KR20090080977A - 바이러스 지질 성분에 영향을 미치는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세포 및 비리온의 지질 내용물 및 멤브레인 특징을 조절하기 위한 조성물, 방법 및 시스템을 제공한다. 지질 보충물의 구체적인 함량, 클래스 및/또는 조합을 포함하는 배지에서의 숙주 세포의 배양은 세포 및 이 세포에서의 성장된 바이러스의 지질 내용물에 영향을 미칠 수 있다. C16:0, C18:0, C18:1n9 및/또는 C18:2n6 지방산을 함유하는, 콜레스테롤 에스테르, 스핑고마이엘린, 당지질과 같은 지질은 바이러스 감염에 대한 세포 허용성, 바이러스 수율, 바이러스 면역원성 및/또는 멤브레인 상 전이 온도에 영향을 미칠 수 있다.
Description
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2006년 10월 17일자로 출원된 것으로 발명의 명칭이 "바이러스 지질 성분에 영향을 미치는 방법"인 미국 가출원 번호 제 60/852,571호(Vu Truong-Le)에 대한 우선권을 주장하고 그 출원의 이익을 특허 청구한다. 상기 선행 출원의 모든 개시내용은 본원에서 참고 인용된다.
발명의 분야
본 발명은 변형된 지질 성분을 갖는 배지, 세포 및 바이러스의 조성물을 포함한다. 세포 및 바이러스를 제공하는 방법은 바이러스 숙주 세포의 배양을 위한, 스핑고마이엘린, 콜레스테롤, 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린과 같은 배지 지질의 조정을 포함한다. 변형된 숙주 세포는 바이러스를 배양하는 경우 보다 더 허용적일 수 있으며, 수율이 더 높을 수 있다. 결과로 수득되는 변형된 바이러스는 프로세싱 조건에 대하여 보다 안정적일 수 있고 보다 우수하게 적합할 수 있다.
세포 원형질 멤브레인은 다양한 지질(예, 인지질, 콜레스테롤, 스핑고리피드 및 당지질)을 함유하지만, 그 지질은 반드시 균일하게 분포되어 있는 것은 아니다. 예를 들면, 멤브레인 이중층의 접하는 내층과 외층의 지질 성분 사이에는 상당한 차이가 있음을 알게 된다. 더욱이, 지질 및 특정 멤브레인 단백질은, 예를 들면 보다 고도로 포화된 지방산을 갖는 특정 지질의 농후성으로 인하여, 일반적으로 멤브레인 내에서보다 조밀하게 충전된 지질을 지닌 "래프트(raft)" 또는 지질 마이크로도메인을 형성할 수 있다. 멤브레인의 지질 조성은 멤브레인의 특징에 실질적으로 영향을 미칠 수 있다.
배양 배지는 동물 세포의 멤브레인의 지질 조성에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌[D. Tombaccini, et al., Lipid Composition of Balb/c3T3, SV3T3, and Conconavalin A-Selected Revertant Cells Grown in Media Containing Lipid- Depleted Serum, J. Lipid Res., 22: 590-597, (1981)]에서는, 세포가 지질-고갈된 배지에서 스트레스 조건하에 성장될 때, 멤브레인 지질 지방산 조성에 대한 다양한 변화에 주목하였다. 이들 변화 중 다수는 지방산 결핍 식이로 유지된 동물의 조직에서 발견된 변화와 유사하였다. 그러나, 정상적인 동물 사료 또는 세포 배양 배지의 보충은 정상적인 멤브레인 지질 조성으로부터 유래한 유의적인 변경을 제공할 것인지는 명확하지 않다.
외피형 바이러스(enveloped viruse)의 지질 조성에 영향을 미치고자 하는 시도들이 있어 왔다. 예를 들면, 문헌[A.C. Roland, et al., "Lipid Composition and Fluidity of the Human Immunodeficency Virus Envelope and Host Cell Plasma Membranes", PNAS 90: 5181-5185(1993)에서는, HTV 외피와 숙주 세포 멤브레인 간에 차이가 있다는 것을 발견하였다. 상기 문헌 저자(Roland)는 HIV-1을 인지질 리 포좀과 함께 배양하면 외피내 콜레스테롤 함량이 감소되는데, 이는 감염성의 현저한 저하를 초래한다는 것을 확인하였다.
그러나, 숙주 세포 및 바이러스의 지질 조성에 영향을 미치는 보다 선택적인 방법들에 대한 필요성이 여전히 유지되고 있다. 정상적인 감염 및 복제와 연관되어 있는 특정 지질 및 성분 지방산의 동정은, 배양 및 특정 바이러스 특징 조절에서의 이익을 가능하게 할 수 있다. 본 발명은 하기 내용 검토시 명백해지는 그러한 특성 및 다른 특성을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 세포 멤브레인 및 바이러스 외피(envelope)의 지질 조성을 조절하기 위한, 조성물, 방법 및 시스템을 포함한다. 숙주 세포는 세포 멤브레인에 제공된 지질의 클래스 및 서브클래스에 영향을 미치도록 보충된 특정 지질을 함유하는 배지에서 성장될 수 있다. 바이러스 숙주 세포를 배양하기 위해 사용된 배지는 바이러스의 외피내 지질 특성, 바이러스의 수율 및 바이러스의 물리적인 특성에 영향을 미칠 수 있다.
바이러스의 지질 조성을 변형시키는 방법은, 예를 들면 바이러스에 적합한 숙주 세포를 배양하기 위한 배양 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조정하는 단계 및 바이러스를 숙주 세포에 감염시키는 단계를 포함할 수 있다. 이로써, 그 배지 지질 농도를 조정하지 않은 동일 숙주 세포에서 성장된 동일(대조군) 바이러스의 경우와는 상이한 지질 조성을 지닌 자손 바리온(progeny virion)이 공급될 수 있다.
본 발명의 방법에 의한 조정에 있어 전형적인 바이러스는, 예를 들면 레트로바이러스(예, HIV), 파라믹소바이러스(예, 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스), 오르토믹소바이러스(예, 인플루엔자 바이러스), 파포바바이러스(예, 인간 파필로마 바이러스), 필로바이러스 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 헤파드나바이러스, 랍도바이러스(예, 라비스), 코로나바이러스(예, SARS), 토가바이러스, 아레나바이러스 및 분야바이러스를 포함한다.
배지의 조절은 본원에서 확인된 지질의 표준 배지 농도를 증가시키거나 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 조절 단계는 한정되거나 또는 알려지지 않은 지질 내용물의 배지를 제조하고, 이어서 배지의 지질 내용물을 변경함으로써(전형적으로, 배지에 한정된 클래스 및/또는 서브클래스의 지질을 첨가함으로써) 배지 지질을 조절하는 것을 포함할 수 있다. 비조절된 세포는 비조절된 출발 배지에서 성장될 수 있으며, 반면 조절된 세포는 조절된 배지에서 성장될 수 있다. 조절된 비리온은 조절된 세포에서 배양될 수 있지만, 비조절된 비리온은 비조절된 세포에서 성장된다. 예를 들면, 배지 중의 지질의 수준은 출발 배지와는 상이한 수준으로, 예컨대 배지 중의 20 mg/L 초과 또는 0.01 mg/L 미만으로 조절될 수 있다. 본 발명의 방법은 스핑고마이엘린, 콜레스테롤, 인지질 및 당지질 클래스의 지질의 조절을 포함한다. 또한, 지질의 조절은 특정 지방산, 예컨대 9-옥타데센산(C18:1n9), 팔미테이트(C16:0), 스테아레이트(C18:0), 리놀레산(C18:2n6) 및 올레이트(C18:1)로 에스테르화된 지질 서브클레스를 증가 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다.
이러한 방식으로 한 바이러스의 지질 조성의 조절은 바이러스 멤브레인 상 전이 온도와 같은 바이러스의 특정한 물리적 특성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 바이러스 멤브레인 상 전이 온도는 바이러스 저장 안정성에 영향을 미치도록 또는 건조 온도와 같은 소정의 제제화 공정 파라미터를 제공하도록, 예를 들면 보존제 분자를 바이러스에 침투시키는 것을 보조하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 조절된 바이러스는, 이것이 액체 보존제 제제 중에서 전이 온도로 유지될 때, 안정화제의 트랜스멤브레인 흡수가 백신 건조 제제의 제조를 위한 건조 공정 전에 및/또는 동안에 영향을 받을 수 있도록, 지질의 특정 상 전이 온도를 지니게 할 수 있다. 건조 방법의 예로는 동결 건조, 동결 발포 건조, 발포 건조(foam drying), 분무 동결 건조, 분무 건조, 고압 분무 건조 및 초임계 분무 건조를 포함할 수 있다.
바이러스 외피 지질 내용물의 조절은 바이러스의 면역원성(immunogenicity)에 영향을 미칠 수 있다. 바이러스 외피는 숙주 유기체의 면역계에 외부적으로 제시되므로, 면역 상호작용에 있어 중요하다. 외피 상의 "지질 래프트"를 형성하는 멤브레인 지질과 단백질의 조합은 유의한 면역원일 수 있다. 멤브레인의 지질 조성에 따라, 전체적인 단백질 항원성 형태와 면역원의 제시에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 조류에서 성장된 포유 동물용 바이러스 백신은, 예를 들면 보다 전형적인 포유류의 지질 내용물을 가지도록 바이러스를 변형시킴으로써 보다 예방적인 반응을 유도하도록 조정될 수 있다. 임의로, 바이러스의 지질 내용물은, 보다 강력하고 장시간 지속적인 면역 반응, 예컨대 보강 효과를 유도하도록 조정될 수 있다.
