CN101189326A - 用于病毒增殖的非致瘤性mdck细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供MDCK衍生的、新的黏着的非致瘤性细胞系，所述细胞系能在有或没有血清存在下生长。本发明细胞系可用于生产疫苗材料(例如，病毒)。更具体地说，本发明细胞系通常可用于生产流感病毒，特别是ca/ts流感病毒。本发明还提供使MDCK细胞适应和生长的方法和培养基制剂从而使其维持非致瘤性。此外，本发明提供用本发明新型细胞系生产疫苗材料(例如，流感病毒)的方法。

Description

用于病毒增殖的非致瘤性MDCK细胞系
发明领域
本发明涉及可用于制备疫苗材料的新型非致瘤性MDCK细胞。非致瘤性MDCK细胞能适应无血清培养基。本发明还涉及用于增殖非致瘤性MDCK细胞的培养基制剂和培养方法以及维持本发明此细胞系非致瘤性质的方法。本发明还涉及利用非致瘤性MDCK细胞进行细胞培养制备流感病毒的方法。本发明也涉及通过所述方法获得的病毒(例如，流感病毒)和含有该类病毒和/或其组分的免疫原性组合物。
发明背景
疫苗接种是预防每年流感流行所致疾病的最重要公共卫生手段。疫苗的有效应用取决于能否从稳定而容易地培养细胞而快速制备大量疫苗材料(例如，病毒)。快速开发疫苗及大量获得疫苗材料对抵御许多人和动物疾病至关重要。疫苗生产滞后及其产量不足可能导致不能控制疾病爆发。例如，近年的研究提出其原因关系到生产抗流感疫苗需要的前导时间很长。参见，例如Wood，J.M.，2001，Philos.Trans.R.Soc.Lond.B.Biol.Sci.，356：1953。有效的疫苗生产需要在高产宿主系统大量培养产生疫苗材料。为获得可接受的收率，不同疫苗材料需要不同的培养条件。可利用含胚蛋、原代组织培养细胞或在已建立的细胞系生产疫苗材料。然而，目前这些宿主系统有下述诸多局限性。
将含胚鸡蛋用于流感疫苗病毒生产通常是已知时间、劳动力和成本密集型加工方法，该方法需要控制鸡交配和鸡蛋受精。此外，对鸡蛋过敏的人禁用鸡蛋生产的流感疫苗，因为可能发生严重的超敏反应。因此，疫苗行业已努力开发了不利用鸡蛋的替代生产平台，例如在细胞培养系统中生产流感疫苗。
应用原代组织培养细胞受阻于开发和维持稳定的原代细胞群困难。常利用已建立的细胞系来克服原代细胞的技术局限性。然而，已知这些细胞系中许多有致瘤性，从而产生安全顾虑，用它们来生产疫苗显然受到管理制约。事实上，世界卫生组织的应用指南指出只有少数细胞系能用于疫苗生产。在细胞培养基中使用动物或人来源的血清和/或蛋白质添加剂也产生了其它问题。例如，熟知各批次添加剂之间在质量和组成上有差异以及污染支原体、病毒、BSE-因子和其它传染因子的风险。总之，血清或血清来源的物质，例如白蛋白、转铁蛋白或胰岛素可能包含有害物质从而污染培养物及其产生的生物学产品。因此，许多组织正试图开发无需血清或血清来源产品的有效宿主系统和培养条件。
因此，需要建立能以低成本、高安全性和稳定的方式(优选无血清或无动物蛋白的培养条件)生产疫苗材料的非致瘤性细胞系。这类细胞系统对生产流感疫苗材料特别有用。
Madin Darby狗肾(MDCK)细胞通常用于流感病毒滴定(Zambon M.，刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，Nicholson编，Webster and Hay，第22章，第291-313页，Blackwell Science，(1998))。1958年从正常的雄性考克斯班尼犬(cocker spaniel)的肾脏建建立了这些细胞。ATCC列出了为S.Madin和N.B.Darby保藏的MDCK(CCL 34)细胞系，然而MDCK细胞的其它许多谱系也可用。Leighton J及其同事出版了一系列证明MDCK细胞致癌特性的论文(Leighton等，1968，Science 163：472；Leighton等，1970，Cancer 26：1022和Leighton等，1971 Europ J.Cancer 8：281)。然而，用于这些研究的MDCK细胞谱系和传代次数未见描述，并且早已知道谱系和传代次数不同的MDCK细胞显示在染色体数目和结构上不同，这种不同可导致细胞具有致瘤特性(Gaush等，1966，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.，122：931)。
由于接受疫苗生产用细胞系的主要顾虑之一是关注那些细胞有无潜在的致癌作用，利用目前描述的细胞系来生产疫苗材料时MDCK细胞应用受限。Groner等(美国专利6,656,720)和Makizumi等(美国专利6,825,036)均声称发现了衍生自MDCK细胞的细胞系，这些细胞系适应在无血清培养基中悬浮生长并可用于生产流感病毒。然而，有报道说丧失了锚定需要与正常动物细胞转化为致瘤性细胞之间存在相关性(Stiles等，1976，Cancer Res.，36：3300)。几个团体(Kessler等，1999，Cell Culture Dev Biol Stand，98：13；Merten等，1999，Cell Culture Dev BiolStand，98：23和Tree等，2001，Vaccine，19：3444)声称描述了利用MDCK细胞大规模生产流感病毒；然而，他们未解决所用的MDCK细胞潜在的转化(为致癌性)作用。
本文引用或讨论的参考文献不应理解为承认这些文献是本发明的现有技术。此外，引用的专利不应理解为承认其有效。
发明概述
本发明提供适应在含血清或无血清培养基制剂，包括无动物蛋白(APF)制剂中生长的非致瘤性MDCK细胞系。在一个实施方式中，本发明的非致瘤性MDCK细胞是黏附细胞。在另一实施方式中，本发明的非致瘤性MDCK细胞具有上皮形态。在还有另一实施方式中，本发明的非致瘤性MDCK细胞是黏附细胞并具有上皮形态。在一个实施方式中，利用成年裸小鼠模型测定致瘤性(例如，Stiles等，1976，Cancer Res，36：1353和以下实施例2)。也可采用其它试验，例如通过注射入鸡胚胎和/或局部应用于绒毛膜尿囊来测试致瘤性(Leighton等，1970，Cancer，26：1024)。
可在本发明MDCK细胞中生长的病毒包括但不限于负链RNA病毒，包括但不限于：流感病毒、RSV、副流感病毒1、2和3以及人肺炎后病毒(metapneumovirus)。
本发明还提供用于产生和维持非致瘤性MDCK细胞的方法和培养基制剂。本发明MDCK细胞对生产疫苗材料，例如病毒特别有用。
本发明的其它方面包括通过在合适的培养基中，在能产生疫苗材料的条件下培养本发明任何MDCK细胞来产生疫苗材料(如病毒)以及从一种或多种宿主细胞或其所生长的培养基中分离该材料的方法。
免疫原性组合物也是本发明的特征。例如，免疫原性组合物包含上述产生的疫苗材料和任选的赋形剂，例如药学上可接受的赋形剂或一种或多种药学上可接受的给药组分。
本发明也包括通过给予对象有效量的一种或多种上述免疫原性组合物从而在该对象中产生免疫应答的方法。此外，通过给予有效量的一种或多种上述免疫原性组合物产生抵御病毒感染(例如，流感病毒)的免疫应答来预防性或治疗性治疗病毒感染的方法也是本发明的一部分。这种治疗的对象可以包括哺乳动物(例如，人)。此外，这些方法也可包括给予用本发明MDCK细胞生产的一种或多种病毒的组合物和药学上可接受的赋形剂，给予对象的用量能有效地预防性或治疗性治疗病毒感染。
阅读以下详述和附图后可更完全地明白本发明的这些和其它目的及特征。
附图简述
图1是细胞中流感毒株的生长情况。A图是显示荧光聚焦试验结果的照片，该试验比较了代表性ca/ts流感毒株在MDCK细胞和Vero细胞克隆(27F9)中的传染扩散情况。B图是流感毒株ca甲型/越南/1203/2004(H5N1)在MDCK细胞中的生长曲线。感染后48小时出现滴度高峰，约为8log10 TCID50/mL并在随后的3-4天维持稳定。
图2概述了用于衍生MDCK-S PreMCB的方法(代次编号57)。实施例2详述了该方法。
图3是显示MDCK-S细胞具有上皮样形态的照片。该照片拍摄自接种后3天。
图4是MDCK-S细胞在10％FBS DMEM培养基中的生长曲线。细胞具有约1天的延滞期，然后是指数生长期，接种后第四天进入稳定期，第5天达到约29×106个细胞的最高密度。
图5是MDCK-S细胞在10％FBS DMEM培养基中的葡萄糖消耗和乳酸产生的图片。对于葡萄糖和乳酸，延滞期的速率低，然后分别增加至2.93mM/天和3.43mM/天。
图6是MDCK-S细胞在10％FBS DMEM培养基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨产生的图片。谷氨酰胺消耗速率是0.49mM/天直至第4天，氨产生速率是0.32mM/天直至第5天。在该研究中谷氨酸未累积。
图7是100个分裂中期低传代(P61/4)和高传代(P81/24)MDCK-S细胞的染色体数目分布图。每个分裂中期的染色体计数范围是70-84，高传代和低传代细胞的众数(modal)染色体数目是78。
图8概述了用于衍生MDCK-T PreMCB的方法(代次编号64/5)。实施例3详述了该方法。
图9是显示MDCK-T细胞具有上皮样形态的照片。该照片拍摄自接种后3天。
图10是MDCK-T细胞在Taub培养基中的生长曲线。细胞没有延滞期，处于指数生长期直至接种后第4天进入稳定期。
图11是MDCK-T细胞在Taub培养基中葡萄糖消耗和乳酸产生的图片。在指数期葡萄糖和乳酸的速率分别是1.78mM/天和2.88mM/天。
图12是MDCK-T细胞在Taub培养基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨产生的图片。谷氨酰胺消耗速率是0.36mM/天直至第4天，氨产生速率以0.22mM/天的速率线性增加直至第7天。在该研究中谷氨酸未累积。
图13是100个分裂中期低传代(P61/4)和高传代(P81/24)MDCK-T细胞的染色体数目分布图。低传代细胞每个分裂中期(细胞)的染色体计数范围是52-82，高传代细胞是54-82。
图14是100个分裂中期MDCK-T、MDCK-SF101(代次71/9)和MDCK-SF102细胞(代次71/9)的染色体数目分布图。SF101和SF102细胞的众数染色体数是78，每个分裂中期SF101和SF102(细胞)的染色体计数范围分别是70-82和60-80。
图15是显示MDCK-SF103具有上皮样形态的照片。该照片拍摄自接种后3天。
图16是MDCK-SF103细胞在MediV SFM103中的生长曲线。细胞具有约1天的延滞期，然后是指数生长期，接种后第4天进入稳定期，第4天达到约17×106个细胞的最高密度。
图17是MDCK-SF103细胞在MediV SFM103培养基中葡萄糖消耗和乳酸产生的图片。在指数期葡萄糖消耗和乳酸产生彼此对映，乳酸浓度增加而葡萄糖浓度降低。
图18是MDCK-SF103细胞在MediV SFM103培养基中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨产生的图片。氨产生速率几乎以线性增加直至第7天。在该研究中谷氨酸未累积。
图19是87代100个分裂中期MDCK-SF103细胞的染色体数目分布图。SF103细胞的众数染色体数是78，染色体计数范围是66-80。
图20是生产规模的生长和纯化。A图是获自250mL转瓶中生长在Cytodex珠上的MDCK-SF103的几种疫苗重配株，乙型/维多利亚/504/2000(约8LogTCID50/mL)、甲型/悉尼/05/97(约7.85LogTCID 50/mL)和甲型/新喀里多尼亚/20/99(约8.2LogTCID 50/mL)的产量。B图概述了可用于疫苗材料的商品化规模生产的大规模细胞培养方法。
发明详述
本发明部分基于发现MDCK细胞可在培养条件下维持非致瘤性。本发明提供的非致瘤性细胞系，包括MDCK细胞系和其它类型的细胞，这些细胞能适应各种细胞培养条件(包括无血清培养基制剂)，它们在本文称为“本发明细胞”。此外，本发明提供包含本发明细胞和其它组分的细胞培养组合物，所述其它组分包括但不限于：培养基(例如，本文公开的培养基)、培养基组分、缓冲液、化合物、其它类型的细胞、病毒材料(例如，病毒基因组、病毒颗粒)和异源蛋白质。本发明也提供可用于培养非致瘤性细胞(包括MDCK细胞)的方法和培养基制剂，所述细胞具有多种具体特征，包括但不限于：非致瘤性细胞(例如，在裸小鼠中不会形成小结)和/或生长成为黏着细胞和/或具有上皮样形态和/或能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒(flavoviruses))复制。本发明的培养条件包括含血清和无血清的培养基制剂以及无动物蛋白(APF)制剂。此外，本发明也提供在非致瘤性细胞，包括MDCK细胞中产生疫苗材料(例如，流感病毒)、从非致瘤性细胞制备疫苗材料的方法和利用非致瘤性细胞产生的疫苗材料预防流感感染的方法。本发明细胞对在其它哺乳动物细胞系(例如，Vero、PerC6、HEK-293、MRC-5和WI-38细胞)中不能有效复制的冷适应/温度敏感/减毒(ca/ts/att)流感毒株(例如，
Figure A20058004800600091
中的那些)的生产特别有用。
细胞特征
在一个实施方式中，本发明的细胞是脊椎动物细胞。在另一实施方式中，本发明细胞是哺乳动物细胞，例如仓鼠、牛、猴或狗，特别是源自这些动物的肾细胞或细胞系。在还有另一实施方式中，本发明细胞是MDCK细胞(例如，源自ATCCCCL-34 MDCK)，在本文专门称为“本发明MDCK细胞”，术语“本发明细胞”包括它们。在一具体实施方式中，本发明细胞衍生自ATCC CCL-34 MDCK。本发明细胞可以采用本领域熟知的方法衍生自CCL-34 MDCK细胞。例如，CCL-34 MDCK细胞可以首先在含血清的培养基中(如Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖，或本文所述的其它培养基)传代有限次数，然后克隆各细胞并特征鉴定各克隆。选出具有优良生物学和生理特性(包括但不限于倍增时间、致瘤性情况和病毒产量)的克隆来产生原始细胞库(MCB)。一方面，本发明细胞适应在选择培养基中(例如，无血清或APF培养基，如本文所述的)生长。这种适应性可在克隆各细胞之前、同时或之后产生。在某些实施方式中，本发明细胞适应在MediV SF101、MediVSF102、MediV SF103、MediV SF104或MediV SF105中生长。本文将适应在这些培养基中生长的本发明细胞分别称为“MDCK-SF101、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105”细胞，统称为“MDCK-SF细胞”。在其它实施方式中，本发明细胞适应在含血清的培养基中(例如，Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)生长，本文将这种细胞称为“MDCK-S”细胞。术语“本发明细胞”和“本发明MDCK细胞”也包括MDCK-SF和MDCK-S细胞。
在本发明一具体实施方式中，这些细胞是以下细胞系，包括但不限于：由美国模式培养物保藏所(10801大学大街，马纳萨斯，弗吉尼亚.20110-2209)保藏并指定ATCC保藏号PTA-6500(2005年1月5日保藏)、PTA-6501(2005年1月5日保藏)、PTA-6502(2005年1月5日保藏)和PTA-6503(2005年1月5日保藏)的那些细胞，本文将这些细胞分别称为“MDCK-S、MDCK-SF101、MDCK-SF102、和MDCK-SF103”，统称为“本发明MDCK细胞”。这些保藏物按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的条款维持。在一个实施方式中，可利用本发明MDCK细胞产生用于制备美国食品与药品管理局批准的人用疫苗材料的细胞库。
