KR20070098998A - 바이러스의 증식을 위한 비-발암성 ｍｄｃｋ 세포주 - Google Patents

바이러스의 증식을 위한 비-발암성 ｍｄｃｋ 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈청의 존재하에, 또는 혈청의 부재하에서 성장할 수 있고, 부착성이며, 비-발암성인 신규한 MDCK-유도된 세포주를 제공한다. 본 발명의 세포주는 백신 물질(예로서, 백신) 생산에 유용하다. 더욱 특히, 본 발명의 세포주는 일반적으로 인플루엔자 바이러스 생산에, 특히, ca/ts 인플루엔자 바이러스 생산에 유용하다. 본 발명은 추가로 MDCK 세포가 비-발암성인 상태로 유지되도록 MDCK 세포를 적응시키고 배양하기 위한 방법 및 배지 조제물을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 세포주에서 백신 물질(예로서, 인플루엔자 바이러스)을 생산하는 방법을 제공한다.

Description

바이러스의 증식을 위한 비-발암성 ＭＤＣＫ 세포주{NON-TUMORIGENIC MDCK CELL LINE FOR PROPAGATING VIRUSES}
본 발명은 백신 물질의 생산을 위해 사용될 수 있는, 신규한 비-발암성 MDCK 세포에 관한 것이다. 비-발암성 MDCK 세포는 무혈청 배양 배지에 적응될 수 있다. 본 발명은 추가로 배지 조제물 및 비-발암성 MDCK 세포를 증식시키기 위한 배양 방법 뿐만 아니라, 본 발명의 세포주의 비-발암성 성질을 유지시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명 추가로 비-발암성 MDCK 세포를 사용하여 세포 배양물액에서 인플루엔자 바이러스를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 기술된 방법에 의해 수득될 수 있는 바이러스(예로서, 인플루엔자) 및 이러한 타입의 바이러스들 및/또는 그의 성분들을 포함할 수 있는 면역원성 조성물에 관한 것이다.
매년 인플루엔자의 유행에 의해 유발되는 질환을 예방하기 위한 가장 중요한 공중 보건 방법이 백신접종이다. 백신의 유효한 유용성은, 안정적이며 배양하기 쉬운 공급원으로부터 다량의 백신 물질(예로서, 바이러스)을 생산할 수 있는지 여부에 달려있다. 신속한 백신 개발과 그의 풍부한 유용성이 다수의 인간 및 동물 질환을 퇴치시키는데 중요하다. 백신 생산의 지연과 그의 양적 부족함 때문에 급증하는 질환을 처리하는데(address) 문제가 발생할 수 있다. 예를 들면, 범유행성 인플루 엔자에 대한 백신을 생산하기 위해 요구되는 장기간의 리드 타임(lead time)에 관한 관계에는 이유가 존재한다고 최근 연구를 통해 제안되었다. 예를 들면, 문헌 [Wood, J. M., 2001, Philos. Trans. R. Soc.Lond. B. Biol. Sci., 356:1953]을 참조할 수 있다. 유효한 백신 생산은 숙주 시스템으로부터 고수율로 생산되는, 다량의 백신 물질의 배양을 필요로 한다. 상이한 백신 물질은 허용가능한 수율을 얻기 위해 상이한 배양 조건을 필요로 한다. 백신 물질은 발육란, 1차 조직 배양 세포에서, 또는 확립 세포주에서 생산될 수 있다. 그러나, 현재 이들 숙주 시스템은 하기 설명하는 다수의 제한들로 인하여 어려움을 겪고 있다.
발육란은 전형적으로 닭 사육 및 난(egg) 수정 관리를 필요로 하는 시간-, 노동-, 및 비용 집약적 공정에서 인플루엔자 백신 바이러스 생산을 위해 사용된다. 추가로, 난에서 생산된 인플루엔자 백신은 달걀 알러지가 있는 사람에게서는 중증의 즉각적인 과민반응을 유발할 수 있기 때문에 금기시된다. 따라서, 백신 산업에서는 세포 배양물 시스템에서 인플루엔자 백신을 생산하는 것과 같이, 난을 이용하지 않는 대체 생산 플랫폼을 개발하기 위한 노력이 계속되어져 왔다.
1차 조직 배양 세포를 사용하는 것은 안정적인 1차 세포 군집을 발생시키고 유지시킬 때 맞이하게 되는 어려움으로 인해 제한을 받게 된다. 대개는 1차 세포에 대한 기술상의 제한을 회피하기 위해서 확립 세포주를 사용한다. 그러나, 이러한 세포주들 다수는 발암성인 것으로 공지되어 있고, 그 자체로서는 안전상의 문제를 일으키며, 백신 생산을 위해 그들을 사용할 경우 그에 대하여 현저한 규제적 제한을 받기 쉽다. 실제로, 세계 보건 기구(World Health Organization)의 적용가능한 가이드라인에서는 백신 생산을 위해 단지 몇 개의 세포주만이 허용되고 있다고 제시하고 있다. 동물 또는 인간 공급원으로부터 유래된 혈청 및/또는 단백질 첨가물을 세포 배양 배지중에서 사용하는 것으로부터도 추가의 문제들이 발생한다. 예를 들면, 다수의 첨가물 사이의 질 및 조성물에 따른 변이성 및 미코플라스마, 바이러스, BSE-병원체 및 다른 감염원에 의한 오염 위험성이 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 혈청 또는 혈청-유래 물질, 예로서, 알부민, 트랜스페린 또는 인슐린은, 배양물 및 그로부터 생산된 생물학적 산물을 오염시킬 수 있는 원치않는 인자를 포함할 수 있다. 따라서, 다수의 단체들은 혈청 또는 혈청 유래 산물을 필요로 하지 않는 유효한 숙주 시스템 및 배양 조건을 개발하기 위해 연구하고 있다.
그 결과, 비용면에서는 저렴하고, 고도로 안전적이며 안정적인 방식으로, 바람직하게는, 무혈청 또는 동물 무단백질 배양 조건에서 백신 물질을 생산하기에 유용한 비-발암성 세포주를 확립하는 것이 요구되고 있다. 그러한 세포 시스템은 인플루엔자 백신 물질 생산에 특히 유용할 것이다.
개의 원위세뇨관(MDCK: Madin Darby Canine Kidney) 세포는 전통적으로 인플루엔자 바이러스 적정에 사용되어 왔다[Zambon M., in Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, ch 22, pg 291-313, Blackwell Science(1998)]. 이들 세포는 1958년에 일반 수컷 코카 스파니엘(cocker spaniel)의 신장으로부터 확립되었다. S. Madin과 N.B. Darby에 의해 기탁된 MDCK(CCL 34) 계통을 ATCC는 목록에 올렸다. 그러나, 다수의 다른 MDCK 세포 계통도 이용가능하다. Leighton J와 그의 동료들은 MDCK 세포의 종양원성 특징을 상세히 보고하는 논문들을 시리즈로 발표하 였다([Leighton et al.,1968, Science 163:472]; [Leighton et al., 1970, Cancer 26:1022] 및 [Leighton et al., 1971 Europ J. Cancer 8:281]). 그러나, 이들 연구에서 사용된 MDCK 세포의 계통 및 계대수는 기재되어 있지 않았고, 상이한 계통 및 상이한 계대로부터의 MDCK 세포가 발암성 성질을 갖는 세포를 가져올 수 있는 염색체 수 및 구조상에 변화를 나타내고 있다는 것은 이미 공지되어 있었다[Gaush et al., 1966, Proc . Soc . Exp . Biol . Med ., 122: 931].
백신 생산을 위한 세포주의 용인성과 관련되는 주요 고려 사항들중 하나는 세포의 잠재적인 악성 종양에 관한 것이기 때문에, 본 기재된 세포를 사용하여 백신 물질을 생산하기 위하여 MDCK 세포를 사용하는 것은 제한을 받는다. 미국 특허 제6,656,720호(Groner et al.) 및 미국 특허 제6,825,036호(Makizumi et al.), 양자 모두는 현탁액중 무혈청 배지에서 성장하도록 적응되고, 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 사용될 수 있는, MDCK 세포로부터 유도된 세포주를 개시하는 것을 목적으로 한다. 그러나, 부착 요구 조건과 정상 동물 세포의 발암성 세포로의 형질전환 사이에는 상관관계가 있다고 보고되었다[Stiles et al., 1976, Cancer Res., 36:3300]. 수개의 단체들은([Kessler et al., 1999, Cell Culture Dev Biol Stand, 98:13]; [Merten et al., 1999, Cell Culture Dev Biol Stand, 98:23] 및 [Tree et al., 2001, Vaccine, 19:3444]) 인플루엔자 바이러스의 대량 생산을 위해 MDCK 세포를 사용하는 것에 대해 기재하는 것을 목적으로 한다; 그러나, 사용되는 MDCK 세포의 잠재적인 형질전환에 대해서는 다루지 않았다.
본 원에서 참조문헌의 인용 또는 논의 그 자체가 본 발명에 대하여 선행 기 술이라는 것을 용인하는 것으로 해석되어서는 안된다. 추가로, 특허 인용은 그의 유효성을 용인하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 발명의 요약
본 발명은 동물성 단백질이 없는(APF: animal protein-free) 제제를 비롯한, 혈청을 함유하는 배지 조제물 또는 무혈청 배지 조제물에서 성장하도록 적응된 비-발암성 MDCK 세포를 제공한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 비-발암성 MDCK 세포는 부착성이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 비-발암성 MDCK 세포는 상피 형태를 갖는다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 비-발암성 MDCK 세포는 부착성이고 상피 형태를 갖는다. 하나의 실시태양에서, 발암성은 성숙한 누드 마우스 모델에서 측정된다(예로서, [Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36:1353] 및 하기 실시예 2). 발암성은 또한 다른 분석법, 예를 들면, 닭의 배아내로의 주사 및/또는 융모요막으로의 국소 적용[Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1024]에 의해 측정될 수 있다.
본 발명의 MDCK 세포에서 배양될 수 있는 바이러스로는 제한하는 것은 아니지만, (-) 스트랜드 RNA 바이러스, 제한하는 것은 아니지만, 인플루엔자, RSV, 1형, 2형 및 3형 파라인플루엔자 바이러스, 및 인간 메타뉴모바이러스를 포함한다.
본 발명은 추가로 비-발암성 MDCK 세포의 유도와 유지에 유용한 방법 및 배지 조제물을 제공한다. 본 발명의 MDCK 세포는 특히 예를 들면, 바이러스와 같은 백신 물질 생산에 유용하다.
본 발명의 다른 측면들은 본 발명의 임의의 MDCK 세포를 백신 물질의 생산을 허용하는 조건하에 적합한 배양 배지중에서 배양하고, 하나 이상의 숙주 세포로부터, 또는 그것이 배양된 배지로부터 분리시킴으로써 백신 물질(예로서, 바이러스)을 생산하는 방법을 포함한다.
면역원성 조성물은 또한 본 발명의 특징이 된다. 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 생산된 백신 물질, 및 임의로, 부형제, 예로서, 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 투여 성분을 포함하는 면역원성 조성물이다.
하나 이상의 상기 기술된 면역원성 조성물을 유효량으로 대상에게 투여함으로써 대상에서 면역원성 반응을 일으키는 방법 또한 현 발명에 포함된다. 추가로, 바이러스 감염에 대한 면역원성 반응을 일으키기에 유효한 양으로 하나 이상의 상기 기술된 면역원성 조성물을 투여함으로써 대상에서 바이러스 감염(예로서, 바이러스성 인플루엔자)을 예방 또는 치료하는 방법 또한 현 발명의 일부분이다. 그러한 치료를 위한 대상으로는 포유동물(예로서, 인간)을 포함할 수 있다. 추가로, 그러한 방법은 또한, 바이러스 감염을 예방학적으로 또는 치료학적으로 치료하기에 유효한 양으로 대상에게 투여되는, 본 발명의 MDCK 세포에서 생산된 하나 이상의 바이러스 및 약제학적으로 허용가능한 부형제의 조성물을 투여하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 이들 및 다른 목적 및 특징은 이하의 상세한 설명을 첨부된 도면과 조합하여 읽음으로써 완전히 명백해진다.
도 1은 세포중의 인플루엔자 균주 배양이다. 패널 A는 MDCK 세포 및 베로(Vero) 세포 클론(27F9)중 대표적인 ca/ts 인플루엔자 균주의 감염 확산을 비교하는 형광 포커스 분석법의 결과를 나타내는 사진이다. 패널 B는 MDCK 세포중 인플루엔자 균주 ca A/베트남/1203/2004(H5N1)의 성장 곡선이다. 역가는 감염 후 48시간째 ~8log10 TCID50/mL의 정점에 도달하였고, 이후 3 내지 4일간 안정적으로 유지되었다.
도 2는 MDCK-S PreMCB(계대수 57)의 유도를 위해 사용된 공정 과정을 개략적으로 설명한다. 본 공정 과정은 실시예 2에서 상세히 설명된다.
도 3은 MDCK-S 세포가 상피-양(like) 형태를 갖는다는 것을 나타내는 사진이다. 접종 후 3일째 사진 촬영하였다.
도 4는 10% FBS DMEM 배지에서의 MDCK-S 세포의 배양 곡선이다. 세포는 약 1일간의 지체기를 가진 후, 지수적으로 성장하였고, 접종 후 4일째 정지기에 진입하여 5일째에는 ~29 x 106 세포의 최대 밀도에 도달하게 되었다.
도 5는 10% FBS DMEM 배지중 MDCK-S 세포의 포도당 소비 및 젖산염 생산에 대한 그래프이다. 지체기 동안 포도당 및 젖산염에 대한 속도는 느렸고, 각각 2.93mM/일 및 3.43mM/일로 증가하였다.
도 6은 10% FBS DMEM 배지중 MDCK-S 세포의 글루타민 소비 및 글루타메이트 및 암모니아 양자 모두의 생산에 대한 그래프이다. 글루타민 소비 속도는 4일까지는 0.49mM/일이었고, 암모니아 생산 속도는 5일까지는 0.32mM/일이었다. 본 연구에 서 글루타메이트는 축적되지 않았다.
도 7은 중기의, 낮은 계대(P61/4) 및 높은 계대(P81/24)의 MDCK-S 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포 플롯이다. 염색체 계수의 범위는 중기당 70 내지 84개이고, 높은 계대 및 낮은 계대 양자 모두에서의 형식상의 염색체 갯수는 78개였다.
도 8은 MDCK-T PreMCB(계대수 64/5)의 유도를 위해 사용된 공정 과정을 개략적으로 설명한다. 본 공정 과정은 실시예 3에서 상세히 설명된다.
도 9는 MDCK-T 세포가 상피-양 형태를 갖는다는 것을 나타내는 사진이다. 접종 후 3일째 사진 촬영하였다.
도 10은 Taub의 배지에서의 MDCK-T 세포의 배양 곡선이다. 세포는 지체기없이 접종 후 4일째 정지기에 진입할 때까지 지수적으로 성장하였다.
도 11은 Taub의 배지중 MDCK-T 세포의 포도당 소비 및 젖산염 생산에 대한 그래프이다. 지수증식기 동안 포도당 및 젖산염에 대한 속도는 각각 1.78mM/일 및 2.88mM/일이었다.
도 12는 Taub의 배지중 MDCK-T 세포의 글루타민 소비 및 글루타메이트 및 암모니아 양자 모두의 생산에 대한 그래프이다. 글루타민 소비 속도는 4일까지는 0.36mM/일이었고, 암모니아 생산 속도는 7일까지 0.22mM/일의 속도로 직선으로 증가하였다. 본 연구에서 글루타메이트는 축적되지 않았다.
도 13은 중기의, 낮은 계대(P61/4) 및 높은 계대(P81/24)의 MDCK-T 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포 플롯이다. 염색체 계수의 범위는 낮은 계대 세포의 경우 중기당 52 내지 82개이고, 높은 계대 세포의 경우, 54 내지 82개였다.
도 14는 중기의 MDCK-T, MDCK-SF101(계대 71/9) 및 MDCK-SF102 세포(계대 71/9) 100개에서의 염색체 갯수 분포 플롯이다. SF101 및 SF102 세포 양자 모두의 형식상의 염색체 갯수는 78개였고, 염색체 계수의 범위는 SF101 및 SF102 세포 각각에 대하여 중기당 70개 내지 82개, 및 60개 내지 80개였다.
도 15는 MDCK-SF103이 상피-양 형태를 갖는다는 것을 나타내는 사진이다. 접종 후 3일째 사진 촬영하였다.
도 16은 MediV SFM103에서의 MDCK-SF103 세포의 배양 곡선이다. 세포는 약 1일간의 지체기를 가진 후, 지수적으로 성장하였고, 접종 후 4일째 정지기에 진입하여 4일째에는 ~17 x 106 세포의 최대 밀도에 도달하게 되었다.
도 17은 MediV SFM103에서의 MDCK-SF103 세포의 포도당 소비 및 젖산염 생산에 대한 그래프이다. 지수증식기 동안 포도당 소비 및 젖산염 생산은 서로서로를 반영하였고, 포도당 농도가 감소함에 따라 젖산염 농도는 증가하였다.
도 18은 MediV SFM103에서의 MDCK-SF103 세포의 글루타민 소비 및 글루타메이트 및 암모니아 양자 모두의 생산에 대한 그래프이다. 암모니아 생산 속도는 7일까지 직선으로 증가하였다. 본 연구에서 글루타메이트는 축적되지 않았다.
도 19는 중기의, 계대 87의 MDCK-SF103 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포 플롯이다. SF103 세포의 형식상의 염색체 갯수는 78개이고, 염색체 계수의 범위는 66 내지 80개였다.
도 20은 생산 규모 배양 및 정제이다. 패널 A는 시토덱스(Cytodex) 비드상에 서 배양된 MDCK-SF103의 250mL 스피너 플라스크로부터 수개의 백신 재조합 균주, B/빅토리아/504/2000(~8 LogTCID50/mL), A/시드니/05/97(~7.85 LogTCID50/mL) 및 A/신규의 칼레도니아/20/99(~8.2 LogTCID50/mL)에 대하여 수득된 수득율의 플롯이다. 패널 B는 백신 물질을 상업적 규모로 생산하기 위하여 사용될 수 있는 규모가 확장된 하나의 세포 배양 공정 과정을 개략적으로 설명한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, MDCK 세포가 비-발암성인 상태로 유지되는 조건하에서 상기 세포를 배양할 수 있다는 발견에 부분적으로 기초한다. 본 발명은 무혈청 배지 조제물을 비롯한 다양한 세포 배양 조건에 적응되고, 본 원에서 "본 발명의 세포"로 언급되는 MDCK 세포주, 및 다양한 종류의 세포를 비롯한, 비-발암성 세포주를 제공한다. 추가로, 본 발명은 본 발명의 세포, 및 제한하는 것은 아니지만, 배지(예로서, 본 원에서 개시된 배지), 배지 성분들, 완충액, 화학적 화합물, 추가의 세포 종류들, 바이러스 물질(예로서, 바이러스 게놈, 바이러스 입자) 및 이종 단백질을 비롯한 다른 성분들을 포함하는 세포 배양 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 제한하는 것은 아니지만, 비-발암성이고/거나(예로서, 누드 마우스에서 결절을 형성하지 않음), 부착 세포로서 성장하고/거나, 상피-양 형태를 갖고/거나, 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소비리다에(orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 랍도바이러스 및 플라보바이러스와 같은 다양한 바이러스의 복제를 지지하는 것과 같은 하나 이상의 특유한 특징을 갖는, MDCK 세포를 비롯한 비-발암성 세포의 배양을 위해 유용한 방법 및 배지 조제물을 제공한다. 본 발명의 배양 조건은 혈청을 함유하는 배지 조제물 및 무혈청 배지 조제물 뿐만 아니라, 동물성 단백질이 없는(APF) 제제를 포함한다. 추가로, 본 발명은 또한 MDCK 세포를 비롯한, 비-발암성 세포에서 백신 물질(예로서, 인플루엔자 바이러스)을 생산하는 방법, 비-발암성 세포로부터 백신 물질을 제조하는 방법, 및 비-발암성 세포에서 생산된 백신 물질을 사용하여 인플루엔자 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 본 발명의 세포는 다른 포유동물 세포주(예로서, 베로, PerC6, HEK-293, MRC-5 및 WI-38 세포)에서는 그만큼 유효하게 복제되지 못하는 저온 적응된/감온성의/약독화된(ca / ts / att) 인플루엔자 균주(예로서, 플루미스트(FluMist)®중의 것)를 생산하는데 특히 유용하다.
세포 특징
하나의 실시태양에서, 본 발명에 따른 세포는 척추동물 세포이다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 세포는 포유동물 세포로서, 예로서, 햄스터, 소, 원숭이 또는 개로부터의 것이거나, 특히, 이들로부터 유래된 신장 세포 또는 세포주이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 세포는 MDCK 세포(예로서, ATCC CCL-34 MDCK로부터 유도)이고, 특히 본 원에서는 "본 발명의 MDCK 세포"로 언급되며, 용어 "본 발명의 세포"로서 포함된다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 세포는 ATCC CCL-34 MDCK로부터 유도된다. 본 발명의 세포는 본 분야에 잘 공지된 방법에 의해 CCL-34 MDCK 세포로부터 유도될 수 있다. 예를 들면, 먼저 혈청을 함유하는 배지(예로서, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium) + 10% 우태아 혈청(FBS: Fetal Bovine serum)+ 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당, 또는 본 원에 기술된 다른 배지)에서 CCL-34 MDCK 세포를 제한된 횟수만큼 계대접종(passage)한 후, 개개의 세포를 콜로닝하고 클론을 특징화할 수 있다. 제한하는 것은 아니지만, 배가 시간, 발암성 프로파일 및 바이러스 생산을 비롯한, 우수한 생물학적, 생리학적 성질을 갖는 클론은 마스터 세포 은행(MCB: master cell bank)의 제작을 위해 선별된다. 하나의 측면에서, 본 발명의 세포는 특상의 배지(예로서, 무혈청 배지 또는 APF 배지, 예로서, 본 원에 기술된 것)에서 성장하도록 적응된다. 개개의 세포를 클로닝하기 이전에, 그와 동시에, 또는 그 후에 적응될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 세포는 MediV SF101, MediV SF102, MediV SF103, MediV SF104 또는 MediV SF105에서 성장하도록 적응된다. 이들 배지에서 성장하도록 적응된 본 발명의 세포는 본 원에서 "MDCK-SF101, MDCK-SF102, MDCK-SF103, MDCK-SF104 및 MDCK-SF 105" 세포로서 각각 언급되고, 총괄적으로는 "MDCK-SF 세포"로 언급된다. 다른 실시태양에서, 본 발명의 세포는 혈청을 함유하는 배지(예로서, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) + 10% 우태아 혈청(FBS) + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당)에서 성장하도록 적응되고, 그러한 세포는 본 원에서 "MDCK-S" 세포로 언급된다. MDCK-SF 및 MDCK-S 세포는 또한 용어 "본 발명의 세포" 및 "본 발명의 MDCK 세포"에 포함된다.