다른 양태에서, 감염에 대한 숙주 세포의 허용성은, 성장 배지 중의 특정 지질의 수준을 변형시킴으로써, 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 허용성과 상호관련이 있는 지질이 부가되거나 또는 보충된 배지 중에서 성장될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 등과 관련하여, 숙주 세포의 감염성은 스핑고마이엘린 및/또는 콜레스테롤이 농후한 배지 중에서 그 숙주 세포를 성장시킴으로써, 강화시킬 수 있다. 배지 중에 C18:0, C18:1n9 및/또는 C18:2n6 지방산과 함께 지질 서브클래스를 포함시키는 것이 특히 이로울 수 있다.
본 발명의 또다른 양태에서, 바이러스의 수율은, 예를 들면 바이러스 외피에 선택적으로 혼입된 지질이 농후한 배지를 제공함으로써, 증가될 수 있다. 예를 들면, 바이러스의 생산은 세포를 위한 배양 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조절함으로써, 세포로부터 증가될 수 있다. 임의로, 바이러스의 수율은 배지에 포스파티딜세린 또는 포스파티딜이노시톨을 첨가함으로써, 증가될 수 있다. 배지 중에 C16:0, 및/또는 C18:2n6 지방산과 지질 서브클래스를 포함시키는 것이 특히 이로울 수 있다.
본 발명은, 닭 난의 요막강 또는 그러한 바람직한 지질을 최적 농도 미만으로 발현하는 배양된 세포주에서 성장된 대조군 인플루엔자 비리온과 비교하여, 멤브레인내 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린의 증가된 비율을 갖는 인플루엔자 비리온 조성물을 포함한다. 임의의 경우에서, 그 증가된 비율은 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤 20 mg/L 또는 그 이상을 함유하는 배지에서 성장된 숙주 세포에서의 비리온 배양으로 기인될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 팔미테이트(C16:0)에 에스테르화된 스핑고마이엘린이 배지 중에 포함되고/되거나, 팔미테이트(C16:0) 또는 스테아레이트(C18:0)에 에스테르화된 콜레스테롤이 배지 중에 포함된다. 보다 바람직한 실시양태에서, 스핑고마이엘린 팔미테이트(C16:0)의 배지내 지방산의 몰 백분율은 표준 배지의 것에 비하여 10% 이상으로 증가되거나, 또는 콜레스테롤 팔미테이트(C16:0) 또는 스테아레이트(C18:0)의 몰 백분율은 표준(예, 출발) 배지의 것에 비하여 10% 이상으로 증가된다. 보다 더 바람직한 실시양태에서, 스핑고마이엘린 팔미테이트(C16:0)의 멤브레인내 지방산의 몰 백분을은 대조군 비리온의 것에 비하여 10% 이상으로 증가되거나, 또는 콜레스테롤 팔미테이트(C16:0) 또는 스테아레이트(C18:0)의 몰 백분율운 대조군 비리온(예, 표준 배지에서 감염 및 성장된 세포로부터 유래한 것)의 것에 바하여 10% 이상으로 증가된다.
바이러스 배양 시스템은, 예를 들면 바이러스에 허용적인 숙주 세포, 세포를 성장시키기에 적합한 배양 배지 중의 세포, 및 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린을 포함한다. 배지에 대한 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린의 첨가는, 허용성을 조정하거나, 세포로부터의 바이러스 수율을 증가시키거나, 저장 중인 바이러스의 안정성을 증가시키거나, 또는 바이러스 멤브레인의 상 전이 온도를 변경시키고자 의도될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 첨가된 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린은 25 몰% 초과의 팔미테이트(C16:0), 20 몰% 초과의 스테아레이트(C18:0) 또는 40 몰% 초과의 올레이트(C18:1)를 포함한다. 바람직한 시스템에서, 바이러스는 레트로바이러스(예, HIV), 파라믹소바이러스(예, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스), 오르토믹소바이러스(예, 인플루엔자 바이러스), 파포바바이러스(예, 인간 파필로마 바이러스), 필로바이러스 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 헤파드나바이러스, 랍도바이러스(예, 라비스), 코로나바이러스(예, SARS), 토가바이러스, 아레나바이러스 및 분야바이러스이다. 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포는 닭 난의 요막강 세포 또는 MDCK 신장 세포이다. 실시양태에서, 예를 들면 바이러스 생산을 증가시키기 위한 실시양태에서, 배지는 또한 포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜이노시톨도 포함한다.
본 발명의 특정 방법에서, 바이러스 숙주 세포의 지질 내용물은 숙주 세포를 제공하는 동물의 식이를 조정함으로써 조절된다. 예를 들면, 변형된 멤브레인 지질 조성을 가진 인플루엔자 바이러스는 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린(또는 기타 소정의 지질 클래스 및/또는 서브클래스)가 농후한 식이를 닭에게 급식하는 단계, 닭으로부터 하나 이상의 수정란을 수집하는 단계, 하나 이상의 난의 요막강을 인플루엔자 바이러스로 접종하는 단계, 및 하나 이상의 요막강으로부터 인플루엔자 바이러스를 수득하는 단계에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 닭의 사료는 요막유액의 총 콜레스테롤 및/또는 스핑고마이엘린이 25 몰% 초과의 팔미테이트(C16:0), 20 몰% 초과의 스테아레이트(C18:0) 및/또는 40 몰% 초과의 올레이트(C18:1)를 포함할 때까지, 농후해진다. 바람직한 실시양태에서, 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이는 1일 당 닭 한마리에 대하여 0.5 g 이상, 1 g 이상, 2 g 이상, 5 g 이상 또는 10 g 이상의 총 콜레스테롤 또는 총 총 스핑고마이에린을 포함한다. 이와같이 제공된 바이러스는, 예를 들면 조절된 지질이 비교적 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래된 난에서의 성장된 바이러스의 경우보다 더 높은 역가, 조절된 지질이 비교적 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래된 난에서의 성장된 바이러스의 경우보다 더 긴 저장 수명(shelf life), 조절된 지질이 비교적 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래된 난에서의 성장된 바이러스의 경우보다 더 높은 항원성(antigenicity), 및 조절된 지질이 비교적 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래된 난에서의 성장된 바이러스로부터 유래된 멤브레인과 비교하여 변형된 멤브레인의 상 전이 등과 같은 소정의 특징을 가질 수 있다.
정의
본원에서 또는 하기 명세서 나머지 부분에서 언급되어 있지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해하는 의미를 갖는다. 하기 정의들은 기술 분야의 용어를 보충 설명하고, 현재 출원에 대하여 기술되며, 임의의 관련되거나 비관련된 케이스에, 예를 들면 임의의 공공 소유의 특허 또는 출원에 귀속되는 것은 아니다.
본 발명을 상세하게 기술하기 전에, 본 발명은 특정 장치나 시스템으로 한정되지 않으며 물론 변경할 수 있음을 숙지하여야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 특정 실시양태를 단지 설명하기 위한 목적일 뿐 한정하고자 하는 것은 아님을 숙지하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수형 "부정관사" 및 "정관사"는, 내용이 달리 지시하고 있지 않다면, 복수의 지시대상도 임의로 포함한다. 따라서, 예를 들면, "지질"에 대한 언급은 2종 이상의 지질의 조합을 포함할 수 있으며; "난"에 대한 언급은 1개의 난 등을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 것과 유사하거나, 변형되거나 또는 동등물인 많은 방법 및 물질이 과도한 실험없이도 본 발명의 실시에 사용될 수 있긴 하지만, 바람직한 물질 및 방법이 본원에 기술된다. 본 발명을 설명하고 청구할 때, 하기 용어는 하기 기술된 정의에 따라 사용된다.
멤브레인 지질의 클래스는 예를 들면 지질이 어떠한 지방산이 지질에 에스테르화되어 있는지에 따라, 특정 서브클래스로서 존재할 수 있는 명명된 지질 분자 타입을 포함한다. 예컨대, 멤브레인 지질의 클래스는, 콜레스테롤, 스핑고마이엘린, 인지질, 당지질, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 리소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine), 카르디오리핀(cardiolipin), 포스파티딜에탄올아민, 세라마이드, 세레브로사이드, 강글리오사이드 등을 포함할 수 있다. 이들 지질의 서브클래스는, 예를 들면 미리스트산, 팔미트산, 스테아르산, 올레산, 리놀레산, 리노넨산, 아라키돈산, 에이코사펜타엔산 등과 같은 상이한 지방산에 에스테르화된 클래스 구성원을 포함할 수 있다. 바이러스는, 하나 이상의 지질 클래스 또는 서브클래스가 다른 바이러스와는 유의적으로(약 10% 차이) 상이한 양 또는 비율로 바이러스 내에 존재하는 경우, 다른 바이러스에 비교하여, "상이한 지질 조성"을 갖는다. 본 발명은 예컨대 동일한 접종원으로 출발하지만 상이한 지질 조성성분 및/또는 상이한 지질 비율을 지닌 배지에서 성장된 세포에서 배양하는 것을 포함하는, 상이한 지질 조성을 지닌 바이러스를 생산하는 방법을 제공한다.