通过传代和根据一种或多种具体特征选出了由细胞系MDCK(CCL 34)所衍生的细胞系MDCK-S、MDCK-SF101、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105，所述特征包括但不限于：能在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中生长为黏着细胞，具有上皮样形态、非致瘤性(例如，在裸小鼠中不会形成小结)和/或能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒)复制。在一个实施方式中，本发明MDCK细胞无致瘤性。本领域熟知测定细胞是否有致瘤性的方法(参见，例如Leighton等，1970，Cancer，26：1024和Stiles等，1976，Cancer Res，36：1353)，以下实施例2详述的美国食品与药品管理局目前首选的方法是利用裸小鼠模型。在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中无致瘤性(参见Stiles等，同上和以下实施例2)。在另一具体实施方式中，本发明MDCK细胞在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时无致瘤性(参见Leighton等，同上)。在还有另一实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中无致瘤性，但在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时有致瘤性。在还有另一实施方式中，本发明MDCK细胞在成年裸小鼠模型中和在注入鸡胚和/或局部应用于绒毛膜尿囊时均无致瘤性。在还有另一实施方式中，本发明MDCK细胞在培养基中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。在还有另一具体实施方式中，培养基是本文所述的培养基(例如，Medi SF103)。
可采用本领域技术人员已知的许多方法定量测定致瘤性。常规使用的一种方法是测定“TD50”值，其定义为诱导50％测试动物产生肿瘤所需的细胞数目(参见例如Hill R.The TD50 assay for tumor cells(肿瘤细胞的TD50试验).刊于：PottenC，Hendry J编，Cell clones(《细胞克隆》).，伦敦：Churchill Livingstone；1985.第223页)。在一个实施方式中，本发明MDCK细胞的TD50值介于约1010-约101、或介于约108-约103、或介于约107-约104。在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞的TD50值高于1010、或高于约109、或高于约107、或高于约106、或高于约105、或高于约104、或高于约103、或高于约102、或高于约101。
在另一实施方式中，本发明非致瘤性细胞能在含血清或无血清培养基或无动物蛋白培养基中生长为黏着细胞。在还有另一实施方式中，本发明非致瘤性细胞具有上皮样形态。在还有另一实施方式中，本发明MDCK细胞能支持各种病毒(包括但不限于正黏病毒、副黏病毒、弹状病毒和黄病毒)复制。认为本发明MDCK细胞可具有一种或多种具体特征的任意组合，包括但不限于：非致瘤性、生长成为黏着细胞、具有上皮样形态和能支持各种病毒复制。
认为本发明MDCK细胞的每一代和每次传代记录应足够详细，从而使得各细胞系都有完整谱系可用。每一代和每次传代的文件可能有助于美国食品与药品管理局和世界上其它管理机构批准使用本发明MDCK细胞来制备疫苗材料。
在另一实施方式中，本发明MDCK细胞无微生物污染(例如，细菌、病毒和真菌污染)。商业承包者(例如，Rockville，MD)可常规进行本领域熟知方法来检测细菌和真菌污染的存在。以下实施例2详述了公认的微生物除菌和支原体检验。要检验的微生物的具体例子见表6。
在还有另一实施方式中，本发明MDCK细胞能支持各种病毒复制，包括但不限于正黏病毒(包括流感A和/或B毒株)、副黏病毒(包括RSV A和/或B，人肺炎后病毒和副流感病毒1、2和/或3)、弹状病毒和黄病毒。在一具体实施方式中，本发明MDCK细胞能支持冷适应/温度敏感(ca/ts/att)流感病毒(例如，见于
Figure A20058004800600122
中的那些)(Belshe等，1998，N Engl J Med 338：1405；Nichol等，1999，JAMA 282：137；Jackson等，1999，Vaccine，17：1905)和/或包含这些病毒为骨架或包含具有以下一个或多个特征的流感病毒为骨架(或一个或多个vRNA区段)的重配病毒复制：冷适应的、减毒的和温度敏感的。细胞能支持病毒复制的一种指标是从受感染的细胞培养物中获得的病毒产量。可采用本领域技术人员已知的许多方法测定病毒产量。例如，可按照检测感染性病毒体的中值组织培养感染剂量(TCID50)试验测定样品中存在的病毒浓度来定量测定病毒产量。TCID50值经常表示成log10 TCID50/mL。在一个实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 TCID50/mL至少为6.0、或至少6.2、或至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0、或至少8.2、或至少8.4、或至少8.6、或至少8.8、或至少9.0、或至少9.2、或至少9.4、或至少9.6、或至少9.8。在另一实施方式中，本发明MDCK细胞支持流感病毒(例如，ca/ts毒株)复制可达到的log10 TCID50/mL至少为约6.0、或至少约6.2、或至少约6.4、或至少约6.6、或至少约6.8、或至少约7.0、或至少约7.2、或至少约7.4、或至少约7.6、或至少约7.8、或至少约8.0、或至少约8.2、或至少约8.4、或至少约8.6、或至少约8.8、或至少约9.0、或至少约9.2、或至少约9.4、或至少约9.6、或至少约9.8。
本领域技术人员应该知道，本发明细胞通常是细胞培养组合物的一部分。细胞培养组合物的组成可根据细胞和所需用途而不同。例如，对于培养目的，细胞培养组合物可包含本发明细胞与细胞生长的合适培养基。因此，本发明提供包含本发明细胞和其它组分的细胞培养组合物，所述其它组分包括但不限于：培养基(例如，本文公开的培养基)、培养基组分、缓冲液、化合物、其它类型的细胞、病毒材料(例如，病毒基因组、病毒颗粒)和异源蛋白质。在一个实施方式中，细胞培养组合物包含本发明细胞和培养基或其组分。细胞培养组合物中可能存在的培养基包括无血清培养基、含血清培养基和APF培养基。在一个实施方式中，细胞组合物包含本文公开的培养基(例如，MediV SF101、MediV SF102、MediV SF103、MediV SF104或MediV SF105)或其各组分。
方法和培养基制剂
本发明提供在含血清培养基中培养非致瘤性MDCK细胞的方法和培养基制剂。本发明也提供使非致瘤性MDCK细胞适应无血清培养基(包括APF培养基制剂)和随后在其中培养的方法。在本发明的某些方面，将培养基配制成能使培养的MDCK细胞保留以下一种或多种特征：非致瘤性、生长为黏着细胞，具有上皮样形态和能支持各种病毒复制。认为细胞培养组合物中可存在本文公开的培养基制剂或其组分。
本领域熟知含血清的培养基制剂。含血清培养基制剂包括但不限于：Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+胎牛血清(FBS)+谷氨酰胺+葡萄糖。在一个实施方式中，含血清培养基中存在的FBS浓度介于约1％-约20％之间，或介于约5％-约15％之间，或介于约5％-约10％之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的FBS浓度为10％。在另一实施方式中，含血清培养基中存在的谷氨酰胺浓度介于约0.5mM-约10mM之间，或介于约1mM-约10mM之间，或介于约2mM-约5mM之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的谷氨酰胺浓度是4mM。在还有另一实施方式中，含血清培养基中存在的葡萄糖浓度介于约1g/L-约10g/L之间，或介于约2g/L-约5g/L之间。在一具体实施方式中，含血清培养基中存在的葡萄糖浓度是4.5g/L。在还有另一实施方式中，含血清培养基制剂包含浓度介于约1％-约20％之间的FBS，浓度介于约0.5mM-约10mM之间的谷氨酰胺和浓度介于约1g/L-约10g/L之间的葡萄糖。在一具体实施方式中，含血清培养基制剂包括Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)+10％胎牛血清(FBS)+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖。DMEM不难从许多商业来源购得，包括例如Gibco/BRL(目录号11965-084)。FBS不难从许多商业来源购得，包括例如JRH Biosciences(目录号12107-500M)。虽然FBS是动物细胞培养基中最常用的添加剂，但本发明也包括常规使用的其它来源血清，包括新生小牛、马和人血清。
在一个实施方式中，通过在补加血清的化学成分明确的培养基中培养得自美国模式培养物保藏所(ATCC CCL34)的Madin Darby狗肾(MDCK)细胞衍生得到的本发明血清适应型非致瘤性MDCK-S细胞。在一具体实施方式中，如下所示，在补加血清的化学成分明确的培养基中扩增MDCK细胞(ATCC CCL34)来产生MDCK-S细胞系：视需要使MDCK(ATCC CCL34)细胞在补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中传代，从而获得足够的细胞来制备称为MDCK-S的冷冻前原始细胞库(PreMCB)。在另一具体实施方式中，采用以下实施例2所述的方法培养这些细胞。特别考虑从PreMCB小瓶再传代MDCK-S血清适应型细胞20次或更多次，并在成年裸小鼠体内模型中检验其致瘤性以及在核型试验中检验其核型。在某些实施方式中，将扩增的MDCK-S细胞皮下注射入成年裸小鼠不产生小结，其众数染色体数目为78，染色体数目的范围不超过约60-88，或不超过约65-85，或不超过约65-80或不超过约70-85。在一个实施方式中，MDCK-S细胞在培养基(例如，本文所述培养基)中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。
本领域技术人员应知道在组织培养应用中使用血清或动物提取物可能有缺点陷(Lambert，K.J.等，刊于：Animal Cell Biotechnology(《动物细胞生物技术》)，第1卷，Spier，R.E.等编，Academic Pres，纽约，第85-122页(1985))。例如，即使来自同一生产商，这些添加剂的化学组成在批次之间可能不同。此外，动物或人源的添加剂也可能污染了外来物质(例如，支原体、病毒和朊病毒)。当细胞培养基制剂利用这些受污染的添加剂时，这些物质可严重破坏所培养细胞的健康状况。此外，当将受外来物质污染的培养物所产生的物质用于细胞治疗和其它临床应用时，这些物质可能造成健康风险。主要的担心是存在的朊病毒会在动物中导致海绵状脑病和在人中导致克-雅病(Creutzfeld-Jakob disease)。因此，本发明还提供无血清的培养基制剂。
本发明的无血清培养基制剂包括但不限于：MediV SF101(Taub+植物水解物)、MediV SF102(Taub+脂质)、MediV SF103(Taub+脂质+植物水解物)、MediVSF104(Taub+脂质+植物水解物+生长因子)和Medi SF105(除了用柠檬酸铁铵/托酚酮或硫酸铁铵/托酚酮替代转铁蛋白外与MediV SF104相同)。特别考虑的Taub的SF培养基(Taub和Livingston，1981，Ann NY Acad Sci.，372：406)是补加以下物质的DMEM和Ham的F12 50∶50混合物∶激素、5μg/mL胰岛素、5μg/mL转铁蛋白、25ng/mL前列腺素E1、50nM氢化可的松、5pM碘塞罗宁、10nMNa2SeO3、4.5g/L葡萄糖、2.2g/L NaHCO3和4mM L-谷氨酰胺。本文也将Taub的SF培养基称为Taub培养基或简称为“Taub”。
植物水解物包括但不限于一种或多种以下植物的水解物：玉米、棉籽、豌豆、大豆、麦芽、马铃薯和小麦。可采用酶水解制备的植物水解物，通常含有肽、游离氨基酸和生长因子的混合物。植物水解物不难购自许多商业来源，包括例如MarcorDevelopment、HyClone和Organo Technie。也考虑可利用酵母水解物替代植物水解物或与之联用。酵母水解物不难购自许多商业来源，包括例如Sigma-Aldrich、USB Corp、Gibco/BRL和其它公司。
可用于补加培养基的脂质包括但不限于：化学成分明确的动物和植物衍生的脂质添加剂以及合成衍生的脂质。脂质添加剂中可能存在的脂质包括但不限于：胆固醇、饱和和/或不饱和脂肪酸(例如，花生四烯酸、亚油酸、亚麻酸、肉豆蔻酸、油酸、棕榈酸和硬脂酸)。脂质添加剂的100×储液中胆固醇的浓度可以介于0.10mg/ml-0.40mg/ml之间。脂质添加剂的100×储液中脂肪酸的浓度可以介于1μg/ml-20μg/ml之间。适合于培养基制剂的脂质不难购自许多商业来源，包括例如HyClone、Gibco/BRL和Sigma-Aldrich。
在一个实施方式中，Taub培养基补加了植物水解物，其终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了小麦水解物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物。本发明提供在本文中称为MediV SFM 101的无血清培养基，其包含补加了终浓度为2.5g/L小麦水解物的Taub培养基。
在另一实施方式中，Taub培养基补加的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少200％、或至少300％。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了化学成分明确的脂质混合物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加的化学成分明确的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的100％(例如，购自生产商的100×储液可加入培养基中至终浓度为1×)。本发明提供在本文中称为MediV SFM 102的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加的化学成分明确的脂质混合物终浓度为生产商推荐终浓度的100％。
在还有另一实施方式中，Taub培养基补加了植物水解物和脂质混合物，其中所述植物水解物的终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，脂质混合物的终浓度为生产商推荐浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。在一具体实施方式中，Taub培养基补加了小麦水解物和化学成分明确的脂质混合物。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物。本发明提供在本文中称为MediV SFM 103的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物。
