KR20070058440A - 복제 선택 재조합 및 그것의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 예를 들면 바이러스, 미생물, 세포 및 다세포 생물을 포함하는 일정 범위의 생물의 유전적 변이성을 결정, 예측 및 특성화하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 병독성 병원체의 동정 방법, 동물 건강에 관련된 병원체 내에서의 유전적 돌연변이, 및 그와 같은 병원체에 대한 예방적 또는 치료적 개입을 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
바이러스 친주, 자손 바이러스 돌연변이주
Description
관련 출원
본 출원은, 그 전체 내용이 본원에 참고로 인용되는 2004년 7월 2일에 출원된 미국 가출원 제 60/585,306 호, 2004년 7월 13일에 출원된 미국 가출원 제 60/587,580 호, 2004년 7월 21일에 출원된 미국 가출원 제 60/590,162 호, 및 2005년 6월 16일에 출원된 미국 가출원 제 60/xxx,xxx 호와 관련된다.
본원 전반에 인용된 모든 참조문헌, 특허 및 공개 특허 출원의 내용은 그 전체 내용이 본원에 참고로 인용된다.
인간 및 동물의 질병을 이해하는 것을 비롯하여 병원체의 유전적 성질을 결정하기 위해 분자 유전학의 발전에 있어 현저한 달성에도 불구하고, 장래의 질병 및 병원체의 병독성의 예측 또는 예후에 대한 규칙은 여전히 종잡을 수 없다. 전형적으로, 질병 (또는 질병 감수성)을 초래하는 세포 게놈의 유전적 변형, 또는 병독성 병원체의 유전자 서열을 사후(a posteriori) 수집하고, 카탈로그화한 후, 진단하고 적절한 치료제를 결정하기 위해 사용한다. 따라서, 유전적 질병 (또는 질병 감수성) 및/또는 병원체로 고통 받는 대상에서의 게놈 불안정성의 결과에 대해 치료적으로 반응하는 것은 통상 순향적(proactive)이기보다는 반응적(reactive)이다. 이는, 예를 들면 바이러스와 같은 병원체에 대한 인간 및 동물의 반응을 치료할 때 특히 그러하다.
바이러스 백신의 개발은 현대 의학에 있어 특유의 도전과제를 제시한다(예를 들면, Ault, A.(2004), Science, 303:1280 참조). 다수의 병원체, 특히 바이러스는 일정하게 진화하기 때문에, 효과적인 백신의 개발은 종종 어렵고 불완전한 과정이다. 바이러스 게놈의 미래의 분자적 진화를 신뢰성 있게 예측하는 것은 그러한 병원체에 예방적으로 또한 치료적으로 투항할 인류의 능력을 진전시킬 것으로 예상된다.
바이러스는 기생균 중 가장 작은 것이며, 번식을 위해서 이들이 감염시키는 세포에 완전히 의존적이다. 인간을 감염시키는 바이러스 중 다수는 명백한 증상을 일으키지 않으면서 숙주를 감염시키는 반면, 다른 것들(예를 들면, 인플루엔자)은 잘 특성화된 집단의 증상들을 일으킨다. 중요한 것은, 증상은 감염시키는 균주의 병독성에 따라 달라질 수 있지만, 동일한 바이러스 균주라도 숙주의 건강 및 면역반응에 따라 현저히 상이한 효과를 낳을 수 있다는 것이다.
인간 및 동물의 질병뿐만 아니라 바이러스와 같은 병원체의 진화를 이해하기 위해서는 게놈의 불안정성을 초래하는 분자적 이벤트에 대해 좀 더 잘 이해하는 것이 필요하다. 실제로, 병원체의 게놈의 분자적 진화를 예측할 수 있는 능력은 항-병원체 작용제의 고안을 증대시킬 것으로 폭넓게 기대된다.
발명의 개요
본 발명은 적어도 부분적으로는 진핵생물 세포, 원핵생물 세포 및 바이러스 를 포함하는 광범위한 생물을 통틀어 게놈 불안정성이 복제 선택 재조합(copy-choice recombination)이라는 새로이 동정된 기전의 함수로서 발생한다는 발견을 근거로 한다. 지금까지는 무작위 돌연변이, 유전자 전좌(gene translocation), 및/또는 유전자 재편성(gene reassortment)이 바이러스 유전적 진화의 주된 기전인 것으로 여겨졌다. 실제로 최근까지, 바이러스의 진화는 주로 바이러스 게놈의 작은 돌연변이가 축적된 것으로 인한다고 추정되었다. 그러나 이 기전으로는 바이러스 진화의 단지 적은 부분만이 설명된다.
본원에서 기술한 새로이 동정된 기전은 세포 또는 생물체적 맥락에서 둘 이상의 유전자 서열 사이의 유전적 돌연변이의 습득에 대해 설명할 수 있다. 따라서, 본원에 개시된 기전은 다세포 생물, 진핵생물 세포, 원핵생물 세포에서, 병원체 및 미생물, 특히 바이러스에서 발생할 수 있는 돌연변이에 대해 예측할 수 있다.
이론에 얽매이지 않으면서, 본 발명은, 예를 들면 폴리머라아제에 의한 교정 착오, 자발적인 점 돌연변이 등을 기초로 한 새로운 유전적 돌연변이(들)의 도입을 통해서라기보다는, 유전자 복제 재조합에 의한 기존의 서열(들)의 재조합 또는 습득, 즉 본원에서 복제 선택 재조합이라 불리는 것을 기초로 한 유전적 진화의 기전을 제공한다.
이 유전적 변화 기전은 진핵생물 세포, 원핵생물 세포, 병원체, 미생물, 바이러스 등의 게놈에서의 유전적 변화를 예측하게 할 수 있는 예측성 규칙을 제공하는데 용이하게 활용될 수 있다. 따라서, 주어진 게놈에서 나타나는 유전자 변경의 가능성은 사전(a priori) 개입, 예를 들면 유전적 질병 또는 장애, 또는 병원체 균 주, 예를 들면 병독성 균주의 발생 또는 출현의 예측 또는 예후를, 치료법이 논리적으로 고안될 수 있도록 허용한다.
본 발명의 예측성 규칙, 즉 복제 선택 재조합의 예측성 규칙은, 예를 들면 1) 유전자 변경이 고등 진핵생물의 게놈 서열에서 보고된 일배체형(haplotype)을 닮은 구역에서 습득된다는 예측, 2) 유전자 변경이 통상 높은 빈도수의 핵산 염기 변이를 포함한다는 예측, 및/또는 3) 유전자 변경이 모체 핵산 서열로부터의 기존의 유전자 서열(들)에서 습득된다는 예측을 포함한다.
한 구체예에서는, 본 발명의 예측성 규칙이 어떤 대상의 질병 또는 장애에 대한 가능성 또는 약물유전체학적(pharmacogenomic) 반응성을 예상함으로써 인간 또는 동물의 건강을 향상시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명의 예측성 규칙이 병원체, 예를 들면 병독성 바이러스 균주의 출현 또는 발생 가능성을 예상하여, 예를 들면 항-병원체 작용제, 예를 들면 항바이러스제 및/또는 백신(예를 들면, 수동적 또는 능동적 백신)의 투여와 같은 치료적 개입을 허용함으로써, 인간 또는 동물의 건강을 향상시키는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 빠른 진화에 대한 선택적 압력을 정의하고 설명하는데 사용될 수 있는, 바이러스 친주(parental viral strain)와 이들의 자손 바이러스 돌연변이주(mutant progeny viral strain)의 비교를 제공한다. 재조합체의 동정을 사용하여 유전적 불안정성을 동정할 수 있는데, 이는 현재 범세계적으로 다수의 바이러스, 예를 들면 인플루엔자에서 명백히 나타난다. 또한 모체 바이러스 는 현장 분리물(field isolate)의 검출 이전에 재조합체를 생성하는데 사용할 수 있고, 그러한 재조합체는 축산업 및 인체 건강에 상당한 혼란을 야기하는 미래의 재조합체에 대한 보호용 백신을 제조하는데 사용될 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명이, 예를 들면 상이한 "모체" 바이러스 또는 박테리아의 단일 숙주 생물체 내에서의 혼합(예를 들면, 에볼라, 독감 및/또는 HIV; 수족구 및 뉴캐슬 질병; SARS, HIV 및/또는 아스트로바이러스; HIV 및 코로나바이러스; 상이한 약물 내성 박테리아 균주 등)에서 발생하는 바이러스 또는 박테리아의 유전적 조성 및, 경우에 따라 수반되는 표현형(phenotypic trait)(예를 들면, 약물 내성)을 예측하는데 적용될 수 있는 규칙을 제공한다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은, 예를 들면 바이러스 백신의 제조, 또는 항바이러스 화합물의 시험에 사용될 다양한 바이러스 서열 라이브러리를 생성시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 바이러스 친주를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 바이러스 백신의 효능을 모니터하고, 바이러스 집단의 상위(divergence)를 모니터하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은, 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는 몇 가지 장점을 가진다.
- 진핵생물, 원핵생물 및 병원체에서 발생하거나 발생하기 쉬운 유전자 변경의 성질을 결정하고 미래의 유전자 변경을 예측하기 위한 규칙의 제공;
- 인간 또는 동물에서의 유전자 변경 및/또는 인간 또는 동물의 약물유전체학적 반응성의 예후 방법의 제공;
- 질병 또는 장애를 조절함으로써 예방하거나 치료하기에 적당한 인간 또는 동물의 유전자 서열을 결정하는 방법의 제공;
- 치료적 개입을 위한 논리적 후보 병원체의 동정 방법;
- 병원체 표적, 예를 들면 바이러스 병원체에 대한 백신 및 백신 개발에 관한 방법 및 조성물; 및
- 인플루엔자, 예를 들면 H5N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H1N1, H9N2, WSN/33, H6N1, H1N2, H2N2, H3N2, H3N8 및 H2N9와 같은 병독성 균주의 인플루엔자에 대한 백신 및 백신 개발에 관한 방법 및 조성물.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위를 통해 명백해질 것이다.
도 1은 두 DNA 복사체 사이의 재조합을 도식적으로 나타낸 것이다. 좌측 패널은 단일 교차 이벤트를 도시하고, 우측 패널은 이중 교차 이벤트를 도시한다.
도 2A 내지 2H는 2001년 홍콩 유행병에서 분리한 인플루엔자 바이러스 유래의 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP 및 NS 유전자 각각에서의 다형태(polymorphism)의 위치를 도시한다.
도 3A 내지 3H는 2002-2003년 동안에 홍콩에서 분리한 인플루엔자 바이러스 유래의 PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, MP 및 NS 유전자 각각에서의 다형태의 위치를 도시한다.
도 4A 내지 4J는 바이러스 재조합의 예를 도시한다. 도 4A 내지 4D는 홍콩에 서 수득한 닭에서 유래한 2종의 분리물(31.2 및 31.4)에서의 다형태를 도시한다. 도 4E는 한국으로부터의 H9N2 분리물의 NA 유전자에서의 재조합을 도시한다. 도 4F는 한국 조류 분리물의 PA 유전자에서의 다형태를 도시한다. 도 4G는 인간 실험실 계통 WSN/33과 2004년의 한국 돼지 분리물 사이의 재조합을 암시하는, 한국 돼지로부터 분리한 PB2의 다형태를 도시한다. 도 4H는 2002년에 분리된 인간 HA 유전자의 재조합을 도시한다.
도 5는 보존된 18개의 뉴클레오티드 구역에 대한 에볼라 및 인플루엔자 균주 서열을 도시한다.
도 6A 내지 6C는 인플루엔자 균주 중 바이러스 재조합의 부가적 예를 도시한다.
도 7A 및 7B는 인플루엔자 균주 중 바이러스 재조합의 부가적 예를 도시한다.
도 8A 및 8B는 인플루엔자 균주 중 바이러스 재조합의 부가적 예를 도시한다.
본 명세서 및 청구범위의 분명한 이해를 돕기 위해, 하기 정의가 편리하게 제공된다.
