于正确方向的插入物的克隆。插入FLG盒后，通过利用下列引物的位点定向诱变将ATG密码子，即f-Luc基因最初的起始密码子，突变为AGG精氨酸密码子，所述引物是：FLmutl 5′AGG CAT TCA GCC AGG GTC ACCGAC GCC 3′和FLmut2 5′GGC GTC GGT GAC CCT GGC TGA ATG CCT3′(Stratagene快变系统(Stratagene QuikChange system))。这是为了防止最初起始密码子的可能使用，其可能甚至在含有TGA或其他终止密码子的FLG盒的存在下，导致萤火虫萤光素酶的“渗漏”表达。通过DNA测序证实克隆。将这些克隆命名为pSP-R501和pSP-X501，其分别对应于野生型和突变形式。
通过缺失2bp(TA)突变质粒载体pRL-TK(Promega)中的海肾萤光素酶基因(R-Luc)的TAA终止密码子。这是利用下列引物的位点定向诱变完成的，所述引物是：pRL.M15′TCAAAAATG AAC AAA TTC TAG AGCGGC C 3′和pRL.M2 5′GGC CGC TCT AGA ATT TGT TCA TTT TTG A 3′(Stratagene快变系统(Stratagene QuikChange system))。对突变的克隆(命名为pRL-M1)进行了完全测序。
为了制备完整的共报道基因构建体，从pSP-R501和pSP-X501中切下含有完整FLG-f-Luc融合基因的Nhe I-Xba I片段。将这些克隆到pRL-M1的唯一Xba I位点中，这是可能的，其原因在于Nhe I和Xba I具有相容的黏性末端。通过DNA测序，选择具有正确方向的野生型和R501X突变克隆。将野生型和R501X突变共报道基因构建体分别命名为pRLF-FLG-WT和pRLF-FLG-501X(图1)。
实施例2：产生人阻抑制子tRNA基因以用于TGA无义突变
人类基因组包括大量CGA-精氨酸t-RNA基因。这些是非常紧密的基因，且含有RNA聚合酶III的基因内启动子(Lewin B.，在：基因VII(GenesVII)，牛津大学出版社(Oxford University Press)，2000，第624-626页)。在目前人类基因组的集合(HG17；http://genome.ucsc.edu)中鉴定出这些基因中的两种，为方便将其命名为TR3和TR4B，并由正常人对照DNA对它们进行扩增。TR3位于染色体6p22.1上，且TR4B位于染色体15q26.1上。具体地，利用引物TR3.F 5′CGA TGC AGA CAATATGCA GA 3′和TR3.R 5′CTAAGC CTA CAA AAC CGA AA 3′，将TR3基因作为668bp的片段进行扩增，其对应于人类基因组HG17集合中碱基编号chr6:26,407,555-26,408,284。利用引物TR4B.F 5′GAC TTC TGG GTG GGCTCT CC 3′和TR4B.R 5′CCC TCC CTC TCC ACT TTC CT 3′，将TR4B基因作为465bp的片段进行扩增。该片段对应于人类基因组HG17集合中碱基编号chr15：87,679,164-87,679,628。利用高保真PCR系统(罗氏(Roche))和下列条件((94℃ 2分钟)x1；(94℃ 30秒，X℃ 30秒，72℃ 60秒)x35；(72℃ 5分钟)x1)进行了PCR。对于TR3，退火温度X＝55℃；对于TR4B，X＝58℃。将这些片段克隆到pCR2.1载体(InVitrogen)中，并对一些克隆进行测序从而获得不含PCR的克隆人为产物的每种构建体的克隆。图3和4中显示了标有注释的完整构建体序列。图5中显示了对由此生成的tRNA分子所预测的二级结构。对这些tRNA基因的反密码子环进行了突变，从而使这些识别TGA终止密码子而非CGA精氨酸密码子，即从5′TCG 3′到5′TCA 3′突变基因中的反密码子环。在TR3基因中，这对应于突变G351A，从引物TR3.F的第一个碱基开始任意编号(见上)。在TR4B中，该突变对应于G180A，从引物TR4B.F的第一个碱基开始编号(见上)。
