WO2022177029A1 - セレノネインを含む、ｃｏｖｉｄ１９治療又は予防薬 - Google Patents

セレノネインを含む、ｃｏｖｉｄ１９治療又は予防薬 Download PDF

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coronavirus
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紀行 鈴木
康光 小椋
泰典 福本
惠一 市川
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国立大学法人千葉大学
キッコーマン株式会社
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    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)

Definitions

  • the present invention relates to the technical field of COVID19 treatment or prevention, including selenoneine.
  • Non-Patent Document 1 Am J Clin Nutr. 2020 Jun 1;111(6):1297-1299. doi : 10.1093/ajcn/nqaa095).
  • Coronaviruses have single-stranded RNA as their genome, and when they infect host cells, long polyproteins are translated from the RNA genome. Proper cleavage of the polyprotein allows each fragment to function as a structural protein or enzyme necessary for viral replication, resulting in viral replication.
  • Proteases that mainly catalyze polyprotein cleavage include the main protease (M pro ) and papain-like protease (PLpro), and these proteases are potential drug discovery targets. Results of computer screening of three-dimensional models by crystallography have reported that some existing drugs can function as effective M pro inhibitors (Non-Patent Document 2: Nature (2020) vol. 582(7811):289-293).
  • Ebselen which is a type of selenium compound, shows a remarkable affinity for the catalytic domain, and is expected to be developed as a therapeutic agent for COVID19 (Non-Patent Document 3: Sci. Adv. 2020 6 eadb0345).
  • Ebselen is a functional molecule containing selenium, one of the essential trace elements, in its molecule.
  • Ebselen is a molecule that potentially has a free selenol group as a tautomer.
  • the mechanism of M pro inhibition by ebselen is thought to be covalent bonding of the selenol group of ebselen to the Cys145 thiol group of the active center of the protease.
  • organoselenium compounds show high binding affinity to the main protease (M pro ) of SARS-CoV-2, suggesting that organoselenium compounds can be candidate molecules for antiviral drugs.
  • M pro main protease
  • the purpose is to provide a drug that has inhibitory activity against the protease of SARS-CoV-2, which is a target for drug discovery.
  • the present inventors focused on the fact that both the main protease (M pro ) and papain-like protease (PLpro) of SARS-CoV-2 are cysteine proteases, and established a screening system using papain inhibitory activity as an indicator. Using such a screener, selenoneine was screened as a substance having a higher inhibitory activity than ebselen, which was identified as an inhibitor of Mpro . Furthermore, they prepared M pro of SARS-CoV-2 and confirmed that protease activity is inhibited by selenoneine, leading to the present invention.
  • the invention thus relates to:
  • a coronavirus protease inhibitor comprising selenoneine or a tautomer or dimer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the protease inhibitor according to item 1 wherein the protease is main protease or papain-like protease.
  • the protease inhibitor according to item 1, wherein the coronavirus is SARS-CoV2.
  • a composition for treating or preventing coronavirus infection comprising selenoneine, a tautomer or dimer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Selenoneine or a tautomer or dimer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in treating or preventing coronavirus infection.
  • the invention according to any one of items [4-1] to [4-4], wherein the coronavirus infection is COVID19.
  • [6] A method for screening therapeutic or preventive agents for coronavirus infections, using inhibitory activity against papain as an index.
  • the method according to item 6, wherein the coronavirus infection is COVID19.
  • the therapeutic or prophylactic agent inhibits main protease or papain-like protease of coronavirus.
  • Selenoneine exerts higher M pro inhibitory activity than ebselen. In addition, selenoneine exhibits higher M pro inhibitory activity than other selenium-containing compounds.
  • FIG. 1 is a three-dimensional model showing that ebselen acts on the active center of M pro .
  • the selenol group which appeared by tautomerization of ebselen, covalently bonds to cysteine 145.
  • FIG. 2 shows a comparison of the sequence and active center conformation of (1) M pro , which is a cysteine protease, and (2) papain sequence and conformation of the active center.
  • FIG. 3 shows a comparison of the sequence and active center conformation of (1) PLpro, a cysteine protease, and (2) papain sequence and conformation of the active center.
  • Figure 4 shows papain enzymatic activity in the presence or absence of ebselen or selenoneine.
  • FIG. 5 shows inhibition curves of ebselen or selenoneine on papain enzymatic activity.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of a plasmid carrying the M pro gene.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE of M pro expressed in E. coli and purified with a His tag. The 33.8 kDa band corresponds to the Mpro band.
  • Figure 8 shows the protease activity of Mpro in the presence or absence of ebselen, ergothioneine or selenoneine. M pro decomposes the fluorescent substrate, resulting in an increase in fluorescence intensity over time.
  • FIG. 5 shows inhibition curves of ebselen or selenoneine on papain enzymatic activity.
  • FIG. 6 shows a schematic diagram of a plasmid carrying the M pro gene.
  • FIG. 7 shows the results of SDS-PAGE of M pro expressed in E. coli and purified with a His tag. The 33.8
  • FIG. 10 shows test compounds (selenoine, ebselen , selenocystine ((SeCys) 2 ), methylselenocysteine (MeSeCys), selenomethionine (SeMet), diphenyldiselenide (PhSeSePh), sodium selenite ( selenite)).
  • this embodiment an embodiment of the present invention (hereinafter referred to as “this embodiment”) will be described in detail, but the present invention is not limited to this, and various modifications are possible without departing from the scope of the invention. is.
  • the present invention relates to a coronavirus protease inhibitor or a composition for the treatment or prevention of coronavirus infection, containing selenoneine or a tautomer or dimer thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • selenoneine has the following chemical name: 2-selenyl-N ⁇ ,N ⁇ ,N ⁇ -trimethyl - L - histidine is a compound of Specifically, the following formula (I): refers to a compound represented by The OH group, NH group, etc. in the molecule may be in a state without hydrogen atoms, that is, in an ionized state. This compound may exist as any optical isomer, geometric isomer, tautomer, or dimer, or mixtures thereof.