在还有另一实施方式中，Taub培养基补加了生长激素。可用的生长激素包括但不限于：表皮生长因子(EGF)、胰岛素生长因子(IGF)、转化生长因子(TGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)。在一具体实施方式中，所述生长因子是表皮生长因子(EGF)。在一个实施方式中，Taub培养基补加的生长因子终浓度介于约0.1-约50.0ng/ml之间、或介于约0.5-约25.0ng/ml之间、或介于约1.0-约20ng/ml之间、或介于约5.0-约15.0ng/ml之间、或介于约8ng/ml-约12ng/ml之间。在一具体实施方式中，Taub培养基补加的EGF的终浓度是约10ng/ml。在还有其它实施方式中，Taub培养基补加了生长因子、植物水解物和脂质混合物，其中所述生长因子的终浓度介于约0.1-约50.0ng/ml之间、或介于约0.5-约25.0ng/ml之间、或介于约1.0-约20ng/ml之间、或介于约5.0-约15.0ng/ml之间、或介于约8ng/ml-约12ng/ml之间，所述植物水解物的终浓度为至少0.5g/L、或至少1.0g/L、或至少1.5g/L、或至少2.0g/L、或至少2.5g/L、或至少3.0g/L、或至少5.0g/L、或至少10g/L、或至少20g/L，所述脂质混合物的终浓度为生产商推荐浓度的至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少125％、或至少150％、或至少175％、或至少200％。在另一具体实施方式中，Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物及终浓度约10ng/ml的EGF。本发明提供在本文中称为MediV SFM 104的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物和终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物及终浓度约10ng/ml的EGF。
本领域技术人员也应知道制备用于生产疫苗的病毒可能需要无动物蛋白的培养基制剂。因此，在某些实施方式中，用无动物的衍生物替代本文公开的无血清培养基(例如，MediV SF101、MediV SF102、MediV SF103、MediV SF104和MediSF105)中一种或多种或所有的动物来源的成分。例如，利用可商品化购得的非动物来源重组胰岛素(例如，Biological Industries目录号01-818-1)替代动物来源的胰岛素。类似地，可利用铁结合试剂(参见例如美国专利5,045,454；5,118,513；6,593,140和PCT公布号WO 01/16294)替代动物来源的转铁蛋白。在一个实施方式中，本发明无血清培养基制剂含有托酚酮(2-羟基-2，4，6-环庚三烯-1)和铁来源(例如，柠檬酸铁铵、硫酸铁铵)替代转铁蛋白。例如，该培养基中托酚酮或托酚酮衍生物与铁的摩尔浓度相比可过量，摩尔比约为5比1到约70比1，或约10比1到约70比1。因此，当该培养基中铁浓度约为0.3μM时，所用托酚酮或其衍生物的浓度约为1.5μM-约20μM，例如约3μM-约20μM。铁可以亚铁或铁离子存在，例如在该培养基中使用简单或络合的铁盐，如硫酸亚铁、氯化铁、硝酸铁或者特别是柠檬酸铁铵。本发明提供在本文中称为MediV SFM105的无血清培养基，其包含的Taub培养基补加了终浓度为2.5g/L的小麦水解物、终浓度为生产商推荐终浓度的100％的化学成分明确的脂质混合物和终浓度约10ng/ml的EGF及比例介于10比1到70比1之间的柠檬酸铁铵∶托酚酮或硫酸铁铵∶托酚酮。
在一个实施方式中，通过在补加血清的化学成分明确的培养基中传代得自美国模式培养物保藏所(ATCC CCL34)的Madin Darby狗肾(MDCK)细胞至少一次，然后在无血清培养基，例如上述的无血清培养基中传代而衍生得到适应无血清的MDCK-SF101、MDCK-SF102、MDCK-SF103、MDCK-SF104和MDCK-SF105非致瘤性细胞(在本文中统称为MDCK-SF)。在一具体实施方式中，如下所示，使MDCK细胞(ATCC CCL34)适应无血清培养基来产生MDCK-SF细胞系：MDCK(ATCC CCL34)细胞在补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)中传代至少一次，然后在无血清培养基中传代。然后视需要使MDCK-SF细胞在无血清培养基中传代以获得足够的细胞来制备冷冻前原始细胞库(PreMCB)。在某些实施方式中，这些细胞在含血清培养基(例如，补加了胎牛血清(10％v/v)、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM))中传代1-5次、或4-10次、或9-20次、或20次以上，然后在无血清培养基(例如，MediV SF101、MediV SF102、MediV SF103、MediV SF104和Medi SF105)中传代。
特别考虑从PreMCB小瓶再传代MDCK-SF适应无血清的细胞20次或更多次，并在成年裸小鼠体内模型中检验其致瘤性以及在核型试验中检验其核型。在某些实施方式中，将扩增的MDCK-SF细胞皮下注射入成年裸小鼠时不产生小结和/或其众数染色体数目为78。在另一实施方式中，扩增的MDCK-SF细胞的众数染色体数目为78，染色体数目的范围不超过约60-约88，或不超过约65-约85，或不超过约65-80或不超过约70-约85。在一个实施方式中，MDCK-SF细胞在培养基(例如，本文所述培养基)中传代至少20代、或至少30代、或至少40代、或至少50代、或至少60代、或至少70代、或至少80代、或至少90代、或至少100代后无致瘤性。
在一个实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是MediVSF101。在另一实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是MediV SF102。在还有另一实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是MediV SF103。在还有另一实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是MediV SF104。在另一实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是MediV SF105。在还有另一实施方式中，用于衍生得到MDCK-SF细胞的无血清培养基是APF培养基。考虑本文所述培养基的配制除去动物蛋白。例如，可用非动物来源的重组转铁蛋白替代牛转铁蛋白。
培养条件
本发明提供在含血清和无血清培养基制剂(同上)中培养MDCK细胞(最好无致瘤性)和其它动物细胞(致瘤性或非致瘤性)的方法。特别考虑了其它培养条件也可能在维持MDCK-S和MDCK-SF细胞处于非致瘤状态中起作用。这些培养条件包括但不限于：选择黏着表面、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、溶氧含量和pH。
特别考虑了本领域技术人员可采用许多方式改进培养条件来优化本发明MDCK细胞的生长。这种改进也可导致病毒材料(例如，病毒)产量提高，或者本领域技术人员可改进培养条件来优化本发明MDCK细胞的疫苗材料产量，而不考虑细胞生长。这些培养条件包括但不限于：黏着表面、细胞密度、温度、CO2浓度、培养方法、溶氧含量和pH。
在一个实施方式中，将本发明MDCK细胞在所附着表面培养为黏着细胞。本领域熟知组织培养细胞能生长在黏着表面上。黏着表面包括但不限于：经修饰的聚苯乙烯塑料表面、蛋白质包被表面(例如，纤连蛋白和/或胶原包被玻璃/塑料)以及各种商品化购得的微载体(例如，DEAE-葡聚糖微载体珠，如Dormacell，Pfeifer& Langen；Superbead，Flow Laboratories；苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如Hillex、SoloHill、Ann Arbor)。微载体珠是能为每份体积的黏着细胞生长提供大表面积的小球(直径100-200微米)。例如，1升培养基可容纳超过2千万个微载体珠，从而能提供超过8000cm2的生长表面。本领域技术人员可根据培养本发明MDCK细胞所用的方法决定黏着表面的选择。本发明方法中可用的合适培养容器均是本领域技术人员已知的那些容器，例如，转瓶、滚瓶(roller bottle)、发酵罐或生物反应器。对于病毒的商业生产，例如疫苗生产，常需要在生物反应器或发酵罐中培养细胞。生物反应器可用容积从1升以下到100升以上，例如Cyto3生物反应器(Osmonics，Minnetonka，MN)；NBS生物反应器(NewBrunswick Scientific，Edison，新泽西)；B.Braun Biotech International的实验室和商业规模生物反应器(B.Braun Biotech，Melsungen，德国)。
在一个实施方式中，可用分批培养系统培养作为黏着细胞的本发明MDCK细胞。在还有另一实施方式中，可用灌注培养系统培养作为黏着细胞的本发明MDCK细胞。对于生产疫苗材料(例如，病毒)，特别考虑用灌注培养系统培养本发明MDCK细胞(例如，在搅拌式容器发酵罐中利用本领域技术人员已知的细胞保留系统，例如离心、过滤、旋转过滤器等)。
在一个实施方式中，在CO2浓度至少为1％、或至少为2％、或至少为3％、或至少为4％、或至少为5％、或至少为6％、或至少为7％、或至少为8％、或至少为9％、或至少为10％、或至少为20％下培养本发明MDCK细胞。
在一个实施方式中，在培养本发明MDCK细胞期间优选将溶氧(DO)浓度(pO2值)范围调节为介于5％-95％(根据空气饱和)之间，或介于10％-60％之间。在一具体实施方式中，溶氧(DO)浓度(pO2值)为至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少50％、或至少60％。
在另一实施方式中，在培养期间将用于培养本发明MDCK细胞的培养基pH范围调节为pH6.4-pH8.0，或pH6.8-pH7.4。在一具体实施方式中，培养基pH为至少6.4、或至少6.6、或至少6.8、或至少7.0、或至少7.2、或至少7.4、或至少7.6、或至少7.8、或至少8.0。
在还有一实施方式中，在温度25℃-39℃培养本发明MDCK细胞。特别考虑了培养温度可按照所需方法而不同。例如，对于细胞增殖，可以在37℃培养本发明MDCK细胞，对于生产疫苗材料(例如，病毒)，可以在较低温度(例如，25℃-35℃)培养。在另一实施方式中，为生产疫苗材料，在低于30℃、或低于31℃、或低于32℃、或低于33℃、或低于34℃温度培养细胞。在另一实施方式中，为生产疫苗材料，在30℃、或31℃、或32℃、或33℃、或34℃温度培养细胞。
为生产疫苗材料(例如，病毒)，特别考虑了在易于更换培养基(的条件下)培养本发明MDCK细胞(例如，灌注系统)。可将细胞培养至极高细胞密度，例如介于1×106和25×106个细胞/mL之间。在培养本发明MDCK细胞期间，应能方便地操控培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸的含量以及pH和pO2值与本领域技术人员已知的其它参数，例如搅拌速率，从而能优化细胞密度和/或病毒生产。
生产疫苗材料(例如，病毒)
本发明提供在细胞培养物中生产病毒的方法(下文称为“本发明方法”)，此法利用了本发明MDCK细胞。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤：
i)在培养基中增殖本发明MDCK细胞；
ii)用病毒感染这些细胞；和
iii)再一阶段培养阶段后，分离在非致瘤性细胞中复制的病毒。
在一个实施方式中，本发明MDCK细胞在步骤(i)中增殖为黏着细胞。在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞可以在任何培养基中培养，包括但不限于上述那些。在某些实施方式中，在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞可以在无血清的培养基中培养，例如MediV-SF101、MediV-SF102、MediV-SF103、MediV-SF104、MediV-SF105和其APF制剂。在该方法(实施)期间，本发明MDCK细胞任选在含血清的培养基中培养(例如，DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)。上文详述了其它培养条件，例如温度、pH、pO2、CO2浓度和细胞密度。为增殖用于生产病毒的本发明MDCK细胞，本领域技术人员可组合各培养条件。
在一个实施方式中，用病毒感染前，细胞增殖的温度介于22℃-40℃之间。在某些实施方式中，用病毒感染前，细胞增殖的温度低于39℃、或低于38℃、或低于37℃、或低于36℃、或低于35℃、或低于34℃、或低于33℃、或低于32℃、或低于30℃、或低于28℃、或低于26℃、或低于24℃。在该方法的一个实施方式中，利用本领域技术人员已知的细胞保留系统，例如离心、过滤、旋转过滤器等、微载体等在灌注系统，例如搅拌式容器发酵罐中进行细胞增殖培养(步骤(i))。
在此情况中，细胞增殖1-20天、或3-11天。在此期间进行培养基替换，每天从0增加至约1-5个发酵罐体积。细胞以此方式增殖至高细胞密度，例如高达至少1×106-25×106个细胞/mL。培养期间，可通过细胞计数、培养基中葡萄糖、谷氨酰胺或乳酸含量和通过本领域技术人员已知的其它参数调节灌注系统中的灌注速率。或者，可以分批方法培养本发明方法步骤(i)的细胞。
在本发明方法的一个实施方式中，在培养期间，可如上所述采用本领域技术人员已知的方法调节步骤(i)所用培养基的pH、pO2值、葡萄糖浓度和其它参数。
在另一实施方式中，用约0.0001-约10、或约0.0005-约5、或约0.002-约0.5m.o.i.(感染复数)的病毒感染细胞。在还有另一实施方式中，用0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5m.o.i.(感染复数)的病毒感染细胞。感染后，进一步培养感染的细胞培养物以复制细胞，特别是直至能检测到最大致细胞病变效应或最大病毒抗原含量。在一个实施方式中，感染后在介于22℃-40℃之间的温度培养细胞。在某些实施方式中，用病毒感染后，在低于39℃、或低于38℃、或低于37℃、或低于36℃、或低于35℃、或低于34℃、或低于33℃、或低于32℃、或低于30℃、或低于28℃、或低于26℃、或低于24℃的温度培养细胞。在另一实施方式中，用病毒感染后，在低于33℃的温度培养细胞。在另一实施方式中，用病毒感染后，在31℃的温度培养细胞。在某些实施方式中，培养细胞2-10天。可以在灌注系统中或任选以分批方法进行培养。
进而在如上所述维持pH和pO2值(的条件下)进行病毒感染后细胞的培养(步骤(iii))。在所述方法步骤(iii)的细胞培养或病毒复制期间，也可以用新鲜制备的培养基、培养基浓缩液或成分(例如氨基酸、维生素、脂质组分、磷酸等)明确的培养基替换细胞培养基来优化抗原产量。可在几天中进一步加入培养基或培养基浓缩液来缓慢稀释细胞，或者可在用培养基或培养基浓缩液进一步灌注期间培育细胞。在此情况中，进而可通过细胞计数、培养基中葡萄糖、谷氨酰胺、乳酸或乳酸脱氢酶含量或本领域技术人员已知的其它参数来调节灌注速率。也可以联用灌注系统与分批方法。
在所述方法的一个实施方式中，感染后经过充分时间，例如2-10天、或任选3-7天获得合适病毒产量后，进行所生产病毒的收集和分离(步骤(iii))。在所述方法的一个实施方式中，在感染2天、或3天、或4天、或5天、或6天、或7天、或8天、或9天、或10天后收集和分离所生产的病毒(步骤(iii))。
可在本发明MDCK细胞中生产的病毒包括但不限于动物病毒，包括正粘病毒科、副粘病毒科、披膜病毒科、疱疹病毒科、弹状病毒科、逆转录病毒科、呼肠孤病毒科、黄病毒科、腺病毒科、小RNA病毒科、沙粒病毒科和痘病毒科。
近年来也开发了用于在细胞培养物中生产流感病毒的系统(参见，例如Furminger.刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，Nicholson，Webster和Hay编，第324-332页，Blackwell Science(1998)；Merten等，刊于Novel Strategiesin The Design and Production of Vaccines(《疫苗设计和生产的新策略》)，Cohen和Shafferman编，第141-151页，Kluwer Academic(1996))。这些方法通常包括用选择的病毒株感染合适的无限增殖宿主细胞。虽然消除了在鸡蛋中生产疫苗有关的许多困难，但不是所有致病流感毒株均能按照已建立的组织培养方法良好培养并生产。此外，在采用已建立方法的组织培养中，具有所需特征(例如减毒、温度敏感性和冷适应)的适合于生产减毒活疫苗的许多毒株培养并不成功，特别是在商品化规模。
