JP2003055259A

JP2003055259A - ウイルス増殖阻害剤

Info

Publication number: JP2003055259A
Application number: JP2001249679A
Authority: JP
Inventors: Yoshiyuki Yoshinaka; 由之吉仲
Original assignee: Japan Science and Technology Corp
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2001-08-20
Filing date: 2001-08-20
Publication date: 2003-02-26

Abstract

(57)【要約】【課題】汎用性のあるウイルス増殖阻害剤や、該ウイ
ルス増殖阻害剤を有効成分とするウイルス感染症の予防
・治療剤を提供すること。【解決手段】スーパーオキシドディスムターゼ様活性
を有する非ペプチド系化合物、例えば、ポルフィリン系
化合物（Ｍｎ(III)テトラキス−４−ベンゾイックアシ
ッド−ポルフィリンクロライド、Ｍｎ(III)テトラキス
−１−メチル−４ピリドール−ポルフィリンテトラクロ
ライド、ヘム等）又はサレン系化合物（ＥＵＫ−８）の
１種若しくは２種以上を有効成分として含有させ、ウイ
ルス増殖阻害剤を調製する。また、かかるウイルス増殖
阻害剤を用いて、ウイルス感染症の予防・治療剤を調製
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、スーパーオキシド
ディスムターゼ様活性を有するポルフィリン系化合物や
サレン系化合物等のスーパーオキシドディスムターゼ様
活性を有する非ペプチド系化合物からなるウイルス増殖
阻害剤や、該ウイルス増殖阻害剤を有効成分とするウイ
ルス感染症の予防・治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】ウイルス感染症の予防・治療は個体のも
つ特異的な免疫反応を利用したワクチンの開発が主流で
あった。近年、ウイルス感染症に対する治療薬の開発が
進められ、特に抗ヘルペス剤としてチミジンキナーゼ阻
害剤、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）剤として逆転
写酵素阻害剤やプロテアーゼ阻害剤、抗インフルエンザ
ウイルス剤としてノイラミニダーゼ阻害剤等の画期的な
薬剤が開発されている。これら薬剤は、ウイルスがもつ
固有の酵素を標的とし、宿主細胞のもつ酵素と選択的な
差別化を行い、成功したものである。上記の成功例に反
して、多くのウイルスでは、ウイルスに特徴的な酵素活
性の検出に困難を伴い、効果的な薬剤の開発に至ってい
ない。また、上記のウイルス感染症に対する治療薬に関
しても、薬剤耐性株の出現やウイルス株の違いによる無
効性が問題となっており、新しい薬剤の開発が必要とさ
れている。

【０００３】一方、個体のもつ非特異的な免疫反応を活
性化し、抗ウイルス作用を誘導する試みは古くから検討
されているが、インターフェロン以外の効果的な治療薬
は未だ開発されていない。その他数多くのサイトカイン
による抗ウイルス作用の検討も進められているが、実用
化には至っていない。

【０００４】また、細胞は、種々の外的刺激に対する防
御機構（ストレス応答）を兼ね備えいることから、ウイ
ルス感染に対する宿主細胞のストレス応答の研究が、様
々な角度から進められてきた。ウイルス遺伝子により宿
主細胞の修飾が誘導されるため、ウイルス／宿主の相互
作用は、未だ不明な点が多い（R. I. Morimotoら, in"s
tress Protein in Biology and Medicine R. I. Morimo
toら編, Cold springHarbor Lab. Press. N.Y. p1" (19
90)）。近年、ウイルス感染により宿主細胞に酸化スト
レスが誘導されるといった報告が相次いでなされており
（Popik, W. ら, Virology 252: 210, 1998、Shapiro,
I. ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 7422, 1998、
Zachos, G. ら, J. Biol. Chem. 274: 5097, 1999）、
細胞レベルにおけるウイルス感染防御機構の解明と、予
防・治療への応用が期待されている。最近、アポトーシ
スを抑制するＢＣＬ−２タンパク質が、ウイルス増殖を
制御する細胞性因子として注目されている(Griffin, D.
E.ら, Ann. Rev. Microbiol. 51: 565, 1997)。また、
Ｎ−アセチルシステインが、抗ＨＩＶ剤として、ＨＩＶ
感染者で誘導される酸化ストレス反応を抑制する目的
で、試みられている例もあるが効果的ではない（Mihm,
S. ら, AIDS 5: 497, 1991）。