본 발명의 특정 실시태양에서, 세포는 제한하는 것은 아니지만, 미국 미생물 보존 센터(버지니아주 20110-2209 마나싸스 유니버시티 불르바드 10801 소재)에 기탁되고 양도된 ATCC 수탁번호가 PTA-6500(2005년 1월 5일 기탁됨), PTA-6501(2005년 1월 5일 기탁됨), PTA-6502(2005년 1월 5일 기탁됨), 및 PTA-6503(2005년 1월 5일 기탁됨)인 것을 비롯한 세포주이고, 이들 세포는 본 원에서 각각 "MDCK-S, MDCK-SF101, MDCK-SF102 및 MDCK-SF103"으로 언급되고, 총괄적으로는 "본 발명의 MDCK 세포"로 언급된다. 이들 기탁은 미생물의 국제기탁에 관한 부다페스트 조약(Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of patent procedure) 협정하에 유지될 것이다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 인간에 사용하기 위한 것으로서 미국식품의약국으로부터 승인받기에 적합한 백신 물질 제조에 유용한 세포 은행을 제작하기 위해 사용된다.
제한하는 것은 아니지만, 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지에서 부착 세포로서 성장하고, 상피-양 형태를 갖고, 비-발암성이고(예로서, 누드 마우스에서 결절을 형성하지 않음), 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스 및 플라보바이러스와 같은 다양한 바이러스의 복제를 지지하는 것과 같은 하나 이상의 특유한 특징과 관련하여 계대접종되고 선별됨으로써 세포주 MDCK-S, MDCK-SF101, MDCK-SF102, MDCK-SF103, MDCK-SF104 및 MDCK-SF105는 세포주 MDCK(CCL 34)로부터 유도된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 비-발암성이다. 세포가 발암성인지를 결정하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고(예를 들면, [Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1024] 및 [Stiles et al., 1976, Cancer Res, 36:1353]를 참조한다), 현재 미국식품의약국이 선호하는 방법인, 누드 마우스 모델을 사용하는 방법에 대해서는 하기 실시예 2에서 상세히 설명한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서 비-발암성이다([Stiles et al., 동일 서적] 및 하기 실시예 2). 또다른 특정 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 닭의 배아내로 주사될 때 및/또는 융모요막에 국소 적용될 때 비-발암성이다([Leighton et al., 동일 서적] 참조). 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서는 비-발암성이지만, 닭의 배아내로 주사될 때 및/또는 융모요막에 국소 적용될 때에는 발암성이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 성숙한 누드 마우스 모델에서, 및 닭의 배아내로 주사될 때 및/또는 융모요막에 국소 적용될 때 비-발암성이다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 배지중 적어도 20회의 계대 후, 또는 적어도 30회의 계대 후, 또는 적어도 40회의 계대 후, 또는 적어도 50회의 계대 후, 또는 적어도 60회의 계대 후, 또는 적어도 70회의 계대 후, 또는 적어도 80회의 계대 후, 또는 적어도 90회의 계대 후, 또는 적어도 100회의 계대 후에도 비-발암성이다. 추가의 또다른 특정 실시태양에서, 배지는 본 원에 기술된 배지이다(예로서, Medi SF103).
발암성은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다수의 방법으로 측량될 수 있다. 통상 사용되는 하나의 방법은 "TD50" 값을 측정하는 것으로서, 상기의 "TD50" 값은 실험 동물의 50%에 암을 유발하기 위해서 요구되는 세포수로서 정의된다(예로서, [Hill R. The TD50 assay for tumor cells. In: Potten C, Hendry J, editors. Cell clones. London: Churchill Livingstone; 1985. p. 223] 참조). 하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 1010개 내지 약 101개 사이, 또는 약 108개 내지 약 103개 사이, 또는 약 107개 내지 약 104개 사이의 TD50 값을 갖는다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 약 1010 초과, 또는 약 109 초과, 또는 약 108개 초과, 또는 약 107개 초과, 또는 약 106개 초과, 또는 약 105개 초과, 또는 약 104개 초과, 또는 약 103개 초과, 또는 약 102개 초과, 또는 약 101개의 TD50 값을 갖는다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 비-발암성 세포는 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지 또는 동물성 단백질이 없는 배지에서 부착 세포로서 성장한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 비-발암성 세포는 상피-양 형태를 갖는다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 비롯한 다양한 바이러스의 복제를 지지한다. 본 발명의 MDCK 세포는 제한하는 것은 아니지만, 비-발암성이고, 부착 세포로서 성장하고, 상피-양 형태를 갖고, 다양한 바이러스의 복제를 지지하는 것과 같은 하나 이상의 특유한 특징들의 임의 조합을 가질 수 있다고 주시된다.
각 세포주의 완전한 계대를 이용할 수 있도록 본 발명의 MDCK 세포 각각의 매 계대접종시마다 충분히 상세하게 기록될 것으로 주시된다. 백신 물질의 제조를 위해서 본 발명의 MDCK 세포를 사용할 것에 대하여 미국식품의약국 및 전 세계의 다른 규제 단체로부터 승인을 받는데 각각의 매 계대접종시마다 기록하는 것이 도움을 줄 수 있다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포에는 미생물 오염원(예로서, 세균성, 바이러스성 및 진균성 오염원)이 없다. 세균성 및 진균성 오염원의 존재 여부를 시험하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 상업적 계약업체(예로서, 바이오릴라이언스(BioReliance)®, 메릴랜드주 로크빌 소재)에 의해 통상적으로 실시된다. 승인받은 미생물 무균 시험 및 미코플라스마 시험은 하기 실시예 2에서 상세히 설명한다. 시험할 수 있는 미생물 병원체의 특정 일례는 표 6에 열거되어 있다.
추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소바이러스(A형 인플루엔자형 및/또는 B형 균주), 파라믹소바이러스(RSV A형 및/또는 B형, 인간 메타뉴모바이러스 및 1형, 2형 및/또는 3형 파라인플루엔자), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 비롯한 바이러스의 복제를 지지한다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 예를 들면, 플루미스트®에서 발견되는 것과 같은 저온 적응된/감온성(ca / ts) 인플루엔자 바이러스([Belshe et al., 1998, NEngl J Med 338:1405]; [Nichol et al., 1999, JAMA 282:137]; [Jackson et al., 1999, Vaccine, 17:1905]), 및/또는 이들 바이러스의 백본을 포함하거나, 저온 적응된 것, 약독화된 것, 및 감온성인 것과 같은 특징들중 하나 이상을 갖는 인플루엔자 바이러스의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 분절(들))을 포함하는 재조합(reassortant) 바이러스의 복제를 지지한다. 세포가 바이러스의 복제를 지지할 수 있는 능력에 대한 하나의 표시는 감염된 세포 배양물로부터 수득되는 바이러스 수율이다. 바이러스 수율은 분 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다수의 방법에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 수율은, 감염성 비리온을 측정하는 50% 조직 배양 감염 유발량(TCID50) 분석법에 따라 시료중에 존재하는 바이러스의 농도를 측정함으로써 측량될 수 있다. TCID5O 값은 대개 log10 TCID50/mL로 기록된다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 적어도 6.0, 또는 적어도 6.2, 또는 적어도 6.4, 또는 적어도 6.6, 또는 적어도 6.8, 또는 적어도 7.0, 또는 적어도 7.2, 또는 적어도 7.4, 또는 적어도 7.6, 또는 적어도 7.8, 또는 적어도 8.0, 또는 적어도 8.2, 또는 적어도 8.4, 또는 적어도 8.6, 또는 적어도 8.8, 또는 적어도 9.0, 또는 적어도 9.2, 또는 적어도 9.4, 또는 적어도 9.6, 또는 적어도 9.8의 log10 TCID50/mL까지 인플루엔자 바이러스(예로서, ca/ts 균주)의 복제를 지지한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 적어도 약 6.0, 또는 적어도 약 6.2, 또는 적어도 약 6.4, 또는 적어도 약 6.6, 또는 적어도 약 6.8, 또는 적어도 약 7.0, 또는 적어도 약 7.2, 또는 적어도 약 7.4, 또는 적어도 약 7.6, 또는 적어도 약 7.8, 또는 적어도 약 8.0, 또는 적어도 약 8.2, 또는 적어도 약 8.4, 또는 적어도 약 8.6, 또는 적어도 약 8.8, 또는 적어도 약 9.0, 또는 적어도 약 9.2, 또는 적어도 약 9.4, 또는 적어도 약 9.6, 또는 적어도 약 9.8의 log10 TCID50/mL까지 인플루엔자 바이러스(예로서, ca/ts 균주)의 복제를 지지한다.
본 발명의 세포가 일반적으로 세포 배양 조성물의 일부분이 될 것이라는 것을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 세포 배양 조성물의 성분들은 세포 및 사용 목적에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 배양 목적일 경우, 세포 배양 조성물은 본 발명의 세포와 세포 배양에 적합한 배지를 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 세포, 및 제한하는 것은 아니지만, 배지(예로서, 본 원에 개시된 배지), 배지 성분들, 완충액, 화학적 화합물, 추가의 세포 종류들, 바이러스 물질(예로서, 바이러스 게놈, 바이러스 입자) 및 이종 단백질을 비롯한 다른 성분들을 포함하는 세포 배양 조성물을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 세포 배양 조성물은 본 발명의 세포와 배지 또는 그의 성분들을 포함한다. 세포 배양 조성물내 존재할 수 있는 배지는 무혈청 배지, 혈청을 함유하는 배지 및 APF 배지를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 세포 조성물은 본 원에 개시된 배지(예로서, MediV SF101, MediV SF102, MediV SF103, MediV SF104 또는 MediV SF105) 또는 그의 성분들을 포함한다.
방법 및 배지 조제물
본 발명은 혈청을 함유하는 배지에서 비-발암성 MDCK 세포를 배양하기 위한 방법 및 그를 위한 배지 조제물을 제공한다. 본 발명은 또한 APF 배지 조제물을 비롯한 무혈청 배지에 비-발암성 MDCK 세포를 적응시킨 후, 배양하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서, 배양되는 동안, MDCK 세포가 제한하는 것은 아니지만, 비-발암성이고, 부착 세포로서 성장하고, 상피-양 형태를 갖고, 다양한 바이러스의 복제를 지지하는 것을 비롯한 특징들중 하나 이상을 유지할 수 있도록 배지를 제조한다. 본 원에 개시된 배지 조제물 또는 그의 성분들이 세포 배양 조성물에 존재할 수 있을 것으로 주시된다.
혈청을 함유하는 배지 조제물은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 혈청을 함유하는 배지 조제물은 제한하는 것은 아니지만, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) + 우태아 혈청(FBS) + 글루타민 + 포도당을 포함한다. 하나의 실시태양에서, FBS은 약 1% 내지 약 20% 사이, 또는 약 5% 내지 약 15% 사이, 또는 약 5% 내지 약 10% 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시태양에서, FBS는 10%의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 또다른 실시태양에서, 글루타민은 약 0.5mM 내지 약 10mM 사이, 또는 약 1mM 내지 10mM 사이, 또는 약 2mM 내지 5mM 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시태양에서, 글루타민은 4mM의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 포도당은 약 1g/L 내지 약 10g/L 사이, 또는 약 2g/L 내지 약 5g/L 사이의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 특정 실시태양에서, 포도당은 4.5g/L의 농도로 혈청을 함유하는 배지에 존재한다. 추가의 또다른 실시태양에서, 혈청을 함유하는 배지 조제물은 약 1% 내지 약 20% 사이의 농도의 FBS, 약 0.5mM 내지 약 10mM 사이의 농도의 글루타민, 및 약 1g/L 내지 약 10g/L 사이의 농도의 포도당을 포함한다. 특정 실시태양에서, 혈청을 함유하는 배지 조제물은 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) + 10% 우태아 혈청(FBS) + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당을 포함한다. DMEM은 예를 들면, 기브코(Gibco)/BRL(카달로그 번호 11965-084)을 비롯한 다수의 상업적 공급처로부터 용이하게 구입할 수 있다. FBS는 예를 들면, JRH 바이오사이언스(JRH Biosciences)(카달로그 번호 12107-500M)를 비롯한 다수의 상업적 공급처로부터 용이하게 구입할 수 있다. FBS는 동물 세포 배양 배지에서 가장 보편적으로 적용되는 보충물인 반면, 갓 태어난 소, 말 및 인간을 비롯한 다른 혈청 공급원도 통상적으로 사용되고, 이는 본 발명에 포함된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK-S 혈청 적응된 비-발암성 세포는 미국 미생물 보존 센터로부터 수득된 개의 원위세뇨관 세포(MDCK)(ATCC CCL34)로부터 유도된 것으로서, 이는 혈청으로 보충된 화학적으로 규정된 배지(chemically defined media)에서 상기 세포를 배양함으로써 수득된다. 특정 실시태양에서, MDCK 세포(ATCC CCL34)를 혈청으로 보충된 화학적으로 규정된 배지에서 확장시켜 하기와 같이 MDCK-S 세포주를 생산한다: MDCK(ATCC CCL34) 세포를 필요에 따라, 우태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 포도당으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 계대접종하여 충분한 세포를 수득함으로써 MDCK-S로 명시되는 냉동된 프리마스터 세포 은행(PreMCB: preMaster Cell Bank)을 제작한다. 또다른 특정 실시태양에서, 세포는 하기 실시예 2에서 설명하는 공정 과정을 사용하여 배양된다. PreMCB 바이알로부터의 MDCK-S 혈청 적응된 세포를 추가로 20회 이상 계대접종하고, 성숙한 누드 마우스 모델에서 발암성에 대하여 생체내 시험하고, 핵형 분석법에 의해 핵학 시험하는 것이 특히 주시된다. 특정 실시태양에서, 확장된 MDCK-S 세포는 성숙한 누드 마우스내로 피하 주사될 경우 결절을 유발하지 않을 것이며, 그의 형식상의 염색체 갯수는 78개이고, 염색체 갯수의 범위는 겨우 약 60-88개, 또는 겨우 약 65-85개, 또는 겨우 약 65-80개, 또는 겨우 약 70-85개일 것이다. 하나의 실시태양에서, MDCK-S 세포는 배지(예로서, 본 원에 기술된 배지)에서 적어도 20회의 계대 후, 또는 적어도 30회의 계대 후, 또는 적어도 40회의 계대 후, 또는 적어도 50회의 계대 후, 또는 적어도 60회의 계대 후, 또는 적어도 70회의 계대 후, 또는 적어도 80회의 계대 후, 또는 적어도 90회의 계대 후, 또는 적어도 100 계대된 후에 비-발암성이다.
조직 배양물 적용시 혈청 또는 동물 추출물을 사용하는 것은 결점을 가질 수 있다는 것을 본 분야의 기술자는 이해할 것이다[Lambert, KJ. et al., In: Animal Cell Biotechnology, Vol 1, Spier, R.E. et al., Eds., Academic Pres New York, pp. 85-122(1985)]. 예를 들면, 이들 보충물들의 화학적 조성물은 로트간의(between lots), 심지어는 하나의 제조사로부터도 달라질 수 있다. 추가로, 동물 또는 인간 기원의 보충물은 또한 우발성 병원체(예로서, 미코플라스마, 바이러스, 및 프리온)로 오염될 수 있다. 이들 오염된 보충물들을 세포 배양 배지 조제물에서 사용할 경우, 이들 병원체는 배양되는 세포의 건강 상태를 심각하게 손상시킬 수 있다. 추가로, 우발성 병원체로 오염된 배양물에서 생산된 물질을 세포 요법 및 다른 임상 적용에 사용할 경우, 이들 병원체는 건강상의 위험성을 내포할 수 있다. 보다 큰 우려 사항은 포유동물에서 해면뇌병증을 유발시키고 인간에서 크로이츠펠트-야콥병을 유발시키는 프리온의 존재이다. 따라서, 본 발명은 추가로 무혈청 배지 조제물을 제공한다.
본 발명의 무혈청 배지 조제물은 제한하는 것은 아니지만, MediV SF101(Taub 배지+식물 가수분해물), MediV SF102(Taub 배지+지질), MediV SF103(Taub 배지+지질+식물 가수분해물), MediV SF104(Taub 배지+지질+식물 가수분해물+성장 인자) 및 Medi SF105(MediV SF104와 동일하되, 단, 트랜스페린은 구연산 철 암모늄/트로폴론 또는 황산제2철 암모늄/트로폴론으로 대체된다)을 포함한다. Taub SF 배지[Taub and Livingston, 1981, Ann NY Acad Sci., 372:406]는 호르몬, 5㎍/mL 인슐린, 5㎍/mL 트랜스페린, 25ng/mL 프로스타글란딘 E1, 50nM 하이드로코르티손, 5pM 삼요오드타이로닌 및 10nM Na2SeO3, 4.5g/L 포도당, 2.2g/L NaHCO3 및 4mML-글루타민으로 보충된 Ham's F12과 DMEM의 50:50 혼합물임에 특히 주시한다. Taub SF 배지는 또한 본 원에서 Taub 배지로서, 또는 간단하게 "Taub"로서 언급된다.
식물 가수분해물은 제한하는 것은 아니지만, 옥수수, 면실, 완두, 대두, 맥아, 감자 및 소맥중 하나 이상으로부터의 가수분해물을 포함한다. 식물 가수분해물은 효소적 가수분해에 의해 생산될 수 있고, 일반적으로는 펩티드, 유리 아미노산 및 성장 인자의 믹스를 포함한다. 식물 가수분해물은 예를 들면, 마르코르 디벨럽먼트(Marcor Development), 하이클론(HyClone) 및 오르가노 테크니크(Organo Technie)를 비롯한 다수의 상업적 공급처로부터 용이하게 수득된다. 효모 가수분해물도 식물 가수분해물을 대신하여, 또는 식물 가수분해물과 함께 사용될 수 있다는 것도 주시된다. 효모 가수분해물은 예를 들면, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), USB 코포레이션(USB Corp), 기브코/BRL 및 다른 곳을 비롯한 다수의 상업적 공급처로부터 용이하게 수득된다.
배양 배지를 보충하기 위하여 사용될 수 있는 지질은 제한하는 것은 아니지만, 화학적 규정된 동물 및 식물 유래 지질 보충물 뿐만 아니라, 합성적 유래 지질을 포함한다. 지질 보충물에 존재할 수 있는 지질은 제한하는 것은 아니지만, 콜레스테롤, 포화 및/또는 불포화 지방산(예로서, 아라키돈산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산, 올레산, 팔미트산 및 스테아르산)을 포함한다. 콜레스테롤은 100 x 지질 보충물 저장액에 0.10mg/ml 내지 0.40mg/ml 사이의 농도로 존재할 수 있다. 지방산은 100 x 지질 보충물 저장액에 1㎍/ml 내지 20㎍/ml 사이의 농도로 존재할 수 있다. 배지 조제물에 적합한 지질은 예를 들면 하이클론, 기브코/BRL 및 시그마-알드리치를 비롯한 다수의 상업적 공급처로부터 용이하게 수득된다.
하나의 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 적어도 0.5g/L, 또는 적어도 1.0g/L, 또는 적어도 1.5g/L, 또는 적어도 2.0g/L, 또는 적어도 2.5g/L, 또는 적어도 3.0g/L, 또는 적어도 5.0g/L, 또는 적어도 10g/L, 또는 적어도 20g/L인 식물 가수분해물로 보충된다. 특정 실시태양에서, Taub 배지는 소맥 가수분해물로 보충된다. 또다른 특정 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 무혈청 배지로서, 본 원에서 MediV SFM 101로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다.
또다른 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 200%, 또는 적어도 300%인 지질 혼합물로 보충된다. 특정 실시태양에서, Taub 배지는 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된다(예로서, 제조사로부터 입수한 100X저장액을 그의 최종 농도 1X로 배지에 가한다). 본 발명은 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 무혈청 배지로서, 본 원에서 MediV SFM 102로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다.
추가의 또다른 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 적어도 0.5g/L, 또는 적어도 1.0g/L, 또는 적어도 1.5g/L, 또는 적어도 2.0g/L, 또는 적어도 2.5g/L, 또는 적어도 3.0g/L, 또는 적어도 5.0g/L, 또는 적어도 10g/L, 또는 적어도 20g/L인 식물 가수분해, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 적어도 200%인 지질 혼합물로 보충된다. 특정 실시태양에서, Taub 배지는 소맥 가수분해물 및 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물로 보충된 Taub 배지를 포함하는 무혈청 배지로서, 본 원에서 MediV SFM 103으로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다.
추가의 또다른 실시태양에서, Taub 배지는 성장 호르몬으로 보충된다. 사용될 수 있는 성장 호르몬은 제한하는 것은 아니지만, 상피 성장 인자(EGF: Epidermal Growth Factor), 인슐린 성장 인자(IGF: Insulin Growth Factor), 전환 성장 인자(TGF: Transforming Growth Factor) 및 섬유모세포 성장 인자(FGF: Fibroblast Growth Factor)를 포함한다. 특정 실시태양에서, 성장 호르몬은 상피 성장 인자(EGF)이다. 하나의 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 0.1 내지 약 50.0ng/ml 사이, 또는 약 0.5 내지 약 25.0ng/ml 사이, 또는 약 1.0 내지 약 20ng/ml 사이, 또는 약 5.0 내지 약 15.0ng/ml 사이, 또는 약 8ng/ml 내지 약 12ng/ml 사이인 성장 인자로 보충된다. 특정 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 10ng/ml인 성장 인자로 보충된다. 추가의 다른 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 약 0.1 내지 약 50.0ng/ml 사이, 또는 약 0.5 내지 약 25.0ng/ml 사이, 또는 약 1.0 내지 약 20ng/ml 사이, 또는 약 5.0 내지 약 15.0ng/ml 사이, 또는 약 8ng/ml 내지 약 12ng/ml 사이인 성장 인자, 및 최종 농도가 적어도 0.5g/L, 또는 적어도 1.0g/L, 또는 적어도 1.5g/L, 또는 적어도 2.0g/L, 또는 적어도 2.5g/L, 또는 적어도 3.0g/L, 또는 적어도 5.0g/L, 또는 적어도 10g/L, 또는 적어도 20g/L인 식물 가수분해, 및 최종 농도가 제조사의 권장 농도의 적어도 50%, 또는 적어도 60%, 또는 적어도 70%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 100%, 또는 적어도 125%, 또는 적어도 150%, 또는 적어도 175%, 또는 적어도 200%인 지질 혼합물로 보충된다. 또다른 특정 실시태양에서, Taub 배지는 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물, 및 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF로 보충된다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물, 및 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF로 보충된 보충된 Taub 배지를 포함하는 무혈청 배지로서, 본 원에서 MediV SFM 104로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다.