정의
용어 "바이러스 친주"란, 한 집단에서 복제 선택 재조합 기전을 통해 그 집단 내 자손 바이러스 돌연변이주에 유전적 물질을 제공하는 둘, 또는 그 이상의 바이러스 균주를 의미한다. 바이러스 친주는 최근에(예를 들면, 1, 2, 3, 6, 12개월 또는 그 이상 내에) 분리된 바이러스 집단에 존재하는 둘 이상의 바이러스 균주이다. 한 측면으로는, 바이러스 친주는 한 집단 내에서 가장 우세한 서열이다. 또 다른 측면으로는, 바이러스 친주는 한 집단 내에서 가장 다양한 서열이다.
본원에서 사용된 용어 "자손 바이러스 돌연변이주"란, 바이러스 친주에서 유래한 자손 바이러스를 의미한다. 한 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주는 친주에 의해 제공된 유전적 물질을 사용하여 복제 선택 재조합 기전에 의해 생성된다. 한 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주는 하나 이상의 목적하는 기준, 예를 들면 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 서열, 병독성, 숙주 범위 또는 친화성(tropism)을 근거로, 한 바이러스 집단에서 분리된다.
유사하게, 용어 "박테리아 친주"란 한 집단에서 복제 선택 재조합 기전을 통해 그 집단 내 자손 박테리아 돌연변이주에 유전적 물질을 제공하는 둘, 또는 그 이상의 박테리아 균주를 의미한다. 박테리아 친주는 최근에(예를 들면, 1, 2, 3, 6, 12 개월 또는 그 이상 내에) 분리된 박테리아 집단에 존재하는 둘 이상의 박테리아 균주이다. 한 측면으로는, 박테리아 친주는 한 집단 내에서 가장 우세한 서열이다. 또 다른 측면으로는, 박테리아 친주는 한 집단 내에서 가장 다양한 서열이다.
마찬가지로, 본원에서 사용된 용어 "자손 박테리아 돌연변이주"는 박테리아 친주에서 유래한 자손 박테리아를 의미한다. 한 구체예에서는, 자손 박테리아 돌연변이주는 친주에 의해 제공된 유전적 물질을 사용하여 복제 선택 재조합 기전에 의해 생성된다. 한 구체예에서는, 자손 박테리아 돌연변이주는 하나 이상의 목적하는 기준, 예를 들면 뉴클레오티드 서열, 폴리펩티드 서열, 약물 내성, 병원성, 감염성 등을 근거로, 한 박테리아 집단에서 분리된다.
본원에서 사용된 용어 "복제 선택 재조합"이란, 자손 바이러스 또는 박테리아 균주가 둘 이상의 바이러스 친주에 의해 감염된 세포 또는 생물체에서 만들어지고, 자손의 유전적 물질은 친주의 유전적 물질의 혼합물인, 바이러스 또는 박테리아 재조합의 기전을 의미한다. 기전에 얽매이지 않으면서, 복제 선택 기전은, DNA 또는 RNA 조각의 복제 중에 한 모체로부터의 DNA 또는 RNA에서 출발하고 제 2의 친주로부터의 DNA 또는 RNA로 전환하는 DNA 또는 RNA 복제 수단에서 비롯된다. 이 과정은 1회 이상 일어날 수 있어서, 두 친주의 혼합물인 DNA 또는 RNA 서열을 갖는 자손 바이러스 또는 박테리아를 초래할 수 있다.
복제 선택 재조합에 의해 생성된 서열, 예를 들면 자손 서열은 전형적으로 주어진 길이의 핵산 내에서, 둘 이상의 핵산 가닥 사이에서, 예를 들면 둘 이상의 뉴클레오티드, 예를 들면 3-5, 5-10, 10-100, 100-1kb, 1kb-10kb, 10kb 이상, 또는 그것의 임의 범위 또는 간격 내에서 일어나는 재조합, 예를 들면 복제 선택 재조합에 의한, 모체 서열과 비교하여 하나 이상의 뉴클레오티드 변화를 포함하는 임의 수의 뉴클레오티드 변화, 예를 들면 2-5, 5-10, 10-20, 20-50, 50-100, 100-500, 500 이상의 변화를 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "전위(transition)/변위(transversion) 비"는 주어진 서열에서 변이, 예를 들어 퓨린을 퓨린으로 치환, 또는 피리미딘을 피리미딘으로 치환하는 것이 이루어지는 횟수 대 변위, 예를 들면 피리미딘을 퓨린으로 치환, 또는 퓨린을 피리미딘으로 치환하는 것이 이루어지는 횟수 사이의 비를 나타낸다. 무작위 과정이라면 비율이 0.5일 것으로 예상할 것이다. 그러나 복수의 데이터 집단을 보면, 비율이 종종 2 이상인 것으로 밝혀져서, 이 과정이 무작위가 아니라 변이가 변위에 비해 선호됨을 암시한다(실시예 참조).
본 발명은 적어도 부분적으로는, 새로운 돌연변이보다는 재조합이 바이러스 진화의 구동력이라는 놀라운 관찰 결과를 근거로 한다. 인플루엔자의 자손 균주가 다양한 인플루엔자 친주에서 일배체형으로서 효과적으로 유래한다는 본 관찰 결과는, 단일 세포 또는 생물체를 둘 이상의 상이한 바이러스 균주 (또는 상이한 유형의 바이러스, 예를 들면 인플루엔자와 HIV, 또는 상이한 박테리아 균주)로 이중 감염시키는 것이 바이러스 진화를 촉진할 수 있다는 것을 드러낸다. 본 발명은 따라서 그러한 현실적인 또는 제어된 혼합 실험의 결과를 예측하기 위한 규칙을 제공한다. 본 발명의 특정 측면에서는, 이러한 규칙이 한 집단 내 우세한 인플루엔자 균주의 유전적 구성에 대한 지식(경우에 따라 당시의 지식)을 근거로 하여, 최적의 백신 표적을 나타내는 자손 인플루엔자 균주를 예측하는데 적용될 수 있다.
부가적 측면에서는, 본 발명의 규칙은 박테리아의 둘 이상의 친주에서 유래한 자손 박테리아 균주의 게놈 조성 및/또는 표현형, 예를 들면 약물 내성의 예측을 가능하게 하는데 적용될 수 있다. 그러한 박테리아는, 예를 들면 후속의 약물 선별(screening) 단계에서 사용될 수 있다.
한 측면에서는, 본 발명은 바이러스 친주 및 자손 바이러스 돌연변이주를 포함하는 바이러스의 집단에서 바이러스 친주를 동정하는 방법으로서, 집단으로부터 분리된 일정 수의 바이러스 균주에서 유래한 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 균주 수가 집단에서 가장 우세한 바이러스 균주를 동정하기에 충분한 수이거나, 바이러스 균주가 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있는 것이거나, 두 가지 모두에 해당되는 것인 단계; 및 집단 내에서 가장 우세한 바이러스 균주, 또는 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있는 바이러스 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고, 여기에서 가장 우세한 바이러스 서열 또는 가장 큰 상위가 있는 바이러스 서열이 바이러스 친주인 것인 방법을 제공한다.
한 구체예에서는, 바이러스 친주가 집단 내에서 가장 우세한 2종의 서열이다. 또 다른 구체예에서는 친주가 가장 큰 서열 상위가 있는 2종의 균주이다.
한 구체예에서는, 본 발명의 방법에 사용되는 바이러스가 바이러스 친주 및 자손 바이러스 돌연변이주를 결정하기에 충분한 기간으로부터 수득된다. 예를 들면, 분리된 바이러스가 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기간은 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 6개월, 1년, 2년, 3년, 4년, 5년, 또는 그 이상일 수 있다. 한 예시적 구체예에서는, 본 발명의 방법에 사용되는 바이러스가 1회의 발병기, 예를 들면 1회의 인플루엔자 발생기로부터 수득된다.
또 다른 구체예에서는 본 발명의 방법이 한정된 지리학적 지역, 예를 들면 감염된 숙주가 적당한 상호작용의 기회가 있는 지역에서 수득된 바이러스를 사용한다. 예를 들면, 한정된 지리학적 지역은 동남아시아, 또는 미대륙이다.
한 관련 구체예에서는, 가장 우세한 바이러스 서열, 또는 가장 큰 서열 상위가 있는 바이러스 서열이 다수의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 정렬시킴으로써 결정된다. 또 다른 관련 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주가 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 형성된다.
서열 정렬은, 예를 들면 수학적 알고리즘을 사용하여 수행될 수 있다. 한 구체예에서는, 2개의 아미노산 서열 사이의 일치도 백분율이 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내 GAP 프로그램에 혼입된, Needleman과 Wunsch(J. Mol. Biol. 48:444-453(1970)) 알고리즘을 사용하여 결정되고, 이 때Blossom 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스를 사용하며, 갭 가중치가 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4이고 길이 가중치가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 또 다른 구체예에서는, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 일치도 백분율이 GCG 소프트웨어 패키지(http://www.gcg.com에서 입수가능함) 내 GAP 프로그램을 사용하여 결정되는데, 여기에서는 NWSgapdna.CMP 매트릭스를 사용하고, 갭 가중치가 40, 50, 60, 70, 또는 80이며, 길이 가중치가 1, 2, 3, 4, 5 또는 6이다. 또 다른 구체예에서는, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 일치도 백분율이 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된 E. Meyers 및 W. Miller의 알고리즘(CABIOS, 4:11-17(1989))을 사용하여 결정되는데, 여기에서는 PAM120 가중치 잔기 표를 사용하고, 갭 길이 벌점이 12이며, 갭 벌점이 4이다.
또한, 데이터베이스에 축적된 바이러스 서열을 자동적으로 비교하여 집단 내 서열 일치도를 결정하는 서열 정렬 프로그램을 기초로 한 알고리즘이 개발될 수 있다. 생체정보학적 접근법을 사용하여 시간 및 위치의 함수로서의 서열 다양성의 양을 모니터함으로써, 의료 전문가들에게 언제 개입, 즉 면역화의 노력이 증가되어야 할지를 알려줄 수 있다. 한 생체정보학적 접근법이, 예를 들면 날짜 또는 위치에 따라 수동으로 정렬 및/또는 분류하기 곤란한 큰 데이터베이스가 있는 바이러스 집단, 예를 들면 HIV 또는 인플루엔자에 대해 특별히 유용할 것이다. 생체정보학은, 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 각각, 예를 들면 동일하지 않은 뉴클레오티드 또는 아미노산의 개수 및/또는 위치에 따라 분류함으로써, 한 바이러스 집단 내 바이러스 친주를 결정하고/하거나, 바이러스 집단 내 돌연변이 바이러스 자손 바이러스를 결정하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서는, 생체정보학이 바이러스 서열의 데이터베이스를 평가하여 바이러스 유전자 서열 내 계보적으로 유의미한 서열 변형을 동정하는데 사용될 수 있다. 앞서 동정된 서열 다형성의 발생은 복제 선택 재조합을 암시한다. 기전에 얽매이지 않으면서, 한동안 관찰되지 않았던 바이러스 집단의 서열 다형성의 발생은 2종의 바이러스 사이에 복제 선택 재조합이 있었음을 나타내는 신호이다. 이러한 접근법은 당업자로 하여금 문제가 될 수 있는, 예를 들면 감염성이 높은 자손 바이러스 돌연변이주를 인-실리코(in silico) 방식으로 동정할 수 있게 할 것이다. 또한 주어진 지리학적 지역에서는 보통 발견되지 않은 공지된 서열 다형성의 존재에 대한 데이터베이스 내 바이러스 서열의 분석은 복제 선택 재조합이 발생했음을 나타낼 수 있다.
한 측면에서는, 본 발명의 방법이 자손 바이러스 돌연변이주에서 복수의 교차점(cross-over point)을 동정하기 위해 컴퓨터 기반 프로그램을 사용할 수 있다. 복제 선택 재조합에 의해 형성된 일부 유전자에는 많은 수의 교차점이 있기 때문에 (종종 유전자 하나 당 10 내지 100개의 교차점), 컴퓨터 알고리즘은 정확한 교차점의 위치를 결정하는데 유용한 도구가 될 것이다. 이러한 컴퓨터 알고리즘은, 자손 바이러스 돌연변이주를 발생시키는 바이러스 친주에서의 교차점 위치를 결정하기 위해 바이러스 서열의 거대한 데이터베이스를 비교할 수 있다. 이러한 위치의 정확한 맵핑(mapping)은 다양한 다형태의 분석과 조합되어, 당업자가 현재 사용되고 있는 혈청형(serotype) 분류보다는 유전자형(genotype)을 근거로 하여 바이러스를 분류할 수 있게 할 것이다.