【０００５】上記の観点に基づき、シンドビスウイルス
(ＳＶ）感染に対する宿主細胞の防御因子の一つとし
て、マンガン・スーパーオキサイドディスムターゼ(Ｍ
ｎ−ＳＯＤ)が本発明者らにより見い出された。すなわ
ち、Ｍｎ−ＳＯＤが高発現している細胞ではＳＶ増殖が
抑制され、さらに、Ｍｎ−ＳＯＤ遺伝子を導入してＭｎ
−ＳＯＤを高発現させるとＳＶ増殖が同様に抑制される
という結果が得られた（Yoshinaka, Y. ら, Biochem. B
iophys. Res. Commun. 261: 139, 1999）。また、Ｍｎ
−ＳＯＤ高発現細胞では、日本脳炎ウイルス(ＪＥＶ)や
インフルエンザウイルス(Ｆｌｕ)においても増殖抑制が
みられる。これらの結果は、ウイルス感染が宿主細胞の
防御機構（抗酸化因子）によって抑制されることを示し
ている。ウイルス感染で宿主細胞に酸化ストレス反応が
誘導されること、Ｍｎ−ＳＯＤなどの抗酸化因子が抗ウ
イルス作用を示すことなどについては、十分な解析が行
われていなかった。また、このような抗酸化因子の誘
導、あるいは同等の生物活性をもつ合成化合物を添加・
処理することにより、細胞レベルで抗ウイルス作用を検
討した例は、ほとんど報告されていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、汎用
性のあるウイルス増殖阻害剤や、該ウイルス増殖阻害剤
を有効成分とするウイルス感染症の予防・治療剤を提供
することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記目的を
達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ウイルス感染は宿主
細胞にとっては外来異物であることから、大小の差はあ
っても酸化ストレスが誘導され、細胞内抗酸化因子（Ｂ
ｃｌ２，Ｍｎ−ＳＯＤ等）が抗ウイルス作用を示すとい
う知見に基づき、特定の抗酸化作用をもつ化合物が抗ウ
イルス阻害剤として有効であるとの仮説を立て、Ｍｎ−
ＳＯＤ活性を有する非ペプチド系化合物であるＭｎ(II
I)テトラキス−４−ベンゾイックアシッド−ポルフィリ
ンクロライド（ＭｎＴＢＡＰ）（Park, J. R.ら, J. Ce
ll Biochem. 60: 12, 1996）がウイルス増殖阻害作用を
有することを確認し、本発明を完成するに至った。

【０００８】すなわち本発明は、スーパーオキシドディ
スムターゼ様活性を有する非ペプチド系化合物の１種若
しくは２種以上を有効成分として含有することを特徴と
するウイルス増殖阻害剤（請求項１）や、スーパーオキ
シドディスムターゼ様活性を有する非ペプチド系化合物
が、スーパーオキシドディスムターゼ様活性を有するポ
ルフィリン系化合物又はサレン系化合物であることを特
徴とする請求項１記載のウイルス増殖阻害剤（請求項
２）や、スーパーオキシドディスムターゼ様活性を有す
るポルフィリン系化合物が、Ｍｎ(III)テトラキス−４
−ベンゾイックアシッド−ポルフィリンクロライド、Ｍ
ｎ(III)テトラキス−１−メチル−４ピリドール−ポル
フィリンテトラクロライド又はヘムであることを特徴と
する請求項２記載のウイルス増殖阻害剤（請求項３）
や、スーパーオキシドディスムターゼ様活性を有するサ
レン系化合物が、ＥＵＫ−８であることを特徴とする請
求項２記載のウイルス増殖阻害剤（請求項４）に関す
る。