동물성 단백질이 없는 배지 조제물이 백신 제조에 사용되는 바이러스 생산을 위해 바람직할 수 있다는 것도 본 분야의 기술자는 이해할 것이다. 따라서, 특정 실시태양에서, 본 원에서 개시된 무혈청 배지(예로서, MediV SF 101, MediV SF 102, MediV SF103, MediV SF104 및 Medi SF105)중의 하나 이상 또는 모든 동물 유래의 성분들은 비-동물성 유도체로 대체된다. 예를 들면, 비-동물성 공급원으로부터 유도된, 상업적으로 구입가능한 재조합 인슐린(예로서, 바이오로지컬 인더스트리즈(Biological Industries) 카달로그 번호 01-818-1)은 동물 공급원으로부터 유래된 인슐린을 대신하여 사용될 수 있다. 유사하게, 철 결합 물질(철 binding agnet)(예로서, 미국 특허 제5,045,454호; 제5,118,513호; 제6,593,140호; 및 PCT 공개번호 WO 01/16294 참조)은 동물 공급원으로부터 유래된 트랜스페린을 대신하여 사용될 수 있다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 무혈청 배지 조제물은 트랜스페린을 대신하여 트로폴론(2-하이드록시-2,4,6-사이클로헤파트리엔-1) 및 철 공급원(예로서, 구연산 철 암모늄, 황산제2철 암모늄)을 포함한다. 예를 들면, 트로폴론 또는 트로폴론 유도체는 약 5:1 내지 약 70:1, 또는 약 10:1 내지 약 70:1의 몰비로 배지에 존재하는 철에 대하여 과량의 몰농도로 존재할 것이다. 따라서, 배지중의 철 농도가 약 0.3μM일 때, 트로폴론 또는 그의 유도체는 약 1.5μM 내지 약 20μM, 예로서, 약 3μM 내지 약 20μM의 농도로 사용될 수 있다. 철은 배지내에서 예로서, 황산제1철, 염화 제2철, 질산철, 또는 특히 구연산 철 암모늄과 같은 단순 철염 또는 복합 철염의 사용으로부터 얻어지는 제1 철 이온 또는 제2 철 이온으로서 존재할 수 있다. 본 발명은 최종 농도가 2.5g/L인 소맥 가수분해물, 및 최종 농도가 제조사의 권장 최종 농도의 100%인 화학적으로 규정된 지질 혼합물, 및 최종 농도가 약 10ng/ml인 EGF, 및 10:1 내지 70:1 사이의 비로 구연산 철 암모늄:트로폴론 또는 황산제2철 암모늄:트로폴론으로 보충된 보충된 Taub 배지를 포함하는 무혈청 배지로서, 본 원에서 MediV SFM 105로서 언급되는 무혈청 배지를 제공한다.
하나의 실시태양에서, MDCK-SF101, MDCK-SF102, MDCK-SF103, MDCK-SF104 및 MDCK-SF105 무혈청 적응된 비-발암성 세포(본 원에서는 총괄적으로 MDCK-SF로 언급됨)는 미국 미생물 보존 센터로부터 수득된 개의 원위세뇨관 세포(MDCK)(ATCC CCL34)로부터 유도된 것으로서, 이는 적어도 1회의 계대접종을 위해 혈청으로 보충되어진 화학적으로 규정된 배지에서 배양한 후, 이를 무혈청 배지, 예를 들면, 상기 기술된 무혈청 배지에서 계대접종함으로써 수득된다. 특정 실시태양에서, MDCK 세포(ATCC CCL34)는 무혈청 배지에 적응되어 하기와 같이 MDCK-SF 세포주를 생산한다: MDCK(ATCC CCL34) 세포를 우태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 포도당으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 적어도 1회에 걸쳐 계대접종한 후, 무혈청 배지에서 계대접종한다. 이어서, 필요에 따라 MDCK-SF 세포를 무혈청 배지에서 계대접종하여 충분한 세포를 수득함으로써 냉동된 프리 마스터 세포 은행(PreMCB)을 제작한다. 특정 실시태양에서, 세포를 혈청을 함유하는 배지 (예로서, 우태아 혈청(10% v/v), 4mM 글루타민 및 4.5g/L 포도당로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(DMEM))에서 1 내지 5회 사이, 또는 4 내지 10회 사이, 또는 9 내지 20회 사이, 또는 20회 초과로 계대접종한 후, 무혈청 배지(예로서, MediV SF101, MediV SF102, MediV SF103, MediV SF104 및 Medi SF105)에서 계대접종한다.
PreMCB 바이알로부터의 MDCK-SF 무혈청 적응된 세포를 추가로 20회 이상 계대접종하고, 성숙한 누드 마우스 모델에서 발암성에 대하여 생체내 시험하고, 핵형 분석법에 의해 핵학 시험하는 것이 특히 주시된다. 특정 실시태양에서, 확장된 MDCK-SF 세포는 성숙한 누드 마우스내로 피하 주사될 경우 결절을 유발하지 않을 것이며, 그의 형식상의 염색체 갯수는 78개일 것이다. 또다른 실시태양에서, 확장된 MDCK-SF 세포의 형식상의 염색체 갯수는 78개이고, 염색체 갯수의 범위는 겨우 약 60 내지 약 88개, 또는 겨우 약 65 내지 약 85개, 또는 겨우 약 65-80개, 또는 겨우 약 70 내지 약 85개일 것이다. 하나의 실시태양에서, MDCK-SF 세포는 배지(예로서, 본 원에 기술된 배지)에서 적어도 20회의 계대 후, 또는 적어도 30회의 계대 후, 또는 적어도 40회의 계대 후, 또는 적어도 50회의 계대 후, 또는 적어도 60회의 계대 후, 또는 적어도 70회의 계대 후, 또는 적어도 80회의 계대 후, 또는 적어도 90회의 계대 후, 또는 적어도 100 계대된 후에 비-발암성이다.
하나의 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV SF101이다. 또다른 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV SF102이다. 추가의 또다른 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV SF103이다. 추가의 또다른 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV SF104이다. 또다른 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는 MediV SF105이다. 추가의 또다른 실시태양에서, MDCK-SF 세포의 유도를 위해 사용되는 무혈청 배지는APF 배지이다. 본 원에 기술된 배지는 동물 단백질을 제거하기 위하여 제조될 수 있다는 것에 주시한다. 예를 들면, 소 트랜스페린을 비 동물성 공급원으로부터 유도된 재조합 트랜스페린으로 대체할 수 있다.
배양 조건
본 발명은 혈청을 함유하는 배지 조제물 및 무혈청 배지 조제물(상기)에서 MDCK 세포(바람직하게 비-발암성) 및 다른 동물 세포(발암성 또는 비-발암성)를 배양하는 방법을 제공한다. 추가의 배양 조건이 비-발암성 상태에서 MDCK-S 및 MDCK-SF 세포를 유지시키는 역할을 할 수 있다는 것에 특히 주시한다. 이들 배양 조건은 제한하는 것은 아니지만, 특상의 부착 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 배양 방법, 용존 산소 함량 및 pH를 포함한다.
본 분야의 기술자는 본 발명의 MDCK 세포의 성장을 최적화하기 위하여 다수의 방법으로 배양 조건을 적응화시킬 수 있다는 것에 특히 주시한다. 그러한 적응화를 통해 바이러스 물질(예로서, 바이러스)의 생산을 증가시킬 수 있고, 다르게, 본 분야의 기술자는 세포 성장과 상관없이 본 발명의 MDCK 세포로부터 백신 물질의 생산을 최적화하기 위하여 배양 조건을 적응화시킬 수 있다. 이들 배양 조건은 제한하는 것은 아니지만, 부착 표면, 세포 밀도, 온도, CO2 농도, 배양 방법, 용존 산소 함량 및 pH를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 그들이 부착되는 표면상에서 부착 세포로서 배양된다. 조직 배양 세포는 부착 표면상에서 배양될 수 있는데, 이 부착 표면은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 부착 표면은, 제한하는 것은 아니지만, 표면 개질된 폴리스티렌 플라스틱, 단백질 코팅된 표면(예로서, 섬유결합소 및/또는 콜라겐 코팅된 유리/플라스틱) 뿐만 아니라, 다수의 다양한 상업적으로 구입가능한 미세담체(예로서, DEAE-덱스트란 미세담체 비드(예, 도르마셀(Dormacell), 파이퍼&란겐(Pfeifer&Langen); 수퍼비드(Superbead)(플루오라보라토리즈(FlowLaboratories)); 스티렌 공중합체-트리메틸아민 비드(예, 힐렉스(Hillex), 솔로힐(SoloHill), 앤아버(AnnArbor))와 같은 스티렌 공중합체-트리메틸아민 비드)를 포함한다. 미세담체 비드는 세포 배양물의 부피당 부착 세포 성장을 위해 큰 표면적을 제공하는 작은 구이다(직경 100-200 미크론 범위). 예를 들어, 배지 1리터는 2천만개 초과의 미세담체 비드를 포함하여 8000 제곱 센티미터를 초과하는 성장 표면을 제공할 수 있다. 특상의 부착 표면은 본 발명의 MDCK 세포 배양물에 사용되는 방법에 의해 결정되고 본 분야의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 공정 과정에서 사용될 수 있는 적합한 배양 베쓸은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 모든 베쓸로서, 예를 들면, 교반 병, 회전 병, 발효조 또는 생물반응기이다. 예를 들면, 백신 생산과 같은 상업적인 바이러스 생산의 경우, 생물반응기 또는 발효기에서 세포를 배양하는 것이 종종 바람직하다. 생물반응기는 1 리터 이하에서부터 100 리터 초과 부피까지 이용가능하며, 예를 들면, Cyto3 생물반응기(Osmonics, 미네소타주 미네통카 소재); NBS 생물반응기(New Brunswick Scientific, 뉴욕주 에디슨 소재); B. 브라운 바이오테크 인터내셔널(B. Braun Biotech International)(B. Braun Biotech, 독일 멜중엔 소재)로부터의 실험실용 및 상업적 규모의 생물반응기가 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 회분식 배양 시스템에서 부착 세포로서 배양된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 관류 배양 시스템에서 부착 세포로서 배양된다. 본 발명의 MDCK 세포는 백신 물질(예로서, 바이러스)의 생산을 위해 관류 시스템에서(예를 들면, 원심분리, 여과, 스핀 필터 등과 같이 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 세포 잔류 시스템을 사용하는 교반 베쓸 발효조에서) 배양될 수 있다는 것에 특히 주시한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 적어도 1%, 또는 적어도 2%, 또는 적어도 3%, 또는 적어도 4%, 또는 적어도 5%, 또는 적어도 6%, 또는 적어도 7%, 또는 적어도 8%, 또는 적어도 9%, 또는 적어도 10%, 또는 적어도 20%의 CO2 농도에서 배양된다.
하나의 실시태양에서, 용존 산소(DO: dissolved oxygen) 농도(pO2 값)는 본 발명의 MDCK 세포의 배양시 유리하게 조절되고, 5% 내지 95% 범위이거나(공기 포화도 기준), 10% 내지 60% 사이이다. 특정 실시태양에서, 용존 산소(DO) 농도(pO2 값)는 적어도 10%, 또는 적어도 20%, 또는 적어도 30%, 또는 적어도 50%, 또는 적어도 60%이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포를 배양하기 위해 사용되는 배양 배지의 pH는 배양시 조절되고, pH 6.4 내지 pH 8.0 범위, 또는 pH 6.8 내지 pH 7.4 범위이다. 특정 실시태양에서, 배양 배지의 pH는 적어도 6.4, 또는 적어도 6.6, 또는 적어도 6.8, 또는 적어도 7.0, 또는 적어도 7.2, 또는 적어도 7.4, 또는 적어도 7.6, 또는 적어도 7.8, 또는 적어도 8.0이다.
추가의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 25℃ 내지 39℃의 온도에서 배양된다. 배양 온도는 원하는 공정 과정에 따라 달라질 수 있다는 것에 특히 주시한다. 예를 들면, 본 발명의 MDCK 세포는 세포의 증식을 위해서는 37℃에서 배양될 수 있고, 백신 물질(예로서, 바이러스)의 생산을 위해 그보다 저온(예로서, 25℃ 내지 35℃)에서 배양될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃ 미만, 또는 31℃ 미만, 또는 32℃ 미만, 또는 33℃ 미만, 또는 34℃ 미만의 온도에서 배양된다. 또다른 실시태양에서, 세포는 백신 물질의 생산을 위해 30℃, 또는 31 ℃, 또는 32℃, 또는 33℃, 또는 34℃의 온도에서 배양된다.
백신 물질(예로서, 바이러스)을 제조하기 위해서는 배지를 용이하게 교환할 수 있도록(예로서, 관류 시스템) 본 발명의 MDCK 세포를 배양한다는 것에 특히 주시한다. 세포는 예를 들면, 1 x 106개 내지 25 x 106개의 세포/mL 사이의 매우 고밀도의 세포로 배양될 수 있다. 포도당, 글루타민, 젖산염의 함량 뿐만 아니라, 배지의 pH 및 pO2 값, 및 예로서, 교반과 같은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다른 파라미터들은 세포 밀도 및/또는 바이러스 생산이 최적화되도록 본 발명의 MDCK 세포 배양시 용이하게 조작될 수 있다.
백신 물질(예로서, 바이러스)의 생산
본 발명은 본 발명의 MDCK 세포가 사용되는, 세포 배양물중 바이러스의 생산 방법(이하, "본 발명의 방법"으로서 언급함)을 제공한다. 하나의 실시태양에서, 방법은
i) 배양 배지에서 본 발명의 MDCK 세포를 증식시키고;
ii) 바이러스로 세포를 감염시키고;
iii) 추가의 배양 단계 후, 비-발암성 세포에서 배양된 바이러스를 분리하는 단계를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 단계 (i)에서 부착 세포로서 증식된다. 본 발명의 MDCK 세포는 제한하는 것은 아니지만, 상기 기술된 것을 비롯한, 임의 배지에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 특정 실시태양에서, 본 발명의 MDCK 세포는 무혈청 배지, 예를 들면, MediV-SF101, MediV-SF102, MediV-SF103, MediV-SF104, MediV-SF105 및 그의 APF 제제에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 임의로, 본 발명의 MDCK 세포는 혈청을 함유하는 배지(예로서, DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당)에서의 공정 과정에 따라 배양될 수 있다. 추가의 배양 조건, 예를 들면, 온도, pH, pO2, CO2 농도, 및 세포 밀도는 상기에 상세하게 기재되어 있다. 본 분야의 기술자는 바이러스를 생산하기 위해서 본 발명의 MDCK 세포를 증식시키기 위한 배양 조건의 조합을 확립할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 바이러스로 감염시키기 이전의, 세포를 증식시키기 위한 온도는 22℃ 내지 40℃ 사이이다. 특정 실시태양에서, 바이러스로 감염시키기 이전의, 세포를 증식시키기 위한 온도는 39℃ 미만, 또는 38℃ 미만, 또는 37℃ 미만, 또는 36℃ 미만, 또는 35℃ 미만, 또는 34℃ 미만, 또는 33℃ 미만, 또는 32℃ 미만, 또는 30℃ 미만, 또는 28℃ 미만, 또는 26℃ 미만, 또는 24℃ 미만이다. 하나의 실시태양에서, 세포를 증식시키기 위해 배양하는 것(단계 (i))은 관류 시스템에서, 예를 들면, 원심분리, 여과, 스핀 필터, 미세담체 등과 같이 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 세포 잔류 시스템을 사용하는 교반 베쓸 발효조에서 수행된다.
이러한 경우, 세포는 1 내지 20일, 또는 3 내지 11일 동안 증식된다. 배지 교환은 본 과정에서 1일당 발효조 용량은 0으로부터 대략 1 내지 5로 증가시키면서 수행한다. 세포는 이러한 방식으로 예를 들면, 적어도 1 x 106개 - 25 x 106개의 세포/mL 이하까지 고밀도의 세포로 증식된다. 관류 시스템에서의 배양시 관류 속도는 세포 계수, 배지중의 포도당, 글루타민 또는 젖산염 함량 및 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다른 파라미터를 통해 조절될 수 있다. 다르게는, 본 발명에 따른 방법중 단계 (i)에서 세포는 회분식 공정으로 배양된다.
본 발명에 따른 방법의 하나의 실시태양에서, 단계 (i)에서 사용되는 배양 배지의 pH, pO2 값, 포도당 농도 및 다른 파라미터는 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 배양하는 동안 조절된다.
또다른 실시태양에서, 바이러스로 세포를 감염시키는 것은 약 0.0001 내지 약 10, 또는 약 0.0005 내지 약 5, 또는 약 0.002 내지 약 0.5의 m.o.i.(감염다중도(multiplicity of infection))로 수행된다. 바이러스로 세포를 감염시키는 것은 0.0001 내지 10, 또는 0.0005 내지 5, 또는 0.002 내지 0.5의 m.o.i.(감염다중도)로 수행된다. 감염 후, 추가로 바이러스를 복제시키기 위해, 특히 최대 세포 변성 효과 또는 바이러스 항원의 최대량을 검출할 수 있을 때까지 감염된 세포 배양물을 배양한다. 하나의 실시태양에서, 감염 후, 세포는 22℃ 내지 40℃ 사이의 온도에서 배양된다. 특정 실시태양에서, 바이러스로 감염된 후, 세포는 39℃ 미만, 또는 38℃ 미만, 또는 37℃ 미만, 또는 36℃ 미만, 또는 35℃ 미만, 또는 34℃ 미만, 또는 33℃ 미만, 또는 32℃ 미만, 또는 30℃ 미만, 또는 28℃ 미만, 또는 26℃ 미만, 또는 24℃ 미만의 온도에서 배양된다. 또다른 실시태양에서, 감염 후, 세포는 33℃ 미만의 온도에서 배양된다. 추가의 또다른 실시태양에서, 감염 후, 세포는 31℃의 온도에서 배양된다. 특정 실시태양에서, 세포를 배양하는 것은 2 내지 10일 동안 수행된다. 배양은 관류 시스템에서 임의로 회분식 공정으로 수행될 수 있다.
바이러스로 감염시킨 후에 세포를 배양하는 것은(단계 (iii)) pH 및 pO2 값이 상기 기재된 바와 같이 유지되도록 수행된다. 공정중 단계 (iii)에 따른 세포의 배양시 또는 바이러스 복제시, 항원 수율을 최적화하기 위하여 세포 배양 배지를 새로 제조된 배지, 배지 농축물로 치환하거나, 규정된 성분들, 예로서, 아미노산, 비타민, 지질 분획으로 치환할 수 있다. 세포는 몇일에 걸쳐 배지 또는 배지 농축물을 추가로 첨가함으로써 서서히 희석될 수 있거나, 배지 또는 배지 농축물과 함께 추가의 관류시 항온배양될 수 있다. 이 경우 관류 속도는 세포 계수, 배지중의 포도당, 글루타민, 젖산염 또는 젖산염 탈수소 효소 함량 및 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다른 파라미터를 통해 조절될 수 있다. 추가로 유가식-배양(fed-batch) 배양 공정과 관류 시스템의 조합도 가능하다.
공정중 하나의 실시태양에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (iii))는 적합한 수율의 바이러스를 생산하기에 충분한 기간, 예로서, 감염 후 2 내지 10일, 또는 임의로 3 내지 7일이 경과한 후 수행한다. 공정중 하나의 실시태양에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (iii))는 감염 후 2일, 또는 3일, 또는 4일, 또는 5일, 또는 6일, 또는 7일, 또는 8일, 또는 9일, 또는 10일이 경과한 후 수행한다.
본 발명의 MDCK 세포에서 생산될 수 있는 바이러스는 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소비리다에(orthomyxoviridae), 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 토가비리다에(Togaviridae), 허피스비리다에(Herpesviridae), 랍도비리다에(Rhabdoviridae), 레트로비리다에(Retroviridae), 레오비리다에(Reoviridae), 플라비비리다에(Flaviviridae), 아데노비리다에(Adenoviridae), 피코나비리다에(Picornaviridae), 아레나비리다에(Arenaviridae) 및 폭스비리다에(Poxviridae) 과를 비롯한 동물 바이러스를 포함한다.
세포 배양물에서 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위한 시스템은 근년에 개발되었다(예로서, [Furminger. in Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay , pp . 324-332, Blackwell Science(1998)]; [ Merten et al . in Novel Strategies in The Design and Production of Vaccines, ed Cohen & Shafferman, pp. 141-151, Kluwer Academic(1996)] 참조). 전형적으로, 이들 방법은 적합한 무한증식 숙주 세포를 선택된 바이러스 균주로 감염시키는 것을 포함한다. 산란계의 난(hen's egg)에서의 백신 생산과 관련된 다수의 어려움들은 해소되었지만, 인플루엔자의 모든 병원성 균주가 잘 성장하는 것은 아니고, 확립된 조직 배양 방법에 따라 생산될 수 있다. 추가로, 예로서, 약독화된 것, 감온성인 것 및 저온 적응된 것과 같은 바람직한 특징을 갖는 균주로서 생 약독화된 백신 생산에 적합한 다수의 균주는 확립 방법의 사용으로는 조직 배양물에서 특히, 상업적 규모로는 성공적으로 성장하지 못했다.
본 발명은 혈청을 함유하는 배지 또는 무혈청 배지에서 성장하도록 적응되고, 배양시에는, 제한하는 것은 아니지만, 인플루엔자를 비롯한 바이러스의 복제를 지지할 수 있는 수개의 비-발암성 MDCK 세포주를 제공한다. 이들 세포주는 세포 배양물내에서 백신 물질로서 사용하기 위한 바이러스를 경제적으로 복제하는데 적합하다. 본 발명의 MDCK 세포는 다른 확립 세포주를 사용할 경우에는 잘 성장하지 않는(하기의 실시예 1 참조) 저온 적응되고 감온성인(ca/ts) 인플루엔자 균주(예로서, 플루미스트®에서 발견되는 인플루엔자 균주)의 생산에 특히 유용하다. 추가로, 본 발명의 MDCK 세포는 발육란에서는 성장할 수 없는 인플루엔자 균주, 예로서, 인간에서도 질환을 유발할 수 있는 조류 인플루엔자 바이러스(예로서, "범유행성" 균주)의 생산에 유용하다.