本发明提供几种非致瘤性MDCK细胞系，这些细胞系已适应在含血清或无血清培养基中生长，在培养时能支持病毒(包括但不限于流感病毒)复制。这些细胞系适用于在细胞培养物中经济地复制用作疫苗材料的病毒。本发明MDCK细胞特别可用于生产用其它已建立细胞系(参见，下文实施例1)培养不佳的冷适应、温度敏感的(ca/ts)流感病毒株(例如，
Figure A20058004800600231
中发现的流感病毒株)。此外，可用本发明MDCK细胞生产在含胚鸡蛋中培养的流感病毒株，例如可在人中致病的禽流感病毒(例如，“流行”毒株)。
可采用本发明方法在本发明MDCK细胞中生产的流感病毒包括但不限于：将选择的血凝素和/或神经氨酸酶抗原掺入减毒、温度敏感、冷适应的(ca/ts)原始毒株的重配病毒。例如，这些病毒可包含如温度敏感(ts)、冷适应(ca)或减毒(att)的原始毒株(例如，甲型/Ann Arbor/6/60、乙型/Ann Arbor/1/66、PR8、乙型/列宁格勒/14/17/55、乙型/14/5/1、乙型/USSR/60/69、乙型/列宁格勒/179/86、乙型/列宁格勒/14/55、乙型/英格兰/2608/76等)中一种或多种的骨架(或一个或多个vRNA区段)。本领域已知在鸡蛋或细胞系中生产重配流感疫苗毒株的方法，包括Kilbourne，E.D.刊于Vaccines(《疫苗》)(第2版)，Plotkin和Mortimer编，WB Saunders Co.(1988)和PCT申请PCT专利公布号WO 05/062820和WO03/091401所公开的那些方法。可采用本发明方法在本发明MDCK细胞中生产的其它流感病毒包括能表达异源基因产物的重组流感病毒，参见例如美国专利公布号2004/0241139和2004/0253273。
在一个实施方式中，如上所述使这些细胞增殖(步骤(i))，然后用流感病毒感染这些细胞(步骤(ii))。在某些实施方式中，以0.0001-10、或0.0005-5、或0.002-0.5的m.o.i.(感染复数)进行感染。在其它实施方式中，以约0.0001-约10、或约0.0005-约5、或约0.002-约0.5的m.o.i.(感染复数)进行感染。任选加入蛋白酶来切割血凝素[HA0]的前体蛋白，从而使病毒吸附到细胞上。按照本发明，可在用流感病毒感染细胞(步骤(ii))之前、同时或之后不久加入蛋白酶。如果在感染同时加入蛋白酶，可将其直接加入待感染的细胞培养物中，或者作为浓缩液与病毒接种物一起加入。在本发明的某些方面，所述蛋白酶是丝氨酸蛋白酶、或半胱氨酸蛋白酶或天冬酰胺蛋白酶。一个实施方式利用胰蛋白酶。一具体实施方式利用TPCK-处理的胰蛋白酶。
在一个实施方式中，向细胞培养物中加入胰蛋白酶最高至终浓度为1-5000mU/ml，或5-1000mU/ml，或100-500mU/ml。在另一实施方式中，向细胞培养物中加入胰蛋白酶最高至培养基中终浓度为1-200μg/ml，或5-50μg/ml，或5-30μg/ml。在本发明方法步骤(iii)的感染细胞的进一步培养期间，以分批方法为例可通过加入新鲜的胰蛋白酶以再活化胰蛋白酶，或者以灌注系统为例中可通过连续加入或间歇加入胰蛋白酶溶液以再活化胰蛋白酶。
感染后，进一步培养感染的细胞培养物以复制病毒，特别是直至能检测到最大致细胞病变效应或最大病毒和/或病毒抗原含量。在某些实施方式中，培养细胞2-10天。进而可在灌注系统中或任选以分批方法进行培养。在另一实施方式中，用流感病毒感染后，在25℃-36℃、29℃-34℃的温度培养细胞。在低于33℃的温度，特别是在上述温度范围培养受感染的细胞能导致某些流感病毒，例如乙型毒株产量较高。此外，考虑在低于35℃培养受感染的细胞能产生温度敏感、冷适应(ts/ca)的流感病毒。考虑ts/ca病毒也可以是减毒的(att)。在另一实施方式中，在低于30℃、或低于31℃、或低于32℃、或低于33℃、或低于34℃的温度培养细胞来产生ts/ca流感病毒株。在一具体实施方式中，在31℃的温度培养细胞来产生乙型流感病毒毒株。
用流感病毒感染后进行上述细胞培养(步骤(iii))。
在所述方法的一个实施方式中，感染后经过充分时间，例如2-10天、或3-7天以产生合适病毒产量后，进行所产生流感病毒的收集和分离(步骤(iii))。通常从受感染细胞生长的培养基中回收病毒。一般先澄清原始培养基，再浓缩流感病毒。常规方法包括过滤、超滤、吸附到硫酸钡上并洗脱以及离心。例如，首先可通过离心(例如1000-2000×g)足够时间(例如，10-30分钟直接)除去细胞碎片和其它大的颗粒物质以澄清受感染培养物的原始培养基。或者，培养基可经0.8μm醋酸纤维素膜过滤器过滤以除去完整的细胞和其它大的颗粒物质。然后可任选离心(例如，15,000×g，约3-5小时)澄清的培养上清液以沉淀流感病毒。将病毒沉淀物重悬于合适的缓冲液，例如STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或pH7.4的磷酸缓冲盐水(PBS)后，可利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心浓缩病毒。无论连续或分梯度离心(例如将介于12％-60％之间的蔗糖梯度分成四个12％步骤)均合适。以某梯度离心的速度和时间应使病毒浓缩成可回收的可见条带。或者，对于最大规模的商品化应用，利用以连续方式操作的区带离心机转头进行密度梯度离心淘选病毒。足以指导技术人员从组织培养物中制备流感病毒的其它细节见，例如Furminger，刊于Textbook of Influenza(《流感教材》)，第324-332页，Nicholson等编；Merten等，刊于Novel Strategies in Design and Production of Vaccines(《疫苗设计和生产的新策略》)，第141-151页，Cohen和Shafferman编；和美国专利号5,690,937。如果需要，可在有稳定剂，例如蔗糖-磷酸盐-谷氨酸(SPG)存在下-80℃保存回收的病毒。
在所述方法的某些实施方式中，用
Figure A20058004800600251
或其它非特异性内切酶处理病毒。
Figure A20058004800600252
处理任选在收集和分离所产生流感病毒(步骤(iii))之前进行。在所述方法的其它实施方式中，
Figure A20058004800600253
处理后澄清病毒材料。用于澄清的方法包括但不限于：直接流动过滤(direct flow filtration)(DFF)。收集和分离所产生流感病毒(步骤(iii))可用的其它步骤包括但不限于：正切线流过滤(TFF)、亲和层析以及离子交换层析和/或羟基磷灰石层析。其它步骤示范于下文实施例章节。
疫苗组合物和用法
本发明还涉及通过本发明方法获得的病毒(例如，流感病毒)。可采用已知方法配制这些病毒从而提供用于给予人或动物的疫苗。这些病毒可以完整的病毒颗粒(例如，减毒的活病毒)或灭活/裂解的病毒(例如，用洗涤剂或甲醛处理的)存在。可任选采用本领域技术人员已知的方法分离病毒的确定病毒组分(例如，蛋白质)用于制备疫苗。
配制完整的病毒颗粒(例如，减毒的活病毒)可包括其它步骤，包括但不限于通过过滤将缓冲液替换为最终制剂，然后进行灭菌步骤。用于这种制剂的缓冲液三加入油其它氨基酸赋形剂，例如精氨酸的200mM蔗糖和pH7.0-7.2的磷酸盐或组氨酸缓冲液。在某些实施方式中，加入能稳定蛋白质的水解物，例如猪明胶。在某些实施方式中，本发明最终病毒溶液/疫苗包含活病毒，该活病毒的液体形式可稳定足够时间从而能在整个流感疫苗接种季节(例如，在北半球约从9月到3月)“现场”保存(例如，在2-8℃、4℃、5℃等冷藏销售和商品化)。因此，需要病毒/疫苗组合物能在整个保存期间保留其效力或其效力丧失速度可接受。在其它实施方式中，这种溶液/疫苗的液体形式能在约2℃-约8℃(例如冷藏温度)稳定。例如，配制冷藏稳定的减毒流感疫苗的方法和组合物描述于2005年10月4日提交的PCT专利申请PCT/US2005/035614，也参见PCT公布WO05/014862。可任选采用喷雾干燥(一种在干热空气流下将制剂料液喷雾雾化成细小液滴的快速干燥方法)来延长疫苗制剂的保存时间。细小液滴蒸发得到溶质构成的干粉(参见，例如美国专利公布2004/0042972)。本领域熟知制备和配制疫苗组合物的灭活/裂解的病毒颗粒的方法，这些方法已用了超过40年。
通常可预防性给予合适载体或赋形剂制备的病毒或病毒组分来刺激对一种或多种病毒毒株特异的免疫应答。载体或赋形剂一般是药学上可接受的载体或赋形剂，例如无菌水、盐水溶液、缓冲盐水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇或它们的组合。可按照本领域已建立的方法制备这种确保无菌、pH、等渗性和稳定性的溶液。通常要选择载体或赋形剂以尽可能降低过敏和其它不良作用，以及配合具体给药途径，例如皮下、肌肉内、鼻内等。
用于病毒的预防性给药的制剂也任选含有一种或多种佐剂以提高针对流感抗原的免疫应答。合适的佐剂包括：皂苷，矿物凝胶，例如氢氧化铝，表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油或烃乳液，卡介菌(BCG)，短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)和合成佐剂QS-21及MF59。
疫苗制剂的给予量通常应足以刺激对流感病毒的一种或多种毒株的特异性免疫应答。给予病毒最好能引发保护性免疫应答。本领域技术人员已知引发抗一种或多种病毒株的保护性免疫应答的剂量和方法。例如，灭活流感病毒的范围是约1-1000 HID50(人感染剂量)，即每份给予的剂量约105-108pfu(噬斑形成单位)。或者，不用佐剂时给予约10-50μg，例如约15μg HA，使用佐剂时给予的剂量较低。一般可在该范围内根据，例如年龄、身体状况、体重、性别、饮食、给药时间和其它临床因素调节该剂量。可全身性给予预防性疫苗制剂，例如通过针头和注射器或无针注射装置的皮下或肌肉内注射。或者，鼻内给予疫苗制剂，可利用滴剂、大颗粒气溶胶(大于约10微米)或喷入上呼吸道。虽然任何上述递送途径能导致保护性全身免疫应答，但鼻内给药能赋予在流感病毒进入部位引发粘膜免疫力的额外优点。对于鼻内给药，优选减毒的活病毒疫苗，例如减毒的冷适应和/或温度敏感的重组或重配流感病毒。虽然优选用一次剂量刺激保护性免疫应答，但也可通过同一或不同途径给予再次剂量来实现所需保护作用。这些方法可适合于任何病毒，包括但不限于正黏病毒(包括甲型和乙型流感病毒)、副黏病毒(包括RSV、人肺炎后病毒和副流感病毒)、弹状病毒和黄病毒。
流感病毒
本文的方法、工艺和组合物主要涉及制备流感病毒疫苗。流感病毒由含分区段单链RNA基因组的内部核蛋白核心和由基质蛋白相连的脂蛋白外膜构成。甲型流感病毒和乙型流感病毒各含有单链负RNA的8个区段。甲型流感病毒基因组编码11种多肽。区段1-3编码构成RNA依赖性RNA聚合酶的3种多肽。区段1编码聚合酶复合体蛋白PB2。区段2和3分别编码其余的聚合酶蛋白PB1和PA。此外，一些流感病毒株的区段1编码PB1编码区内的另起读框产生的小蛋白，PB1-F2。区段4编码参与感染期间细胞附着和进入的血凝素(HA)表面糖蛋白。区段5编码核衣壳核蛋白(NP)多肽，病毒RNA有关的主要结构组分。区段6编码神经氨酸酶(NA)被膜糖蛋白。区段7编码从另路剪接的mRNA翻译的两种基质蛋白，称为M1和M2。区段8编码从另路剪接的mRNA变体翻译的两种非结构蛋白，NS1和NS2。
乙型流感病毒的8个基因组区段编码11种蛋白质。3个最大的基因编码RNA聚合酶的组分，PB1、PB2和PA。区段4编码HA蛋白。区段5编码NP。区段6编码NA蛋白和NB蛋白。NB和NA两种蛋白均从双顺反子(biscistronic)mRNA的重叠读框翻译。乙型流感病毒的区段7也编码两种蛋白：M1和M2。最小的区段编码两种产物，其中NS1从全长RNA翻译，NS2从剪接的mRNA变体翻译。
制备重配病毒以在批准的原始毒株(也称为原始供体病毒(MDV))中掺入选择的血凝素和神经氨酸酶抗原。
Figure A20058004800600271
利用批准的冷适应、减毒、温度敏感的MDV毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/Ann Arbor/1/66)。可采用许多方法来制备重配病毒，包括鸡蛋方法和更新的细胞培养方法(参见，例如PCT公布WO 03/091401；WO 05/062820和美国专利号6,544,785；6,649,372；6,951,754)。考虑可利用本发明MDCK细胞、培养基和方法来生产流感病毒，包括但不限于：本文公开的流感病毒株(例如，甲型/AnnArbor/6/60和乙型/AnnArbor/1/66)和包含甲型/AnnArbor/6/60、乙型/AnnArbor/1/66的基因，PR8的重配病毒。还考虑可利用本发明MDCK细胞、培养基和方法来生产具有温度敏感、冷适应、减毒的一种或多种表型的流感病毒(包括重配病毒)。可采用经典重配技术，例如共感染方法或任选通过质粒拯救技术制备重配体(参见，例如PCT公布WO 03/091401；WO 05/062820和美国专利号6,544,785；6,649,372；6,951,754)。
实施例
现在参考以下实施例描述本发明。提供这些实施例的目的只是为了说明，本发明决不应理解为局限于这些实施例，而应理解为包括根据本文所提供指导显而易见的任何及所有改进形式。
实施例1
测定ca/ts流感病毒株在细胞系中的感染传播速度和特征鉴定MDCK细胞产生的流感病毒
疫苗工业已努力开发了不利用鸡蛋而能在哺乳动物或昆虫细胞培养系统中生产流感疫苗的替代生产平台。(该平台)的明显优点是易于放大、对生产过程的控制提高和除去了在一些疫苗中可能导致过敏反应的鸡蛋蛋白。因为细胞培养系统可快速放大，其在流感流行，鸡蛋供应短缺和需要快速生产疫苗之时能赋予额外的优点。用总共7种不同的以下细胞系进行了初步研究：2种人二倍体肺成纤维细胞系(MRC-5和WI-38)(数据未显示)；人视网膜母细胞瘤细胞系和人肾细胞系(分别是PER.C6和29)(数据未显示)，二者均遗传构建成能产生腺病毒产物；恒河猴胎肺细胞系(FRhL2)(数据未显示)；非洲绿猴肾细胞系(Vero)；和Marin-Darby狗肾细胞系(MDCK)。MDCK细胞是所测试的那些细胞系中唯一能使以下所有4种类型的毒株增殖至商品化合理滴度(＞107Log TCID50/mL)(图1，数据未显示)的细胞系：冷适应、温度敏感的减毒(ca/ts/att)重配流感病毒株，H1N2、H3N2；潜在的流行疫苗毒株H5N1以及乙型毒株。比较了在MDCK细胞中与鸡蛋中培养的病毒的遗传和抗原特性。发现基因组序列没有明显变化(数据未显示)，HAI滴度测定抗原活性相当(表1)。
荧光聚焦试验：在96孔黑色平板中培养MDCK和Vero细胞超过4天(DMEM+4mM谷氨酰胺+青霉素/链霉素)。在DMEM+4mM谷氨酰胺+60mU/mLTPCK胰蛋白酶中用0.01MOI的ca/ts乙型流感病毒株(乙型/香港/330/01和乙型/Yamanashi/166/98)感染各孔。固定病毒感染的各板，如下所示进行免疫染色来测定感染传播。除去各板的含病毒培养液，用200μl/孔DPBS(无Ca2+/Mg2+)洗涤各板一次，然后加入200μl/孔PBS配制的4％(v/v)冷低聚甲醛固定各板。用200μl/孔DPBS(无Ca2+/Mg2+)洗涤各板两次，然后用第一抗体(用PBS配制的0.1％皂苷、1％BSA作1∶1000稀释的绵羊抗乙型yamanshi(抗体)和绵羊抗乙型香港(抗体))培育细胞。培育1小时后，除去第一抗体，用PBS配制的0.1％吐温20洗涤细胞三次，用第二抗体(用PBS配制的0.1％皂苷、1％BSA作1∶100稀释的FITC标记家兔抗绵羊(抗体))培育各孔。利用荧光显微镜每天目测检查各孔，共4天，采用SPOT程序每日拍摄图像。