【０００９】また本発明は、請求項１〜４のいずれか記
載のウイルス増殖阻害剤を含有することを特徴とするウ
イルス感染症の予防・治療剤（請求項５）や、請求項１
〜４のいずれか記載のウイルス増殖阻害剤を含有するこ
とを特徴とするウイルス感染症の予防・治療用食品素材
又は食品（請求項６）に関する。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明のウイルス増殖阻害剤とし
ては、スーパーオキシドディスムターゼ様活性を有する
非ペプチド系化合物、例えば、スーパーオキシドディス
ムターゼ様活性を有するポルフィリン系化合物又はサレ
ン系化合物の１種若しくは２種以上を有効成分として含
有するものであればどのようなものでもよく、上記スー
パーオキシドディスムターゼ様活性とは、スーパーオキ
シドディスムターゼ（ＥＣ１．１５．１．１．）が有す
ると同様な活性、すなわちスーパーオキシドアニオンラ
ジカルの不均化反応を触媒する活性をいう。また、ポル
フィリン系化合物とは、ポルフィンやポルフィン錯体を
母核とする誘導体をいい、スーパーオキシドディスムタ
ーゼ様活性を有するポルフィリン系化合物としては、Ｃ
ｕ、Ｆｅ、Ｍｎ、Ｃｏ、Ｃｒ、Ｔｉ及びＶから選択され
た遷移金属、好ましくはＭｎを含むポルフィリン錯体を
挙げることができ、ＭｎＴＢＡＰ、Ｍｎ(III)テトラキ
ス−１−メチル−４ピリドール−ポルフィリンテトラク
ロライド、Ｍｎ(III)テトラキス−フェニル−ポルフィ
リンクロライド、Ｍｎ(III)テトラキス−ｐ−メトキシ
フェニル−ポルフィリンクロライド、ヘム、クロム(II
I)テトラフェニルポルフィリンクロライド等を具体的に
例示することができる。また、サレン系化合物とは、
Ｎ，Ｎ'−ビスサリシリデン−ジアミンやその金属錯体
を母核とする誘導体をいい、スーパーオキシドディスム
ターゼ様活性を有するサレン系化合物としては、ＥＵＫ
−８、ＥＵＫ−１３４、ＥＵＫ−１８９、（Ｓ，Ｓ）−
Ｎ，Ｎ'−ビス（３−クロロ−５Ｒ−サリシリデン）−
ジアミノマンガン等のマンガンサレン錯体を具体的に例
示することができる。

【００１１】上記のスーパーオキシドディスムターゼ様
活性を有するポルフィリン系化合物又はサレン系化合物
は、市販品を購入することにより、あるいは公知の方法
で合成することにより、容易に入手できるものである。
また、スーパーオキシドディスムターゼ様活性を有する
ポルフィリン系化合物又はサレン系化合物の中でも、水
溶性でメンブレン指向性を有し、細胞毒性が低いものが
好ましく、かかる観点からして、特にＭｎＴＢＡＰが好
ましい。ＭｎＴＢＡＰは、水溶性でメンブレン指向性を
有し容易に細胞に取り込まれ、また、培養細胞レベルで
細胞毒性は非常に弱く、８０μＭでも細胞増殖阻害は弱
い。

【００１２】上記本発明のウイルス増殖阻害剤は、ほと
んどのウイルス感染に有効であり、特にインフルエン
ザ、Ｃ型肝炎、ＨＩＶウイルスに有効である。本発明の
ウイルス感染症の予防・治療剤としては、上記本発明の
ウイルス増殖阻害剤を含有するものであればどのような
ものでもよく、本発明のウイルス感染症の予防・治療剤
は、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、穎粒剤、
カプセル剤等通常、その使用目的に応じた製剤形態で使
用することができ、製剤化に際しては、薬学的に許容さ
れる通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、
ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤な
どの各種調剤用配合成分を添加することができる。また
これら予防若しくは治療剤は、経口的又は非経口的に投
与することができる。すなわち通常用いられる投与形
態、例えば粉末、顆粒、カプセル剤、シロップ剤、懸濁
液等の剤型で経口的に投与することができ、あるいは、
例えば溶液、乳剤、懸濁液等の剤型にしたものを注射の
型で非経口投与することができる他、スプレー剤の型で
鼻孔内投与することもできる。

【００１３】本発明のウイルス増殖阻害剤の投与量は、
用法、患者の年齢、性別、その他の条件、疾患の程度な
どに応じて適宜決定できるが、通常有効成分である前記
化合物の量は、1日当たり体重１ｋｇ当たり約１００μ
ｇ〜２０ｍｇ程度が好ましい。該ウイルス増殖阻害剤は
１日に２〜４回程度に分けても投与することができる。

【００１４】上記本発明のウイルス増殖阻害剤を食品素
材又は食品に添加・配合して、ウイルス感染症の予防・
治療用機能性食品とすることもできる。上記食品素材又
は食品としては、ヨーグルト、ドリンクヨーグルト、ジ
ュース、牛乳、豆乳、酒類、コーヒー、紅茶、煎茶、ウ
ーロン茶、スポーツ飲料等の各種飲料や、プリン、クッ
キー、パン、ケーキ、ゼリー、煎餅などの焼き菓子、羊
羹などの和菓子、冷菓、チューインガム等のパン・菓子
類や、うどん、そば等の麺類や、かまぼこ、ハム、魚肉
ソーセージ等の魚肉練り製品や、みそ、しょう油、ドレ
ッシング、マヨネーズ、甘味料等の調味類や、豆腐、こ
んにゃく、その他佃煮、餃子、コロッケ、サラダ等の各
種総菜をあげることができる。