C16:0, C18:1n9와 같이 지방산 사슬의 간단한 표기는 당해 분야에서 통상적으로 알려져 있다. 예컨대, C18:1라는 표기는 사슬 중의 불포화 위치에서 1개의 이중 결합을 갖는 탄소수 18의 지방산을 의미한다. C18:1n9는 9번째 탄소에서 이중 결합을 갖는 탄소수 18의 지방산 사슬을 의미한다. 전형적으로, 지방산은 지질 분자내 보다 극성인 기에 에스테르화되어, 예를 들면 인지질, 스핑고리피드, 당지질 등을 형성하게 된다. 다른 경우, 지방산은 콜레스테롤과 같이 비교적 소수성인 기로 에스테르화될 수 있다.
본원에서, 지질과 관련하여 용어 "조절(하는)"은 지질, 지질 클래스 및/또는 지질 서브클래스의 양, 농도 및/또는 비율을 변화시킨다는 것을 의미한다. 많은 경우에서, 예컨대 배지 지질의 조절은 출발 배지에 대한 지질의 첨가를 수반한다. 그러나, 조절은 임의로 배지, 세포 멤브레인 또는 바이러스로부터 지질을 감소 또는 제거하는 것을 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 세포 멤브레인 지질에 대한 FTIR 데이타의 차트를 나타낸 것이다. 대조군 닭 배아 신장(CEK: chicken embryo kidney) 세포는 약 7℃, 32℃ 및 54℃에서 상 전이를 나타낸다(차트 1A). 사이클로덱스트린을 이용하여 CEK 세포 멤브레인에서 콜레스테롤을 제거하면, 약 45℃ 용융 지질 정렬 군의 유의적인 증가가 야기되었는데(1B), 이는 인플루엔자 감염에 강력하게 허용적인 CEK 세포의 원형질 멤브레인이, 유의적인 양의 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 함유한다는 것을 나타낸다. 멤브레인을 스핑고마이엘리나제로 처리하면, 저 용융 군의 유의적인 감소가 초래되고, 보다 잘 정렬된 고용융 멤브레인 지질 군의 큰 증가가 초래된다. 이러한 반응은, CEK 세포가 유의적인 양의 스핑고마이엘린을 함유한다는 것을 강력하게 시사한다. 이들을 함께 고려할 경우, 데이타는, 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린이 CEK 멤브레인에 중요한 성분이라는 점을 나타내고, 이들 지질이 인플루엔자 감염 허용성에 기여한다는 점을 나타낸다.
도 2는 A/시드니 바이러스 외피 지질에 대한 FTIR 데이타 차트를 나타낸 것이다. 사이클로텍스트린으로 처리하여 콜레스테롤 함량을 감소시키거나, 또는 스핑고마이엘리나제로 처리하여 스핑고마이엘린을 세라마이드로 전환시키면, 정렬된 고 용융 멤브레인 지질 군의 유의적인 증가가 초래된다. 데이타는, CEK 세포와 유사하게, A/시드니와 같은 인플루엔자 바이러스가 유의적인 양의 콜레스테롤 및 스핑고리피드를 함유한다는 점을 나타낸다.
도 3은 닭의 요막강(CAS) 숙주 세포의 멤브레인, 및 난의 요막강 내부에 정렬된 CAS 세포로부터 생성된 인플루엔자 바이러스의 멤브레인에서의 특정 지질 클래스를 비교하여 나타낸 히스토그람 차트를 나타낸 것이다. 데이타는, 일반적인 포유류 세포로부터 유래된 다양한 지질 클래스의 전형적인 분포와 비교하여, 인플루엔자 감염에 매우 허용적인 것으로 알려져 있는 CEK 세포 뿐만 아니라 인플루엔자 바이러스에서의 포스파티딜세린 및 스핑고마이엘린의 농후성을 시사해 보여준다
도 4 및 5는 CAS 세포와 CAS 세포에서의 성장된 바이러스 간에 인지질 서브클래스를 비교하여 나타낸 히스토그람 차트를 나타낸 것이다.
도 6은 CAS 세포와 CAS 세포에서의 성장된 바이러스 간에 스핑고마이엘린 서브클래스를 비교하여 나타낸 히스토그람 차트를 나타낸 것이다.
도 7은 CAS 세포와 CAS 세포에서의 성장된 바이러스 간에 콜레스테롤 에스테르 서브클래스를 비교하여 나타낸 히스토그람 차트를 나타낸 것이다. 결과는 허용적인 숙주와 비-허용적인 숙주 간에는 유의적인 지질 조성 차이가 존재한다는 점을 사해 보여준다.
도 8은 바이러스와 바이러스에 대한 허용성 수준이 상이한 세포 간에 멤브레인 지질 클래스 차이를 나타낸 것이다. 결과는 허용적인 숙주와 비-허용적인 숙주 사이에는 유의적인 지질 조성 차이가 있다는 점을 시사해 보여준다.
도 9는 바이러스와 바이러스 허용성 수준이 상이한 세포 간에 멤브레인 콜레스테롤 에스테르 서브클래스의 차이가 있다는 점을 시사해 보여준다.
도 10은 바이러스와 바이러스 허용성 수준이 상이한 세포 간에 멤브레인 스핑고마이엘린 서브클래스의 차이가 있다는 점을 시사해 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 변형된 지질 조성을 가진 바이러스를 포함하며, 그리고 바이러스 및 숙주 세포의 지질 구성에 영향을 미치는 방법을 포함한다. 하나의 양태에서, 바이러스 숙주 세포의 세포 멤브레인 지질은, 예를 들면 배지 성분을 조정함으로써 변형될 수 있다. 이러한 변형된 숙주 세포는 증가된 허용성으로 감염될 수 있으며, 바이러스의 증가된 수율을 제공할 수 있다. 변형된 세포에서 배양된 바이러스는, 비변형된 숙주 세포에서 성장된 동일 바이러스와 비교하여, 예를 들면 향상된 안정성, 변형된 면역원성 및/또는 변경된 멤브레인 상 전이 특징을 제공하는 변형된 바이러스 멤브레인 지질 조성을 가질 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시양태에서는, 콜레스테롤, 스핑고마이엘린, 포스파티딜세린/포스파티딜이노시톨 및/또는 포스파티딜콜린을 숙주 세포의 멤브레인(외부 멤브레인 또는 내부 멤브레인)의 지질 조성 및/또는 지질(예, 바이러스 멤브레인) 조성에 영향을 미치는 함량으로 포함하는 배지가 제공될 수 있다. 결과로 형성된 멤브레인 조성은 배지에서 성장된 세포로부터 배양된 바이러스의 배양, 공정 파라미터, 안정성 및 항원 특성에서의 이점을 제공할 수 있다.
본 발명자들은 허용적인 숙주와 비-허용적인 숙주 간에, 그리고 바이러스와 그 숙주 세포 간에는 유의적인 지질 조성 차이가 존재하며, 이 점은 예를 들면 보다 큰 효능, 보다 강력한 면역원성, 보다 용이한 공정, 및/또는 보다 긴 저장 수명을 갖는 바이러스 백신을 제공하는데 이용될 수 있다는 점을 발견하게 되었다. 예를 들면, 멤브레인 스핑고마이엘린(특히 18:0(스테아르) 지방산 사슬을 높은 비율로 지닌 것) 및/또는 콜레스테롤 에스테르(특히 18:1n9(올레) 지방산 사슬을 지닌 것)가 증가되도록 변형된 세포는, 예를 들면 레트로바이러스(예, HIV), 파라믹소바이러스(예, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스), 오르토믹소바이러스(예, 인플루엔자 바이러스), 파포바바이러스(예, 인간 파필로마 바이러스), 필로바이러스 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 헤파드나바이러스, 랍도바이러스(예, 라비스), 코로나바이러스(예, SARS), 토가바이러스, 아레나바이러스 및 분야바이러스와 같은 바이러스에 대해 증가된 허용성을 가질 수 있다. 임의로, 바이러스의 지질 내용물은, 숙주 세포의 배지 조성에 의해 영향을 받아, C16:0 콜레스테롤 에스테르, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨 및 C16:0(팔미트) 스핑고리피드 및 18:2n6(리놀레) 콜레스테롤과 같은, 바이러스 선호적인 지질과 지방산을 보다 높은 비율로 제공할 수 있다.
숙주 세포의 지질에 미치는 영향
지질 내용물과 특정 숙주 세포 특징 간의 본원에 제공된 상호관련성에 비추어, 그리고 숙주 세포의 지질 조성이 성장 배지의 지질 내용물에 의해 영향 받을 수 있다는 점을 고려하여, 바이러스 숙주 세포의 특징을 개선시키기 위한 방법론이 본원에 제공된다.
하나의 양태에서, 바이러스 숙주 세포에 대한 배양 조건은 감염에 대한 허용성을 향상시키도록 그리고 최종적인 바이러스 배양 수율을 개선시키도록 조정될 수 있다. 감염의 허용성, 예를 들면, 숙주 세포의 인플루엔자 바이러스에 대한 감염의 허용성은 숙주 세포 지질 멤브레인 내의 보다 높은 비율의 C18:1n9 콜레스테롤과 상관이 있는 것으로 밝혀졌다. 또한, 본 발명자들은 보다 허용적인 숙주 세포의 멤브레인 지질 내의 증가된 C18:0 스핑고마이엘린의 경향을 갖는다는 점도 발견하게 되었다. 본 발명의 방법에서, 바이러스 숙주 세포는 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르 및/또는 C18:0 스핑고마이엘린이 포함된 배지에서 성장된다. 본 발명의 방법에서, 바이러스 숙주 세포는 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르 및/또는 C18:0 스핑고마이엘린을 20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 500 mg/L 또는 그 이상으로 함유하는 배지에서 성장된다.