结果和讨论
采用荧光聚焦试验评估乙型ca/ts流感病毒株感染是否能在MDCK和Vero中传播，也评估了在50个Vero克隆中病毒感染的传播中是否有差异。因为MDCK细胞单层的荧光增加超过4天，而在Vero细胞中没有(参见图1A)，可以得出结论Vero不允许乙型ca/ts毒株产生，而MDCK允许。该数据类似于早先实验的数据，显示在MDCK细胞中乙型毒株的产量能达到7-7.5log10 TCID50但在Vero细胞中只能达到4-4.5log10 TCID50(数据未显示)。
也测试了MDCK细胞能否支持多种ca/ts/att重配毒株(包括潜在的流行疫苗毒株，ca甲型/越南/1203/2004)复制。用低感染复数的ca甲型/越南/1203/2004感染MDCK细胞，定量测定感染后各种时间上清液中的病毒。感染48小时时，ca甲型/越南/1203/2004的滴度达到约8log10 TCID50/mL，并且在接下来的3-4天维持稳定。参见图1B和表2。
甲型/H1N1、甲型/H5N1、甲型/H3N2和乙型Ca/ts/att毒株可在MDCK细胞中复制达到较高滴度。此外，在MDCK细胞中传代这些ca/ts/att毒株未明显改变它们的基因组序列。将三种ca/ts/att毒株：ca甲型/悉尼/05/97、ca甲型/北京/262/95和ca乙型/Ann Arbor/1/94在MDCK细胞中传代一次或两次，测序所有6个内部基因的整个编码区并与起始材料作比较。未观察到核苷酸变化(数据未显示)，证明经此底物(细胞)传代未改变这些毒株的遗传组成。在预计能模拟该生产过程的条件下(包括培养基组成、输入剂量(moi)、培养温度和收集时间)对MDCK细胞产生的不同疫苗毒株作进一步序列特征鉴定。根据初步数据，预计MDCK产生的病毒基因组序列不会有明显变化。
因为在MDCK细胞中传代后基因组在遗传上稳定，估计在鸡蛋或MDCK细胞中产生的疫苗的生物学特性没有区别。然而，与鸡蛋产品相比，细胞培养的主要病毒产品可能有一些微小差异，特别是对于病毒蛋白质(包括HA和NA)的翻译后修饰，或病毒包膜的脂质组成；二者均可能改变病毒粒子的总体物理特性。细胞培养生产的和鸡蛋生产的疫苗的抗原性初步临床前数据证明此重要参数没有可检测的差异。通过MDCK细胞传代几种疫苗毒株的鸡蛋储液，利用参比抗血清检测HAI滴度来测定两种产物的抗原性。如表1所示，所有HAI滴度彼此在两倍之内，表明与鸡蛋衍生的病毒材料相比，该疫苗在细胞中的复制未改变其抗原性。
表1.在鸡蛋和MDCK细胞中生产的菌株的HAI滴度
实施例2
非致瘤性血清MDCK细胞的衍生
MDCK细胞已常规用于滴定流感病毒(Zambon，1988，刊于Textbook ofInfluenza(《流感教材》)，Nicholson、Webster和Hay编，第24章，第324-332页，Blackwell Science)，因此可用于为生产疫苗材料而增殖流感病毒。然而，常规用基础培养基制剂，例如补加了FBS的Eagle极限必需培养基(EMEM)培养MDCK细胞。多份报道表明MDCK细胞在这些条件下培养和/或长期培养可能有致瘤性(参见例如Gaush等，Proc Soc Exp Biol Med，122：931；Leighton等，1968，Science，163：472和Leighton等，1970，Cancer，26：1022)。因此，关注的是利用MDCK细胞生产疫苗材料并致力于开发其它细胞系(例如，PER.C6和VERO)。不幸的是，不是所有的流感病毒株均能在其它哺乳动物细胞系中生长良好，特别是包括
Figure A20058004800600311
(一种减毒流感活疫苗)的冷适应流感病毒只能在MDCK细胞中生长到适当滴度(＞107 TCID 50/mL)(参见上文实施例1)。特征鉴定MDCK细胞系的早期报道表明早期代次的MDCK细胞可能不致瘤(Gaush等，1966，Proc Soc Exp Biol Med.122：931)。本实验的目标是建立培养基和传代方法以使MDCK细胞维持非致瘤状态。
利用补加10％FBS、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的DMEM作为生长培养基在T-培养瓶中扩增得自ATCC(CCL 34)的MDCK细胞。对血清培养的MDCK细胞(MDCK-S细胞)建立前原始MDCK细胞库，采用商业承包者(BioReliance，Rockville，MD)的常规测试检验该细胞库有无细菌/真菌污染和支原体污染。发现这些细胞中不存在细菌/真菌污染。也发现MDCK-S细胞中不存在可培养的支原体。也通过核型试验检验了该库的MDCK-S细胞，发现这些细胞是狗来源的，众数染色体数是78，染色体数范围是70-84。然后从PreMCB小瓶再传代MDCK-S细胞20次，利用体内裸小鼠模型检验核型和致瘤性。核型检验显示最后一代的MDCK-S细胞(p 81/24)表现出与早期代次的MDCK-S细胞相同的众数染色体数(78)和染色体范围(70-84)，表明这些细胞未因长期传代而改变。将1×107个MDCK-S细胞皮下注射入成年裸小鼠未形成任何小结，故可视作非致瘤性。
材料与方法
材料：MDCK细胞(ATCC，目录号：CCL-34)；T-25、T-75、T-225培养瓶(Corning，目录号：430639、430641、431082)；Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)粉末(Gibco，Grand Island NY，制剂号：01-5052EF)；胎牛血清，经γ-射线照射过(JRH，Lenexa KS，目录号：12107-500M)；L-谷氨酰胺(JRH，Lenexa KS，目录号：59202-100M)；D-葡萄糖(Amresco，目录号：0188-1KG)；无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)粉末(Gibco，Grand Isand NY，目录号：21600-069)；0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Grand Island NY，目录号：25300)；二甲基亚砜DMSO(Sigma，St.Louis MS，目录号：D2650)；PBS配制的0.4％w/v台盼蓝染料(Sigma，St.Louis MS，目录号：T8154)；CO2培养箱(Forma Scientific，型号：3110)；YSI生物分析仪(YSI，型号：2700 select)；体外化学系统(Ortho clinic，DT60 II型)；改进的Neubaurr血细胞计数器(Hausser Scientific，Brightline 0.1mm深/Reichert，Brightline 0.1mm深)。
在组织培养瓶中亚培养血清MDCK(MDCK-S)细胞：一小瓶血清MDCK细胞得自ATCC。利用补加10％(v/v)FBS、4.5g/L葡萄糖、2.2g/L NaHCO3和4mM谷氨酰胺的DMEM培养基在T-75培养瓶中培养这些细胞。细胞在接种后3或4天传代，如果在第4天传代，则在接种后第3天进行培养基完全替换。如下所述从T-瓶回收细胞。
除去消耗的生长培养基，用DPBS(无钙和镁)洗涤细胞单层两次。向各瓶中加入在37℃水浴预热的合适量胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-瓶在37℃，5％CO2培养箱中培育约15-20分钟。每5分钟检查培养瓶看细胞是否脱离，拍打培养瓶几次以帮助细胞脱离。当细胞完全从T-瓶式脱离后，加入等体积的含10％血清的完全生长培养基(3mL/T-75，7.5mL/T-225)以抑制胰蛋白酶。用大小合适的移液管上下抽吸细胞悬浮液以破碎任何大细胞块。用血细胞计数器计数两份0.5mL细胞悬液样品。如果两次计数的结果彼此相差不在15％以内，重复计数细胞。在新鲜培养瓶中用新鲜温热的生长培养基(DMEM+10％FBS+4.5g/L葡萄糖+4mM谷氨酰胺)将细胞稀释至0.05×106个活细胞/mL，接种于T-培养瓶中(35mL/T75或100mL/T-225)。然后在37±1℃，5％CO2中培育培养瓶3天，再进行亚培养或培养基更换。
制备MDCK-S细胞库：如上所述在T-培养瓶中扩增MDCK-S细胞直至回收到构建细胞库所需的细胞量(4×106个细胞/小瓶×小瓶数目)。在指数生长期(接种后3天)通过所述胰蛋白酶消化回收MDCK-S细胞。合并各培养瓶的MDCK-S细胞悬液，在150-250g离心7±1分钟回收细胞。从各试管中吸弃上清液，用新鲜的完全生长培养基(DMEM+10％FBS+4.5g/L葡萄糖+4mM谷氨酰胺)重悬细胞沉淀物。合并不同离心瓶的细胞悬液，用移液管上下抽吸几次以破碎任何大细胞块。测定细胞总数，以及确定每小瓶4×106个细胞所用的冷冻小瓶总数。
然后利用新鲜的生长培养基将细胞悬液的体积调节至上述值。在细胞悬液中加入等体积的新鲜制备2×冷冻培养基(DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺+4.5/L葡萄糖+15％DMSO)。彻底混合细胞悬液，将1ml细胞悬液加入各冷冻小管中。将所有小瓶转移入Nalgene冷冻容器，置于≤-60℃的冰箱中。再将冷冻小瓶转移至液氮储藏罐。
制备T-75培养瓶中MDCK-S细胞的生长曲线：细胞在其生长培养基中至少传代4次(融化后)，然后进行生长曲线研究。使MDCK-S细胞在T-225瓶中扩增，从而获得总共至少2.7×107个细胞。培养各瓶细胞至80-95％汇合，然后如上所述胰蛋白酶消化。合并回收的MDCK-S细胞，用移液管上下抽吸细胞悬液几次以破碎任何大细胞块。取两份样品(0.5ml)作细胞计数及测定细胞密度。如果两次样品计数的结果彼此相差不在15％以内，重复计数。然后用总体积为540ml的完全生长培养基稀释总共2.7×107个MDCK-S细胞(5.0×104个细胞/mL)。然后将该MDCK-S细胞悬液分散入14×T-75培养瓶中(35mL/T75培养瓶)。将各瓶置于37±1℃，5％CO2培养箱中。
每天从培养箱中取出两个T-培养瓶作细胞计数和代谢分析。从各瓶中取两份细胞培养基样品(约1.0mL)作代谢分析。利用YSI和Vitros分析仪测定一份样品的葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和氨浓度。将另一份样品冷冻于-70℃待日后作氨基酸分析。如上所述通过胰蛋白酶消化回收各瓶的MDCK-S细胞。测定细胞密度，也测定每个T-培养瓶的细胞总数。如果两次样品计数的结果彼此形成不在15％以内，重复计数。给出的数值是对两份不同代次(p63和p65)的MDCK-S细胞的两份独立生长曲线研究的平均值。
核型检验：在佛罗里达州，墨尔本的Applied Genetics Laboratories(应用遗传学实验室)进行核型检验。简言之，将T-225培养瓶中生长的MDCK-S细胞运至Applied Genetics Laboratories(应用遗传学实验室)。按照上述方法维持和亚培养细胞。当认为这些细胞具有足够的有丝分裂细胞时，收集这些细胞作有丝分裂分析。37℃用秋水仙胺(0.02μg/mL)处理这些细胞150分钟。然后用胰蛋白酶消化收集细胞，200g离心细胞5分钟。吸弃上清液，将细胞悬浮在预温暖的低渗溶液中，37℃培育10分钟。离心沉淀溶胀的细胞，然后室温用卡诺依溶液(3∶1甲醇∶冰醋酸)固定40分钟。再次离心细胞，用卡诺依固定液洗涤至少两次。最后离心一次后，将细胞重悬在1-3ml新鲜的固定液中产生乳白色的细胞悬浮液。将数滴最终细胞悬液置于清洁载玻片上，空气干燥。
向载玻片上加入磷酸缓冲液配制的赖特染液，培育7-10分钟染色细胞。7-10分钟后用自来水洗涤载玻片，然后空气干燥。用低倍物镜(10×)扫描观察细胞以找寻细胞分裂中期的细胞，用高倍油镜(100×)分析分裂中期细胞的染色体。对100个分裂中期细胞分析其细胞形成异常和染色体计数。扫描观察1000个细胞测定多倍体频率和有丝分裂指数(正发生有丝分裂的细胞百分数)。
MDCK-S PRE-MCB的无菌检验(细菌抑制和真菌抑制及4种培养基的无菌 检测)：在马里兰，Rockville的Bioreliance Inc.检验了MDCK-S Pre-MCB的细菌抑制和真菌抑制活性。进行该试验以符合US 26和21 CFR 610.12要求。该试验检验接种在含0.1mL测试样品的合适肉汤培养基中的对照生物(枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、白色念珠菌(Candida albicans)、产芽胞梭状芽胞杆菌(Clostridium sporogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginonsa)、黑曲霉(Aspergillus Niger))与只含对照生物的肉汤培养基之间是否有生长差异。简言之，将测试品接种于3试管的TSB(大豆酪蛋白消化培养基)、4试管的THIO(巯基乙酸钠液体培养基)、2试管的SAB(Sabourand葡萄糖琼脂)和1试管的PYG(蛋白胨酵母提取物)中。然后将含少于100 cfu的各对照生物接种入合适类型的培养基中。阳性对照是接种于TSB和THIO的枯草芽胞杆菌、接种于TSB和SAB的白色念珠菌(20-25℃和30-35℃)、接种于THIO和PYG的产芽胞梭状芽胞杆菌、绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉。阴性对照是无菌PBS。培养基培育35-天，检查生物的生长情况。
也在Bioreliance，Rockville MD采用4种培养基无菌检验分析测试品中是否存在细菌和真菌污染，设计该试验以符合USP 26，EP和21CFR610.12的要求。简言之，将测试品接种于2试管的TSB(大豆酪蛋白消化培养基)、2试管的THIO(巯基乙酸钠液体培养基)、3试管的SAB(Sabourand葡萄糖琼脂)和2试管的PYG(蛋白胨酵母提取物)中。培养基在合适温度培育(SAB斜面培养基用两种温度培育)，在整个14天期间观察所有试管，在第3/第4或第5天、第7天或第8天和第14天检查各试管。将显示混浊的任何测试品接种试管接种平板，对各平板进行革兰染色。阴性对照是无菌PBS。
支原体/支原体抑制(mycoplasmstasis)检验：将一小瓶冻存的MDCK-S细胞(MDCK preMCB，批号747p105)发往Bioreliance。如上所述扩增细胞并在T-培养瓶中培养。制备浓度为5×105个细胞/mL的细胞裂解液，-70℃冷冻。检验测试品在琼脂肉汤/平板和/或VERO细胞中能否抑制肺炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、口腔支原体(Mycoplasma orale)和猪鼻支原体(Mycoplasmahyorhinis)的生长。
对于琼脂分离试验，在琼脂平板或肉汤瓶中检验掺加或不掺加的测试品。用肺炎支原体和口腔支原体掺加测试品以达到10-100cfu/0.2mL(对于琼脂检验)和10-100cfu/10mL(对于半肉汤试验)的稀释度。一部分测试样品不掺加。用掺加(2瓶)或不掺加的(2瓶)各10ml接种4个半固体肉汤瓶。在合适温度以需氧或厌氧方式培养掺加/未掺加的各一瓶。用各掺加样品或未掺加样品接种10块A型琼脂板和10块B型琼脂板。在合适温度以需氧或厌氧方式培养A型琼脂板和B型琼脂板的一半。未接种的支原体半固体肉汤用作未接种阴性对照。观察所有肉汤瓶21天。在第3、7和14天将各肉汤瓶(除未接种阴性对照之外)在A型琼脂板或B型琼脂板上(各10块平板，0.2ml/平板)亚培养，在与相应肉汤瓶相同的条件下培育。每天检查各板一次，共21天。
对于增强的VERO细胞培养试验，检验掺加或不掺加的测试品。测试品掺加了10-100cfu/0.2mL浓度的口腔枝原和猪鼻支原体。掺加的测试品、未掺加的测试品、阳性对照和阴性对照各接种在VERO细胞培养物的T-75培养瓶中。培育3-5天后，刮下各瓶的细胞，快速冷冻。将各瓶中1mL细胞裂解液的十分之二接种入含VERO细胞个6孔板各孔中。此外，将阳性和阴性对照接种入含VERO细胞的6孔板合适孔中。3-5天后，固定细胞，用DNA结合性HOECHT染料染色，评估支原体的存在。