【００１５】

【実施例】以下に、製剤例、実施例を挙げてこの発明を
更に具体的に説明するが、この発明の範囲はこれらの例
示に限定されるものではない。製剤例１所定量のＭｎＴＢＡＰ、デンプン、マグネシウムステア
レート、乳糖を混合し、常法により打錠した。錠剤１錠
（２００ｍｇ）当たりの組成は以下の通りであった。ＭｎＴＢＡＰ５ｍｇデンプン１３２ｍｇマグネシウムステアレート１８ｍｇ乳糖４５ｍｇ

【００１６】製剤例２所定量のＭｎＴＢＡＰ、ポリエチレングリコール[分子
量４０００]、塩化ナトリウム、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレエート、メタ重亜硫酸ナトリウム、メ
チル−パラペン、注射用蒸留水を注射剤の原料として用
いた。上記パラベン類、メタ重亜硫酸ナトリウム及び塩
化ナトリウムを撹拌しながら、８０℃で上記の約半量の
蒸留水に溶解した。さらに得られた溶液を４０℃まで冷
却しＭｎＴＢＡＰ、次にポリエチレングリコール及びポ
リオキシエチレンソルビタンモノオレエートをその溶液
中に溶解した。次に、かかる溶液に注射用蒸留水を加え
て最終の容量に調製し、適当なフィルターぺーパーを用
いて滅菌濾過することにより滅菌して、１ｍｌずつアン
プルに分注し注射剤を調製した。アンプル１００本当た
りの組成は以下の通りであった。ＭｎＴＢＡＰ５００ｍｇポリエチレングリコール[分子量４０００] ３００ｍｇ塩化ナトリウム９００ｍｇポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート４００ｍｇメタ重亜硫酸ナトリウム１００ｍｇメチル−パラペン１８０ｍｇプロピル−パラペン２０ｍｇ注射用蒸留水１００ｍｌ

【００１７】実施例Ａ：材料と方法（Ａ−１：ウイルスの培養系とウイルス力価の測定）本
発明化合物のウイルス増殖に対する作用を、以下の方法
により測定した(Nakatsue, M. ら, Biochem. Biophys.
Res Commun. 253, 59, 1998)。シンドビスウイルス（Ｓ
Ｖ）については主にＴＥ株、６３３株を用いた。ＴＥ
株、６３３株は、Dr. D. E. Griffin, Jhons Hopkins U
niversity School of Hygine and Public Health, Balt
imore, USAより分与されたものを用いた。培養細胞はＶ
ｅｒｏ（アフリカミドリザル腎臓由来）又はＢＨＫ−２
１（ハムスター胎児腎臓由来）を用い、培地はダルベッ
コの最小必須培地（ＤＭＥＭ）に１０％ウシ胎児血清を
添加したものを用い、５％ＣＯ₂存在下において３７℃
で培養した。なお、上記Ｖｅｒｏ及びＢＨＫ−２１細胞
株は（株）大日本製薬より購入し、ＪＥＶ（中山株）、
Ａ型インフルエンザウイルス（Ｆｌｕ−Ａ，ＰＲ８
株）、及びＭＤＣＫ細胞（イヌ腎細胞）は感染症研究所
の小田切孝人博士より分与を受け、また、Ｎ１８（ラッ
ト神経細胞腫由来）、ＡＴ３（ヒト前立腺癌由来）、及
びＢｃｌ−２発現ＡＴ３細胞（ＡＴ３／ｂｃｌ−２）は
Dr. D. E. Griffinより分与を受けた。

【００１８】０．２ｍｌのウイルス希釈液［Ｍｇ²⁺、Ｃ
ａ²⁺非含有０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５ＭＮａ
Ｃｌ，ｐＨ７．０（ＰＢＳ−）に１％牛血清アルブミ
ンを添加したもの］中に細胞当たり感染性を示すウイル
ス量が０．０１〜５０［multiplicity of infection(ｍ
ｏｉ)=０．０１〜５０］となるように希釈し、このウイ
ルス量が調整された希釈液を用いて、９０％単層培養が
形成された細胞に、３７℃で６０分間ＳＶを感染させた
後、培養液で２回洗浄し、新しい培養液を加え、３７℃
で培養を続けた（Tucker, P. C.ら, J. Virol. 71: 610
6, 1997）。

