CN102939104A

CN102939104A - 用冻干浓缩疫苗抗原

Info

Publication number: CN102939104A
Application number: CN201180027227XA
Authority: CN
Inventors: S·科玛莱迪; A·斯卡皮尼; B·宝德纳; D·欧哈根; M·辛格
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics AG
Priority date: 2010-06-01
Filing date: 2011-06-01
Publication date: 2013-02-20
Also published as: BR112012030616A2; EP2575873B1; AU2011262312B2; PT2575873E; WO2011151726A3; JP2013527225A; ES2564096T3; JP5976639B2; PL2575873T3; CA2801151A1; WO2011151726A2; EP2575873A2; NZ603863A; EA201291404A1; KR20130081659A; AU2011262312A1; US20130243841A1

Abstract

制备冻干疫苗抗原的方法，包括步骤(i)用离心过滤和/或超滤提高含抗原的液体组合物中该抗原的浓度，提供浓缩抗原和(it)冻干所述浓缩抗原，提供冻干疫苗抗原。所述冻干的材料可重建并用于疫苗制剂。该方法尤其用于流感疫苗抗原。

Description

用冻干浓缩疫苗抗原

本申请要求美国临时申请61/396,720（2010年6月1日提交）的优先权，其全部内容通过引用纳入本文以用于所有目的。

技术领域

本发明涉及加工用于疫苗的抗原溶液的领域。

技术背景

疫苗生产中，通常会发生批量生产的抗原浓度超过最终患者制剂浓度的情况，因此所述工艺包括稀释散装部分的步骤。然而，在一些情况中，需要增加水性散装中的抗原浓度，本发明涉及浓缩抗原的方法。有用的方法应增加抗原浓度而不破坏其免疫原性。

一种需要抗原浓度的情况是用于递送小体积物质的新递送技术。例如，疫苗能通过微针[2,3]或通过薄膜或条[1,14-17]递送。这些技术递送的体积远小于常用的肌内注射0.5ml，但它们可能需要相同抗原量，这通常要求更浓缩的散装抗原。

一种能使个体流感病毒血凝素(HA)浓度从125-500μg/ml增加至14mg/ml的现有浓缩方法包括将起始体积的水性材料正切流动过滤(TFF)到10mg/ml浓度，然后冻干，随后在小于起始体积的水性体积中重建冻干物。此方法能在3种不同散装单价HA上进行，其作为单个三价水性组合物的重建能提供42mg/ml的终HA浓度。

本发明的目标是提供进一步和改进的方法用于增加疫苗生产所用材料中的抗原浓度，特定用于流感疫苗生产，如不通过肌内注射递送的流感疫苗。

发明内容

与用TFF浓缩抗原的现有方法相反，本发明的抗原浓缩过程使用离心过滤和/或超滤。如同现有方法，浓缩材料随后能冻干，所冻干材料能重建用于进一步应用。

因此，本发明提供制备冻干疫苗抗原的方法，包括步骤(i)用离心过滤和/或超滤提高含抗原的液体组合物中该抗原的浓度，提供浓缩抗原和(ii)冻干所述浓缩抗原，提供冻干疫苗抗原。

本发明还提供由该方法制备的冻干疫苗抗原。

冻干疫苗抗原能用于配制疫苗，或能重建且随后配制疫苗。该重建的理想体积小于所述液体组合物原始体积，即步骤(i)开始时的体积，并小于浓缩抗原的冻干前体积，即步骤(ii)开始时的体积，因为这再次增加抗原浓度。所述重建的材料可用于配制疫苗。

本发明还提供了通过此方法配制的病毒。

所述方法特定用于制备冻干的流感疫苗抗原，所述冻干的流感疫苗抗原用于配制流感疫苗。

抗原

本发明用于从各种来源浓缩抗原。所述抗原可来自细菌、病毒、真菌或寄生虫。因此所述疫苗抗原用于提供保护抵御细菌、病毒、真菌和/或寄生虫引起的疾病。

用于本发明的常见细菌包括但不限于：

·包特氏菌属（Bordetella），如百日咳博德特菌（B.pertussis）

·梭菌，如破伤风梭菌（C.tetani）和郝氏梭菌（C.hotulmum）

·棒状杆菌（Corynebacteria），如白喉棒状杆菌（C.diphtheriae.）

·巴斯德菌（Pasteurella），如流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）

·分枝杆菌(Mycobacteria),如结核分枝杆菌（M.tuberculossi）、牛分枝杆菌（M.bovis）和减毒卡介苗（Bacillus Calmette Guerin）

·奈瑟球菌（Neisseria），如脑膜炎奈瑟球菌（N.meningitidis）和淋病奈瑟氏球菌（N.gonorrhoeae）

·沙门菌（Salmonella）,如伤寒沙门菌（S.typhi）、副伤寒沙门菌（S.paratyphi）、鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）、肠炎沙门氏菌（S.enteritidis）

·链球菌（Streptococci），如肺炎链球菌（S.pneumoniae(pneumococcus)）、无乳链球菌（S.agalactiae）和化脓链球菌（S.pyogenes）

用于本发明的典型病毒一般包括但不限于：

·正粘病毒,如A、B或C型流感病毒。A型或B型流感病毒可以是大流行（每年/季节）毒株，或来自可能引起爆发流行的毒株(即，与目前流行毒株的血凝素相比具有新型血凝素的流感毒株，或对禽类对象有致病性并可能水平传播给人群的流感毒株，或对人有致病性的流感毒株)。根据特定季节和毒株特性，A型流感病毒可以衍生自下列一种或多种血凝素亚型：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。更多的细节在下文中给出。

·副粘病毒，如肺炎病毒(RSV)、副粘病毒(PIV)和麻疹病毒(麻疹)。

肺炎病毒或偏肺病毒，例如呼吸道合胞病毒（RSV）、牛呼吸道合胞病毒、小鼠肺炎病毒和火鸡鼻气管炎病毒。优选所述肺炎病毒是RSV或人偏肺病毒(HMPV)。

·副粘病毒，如1、2、3或4型副流感病毒(PIV)、流行性腮腺炎病毒（Mumps）、仙台病毒、猴副流感病毒5型、牛副流感病毒和新城疫病毒。优选所述副粘病毒是PIV或流行性腮腺炎病毒。

·小核糖核酸病毒：如肠道病毒、鼻病毒、肝核糖核酸病毒、心脏病毒和口蹄疫病毒。肠道病毒包括1、2或3型脊髓灰质炎病毒，1-22型和24型柯萨奇病毒A，1-6型柯萨奇病毒B，1-9、1-27和29-34型艾柯(ECHO)病毒和肠道病毒68-71型。优选所述肠道病毒是脊髓灰质炎病毒，例如1型毒株如Mahoney或Brunenders，2型毒株如MEF-I或3型毒株如Saukett。嗜肝RNA病毒属（又称为肝病毒属）是甲肝病毒。

·披膜病毒，如风疹病毒、α病毒或动脉炎病毒。优选风疹病毒属，例如风疹病毒。用于灭活的有用α病毒包含水生α病毒，例如鲑鱼胰腺病病毒（salmonpancreas disease virus）和昏睡病病毒。

·黄病毒，如蜱媒脑炎(TBE)、登革热(1、2、3或4型)、黄热病、日本脑炎、西尼罗河脑炎、圣路易斯脑炎、俄国春夏脑炎、波瓦生脑炎。

丙肝病毒(HCV)。

·瘟病毒，如牛病毒性腹泻(BVDV)、猪瘟(CSFV)或边界病(BDV)。

嗜肝DNA病毒，如乙肝病毒。

杆状病毒，例如恐水病病毒(如狂犬病病毒)和水泡病毒(VSV)。

·杯状病毒例如沃克病毒，和诺沃克样病毒例如夏威夷病毒和雪山病毒，和水泡疹病毒例如猪水疱疹病毒。

·冠状病毒，如SARS、人呼吸道冠状病毒、禽传染性支气管炎(IBV)、小鼠肝炎病毒(MHV)和猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)。

