CN117070478A - 一种携带HiBiT标签的流感病毒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种携带HiBiT标签的流感病毒及其构建方法和应用，属于生物医药技术领域。一种携带HiBiT标签的流感病毒，包括在流感病毒的基因组基础上，将非结构蛋白NS1基因和HiBiT标签融合表达。本发明在NS1基因RNA结合域和效应域之间的连接处替换为Nanoluc荧光素酶报告基因的小亚基HiBiT用于检测荧光素酶活性。构建荧光素酶报告病毒具有优异的稳定性和复制能力，方便检测，可用于抗病毒药物、抗体或者疫苗的评价和评估，具有重要的科研价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种携带HiBiT标签的流感病毒及其构建方法和应用。
背景技术
A型流感病毒(IAV)属于正粘病毒科成员，其基因组是一种单股负链RNA，分为8节段。IAV最大的特点是容易变异或者发生基因重排产生新型流感病毒，产生的新型流感病毒的传播能力和致病能力很难预测，并且增加了IAV的防控难度。
IAV根据其表面结构及其基因特性(HA和NA)的不同可分为许多亚型，到目前为止IAV已发现的血凝素HA有18个亚型(H1-H18)，神经氨酸酶(HA)有11个亚型(N1-11)。IAV基因组至少编码17种以上病毒蛋白，包括两种外膜蛋白血凝素HA和神经氨酸酶NA。其内部蛋白分别是核蛋白NP、三种聚合酶PB1、PB2和PA，两种基质蛋白M1和M2，非结构蛋白NS1等。IAV在进化过程中会产生基因突变或基因重排产生新型IAV，产生的IAV有些可以感染人和哺乳动物，使公共卫生安全产生严重的危机。目前使用的IAV疫苗不能提供理想的保护，因此需要经常更新疫苗株。由于IAV耐药株的不断出现和现有药物对IAV抑制效果的不可控性，需要开发新型的抗病毒药物试剂。然而无论是疫苗研发还是抗病毒药物试剂的筛选均需要进行免疫能力测试和药效评估，都会耗费研究者大量的时间。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种携带HiBiT标签的流感病毒，是一种稳定性高、复制能力好、灵敏性强的报告病毒，用于抗病毒药物、抗体或者疫苗的评价和评估工具。
本发明提供了一种携带HiBiT标签的流感病毒，包括在流感病毒的基因组基础上，将非结构蛋白NS1基因和HiBiT标签融合表达。
优选的，所述HiBiT标签替换了在非结构蛋白NS1基因的RNA结合域和效应域之间74～84位氨基酸。
优选的，所述HiBiT标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选的，改造后的非结构蛋白NS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选的，所述流感病毒包括A型流感病毒；
优选的，所述A型流感病毒的NP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
聚合酶PB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
聚合酶PB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
聚合酶PA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
基质蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
血凝素HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
神经氨酸酶NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
本发明提供了所述携带HiBiT标签的流感病毒的构建方法，包括以下步骤：
制备NS1-HiBiT融合基因；
将所述NS1-HiBiT融合基因、NP基因、PB1基因、PB2基因、PA基因、M基因、HA基因、NA基因分别构建入表达载体中，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体进行共转染至哺乳动物细胞中进行病毒拯救，得到携带HiBiT标签的流感病毒。
优选的，在所述病毒拯救后进行病毒增殖；所述病毒增殖的方法为将拯救后的病毒株接种至鸡胚中培养，收集病毒。
优选的，所述病毒拯救的时间为在所述共转染后，进行48～96小时的培养；
所述哺乳动物细胞为293T细胞。
本发明提供了所述携带HiBiT标签的流感病毒或所述构建方法得到的携带HiBiT标签的流感病毒在以下产品的筛选和/或评估中的应用：抗流感病毒药物、抗流感病毒抗体和流感病毒疫苗。
本发明提供了一种携带HiBiT标签的流感病毒，包括在流感病毒的基因组基础上，将非结构蛋白NS1基因和HiBiT标签融合表达。实验表明，本发明构建的携带HiBiT标签的流感病毒在HiBiT标签稳定表达的基础上，还具有病毒复制能力强、稳定、易于检测，采用其进行抗流感病毒药物筛选，具有灵敏度高的显著优势，检测时间短，相比现有传统检测方法大大节约了时间。
本发明提供的所述携带HiBiT标签的流感病毒的构建方法，也可以应用于其他亚型流感病毒，如H1N1、H3N2等的报告病毒构建，对相应抗病毒药物、抗体或者疫苗的评价和评估具有重要的科研价值。
附图说明
图1为本发明流感荧光素酶报告病毒的构建示意图；
