CN114107558A - 一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法，所述方法以SV40转化的人新生肾脏细胞即324K细胞作为检测鼠细小病毒即MVM病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对鼠细小病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度。本发明提供的测定方法采用组织半数感染发结合结晶紫染色法来判断细胞病变效应，能够简单直观的观察到细胞情况，有效降低实验人员镜下观察的主观性影响，同时不同的操作者在不同时间下使用本方法对MVM病毒进行测定时，实验结果不受影响，具有稳定性良好，可重复性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法。
背景技术
近年生物制药行业快速发展，新冠病毒的爆发愈发凸显生物技术行业的在民生安全保障中的重要性。预防性疫苗、细胞制品、血液制品等生物制剂的应用在预防及疾病治疗中发挥着重要作用，但由于这些生物制剂来源特殊复杂，特别是从人或动物器官、组织血液或其他生物体液中提取的生物制品，存在极大被病毒污染的风险，直接注射是此类制剂的给药方式，若被污染，将严重威胁患者的生命健康。
为保证生物制剂的安全性与有效性，病毒清除/灭活验证研究至关重要。根据美国药监局(FDA)、欧洲药监局(EMA)以及国际人用药品技术要求协调委员会(ICH Q5A)的指导原则，病毒清除/灭活是生物药品研发过程的必需过程。一般常通过添加指示病毒来评估纯化工艺各个步骤的清除/灭活病毒的能力，衡量病毒清除/灭活的效果。
鼠细小病毒(Minute Virus of Mice，MVM)是一种小型无包膜的单链DNA病毒，病毒颗粒直径18-22nm，属于细小病毒科细小病毒属，具有极好的稳定性，对理化试剂具有很高的抵抗性，不易被清除，常作为病毒清除工艺的指示病毒。可通过感染其敏感细胞产生的细胞病变来进行定量，如324K细胞。
常见的病毒滴度测定的方法有噬斑法和组织半数感染量终点滴定法(TCID50法)，这两种方法用于测量生物滴度，此外还有酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光定量PCR法以及其他光学法，用于测量病毒物理滴度，物理滴度测量的是病毒的总颗粒数或其总基因组数。荧光定量PCR法就是通过检测从病毒提取的总的核酸来定量病毒，该类方法能够快速且较准确地反映样品中总的病毒数，但不是所有的病毒颗粒均具有感染力，因此该方法不能反映病毒的感染活性，其测得的病毒滴度也显著高于感染性滴度法测得的结果。
噬斑法是病毒定量的经典方法，通过对病毒感染指示细胞产生的噬斑进行计数来定量具有感染活性的病毒数，该法在噬斑计数时，实验员的主观性强，不同实验员之间的计数存在差异。此外，由于MVM病毒感染324K细胞形成的噬斑边界不明显，且噬斑形态容易受细胞状态以及实验员操作的误差影响，容易影响检测结果。
酶联免疫法基于抗原抗体反应原理，通过酶催化的显色反应对病毒进行定量。过程中需要特异性抗体，检测成本高，操作复杂。
组织半数感染量终点滴定法是病毒滴度测定的经典方法之一，应用范围广，一般在接种病毒3-8天后，由操作人员在显微镜下观察细胞病变效应即CPE情况，判定各孔是否感染，这种结果的判断主要依据操作人员的工作经验，因此对检测结果的影响较大。针对此方法，减少主观因素的影响是方法改进的关键。染色法是一种简单且可直观观察细胞病变的方法，而可快速染色且对人体健康无害的染料选择甚为重要。MTT与中性红在相关实验中均有应用(JVirol Methods.2006Jul；135(1):56-65.)，但要么存在危害健康的物质，要么染色效果欠佳且耗时长，不是理想的染料选择。
结晶紫染料在噬斑实验中应用成熟，可快速染色，并且着色效果好。本发明期望利用组织半数感染法结合结晶紫染色法准确测定有感染活力的MVM病毒，适用于病毒清除/灭活研究的需要。
通过对中英文专利的检索，暂未发现明确地应用组织半数感染法测定MVM病毒滴度的专利。因此，急需开发出一种适用于病毒清除/灭活研究且行之有效的MVM病毒滴度测定的方法。
组织半数感染法作为病毒滴度测定方法需要优秀的细胞品系用于MVM病毒的测定，需要满足以下要求：