한 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주가 재편성과 조합된 복제 선택 재조합 기전에 의해 생성될 수 있다. 또 다른 구체예에서는, 돌연변이 바이러스 자손 바이러스가 재편성의 부재 하에 복제 선택 재조합에 의해 생성된다.
또한, 시험관내 또는 생체내 기법을 사용하여, 집단 내 상이한 바이러스의 개별적 유전자들을 선택적으로 재조합하여 돌연변이 바이러스 자손 바이러스를 생성할 수 있다. 예를 들면, 한 바이러스 집단에서 수득된 일정 수의 유전자는, 예를 들면 서열 정렬을 사용하여 분석될 수 있다. 당업자는 집단에서 목적하는 서열을 갖는 유전자를 분리하고, 이 유전자를 사용하여 숙주 세포, 난(egg) 또는 동물을 감염시켜 목적하는 재조합체 세트를 생성시킬 수 있다. 이러한 상황에서는, 숙주를 감염시키는데 사용된 유전자가 복수의 상이한 바이러스(예를 들면, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 그 이상의 상이한 바이러스)에서 유래할 수 있다.
본 발명의 한 측면에서는, 본 발명의 방법이 대상을 감염시키는 임의의 바이러스에 대해 사용될 수 있다. 용어 "대상"이란 바이러스 감염될 수 있는 생물체를 포함한다. 대상의 예로는 포유류, 예를 들면 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트 및 비-인간 유전자 도입 동물, 또는 조류, 예를 들면 오리, 닭, 거위 및 고니가 포함된다. 특정 구체예에서는, 대상이 인간이다. 유사하게, 용어 "숙주"는 바이러스 균주, 복제 선택 재조합을 통해 재조합한 뉴클레오티드 서열 등을 품은 생물체, 예를 들면 포유류, 예를 들면 인간, 개, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 고양이, 마우스, 토끼, 랫트 또는 조류, 예를 들면 오리, 닭, 거위 및 고니, 및 비-인간 유전자 도입 동물을 포함한다.
한 구체예에서는, 바이러스가 RNA 바이러스이다. 한 구체예에서는, RNA 바이러스가 단일 가닥 RNA 바이러스이다. 한 구체예에서는, 단일 가닥 RNA 바이러스가 양성 극성 RNA 바이러스이다. 또 다른 구체예에서는 단일 가닥 RNA 바이러스가 음성 극성 RNA 바이러스이다. 한 관련 구체예에서는, RNA 바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스이다. 한 관련 구체예에서는, 이중 가닥 RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스이다. 또 다른 구체예에서는 이중 가닥 RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스이다.
또 다른 구체예에서는, 바이러스가 DNA 바이러스이다. 한 구체예에서는, DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 또 다른 구체예에서는, DNA 바이러스가 이중 가닥 DNA 바이러스이다.
한 구체예에서는, 바이러스가 인플루엔자 바이러스이다. 또 다른 구체예에서는, 바이러스가 코로나바이러스 바이러스, 예를 들면 SARS CoV이다.
한 구체예에서는, 단백질 또는 핵산 서열이 인플루엔자 바이러스에서 유래한 것이다.
한 구체예에서는, 인플루엔자 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 HA, NA, NP, PA, PB1, PB2, MP 및 NS, 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다.
한 구체예에서는, 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 분리된 바이러스 균주를 서열분석(sequencing)함으로써 수득된다. 또 다른 구체예에서는, 서열이 대상(예를 들면 인간 또는 동물) 또는 조직 샘플로부터 분리한 핵산 분자를 서열분석함으로써 수득된다. 또 다른 구체예에서는, 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 공개적으로 입수가능한 데이터베이스에서 수득된다. 특정 구체예에서는, 충분한 수가 5, 10, 20, 30, 40 50 또는 그 이상의 바이러스 서열이다.
한 구체예에서는, 하나 이상의 바이러스 유전자가 적어도 둘, 셋, 넷 또는 다섯 개 이상의 유전자이다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 바이러스 백신의 제조방법으로서, 숙주 동물, 숙주 동물 세포, 세포주, 난세포, 박테리아 세포, 또는 바이러스 복제를 지지하는 세포 추출물을 상술한 방법에 따라 동정된 바이러스 친주로써 감염시키는 단계; 및 숙주 동물 세포주, 난세포, 박테리아 세포, 또는 바이러스 복제를 지지하는 세포 추출물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바이러스 백신은, 예를 들면 생백신, 사멸백신, 약독화 백신 또는 단위 백신일 수 있다(예를 들면, 현장 바이러스학(Fields Virology)(1996), 제 3판, 리펜코트-레이븐 출판사(Lippencott-Raven Publishers), 필라델피아, pp.467-469 참조). 백신 제조의 다른 예는, 예를 들면 Meadors 등(1986) Vaccine: 179-184, Ploand 등(1990) J. Infect . Disease 878-882, Fenner 등, 동물 바이러스의 생물학(The Biology of Animal Viruses); 뉴욕, 아카데믹 프레스(Academic Press), 1974:543-586, Saban 등(1973) J. Biol . Stand. 115-118, 및 Lowrie 등 DNA 백신: 방법 및 프로토콜(DNA Vaccines: Methods and Protocols), 휴마나 프레스(Humana Press), 뉴저지, 1999에 있다.
약독화 전생물 백신(attenuated whole organism vaccine은 목적하는 바이러스의 비-병원성 형태를 사용한다. 비-병원성은 바이러스를 비정상적 조건 하에 증식시킴으로써 유도될 수 있다. 비정상적 배지에 의해 선택된 돌연변이들은 보통 숙주 내에서 증식하고 병원성이 될 능력이 한정된다. 약독화 백신의 장점은 약독화된 병원체가 질병을 옮기지 않고 감염을 모사한다는 것이다. 바이러스가 여전히 살아있으므로, 지속적인 항원 자극을 제공하여 기억 세포 생성에 충분한 시간을 준다. 또한 세포-매개 면역성이 보통 요망되는 바이러스의 경우, 약독화 병원체가 숙주 세포 내에서 복제 가능하다. 병독성을 야기하는 하나 이상의 유전자를 제거함으로써 이러한 단점을 피하기 위해 유전공학 기법이 사용되고 있다.
불활성화 전생물 백신(inactivated whole organism vaccine)은 사멸되고 숙주 내에서 더 이상 복제할 수 없는 바이러스를 사용한다. 바이러스는 표면 항원이 손상되지 않도록 하면서 열 또는 화학적 수단에 의해 불활성화된다. 불활성화 백신은 일반적으로 안전하나, 완전히 위험이 없는 것은 아니다. 죽은 생물체는 숙주 내에서 자신을 유지할 수 없고 면역체계에 의해 신속히 제거되므로, 지속적인 항원 노출을 생성하기 위해서는 보통 복수의 부스터가 필요하다.
바이러스에 의해 나타내어지는 하나 이상의 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 숙주 내에서 면역 반응을 이끌어내는 백신으로 제형화될 수 있다. 이러한 소위 "단위" 백신은 종종 전 바이러스 백신에 수반하는 안전성 문제를 감소시킨다.
한 관련 구체예에서는, 방법에 자손 바이러스 돌연변이주를 약독화시켜 약독화 바이러스 백신을 제조하는 단계가 추가 포함된다. 또 다른 구체예에서는, 방법에 자손 바이러스 돌연변이주를 사멸시켜 사멸 바이러스 백신을 제조하는 단계가 추가 포함된다. 또 다른 구체예에서는, 방법에 자손 바이러스 돌연변이주로부터 바이러스 항원, 또는 그것의 일부를 분리하여 아단위 바이러스 백신을 제조하는 단계가 추가 포함된다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 대상을 면역화시키기에 충분한 양의 약독화 바이러스 백신을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서는, 대상이 포유류, 예를 들면 인간이고, 또 다른 구체예에서는 대상이 조류이다.
한 구체예에서는, 대상(예를 들면, 인간 또는 동물)을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법에, 대상을 면역화시키기에 충분한 양의 사멸되거나 약독화된 바이러스 백신을 대상에 투여하는 단계가 포함된다. 또 다른 구체예에서는, 본 발명은 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 대상을 면역화시키기에 충분한 양의 아단위 바이러스 백신을 대상에 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서는, 친주가 인플루엔자 바이러스 균주이다. 또 다른 구체예에서는 친주가 코로나바이러스 바이러스 균주이다.
한 측면으로는, 본 발명은 대상(예를 들면 인간 또는 동물)을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 제1 바이러스 친주를 대표하는 제1 바이러스 및 제2 바이러스 친주를 대표하는 제2 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에 투여하는 단계를 포함하며, 제1 및 제2 바이러스 친주가 본원에 기술된 방법에 따라 동정되는 것인 방법을 제공한다.
한 구체예에서는, 바이러스 친주가 대상에 투여되기 전에 약독화된다. 또 다른 구체예에서는, 바이러스 친주가 대상에 투여되기 전에 사멸된다. 또 다른 구체예에서는, 방법에, 바이러스 친주로부터 바이러스 항원, 또는 그것의 일부를 분리하여, 대상에 투여하기 전에 아단위 바이러스 백신을 제조하는 단계가 포함된다.
한 구체예에서는, 바이러스 친주가 인플루엔자 바이러스 균주이다. 또 다른 구체예에서는, 바이러스 친주가 코로나바이러스 바이러스 균주이다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 본원에 기술된 방법에 따라 동정된 바이러스 친주, 또는 그것의 항원, 또는 항원의 일부를 포함하는 바이러스 백신 조성물을 제공한다.
한 구체예에서는, 바이러스 백신이 바이러스 친주, 또는 그것의 항원, 또는 항원의 일부에서 수득된 자손 바이러스 돌연변이주를 추가 포함한다. 또 다른 구체예에서는, 백신이 2종의 바이러스 균주, 또는 2종의 바이러스 균주의 항원, 또는 항원의 일부를 포함한다.
또 다른 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물이, 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 바이러스 균주의 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 제조된다. 한 구체예에서는, 2종의 바이러스 균주가 본원에 기술된 방법에 따라 동정된 바이러스 친주이다.
한 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주가 숙주 동물 내에서 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성된다. 또 다른 구체예에서는, 자손 바이러스 돌연변이주가 세포 배양액 내에서 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성된다.
한 구체예에서는, 바이러스 백신이 투여되어야 하는 대상이 집단 내 현존하는 바이러스 균주의 유전자형을 기초로 결정될 수 있다. 유사하게, 주어진 대상에게 투여되어야 할 백신의 종류는 집단 내 현존하는 바이러스 균주의 유전자형을 기초로 결정될 수 있다. 예를 들면, 현재 분리된 바이러스는 이들이 갖는 다형태의 수에 따라 분류될 수 있다. 한 구체예에서는, 다형태가 이전의 발병에서 유래한 분리물에서 동정된 것들이다. 바이러스 분리물의 집단 내 서열 다형태의 동정을 사용하여 노출 시간표(exposure timeline)를 작성할 수 있다. 이 시간표는 연령군의 바이러스 감염 용이성을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 1970년에 동정된 일정 수의 다형태를 갖는 새로운 분리물은 1970년 이전에 태어난 사람들에게는 별 문제가 되지 않을 수 있으나, 동일한 분리물은 1970년 이후에 태어난 대상에 있어서는 보다 심각한 감염을 일으킬 수 있다. 이러한 시간표를 근거로, 의료 전문가들은 어느 대상이 백신을 투여받아야 하는지, 또는 주어진 대상이 무슨 백신을 투여받아야 하는지를 결정할 수 있다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 바이러스 집단에 있어서 게놈의 안정성을 확인하는 방법으로서, 집단으로부터 분리된 충분한 수의 바이러스로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계; 분리된 바이러스 내 재조합 바이러스 서열의 수를 비교하는 단계를 포함하고; 여기에서 상이한 바이러스 서열의 수가 더 클수록 바이러스 게놈의 불안정성이 더 큰 것인 방법을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 바이러스 집단에 있어서 게놈의 안정성을 확인하는 방법으로서, 집단으로부터 분리된 충분한 수의 바이러스로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 비교하는 단계; 분리된 바이러스 내 친주 바이러스 서열 사이의 다양성을 비교하는 단계를 포함하고; 여기에서 상이한 바이러스 서열의 다양성이 더 클수록 바이러스 게놈의 불안정성이 더 큰 것인 방법을 제공한다.