  • selenoneine may take any of the forms of formulas (I)-(III) below:
  • selenoneine may contain compounds in the form of formulas (I)-(III) in any proportion.
  • a dimerized compound can be reduced to a monomer by the ambient environment.
  • the composition containing the compound of formula (I) or (II) may further contain a reducing agent.
  • Any reducing agent can be used as such a reducing agent, and examples thereof include glutathione (GSH), dithiothreitol (DTT), and mercaptoethanol.
  • Selenoneine is a component that is abundantly contained in blood such as tuna, marlin, and mackerel, and is a component that is ingested on a daily basis.
  • Selenoneine can be produced as appropriate by those skilled in the art.
  • a method for producing selenoneine it can be produced by a chemical synthesis method (Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1-6), or by extraction from a biological tissue containing selenoneine, or by fermentation with microorganisms. can be manufactured.
  • ergothioneine is produced simultaneously with selenoneine, and it is difficult to separate them.
  • the resulting transformant extract containing selenoneine may contain ergothioneine in addition to selenoneine.
  • the selenoneine is preferably purified selenoneine.
  • Selenoneine can be purified by techniques known to those skilled in the art, such as HPLC.
  • coronavirus protease preferably relates to the SARS-CoV2 protease.
  • Coronavirus proteases include the main protease ( Mpro ) and the papain-like protease (PLpro).
  • Mpro main protease
  • PLpro papain-like protease
  • SARS-CoV2 main protease (M pro ) is preferred from the viewpoint of drug discovery targets.
  • the main protease also called 3Clpro, nonstructural protein 5 (nsp5), relates to the main protease that degrades polyproteins.
  • the main protease is a cysteine protease and functions as a dimer composed of identical subunits.
  • the main protease of SARS-CoV2 has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) consisting of 306 residues. An active center formed from such sequence Cys145 and His41 is known, and the selenol group of ebselen is believed to covalently bond to the thiol group of Cys145 (Fig. 1).
  • Selenoneine which is a selenium-containing compound, also has a selenol group, so that it can covalently bind to Cys145 of the active center of M pro and have M pro inhibitory activity.
  • Papain-like proteases are related to nonstructural protein 3 (nsp3) proteases and are cysteine proteases that degrade polyproteins.
  • the papain-like protease of SARS-CoV2 has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 3) consisting of 317 residues.
  • the catalytic triad structure spanning the active center of papain-like protease is Asp286-His272-Cys111.
  • Papain is a type of cysteine protease contained in papaya and has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) consisting of 345 residues.
  • a cysteine protease refers to a proteolytic enzyme that contains a cysteine in the catalytic domain of the enzyme. Cysteine thiols are deprotonated by histidines, which are normally located near cysteines in the catalytic domain, and the anionized thiol groups attack the carbonyl carbons of substrate peptides or proteins, hydrolyzing peptide bonds. Therefore, covalent binding of a protease inhibitor to the thiol groups of cysteines in the catalytic domain inhibits the enzymatic activity of cysteine proteases.
  • Both papain and the main protease or papain-like protease are cysteine proteases, and form catalytic triads or catalytic dyads characterized by amino acid residues common to the active centers.
  • Catalytic triad refers to the three coordinating amino acids found in the active site of some enzymes. The constituent coordinating amino acids differ depending on the type of enzyme.
  • Catalytic triads of cysteine proteases are composed of cysteine, histidine, and asparagine or aspartic acid as the third amino acid.
  • Such a screening method specifically includes preparing a solution containing a candidate agent, a papain-degrading fluorescent substrate, and papain, and measuring the fluorescence intensity of the solution.
  • the fluorescence intensity over time may be measured, or the papain inhibition curve of the candidate drug may be obtained by measuring the change in fluorescence intensity when the concentration of the candidate drug is changed.
  • selenonein that exhibits papain inhibitory activity may have inhibitory activity on the main protease or papain-like protease.
  • the protease inhibitor of the present invention can suppress the proliferation of coronaviruses by suppressing the degradation of polyproteins produced from coronaviruses, and can thereby be used as therapeutic and prophylactic agents. Also, the protease inhibitors of the present invention may be included in foods or food compositions.
  • composition of the present invention comprises a therapeutically effective amount of selenoneine or a tautomer or dimer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Additionally, a pharmaceutically acceptable carrier or excipient may be included. Therefore, the composition of the present invention can also be called a pharmaceutical composition.
  • the protease inhibitors and compositions of the invention are administered to patients in need of treatment or prevention.
  • Another aspect of the present invention is the use of selenoneine or a tautomer or dimer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof, a protease inhibitor according to the present invention, or a therapeutic or prophylactic pharmaceutical composition for treatment or prevention.
  • the dosage/number of doses can be appropriately selected depending on the symptoms.
  • pharmaceutically acceptable excipient includes any carrier, diluent, adjuvant or medium, preservative or antioxidant, filler, disintegrant, wetting agent, emulsifier, suspending agent. Also included are clouding agents, solvents, dispersion media, coatings, antibacterial agents, fungicides, isotonic agents and absorption retardants and the like.
  • clouding agents solvents, dispersion media, coatings, antibacterial agents, fungicides, isotonic agents and absorption retardants and the like.
  • Excipients can be used in the compositions of the present invention, except where conventional excipients are incompatible with selenoneine. Supplementary active ingredients can also be incorporated into the compositions as appropriate therapeutic combinations.
  • Subjects who need treatment or prevention include those who may be exposed to coronavirus.
  • a “therapeutically effective amount” is an amount that, when administered, is capable of inhibiting active proteases involved in pathogenesis, and which, when administered, is effective in preventing or treating the onset or exacerbation of COVID 19.
  • a therapeutically effective amount can be determined through animal experiments and human clinical trials.
  • selenoneine which is an active ingredient of the present invention, is ingested by eating fish. can also be used to determine the therapeutically effective amount.