본 발명의 MDCK 세포에서 본 발명의 방법에 따라 생산될 수 있는 인플루엔자 바이러스는 제한하는 것은 아니지만, 약독화되고, 감온성이고, 저온 적응된 (ca/ts/att) 마스터 균주와 관련하여 선택된 적혈구 응집소 및/또는 뉴라민 분해효소 항원을 혼입하고 있는 재조합 바이러스를 포함한다. 예를 들면, 바이러스는 예로서, 감온성인 것(ts: temperature - sensitive), 저온 적응된 것(ca: cold -adapted) 또는, 약독화된 것(att: attenuated)중 하나 이상인 마스터 균주(예로서, A/앤아버/6/60, B/앤아버/1/66, PR8, B/레닌그라드/14/17/55, B/14/5/1, B/USSR/60/69, B/레닌그라드/179/86, B/레닌그라드/14/55, B/잉글랜드/2608/76 등)의 백본(또는 하나 이상의 vRNA 분절)을 포함할 수 있다. 난 또는 세포주에서 재조합 인플루엔자 백신 균주를 생산하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 예를 들면, [Kilbourne, E.D. in Vaccines(2nd Edition), ed. Plotkin and Mortimer, WB Saunders Co.(1988)] 및 PCT 출원 PCT 특허 공개번호 WO 05/062820 및 WO 03/091401에 개시된 것을 포함한다. 본 발명의 MDCK 세포에서 본 발명의 방법에 의해 생산될 수 있는 다른 인플루엔자 바이러스는 이종 유전자 산물을 발현시킬 수 있는 재조합 인플루엔자 바이러스를 포함한다(예를 들면, 미국 특허 공개번호 제2004/0241139호 및 제2004/0253273호 참조).
하나의 실시태양에서, 세포는 상기 기재된 바와 같이 증식된(단계 (i)) 후, 세포는 인플루엔자 바이러스로 감염된다(단계 (ii)). 특정 실시태양에서, 감염은 0.0001 내지 10, 또는 0.0005 내지 5, 또는 0.002 내지 0.5의 m.o.i.(감염 다중도)로 수행된다. 다른 실시태양에서, 감염은 약 0.0001 내지 약 10, 또는 약 0.0005 내지 약 5, 또는 약 0.002 내지 약 0.5의 m.o.i.(감염 다중도)로 수행된다. 임의로, 적혈구 응집소의 전구체 단백질[HA0]을 절단시켜 세포상에 바이러스를 흡착시킬 수 있는 단백질 분해효소를 첨가한다. 단백질 분해효소의 첨가는 인플루엔자 바이러스로 세포를 감염시키는 단계(단계 (ii)) 직전에, 그와 동시에, 또는 그 직후에 본 발명에 따라 수행될 수 있다. 감염과 동시에 첨가를 수행할 경우, 단백질 분해효소는 감염시키고자 하는 세포 배양물에 직접 첨가할 수 있거나, 예를 들면, 바이러스 접종물과 함께 농축물로서 직접 첨가할 수 있다. 본 발명의 특정 측면에서, 단백질 분해효소는 세린 단백질 분해효소, 또는 시스테인 단백질 분해효소, 또는 아스파라긴 단백질 분해효소이다. 하나의 실시태양에서, 트립신이 사용된다. 특정 실시태양에서, TPCK-처리된 트립신이 사용된다.
하나의 실시태양에서, 트립신은 최종 농도 1 내지 5000mU/ml, 또는 5 내지 1000mU/ml, 또는 100 내지 500 mU/ml 이하까지 세포 배양물에 첨가된다. 대체 실시태양에서, 트립신은 배양 배지에 최종 농도 1 내지 200㎍/ml, 또는 5 내지 50㎍/ml, 또는 5 내지 30㎍/ml 이하까지 세포 배양물에 첨가된다. 본 발명에 따른 공정 과정중 단계 (ii)에 따라 감염된 세포를 추가로 배양하는 동안, 회분식 공정의 경우에는 트립신을 새로 첨가하거나, 관류 시스템의 경우에는 트립신 용액을 연속적으로 첨가하거나 간헐적으로 첨가하여 트립신 재활성화시킬 수 있다.
감염 후, 추가로 바이러스를 복제시키기 위해, 특히 최대 세포 변성 효과 또는 바이러스 항원의 최대량을 검출할 수 있을 때까지 감염된 세포 배양물을 배양한다. 특정 실시태양에서, 세포 배양은 2 내지 10일 동안 수행된다. 이번에 배양은 관류 시스템에서 또는 임의로, 회분식 공정으로 수행될 수 있다. 추가의 실시태양에서, 세포는 인플루엔자 바이러스로 감염된 후 25℃ 내지 36℃, 또는 29℃ 내지 34℃의 온도에서 배양된다. 33℃ 미만의 온도, 특히 상기 지시된 온도 범위에서 감염된 세포를 배양할 경우, 특정 인플루엔자 바이러스, 예를 들면, B형 균주를 고수율로 생산할 수 있다. 추가로, 감온성이고 저온 적응된(ts/ca) 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해서는 35℃ 미만의 온도에서 감염된 세포를 배양하는 것이 주시된다. ts/ca 바이러스는 또한 약독화된(att) 것일 수 있다는 것에 주시한다. 또다른 실시태양에서, 세포는 ts/ca 인플루엔자 균주를 생산하기 위해 30℃ 미만, 또는 31℃ 미만, 또는 32℃ 미만, 또는 33℃ 미만, 또는 34℃ 미만의 온도에서 배양된다. 특정 실시태양에서, 세포는 인플루엔자 바이러스 B형 균주를 생산하기 위해서 31℃의 온도에서 배양된다.
이번의, 인플루엔자 바이러스로 감염된 후 세포 배양은(단계 (iii)) 상기 기술된 바와 같이 수행된다.
공정 과정중 하나의 실시태양에서, 생산된 바이러스의 수거 및 분리(단계 (iii))는 적합한 수율의 바이러스를 생산하기에 충분한 기간, 예로서, 감염 후 2 내지 10일, 또는 임의로 3 내지 7일이 경과한 후 수행한다. 바이러스는 전형적으로 감염된 세포가 배양되었던 배양 배지로부터 회수된다. 전형적으로, 인플루엔자 바이러스 농축 이전에 조(crude) 배지를 정화시킨다. 보편적인 방법은 여과, 한외여과, 황산바륨상에서의 흡착 및 용출, 및 원심분리를 포함한다. 예를 들면, 감염된 배양물로부터의 조 배지는 먼저 세포 파편 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예로서, 10 내지 30분 동안, 예로서, 1000-2000 x g에서 원심분리에 의해 정화될 수 있다. 다르게, 배지는 무손상(intact) 세포 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기 위해 0.8㎛ 아세트산 셀룰로오스 필터를 통해 여과된다. 임의로, 이어서 인플루엔자 바이러스를 펠릿화시키기 위하여 정화된 배지 상등액은 예로서, 15,000 x g, 대략 3-5시간 동안 원심분리된다. 적절한 완충액, 예로서, STE(0.01M 트리스-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 식염수(PBS: phosphate buffered saline)(pH 7.4)에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 바이러스를 수크로오스(60%-12%) 또는 포타슘 타르트레이트(50%-10%)상에서의 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스를 농축시킨다. 연속 또는 단계 구배, 예를 들면, 4개의 12% 단계의 12%와 60% 사이의 수크로스 구배가 적절하다. 회수를 위한 가시적인 밴드내로 바이러스를 농축시키는 데 충분한 속도, 및 시간 동안 구배물을 원심분리시킨다. 다르게는, 그리고, 가장 큰 규모의 상업적 적용을 위해서는, 연속적인 모드로 작용하는 영역-원심분리 로터를 이용하여 밀도 구배로부터 바이러스를 현탁분리한다. 당업자가 조직 배양물로부터 인플루엔자 바이러스를 준비하도록 안내하기에 충분한 상세한 사항은 예를 들면, [Furminger, in Textbook of Influenza pp. 324-332 Nicholson et al. (ed)]; [Merten et al., in Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141-151 Cohen & Shafferman (ed)]), 및 미국 특허 번호 제5,690,937호에 개시된다. 원한다면, 회수된 바이러스를 수크로스-포스페이트-글루타메이트(SPG)와 같은 안정화제가 존재하는 상태하에 -80℃에서 저장할 수 있다.
공정중 특정 실시태양에서, 바이러스는 벤조나제(Benzonase)® 또는 다른 비-특이 엔도뉴클레아제로 처리된다. 임의로, 생산된 인플루엔자 바이러스의 수거 및 분리((단계 (iii)) 이전에 벤조나제® 처리를 실시한다. 공정중 다른 실시태양에서, 벤조나제® 처리 후, 물질을 정화시킨다. 정화에 유용한 방법은 제한하는 것은 아니지만, 직류식 여과(DFF: direct flow filtration)를 포함한다. 생산된 인플루엔자 바이러스의 수거 및 분리((단계 (iii))를 위해 사용될 수 있는 추가의 단계는 제한하는 것은 아니지만, 접선 유동 여과(TFF: tangential flow filtration), 친화성 크로마토그래피 뿐만 아니라, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 하이드록시수산화인회석 크로마토그래피를 포함한다. 하기 실시예 섹션에서 다른 단계가 예시된다.
백신 조성물 및 사용 방법
본 발명은 추가로 본 발명에 의해 수득될 수 있는 바이러스(예로서, 인플루엔자)에 관한 것이다. 이들 바이러스는 인간 또는 동물에 투여하기 위한 백신을 제공하는 공지 방법에 의해 제제화될 수 있다. 바이러스는 무손상 바이러스 입자(예로서, 생 약독화된 바이러스)로서, 또는 불활성/붕괴(disintegrated) 바이러스(예로서, 포름알데히드 세정제로 처리된 것)로서 존재할 수 있다. 임의로, 규정된 바이러스 성분(예로서, 단백질)은 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 방법에 의해 바이러스로부터 분리될 수 있고, 백신 제조에 사용될 수 있다.
무손상 바이러스 입자(예로서, 생 약독화된 바이러스)의 제조 방법은 제한하는 것은 아니지만, 여과에 의한 최종 제제로의 완충액 교환과, 이어서 멸균 단계를 비롯한 추가의 단계를 포함할 수 있다. 상기 제조 방법에 유용한 완충액은 20OmM 수크로오스, 및 아르기닌과 같은 다른 아미노산 부형제가 첨가된 pH 7.0-7.2의 인산염 또는 히스티딘 완충액을 함유할 수 있다. 특정 실시태양에서, 안정화 단백질 가수분해물, 예로서, 돼지 젤라틴을 첨가한다. 몇몇 실시태양에서, 본 발명의 최종 바이러스 용액/백신은 인플루엔자 백신화 시즌(예로서, 전형적으로는 북반구에서 9월경부터 3월까지) 내내 "장에서(in field)"(예로서, 2-8℃, 4℃, 5℃ 등에서 냉장되었을 때 판매시 및 상업화시) 저장할 수 있기에 충분한 시간 동안 액상 형태로 안정적인 생 바이러스를 포함할 수 있다. 따라서, 바이러스/백신 조성물은 저장 기간 내내 허용가능한 속도로 그의 효능을 유지하거나 그의 효능을 잃지 않는 것이 요구된다. 다른 실시태양에서, 그러한 용액/백신은 약 2℃ 내지 약 8℃, 예로서, 냉장 온도에서 액상 형태가 안정적이다. 예를 들면, 냉장 온도에서 안정적인 약독화된 인플루엔자 백신을 제조하는 방법 및 조성물은 2005년 10월 4일 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US2005/035614(또한 PCT 공개번호 WO 05/014862 참조)에 기술되어 있다. 임의로, 건조 가열식 가스 스트림하에서 제제의 액상 공급물이 미세 액적(droplet)으로 분사 분무화(spray atomized)되는 분무 건조, 급속 건조 공정은 백신 제제의 저장 시간을 연장시키기 위하여 사용될 수 있다. 미세 액적의 증발을 통해 용해된 용질로 구성된 건성 분말이 수득된다(예로서, 미국 특허 공개번호 제2004/0042972호 참조). 백신 조성물용의 불활성/붕괴 바이러스 입자 생산 방법 및 제조 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고 지난 40년간 이용되어 왔다.
일반적으로, 바이러스 또는 바이러스 성분은 하나 이상의 바이러스 균주에 대해 특이적인 면역 반응을 자극시키기 위해 적절한 담체 또는 부형제에서 예방학적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 담체 또는 부형제는 예로서, 멸균수, 수성 식염수 용액, 수성 완충 식염수 용액, 수성 덱스트로스 용액, 수성 글리세롤 용액, 에탄올, 또는 그의 조합과 같은 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제이다. 멸균성, pH, 등장성, 및 안정성을 보장하는 그러한 용액의 제조는 본 분야에 확립된 프로토콜에 따라 이루어진다. 일반적으로, 담체 또는 부형제는 알레르기 및 다른 부적절한 효과를 최소화하고, 피하, 근육내, 비강내 등과 같은 특정 투여 경로에 맞도록 선택된다.
임의로, 바이러스, 또는 그의 성분들의 예방학적 투여용 제제는 또한 인플루엔자 항원에 대한 면역 반응을 증강시키기 위한 하나 이상의 애주번트를 함유한다. 적합한 애주번트는 사포닌, 미네랄 겔, 예로서, 수산화 알루미늄, 계면 활성 물질, 예로서, 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 또는 탄화수소 유제, 바실 칼메테-구에린(BCG: bacille Calmette-Guerin), 코린박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum), 및 일반 애주번트 QS-21 및 MF59를 포함한다.
일반적으로, 본 발명의 인플루엔자 바이러스는 하나 이상의 인플루엔자 바이러스 균주에 대해 특이적인 면역 반응을 자극하기에 충분한 양으로 투여된다. 바람직하게는, 인플루엔자 바이러스의 투여는 보호성 면역 반응을 유도한다. 하나 이상의 인플루엔자 균주에 대한 보호성 면역 반응을 유발하기 위한 투여량 및 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 불활성화된 인플루엔자 바이러스는 약 1-1000 HID50(인간 감염성 투여량(human infectious dose))의 범위, 즉 투여되는 투여량 당 약 105-108pfu(플라크 형성 단위(plaque forming units))로 제공된다. 다르게는, 약 10-50㎍, 예를 들면, 15㎍ HA가 애주번트없이 투여되며, 보다 작은 투여량은 애주번트와 함께 투여된다. 일반적으로, 투여량은 예를 들면, 나이, 물리적 상태, 체중, 성별, 식사, 투여 시간 및 다른 임상적 요소에 기초하여 이 범위내에서 조정될 것이다. 예방 백신 제제는 예를 들면, 주사 바늘 및 시린지, 또는 바늘없는 주사 장치를 이용한 피하 또는 근육내 주사에 의해 전신 투여된다. 다르게는, 백신 제제는 드롭, 큰 입자 에어로졸(약 10 미크론 이상)에 의해, 또는 상부 호흡기내로의 분사에 의해 비강내로 투여된다. 상기 전달 경로중 어느 것이든 보호성 전신 면역 반응을 야기하지만, 비강내 투여는 인플루엔자 바이러스의 도입 부위에서 점막 면역성을 유발하는 추가 잇점을 제공한다. 비강내 투여의 경우, 약독화된 생 바이러스 백신이 종종 바람직하며, 예를 들면, 약독화된 것, 저온 적응된 것 및/또는 감온성인 재조합 또는 재배열 인플루엔자 바이러스가 바람직하다. 단일 투여에 의한 보호성 면역 반응의 자극이 바람직하며, 원하는 예방 효과를 이루기 위하여 추가의 투여량을 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여할 수 있다. 이들 방법은 제한하는 것은 아니지만, 오르토믹소바이러스(A형 및 B형 인플루엔자 균주 포함), 파라믹소바이러스(RSV, 인간 메타뉴모바이러스 및 파라인플루엔자 포함), 랍도바이러스 및 플라보바이러스를 비롯한 임의의 바이러스에 대해 적응될 수 있다.
인플루엔자 바이러스
본 원의 방법, 공정 및 조성물은 일차적으로 백신용 인플루엔자 바이러스의 생산에 관한 것이다. 인플루엔자 바이러스는 분절화된 단쇄 RNA 게놈을 함유한 내부 리보뉴클레오단백질 코어 및 매트릭스 단백질이 붙어있는 외부 지질단백질 외피로 구성된다. A형 및 B형 인플루엔자 바이러스 각각은 (-) 센스의 단쇄 RNA의 분절 8개를 함유한다. A형 인플루엔자 게놈은 적어도 11개의 폴리펩티드를 코딩한다. 분절 1-3은 바이러스 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 구성하는 세개의 폴리펩티드를 코딩한다. 분절 1은 폴리머라제 복합체 단백질 PB2를 코딩한다. 나머지 폴리머라제 단백질 PB1과 PA는 분절 2와 분절 3에 의해 각각 코딩된다. 또한, 일부 A형 인플루엔자 균주의 분절 1은 PB1 코딩 영역내의 다른 리딩 프레임으로부터 생산되는 작은 단백질인 PB1-F2를 코딩한다. 분절 4는 감염 동안의 세포 부착과 진입에 관여하는 헤마글루티닌(HA) 표면 당단백질을 코딩한다. 분절 5는 바이러스 RNA와 연합된 주요 구조 성분인 뉴클레오캡시드 핵단백질(NP) 폴리펩티드를 코딩한다. 분절 6은 뉴라민 분해효소(NA) 외피 당단백질을 코딩한다. 분절 7은 상이하게 스플라이싱된 mRNA들로부터 해독되는, M1과 M2로 표시되는 두 가지의 매트릭스 단백질을 코딩한다. 분절 8은 다르게 스플라이싱된 mRNA 변이체들로부터 해독되는 두 가지의 비구조 단백질인 NS1 과 NS2(NEP)를 코딩한다.
B형 인플루엔자의 8개의 게놈 분절은 11개의 단백질을 코딩한다. 세 개의 가장 큰 유전자들은 RNA 폴리머라제의 성분인 PB1, PB2 및 PA를 코딩한다. 분절 4는 HA 단백질을 코딩한다. 분절 5는 NP를 코딩한다. 분절 6은 NA 단백질과 NB 단백질을 코딩한다. NB와 NA 두 단백질 모두 비스시스트로닉(biscistronic) mRNA의 중복 리딩 프레임으로부터 해독된다. B형 인플루엔자의 분절 7은 또한 두 단백질 M1과 BM2를 코딩한다. 가장 작은 분절은 두 생성물을 코딩하여, NS1은 전장 RNA로부터 해독되고, NS2는 스플라이싱된 mRNA 변이체로부터 해독된다.
재조합 바이러스는 소위 마스터 도너 바이러스(MDV: master donor virus)로도 명명되는 공인된 마스터 균주와 관련하여 선택된 적혈구 응집소 및 뉴라민 분해효소를 혼입시키기 위하여 생산된다. 플루미스트®는 공인된 저온 적응되고, 약독화되고, 감온성인 MDV 균주(예로서, A/앤아버/6/60 및 B/앤아버/1/66)를 사용한다. 난-기반(egg-based) 방법 및 더욱 최근의 세포 배양 방법(예로서, PCT 공개번호 WO 03/091401; WO 05/062820 및 미국 특허 번호 제6,544,785호; 제 6,649,372호; 제6,951,754)을 비롯한 다수의 방법이 재조합 바이러스 생성에 유용하다. 본 발명의 MDCK 세포, 배지 및 공정은 제한하는 것은 아니지만, 본 원에 개시된 인플루엔자 균주(예로서, A/앤아버/6/60 및 B/앤아버/1/66) 및 A/앤아버/6/60, B/앤아버/1/66, PR8의 유전자를 포함하는 재조합 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 유용하다는 점에 주시한다. 추가로, 본 발명의 MDCK 세포, 배지 및 공정은 감온성인 것, 저온 적응된 것, 약독화된 것의 표현형중 하나 이상을 갖는 재조합 바이러스를 비롯한 인플루엔자 바이러스의 생산을 위해 유용하다는 점에 주시한다. 전형적 재조합 기술, 예를 들면, 공-감염 방법에 의해, 임의로 플라스미드 구조 기술에 의해 재조합을 생성시킬 수 있다(예로서, PCT 공개번호 WO 03/091401; WO 05/062820 및 미국 특허번호 제6,544,785호; 제6,649,372호; 제6,951,754호 참조).
이에 본 발명은 하기 실시예를 참고로 하여 기술된다. 이들 실시예는 단지 설명하기 위한 목적으로 제공되고, 본 발명이 어느 방식으로든, 본 실시예로 제한된다고 해석되어서는 안되며, 본 원에서 제공되는 교시의 결과로서 입증되는 임의의 변형 및 모든 변형도 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
실시예 1
세포주에서의 ca / ts 인플루엔자 균주의 감염 확산 측정 및 MDCK 세포에서 생산된 인플루엔자의 특징화
백신 산업에서는 난을 이용하지 않는 대체 생산 플랫폼을 개발하기 위한 노력 및 포유동물 또는 곤충 세포 배양물 시스템에서 인플루엔자 백신을 생산하기 위한 노력이 계속되어져 왔다. 명백한 잇점은 용이한 확장성, 공정 제어 증가 및 일부 백신에서 알러지 반응을 유발할 수 있는 난단백(egg protein)의 제거이다. 세포 배양물 기반 시스템은 신속하게 확장될 수 있기 때문에 난 공급이 부족할 수 있는 가능성이 있고 백신의 신속한 생산이 요구되고 있는, 인플루엔자 범유행성 시대에 있어 추가의 잇점을 제공한다. 초기 연구는 총 7개의 상이한 세포주: 2개의 인간 이배체 폐 섬유모세포주(MRC-5 및 WI-38)(데이타로 나타내지 않음), 인간 망막모세포종 및 인간 신장 세포주(양자 모두는 아데노바이러스 산물의 생산을 위해 유전적으로 작제되었다(각각, PER.C6 및 293)(데이타로 나타내지 않음), 태아 레서스 폐 세포주(FRhL2: fetal rhesus lung cell line)(데이타로 나타내지 않음), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포주(베로), 및 개의 원위세뇨관 세포주(MDCK)를 사용하여 실시하였다. 4 종류의 저온 적응성, 감온성, 약독화된(ca/ts/att) 재조합 인플루엔자 바이러스 균주, H1N1, H3N2, 잠재성의 범유행성 백신 균주 H5N1 뿐만 아니라, B 균주를 상업적으로 적당한 역가(>107 Log TCID50/mL)까지 증식시킬 수 있는지에 대하여 시험되는 것중 유일한 세포주는 MDCK 세포였다(도 1 및 데이타로 나타내지 않음). MDCK 세포에서 배양된 바이러스의 유전자적 및 항원적 특징을 난에서 배양된 바이러스의 것과 비교하였다. 게놈 서열상에서 유의적 변화는 관찰되지 않았고(데이타로 나타내지 않음) HAI 역가에 의해 측정된 항원성은 유사하였다(표 1).