유전자 안정성은 유전자 안정성에 대한 환경 또는 실험의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다. 이 측정은 능동적으로 또는 수동적으로 구해질 수 있다. 따라서, 동물은 면역화된 후, 2종의 친주로 공동 감염될 수 있으며, 자손을 모니터하여 발생하는 재조합의 양을 관찰할 수 있다. 이러한 접근법은 재조합체를 감소시키거나 제거할 수 있는 백신의 능력을 측정하는데 사용될 수 있다. 유사하게, 상이한 시점에서 자연적 집단을 분석함으로써 재조합에 대한 환경 효과를 측정할 수 있다. 유전자 안정성 (또는 불안정성)의 양은, 명백한 질병의 부재 하에서도 공격적인 개입이 필요한 시점을 동정하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 대상(예를 들면, 인간 또는 동물)을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 바이러스 균주의, 복제 선택 기전에 따라 재조합에 의해 제조된 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원, 또는 항원의 일부를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 대상(예를 들면, 인간 또는 동물)을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 한 바이러스 집단에서 바이러스 친주를 결정하는 단계; 바이러스 친주가 복제 선택 기전에 따라 재조합하게 하여 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계; 바이러스 친주, 또는 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 인플루엔자 친주 및 자손 인플루엔자 돌연변이주를 포함하는 인플루엔자 바이러스 집단에서 인플루엔자 친주를 동정하는 방법으로서, 집단으로부터 분리된 일정 수의 인플루엔자 균주로부터 하나 이상의 인플루엔자 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내에서 가장 우세한 인플루엔자 균주를 동정하기에 충분하거나, 인플루엔자 균주가 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있거나, 두 가지 모두 해당되는 단계; 및 집단 내에서 가장 우세한 인플루엔자 균주, 또는 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있는 인플루엔자 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고, 여기에서 가장 우세한 인플루엔자 서열, 또는 가장 큰 상위가 있는 인플루엔자 서열이 인플루엔자 친주인 것인 방법을 제공한다.
한 관련 구체예에서는, 본 발명은 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서, 숙주 동물을 동정된 인플루엔자 친주로 감염시키는 단계; 및 숙주 동물로부터 자손 인플루엔자 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
한 관련 구체예에서는, 본 발명은 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 제1 인플루엔자 친주를 대표하는 제1 인플루엔자 바이러스 및 제2 인플루엔자 친주를 대표하는 제2 인플루엔자 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하며, 제1 및 제2 인플루엔자 친주가 본원에 기술한 방법에 따라 동정되는 것인 방법을 제공한다.
한 측면으로는, 본 발명은 재조합 바이러스 균주의 라이브러리를 작성하는 방법으로서, 숙주 세포 또는 동물을 둘 이상의 바이러스 균주로 감염시키는 단계; 둘 이상의 바이러스 균주의 복제 선택 기전에 의한 바이러스의 재조합을 허용함으로써, 바이러스 균주의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서는, 재조합 바이러스 균주의 라이브러리가 백신 제조를 위해 분리될 수 있다.
한 관련 구체예에서는, 바이러스 균주가 상이한 종의 바이러스일 수 있다. 예를 들면, 제1 바이러스는 인플루엔자이고 제2 바이러스는 코로나 바이러스, 예를 들면 SARS일 수 있다. 한 관련 구체예에서는, 다른 종의 게놈에서 유래한 한 종의 게놈의 DNA 서열을 동정하는 것은, 이 DNA 단편이 바이러스에게 유리한 특성, 즉 증가된 감염성 또는 병독성을 부여함을 암시한다. 이러한 DNA 영역의 표적화는 효과적인 항-바이러스 요법을 제공할 것이다.
한 관련 구체예에서는, 바이러스 균주의 라이브러리가 항바이러스 화합물이 투여된 숙주 세포 또는 동물 내에서 생성될 수 있다. 한 관련 구체예에서는, 항바이러스 화합물의 존재 하에 생성된 바이러스 균주가 항바이러스 화합물로 처리된 대상의 집단 내에서 발생할 항바이러스제 내성 균주를 의미한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 인플루엔자 균주의 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성된 자손 인플루엔자 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 구체예에서는, 당해 분야에서 인식된 유전자 치료 방법, 예를 들면 RNAi가, 경우에 따라 한 균주 내에서 및/또는 다르게는 서열 특이적인 방식으로, 예를 들면 miRNA, siRNA, shRNA 또는 상기와 같은 기타 작용제의 사용을 통해 바이러스 균주를 표적화하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 코로나바이러스 친주 및 돌연변이 자손 코로나바이러스 균주를 포함하는 코로나바이러스 바이러스의 집단에서 코로나바이러스 친주를 동정하는 방법으로서, 집단에서 분리된 일정 수의 코로나바이러스로부터 하나 이상의 코로나바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내 가장 우세한 코로나바이러스 균주의 동정을 허용하기에 충분하거나, 코로나바이러스 균주가 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있거나, 또는 두 가지 모두 해당되는 단계; 및 집단 내에서 가장 우세한 코로나바이러스 균주, 집단 내에서 가장 큰 서열 상위가 있는 코로나바이러스 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고; 여기에서 가장 우세한 코로나바이러스 서열, 또는 가장 큰 상위가 있는 코로나바이러스 서열이 코로나바이러스 친주인 것인 방법을 제공한다.
한 관련 구체예에서는, 본 발명은 코로나바이러스 백신을 제조하는 방법으로서, 숙주 동물을 동정된 코로나바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및 숙주 동물로부터 자손 코로나바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 대상을 코로나바이러스 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서, 제1 코로나바이러스 친주를 대표하는 제1 코로나바이러스 바이러스 및 제2 코로나바이러스 친주를 대표하는 제2 코로나바이러스 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에 투여하는데, 제1 및 제2 코로나바이러스 친주가 본원에 기술한 방법에 따라 동정되는 것인 방법을 제공한다.
한 측면으로는, 본 발명은 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 코로나바이러스 균주의, 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성된 자손 코로나바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 바이러스 백신의 제조를 위해 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 방법으로서, 세포 또는 동물을 2종의 동일하지 않은 바이러스 균주로 감염시키는 단계; 복제 선택 기전에 따른 동일하지 않은 바이러스 균주의 재조합을 허용하는 단계; 이로써 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 구체예에서는, 방법에 숙주 세포 또는 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계가 추가 포함된다.
한 측면으로는, 본 발명은 백신의 효능을 결정하는 방법으로서, 바이러스 백신으로 처리된 집단으로부터 분리된 일정 수의 바이러스 균주로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득함에 있어, 그 수가 집단 내에서 일정 수의 자손 바이러스 돌연변이주를 허용하기에 충분한 것인 단계를 포함하고; 여기에서 상이한 자손 바이러스 돌연변이주 서열의 수가 적을수록 백신의 효능이 더 큰 것인 방법을 제공한다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 자손 바이러스 돌연변이주로부터 하나 이상의 유전자의 서열을 예측하는 방법으로서, 바이러스 친주로부터 하나 이상의 유전자의 서열을 수득하는 단계, 가능한 재조합 이벤트의 위치를 결정하는 단계, 이로써 자손 바이러스 돌연변이주로부터하나 이상의 유전자의 서열을 예측하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 관련 구체예에서는, 바이러스 균주가 인플루엔자 바이러스 균주, 코로나 바이러스 균주, 및 HIV 바이러스 균주로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 관련 구체예에서는, 방법에, 상기 바이러스에 대한 백신을 개발하기 위해 자손 바이러스 돌연변이주의 예측된 서열을 사용하는 단계가 추가 포함된다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 방법으로서, 세포 또는 동물을 2종의 동일하지 않은 바이러스 균주로 감염시키는 단계, 복제 선택 기전에 따른 동일하지 않은 바이러스 균주의 재조합을 허용하는 단계, 이로써 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 관련 구체예에서는, 방법에 상기 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계가 추가 포함된다.
한 관련 측면에서는, 본 발명은 돌연변이 자손 바이러스(들)을 생성시키는 방법으로서, 세포 또는 동물을 2종 이상의 동일하지 않은 바이러스(예를 들면, 에볼라 및 인플루엔자)로 감염시키는 단계, 복제 선택 재조합 기전에 따라 동일하지 않은 바이러스의 재조합을 허용하는 단계, 이로써 돌연변이 자손 바이러스(들)를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 관련 구체예에서는, 방법에 상기 돌연변이 바이러스(들)를 분리하고/하거나 이에 대해 백신(들)을 구축하는 단계가 추가 포함된다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 자손 박테리아 돌연변이주를 생성시키는 방법으로서, 세포 또는 동물을 2종 이상의 동일하지 않은 박테리아 균주로 감염시키는 단계, 복제 선택 재조합 기전에 따라 동일하지 않은 박테리아 균주의 재조합을 허용하는 단계, 이로써 자손 박테리아 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 관련 구체예에서는, 방법에 상기 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계가 추가 포함된다. 또 다른 구체예에서는, 방법에 돌연변이 자손 박테리아의 표현형(예를 들면, 약물 내성, 예를 들면 화합물 선별 분석을 통해 평가되는 것)을 평가하는 단계가 추가 포함된다.
한 관련 측면으로는, 복제 선택 재조합으로 인해 특정 식물, 예를 들면 아라비돕시스(Arabidopsis)에서 비-멘델성 유전이 일어난다. 따라서, 본 발명은 식물에서 복제 선택 재조합을 통해 비-멘델성 유전을 예측하고/하거나 수행하는 방법을 제공하는데, 단 2종 이상의 동일하지 않은 모체 식물이어야 한다.
한 관련 측면으로는, 본 발명은 2종 이상의 모체 바이러스, 박테리아 또는 식물로부터 복제 선택 재조합을 통해 가능한 돌연변이 자손의 범위를 평가함으로써, 돌연변이 자손 바이러스, 박테리아 또는 식물의 표현형(예를 들면, 병독성, 약물 내성 등)을 예측하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면으로는, 본 발명은 재조합 유전자의 집단을 생성시키는 방법으로서, 세포 내로 두 복제물 이상의 동일하지 않은 유전자를 도입하는 단계, 유전자의 재조합을 허용하는 단계, 이로써 재조합 유전자의 집단을 생성시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 한 관련 구체예에서는, 재조합이 복제 선택 기전을 통해 일어난다. 한 관련 구체예에서는, 방법에 재조합 유전자 집단의 1종 이상의 구성원을 분리하는 단계가 추가 포함된다. 한 구체예에서는, 유전자가 바이러스 유전자이다. 또 다른 구체예에서는, 유전자가 비-바이러스 종, 예를 들면 식물 또는 동물에서 유래한다.
실시예 전체를 통해, 달리 언급되지 않은 한 하기 물질 및 방법을 사용하였다.
물질 및 방법
일반적으로, 본 발명의 실시에는, 달리 표시되지 않은 한, 화학, 분자생물학, DNA 재조합 기술, 면역학(특히, 예를 들면 항체 기술), 및 전기영동에서의 표준 기법의 통상적인 기법들이 채택되었다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch 및 Maniatis, 분자 클로닝(Molecular Cloning): 콜드 스프링 하버 연구소 출판사(Cold Spring Harbor Laboratory Press)(1989); 항체 공학 프로토콜(분자생물학적 방법)(Antibody Engineering Protocols(Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., 휴마나 출판사(Humana Pr)(1996); 항체 공학: 실무적 접근법(Antibody Engineering: A Practical Approach)(실무적 접근법 시리즈, 169), McCafferty 편저, 얼 출판사(Irl Pr)(1996); 항체: 실험실 설명서(Antibodies: A Laboratory Manual), Harlow 등, C.S.H.L. 출판사(1999); 및 분자생물학의 현행 프로토콜(Current Protocols in Molecular Biology), Ausubel 등 편저, 존 와일리 앤드 선스(John Wiley & Sons)(1992) 참조.