  • selenoneine can be administered at 28 ⁇ g/kg, but is not intended to be limited to these amounts.
  • compositions of the present invention can be provided in any dosage form, including tablets, capsules, powders, nasal drops, or aerosol forms, injection solutions, drops, ointments, creams, sprays, transdermal patches. can be formulated into
  • Another aspect of the invention may relate to a food composition
  • a food composition comprising selenoneine or a tautomer or dimer thereof or a food acceptable salt thereof.
  • Such food compositions include functionally labeled foods, nutritionally functional foods, and functionally labeled foods that display functions such as prevention and resistance to coronaviruses, particularly SARS-CoV2, or functions to inhibit coronavirus protease, particularly the main protease. Or it may be a food for specified health use.
  • a food composition, a food with function claims, a food with nutrient function claims, or a food for specified health uses for example, contains 1 to 1000 ppm, preferably 10 to 100 ppm, and most preferably 30 to 70 ppm of selenoneine or a tautomer or dimeric form thereof. It may be a beverage, food, or supplement containing the polymer or its food-acceptable salt. Selenoneine is known to be abundant in fish.
  • the selenoneine content in bluefin tuna is 30 mg Se/kg, and that 100 g of fish meat is eaten and uniformly distributed in a human body weighing 60 kg, the selenoneine content in the body is theoretically about 1 ⁇ M, and the blood concentration is It can be estimated to be approximately 8 ⁇ M.
  • Fish that may contain selenoneine include tuna, marlin, mackerel, yellowtail, sea bream, pufferfish, salmon/trout, flounder/flatfish, and particularly tuna, marlin, mackerel, A lot of yellowtails are included.
  • Examples of food compositions, foods with function claims, foods with nutrient function claims, or foods for specified health uses include raw edible parts of these fish and processed foods made from fish. These fish may be wild or farmed. Since the selenoneine content in fish varies depending on the type of feed, farmed fish with increased selenonein content are more preferred.
  • Examples of processed foods made from fish include any foods made from fish, such as canned food, bottled food, food boiled in soy sauce, dried fish, dried fish, paste, pickled fish, and supplements.
  • Tuna species used in food compositions, foods with function claims, foods with nutrient function claims, or foods for specified health uses include the tuna family and the Hagatsuo family.
  • Examples of the tuna family include the genus Tuna, the genus Pomella, the genus Suma, and the genus Bonito, and examples of the genus Hagatsuo include the genus Dogtooth tuna and the genus Pomfret.
  • tuna examples include albacore tuna, bluefin tuna, southern bluefin tuna, Atlantic tuna, Atlantic bluefin tuna, yellowfin tuna, bigeye tuna, and the like; Alternatively, mention may be made of albacore, bluefin tuna, southern bluefin tuna, Atlantic tuna, Atlantic bluefin tuna, yellowfin, bigeye, longfin, bonito or trout. Preferable examples include albacore, bluefin tuna, Atlantic bluefin tuna, bluefin tuna, yellowfin, bigeye, longfin, bonito, and trout.
  • Example 1 Inhibitory Activity of Papain Activity 10 ⁇ g/ml of papain (sold by Sigma-Aldrich Japan) and 5 ⁇ M of ebselen or selenoneine were dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) kept at 37° C., After preincubation for 15 minutes, 10 ⁇ M Bz-Arg-MCA was added to the same reaction solution, and changes in fluorescence intensity due to cleavage of Bz-Arg-MCA were observed over time with a fluorometer. The results are shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of M pro of SARS-CoV2 M pro DNA was synthesized according to the nucleotide sequence of NC_45512 (10055-10972: SEQ ID NO: 4) by total gene synthesis.
  • Mpro was introduced into a GST- and histidine-tagged plasmid (Fig. 6) and transformed into E. coli strain BL21(DE3).
  • E. coli BL21(DE3) strain was cultured at 37° C. to express the M pro protein.
  • Cell bodies were harvested and the M pro protein was purified using a binding agent for histidine tags.
  • M pro and human rhinovirus 3C protease HRV
  • HRV human rhinovirus 3C protease
  • a binding agent for histidine tag was used to remove undigested M pro and HRV to obtain a purified preparation of M pro protein.
  • Purified M pro protein was dissolved in a storage buffer of 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 0.01% Triton-X-100, 50% glycerol, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, subjected to SDS-PAGE and analyzed with Coomassie brilliant. Stained with blue (Fig. 7).
  • the purified M pro protein dissolved in a storage buffer containing DTT was dialyzed using a microdialysis cartridge Xpress Micro / Mini Dialyzer (manufactured by Funakoshi Co., Ltd.) to remove DTT and inhibit the inhibitory activity of Example 4. submitted for testing.
  • Example 3 Preparation of PLpro of SARS-CoV2 PLpro DNA is synthesized according to the base sequence of SEQ ID NO: NC_45512 (4955-5908: SEQ ID NO: 5) by total gene synthesis.
  • PLpro is introduced into a histidine-tagged plasmid and transformed into E. coli strain BL21(DE3).
  • E. coli strain BL21(DE3) is cultured to express the PLpro protein.
  • Cell bodies are harvested and the PLpro protein purified using a binding agent to the histidine tag. GST and histidine tag are removed by autolysis of PLpro and HRV, and a binder for histidine tag is used to remove undigested PLpro and HRV to obtain a purified product of PLpro protein.
  • Example 4 SARS-CoV2 inhibitory activity against M pro 2 ⁇ g/ml of M pro and 5 ⁇ M of ebselen, selenoneine, or ergothioneine were each dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) kept at 37°C. , After preincubation for 5 minutes, 10 ⁇ M Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA was added to the same reaction solution, and Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA was cleaved with a fluorometer. Inhibitory activity was examined by measuring changes in fluorescence intensity (Fig. 8).
  • Example 5 SARS-CoV2 inhibitory activity against M pro 2 ⁇ g/ml of M pro and 1 ⁇ M of test compound were each dissolved in 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) kept at 37° C. and preincubated. After 5 minutes, 10 ⁇ M Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA was added to the same reaction solution, and the fluorescence intensity accompanying the cleavage of Ac-Abu-Tle-Leu-Gln-MCA was measured with a fluorometer. to measure the inhibitory activity (Fig. 10).