实施例3：FLG连读的双萤光素酶测定
通过利用Fugene-6系统(罗氏(Roche))，在96孔板中将共报道基因构建体pRLF-FLG-WT和pRLF-FLG-501X瞬时转染到293细胞(转化的人肾上皮细胞系)中，而对它们进行测试。转染后48小时，对细胞使用双萤光素酶测定系统(Promega)，所述系统检测特异性萤光素酶信号，其对应于海肾和萤火虫萤光素酶报道基因。对野生型共报道基因，pRLF-FLG-WT，获得了海肾和萤火虫萤光素酶的强信号，如图6a所示。相反地，对pRLF-FLG-501X构建体，仅获得了海肾信号，显示出存在于该构建体中FLG盒内的R501X过早终止密码子突变导致萤火虫萤光素酶表达的完全丧失(图6a)。
实施例4：FLG无义突变的连读测定
利用具有浓度范围0-2000μg/ml庆大霉素的pRLF-FLG-501X，如上所述在96孔板中进行了293细胞的瞬时转染。利用pRLF-FLG-WT平行地进行了阳性对照转染。如上所述，利用双萤光素酶测定系统(Promega)测量聚丝蛋白无义突变连读活性。图6b显示庆大霉素以剂量依赖的方式，容许R501X过早终止密码子突变的连读，该试验中最大连读发生在浓度为2000μg/ml时。作为使用氨基糖苷进行R501X突变的连读的备选，测试了人阻抑制子转移RNA(tRNA)种类TR3supTGA和TR4BsupTGA(见实施例2)。利用Fugene-6瞬时转染系统(罗氏(Roche))，将这些共转染到如上所述具有pRLF-FLG-501X报道基因质粒的293细胞中。这显示出所测试的两种阻抑制子tRNA种类均提供强连读信号(图6b)。
实施例5：角质形成细胞培养物中聚丝蛋白表达的再活化
建立了来自患有严重IV个体的原代角质形成细胞培养物，已经显示出所述个体是对聚丝蛋白R501X突变的纯合体，正如Smith FJD等，自然遗传学(Nature Genetics)2006，印刷中所述。正常原代角质形成细胞不表达聚丝蛋白到可测量的水平，其原因在于后者是晚分化特异性蛋白。然而，通过将培养物转移到高钙培养基中，可以诱导这些细胞表达聚丝蛋白，这导致角质形成细胞的层化和分化，从而引起聚丝蛋白的表达(Smith FJD等，2006，印刷中)。正常对照角质形成细胞的分化引起聚丝蛋白原在充分层化的细胞集落中表达(图7)。利用间接免疫荧光，使用了针对人聚丝蛋白重复肽中表位的单克隆抗体15C10(Novocastra)对蛋白质进行染色。相反，来自R501X纯合体患者的充分层化的培养物未能表达聚丝蛋白原(图7，也见Smith FJD等，2006中，印刷中)。然而，当用600μg/ml庆大霉素处理来自R501X纯合体患者的分化的培养物时，发现充分层化的细胞集落在96小时，以与正常对照相当的水平表达聚丝蛋白原(图7)。而且，聚丝蛋白原以细胞质颗粒的形式存在，与对照角质形成细胞中观察到的那些相当。因此，庆大霉素能够在培养的细胞中促进R501X聚丝蛋白突变的连读。
实施例6：器官培养中表皮聚丝蛋白表达的再活化
在添加或减去600μg/ml庆大霉素的Dulbecco改良Eagle培养基中，在培养物中培养3mm立方体的皮肤活组织切片材料4天，该材料来自患有明显IV的聚丝蛋白R501X/R501X纯合体患者。培养后，固定并包埋该活组织切片材料以进行组织学和免疫组化。当用针对人聚丝蛋白重复肽中表位的单克隆抗体15C10(Novacastra)染色时，未处理的活组织切片完全是阴性的(图8)，这与对聚丝蛋白无效突变纯合性相一致(Smith FJD等，自然遗传学(Nature Genetics)论文，2006，印刷中)。相反，用庆大霉素培养过的活组织切片材料显示出颗粒细胞层的强烈染色(图8)。由于纯合或混合杂合聚丝蛋白无效突变，所以缺乏可通过组织学鉴定的透明角质颗粒是严重IV的标记(Smith FJD等，自然遗传学(Nature Genetics)论文，2006，印刷中)。显著地，用庆大霉素处理于此观察到的聚丝蛋白染色的恢复引起透明角质颗粒的重新出现(图8)。此外，在颗粒层中较高的一些细胞中，其中聚丝蛋白染色特别强烈，观察到其细胞形态变得更加扁平(图8)。因此，恢复的蛋白质表达表现出促进正确的表皮终止分化，这与聚丝蛋白蛋白功能的完全恢复相一致。