실시예
1: 재조합을 통한 인플루엔자 A의 발생 및 진화
인플루엔자 A는 점 돌연변이를 통해 서서히 진화하고, 8개의 유전자 절편의 개편을 통해 갑작스럽게 진화하는 것으로 추정된다. 여기에서, 인플루엔자 A의 진화는 2종의 상이한 바이러스로 감염된 숙주 내에서의 재조합에 의해 추진되는 것으로 나타났다. 근친 관계에 있는 바이러스의 다형태 대부분은 이형태(bimorphism)이며, 단백질 수준에서는 작용하지 않는 세 번째 염기 코돈의 변화를 포함한다. 재조합은 초기 유전자의 버전 모두를 생성시키며, 양 바이러스 모두 생존가능하다. 재 조합은 기존의 다형태를 재분산시켜, 새로운 바이러스가 발생하기 전 이들의 유전자 조성을 예측할 수 있게 한다. 이러한 재조합 기전은 일반적이다. 이는 유행병인 H5N1 인플루엔자를 비롯하여 빠르게 진화하는 게놈의 대부분 또는 전부를 발생시킨다.
닥쳐오는 H5N1 독감 유행병은 상당한 관심을 끌었다(Peiris 등 2004; Fouchier 등 2005; Osterholm 2005). H5N1의 진화 및 발생 뒷면의 분자적 기전을 결정하기 위해, 최근 홍콩에서 수득한 분리물의 서열들을 비교하여, 동아시아 전체에 퍼지고 베트남, 태국 및 캄보디아에서 인간 사상자를 낸 유행병 균주의 진화에 대한 유전적 기반을 결정하였다.
인플루엔자는 절편화된 게놈을 가지며, 8개의 유전자의 재편성을 사용하여 H5N1 분리물을 분류해왔다(Guan 등 2002, Alexander 등 2003). 인플루엔자 유전자 조성의 변화는 부동(drifts)과 이동(shifts)으로 설명되어 왔다(Webster 등 1992). 부동은 교정 기능이 결핍된 RNA 중합효소에 의한 복제 착오로 인한 점진적인 변화로 특징지어져 왔다. 이동은 8개의 하위 게놈 RNA의 재편성으로 인한 유전자 조성에서의 좀 더 극적인 변화를 포함하는 것으로 생각된다.
H5N1 분리물의 변화 분석은 부동 및 이동이 모두 상동성 재조합에 의해 야기되며, 이는 상보성 게놈을 발생시킨다는 것을 나타내었다. 이중 감염은 재조합체를 초래하고, 이는 2종의 근친 관계에 있는 바이러스가 재조합할 때의 점 돌연변이와 유사하다. 보다 먼 친척관계의 바이러스 간에서는 동일한 기전이 훨씬 더 극적인 변화를 생성시킬 수 있고, 상보적인 2종의 생존가능한 게놈을 생성시킬 수 있다. 다형태의 대부분은 변이이며, 따라서 위치는 크게 이원적(binary)이고, RNA 변화의 대부분은 동일한 맥락(synonymous)이다. 따라서, 유전자 집단에서의 다형태는 크게 퓨린 또는 피리미딘으로 나타내어지는 이형태이다. 유전자 코드의 중복성은 대부분의 제3 염기 변이에 대해 동일한 맥락의 변화를 생성한다.
데이터베이스에서 많은 변화가 발견되므로, 다수의 변경은 생존가능한 자손을 생성시킬 것이지만, 변화는 체류 유전자 풀(pool)에 의해 크게 제한되며, 재조합체의 조성은 공동순환하는 유전자형의 다형태의 우세함과 관련이 있다. 새로 형성된 재조합체는 우세한 유전자 풀에 의해 예측될 수 있다.
이러한 상보적 다형태는 거의 모든 생물학적 시스템에서 사용된다. 이들은 빠르게 진화하는 바이러스에서 흔하나, 유사한 기전이 세포 수준에서 다형태의 보수를 추진한다. 또한, 비-상동성 재조합은 에볼라 및 유행병인 H1N1 및 H5N1 인플루엔자와 같은 유사한 병리학을 갖는 바이러스 게놈을 함께 연결하기 위해 사용된다.
유행병 H5N1의 진화는 2001년 H5N1 홍콩 분리물로 추적될 수 있다. 생물 시장(live market) 분리물로 재편성 유전자를 기반으로 한 5개의 군을 형성하였다(Guan 등 2002). 대표적 분리물은 마우스 뇌에서 분리한 향신경성 버전을 생성하였다(Alexander 등 2003). 홍콩의 분리물은 분리물의 20% 이상에서 존재하는 주요 다형태를 가졌다.
8 개 유전자 모두에 대한 다형태를 도 1에 나열하였다(도 1A 내지 1H). 각각의 유전자에 대해, 분리물을 대립유전자 1 및 대립유전자 2로 명명된 2개의 주요 유전자형으로 격리시켰다. 대립유전자 1은 그룹 A로 구성되었고, 일부 유전자에 대해서는 그룹 B로 구성되었다. 대립유전자 2는 전반적으로 그룹 C 내지 E였다. 이러한 군형성은 8개의 유전자 전체에 존재하였고, 다형태를 베트남 및 태국에서 발견된 유행병 균주의 발생과 관련해 코딩하였다. 2개의 대립유전자는 서로 상보적이며, 대부분의 위치에서 다형태는 제3 염기 위치에 퓨린 또는 피리미딘이 혼입되어 동일한 맥락의 변화를 생성하는 이형태였다.
이형태의 상보적 성질은 2개의 대립유전자가 상동성 재조합을 통해 생성되었음을 암시한다. 제3 염기 위치에서 퓨린 또는 피리미딘만을 사용함으로써 동일한 단백질의 두 가지 RNA 버전을 생성한다. 각각의 유전자에 대한 이형태의 개수는 이들 유전자 중 일부가 이미 재조합되어 유행병 균주에 고도로 상동성인 한 버전, 및 교체되는 퓨린 또는 피리미딘을 함유하는 또 다른 버전을 생성하였음을 암시하였다. 따라서, PB2, HA, NA, 및 NS에 대해서는, 다형태의 개수가 적고(11 내지 39), 유행병 균주와 일치하는 이형태는 2개의 대립유전자 사이에 고르게 나뉘어져 있었다. 반면, PB1은 이미 재조합되어 일치하는 이형태의 대부분을 대립유전자 1에 위치시켰고, 111개의 다형태가 존재하였다. 유사하게, PA 또한 재조합되어 일치하는 이형태의 대부분이 대립유전자 2에 있었고, 114개의 다형태가 있었다. M은 더 작은 유전자이고 유전적으로 다양하지 않아서, 29개의 다형태만이 있었고, 일치하는 유행병 유전자의 대부분은 대립유전자 2에 있었다. NP는 좀 달랐다. 고르게 나뉘어진 다형태가 63 개 있었으나, 어느 대립유전자에도 있지는 않지만 홍콩의 다른 분리물에는 신규한 NP 유전자로 정의되는 그룹 E에 이미 존재하는 부가적 다형태가 61 개 있었다.
도 1에 나타낸 유전자형 데이터 또한 더 제한된 재조합을 나타내었고, 이는 짝지어진 분리물에서 볼 수 있었다. PA에서는, 닭의 분리물인 YU822.2이 그룹 A에서 유래하였고 대립유전자 1과 일치하였다. 그러나 2개의 서열이 위치 933번과 1143번 사이에서 나뉘어져 있었다. 이 영역에는 18개의 다형태가 있었고, 두 위치만이 양 분리물 모두에서 동일하였다. 나뉘어진 16 개 위치에 대해서는, 마우스 뇌 분리물이 모든 16개의 위치에서 대립유전자 2와 일치하였다. 유사한 교차 이벤트가 PB1 유전자에서 관찰되었다. NT873.3은 그룹 E에 속했고, 대립유전자 2와 일치하였다. 그러나 2개의 서열이 위치 1374 번 및 1509 번 사이에서 나뉘어졌다. 10개의 이형태가 있었고, NT873.3은 10 위치 모두에서 대립유전자 1에 대한 공통 서열과 일치하여, 대립유전자 1의 짧은 영역이 대립유전자 2에서 검출되도록 한 또 다른 교차 이벤트가 있었음을 확인시켜준다.
도 2는 2002년과 2003년의 홍콩 분리물에서 관찰된 훨씬 더 방대한 재조합의 결과를 나타낸다(Strum-Ramirez 등 2004). 패널 1은 도 1과 동일한 이형태를 함유한다. 그러나 더 최근의 분리물은 대립유전자 1 및 2에서 유래한 다형태가 재조합되어, 유행병 균주와 고도로 상동성인 새로운 대립유전자를 생성하였다. 이 재조합은 8 개 유전자 모두에 존재하였다. 도 2는 또한 유행병 균주에는 존재하였으나 2001년의 홍콩 분리물에서는 없었던 이형태를 함유한다. 패널 A의 이형태에서 재조합된 게놈 또한 2001년의 홍콩에서는 존재하지 않았던 다형태의 대부분을 가졌다(패널 B). 따라서, 대립유전자 1 및 2의 이형태가 조합되었을 뿐만 아니라, 유전자 는 이제 홍콩 외부에서 습득된 것 같은, 없었던 이형태의 대부분을 함유하였다. 패널 C는 2002년 및 2003년 홍콩 분리물에서는 존재하지 않는 이형태를 나열한다. 이들 이형태는 보다 더 먼 친척관계에 있는 포유류 분리물(HLN 준비 중)에서 발견될 수 있다. 그러나 도 2는 도 1의 이형태가 재조합되고, 2001년 홍콩에서는 존재하지 않았던 이형태의 대부분이 부가되었음을 나타낸다.
도 3은 재조합의 부가적 예를 나타낸다. 첫 4개의 패널(도 3A 내지 3D)에서는, 복제 복합체에 대한 4개의 유전자의 다형태가 나열되어 있다. 이들 이형태는 홍콩의 동일한 닭에서 수득한 2개의 분리물, 31.2 및 31.4에 의해 한정된다. 다수의 다형태는 31.2와 31.4 사이의 상보적 관계로 인한 것이다. 31.2는 재조합되었고, 유행병 균주와 근친 관계에 있다. 반면, 상응하는 반대 퓨린 또는 피리미딘이 31.4 서열에서 발견된다. 이들 2개의 상보적 서열은, 첫 4개의 패널에서 나타나는 바와 같이 홍콩 생물 시장에서 발견된 부가적 재조합체의 모체로서 작용한다.
이형태의 개수는 4 개 유전자 각각에 대해 큰 수였고, 2개의 모체 유전자는 유행병 유전자와 상동성이거나 비-상동성이었다. PB1(도 3A)에 있어서는, 181개의 이형태가 존재하였다. 재조합체 37.4는 위치 1418번까지 31.2와 거의 동일하였다. 남아있는 서열의 나머지(위치 1890번까지)는 유행병 균주와 일치하였다. 패널에 포함된 것은 후지산 지방에서 수득한 H5N1 분리물인데, 이는 31.2 서열과 상동성이다. 후지산 서열은 완전하고, 31.2에는 부재하는 서열의 위치에서의 다형태를 정의하는데 사용되었다. 후지산 서열은 31.2에 상동성인 다수의 홍콩 외부의 서열 중 하나이다.
PB2(도 3B)에 있어서는, 부분적 서열만이 입수가능하였으나, 위치 1023번에서 시작하는 유전자의 3' 절반에서는 144개의 이형태가 존재하였다. 이 유전자에 대해서는, YU100이 재조합체이고, 이것은 1665번 위치까지는 유행병 유전자와 거의 동일하였고, 그 다음은 유전자의 나머지는 31.4와 일치하였다. 비교를 위해, 세계 곳곳에서 수득한 다른 혈청형(H7N7, H7N3, H9N1, H9N2)에서 수득한 상동성 유전자를 정렬하였고, 교체되는 퓨린 또는 피리미딘을 갖는 서열은 광범위하게 퍼져 있었고 홍콩에서 발견되는 신규한 유전자로 제한되는 것이 아님을 입증하였다.