  • Selenoneine was about 20%, while ebselen, selenocystine ((SeCys) 2 ), methyl Selenocysteine (MeSeCys), selenomethionine (SeMet), diphenyldiselenide (PhSeSePh) and sodium selenite (selenite) were all above 90%. Therefore, it was shown that selenoneine is remarkably superior to other selenium-containing compounds, particularly in terms of M pro inhibitory activity.
  • Example 6 Growth Inhibitory Activity against SARS-CoV2 Inhibition of SARS-CoV2 infection of host cells by ebselen or selenoneine can be measured, for example, by plaque assay.
  • Host cells are grown in monolayers in a 37° C., 5% CO 2 incubator until confluent. Next, after removing the medium and washing the cell surface with PBS(-), a virus solution and a 0 to 100 ⁇ M protease inhibitor solution are added and incubated for 30 minutes. After 30 minutes, the sample solution is removed and an agar medium is overlaid. When the agar has hardened, the plates are inverted and incubated in a 37°C, 5% CO2 incubator for 2 days.
  • the layered medium is removed, the plate is dried, stained with a crystal violet staining solution for 5 minutes, washed with purified water, and air-dried. Finally, the number of plaques is counted, compared with the control group, and the infection inhibition rate of the protease inhibitor against the virus is calculated.

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Abstract

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による感染症（ＣＯＶＩＤ１９）の治療又は予防用組成物の提供を目的とする。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のプロテアーゼの阻害活性を有する薬剤のスクリーニング方法を確立し、セレノネインがＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のプロテアーゼの阻害活性を有することを見出したことに基づき、セレノネインを含むＣＯＶＩＤ１９の治療又は予防用組成物を提供する。

Description

セレノネインを含む、ＣＯＶＩＤ１９治療又は予防薬
　本発明は、セレノネインを含む、ＣＯＶＩＤ１９治療又は予防の技術分野に関する。
　２０１９年秋から２０２２年にパンデミックを引き起こしたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスにより引き起こされるＣＯＶＩＤ１９に対するワクチンや治療薬の開発が急務である。いくつかの効果が認められたワクチンの開発が進み、使用されてきている。一方、日本を含むアジア諸国において、ＣＯＶＩＤ１９患者の重症化率や死亡率が、欧州各国に比べ低いことが疫学的に示されており、何らかの要因が、ＣＯＶＩＤ１９に対して抵抗性を付与することが考えられている。かかる要因の候補について研究が行われている。体内のセレン欠損により、コクサッキーウイルスやインフルエンザウイルスなどのＲＮＡウイルスの毒性が高まることが知られている。こうした背景から中国の都市間におけるセレン状態と、ＣＯＶＩＤ１９患者のアウトカムとの関連性が報告されている（非特許文献１：Am J Clin Nutr. 2020 Jun 1;111(6):1297-1299. doi: 10.1093/ajcn/nqaa095）。
　コロナウイルスは、一本鎖ＲＮＡをゲノムとして有し、宿主細胞に感染すると、ＲＮＡゲノムから長いポリタンパク質が翻訳される。ポリタンパク質が適切に切断されることで、各断片がウイルス増殖に必要な構造タンパク質や酵素として機能するようになり、ウイルスが増殖する。ポリタンパク質の切断を主に触媒するプロテアーゼとして、メインプロテアーゼ（Ｍpro）とパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）が挙げられ、これらのプロテアーゼは、有力な創薬ターゲットとなる。結晶解析による三次元モデルに対するのコンピュータースクリーニングの結果により、幾つかの既存の薬剤が、有効なＭpro阻害剤として機能しうることが報告されている（非特許文献２：Nature (2020) vol. 582(7811):289-293）。なかでも、セレン化合物の一種であるエブセレンが、触媒領域に対して際立った親和性を示し、それによりＣＯＶＩＤ１９に対する治療薬としての開発が期待されている（非特許文献３：Sci. Adv. 2020 6. eadb0345）。エブセレンは、必須微量元素のひとつであるセレンを分子内に含む機能性分子である。エブセレンは、互変異性体として遊離のセレノール基を潜在的に有する分子である。エブセレンによるＭpro阻害の機構は、プロテアーゼの活性中心のＣｙｓ１４５チオール基に対し、エブセレンのセレノール基が共有結合すると考えられている。また、インシリコ解析において、有機セレン化合物が、SARS-CoV-2のメインプロテアーゼ（Ｍpro）に対し、高い結合親和性を示すことから、有機セレン化合物が抗ウイルス薬の候補分子になりうることが示されている（非特許文献４）。
Am J Clin Nutr. 2020 Jun 1;111(6):1297-1299. doi: 10.1093/ajcn/nqaa095 Nature (2020) vol. 582(7811):289-293 Sci. Adv. 2020 6. eadb0345 Chemrexiv (2020-07-02) DOI:10.26434/chemrxiv.12594134
　創薬ターゲットであるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のプロテアーゼの阻害活性を有する薬剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のメインプロテアーゼ（Ｍpro）とパパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）が共にシステインプロテアーゼであることに着目し、パパイン阻害活性を指標としたスクリーニング系を確立した。かかるスクリーニンにより、Ｍproの阻害剤として特定されたエブセレンよりも高い阻害活性を有する物質としてセレノネインをスクリーニングした。さらにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＭproを調製し、セレノネインによりプロテアーゼ活性が阻害されることを確認し、本発明に至った。そこで本発明は下記に関する：