MVM在指示细胞上易感性强，能够引起明显的CPE，能够明显的区分病变细胞与正常细胞；在适当的病毒滴度范围内，病毒的滴度与稀释倍数应呈良好的线性关系；测定结果应具有稳定性，不同时间、不同的操作者均不会影响实验结果，可重复性要好，检测灵敏度要高；该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合相关法规要求。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法，所述方法以SV40转化的人新生肾脏细胞即324K细胞作为检测鼠细小病毒即MVM病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对鼠细小病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度，包括以下步骤：
1)将324K细胞接种于细胞培养96孔板中，所述细胞培养96孔板的每个培养孔内均添加有细胞培养基，324K细胞的汇合度为50-70％时，结束培养；
2)对MVM病毒进行稀释，将经稀释的多个不同稀释度的MVM病毒分别加入至含324K细胞的培养孔内，再将接种了MVM病毒的所述细胞培养96孔板转移入细胞培养箱中，培养6-7天；
3)324K细胞出现明显的细胞病变效应后终止培养，在每孔细胞中加入固定液对324K细胞进行固定，固定结束后除去固定液；
4)加入染色液对324K细胞进行染色，染色结束后，清洗并晾干细胞培养96孔板，读取每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Spearman-Kaerber法计算MVM病毒的滴度。
具体地，步骤1)中，所述细胞培养96孔板上的每个培养孔接种1.0×104个细胞。
具体地，所述对MVM病毒进行稀释是指对MVM病毒进行连续稀释，所述连续稀释的倍数为10倍、3.2倍、2.5倍中的一种。
具体地，所述细胞培养96孔板上的每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度下的MVM病毒液做8个复孔。
具体地，步骤1)中，所述细胞培养96孔板中的细胞在接种MVM病毒前的培养天数均不得超过2天，在步骤2)中，接种MVM病毒前需要用新鲜培养基对细胞培养96孔板中的细胞培养基进行替换。
具体地，所述细胞培养基和新鲜培养基均为1×MEM完全培养基。
具体地，步骤2)中，接种MVM病毒后进行培养时，采用封口膜封闭所述细胞培养96孔板。
具体地，步骤2)中，稀释MVM病毒采用的稀释液为使用HEPES作为缓冲液的EMEM培养基，所述HEPES的浓度为0.25mol/L。
具体地，步骤3)中，所述固定液为多聚甲醛固定试剂，所述固定是指在细胞培养96孔板的每个培养孔中均加入多聚甲醛固定试剂，使得多聚甲醛固定试剂覆盖细胞培养孔，固定的时间不少于15分钟。
具体地，步骤4)中，所述染色液为结晶紫溶液，所述结晶紫溶液的浓度为0.5％，染色时间为3分钟。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.指示细胞324K被MVM病毒感染后，324K细胞在显微镜下显示出明显的CPE，结晶紫染色后呈现显著区别于未感染细胞的染色形态，相对于显微镜观察，染色更有助于统一判断标准，减少人员主观因素带来的误差；
2.通过控制变量，验证MVM感染324K细胞的组织半数感染法测定的稳定性与可重复性，结果表明，在不同时间、不同操作人员的情况下，用该方法测定的MVM病毒滴度没有显著差异，绘制的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强；
3.本方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，符合相关法规要求，说明该方法能够应用于病毒清除/灭活验证研究中鼠细小病毒滴度的测定；
4.本方法详细描述了以324K细胞作为指示细胞，MVM病毒的组织半数感染法染色测定病毒滴度的方法，为其他需要用于病毒清除/灭活验证研究的机构提供了良好的参考依据，同时也为MVM其他亚型的病毒滴度测定提供可借鉴的实验方法。
附图说明
图1是本发明典型的MVM病毒组织半数感染法细胞图；
图2是本发明实施例二中324K细胞组织半数感染法测定MVM病毒滴度的线性关系；
图3是本发明实施例三中同一操作人员在不同时间下采用本方法测定MVM病毒滴度的线性关系；
图4本发明实施例四中不同操作人员采用本方法测定MVM病毒滴度的线性关系；