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15.Presland，R.B.等，人类聚丝蛋白原的N末端结构域在表皮分化过程中特异性蛋白水解性分裂的证据(Evidence for specific proteolytic cleavage ofthe N- terminal domain of human profilaggrin during epidermaldifferentiation).皮肤病学研究杂志(JInvest Dermatol)108，170-8(1997).
16.Ishida-Yamamoto，A.，Takahashi，H.，Presland，R.B.，Dale，B.A.& Iizuka，H.在正常人类皮肤和兜甲蛋白角皮病中，聚丝蛋白原N末端结构域向具有片断DNA的角质形成细胞核中的迁移(Translocation of profilaggrinN-terminal domain into keratinocytes nuclei with fragmented DNA in normalhuman skin and loricrin keratoderma).实验室研究(Lab Invest)78，1245-53(1998).
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Claims (15)

1.一种试剂用于制备用于治疗IV和/或相关疾病的药物的用途，所述试剂能够赋予在聚丝蛋白基因中连读功能失去突变的能力。
2.一种预防或治疗IV和/或其他相关疾病的方法，其包括向受试者施用试剂的步骤，所述试剂能够赋予在聚丝蛋白基因中连读功能失去突变的能力。
3.按照权利要求2的方法，其中认为所述方法是美容治疗。
4.按照以上权利要求中任一项的用途或方法，其中所述功能失去突变是无义突变。
5.按照权利要求4的用途或方法，其中所述突变是1501C>T(从起始ATG开始编码)，其导致胞苷被胸苷所取代和相应的在位置501处精氨酸变为终止密码子(R501X)的氨基酸改变。
6.按照以上权利要求中任一项方法的用途，其中所述受试者是新生儿、儿童或成年人。
7.按照以上权利要求中任一项的用途或方法，其中所述试剂是氨基糖苷类抗生素。
8.按照权利要求7的用途或方法，其中所述氨基糖苷是庆大霉素、巴龙霉素、新霉素或妥布霉素。
9.按照权利要求1-6中任一项的用途或方法，其中所述试剂是负霉素或突变tRNA。
10.一种测试试剂连读无义突变能力的方法，其包括下列步骤：
a)提供突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体；
b)使测试试剂和所述构建体相接触；和
c)检查所述测试试剂是否能够影响突变聚丝蛋白基因的连读和报道基因的表达。
11.按照权利要求10的方法，其中所述聚丝蛋白核酸序列长度为10-1000bp。
12.按照权利要求10或11的方法，其中突变聚丝蛋白基因/报道基因构建体包含与3’报道基因序列符合读框地连接的5’突变聚丝蛋白核酸序列。
13.按照权利要求12的方法，其中所述构建体还包括另外的聚丝蛋白序列5’阳性对照报道基因。
14.按照权利要求13的方法，其中所述报道基因是萤光素酶基因，β-半乳糖苷酶基因，荧光基因诸如绿色荧光蛋白等，氯霉素乙酰转移酶，β-葡糖醛酸糖苷酶等。
15.按照权利要求14的方法，其中所述构建体示意性地显示于图1中。
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