图2为流感荧光素酶报告病毒遗传稳定性结果，图2中A为本发明流感荧光素酶报告病毒在鸡胚中进行连续传代评价图；图2中B为本发明流感荧光素酶报告病毒传代后HiBiT标签表达稳定性评价图；
图3为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒的体外条件下复制能力结果；图3中A为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以不同剂量感染MDCK细胞后的复制动力学曲线比较结果；图3中B为野生病毒和报告病毒以不同剂量感染MDCK细胞后的荧光素酶活性检测结果；
图4为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒感染小鼠结果；图4中A为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染BALB/c小鼠后在不同时间点各脏器中病毒载量检测；图4中B为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染BALB/c小鼠后在不同时间点各脏器中荧光素酶活性检测结果；
图5为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒感染SPF鸡后各脏器感染结果；图5中A为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点各脏器中病毒载量检测；图5中B为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点各脏器中荧光素酶活性检测结果；
图6为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒感染SPF鸡后结果拭子结果；图6中A为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点拭子中病毒载量检测结果；图6中B为野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点拭子中荧光素酶活性检测结果；
图7为Baloxanir药物后对流感荧光素酶报告病毒抑制效果评估结果；图7中A为不同浓度Baloxanir药物处理24h后对流感荧光素酶报告病毒抑制效果评价结果；图7中B为不同浓度Baloxanir药物处理36h后对流感荧光素酶报告病毒抑制效果评价结果；图7中C为Baloxanir药物处理对细胞活性影响结果；
图8为灭活疫苗免疫后对流感荧光素酶报告病毒攻击结果；图8中A为流感荧光素酶报告病毒攻击免疫组和对照组的SPF鸡后各脏器中荧光素酶活性检测结果；图8中B为流感荧光素酶报告病毒攻击免疫组和对照组的SPF鸡后拭子中荧光素酶活性检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种携带HiBiT标签的流感病毒，包括在流感病毒的基因组基础上，将非结构蛋白NS1基因和HiBiT标签融合表达。
在本发明中，所述HiBiT标签替换了在非结构蛋白NS1基因的RNA结合域和效应域之间74～84位氨基酸，对报告病毒进行连续传代至15代以及对报告病毒的生长特性进行研究发现报告基因能够稳定遗传且不影响病毒的复制和感染能力。所述HiBiT标签的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:1所示。
在本发明中，所述流感病毒优选包括A型流感病毒。在本发明实施例中，以A/Chicken/Wuwei/170/2020(H9N2)流感病毒株为试验毒株进行改造。改造后的非结构蛋白NS1基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:2所示。所述A型流感病毒的NP基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:3所示；聚合酶PB1基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:4所示；聚合酶PB2基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:5所示；聚合酶PA基因的核苷酸序列优选如SEQ IDNO:6所示；基质蛋白M基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:7所示；血凝素HA基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:8所示；神经氨酸酶NA基因的核苷酸序列优选如SEQ ID NO:9所示。
本发明提供了所述携带HiBiT标签的流感病毒的构建方法，包括以下步骤：
制备NS1-HiBiT融合基因；
将所述NS1-HiBiT融合基因、NP基因、PB1基因、PB2基因、PA基因、M基因、HA基因、NA基因分别构建入表达载体中，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体进行共转染至哺乳动物细胞中进行病毒拯救，得到携带HiBiT标签的流感病毒。
本发明制备NS1-HiBiT融合基因。
在本发明中，所述制备NS1-HiBiT融合基因的方法优选包括人工合成法或PCR扩增法获得。
得到NS1-HiBiT融合基因后，本发明将所述NS1-HiBiT融合基因、NP基因、PB1基因、PB2基因、PA基因、M基因、HA基因、NA基因分别构建入表达载体中，得到重组表达载体。