본 발명의 특정 실시양태에서, C18:1n9 콜레스테롤 에스테르 및/또는 C18:0 스핑고마이엘린의 양은 바이러스 숙주 세포를 위한 배양 배지 중에서 조절된다. 예를 들면, 다양한 양의 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르 및/또는 C18:0 스핑고마이엘린이 표준 상업적인 배지(또는 임의 다른 출발 배지)에 첨가되어, 이들 지질의 존재를 보장할 수 있고, 이들 지질의 절대량을 증가시킬 수 있고/또는 있거나, 이들 지질의 비율을 증가시킬 수 있다. 임의로, 배지는 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르보다 더 적거나 더 낮은 비율의 다른 콜레스테롤 에스테르, 예컨대 C16:0 및/또는 C18:0 콜레스테롤 에스테르로 제제화할 수 있다. 임의로, 숙주 세포 배양 배지는 C18:0 스핑고마이엘린보다 보다 더 작거나 더 낮은 비율의 다른 스핑고리피드, 예컨대 C16:0 및/또는 C18:1n9 스핑고마이엘린으로 제제화할 수 있다. 예를 들면, 외비 보유 바이러스를 배양하기 위한 숙주 세포는 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르를 다른 개별 콜레스테롤 에스테르에 비하여 과량으로, 또는 다른 콜레스테롤 에스테르의 조합에 비하여 과량으로 함유하는 배지에서 성장될 수 있다. 임의로, 외피를 지 바이러스를 배양하기 위한 숙주 세포는 C18:0 스핑고마이엘린을 다른 개별 스핑고리피드에 비하여 과량으로, 또는 다른 스핑고리피드의 조합에 비하여 과량으로 함유하는 배지에서 성장될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 예를 들면, 외비 보유 바이러스의 숙주 세포를 배양하기 위한 액체 배지는 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르를 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L, 또는 그 이상으로 함유한다. 이 실시양태에서, C18:1n9 지방산을 포함하지 않는 콜레스테롤 에스테르는, 배양 배지에 존재하지 않거나, C18:1n9 콜레스테롤 에스테르보다 더 적은 개별적인 양으로 존재하거나, 또는 총 조합 함량이 C18:1n9 콜레스테롤 에스테르보다 더 적은 총 조합 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 특정 실시양태에서, 외비 보유 바이러스의 숙주 세포를 배양하기 위한 액체 배지는 C18:0 스핑고마이엘린을 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L 또는 그 이상으로 함유한다. 이 실시양태에서, C18:0 지방산을 포함하지 않는 스핑고마이엘린은, 기본적으로 배양 배지에 존재하지 않거나, C18:0 스핑고마이엘린보다 더 적은 개별 양으로 존재하거나, 또는 C18:0 스핑고마이엘린보다 더 적은 총 조합 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, C18:1n9 콜레스테롤 에스테르는, 외비 보유 바이러스의 숙주 세포를 위한 배양 배지에서, 배지의 총 성분 콜레스테롤 에스테르의 적어도 35 몰%, 적어도 40 몰%, 적어도 50 몰%, 적어도 60 몰%, 또는 그 이상의 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 또한, C18:0 스핑고마이엘린은, 외비 보유 바이러스의 숙주 세포용 배양 배지에서, 배지 중의 스핑고리피드의 적어도 15%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 그 이상의 양으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물 및 방법의 다른 양태에 있어서, 본 발명자들은 숙주 세포의 외피 보유 바이러스의 허용성은 세포 또는 배지 지질이 C18:2n6 지방산을 포함하는 경우 더 높다는 것을 발견하게 되었다. 이들 지방산은 유리 지방산, 또는 C18:2n6 콜레스테롤, C18:2n6 콜레스테롤 에스테르, 및/또는 C18:2n6 스핑고마이엘린과 같은 멤브레인 지질 분자 내에 에스테르화될 수 있다. 외피 보유 바이러스 숙주 세포를 배양하기 위한 바람직한 액체 배지는, C18:2n6 지방산 또는 이 지방산을 포함하는 지질의 적어도 0.5 mg/L, 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L 또는 그 이상 포함한다. 다른 양태에서, C18:2n6 콜레스테롤 에스테르는, 외피 보유 바이러스 숙주 세포를 위한 배양 배지에서, 총 성분 콜레스테롤 에스테르의 5 몰%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20 %, 또는 그 이상의 함량으로 존재하는 것이 바람직하다. 임의로, C18:2n6 스핑고마이엘린은, 외피 보유 바이러스 숙주 세포를 위한 배양 배지에서, 배지의 총 성분 스핑고리피드의 적어도 5 몰%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20% 또는 그 이상의 함량으로 존재하는 것이 이로울 수 있다.
가장 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포의 바이러스 감염의 허용성은 전술한 지질의 조합을 성장 배지에 보충함으로써 조절된다. 예를 들면, 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포 성장 배지는, C18:1n9 콜레스테롤 에스테르, C18:0 스핑고마이엘린, C18:2n6 스핑고마이엘린 및 C18:2n6 콜레스테롤 중 2종 이상으로 보충된다. 하나의 양태에서, 배지는 C18:1n9 에스테르인 콜레스테롤 에스테르 35 몰% 이상과 C18:0 지방산인 스핑고리피드 지방산 15 몰% 이상을 제공하도록 보충된다. 다른 양태에서, 배지는 C18:1n9 에스테르인 콜레스테롤 에스테르 35 몰% 이상, C18:0 지방산인 스핑고리피드 지방산 15 몰% 이상 및 C18:2n6 지방산인 스핑고리피드 지방산 5 몰% 이상을 제공하도록 보충된다.
바이러스 역가에 미치는 영향
배양으로부터 유래된 바이러스 역가는 바이러스 수거물을 제조 및 처리하는 시간 및 비용에 강력하게 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 방법은 생산성, 예를 들면 숙주 세포의 바이러스 감염에 대한 향상된 허용성과 상관이 있는 지질을 제공함으로써, 그리고/또는 숙주의 것에 비하여 바이러스 지질이 선택적으로 농후한 지질을 제공함으로써, 외피 보유 바이러스 배양의 생산성을 개선시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 이로운 바이러스는 일반적으로 외피 보유 바이러스를 포함한다. 그러나, 본 발명에서는 본원에 기술된 배지 지질 조정이 숙주 세포의 외피 미보유 바이러스에 대한 허용성에 이로울 수 있다는 것도 인지하고 있다. 더욱이, 본 발명자들은, 많은 외피 미보유 바이러스가, 본 발명의 배지 변형으로부터, 예를 들면 보다 안정적이고/이거나 보다 생산적인 비리온 자손을 제공하는데 이로울 수 있는, 지질 및/또는 지단백질 성분을 갖는다는 점을 인지하고 있다.
본 발명의 조성물, 방법 및 시스템에 사용하기에 바람직한 바이러스는 외피 보유 바이러스를 포함한다. 특히, 본 발명의 배지에서 성장된 세포에서의 배양으로부터 이로울 수 있는 보다 바람직한 바이러스로는, 베큘로바이러스 과(Baculoviridae), 헤르페스바이러스 과(Herpesviridae), 이리도바이러스 과(Iridoviridae), 폭스바이러스 과(Poxviridae), 시스토바이러스 과(Cystoviridae), 코로나바이러스 과(Coronaviridae), 플라비바이러스 과(Flaviviridae), 토가바이러스 과(Togaviridae), 아르테리바이러스 과(Arterivirus), 레트로바이러스 과(Retroviridae), 오르소믹소바이러스 과(Orthomyxoviridae), 필로바이러스 과(Filoviridae), 파라믹소바이러스 과(Paramyxoviridae), 랍도바이러스 과(Rhabdoviridae), 아레나바이러스 과(Arenaviridae), 및 분야바이러스 과(Bunyaviridae)의 구성원이다. 가장 바람직한 바이러스는, 다양한 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV: human immunodeficiency virus), 파라믹소바이러스(예, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스) 및 파포파바이러스(예, 인간 파필로마 바이러스)를 포함한다.
본 발명의 방법을 이용하여 바이러스 역가를 증가시키는 것과 관련하여, 이는 숙주 세포의 허용성을 증가시키기 위한 전술한 방법에 따라 달성할 수 있다. 세포의 바이러스 감염 허용성은 어떤 세포가 어느 수준으로 숙주로서 작용하여 바이러스의 복제를 촉진시킬 수 있는지에 대한 척도이다. 바이러스는 어떤 이유로든지 바이러스에 대해 허용적이지 않은 세포에서는 복제할 수 없다. 한편, 바이러스에 대해 더욱 허용적인 세포는, 전형적으로 덜 허용적인 세포에 비해 세포 당 비리온을 더 많이 복제한다. 보다 허용적인 세포의 또다른 이점은, 세포 당 자손 비리온이 많지 않더라도, 감염 효율이 일정 부분이상 높을 수 있다는 것이다. 즉, 흔히 세포가 허용적일수록 보다 높은 비율의 접종원 비리온에 감염될 수 있어, 예를 들면, 역가가 낮거나 또는 분해된 접종원의 감염을 보다 효과적으로 증식시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 양태에서, 숙주 세포의 허용성을 증가시키기 위한 방법은 숙주 세포 배양의 감염으로부터 수득되는 바이러스 역가를 향상시키는데 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 숙주 세포의 감염으로부터 생성된 바이러스의 품질 및/또는 양은 숙주 세포의 지질에 비해 바이러스에서 비교적 풍부하거나 바이러스에서 비교적 농후한 지질의 제공에 의해 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, 본 발명자들은, 숙주 세포의 배지 및/또는 숙주 세포와 비교하여, 바이러스가 특정 지질에서 비교적 높은 지질 내용물을 가질 수 있다는 지를 측정하게 되었다. 바이러스에서 선택적으로 농후한 지질의 제공은, 바이러스의 배양에서의 이점, 예컨대 향상된 허용성, 증가된 감염성, 증가된 역가 및/또는 증가된 수율을 제공할 것으로 예상된다.