［１］　セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を含む、コロナウイルスのプロテアーゼ阻害剤。
［２］　前記プロテアーゼが、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼである、項目１に記載のプロテアーゼ阻害剤。
［３］　前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、項目１に記載のプロテアーゼ阻害剤。
［４－１］　セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防用の組成物。
［４－２］　コロナウイルス感染症の治療又は予防において使用するためのセレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩。
［４－３］　コロナウイルスによる感染の治療又は予防を必要とする対象における、コロナウイルス感染症を治療又は予防するための方法であって、前記対象に対して、セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を投与することを含む、前記方法。
［４－４］　コロナウイルスの治療薬又は予防薬の製造のための、セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩の使用。
［５］　前記コロナウイルス感染症が、ＣＯＶＩＤ１９である、項目［４－１］～［４－４］のいずれか一項に記載の発明。
［６］　パパインに対しての阻害活性を指標とした、コロナウイルス感染症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
［７］　前記コロナウイルス感染症が、ＣＯＶＩＤ１９である、項目６に記載の方法。
［８］　前記治療薬又は予防薬が、コロナウイルスのメインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼを阻害する、項目６又は７に記載の方法。
　セレノネインは、エブセレンよりも高いＭpro阻害活性を発揮する。また、セレノネインは、他の含セレン化合物に比較して、高いＭpro阻害活性を発揮する。
図１は、Ｍproの活性中心にエブセレンが作用することを、三次元モデルで示した図である。エブセレンが互変異化して現れたセレノール基が、システイン１４５と共有結合する。 図２は、システインプロテアーゼである（１）Ｍproの配列および活性中心の立体構造と、（２）パパインの配列および活性中心の立体構造との比較を示す。 図３は、システインプロテアーゼである（１）ＰＬｐｒｏの配列および活性中心の立体構造と、（２）パパインの配列および活性中心の立体構造との比較を示す。 図４は、エブセレン又はセレノネインの存在下又は非存在下における、パパイン酵素活性を示す。パパイン酵素活性により、蛍光基質が分解することで時間経過とともに蛍光強度が高くなる。 図５は、パパイン酵素活性に対するエブセレン又はセレノネインの阻害曲線を示す。 図６は、Ｍproの遺伝子を搭載したプラスミドの模式図を示す。 図７は、大腸菌により発現され、Ｈｉｓタグで精製されたＭproをＳＤＳ－ＰＡＧＥに供した結果を示す。３３．８ｋＤaのバンドがＭproのバンドに相当する。 図８は、エブセレン、エルゴチオネイン又はセレノネインの存在下又は非存在下におけるＭproのプロテアーゼ活性を示す。Ｍproにより、蛍光基質が分解することで時間経過とともに蛍光強度が高くなる。 図９は、エブセレン、エルゴチオネイン又はセレノネインによる、Ｍproのプロテアーゼ活性の阻害曲線を示す。 図１０は、Ｍproに対する、試験化合物（セレノネイン、エブセレン、セレノシスチン（（SeCys）2）、メチルセレノシステイン（MeSeCys）、セレノメチオニン（SeMet）、ジフェニルジセレニド（PhSeSePh）、亜セレン酸ナトリウム（selenite））による阻害活性を示す。
　以下、本発明の実施の形態（以下、「本実施形態」という。）について詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能である。
　本発明は、セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を含む、コロナウイルスのプロテアーゼ阻害剤或いはコロナウイルス感染症の治療又は予防用組成物に関する。
　本発明において、セレノネインは、以下の化学名：２－セレニル―Nα,Nα,Nα－トリメチル－Ｌ-ヒスチジン（2-selenyl-Nα,Nα,Nα-trimethyl-L-histidine)の化合物である。具体的に、以下の式（Ｉ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 で表される化合物を指す。分子中のＯＨ基、ＮＨ基などは水素原子の無い状態、すなわち、イオン化した状態にあってもよい。この化合物は、任意の光学異性体、幾何異性体、互変異性体、又は二量体、或いはこれらの混合物として存在していてもよい。互変異性化及び二量化の結果、セレノネインは、下記の式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の任意の形態をとってもよい：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　本発明において、セレノネインは、式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の形態の化合物を任意の割合で含有してもよい。二量化された化合物は、周囲環境により、単量体へと還元されうる。また、単量体を維持するために、式（Ｉ）又は（ＩＩ）で表される化合物を含む組成物は、さらに還元剤を含みうる。このような還元剤としては、任意の還元剤を使用しうるが、一例としてグルタチオン（ＧＳＨ）、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノールを使用しうる。セレノネインは、マグロ類、カジキ類、サバ類などの血合いに多く含まれる成分であり、日常的に摂取されている成分である。
　セレノネインは、当業者であれば適宜製造することができる。セレノネインの製造方法としては、化学合成方法（Angew. Chem. Int. Ed. 2019, 58, 1 - 6）により製造することもできるし、セレノネインを含有する生物組織からの抽出や、微生物による発酵により製造することができる。例えば、特許第５６６９０５６号公報に記載されているようにイカ類、魚類、鳥類、哺乳類などの組織から抽出する方法；Pluskal Tらの文献(Pluskal T et al.,PLoS One 2014 May 14;9(5):e97774)に記載されている、エルゴチオネイン生合成系に関与する遺伝子を導入した分裂酵母であるシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を利用する方法；国際公開第２０１７／０２６１７３号に記載されている、ヒスチジン及びセレン化合物を、セレノネイン合成酵素をコードする遺伝子を過剰発現するアスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）などのアスペルギルス属微生物や大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）などの形質転換体を利用する方法などが挙げられる。このうち、セレノネインを工業的規模で生産する場合には、セレノネインを高収量で生産する観点で国際公開第２０１７／０２６１７３号に記載の方法が好ましい。