逆转录病毒，如肿瘤病毒、慢病毒或泡沫病毒。肿瘤病毒可以是HTLV1、HTLV-2或HTLV-3。慢病毒可以是SIV、HIV1或HIV-2。

呼肠孤病毒，如正呼肠孤病毒、轮状病毒、环状病毒或科罗拉多壁虱热病毒（Coltivirus）。

·细小病毒，例如细小病毒B19或博卡病毒。

人疱疹病毒，如单纯疱疹病毒(HSV)，水痘-带状疱疹病毒(VZV)，EB病毒(EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人疱疹病毒6型(HHV6)，人疱疹病毒7型(HHV7)和人疱疹病毒8型(HHV8)。

·乳头状多瘤空泡病毒，如乳头瘤病毒和多瘤病毒。乳头瘤病毒包括HPV血清型1、2、4、5、6、8、11、13、16、18、31、33、35、39、41、42、47、51、57、58、63和65。

·腺病毒，包含任何人腺病毒A、B、C、D、E、F或G。

本发明理想用于就病毒制备疫苗，特别是疫苗抗原为病毒表面糖蛋白的病毒。因此本发明理想用于浓缩流感病毒抗原血凝素以制备流感病毒疫苗，如下文所详述。步骤(i)和(ii)和之后的重建可提供HA含量>5mg/ml，甚至>10mg/mL的流感疫苗抗原。

液体组合物

本发明方法提高抗原在液体组合物中的浓度，从而提供浓缩抗原用于配制目的。

优选的液体组合物是从未在步骤(ii)之前冻干的组合物。优选的液体组合物在步骤(i)开始时基本不含冻干保护剂。因此组合物可基本不含外源糖醇（尤其是：山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、赤藻糖醇、木糖醇）和/或外源二糖(尤其是:蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖、乳糖、纤维二糖)。液体组合物中(山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖、乳糖、纤维二糖)的组合浓度可低于10mg/ml(即低于1%)且理想地低于1mg/ml如低于0.1mg/ml。

常用的液体组合物是散装疫苗如含有用于至少500单独人单位剂量疫苗的足够抗原。

液体组合物可为单价(即含仅针对一种病原体提供保护的疫苗抗原)或多价(即含针对多于一种病原体提供保护的疫苗抗原，所述病原体包括多于一种的不同非交叉保护病原体如多重脑膜炎球菌血清型或多重A型流感病毒血凝素型)。

本发明可使用具有各种疫苗抗原浓度的液体样品。通常所述液体样品包括浓度至少为1μg/ml的疫苗抗原。

浓缩步骤

本发明方法涉及用浓度离心过滤和/或超滤增加抗原浓度的步骤。

离心过滤涉及通过滤器的液体离心。所述滤器保留抗原用于浓缩但不保留溶剂或较小溶质。随着滤出物体积增加，滞留物中的抗原浓度也增加。该技术通常使用固定角转子。各种合适的离心过滤设备可市售获得，如商标为Centricon^TM、Vivaspin^TM和Spintek^TM的产品。选择所述滤器的截留值从而感兴趣的抗原保持在滞留物中。

超滤涉及使用流体静压力以迫使液体面对半透膜。所述滤器保留待浓缩抗原但不保留溶剂或较小溶质。流体静压力的连续施用使滤出物体积增加，且因此滞留物中的抗原浓度也增加。很多超滤膜市售可得。超滤膜的截留分子量（MWCO）确定了哪种溶质能穿过所述膜（即进入滤液）和哪种溶质保留（即在滞留物中）。选择本发明所用滤器的MWCO从而几乎所有感兴趣的抗原保留在滞留物中。

无论选择何种技术，优选使感兴趣的抗原浓度增加至少n倍，其中n为5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、或更高。

冻干步骤

抗原浓缩后，本发明的方法冻干所述浓缩抗原以提供冻干疫苗抗原。

冻干通常涉及腔室内的三个阶段:(a)冷冻;(b)初级干燥;和(c)二级干燥。步骤(a)将偶联物中的流动水冷冻。步骤(b)中所述腔室压力降低（如<0.1Torr）并对产品加热使冷冻的水升华。步骤(c)中的温度增加以解吸任何结合水如结晶水，直到残留的水含量降至需要的水平。

冷冻前，典型冻干的初始步骤是添加冻干保护剂。在一些实施方式中，冻干保护剂可在步骤(i)的浓缩之前添加，但优选在浓缩后添加，即在步骤(i)结束或步骤(ii)开始时。这使得在冻干冷冻开始时更容易控制所存在的冻干保护剂含量。

因此，本发明方法涉及添加一种或更多冻干保护剂到浓缩抗原中的步骤。合适的冻干保护剂包括但不限于糖醇（如山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、赤藻糖醇、木糖醇）和二糖（如蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖、乳糖、纤维二糖）。蔗糖和甘露糖醇（或其混合物）是本发明使用的优选冻干保护剂。

冻干后，冻干疫苗抗原可重建。该重建可使用水（如注射用水wfi）或缓冲液（如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、硼盐酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液）。包含的缓冲液一般是5-20mM。优选磷酸盐缓冲液。

步骤(i)浓缩第一液体体积的疫苗抗原，提供在第二（减少）液体体积中有相同抗原量的组合物。步骤(ii)干燥该浓缩的材料。该干燥的材料可在第三液体体积中重建，若所述第三体积大于所述第一体积，则全过程未能浓缩抗原。相似地，若所述第三体积大于所述第二体积，所述重建步骤倒退回浓缩形式。因此，所述第三体积等于或优选小于所述第二体积。因此所述冻干/重建步骤可实现进一步的抗原浓缩。所述第三体积等于（或大于）第二体积的实施方式仍用于例如缓冲液更换等，但这并不优选。

制剂

冻干疫苗抗原可用于制备疫苗，但通常先重建。

本发明可用于制备各种疫苗制剂。增加的抗原浓度表明本发明理想地用于涉及递送小体积材料给患者的技术。例如，本发明用于制备单位剂量体积为0.1ml或更少（如用于皮内注射）的液体疫苗制剂。本发明还用于制备固体（包括非冻干固体）疫苗制剂，因为这些可能需要高抗原浓度。如下所详述，合适的固体制剂包括但不限于生物可降解的固体微针、包被微针和口服薄膜。因此，本发明方法中的制备步骤可包括：从所述冻干疫苗抗原制备固体疫苗形式。

本发明配制的疫苗可从冻干步骤中保留冻干保护剂。因此疫苗可包括例如一种或多种山梨糖醇、甘露糖醇、麦芽糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳果糖、乳糖和/或纤维二糖。

本发明疫苗理想上不含菊糖。

生物可降解的固体微针

可用本发明制备的一种有用的固体制剂为生物可降解的固体微针。这些通常不单独给予，而是同时给予多重针，如含多种微针的皮肤贴片。

所述微针为固体，从而在其在储存期间保留其结构完整性且可在施用所述贴片时穿透对象皮肤。皮肤穿透所需的机械特性取决于测试生物体，但其强度通常足以穿透人类皮肤。形成合适固体针的材料容易获得且可对其测试以测定用于任何具体需要的合适浓度等。