图中，每个Run中最后两组实验中MVM病毒的滴度低于检测线，因此未用于数据分析。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。以下实施例中所使用的材料、仪器和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中所使用的技术手段，如无特殊说明，均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例一 组织半数感染法染色测定MVM病毒滴度具体实施方法
首先，将MVM病毒解冻，经超声和过滤处理后，根据实际情况做10倍系列稀释，病毒稀释液选用添加HEPES作为缓冲液的EMEM培养基，其中HEPES的浓度为0.25mol/L；
其次，在细胞培养96孔板中加入1×MEM完全培养基，将324K细胞接种于细胞培养96孔板中，每个细胞孔内接种约1.0×104个细胞，在37℃，5％CO2培养条件下进行细胞培养，至第二天观察细胞，至细胞汇合度为50-70％可进行后续操作，接种324K细胞的数目可以在合理范围内调整，使细胞汇合度在两天内达到50-70％即可进行后续操作；
再次，使用制备好的不同稀释度的MVM病毒去感染324K细胞，吸去细胞培养基，加入50μL324K病毒液后,加入新鲜培养基200μL至每个细胞孔，新鲜培养基为1×MEM培养基，每个稀释度病毒液做8个复孔，将接种病毒的细胞板立即转移入细胞培养箱中，培养7天；
最后，待细胞出现明显的细胞病变效应后，终止培养，在每孔细胞中加入适量多聚甲醛固定试剂，使其充分覆盖细胞培养孔，多聚甲醛能够将细胞板底部的细胞固定，作用时间应不少于15分钟，随后轻轻去除固定液，在细胞中加入适量0.5％结晶紫溶液对细胞进行染色，染色3分钟后，弃去结晶紫溶液，用清水洗净细胞。
在通风橱中晾干细胞培养96孔板，并在白光透射仪下观察记录出现CPE的细胞孔，记录阳性比例后，计算病毒滴度。图1为本发明典型的MVM组织半数感染法实例图片。
实施例二MVM组织半数感染法的线性及范围
按照实施例一的操作流程，两个实验操作人员共进行了3个Run实验，每个Run进行6个样品的独立系列稀释，每个样品做3个重复，每个系列稀释包含8个不同的稀释因子，并计算各个稀释系列的病毒滴度，包括绘制标准曲线、计算线性相关系数和确定病毒检测范围，标准曲线和线性相关系数结果见图2。
由图2可知，在所测的病毒滴度范围内，3个Run独立的系列稀释的标准曲线具有良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例三 同一操作人员在不同时间进行MVM病毒感染324K细胞实验的比较
按照实施例一的操作流程，实验操作者Operator1分别在第一天和第二天进行MVM病毒的滴度测定实验Run1和Run3，每个Run包含6个样品的实验，每个样品做三个重复，样品系列稀释后，每个稀释度做8个复孔实验，结果如图3所示。
由图3可知，不同的两个时间点下，MVM病毒感染324K细胞，在不同的稀释因子下，均呈现出良好的线性关系，结果稳定性好，可重复性强。
实施例四 不同实验操作者的比较
按照实施例一的操作流程，两位实验操作者Operator 1和Operator 2同时分别独立进行实验，Run1和Run2，每个Run包含6个样品的实验，每个样品做三个重复，样品系列稀释后，每个稀释度做8个复孔实验，结果如图4所示。
由图4可知，Operator 1和Operator 2无显著差别，两个操作人员在不同的稀释因子下使用MVM病毒感染324K细胞，实验结果均呈现出良好的线性关系。
实施例五MVM病毒滴度的统计分析
按照实施例一的操作流程，两位实验操作人员Operator 1和Operator 2参与实验，共进行了18组独立的系列稀释实验，实验操作者Operator 1完成12组独立系列稀释实验，实验操作者Operator 2完成6组独立系列稀释实验，对此18组实验结果进行统计分析，具体包括：准确度、线性、测定范围、定量限、重复性和中间精密度等数据，结果如下表所示：
| 分析参数 | 统计参数，单位 | 数值 |
| 准确度 | ％ | 97％-104％ |
| 线性 | Coefficient of Determination，R2 | 0.9998 |
| 范围 | TCID50/mL | 11.2 |
| 定量限 | TCID50/mL | 7.5 |
| 重复性 | 95％置信区间(Log10 titer) | 0.11 |
| 中间精密度 | 95％置信区间(Log10 titer) | 0.18 |
