CN113817874A - 一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法，以LLC‑MK2细胞作为检测呼肠孤病毒3型的指示细胞，利用结晶紫染色并读取病毒空斑数目，根据空斑数目结合对应的稀释倍数计算呼肠孤病毒3型的滴度。本发明中的LLC‑MK2指示细胞与呼肠孤病毒3型有高度敏感性，能产生易于观察的病毒空斑，且病毒滴度与产生的空斑数目呈良好线性关系，稳定性、重现性好，灵敏度高，适用于病毒的清除/灭活验证研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法。
背景技术
近年来，重组蛋白、抗体等生物制品已成为生物医药产业中最重要的产品。现代生物制品常以动物细胞作为蛋白表达系统，以保证蛋白产品的生物活性。但细胞体系极易受到病毒的污染，因此各国药监机构要求这类制品在临床实验前和生产阶段前申报材料中纯化工艺必须经过病毒清除/灭活验证，以确保不会出现病毒污染，保证患者的用药安全。
呼肠孤病毒3型(mammalian orthoreovirus type-3,Reo-3)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)、正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)中的哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammalianorthoreovirus)，是一种非包膜RNA病毒。病毒颗粒呈圆球形，直径约为85nm。呼肠孤病毒3型对脂类溶剂具有抵抗力，并在较宽的pH范围内稳定，蛋白水解酶可能会通过切割病毒衣壳蛋白而增加呼肠孤病毒3型的感染能力。苯酚，福尔马林，95％乙醇和β-丙内酯均可灭活病毒。因呼肠孤病毒3型表现出较为广泛的理化耐受性特点，因此常被作为非特异性“模型”病毒进行病毒清除研究，用来评价生产工艺灭活/去除病毒的总体能力。
对于呼肠孤病毒3型的定量测定，通常有以下方法：1.通过提取检测样品的RNA，利用反转录荧光定量PCR(RT-qPCR)法通过检测呼肠孤病毒3型的特异性基因来定量测定病毒的含量。但由于该类方法主要是通过对病毒基因组中保守基因的扩增来测定病毒的含量，检测的是病毒的基因，其检测结果并不能反映病毒的感染活性。2.通过免疫学方法检测呼肠孤病毒：酶联免疫吸附实验(ELISA)，通过包被病毒抗原测定抗体效价来间接评价病毒感染水平或通过包被特异性抗体检测病毒的抗原表位，但是该方法更适用于血清学检测，不适用于病毒清除研究。
通过对中英文专利的检索，并没发现明确地应用空斑检测法测定Reo-3病毒滴度的专利。因此急需开发出一种有效的测定Reo-3病毒滴度的方法，使之适用于病毒的清除/灭活验证研究。
空斑计数法准确定量测定Reo-3病毒滴度，需满足以下要求：Reo-3应对指示细胞具有高度敏感性，能够引起明显的细胞病变效应，并且能够在指示细胞上产生易于观察的病毒空斑；在一定的病毒滴度范围内，病毒的滴度与产生的空斑数目应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同细胞批次、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
发明内容
现有技术中没有发现明确地应用空斑检测法测定呼肠孤病毒3型(mammalianorthoreovirus type-3,Reo-3)滴度的方法。因此，本发明期望建立一种有效的测定Reo-3滴度的方法，该方法中的指示细胞与Reo-3病毒有高度敏感性，能产生易于观察的病毒空斑，且病毒滴度与产生的空斑数目呈良好线性关系，稳定性、重现性好，灵敏度高，适用于病毒的清除/灭活验证研究。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法，包括如下步骤：
1)用不同稀释倍数的呼肠孤病毒3型病毒液感染LLC-MK2，获得接种细胞；
2)在细胞培养箱中孵育接种细胞；
3)孵育后弃去呼肠孤病毒3型病毒液，将接种细胞置于细胞培养箱中培养至出现空斑；
4)对接种细胞进行染色，显现出空斑，读取空斑数目；
5)根据空斑数目以及对应的稀释倍数计算呼肠孤病毒3型滴度。
具体的，步骤1)中，所述LLC-MK2接种于含细胞培养基的细胞培养六孔板中。
具体的，所述细胞培养六孔板中每个培养孔接种2.0×105～3.0×105个LLC-MK2。
具体的，步骤1)中，对呼肠孤病毒3型病毒液作10倍～108倍系列稀释。
具体的，所述细胞培养六孔板中每个培养孔中加入相同体积的呼肠孤病毒3型病毒液。
具体的，所述细胞培养六孔板中每个稀释度的呼肠孤病毒3型病毒液做3个复孔。
具体的，步骤2)中，将接种细胞立即转移入细胞培养箱中，进行孵育。
具体的，步骤3)中，在孵育后的接种细胞中加入细胞培养基-琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至细胞培养基-琼脂混合物完全凝固后将接种细胞置于细胞培养箱中培养8天。
具体的，步骤4)中，接种细胞染色前，加入适量甲醛，使甲醛充分覆盖细胞，并将细胞固定至少一小时。
具体的，固定完成后，去除接种细胞表面的琼脂混合物，用结晶紫染色液对接种细胞染色5分钟，然后洗净、晾干。
具体的，所述细胞培养基为DMEM完全培养基。