所述微针为生物可溶性和生物可降解。因此所述贴片施用后所述固体材料在皮肤中溶解，这与参考文献2和3（见下）中所用的包被微针相反。溶解后，所述材料可代谢产生无害的终产物。施用所述贴片后溶解的时间尺度可不同，但溶解通常在施用贴片后立即开始（如10秒内）且可持续如多至1分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟、1小时、5小时、10小时或24小时，直到所述微针完全溶解。有合适体内溶解动力学的材料容易获得且其可不同并进行测试以确定用于任何所需溶解概况的合适浓度等。

用于形成微针的合适基质材料通常为生物可溶性或生物可降解聚合物，且这些可包括一种或多种碳水化合物。例如，所述材料可包括纤维素、糊精、右旋糖酐、二糖、壳聚糖、壳质等或其混合物。也可使用其它GRAS材料。这些材料可通过将其纳入用于重建所述冻干疫苗抗原的液体中而方便地与疫苗抗原组合。

合适的纤维素包括但不限于纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素和羟丙基甲基纤维素。合适的糊精包括但不限于麦芽糖糊精、环式糊精、淀粉糊精、艾考糊精（icodextrin）、黄糊精和白糊精。合适的二糖包括但不限于：蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、松二糖、和纤维二糖。一种用于形成生物可溶性和生物可降解微针的合适材料为糊精/海藻糖混合物。

所述微针可透过皮肤。其应该足够长以穿透表皮从而将材料递送到真皮（即皮内递送），但理想地没有长到能透入到或穿过下皮。其通常为100-2500μm长如1250-1750μm长或约1500μm长。递送时，顶部可透过真皮，但所述针的基部可保留在表皮内。

所述微针可具有各种形状和几何学。其通常沿向皮点渐缩即为锥形或圆锥型。锥形微针通常具有<500μm的最大直径。

单一贴片通常包括多种微针，如每贴片≥10、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80、≥90、≥100、≥200、≥300、≥400、≥50、≥750、≥1000或更多种。贴片包括多种微针时，其可包括结合所有微针的背衬层。单一背衬层通常具有≥20种突出的微针。贴片包括多种微针时，这些可以规律重复形式或阵列排列，或可无规律排列。

贴片通常具有3cm²或更小的面积，例如<2cm²或<1cm²。直径0.5cm-1.5cm的圆形贴片有用。

贴片上微针的密度可不同，但可为≥10cm^-2、≥20cm^-2、≥30cm^-2、≥40cm^-2、≥50cm^-2、≥60cm^-2、≥70cm^-2、≥80cm^-2或更高。

本发明的贴片具有面对皮肤的内面和面对环境的外面。所述内面可包括粘合剂以协助粘附对象皮肤。存在时，其优选不位于所述微针自身上，即所述微针是无粘合剂的。贴片可具有提供外部粘合边缘的其他背衬而不是在内面具有粘合剂，以用于将贴片粘附于皮肤，如橡皮膏或烟碱贴片所示。

上述贴片可通过下述技术和参考文献4-8的指导而制备。例如，可制备具有1.5mm长微针腔的模具。糊精和海藻糖的基质材料可与流感疫苗组合，且该水性材料可在模具中离心浇注，形成固体微针阵列。然后纤维素凝胶可在所述基质/疫苗混合物（如已形成膜的混合物）上浇注，形成贴片上的背衬层。当该背衬层干燥时，其可移除，产生突出固体微针的贴片。因此本发明方法中的配制步骤可包括：(a)混合生物可溶性和生物可降解基质材料和所述疫苗抗原，通常是通过重建冻干疫苗抗原；和(b)添加步骤(a)的混合物到含腔的模具中以形成微针。还可包括(c)将所述混合物留在模具中，形成固体微针；(d)任选地，将材料施用于所设置的微针，提供背衬层；和(e)将所述微针（和任选的背衬层）从模具中移除。

贴片可包装在如在氮气下密封的单独小袋中，然后加热密封。其需要小心储存以防止损坏所述微针。

包被微针

可用本发明制备的另一种有用的固体制剂为包被微针。这些通常不单独给予，而是例如通过多种微针同时给予多重针。一种合适的产品市售商标为Macroflux^TM(佐萨诺公司（Zosano）)。

所述微针为固体，从而在其在储存期间保留其结构完整性且可穿透对象皮肤。皮肤穿透所需的机械特性取决于测试生物体，但其强度通常足以穿透人类皮肤。所述微针为固体且在插入患者皮肤后保持完整（与上述生物可降解微针相反）。形成合适固体微针的材料容易得到且可对其测试并就具体需要进行选择如金属（如不锈钢）或聚合物（如理想地药物级的聚碳酸酯）。金属针可通过使用激光切割和电抛光来制造[9]。聚合物针可通过微复制和/或微成型（包括注射成型）来制造。合适的微针如参考文献2、3和9-13所公开。

本发明抗原可包被在所述微针上。此包被可通过简单过程如浸涂实现，如涉及浸渍步骤然后干燥步骤（如通过蒸发），按需重复。其它有用包被技术公开于参考文献11。因此本发明方法中的配制步骤可包括：将冻干疫苗抗原或其重建形式应用于一种或多种固体微针的表面，提供包被微针设备用于疫苗注射。

应用于所述针的包被溶液可包括一种或多种生物可溶性和生物可降解基质材料，且这些可包括一种或多种碳水化合物。例如，所述材料可包括纤维素、糊精、右旋糖酐、二糖、壳聚糖、壳质等或其混合物。也可使用其它GRAS材料。合适的纤维素、糊精和二糖如上所列。这些材料可通过将其纳入用于重建所述冻干疫苗抗原的液体中而方便地与疫苗抗原组合。

因此本发明方法中的配制步骤可包括：(a)混合生物可溶性和生物可降解基质材料与所述疫苗抗原，通常通过重建冻干疫苗抗原；和(b)将步骤(a)的混合物应用于一种或多种固体微针的表面以提供包被的微针设备用于所述疫苗注射可通过使用参考文献11所述的一种或多种“促沉积组分”来增强包被。

上述施用步骤可包括施用子步骤，然后是干燥子步骤，且此对子步骤可进行一次或多次如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。

设备中的微针可在施用时透过所述皮肤。其需要足够长以穿透表皮从而将材料递送到真皮（即皮内递送），但理想地没有长到能透入或穿过下皮。其通常为100-2500μm长如250-750μm长或约1500μm长。递送时，顶部可穿透真皮，但所述针的基部可保留在表皮内。所述针可施用在患者皮肤上30秒-30分钟，然后可移除。

微针设备通常包括多种微针，如每设备≥10、≥20、≥30、≥40、≥50、≥60、≥70、≥80、≥90、≥100、≥200、≥300、≥400、≥50、≥750、≥1000、≥1500、≥2000或更多种（如每设备300-1500种）。当设备包括多种微针时，这些通常全部结合单一背衬层。设备包括多种微针时，这些可以规律重复形式或阵列排列，或可无规律排列。

微针设备通常具有3cm²或更小的面积，例如<2cm²或<1cm²。直径0.5cm-1.5cm的圆形设备有用。

微针密度可不同，但可为≥10cm^-2、≥20cm^-2、≥30cm^-2、≥40cm^-2、≥50cm^-2、≥60cm^-2、≥70cm^-2、≥80cm^-2或更高。各微针之间2mm且密度为14种微针/cm²的设备是有用的。

微针设备具有面对皮肤的内面和面对环境的外面。所述内面可包括粘合剂以协助粘附对象皮肤。存在时，其优选不位于所述微针自身上，即所述微针是无粘合剂的。设备可具有提供外部粘合边缘的其他背衬而不是在内面具有粘合剂，以用于将设备粘附于皮肤。