　なお、国際公開第２０１７／０２６１７３号パンフレットに記載のセレノネイン合成酵素を過剰発現する形質転換体を用いる方法では、セレノネインとともに、エルゴチオネインが同時的に生成し、これらを分離することは困難であることから、得られるセレノネインを含有する形質転換体抽出物は、セレノネインに加えて、エルゴチオネインを含有し得る。入手可能であれば、セレノネインは、精製したセレノネインであることが好ましい。セレノネインは、ＨＰＬＣなどの当業者に公知の手法により精製することができる。
　コロナウイルスのプロテアーゼは、好ましくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のプロテアーゼに関する。コロナウイルスのプロテアーゼとしては、メインプロテアーゼ（Ｍpro）と、パパイン様プロテアーゼ（ＰＬｐｒｏ）が挙げられる。創薬ターゲットである観点から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のメインプロテアーゼ（Ｍpro）が好ましい。
　メインプロテアーゼは、３Ｃｌｐｒｏ、非構造タンパク質５（ｎｓｐ５）とも呼ばれ、ポリタンパク質を分解する主なプロテアーゼに関する。メインプロテアーゼは、システインプロテアーゼであり、同じサブユニットから構成される二量体として機能する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のメインプロテアーゼは、３０６残基からなるアミノ酸配列（配列番号１）を有する。かかる配列のＣｙｓ１４５と、Ｈｉｓ４１から形成される活性中心が知られており、エブセレンのセレノール基が、Ｃｙｓ１４５のチオール基に対して共有結合すると考えられている（図１）。セレンを含有する化合物であるセレノネインもセレノール基を有することから、Ｍproの活性中心のＣｙｓ１４５に共有結合し、Ｍpro阻害活性を有しうる。
　パパイン様プロテアーゼは、非構造タンパク質３（ｎｓｐ３）のプロテアーゼに関し、ポリタンパク質を分解するシステインプロテアーゼである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のパパイン様プロテアーゼは、３１７残基からなるアミノ酸配列（配列番号３）を有する。パパイン様プロテアーゼの活性中心にかかるｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ構造は、Ａｓｐ２８６－Ｈｉｓ２７２－Ｃｙｓ１１１である。
　パパインは、パパイヤが含むシステインプロテアーゼの一種であり、３４５残基からなるアミノ酸配列（配列番号２）を有する。システインプロテアーゼは、酵素の触媒領域にシステインを含むタンパク質分解酵素をいう。通常、触媒領域のシステインの近傍に存在するヒスチジンにより、システインのチオールが脱プロトン化され、陰イオンになったチオール基が、基質ペプチド又はタンパク質のカルボニル炭素を攻撃し、ペプチド結合を加水分解する。したがって、触媒領域のシステインのチオール基に、プロテアーゼ阻害剤が共有結合することで、システインプロテアーゼの酵素活性が抑制される。
　パパインと、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼはともにシステインプロテアーゼであり、活性中心に共通したアミノ酸残基が特徴的なｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ、もしくはｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｙａｄを形成している。Ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄとは、いくつかの酵素の活性部位にみられる３つの配位アミノ酸をいう。酵素の種類により、構成する配位アミノ酸は異なる。システインプロテアーゼのＣａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄは、システインと、ヒスチジンと、３つ目のアミノ酸としてアスパラギン又はアスパラギン酸とにより構成される。このうち、システインと、システインのチオールの脱プロトン化に寄与するヒスチジンは必須の構成であるが、パパインなどでみられるアスパラギンは活性への影響が少なく、その場合にはシステインとヒスチジンとからなるＣａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｙａｄとも呼ばれる。したがって、パパインに対しての阻害活性を有する物質を選択することで、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼの阻害剤としてスクリーニングすることができる。本発明の別の態様として、パパインに対しての阻害活性を指標とした、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼの阻害剤又はコロナウイルス治療又は予防薬のスクリーニング方法に関する。かかるスクリーニング方法は、具体的に、候補薬剤と、パパイン分解性の蛍光基質と、パパインとを含む溶液を調製し、前記溶液の蛍光強度を測定することを含む。経時的な蛍光強度を測定してもよいし、候補薬剤の濃度を変化させた際の蛍光強度変化を測定することで、候補薬剤のパパイン阻害曲線を得てもよい。ｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｔｒｉａｄ構造又はｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｄｙａｄ構造に共通点を有する観点から、パパインの阻害活性を示すセレノネインは、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼの阻害活性を有しうる。
　本発明のプロテアーゼ阻害剤は、コロナウイルスから生成するポリタンパク質の分解を抑制することで、コロナウイルスの増殖を抑制することができ、それにより治療薬及び予防薬として使用することができる。また、本発明のプロテアーゼ阻害剤は、食品又は食品組成物に含まれてもよい。
　本発明の組成物は、治療有効量のセレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を含む。さらに、医薬として許容される担体または賦形剤を含んでいてもよい。したがって、本発明の組成物は、医薬組成物ということもできる。本発明のプロテアーゼ阻害剤及び組成物は、治療又は予防を必要としている患者に投与される。
　本発明の別の態様は、セレノネイン又はその又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩、本発明に係るプロテアーゼ阻害剤、或いは治療又は予防用医薬組成物を、治療又は予防を必要とする対象に投与することを含む。経口投与又は非経口投与のいずれで投与されてもよい。非経口投与としては、一例として腹腔内投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、経鼻投与、口腔内投与、経肺投与、局所投与が挙げられる。投与量／回数は、症状に応じて適宜選択することができる。
　本明細書で使用する「薬剤として許容される賦形剤」には、いかなる担体、希釈剤、補助剤、または媒体、保存料もしくは酸化防止剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤、殺カビ剤、等圧剤および吸収遅延剤なども含まれる。これらの賦形剤の有効成分に対する使用は、本技術分野において周知である。従来の賦形剤が、セレノネインと共存し得ない場合を除き、本発明の組成物に賦形剤を使用することができる。補助的な有効成分も、適当な治療用の組合せとして組成物中に組み込むことができる。