【００１９】ウイルス力価の測定にはＢＨＫ−２１細胞
を用いた。培養上清を上記希釈液で１０倍階段希釈した
もの各０．２ｍｌを３個のウェル（６ウェルプレート）
に接種し３７℃で６０分間感染させた後、１．２％メチ
ルセルロースを加えたＤＭＥＭ（２％ウシ胎児血清含
有）で２日間培養した。メチルセルロースを取り除き、
細胞を２．５％クリスタルバイオレット（３０％エチル
アルコール、１％シュウ酸アンモニウム中）で染色し、
３個のウェルのプラークの平均値から１ｍｌ中のウイル
ス量［ＰＦＵ(プラーク形成単位（plaque forming unit
s)/ml］を算出した(Tucker, P. C.ら, J. Virol. 71: 6
106, 1997)。

【００２０】（Ａ−２：ＳＶの持続感染細胞の培養）Ｖ
ｅｒｏ細胞に６３３株を感染させ培養を続けても持続感
染は成立しにくいが、ＴＥ株感染で持続感染が成立す
る。Ｖｅｒｏ細胞にｍｏｉ＝５０でＴＥ株を感染させ培
養すると、ウイルスは一過性に増殖し、感染後３日後に
７０〜９０％の細胞が死滅する。生存した細胞はウイル
スを産生しながら増殖し、感染後１０日目に単層を形成
し、持続感染細胞となる(第４６回日本ウイルス学会抄
録集, P108, 1998)。

【００２１】（Ａ−３：ＳＶ感染細胞のタンパク質の分
析）細胞内ウイルスタンパク質の分析、細胞タンパク質
（Ｍｎ−ＳＯＤ、Ｂｃｌ−２など）の分析はＳＤＳ−ポ
リアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、免疫
ブロット（ＩＢ）法により行い、データの解析は画像を
ＣＣＤカメラで撮影後、（ファルマシア／アプライドバ
イオシステム社製）のＡＩＳ（The analytical Imaging
System）ソフトにより各バンドの染色濃度を測定した
（Nakatsue, M.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2
53: 59, 1998）。免疫ブロットには抗ウサギＳＶ抗体、
抗ウサギＭｎ−ＳＯＤ抗体、抗ヒトマウスモノクロナー
ル抗体を用い、二次抗体はアルカリホスファターゼを結
合したそれぞれの抗体に対する抗体を用い、検出はＮＢ
Ｔ（ニトロブルーテトラゾリュウム塩）による発色によ
り行った（Yoshinaka, Y.ら, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 261: 139, 1999)。

【００２２】（Ａ−４：阻害剤のウイルス増殖阻害と濃
度の測定）阻害剤のウイルス増殖阻害について、種々の
条件で検討した。用いた試薬は全て水溶性であるため、
５ｍＭの濃度のストック液をＰＢＳ（−）で調整した。
沈殿の形成がみられる場合は少量の１．０ＭＮａＯＨ
で弱アルカリ性とした。試薬の添加はウイルス感染前
２、６時間、感染と同時、感染後２、４、６時間に行
い、ウイルス感染量はｍｏｉ＝０．０１及びｍｏｉ＝５
０について行った。培養上清の回収はｍｏｉ＝５０で感
染させた場合は２４時間後、ｍｏｉ＝０．０１で感染さ
せた場合は４８時間後に行い、ウイルス力価を測定し
た。ウイルス力価を測定するとともに感染細胞も回収し
た。感染細胞の回収は、細胞をＰＢＳ（−）で一回洗浄
後、０．３ｍｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用サンプルバッファ
ーで溶解し、軽く超音波処理を行い、一分間煮沸後、細
胞内タンパク質組成と量を測定のために使用した（Naka
tsue, M.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 5
9, 1998）。

【００２３】さらにＳＶをＶｅｒｏ細胞に１時間感染
後、それぞれの試薬を添加、２４時間（ｍｏｉ＝５０で
感染させたもの）又は４８時間（ｍｏｉ＝０．１で感染
させたもの）後に培養上清を回収し、ウイルス力価を測
定した。また、ウイルス液とＭｎＴＢＡＰを混合後、２
２℃で１時間静置後ウイルス力価を測定し、直接作用の
有無を検討した。さらに非感染細胞に及ぼすＭｎＴＢＡ
Ｐの作用を、７０％単層を形成したＶｅｒｏ細胞に種々
の濃度のＭｎＴＢＡＰを加え４日間培養後、それぞれの
濃度について全タンパク質組成をＳＤＳ−ＰＡＧＥで比
較した。