微针设备可包装在如在氮气下密封的单独小袋中，然后加热密封。其需要小心储存以防止损坏所述微针。

薄膜

可用本发明制备的另一有用固体制剂是薄膜如口服薄膜。这些膜潮湿且在接触唾液和口腔组织后快速溶解，从而在口中释放疫苗抗原。这些薄膜的主要组分通常为一种或多种亲水聚合物，其可具有良好的粘附性以提供完全溶解前对颊部组织的强力粘附。相似的膜可用于非口头递送如用于参考文献14所公开的经皮递送。

合适的薄膜初始施用时通常为10-500μm厚，如75-150μm厚。其他尺寸可适于装入患者嘴里，如成人嘴里或婴儿嘴里。

一种合适的膜类型公开于参考文献15。该膜包括粘膜粘附性双层膜，具有(i)Noveon和Eudragit S-100作为粘膜粘附层和(ii)药物腊用作不透性背衬层。该膜的其它细节如文献16所述。

另一合适的膜类型公开于参考文献17。该膜包括：(a)一种或多种水溶性聚合物;(b)一种或多种粘膜粘附聚合物;(c)包封在微颗粒中的疫苗抗原。合适的水溶性聚合物包括但不限于：支链淀粉、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、海藻酸钠、聚乙烯乙二醇、黄原胶、黄蓍胶、瓜尔胶、阿拉伯树胶、阿拉伯胶、丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯共聚物、羧基乙烯基共聚物(carboxyvinylcopolymer)、淀粉酶、高直链淀粉、羟丙基高直链淀粉、糊精、果胶、甲壳素、果聚糖、爱生兰、胶原、明胶、醇溶蛋白、面筋、大豆蛋白分离物、乳清蛋白和酪蛋白。合适的粘膜粘附聚合物包括但不限于：壳聚糖、透明质酸盐、藻酸盐、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(L-赖氨酸)、聚(乙烯亚胺)、聚(环氧乙烷)、聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)和其衍生物或共聚物。有用的微粒用存在于嘴中时释放所述微粒的包封内含物（即疫苗抗原）的材料制备。

参考文献14中的膜包括用于经皮递送的阳离子聚（β-氨基酯）。

用于本发明的口腔膜可包括调味剂以使疫苗在给予期间更可口。

薄膜可用各种方法制备，包括但不限于：溶剂浇铸；热熔挤出；固体分散挤出；和滚动。

因此本发明方法中的配制步骤可包括：(a)混合疫苗抗原与一种或多种口服可溶性聚合物，通常是通过重建冻干疫苗抗原；和(b)用步骤(a)的混合物形成膜，提供适于颊部给予所述疫苗的薄膜。

本发明方法中的配制步骤可包括：(a)混合疫苗抗原与一种或多种局部可溶性聚合物如聚(P-氨基酯)，通常是通过重建冻干疫苗抗原；和(b)用步骤(a)的混合物形成膜，提供适于经皮给予所述疫苗的薄膜。

这些膜可包装在如在氮气下密封的单独单位剂量小袋中，然后加热密封。所述小袋需不透水以在储存期间保持膜干燥。

治疗方法和疫苗给予

本发明配制的疫苗可通过皮肤、通过颊部组织等递送给对象。因此本发明提供使对象产生免疫应答的方法，所述方法包括向对象给予本发明配制的疫苗的步骤。这可涉及例如向对象皮肤施用微针贴片或设备，从而所述微针穿透所述对象真皮，或向对象颊部组织或舌头施用薄膜。

本发明还提供冻干抗原用于为对象接种疫苗的方法。本发明还提供冻干抗原在制造用于引起对象免疫应答的药物中的应用。

本发明还提供重建冻干抗原用于为对象接种疫苗的方法。本发明还提供重建冻干抗原在制造用于引起对象免疫应答的药物中的应用。

疫苗产品适于将疫苗给予人类或非人动物对象。

这些方法和应用引起的免疫应答通常包括抗体应答，优选保护性抗体应答。

微针贴片或设备可通过简单人工应用（如用粘性膏药或用已知皮肤贴片）而施用于皮肤或可用弹簧驱动的注射器施用。

可用按照本发明制备的疫苗治疗儿童和成年人。

可通过单剂量方案或多剂量方案进行治疗。多剂量可以用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。一般以至少1周（例如约2周、约3周、约4周、约6周、约8周、约10周、约12周、约16周等）的间隔给予多个剂量。

流感疫苗接种

本发明方法理想用于制备流感疫苗。目前可以获得各种形式的流感病毒疫苗(例如参见参考文献18的第17和18章)且当前疫苗是基于灭活或活的减毒病毒。灭活疫苗（全病毒、裂解病毒颗粒或表面抗原）通过肌肉内或皮内注射给予，而活疫苗鼻内给予。本发明可使用所有这些疫苗形式。

本发明的一些实施方式使用表面抗原流感疫苗（灭活）。该疫苗比裂解或全病毒颗粒疫苗含更少病毒组分。其包括表面抗原血凝素，通常还有神经氨酸苷酶。从流感病毒中制备这些蛋白质纯化形式的方法为本领域熟知。FLUVIRIN^TM、AGRIPPAL^TM和INFLUVAC^TM产品是表面抗原流感疫苗的示例。

本发明使用表面抗原流感疫苗时，此病毒可在蛋中或细胞培养物中生长（见下）。目前培养疫苗用流感病毒的标准方法采用含胚的SPF鸡蛋，由鸡蛋内容物(尿囊液)纯化病毒。如果使用基于鸡蛋的病毒培养，则可将一种或多种氨基酸与病毒一起引入鸡蛋的尿囊液中[24]。病毒先在蛋中生长。然后从感染的蛋中收获。可通过各种方法由尿囊液收获病毒颗粒。例如，纯化方法可包括用含有去污剂以破坏病毒颗粒的线性蔗糖梯度溶液进行区带离心。任选稀释后，可通过渗滤纯化抗原。灭活病毒的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理：去污剂、甲醛、β-丙内酯、亚甲基蓝、亚甲蓝、补骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二元乙基胺、乙酰基乙烯亚胺或其组合。本领域已知病毒灭活的非化学方法，例如UV射线或γ射线辐射。

本发明的一些实施方式可使用全病毒、裂解病毒、病毒体、活的减毒病毒或重组血凝素。通过就例如是否存在额外的流感病毒蛋白来测试其抗原，这些疫苗可与表面抗原疫苗容易地区分。

完整的灭活病毒可通过从含病毒液体（如获自蛋或培养基）中收获病毒颗粒而获得，然后如上所述测试它们。

通过用去污剂(如乙醚、聚山梨醇酯80、脱氧胆酸盐、三正丁基磷酸盐、曲通X100、曲通N101、溴化十六烷基三甲铵、特吉托ΝP9等)处理纯化的病毒颗粒来获得裂解病毒颗粒，从而产生亚病毒颗粒制剂，包括'吐温-醚'裂解方法。裂解流感病毒的方法为本领域熟知，例如参见参考文献19-24等。一般使用破坏浓度的裂解剂破坏或片段化完整病毒来裂解病毒，无论该病毒有无感染性。这种破坏导致病毒蛋白的完全或部分溶解，改变病毒的完整性。优选的裂解剂是非离子型和离子型(例如阳离子)表面活性剂，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜碱、甜菜碱、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季铵化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲铵)、三正丁基磷酸酯、十四烷基三甲铵盐、脂质体（lipofectin）、脂质体转染试剂(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性剂，如曲通X100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐温表面活性剂)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一种有用的裂解方法利用脱氧胆酸钠和甲醛的连续作用，并且裂解可在病毒颗粒初始纯化期间(例如在蔗糖密度梯度溶液中)进行。因此，裂解工艺可包含：澄清含病毒颗粒的物质(以去除非病毒颗粒物质)，浓缩收获的病毒颗粒(例如使用吸附方法，如CaHPO₄吸附)，从非病毒颗粒物质分离全病毒颗粒，用裂解剂在密度梯度离心步骤中裂解病毒颗粒(例如，用含有裂解剂如脱氧胆酸钠的蔗糖梯度)，然后过滤(例如超滤)以去除不需要的物质。可将裂解病毒颗粒重悬于磷酸钠缓冲的等渗氯化钠溶液中。裂解疫苗的示例有BEGRIVAC^TM、INTANZA^TM、FLUARIX^TM、FLUZONE^TM和FLUSHIELD^TM产品。