MDCK-S细胞在裸小鼠中的致瘤性检验：
Figure A20058004800600351
Rockville，MD进行了在无胸腺裸(nu/nu)小鼠中评估肿瘤形成。简言之，用0.2mL(1×107个细胞/小鼠)的阳性对照(18C1-10T细胞)、阴性对照(叙利亚仓鼠胚胎细胞；SHE细胞)或测试细胞(血清MDCK细胞，747p105高代次)皮下注射30只雌性无胸腺小鼠(4周龄)。注射前随机分组小鼠，所有小鼠用22号针头在同一天注射。每个工作日观察所有小鼠，每周两次触诊注射部位有无病灶产生发展，共84天。测量各病灶，只要病灶大小没有可见增加则保留小鼠。最长3个月。84天后处死所有小鼠并尸检，通过组织病理学方法分析注射部位、肺、肩胛骨淋巴结和总体病灶。
在MDCK-S细胞中复制冷适应流感病毒株：以5×104个细胞/mL接种T-75培养瓶(35mL DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺)，细胞维持于37℃和5％CO2的培养箱内培育3天。接种3天后，利用胰蛋白酶EDTA收集测定每个T-培养瓶的总细胞，通过台盼蓝排除试验测定细胞计数。然后如下所示感染其余T-培养瓶细胞。吸出生长培养基，每培养瓶用10mL DPBS(无Ca2+/Mg2+)洗涤细胞一次。按照以下方程测定以0.01感染复数(MOI)感染各T-培养瓶细胞的病毒量：
Figure A20058004800600361
MOI定义为每个细胞加入的病毒颗粒。
然后向各T-培养瓶35mL感染后的培养基(DMEM+4mM谷氨酰胺+60mu/mL TPCK胰蛋白酶)中加入所需量的病毒。随后将T-培养瓶在33℃，5％CO2下培育，每天取样，共6天。向各样品中加入10×SP作为稳定剂，将样品保存于＜-70℃，然后检验感染性。
按照检测感染性病毒粒子的中值组织培养感染性剂量(TCID50)试验测定各样品中存在的病毒浓度。简言之，MDCK细胞在96-孔板中生长至汇合，加入ca/ts流感病毒样品的连续稀释液。MDCK细胞试验平板中的样品通常最终稀释为10-4-10-10。列1-5和8-12中各孔含有稀释的病毒和样品，列6-7中各孔只接受病毒稀释液并用作细胞对照。该方式在每块板上产生两个数据点(n＝2)。MDCK细胞中病毒复制导致细胞死亡，子代病毒释放入培养上清液中。子代病毒感染其它细胞，最终导致细胞单层破坏。在33±1℃，CO2环境中培育6天会发生因感染所致的致细胞病变效应(CPE)。然后从培养箱中取出平板，弃去孔中的培养基，向各孔中加入100μl MEM+4mM谷氨酰胺+青霉素/链霉素+MTT。平板在37℃ 5％CO2培育6小时，目测检查各孔产生的颜色(黄色/橙色表明CPE孔，固体紫色结晶表明无CPE)来确定显示CPE的孔数。按照Karber改进的Reed-Muench方法，利用每半块板中显示CPE的孔数计算滴度(log10TCID50/mL)。
结果和讨论
在T-75培养瓶中，用完全生长培养基(DMEM+10％FBS+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖)分别融化两冷冻管的血清MDCK细胞。融化后细胞存活率分别是97％和98％。融化3天后细胞达到汇合。细胞的形态是上皮样的，类似于得自ATCC的储备物(图3)。将这些细胞传代5次，构建这些血清培养的MDCK细胞(MDCK-S细胞)的前原始细胞库PreMCB。图2概述了获得MDCK-S前原始细胞库(PreMCB)所用的方法。
图4显示了MDCK-S细胞在10％FBS DMEM培养基中的生长曲线。所示结果是用不同代次(P63和P65)细胞的两个实验的平均值。MDCK-S细胞有约1天的延滞期，在此期间细胞数未从接种时倍增(接种时1.75×106总细胞/T75培养瓶，第1天2.9×106总细胞/T-75)。在第1天葡萄糖消耗/乳酸产生速率几乎是0，表明细胞处于延滞期(图5)。然后细胞在细胞生长期间呈指数生长，接着在接种后第4天进入稳定期。指数生长期中MDCK-S细胞的倍增时间是23.1小时。指数期葡萄糖消耗和乳酸产生彼此对映，乳酸浓度增加与葡萄糖浓度降低一致(图5)。葡萄糖消耗/乳酸产生速率与细胞生长曲线良好相关(比较图4和5)。延滞期此二速率低，在指数期的第1到第4天葡萄糖(消耗速率)上升至2.93mM/天，乳酸(产生速率)上升至3.43mM/天。
MDCK细胞在接种后第4天进入稳定期，在接种后第5天达到最大细胞密度约29±0.99×106个细胞(图4)。在此项研究中，达到最大密度后细胞数维持恒定直至第7天。稳定期的葡萄糖消耗速率和乳酸产生速率分别降低至0.33mM/天和0.25mM/天。培养7天后，培养基中仍有约12mM葡萄糖。在第4天，葡萄糖消耗量与乳酸产生量之比是1.2。
图6显示了MDCK-S细胞中谷氨酰胺消耗和谷氨酸及氨的产生。谷氨酰胺消耗速率和氨的产生速率也与细胞生长曲线有关(比较图4和6)。指数生长期间，MDCK-S细胞以0.49mM/天的速率消耗谷氨酰胺直至第4天，同时以0.32mM/天的速率产生氨直至第5天。然后在细胞进入稳定期时，谷氨酰胺的消耗速率降低至0.24mM/天，同时氨的产生速率降低至0.11mM/天。接种后第4天，氨产生和谷氨酰胺消耗量速率之比是0.7。在此7天的细胞生长研究中，谷氨酰胺代谢所产生的谷氨酸未累积。
检验了61/4代和81/24代的MDCK-S细胞的核型。G带染色体分析显示细胞是狗来源。图7显示了100个分裂中期细胞中染色体数的分布。对于低代次61/4细胞，每个分裂中期(细胞)的染色体计数范围是70-84条染色体，高代次81/24细胞是70-84条染色体。两种代次的众数染色体数是78条染色体。染色体分布未随传代而改变。估计这些细胞的形态(modality)与正常狗肾细胞一样(Starke等，1972，Prog Immunobiol Stand.，5：178)。
检验了MDCK-S preMCB中是否存在任何细菌、真菌或支原体污染。pre-MCB经无菌检验(采用直接接种方法检查细菌和真菌污染的4种培养基的无菌检验)，发现不存在支原体(琼脂可培养和非琼脂可培养试验)。在细菌抑制/真菌抑制检验和支原体抑制检验中均发现测试品未抑制阳性对照生长。
将81/24代(pre-MCB+20次传代)的MDCK-S细胞接种于裸小鼠进行3个月的致瘤性检验。在接种了MDCK-S细胞的任何小鼠中未诊断到赘生物，表明MDCK-S细胞无致瘤性(表4)。
检验了MDCK-S细胞，发现它能支持冷适应温度敏感的重配流感病毒株复制(表2)。
表2：冷适应流感病毒株在适应含血清和无血清MediV SF101的MDCK细胞中的生长情况
  病毒株(6∶2重配株)     血清MDCK(log10 TCID50/mL)     无血清MDCK(log10 TCID50/mL)
  甲型/新喀里多尼亚/20/99     8.1     7.8
  甲型/德克萨斯/36/91     6.4     ＜5.2
  甲型/巴拿马/2007/99     6.8     6.4
  甲型/悉尼/05/97     7.0     6.5
  乙型/布里斯班/32/2002     7.2     7.5
  乙型/香港/330/01     7.2     7.4
  乙型/维多利亚/504/2000     6.9     7.5
实施例3
在Taub培养基中衍生无血清MDCK细胞
以上实施例2详述的结果表明可在维持MDCK细胞的上皮形态和正常核型以及支持冷适应流感病毒复制的条件下培养它们。此外，我们证明在以上研究开发的条件下培养MDCK细胞能得到非致瘤性MDCK细胞。然而，实施例2所用的培养基含有胎牛血清(FBS)。FBS是成分复杂的混合物，其批次之间差异的问题已见报道。目前牛的牛海绵状脑病(BSE)问题也产生了安全顾虑。为提高治疗和疫苗接种而生产的生物制品安全性，开发能维持MDCK-S细胞系的非致瘤性本质和生长特征的无血清培养基至关重要。
利用补加了10％FBS、4mM谷氨酰胺和4.5g/L葡萄糖的DMEM作为生长培养基将得自ATCC(ccl 34)的Madin Darby狗肾细胞(MDCK)在T-培养瓶中传代5次来扩增。然后将细胞转移至无血清的Taub培养基(配方见下文)。适应在Taub培养基制剂中生长的细胞称为MDCK-T。建立MDCK-T细胞的pre-MCB(参见图8)，检验细菌/真菌污染和支原体污染。也通过核型试验检验了MDCK-T细胞前原始细胞库中的细胞，发现其是狗来源的，众数染色体数是78，染色体数范围是52-84。此外，从PreMCB小瓶传代MDCK-T细胞至少20次，利用成年裸小鼠体内模型检验核型和致瘤性。然而，发现MDCK-T细胞在此模型中有致瘤性，表明公布的Taub培养基不支持为生产人用疫苗材料而稳定地培养MDCK细胞。
材料与方法
材料：MDCK细胞(ATCC，目录号：CCL-34，54代)；T-25、T-75、T-225培养瓶(Corning，目录号：430639、430641、431082)；Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)粉末(Gibco，Grand Island NY，制剂号：01-5052EF)；Ham F12营养混合物粉末(Gibco，Grand Island NY，目录号：21700-075)；胎牛血清，经γ-射线照射过的(JRH，Lenexa KS，目录号：12107-500M)；L-谷氨酰胺(JRH，Lenexa KS，目录号：59202-100M)；D-葡萄糖(Amresco，目录号：0188-1KG)；无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)粉末(Gibco，Grand Isand NY，目录号：21600-069)；胰岛素粉末(Serological，目录号4506)；转铁蛋白(APO形式)(Gibco，Grand Island NY，目录号：11108-016)；前列腺素E1(Sigma，St.Louis MS，目录号：P7527)；氢化可的松(Mallinckrodt，目录号：8830(-05))；碘塞罗宁(Sigma，St.Louis MS，目录号：T5516)；钠硒(Sodium Selenium)(EMD，目录号：6607-31)；0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Grand Island NY，目录号：25300)；利马豆胰蛋白酶抑制剂(Worthington，目录号：LS002829)；二甲基亚砜，DMSO(Sigma，St.Louis MS，目录号：D2650)；PBS配制的0.4％w/v台盼蓝染料(Sigma，St.Louis MS，目录号：T8154)；改进的Neubaurr血细胞计数器(Hausser Scientific，Brightline 0.1mm深/Reichert，Brightline 0.1mm深)；YSI生物分析仪(YSI，型号：2700 select)；体外化学系统(Ortho clinic，DT60II型)。
配制Taub无血清培养基：
Taub培养基(Taub和Livingston，1981，Ann NY Acad Sci.，372：406)是由DMEM/HAM F12(1∶1)构成的一种无血清培养基制剂，其含有4.5g/L葡萄糖和4mM谷氨酰胺作为基础培养基制剂并向其中加入表3所示的激素/因子。
表3：加入无血清培养基制剂的激素和生长因子
    组分名称     终浓度
    胰岛素     5μg/mL
    转铁蛋白     5μg/mL
    碘塞罗宁(T3)     5×10-12M
    氢化可的松     5×10-8M
    前列腺素E1     25ng/mL
    亚硒酸钠     10-8M
在传代或重加料之时通过向SF DMEM/Ham F12培养基+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖+10-8M亚硒酸钠中加入激素储备液来新鲜制备Taub SFM。通过将100μL胰岛素储备液(5mg/mL)、100μL转铁蛋白储备液(5mg/mL)、100uL碘塞罗宁(T3)储备液(5×10-9M)、5μL氢化可的松储备液(10-3M)和50μL前列腺素E1储备液(50μg/mL)加入基础DMEM/Ham F12培养基+4mM谷氨酰胺+4.5g/L葡萄糖+10-8M亚硒酸钠中来制备100mL Taub培养基。所有储备液如下所示制备：
胰岛素储备液：将适量胰岛素溶解于0.01N HCl中制备5mg/ml储备液。溶液经0.2微米除菌级过滤器过滤，等分加入Nalgene冷冻管，4℃保存。
转铁蛋白储备液：将适量转铁蛋白溶解于MilliQ水中制备5mg/ml储备液。溶液经除菌级过滤器过滤，然后等分加入Nalgene冷冻管，＜-20℃保存。
碘塞罗宁(T 3 )储备液：将适量T3溶解于0.02N NaOH中获得10-4M溶液制备成储备液。用0.02N NaOH将该储备液进一步稀释至浓度为5×10-9M的储备液，经除菌级过滤器过滤，等分加入Nalgene冷冻管，＜-20℃保存。
氢化可的松储备液：将适量氢化可的松溶解于100％乙醇中制备10-3M储备液，等分加入Nalgene冷冻管。4℃保存各小瓶3-4个月。
前列腺素E 1 储备液：将适量PGE1溶解于100％无菌乙醇中制备50μg/mL储备液，等分加入Nalgene冷冻管，＜-20℃保存。
Na 2 SeO 3 储备液：将适量硒化钠溶解于WFI水或MilliQ水中制备10-2M储备液。用水将该储备液进一步稀释至浓度为10-5M，经除菌级过滤器过滤，4℃保存。
使MDCK-S细胞适应无血清Taub培养基：用含4.5g/L葡萄糖、2.2g/LNaHCO3和4mM L-谷氨酰胺的10％FBS DMEM培养基培养得自ATCC(54代)的一冷冻管MDCK细胞，传代5次(如上所述)，然后接种入无血清的Taub培养基。通过胰蛋白酶消化回收T-75培养瓶中培养的血清MDCK细胞。除去消耗的生长培养基，用DPBS(无钙和镁)洗涤细胞单层两次，然后弃去DPBS。加入合适量的预温热胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75)，T-培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中培育约15分钟。用手掌拍打烧瓶几次使细胞完全脱离。加入等体积的利马豆胰蛋白酶抑制剂来中和胰蛋白酶，取两份样品测定细胞悬液的细胞浓度。然后将1.75×106个细胞在新的T75培养瓶中稀释至35mL Taub培养基中。将培养瓶置于维持在5％CO2、37±1℃的细胞培养箱中。细胞在接种后亚培养3天，或在第3天更换温完全培养基，然后在接种后第4天亚培养。
亚培养适应Taub培养基的MDCK细胞：除去消耗的生长培养基，用DPBS(无钙和镁)洗涤细胞单层两次。加入合适量的预温热胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中培育约15分钟。用手掌拍打烧瓶几次以使细胞完全脱离。然后加入等体积的利马豆胰蛋白酶抑制剂(3mL/T-75，7.5mL/T-225)来抑制胰蛋白酶。用大小合适的移液管上下抽吸细胞悬液使之均匀。取两份0.5mL细胞悬液样品作细胞计数。如果两次计数的结果彼此相差不在15％以内，重复细胞计数。计数后，在新的培养瓶中用新鲜的预温Taub培养基稀释细胞至0.05×106个活细胞/mL，总体积为35mL/T75或100mL/T-225。然后37±1℃，5％CO2环境中培育培养瓶。细胞于第3天在新T培养瓶中亚培养，或更换温完全培养基，于接种后第4天在新T培养瓶中亚培养培养物。
制备适应Taub培养基的MDCK细胞PreMCB库：如以上实施例2所述制备适应无血清Taub的MDCK细胞系(MDCK-T)的前原始细胞库，除了2×冷冻培养基是Taub培养基+15％DMSO外。