本发明对所述表达载体的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的表达载体即可，例如pBD载体。本专利所用载体为pBD载体，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所陈化兰院士构建并馈赠(参见现有技术Li,Z.,Chen,H.,Jiao,P.,Deng,G.,Tian,G.,Li,Y.,Hoffmann,E.,Webster,R.G.,Matsuoka,Y.,Yu,K.,2005b.Molecular basisofreplication ofduck H5N1 influenza viruses in amammalian mouse model.J Virol79,12058-12064,10.1128/JVI.79.18.12058-12064.2005.)。本发明对所述构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建重组表达载体的方法即可，例如同源重组方法、人工合成方法等。所述构建后，优选对这8种重组表达载体进行验证。所述验证的方法优选为将重组表达载体导入大肠杆菌感受态中，经过培养，提取大量质粒进行根据特异性基因片段进行菌液PCR和测序。
得到阳性的重组表达载体后，本发明将所述重组表达载体进行共转染至哺乳动物细胞中进行病毒拯救，得到携带HiBiT标签的流感病毒。
本发明对所述共转染的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的共转染方法即可。在本发明实施例中，所述共转染优选在转染试剂X-treme GENETMHP DNA TransfectionReagent(Roche)完成转染。所述所述哺乳动物细胞为293T细胞。所述病毒拯救的时间为在所述共转染后，优选进行48～96小时的培养。
在本发明中，在所述病毒拯救后优选进行病毒增殖；所述病毒增殖的方法为将拯救后的病毒株接种至鸡胚中培养，收集病毒。所述鸡胚优选为SPF鸡胚。所述SPF鸡胚的日龄优选为9～11日龄。
在本发明中，采用上述方法制备的重组流感病毒颗粒的表面实现HiBiT标签与NS基因融合表达，因携带HiBiT标签，通过荧光素酶的小亚基和大亚基具有很高的亲和力，结合后产生较高的荧光素酶活性。实验表明，稳定性评估实验表明，构建的报告病毒连续15代复制稳定，其荧光素酶检测结果显示具有优异的稳定性，且与病毒向具有相关性。同时经体内外多周期复制分析结果表明，与复制能力相同，报告病毒的感染能力与野生病毒相同，这表明，HiBiT标签的插入并未影响流感病毒的复制和感染活性，并且报告病毒在多种生物体内均实现脏器和拭子的感染和检测。
本发明提供了所述携带HiBiT标签的流感病毒或所述构建方法得到的携带HiBiT标签的流感病毒在以下产品的筛选和/或评估中的应用：抗流感病毒药物、抗流感病毒抗体和流感病毒疫苗。
在本发明中，以Baloxavir药物为例，开展了携带HiBiT标签的流感病毒对抗病毒药物对病毒抑制效果检测实验，结果表明，本发明的流报告病毒作为抗病毒药物试剂筛选的高通量工具。
在本发明中，以灭活疫苗为例，开展了携带HiBiT标签的流感病毒对免疫后产生的中和抗体的中和实验，结果表明，本发明的流感荧光素酶报告病毒作为疫苗效果评价的高通量工具。
下面结合实施例对本发明提供的一种携带HiBiT标签的流感病毒及其构建方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种H9N2流感荧光素酶报告病毒的构建方法
选用流感病毒株A/Chicken/Wuwei/170/2020(H9N2)，将其NS1基因RNA结合域和效应域之间的连接处74-84位氨基酸替换为HiBiT标签序列，得到融合基因(NS1-HiBiT)；将基因片段(PB2、PB1、PA、NP、M、NS-HiBiT、HA、NA)重组到pBD载体中，制备以下8种重组表达质粒：pBD-PB2、pBD-PB1、pBD-PA、pBD-NP、pBD-M、pBD-NS-HiBiT、pBD-HA、pBD-NA；引物信息如下表1。
表1基因片段的扩增用引物序列
将上述8个重组表达质粒各0.5μg加入到200μL新鲜的Opti-MEM；借助转染试剂X-treme GENETMHP DNA Transfection Reagent(Roche)完成转染；共转染至293T细胞中，48小时后从上清液中收集病毒，并在9-11日龄的SPF鸡胚上进行病毒增殖。构建得到流感荧光素酶报告病毒。
图1为本发明报告病毒的构建示意图。在NS基因中引入的HiBiT标签表达产生纳米荧光素酶的小亚基。该小亚基和大亚基具有很高的亲和力，结合后产生较高的荧光素酶活性，HiBiT标签与NS基因融合表达的蛋白可以存在于病毒颗粒中。
实施例2
流感荧光素酶报告病毒稳定性评价
对实施例1构建得到的流感荧光素酶报告病毒的稳定性进行评价：
具体操作为：
(1)报告病毒于SPF鸡胚中连续传15代；
(2)将收集到的上述病毒用红细胞凝集试验检测血凝效价；
(3)利用Nano-HiBiT Lytic Detection System(Promega)按照使用说明书对20μl病毒上清液进行荧光素酶检测；
(3)比较发现：报告病毒连续15代复制稳定，其荧光素酶检测结果显示具有优异的稳定性，且与病毒向具有相关性。