病毒体是无病毒样脂质体颗粒的核酸[25]。其可通过用去污剂溶解病毒，然后去除核衣壳和重建含病毒糖蛋白的膜来制备。另一种制备病毒体的方法包括将病毒膜糖蛋白加入过量磷脂中，得到膜中具有病毒蛋白质的脂质体。

活的减毒病毒获自病毒（生长在蛋或细胞培养物中），但所述病毒并非灭活。然而，所述病毒为减毒的（"att"）如从而在人流感病毒感染的雪貂模型中不产生流感样疾病。其还可为冷适应（"ca"）毒株即其可在25°C有效复制，该温度对许多野生型流感病毒的复制有限制性。其还可为温度敏感性（"ts"）即其复制限于许多野生型流感病毒有效生长的温度（37-39°C）。ca、ts和att表型的累积效果是减毒疫苗中的病毒可在鼻咽中复制以诱导通常人类患者的保护免疫，但不引起疾病即其对目标人群的一般给予是安全的。这些病毒可通过从含病毒颗粒的液体中（如通过离心澄清所述液体后）纯化病毒颗粒来制备，然后用缓冲液（如含蔗糖、磷酸钾和谷氨酸单钠）稳定。活的疫苗包括FLUMIST^TM产品。尽管本发明可使用活疫苗，但优选使用非活疫苗。

作为使用获自病毒颗粒的抗原的替代方法，可以在重组宿主中(例如在昆虫细胞系如Sf9中使用杆状病毒载体)表达血凝素，以纯化形式[26-28]或病毒样颗粒形式(VLP；例如见文献29和30)使用。

本发明的一些实施方式使用生长在细胞培养物中而不是蛋中的病毒制备的流感疫苗。使用细胞培养时，病毒生长底物通常是哺乳动物来源的细胞系。合适的哺乳动物细胞来源包括但不限于仓鼠、牛、灵长类(包括人类和猴)，以及犬细胞。可使用各种细胞类型，例如肾细胞、成纤维细胞、视网膜细胞、肺细胞等。合适仓鼠细胞的例子是名为BHK21或HKCC的细胞系。合适的猴细胞是例如非洲绿猴细胞，如Vero细胞系中的肾细胞。合适的犬细胞是(例如)肾细胞，如MDCK细胞系。因此，合适的细胞系包括但不限于：MDCK、CHO、293T、BHK、Vero、MRC5、PER.C6、WI-38等。用于培养流感病毒的优选哺乳动物细胞系包括：MDCK细胞[31-34]，衍生自马达二氏(Madin Darby)犬肾；Vero细胞[35-37]，衍生自非洲绿猴(Cercopithecus aethiops)肾；或PER.C6细胞[38]，衍生自人胚视网膜母细胞。这些细胞系可广泛获得，例如来自美国典型细胞培养物保藏中心(ATCC)、Coriell细胞库、或欧洲细胞培养物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各种不同Vero细胞，目录号为CCL-81、CCL-81、CRL-1586和CRL-1587；并提供MDCK细胞，目录号为CCL-34。PER.C6可获自ECACC，保藏号为96022940。哺乳动物细胞系的次优选替代方案是可以在禽细胞系上培养病毒[例如参考文献39-41]，这些细胞系包括衍生自鸭(如鸭视网膜)或母鸡的细胞系。禽细胞系的例子包括禽胚胎干细胞[39.42]和鸭视网膜细胞[40]。合适的禽胚胎干细胞包括衍生自鸡胚胎干细胞的Ebx细胞系，EB45、EB14和EB14-074[43]。也可使用鸡胚成纤维细胞(CEF)。

用于培养流感病毒的最优选细胞系是MDCK细胞系。原始MDCK细胞系可购自ATCC(CCL-34)，但也可使用该细胞系的衍生物。例如，参考文献31公开了适合悬浮培养生长的MDCK细胞系('MDCK 33016'，保藏号DSM ACC 2219)。类似的，参考文献44公开了在无血清培养基中悬浮培养生长的MDCK衍生细胞系('B-702'，保藏号FERM BP-7449)。参考文献45公开了非致瘤性MDCK细胞，包括'MDCK-S'(ATCC PTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCC PTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCC PTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。参考文献46公开了非常容易感染的MDCK细胞系，包括‘MDCK.5F1’细胞(ATCC CRL 12042)。可使用任何这些MDCK细胞系。

在哺乳动物细胞系上培养病毒时，本发明产品宜不含鸡蛋蛋白质(如卵清蛋白和卵类粘蛋白)和鸡DNA，从而降低可能的变应原性。

本发明细胞衍生产品中的血凝素与鸡蛋衍生的病毒相比具有不同的糖基化形式。因此，所述HA(和其它糖蛋白)可包含鸡蛋中未见的糖形。有用的HA包括犬糖形。

蛋衍生材料和鸡糖形的缺失提供可使细胞培养物中所生长病毒制备的疫苗与蛋衍生产品区分的方法。

在细胞系上培养病毒时，生长培养物以及用于起始培养的病毒接种物优选不含(即经污染检测且得到阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环病毒和/或细小病毒[47]。特别优选不存在单纯疱疹病毒。

为了在细胞系如MDCK细胞上生长，可以在悬浮[31，48，49]或贴壁培养的细胞上培养病毒。一种适合悬浮培养的MDCK细胞系是MDCK 33016(保藏号为DSM ACC 2219)。或者，可采用微载体培养。

优选在无血清培养基和/或无蛋白培养基中培养支持流感病毒复制的细胞系。在本发明中，培养基称为无血清培养基，其中没有人或动物来源血清的添加剂。无蛋白应理解为在不含蛋白质、生长因子、其它蛋白添加剂和非血清蛋白质的情况下发生细胞增殖的培养物，但可任选包含诸如胰蛋白酶和其它蛋白酶等可能是病毒生长所必需的蛋白质。在这类培养物中生长的细胞本身天然含有蛋白质。

支持流感病毒复制的细胞系优选在病毒复制期间于37℃以下生长[55]，例如30-36°C,31-35°C,或33±1°C。

在培养细胞中增殖病毒的方法通常包括以下步骤：用要培养的毒株接种培养的细胞；将感染细胞培养一段所需时间以增殖病毒，如根据病毒效价或抗原表达进行测定(例如，在接种后培养24-168小时)并收集增殖的病毒。用1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选1:50-1:10的病毒(由PFU或TCID50测定)与细胞比接种培养的细胞。将病毒加入细胞悬液，或应用于单层细胞，病毒在25-40℃，优选28-37℃吸附到细胞上至少60分钟，但通常短于300分钟，优选90-240分钟。可通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(例如单层)，以提高所收获培养物上清中的病毒含量。然后，可灭活或冷冻储存收获的液体。可以约0.0001-10、优选0.002-5、更优选0.001-2的感染复数(″m.o.i.")感染培养的细胞。更优选以约0.01的m.o.i.感染细胞。可以在感染后30-60小时收获感染的细胞。优选在感染后34-48小时收获细胞。更优选在感染后38-40小时收获细胞。通常在细胞培养期间加入蛋白酶(一般为胰蛋白酶)以释放病毒，可在培养期间任何合适的阶段加入蛋白酶。