본 발명자들은, 특정 외피 보유 바이러스 입자는 C16:0 지방산을 포함하는 지질이 농후되어 있음을 발견하게 되었다. 하나의 실시양태에서, 바이러스 배양의 생산성은 바이러스를 위한 숙주 세포를 배양하는데 사용된 배지에 C16:0 지방산 또는 C16:0 지방산을 포함하는 지질을 첨가함으로써 의해 증가될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 바이러스는, C16:0 지방산(팔미트산), 그의 염, 또는 C16:0 지방산을 포함하는 지질, 예컨대 콜레스테롤 에스테르 또는 스핑고리피드를 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L, 또는 그 이상으로 포함하는 액체 배지에서 성장된 숙주 세포에서 배양될 수 있다. 이 실시양태에서, 상기 열거된 C16:0 지질은 지질의 개별 타입의 다른 지방산의 경우 또는 전체 지질의 경우보다 더 많은 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, C16:0 콜레스테롤 에스테르는, 외피 보유 바이러스의 숙주 세포를 위한 배양 배지에서, 총 배지 콜레스테롤 에스테르의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 존재하는 것이 바람직하다. 또한, C16:0 스핑고마이엘린은, 외피 보유 바이러스의 숙주 세포용 배양 배지에서, 배지 스핑고리피드의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은, 특정 외피 보유 바이러스의 입자는 C18:2n6 지방산을 포함하는 지질이 농후되어 있음을 발견하게 되었다. 하나의 실시양태에서, 바이러스 배양의 생산성은 바이러스에 대한 숙주 세포를 배양하는데 사용된 배지에 C18:2n6 지방산 또는 C18:2n6를 포함하는 지질을 첨가함으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 바이러스는, C18:2n6 지방산(리놀레산), 이의 염 또는 콜레스테롤 에스테르 또는 스핑고리피드와 같은 하나 이상의 C18:2n6 지방산을 포함하는 지질을 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L, 또는 그 이상으로 포함하는 액체 배지에서 성장된 숙주 세포에서 배양될 수 있다. 이 실시양태에서, 상기 열거된 C18:2n6 지질은 지질의 개별 타입의 다른 지방산의 경우 또는 전체 지질의 경우보다 더 많은 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, C18:2n6 콜레스테롤 에스테르는 배지 콜레스테롤 에스테르의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 외피 보유 바이러스의 숙주 세포용 배양 배지에 존재하는 것이 바람직하다. 더구나, C18:2n6 스핑고마이엘린은 배지 스핑고리피드의 적어도 2 몰%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30% 또는 그 이상의 함량으로 외피 보유 바이러스의 숙주 세포를 위한 배양 배지에 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 생산성(예, 감염성, 복제, 역가, 숙주 세포 당 감염 단위(infectious units per host cell))은 전술한 지질의 조합이 보충된 배지에서 바이러스의 숙주 세포를 성장시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 실시양태에서, 바이러스의 숙주 세포를 위한 배양 배지는 C16:0 콜레스테롤 에스테르, C16:0 스핑고마이엘린, C18:2n6 스핑고마이엘린 and C18:2n6 콜레스테롤 에스테르 중 2종 이상으로 보충된다. 하나의 양태에서, 배지는 C18:2n6 지방산을 포함하는 콜레스테롤 에스테르 및/또는 스핑고리피드 지방산의 적어도 15 몰%를 제공하도록 보충된다. 다른 양태에서, 배지는 C16:0 지방산인 스핑고리피드 지방산의 적어도 10 몰% 및 C16:0 지방산을 포함하는 콜레스테롤 에스테르의 적어도 15 몰%를 제공하도록 보충된다. 다른 양태에서, 배지는 C18:2n6 에스테르인 콜레스테롤 에스테르의 적어도 10 몰%, C18:2n6 지방산인 스핑고리피드 지방산의 적어도 10 몰%, C16:0 에스테르인 콜레스테롤 에스테르의 적어도 10 몰%, 및 C16:0 지방산인 스핑고리피드 지방산의 적어도 5 몰%를 제공하도록 보충된다.
향상된 바이러스의 안정성
본 발명의 방법에 따른, 바이러스 지질 조성의 양 및/또는 비율의 조정은 바이러스의 물리적 안정성 양태들을 향상시키는 데 이용할 수 있다. 예를 들면, 용융점이 보다 높은 지질을 포함하도록 조정된 바이러스, 백신 제제화 프로세스에 보다 적합한(complimentary) 지질, 또는 산화 경향이 낮은 지질은, 특정 환경에서 보다 우수한 안정성, 예를 들면 백신 제품 및/또는 공정 중간산물의 저장 수명 안정성을 제공할 수 있다.
지질의 용융점은 일반적으로 보다 긴 지방산 사슬이 함유된 지질과 포화 지방산이 함유된 지질에서 더 높다. 또한, 멤브레인의 유동성은 콜레스테롤의 비율 증가에 따라 낮아지므로, 콜레스테롤 함량이 높은 멤브레인은 더욱 단단하고 보다 안정적일 수 있다. 더구나, 포화 지방산 사슬의 산화 민감성(예, 저장시 라디칼 매개 사슬 반응)은 불포화 지방산 보다 낮다. 본 발명의 양태에서, 바이러스, 특히 외피 보유 바이러스의 안정성은 포화 지방산의 함량이 높고 및/또는 콜레스테롤 함량이 낮은 지질이 포함된 배지에서 배양한 세포에 배양함으로써 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 보다 안정적인 비리온을 생산하기 위한 세포 배양 배지는, 표준 배지 보다 포화 지방산의 비율이 더 높게 포함된 스핑고마이엘린과 인지질의 함량 보충을 포함할 수 있다. 표준 배지(예, 상업적으로 구입가능한 배지)에, 예컨대 C16:0 지방산, C18:0 지방산, 및/또는 C20:0 지방산의 비율이 비정상적으로 높은 지질을 보충할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 바이러스의 숙주 세포용 배양 배지는 예컨대 C16:0 지방산, C18:0 지방산, 및/또는 C20:0 지방산과 같은 1종 이상의 포화 지방산을 포함하는 지질을 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L, 또는 그 이상으로 포함한다. 이러한 실시양태에서, C16-C20 포화 지방산은 배지에서 지질(예, 인지질, 스핑고리피드, 당지질 등)의 다른 지방산의 경우 또는 총 지질의 경우보다 더 많은 양으로 존재하는 것이 바람직하다. 본 발명의 다른 양태에서, C16-C20 불포화 지방산은 개별 배지 지질 타입 또는 총 배지 지질의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 외비 보유 바이러스 숙주 세포를 위안 배양 배지에서 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명자들은, 멤브레인 생체물질(membranous biologic)을 거의 멤브레인의 상 전이 온도에서 액체 보존액에 노출시킴으로써, 생물학적 물질(예, 박테리아, 외피 보유 바이러스, 동물 세포 등)의 안정성을 향상시킬 수 있다는 것을 언급한 바 있다(출원번호 10/412,630호를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 명세서에 포함됨). 상 전이 온도에서, 멤브레인의 투과성은 실질적으로 증가하므로, 따라서 보존성 물질(예, 표준 생체물질 포뮬레이션 당 및 아미노산)들이 보다 쉽게 멤브레인을 통과할 수 있다. 본 발명의 양태에서, 세포 및/또는 바이러스를 제제화 및 보존 프로세스에 보다 적합한 상태가 되게 하기 위해, 세포 또는 바이러스 숙주의 상 전이 온도를 배지의 지질 내용물의 조정에 의해 조절할 수 있다. 예를 들면, 멤브레인의 전형적인 상 전이 온도는 약 15℃일 수 있다. 그러나, 보다 낮은 온도나 또는 5-10℃에서 바이러스를 취급하는 것이, 취급 과정 전반에 걸쳐 생존성을 증강시키고 및/또는 예컨대 분무 건조, 동결건조 또는 동결-발포 건조를 실시하는 동안에 잠열의 결과로서 접하게 되는 온도와 일치된다는 점에 바람직할 수 있다. 한편, 예컨대 본질적으로 낮은 상 전이 온도을 갖는 멤브레인(예, 호냉성 생활형) 또는 좀더 높은 온도에서의 멤브레인 투과성이 바람직한 프로세스(예, 포괄적 변환 프로세스)에서는, 세포 멤브레인의 상 전이 온도를 보다 높은 온도로 조절하는 것이 바람직할 수 있다.