형광 포커스 분석법 : MDCK 및 베로 세포를 4일 내내 96 웰 블랙 플레이트(DMEM + 4mM 글루타민 + PEN/Strep)에서 배양하였다. 각 웰은 DMEM + 4mM 글루타민 + 60 mU/mL TPCK 트립신중 ~0.01의 MOI로 ca/ts B형 인플루엔자-균주(B/홍콩/330/01 및 B/야마나시/166/98)를 사용하여 감염시켰다. 감염 확산을 측정하기 위하여 하기와 같이 바이러스로 감염된 플레이트를 고정시키고 면역 염색시켰다. 바이러스를 함유하는 배지를 각 플레이트로부터 채취(remove)하고, 200㎕/웰로 DPBS(Ca2+/Mg2+없음)를 사용하여 플레이트를 1회 세척한 후, PBS중의 200㎕/웰의 냉 4%(v/v) 파라포름알데히드를 첨가하여 플레이트를 고정시켰다. 200㎕/웰의 DPBS(Ca2+/Mg2+없음)를 사용하여 플레이트를 2회 세척한 후, 1차 항체(1:1000의 비율로 PBS중의 0.1% 사포닌, 1% BSA에 희석된 양 항(sheep anti) B 야마나시 및 양 항 B 홍콩)와 함께 세포를 항온배양하였다. 1시간 동안 항온배양시킨 후, 1차 항체을 제거하고, 세포를 PBS중 0.1% 트윈 20으로 3회 세척하고, 웰을 2차 항원(1:100 희석율로 PBS중의 0.1% 사포닌, 1% BSA에 희석된, FITC로 표지되어 있는 래빗 항 양(rabbit anti sheep))과 함께 항온배양하였다. 형광 현미경을 사용하여 4일 동안 매일 웰을 가시화하고, SPOT 프로그램을 사용하여 영상 촬영하였다.
결과 및 논의
형광 포커스 분석법을 사용하여 MDCK 및 베로에서 ca/ts B형 인플루엔자-균주가 확장되는지 여부를 평가하고, 50개의 베로 세포 클론들 사이의 바이러스 감염의 확장에 임의의 차이가 있는지를 평가하였다. MDCK 세포에서는 4일 내내 단층 형광이 증가한 반면, 베로 세포에서는 증가하지 않았기 때문에(도 1A 참조), MDCK와는 대조적으로 베로는 ca/ts B 균주의 생산에 대하여 비허용적이라고 결론지을 수 있었다. 이 데이타는, B-균주는 MDCK 세포에서 7-7.5 log10 TCID50까지 생산될 수 있지만, 베로 세포에서는 단지 4-4.5 log10 TCID50까지만 생산될 수 있다는 것(데이타로 나타내지 않음)을 나타내는 이전 실험에서의 데이타와 유사하였다.
잠재성의 범유행성 백신 균주, ca A/베트남/1203/2004를 비롯한 다수의 ca/ts/att 재조합 균주의 복제를 지지하는 MDCK 세포의 능력에 대하여도 MDCK 세포를 시험하였다. 낮은 감염 다중도로 ca A/베트남/1203/2004를 사용하여 MDCK 세포를 감염시키고, 감염 후 다양한 시점에 상등액중의 바이러스를 측량하였다. 감염 후 48시간까지 ca A/베트남/1203/2004의 역가는 대략 8 log10 TCID50/mL에 도달하였 고, 이후 3 내지 4일 동안 안정적으로 유지되었다. 도 1B 및 표 2를 참조한다.
타입 A/H1N1, A/H5N1, A/H3N2 및 B의 ca/ts/att 균주는 MDCK 세포에서 상대적으로 고역가로 복제되었다. 추가로, MDCK 세포에서 이들 ca/ts/att 균주를 계대접종하였을 때 그들의 게놈 서열은 유의적으로 변경되지 않았다. 3개의 ca/ts/att 균주, ca A/시드니/05/97, ca A/베이징/262/95, 및 ca B/앤아버/1/94를 MDCK 세포에 1회 또는 2회에 걸쳐 계대접종하고, 6개 모두의 내부 유전자의 전체 코딩 부위를 서열화하고 출발 물질과 비교하였다. 뉴클레오티드상의 어떤 변화도 관찰되지 않았으며(데이타로 나타내지 않음), 이를 통해 이러한 치환을 통한 계대접종이 이들 균주의 유전자 조성을 변화시키지는 못했다는 것이 입증되었다. 추가로, 배지 조성, 투여량(input dose)(moi), 항온배양 온도 및 수거 시간을 비롯한, 생산 공정 과정을 모사할 것으로 기대되는 조건하에서 MDCK 세포에서 생산된 상이한 백신 균주에 대하여 서열 특징화를 실시하였다. 예비 데이타에 기초하여, MDCK-생산된 바이러스의 게놈 서열상의 유의적 변화는 없을 것으로 기대되었다.
MDCK 세포에서의 계대접종후 게놈은 유전자적으로 안정적이었기 때문에, 난 또는 MDCK 세포에서 생산된 백신의 생물학적 특징은 식별이 불가능할 것으로 기대된다. 그러나, 난-기반 산물과 비교할 때 세포 배양물로부터의 1차 바이러스 산물은 특히 양자 모두가 비리온의 전반적인 물리적 성질을 잠재적으로 변화시킬 수 있는, HA 및 NA를 비롯한 바이러스 단백질의 해독 후 변형, 또는 바이러스 막에서의 지질 조성과 관련해서는 몇몇 미묘한 차이를 가질 수 있었다. 세포 배양물에서 생산된 백신 및 난에서 생산된 백신의 항원성에 대한 예비 사전임상 데이타를 통해 중요한 파라미터에서의 검출가능한 차이는 없음이 입증되었다. 수개의 백신 균주의 난 저장액을 MDCK 세포을 통해 계대접종하고, 양 산물의 항원성은 참조 항혈청을 사용하여 HAI 역가를 측정함으로써 결정하였다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 모든 HAI 역가는 서로서로의 2-배 이내에 있었고, 이는 난에서 유도된 물질과 비교할 때 세포에서의 백신 복제는 백신의 항원성을 변화시키지 못한다는 것을 시사한다.
표 1. 난 및 MDCK 세포에서 생산된 균주의 HAI 역가
HAI 역가
균주 난 유도 MDCK 유도
A/파나마/20/99 256 256
A/후한/359/95 1024 2048
A/와이오밍/03/2003 512 1024
B/지린/20/2003 64 32
B/홍콩/330/01 64 64
B/ 강소성 /10/2003 128 128
실시예 2
비-발암성 혈청 MDCK 세포의 유도
MDCK 세포는 전통적으로 인플루엔자 바이러스 적정에 사용되어 왔고[Zambon M., in Textbook of Influenza, ed Nicholson, Webster and Hay, ch 22, pg 291-313, Blackwell Science(1998)], 이로써, 백신 물질의 생산을 위한 인플루엔자의 증식을 위해 사용될 수 있다. 그러나, MDCK 세포는 전통적으로 FBS로 보충된 이글스 최소 기본 배지(EMEM: Eagle's Minimal Essential Medium)와 같은 기초 배지 조제물에서 배양되어 왔다. MDCK 세포는 이들 조건 및/또는 장시간 동안 배양될 때 발암성일 수 있다고 다수의 보고를 통해 시사된 바 있다(예를 들면, [Gaush et al., Proc Soc Exp Biol Med, 122:931]; [Leighton et al., 1968, Science, 163:472] 및 [Leighton et al., 1970, Cancer, 26:1022] 참조). 따라서, 백신 물질을 생산하기 위해 MDCK 세포를 사용하는 것에 대한 우려가 있었고, 다른 세포주(예로서, PER.C6 및 베로)를 개발하는데 노력이 집중되었다. 불행하게도, 모든 인플루엔자 균주가 다른 포유동물 세포주에서 잘 성장하지는 못했고, 특히, 플루미스트®, 생 약독화된 인플루엔자 백신을 포함하는 저온 적응된 인플루엔자 바이러스는 오직 MDCK 세포에서만 적당한 역가(>107 TCID50/mL)로 성장하였다. MDCK 세포를 특징화하는 초기의 보고에서는 MDCK 세포의 초기 계대는 발암성이 아닐 수 있다고 시사였다[Gaush et al., 1966, Proc Soc Exp Biol Med.122:931]. 비-발암성 상태로 MDCK 세포를 유지시키기 위해 배양 배지 및 계대접종 프로토콜을 확립하는 것이 본 실험의 목적이었다.
10% FBS, 4mM 글루타민 및 4.5g/L 포도당으로 보충된 DMEM을 배양 배지로서 사용하여 T-플라스크에서 ATCC(CCL 34)로부터 수득한 MDCK 세포를 확장시켰다. 혈청에서 배양된 MDCK 세포(MDCK-S 세포)상에서 프리-마스터 MDCK 세포 은행을 확립시키고, 상업적 계약업체(예로서, 바이오릴라이언스®, 메릴랜드주 로크빌 소재)에 의해 실시되는 통상의 시험을 사용하여 세균성/진균성 오염원 및 미코플라스마 오염에 대하여 시험하였다. 세포는 세균성/진균성 오염원의 존재에 대해서는 음성인 것으로 나타났다. 상기 은행으로부터의 MDCK-S 세포를 또한 핵형 분석법에 의해서도 시험하였고, 이는 개에서 유래된 것으로 밝혀졌으며, 염색체 갯수의 범위는 70 내지 84개였고, 형식상의 염색체 갯수는 78개였다. 이어서, PreMCB 바이알로부터 추가의 20회의 계대접종을 위해 MDCK-S 세포를 계대접종시키고, 생체내 성숙한 누드 마우스 모델에서 핵학 및 발암성에 대하여 시험하였다. 핵학 시험에서 마지막 계대인 MDCK-S 세포(p81/24)는 초기 계대인 MDCK-S 세포와 형식상의 염색체 갯수(78개)가 동일하였고 염색체 범위(70 내지 84개)도 동일한 것으로 나타났으며, 이는 계대 확장시에도 세포는 변하지 않았다는 것을 시사하는 것이다. 10 x 107개의 MDCK-S 세포를 성숙한 누드 마우스내로 피하 주사하였을 때 어떤 결절도 형성되지 않았고, 이는 비-발암성인 것으로 간주되었다.
재료 및 방법
재료 : MDCK 세포(ATCC, 카달로그 번호: CCL-34); T-25, T-75, T-225 플라스크(코닝(Corning), 카달로그 번호: 430639, 430641, 431082); 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 제제 번호:01-5052EF); 우태아 혈청, 감마선-조사(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 12107-500M); L-글루타민(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 59202-100M); D-포도당(암레스(Amresco), 카달로그 번호: 0188-1KG); Ca+2 및 Mg+2 분말을 포함하지 않는 둘베코 인산염 완충 식염수(DPBS: Dulbecco's Phosphate buffered saline)(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 21600-069); 0.05% 트립신-EDTA(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 25300); 디메틸설폭시드, DMSO(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: D2650); PBS중 0.4%w/v 트립판 블루 염료(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: T8154); CO2 인큐베이터(포르마 사이언티픽(Forma Scientific), 모델 번호: 3110); YSI 바이오애널라이저(YSI, 모델 번호: 2700 셀렉트(select)); 비트로 케미스트리 시스템(Vitro Chemistry System)(오르토 클리니크(Ortho clinic), 모델: DT60 II); 임프루브드 뉴바우르(Improved Neubaurr) 혈구계(하우저 사이언티픽(Hausser Scientific), 휘선 0.1mm/라이혀트(Reichert), 휘선 0.1mm).
조직 배양 플라스크에서 혈청 MDCK ( MDCK -S) 세포의 계대배양 : ATCC로부터 혈청 MDCK 세포 바이알을 입수하였다. T-75 플라스크중 10%(v/v) FBS, 4.5g/L 포도당, 2.2g/L NaHCO3 및 4mML-글루타민으로 보충된 DMEM 배지에서 세포를 배양하였다. 접종 후 3 또는 4일째 세포를 계대접종하고, 세포를 4일째 계대접종할 경우에서 접종 후 3일째 완전 배지로 교환하였다. 하기 기술하는 바와 같이 세포를 T-플라스크로부터 회수하였다.
사용한(spent) 성장 배지를 제거하고, 세포 단층을 DPBS(칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 37℃ 수조에서 사전에 가온시킨 적절량의 트립신-EDTA(3mL/T-75, 7.5mL/T-225)를 각 플라스크에 가하고, T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 15-20분 동안 항온배양하였다. 세포가 분리되었는지 여부를 체크하기 위하여 플라스크를 매 5분마다 체크하고, 세포의 분리를 돕기 위해 수회에 걸쳐 플라스크를 래핑(rapping)하였다. 세포가 T-플라스크로부터 완전하게 분리되었을 때, 10% 혈청을 함유하는 완전 성장 배지를 동량(3mL/T-75, 7.5mL/T-225) 가하여 트립신을 저해시켰다. 임의의 거대 세포 응괴물(clump)을 파 괴시키기 위하여 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 흡인시켰다. 2개의, 0.5mL의 세포 현탁액 시료를 혈구계에서 계수하였다. 2개의 계수 결과가 서로서로의 15% 내에 있지 않다면, 세포 계수를 반복하였다. 세포는 새로운 플라스크중 새로운 가온 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 4.5g/L 포도당 + 4mM 글루타민)에서 0.05 x 106개의 생육성 세포/mL로 희석시키고 T-플라스크(35mL/T75 또는 100mL/T-225)에 접종하였다. 이어서, 계대배양하거나 또는 배지 교환하기 3일 전에 37 ± 1℃, 5% CO2 환경에서 플라스크를 항온배양하였다.
MDCK -S 세포 은행 제작 : 저장(banking)에 필요한 요구량(4 x 106개의 세포/바이알 x 바이알 갯수)의 세포를 회수할 수 있을 때까지 상기 기술한 바와 같이 MDCK-S 세포를 T-플라스크에서 확장시켰다. 기술한 바와 같은 트립신처리에 의한 지수증식기(접종 후 3일째)때 MDCK-S 세포를 회수하였다. 7 ± 1분 동안 150-250g에서 원심분리하여 개개의 플라스크로부터 MDCK-S 세포 현탁액을 회수하였다. 상등액은 각 튜브로부터 흡인시키고, 세포 펠릿을 새로운 완전 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 4.5g/L 포도당 + 4mM 글루타민)에 재현탁시켰다. 상이한 원심분리 병으로부터의 세포 현탁액을 풀링하고, 임의의 거대 세포 응괴물을 파괴시키기 위하여 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 흡인시켰다. 전체 세포수를 측정하고, 4 x 106개의 세포/바이알로 냉동될 수 있는 바이알의 전체 갯수를 측정하였다.
이어서, 새로운 성장 배지를 사용하여 세포 현탁액의 용량을 상기 값으로 조정하였다. 새로 제조된 2 X 냉동 배지(DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민 + 4.5/L 포도당 + 15% DMSO)를 동량으로 세포 현탁액에 가하였다. 세포 현탁액을 완전하게 혼합하고, 1mL의 세포 현탁액을 각각의 냉동 바이알내로 분배하였다. 모든 바이알을 나르겐(Nalgene) 냉동 용기로 옮기고 ≤ -6O℃ 냉동고에 놓았다. 냉동된 바이알을 액상 질소 저장 탱크로 옮겼다.
T-75 플라스크에서의 MDCK -S 세포 성장 곡선의 작성 : 세포 성장 곡선 연구에 앞서 세포를 적어도 4회(해동 후)에 걸쳐 그들의 성장 배지에서 계대접종하였다. 전체 적어도 2.7 x 107개의 세포를 수득하기 위하여 MDCK-S 세포를 T-225 플라스크내로 확장시켰다. 상기 기술한 바와 같이 트립신처리하기 전에 플라스크를 80-95% 융합시까지 배양시켰다. 회수한 MDCK-S 세포를 풀링하고, 임의의 거대 세포 응괴물을 파괴시키기 위하여 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 흡인시켰다. 세포 계수를 위해 2개의 시료(0.5mL)를 채취하고, 세포 밀도를 측정하였다. 2개의 시료의 계수가 서로서로의 15% 내에 있지 않다면, 세포 계수를 반복하였다. 이어서, 2.7 x 107개의 전체 MDCK-S 세포를 전체 용량 540mL의 완전 성장 배지(5.O x 104 세포/mL)로 희석시켰다. 이어서, 이러한 세포 현탁액을 14 x T-75 플라스크(35mL/T-75 플라스크)내로 분배하였다. 플라스크를 37 ± 1℃, 5% CO2 인큐베이터에 놓았다.
세포 계수 및 물질대사 분석을 위해 인큐베이터로부터 2개의 T-플라스크를 날마다 채취하였다. 물질대사 분석을 위해 2개의, 세포 배양 배지 시료(대략 1.0mL)를 각각의 플라스크로부터 채취하였다. YSI 및 비트로스 분석기를 사용하여 포도당, 젖산염, 글루타민, 글루타메이트 및 암모니아 농도를 측정하기 위하여 하나의 시료를 사용하였다. 남은 시료 하나는 추후의 아미노산 분석을 위해 7O℃에서 냉동시켰다. 상기 기술한 바와 같이 트립신처리하여 각각의 플라스크로부터 MDCK-S 세포를 회수하였다. 세포 밀도를 측정하고, T-플라스크당 전체 세포수도 측정하였다. 2개의 시료의 계수가 서로서로의 15% 내에 있지 않다면, 세포 계수를 반복하였다. 제시한 갯수는 계대수(p63 및 p65)가 상이한 2개의 MDCK-S 세포에서 실시된 2개의 독립 성장 곡선 연구에서의 평균값이다.
핵학 시험 : 핵학 시험은 플로리다주 멜버른에 소재하는 어플라이드 제네틱스 래버러토리스(Applied GeneticsLaboratories)에서 수행하였다. 간단하게, T-225 플라스크에서 배양된 MDCK-S 세포를 어플라이드 제네틱스 래버러토리스로 옮겼다. 세포를 유지시키고, 상기 열거된 각각의 방법에 따라 계대배양하였다. 세포가 충분한 유사분열 세포를 가졌다고 판단되었을 때, 유사분열 분석을 위해 세포를 수거하였다. 세포는 150분 동안 37℃에서 콜세미드(0.02㎍/mL)를 사용하여 처리하였다. 이어서, 세포를 트립신처리에 의해 수거하고, 세포를 5분 동안 200g에서 원심분리하였다. 상등액을 흡인시키고, 세포를 사전에 가온된 저장액에 재현탁시키고, 37℃에서 10분 동안 재현탁시켰다. 원심분리에 의해 팽윤성 세포를 펠릿화시킨 후, 실온에서 40분 동안 카노이(carnoy) 용액(3:1의 메탄올:빙초산)에서 항온배양시켜 고정 시켰다. 세포를 다시 원심분리하고, 세포를 카노이 고정액을 사용하여 적어도 2회에 걸쳐 세척하였다. 마지막 원심분리 후, 세포를 1 내지 3ml의 새로운 고정액에 재현탁시켜 유백색의 세포 현탁액을 생산하였다. 점적량(drops)의 최종 세포 현탁액을 깨끗한 슬라이드에 놓고, 대기 건조시켰다.
인산염 완충 식염수중 라이트(Wright) 염색액을 슬라이드에 가하여 세포를 염색하고, 7-10분 동안 항온배양하였다. 7-10분후 슬라이드를 수돗물로 세척한 후 대기 건조시켰다. 저배율 대물렌즈(10X)를 사용하여 세포를 스캐닝함으로써 세포가 세포 분열중 중기 단계에 있음을 확인하고, 중기에서의 세포 염색체는 고배율 유침 렌즈(oil immersion lens)(100X)를 통해 분석하였다. 세포유전학적 이상 및 염색체 계수를 위해 중기에 있는 100개의 세포를 분석하였다. 다배체형의 빈도(polyploid frequency) 및 유사분열 지수(유사분열중인 세포의 퍼센트)를 측정하기 위해 1000개의 세포를 스캐닝하였다.
MDCK -S PRE - MCB 의 무균성 시험(정균성 및 정진균성 및 배지 4개의 무균성) : 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 바이오릴라이언스 인코포레이티드(Bioreliance Inc.)에서 정균성 및 정진균성 활성에 대하여 MDCK-S Pre-MCB를 시험하였다. US 26 및 21 CFR 610.12 요건을 충족시키기 위해 분석을 실시하였다. 이러한 분석법은 대조군 유기체만을 함유하는 브로쓰 배지와 비교하여, 0.1mL의 시험 시료를 함유하는 적절한 브로쓰 배지에 접종된 대조군 유기체(바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 클러스트리디움 스포로지너스(Clostridium sporogenes), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginonsa), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus Niger))의 성장에 차이가 있는지에 대해 시험하였다. 간단하게, 시험물(test article)을 TSB(대두-카제인 분해 배지) 튜브 3개, THIO(액체 티오글리콜레이트 배지) 튜브 4개, AB(사브로 덱스트로오스 아가) 튜브 2개, 및 PYG(펩톤 효소 추출액: peptone yeast extract) 튜브 2개내로 접종하였다. 이어서 100cfu 미만의 대조군 유기체를 함유하는 각각의 대조군 유기체를 적절한 종류의 배지내로 접종하였다. 양성 대조군은 TSB 및 THIO중 바실러스 서브틸리스, TSB 및 SAB(20-25℃ 및 30-35℃에서)중 칸디다 알비칸스, THIO 및 PYG중 클러스트리디움 스포로지너스, 슈도모나스 애루지노사, 스타필로코커스 아우레우스 및 아스페르길루스 니게르로 구성되었다. 음성 대조군은 멸균 PBS였다. 배지를 3-5일 동안 항온배양하고, 유기체의 성장에 대하여 체크하였다.
메릴랜드주 로크빌에 소재하는 바이오릴라이언스에서의, 4개의 배지 무균성 시험을 사용하여 세균성 및 진균성 오염원 존재에 대해서도 시험물을 분석하고, USP 26, EP 및 21CFR610.12 요건을 충족시키도록 분석법을 디자인하였다. 간단하게, 시험물을 TSB(대두-카제인 분해 배지) 튜브 2개, THIO(액체 티오글리콜레이트 배지) 튜브 2개, AB(사브로 덱스트로오스 아가) 튜브 3개, 및 PYG(펩톤 효소 추출액) 튜브 2개내로 접종하였다. 배지를 적절한 온도에서 항온배양하고(SAB 비탈 배지는 2개의 온도에서 항온배양하였다) 튜브 모두를 14일간 관찰하는데, 시험 3/4일째 또는 5일째, 7 또는 8일째 및 14일째 튜브를 체크하였다. 혼탁하게 보이는, 임의의 시험물이 접종된 튜브를 플레이팅 아웃(plating out)시키고, 플레이트에서 그 람 염색을 실시하였다. 음석 대조군은 멸균 PBS였다.