含制备自细胞培养物的疫苗的疫苗产物优选含有每剂量低于10ng(优选低于1ng，更优选低于100pg)残留的宿主细胞DNA，尽管可能存在痕量宿主细胞DNA。

任何残留宿主细胞DNA的平均长度优选小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp等。

在疫苗制备过程中可采用标准纯化方法，如色谱等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如用DNA酶处理来增强对残留宿主细胞DNA的移除。参考文献51和52公开了一种减少宿主细胞DNA污染的便捷方法，该方法包括两步处理，先使用DNA酶(如Benzonase)处理(可以在病毒生长过程中使用)，然后使用阳离子去污剂(如CTAB)处理(可以在病毒颗粒破坏过程中使用)。也可利用烷化剂如β丙内酯处理来去除宿主细胞DNA，该方法也宜用于灭活病毒颗粒[53]。

本发明的一些实施方式使用单价流感疫苗(即它包含来自单一流感病毒株的血凝素抗原)，但在一些实施方式中它可以是多价疫苗，例如二价疫苗、三价疫苗、四价疫苗或>4价疫苗（即包括来自多于4种不同流感病毒株的血凝素）。通过用氨基酸测序等就多重HA型进行测试可容易区分单价和多价疫苗。

单价疫苗尤其用于在大流行或大流行前期中，针对大流行或潜在大流行毒株的免疫接种。这些毒株的特征是：(a)与目前流通的人毒株中的血凝素相比，其含有新的血凝素，即十年以上在人群中未显见的血凝素(如H2)，或者从未在人群中发现的血凝素(如通常只出现在鸟群体中的H5、H6或H9)，从而人群未曾免疫接触过该毒株的血凝素；(b)其能够在人群中横向传播；和(c)其对人有致病性。这些毒株可包括任何A型流感病毒HA亚型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16。优选用含H5血凝素类型的病毒免疫以抵御大流行流感，或H2、H7或H9亚型。本发明可保护抵御A型流感病毒NA亚型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中的一种或多种。因此可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出现的大流行毒株。

多价疫苗更通常用于季节性设置，如三价疫苗通常包括来自两种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株的血凝素，如H1N1A型流感病毒株、H3N2A型流感病毒株和B型流感病毒株。也可用四价疫苗[54]，如包含来自2种A型流感病毒株和2种B型流感病毒株、或者3种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株的抗原。因此疫苗可为二价、三价、四价等。除了单价疫苗，其通常包括来自A型流感病毒株和B型流感病毒株的血凝素。在仅包括两种A型流感病毒株的疫苗中，通常为一种H1毒株(如H1N1毒株)和一种H3毒株(如H3N2毒株)。然而在一些实施方式中，可能有一种大流行A型流感病毒株和一种H1毒株或一种大流行A型流感病毒株和一种H3毒株。

疫苗包含一种以上流感毒株时，一般单独培养不同毒株，并在收获病毒和制备抗原后将它们混合在一起。因此，本发明方法可包括混合一种以上流感毒株的抗原的步骤。

如参考文献54所述，示例性四价疫苗可包含来自2种A型流感病毒株和2种B型流感病毒株('A-A-B-B')、或者3种A型流感病毒株和一种B型流感病毒株('A-A-A-B')的血凝素。

B型流感病毒目前不显示不同的HA亚型，但B型流感病毒株分成两种不同的谱系。这些谱系出现于1980年代晚期，并且具有在抗原/遗传上可彼此区分的HA[55]。当前B型流感病毒株是B/Victoria/2/87-样或B/Yamagata/16/88-样。当本发明的疫苗包含两种B型流感病毒株时，其通常可为一种B/Victoria/2/87样毒株和一种B/Yamagata/16/88样毒株。通常可从抗原性区分这些毒株，但氨基酸序列的差异也可以区分这两种谱系，例如B/Yamagata/16/88-样毒株常常(但并非总是)具有氨基酸残基164缺失(相对'Lee40'HA序列进行编号)的HA蛋白[56]。

优选的A-A-B-B疫苗包括来自下述的血凝素:(i)H1N1毒株;(ii)H3N2毒株;(iii)B/Victoria/2/87-样毒株;和(iv)B/Yamagata/16/88-样毒株。

在包括三种A型流感病毒株的疫苗中，通常为一种H1株系(如H1N1株系)和两种H3株系(如两种H3N2株系)。所述两种H3毒株具有抗原性不同的HA蛋白，如与A/Moscow/10/99交叉反应的一种H3N2毒株和与A/FuJian/411/2002交叉反应的一种H3N2毒株。所述两种H3毒株可来自不同分化枝（参考文献57公开的H3N2毒株的A、B和C分化枝）。然而在一些实施方式中，这些毒株之一（即H1或两种H3毒株之一）可被大流行毒株替代。

因此一种优选的A-A-A-B疫苗包括来自下述的血凝素：(i)H1N1毒株:(ii)A/Moscow/10/91-样H3N2毒株;(iii)A/Fujian/411/2002-样H3N2毒株;和(iv)B型流感病毒株，其可为B/Victoria/2/87-样或B/Yamagata/16/88-样。

另一优选的A-A-A-B疫苗包括来自下述的血凝素:(i)H1N1毒株,(ii)H3N2毒株,(iii)H5毒株(如H5N 1毒株)和(iv)B型流感病毒株。

另一优选的A-A-A-B疫苗包括来自下述的血凝素:(i)两种不同H1毒株,(ii)H3N2毒株和(iii)B型流感病毒株。

当所存在抗原来自两种或多种B型流感病毒株时，至少两种B型流感病毒株可以具有不同的血凝素但相关的神经氨酸酶。例如，它们可以都具有B/Victoria/2/87样神经氨酸酶[58]或可都具有B/Yamagata/16/88样神经氨酸酶。例如，两种B/Victoria/2/87样神经氨酸酶都可具有以下序列特征中的一种或多种：(1)残基27处不是丝氨酸，但优选是亮氨酸;(2)残基44处不是谷氨酸，但优选是赖氨酸;(3)残基46处不是苏氨酸，但优选是异亮氨酸;(4)残基51处不是脯氨酸，但优选是丝氨酸;(5)残基65处不是精氨酸，但优选是组氨酸;(6)残基70处不是甘氨酸，但优选是谷氨酸;(7)残基73处不是亮氨酸，但优选是苯丙氨酸;和/或(8)残基88处不是脯氨酸，但优选是谷氨酰胺。类似地，在一些实施方式中，神经氨酸酶可在残基43处有缺失，或可以是苏氨酸；在残基43处有缺失，由NA基因中的三核苷缺失引起，被报导为B/Victoria/2/87样毒株特征，尽管近来的毒株重新获得了Thr-43[58]。当然，反之，两种B/Yamagata/16/88样神经氨酸酶也可具有相反性质，例如S27,E44,T46,P51,R65,G70,L73,和/或P88。这些氨基酸相对于‘Lee40’神经氨酸酶序列进行编号[59]。因此本发明的A-A-B-B疫苗可使用2种B型毒株，其对HA抗原性不同(一种为B/Yamagata/16/88-样,一种为B/Victoria/2/87-样)，但就NA相关(均为B/Yamagata/16/88-样或均为B/Victoria/2/87-样).