　治療又は予防を必要とする対象としては、コロナウイルスへの暴露の可能性のある対象が挙げられる。
　「治療有効量」は、投与された場合に発病に関与する活性なプロテアーゼを阻害可能な量であり、また投与された場合にＣＯＶＩＤ１９の発症又は憎悪を予防または治療するのに有効な、本発明による化合物／薬剤の量を意味する。治療有効量は、動物実験やヒトに対する臨床試験を通じて決定することができる。一方、本発明の有効成分であるセレノネインは、魚食により摂取されており、例えば一日当たり１．７ｍｇまでの投与であれば、安全性上問題なく使用することができ、かかる量を考慮に入れて治療有効量を決定することもできる。一例として、セレノネインは２８μｇ／ｋｇで投与することができるが、これらの量に限定されることを意図するものではない。
　本発明の組成物は、任意の剤形で提供することができ、錠剤、カプセル剤、粉末、点鼻剤、またはエアロゾルの形態、注射液、点滴、軟膏、クリーム、スプレー、経皮パッチの形態に剤形されうる。
　本発明の別の態様では、セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその食品として許容される塩を含む、食品組成物に関していてもよい。このような食品組成物としては、コロナウイルス、特にＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する予防や抵抗性といった機能、又はコロナウイルスのプロテアーゼ、特にメインプロテアーゼを阻害するという機能を表示した機能性表示食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品であってもよい。食品組成物、機能性表示食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品は、一例として、１～１０００ｐｐｍ、好ましくは１０～１００、最も好ましくは３０～７０ｐｐｍ程度のセレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその食品として許容される塩を含む、飲料品、食品、サプリメントであってもよい。セレノネインは、魚類に多く含まれていることが知られている。例えば、クロマグロ中のセレノネイン含量を３０ｍｇ　Ｓｅ／ｋｇとし、魚肉を１００ｇ摂食し、体重６０ｋｇのヒト体内で均一に分布したと仮定した場合、理論上、体内のセレノネイン含量は約１μM、血中濃度で約８μMとなることが推定できる。
セレノネインが含まれうる魚類としては、マグロ類、カジキ類、サバ類、ブリ類、タイ類、フグ類、サケ・マス類、ヒラメ・カレイ類が挙げられ、特にマグロ類、カジキ類、サバ類、ブリ類に多く含まれる。食品組成物、機能性表示食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品として、これらの魚類の生食可食部、又は魚類を原料とする加工食品が挙げられる。これらの魚類は天然物又は養殖物であってもよい。魚類中のセレノネイン含量は、餌の種類によって変動するため、より好ましくは、セレノネイン含量が増加された養殖魚が好ましい。魚類を原料とする加工食品としては、缶詰、瓶詰、佃煮、乾燥魚、干物、練り物、漬け魚、サプリメントなど、魚を原料とする任意の食品が挙げられる。
　食品組成物、機能性表示食品、栄養機能食品、又は特定保健用食品に使用しるマグロ類としては、マグロ族及びハガツオ族を挙げることができる。マグロ族としては、マグロ属、ソウダガツオ属、スマ属、カツオ属等を挙げることができ、ハガツオ族としては、イソマグロ属、ハガツオ属等を挙げることができる。マグロ類としては、例えば、マグロ属のビンナガ、クロマグロ、ミナミマグロ、タイセイヨウマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キハダ、メバチ、コシナガ等、カツオ属のカツオ、ソウダガツオ属のヒラソウダ及びマルソウダ、スマ属のスマ等、ハガツオ属のハガツオを挙げることができ、あるいは、ビンナガ、クロマグロ、ミナミマグロ、タイセイヨウマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キハダ、メバチ、コシナガ、ハガツオ又はスマを挙げることができる。好ましくは、ビンナガ、クロマグロ、タイセイヨウマグロ、タイセイヨウクロマグロ、キハダ、メバチ、コシナガ、ハガツオ又はスマを挙げることができる。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：パパイン活性の阻害活性
　１０μｇ／ｍｌのパパイン（販売元：シグマアルドリッチジャパン）と、５μＭのエブセレン又はセレノネインを、３７℃に保った５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、プレインキュベーションを１５分間行った後に、同反応液に１０μＭのＢｚ－Ａｒｇ－ＭＣＡを添加し、蛍光光度計でＢｚ－Ａｒｇ－ＭＣＡの切断に伴う蛍光強度変化を時間を追って観察した。結果を図４に示す。
　１０μｇ／ｍｌのパパイン（販売元：シグマアルドリッチジャパン）と、０から１２５μＭのエブセレン又は０から５μＭのセレノネインを、３７℃に保った５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、プレインキュベーションを１５分間行った後に、同反応液に１０μＭのＢｚ－Ａｒｇ－ＭＣＡを添加し、蛍光光度計でＢｚ－Ａｒｇ－ＭＣＡの切断に伴う蛍光強度変化を測定して阻害活性を調べた。結果を図５に示す。図５の結果から、パパインに対するセレノネインの阻害活性（ＩＣ50＝０．２５μＭ）、及びエブセレンの阻害活性（ＩＣ50＝５．０μＭ）を求めた。
実施例２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭproの調製
　遺伝子全合成により、NC_45512の塩基配列(10055-10972：配列番号４)に従ってＭproのＤＮＡを合成した。ＭproをＧＳＴおよびヒスチジンタグ付きのプラスミドに導入し（図６）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションした。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、３７℃で培養し、Ｍproタンパク質を発現させた。細胞体を回収し、ヒスチジンタグに対する結合剤を用いて、Ｍproタンパク質を精製した。Ｍproの自己消化とヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（ＨＲＶ）によってＧＳＴとヒスチジンタグを除去し、ヒスチジンタグに対する結合剤を用いて、未消化のＭproとＨＲＶを除去し、Ｍproタンパク質の精製標品を得た。精製したＭproタンパク質を、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、５０％グリセロール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＤＴＴの貯蔵緩衝液に溶解し、ＳＤＳ-ＰＡＧＥに供し、クマシーブリリアントブルーにより染色した（図７）。ＤＴＴを含有する貯蔵緩衝液に溶解した精製Ｍproタンパク質を、微量透析カートリッジＸｐｒｅｓｓ Ｍｉｃｒｏ / Ｍｉｎｉ Ｄｉａｌｙｚｅｒ（販売元：フナコシ株式会社）を用いて透析することでＤＴＴを除去し、実施例４の阻害活性試験に供した。
実施例３：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＰＬｐｒｏの調製