以上结果表明，以324K细胞为指示细胞，用半数组织感染法结合结晶紫溶液染色测定MVM病毒滴度的方法，MVM病毒在指示细胞324K上易感性强，能够产生明显的细胞病变效应，能够明显地区分病变细胞与正常细胞，且在适当的病毒滴度范围内，MVM病毒的滴度与稀释倍数应呈良好的线性关系；此外，不同时间、不同的操作者均不会影响实验结果，表明该方法稳定性高，可重复性好，检测灵敏度高，且该方法的各种参数，包括：线性标准曲线、线性相关系数、测定范围、检测限、精密度、灵敏度等方面，都符合FDA，ICH和USP相关GLP法规要求，能够用于病毒清除/灭活验证研究中。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种组织半数感染法染色测定鼠细小病毒滴度的方法，其特征在于，所述方法以SV40转化的人新生肾脏细胞即324K细胞作为检测鼠细小病毒即MVM病毒的指示细胞，采用组织半数感染法对鼠细小病毒进行滴定，再结合结晶紫染色法判断细胞病变效应，最终计算得出病毒的滴度，包括以下步骤：
1)将324K细胞接种于细胞培养96孔板中，所述细胞培养96孔板的每个培养孔内均添加有细胞培养基，324K细胞的汇合度为50-70％时，结束培养；
2)对MVM病毒进行稀释，将经稀释的多个不同稀释度的MVM病毒分别加入至含324K细胞的培养孔内，再将接种了MVM病毒的所述细胞培养96孔板转移入细胞培养箱中，培养6-7天；
3)324K细胞出现明显的细胞病变效应后终止培养，在每孔细胞中加入固定液对324K细胞进行固定，固定结束后除去固定液；
4)加入染色液对324K细胞进行染色，染色结束后，清洗并晾干细胞培养96孔板，读取每个稀释度下出现细胞病变效应的细胞孔数，根据Spearman-Kaerber法计算MVM病毒的滴度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞培养96孔板上的每个培养孔接种1.0×104个细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述对MVM病毒进行稀释是指对MVM病毒进行连续稀释，所述连续稀释的倍数为10倍、3.2倍、2.5倍中的一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述细胞培养96孔板上的每个培养孔中加入相同体积的接种量，每个稀释度下的MVM病毒液做8个复孔。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述细胞培养96孔板中的细胞在接种MVM病毒前的培养天数均不得超过2天，在步骤2)中，接种MVM病毒前需要用新鲜培养基对细胞培养96孔板中的细胞培养基进行替换。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基和新鲜培养基均为1×MEM完全培养基。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，接种MVM病毒后进行培养时，采用封口膜封闭所述细胞培养96孔板。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，稀释MVM病毒采用的稀释液为使用HEPES作为缓冲液的EMEM培养基，所述HEPES的浓度为0.25mol/L。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述固定液为多聚甲醛固定试剂，所述固定是指在细胞培养96孔板的每个培养孔中均加入多聚甲醛固定试剂，使得多聚甲醛固定试剂覆盖细胞培养孔，固定的时间不少于15分钟。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述染色液为结晶紫溶液，所述结晶紫溶液的浓度为0.5％，染色时间为3分钟。
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| JAMES D MACY等: "Detection and control of mouse parvovirus", JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR LABORATORY ANIMAL SCIENCE * |
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