일반적으로, 멤브레인의 견고성과 상 전이 온도는, 예컨대, 1) 콜레스테롤 결핍 배지에서의 세포 배양, 2) 스핑고마이엘린 보충된 배지에서의 세포 배양, 3) 세포의 사이클로덱스트린에 노출(멤브레인 콜레스테롤을 감소시키기 위함), 4) 멤브레인의 스핑고마이엘리나제에 노출(그로 인해 멤브레인의 스핑고마이엘린을 보다 견고한 세라마이드로 변환시킴), 및/또는 5) 세포를 장쇄 및/또는 포화 지방산의 비율이 높은 지방산을 포함하는 지질이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 멤브레인의 상 전이 온도는, 예컨대 1) 세포를 콜레스테롤 보충된 배지에서 배양, 2) 세포를 스핑고마이엘린이 결핍된 배지에서 배양, 및/또는 3) 세포를 단쇄 및/또는 불포화 지방산의 비율이 높은 지방산을 포함하는 지질이 첨가된 배지에서 배양함으로써, 낮출 수 있다.
세포의 상 전이 온도를 낮추는 바람직한 실시양태에서, 세포는 콜레스테롤과 같은 보충 지질 및 비교적 단쇄(C12-C16) 지방산을 포함하는 지질, 더 바람직하기로는 불포화 지방산을 포함하는 지질이 함유된 배양 배지에서 성장된다. 예컨대, 세포는, 콜레스테롤 및/또는 1종 이상의 C12 - C16 불포화 지방산을 포함하는 지질이, 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L 또는 그 이상으로 포함하도록 보충된, 세포용 표준 배지에서 성장될 수 있다. 지질의 지방산이 다른 지방산(예, C18-C22 포화 지방산) 보다 다량으로 존재하는 것이 바람직하다. 임의로, 멤브레인의 상 전이 온도를 높이기 위해, 숙주 세포를 지질의 여러가지 클래스 및/또는 서브클래스 다양성이 낮아진 배지에서 배양할 수 있다. 세포의 멤브레인 상 전이 온도 감소를 보조하기 위해, 불포화 C12-C16 지방산이 개별 배지 지질 타입이나 총 배지 지질의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 배양 배지에 존재하는 것이 바람직하다. 임의로, 멤브레인의 상 전이 온도를 낮추기 위해, 세포는 지질의 여러가지 클래스 및/또는 서브클래스 다양성이 증가된 배지에서 배양할 수 있다. 바이러스 멤브레인의 상 전이 온도를 적정하는 바람직한 실시양태로, 바이러스는 전술한 바와 같이 처리한 숙주 세포를 이용하여 배양한다.
세포의 상 전이 온도를 증가시키는 바람직한 실시양태로, 세포는 스핑고리피드와 같은 보충 지질과 비교적 장쇄(C18-C22), 바람직하기로는 불포화, 더 바람직하기로는 상이한 지질의 수가 제한된 지방산이 포함된 배양 배지에서 성장된다. 예컨대, 세포는 스핑고마이엘린 및/또는 1종 이상의 C18 - C22 포화 지방산을 포함하는 다른 지질을 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L, 또는 그 이상으로 포함하도록 보충된, 세포용 표준 배지에서 성장될 수 있다. 지질의 지방산이 다른 지방산(예, C12 - C16 불포화 지방산) 보다 다량으로 존재하는 것이 바람직하다. 세포의 멤브레인 상 전이 온도 강하를 보조하기 위해, 불포화 C18- C22 지방산이 개별 배지 지질 타입이나 총 배지 지질의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 배양 배지에 존재하는 것이 바람직하다. 바이러스 멤브레인의 상 전이 온도를 높이기 위한 바람직한 실시양태에서, 바이러스는 전술한 바와 같은 배지에서 배양한 숙주 세포를 이용하여 배양한다. 임의로, 세포 또는 바이러스 멤브레인의 상 전이 온도는 스핑고마이엘리나제 및/또는 사이클로덱스트린에 노출시킴으로써 증가시킬 수 있다.
세포 또는 바이러스의 멤브레인 지질을 조절하기 위한 시스템
본 발명은 세포나 바이러스의 멤브레인내 지질 조성을 변형하기 위한 시스템을 포함한다. 이 시스템은 일반적으로, 예컨대 적정 배양 배지내 하나 이상의 세포, 인지질, 콜레스테롤 및/또는 스핑고마이엘린이 보충된 배지를 포함한다. 이 시스템은 세포에 감염시킬 수 있는 바이러스를 포함할 수 있다.
세포 및 바이러스 지질의 조작 시스템 및 방법은, 동정된(identified) 성분이 없거나 결핍된 배지의 보충을 포함한다. 보충은 선택적으로 당업계에 잘 알려져 있는 표준 배지나 미공개 성분들에 지정된 지질의 첨가를 포함할 수 있다. 본 발명은 본원에 기술된 특이적인 지질의 첨가(또는 제거하기 위한 재제제화)에 의한 지정된 변형으로 인한, 세포 및 바이러스 지질의 변형을 고려한다. 예를 들면, 어떤 표준 배지는, 변형을 위한 지질이 얼마간 함유되어 있을 가능성이 있더라도, 세포 또는 바이러스의 지질 내용에 영향을 주기 위해 지정된 지질에 대한 조절을 행할 수 있다. 예컨대, 하기 배지를, 본원에 기술된 바와 같이, 지질 조절하여, 숙주 세포 및/또는 바이러스 지질 조성을 변형시킬 수 있다: 293 세포 배지, 지방세포/지방전구세포 배지, 양수 세포 배지, 성상세포 배지, 기본 배지 이글(Basal Medium Eagle), 혈액 및 골수 세포 배지, CHO 세포 배지, 연골세포 배지, 클릭의 배지(Click's Media), CMRL 1066 배지, D-MEM w/o 글루타민, D-MEM/F12 배지, D-MEM w/ 글루타민, 내피세포 배지, 섬유모세포 배지, 유전자 치료 배지, G-MEM 배지, 함스 F-10 배지, 함스 F-12 배지, 간세포 배지, 하이브리도마 배지, IMEM 리히터스 배지, 이스코브스 배지, 각질형성세포 배지, Liebovitz L-15 배지, McCoy's 5A 배지, MCDB 131 배지, MDCK 배지, 배지 199, MEM 알파 배지, MEM 스피너 배지, MEM w/ 글루타민, MEM w/o 글루타민, NCTC-109 배지, 신경 세포 배지, 올리고덴드로사이트 배지, 골모세포 배지, RPMI 1640 배지, 평활 세포 배지, 형질감염된 세포 선별 및 클로닝 배지, VERO 세포 배지, 윌리암스 배지, MS(Murashige & Skoog) 기본 염 용액, Chu (N6) 배지, DKW/Juglans 기본 염 혼합물, 맥코웬의 목본 배지, 길라드의 (F/2) 해양 농화 기본 염(Guillard's (F/2) Marine Enrichment Basal Salt)등(예, 인비트로, 시그마-알드리치 등 참조).
세포, 배지 및 바이러스는 발효기, T-플라스크, 페트리디쉬, 플라스크, 교반 플라스크 등과 같은 배양 용기내에 포함될 수 있다. 시스템은 안정적인 배양 온도, 예컨대 약 10℃ 내지 약 40℃, 또는 약 37℃를 제공하기 위한 서브 시스템 구성을 포함할 수 있다.
시스템에 대한 구체적인 실시양태에서, 스핑고마이엘린은 C16:0 지방산, C18:0 지방산, C182n6 및/또는 C181n9 지방산을 포함할 수 있다. 예컨대, 배지 스핑고마이엘린은 (에스테르화된) 25 몰% 또는 그 이상의 팔미테이트(C16:0), 20 몰% 또는 그 이상의 스테아레이트(C18:0) 및/또는 40 몰% 또는 그 이상의 올레이트(C18:1n9)를 포함할 수 있다.
방법 및 시스템의 다른 측면에 있어서, 바이러스의 숙주 세포에 대한 배양용 배지는 보충되는(일반적인 배지 함량 또는 표준 배지 함량과 비교하여) 포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜이노시톨을 포함한다. 예컨대, 세포는, 포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜이노시톨을 적어도 1 mg/L, 5 mg/L, 10 mg/L, 25 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 200 mg/L, 400 mg/L 또는 그 이상으로 포함하도록 보충된, 세포용 표준 배지에서 성장될 수 있다. 이들 인지질의 지방산에는 C16:0, C18:0, C18:1n9, 및/또는 C18:2n6가 우세적으로 존재하는 것이 바람직하다. 인지질 보충은 1종 이상의 C18:2n6 지방산을 포함하는 것이 가장 바람직하다. 포스파티딜세린 및/또는 포스파티딜이노시톨이 인지질이나 배지내 총 지질의 적어도 10 몰%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40% 또는 그 이상의 함량으로 배양 배지에 존재하는 것이 바람직하다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 동물 세포이다. 바람직하기로는, 세포는 조류 또는 포유류 동물이다. 더 바람직하기로는, 세포는 인간 세포, 원숭이 세포, 유인원 세포, 닭 세포이다. 가장 바람직하기로는, 세포는 닭의 요막강(CAS) 세포, 닭의 배아 신장(CDK) 세포, 개의 신장 세포, Vero 세포, 림프구, MDCK 세포, MA-104 세포, CHO 세포, HeLa 세포, 293 세포, NSO 세포 및 U937 세포이다.