PA(도 3C)에 있어서는, 191개의 이형태가 존재하였고, YU100 및 37.4 모두 이 유전자의 재조합체였다. YU100은 1449번 위치까지 31.4와 일치하였고, 그 다음은 31.2 서열로 전환하였다. 반면, YU100은 873번 위치까지는 31.2와 일치하였고, 그 다음은 31.4 서열로 전환하였다.
NP(도 3D)에 있어서는, 2개의 홍콩 친주 사이의 관계가 전환되었다. 31.2는 유행병 균주에 고도로 상동성이었고, 이 유행병 균주는 31.4와는 먼 친척관계에 있었다. 37.4는 NP의 재조합체였고, 789번 위치까지는 31.2와 이형태를 공통으로 가졌고, 그 다음은 유전자의 3' 절반에 대해 31.4와 일치하였다.
따라서, 도 3A 내지 3D는 닭 31에서 발견된 2개의 모체 서열을 비롯하여, 단일 교차점을 갖는 하나 또는 2개의 재조합체를 나타낸다. 닭 31의 2개의 모체 서열은 공통적이다. 유행병 버전은 아시아 전체에서 수득된 유전자형 Z 분리물에서 발견되었고(Guan 등, 2004), 반대의 퓨린 또는 피리미딘을 갖는 서열은 아시아 전체에서 수득된 H5N1 분리물뿐만 아니라 전 세계에서 수득된 다른 혈청형에서도 발견 되었다. 따라서, 재조합은 뉴클레오티드 수준에서는 상당히 상이하였지만 단백질 수준에서는 매우 상동성인 2개의 유전자를 생성하였다.
재조합은 내부 유전자에만 제한되지 않았다. NA의 재조합의 증거가 도 3E에 나타나있다. 이들 서열은 한국에서 수득된 H9N2 분리물에서 수득되었다. 유전자의 5' 절반에서, 2개의 돼지 서열(S452 및 S81)이 닭 서열(S1)과 서열을 공통으로 가졌고, 나머지 3개의 돼지 서열(S83, S109, S190)은 반대 이형태 서열을 형성하였다. 그러나 660번 위치에서는 이들 돼지 서열 중 두 개가 교체 서열로 전환하였다.
한국 조류 분리물(S16)은 PA의 재조합체였다. 처음 231 bp의 서열은 홍콩/광조우에서 수득된 2개의 H9N2 분리물과 거의 동일하였다. 2003년 조류 분리물과는 단 하나의 bp만이 차이가 났고, 1999년의 인간 H9N2 분리물과는 단 2 bp만이 차이가 났다. 이러한 상동성은 한국 조류 분리물과 홍콩 분리물 사이의 이중 감염을 암시한다. 이러한 회합은 S16의 M 유전자의 서열에 의해 증가되었다. 1998년의 H9N2 돼지 서열(10)과는 정확히 일치하거나, 1998년 제2 돼지 분리물(9)과는 단 하나의 bp만이 차이가 났다.
재조합은 인간 독감 유전자에서도 발견될 수 있었다. 2개의 한국 돼지 분리물은 인간 실험실 계통 WSN/33과 2004년 한국 돼지 분리물 사이의 PB2 재조합체를 나타내었다. 도 3G는 S109의 유전자은행(Genbank) 서열이 WSN/33과 5' 말단에서 일치함을 나타낸다. 이러한 일치는 유전자의 5' 말단까지 확장되었고(Sang Seo, 개인적 교신), 유사한 일치가 WSN/33과 S81 사이에서 발견되었다(Sang Seo, 개인적 교신).
인간/인간 재조합은 도 3H에 입증되어 있다. 2002년 한국 분리물에서의 HA의 5' 절반은 와이오밍 백신 서열에 의해 나타내어지는 현재의 H3N2 분리물과 일치하였다. 이들 한국 분리물은 1991년에 수득된 한국 분리물과 유전자의 3' 위치에서 일치하였다. 1991년 서울 서열과 근친 관계인 서열은 1980년 후반에 전세계적으로 동정되었으나 1991년부터 2002년까지의 유전자은행의 HA 서열에는 부재하며, 재조합체로서만 재발생하였다.
논의
인플루엔자 진화는 일련의 부동(drifts) 및 이동(shifts)으로 설명되어 왔다. 부동은 착오하기 쉬운 중합효소에 의해 생성되는 점 돌연변이에 의해 추진되는 반면, 이동은 8개의 하위 게놈 인플루엔자 RNA의 재편성과 관련있는 것으로 추정되었다. 그러나 본 발명은 부동 및 이동이 재조합에 의해 일어남을 보여주며, 바이러스 및 기타 유전자 시스템, 특히 인플루엔자에서 발견되는 유전자 다양성에 대한 기전을 제공하였다.
인플루엔자 서브타입 H5N1과 다른 서브타입 사이의 재편성이 앞서 관찰되었다. 홍콩 환자에서 수득된 1997년의 H5N1 분리물은 재편성체(reassortant)였다(Guan 등, 1999). 내부 유전자는 H9N2 및 H6N1 분리물에서 발견된 유전자와 근친 관계였다. 그러나 이러한 유전자 배열은 1997년에 홍콩에서 수집한 H5N1 이후로는 발견되지 않았다. H5N1은 2003년에 홍콩에서 인간에서 다시 분리되었으며 ,이들 분리물은 Z 유전자형으로 불리는 매우 상이한 배열을 가졌다(Guan 등 2004; Chen 등 2004). 그 해 후반에, 관련된 배열이 Z+로 명명되었고, 이 군은 2004년 초반까지 아시아 전역에서 발견되었다. 그러나 이들 분리물은 지역 특이적인 다형태를 가졌고, 베트남 및 태국의 환자에서 수득된 분리물은 그 두 나라에만 독특하거나 그 두 나라 사이에 독특하게 공유된 다형태를 함유하였다. 이러한 다형태는 다른 곳에서 기술될 것이나, 일반적으로 다형태는 다른 H5N1 분리물에서는 발견되지 않았으나, 혈청형은 포유류에서 흔하게 발견되었다. Z+ 유전자형 사이의 생물학적 차이는 다형태로 인한 것이며 재편성에 의한 것은 아니었다. 유사하게, 마우스 뇌에서 수득한 분리물과 모체 바이러스와의 차이는 다형태에 의한 것이며 재편성에 의한 것이 아니었다. 차이점 중 일부는 명백히 재조합의 짧은 스트레치(stretch)에 의해 생성되었다.
다른 다형태들은 점 돌연변이처럼 보였으나, 다형태는 최근의 돌연변이로 인한 것이 아니었다. 이들은 포유류 혈청형에서 발견될 수 있었다. 유사하게, H5N1 유행병 균주에서 발견된 다형태 중 다수는 이전에 돌았던 H5N1 분리물에서 발견될 수 있었다. 그러나, 본원에 나타난 바와 같이, 이들 다형태는 재조합을 통해 합쳐졌고, 종종 공동 순환하는 일배체형을 포함하였다. 이들 다형태는 대부분 이형태였고, 이들은 재조합을 통해 합쳐졌다. 이러한 과정은 제3 염기 코돈 위치에서 상이한 2종의 바이러스를 동시에 생성시켰다. 이러한 차이의 대부분은 변이였으므로, 대부분의 단백질 변화는 동일한 맥락이었다. 그 이유는 64개의 코돈 중 60개의 제3 염기 위치에서의 변이가 동일한 맥락의 변화를 생성하기 때문이다.
2001년 홍콩에서는 2종의 주요 근친관계 유전자형이 돌았다. 최근에 재조합되지 않은 유전자에서는 새로운 재조합된 이형태가 점 돌연변이처럼 보였다. 짝지 어진 샘플은 짧은 단편의 재조합을 입증하였다. 유전자의 일부는 이미 재조합되어, 유행병 균주와 일치하는 다수의 이형태를 갖는 하나의 일배체형, 및 일치하지 않는 다수의 이형태를 갖는 반대 버전을 초래하였다. 이들 2종의 유사하지 않은 일배체형 사이의 추가적 재조합은, 한쪽 모체로부터의 유전자의 한쪽 말단을 가지고 또 다른 모체로부터의 유전자의 다른 절반을 갖는 키메라인 새로운 유전자를 생성하였다.
한 기전에서는, 다수의 교차 이벤트가 한 숙주 내 이중 감염에서 일어나며; 또 다른 기전에서는, 복수의 교차 이벤트가 일련의 이중 감염을 통해 축적된다. 재조합체의 일부는 유전자 중심 근처의 단일 교차에 의해 생성된 반면, 다른 것들은 수백 bp의 짧은 영역을 포함하였다. 후속의 분리물에서 동정된 재편성 및 재조합의 횟수는 이중 감염을 통해 생성될 수 있었던 이론치에 비해 훨씬 적었다.
재조합은 H5N1 또는 조류 유전자에만 국한되지 않는다. 인간 유전자는 동일한 기전을 이용하여 진화하고, 한국 돼지 서열에서는 절반이 인간이고 절반이 조류인 유전자가 발견되었다. 위에서 언급한 실시예에서는, 재조합은 80년대 후반 및 90년대 초반에 널리 퍼졌던 바이러스로 이루어졌으나, 10년 동안은 유전자은행의 서열에서 사라졌었다. 따라서, 서열은 꽤 안정할 수 있으며, 나중에 집단 내에서 재출현할 수 있다. 이러한 데이터는 재조합의 부재 하에서 복제의 신뢰성이 과도하게 높음을 나타낸다. 이러한 서열 일치도의 보존은 고도로 진화하는 환경에서도 발견될 수 있다. 2003년의 한국 분리물에서는, 빠른 유전자 변화를 생성한 지역인 홍콩에서 수득된 분리물로 이루어진 이중 감염의 증거가 있었다. 그러나 1998년 홍콩 의 돼지 분리물에서 수득한 M 유전자의 정확한 복제물이 5년 뒤 한국 조류 분리물에서 발견될 수 있었다. 이러한 데이터는 중합효소가 착오를 일으키기 쉬운 것이 아니거나, 착오가 교정됨을 나타낸다. 조류 또는 인간 분리물에서 매년 보여지는 다양성은 최근의 돌연변이로 인한 것이 아니다. 대신, 변화는 응집된 이형태로서, 재조합을 통해 분산되는 것이다.
재조합을 통한 바이러스의 진화는 안정하다. 홍콩의 2001년 균주에서 나타나는 재조합은 2004년 유행병 균주에 여전히 존재한다. 홍콩 분리물은 재조합 과정에 대한 창구를 제공하였으나, 더 이른 시기의 재조합된 유전자를 갖는 분리물을 포함하여, 동일한 종류의 재조합이 다른 곳에서도 관찰되었다. 1930년대에 분리된 인간 H1N1 독감, 예컨대 WSN/33과, 역시 1930년대에 분리된 전형적인 돼지 H1N1을 비교하였는데, 1918 유행병 균주에서 상보적인 이형태가 발견됨이 동정되었다. 이러한 관계는 다른 곳에서 설명할 것이다.
이러한 데이터는 수가지 실제적인 용도를 가진다. 새로이 형성된 재조합체가 모체 유전자 사이에서 교차에 의해 생성되었으므로, 새로운 재조합체는 그 지역에서 우세한 게놈을 근거로 예측될 수 있다. 2종의 우성 유전자형 사이의 재조합체 정렬, 및 재조합체의 상보적 버전이 생성될 수 있다. 이형태를 사용하여 재조합체의 기원을 결정할 수 있고, 변화는 대부분 변이이므로, 이형태를 사용하여 상보적 버전의 서열을 예측할 수도 있다. 따라서, 한 버전은 상보적 버전의 서열을 예측한다. 이러한 규칙은 미래와 과거의 일배체형을 동정하는데 사용될 수 있으며, 이는 백신 개발에 응용될 수 있다.