　遺伝子全合成により、配列番号NC_45512の塩基配列(4955-5908：配列番号５)に従ってＰＬｐｒｏのＤＮＡを合成する。ＰＬｐｒｏをヒスチジンタグ付きのプラスミドに導入し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株にトランスフォーメーションする。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養し、ＰＬｐｒｏタンパク質を発現せる。細胞体を回収し、ヒスチジンタグに対する結合剤を用いて、ＰＬｐｒｏタンパク質を精製する。ＰＬｐｒｏの自己消化とＨＲＶによってＧＳＴとヒスチジンタグを除去し、ヒスチジンタグに対する結合剤を用いて、未消化のＰＬｐｒｏとＨＲＶを除去し、ＰＬｐｒｏタンパク質の精製標品を得る。
実施例４：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭproに対する阻害活性
　２μｇ／ｍｌのＭproと、５μＭのエブセレン、セレノネイン、又はエルゴチオネインをそれぞれ、３７℃に保った５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、プレインキュベーションを５分間行った後に、同反応液に１０μＭのＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡを添加し、蛍光光度計でＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡの切断に伴う蛍光強度変化を測定して阻害活性を調べた（図８）。対照として、阻害化合物未添加の点でのみ異なる条件で蛍光強度変化を測定した。
　Ａｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡは、Ｍproにより分解され下記の通り、蛍光物質を生成し、Ｍpro阻害化合物の作用により蛍光物質の生成が抑制される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　エブセレン及びエルゴチオネインを添加した場合の蛍光強度変化は、未添加対照と同等であった。一方、セレノネインを添加した場合、未添加対照と比較して蛍光強度が低く抑えられており、セレノネインが、Ｍproの活性を阻害していることが示された。
　２μｇ／ｍｌのＭproと、０～２５μＭのエブセレン、０～２５μＭのエルゴチオネイン又は０～５μＭのセレノネインを、それぞれ、３７℃に保った５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、プレインキュベーションを５分間行った後に、同反応液に１０μＭのＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡを添加し、蛍光光度計でＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡの切断に伴う蛍光強度変化を測定して蛍光強度を測定し、阻害曲線を求めた（図８）。回帰曲線から、ＩＣ50値を算出したところ、下記の表の通りであった：
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例５：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のＭproに対する阻害活性
　２μｇ／ｍｌのＭproと、１μＭの試験化合物をそれぞれ、３７℃に保った５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）に溶解し、プレインキュベーションを５分間行った後に、同反応液に１０μＭのＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡを添加し、蛍光光度計でＡｃ－Ａｂｕ－Ｔｌｅ－Ｌｅｕ－Ｇｌｎ－ＭＣＡの切断に伴う蛍光強度を測定して、阻害活性を測定した（図１０）。試験化合物としては、セレノネイン、エブセレン、セレノシスチン（（SeCys）2）、メチルセレノシステイン（MeSeCys）、セレノメチオニン（SeMet）、ジフェニルジセレニド（PhSeSePh）、亜セレン酸ナトリウム（sodium selenite）を用いた。亜セレン酸ナトリウムを除くこれらの含セリン化合物は、インシリコの試験において、Ｍpro阻害活性を有すると予測された化合物である（非特許文献４）。試験化合物未添加の蛍光強度を１００とした場合の、試験化合物添加１分後の蛍光強度を測定したところ、セレノネインは約２０％であった一方、エブセレン、セレノシスチン（（SeCys）2）、メチルセレノシステイン（MeSeCys）、セレノメチオニン（SeMet）、ジフェニルジセレニド（PhSeSePh）、亜セレン酸ナトリウム（selenite）はいずれも９０％超であった。したがって、セレノネインが、他の含セレン化合物と比較して、特にＭpro阻害活性の点で顕著に優れていることが示された。
実施例６：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に対する増殖阻害活性
　エブセレン又はセレノネインによるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２の宿主細胞への感染阻害は、例えば、プラークアッセイ法によって測定することができる。宿主細胞を３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターでコンフルエントになるまで単層培養する。次に培地を除去し、ＰＢＳ（－）にて細胞表面を洗浄した後、ウイルス溶液と、０から１００μＭのプロテアーゼ阻害剤溶液を添加し３０分間インキュベーションを行う。３０分後に検体溶液を除去し、寒天培地を重層する。寒天が固まったらプレートを反転し３７℃、５％ ＣＯ２のインキュベーターで２日間インキュベートする。その後重層培地を外し、プレートを乾燥させ、クリスタルバイオレット染色液にて５分間染色を行った後、精製水で洗浄し風乾させる。最後にプラークの数をカウントし、対照群と比較し、ウイルスに対するプロテアーゼ阻害剤の感染阻害率を計算する。

Claims (9)

  1. 　セレノネイン、又はその互変異性体若しくは二量体、或いはその医薬として許容される塩を含む、コロナウイルスのプロテアーゼ阻害剤。
  2. 　前記プロテアーゼが、メインプロテアーゼ又はパパイン様プロテアーゼである、請求項１に記載のプロテアーゼ阻害剤。
  3. 　前記コロナウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２である、請求項１又は２に記載のプロテアーゼ阻害剤。
  4. 　セレノネイン又はその互変異性体若しくは二量体或いはその医薬として許容される塩を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防用の組成物。
  5. 　前記コロナウイルス感染症が、ＣＯＶＩＤ１９である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のプロテアーゼ阻害剤を含む、コロナウイルス感染症の治療又は予防用の組成物。
  7. 　パパインに対しての阻害活性を指標とした、コロナウイルス感染症の治療又は予防薬のスクリーニング方法。
  8. 　前記コロナウイルス感染症が、ＣＯＶＩＤ１９である、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記治療薬又は予防薬が、コロナウイルスのメインプロテアーゼを阻害する、請求項７又は８に記載の方法。
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