바람직한 실시양태에서, 바이러스는 베큘로바이러스 과, 헤르페스바이러스 과, 이리도바이러스 과, 폭스바이러스 과, 시스토바이러스 과, 코로나바이러스 과, 플라비바이러스 과, 토가바이러스 과, 아르테리바이러스 과, 레트로바이러스 과, 오르소믹소바이러스 과, 필로바이러스 과, 파라믹소바이러스 과, 랍도바이러스 과, 아레나바이러스 과, 및 분야바이러스 과에 속하는 바이러스 등의 외피 보유 바이러스이다. 가장 바람직한 바이러스는, 다양한 인플루엔자 바이러스, 인간 면역결핍(HIV) 바이러스, 파라믹소바이러스(예, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스) 및 파포파바이러스(예, 인간 파필로마 바이러스)를 포함한다.
본 발명의 시스템에서 바이러스의 배양으로 자손 비리온의 임의 특징들을 통제할 수 있다. 예컨대, 보충된(조절된) 배지에서의 숙주 세포의 배양은 비보충 배지에서 배양한 숙주 세포에서 배양시킨 바이러스에 비해 높은 역가를 제공할 수 있으며, 바이러스에 장기간의 저장 수명을 제공할 수 있으며, 바이러스에 대해 높은 면역원성을 제공할 수 있으며, 및/또는 바이러스에 변형된 멤브레인 Tg를 제공할 수 있다.
시스템 및 방법의 다른 양태에서, 숙주 세포(예, CAS 세포) 및/또는 바리온의 지질 내용물은, 숙주 세포를 제공하는 동물에 이로운 것으로 본원에 동정된 지질이 농후한 식이를 제공함으로써, 영향을 미칠 수 있다. 예컨대, 동물에, 스핑고마이엘린, 인지질 및/또는 콜레스테롤 에스테르와 같은, C16:0, C18:0, C18:1n9, 및/또는 C18:2n6 지방산을 포함하는, 지질이 농후한 식이를 급식할 수 있다.
하기 실시예들은 설명하기 위한 것으로, 청구된 본 발명을 한정하는 것은 아니다. 당업자는 실질적으로 유사한 결과를 수득하면서 변형될 수 있는 다양한 파라미터를 숙지할 것이다.
인플루엔자 바이러스 외피의 상 전이 측정으로, 비교적 견고한 멤브레인 구조, 고용융점 지질의 고농도 입증, 및 바이러스 외피 상의 콜레스테롤 및 스핑고리피드의 다량 함유가 확인되었다. 생각한 의문은, 특정 지질 클래스가 이들이 배양된 숙주 세포와 비교하여 비리온에서 선호적으로 또는 선택적으로 강화되는가?였다. 본 발명자들은 바이러스에 강화된 지질의 타입과 서브클래스, 허용성 수준이 상이한 숙주 세포의 지질 조성의 차이, 및 "선호적인" 지질 성분을 보충한 세포 배양 배지의 효과를 연구하였다.
본 발명자들은, 숙주 세포 및 비리온들 간에 지질 조성의 차이가 세포와 바이러스 산물의 생산성 및 효능을 변형하는데 유용한 특징들과 상호 관련있음을 확인하였다. 예컨대, 지질 조성 분석으로, 스핑고마이엘린과 콜레스테롤의 수준이 바 이러스를 생산하는 숙주 세포와 비교하여 바이러스의 외피에 다량 존재하는 것으로 나타났다. 본 발명자들은 바이러스와 세포 간에 스핑고마이엘린 서브타입과 콜레스테롤 서브타입에서의 유의적인 차이에 주목하였다. 스핑고마이엘린 16:0이 바이러스에서 고농도로 발견되었고, 18:0은 바이러스에서는 (아마 선호적으로) 감소되었지만 허용적인 세포에서는 더 높았다. 18:1n9 사슬-길이의 콜레스테롤 에스테르는 세포에 선호적으로 농후하지지만, 16:0은 바이러스에서 농후하게 되었다. Vero 세포(인플루엔자에 대한 허용성이 낮음)는, 인플루엔자 감염에 높은 허용성을 보이는 요막강 세포 보다 스핑고마이엘린은 적게, 18:1n9 콜레스테롤 에스테르 함량은 매우 낮게 포함한다.
실시예 1- 멤브레인 상 전이의 FTIR 현미경 검사
도 1A - 1C에 나타낸 바와 같이, 멤브레인의 지질 가동성은 멤브레인내 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린의 내용에 따라 영향을 받았다. FTIR에서, ~2850cm-1에서 대칭적인 -CH2 신축 진동(stretching vibration)이 검출되었고 인지질 꼬리기의 지방 아실 측쇄의 진동을 모니터링하였다. 파수 대 온도를 그래프로 그려, 멤브레인의 상 변화를 확인하였다. 유상 고 지질 가동성 상 변화에서 겔-결정 상 변화를 검출할 수 있었다. 높은 파수로의 전이는 고도로 정렬된(또는 더욱 견고한) 멤브레인 지질 환경을 시사하는 것으로 확인되었다.
사이클로덱스트린의 소수성 포켓은 멤브레인으로부터 콜레스테롤을 격리시키는 능력을 가지고 있다. 멤브레인의 콜레스테롤 함량이 도 1A의 대조군과 비교하 여, 사이클로덱스트린 처리에 의해 감소되었을 때, 지질 가동성은 감소되었으며, 지질은 도 1B에 나타낸 바와 같이 더욱 정렬된 것으로 확인되었다. 도 1C에 나타낸 바와 같이, 멤브레인 용융점과 지질 정렬(lipid order)은, 스핑고마이엘리나제로 멤브레인 처리에 의해 따라서 멤브레인의 스핑고마이엘린이 세라마이드로 변환되어, 더욱 증가되었다. 또한, 이러한 실험에서, 인플루엔자 감염에 대한 허용성이 높은 CEK 세포에는, 조절하여 멤브레인 특성을 변화시키기 쉬운 다량의 콜레스테롤과 스핑고리피드가 포함되어 있는 것으로 나타났다.
하나의 양태에서, FTIR 분석을 이용하여 숙주 세포의 허용성을 예측할 수 있다. 예컨대, 처리에 대한 임의 FTIR 프로파일 및/또는 반응은 허용성과 상호 관련있을 수 있다. 숙주 세포 배지의 조절은 멤브레인의 지질 조성과 멤브레인 특징에 유사한 변화를 제공할 수 있다.
실시예 2 - 처리한 비리온 멤브레인의 FTIR 분석
바이러스 멤브레인의 정렬 및 지질 가동성은 또한 지질 함량 변화에 의해 영향을 받을 수 있는 것으로 확인되었다. 예컨대, 도 2에 나타낸 바와 같이, 바이러스 멤브레인의 콜레스테롤 함량 변형(예, 사이클로덱스트린 처리에 의해)은 가동성 및 상 전이 특징을 변경시킬 수 있다. 아울러, 멤브레인의 스핑고마이엘린의 세라마이드로의 변환 역시 FTIR에 의해 검출되는 바와 같이 멤브레인의 특성을 변경시킬 수 있다. 이러한 실험에서, 허용적인 숙주 세포를 이용한 경우와 같이, 바이러스는 비교적 다량의 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린을 가지는 것으로 보인다. 바이러스 멤브레인은 가장 허용적인 숙주 세포의 멤브레인보다 콜레스테롤 및 스핑고마 이엘린이 강화된 것으로 보인다.
하나의 양태에서, FTIR 분석을 이용하여 바이러스의 예컨대 저장시 변화를 검출할 수 있다. 예컨대 임의 멤브레인 지질 성분의 분해 또는 결핍은 FTIR 프로파일 변화와 상호 관련있을 수 있다.
이러한 실험로부터, flu 외피는 파수의 변화 크기에 의해 입증된 바와 같이, 비교적 견고한 것으로 관찰되었다. flu는 콜레스테롤과 스핑고리피드를 고농도로 포함하고 있을 것 같다. A/시드니에서의 대규모 상 전이는 ~15℃에서 검출가능하지만, B/하얼빈의 경우에는 이보다 낮다. 이러한 상 전이를 이용하여 예컨대 바이러스 백신의 제제 건조 과정의 건조 사이클을 설계할 수 있다. HIV에서와 같이, 인플루엔자 외피는 표준 숙주 멤브레인의 변칙적인 멤브레인 지질 래프트나 마이크로도메인으로부터 유래된다.
실시예 3 - 지질 서브타입을 포함한 멤브레인 구성 분석
박막 크로마토그래피(TLC) 및 가스 크로마토그래피 방법으로, 10종의 클래스와 40종의 서브클래스의 멤브레인 지질을 동정하였다. 클래스에는, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린/이노시톨, 스핑고마이에린, 콜레스테롤 에스테로, 유리 지방장산, 디아실글리세라이드, 트리아실글리세라이드, 카디오리딘 및 리소포스파티딜콜린이 포함된다. 클래스내에서도, 예컨대 지방산이 어떤 지질 구조로 에스테르화되었는지에 따라, 지질을 추가적으로 특정화하였다. 검출 한계는 전형적으로 약 1 nmol이며, 분석 가변성은 10% 런 투 런(run to run) 미만의 범위였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 특히, 바이러스 외피 멤브레인에는 숙주 CAS 세포멤브레인에 비해 스핑고마이엘린과 당지질(포스파티딜세린/이노시톨)가 강화되어 있다.