미코플라스마/미코플라스마 생장정지( mycoplasmastasis ) 시험 : 냉동 MDCK-S 세포(MDCK preMCB 로트 번호(lot no.) 747p1O5) 바이알을 바이오릴라이언스로 보냈다. 상기 설명된 바와 같이 T-플라스크에서 세포를 확장시키고, 배양하였다. 5 x 105개의 세포/mL 농도의 세포 용해물을 제조하고 -7O℃에서 냉동시켰다. 아가 브로쓰/플레이트 및/또는 베로 세포에서 폐렴 미코플라스마(Mycoplasma pneumoniae), 마이코플라스마 오랄(Mycoplasma orale) 및 미코플라스마 히오르히니스(Mycoplasma hyorhinis)의 성장을 저해하는 능력에 대해 시험물을 시험하였다.
아가 분리 시험을 위해, 시험물을 아가 플레이트 또는 브로쓰 병 위에 시험적으로 스파이킹(spiking)시키거나 언스파이킹(unspiking)시켰다. 시험물을 폐렴 미코플라스마 및 마이코플라스마 오랄로 스파이킹시켜 10 내지 100cfu/0.2mL(아가 분석법용), 및 10 내지 100cfu/10mL(반 브로쓰 분석법용)로 희석시켰다. 시험 시료중 일부는 스파이킹시키지 않았다. 4개의 반고체 브로쓰 병에 스파이크된 것(병 2개) 또는 언스파이크된 것(병 2개) 각 10ml를 접종하였다. 스파이크된 것/언스파이크된 것 각각의 병 1개를 적절한 온도하에 호기적 또는 혐기적 상태에서 항온배양하였다. 10개의 A형 아가 플레이트 및 10개의 B형 아가 플레이트에 각각의 스파이크된 시료 또는 언스파이크된 시료를 접종하였다. A형 아가 플레이트중 ½ 및 B형 아가 플레이트중 ½을 적절한 온도하에 호기적 또는 혐기적 상태에서 항온배양하였다. 비접종 미코플라스마 반고체 브로쓰는 비접종 음성 대조군으로서의 역할을 하 였다. 브로쓰 병 모두를 21일 동안 관찰하였다. 3일째, 7일째, 및 14일째 각각의 브로쓰 병(단, 비접종 음성 대조군은 제외)을 A형 아가 플레이트 또는 B형 아가 플레이트(각각 10개, 0.2mL/플레이트)상에 계대배양하고, 적절한 병과 동일한 조건하에서 항온배양하였다. 21일 동안 하루에 한번씩 검사하였다.
증진된 베로 세포 배양물 분석을 위해, 시험물을 시험적으로 스파이킹시키거나 언스파이킹시켰다. 시험물을 10-100cfu/0.2mL 농도의 M. 오랄 및 M. 히오르히니스로 스파이킹시켰다. 스파이크된 시험물, 언스파이크된 시험물, 양성 대조군 및 음성 대조군 각각을 베로 세포 배양물의 T-75 플라스크에 접종하였다. 접종 후 3-5일째, 각 플라스크로부터 세포를 스크래핑하고 급속 냉동시켰다. 각 플라스크로부터의 10번째 세포 용해물 1mL 2개를 베로 세포를 함유하는 6개의 웰 플레이트중 각각의 웰에 접종하였다. 추가로, 양성 및 음석 대조군을 베로 세포를 함유하는 6개의 웰 플레이트중 적절한 웰에 접종하였다. 3-5일 후, 세포를 고정시키고, DNA 결합 HOECHT 염료로 염색하고, 미코플라스마의 존재에 대하여 평가하였다.
누드 마우스에서의 MDCK -S 세포의 발암성 시험 : 누드(nu/nu) 가슴샘이 없는 마우스에서의 종양 형성에 대한 평가는 메릴랜드주 로크빌에 소재하는 바이오릴라이언스®에서 실시하였다. 간단하게, 0.2mL(1 x 107개의 세포/마우스)의 양성 대조군(18C1-10T 세포), 음성 대조군(시리아 햄스터 배아 세포; SHE(Syrian hamster embryo) 세포) 또는 시험 세포(혈청 MDCK 세포, 747p1O5의 높은 계대)중 하나를 가슴샘이 없는 암컷 마우스(4주령) 30마리에 피하 주사하였다. 주사 전에 동물을 임 의 추출하고, 같은날 22 게이지 바늘을 사용하여 마우스 모두에 주사하였다. 매 실험일마다 동물 모두를 관찰하고, 84일 동안 병변 발생에 대하여 1주일에 2번씩 주사 부위를 촉진(palpate)하였다. 각각의 병변을 측정하고, 육안으로 볼 때 병변의 크기가 증가하지 않는 한은 동물을 그대로 유지시켰다. 이는 최대 3개월간 유지되었다. 마우스 모두를 희생시키고, 84일 후 부검하고, 주사 부위, 폐, 견갑 림프절 및 육안적 병변(gross lesion)을 조직생리학적 방법에 의해 분석하였다.
MDCK -S에서의 저온 적응된 인플루엔자 균주 복제 : T-75 플라스크를 5 x 104개의 세포/mL(35mL의 DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민)로 접종하고, 37℃, 5% CO2로 유지되는 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 접종 후 3일째, 트립신 EDTA를 사용하여 수거함으로써 T-플라스크당 전체 세포수를 측정하고 트립판 블루 배제법에 의해 세포 계수를 측정하였다. 이어서, 잔존하는 T-플라스크를 하기와 같이 감염시켰다. 배양 배지를 흡인시키고, 플라스크당 10mL의 DPBS(Ca2 +/Mg2 + 포함하지 않음)를 사용하여 세포를 2회에 걸쳐 세척하였다. 0.01의 감염 다중도(MOI)로 각각의 T-플라스크를 감염시키기 위한 바이러스의 양은 하기 식에 따라 결정하였다:
Figure 112007053425987-PCT00001
(여기에서, MOI는 첨가 세포수당 바이러스 입자의 갯수로서 정의된다).
이어서, 요구량의 바이러스를 각 T-플라스크중 35mL의 감염 후 배지(DMEM + 4mM 글루타민 + 60 mu/mL TPCK 트립신)에 가하였다. 이어서, T-플라스크를 33℃, 5% CO2에서 항온배양하고, 6일 동안 매일 시료를 채취하였다. 1O X SP를 안정화제로서 각 시료에 가하고, 감염성에 대하여 시험하기 이전에 시료를 <-70℃에서 저장하였다.
각 시료에 존재하는 바이러스의 농도는 감염성 비리온을 측정하는 중앙 조직 배양 감염 유발량(TCID50) 분석법에 따라 측정하였다. 간단하게, MDCK 세포를 96-웰 미량역가 플레이트에 융합 단층으로 성장시키고, 일련의 ca/ts 인플루엔자 바이러스 시료 희석액을 가하였다. MDCK 세포 측정 플레이트중 시료의 최종 희석도는 전형적으로 10-4 내지 10-10이었다. 칼럼 1-5 및 8-12의 웰은 바이러스-희석된 시료를 함유하고, 칼럼 6-7의 웰은 단지 바이러스 희석액만을 함유하였고, 이는 세포 대조군으로서의 역할을 하였다. 이러한 포맷은 플레이트당 2개의 데이타 점(n=2)을 형성하였다. MDCK 세포에서의 바이러스 복제를 통해 세포는 사멸하고, 자손 바이러스는 배양 상등액으로 방출되었다. 자손 바이러스는 다른 세포를 감염시켰고, 이를 통해 결과적으로는 단층이 파괴되었다. 6일 동안 CO2 환경하에 33 ± 1 ℃에서 항온배양하는 동안 감염으로부터 유발되는 세포 변성 효과(CPE)가 발생할 수 있었다. 이어서, 인큐베이터로부터 플레이트를 채취하고, 웰중 배지를 버리고, 100㎕의 MEM + 4mM 글루타민+ 페니실린/스트렙토마이신 + MTT를 각각의 웰에 가하였다. 37℃, 5% CO2에서 6시간 동안 플레이트를 항온배양하고, 각 웰에서 형성된 색상을 육안으로 조사하여(황색/오렌지색은 CPE 웰을 나타내고, 보라색 일색은 CPE가 없음을 나 타낸다) CPE를 나타내는 웰의 수를 측정하였다. 각 플레이트중 ½에서 CPE를 나타내는 웰의 갯수를 사용하여, Reed-Muench 방법의 Karber 변형법에 기초하여 역가(log10 TCID50/mL)을 산출하였다.
결과 및 논의
혈청 MDCK 세포의 냉동 바이알 2개를 각각 별개의 시점에 T-75 플라스크내 완전 성장 배지(DMEM + 10% FBS + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당)에서 해동시켰다. 해동시 세포의 생육성은 각각 97% 및 98%였다. 해동 후 3일째 세포가 융합되었다. 세포의 형태는 상피-양이었고, ATCC로부터 수득한 저장액과 유사하였다(도 3). 이들 세포를 5회에 걸쳐 계대접종하고, 이들 혈청 배양된 MDCK 세포(MDCK-S 세포)에 대한 프리-마스터 세포 은행 PreMCB를 확립시켰다. 도 2는 MDCK-S 프리-마스터 세포 은행(Pre-MCB)의 유도화를 위해 사용한 공정 과정을 개략적으로 설명하는 것이다.
10% FBS DMEM 배지에서의 MDCK-S 세포의 성장 곡선은 도 4에 나타낸다. 결과는 계대수가 상이한(P63&P65) 세포를 사용한 2개의 실험값의 평균이었다. MDCK-S 세포는 대략 1일간의 지체기를 가졌는데, 이때, 세포수는 접종시의 2배가 되지 못했다(접종시 1.75 x 106개의 전체 세포/T75 플라스크, 및 1일째 2.9 x 106개의 전체/T-75). 세포가 지체기인 것으로 보이는 첫째날에는 포도당 소비 속도/젖산염 생산 속도도 거의 0이었다(도 5). 이어서, 접종 후 4일째 정지기에 진입하기 이전의 세포 성장 기간 동안에는 세포가 지수적으로 성장하였다. 지수증식기에서 MCDK-S 세포의 배가 시간은 23.1시간이었다. 지수증식기 동안에는 포도당 소비 및 젖산염 생산은 서로서로를 반영하면서, 포도당 농도가 감소함에 따라 젖산염은 증가하였다(도 5). 포도당 소비 속도/젖산염 생산 속도는 세포 성장 곡선에 있어 서로 연관성을 가졌다(도 4 및 5 비교). 상기 속도는 정체기 동안에는 느렸고, 1일째 내지 4일째의 지수증식기 동안에 포도당의 경우, 2.93mM/일로, 젖산염의 경우, 3.43mM/일로 증가하였다.
접종 후 4일째 MDCK-S 세포는 정지기로 진입하였고, 접종 후 5일째에는 약 29 ± 0.99 x 106개 세포의 최대 세포 밀도에 도달하게 되었다(도 4). 본 연구에서 최대 밀도에 도달한 후, 7일까지는 세포수가 일정하게 유지되었다. 정지기에서 포도당 소비 속도 및 젖산염 생산 속도는 포도당의 경우, 0.33mM/일, 젖산염의 경우, 0.25mM/일로 저속화되었다. 7일간의 배양 후, 배지에 남아있는 포도당은 여전히 대략 12mM이었다. 4일째, 생산되는 젖산염에 대하여 소비되는 포도당의 양적비는 1.2였다.
MDCK-S 세포의 글루타민 소비, 및 글루타메이트 및 암모니아 생산은 도 6에 나타낸다. 글루타민 소비 속도 및 암모니아 생산 속도도 세포 성장 곡선과 서로 연관성을 가졌다(도 4 및 6 비교). MDCK-S 세포는 4일까지의 지수증식기 동안 0.49mM/일의 속도로 글루타민을 소비하는 동시에, 5일까지는 0.32mM/일의 속도로 암모니아를 생산하였다. 이어서, 세포가 정지기로 진입하였을 때, 글루타민 소비 속도는 0.24mM/일로 하락하였고, 암모니아 생산 속도는 0.11mM/일로 하락하였다. 접종 후 4일째 글루타민 소비에 대한 암모니아 생산비는 0.7이었다. 본 7일간의 세포 성장 연구에서 글루타민 대사로부터 생성되는 글루타메이트는 축적되지 않았다.
MDCK-S 세포의 핵학은 계대 61/4 및 계대 81/24에서 시험하였다. G-밴드 염색체 분석을 통해 세포가 개로부터 기원한 것임을 나타내었다. 중기의 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포를 도 7에 나타낸다. 염색체 계수의 범위는 낮은 계대 61/4에서는 중기의 세포당 70 내지 84개의 염색체였고, 높은 계대 81/24에서는 70 내지 84개의 염색체였다. 계대 양자 모두 형식상의 염색체 갯수는 78개의 염색체였다. 염색체 분포는 계대접종에 따라 변하지 않았다. 세포 모드는 정상의 개 신장 세포에 대한 것으로 예측되었다[Starke et al., 1972, Prog Immunobiol Stand., 5:178].
MDCK-S preMCB를 임의의 세균성, 진균성 또는 미코플라스마 오염원의 존재에 대하여 시험하였다. pre-MCB는 무균성 시험(세균성 및 진균성 오염원을 체크하기 위해 직접적인 접종 방법을 사용하는 배지 4개의 무균성 시험)에 통과하였고, 미코플라스마 존재에 대해서는 음성인 것으로 밝혀졌다(아가-배양 분석법 및 아가가 없는 배양(non-agar cultivable) 분석법). 시험물은 또한 정균성/정진균성 시험 및 미코플라스마 생장 정지 시험 양자 모두에서 양성 대조군의 성장을 저해시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.
계대 81/24(pre-MCB + 20 계대)의 MDCK-S 세포를 3개월간 발암성 시험용 누드 마우스에 놓았다. MDCK-S 세포를 접종받은 어떤 마우스에서도 신생물으로 진단받지 않았고, 이는 MDCK-S 세포가 발암성이 아님을 입증하는 것이었다(표 4).
MDCK-S 세포의 시험을 통해 MDCK-S 세포가 저온 적응된 감온성의 약독화된 재조합 인플루엔자 균주의 복제를 지지할 수 있다고 밝혀졌다(표 2).
표 2: 혈청 및 무혈청 MediV SF101 에 적응된 MDCK 세포에서의 저온 적응된 인플루엔자 바이러스 균주의 성장
바이러스 균주 (6:2 재조합) 혈청 MDCK (log10 TCID50/mL) 무혈청 MDCK (log10 TCID50/mL)
A/신규의 칼레도니아/20/99 8.1 7.8
A/텍사스/36/91 6.4 <5.2
A/파나마/2007/99 6.8 6.4
A/시드니/05/97 7.0 6.5
B/브리즈번/32/2002 7.2 7.5
B/홍콩/330/01 7.2 7.4
B/빅토리아/504/2000 6.9 7.5
실시예 3.
Taub 배지에서 무혈청 MDCK 세포의 유도
상기 실시예 2에서 상세히 설명된 결과는, MDCK 세포의 상피 형태 및 정상적인 핵학 뿐만 아니라, 저온 적응된 인플루엔자 균주를 복제할 수 있는 그의 능력을 유지시키는 조건하에서 MDCK 세포가 배양될 수 있다는 것을 입증한다. 추가로, 본 발명자는 상기 연구에서 상기 조건하에 MDCK 세포를 배양하는 것이 비-발암성인 MDCK 세포에서의 결과를 나타내었음을 입증하였다. 그러나, 실시예 2에서 사용되는 배양 배지는 우태아 혈청(FBS)을 함유하였다. FBS는 성분들의 복합 혼합물이고, 로트-대-로트 변동(lot-to-lot variation)으로 보고된 문제가 존재하였다. 또한, 소에서의 소 해면 뇌병증(BSE: bovine spongiform encephalopathy)과 관련된 현 문제들은 안전상의 우려를 일으키고 있다. MDCK-S 세포주의 비-발암성 성질 및 배양 특 징이 유지되는 무혈청 배지를 개발하는 것이 요법 및 백신화를 위해 생산되는 생물학적 제제의 안전성을 증가시키는데 중요하다.
5회 계대접종하기 위한 배양 배지로서 10% FBS, 4mM 글루타민 및 4.5g/L 포도당으로 보충된 DMEM을 사용하여 ATCC(ccl 34)로부터 입수한 개의 원위세뇨관 세포(MDCK)를 T-플라스크에서 확장시켰다. 이어서, 세포를 무혈청 Taub 배지(제조에 대해서는 하기 참조)로 옮겼다. 무혈청 Taub 배지 조제물에서 성장하도록 적응된 세포를 MDCK-T로 명시하였다. MDCK-T 세포에 대한 pre-MCB를 확립하고(도 8 참조), 세균성/진균성 오염원 및 미코플라스마 오염에 대해 시험하였다. 세포들, MDCK-T 세포와 프리-마스터 세포 은행 또한 핵형 분석법에 의해 시험함으로써, 이는 개 기원이고, 염색체 갯수의 범위가 52개 내지 84개이고, 형식상의 염색체 갯수는 78개인 것으로 밝혀졌다. 추가로, 적어도 또다른 20회의 계대접종을 위해 PreMCB 바이알로부터 MDCK-T 세포를 계대접종하고, 생체내 성숙한 누드 마우스 모델에서 핵학 및 발암성에 대하여 시험하였다. 그러나, MDCK-T 세포는 발암성인 것으로 밝혀졌고, 이는 공개된 Taub 배지가 인간 백신 물질의 생산을 위한 MDCK 세포의 안정적인 배양을 지지하지 못한다는 것을 시사하는 것이었다.
재료 및 방법
재료 : MDCK 세포(ATCC, 카달로그 번호: CCL-34, 계대 54); T-25, T-75, T-225 플라스크(코닝, 카달로그 번호: 430639, 430641, 431082); 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 제제 번호:01-5052EF); Ham F12 영양소 혼합물 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 21700-075); 우태아 혈청, 감마선-조사(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 12107-500M); L-글루타민(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 59202-100M); D-포도당(암레스, 카달로그 번호: O188-1KG); Ca+2 및 Mg+2 분말을 포함하지 않는 둘베코 인산염 완충 식염수 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 21600-069); 인슐린 분말(세로로지컬(Serological), 카달로그 번호 4506); 트랜스페린(APO 형태)(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 11108-016); 프로스타글란딘 E1(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: P7527); 하이드로코르티손(말린크로트(Mallinckrodt), 카달로그 번호: 8830(-05)); 삼요오드타이로닌(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: T5516); 나트륨 셀레늄(EMD, 카달로그 번호: 6607-31); 0.05% 트립신-EDTA(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 25300); 리마빈 트립신 저해제(워딩톤(Worthington), 카달로그 번호: LS002829); 디메틸설폭시드, DMSO(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: D2650); PBS중 0.4%w/v 트립판 블루 염료(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: T8154); 임프루브드 뉴바우르 혈구계(하우저 사이언티픽, 휘선 0.1mm/라이혀트, 휘선 0.1mm); YSI 바이오애널라이저(YSI, 모델 번호: 2700 셀렉트); 비트로 케미스트리 시스템(오르토 클리니크, 모델: DT60 II).
Taub 's 무혈청 배지 제조: Taub 배지[Taub and Livingston, 1981, Ann NY Acad Sci.,372:406]은 기초 배지 조제물로서, 4.5g/L 포도당 및 4mM 글루타민을 함 유하는 DMEM/HAM F12(1:1)로 구성된 무혈청 배지 조제물이며, 그에 첨가되는 호르몬/인자는 표 3에 나타낸다.
표 3: 무혈청 배지 조제물에 첨가되는 호르몬 및 성장 인자
성분 명칭 최종 농도
인슐린 5㎍/mL
트랜스페린 5㎍/mL
삼요오드타이로닌(T3) 5 x 10-12M
하이드로코르티손 5 x 10-8M
프로스타글란딘 E1 25ng/ml
아셀렌산나트륨(sodium selenite) 10-8M
Taub SFM은 계대접종시 새로 제조하거나, SF DMEM/Ham F12 배지 + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당 + 10-8M 아셀렌산나트륨에 호르몬 보충물의 저장액을 첨가함으로써 제조하였다. 100㎕의 인슐린 저장액(5mg/ml), 100㎕ 트랜스페린 저장액(5mg/ml), 100㎕ 삼요오드타이로닌(T3) 저장액(5 x 10-9M), 5㎕의 하이드로코르티손 저장액(10-3M) 및 50㎕의 프로스타글란딘 E1 저장액(50㎍/mL)을 기초 DMEM/Ham F12 배지 + 4mM 글루타민 + 4.5g/L 포도당 + 10-8M 아셀렌산나트륨에 가하여 100mL의 Taubs 배지를 제조하였다. 모든 저장액은 하기와 같이 제조하였다.
인슐린 저장액 - 0.01 N HCl에 적절량의 인슐린을 용해시켜 5mg/ml 저장액을 제조하였다. 0.2 미크론의 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시키고, 날진(Nalgene) 냉동 바이알내로 분취시키고, 4℃에서 저장하였다.
트랜스페린 저장액 - MilliQ 수에 적절량의 트랜스페린을 용해시켜 5mg/ml 저장액을 제조하였다. 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 날진 냉동 바이알내로 분취시키고 -20℃에서 저장하였다.
삼요오드타이로닌(T 3 ) 저장액 - 0.02N NaOH에 적절량의 T3을 용해시켜 10-4M 용액을 수득함으로써 저장액을 제조하였다. 이 저장액은 추가로 0.02N NaOH를 사용하여 5 x 10-9M 저장액으로 희석시키고, 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시킨 후, 날진 냉동 바이알내로 분취시키고, -20℃에서 저장하였다.
하이드로코르티손 저장액 - 100% EtOH에 적절량의 하이드로코르티손을 용해시켜 10-3M 저장액을 제조하고, 날진 냉동 바이알내로 분취시키고 4℃에서 3-4개월간 저장하였다.
프로스타글란딘 E 1 저장액 - 100% 멸균 EtOH에 적절량의 PGE1을 용해시켜 50㎍/mL 저장액을 제조하고, 날진 냉동 바이알내로 분취시키고, < -20℃에서 저장하였다.
Na 2 SeO 3 저장액 - WFI 수 또는 MilliQ 수에 적절량의 셀렌화나트륨을 용해시켜 10-2M 저장액을 제조하였다. 이를 추가로 최종 농도 10-8M가 되도록 물에 희석시키고 멸균 등급 필터를 통해 용액을 통과시키고, 4℃에서 저장하였다.
