CN110923209A - 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法 - Google Patents

一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110923209A
CN110923209A CN201910963582.6A CN201910963582A CN110923209A CN 110923209 A CN110923209 A CN 110923209A CN 201910963582 A CN201910963582 A CN 201910963582A CN 110923209 A CN110923209 A CN 110923209A
Authority
CN
China
Prior art keywords
liposome
cell culture
virus
liposomes
viruses
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910963582.6A
Other languages
English (en)
Inventor
王吉贵
刘维全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Agricultural University
Original Assignee
China Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Agricultural University filed Critical China Agricultural University
Priority to CN201910963582.6A priority Critical patent/CN110923209A/zh
Publication of CN110923209A publication Critical patent/CN110923209A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36051—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，所述方法为：在生产有囊膜病毒时，在病毒增殖后期将100‑5000μL的脂质体或动物细胞膜破坏后水相的上层含有的脂层物质加入到细胞满度达80‑100％，75cm2的细胞培养瓶中。可提高产生完整病毒的数量。

Description

一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法
技术领域
本发明属于生物制品领域的病毒生产制备，具体涉及一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法。
背景技术
病毒是一类不具细胞结构，具有遗传、复制等生命特征的微生物。病毒主要由内部的遗传物质和蛋白质外壳组成。由于病毒是一类非细胞生物体，故单个病毒个体不能称作"单细胞"，这样就产生了病毒粒或病毒体。病毒粒有时也称病毒颗粒或病毒粒子，专指成熟的、结构完整的和有感染性的单个病毒。核酸位于它的中心，称为核心或基因组，蛋白质包围在核心周围，形成了衣壳。衣壳是病毒粒的主要支架结构和抗原成分，有保护核酸等作用。衣壳是由许多在电镜下可辨别的形态学亚单位--衣壳粒所构成。核心和衣壳合称核心壳。有些较复杂的病毒，(一般为动物病毒，如流感病毒)，其核心壳外还被一层含蛋白质或糖蛋白的类脂双层膜覆盖着，这层膜称为囊膜。囊膜中的类脂来自宿主细胞膜。有的囊膜上还长有刺突等附属物。囊膜的有无及其性质与该病毒的宿主专一性和侵入等功能有关。可将病毒分为有囊膜病毒和无囊膜病毒。有囊膜病毒包括痘病毒科、杆状病毒科、多DNA病毒科、嗜肝病毒科、反转录病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、冠状病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼病毒科、嵌沙样病毒科、疱疹病毒科、虹彩病毒科等成员。
病毒同所有的生物一样，具有遗传、变异、进化的能力，是一种体积非常微小，具有高度的寄生性，完全依赖宿主细胞的能量和代谢系统，获取生命活动所需的物质和能量，离开宿主细胞，它只是一个大化学分子，停止活动。遇到宿主细胞它会通过吸附、侵入、增殖、成熟(装配)、释放子代病毒而显示典型的生命体特征。病毒在宿主细胞内的复制过程叫做复制周期。病毒复制的基本过程为：1、吸附，即病毒颗粒与细胞膜的受体发生相互作用后病毒颗粒特异性地吸附于宿主细胞表面；2、侵入，病毒吸附于宿主细胞膜后以各种不同的方式进入细胞，此即侵入；3、脱壳，病毒在宿主细胞内脱去核壳，病毒核酸随后进入细胞的一定部位；4、病毒大分子的生物合成，病毒基因组进入宿主细胞后，一方面表达与合成病毒复制过程中所必需的结构蛋白和非结构蛋白，另一方面进行复制合成子代病毒核酸；5装配与释放，病毒核酸与壳体蛋白合成完毕后，在细胞核内或胞浆内装配成熟为病毒颗粒(核衣壳)，有囊膜病毒还会利用细胞膜等生物膜成分合成出自己的囊膜，即成为子代病毒体，然后子代病毒体以不同方式从感染细胞中释放到细胞外环境中。有的病毒体形成了成熟的病毒粒子，有的仅有衣壳无核酸，有的有核酸和衣壳，但是缺乏囊膜。所以在疫苗生产中，有囊膜病毒的滴度常常会因此受到影响。
在实际生产中，利用细胞培养生产有囊膜病毒时，也发现部分病毒滴度不高，而在细胞裂解后发现有一些没有核酸或没有囊膜的类病毒颗粒。
脂质体亦称类脂小球、液晶微囊。是一种类似微型胶囊的剂型。