具体的，所述呼肠孤病毒3型的稀释液为HEPES缓冲液。
具体的，所述细胞培养基-琼脂混合物包括2×细胞培养基和1％低熔点琼脂糖。
本发明中使用了恒河猴肾脏上皮细胞(LLC-MK2)作为指示Reo-3的指示细胞，以下称为LLC-MK2细胞(该细胞系是商业化细胞系，可以从ATCC购买，货号为CCL-7.1TM，遗传背景清晰、细胞性状稳定、可连续传代)，用空斑测定法(plaque assay)准确定量测定Reo-3病毒的滴度，单位为PFU/mL(PFU定义为空斑形成单位)。Reo-3病毒感染LLC-MK2细胞，LLC-MK2细胞因病毒感染产生细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)后形成病毒空斑。理论上一个有感染性的病毒颗粒侵染一个宿主细胞，病毒建立感染后以辐射状感染四周细胞，造成该区域细胞死亡，形成一个病毒空斑即一个PFU，根据空斑数目以及相应的稀释倍数即可得计算出病毒的滴度。
本发明的有益效果包括：
1.指示细胞LLC-MK2被Reo-3病毒感染后用固体琼脂细胞培养基进行培养，感染后的LLC-MK2细胞，无论是显微镜下还是肉眼观察，均显示出明显的CPE(cytopathiceffect)，染色后呈特定的空斑形态。
2.通过控制变量，验证Reo-3感染LLC-MK2细胞的空斑测定的稳定性与可重复性，结果表明，在不同时间、不同细胞批次和不同操作人员的情况下，用该方法测定的Reo-3病毒滴度没有显著差异，绘制的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
3.本方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，符合相关法规要求，说明该方法能够应用于病毒清除验证中呼肠孤病毒3型滴度的测定。
4.本方法详细描述了以LLC-MK2细胞作为指示细胞，Reo-3病毒的空斑测定方法，为其他需要用于病毒清除/灭活验证研究的机构提供了良好的参考依据，同时也为其他疱疹病毒的病毒滴度测定提供可借鉴的实验方法。
附图说明
图1是本发明中分别在同一天的不同时间和隔天进行Reo-3的空斑测定的标准曲线的线性关系；
图2是本发明中Reo-3病毒感染3个批次LLC-MK2细胞的各批次的线性关系；
图3是本发明中对Reo-3感染3个批次LLC-MK2细胞的空斑测定进行汇总的标准曲线；
图4是本发明中不同实验操作者Operator1和Operator2的Reo-3空斑测定的标准曲线；
图5是本发明中LLC-MK2细胞空斑测定Reo-3病毒滴度共完成4个Run的标准曲线。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一：同一操作人员在不同时间进行Reo-3病毒感染LLC-MK2细胞实验的比较
将Reo-3病毒解冻后，经超声和过滤处理后用病毒稀释液对病毒进行系列稀释，根据实际情况做10倍系列稀释。
将LLC-MK2细胞接种于细胞培养六孔板中，每个细胞孔接种2.0×105个细胞，在37℃，5％CO2培养条件下进行细胞培养，第二天观察细胞，至细胞汇合度为90％-100％可进行后续操作。亦可调整接种细胞的数目，使细胞汇合度在90％左右。
对病毒进行连续10倍稀释至10-8稀释度，将制备好的不同稀释度的Reo-3病毒去感染LLC-MK2细胞：吸去细胞培养基，每个细胞孔中加入0.5mL病毒液，每个稀释度病毒液做3个复孔。将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，进行孵育。期间，每15至30分钟，轻轻晃动细胞板，使病毒液充分覆盖培养孔内所有细胞。同时，将细胞培养基和溶解的琼脂糖按比例混合均匀，放置在37℃水浴中待用。将孵育后的细胞培养六孔板取出，弃去病毒液，在每孔中加入2.0mL事先准备好的培养基-琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至覆盖在细胞表面的培养基-琼脂混合物完全凝固。凝固后将细胞培养板转移至细胞培养箱中，培养8天。
待细胞出现明显的空斑后，终止培养，在每孔细胞中加入适量多聚甲醛固定试剂，使其充分覆盖细胞培养孔。多聚甲醛能够从培养基-琼脂糖凝胶的表面往下渗透，将细胞板底部的细胞固定。固定细胞至少一小时，随后轻轻去除细胞表面的固体琼脂，在细胞中加入适量0.5％结晶紫溶液对细胞进行染色。染色5分钟后，弃去结晶紫溶液，用清水洗净细胞。在通风橱中晾干细胞培养六孔板，并在白光透射仪下观察空斑形态：指示细胞LLC-MK2被Reo-3病毒感染后用固体琼脂细胞培养基进行培养，感染后的LLC-MK2细胞无论是显微镜下还是肉眼观察均显示出明显的CPE(cytopathic effect)，结晶紫染色后呈特定的空斑形态。读取每孔的病毒空斑数目，计算病毒滴度。
同一位实验人员分别在同一天的不同时间和隔天进行Reo-3的空斑测定实验，每次实验做三组重复，每组做三个复孔，实验结果如图1所示。实验结果：三个时间点的Reo-3病毒感染LLC-MK细胞的标准曲线线性关系良好。
实施例二：Reo-3病毒感染3个不同批次LLC-MK2细胞的比较
同一批次Reo-3病毒感染3个不同批次的LLC-MK2细胞，每个批次细胞做三组重复，每组做三个复孔。空斑测定实验结果如图2和图3所示。由图2可知，3批次细胞之间没有显著差异，3条标准曲线的线性关系都很好，具有良好的重复性。图3中3组数据汇总后的标准曲线的线性关系好。