【００２４】実施例Ｂ：結果（Ｂ−１：ＭｎＴＢＡＰ、ヘム、ＥＵＫ―８によるＳＶ
増殖阻害）ＭｎＴＢＡＰ、ヘム、ＥＵＫ−８によるＳＶ
増殖阻害について調べた。ＳＶ（ＴＥ株）をＶｅｒｏ細
胞にｍｏｉ＝５０で１時間感染後、ＭｎＴＢＡＰ、ヘ
ム、ＥＵＫ−８をそれぞれ０（対照）、３μＭ、１０μ
Ｍ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭずつ添加し、２４時
間後に培養上清を回収し、ウイルス力価を測定した。ま
た、ＭｎＴＢＡＰについては、ＴＥ株をＶｅｒｏ細胞に
ｍｏｉ＝０．１で感染したものについても検討した。結
果を図１に示す。ウイルス液（ｍｏｉ＝５０）とＭｎＴ
ＢＡＰとを混合し、１時間２２℃で静置後ウイルス力価
を測定し、直接作用の有無を検討した。図１からわかる
ように、ＭｎＴＢＡＰは、ＩＣ₅₀（50%inhibitory conc
entration）が１μＭと非常に強い増殖阻害を示した
が、ウイルスに対して直接的な不活化作用は認められな
かった。ヘムとＥＵＫ−８のＩＣ₅₀はそれぞれ２０μＭ
と５０μＭであった。また、ＭｎＴＢＡＰ添加４日目の
細胞を回収し、タンパク質量とタンパク組成を調べた結
果、８０μＭで１０％タンパク量が減少していた以外は
ほとんど差がみられず、細胞毒性は弱いことが示された
（図７）。

【００２５】（Ｂ−２：ＭｎＴＢＡＰの非存在下及び４
０μＭ存在下におけるウイルス増殖の比較）ＴＥ株をｍ
ｏｉ＝５０でＶｅｒｏ細胞に１時間感染後、ＭｎＴＢＡ
Ｐ４０μＭを添加し、一定時間ごとに培養上清を回収し
ウイルス力価を測定した。結果を図２に示す。図２から
わかるように、４０μＭのＭｎＴＢＡＰの存在下（■）
では、非存在下（●）に比べて、ウイルス力価が低下し
ており、４０μＭのＭｎＴＢＡＰの存在下では、感染初
期から細胞外ウイルスの産生が抑制され、感染後９時間
後では１０^-3に抑制されていた。この結果は、ＭｎＴＢ
ＡＰが強いウイルス増殖阻害活性を有することを示して
いる。

【００２６】（Ｂ−３：ＭｎＴＢＡＰの長時間存在下に
おける細胞外ウイルス増殖に対する影響）ＴＥ株をＶｅ
ｒｏ細胞に１時間感染後ＭｎＴＢＡＰを０、２０、８０
μＭ添加し、一日ごとに培養上清を３日目まで回収し、
ウイルス力価を測定した。培養上清に蓄積するウイルス
量を測定した結果を図３に示す。図３から、感染後１日
目でウイルス量が最大になり、以後漸次減少すること
や、ＭｎＴＢＡＰ濃度依存的にウイルス量が減少するこ
とがわかる。

【００２７】（Ｂ−４：ＭｎＴＢＡＰの添加時期による
細胞外ウイルス増殖に対する影響）ＴＥ株をＶｅｒｏ細
胞に１時間感染させた。感染直後、感染後１，２，３，
６，８，１６時間後にそれぞれ４０μＭのＭｎＴＢＡＰ
を添加し、感染２４時間後に培養上清を回収し、ウイル
ス力価を測定した。結果を図４に示す。図４よりＭｎＴ
ＢＡＰの添加の時期がはやいほど、ウイルス増殖阻害効
果が強いことがわかった。