MDCK-S 세포의 무혈청 Taub 배지로의 적응 : 무혈청 Taub 배지내로 계대접종하기 전에, ATCC(계대 54)로부터의 MDCK 세포의 냉동 바이알을 5회의 계대접종을 위해 4.5g/L 포도당, 2.2g/L NaHCO3 및 4mML-글루타민을 포함하는 10% FBS DMEM 배지에서 배양하였다(상기 기술한 바와 같음). T-75 플라스크에서 배양된 혈청 MDCK를 트립신처리에 의해 회수하였다. 사용한 성장 배지는 제거하고, 세포 단층을 DPBS(칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)로 2회에 걸쳐 세척한 후, DPBS는 버렸다. 사전에 가온된 적절량의 트립신-EDTA(3mL/T-75)을 가하고, T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 15분 동안 항온배양하였다. 세포가 완전하게 분리되도록 하기 위하여 수회에 걸쳐 손바닥으로 플라스크를 랩핑하였다. 동량의 리마빈 트립신 저해제를 가하여 트립신을 중화시키고 2개의 시료를 채취하여 세포 현탁액중의 세포 농도를 측정하였다. 이어서, 1.75 x 106개의 세포를 새로운 T75 플라스크중의 35mL Taub 배지내로 희석시켰다. 플라스크를 37±1℃, 5% CO2로 유지되는 세포 배양 인큐베이터에 놓았다. 세포를 접종한 후 3일째 계대배양하거나, 3일째 완전 배지 교환한 후에 접종 후 4일째되는 날 계대배양하였다.
Taub 배지 적응된 MDCK 세포의 계대배양 : 사용한 성장 배지는 제거하고, 세포 단층을 DPBS(칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 사전에 가온된 적절량의 트립신-EDTA(3mL/T-75, 7.5mL/T-225)을 가하고, T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 15분 동안 항온배양하였다. 세포가 완전하게 분리되도록 하기 위하여 수회에 걸쳐 손바닥으로 플라스크를 랩핑하였다. 이어서, 동량의 리마빈 트립신 저해제(3mL/T-75, 7.5mL/T-225)를 가하여 트립신을 저해시켰 다. 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 흡인시켜 세포 현탁액을 균질화시켰다. 세포 계수를 위해 2개의 시료(0.5mL)를 채취하였다. 2개의 시료의 계수가 서로서로의 15% 내에 있지 않다면, 세포 계수를 반복하였다. 계수한 후, 세포를 전체 용량이 35mL/T75 또는 100mL/T-225이 되도록 새로운 플라스크중 사전에 가온시킨 새로운 Taub 배지에서 0.05 x 106개의 생육성 세포/mL로 희석시켰다. 이어서, 플라스크를 37 ± 1℃, 5% CO2 환경하에서 항온배양하였다. 세포를 3일째 새로운 T-플라스크에 계대접종하거나(하기 기술하는 바와 같음) 접종 후 4일째 완전 배지를 교환하고, 새로운 T-플라스크로 배양물을 계대배양하였다.
Taub 배지 적응된 MDCK 세포 PreMCB 은행의 제작 : Taub 무혈청 적응된 MDCK 세포주(MDCK-T)에 대한 프리-마스터 세포 은행을 상기 실시예 2에서와 같이 제조하되, 단, 2X 냉동 배지는 Taub 배지 + 15% DMSO였다.
Taub 배지 적응된 MDCK(MDCK-T) 세포의 특징화 : MDCK-T preMCB의 핵학, 무균성 및 미코플라스마 시험은 실시예 2에 기술된 바와 같이 실시하되, 단, 완전 배지를 함유하는 혈청을 대신하여 Taub 배지를 사용하였다. 추가로, T-75 플라스크중 MDCK-T 세포의 성장 곡선 특징 및 MDCK-T 세포에서의 저온 적응된 인플루엔자 균주의 복제를 실시예 2에 기술된 바와 같이 검사하되, 단, 완전 배지를 함유하는 혈청을 대신하여 Taub 배지를 사용하였다. 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 바이오릴라이언스에 의해 계대 88/29(pre-MCB + 20 계대)의 MDCK-T 세포상에서 발암성 연구를 실시하였다.
결과 및 논의
MDCK-T preMCB(계대 64/5) 세포의 냉동 바이알을 T-75 플라스크중 무혈청 Taub 배지로 해동시켰다. 세포 생육성은 97%였고, 해동시 5.25 x 106개의 세포가 냉동 바이알로부터 회수되었다. 해동 후 3일째 세포는 융합되었다. 세포 형태는 모(parent) MDCK-S 세포와 유사한 상피-양 세포를 나타내었다(도 9).
Taub SF 배지에서의 MDCK-T 세포에 대한 성장 곡선은 도 10에 나타낸다. 결과는 계대수가 상이한(P71/12 & P73/14) 세포를 사용한 2개의 실험값의 평균이다. MDCK-S 세포에는 지체기가 없었고, 접종 후 1일째 세포는 2개가 되었다(1일째 3.42 x 106개의 전체 세포/T75 플라스크 대 0일째 1.75 x 106개의 전체 세포/T75 플라스크). 정지기에 진입하는 4일째까지 세포는 지수증식기로 성장하였다. 지수증식기에서 세포의 배가 시간은 20.4시간이었다. 지수증식기 동안(0일째부터 4일째까지), 포도당 및 글루타민(도 11 및 12)을 사용하면서 동시에 젖산염 및 암모니아를 생산하였다. 포도당 소비 속도/젖산염 생산 속도는 세포 성장 곡선에 있어 서로 연관성을 가졌다(도 10 및 11 비교). 0일째부터 4일째까지의 지수증식기 동안 포도당 소비 속도는 1.78mM/일이었고, 젖산염의 생산 속도는 2.88mM/일이었다. MDCK-T 세포는 7일까지의 배양기간 동안 배지중에서 대략적으로 총 10mM의 포도당만을 소비하였다. 접종 후 4일째 생산되는 젖산염에 대하여 소비되는 포도당의 양적비는 1.2였다. 정지기에 진입하는 4일째 이후에는 포도당 소비 속도 및 젖산염 생산 속도는 하강하였고, 포도당 소비 속도는 0.65mM/일이었고, 젖산염의 생산 속도는 0.46mM/ 일이었다. 접종 후 대략 4일째 최대 세포 밀도 37 ± 0.24 x 106에 도달하였다. 정지기 동안 세포 밀도는 하강하지 않았고, 7일째까지 일정하게 유지되었다.
글루타민 소비 속도 및 암모니아 생산 속도는 MDCK-T 세포 배양물 및 포도당/젖산염 프로파일과 유사하였다(도 10, 11 및 12 비교). MDCK-T 세포는 지수증식기(0일째부터 4일째까지) 동안 0.36mM/일의 속도로 글루타민을 소비하였고, 세포가 정지기에 진입하였을 때(4일째 내지 7일째) 속도는 0.27mM/일로 하강하였다. 암모니아 생산은 7일째까지 0.22mM/일의 속도로 직선으로 증가하였다. 접종 후 4일째 글루타민 소비에 대한 암모니아 생산비는 0.49였다. 전체 7일 동안 글루타메이트 농도에는 뚜렷한 변화가 없었다.
실시예 2에서와 같이 ca/ts 인플루엔자 복제를 지지하는 능력에 대하여 MDCK-T 세포를 시험하였다. 표 2에 나타낸 결과는 MDCK-T 세포가 MDCK-S 세포에 대하여 제시된 것과 거의 동일한 수준으로 ca/ts 인플루엔자 복제를 지지할 수 있다는 것을 시사한다.
MDCK-T 세포 핵학은 계대 68/9 및 계대 88/29에서 시험하였다. G-밴드 염색체 분석을 통해 세포가 개로부터 기원한 것임을 나타내었다. 중기의 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포를 도 13에 나타낸다. 염색체 계수의 범위는 낮은 계대 68/9에서는 중기의 세포당 52 내지 82개의 염색체였고, 높은 계대 81/24에서는 54 내지 82개의 염색체였고, 이는 염색체 분포가 계대접종에 따라 변하지 않았음을 시사하였다. 그러나, MDCK-T 세포는 MDCK-S 세포(70-84개)와 비교할 때, 보다 광범위한 범위의 염색체 갯수(52 내지 84개)를 나타내는 것을 알 수 있었다.
MDCK-T preMCB를 임의의 세균성, 진균성 또는 미코플라스마 오염원의 존재에 대하여 시험하였다. MDCK-T pre-MCB는 무균성 시험(세균성 및 진균성 오염원을 체크하기 위해 직접적인 접종 방법을 사용하는 배지 4개의 무균성 시험)에서 통과하였고, 미코플라스마 존재에 대해서는 음성인 것으로 밝혀졌다(아가-배양 분석법 및 아가가 없는 배양 분석법). 시험물은 또한 정균성/정진균성 시험 및 미코플라스마 생장 정지 시험 양자 모두에서 양성 대조군의 성장을 저해시키지 못하는 것으로 밝혀졌다.
계대 88/29(pre-MCB + 20 계대)의 MDCK-S 세포를 3개월간 발암성 시험용 누드 마우스에 놓았다. 시험물 마우스 10마리중 6마리의 시험물에서 주사 부위가 샘암종인 것으로 진단받았다. 이는 SF Taubs 배지에서 배양된 MDCK 세포가 발암성이라는 것을 나타낸다. MDCK-S 및 MDCK-T 세포에 대한 발암성, TP50 예측치 및 핵학을 하기 표 4에 요약한다.
실시예 4
MediV 무혈청 배지에서의 무혈청 MDCK 세포 유도:
실시예 3에서 상세히 설명된 결과는 무혈청 Taub 배지(MDCK-T)에서 성장할 수 있도록 적응된 MDCK 세포는 우수한 배양 특징은 갖고, ca/ts 인플루엔자 균주의 복제를 지지할 수 있지만, 발암성이었다는 것을 입증한다. 따라서, 이러한 결과는, 문헌에서 보고된 바와 같이 MDCK 세포가 표준 무혈청 배지 조제물에서 용이하게 형 질전환될 수 있다는 것을 시사한다. 본 발명에 따라, 수개의 추가 무혈청 배지 조제물이 개발되었고, MDCK-S 세포의 비-발암성 성질을 유지하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. MediV SFM 101, 102 및 103으로 명명되는 신규한 무혈청 제제 각각에 MDCK-S 세포를 적응시켰다. 이들 무혈청 적응된 세포주는 각각 MDCK-SF101, -SF102 및 -SF103로 명명하였고, 총괄적으로는 "MDCK-SF"로 언급하였다. 각 MDCK-SF 적응 세포주에 대한 PreMCBs를 제작하였다. 세균성/진균성 오염원 및 미코플라스마 오염(최종 결과를 기다리는 중)에 대하여 MDCK-SF 세포주 preMCBs를 시험하였다. 핵형 분석에 의해 대해서도 preMCBs를 시험하였고, MDCK-SF101 및 MDCK-SF102 세포의 염색체 갯수의 범위는 각각 70개 내지 82개, 및 60개 내지 80개였고, 형식상의 염색체 갯수는 78개였다. 추가로, PreMCB 바이알로부터의 적어도 또다른 20회의 계대접종을 위해 각 무혈청 배지 은행으로부터의 세포를 계대접종하고, MDCK-SF103을 생체내 성숙한 누드 마우스 모델에서 핵학 및 발암성에 대하여 시험하였다. 계대 87의 MDCK-SF103의 염색체 갯수의 범위는 66개 내지 80개이고, 형식상의 염색체 갯수는 78개인 것으로 밝혀졌고, 비-발암성인 것으로 간주되었다.
재료 : MDCK 세포(ATCC, 카달로그 번호: CCL-34, 계대 54); T-25, T-75, T-225 플라스크(코닝, 카달로그 번호: 430639, 430641, 431082); 둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 제제 번호: 01-5052EF); Ham F12 영양소 혼합물 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 21700-075); 우태아 혈청, 감마선-조사(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 12107-500M); L-글루타민(JRH, 캔자스주 레넥사 소재, 카달로그 번호: 59202- 100M); D-포도당(암레스, 카달로그 번호: 0188-1KG); Ca+2 및 Mg+2 분말을 포함하지 않는 둘베코 인산염 완충 식염수 분말(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 21600-069); 인슐린분말(세로로지컬, 카달로그 번호4506); 트랜스페린(APO 형태)(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: L 1108-016); 프로스타글란딘 E1(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: P7527); 하이드로코르티손(말린크로트, 카달로그 번호: 8830(-05)); 삼요오드타이로닌(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: T5516); 나트륨 셀레늄(EMD, 카달로그 번호: 6607-31); 0.05% 트립신-EDTA(기브코, 뉴욕주 그랜드아일랜드 소재, 카달로그 번호: 25300); 리마빈 트립신 저해제(워딩톤, 카달로그 번호: LS002829); 디메틸설폭시드, DMSO(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: D2650); PBS중 0.4%w/v 트립판 블루 염료(시그마, 미주리주 세인트루이스 소재, 카달로그 번호: T8154); 임프루브드 뉴바우르 혈구계(하우저 사이언티픽, 휘선 0.1mm/라이혀트, 휘선 0.1mm); YSI 바이오애널라이저(YSI, 모델 번호 : 2700 select); 비트로 케미스트리 시스템(오르토 클리니크, 모델: DT60 II).
MediV 무혈청 배지(MediV SFM 101. 102 및 103) 제조 : 각각의 MediV 무혈청 배지 조제물은 기초 배지로서 Taub 배지(상기 실시예 2의 방법부 참조)를 사용하였고, 하기와 같은 보충물이 첨가되었다:
MediV SFM 101: Taub + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수)(카달로그 번호 19559). 소맥 펩톤 E1은 멸균 250g/L 저장액으로서 물에 저장되 었다.
MediV SFM 102: Taub + 최종 농도 1X로 첨가된 100 X 화학적으로 규정된 지질 농축물(기브코 BRL로부터 입수)(카달로그 번호 11905)
MediV SFM 103: Taub + 최종 농도 1 X 의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수)
Medi SFM 104: Taub + 최종 농도 1 X 의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수) + 0.01㎍/mL EGF(다수의 공급처).
Medi SFM105: 트랜스페린을 포함하지 않는 Taub + 최종 농도 1 X 의 지질 농축물(기브코로부터 입수) + 2.5g/L 소맥 펩톤 E1(오르가노 테크니크로부터 입수) + 0.01㎍/mL EGF + 10:1 내지 70:1의 비로 구연산 철 암모늄:트로폴론 또는 황산제2철 암모늄:트로폴론.
MDCK -S 세포의 무혈청 MediV 배지 조제물로의 적응 : 무혈청 MediV SFM 배지 조제물(MediV SFM 101, MediV SFM 102 또는 MediV SFM 103)내로 계대접종하기 전에 ATCC로부터의 MDCK 세포의 냉동 바이알을 5회의 계대접종을 위해 4.5g/L 포도당, 2.2g/L NaHCO3 및 4mML-글루타민을 포함하는 10% FBS DMEM 배지에서 배양하였다(상기 기술한 바와 같음). T-75 플라스크에서 배양된 혈청 MDCK를 트립신처리에 의해 회수하였다. 사용한 성장 배지는 제거하고, 세포 단층을 DPBS(칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)로 2회에 걸쳐 세척한 후, DPBS는 버렸다. 사전에 가온된 적절량의 트립신-EDTA(3mL/T-75)을 가하고, T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 15분 동안 항온배양하였다. 세포가 완전하게 분리되도록 하기 위하여 수회에 걸쳐 손바닥으로 플라스크를 랩핑하였다. 동량의 리마빈 트립신 저해제를 가하여 트립신을 중화시키고 2개의 시료를 채취하여 세포 현탁액중의 세포 농도를 측정하였다. 이어서, 1.75 x 106개의 세포를 새로운 T75 플라스크중의 35mL의 원하는 MediV SFM 배지 조제물내로 희석시켰다. 플라스크를 37±1℃, 5% CO2로 유지되는 세포 배양 인큐베이터에 놓았다. 세포를 접종한 후 3일째 계대배양하거나, 3일째 완전 배지 교환한 후에 접종 후 4일째되는 날 계대배양하였다.
MediV SFM 배지 적응된 MDCK 세포의 계대배양 : 사용한 성장 배지는 제거하고, 세포 단층을 DPBS(칼슘 및 마그네슘을 포함하지 않음)로 2회에 걸쳐 세척하였다. 사전에 가온된 적절량의 트립신-EDTA(3mL/T-75, 7.5mL/T-225)을 가하고, T-플라스크를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 약 15분 동안 항온배양하였다. 세포가 완전하게 분리되도록 하기 위하여 수회에 걸쳐 손바닥으로 플라스크를 랩핑하였다. 이어서, 동량의 리마빈 트립신 저해제(3mL/T-75, 7.5mL/T-225)를 가하여 트립신을 저해시켰다. 적절한 크기의 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 위아래로 흡인시켜 세포 현탁액을 균질화시켰다. 세포 계수를 위해 2개의 시료(0.5mL)를 채취하였다. 2개의 시료의 계수가 서로서로의 15% 내에 있지 않다면, 세포 계수를 반복하였다. 계수한 후, 세포를 전체 용량이 35mL/T75 또는 100mL/T-225이 되도록 새로운 플라스크중 적절한 것으로서, 사전에 가온시킨 새로운 MediV SFM 배지에서 0.05 x 106개의 생육성 세포/mL로 희석시켰다. 이어서, 플라스크를 37 ± 1℃, 5% CO2 환경하에서 항온배양하였다. 세포를 3일째 새로운 T-플라스크에 계대접종하거나(하기 기술하는 바와 같음) 접종 후 4일째 완전 배지를 교환하고, 새로운 T-플라스크로 배양물을 계대접종하였다. 주의: MDCK-SF 세포는 항상 그들이 적응된 것과 동일한 MediV SFM 배지 조제물내로 계대접종시켰다.
MediV SFM 배지 적응된 MDCK 세포 PreMCB 은행의 제작 : 무혈청 적응된 MDCK 세포주에 대한 프리-마스터 세포 은행을 상기 실시예 1에서와 같이 제조하되, 단, 2 X 냉동 배지는 적절한 MediV SFM 배지 조제물 + 15% DMSO였다.
MediV SFM 배지 적응된 MDCK ( MDCK - SF ) 세포의 특징화 : MDCK-SF preMCB의 핵학, 무균성 및 미코플라스마 시험은 본 원에 기술된 방법에 따라 실시하되, 단, 완전 배지를 함유하는 혈청을 대신하여 적절한 MediV SFM 배지 조제물을 사용하였다. 추가로, T-75 플라스크중 MDCK-SF 세포의 성장 곡선 특징 및 MDCK-SF 세포에서의 저온 적응된 인플루엔자 균주의 복제를 실시예 2에 기술된 바와 같이 검사하되, 단, 완전 배지를 함유하는 혈청을 대신하여 적절한 MediV SFM 배지 조제물을 사용하였다. 추가로, 상기 실시예 2에 기술된 바와 같이 상업적 계약업체(예로서, 바이오릴라이언스)에 의해 추가의 회수로 계대접종시킨 후(예로서, preMCB + 20회 계대) MDCK-T 세포상에서 발암성 연구를 실시하였다.
결과 및 논의
MDCK-SF101 및 MDCK-SF102 세포의 세포 핵학을 계대 71/9에서 시험하고, MDCK-SF103은 계대 87에서 시험하였다. 중기의 MDCK-T, MDCK-SF101 및 MDCK-SF102 세포 100개에서의 염색체 갯수 분포를 도 13에, MDCK-SF103의 것은 도 19에 나타낸다. MDCK-T 세포는 MDCK-SF101, MDCK-SF102 또는 MDCK-SF103 세포(각각 70-82개, 60-80개, 및 66-80개)와 비교할 때, 보다 광범위한 범위의 염색체 갯수(52 내지 84개)를 나타내는 것을 알 수 있었다. MDCK-SF101, MDCK-SF102 및 MDCK-SF103 세포에 대한 염색체 갯수 범위는 비-발암성 MDCK-S 혈청 배양된 세포에 대한 것(70-84개)과 더 유사하였고, 이는 MediV SF101, MediV SF 102, 및 MediV SF 103 배지 조제물이 이들 제제에서 배양되는 MDCK 세포의 정상적인 염색체 수를 보다 잘 유지시킬 수 있다는 것을 시사한다.
MediV SF103 배지에서의 MDCK-SF103 세포에 대한 대표적인 예비 성장 곡선은 도 16에 나타낸다. MDCK-SF103 세포는 약 1일간의 지체기를 가졌다. 정지기에 진입하는 약 4일째까지 세포는 지수증식기로 성장하였다. 지수증식기(0일째부터 4일째까지) 동안 포도당 및 글루타민(도 17 및 18)을 사용하면서, 동시에 젖산염 및 암모니아를 생산하였다. 포도당 소비 속도/젖산염 생산 속도는 세포 성장 곡선에 있어 서로 연관성을 가졌다(도 16 및 17 비교). 접종 후 대략 4일째 최대 세포 밀도 ~17 x 106에 도달하였다. 정지기 동안 세포 밀도는 하강하지 않았고, 7일째까지 일정하게 유지되었다.
글루타민 소비 속도 및 암모니아 생산 속도는 MDCK-SF 103 세포 배양물 및 포도당/젖산염 프로파일과 유사하였다(도 18). 암모니아 생산은 7일째까지 직선으로 증가한 반면, 전체 7일 동안 글루타메이트 농도에는 뚜렷한 변화가 없었다.
하기 실시예 7에 기술되는 바와 같이 수개의 재조합 인플루엔자 균주의 복제를 지지하는 능력에 대하여 MDCK-SF103 세포를 시험하였다. 도 2OA에 나타낸 결과는 MDCK-SF 103 세포가 시험된 각각의 인플루엔자 균주의 복제를 지지할 수 있다는 것을 시사한다.
상기 기술한 바와 같이 MDCK-SF 103 세포를 3개월간 발암성 시험용 누드 마우스에 놓았다. 성숙한 누드 마우스 모델에서 시험물은 비-발암성인 것으로 간주되었다(바이오릴라이언스 연구 번호 AB09EU.001000.BSV).
표 4: 상이한 배지에서 계대접종된 MDCK 세포의 발암성 및 핵학
세포 ( 계대수 ) 발암성 TP 50 * 예측치 ( 종양을 갖고 있는 동물수 /전체 동물수 ) 핵형 중위수 ; 평가
MDCK-S (P61/4) ND ND 78: 염색체 수(70 내지 82개)에 이상이 있는 세포는 거의 없음
MDCK-S (P81/24) 신생물 없음 주사 부위에서 섬유육종이 발견 예측불가 (>107) (0/10) 염색체 수(70 내지 82개)에 이상이 있는 세포는 거의 없음
MDCK-T (P63/4) ND ND 78: 염색체 갯수가 52 내지 82개인 세포 다수 분포
MDCK-T (P88/29) 신생물 발견 >106 (6/10) 78: 염색체 갯수가 52 내지 82개인 세포 다수 분포
MDCK-SF101 ND ND 염색체 수(70 내지 82개)에 이상이 있는 세포는 거의 없음
MDCK-SF102 ND ND 염색체 수(60 내지 80개)에 이상이 있는 세포는 거의 없음
MDCK-SF103 신생물 없음 주사 부위에서 섬유육종이 발견 예측불가 (>107) (0/10) 염색체 수(60 내지 80개)에 이상이 있는 세포는 거의 없음
* TP50: 동물의 50%에 종양을 유발하기 위해서 요구되는 세포수
ND: 비수행
실시예 5.