본원에 기술된 규칙의 응용분야는 인플루엔자 진화를 넘어서 더욱 확장된다. 유전자은행의 바이러스 서열은 코돈의 제3 염기 위치에서의 높은 변이율을 나타낸다. 다른 바이러스들도 빠른 진화를 위한 이형태를 사용하며, 상보적 버전의 바이러스는 풍부하다. 이러한 상보적 관계는 SARS(Mara 등 2003; Rota 등 2003), NL63(va der Hoek 등 2004) 및 HKU-1(Woo 등 2005)을 포함하는 코로나바이러스에서 볼 수 있다. 이러한 관계는 다른 곳에서 설명할 것이다.
이러한 관계는 또한 다른 시스템에서도 발견될 수 있으며, 아라비돕시스 HTH 유전자에 대해 최근에 기술된 것과 같은 고등생물의 유전자 복구를 설명할 수 있다. 아라비돕시스 HTH 유전자에 대한 11개 다형태를 특성화하였는데(Lolle 등 2004), 11 개 모두 변이였다. 그러나 이러한 변이는 돌연변이원화(mutagenized)된 모주에서 선택되어서 제3 염기 변이가 아니었으며, 변화는 동일한 맥락이 아니었다(Krolikowski 등 2003). 그러나 인플루엔자처럼 변화는 주형 주도적이며 특이적이었다. 이들은 더 높은 빈도수로, 다양한 조건 하에 발견되었다(Lolle 등 2004). 따라서, 유전자의 이중 가닥 RNA 버전에서의 재조합으로써, 아라비돕시스의 F3 자손에서의 자가수태(self fertilization) 후에 관찰되는 비-멘델성 유전에 대해 설명할 수 있다.
바이러스 게놈에서의 고빈도 재조합은 이중 감염에 의해 주도된다. 그러나 이중 감염은 또한 관련없는 게놈을 포함하는, 보다 더 극적인 진화에서 역할을 할 수 있다. H5N1의 18 bp 영역인 HA는 에볼라 스파이크 유전자(HLN 준비 중)에서 발견될 수 있다. 이 특별한 영역은 양 게놈 모두에서 영역 특이적인 이형태를 함유한 다. 따라서, 베트남 및 태국에서 수득된 분리물은 초기의 H5N1 분리물에서는 발견되지 않는 특이적 이형성을 가진다. 또한, 제2 다형성은 1918 유행병 HA에서 발견되는 HA 서열을 생성한다. 따라서, 동일 부류의 바이러스에 의해 감염된 숙주에서 발견되는 상동성 재조합의 높은 빈도수 또한 상이한 부류의 바이러스로 확장되어, 에볼라, H5N1 또는 H1N1에 감염된 인간 또는 동물에서 발견되는 과잉 출혈과 같은 유사한 임상적 발현과 연관될 수 있는 서열을 공유하게 된다. 이러한 관계의 세부사항은 다른 곳에서 기술될 것이다.
재조합은 빠른 진화의 강력한 구동력이다. 인플루엔자에서는 재조합이 부동 및 이동 모두를 생성할 수 있으며, 빠른 진화적 변화에 대해 동일한 기전이 보편적으로 채택되어 왔다.
실시예
2: 상이한 바이러스 간의 복제 선택 재조합
복제 선택 재조합의 고유표시는 상이한 유형의 모체 바이러스의 돌연변이 자손에서 관찰될 수 있다. 도 5에서는, 18 뉴클레오티드 길이의 구역이 아프리카의 에볼라와 1918 독감 유행병 사이에서, H5 인플루엔자 균주의 중간체 돌연변이 자손 균주를 통해 연결되어 보존되어왔다. 따라서, 복제 선택 재조합은 선택적 압력과 조합되었을 때 상이한 모체 바이러스 사이에 서열 블록을 보존하도록 작용할 수 있다. 도 5에 나타낸 보존된 18 뉴클레오티드 블록은 마찬가지로 기능적 활성을 갖는 작은 RNA, 예를 들면 miRNA를 코딩한다. 상이한 바이러스에서 수득되는 서열의 유사한 재조합은 SARS, IBV와 아스트로바이러스(보존된 3' 줄기 루프 구조가 공유된다), 수족구 질병과 뉴캐슬 질병; 및 HIV와 코로나바이러스에서 발견되었다.
실시예
3: 박테리아에 적용되는 복제 선택 재조합
모체 박테리아 서열의 조합으로부터 발생할 것 같은 돌연변이 자손 박테리아의 서열의 조성을 예측할 수 있는 능력은 주어진 표현형(예를 들면, 약물 내성)을 보유할 수 있는 도연변이 자손 박테리아(들)의 예측 및 동정을 증대시키는데 사용될 수 있다. 2개의 모체 박테리아 서열은, 돌연변이 자손 박테리아(들)은 모니터된 특징을 나타낼 것이라는 예측을 증대시키는 본 발명의 규칙을 통해 시험관내, 생체내 또는 인-실리코(in silico)로 조합될 수 있다. 본 발명은 따라서, 예를 들면 약물 선별 접근법에 적용될 수 있다.
참조문헌
균등예
당업자는, 일상적 실험 이상의 것을 사용하지 않고도, 본원에 기술된 본 발명의 구체적 구체예에 대한 균등예의 다수를 인식하거나 확신할 수 있을 것이다. 그러한 균등예는 하기 청구범위에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
Claims (130)
- 바이러스 친주 및 자손 바이러스 돌연변이주를 포함하는 바이러스 집단에서 바이러스 친주를 동정하는 방법으로서,a) 집단으로부터 분리된 일정 수의 바이러스 균주로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내에서 우세한 바이러스 균주를 동정하기에 충분한 수이거나, 바이러스 균주가 집단 내 서열 상위(divergence)가 있는 것이거나, 두 가지 모두에 해당하는 것인 단계; 및b) 집단 내 우세한 바이러스 균주, 또는 집단 내 서열 상위가 있는 바이러스 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고 여기에서 우세한 바이러스 서열, 또는 서열 상위가 있는 바이러스 서열이 바이러스 친주로서 동정되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 우세한 바이러스 서열, 또는 서열 상위가 있는 바이러스 서열이 다수의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 정렬시킴으로써 결정되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주가 복제 선택 기전(copy-choice mechanism)에 따른 재조합에 의해 형성되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스 친주가 집단 내 가장 우세한 2종의 서열인 방법.
- 제1항에 있어서, 친주가 최대 서열 상위가 있는 2종의 균주인 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스가 RNA 바이러스인 방법.
- 제6항에 있어서, RNA 바이러스가 단일 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제7항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 양성 극성(positive-sense) RNA 바이러스인 방법.
- 제7항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 음성 극성(negative-sense) RNA 바이러스인 방법.
- 제6항에 있어서, RNA 바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제10항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제10항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제1항에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스인 방법.
- 제13항에 있어서, DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 제13항에 있어서, DNA 바이러스가 이중 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 제9항에 있어서, 바이러스가 인플루엔자 바이러스인 방법.
- 제9항에 있어서, 바이러스가 코로나바이러스 바이러스인 방법.
- 제1항에 있어서, 단백질 또는 핵산 서열이 인플루엔자 바이러스로부터 유래한 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 인플루엔자 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 HA, NA, NP, PA, PB1, PB2, MP, 및 NS 또는 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 분리된 바이러스 균주를 서열분석함으로써 수득되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 핵산 또는 폴리펩티드 서열이 공개적으로 입수가능한 데이터베이스로부터 수득되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 충분한 수가 5종 이상의 바이러스 서열인 방법.
- 제1항에 있어서, 충분한 수가 15종 이상의 바이러스 서열인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 유전자가 2종 이상의 유전자인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 유전자가 3종 이상의 바이러스 유전자인 방법.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 바이러스 유전자가 4종 이상의 바이러스 유전자인 방법.
- 숙주 동물을 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조 방법.
- 세포주를 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조 방법.
- 난(egg)을 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조 방법.
- 곤충 세포를 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조 방법.
- 박테리아 세포를 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조 방법.
- 바이러스 복제를 지원할 수 있는 세포 또는 세포 추출물을 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는 바이러스 백신의 제조 방법.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주를 약독화시켜 약독화 바이러스 백신을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주를 사멸시켜 사멸 바이러스 백신을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주로부터 바이러스 항원, 또는 그것의 일부를 분리하여 아단위(subunit) 바이러스 백신을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스가 RNA 바이러스인 방법.
- 제36항에 있어서, RNA 바이러스가 단일 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제37항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 양성 극성 RNA 바이러스인 방법.
- 제37항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 음성 극성 RNA 바이러스인 방법.
- 제36항에 있어서, RNA 바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제40항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제40항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제42항에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스인 방법.
- 제43항에 있어서, DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 제43항에 있어서, DNA 바이러스가 이중 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제43항에 따른 약독화 바이러스 백신을, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제44항의 사멸 바이러스 백신을, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제46항의 아단위 바이러스 백신을, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 제39항에 있어서, 친주가 인플루엔자 바이러스 균주인 방법.
- 제39항에 있어서, 친주가 코로나바이러스 바이러스 균주인 방법.
- 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제1 바이러스 친주를 대표하는 제1 바이러스 및 제2 바이러스 친주를 대표하는 제2 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,여기에서 제1 및 제2 바이러스 친주가 제1항의 방법에 따라 동정된 것인 방법.
- 제51항에 있어서, 바이러스가 RNA 바이러스인 방법.
- 제52항에 있어서, RNA 바이러스가 단일 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제53항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 양성 극성 RNA 바이러스인 방법.
- 제53항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 음성 극성 RNA 바이러스인 방법.
- 제52항에 있어서, RNA 바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제51항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제51항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 방법.
- 제51항에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스인 방법.
- 제59항에 있어서, DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 제59항에 있어서, DNA 바이러스가 이중 가닥 DNA 바이러스인 방법.
- 제51항에 있어서, 대상에게 투여하기 전에 바이러스 친주를 약독화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제51항에 있어서, 대상에게 투여하기 전에 바이러스 친주를 사멸시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제51항에 있어서, 대상에게 투여하기 전에, 바이러스 친주로부터 바이러스 항원, 또는 그것의 일부를 분리하여 아단위 바이러스 백신을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제51항에 있어서, 친주가 인플루엔자 바이러스 균주인 방법.
- 제51항에 있어서, 친주가 코로나바이러스 바이러스 균주인 방법.
- 제1항에 따라 동정된 바이러스 친주, 또는 그것의 항원, 또는 항원의 일부를 포함하는 바이러스 백신 조성물.
- 제67항에 있어서, 바이러스 친주, 또는 그것의 항원, 또는 항원의 일부에서 유도된 자손 바이러스 돌연변이주를 추가로 포함하는 바이러스 백신.
- 제67항에 있어서, 백신이 2종의 바이러스 균주, 또는 2종의 바이러스 균주의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 것인 바이러스 백신.
- 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 바이러스 균주의 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 제조된 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 2종의 바이러스 균주가 제1항의 방법에 따라 동정된 바이러스 친주인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주가 숙주 동물 또는 그것의 세포 내에서 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성되는 것인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주가 세포 배양액 또는 그것의 추출물 중에서 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성되는 것인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 바이러스가 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제69항에 있어서, RNA 바이러스가 단일 가닥 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 양성 극성 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 단일 가닥 RNA 바이러스가 음성 극성 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, RNA 바이러스가 이중 가닥 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제78항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 양성 가닥 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제78항에 있어서, 이중 가닥 RNA 바이러스가 음성 가닥 RNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제70항에 있어서, 바이러스가 DNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제81항에 있어서, DNA 바이러스가 단일 가닥 DNA 바이러스인 백신 조성물.
- 제81항에 있어서, DNA 바이러스가 이중 가닥 DNA 바이러스인 백신 조성물.
- 바이러스 집단 내 게놈의 안정성을 확인하는 방법으로서,집단으로부터 분리된 충분한 수의 바이러스로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계; 및분리된 바이러스에서 재조합 바이러스 서열의 수를 비교하는 단계를 포함하며 여기에서 상이한 바이러스 서열의 수가 클수록 바이러스 게놈의 불안정성이 커지는 것인 방법.
- 바이러스 집단 내 게놈의 안정성을 확인하는 방법으로서,집단으로부터 분리된 충분한 수의 바이러스로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계; 및분리된 바이러스에서 바이러스 서열의 다양성을 비교하는 단계를 포함하며 여기에서 다양성이 클수록 바이러스 게놈의 불안정성이 커지는 것인 방법.