【００２８】（Ｂ−５：ＭｎＴＢＡＰのウイルス感染細
胞の細胞形態及びアポトーシス誘導に対する影響）ＴＥ
株をＶｅｒｏ細胞に１時間感染後ＭｎＴＢＡＰをそれぞ
れ０（対照），３μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μ
Ｍ、８０μＭを添加し、感染２４時間後に感染細胞の形
態観察及びＤＮＡ断片化について調べた。結果を図５に
示す。図５（上）より、ＭｎＴＢＡＰ処理Ｖｅｒｏ細胞
は、濃度依存的にウイルスによる細胞変性効果が抑制さ
れていることがわかる。また、図５（下）より、ＭｎＴ
ＢＡＰ処理Ｖｅｒｏ細胞のＤＮＡの断片化が濃度依存的
に抑制されており、ＭｎＴＢＡＰの添加によりウイルス
によって誘導されるアポトーシスが抑制されることが明
らかとなった。

【００２９】（Ｂ−６：ＳＶ持続感染細胞におけるＭｎ
ＴＢＡＰの細胞外ウイルス増殖に対する影響）ＳＶ持続
感染細胞ＡＴ−３（Ｂｃｌ−２）／６３３、Ｖｅｒｏ／
ＴＥ、又はＮ１８／ＴＥにＭｎＴＢＡＰをそれぞれ０
（対照），３μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８
０μＭ添加し、２４時間後のウイルス力価を測定した。
結果を図６に示す。図６よりＭｎＴＢＡＰ処理ＳＶ持続
感染細胞は、いずれも濃度依存的にウイルス力価が低下
することが認められた。

【００３０】（Ｂ−７：ＭｎＴＢＡＰの非感染細胞に対
する影響）７０％単層を形成したＶｅｒｏ細胞にＭｎＴ
ＢＡＰ（Ａ）をそれぞれ０（対照），３μＭ、１０μ
Ｍ、２０μＭ、４０μＭ、８０μＭずつ添加し、４日後
に培養細胞を回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質組
成と量を調べた。結果を図７に示す。図７よりＭｎＴＢ
ＡＰ処理Ｖｅｒｏ細胞におけるタンパク質組成と量はＭ
ｎＴＢＡＰ添加濃度の多寡にかかわらず、ほとんど変化
は見られないが、８０μＭにおいて全タンパク質量が１
０％減少していた。

【００３１】（Ｂ−８：ＭｎＴＢＡＰの細胞内ウイルス
タンパク質及び細胞構成成分に対する影響）ＴＥ株をＶ
ｅｒｏ細胞に１時間感染後、ＭｎＴＢＡＰをそれぞれ０
（対照），３μＭ、１０μＭ、２０μＭ、４０μＭ、８
０μＭ添加し、感染２４時間後に細胞を回収し、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ／ＩＢによりそれぞれの成分のタンパク質量
を、ヒストンＩＶについてはＣＢＢ染色により定量し、
Ｍｎ−ＳＯＤ，Ｂｃｌ−２，ウイルス成分についてはＩ
Ｂをスキャンして定量した。結果を図８に示す。図８よ
りウイルスコア成分のタンパク量はＭｎＴＢＡＰ濃度依
存的に減少したが、ヒストンＩＶ、Ｍｎ―ＳＯＤ、及び
Ｂｃｌ−２のタンパク量はＭｎＴＢＡＰ添加濃度の多寡
にかかわらず大きな変化は認められなかった。

【００３２】（Ｂ−９：ＭｎＴＢＡＰによるＳＶ以外の
ウイルスの増殖への影響）他のウイルス、例えば日本脳
炎ウイルス（ＪＥＶ）、インフルエンザウイルス（Ｆｌ
ｕ−Ａ）感染細胞についてもＭｎＴＢＡＰによるウイル
ス増殖の抑制がみられた。結果を図９に示す。日本脳炎
ウイルスはＶｅｒｏ細胞にｍｏｉ＝０．０１で感染後、
４８時間目にウイルス量を測定した。インフルエンザウ
イルスはＶｅｒｏ細胞にｍｏｉ＝１で感染させ、トリプ
シン（１μｇ／ｍｌ）非存在下で培養し、感染後４８時
間目にウイルス量をＭＤＣＫ細胞で測定した。