1971年英国莱门(Rymen)等人开始将脂质体作药物载体。脂质体是将药物包封于类脂质双分子层形成的薄膜中间而制成的超微型球状载体制剂。所谓载体可以是一组分子，包蔽于药物外，通过渗透或被巨噬细胞吞噬后，载体被酶类分解而释放药物，从而发挥作用。脂质体作为药物的载体可产生药物的定向作用，提高药物的疗效，降低药物的毒副作用。该剂型在抗癌药物中应用比较广泛。
根据脂质体的结构不同，脂质体可分为三类：
(1)单室脂质体(Unilamellar or Single Compartment Liposomes)。球径约为≤25μm，水溶性药物的溶液只被一层类脂双分子层所包封，脂溶性药物则分散于双分子层中。凡经超声波分散的脂质体混悬液，绝大部分为单室脂质体。
(2)多室脂质体(Multilamellar or Multiple Compartment Liposomes)。球径约为≤100μm，有几层脂质双分子层将被包含的药物(水溶性药物)的水膜隔开，形成不均匀的聚合体，脂溶性药物则分散于几层双分子层中。
(3)大多孔脂质体(Macrovesicle)。球径约0.13±0.06μm，单层状，比单室脂质体可多包蔽10倍的药物。我国应用唐松草碱，鹤草酚、喜树碱等中药有效成分制成脂质体，在提高疗效、降低副作用方面，取得了良好效果。尤其是脂质体双分子层中包裹脂溶性药物，脂质体双分子包围的中心室包蔽水溶性药物，可制备中西医结合的处方。如将5-氟脲嘧啶与猪苓多糖组成处方，包成脂质体，由于猪苓多糖可显著提高机体的免疫力，增加吞噬细胞的吞噬力，5-氟脲嘧啶能从细胞增殖周期的某一环节对癌细胞予以打击，中西药同时发挥作用，使药物疗效显著提高，由于载体的定向作用使毒性也显若降低。
发明内容
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，本发明所述的方法可增加有囊膜病毒的成熟病毒粒子的数量，提高病毒滴度。
为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：
一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，所述方法为：在生产有囊膜病毒时，在病毒增殖后期将100-5000μL的脂质体或动物细胞膜破坏后水相的上层含有的脂层物质加入到细胞满度达80-100％，75cm2的细胞培养瓶中。
在上述方案的基础上，所述脂质体为单室脂质体、多室脂质体或大多孔脂质体。
在上述方案的基础上，所述脂质体为Lipofectamine 2000或Lipofectamine3000。
本发明的有益效果：子代病毒在增殖后期，由于没有足够的囊膜包裹，形成了不完整的病毒，并没有侵染性、致病性，所以在病毒增殖后期添加脂质体，可促进不完整病毒的包装，提高生产病毒的效率。
具体实施方式
以下对本发明作进一步详细说明。
一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，所述方法为：在生产有囊膜病毒时，在病毒增殖后期将100-5000μL的脂质体或动物细胞膜破坏后水相的上层含有的脂层物质加入到细胞满度达80-100％，75cm2的细胞培养瓶中。
在上述方案的基础上，所述脂质体为单室脂质体、多室脂质体或大多孔脂质体。
在上述方案的基础上，所述脂质体为Lipofectamine 2000或Lipofectamine3000。
实施例一：在Marc145细胞中生产猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)时，在病毒增殖后期，宿主细胞尚未破裂之前，将500μL的lipofectamine 3000加入到75cm2细胞培养瓶中，最终可使病毒滴度从104.5TCID50/ml提高到106.0TCID50/ml。
本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。

Claims (3)

1.一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，其特征在于，所述方法为：在生产有囊膜病毒时，在病毒增殖后期将100-5000μL的脂质体或动物细胞膜破坏后水相的上层含有的脂层物质加入到细胞满度达80-100％，75cm2的细胞培养瓶中。
2.如权利要求1所述的细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，其特征在于，所述脂质体为单室脂质体、多室脂质体或大多孔脂质体。
3.如权利要求1所述的细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法，其特征在于，所述脂质体为Lipofectamine 2000或Lipofectamine 3000。
CN201910963582.6A 2019-10-11 2019-10-11 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法 Pending CN110923209A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910963582.6A CN110923209A (zh) 2019-10-11 2019-10-11 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910963582.6A CN110923209A (zh) 2019-10-11 2019-10-11 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110923209A true CN110923209A (zh) 2020-03-27