도 4 및 5에 나타낸 바와 같이, 숙주 세포와 후대 바이러스 간에 지질 내용 서브타입의 유의적인 차이가 보인다. 예컨대, 포스파티딜에탄올아민과 포스파티딜세린/이노시톨 둘다, 숙주 보다 바이러스에서 C18:1n9 지방산이 강화된 것으로 보인다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 숙주 세포 수준 이상으로 바이러스에서 C18:1n9 지방산을 가진 스핑고마이엘린 서브타입의 실질적인 강화가 있다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 허용적인 CAS 세포는 후대 바이러스 이상으로 C18:1n9 지방산을 포함하는 콜레스테롤 에스테르의 실질적인 강화가 있다.
실시예 4 - 허용적인 세포와 비-허용적인 세포의 멤브레인 조성
일련의 분석으로 바이러스 감염에 대한 다양한 정도의 허용성을 가진 숙주 세포의 선별을 수행하였다. 특정 멤브레인 지질과 바이러스 감염에 대한 민감성에 대한 상호 관련성에 대한 경향을 파악하였다.
예컨대, Vero 세포는 비교적 인플루엔자 바이러스 감염에 허용적이지 않으며, MDCK 세포는 다소 보다 허용적이며, CAS 세포는 가장 허용적이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 스핑고마이엘린은 실질적으로 허용적인 세포에서 현저하다.
콜레스테롤 에스테르에 있어, C18:1n9 및 C18:2n6 지방산은 도 9에 나타낸 바와 같이 덜 허용적인 세포 보다는 허용적인 세포에서 보다 유의하게 현저하다.
스핑고마이엘린 서브타입에 있어, 도 10에 나타낸 바와 같이, C18:0 함유성 스핑고마이엘린의 다량 함유와 허용성 간에 상호관련성이 있는 것으로 보인다.
요약하건대, 세포 및 바이러스 멤브레인 지질의 조정은 숙주 세포의 허용성과 바이러스의 배양 수율에 영향을 미친다는 기대를 뒷받침하였다. 상 전이 측정으로, 인플루엔자 바이러스 외피가 매우 견고하며 높은 용융점의 지질로 구성된 것으로 보여진다. 지질 조성 분석에서, 바이러스 외피에서의 스핑고마이에린과 콜레스테롤의 수치 증가가 확인되었다. 바이러스와 세포 간에 스핑고마이에린 서브타입과 콜레스테롤 서브타입에 있어 유의적인 차이가 관찰되었다. Vero 세포는 보다 허용적인 요막강 세포 보다 스핑고마이엘린을 적게, 그리고 18:1n9 콜레스테롤 에스테르를 현저하게 적게 포함하고 있다.
본원에 기술된 실시예 및 실시양태들은 단순히 예시하기 위한 것으로, 본 발명에 비추어 다양한 변형 또는 변경을 당업자라면 제시할 수 있으며, 이러한 변형 또는 변경은 첨부된 청구범위와 본 출원의 사상과 범위 내에 포함되는 것으로 이해된다.
Claims (24)
- 바이러스 지질 조성을 변형시키는 방법으로서,바이러스에 적합한 숙주 세포의 타입을 배양하기 위한 배양 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조절하는 단계, 및숙주 세포를 바이러스로 감염시키는 단계를 포함함으로써, 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤 수준을 조절하지 않는 배양 배지에서 성장된 숙주 세포 타입에서의 배양된 대조군 바이러스와는 상이한 지질 조성을 지닌 바이러스를 제공하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 바이러스는 레트로바이러스(retrovirus), 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 호흡기 합포체 바이러스(respiratory syncytial virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 메타뉴모바이러스(metapneumovirus), 오르토믹소바이러스(orthomyxovirus), 인플루엔자 바이러스(influenza virus), 파포바바이러스(papovavirus), 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus), 필로바이러스(filovirus), 폭스바이러스(poxvirus), 헤르페스바이러스(herpesvirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 랍도바이러스(rhabdovirus), 라비스(rabies), 코로나바이러스(coronavirus), SARS, 토가바이러스(togavirus), 아레나바이러스(arenavirus) 및 분야바이러스(bunyavirus)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조절함으로써 바이러스 멤브레인 상 전이 온도를 변경하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제3항에 있어서, 바이러스를 지질 멤브레인 전이 온도에서 액체 보존제 제제 중에 유지하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제4항에 있어서, 바이러스를 동결 건조, 동결 발포 건조, 발포 건조, 분무 동결 건조, 분무 건조, 고압 분무 건조 및 초임계 분무 건조로 이루어진 군으로부터 선택된 방법으로 건조하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스핑고마이엘린 및 콜레스테롤의 총 수준은 배지 중에 20 mg/L 초과 또는 0.01 mg/L 미만으로 조절되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스의 면역원성이 변경될 때까지 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조절하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스에 대한 숙주 세포의 허용성(permissivity)이 증가될 때까지 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 조절하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 조절 단계는 스핑고마이에린 수준을 증가시키는 단계 또는 9-옥타데센산(C18:1n9)을 포함하는 콜레스테롤을 증가시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 배지 중의 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 수준을 세포로부터 바이러스의 생산이 증가되는 지점까지 조절하는 단계를 더 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤은 팔미테이트(C16:0), 스테아레이트(C18:0) 및 올레이트(C18:1)로 이루어진 군으로부터 선택된 지방산을 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 배지에 포스파티딜세린 또는 포스파티딜이노시톨을 첨가하는 단계를 더 포함함으로써, 자손 비리온의 향상된 수율을 제공하는 방법.
- 닭의 난의 요막강에서 성장된 대조군 인플루엔자 비리온과 비교할 때 멤브레인 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤의 증가된 비율을 포함하는 인플루엔자 비리온.
- 제13항에 있어서, 상기 증가된 비율은 스핑고마이엘린 또는 콜레스테롤 20 mg/L 또는 그 이상을 함유하는 배지 중에 성장된 숙주 세포에서의 비리온 배양으로 부터 기인되는 것인 인플루엔자 비리온.
- 제13항에 있어서, 스핑고마이엘린 팔미테이트(C16:0)의 멤브레인내 지방산의 몰 백분율은 대조군 비리온의 것에 비해 10% 이상으로 증가되거나, 또는 콜레스테롤 팔미테이트(C16:0) 또는 스테아레이트(C18:0)의 몰 백분율은 대조군 비리온의 것에 비하여 10% 이상로 증가되는 것인 인플루엔자 비리온.
- 바이러스의 배양 시스템으로서,바이러스에 허용적인 숙주 세포;세포를 성장시키기에 적합한 세포 배양 배지 중의 세포; 및콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린을 포함함으로써, 배지에 대한 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린의 첨가는 허용성을 조절하거나, 세포로부터의 바이러스 수율을 증가시키거나, 저장 중인 바이러스의 안정성을 증시키거나, 또는 바이러스의 멤브레인 상 전이 온도를 변경시키는 것인 배양 시스템.
- 제16항에 있어서, 상기 첨가된 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린은 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린의 첨가에 의한 조절 이전의 배지 중에서보다 25 몰% 초과의 팔미테이트(C16:0), 20 몰% 초과의 스테아레이트(C18:0) 또는 40 몰% 초과의 올레이트(C18:1)를 포함하는 것인 배양 시스템.
- 제16항에 있어서, 상기 비리온은 레트로바이러스, 파라믹소바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 메타뉴모바이러스, 오르토믹소바이러스, 인플루엔자 바이러스, 파포바바이러스, 인간 파필로마 바이러스, 필로바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스바이러스, 헤파드나바이러스, 랍도바이러스, 라비스, 코로나바이러스, SARS, 토가바이러스, 아레나바이러스 및 분야바이러스로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 배양 시스템.
- 제16항에 있어서, 상기 세포는 닭의 요막강(CAS: chicken allantoic sac) 세포, 닭 배아 신장(CEK: chicken embryo kidney) 세포, 개과 신장 세포, Vero 세포, 림프구, MDCK 신장 세포, MA-104 세포, CHO 세포, HeLA 세포, 293 세포, NSO 세포 및 U937 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 배양 시스템.
- 제16항에 있어서, 상기 배지는 포스파티딜세린 또는 포스파티딜 이노시톨을 포함하는 것인 배양 시스템.
- 변형된 멤브레인 지질 조성을 지닌 인플루엔자 바이러스를 제공하는 방법으로서,콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이를 닭에게 급식하는 단계;닭으로부터 하나 이상의 수정란을 수집하는 단계;하나 이상의 난의 요막강을 인플루엔자 바이러스로 접종하는 단계; 및하나 이상의 요막강으로부터 인플루엔자 바이러스를 수득하는 단계를 포함하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린은 25 몰% 초과의 팔미테이트(C16:0), 20 몰% 초과의 스테아레이트(C18:0) 또는 40 몰% 초과의 올레이트(C18:1)를 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이는 1일 닭 한마리에 대하여 1 g 이상의 총 콜레스테롤 또는 총 스핑고마이엘린을 포함하는 것인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 식이의 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린은, 상기 제공된 바이러스가 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래한 난에서의 배양된 바이러스의 경우보다 더 높은 역가, 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래한 난에서의 배양된 바이러스의 경우보다 더 긴 저장 수명(shelf life), 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래한 난에서의 배양된 바이러스의 경우보다 더 높은 항원성(antigenicity), 및 콜레스테롤 또는 스핑고마이엘린이 농후한 식이를 급식하지 않은 대조군 닭으로부터 유래한 난에서의 배양된 바이러스로부터 유래한 멤브레인과 비교하여 변형된 멤브레인 상 전이로 이루어진 군으로부터 선택된 특징을 포함할 때까지, 적어도 조절하는 것인 방법.
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