实施例三：不同实验操作者的比较
两位实验操作者Operator 1和Operator 2进行实验，每个操作者做三组重复，每组做三个复孔实验结果如图4所示。由图4可知，Operator 1和Operator 2无显著差别，2条标准曲线重复性好。
实施例四：Reo-3病毒滴度的统计分析
两位实验操作人员Operator 1和Operator 2参与实验。共进行四轮实验，Operator 1完成三轮实验，Operator 2完成一轮实验，对此四轮实验结果进行统计分析：绘制标准曲线、计算线性相关系数、确定病毒检测范围同时计算出精密度、检测限等相关数据。标准曲线和线性相关系数结果见图5，其他相关数据：
Linearity：Coefficient of Determination,R2线性拟合计算得到：0.9522；
Range：范围应在可计数的空斑数范围即在1PFU到TNTC(空斑数过多无法计数)之间；
Limit of Quantitation：c＝lnp/-v＝1.997PFU/mL；
注：p:probability,v:volume of sample，本实验中：p≤0.05，v＝1.5mL(每孔0.5mL，共三个复孔)；
Limit of Detection：所检测的最小数量为一个空斑即1PFU；
Precision：不同Run的log10 Titer的平均值、标准偏差以及95％置信度进行统计分析对其精密度进行研究，见下表：
表1批内精密度测试
表2批间精密度测试
以上结果表明以LLC-MK2细胞为指示细胞，用空斑测定实验测定Reo-3病毒滴度的方法，符合FDA,ICH和相关法规要求，能够用于病毒清除/灭活验证研究中。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (13)
1.一种利用空斑染色测定呼肠孤病毒3型滴度的方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)用不同稀释倍数的呼肠孤病毒3型病毒液感染LLC-MK2，获得接种细胞；
2)在细胞培养箱中孵育接种细胞；
3)孵育后弃去呼肠孤病毒3型病毒液，将接种细胞置于细胞培养箱中培养；
4)对培养后的接种细胞进行染色，显现出空斑，读取空斑数目；
5)根据空斑数目以及对应的稀释倍数计算呼肠孤病毒3型滴度。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述LLC-MK2接种于含细胞培养基的细胞培养六孔板中。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个培养孔接种2.0×105～3.0×105个LLC-MK2。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，对呼肠孤病毒3型病毒液作10倍～108倍系列稀释。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个培养孔中加入相同体积的呼肠孤病毒3型病毒液。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养六孔板中每个稀释度的呼肠孤病毒3型病毒液做3个复孔。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，将接种细胞立即转移入细胞培养箱中，进行孵育。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，在孵育后的接种细胞中加入细胞培养基-琼脂混合物，在室温下放置10至30分钟，直至细胞培养基-琼脂混合物完全凝固后将接种细胞置于细胞培养箱中培养8天。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，接种细胞染色前，加入适量甲醛，使甲醛充分覆盖细胞，并将细胞固定至少一小时。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，固定完成后，去除接种细胞表面的细胞培养基-琼脂混合物，用结晶紫染色液对接种细胞染色5分钟，然后洗净、晾干。
11.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述呼肠孤病毒3型病毒液的稀释液为HEPES缓冲液。
12.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基为DMEM完全培养基。
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基-琼脂混合物包括2×细胞培养基和1％低熔点琼脂糖。
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Patent Citations (3)
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| 窦丽丽 等: "呼肠孤病毒空斑检测方法建立", 中国人兽共患病学报, pages 1 * |
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