【００３３】（Ｂ−１０：結果のまとめ）ＭｎＴＢＡＰ
は、Ｖｅｒｏ、Ｎ１８、ＢＨＫ−２１細胞で顕著な細胞
外ウイルスの産生を１０^-2〜１０^-4に抑制する（ＩＣ₅₀
＝１〜３μＭ）。また、試薬の添加時間にかかわらず、
高ＭＯＩ、低ＭＯＩ感染ともに増殖阻害がみられ（感染
後の試薬添加時間に比例して、阻害程度は弱くなるが１
６時間後添加でも３０％の阻害がみられる。通常、感染
後９〜１２時間で細胞外ウイルスの力価は最高とな
る）、細胞内ウイルスタンパク質量も平行して減少す
る。感染前、あるいは感染と同時添加でも同様の傾向が
見られる。同様に、持続感染細胞（Ｖｅｒｏ／ＴＥ株、
Ｎ１８／ＴＥ株、ＡＴ３−ｂｃｌ２／６３３株）でも細
胞外ウイルスの産生が１０^-1〜１０^-2に抑制される。ま
た、ウイルスに対する試薬の直接不活化作用はない。さ
らに、培養細胞における細胞毒性は、８０μＭにおいて
増殖速度が１０％程度遅くなる以外は殆ど確認できな
い。

【００３４】ＭｎＴＢＡＰの抗ウイルス作用の詳細な作
用点は現在のところ不明であるが、ウイルス感染で誘導
され、ウイルス増殖に何らかの関与が考えられるスーパ
ーオキサイドの消去により、ウイルス増殖が抑制される
と考えられる。ウイルス種による特異性は低いと考えら
れ、対象としてインフルエンザ、Ｃ型肝炎、エイズウイ
ルスなどへの応用が期待できる。ウイルス種により酸化
ストレスの誘導能が異なると考えられるが、効果はその
強弱に依存するものと思われる。ヘム及びサレン化合物
はＭｎＴＢＡＰの作用より抑制能は低いが同様の作用を
もつ。

【００３５】

【発明の効果】本発明のウイルス増殖阻害剤は、ウイル
ス増殖機構に直接関与せず、細胞機能を介して非特異的
に抑制作用を示すと考えられることから、Ｃ型肝炎ウイ
ルス、ＨＩＶなど、多くの薬剤を必要とするウイルス疾
患の治療や予防に有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＭｎＴＢＡＰ、ヘム、ＥＵＫ−８のウイルス粒
子及び細胞外ウイルス増殖に対する影響を示す図であ
る。

【図２】ＭｎＴＢＡＰの非存在下及び４０μＭ存在下に
おけるウイルス増殖の比較を示す図である。

【図３】ＭｎＴＢＡＰの長時間存在下における細胞外ウ
イルス増殖に対する影響を示す図である。

【図４】ＭｎＴＢＡＰの添加時期による細胞外ウイルス
増殖に対する影響を示す図である。

【図５】ＭｎＴＢＡＰのウイルス感染細胞の細胞形態及
びアポトーシス誘導に対する影響を示す図である。

【図６】ＳＶ持続感染細胞におけるＭｎＴＢＡＰの細胞
外ウイルス増殖に対する影響を示す図である。

【図７】ＭｎＴＢＡＰの非感染細胞に対する影響を示す
図である。

【図８】ＭｎＴＢＡＰの細胞内ウイルスタンパク質及び
細胞構成成分に対する影響を示す図である。

【図９】ＭｎＴＢＡＰのＳＶ、ＪＥＶ、及びＦｌｕ−Ａ
の増殖に与える影響を示す図である。

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】スーパーオキシドディスムターゼ様活性
を有する非ペプチド系化合物の１種若しくは２種以上を
有効成分として含有することを特徴とするウイルス増殖
阻害剤。
【請求項２】スーパーオキシドディスムターゼ様活性
を有する非ペプチド系化合物が、スーパーオキシドディ
スムターゼ様活性を有するポルフィリン系化合物又はサ
レン系化合物であることを特徴とする請求項１記載のウ
イルス増殖阻害剤。
【請求項３】スーパーオキシドディスムターゼ様活性
を有するポルフィリン系化合物が、Ｍｎ(III)テトラキ
ス−４−ベンゾイックアシッド−ポルフィリンクロライ
ド、Ｍｎ(III)テトラキス−１−メチル−４ピリドール
−ポルフィリンテトラクロライド又はヘムであることを
特徴とする請求項２記載のウイルス増殖阻害剤。
【請求項４】スーパーオキシドディスムターゼ様活性
を有するサレン系化合物が、ＥＵＫ−８であることを特
徴とする請求項２記載のウイルス増殖阻害剤。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか記載のウイルス
増殖阻害剤を含有することを特徴とするウイルス感染症
の予防・治療剤。
【請求項６】請求項１〜４のいずれか記載のウイルス
増殖阻害剤を含有することを特徴とするウイルス感染症
の予防・治療用食品素材又は食品。