如图2所示，报告病毒在鸡胚中进行连续传代，并对收获病毒(第1代至第15代)的血凝效价和荧光素酶活性进行测定，测定结果显示该报告病毒连续15代复制稳定，其荧光素酶检测结果显示具有优异的稳定性，且与病毒向具有相关性。
实施例3
流感荧光素酶报告病毒的体内外多周期复制分析
1.流感荧光素酶报告病毒的体外多周期复制分析，具体操作为：
(1)铺MDCK细胞于12孔板中并用指定病毒(流感荧光素酶报告病毒或野生病毒)进行感染；
(2)37℃孵育1小时，然后使用PBS轻轻洗涤细胞3次，并加入含有0.5μg/mL TPCK-胰蛋白酶的新鲜OptiMEM；
(3)在换液后的指定时间点收取上清液；
(4)分别利用连续10倍稀释的野生病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度(参见现有技术Reed LJ,Muench H.A simple method of estimatingfifty percent endpoints.Am J Hyg.1938；27(3):493-497.DOI:10.1093/ oxfordjournals.aje.a118408.)；同期进行荧光素酶活性检测。
如图3所示，其中本发明流感荧光素酶报告病毒和野生病毒以不同剂量感染MDCK细胞后的复制动力学曲线比较，结果表明，流感荧光素酶报告病毒和野生病毒相比在复制动力学方面表现一致，这说明荧光素酶小亚基的表达并未影响流感病毒的复制。流感荧光素酶报告病毒和野生病毒以不同剂量感染MDCK细胞后的荧光素酶活性检测结果，结果表明流感荧光素酶报告病毒能够稳定表达荧光素酶小亚基，而野生病毒则无法表达。
2.流感荧光素酶报告病毒的小鼠体内多周期复制分析，具体操作为：
(1)流感荧光素酶报告病毒和野生病毒两种病毒分别以106EID50/100μL剂量感染BALB/c小鼠；
(2)感染后分别在第3天和第5天收集各脏器；
(3)对各脏器进行匀浆后，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对10倍稀释的病毒液进行荧光素酶活性检测。
如图4所示，野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染BALB/c小鼠后在不同时间点各脏器中病毒载量检测，结果表明，各脏器中两种病毒的感染载量并未呈现显著性差异，这说明荧光素酶小亚基的表达并未影响流感病毒的体内的感染能力。
野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染BALB/c小鼠后在不同时间点各脏器中荧光素酶活性检测结果表明，与野生型流感病毒相比，流感荧光素酶报告病毒的荧光素酶活性仅在肺和鼻腔中检测到显著性提高，这表明流感荧光素酶报告病毒仅感染鼻腔和肺等呼吸系统，而对脑、脾和肾等其他器官不会造成感染。
3.流感荧光素酶报告病毒的鸡胚体内多周期复制分析，具体操作为：
(1)两种病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡；
(2)感染后分别在第2天和第4天收集各脏器；
(3)对各脏器进行匀浆后，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对10倍稀释的病毒液进行荧光素酶活性检测。
如图5所示，野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点各脏器中病毒载量检测结果表明，流感荧光素酶报告病毒和野生流感病毒对鸡胚的不同脏器的侵染程度是相同，未呈现显著性差异；
野生病毒和流感荧光素酶报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点各脏器中荧光素酶活性检测结果表明，与野生流感病毒相比，流感荧光素酶报告病毒在三种脏器中检测的荧光素酶活性均显著性提高。
4.具体操作为：
(1)流感荧光素酶报告病毒和野生病毒两种病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡；
(2)感染后分别在第2天和第4天收集喉拭子和泄殖腔拭子；
(3)对拭子上清液，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对拭子上清液进行荧光素酶活性检测。
如图6所示，图6中A为野生病毒和报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点拭子中病毒载量检测，发现重组H9N2-NS-HiBiT病毒和野生型H9N2AIV均可在喉拭子和泄殖腔拭子中有效复制，且复制能力相似；图6中B为野生病毒和报告病毒以106EID50/100μL剂量感染SPF鸡后在不同时间点拭子中荧光素酶活性检测结果，发现重组H9N2-NS-HiBiT病毒感染SPF鸡后在喉拭子和泄殖腔拭子中可以检测到较高的荧光素酶活性，表明可以通过荧光素酶法检测体内试验中拭子中的病毒滴度。
实施例4
构建得到的流感荧光素酶报告病毒在抗流感病毒药物筛选方面的应用
(1)用1MOI剂量将流感荧光素酶报告病毒感染MDCK细胞；
(2)感染1h后弃去上清，使用PBS轻轻洗涤细胞3次后加入含有不同浓度Baloxanir药物和0.5μg/mL TPCK-胰蛋白酶的新鲜OptiMEM；
(3)感染后分别在24h和36h收取病毒样品；
(4)对收取的病毒液，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对收取的病毒液进行荧光素酶活性检测；