Family

ID=69848852

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910963582.6A Pending CN110923209A (zh) 2019-10-11 2019-10-11 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110923209A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101578362A (zh) * 2006-10-17 2009-11-11 米迪缪尼有限公司 影响病毒脂质的成分
WO2011135734A1 (ja) * 2010-04-28 2011-11-03 株式会社アルファ・ナノ・メディカ ウイルスの複合体、それを含有する治療薬及び治療方法
CN109735571A (zh) * 2019-03-11 2019-05-10 四川药智联恒科技有限公司 双自杀基因慢病毒表达载体及其应用
CN109985242A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 广州威溶特医药科技有限公司 甲羟戊酸代谢通路抑制剂和甲病毒在制备抗肿瘤药物的应用
CN110669740A (zh) * 2019-07-16 2020-01-10 伍泽堂 溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101578362A (zh) * 2006-10-17 2009-11-11 米迪缪尼有限公司 影响病毒脂质的成分
WO2011135734A1 (ja) * 2010-04-28 2011-11-03 株式会社アルファ・ナノ・メディカ ウイルスの複合体、それを含有する治療薬及び治療方法
CN109985242A (zh) * 2017-12-29 2019-07-09 广州威溶特医药科技有限公司 甲羟戊酸代谢通路抑制剂和甲病毒在制备抗肿瘤药物的应用
CN109735571A (zh) * 2019-03-11 2019-05-10 四川药智联恒科技有限公司 双自杀基因慢病毒表达载体及其应用
CN110669740A (zh) * 2019-07-16 2020-01-10 伍泽堂 溶瘤病毒及其应用和治疗癌症的药物

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COLIN D.PORTER等: ""Cationic Liposomes Ehance the Rate of Transduction by a Recombinant Retroviral Vector In Vitro and In Vivo"", 《GENE THERAPY》 *
杨生玺: ""重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素"", 《第四军医大学学报》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Lucas et al. Viral capsids and envelopes: structure and function
Lorizate et al. Role of lipids in virus replication
Punch et al. Potassium is a trigger for conformational change in the fusion spike of an enveloped RNA virus
US12006500B2 (en) Composition and methods of RNAi prophylactics and therapeutics for treatment of severe acute respiratory infection caused by 2019 novel coronavirus (2019-nCoV)
JP2007295937A (ja) 細胞培養物からウイルスを抽出する方法
US11020470B2 (en) Virus-like particles
CN114404391B (zh) 一种纳米粒及其制备方法和用途
Fuller et al. Cell surface influenza haemagglutinin can mediate infection by other animal viruses.
CN112048004B (zh) 一种柯萨奇病毒b5型病毒样颗粒、其制备方法及应用
KR20200063275A (ko) 코로나바이러스 예방 및 치료제
Kovalev et al. Reconstitution of an RNA virus replicase in artificial giant unilamellar vesicles supports full replication and provides protection for the double-stranded RNA replication intermediate
US20240024455A1 (en) Multicistronic rna vaccines and uses thereof
Barreto-Vieira et al. Dengue, Yellow Fever, Zika and Chikungunya epidemic arboviruses in Brazil: ultrastructural aspects
CN110923209A (zh) 一种细胞培养物中添加脂质体提高有囊膜病毒滴度的方法
Omasta et al. Cellular Lipids—Hijacked Victims of Viruses
US20200237678A1 (en) Lipid nanoparticle membrane composition
CN104288759A (zh) 一种禽流感疫苗组合物及其制备方法和应用
Konopka et al. Long-Term Noncytopathic Productive Infection of the Human Monocytic Leukemia Cell Line THP-1 by Human Immunedeficiency Virus Type 1 (HIV-1IIIB)
WO2023133922A1 (zh) 一种微米级脂质复合物及其制备和应用
WO2011147175A1 (zh) 细胞微粒子-siRNA复合物的制备及其在艾滋病治疗中的应用
Nayak Virus morphology, replication, and assembly
Montazeri Aliabadi et al. Suppression of human coronavirus 229E infection in lung fibroblast cells via RNA interference
US20220145309A1 (en) Yeast-Based Oral Vaccination
WO2016110173A1 (zh) 一种流感病毒神经氨酸酶的新型抑制剂及其用途
CN112472791A (zh) CsA脂质体在制备抗SARS-CoV-2药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20200327