特征鉴定适应Taub培养基的MDCK(MDCK-T)细胞：如实施例2所述进行MDCK-T细胞的核型、无菌和支原体检验，除了用Taub培养基替代含血清的完全培养基外。此外，如实施例2所述检测了T-75培养瓶中MDCK-T细胞的生长曲线特征和冷适应流感病毒株在MDCK-T细胞中的复制情况，除了用Taub培养基替代含血清的完全培养基外。如以上实施例2所述，通过BioReliance对88/29代MDCK-T细胞(pre-MCB+20次传代)进行致瘤性研究。
结果与讨论
在T-75培养瓶中用无血清Taub培养基融化一冷冻管的MDCK-T preMCB(64/5代)细胞。融化后细胞存活率是97％，从冷冻管回收到5.25×106个细胞。融化3天后细胞生长达到汇合。细胞的形态显示上皮样细胞，类似于亲代MDCK-S细胞(图9)。
图10显示了MDCK-T细胞在Taub SF培养基中的生长曲线。所示结果是用不同代次(P71/12和P73/14)细胞的两个实验的平均值。MDCK-T细胞没有延滞期，细胞在接种1天后倍增(第1天3.42×106总细胞/T-75培养瓶，第0天1.75×106总细胞/T75培养瓶)。细胞处于指数生长期直至第4天，此时它们进入稳定期。指数生长期中细胞的倍增时间是20.4小时。指数期间(第0天到第4天)它们利用葡萄糖和谷氨酰胺(图11和12)，同时产生乳酸和氨。葡萄糖消耗/乳酸产生速率与细胞生长曲线良好相关(比较图10和11)。在指数期的第0到第4天葡萄糖消耗速率是1.78mM/天，乳酸产生速率是2.88mM/天。培养7天时，MDCK-T细胞只消耗了培养基中总共约10mM的葡萄糖。接种后第4天，葡萄糖消耗量与乳酸产生量之比是1.2。第4天后葡萄糖消耗和乳酸产生速率降低，此时细胞进入稳定期，葡萄糖消耗速率是0.65mM/天，乳酸产生速率是0.46mM/天。在接种后约第4天达到最大细胞密度37±0.24×106个细胞。细胞密度在稳定期不降低，维持恒定直至第7天。
谷氨酰胺消耗速率和氨产生速率类似于MDCK-T细胞的生长和葡萄糖/乳酸状况(比较图10、11和12)。在指数生长期间(第0天到第4天)，MDCK-T细胞以0.36mM/天的速率消耗谷氨酰胺，当细胞进入稳定期时(第4天到第7天)该速率降至0.27mM/天。氨产生以0.22mM/天的速率线性增加直至第7天。接种后第4天时，氨产生与谷氨酰胺消耗之比是0.49。在整个7天期间谷氨酸浓度无显著改变。
按照实施例2检验了MDCK-T细胞支持ca/ts流感病毒复制的能力。表2所示结果表明MDCK-T细胞能支持ca/ts流感病毒复制，(病毒的)复制水平几乎与MDCK-S细胞观察到的相同。
检验了68/9代和88/29代的MDCK-T细胞的核型。G带染色体分析显示细胞是狗来源。图13显示了100个分裂中期细胞中染色体数的分布。对于低代次68/9细胞，每个分裂中期(细胞)的染色体计数范围是52-82条染色体，高代次81/24细胞是54-82条染色体，表明染色体分布未随传代而改变。然而，可以看到与MDCK-S细胞(70-84)相比，MDCK-T细胞显示染色体数散布更广(52-84)。
检验了MDCK-T preMCB中是否存在任何细菌、真菌或支原体污染。MDCK-T pre-MCB经无菌检验(采用直接接种方法检查细菌和真菌污染的4种培养基的无菌检验)，发现不存在支原体(琼脂可培养和非琼脂可培养试验)。在细菌抑制/真菌抑制检验和支原体抑制检验中均观察到测试品不抑制阳性对照生长。
将89/29代(pre-MCB+20次传代)的MDCK-T细胞接种于裸小鼠进行3个月的致瘤性检验。在十分之六的样品测试小鼠中诊断到注射部位有腺瘤发生。这表明在SF Taub培养基中生长的MDCK细胞有致瘤性。下表4总结了MDCK-S和MDCK-T细胞的致瘤性、估计的TP50及核型。
实施例4
在MediV无血清培养基中衍生无血清MDCK细胞：
实施例3详述的结果证明虽然适应在无血清Taub培养基中生长的MDCK细胞(MDCK-T)具有优秀的生长特征，并能支持ca/ts流感病毒株复制，但它们有致瘤性。因此，这些结果表明MDCK细胞可能在参考文献报道的标准无血清培养基制剂中容易转化。本发明开发了几种其它无血清培养基制剂，检验了它们维持MDCK-S细胞非致瘤性本质的能力。MDCK-S细胞适应于称为MediVSFM 101、102和103的各种新的无血清制剂。这些适应无血清的细胞系分别称为MDCK-SF101、-SF102和-SF103，统称为“MDCK-SF”。制备了适应MDCK-SF的各细胞系的PreMCB。检验了MDCK-SF细胞系preMCB的细菌/真菌污染和支原体污染(正等待最终结果)。也通过核型试验检验了MDCK-SFpreMCB，MDCK-SF101和MDCK-SF102细胞的众数染色体数是78，染色体数范围分别是70-82和60-80。此外，从PreMCB小瓶再传代各无血清培养基(细胞)库的细胞至少20次，用成年裸小鼠体内模型检验MDCK-SF103的核型和致瘤性。发现87代MDCK-SF103的众数染色体数为78，范围是66-80，可视作非致瘤性。
材料：MDCK细胞(ATCC，目录号：CCL-34，54代)；T-25、T-75、T-225培养瓶(Corning，目录号：430639、430641、431082)；Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)粉末(Gibco，Grand Island NY，制剂号：01-5052EF)；Ham F12营养混合物粉末(Gibco，Grand Island NY，目录号：21700-075)；胎牛血清，经γ-射线照射过(JRH，Lenexa KS，目录号：12107-500M)；L-谷氨酰胺(JRH，Lenexa KS，目录号：59202-100M)；D-葡萄糖(Amresco，目录号：0188-1KG)；无Ca2+和Mg2+的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS)粉末(Gibco，Grand Isand NY，目录号：21600-069)；胰岛素粉末(Serological，目录号4506)；转铁蛋白(APO形式)(Gibco，Grand Island NY，目录号：11108-016)；前列腺素E1(Sigma，St.Louis MS，目录号：P7527)；氢化可的松(Mallinckrodt，目录号：8830(-05))；碘塞罗宁(Sigma，St.Louis MS，目录号：T5516)；钠硒(Sodium Selenium)(EMD，目录号：6607-31)；0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco，Grand Island NY，目录号：25300)；利马豆胰蛋白酶抑制剂(Worthington，目录号：LS002829)；二甲基亚砜，DMSO(Sigma，St.Louis MS，目录号：D2650)；PBS配制的0.4％w/v台盼蓝染料(Sigma，St.Louis MS，目录号：T8154)；改进的Neubaurr血细胞计数器(Hausser Scientific，Brightline 0.1mm深/Reichert，Brightline 0.1mm深)；YSI生物分析仪(YSI，型号：2700 select)；体外化学系统(Ortho clinic，DT60II型)。
配制MediV无血清培养基(MediV SFM 101、102和103)：如下所示，各MediV无血清培养基制剂利用Taub培养基(参见以上实施例2的方法章节)作为基础培养基并加入了补充物：
MediV SFM 101：Taub+2.5g/L购自Organo Techine的小麦蛋白胨E1(目录号19559)。小麦蛋白胨E1以除菌的250g/L储备水溶液保存。
MediV SFM 102：Taub+100×购自GIBCO BRL的化学成分明确的脂质浓缩液(目录号11905)，加入至终浓度为1×。
MediV SFM 103：Taub+1×购自GIBCO的终浓度脂质浓缩液+2.5g/L购自Organo Technie的小麦蛋白胨E1。
Medi SFM 104：Taub+1×购自GIBCO的终浓度脂质浓缩液+2.5g/L购自Organo Technie的小麦蛋白胨E1+0.01μg/mL EGF(多种来源)。
Medi SFM105：无转铁蛋白的Taub+1×购自GIBCO的终浓度脂质浓缩液+2.5g/L购自Organo Technie的小麦蛋白胨E1+0.01μg/mL EGF+比例介于10∶1和70∶1之间的柠檬酸铁铵∶托酚酮或硫酸铁铵∶托酚酮。
使MDCK-S细胞适应无血清的MediV SFM培养基制剂：
用含4.5g/L葡萄糖、2.2g/L NaHCO3和4mM L-谷氨酰胺的10％FBSDMEM培养基将得自ATCC的一冷冻管MDCK细胞培养传代5次(如上所述)，然后接种入MediV SFM培养基制剂(MediV SFM 101、MediV SFM 102或MediVSFM 103)。通过胰蛋白酶消化回收T-75培养瓶中培养的血清MDCK。除去消耗的生长培养基，用DPBS(无钙和镁)洗涤细胞单层两次，然后弃去DPBS。加入合适量的预温胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75)，T-培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中培育约15分钟。用手掌拍打培养瓶几次以使细胞完全脱离。加入等体积的利马豆胰蛋白酶抑制剂中和胰蛋白酶，取两份样品测定细胞悬液中细胞的浓度。然后将1.75×106个细胞在新鲜T75培养瓶中稀释到35mL所需的MediVSFM培养基制剂。将培养瓶置于维持在5％CO2、37±1℃的细胞培养箱中。细胞在接种后亚培养3天，或在第3天更换为完全培养基，然后在接种后第4天亚培养。采用上述相同的方法细胞或许能适应MediV SF104和MediV SF105。
亚培养适应MediV SFM培养基的MDCK细胞：除去消耗的生长培养基，用DPBS(无钙和镁)洗涤细胞单层两次。加入合适量的预温胰蛋白酶-EDTA(3mL/T-75，7.5mL/T-225)，T-培养瓶在37℃，5％CO2培养箱中培育约15分钟。用手掌拍打烧瓶几次以使细胞完全脱离。然后加入等体积的利马豆胰蛋白酶抑制剂(3mL/T-75，7.5mL/T-225)抑制胰蛋白酶。用大小合适的移液管上下抽吸细胞悬液使之均匀。取两份0.5mL细胞悬液样品作细胞计数。如果两次计数的结果彼此相差不在15％以内，重复细胞计数。计数后，在新的培养瓶中用新鲜的预温MediV SFM培养基制剂将细胞稀释至0.05×106个活细胞/mL，总体积为35mL/T75或100mL/T-225。然后在37±1℃，5％CO2环境中培育培养瓶。细胞于第3天在新T培养瓶中亚培养(如下所述)，或更换为完全培养基，于接种后第4天在新T培养瓶中亚培养培养物。注意：MDCK-SF细胞一直在它们要适应的同样MediV SFM培养基制剂中亚培养。
制备适应MediV SFM培养基制剂的MDCK细胞PreMCB库：如以上实施例1所述制备适应无血清的MDCK细胞系的前原始细胞库，除了2×冷冻培养基是合适的MediV SFM培养基制剂+15％DMSO外。
特征鉴定适应MediV SFM培养基的MDCK(MDCK-SF)细胞：按照本文(例如实施例2)所述的方法检验MDCK-SF preMCB的核型、无菌和支原体，除了利用合适的MediV SFM培养基制剂替代含血清的完全培养基外。此外，如实施例2所述检测了T-75培养瓶中MDCK-SF细胞的生长曲线特征和MDCK-SF细胞中冷适应流感病毒株的复制情况，除了利用合适的MediV SFM培养基制剂替代含血清的完全培养基外。此外，如以上实施例2所述，通过商业承包者(例如，BioReliance)对传代额外次数(例如，pre-MCB+20次传代)的MDCK-SF细胞进行致瘤性研究。
结果与讨论
检验了71/9代的MDCK-SF101和MDCK-SF102细胞和87代的MDCK-SF103细胞的细胞核型。图14显示了100个分裂中期MDCK-T、MDCK-SF101和MDCK-SF102细胞中染色体数的分布，图19显示了MDCK-SF103细胞中染色体数的分布。可以看到与MDCK-SF101、MDCK-SF102或MDCK-SF103细胞(染色体数分别是70-82、60-80和66-80)相比，MDCK-T细胞显示染色体数散布更广(52-84)。MDCK-SF101、MDCK-SF102和MDCK-SF103细胞中染色体数的散布更接近非致瘤性MDCK-S血清培养的细胞中所见的(70-84)，这表明MediV SF101、MediV SF102和MediV SF103培养基制剂能更好地维持在这些制剂中生长的MDCK细胞的正常染色体数。
图16显示了MDCK-SF103细胞在MediV SF103培养基中的代表性初级生长曲线。MDCK-SF103细胞具有约1天的延滞期。细胞处于指数生长期直至第4天，此时它们进入稳定期。指数期间(第0天到第4天)它们利用葡萄糖和谷氨酰胺(图17和18)，同时产生乳酸和氨。葡萄糖消耗/乳酸产生速率与细胞生长曲线良好相关(参见图16和17)。在接种后约第4天达到最大细胞密度约17×106。细胞密度在稳定期不降低，维持相当恒定直至第7天。
谷氨酰胺消耗速率和氨产生速率类似于MDCK-SF103细胞的生长和葡萄糖/乳酸状况(参见图18)。氨产生线性增加直至第7天，而在7天期间谷氨酸浓度无明显改变。
按照以下实施例7所述检验了MDCK-SF103细胞支持几种重配流感病毒复制的能力。图20A所示结果表明MDCK-SF103细胞能支持测试的各流感病毒株的复制。
如上所述，将MDCK-SF103细胞接种于裸小鼠进行3个月的致瘤性检验。测试制品在成年裸小鼠模型(RioReliance研究号AB09EU.001000.BSV)中认为无致瘤性。
表4：MDCK细胞在不同培养基中传代的致瘤性和核型
    细胞(代次)   致瘤性   估计的TP50 ＊(无肿瘤小鼠/小鼠总数)  核型中值数；评价
    MDCK-S(P61/4)   ND     ND  78；极少细胞具有异常的染色体数(70-82)
    MDCK-S(P81/24)   无瘤形成。注射部位纤维肉瘤     不可估计(＞107)(0/10)  78；极少细胞具有异常的染色体数(70-82)
    MDCK-T(P63/4)   ND     ND  78；大部分细胞的染色体数为52-82
    MDCK-T(P88/29))   观察到瘤形成     约107(6/10)  78；大部分细胞的染色体数为52-82
    MDCK-SF101   ND     ND  78；极少细胞具有异常的染色体数(70-82)
    MDCK-SF102   ND     ND  78；极少细胞具有异常的染色体数(60-80)
    MDCK-SF103   无瘤形成。注射部位纤维肉瘤     不可估计(＞107)(0/10)  78；极少细胞具有异常的染色体数(66-80)
*TP50：在50％小鼠中诱导肿瘤所需的细胞数
ND：未做
实施例5
感染培养的人上皮细胞
为评估MDCK和鸡蛋产生的疫苗在人源细胞中复制后的生物化学、生物学和结构相似性，将疫苗在相关的人二倍体细胞，例如正常人支气管上皮细胞(NHBE)中传代一次。该次传代用于模拟人气道中的一次感染，从而能比较子代病毒(最终负责引发有效免疫应答的病毒)。对这些材料进行疫苗的血凝素(结合与融合的)和神经氨酸酶活性研究，也评估了其它生物化学和结构研究，包括电子显微镜、传染性颗粒与总颗粒之比和病毒基因组等价物。总之，这些比较用于证明细胞衍生的疫苗与有效且安全的鸡蛋生产疫苗具有可比性。商业承包者(例如，
Figure A20058004800600481
Rockville，MD)可常规实施本领域熟知方法来检验细菌和真菌污染的存在。表5总结了可实施的分析研究。
表5：初步研究比较细胞生产的和鸡蛋生产的疫苗
  体内(雪貂)   体外＊
  减毒/复制上气道中的复制程度上气道中复制的动力学   病毒结合血凝素滴度不同唾液酸的结合
  免疫原性交叉反应性动力学   物理特性通过EM观察的形态学传染性颗粒：总颗粒(基因组)
  传染力产生可检测复制所需的剂量产生抗体应答所需的剂量   融合活性最佳pH最佳温度
  基因组序列
  神经氨酸酶活性
实施例6.