在一些实施方式中，本发明不涵盖含有来自各A/New Caledonia/20/99(H1N1)、A/Wyoming/03/2003(H3N2)和B/Jiangsu/10/2003毒株的血凝素的三价裂解疫苗。

其抗原可有用地包含在组合物中的毒株包括对抗病毒治疗有抗性(例如对奥塞米韦[60]和/或扎那米韦有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[61]。

在本发明的一些实施方式中，疫苗可包括小量基于汞的防腐剂，如硫柳汞（thiomersal）或水杨乙汞（merthiolate）。存在时，所述防腐剂通常提供少于5μg/ml的汞，更低水平可为例如<1μg/ml、<0.5μg/ml。优选的疫苗不含硫柳汞，且更优选不含汞[23,62]。此类疫苗可包括非汞防腐剂。硫柳汞的非汞替代物包括2-苯氧乙醇或琥珀酸α-生育酚[23]。更优选地，疫苗无防腐剂。

在一些实施方式中，疫苗可包括稳定量的明胶，如少于0.1%。然而在其它实施方式中，疫苗不含明胶。无明胶可确保所述疫苗在少部分明胶敏感性患者中安全[63,64]。

在一些实施方式中，疫苗可包括一种或多种抗生素如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B。尽管在优选的实施方式中，所述疫苗不含抗生素。

在一些实施方式中，疫苗可包括甲醛。尽管在优选的实施方式中，所述疫苗不含甲醛。

如上所述，在一些实施方式中，疫苗可包括蛋组分（如卵清蛋白和卵类粘蛋白），但优选实施方式不含蛋组分。

不使用某些组分和添加剂的疫苗制备公开于参考文献65，从而确保不存在甚至是残留量的这些材料。

血凝素（HA）是现有灭活流感疫苗中的主要免疫原，且参照一般由SRID测定的HA水平来标准化疫苗剂量。现有的疫苗一般含有约15μgHA/毒株，但也可使用更低的剂量，例如用于儿童或大流行状况，或者是使用佐剂时。采用了分数剂量如1/2(即7.5μgHA/毒株)、1/4和1/8[35,36]，以及较高剂量(如3x或9x剂量[66.67])。这些疫苗具有0.5ml的剂量体积，即通常HA浓度为30μg/ml/毒株。三价INTANZA^TM产品在0.1ml体积中含9μg HA/毒株，即HA浓度为90μg/ml/毒株，产生270μg/ml的总HA浓度。

本发明产品可包括每流感病毒株0.1-50μg HA/剂量，优选0.1-50ug如1-20μg。产品理想地具有每毒株≤16μg血凝素如1-15μg、1-10μg、1-7.5μg、1-5μg等。具体每毒株HA剂量包括例如，约15、约10、约7.5、约5、约3.8、约1.9、约1.5μg等/毒株。

对于活疫苗，利用组织培养感染剂量中值(TCID₅₀)而非HA含量来测量剂量，如TCID₅₀为10⁶-10⁸(优选为10^6.5-10^7.5)/毒株/剂量。

本发明所用的流感毒株可以具有野生型病毒中发现的天然HA，或具有修饰HA。例如，已知修饰HA以去除决定簇(如HA1/HA2切割位点周围的超碱性区域(hyper-basic region))，使病毒在禽类动物中具有高致病性。采用反向遗传学促进这类修饰。

本发明的疫苗产品可包括流感病毒疫苗抗原以外的组分。如上所述，例如，其可包括生物可溶性和生物可降解基质材料或口服膜聚合物。

疫苗产品可包括去污剂。去污剂的水平可变化很大，如0.05-50μg去污剂/μgHA（'μg/μg'）。可使用低水平的去污剂如0.1-1μg/μg，或可使用高水平如5-30μg/μg。所述去污剂可为单一去污剂（如聚山梨酯80或CTAB）或混合物（如聚山梨酯80和CTAB）。优选的去污剂是非离子型，如聚山梨酯80（‘吐温80’）或辛基苯酚乙氧基化物（‘曲通X 100’）。聚山梨酯80可以0.05-50μg聚山梨酯80/μgHA存在，如0.1-1μg/μg、0.1-0.8μg/μg、0.1-0.5μg/μg、5-40μg/μg、5-30μg/μg或8-25μg/μg。

如上所述，一些疫苗产品可包括防腐剂如硫柳汞或2-苯氧基乙醇，但优选疫苗不含汞或不含防腐剂。

组合物可包含生理盐如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1-20mg/ml存在。可以存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、氯化镁、氯化钙等。

疫苗产品可含有一种或多种缓冲剂。常用缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(具体是有氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。包含的缓冲液一般是5-20mM。

优选无菌的疫苗产品。疫苗产品优选无热原，如每剂量含有<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂量<0.1EU。优选不含谷蛋白的疫苗产品。

疫苗产品可包括免疫刺激分子。这些可在制备贴片前与抗原混合。合适的免疫刺激分子种类包括但不限于：TLR3激动剂;TLR4激动剂;TLR5激动剂;TLR7激动剂;TLR8激动剂;TLR9激动剂;和CD1d激动剂。合适的免疫刺激分子包括但不限于：咪唑并喹啉如咪喹莫特("R-837")[68,69]和雷西莫特("R-848")[70]，或其盐(如盐酸盐);氨烷基氨基葡糖苷磷酸盐衍生物,如RC-529[71,72];α-糖基神经酰胺，如α-半乳糖基神经酰胺;参考文献73的'ER 804057';E5564[74,75];等。

评价接种流感病毒疫苗后抗体应答、中和能力和保护水平的方法为本领域熟知。人类研究表明，针对人流感病毒血凝素的抗体效价与保护作用相关联(约30-40的血清样品血凝反应-抑制效价对同源病毒感染产生约50%保护作用)[76]。一般通过血凝反应抑制、微量中和、单径向免疫扩散(SRID)和/或单径向溶血(SRH)来测定抗体应答。本领域熟知这些测定技术。优选的疫苗满足1、2或3个CPMP功效标准。在成年人(18-60岁)中，这些标准是：(1)≥70%血清保护；(2)≥40%血清转化；和/或(3)GMT增加≥2.5倍。在老年人(>60岁)中，这些标准是：(1)≥60%血清保护；(2)≥30%血清转化；和/或(3)GMT增加≥2倍。这些标准基于至少50位患者的开放标记研究。

目前，推荐将流感疫苗用于年龄大于6个月的儿童和成年人免疫。因此，人类对象可以小于1岁、1-5岁、5-15岁、15-55岁或至少55岁。接受该疫苗的优选对象是老年人(例如≥50岁、≥60岁，优选≥65岁)、年轻人(如≤5岁)、住院对象、健康护理工作人员、武装部队和军人、怀孕妇女、慢性疾病患者、免疫缺陷对象、在接受该疫苗前7天内接受过抗病毒化合物(如奥塞米韦或扎那米韦化合物；见下)的对象、对鸡蛋过敏的人和出国旅行者。然而所述疫苗不仅适用于这些人群，还可用于更广泛的群体。对于大流行毒株，优选给予所有年龄组人。

给予一个以上剂量(一般是两个剂量)特别可用于未曾免疫接触的患者，例如从未接受过流感疫苗的人，或者用于免疫接种抵御新HA亚型(如在大流行爆发中)。

用缓冲液重建

在其他方面，本发明提供制备疫苗抗原的方法，所述方法包括步骤(i)提高含抗原的液体组合物中该抗原的浓度，提供浓缩抗原，(ii)冻干所述浓缩抗原，提供冻干疫苗抗原和(iii)在水性缓冲液中重建所述冻干疫苗抗原，提供重建抗原。

除了可用于步骤(i)中浓缩的技术和步骤(iii)中重建所用的材料，该其他方面的细节与本文已述相同。

与本发明前述方面相反，步骤(i)不限于在步骤(i)中使用离心过滤和/或超滤。各种技术均可用于步骤(i)中的浓缩，包括但不限于：离心过滤、超滤或切向流过滤（还称为交叉流过滤）。这三种浓缩技术并不互相排斥，如本发明可使用切向流超滤。