- 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 바이러스 균주의 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 제조된 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
- 바이러스 집단에서 바이러스 친주를 결정하는 단계;바이러스 친주가 복제 선택 기전에 따라 재조합되게 하여 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계; 및바이러스 친주, 또는 자손 바이러스 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함하는, 대상을 바이러스에 대해 면역화시키는 방법.
- 인플루엔자 친주 및 인플루엔자 자손 돌연변이주를 포함하는 인플루엔자 바이러스 집단 내에서 인플루엔자 친주를 동정하는 방법으로서,a) 집단으로부터 분리된 일정 수의 인플루엔자 균주로부터 하나 이상의 인플루엔자 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수는 집단 내에서 우세한 인플루엔자 균주를 동정하기에 충분하거나, 인플루엔자 균주가 집단 내에서 서열 상위가 있거나, 또는 두 가지 모두 해당되는 단계; 및b) 집단 내에서 우세한 인플루엔자 균주, 또는 집단 내에서 서열 상위가 있는 인플루엔자 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고 여기에서 인플루엔자 서열, 또는 서열 상위가 있는 인플루엔자 서열이 인플루엔자 친주인 방법.
- 숙주 동물을 제88항에 따라 동정된 인플루엔자 친주로 감염시키는 단계; 및숙주 동물로부터 인플루엔자 자손 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 인플루엔자 백신의 제조 방법.
- 대상을 인플루엔자 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제1 인플루엔자 친주를 대표하는 제1 인플루엔자 바이러스 및 제2 인플루엔자 친주를 대표하는 제2 인플루엔자 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하고,여기에서 제1 및 제2 인플루엔자 친주가 제88항의 방법에 따라 동정되는 것인 방법.
- 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 인플루엔자 균주의 복제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성된 인플루엔자 자손 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물.
- 코로나바이러스 친주 및 코로나바이러스 자손 돌연변이주를 포함하는 코로나바이러스 바이러스 집단에서 코로나바이러스 친주를 동정하는 방법으로서,a) 집단으로부터 분리된 일정 수의 코로나바이러스 균주로부터 하나 이상의 코로나바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내에서 우세한 코로나바이러스 균주를 동정하기에 충분하거나, 코로나바이러스 균주가 집단 내에서 서열 상위가 있거나, 두 가지 모두 해당되는 단계; 및b) 집단 내에서 우세한 코로나바이러스 균주, 또는 집단 내에서 서열 상위가 있는 코로나바이러스 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고 여기에서 우세한 코로나바이러스 서열, 또는 서열 상위가 있는 코로나바이러스 서열이 코로나바이러스 친주인 방법.
- 숙주 동물 세포, 세포주, 난 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포, 또는 바이러스 복제를 지원할 수 있는 세포 추출물을 제92항에 따라 동정된 코로나바이러스 친주로 감염시키는 단계; 및세포 또는 세포 추출물로부터 코로나바이러스 자손 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 백신의 제조 방법.
- 대상을 코로나바이러스 바이러스에 대해 면역화시키는 방법으로서,제1 코로나바이러스 친주를 대표하는 제1 코로나바이러스 바이러스 및 제2 코로나바이러스 친주를 대표하는 제2 코로나바이러스 바이러스를, 대상을 면역화시키기에 충분한 양으로 대상에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기에서 제1 및 제2 코로나바이러스 친주가 제88항의 방법에 따라 동정되는 것인 방법.
- 게놈이 동일하지 않은 핵산 서열로 구성된 2종의 코로나바이러스 균주의 복 제 선택 기전에 따른 재조합에 의해 생성되는 코로나바이러스 자손 돌연변이주, 또는 그것의 항원 또는 항원의 일부를 포함하는 백신 조성물.
- 세포 또는 동물을 2종의 동일하지 않은 바이러스 균주로 감염시키는 단계;복제 선택 기전에 따라 동일하지 않은 바이러스 균주를 재조합시키는 단계; 및이로써 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조를 위해 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 방법.
- 제96항에 있어서, 숙주 세포 또는 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제96항에 있어서, 동일하지 않은 바이러스 균주가 상이한 바이러스에서 유래한 것인 방법.
- 제98항에 있어서, 상이한 바이러스로부터 수득한 동일하지 않은 바이러스 균주가 인플루엔자 및 에볼라로부터 유래한 것인 방법.
- 백신의 효능을 결정하는 방법으로서,바이러스 백신으로 처리된 집단으로부터 분리된 일정 수의 바이러스 균주로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내 자손 바이러스 돌연변이주의 수를 허용하기에 충분한 것인 단계를 포함하며 여기에서 상이한 자손 바이러스 돌연변이주 서열의 수가 적을수록 백신의 효능이 더 큰 것인 방법.
- 바이러스 집단에서 유전자 다양성을 모니터함으로써 바이러스 백신의 효능을 결정하는 방법으로서,바이러스 백신으로 처리하기 전 및 후에 집단으로부터 분리된 충분한 수의 바이러스로부터 하나 이상의 바이러스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계; 및처리 전에 분리된 바이러스의 자손 바이러스 돌연변이주의 수를, 처리 후에 분리된 자손 바이러스 돌연변이주의 수와 비교하는 단계를 포함하고 여기에서 서열의 유전자 다양성의 감소가 처리의 효능을 나타내는 것인 방법.
- 세포 또는 숙주 동물을 2종 이상의 바이러스 균주로 감염시키는 단계;바이러스 균주가 복제 선택 기전에 의해 재조합하도록 하는 단계; 및이로써 바이러스 균주의 라이브러리를 생성하는 단계를 포함하는, 바이러스 균주의 라이브러리 생성 방법.
- 제102항에 있어서, 세포 또는 숙주 동물로부터 바이러스 균주의 라이브러리를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 항바이러스제에 대한 내성이 있는 바이러스의 유전자형을 예측하는 방법으로서,항바이러스 화합물로 처리된 세포 또는 숙주 동물을 2종 이상의 바이러스 친주로 감염시키는 단계;상기 바이러스 균주가 복제 선택 기전에 의해 자손 바이러스 돌연변이주를 생성하게 하는 단계; 및세포 또는 숙주 동물로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 포함하고 여기에서 분리된 자손 바이러스 돌연변이주가, 항바이러스 화합물로 처리된 감염된 대상 집단에서 생성될, 항바이러스제에 대한 내성이 있는 바이러스 균주임을 나타내는 것인 방법.
- 바이러스 친주, 및 복제 선택 재조합 기전을 통해 바이러스 친주로부터 생성된 자손 바이러스 돌연변이주를 포함하는 바이러스 집단에서 바이러스 친주를 동정하는 방법으로서,a) 집단으로부터 분리된 일정 수의 바이러스 균주로부터 하나 이상의 바이러 스 유전자의 핵산 또는 폴리펩티드 서열을 수득하는 단계로서, 그 수가 집단 내 우세한 바이러스 균주의 동정을 허용하기에 충분한 수이거나, 바이러스 균주가 집단 내에서 서열 상위가 있는 것이거나, 두 가지 모두 해당되는 단계; 및b) 집단 내에서 우세한 바이러스 균주, 또는 집단 내에서 서열 상위가 있는 바이러스 균주, 또는 두 가지 모두를 동정하는 단계를 포함하고 여기에서 우세한 바이러스 서열, 또는 서열 상위가 있는 바이러스 서열이 바이러스 친주인 방법.
- 세포 또는 동물을 2종의 동일하지 않은 바이러스 균주로 감염시키는 단계;복제 선택 기전에 따라 동일하지 않은 바이러스 균주를 재조합시키는 단계;집단으로부터 자손 바이러스 돌연변이주를 선택하는 단계; 및이로써 바이러스 백신의 제조를 위해 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는, 바이러스 백신의 제조를 위해 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 방법.
- 제106항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주가 결정가능한 표현형 또는 유전자형을 근거로 분리되는 것인 방법.
- 제107항에 있어서, 상기 관찰 가능한 표현형이 재조합, 병독성 및 친화 성(tropism)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- 바이러스 친주로부터 하나 이상의 유전자의 서열을 수득하는 단계;가능한 재조합 사건의 위치를 결정하는 단계; 및이로써 자손 바이러스 돌연변이주에서 하나 이상의 유전자의 서열을 예측하는 단계를 포함하는, 자손 바이러스 돌연변이주에서 하나 이상의 유전자의 서열을 예측하는 방법.
- 제109항에 있어서, 바이러스 균주가 인플루엔자 바이러스 균주, 코로나바이러스 균주 및 HIV 바이러스 균주로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
- 제109항에 있어서, 자손 바이러스 돌연변이주의 예측된 서열을 사용하여 상기 바이러스에 대한 백신을 개발하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 세포 또는 동물을 2종의 동일하지 않은 바이러스 균주로 감염시키는 단계:복제 선택 기전에 따라 동일하지 않은 바이러스 균주의 재조합을 허용하는 단계; 및이로써 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 단계를 포함하는, 자손 바이러스 돌연변이주를 생성시키는 방법.
- 제112항에 있어서, 상기 자손 바이러스 돌연변이주를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 세포 내로 한 유전자의 둘 이상의 동일하지 않은 복제물을 도입하는 단계;유전자를 재조합시키는 단계; 및이로써 제조합체 유전자의 집단을 생성시키는 단계를 포함하는, 재조합체 유전자의 집단을 생성시키는 방법.
- 제114항에 있어서, 재조합이 복제 선택 기전을 통해 일어나는 것인 방법.
- 제114항에 있어서, 재조합체 유전자의 집단 중 하나 이상의 구성원을 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 한 유전자의 2개의 동일하지 않은 복제물을 세포 내로 도입하는 단계; 및유전자가 복제 선택 재조합을 통해 재조합되도록 하여, 수득된 재조합된 DNA 분자가, 유전자의 2개의 동일하지 않은 복제물 각각에서 유도된 DNA 서열의 일부를 갖도록 하는 단계를 포함하는, 재조합된 DNA 분자를 제조하는 방법.
- 제117항에 있어서, 상기 유전자가 식물 유전자인 방법.
- 제117항에 있어서, 유전자가 동물 유전자인 방법.
- 제117항에 있어서, 상기 유전자가 바이러스 유전자인 방법.
- 제117항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자가 이종 유전자 또는 그것의 단편인 방법.
- 일정 수의 재조합 자손 바이러스 균주에 대해 동물을 면역화시키는데 효과적인 바이러스 백신.
- 재조합 자손 바이러스 균주에 대해 효과적인 바이러스 백신.
- 상이한 혈청형을 갖는 바이러스 친주에서 유도된 재조합 자손 바이러스 균주에 대해 효과적인 바이러스 백신.
- 제124항에 있어서, 바이러스 친주 혈청형이 H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H5N1, H7N2, H7N3, H7N7, H9N2 및 H3N8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 바이러스 백신.
- 2종 이상의 바이러스 균주의 서열로부터 자손 바이러스 균주 서열을 예측하는 방법으로서,a) 2종 이상의 동일하지 않은 바이러스 균주 서열을 선택하는 단계; 및b) 복제 선택 재조합 기전을 통해 선택된 균주 서열로부터 생성된 자손 바이러스 균주 서열을 예측하는 단계를 포함하여, 자손 바이러스 균주 서열이 예측되도록 하는 방법.
- 제126항에 있어서, 하나 이상의 자손 바이러스 균주에 대한 백신을 만들어내는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제127항에 있어서, 백신을 대상에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 재조합된 DNA 분자의 서열을 예측하는 방법으로서,a) 유전자의 2개의 동일하지 않은 복제물을 선택하는 단계; 및b) 복제 선택 재조합 기전을 통해 선택된 유전자의 재조합을 모델링하는 단계를 포함하여, 재조합된 DNA 분자의 서열을 예측하도록 하는 방법.
- 2종 이상의 바이러스 균주의 서열로부터 재조합 자손 바이러스 균주 서열을 동정하는 방법으로서,a) 2종 이상의 바이러스 균주 서열을 선택하는 단계; 및b) 복제 선택 재조합을 통해 생성된 자손 바이러스 균주 서열을 동정하는 단계를 포함하여, 재조합 자손 바이러스 균주 서열을 동정하도록 하는 방법.
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