如图7所示，图7中A为不同浓度Baloxanir药物处理24h后对报告病毒抑制效果评价结果；图7中B为不同浓度Baloxanir药物处理36h后对报告病毒抑制效果评价结果；图7中C为Baloxanir药物处理对细胞活性影响结果。由图7可以看出，本发明的流感荧光素酶报告病毒作为筛选工具能够更加灵敏、快速的进行抗流感病毒药物的筛选，节约时间，可用于高通量筛选。
实施例5
构建得到的流感荧光素酶报告病毒在疫苗效果评价方面的应用
(1)用流感病毒灭活疫苗免疫SPF鸡3次，每次免疫前收集血清，每7天免疫一次，免疫剂量为0.5mL/次；
(2)用106EID50/100μL剂量将流感荧光素酶报告病毒感染上述免疫后的SPF鸡；
(3)感染后分别在第2天和第4天收集各脏器和咽拭子以及泄殖腔；
(4)对收取的脏器匀浆后，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对10倍稀释的病毒液进行荧光素酶活性检测；
(5)对收取的拭子，分别利用连续10倍稀释的原种病毒接种到鸡胚来测定EID50值，并通过Reed-Muench方法计算滴度；同期对病毒液进行荧光素酶活性检测；
(6)对收取的血清，分别利用传统病毒中和试验和基于荧光素酶报告病毒的病毒中和实验法检测中和效价；
如图8所示，流感荧光素酶报告病毒攻击免疫组和对照组的SPF鸡后各脏器中荧光素酶活性检测结果表明，与对照组相比，流感荧光素酶报告病毒感染组的荧光素酶活性有显著性降低，分析原因可能是灭活疫苗免疫的SPF鸡产生的抗体中和了流感荧光素酶报告病毒。图8中B为流感荧光素酶报告病毒攻击免疫组和对照组的SPF鸡后拭子中荧光素酶活性检测结果表明，咽拭子和泄殖腔拭子的检测结果与各脏器的检测结果较为类似，与对照组相比，流感荧光素酶报告病毒感染组的荧光素酶活性有显著性降低。由此可以看出，本发明的流感荧光素酶报告病毒作为疫苗效果评价的高通量工具。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，包括在流感病毒的基因组基础上，将非结构蛋白NS1基因和HiBiT标签融合表达。
2.根据权利要求1所述携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，所述HiBiT标签替换了在非结构蛋白NS1基因的RNA结合域和效应域之间的74～84位氨基酸。
3.根据权利要求1所述携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，所述HiBiT标签的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.根据权利要求1所述携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，改造后的非结构蛋白NS1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求1～4中任意一项所述携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，所述流感病毒包括A型流感病毒。
6.根据权利要求5所述携带HiBiT标签的流感病毒，其特征在于，所述A型流感病毒的NP基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
聚合酶PB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
聚合酶PB2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；
聚合酶PA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
基质蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；
血凝素HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；
神经氨酸酶NA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。
7.权利要求1～6中任意一项所述携带HiBiT标签的流感病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备NS1-HiBiT融合基因；
将所述NS1-HiBiT融合基因、NP基因、PB1基因、PB2基因、PA基因、M基因、HA基因、NA基因分别构建入表达载体中，得到重组表达载体；
将所述重组表达载体进行共转染至哺乳动物细胞中进行病毒拯救，得到携带HiBiT标签的流感病毒。
8.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，在所述病毒拯救后进行病毒增殖；所述病毒增殖的方法为将拯救后的病毒株接种至鸡胚中培养，收集病毒。
9.根据权利要求7所述构建方法，其特征在于，所述病毒拯救的时间为在所述共转染后，进行48～96小时的培养；
所述哺乳动物细胞为293T细胞。
10.权利要求1～6中任意一项所述携带HiBiT标签的流感病毒或权利要求7～9中任意一项所述构建方法得到的携带HiBiT标签的流感病毒在以下产品的筛选和/或评估中的应用：抗流感病毒药物、抗流感病毒抗体和流感病毒疫苗。
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