배양물에서 인간 상피 세포의 감염
인간 기원의 세포에서 MDCK 및 난에서 생산된 백신의 복제에 이어, 생화학적, 생물학적, 및 구조적 유사성을 평가하기 위해서, 백신을 관련 이배체 인간 세포, 예로서, 정상 인간 기관지 상피 세포(NHBE: normal human bronchial epithelial)에서 1회에 걸쳐 계대접종하였다. 이러한 계대접종은 인간의 기도에서 단일 감염 이벤트를 모사하는 역할을 하였고, 이후, 궁극적으로 면역 반응을 유도 하는 원인 바이러스인 자손 바이러스를 비교할 수 있었다. 백신의 적혈구 응집소(결합 및 융합) 및 뉴라민 분해효소 활성의 연구는 이들 재료상에서 평가하였고, 또한, 전자 현미경, 전체 입자에 대한 감염성 비, 및 바이러스 게놈 등가물을 비롯한 다른 생화학적 및 구조적 연구를 통해 평가하였다. 전반적으로, 이들 비교는 세포-유도된 백신과 유효하고 안전한 난에서 생산된 백신의 비교를 입증하는 역할을 했다. 세균성 및 진균성 오염원의 존재에 대한 시험 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있고, 상업적 계약업체(예로서, 바이오릴라이언스®, 메릴랜드주 로크빌 소재)에 의해 통상적으로 실시된다. 실시할 수 있는 분석적 연구에 대한 개요를 표 5에 요약한다.
표 5: 세포 및 난에서 생산된 백신을 비교하는 임상전 연구
생체내 ( 페럿 ) 시험관내 *
약독화/복제 상기도에서의 복제 범위 상기도에서의 복제 역학 바이러스 결합 적혈구응집 역가 상이한 시알산의 결합
면역원성 교차반응 역학 물리적 성질 EM에 의한 형태 감염성 입자:전체 입자(게놈)
감염성 검출가능한 복제를 위한 요구량 항체 반응을 위한 요구량 융합 활성 최적 pH 최적 온도
게놈 서열
뉴라민 분해효소 활성
실시예 6:
마스터 세포 은행의 제작, 시험 및 특징화
생산되는 세포는 유전자 배열이 독특한 것으로부터 유래한다는 것을 확인하기 위하여, 희석율을 제한하면서 생물학적으로 클로닝함으로써, 상기 기술된(실시 예 2-4 참조) 하나 이상의 preMCBs로부터의 마스터 세포 은행(MCB) 세포의 생산을 개시하였다. 이어서, 클론을 배가 시간 및 상대적인 발암성 뿐만 아니라, 바이러스 생산을 비롯한 다양한 표현형 성질에 대하여 스크리닝하였다. 개념 실험의 초기 증거에서, FCS를 함유하는 배지에서 54개의 MDCK 클론을 수득하였다. 이들 클론을 계대접종하고, 각각을 낮은 감염 다중도의 ca A/신규의 칼레도니아/20/99로 감염시켰다. 감염 후 몇일이 지난 후에, 상등액을 제거하고, 상등액중의 바이러스의 양은 TCID50에 의해 측정하였다. 소수의 클론은 상대적으로 고 역가의 바이러스를 생산하였고, 이는 클론화되지 못한(noncloned) 모 세포에서 생산된 것보다 더 많았다. 우수한 생물학적 및 생리학적 성질을 갖는 클론을 사용하여 마스터 세포 은행(MCB)을 확립하였다.
우발성 병원체에 대한 증거는 존재하지 않는다는 것을 확인하기 위해서 MCB를 광범위하게 시험하였다. 예를 들면, 구입가능한 바이러스 병원체에 대하여, 하기 표 6에 나타낸 바와 같은, 하나 이상의, 수개의 PCR 및/또는 항체-특이 시험을수행하였다.
표 6: MCB 에 대한 시험 요법
일반 시험
무균성
미코플라스마
시험관내 우발성 병원체
생체내 우발성 병원체
PERT
공-배양
핵학
전자 현미경
무손상 세포의 발암성(TP50)
세포 DNA의 암유발성
세포 용해물의 암유발성
9CFR당 소 바이러스
9CFR당 돼지 바이러스
PCR * / Ab 특이
1&2형 AAV
HCMV
EBV
HSV
B, C & E형 간염
6, 7 & 8형 HHV
1 & 2형 HIV
HPV
I & II형 HTLV
폴리오마(BK 및 JC 바이러스)
서코바이러스
개 파르보바이러스
개 디스템퍼
아데노바이러스
SV40
실시예 7:
백신 물질의 공정 과정 및 제조
현재 공인된 폴리오 백신을 생산하기 위해 사용되는 것과 유사한 용법으로서, 고도로 확장가능한 미세담체 기술 용법을 MDCK 세포에서의 인플루엔자 생산에 적용시킬 수 있다. 덱스트란으로 제조된 구형 비드는 2 내지 1OL 생물반응기에서 MDCK 세포의 탁월한 성장을 지지한다. SFMV 103에서 배양된 모 MDCK 세포는 양쪽 스피너 플라스크에서 회분식 모드로 2 x 106개의 핵/ml의 밀도로 시토덱스 1 미세담체상에서 성장할 수 있는 것으로 밝혀졌고, MDCK 세포는 생물반응기중에서 > 1 x 10개의 세포/mL로 10L 규모까지(데이타로 나타내지 않음) 성장하였다. 초기의 시험적 규모의 작업을 통해, MDCK 세포는 무혈청 공정에서 고역가로 백신 인플루엔자 균주를 생산할 수 있다는 것이 입증되었고, 역가는 T-플라스크중 혈청에서 배양된 세포를 사용하여 얻은 생산성과 동등하거나 그보다 크다는 것이 밝혀졌다. 도 2OA에 나타낸 바와 같이, 250mL 스피너 플라스크중 시토덱스 비드에서 배양된 MDCK 세포는 H1N1, H3N2 및 B 백신 균주를 고역가로 생산하였다. 임상적인 생산을 위해서는 인플루엔자 바이러스를 MDCK 세포에서 20L 또는 150L 규모로 생산할 수 있는 반면, 상업적 규모의 생산일 경우에는 2,500L 생물반응기를 사용할 수 있다. 도 2OB에는 세포 배양 규모를 상업적 생산 수준으로 확장시키기 위해 사용될 수 있는 하나의 공정 과정을 개략적으로 설명한다. 시험 세포 은행을 먼저 T-75 플라스크로부터 T-225 플라스크로 확장시킨 후, 순차적으로, 1리터 스피너 플라스크로, 20리터 이어서 300리터 생물반응기로, 최종적으로는 2500리터 생물반응기로 확장시켰다. 세포 밀도가 최적일 때, 배양물에 마스터 바이러스 균주를 접종한다. 이어서, 배양된 상등액으로부터 바이러스를 수거한다.
인플루엔자 백신에 기초한 세포 배양물에 대한 정제 공정은 난-기반 인플루엔자 백신 정제 공정(예로서, PCT 공개번호 WO 05/014862 및 PCT 특허 출원 PCT/US05/035614(2005년 10월 4일 출원))를 모델로 삼았다. 세포로부터의 바이러스 백신 물질의 정제는 하기 공정: 균질화, 정화, 원심분리, 한외여과, 황산바륨상에서의 흡착 및 용출, 접선 유동 여과, 밀도 구배 한외원심분리, 크로마토그래피, 및 멸균 여과중 임의 것 또는 모두를 포함할 수 있다. 다른 정제 단계 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 감염된 배양물로부터의 조 배지는 먼저 세포 파편 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기에 충분한 시간, 예로서, 10 내지 30분 동안 예로서, 1000-2000 x g에서 원심분리에 의해 정화될 수 있다. 다르게, 배지는 무손상 세포 및 다른 거대 과립 물질을 제거하기 위해 0.8㎛ 아세트산 셀룰로오스 필터를 통해 여과된다. 임의로, 이어서 인플루엔자 바이러스를 펠릿화시키기 위하여 정화된 배지 상등액은 예로서, 15,000 x g, 대략 3-5시간 동안 원심분리된다. 적절한 완충액, 예로서, STE(0.01M 트리스-HCl; 0.15M NaCl; 0.0001M EDTA) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)에 바이러스 펠릿을 재현탁시킨 후, 바이러스를 수크로오스(60%-12%) 또는 포타슘 타르트레이트(50%-10%)상에서의 밀도 구배 원심분리에 의해 바이러스를 농축시킨다. 연속 또는 단계 구배, 예를 들면, 4개의 12% 단계의 12%와 60% 사이의 수크로스 구배가 적절하다. 회수를 위한 가시적인 밴드내로 바이러스를 농축시키는 데 충분한 속도, 및 시간 동안 구배물을 원심분리시킨다. 다르게는, 그리고, 가장 큰 규모의 상업적 적용을 위해서는, 연속적인 모드로 작용하는 영역-원심분리 로터를 이용하여 밀도 구배로부터 바이러스를 현탁분리한다.
세포로부터의 바이러스 백신 물질의 정제에 관여할 수 있는 성질은 공정 초 기에 비-특이 엔도뉴클레아제인, 벤조나제®를 사용하는 것이다. 세포성 DNA의 종양원성을 평가하는 연구에 기초한 바, MDCK 세포성 DNA는 종양원성 위험을 내포하지 않는 반면, 벤조나제® 처리는 사실상 임의의 잠재성 또는 가상의 위험성을 제거할 것이다. 하나의 정제 공정에 있어서, 벤조나제® 처리 후, 물질을 직류식 여과(DFF)에 의해 정화하는데, 여기에서, 상기 직류식 여과는 또한 벌크 물질내 임의의 잔류성 무손상 포유동물 세포도 제거할 것이다. 이어서, 여과된 벌크는 추가의 정제 단계 이전에 접선 유동 여과에 의해 농축된다. 다른 바이러스 시스템에서도 잘 작동하는 친화성 크로마토그래피 뿐만 아니라, 이온 교환 크로마토그래피 및/또는 하이드록시수산화인회석 크로마토그래피를 비롯한 정제 방법은 세포 배양물 기반 인플루엔자 백신 생산에 유용하다. 이어서, 개발된 공정에 의해 수득한, 고도로 정제된 바이러스 물질을 백신 물질 생산에 사용한다. 예를 들면, 생 약독화된 백신 생산에 사용하기 위해(예로서, 플루미스트®) 바이러스 물질을 최종 제제로 여과에 의해 완충액을 교환시킨 후 멸균 단계를 수행할 수 있다. 그러한 제제로 유용한 완충액은 20OmM 수크로오스 및 아르기닌과 같은 다른 아미노산 부형제가 첨가된 pH 7.0-7.2의 인산염 또는 히스티딘 완충액을 함유할 수 있다. 필요할 경우, 안정화 단백질 가수분해물, 예로서, 돼지 젤라틴도 첨가할 수 있다. 이상적으로, 연장된 저장 기간 동안 안정적이도록 백신 물질을 제조한다. 저장 기간을 연장시키기 위하여 사용될 수 있는 한 방법은 건조 가열식 가스 스트림하에서 제제의 액상 공급물이 미세 액적으로 분사 분무화되는 급속 건조 공정인 분무 건조이다. 미세 액적의 증발 을 통해 용해된 용질로 구성된 건성 분말이 수득된다(예로서, 미국 특허 공개번호 제2004/0042972호 참조). 분무 건조는 종래의 냉동-건조 공정과 비교할 때 확장이 용이하고, 제조 비용과 관련하여 잇점을 제공한다. 다르게는, 백신 물질은 냉장 온도에서 액상 형태로 안정적이도록 본 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조된다. 예를 들면, 냉장 온도에서 안정적인 약독화된 인플루엔자 백신을 제조하기 위한 방법 및 조성물은 2005년 10월 4일 출원된 PCT 특허 출원 PCT/US2005/035614에 기술되어 있다.
공정중(In-process) 특징화 단계는 생산을 모니터하는 정제 설계내로 도입된다. 포함할 수 있는 특징화 단계는 제한하는 것은 아니지만, 바이러스 감염성을 측정하는 단순 항체 결합 및 형광 염색 방법을 사용하는 형광 포커스 분석법(FFA, 예로서, 상기 참조)을 포함한다. 본 분야의 기술자에게 공지되어 있는 다수의 방법을 사용하여 실시할 수 있는 전체 단백질 및 DNA 분석법을 사용하여 초기에 남아있는 불순물의 퍼센트를 측정한다. 백신의 용량당 바이러스의 감염성(예로서, 감염성/mg)을 산출함으로써 제제의 특정 활성을 측정할 수 있다.
실시예 8:
임상전 동물 모델
페렛(ferret)은 약독화된 인플루엔자 백신 및 성분 백신 균주의 약독성 및 면연원성을 평가하기 위하여 사용되는 건장한 모델이다. MCB로부터 생산된 세포 유도된 인플루엔자 균주의 성능을 난에서 생산된 동일 균주와 비교한다. 대조 연구에서 이들 재료들의 직접(head to head) 비교를 통해 이들 바이러스 산물이 고도의 수준으로 유사하다는 것을 확인할 수 있다.
페렛에서 2개의 백신이 감염시키는 능력 또는 "종두 접종(take)" 수행 능력을 평가하기 위하여, 동물을 가볍게 마취시키고, 세포 또는 난에서 생산된 바이러스 검사물을 비강내로 접종하였다. 동물의 상기도에서의 바이러스 복제의 역학 및 그 범위를 평가하기 위해서, 접종 후 수개의 시점에서 코 세척물을 수집하고, 바이러스의 양은 수개의 이용가능한 방법들중 하나에 의해 평가하였다. 실험은 광범위한 용량으로 실시되었고, 다수의 균주와 상이한 3가 혼합물을 포함하였으며, 이로부터 난에서 생산된 균주에 대하여 상대적인 세포 배양물에서 배양된 균주의 감염성을 추론하게 되었다. 이들 동일한 연구를 다시 사용함으로써 인플루엔자 균주의 면역원성에 대하여 평가하였는데, 이는 감염을 개시하는 선척적인 바이러스의 능력과 연계되는 것이다. 동물을 출혈시키고, 접종 후 다양한 시점(주 단위)에 코 세척물을 수거하고; 이들 검사물을 사용하여 감염에 대한 혈청 항체 및 코 IgA 반응을 평가하였다. 감염성, 혈청 항체 및 점막 항체 반응이라는 이들 데이타의 정점을 사용하여 난에서 생산된 백신에 대하여 상대적인 세포에서 생산된 백신의 감염성을 비교하고 평가하고자 하였다. 가장 가능성이 높은 결과로서는, 세포 및 난에서 생산된 백신 균주가 유사한 감염성 및 면역원성을 가질 것이라고 예측되었다. 세포에서 유도된 백신이 난에서 유도된 산물보다 감염성이 우수하거나 면역원성이 우수하다면, 보다 소량의 투여량을 사용함으로써 가능성을 평가하기 위한 추가의 연구를 실시하였다.
단일 단위의 인간 투여량을 사용하여 세포 배양물에서 유도된 백신을 평가하 기 위하여 페렛에서 다수의 면역원성 및 복제 연구를 실시하였다. ca/ts/att 균주로 감염시켰을 때는 일반적으로 페렛에서 강하고 신속하게 항체 반응이 유도되었다. 추가로, 개개의 ca/ts/att 균주를 통상적으로 시험하였고, 이들 동물의 코인두에서는 상대적으로 고역가로 복제되되, 폐에서는 검출불가능한 수준으로 복제됨으로써 약독화된(att) 표현형을 발현시킨다는 것으로 나타났다. 이러한 생물학적 성향에 세포 배양물의 성장이 미치는 영향에 대해서도 평가하였다. 그러나, att 표현형도 이들 균주의 유전적 조성에 필수 부분이기 때문에 어떤 차이도 관찰될 가능성은 없었다. 이들 동물에서 단일 투여량으로 인간에게 투여한 후, 이들 균주의 배양 역학 및 교차반응을 평가하였다. 난에서 유도된 물질로부터 제조된 생 약독화된 백신은 유전적 계통내에서 다수의 균주와 교차반응하는 혈청 항체를 유도하였고; 세포에서 유도된 백신도 동일한 능력을 가질 것이라고 예측되었다.
이들 비교 연구는, 1차 바이러스 산물의 잠재적인 생화학적 및/또는 생물리학적 차이에 대하여 중요한 식견을 제공하여야 하고, 이러한 후성적(epigenetic) 차이가 인간 세포 또는 동물 연구에서 바이러스를 1차 계대접종하여 측정된 ca/ts/att 균주의 성능에 대해 미치는 영향력을 입증하여야 했다. 현재까지의 연속된 정보에 기초하여 볼 때, MDCK 세포에서 생산된 ca/ts/att 균주의 성능에 대해 미치는 영향력은 없는 것으로 예측되었다.
페렛은 인플루엔자에 대하여 잘 보고되어 있는 동물이고, ca/ts/att 균주의 약독화 표현형 및 면역원성을 평가하기 위해 통상 사용된다. 일바적으로, 8-10주령의 동물을 사용하여 약독화를 평가하고; 전형적으로는, 시험군 또는 대조군당 3-5 마리(n=3-5)의 동물을 사용하여 평가하였다. 8주령 내지 6개월된 동물에서 면역원성 연구에 대해 평가하고, 일반적으로는 시험물군 또는 대조군당 3-5마리(n=3-5)의 동물이 필요하였다. 이러한 동물의 마릿수가 군들 사이에서 통계학적으로 유효하거나 관측상 중요한 비교를 위한 충분한 정보를 제공하였다. 대부분의 연구에서는 인플루엔자-양 징후가 발견될 수도 있지만, 가능성은 없다. 페렛은 식욕 감퇴 또는 체중 감소, 코 또는 눈 분비물과 같은 징후를 보이지 않았고; 인플루엔자-양 질병의 징후가 관찰되는 것이 연구의 필수 부분이고, 진통제와 같은 개입은 정당화되지 못했다. 불편함, 예로서, 아물질 않은 미란 또는 현저한 체중 감소와 같은 다른 징후들도 동물의 적절한 소인의 결과였고, 이후 주치 수의사와 함께 논의하였다.
본 발명은 특정 실시태양와 관련하여 개시되고 있지만, 본 발명의 진실된 정신 및 범주로부터 벗어남 없이 본 분야의 다른 기술자들에 의해 본 발명의 다른 실시태양 및 변형도 고안될 수 있다는 것은 명백하다. 첨부된 청구범위는 모든 그러한 실시태양들과 등가적인 변형도 포함하는 것으로서 해석되어야 한다. 예를 들면, 상기 기재된 모든 기술과 기기들은 다양하게 조합하여 사용될 수 있다. 각각의 개별 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류가 개별적으로 모든 목적으로 참고로 인용된다고 기재되어 있지만, 본 출원에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 또는 기타 서류는 동일한 정도로 모든 목적으로 그 전체가 참고로 인용된다. 추가로, 2004년 12월 23일 출원된 미국 가출원 번호 제60/638,166호, 및 2005년 1월 5일 출원된 미국 가출원 번호 제60/641,139호도 본 원에서 모든 목적으로 그 전체가 참고로 인용된다.

Claims (19)

  1. 세포주 MDCK(ATCC CCL34)의 유도체인 비-발암성 MDCK 세포를 포함하는 세포 배양 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 조성물이 혈청을 함유하지 않는 세포 배양 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 비-발암성 MDCK 세포가 부착성인 세포 배양 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비-발암성 MDCK 세포가 세포주 MDCK-S(ATCC PTA-6500)로부터 유도된 것인 세포 배양 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 비-발암성 MDCK 세포가 무혈청 배지에서 성장하도록 적응된 세포 배양 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 비-발암성 MDCK 세포가 MDCK-SF101(ATCC PTA-6501); MDCK-SF102(ATCC PTA-6502); 및 MDCK-SF103(PTA-6503)으로 구성된 군으로부터 선택되는 세포주로부터 유래한 것인 세포 배양 조성물.
  7. a. 제1항 또는 제6항의 세포 배양 조성물의 MDCK 세포를 감염시키는 단계;
    b. 상기 세포 배양 조성물을 항온배양하는 단계; 및
    c. 상기 세포 배양 조성물로부터 인플루엔자 바이러스를 분리시키는 단계를 포함하는, 인플루엔자 바이러스 생산 방법.
  8. 제7항에 있어서, MDCK 세포가 부착성인 방법.
  9. 제7항의 방법에 따라 생산된 인플루엔자 바이러스.
  10. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제 중 제9항의 인플루엔자 바이러스의 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물.
  11. 제10항의 면역원성 조성물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 인플루엔자 감염을 예방하는 방법.
  12. 제8항의 방법에 따라 생산된 인플루엔자 바이러스.
  13. MDCK-S(ATCC PTA-6500); MDCK-SF101(ATCC PTA-6501); MDCK-SF102(ATCC PTA- 6502); 및 MDCK-SF103(ATCC PTA-6503)으로 구성된 군으로부터 선택되는 비-발암성 MDCK 세포주.
  14. a. MDCK(ATCC CCL34) 세포를 규정 배지 및 혈청에서 성장하도록 적응시키는 단계;
    b. 배양 조건을 유지하는 단계; 및
    c. 세포 은행을 확립하는 단계를 포함하는, 혈청을 함유하는 배지에서 배양될 수 있고 인플루엔자 바이러스에 의해 감염될 수 있는, 부착성의 비-발암성 MDCK 세포주를 제조하는 방법.
  15. 제14항의 방법에 의해 제조된 세포주.
  16. a. MDCK(ATCC CCL34) 세포를, 지질을 포함하는 Taub의 SF 배지; 소맥 가수분해물을 포함하는 Taub의 SF 배지; 지질 및 소맥 가수분해물을 포함하는 Taub의 SF 배지; 지질, 소맥 가수분해물, 및 EGF를 포함하는 Taub의 SF 배지; 및 지질, 소맥 가수분해물, EGF, 트로폴론은 포함하되, 단, 트랜스페린은 포함하지 않는 Taub의 SF 배지로 구성된 군으로부터 선택되는 무혈청 배지에서 성장하도록 적응시키는 단계;
    b. 배양 조건을 유지하는 단계; 및
    c. 세포 은행을 확립하는 단계를 포함하는, 무혈청 배지에서 배양될 수 있고 인플루엔자 바이러스에 의해 감염될 수 있는, 부착성의 비-발암성 MDCK 세포주를 제조하는 방법.
  17. 제16항의 방법에 의해 제조된 세포주.
  18. MediV SF101; MediV SF102; MediV SF103; MediV SF104; 및 MediV SF105로 구성된 군으로부터 선택되는 배지 조제물.
  19. 제18항의 배지에서 동물 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물 세포의 비-발암성 성질을 유지시키는 방법.
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