切向流过滤(TFF)涉及将液体切向穿过滤膜。所述样品侧相对滤出物侧通常维持正压力。随着液体流过所述滤器，其中的组分可穿过所述膜进入滤出物。连续流使滤出物体积增加，且因此增加滞留物中的抗原浓度。TFF与垂直(deadend)过滤相反，后者中样品穿过膜而非与之相切。很多TFF系统市售可得。TFF膜的MWCO确定了哪种溶质能穿过所述膜（即进入滤液）和哪种溶质保留（即留在滞留物中）。选择本发明所用TFF滤器的MWCO从而几乎所有感兴趣的抗原保留在滞留物中。

无论选择何种技术，优选使感兴趣的抗原浓度增加至少n倍，其中n为5、6、7、8、9、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80或更大。

在此方面，步骤(iii)中的重建使用缓冲液（磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂；或柠檬酸盐缓冲剂）。包含的缓冲液一般是5-20mM。优选磷酸盐缓冲剂。使用水或非水性溶剂的缓冲液重建不是本发明此方面的部分。

步骤(i)浓缩第一液体体积的疫苗抗原，提供在第二（减少）液体体积中有相同抗原量的组合物。步骤(ii)干燥该浓缩的材料。该干燥材料在第三体积缓冲液中重建。所述第二体积小于第一体积。所述第三体积等于或优选地低于所述第二体积（且因此通过该定义而低于所述第一体积，即全过程提供初始液体组合物中更浓缩的抗原水性形式）。

此方面的重建抗原可用于制备本文已述的疫苗。

此方面通常用于制备流感疫苗，包括：单价或多价疫苗；蛋衍生或细胞培养衍生的疫苗；灭活或活的疫苗；表面抗原或裂解病毒疫苗；液体或固体疫苗等。

在一个实施方式中，所述缓冲液重建的抗原用于包被上述微针。

概述

术语“包含”涵盖“含有”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可仅由X组成或可含有其它物质，例如X+Y。

词语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。在必要时，词语“基本上”可从本发明的定义中省略。

与数值x相关的术语“约”是任选的并表示例如x±5%。

除非另有明确说明，包括混合两种或多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因此，组分可以任何顺序混合。有三种组分时，可将两种组分相互合并，然后可将该组合再与第三种组分混合等。

将动物(且特别是牛)材料用于培养细胞时，其应获自未患传染性海绵状脑病(TSE)，特别是未患牛海绵状脑病(BSE)的来源。总之，优选在完全不含动物来源材料的情况下培养细胞。

将化合物作为组合物的一部分给予机体时，该化合物可另外由合适的前药替代。

附图简要说明

图1显示离心过滤的SEC色谱图。x轴显示保留时间（分钟）且y轴显示吸光度单位。图1A显示起始抗原。图1B显示45分钟后的滞留物。图1C显示45分钟后的滤出物。

具体实施方式

离心过滤

离心过滤使用10kDa截留值的Millipore^TM设备，以5000rpm运行。

测试三种离心持续时间：15、30和45分钟。检查滞留物（浓缩物）和滤出物以观察流感病毒血凝素的定位。图1显示45分钟后所述抗原仍在滞留物中。15分钟后抗原浓缩3倍，30分钟后6倍，45分钟后13倍。15分钟后抗原回收40%，30分钟后41%，45分钟后55%。因此，选择45分钟进一步操作。在进一步操作中，抗原在离心后冻干，提供进一步浓缩。蔗糖单独（以两种不同浓度）或与甘露糖醇一起用作冻干保护剂。重建冻干材料。重建的样品含可见的聚集体。相对于起始材料，如下浓缩HA含量（ELISA测量）：

处理	浓缩（x）
		起始材料	1.0x
添加蔗糖	2.3x
		添加蔗糖（较高浓度）	1.3x
添加蔗糖＋甘露糖醇	0.8x
		蔗糖、冻干、重建	13.3x
蔗糖＋甘露糖醇、冻干、重建	8.5x
		离心、蔗糖、冻干、重建	25.2x
离心、蔗糖（较高）、冻干、重建	28.4x

因此离心和冻干的组合可提供流感病毒HA含量>25倍的浓缩。所述两种离心样品还通过SRID评估，且其显示21.1x和35.1x的HA含量增加，较高的蔗糖水平也产生更好的结果。

超滤

超滤使用具有再生纤维素制备的10kDa截留膜的Amicon^TM搅拌细胞浓缩器，在增压氮气下操作1小时。

若加入冻干，然后重建回冻干前的体积，则所述重建材料具有与起始材料相当的HA浓度（如SRID所测），表明功能性抗原没有损失。重建材料可稳定>2周。

应理解，仅以举例的方式描述了本发明，在本发明的范围和构思内可对之进行修改。

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Claims

1.一种制备冻干疫苗抗原的方法，所述方法包括步骤(i)用离心过滤或超滤提高含抗原的液体组合物中所述抗原的浓度，提供浓缩抗原和(ii)冻干所述浓缩抗原，提供冻干疫苗抗原。

2.一种制备重建液体疫苗抗原的方法，所述方法包括步骤：(a)通过权利要求1所述的方法冻干抗原；和(b)在水性液体中重建所述冻干疫苗抗原。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中使用的水性液体的体积低于步骤(a)开始时所用液体组合物的体积。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中使用的水性液体的体积低于步骤(a)期间制备的浓缩抗原的体积。

5.如权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于，所述重建液体疫苗抗原用于配制疫苗。

6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述疫苗抗原用于保护抵御细菌、病毒、真菌和/或寄生虫引起的疾病。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述疫苗是流感疫苗。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)使抗原浓度增加至少10倍。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(ii)开始时向所述浓缩抗原加入冻干保护剂。

10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述冻干疫苗抗原或所述重建液体疫苗抗原用于制备固体疫苗。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固体疫苗包括生物可降解的微针。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述微针通过下述步骤制造：(a)混合生物可溶性和生物可降解的基质材料与所述重建液体疫苗抗原；和(b)将步骤(a)的混合物加入含腔的模具，形成微针。

13.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固体疫苗包括包被的微针。

14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述微针为金属或塑料。

15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述方法包括将所述重建液体疫苗抗原施加到一种或多种固体微针的表面以提供包被的微针设备用于所述疫苗注射。

16.如权利要求11-15中任一项所述的方法，其特征在于，所述微针长度为100-2500μm。

17.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述固体疫苗包括薄膜。

18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法包括混合所述重建液体抗原和一种或多种口服可溶性聚合物，然后用所述混合物形成膜以提供适于颊部给予所述疫苗的薄膜。

19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法包括混合所述重建液体抗原和一种或多种局部可溶性聚合物，然后用所述混合物形成膜以提供适于经皮给予所述疫苗的薄膜。

20.如权利要求17-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述膜厚度为10-500μm(例如75-150μm)。

21.如权利要求17-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗原在所述膜内微粒中包封。

22.一种制备包装疫苗的方法，所述方法包括：(i)通过如权利要求10-21中任一项所述的方法制备固体疫苗；然后(ii)将固体疫苗包装到单独单位剂量袋中。

23.一种由前述权利要求中任一项所述的方法制备的疫苗。

24.一种在对象中产生免疫应答的方法，所述方法包括将权利要求23所述的疫苗给予对象的步骤。

25.一种制备疫苗抗原的方法，所述方法包括步骤(i)提高含抗原的液体组合物中所述抗原的浓度，提供浓缩抗原，

(ii)冻干所述浓缩抗原，提供冻干疫苗抗原，和

(iii)在水性缓冲液中重建所述冻干疫苗抗原，提供重建抗原。

26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述步骤(i)使用离心过滤、超滤或切向流过滤。

27.如权利要求25或26所述的方法，其特征在于，所述步骤(iii)中的重建使用磷酸盐缓冲液。