原始细胞库的产生、检验和特征鉴定
为制成原始细胞库(MCB)，可通过有限稀释法生物学克隆上述一个或多个preMCB(参见，实施例2-4)细胞以确保产生的细胞衍生自唯一的遗传组成(genetic constellation)。然后筛选各克隆的各种表型，包括倍增时间和相对致瘤性以及病毒产量。在此概念实验(concept experiment)的最初证据中，在含FCS的培养基中获得54个MDCK克隆。传代这些克隆，用低感染复数的ca甲型/新喀里多尼亚/20/99感染各克隆。感染几天后，取出上清液，通过TCID50检测上清液中的病毒量。少数克隆产生的病毒滴度高于未克隆的亲代细胞产生的。利用生物学和生理学特性优秀的克隆建立原始细胞库(MCB)。
进一步检验MCB以确保没有偶然物质的证据。例如，进行几种利用病毒物质的PCR和/或抗体特异性检验的一种或多种，如下表6所示。
表6：MCB的检验方案
Figure A20058004800600491
实施例7.
疫苗材料的方法和配制
采用与生产目前批准的脊髓灰质炎疫苗所用技术类似的可扩大规模的微载体技术，将其应用于在MDCK细胞中生产流感病毒。葡聚糖制成的球形珠能支持MDCK细胞在2-10L生物反应器中良好生长。发现在SFMV 103中生长的亲代MDCK细胞能在两种转瓶中以分批方式在Cytodex 1微载体上生长至密度为2×106个核/mL，MDCK细胞在最高10L规模的生物反应器中能生长至＞1×106个细胞/mL(数据未显示)。最初的中试规模运作证明这些MDCK细胞以无血清方法能产生高滴度的疫苗流感病毒株，发现该滴度等于或大于T-培养瓶中利用血清培养细胞获得的生产力。如图20A所示，250mL转瓶中Cytodex珠中生长的MDCK细胞产生了高滴度的H1N1、H3N2和乙型疫苗毒株。对于临床生产，可以20L或150L规模在MDCK细胞中生产流感病毒，而对于商品化规模，可利用2,500L生物反应器进行生产。图20B概述了可用于将细胞培养规模放大至商品化生产水平的一种方法。首先将工作细胞库依次从T-75培养瓶放大至T-225培养瓶，再放大至1升转瓶，再到20升，再到300升生物反应器，最后放大至2500升生物反应器。当获得最佳细胞密度时，用原始病毒株接种培养细胞。然后从培养上清液中大量收集病毒。
细胞培养的流感疫苗的纯化方法模仿鸡蛋的流感疫苗的纯化方法(参见，例如PCT公布WO 05/014862和2005年10月4日提交的PCT专利申请PCT/US05/035614)。从细胞中纯化病毒疫苗材料可包括以下任一种或所有方法：均浆、离心澄清、超滤、吸附到硫酸钡上并洗脱、正切线流过滤、密度梯度超离心、层析和除菌过滤。也可包括其它纯化步骤。例如，首先通过离心(如1000-2000×g)足够时间(如10-30分钟)除去细胞碎片和其它大的颗粒物质从而澄清受感染培养物的粗制培养液。或者，培养基经0.8μm醋酸纤维素滤膜过滤以除去完整的细胞和其它大的颗粒物质。然后任选离心(如15,000×g，约3-5小时)澄清的培养基上清液以沉淀流感病毒。将病毒沉淀物重悬在合适缓冲液，例如pH7.4的STE(0.01M Tris-HCl；0.15M NaCl；0.0001M EDTA)或磷酸缓冲盐水(PBS)中后，可利用蔗糖(60％-12％)或酒石酸钾(50％-10％)密度梯度离心浓缩病毒。连续或分步梯度(例如介于12％-60％之间的蔗糖梯度分成四个12％步骤)均合适。以某速度离心各梯度充足时间以使病毒浓缩成回收的可见条带。或者，对于最大规模商品化应用，利用以连续方式操作的区带离心机转头密度梯度离心淘选病毒。
纯化细胞的病毒疫苗材料包括的特征是在(纯化)方法的早期利用
Figure A20058004800600501
一种非特异性核酸内切酶。虽然根据评估细胞DNA致瘤性的研究，MDCK细胞DNA不具有致瘤危险，但
Figure A20058004800600502
处理实际上能消除任何潜在的或假设的风险。在一种纯化方法中，
Figure A20058004800600503
处理后，通过直接流体过滤(DFF)也能除去散装材料中任何残留的完整哺乳动物细胞而澄清材料。然后通过正切线流过滤(TFF)浓缩过滤后的散装液，然后进行其它纯化步骤。包括已良好用于其它病毒系统的亲和层析以及离子交换层析和/或羟基磷灰石层析在内的纯化方法可用于细胞培养流感疫苗的生产。然后利用所开发的方法获得的高度纯化病毒材料生产疫苗材料。例如，为用于减毒活疫苗生产(如
Figure A20058004800600511
)，可采用过滤更换病毒材料的缓冲液制成最终制剂，然后经除菌步骤。用于这种制剂的缓冲液是含有氨基酸赋形剂，例如精氨酸和200mM蔗糖的pH7.0-7.2的磷酸盐或组氨酸缓冲液。如果需要稳定化，也可加入蛋白水解物，例如猪明胶。将疫苗材料配制为长期保存稳定的制剂是理想的。可用于延长保存时间的一种方法是喷雾干燥，一种在干热空气流下将制剂料液喷雾雾化成细小液滴的快速干燥方法。细小液滴蒸发得到溶质构成的干粉(参见，例如美国专利公布2004/0042972)。与常规的冻干方法相比，喷雾干燥的优点是易于放大和生产成本(低)。或者，可采用本领域已知的方法将疫苗材料配制为冷藏稳定液体制剂。例如，2005年10月4日提交的PCT专利申请PCT/US2005/035614描述了配制冷藏稳定的减毒流感疫苗的方法和组合物。
可在纯化方案中加入特征鉴定步骤来监测生产。可采用的特征鉴定步骤包括但不限于荧光聚焦试验(FFA，参见例如上文)，该试验采用简单的抗体结合与荧光染色方法来测定病毒传染力。可采用本领域技术人员已知的许多方法测定总蛋白和DNA来测定最初杂质的残留百分比。可通过计算单位剂量疫苗的病毒传染力(例如，传染力/mg)来测定该制剂的比活性。
实施例8.
临床前动物模型
雪貂是用于评估减毒流感疫苗和组成疫苗的病毒株的减毒程度和免疫原性的可靠动物模型。MCB生产的细胞衍生流感病毒株的性能与鸡蛋生产的相同毒株作比较。在受控研究中直接比较这些材料能高标准地确保这些病毒产物的可比性。
为评估两种疫苗感染或实现“进入”雪貂的能力，轻度麻醉雪貂后鼻内接种细胞或鸡蛋生产的病毒制品。接种后，在几个时间点收集鼻洗涤液，采用几种可用方法之一评估病毒量来评估在雪貂上呼吸道中病毒复制的动力学和水平。用各种剂量进行实验包括多种毒株和不同的三价混合物来归纳细胞培养生产病毒株与鸡蛋生产病毒株的相对传染力。也采用这些相同的研究来评估流感病毒株的免疫原性，这是与病毒初始感染能力天然相关的特性。在接种后各时间点(周)对动物放血并收集鼻洗涤液；利用这些样品评估针对感染的血清抗体应答和鼻IgA应答。可利用这些数据、传染力、血清抗体和粘膜抗体应答的峰值来比较和评估细胞生产疫苗与鸡蛋生产疫苗的相对传染力。预计最可能的结果是细胞和鸡蛋生产的疫苗毒株具有相似的传染力和免疫原性。如果细胞生产的疫苗比鸡蛋生产的疫苗显示更高的传染力或更高的免疫原性，则作进一步研究来评估降低剂量的可能性。
在雪貂模型中进行了许多免疫原性和复制研究来评估一个单位人用剂量的细胞培养生产疫苗的效力。用ca/ts/att病毒株感染通常能在雪貂中引发强烈且快速的抗体应答。此外，常规检验了各ca/ts/att病毒株，这些病毒株显示通过在这些雪貂的鼻咽中复制达到较高滴度但在肺中的水平检测不到而表现出减毒(att)的表型。也评估了这些细胞培养物生长对这些生物学特性的影响。然而，因为att表型是这些病毒株遗传组成的固有部分，不可能观察到任何差异。将一份人用剂量给予这些雪貂后，评估了这些病毒株的生长动力学和交叉反应性。用鸡蛋衍生材料生产的减毒活疫苗可引发能与某遗传谱系内多种病毒株交叉反应的血清抗体；估计细胞衍生的疫苗具有相同能力。
这些可比性评估可有效了解初级病毒产品可能的生物化学和/或生物物理学差异，通过将病毒在人细胞中首次传代或动物研究检测证明这些遗传外差异对ca/ts/att病毒株性能的影响。根据目前的序列信息，用MDCK细胞生产估计不会影响ca/ts/att病毒株的免疫原性性能。
雪貂是经充分证明的流感动物模型，惯常用于评估ca/ts/att病毒株的减毒表型和免疫原性。一般利用8-10周龄的雪貂来评估减毒性能，通常研究设计评估每个测试或对照组n＝3-5只雪貂。利用8周龄-6月龄的雪貂进行免疫原性研究，通常每种测试品或对照组需要n＝3-5只雪貂。这些数量可提供足够的信息从而能获得各组之间统计学有效或在观察上至关重要的比较。大多数研究观察到流感样症状，但不一定。雪貂不表现出食欲或体重降低、鼻或眼排出物；观察到流感样疾病症状是该研究的必需部分，不许使用诸如镇痛剂干预。与主治兽医讨论后合适处置有其它不适症状，例如开放性溃疡或体重明显丧失的雪貂。
虽然参考具体实施方式公开了本发明，但本领域技术人员可设计出本发明的其它实施方式和变化形式而不脱离本发明的真实构思和范围。附加的权利要求书应解释为包含了所有这些实施方式及等价变化形式。例如，可以各种组合使用上述所有技术和设备。如同每份出版物、专利、专利申请或其它文献单独表明出于所有目的纳为参考的程度一样，本申请引用的所有出版物、专利、专利申请或其它文献出于所有目的全文纳为参考。此外，2004年12月23日提交的美国临时申请号60/638,166和2005年1月5日提交的60/641,139出于所有目的全文纳入本文作为参考。

Claims (19)

1.一种细胞培养组合物，其包含非致瘤性MDCK细胞，该细胞是细胞系MDCK(ATCC CCL34)的衍生物。
2.如权利要求1所述的细胞培养组合物，其特征在于，所述组合物不含血清。
3.如权利要求1所述的细胞培养物组合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK细胞是黏着的。
4.如权利要求1、2或3所述的细胞培养组合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK细胞衍生自细胞系MDCK-S(ATCC PTA-6500)。
5.如权利要求1所述的细胞培养组合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK细胞适应于在无血清培养基中生长。
6.如权利要求5所述的细胞培养组合物，其特征在于，所述非致瘤性MDCK细胞来自以下细胞系：MDCK-SF101(ATCC PTA-6501)；MDCK-SF102(ATCC PTA-6502)；和MDCK-SF103(PTA-6503)。
7.一种生产流感疫苗的方法，所述方法包括：
a.感染如权利要求1或6所述细胞培养组合物中的MDCK细胞；
b.培育所述细胞培养组合物；和
c.从所述细胞培养物组合物中分离流感病毒。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述MDCK细胞是黏着的。
9.一种用权利要求7所述方法生产的流感病毒。
10.一种用药学上可接受的载体或赋形剂配制的含权利要求9所述流感病毒多肽的免疫原性组合物。
11.一种预防动物感染流感的方法，所述方法包括给予该动物如权利要求10所述的免疫原性组合物。
12.一种用如权利要求8所述方法生产的流感病毒。
13.一种选自以下的非致瘤性MDCK细胞系：MDCK-S(ATCC PTA-6500)；MDCK-SF101(ATCC PTA-6501)；MDCK-SF102(ATCC PTA-6502)；和MDCK-SF103(ATCC PTA-6503)。
14.一种制备黏着的非致瘤性MDCK细胞系的方法，该细胞系能用含血清的培养基培养以及能被流感病毒感染，所述方法包括以下步骤：
a.使MDCK(ATCC CCL34)细胞适应于在成分明确的培养基和血清中生长；
b.维持生长条件；和
c.建立细胞库。
15.一种通过权利要求14所述方法制备的细胞系。
16.一种制备黏着的非致瘤性MDCK细胞系的方法，该细胞系能用无血清的培养基培养以及能用流感病毒感染，所述方法包括以下步骤：
a.使MDCK(ATCC CCL34)细胞适应于在选自以下的无血清培养基中生长：含有脂质的Taub SF；含有小麦水解物的Taub SF；含有脂质和小麦水解物的Taub SF；含有脂质、小麦水解物和EGF的Taub SF；和含有脂质、小麦水解物、EGF、托酚酮但不含转铁蛋白的Taub SF；
b.维持生长条件；和
c.建立细胞库。
17.一种通过如权利要求16所述方法制备的细胞系。
18.一种选自以下的培养基制剂：MediV SF101；MediV SF102；MediVSF103；MediV SF104和MediV SF105。
19.一种维持动物细胞非致瘤特性的方法，所述方法包括在如权利要求18所述的培养基中培育所述动物细胞。
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